単子葉植物種子の中で発現させたヒト血中蛋白質
【課題】ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に高い割合で産生させる。
【解決手段】単子葉植物細胞に、キメラ遺伝子による形質転換を受けさせ、形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物をヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、植物から種子を収穫する。得られたヒト血中蛋白質は収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する。
【解決手段】単子葉植物細胞に、キメラ遺伝子による形質転換を受けさせ、形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物をヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、植物から種子を収穫する。得られたヒト血中蛋白質は収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト用および動物用の局所組成物およびヒト用の治療組成物を製造する時に用いる目的で、単子葉植物の種子の中で産生したヒト血中蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
好ましい治療効果をもたらすヒト血中蛋白質の必要量が多いため、あるいは特定の病気にかかっている世界中の患者人口が必要とするヒト血中蛋白質の量が多いため、多くのヒト血中蛋白質が不足又は供給が制限されている。また、通常は血液製剤から抽出される血中蛋白質を作物植物のような代替源などを用いて生産することも望ましい。植物から血中蛋白質を生産することにより、血中蛋白質画分のヒトウイルスおよびヒトもしくは動物用血液製剤画分の中に存在する他の病気の原因となる媒介物による汚染が軽減される。
ヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン（「ＡＡＴ」）、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子（例えば第Ｖ−ＸＩＩＩ因子）などの血中蛋白質が数多くのヒトの病気に治療効力を有することが知られている。
ヘモグロビンは酸素を細胞に輸送する主要な血液成分分子である。哺乳動物のヘモグロビンは２個のα様ポリペプチドサブユニットと２個の非α（通常はβ、γもしくはδ）サブユニットで構成されている四量体蛋白質である。それらのサブユニットは主要アミノ酸配列の点で異なるが、それらの二次的および三次的構造は類似している。各グロビンサブユニットは酸素が結合するヘム基として知られるＦｅ２＋−ポルフィリン錯体に非共有相互作用により結合している。成体型赤血球中の主なヘモグロビンはヘモグロビンＡ１（ＨｂＡ）として知られるα２β２である。各ヘモグロビン四量体の分子量は６４ｋＤであり、そして各α様およびβ様鎖の分子量はそれぞれ約１５．７ｋＤ（１４１個のアミノ酸）および約１６．５ｋＤ（１４６個のアミノ酸）である。
【０００３】
ＡＡＴはセルピン阻害剤の種類に属していてヒト血漿の中に存在する主要プロテアーゼ阻害剤の１種である。ＡＡＴはアミノ酸数が３９４で分子質量が約５２ｋＤの単一ポリペプチドであり、この分子の天然ヒト形態では炭水化物を約１５％含有する。ヒト血漿中のＡＡＴ濃度は１０００〜３０００ｍｇ／Ｌの範囲であり、ヒト乳中での濃度は１００から４００ｍｇ／Ｌの範囲である。ＡＡＴの主要な生理学的役割は好中球エラスターゼの抑制であるが、不足した場合肺気腫の発生がもたらされる。エラスターゼの活性が過剰になると、気腫、肝炎およびいろいろな皮膚疾患がもたらされる。ＡＡＴがヒト好中球エラスターゼに対して示す結合親和力は最大であるが、また、ＡＡＴは膵臓のプロテアーゼ、例えばキモトリプシンおよびトリプシンなどにも親和性を示す。ＡＡＴ欠乏症の治療で現在行われている主な起点は、ヒト血漿からＡＡＴを単離することにある。
【０００４】
フィブリノゲンは血液凝固カスケードに関与していて、天然の凝固剤であるトロンビンと相互作用することでフィブリンに変化する。フィブリンが主要な血液凝固成分である。成熟したヒトフィブリノゲンは２対の３独立ポリペプチド鎖（α、βおよびγ）で構成されていて、前記３本の独立したポリペプチド鎖が２９個の分子内および分子間ジスルフィド結合で共に連結することで３４０ｋＤの天然蛋白質を形成しており、ヒト血漿中に約２５００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。個々のフィブリノゲンドメインの三次元構造分析によって、ヒトフィブリノゲンが多機能的役割を果たすことに対する重要な手掛かりを与える詳細な構造的特徴が発見された。フィブリノゲンの前記ポリペプチドはそれぞれ約７２ｋＤ（α）、５２ｋＤ（β）および４８ｋＤ（γ）であり、βポリペプチド鎖によって天然の分子組み立てが決まる。フィブリノゲンの構造は、フィブリノゲン、他の蛋白質、特定の細胞型との相互作用を助長しかつフィブリノゲンが血液凝固、炎症、血管形成、創縫合、動脈形成および腫瘍形成を包む数多くの重要な生理学的プロセスに参与することを可能にする、複数の結合部位を含有する構造的および機能的ドメインを数多く有することを特徴とする。凝固の観点によるフィブリン形成に天然のフィブリノゲンとその天然の凝固剤である第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンとの相互作用が介在するが、その相互作用は血液に可溶なカルシウムの存在下で起こる。
【０００５】
アルブミンは、哺乳動物の血清生物学でいろいろな機能、注目すべきは、ホルモンおよび他の可溶リガンドを部位から部位に運ぶ機能を果たし、また主として哺乳動物の一般的生物化学に寄与する他の活動を行う輸送蛋白質分子である。また、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）も血液の主要な蛋白質成分であり、これは約３０，０００〜５０，０００ｍｇ／Ｌの血清濃度で活動的に存在する。ＨＳＡは６６．５ｋＤの単一ポリペプチド鎖であり、これは最初に肝臓の中でプレプロアルブミン分子として合成され、そしてＮ−末端およびＣ−末端がゴルジプロセシングされた後に小胞体から放出される。その結果として生じる成熟した蛋白質の長さはアミノ酸５８５個分である。遺伝子組換えタバコの葉の中でＨＳＡの天然のプレプロシーケンスが植物細胞膜をまたがる的確な蛋白質標的／プロセシングで機能し得ることが示された（非特許文献１）。
【０００６】
血漿糖蛋白質であるプロトロンビンはセリンプロテアーゼトロンビンの酵素原であり、フィブリノゲンからフィブリンへの変換に触媒作用を及ぼすばかりでなく、血液凝固にとって重要であり得る他のいくつかの反応にも触媒作用を及ぼす。プロトロンビンは分子量が約７２，０００の大きさの単一ポリペプチド鎖である。完全なヒトトロンビンｃＤＮＡは６２２個のアミノ酸残基で構成されていて、３６個のアミノ酸残基で出来ているリーダー配列を包含する。活動的なトロンビンの見かけ分子量は３６，０００であり、これはプロトロンビンが開裂を起こす結果としてもたらされる２個のジスルフィドで連結しているポリペプチド鎖で構成されている。蛋白質分解が起こるとヒトプロトロンビンがインビトロで活性化されて活性のあるトロンビンに変化することが、極めて良好に特徴づけられている。
【０００７】
第Ｖ−ＸＩＩＩ因子は、血液凝固の古典的なカスケード機構の「固有の経路」に関与する蛋白質（大部分のプロテアーゼは活性状態にある）である。そのような分子は大部分が前駆体として存在していて、前記前駆体は秩序のある変換順でプロセシングされて、不活性な形態から触媒的に活性のある形態になる。第Ｖ因子はプロアクセレリン（促進性グロブリン）である一方、第ＶＩ因子は第Ｖ因子の活性形態である。第ＶＩＩ因子はプロコンバーチン、即ち血漿トロンボプラスチン成分である一方、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）および第ＩＸ因子（クリスマス抗血友病因子）は両方とも血友病状態に関連している。第Ｘ因子（Ｓｔｕａｒｔ−Ｐｏｗｅｒ因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆物質）および第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）は全部トロンビンの成熟／安定化に関与している。第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）は凝固過程中にフィブリンに直接作用する血漿トランスグルタミナーゼである。前記因子はすべて血清血漿中に比較的低濃度（０．００１から５０ｍｇ／Ｌ）で存在する。血液凝固カスケードに関与している他の蛋白質因子には、フレッチャー因子（プレカリクレイン）、フィッツジェラルド因子（キニノゲン）およびフォン・ヴィレブランド因子が含まれる。
