化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、オリゴヌクレオチドをバインディングさせた金鍍金ステント、及びこれらの製造方法
【課題】損傷部位に局所的に濃度を高めて全身的に毒性は最小化することができる長所を有していて血管整形術の後、再狭窄の防止に用いられるオリゴヌクレオチド金鍍金ステントを提供する。
【解決手段】金鍍金ステントに多様な化学物質、つまり２−アミノアルカンチオール、エピハロゲンヒドリン、及びジアミン化合物を順次に反応させて前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディング（binding）させたオリゴヌクレオチド金鍍金ステントを提供する。
【解決手段】金鍍金ステントに多様な化学物質、つまり２−アミノアルカンチオール、エピハロゲンヒドリン、及びジアミン化合物を順次に反応させて前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディング（binding）させたオリゴヌクレオチド金鍍金ステントを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は金鍍金ステント（stent）及びその製造方法に関するものであって、より詳しくは金鍍金ステントに多様な化学物質、つまり２−アミノアルカンチオール、エピハロゲンヒドリン、及びジアミン化合物を順次に反応させて前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、及び前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディングさせたオリゴヌクレオチド金鍍金ステントに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
米国心臓学会によると、心血管疾患は死亡率１位という高い数値を記録しており、一日に２千６百人以上が疾患で死亡すると報告された。韓国の場合も１９８０年代以後、食習慣がますます西欧化されながら動脈硬化による疾患の有病率が大きく増加しつつある。
【０００３】
経皮経管冠動脈形成拡張術（Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty）は心血管造影術を行った後、血管狭窄程度が激しい場合に狭窄病変を治療する方法であって、脳卒中、狭心症、及び心筋梗塞症の患者などに行われる。血管を通した侵襲的な治療であるが、バイパス術より入院期間が短く、何度も施術が可能であり、死亡率が少ない。ガイドワイヤーを病変冠状動脈内に挿入し、その上にバルーンカテーテルを病変部位に位置させた後、圧力を加えてバルーンを拡張させて狭くなった病変を広める方法である。膨張されたバルーンによるアテローム斑の破裂、圧着、伸展で病変が広がれる。しかし、血管損傷を導いている血管のリモデリングと中間膜の増殖を導いて結局３０乃至７０％の患者に６ヶ月以内に再び狭くなる副作用を起させることによって何度も行わなければならないという短所があった。
【０００４】
このような過程を数回繰り返しても残余狭窄の程度が激しかったり、血管剥離、破裂されたアテローム斑によって血管閉鎖がある場合、これを防止するために金属網のステント（stent）を挿入する。
【０００５】
１９９４年、Benestent及びstress臨床研究において、網手術がバルーン拡張形成術に比べてその長期再狭窄率をさらに減らすことができるという根拠を備えた以後、現在の臨床においては８０から９０％まで冠動脈狭窄病変の治療に網治療手術が普遍化したと見られる。ステント手術が普遍化されながらも１５乃至２０％程度の再狭窄は克服することができなく、これを克服するために放射線治療が使用されたが、後期再狭窄及び血栓症によって使用に限られた。しかし最近、これを克服した方法として抗癌剤や免疫抑制剤を用いてステント表面の再狭窄率を１０％未満に減らした薬物コーティングステント（シロリムス溶出ステント（Sirolimus eluting stent）例：RAVEL, SIRIUS, C- & E-SIRIUS, DIRECT, SVELTE, SIRIUS, REALITY、パクリタキセル溶出ステント（Paclitaxel-eluting stent）例：TAXUSＩ〜VI, Endeavor-Ｉ〜IIIなど）が開発されて研究を通してその効用性を立証した。しかしながら、これもステントコーティング薬剤が免疫抑制剤または抗癌剤などが使用されていて内皮細胞にも毒性が示される可能性がある。
【０００６】
韓国内で経皮冠動脈インターベンションは年一万回を超え、韓国内の市場規模のみにしても２００億以上になる。血管形成術に用いられるステントの国産化程度は非常にわずかな水準であるのみならず、医療器資材及び薬剤が全て外国から開発されて１年間の技術料のみでも莫大な国富が費やされる。従って、新しい心血関係の疾患の標的とこれに対する新薬開発は莫大な経済、社会的な利益をもたらすと予想され、薬物コーティングステントは局所的な薬物を効果的かつ持続的に伝達してステント内の再狭窄率を画期的に低めることができると報告された以後、最近に韓国内の市場で市販されて既存のステントの約２倍ほどの高い値段で販売されるだけでなく、これから薬物コーティングステント市場の規模はさらに速い速度で成長すると期待されていて、これに対する技術開発が至急の状況である。
【０００７】
一方、最近には生体素材を用いた薬剤市場が全世界的に拡大される成り行きであり、RNA研究の中でもRNA干渉（RNAi、RNA interference）に対する研究が集中スポットライトを受けられ、その中でも特にＲＮＡ干渉現象が導かれる低分子干渉ＲＮＡ（siRNA、small interfering RNA）技術が脚光を浴びている。また、ＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡはあたかも遺伝情報を伝達するＲＮＡ線の遺伝子スイッチのように中間で蛋白質合成の遺伝情報を遮断する役割を果たして、遺伝病治療だけでなくウイルス感染性疾患治療などの多方面に渡って応用が可能である。
【０００８】
現在ＲＮＡ干渉技術の最も重要な問題はｓｉＲＮＡ運びシステムが無いということであって、ＲＮＡ干渉効果を十分導くことができるようにｓｉＲＮＡを標的細胞に注入する効率かつ安全な伝達システムが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明において、金鍍金ステントにバインディングするオリゴヌクレオチドの中でsiRNAは生体素材であって、化学物（薬物）による毒性を最小化して中間層の平滑筋細胞が特異的に作用して増殖抑制の効果をもたらすことと期待され、なお、ｓｉＲＮＡを金鍍金ステントにバインディングして投与する方法は損傷部位に局所的に濃度を高め、全身的に毒性は最小化することができる長所がある。化学的にステントをコーティングする技術やｓｉＲＮＡを変化する技術はそれぞれ技術導入は可能であるが、本発明から行われた金鍍金ステントにｓｉＲＮＡをバインディングする技術は今まで行ったことの無い新しい方法である。
【００１０】
本発明で生体素材のｓｉＲＮＡをバインディングすることは、化学物による毒性を最小化して中間層の平滑筋細胞が特異的に作用して増殖抑制効果と損傷部位に局所的に濃度を高め、全身的に毒性は最小化することができる長所がある。
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は金で鍍金されたステントの表面上に多様な化学物質を順次に反応させて化学物質でコーティングされた金鍍金ステント及びそれの製造方法を提供することに目的がある。
【００１２】
また、本発明は前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディング（binding）させたオリゴヌクレオチド金鍍金ステント及びこれの製造方法を提供することにもう一つの目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は金鍍金ステント及びその製造方法に関するものであって、より詳しくは金鍍金ステントに多様な化学物質、つまり２−アミノアルカンチオール、エピハロゲンヒドリン、及びジアミン化合物を順次に反応させて前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、及び前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディングさせたオリゴヌクレオチド金鍍金ステントに関するものである。
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１５】
本発明は下記構造式Ｉで表示される金鍍金ステントに関するものである。
【００１６】
＜構造式Ｉ＞
【００１７】
前記式中、Ｒ１はＢｒ、Ｃｌ、または
【化２】
であり；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【００１８】
前記構造式１中、ｍは１以上の整数であって、ステントの表面を囲んでいる程度であるため、その数を制限することは意味が無い。
【００１９】
また、本発明は前記構造式Ｉで表示されるステントのアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）基とｓｉＲＮＡがバインディングして形成させることを特徴とする、ｓｉＲＮＡでバインディングされた金鍍金ステントに関するものである。バッファー処理した時、前記ｓｉＲＮＡは（−）電荷を帯びるものであって、アミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）基を含めている化学物質でコーティングされた金鍍金ステントのアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）基と電荷を帯びながらバインディングするものである。
【００２０】
本発明による金鍍金ステントは下記の構造式Ｉ−１の金鍍金ステント、構造式Ｉ−２のアミン（−ＮＨ−）を有する金鍍金ステント、構造式IIのアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を有する金鍍金ステント、及び前記ステントのアミン基にオリゴヌクレオチドがバインディングされた金鍍金ステントを含み、前記オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれるものが望ましく、さらに望ましくはｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）である。
【００２１】
前記オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれることを特徴とするが、バッファー処理時に（−）電荷を帯びるｓｉＲＮＡが金鍍金ステントにバインディングされることと同じ原理で、ＤＮＡ、ＲＮＡもやはり金鍍金ステントと電荷を帯びながらバインディングされることができる。
【００２２】
＜構造式Ｉ−１＞
【００２３】
＜構造式Ｉ−２＞
【００２４】
＜構造式II＞
【００２５】
前記式中、Ａ、Ｒ２、ｎ、及びｐは前記構造式Ｉにおける定義と同一であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；Ｒ１１及びＲ１２は互いに独立に水素またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルであり；ｍは１乃至百万の整数であり；ｑは１乃至３０の整数である。
【００２６】
本発明による金鍍金ステントは下記構造式IIIのアミン基（−ＮＨ−または −ＮＨ２）を含む金鍍金ステントであるものが望ましく、下記構造式IIIのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含む金鍍金ステントのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）がバインディングされた金鍍金ステントであるものが最も望ましく、図１に例示した。
【００２７】
＜構造式III＞
【００２８】
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【００２９】
本発明による前記構造式Ｉ−１の金鍍金ステントは下記の段階を経て製造される。
【００３０】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；及び
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
【００３１】
前記式中、ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数であり；ｎは１乃至３０の整数である。
【００３２】
本発明による前記構造式Ｉ−２のアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含む金鍍金ステントは下記の段階を経て製造される。
【００３３】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；及び
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含むステントを形成する段階
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
【００３４】
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【００３５】
本発明による前記構造式Ｉ−３のオリゴヌクレオチドがアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にバインディングされた金鍍金ステントは下記の段階を経て製造される。
【００３６】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖのステントに化学式２のエピハロゲンヒドリンを反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；及び
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のステントを形成する段階；
４）前記形成された下記構造式Ｉ−２のステントのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にオリゴヌクレオチドをバインディングさせてｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）がバインディングされた金鍍金ステントを形成する段階
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
【００３７】
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数であり；ｎは１乃至３０の整数であり；ｐは１乃至３０の整数である。
【００３８】