【０００８】
ヒトに存在する免疫グロブリン（抗体）は患者が接触した可能性のあるいろいろな病原体に対して抵抗力を与える働きをする。免疫グロブリン分子はヒト血清中の質量の１５〜２０％を占めていて、主にＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ型の抗体で構成されており、これらは、血液系および潜在的に体の残りの部分に侵入して来るいろいろな感染症との戦いに関与している。ＩｇＧ型の抗体が最も優勢で６〜１８ｇ／Ｌの血清濃度で存在する。血液系はまた、結果として起こる感染および潜在的腫瘍標的に対抗する目的で、そのような分子を体の特定領域に向かわせる担体としても働く。成熟した抗体は２個のポリペプチド（軽および重鎖）で構成されており、それらが機能的実体を形成するため等モル量で発現して一緒になる必要がある。軽鎖（〜２５ｋＤ）はアミノ酸〜２１０−２４０個分の長さを有する蛋白質である一方、重鎖（〜５０ｋＤ）はアミノ酸〜４５０−４６０個分の長さを有する蛋白質である。軽鎖および重鎖は共にプロセシングされて血液の流れの中に分泌されるようにシグナルペプチドを有する。２種類の遺伝子が発現し、２種類の蛋白質が合成されそして四量体蛋白質が正確に組み立てられる結果として機能的抗体がもたらされる必要があるため、植物の中で起こるモノクローナル抗体の発現に特に関心が持たれている。
植物における抗体に関する初期の研究は、ＩｇＧ抗体の種類に焦点が当てられていた（非特許文献２、３）が、より最近の研究で複雑な抗体分子、例えば分泌型ＩｇＡ抗体（４個の遺伝子）およびより複雑な抗体形態の植物内発現が研究されている（非特許文献４、５）。
【０００９】
遺伝子組換えタバコ植物の葉の中に抗体分子を産生させることが特許文献１、２、３および４（全部関連した特許である）に開示されている。
タバコ植物の葉、幹、花および根の中に免疫グロブリン含有保護蛋白質を産生させることが、特許文献５に開示されている。
タバコ植物の色素体の中に抗体を産生させることが、特許文献６に開示されている。
遺伝子組換え植物の中に異種蛋白質を商業的に産生させるに適するように制御した環境の農業用生物反応器が、特許文献７に開示されている。この特許文献７には哺乳動物血中蛋白質の産生を達成可能であることが開示されている。実施例７にジャガイモ、タバコおよびアルファルファ植物の葉の中にヒト血液因子を産生させることが開示されている。
タバコ植物の葉の中にヘモグロビンおよびミオグロビンを産生させることが、特許文献８に開示されている。実施例Ｘに組換え型ヘモグロビンをタバコの種子から抽出して、ある程度精製することが開示されている。同時発現プラスミドｐＢＩＯＣ５９の形質転換でそのような発現を得ているが、前記ｐＢＩＯＣ５９は葉緑体の中で標的に向かうように構築されており、その目的のため、ピスム・サチブムＬ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ）のリブロース１，５−ジホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットの前駆体のトランジットペプチドを含有している。種子において、抽出される可溶蛋白質全体を基準にした組換え型ヘモグロビンの最大濃度が０．０５％である度合の発現が起こると報告された。
【００１０】
特許文献８の実施例ＸＩに、トウモロコシの種子の中で構成的発現またはアルブミン中の発現が起こるように、ヘモグロビンのαまたはβ鎖の一方を含有させたプラスミドの構築が開示されている。特許文献８によれば、ヘモグロビン鎖の構成的またはアルブミン特異的発現を起こさせるには以下の調節配列が必要であった。構成的発現を可能にする３種類のプロモーター［（ｉ）プラスミドｐＡｃｔ１−Ｆ４の中に含まれているイネアクチンプロモーターに続くイネアクチンイントロン、（ｉｉ）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ二重構成プロモーター、または（ｉｉｉ）プラスミドｐｙ６３の中に含まれているトウモロコシｙゼイン遺伝子のプロモーター］の中の１つそして２種類のターミネータ［（ｉ）３５ＳポリＡターミネータまたは（ｉｉ）ＮＯＳポリＡターミネータ］の中の１つである。そのようなプラスミドの形質転換または発現をトウモロコシまたはトウモロコシの種子の中で起こさせることに関しては、実験もデータも示されていない。
菜種およびタバコ植物の中で起こる種子油の発現に影響を与えて、それを変える目的でブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｃｉｃａ ｎａｐｕｓ）のＡＣＰから得た種子特異的プロモーターの使用が特許文献９に開示されている。特許文献９には、血液因子またはヒト血清アルブミンなどの薬学的蛋白質の発現のためそのような種子特異的プロモーターを用いることができることが一般的に開示されてはいるが、しかしながら、それに関して如何なる実験データも示されていない。
【００１１】
非特許文献６は、植物の中に抗体および蛋白質を産生させることを包含する医学的分子養殖分野における最近の進展を考察している総論である。
ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に高収率で産生させることは、前記特許または前記出版物のいずれにも開示されていない。特別な血中蛋白質を投与することによって治療可能な状態のヒトを治療しようとする時に、そのような蛋白質を患者集団に充分な供給量で供給することができるように、汚染源物が入っていないヒト血中蛋白質を高収率で生産することが望ましい。
【特許文献１】米国特許第６，４１７，４２９号
【特許文献２】米国特許第５，９５９，１７７号
【特許文献３】米国特許第５，６３９，９４７号
【特許文献４】米国特許第５，２０２，４２２号
【特許文献５】米国特許第６，３０３，３４１号
【特許文献６】公開された米国特許出願２００２／０１７４４５３
【特許文献７】公開された米国特許出願２００２／００４６４１８
【特許文献８】米国特許第６，３４４，６００号
【特許文献９】米国特許第５，７６７，３６３号
【非特許文献１】シズモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ）他、１９９０年
【非特許文献２】ヒアット（Ｈｉａｔｔｅ）他、１９８９年
【非特許文献３】ヒアット（Ｈｉａｔｔｅ）およびマー（Ｍａ）、１９９２年
【非特許文献４】マー (Ｍａ)他、１９９５年
【非特許文献５】ヴァイン（Ｖｉｎｅ）他、２００１年
【非特許文献６】ダニエル（Ｄａｎｉｅｌｌ）他、２００１年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの局面は、組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法を包み、この方法は、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していてこれと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする、単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法である。
【００１３】
本発明は、また、本方法で得た精製ヒト血中蛋白質も包含する。前記ヒト血中蛋白質は好ましくは１種以上の植物グリコシル基を含有する。
本発明は、また、本発明の方法で得た収穫した種子から調製した単子葉植物種子製品、好ましくは全種子、粉、抽出物およびモルトから選択した単子葉植物種子製品も提供する。好ましくは、前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する。
本発明は、更に、精製ヒト血中蛋白質、好ましくは少なくとも１種の植物グリコシル基を含有する精製ヒト血中蛋白質および少なくとも１種の薬学的に受け入れられる賦形剤または栄養素を含んで成る組成物も提供し、前記ヒト血中蛋白質はヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列を含有する単子葉植物の中で産生され、前記単子葉植物から収穫した種子から精製したものである。前記栄養素は前記単子葉植物以外の原料から採ったものである。このような調合物を非経口、腸内、吸入、鼻内または局所送達の目的で用いることができる。
本発明の以下の詳細な説明を添付図および請求の範囲と合わせて読むことで、本発明の前記および他の目的および特徴がより詳細に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
特に明記しない限り、本明細書で用いる用語は全部以下に示す意味を有するか、或は一般的に当業者にとって当該用語が持つ意味に一致する。実施者は、技術的定義及び表現に関し、特にサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（１９８９年）モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コールド スプリング ハーバー プレス、ニューヨーク州プレインビュー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）、オースベル エフエム（Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ）他（１９９３年）カレント プロトコルズ イン モレキュラー バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー アンド サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）およびヘルフィン（Ｇｅｌｖｉｎ）およびスヒルペロー（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）編集（１９９７年）プラント モレキュラー バイオロジー マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）、クルウェール アカデミック パブリッシャーズ、オランダ国（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が参考になるであろう。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態でもよく、これらにはメッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。そのようなＤＮＡは二本鎖または一本鎖でもよく、そして一本鎖の場合にはコード鎖または非コード（アンチセンス、相補）鎖でもよい。
植物細胞を言及する時の用語「安定に形質転換された」は、その植物細胞がゲノムの中に一体化されている外来（異種）核酸配列を有していてそれが二世代以上に亘って保持されることを意味する。
「宿主細胞」は、ベクターを含有しかつ異種核酸配列の複製および／または転写および／または発現を支援する細胞を意味する。本発明による宿主細胞は単子葉植物細胞が好ましい。ＤＮＡを所望植物宿主細胞に移動させるための細菌、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞のような他の宿主細胞を二次的宿主として用いることも可能である。
「植物細胞」は、植物に由来する細胞のいずれかを指し、未分化組織（例えばカルス）ばかりでなく植物の種子、花粉、珠芽、胚、懸濁培養物、分裂領域、葉、根、芽、配偶体、胞子体および小胞子が含まれる。
【００１６】
用語「成熟した植物」は完全に分化した植物を指す。
用語「種子製品」には、これらに限定するものでないが、種子画分、例えば皮が剥かれた全種子、粉（製粉によって皮が剥かれかつ粉末になるまで粉砕された種子）、種子抽出物、好適には蛋白質抽出物（粉の蛋白質画分を炭水化物画分から分離した場合）、モルト（モルト抽出液またはモルトシロップを包含）および／または遺伝子組換え穀類から得られた精製蛋白質画分が含まれる。
用語「生物学的活性」は、本分野の技術者が当該蛋白質に典型的に帰すると考えるいかなる生物学的活性をも指す。
用語「血中蛋白質」は、正常なヒト血液に存在する１種以上の蛋白質またはそれらの生物学的に活性なフラグメントを指し、ヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、プロトロンビン／トロンビン、抗体、血液凝固因子（第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フレッチャー因子、フィッツジェラルド因子およびフォン・ヴィレブランド因子）およびそれらの生物学的に活性なフラグメントが含まれるが、これらに限定するものではない。
用語「非栄養的」は、主要な効果として受容者に栄養を与えることのない薬学的に受け入れられる賦形剤を指す。好ましくは、その賦形剤は腸に送達される調合物に下記のうちの一つの役割を提供する。治療用蛋白質用の担体として働くこと、消化管の中で当該蛋白質を酸から保護すること、送達すべき活性材料を持続放出させること、または当該血中蛋白質を当該患者に投与するに有用な品質を当該製剤に与えることである。
【００１７】
「単子葉植物種子成分」は、単子葉植物の種子、典型的には成熟した単子葉植物の種子から抽出可能な炭水化物、蛋白質および脂質成分を指す。
「種子成熟」は、受精から出発して代謝貯蔵物、例えば糖、オリゴ糖、澱粉、フェノール成分、アミノ酸および蛋白質などが種子（穀類）の中のいろいろな組織、例えば胚乳、種皮、アリューロン層および小鱗片上皮などに空胞標的の有り無しで蓄積する結果として起こる種子の増大、登熟そして種子の乾燥で終わる期間を指す。
「成熟特異的蛋白質プロモーター」は、種子成熟中に実質的に上方調節される活性（２５％を超える度合で）を示すプロモーターを指す。
「異種ＤＮＡ」は、植物細胞の中に別の源から導入されたか或はある植物源（同じ植物源を包含）に由来するが異種ＤＮＡの発現を正常には調節しないプロモーターの制御下にあるＤＮＡを指す。
「異種蛋白質」は、異種ＤＮＡがエンコードする蛋白質である。
「シグナル配列」は、Ｎ末端もしくはＣ末端ポリペプチド配列であり、結合されるペプチドまたは蛋白質が選択された細胞内もしくは細胞外領域にあると特定するのに有効である。本発明によれば、好ましくは、シグナル配列は結合されたペプチド又は蛋白質を胚乳細胞、より好ましくは細胞内空胞または他の蛋白質貯蔵体、葉緑体、ミトコンドリアまたは小胞体などの胚乳細胞小器官、または細胞外空間部のような位置に宿主細胞からの分泌後に配置させることを目標とする。
【００１８】
本発明で用いるに適した発現ベクターは、植物の中で関連した上流および下流配列と一緒になって機能するように考案したキメラ核酸構築物（または発現ベクターまたはカセット）である。
一般的に、本発明の実施で用いる発現ベクターは、キメラ遺伝子を構成する下記の機能的にリンクした成分を含む。熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、前記プロモーターと機能的にリンクしていて、リンクしたポリペプチドが胚乳細胞、好ましくは蛋白質貯蔵体などの胚乳細胞の小器官を標的にすることが可能な単子葉植物種子特異的シグナル配列（例えばＮ末端リーダー配列またはＣ末端トレーラ配列）をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中でリンクしていてヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列である。好ましくは、前記シグナル配列が植物細胞の中で前記ヒト血中蛋白質から開裂するようにする。
次に、前記キメラ遺伝子は通常適切な植物形質転換用ベクターの中に配置される。前記ベクターは、（ｉ）前記キメラ遺伝子の上流および／または下流に位置する伴配列（これはプラスミドまたはウイルスが源になっておりかつ当該ベクターがＤＮＡを細菌から所望の植物宿主に移動させることを可能にするに必要な特徴を前記ベクターに与える）、（ｉｉ）選択可能マーカー配列、および（ｉｉｉ）転写終結領域（これは一般に当該ベクターの転写開始調節領域とは反対側の末端部に位置する）を有する。