前記構造式Ｉ−２のアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含むステントは鎖内にアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含有しており、前記アミン基に生体素材のオリゴヌクレオチドがバインディングして製造されるオリゴヌクレオチドがバインディングされた金鍍金ステントを通して血管にオリゴヌクレオチドが伝達できるようになる。
【００３９】
本発明においてオリゴヌクレオチドで使用されたｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に蛍光を現すフルオレセインを金鍍金されたステントにバインディングして蛍光分光光度計で検出した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のｓｉＲＮＡをバインディング（binding）させたｓｉＲＮＡ金鍍金ステントの一例である。
【図２】実施例１において試料を入れない状態（対照群）のＩＲスペクトルである。
【図３】実施例１から製造された化合物ＣのＩＲスペクトルである。
【図４】実施例１から製造された化合物ＤのＩＲスペクトルである。
【図５】実施例１から製造された化合物Ｅのアミン化合物を有する金（Ａｕ）化合物のＩＲスペクトルである。
【図６】実施例１で使用される純粋な金箔のゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図７】実施例１から製造された化合物Ｃのゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図８】実施例１から製造された化合物Ｄのゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図９】実施例１から製造された化合物Ｅのゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図１０】実施例２において炭酸ナトリウム緩衝剤（sodium carbonate buffer、pH11）を使用して蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で測定したスペクトル（対照群）である。
【図１１】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを１０秒間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１２】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを３分間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１３】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを６分間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１４】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを９分間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１５】実施例２において５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）ｓｉＲＮＡを用いて金鍍金ステントとｓｉＲＮＡとの間のバインディングされた量を測定したグラフである。
【図１６】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）ｓｉＲＮＡオリゴ３０ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図１７】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）ｓｉＲＮＡオリゴ３３.２ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図１８】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセインｓｉＲＮＡオリゴ６８ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図１９】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセインｓｉＲＮＡオリゴ１０８．５ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図２０】実施例２で５′−フルオレセインｓｉＲＮＡを用いて最高濃度で結合されたステントとｓｉＲＮＡのバインディングされた程度を逆に定量したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は下記の実施例に基づいてさらに詳しく説明し、下記の実施例は本発明についてよりわかりやすくするためのものであって、本発明の範囲がここに限られるものではない。
【００４２】
＜実施例１＞
化学物質がコーティングされた金鍍金ステント（構造式III）の製造
【化３】
【００４３】
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【００４４】
エタノール下において、金鍍金されたステント（0.0165g、0.084mmol）［金鍍金ステント＝薄膜の厚さ0.03μｍ、Daeduckケミカル］と２−アミノエタンチオール（3.88mmol、金鍍金ステントの４６倍、Aldrich）を過量使用して常温で２時間超音波処理（sonicate）して金鍍金されたステントの表面に硫黄（Ｓ）が結合された金鍍金ステント［化合物Ａ］を合成した。前記合成されたステント［化合物Ａ］をアセトニトリル（Acetonitrile）20mlで３回洗滌した後、トリエチルアミン（Triethylamine、3.36mmol、金鍍金ステントの４０倍）と過量のエピブロモヒドリン（3.53mmol、金鍍金ステントの４２倍、Aldrich）のニート反応させてステント［化合物Ｂ］を合成した。
【００４５】
前記合成されたステント［化合物Ｂ］をAldrich社から購入したスペルミン（2.52mmol、金鍍金ステントの３０倍）を使用してホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ９．５）で反応した後、アセトニトリルで３回洗滌してアミン（−ＮＨ−または −ＮＨ２）を含むステント［構造式III］を得た。
【００４６】
構造式ＩＩＩで表示されるアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含むステントを製造するために使用される化学物質が順次に結合しているかを確認するためにＩＲ及びゼータポテンシャル（zeta-potential）を測定した。しかし、ステントは鉄網でＮＭＲ、ＩＲ、ｍｐなどの測定が不可であるため、本発明で使用される金が鍍金されたステントのステントの代わりに金箔（DongYang金銀箔粉工業社）を用いて前記実施例１と同一な方法で２−アミノエタンチオール、エピブロモヒドリン、及びスペルミンを順次に反応させてそれぞれの段階で合成される化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅのアミン末端を有する化合物のＩＲとゼータポテンシャルを測定した結果を図２乃至図９に示した。
【００４７】
前記図２と図６は対照群であり、図３乃至図５に化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅのアミン末端を有する化合物のＩＲをそれぞれ示し、図７乃至図９に化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅのアミン末端を有する化合物のゼータポテンシャルを測定した結果をそれぞれ示した。