【００１９】
本技術分野ではいろいろな植物宿主細胞に適した数多くの種類の発現ベクターおよび適切な調節配列が知られている。種子成熟条件下で誘導可能な様式で調節されるようにプロモーター領域を選択する。本発明のそのような実施例の１つの面において、本発現構築物は、種子成熟中に特異的に上方調節される活性を示すプロモーターを含む。本発明で用いるプロモーターは、通常、イネ、大麦、小麦、カラスムギ、ライムギ、トウモロコシ、粟、ライ小麦またはソルガムなどの穀類に由来するプロモーターである。そのようなプロモーターの例には、下記の成熟特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の中の１つと関連する成熟特異的プロモーター領域が含まれる。それらは、イネのグルテリン、オリジンおよびプロラミン、大麦のホルデイン、小麦のグリアジンおよびグルテリン、トウモロコシのゼインおよびグルテリン、カラスムギのグルテリン、およびソルガムのカフィリン、粟のペニセチンおよびライムギのセカリンである。そのような遺伝子に由来する代表的な調節領域の例はＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６〜１４である。特にそのようなプロモーターを転写因子と協力させて用いる場合、種子成熟における発現に適した他のプロモーターには大麦の胚乳特異的Ｂ１−ホルデインプロモーター、ＧｌｕＢ−２プロモーター、Ｂｘ７プロモーター、Ｇｔ３プロモーター、ＧｌｕＢ−１プロモーターおよびＲｐ−６プロモーターが含まれる。
【００２０】
植物種子組織の中で優先的に発現するプロモーターを用いてヒト血中蛋白質をエンコードする核酸を発現させることに特に関心が持たれている。そのようなプロモーター配列の例には、植物貯蔵蛋白質遺伝子をエンコードする配列に由来する配列または脂肪種子の中で起こる脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来する配列が含まれる。好ましい典型的プロモーターには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で例示するような胚乳の外側層の中で遺伝子発現を起こすグルテリン（Ｇｔ１）プロモーター、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で例示するような胚乳の中心部で遺伝子発現を起こすグロブリン（Ｇｌｂ）プロモーターが含まれる。プロモーター配列は自身と機能的にリンクした遺伝子コード配列の転写を制御し、それらの中には、天然に存在するプロモーター又は種子特異的転写を方向付けし得る天然プロモーターの領域と、２種以上のプロモーター要素が組み合わされているハイブリッドプロモーターとが含まれる。そのようなハイブリッドプロモーターを構築する方法は本技術分野で良く知られている。
【００２１】
ある場合には、プロモーターは本キメラ核酸構築物を導入すべき植物細胞と同じ植物種に由来する。別の実施例では、プロモーターは植物宿主細胞とは異種である。
別法として、ある種類の単子葉植物に由来する種子特異的プロモーターを用いて異なる単子葉植物または穀類以外の単子葉植物に由来する核酸コード配列の転写を調節することも可能である。
重要な蛋白質をエンコードすることに加え、本発現カセットまたは異種核酸構築物は、必要に応じて、当該蛋白質のプロセシングおよび転位を可能にするシグナルペプチドをエンコードするＤＮＡを含有する。典型的なシグナル配列は、単子葉植物成熟特異的遺伝子に関連した配列であり、それらは、グルテリン、プロラミン、ホルデイン、グリアジン、グルテニン、ゼイン、アルブミン、グロブリン、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、澱粉合成酵素、分枝酵素、Ｅｍおよびリー(ｌｅａ)である。蛋白質貯蔵体用のシグナルペプチドをエンコードする典型的な配列を本明細書ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１５〜２１として識別する。
【００２２】
１つの好適な実施例における方法は、蛋白質を胚乳細胞、好ましくは蛋白質貯蔵体、ミトコンドリア、小胞体、空胞、葉緑体または他の色素体コンパートメントなどの胚乳細胞の小器官の中に局在化させることに向けたものである。例えば、蛋白質が葉緑体などの色素体を標的にする時には、発現を起こす目的で、本構築物は、当該遺伝子産物を当該色素体に向かわせる配列も使用する。そのような配列を本明細書では葉緑体運搬ペプチド（ＣＴＰ）または色素体運搬ペプチド（ＰＴＰ）と呼ぶ。このように、重要な遺伝子が葉緑体の中に直接挿入されない時には、本発現構築物は追加して重要な遺伝子が葉緑体に向かうようにする運搬ペプチドをエンコードする遺伝子も含有する。葉緑体運搬ペプチドは重要な遺伝子、或はＣＴＰを有する異種配列から得られ、本技術分野で公知である。例えばスミーケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）他、１９８６年；ワスマン（Ｗａｓｍａｎｎ）他、１９８６年、ボン ヘイジン（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）他、１９９１年、米国特許第４，９４０，８３５号および５，７２８，９２５号を参照のこと。また、当該蛋白質を小胞体（ＥＲ）に転位させるに適した追加的運搬ペプチド（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、１９９１年；ヴィターレ（Ｖｉｔａｌｅ）およびクリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、１９９２年）、核内保留シグナル（シレー（Ｓｈｌｅｈ）他、１９９３年；ヴァラゴナ（Ｖａｒａｇｏｎａ）他、１９９２年）または空胞（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）およびクリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）１９９２年；ベドナレック（Ｂｅｄｎａｒｅｋ）およびライケル（Ｒａｉｋｅｌ）、１９９２年；また米国特許第５，３６０，７２６号も参照）を本発明の構築物で用いることも可能である。
【００２３】
別の典型的な種類のシグナル配列は、種子発芽中にアリューロン細胞が異種蛋白質を分泌するのを助長するに有効な配列であり、それには、アルファ−アミラーゼ、プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ、（１−３）−ベータ−グルカナーゼ、（１−３）（１−４）−ベータ−グルカナーゼ、エステラーゼ、酸性ホスファターゼ、ペントサミン、エンドキシラナーゼ、β−キシロピラノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、（１−６）−ベータ−グルカナーゼ、ペリオキシダーゼおよびリソホスホリパーゼに関連したシグナル配列が含まれる。
いろいろな蛋白質貯蔵用蛋白質が成熟特異的プロモーターの制御下にあり、かつそのようなプロモーターを蛋白質体を標的にするシグナル配列と機能的にリンクさせることから、本キメラ遺伝子を構築する時、プロモーター配列とシグナル配列を単一の蛋白質貯蔵遺伝子から単離した後に血中蛋白質と機能的にリンクさせてもよい。１つの好ましい典型的プロモーター−シグナル配列は、イネのＧｔ１遺伝子に由来する配列であり、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で識別する典型的な配列を有する。別法として、プロモーター配列とリーダー配列を異なる遺伝子から得ることも可能である。１つの好ましい典型的プロモーター−シグナル配列組み合わせは、イネのＧｔ１リーダー配列にリンクさせたイネのＧｌｂプロモーターであり、これの例はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７である。
好ましくは、植物の中で機能するように考案した発現ベクターもしくは異種核酸構築物は、発現カセットの上流および下流に伴配列を含有する。伴配列はプラスミドまたはウイルスが源の配列であり、当該ベクターがＤＮＡ、例えば複製起源と選択可能マーカーを含有する配列などを二次的宿主から植物宿主に移動可能とするのに必要な特徴を前記ベクターに与える。典型的な二次的宿主には細菌および酵母が含まれる。
１つの実施例における二次的宿主は大腸菌であり、複製起源はＣｏｌＥ１型であり、そして選択可能マーカーはアンピリシン耐性をエンコードする遺伝子である。そのような配列は本技術分野で良く知られておりかつ同様に商業的に入手可能である[例えばクロンテック社、カリフォルニア州パロアルト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）；ストラタジーン社、カリフォルニア州ラホラ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）]。
【００２４】
転写終結領域は、通常に転写開始領域と結合している遺伝子、或は異なる遺伝子から取ることが可能である。典型的な転写終結領域にはアグロバクテリウムＴｉプラスミドに由来するＮＯＳターミネータおよびイネα−アミラーゼターミネータが含まれる。
また、高レベルの転写および妥当な転写終結のそれぞれを最適にする目的で本発現カセットにポリアデニル化テールを付加させることも可能である。ポリアデニル化配列には、これらに限定するものでないが、アグロバクテリウムオクトピン合成酵素シグナルまたは同じ種のノパリン合成酵素が含まれる。
植物細胞における選択に適切な選択可能マーカーには、これらに限定するものでないが、カナマイシン（ｎｐｔｌｌ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラシクリンなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。追加の選択可能マーカーには、ビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子、グリホセート耐性をエンコードする変異ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子、ブロモキシニル耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子、イミダゾリノンもしくはスルホニル尿素耐性を与える変異アセトラクテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）、およびメトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子が含まれる。
用いる個々のマーカー遺伝子は、当該ＤＮＡを導入しなかった細胞に比較して形質転換細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子である。好ましくは、それらは組織培養段階における選択を助長する選択可能マーカー遺伝子、例えばカナマイシン、ヒグロマイシンもしくはアンピシリン耐性遺伝子などである。
【００２５】
また、本発明のベクターを修正して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクターに相同性を示す領域と、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴ−ＤＮＡ境界領域とキメラ遺伝子または発現カセット（上述のもの）を含有する中間的植物形質転換用プラスミドを含有させることも可能である。その上、本発明のベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンスの武装解除した植物腫瘍誘発プラスミドを含有することも可能である。
一般的には、選択した核酸配列は本ベクターの中の適切な制限エンドヌクレアーゼの一部分或いは複数の部位の中に挿入される。本発明で用いるベクターを構築する時、当業者に公知の切断、連結反応そして二次的宿主細胞への形質転換の標準的な方法を用いる（一般的に、前記マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、およびヘルフィン（Ｇｅｌｖｉｎ）他を参照）。
植物の細胞または組織は発現構築物［例えば関心のある遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡのような異種核酸構築物］と共にいろいろな標準的技術を用いて形質転換される。植物遺伝子発現の向上を助長する目的でベクターを有効に導入することが本発明の重要な面である。そのようなベクターの配列が安定に形質転換されること、好適には宿主のゲノムの中に一体化されるのが好ましい。
【００２６】
宿主植物細胞の形質転換の方法は本発明にとって重要ではない。当業者は、本分野の技術には多様な形質転換技術が存在し、かつ新規な技術が継続的に利用できるようになることを認識しているであろう。標的宿主植物に適切な如何なる技術も本発明の範囲内で使用可能である。例えば、本構築物はいろいろな形態で導入可能であり、そのような形態には、これらに限定するものでないが、ＤＮＡストランド、プラスミドまたは人工染色体が含まれる。本構築物の標的植物細胞への導入はいろいろな技術を用いて達成可能であり、そのような技術には、これらに限定するものでないが、燐酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、原形質融合またはミクロプロジェクタイルボンバードメント（クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）、１９９２年；サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）他、１９９３年）が含まれる。当業者は、詳細について文献を参考にし、本発明の方法の使用に適した技術を選択することが可能である。
植物細胞の形質転換にアグロバクテリウムを用いる場合、ベクターをアグロバクテリウム宿主の中に導入して、アグロバクテリウム宿主の中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉもしくはＲｉプラスミドによる相同的組換えを起こさせる。組換え用Ｔ−ＤＮＡを含有するＴｉもしくはＲｉプラスミドを武装させる（こぶの形成を可能にする）、又は武装解除させる（こぶの形成を不可能にする）ことが可能であるが、形質転換アグロバクテリウム宿主の中にｖｉｒ遺伝子が存在する限り、後者が許容される。武装したプラスミドを用いると正常な植物細胞とこぶの混合物が生じ得る。
【００２７】
アグロバクテリウムが宿主植物細胞の形質転換の際媒体として用いられる場合には、単数または複数のＴ−ＤＮＡ境界領域に隣接している発現もしくは転写用構築物は、大腸菌およびアグロバクテリウムの中で複製し得る広範宿主範囲ベクターの中に挿入されるが、ｐＲＫ２またはこれの誘導体などが広範宿主範囲ベクターの例として文献に記述されている。ディッタ（Ｄｉｔｔａ）他、１９８０年およびＥＰＡ ０ １２０ ５１５の文献を参照のこと。あるいは、植物細胞の中で発現される配列を個別の複製配列を含むベクターの中に挿入することも可能であるが、個別の複数配列の一方は大腸菌内でベクターを安定させ、他方はアグロバクテリウム内でベクターを安定させる。マックブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ）およびサマーフェルト（Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ）１９９０年を参照すると、複製起源であるｐＲｉＨＲＩ（ジュアニン（Ｊｏｕａｎｉｎ）他、１９８５年）が用いられ、宿主アグロバクテリウム細胞における植物の発現ベクターの安定性を増加させる。
本発現構築物に組み込むＴ−ＤＮＡは、形質転換アグロバクテリウムと形質転換植物細胞の選択を可能にする１種以上の選択可能マーカーコード配列である。植物細胞に関する使用に適した抗生物質耐性マーカーが数多く開発されており、それらには、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシン等の抗生物質を不活性にする遺伝子が含まれる。使用する個々のマーカーは本発明にとって必須ではなく、好適な個々のマーカーは個々の宿主および構築様式に依存する。