【００４８】
図２の対照群と比較する場合、図３乃至図５のＩＲスペクトルから３，３００ｃｍ−１乃至３，５００ｃｍ−１の範囲でアミン基を、１，２５０ｃｍ−１乃至１，１９０ｃｍ−１でＣＨ２−Ｂｒの曲げ、１，０５０ｃｍ−１で一次アルコールのＣ−Ｏのストレッチ（stretch）をそれぞれ確認することができた。
【００４９】
また、純粋金において（＋）電荷を帯びる図５（対照群）と比べた時、図７乃至図９のゼータポテンシャルの電荷値の変化でその合成を確認することができ、金は＋２価なので自体は（＋）電荷の値であり、末端にアミン（N+）が付くと周りに（−）値が集められてゼータポテンシャルを測定すれば−に変わるからchargeの変化でその合成有無を判断した。
【００５０】
＜実施例２＞ ｓｉＲＮＡがバインディングされた金鍍金ステントの製造
【００５１】
蛍光染色された５′−フルオレセインｓｉＲＮＡオリゴ（CCU ACG CCA AUU UCG U：序列目録１）１０ｎｍｏｌをトリスバッファー（Tris buffer）（バイオニアｐＨ７．４）１０００μｌで希釈した後、ここに前記実施例１から製造されたアミン基を含むステント［構造式ＩＩＩ］を入れて５分間反応させ、ＤＥＰＣ ＤＷ（Diethyl pyrocarbonate treated distilled water、バイオニア）１ｍｌで５回洗滌してsiRNAがアミン基にバインディングされた金鍍金ステントを得て、図１に一部を例示した。
【００５２】
＜構造式III＞
【００５３】
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【００５４】
炭酸ナトリウム（Na2CO3、Aldrich社）を使用して製作したバッファー（pH11）３ｍｌに前記得られたｓｉＲＮＡがアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にバイン ディングされた金鍍金ステントを一定時間置きでを浸して剥して取れたフルオレセイン（ｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に蛍光を現すフルオレセイン）を蛍光分光光度計（SHIMADZU、RF-5301PC）で測定して、下記表１と図９乃至図１４に示し、９分で最高107.478の強度を見せることが確認できた。
【００５５】
＜表１＞
【００５６】
前記表１から、最高の強度である１０７．４７８を見せる９分でフルオレセインの量を逆に定量するために、炭酸ナトリウム（Na2CO3、Aldrich社）を使用して製作したバッファー（ｐＨ１１）３ｍｌの下において前記得られたｓｉＲＮＡがアミン（−ＮＨＸ）にバインディングされた金鍍金ステント［構造式III］を浸して剥して取れたフルオレセイン（ｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に蛍光を現すフルオレセイン）を蛍光分光光度計（SHIMADZU、RF-5301PC）で測定して、逆にその量を定量して強度とpmolを下記表２と図１５乃至図１９に示し、１０７．４７８の強度は約１００ｐｍｏｌの量であることを確認した。
【００５７】
＜表２＞
【産業上の利用可能性】
【００５８】
前記から調べてみたように、金鍍金されたステント表面にオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に付いてあるフルオレセインを測定することによって、金鍍金されたステント化合物にｓｉＲＮＡがバインディングされていることを蛍光分光光度計で確認することができた。
【００５９】
また、従来のステントコーティング薬剤で選択使用された各種抗癌剤は内皮細胞に毒性を示したが、本発明による金鍍金ステントは生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディングすることで、化学物による毒性を最小化して中間層の平滑筋細胞が特異的に作用して増殖抑制効果と損傷部位に局所的に濃度を高めて全身的な毒性は最小化することが期待できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は金鍍金ステント（stent）及びその製造方法に関するものであって、より詳しくは金鍍金ステントに多様な化学物質、つまり２−アミノアルカンチオール、エピハロゲンヒドリン、及びジアミン化合物を順次に反応させて前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、及び前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディングさせたオリゴヌクレオチド金鍍金ステントに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
米国心臓学会によると、心血管疾患は死亡率１位という高い数値を記録しており、一日に２千６百人以上が疾患で死亡すると報告された。韓国の場合も１９８０年代以後、食習慣がますます西欧化されながら動脈硬化による疾患の有病率が大きく増加しつつある。
【０００３】
経皮経管冠動脈形成拡張術（Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty）は心血管造影術を行った後、血管狭窄程度が激しい場合に狭窄病変を治療する方法であって、脳卒中、狭心症、及び心筋梗塞症の患者などに行われる。血管を通した侵襲的な治療であるが、バイパス術より入院期間が短く、何度も施術が可能であり、死亡率が少ない。ガイドワイヤーを病変冠状動脈内に挿入し、その上にバルーンカテーテルを病変部位に位置させた後、圧力を加えてバルーンを拡張させて狭くなった病変を広める方法である。膨張されたバルーンによるアテローム斑の破裂、圧着、伸展で病変が広がれる。しかし、血管損傷を導いている血管のリモデリングと中間膜の増殖を導いて結局３０乃至７０％の患者に６ヶ月以内に再び狭くなる副作用を起させることによって何度も行わなければならないという短所があった。
【０００４】
このような過程を数回繰り返しても残余狭窄の程度が激しかったり、血管剥離、破裂されたアテローム斑によって血管閉鎖がある場合、これを防止するために金属網のステント（stent）を挿入する。
【０００５】
１９９４年、Benestent及びstress臨床研究において、網手術がバルーン拡張形成術に比べてその長期再狭窄率をさらに減らすことができるという根拠を備えた以後、現在の臨床においては８０から９０％まで冠動脈狭窄病変の治療に網治療手術が普遍化したと見られる。ステント手術が普遍化されながらも１５乃至２０％程度の再狭窄は克服することができなく、これを克服するために放射線治療が使用されたが、後期再狭窄及び血栓症によって使用に限られた。しかし最近、これを克服した方法として抗癌剤や免疫抑制剤を用いてステント表面の再狭窄率を１０％未満に減らした薬物コーティングステント（シロリムス溶出ステント（Sirolimus eluting stent）例：RAVEL, SIRIUS, C- & E-SIRIUS, DIRECT, SVELTE, SIRIUS, REALITY、パクリタキセル溶出ステント（Paclitaxel-eluting stent）例：TAXUSＩ〜VI, Endeavor-Ｉ〜IIIなど）が開発されて研究を通してその効用性を立証した。しかしながら、これもステントコーティング薬剤が免疫抑制剤または抗癌剤などが使用されていて内皮細胞にも毒性が示される可能性がある。
【０００６】
韓国内で経皮冠動脈インターベンションは年一万回を超え、韓国内の市場規模のみにしても２００億以上になる。血管形成術に用いられるステントの国産化程度は非常にわずかな水準であるのみならず、医療器資材及び薬剤が全て外国から開発されて１年間の技術料のみでも莫大な国富が費やされる。従って、新しい心血関係の疾患の標的とこれに対する新薬開発は莫大な経済、社会的な利益をもたらすと予想され、薬物コーティングステントは局所的な薬物を効果的かつ持続的に伝達してステント内の再狭窄率を画期的に低めることができると報告された以後、最近に韓国内の市場で市販されて既存のステントの約２倍ほどの高い値段で販売されるだけでなく、これから薬物コーティングステント市場の規模はさらに速い速度で成長すると期待されていて、これに対する技術開発が至急の状況である。
【０００７】
一方、最近には生体素材を用いた薬剤市場が全世界的に拡大される成り行きであり、RNA研究の中でもRNA干渉（RNAi、RNA interference）に対する研究が集中スポットライトを受けられ、その中でも特にＲＮＡ干渉現象が導かれる低分子干渉ＲＮＡ（siRNA、small interfering RNA）技術が脚光を浴びている。また、ＲＮＡ干渉を起こすｓｉＲＮＡはあたかも遺伝情報を伝達するＲＮＡ線の遺伝子スイッチのように中間で蛋白質合成の遺伝情報を遮断する役割を果たして、遺伝病治療だけでなくウイルス感染性疾患治療などの多方面に渡って応用が可能である。
【０００８】
現在ＲＮＡ干渉技術の最も重要な問題はｓｉＲＮＡ運びシステムが無いということであって、ＲＮＡ干渉効果を十分導くことができるようにｓｉＲＮＡを標的細胞に注入する効率かつ安全な伝達システムが必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明において、金鍍金ステントにバインディングするオリゴヌクレオチドの中でsiRNAは生体素材であって、化学物（薬物）による毒性を最小化して中間層の平滑筋細胞が特異的に作用して増殖抑制の効果をもたらすことと期待され、なお、ｓｉＲＮＡを金鍍金ステントにバインディングして投与する方法は損傷部位に局所的に濃度を高め、全身的に毒性は最小化することができる長所がある。化学的にステントをコーティングする技術やｓｉＲＮＡを変化する技術はそれぞれ技術導入は可能であるが、本発明から行われた金鍍金ステントにｓｉＲＮＡをバインディングする技術は今まで行ったことの無い新しい方法である。
【００１０】
本発明で生体素材のｓｉＲＮＡをバインディングすることは、化学物による毒性を最小化して中間層の平滑筋細胞が特異的に作用して増殖抑制効果と損傷部位に局所的に濃度を高め、全身的に毒性は最小化することができる長所がある。
【００１１】
前記目的を達成するために、本発明は金で鍍金されたステントの表面上に多様な化学物質を順次に反応させて化学物質でコーティングされた金鍍金ステント及びそれの製造方法を提供することに目的がある。
【００１２】
また、本発明は前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディング（binding）させたオリゴヌクレオチド金鍍金ステント及びこれの製造方法を提供することにもう一つの目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は金鍍金ステント及びその製造方法に関するものであって、より詳しくは金鍍金ステントに多様な化学物質、つまり２−アミノアルカンチオール、エピハロゲンヒドリン、及びジアミン化合物を順次に反応させて前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステント、及び前記化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディングさせたオリゴヌクレオチド金鍍金ステントに関するものである。
【００１４】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１５】
本発明は下記構造式Ｉで表示される金鍍金ステントに関するものである。
【００１６】
＜構造式Ｉ＞
【００１７】
前記式中、Ｒ１はＢｒ、Ｃｌ、または
【化２】
であり；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【００１８】
前記構造式１中、ｍは１以上の整数であって、ステントの表面を囲んでいる程度であるため、その数を制限することは意味が無い。
【００１９】
また、本発明は前記構造式Ｉで表示されるステントのアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）基とｓｉＲＮＡがバインディングして形成させることを特徴とする、ｓｉＲＮＡでバインディングされた金鍍金ステントに関するものである。バッファー処理した時、前記ｓｉＲＮＡは（−）電荷を帯びるものであって、アミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）基を含めている化学物質でコーティングされた金鍍金ステントのアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）基と電荷を帯びながらバインディングするものである。
【００２０】
本発明による金鍍金ステントは下記の構造式Ｉ−１の金鍍金ステント、構造式Ｉ−２のアミン（−ＮＨ−）を有する金鍍金ステント、構造式IIのアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を有する金鍍金ステント、及び前記ステントのアミン基にオリゴヌクレオチドがバインディングされた金鍍金ステントを含み、前記オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれるものが望ましく、さらに望ましくはｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）である。
【００２１】
前記オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれることを特徴とするが、バッファー処理時に（−）電荷を帯びるｓｉＲＮＡが金鍍金ステントにバインディングされることと同じ原理で、ＤＮＡ、ＲＮＡもやはり金鍍金ステントと電荷を帯びながらバインディングされることができる。
【００２２】
＜構造式Ｉ−１＞
【００２３】
＜構造式Ｉ−２＞
【００２４】
＜構造式II＞
【００２５】
前記式中、Ａ、Ｒ２、ｎ、及びｐは前記構造式Ｉにおける定義と同一であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；Ｒ１１及びＲ１２は互いに独立に水素またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルであり；ｍは１乃至百万の整数であり；ｑは１乃至３０の整数である。
【００２６】
本発明による金鍍金ステントは下記構造式IIIのアミン基（−ＮＨ−または −ＮＨ２）を含む金鍍金ステントであるものが望ましく、下記構造式IIIのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含む金鍍金ステントのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）がバインディングされた金鍍金ステントであるものが最も望ましく、図１に例示した。
【００２７】
＜構造式III＞
【００２８】
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【００２９】
本発明による前記構造式Ｉ−１の金鍍金ステントは下記の段階を経て製造される。