【００２８】
植物細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換では、外植片はアグロバクテリウムと共に結果として感染がもたらされるに充分な時間インキュベートし、細菌を殺した後、植物細胞を適切な選択用培地の中で培養する。カルス形成後、公知方法に従って適切な植物ホルモンを用いることで芽形成を促すことも可能で、その後芽を発根用培地に移して植物を再生させる。次に、その植物を生育させて結実させた後、その種子を用いて世代の繰り返しを確立しそして前記植物が産生した組換え型蛋白質を単離する。
２種以上の発現構築物を含有する植物細胞を得る方法は、数多く存在する。１つの方策として、植物細胞は１番目の構築物と２番目の構築物を単一の形質転換用ベクターの中に含有させるか或はその中の１つが所望遺伝子を発現する個別のベクターを用いることにより、両方の発現構築物で同時形質転換される。２番目の構築物はすでに１番目の発現構築物で形質転換された植物の中に導入されるか、或は別法として、１つが１番目のそして１つが２番目の構築物を有する形質転換植物を交雑させることで前記構築物を同じ植物の中に共に持ち込むことも可能である。
【００２９】
好ましい実施例において、本発明の方法で用いる植物はイネ科として知られる分類学的科の員に由来する植物である。それはイネ科の員全部を含み、その中で食用品種は穀類として知られる。そのような穀類には非常に多様な種、例えば小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｓ．）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓｐｓ．）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｓ．）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓｐｓ．）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｓｐｓ．）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（Ｚｅａ ｓｐｓ．）および粟（Ｐｅｎｎｉｓｑｔｔｕｍ ｓｐｓ．）などが含まれる。本発明の実施に好適な穀類はイネ、小麦、トウモロコシ、大麦、ライ麦およびライ小麦であり、イネが最も好ましい。
ヒト血中蛋白質を種子の中に発現する遺伝子組換え植物を生産する目的で、単子葉植物の細胞またはそれから得た組織はヒト血中蛋白質のコード配列を含んで成る発現ベクターで形質転換される。その遺伝子組換え植物細胞を適切な選択剤を含む培地の中で培養することで、異種核酸配列を発現する植物細胞を識別して選択する。異種核酸配列を発現する植物細胞を選択した後、選択した遺伝子組換え植物細胞から全植物体を再生させる。形質転換植物細胞から全植物体を再生させる技術は本技術分野で一般に公知である。遺伝子組換え植物株、例えばイネ、小麦、トウモロコシまたは大麦などを育成させそして通常の植物繁殖技術を用いて遺伝的交雑を行ってもよい。
【００３０】
形質転換植物細胞を選別し、選択剤濃度が閾値の選択培地の中で培養可能かどうかを調べる。通常、選択培地の上または中で増殖した植物細胞は新しく供給した同じ培地に移され再び培養される。次に、その外植片を再生条件下で培養することで再生した植物芽を生じさせる。芽形成後、その芽を選択的発根用培地に移すことで完全な植物体を生じさせる。次に、その植物体を生育させて結実させ、切り取ることなどで、形質転換植物を繁殖させることも可能である。そのような方法は植物細胞の効率良い形質転換そして組換え型ヒト血中蛋白質を産生し得る遺伝子組換え植物の再生を可能にする。
組換え型ヒト血中蛋白質の発現は標準的分析技術、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、ＨＰＬＣ、ＮＭＲまたは質量分析などを用いることに加えて、発現させるべき個々の蛋白質に特異的な生物学的活性を検定することで立証可能である。
本発明はまた、植物細胞の中に組換えて産生した精製血中蛋白質、好ましくは宿主植物細胞が実質的に汚染されておらず、かつ好適には少なくとも１種の植物グリコシル基を含有する血中蛋白質も提供する。植物グリコシル基は、血中蛋白質が植物の中に産生されたことを示すと同時に、適用される治療事情のいずれにおいても血中蛋白質の生物学的活性を著しく損ねることはない（組換のないヒト血中蛋白質と比較した時の活性損失度合は好適には２５％未満であり、より好ましくは１０％未満である）。本発明のいくつかの実施例によれば、通常、ヒト血中蛋白質は遺伝子組換え植物から収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約０．５％、少なくとも約１．０％または少なくとも約２．０％を構成する。しかしながら、好ましい実施例における蛋白質発現は以前に報告された発現よりもずっと高い、即ち少なくとも約３．０％であり、よって、商業的生産の実現性が極めて高い。蛋白質の発現は可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％でさえあるのが好ましい。
【００３１】
本発明は、その収穫した種子から製造した植物種子製品も包含する。好ましくは、ヒト血中蛋白質は本種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％、より好適には少なくとも約５．０％、最も好ましくは少なくとも約１０．０％を構成する。本図に示すように、ＡＡＴに代表される米粒中のヒト血中蛋白質、３種類のフィブリノゲンポリペプチドおよびＨＳＡの発現は可溶蛋白質全体の少なくとも約１０％を占める。
本発明は、また、単子葉植物の種子の中に組換えて産生したヒト血中蛋白質を含んで成る組成物、及びその組成物を製造する方法も提供する。本発明の実施において、ヒト血中蛋白質はその核酸コード配列を発現する遺伝子組換え植物の種子または粒の中に産生される。発現後、血中蛋白質を実質的に未精製形態（即ち、当該組成物の少なくとも２０％が植物材料を含んで成る）で患者に提供するか、或はその血中蛋白質を成熟した種子の製品（例えば、粉、抽出物、モルトまたは全種子など）から単離または精製しそして調合することで患者に提供することも可能である。
そのような組成物には、意図される送達の種類に適した配合物が含まれる。送達の種類には、非経口、腸内、吸入、鼻内または局所送達などが含まれる。非経口送達には、静脈内、筋肉内または座薬などが含まれ、腸内送達には、ピル、カプセル、または他の非栄養的な薬学的に許容可能な賦形剤で作られた製剤、または例えば蛋白質が作られる穀類の抽出液内のような遺伝子組換え植物に由来する栄養素、あるいは遺伝子組換え植物以外の源に由来する栄養素を含む組成物を経口投与することなどが含まれる。そのような栄養素には、塩、糖、ビタミン、鉱物、アミノ酸、ペプチド、そして当該ヒト血中蛋白質以外の蛋白質などが含まれる。鼻内および吸入送達システムには、鼻孔または口の中に入れるスプレーまたはエーロゾルが含まれる。局所送達には、クリーム、局所的スプレーまたは軟膏などが含まれる。好ましくは、そのような組成物は実質的に遺伝子組換え植物の汚染物を含まず、植物材料含有量を好適には２０％未満、より好適には１０％未満、最も好適には５％未満にする。好適な投与経路は腸内であり、組成物は非栄養的であるのが好ましい。
血中蛋白質は、前記種子製品から粉砕、濾過、加熱、加圧、塩抽出、蒸発またはクロマトグラフィーなどの方法で精製可能である。
【００３２】
本発明に従って産生させるヒト血中蛋白質はまた、対立遺伝子変異体或は合成変異体であるかに拘わらずあらゆる変異体を含む。「変異」ヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列は、天然の血中蛋白質配列からの１個以上のアミノ酸により変化される変異ヒト血中蛋白質アミノ酸配列をエンコード可能であり、少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されるのが好ましい。変異体をもたらす核酸の置換、挿入または欠失は、エンコードされるアミノ酸配列が天然のヒト血中蛋白質の生物学的活性と実質的に同じ活性を維持している限り、配列内のいずれかの残基において発生する可能性がある。別の実施例では、変異ヒト血中蛋白質核酸配列は天然の配列と同じポリペプチドをエンコードし得るが、遺伝子コードが縮重していることが理由で、変異体は天然のポリヌクレオチド配列からの１個以上の塩基により変化される核酸配列を有する。