【００３０】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；及び
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
【００３１】
前記式中、ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数であり；ｎは１乃至３０の整数である。
【００３２】
本発明による前記構造式Ｉ−２のアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含む金鍍金ステントは下記の段階を経て製造される。
【００３３】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；及び
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含むステントを形成する段階
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
【００３４】
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【００３５】
本発明による前記構造式Ｉ−３のオリゴヌクレオチドがアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にバインディングされた金鍍金ステントは下記の段階を経て製造される。
【００３６】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖのステントに化学式２のエピハロゲンヒドリンを反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；及び
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のステントを形成する段階；
４）前記形成された下記構造式Ｉ−２のステントのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にオリゴヌクレオチドをバインディングさせてｓｉＲＮＡ（small interfering RNA）がバインディングされた金鍍金ステントを形成する段階
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
【００３７】
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数であり；ｎは１乃至３０の整数であり；ｐは１乃至３０の整数である。
【００３８】
前記構造式Ｉ−２のアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含むステントは鎖内にアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含有しており、前記アミン基に生体素材のオリゴヌクレオチドがバインディングして製造されるオリゴヌクレオチドがバインディングされた金鍍金ステントを通して血管にオリゴヌクレオチドが伝達できるようになる。
【００３９】
本発明においてオリゴヌクレオチドで使用されたｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に蛍光を現すフルオレセインを金鍍金されたステントにバインディングして蛍光分光光度計で検出した。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】化学物質でコーティングされた金鍍金ステントに生体素材のｓｉＲＮＡをバインディング（binding）させたｓｉＲＮＡ金鍍金ステントの一例である。
【図２】実施例１において試料を入れない状態（対照群）のＩＲスペクトルである。
【図３】実施例１から製造された化合物ＣのＩＲスペクトルである。
【図４】実施例１から製造された化合物ＤのＩＲスペクトルである。
【図５】実施例１から製造された化合物Ｅのアミン化合物を有する金（Ａｕ）化合物のＩＲスペクトルである。
【図６】実施例１で使用される純粋な金箔のゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図７】実施例１から製造された化合物Ｃのゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図８】実施例１から製造された化合物Ｄのゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図９】実施例１から製造された化合物Ｅのゼータポテンシャル（zeta-potential）測定結果のグラフである。
【図１０】実施例２において炭酸ナトリウム緩衝剤（sodium carbonate buffer、pH11）を使用して蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で測定したスペクトル（対照群）である。
【図１１】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを１０秒間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１２】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを３分間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１３】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを６分間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１４】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、ｓｉＲＮＡがバイン ディングされた金鍍金ステントを９分間反応させた後、蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）を測定したスペクトルである。
【図１５】実施例２において５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）ｓｉＲＮＡを用いて金鍍金ステントとｓｉＲＮＡとの間のバインディングされた量を測定したグラフである。
【図１６】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）ｓｉＲＮＡオリゴ３０ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図１７】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセイン（5'-Fluorescein）ｓｉＲＮＡオリゴ３３.２ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計（spectrofluorophotometer）で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図１８】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセインｓｉＲＮＡオリゴ６８ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図１９】実施例２で炭酸ナトリウム緩衝剤の下において、蛍光染色された５′−フルオレセインｓｉＲＮＡオリゴ１０８．５ｐｍｏｌを定量して蛍光分光光度計で５′−フルオレセインを測定したスペクトルである。