変異核酸配列は、「保存」置換を含む変異アミノ酸配列をエンコード可能であり、前記保存置換においては、置換されたアミノ酸は置換する前のアミノ酸と同様な構造的または化学的特性、及び自然界に見られる相同蛋白質における物理化学的アミノ酸側鎖特性および高置換度を有する（標準的ＤａｙｈｏｆｆフレクエンシーエクスチェンジマトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスなどで測定したもの）。加えて、或は別法として、変異核酸配列は、「非保存」置換を含む変異アミノ酸配列をエンコード可能であり、前記非保存置換においては、置換されたアミノ酸は置換する前のアミノ酸と異なる構造的または化学的特性を有する。当業者に一般的に知られているように、標準的置換の種類には自然界に見られる相同蛋白質が示す共通の側鎖特性および最大置換度を基にした６種類のアミノ酸が含まれ、変異ヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列を発展させるのに用いられる。
【００３３】
当業者に理解されるように、ある場合には、天然には存在しないコドンを持たせたヒト血中蛋白質をエンコードするヌクレオチド配列を用いるのも有利と考えられる。個々の真核細胞宿主に好適なコドンは、例えばヒト血中蛋白質発現速度を速めるため、または天然に存在する配列がもたらす転写物よりも半減期が長いといったような望ましい特性を有する組換え型ＲＮＡ転写産物を生産するために選択される。例として、イネの中で発現させた遺伝子のコドンでは３番目のコドン位置の中のグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）が豊富であることが示されている（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、１９９０年）。低いＧ＋Ｃ含有量から高いＧ＋Ｃ含有量に変えると大麦粒の中の外来蛋白質遺伝子の発現レベルが高くなることが分かっている（ホーバス（Ｈｏｒｖａｔｈ）他、２０００年）。本発明で用いる血中蛋白質をエンコードする遺伝子は、イネ遺伝子コドンバイアス（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、１９９０年）を遺伝子クローニング用の適切な制限部位と共に用いることを基にしたオペロン技術［カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）］を用いて合成された。これらの「コドン最適化」遺伝子を種子指向単子葉植物発現用の調節/分泌配列と連結させた後、これらのキメラ遺伝子を適切な植物形質転換用ベクターの中に挿入した。
【００３４】
ヒト血中蛋白質をエンコードするヌクレオチド配列は、これらに限定するものでないが、細胞によるヒト血中蛋白質のクローニング、プロセシングおよび／または発現を修正する変化を含む様々な理由で、ヒト血中蛋白質コード配列を変えるために操作される。
異種核酸構築物は所定のヒト血中蛋白質のコード配列を含むことが可能であるが、それは（ｉ）孤立した状態、（ｉｉ）ヒト血中蛋白質コード配列が主要なコード配列である融合蛋白質またはシグナルペプチドのような追加的コード配列と組み合わされた状態、（ｉｉｉ）コード配列を適切な宿主の中で発現させるに有効である、イントロン、或いはプロモーターやターミネータ要素もしくは５’および／または３’非翻訳領域を始めとする制御要素等の非コード配列と組み合わされた状態、および／または（ｉｖ）ベクター或いはヒト血中蛋白質コード配列が異種遺伝子である宿主環境の中に存在する状態で含むことが可能である。
発現構築物は、意図した用途に応じて、ヒト血中蛋白質全体をエンコードする核酸配列か或はその一部を含有可能である。例えば、プローブとして用いられる構築物にヒト血中蛋白質配列を用いる場合は、高度に保存されているヒト血中蛋白質領域をエンコードすることが確認されている配列のようなヒト血中蛋白質エンコード配列の特別な部分のみを含む構築物を調製する方が有利と思われる。
【００３５】
本発明は、１つの実施例において、成熟した単子葉植物種子から得た粉、抽出物またはモルト及び種子が産生した１種以上のヒト血中蛋白質を未精製形態で含有する種子組成物を提供する。そのような粉から血中蛋白質を単離することに伴い、種子を粉砕して粉にし、その粉を緩衝水溶液で抽出しそして場合に応じて抽出物を部分的に濃縮および／または不要な成分を除去することで抽出組成物を形成することが可能である。好ましい方法では、イネの種子のような成熟した単子葉植物種子を粉砕して粉にした後、その粉を食塩水または燐酸塩緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、重炭酸アンモニウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液またはトリス緩衝液のような緩衝液に入れて懸濁させる。重炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムのような揮発性緩衝剤又は塩は、塩を除去する段階は必要でなく、よって抽出処理方法が簡単になる。
前記粉懸濁液を振とうしながら２０〜５５℃の範囲の温度で典型的には３０分から４時間インキュベートする。その結果として得たホモジェネートを濾過または遠心分離のいずれかで浄化する。浄化した濾液または上澄み液に脂質、糖および塩のような汚染物を除去するため、限外濾過もしくは透析または両方などのさらなる処理を加えてもよい。最後に、材料を例えば凍結乾燥などで乾燥させ、乾燥したケーキまたは粉末を生じさせてもよい。そのような抽出物は血中蛋白質の収率が高いことに加えて、蛋白質精製に伴う損失が本質的に限られていると言った利点を有する。
一般的には、蛋白質が成熟した種子産物の中に産生された時点で、本技術分野で公知の濾過、アフィニティーカラム、ゲル電気泳動および他の標準的手順のような標準的方法を用いて前記蛋白質を更に精製してもよい。次に、精製した蛋白質をヒト患者に送達するのに望ましい様式で調合してもよい。治療用製剤では２種以上の蛋白質を結合することが可能である。蛋白質を食料以外の目的で投与することが要求される生物医学用途では、その蛋白質を精製して用いてもよい。
以下の実施例は本発明を説明するものであり、決して本発明を制限することを意図するものでない。
【実施例１】
【００３６】
ＡＡＴとフィブリノゲンポリペプチドをエンコードする遺伝子組換えイネの生産
粒子ボンバードメント媒介イネ形質転換および植物再生の基本的手順を、ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、（２００１年）が記述した如く実施した。イネ変異体ＴＰ３０９種子の皮を剥き、５０％（体積／体積）の市販漂白剤に２５分間入れることで殺菌した後、無菌水で洗浄した。殺菌した種子をＮ６塩（Ｓｉｇｍａ）、Ｂ５ビタミン（Ｓｉｇｍａ）、２，４−Ｄを２ｍｇ／ｌおよびスクロースを３％入れたイネカルス誘発培地（ＲＣＩ）プレートの上に置いた。前記イネ種子を１０日間インキュベートすることでカルス形成を誘発した。前記種子から一次カルスを切り取って、ＲＣＩの上に３週間置いた。これを更に２回行うことでボンバードメントで用いる二次および三次カルスを形成し二次培養を継続した。ボンバードメントを行う前に、直径が１〜４ｍｍのカルスを、マンニトールを０．３Ｍとソルビトールを０．３Ｍ入れたＲＣＩの上に４ｃｍの円の状態で５〜２４時間置いた。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＣ−１０００／Ｈｅ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてミクロプロジェクタイルボンバードメントを実施した。この手順では１．５ｍｇの金粒子（６０ｕｇ／ｍｌ）を２．５ｕｇのＤＮＡで被覆する必要がある。１１００ポンド毎平方インチ（約７．５８４２３ｘ１０６パスカル）のＨｅ圧力を用いて、ＤＮＡで被覆しておいた金粒子をイネカルスに衝突させた。