【図２０】実施例２で５′−フルオレセインｓｉＲＮＡを用いて最高濃度で結合されたステントとｓｉＲＮＡのバインディングされた程度を逆に定量したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は下記の実施例に基づいてさらに詳しく説明し、下記の実施例は本発明についてよりわかりやすくするためのものであって、本発明の範囲がここに限られるものではない。
【００４２】
＜実施例１＞
化学物質がコーティングされた金鍍金ステント（構造式III）の製造
【化３】
【００４３】
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【００４４】
エタノール下において、金鍍金されたステント（0.0165g、0.084mmol）［金鍍金ステント＝薄膜の厚さ0.03μｍ、Daeduckケミカル］と２−アミノエタンチオール（3.88mmol、金鍍金ステントの４６倍、Aldrich）を過量使用して常温で２時間超音波処理（sonicate）して金鍍金されたステントの表面に硫黄（Ｓ）が結合された金鍍金ステント［化合物Ａ］を合成した。前記合成されたステント［化合物Ａ］をアセトニトリル（Acetonitrile）20mlで３回洗滌した後、トリエチルアミン（Triethylamine、3.36mmol、金鍍金ステントの４０倍）と過量のエピブロモヒドリン（3.53mmol、金鍍金ステントの４２倍、Aldrich）のニート反応させてステント［化合物Ｂ］を合成した。
【００４５】
前記合成されたステント［化合物Ｂ］をAldrich社から購入したスペルミン（2.52mmol、金鍍金ステントの３０倍）を使用してホウ酸ナトリウム緩衝剤（ｐＨ９．５）で反応した後、アセトニトリルで３回洗滌してアミン（−ＮＨ−または −ＮＨ２）を含むステント［構造式III］を得た。
【００４６】
構造式ＩＩＩで表示されるアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）を含むステントを製造するために使用される化学物質が順次に結合しているかを確認するためにＩＲ及びゼータポテンシャル（zeta-potential）を測定した。しかし、ステントは鉄網でＮＭＲ、ＩＲ、ｍｐなどの測定が不可であるため、本発明で使用される金が鍍金されたステントのステントの代わりに金箔（DongYang金銀箔粉工業社）を用いて前記実施例１と同一な方法で２−アミノエタンチオール、エピブロモヒドリン、及びスペルミンを順次に反応させてそれぞれの段階で合成される化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅのアミン末端を有する化合物のＩＲとゼータポテンシャルを測定した結果を図２乃至図９に示した。
【００４７】
前記図２と図６は対照群であり、図３乃至図５に化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅのアミン末端を有する化合物のＩＲをそれぞれ示し、図７乃至図９に化合物Ｃ、化合物Ｄ、及び化合物Ｅのアミン末端を有する化合物のゼータポテンシャルを測定した結果をそれぞれ示した。
【００４８】
図２の対照群と比較する場合、図３乃至図５のＩＲスペクトルから３，３００ｃｍ−１乃至３，５００ｃｍ−１の範囲でアミン基を、１，２５０ｃｍ−１乃至１，１９０ｃｍ−１でＣＨ２−Ｂｒの曲げ、１，０５０ｃｍ−１で一次アルコールのＣ−Ｏのストレッチ（stretch）をそれぞれ確認することができた。
【００４９】
また、純粋金において（＋）電荷を帯びる図５（対照群）と比べた時、図７乃至図９のゼータポテンシャルの電荷値の変化でその合成を確認することができ、金は＋２価なので自体は（＋）電荷の値であり、末端にアミン（N+）が付くと周りに（−）値が集められてゼータポテンシャルを測定すれば−に変わるからchargeの変化でその合成有無を判断した。
【００５０】
＜実施例２＞ ｓｉＲＮＡがバインディングされた金鍍金ステントの製造
【００５１】
蛍光染色された５′−フルオレセインｓｉＲＮＡオリゴ（CCU ACG CCA AUU UCG U：序列目録１）１０ｎｍｏｌをトリスバッファー（Tris buffer）（バイオニアｐＨ７．４）１０００μｌで希釈した後、ここに前記実施例１から製造されたアミン基を含むステント［構造式ＩＩＩ］を入れて５分間反応させ、ＤＥＰＣ ＤＷ（Diethyl pyrocarbonate treated distilled water、バイオニア）１ｍｌで５回洗滌してsiRNAがアミン基にバインディングされた金鍍金ステントを得て、図１に一部を例示した。
【００５２】
＜構造式III＞
【００５３】
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【００５４】
炭酸ナトリウム（Na2CO3、Aldrich社）を使用して製作したバッファー（pH11）３ｍｌに前記得られたｓｉＲＮＡがアミン（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にバイン ディングされた金鍍金ステントを一定時間置きでを浸して剥して取れたフルオレセイン（ｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に蛍光を現すフルオレセイン）を蛍光分光光度計（SHIMADZU、RF-5301PC）で測定して、下記表１と図９乃至図１４に示し、９分で最高107.478の強度を見せることが確認できた。
【００５５】
＜表１＞
【００５６】
前記表１から、最高の強度である１０７．４７８を見せる９分でフルオレセインの量を逆に定量するために、炭酸ナトリウム（Na2CO3、Aldrich社）を使用して製作したバッファー（ｐＨ１１）３ｍｌの下において前記得られたｓｉＲＮＡがアミン（−ＮＨＸ）にバインディングされた金鍍金ステント［構造式III］を浸して剥して取れたフルオレセイン（ｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に蛍光を現すフルオレセイン）を蛍光分光光度計（SHIMADZU、RF-5301PC）で測定して、逆にその量を定量して強度とpmolを下記表２と図１５乃至図１９に示し、１０７．４７８の強度は約１００ｐｍｏｌの量であることを確認した。
【００５７】
＜表２＞
【産業上の利用可能性】
【００５８】
前記から調べてみたように、金鍍金されたステント表面にオリゴヌクレオチドのｓｉＲＮＡオリゴの５′位置に付いてあるフルオレセインを測定することによって、金鍍金されたステント化合物にｓｉＲＮＡがバインディングされていることを蛍光分光光度計で確認することができた。
【００５９】
また、従来のステントコーティング薬剤で選択使用された各種抗癌剤は内皮細胞に毒性を示したが、本発明による金鍍金ステントは生体素材のオリゴヌクレオチドをバインディングすることで、化学物による毒性を最小化して中間層の平滑筋細胞が特異的に作用して増殖抑制効果と損傷部位に局所的に濃度を高めて全身的な毒性は最小化することが期待できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記構造式Ｉで表示される金鍍金ステント。
＜構造式Ｉ＞
前記式中、Ｒ１はＢｒ、Ｃｌ、または
【化１】
であり；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【請求項２】
下記構造式IIで表示される請求項１に記載の金鍍金ステント。
＜構造式II＞
前記式中、Ａ、ｎ、及びｐは請求項１の定義と同一であり；ｍは１乃至 １００万の整数であり；Ｒ１１及びＲ１２は互いに独立で水素またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルであり；ｑは１乃至３０の整数である。
【請求項３】
下記構造式IIIで表示される請求項２に記載の金鍍金ステント。
＜構造式III＞
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３から選ばれるいずれか１項に記載の金鍍金ステントのアミノ基とオリゴヌクレオチドがバインディングして形成されたことを特徴とする金鍍金ステント。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項４に記載の金鍍金ステント。
【請求項６】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；及び
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のステントを形成する段階；
とを含む構造式Ｉ−２の金鍍金ステントを製造する方法。
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【請求項７】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のステントを形成する段階；
４）前記形成された下記構造式Ｉ−２のステントのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にオリゴヌクレオチドをバインディングさせてオリゴヌクレオチドがバインディングされた金鍍金ステントを形成する段階；とを含む金鍍金ステントを製造する方法。
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【請求項８】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；及び
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；とを含む構造式Ｉ−１の金鍍金ステントを製造する方法。
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
前記式中、ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数であり；ｎは１乃至３０の整数である。
【請求項１】
下記構造式Ｉで表示される金鍍金ステント。
＜構造式Ｉ＞
前記式中、Ｒ１はＢｒ、Ｃｌ、または
【化１】
であり；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【請求項２】
下記構造式IIで表示される請求項１に記載の金鍍金ステント。
＜構造式II＞
前記式中、Ａ、ｎ、及びｐは請求項１の定義と同一であり；ｍは１乃至 １００万の整数であり；Ｒ１１及びＲ１２は互いに独立で水素またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルであり；ｑは１乃至３０の整数である。
【請求項３】
下記構造式IIIで表示される請求項２に記載の金鍍金ステント。
＜構造式III＞
前記式中、ｍは１乃至１００万の整数である。
【請求項４】
請求項１乃至請求項３から選ばれるいずれか１項に記載の金鍍金ステントのアミノ基とオリゴヌクレオチドがバインディングして形成されたことを特徴とする金鍍金ステント。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡからなる群から選ばれたものであることを特徴とする請求項４に記載の金鍍金ステント。
【請求項６】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；及び
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のステントを形成する段階；
とを含む構造式Ｉ−２の金鍍金ステントを製造する方法。
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【請求項７】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；
３）前記形成された下記構造式Ｉ−１のステントに化学式３のジアミン化合物を反応させて下記構造式Ｉ−２のステントを形成する段階；
４）前記形成された下記構造式Ｉ−２のステントのアミン基（−ＮＨ−または−ＮＨ２）にオリゴヌクレオチドをバインディングさせてオリゴヌクレオチドがバインディングされた金鍍金ステントを形成する段階；とを含む金鍍金ステントを製造する方法。
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜構造式Ｉ−２＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
＜化学式３＞
前記式中、ＡはＣ１乃至Ｃ３０のアルキレンであり、前記アルキレンの炭素原子は酸素、窒素、または硫黄から選ばれる１つ以上のへテロ原子で置換でき；Ｒ２はアミノ基またはＣ１乃至Ｃ３０のアルキルアミノ基から選ばれる１つ以上が置換されたＣ１乃至Ｃ３０のアルキル又は水素であり；ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数、ｎは１乃至３０の整数、ｐは１乃至３０の整数である。
【請求項８】
１）下記構造式IVの金鍍金ステント（stent）に化学式１の２−アミノアルカンチオールを反応させて下記構造式Ｖのステントを形成する段階；及び
２）前記形成された下記構造式Ｖの硫黄（Ｓ）が結合されたステントと化学式２のエピハロゲンヒドリンをエポキシ開環反応させて下記構造式Ｉ−１のステントを形成する段階；とを含む構造式Ｉ−１の金鍍金ステントを製造する方法。
＜構造式IV＞
＜構造式Ｖ＞
＜構造式Ｉ−１＞
＜化学式１＞
＜化学式２＞
前記式中、ＸはＢｒまたはＣｌであり；ｍは１以上の整数であり；ｎは１乃至３０の整数である。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【公表番号】特表２０１０−５３０２７３（Ｐ２０１０−５３０２７３Ａ）
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５１３１００（Ｐ２０１０−５１３１００）
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００３３８５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５６２７０
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０２２３５７７３）バイオニア コーポレーション (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年９月９日（２０１０．９．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１６日（２００８．６．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００８／００３３８５
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１５６２７０
【国際公開日】平成２０年１２月２４日（２００８．１２．２４）
【出願人】（５０２２３５７７３）バイオニア コーポレーション (14)
【Ｆターム（参考）】
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