ボンバードメント後のカルスを４８時間かけて回復させた後、選択の目的でヒグロマイシンＢを３０ｍｇ／ｌ入れておいたＲＣＩに移して、２６℃の暗所で４５日間インキュベートした。形質転換カルスを選択して、ＡＢＡを５ｍｇ／ｌ、ＢＡＰを２ｍｇ／ｌ、ＮＡＡを１ｍｇ／ｌおよびヒグロマイシンＢを３０ｍｇ／ｌ入れたＲＣＩ（２，４−Ｄを除く）に移して９〜１２日間置いた。形質転換カルスを、ヒグロマイシンＢを含まずＢＡＰを３ｍｇ／ｌおよびＮＡＡを０．５ｍｇ／ｌ入れたＲＣＩ（２，４−Ｄを除く）からなる再生用培地に移して、連続照明条件下で２〜４週間培養した。再生した植物体（高さが１〜３ｃｍ）を、濃度がＭＳ培地（Ｓｉｇｍａ）の濃度の半分であり、スクロースを１％およびＮＡＡを０．０５ｍｇ／ｌ加えた発根用培地に移した。植物体は発根用培地上で２週間後に根を出し、芽が約１０ｃｍになるまで生育させた。植物を商業的土壌（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ ＃１）が５０％、田圃の土壌が５０％に混合した６．５ｘ６．５ｃｍのポットに移した。植物をプラスチック製容器で覆ってほぼ１００％の湿度を保持しそして連続光の下で１週間生育させた。その透明なプラスチック製カバーを１日かけてゆっくり移動させることで、湿度と水を徐々に少なくしそして必要に応じて肥料を加えた。遺伝子組換えＲ０植物の高さが約２０ｃｍになった時点で、それらを温室に移して、その中で成熟するまで生育させた。
個々のＲ０再生植物から得た個々のＲ１種子粒を胚と胚乳に切り裂いた。その単離したイネ胚乳の中の組換え型血中蛋白質（ＡＡＴおよびフィブリノゲンポリペプチド）の発現レベルを検査した。組換え型蛋白質発現の度合が高い個々のＲ１粒から得た胚を、５０％の漂白液に入れて２５分間殺菌した後、無菌蒸留水で洗浄した。殺菌した胚をスクロースを１％とＮＡＡを０．０５ｍｇ／ｌ添加した１／２のＭＳ基礎塩を含む組織培養管の中に入れた。約２週間で、胚が発芽し７ｃｍまでの芽と健康な根系を有する植物体を得た。成熟したＲ１植物が再生体として得られた。
【実施例２】
【００３７】
組換え型血中蛋白質を含有する米抽出物の製造、さらに非経口および腸内用製剤での前記抽出物の使用
一般的な米抽出物製造手順
異種ポリペプチドを含有する遺伝子組換え米を乾式製粉または湿式製粉方法のいずれかで米抽出物に変化させることができる。乾式製粉方法では、異種ポリペプチドを含有する遺伝子組換え水稲種子の皮を皮剥き機で剥いた。その米を例えば１つの実験ではＫ−ＴＥＣのモデル９１ Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｍｉｌｌを速度３で用いるなどして乾式製粉工程で粉砕して微細な粉にした。この米粉に燐酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）が加えられ、ＰＢＳは、０．１３５ＮのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４をｐＨ７．４で含み、さらに場合によっては０．３５ＮのＮａＣｌのような追加のＮａＣｌも含む。いくつかの実験では、粉１ｇ当たり約１０ｍｌの抽出用緩衝液を用いた。他の実験では、初期の粉／緩衝液の比率を１ｇ／４０ｍｌから１ｇ／１０ｍｌの範囲で変化させた。混合物を穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。別の実験では、インキュベートの温度を例えば約２２℃から約６０℃のように低く或は高くし、インキュベーション時間を例えば約１０分から約２４時間のように長く或は短くした。Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ ＶａｒｉＭｉｘプラットフォームミキサーを高速に設定して用いることで粒子を懸濁状態に保持した。
いくつかの実験では、ＰＢＳの代わりに他の緩衝剤、例えば重炭酸アンモニウムなどを用いた。１つの実施例では、１ｋｇの米粉に０．５Ｍの重炭酸アンモニウムを１０リットル加えた。
その結果として得られるホモジェネートを濾過または遠心分離のいずれかで浄化した。濾過の方法として、混合物を室温で約３０分間沈降させた後、ホモジェネートを集めて濾過した。ポール ゲマンサイエンシーズ（Ｐａｌｌ Ｇｅｍａｎｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入した異なる３種類の形態のフィルターが用いられ、それらは３μｍのひだ付きカプセル、１．２μｍの血清用カプセルおよびＳｕｐｏｒｃａｐカプセル５０（０．２μｍ）であった。遠心分離はＢｅｃｋｍａｎ Ｊ２−ＨＣ遠心分離機を用いて、前記混合物に３０，０００ｇの遠心分離を４℃で約１時間行った。その上澄み液を保持しそして沈澱物を廃棄した。
１つの実施例では、その濾液および上澄み液にさらなる処理、例えば限外濾過法や透析または両方などによる処理を受けさせることで、脂質、糖および塩などの成分を除去した。
次に、上記の濾過手順で得た濾液（これは浄化抽出液とも呼ばれる）をバッチ式循環様式で操作された螺旋巻きタンジェンシャルフローフィルターを用いて濃縮した。１つの実施例では、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）３０００〜４０００分子量カットオフ膜をこの段階で用いた。濃縮された最終的な抽出液を冷室の中に一晩保持した。
次に、前記濃縮抽出液を凍結乾燥で乾燥させて粉末にした。凍結乾燥材料を凍結乾燥機のトレーからすくい取って、共にプラスチック製バッグの中に入れた。バッグに真空をかけることで乾燥材料を圧縮した後、この材料をプラスチックを通して手でこねることで混合し、かつ粒径を小さくした。
また、湿式製粉手順を用いて米抽出液を製造することも可能である。組換え型ヒト血中蛋白質を含有する遺伝子組換え水稲種子は３０℃で０から２８８時間再水和させてもよい。再水和した種子を抽出用ＰＢＳ緩衝液の中で粉砕する。初期の種子／緩衝液の比率を例えば１ｇ／４０ｍｌから１ｇ／１０ｍｌの範囲で変化させてもよい。
そのような湿式製粉方法を用いるとヒト血中蛋白質を２０％を超える度合で回収することができる。湿式製粉の結果として、血中蛋白質標的の安定性に応じて、初期の抽出液を冷えた状態（４℃）に保持することができるか或は使用時まで凍結状態で貯蔵することが可能になる。初期抽出液を処理して乾燥した抽出物を得る様式はこの章の乾式製粉に関する記述のものと同様である。
【実施例３】
【００３８】
組換え型血中蛋白質および対照イネ抽出物の濃縮および透析濾過
濃縮および透析濾過で用いる条件は体積、速度、費用などに応じて変化する。これらの条件は本明細書の開示に関する本技術分野で標準的なものである。凍結した初期抽出物を冷室（約２〜８℃）の中で６時間かけて解凍させた。その解凍材料を０．４５μｍのフィルターに通すことで浄化した後、ポリエーテルスルホンの５０００ノミナル（Ｎｏｍｉｎａｌ）分子量カットオフ膜を用いて濃縮した。
９０ｍｌの対照抽出物の濾液を濃縮して１０ｍｌにした後、濃縮濾液に脱イオン水をさらに１０ｍｌ加えてもよい。希釈した濾液に水を用いた透析濾過をもう一度行ってもよい。沈澱物は１６ｍＳの時に生じ始めイオン強度を低くするにつれて増加する。イオン強度を高める目的で１．０Ｍの重炭酸アンモニウム溶液を保持液に添加した。曇りが完全には消失しなかったが減少した。その材料に水を用いた透析濾過を数回、１つの実施例では３回受けさせ、そして０．１Ｍの重炭酸アンモニウムを用いて数回、１つの実施例では３回受けさせた。材料を濃縮して９ｍｌにした後、膜を０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで濯いだ。濃縮液を数枚の０．２μｍのボタンフィルターに通して濾過した。１つの実施例では、２．３ｍｌの濾液に凍結乾燥をそのまま行い、また２．３ｍｌの濾液を脱イオン水で希釈し１２ｍｌにした後に凍結乾燥を行い、また２．０ｍｌの濾液を脱イオン水で希釈し２５ｍｌにした後に凍結乾燥を行った。これらの濾液は全部透明なままであった。
全体で８９ｍｌの組換え型蛋白質抽出液の濾液を濃縮して１０ｍｌにした後、０．１Ｍの重炭酸アンモニウムをさらに１０ｍｌ加える。結果として得られる混合物を濃縮し１０ｍｌに戻し、さらに０．１Ｍの重炭酸アンモニウムを１０ｍｌ加える。保持液が曇り始める。その材料に０．１Ｍの重炭酸アンモニウムによる透析濾過を数回、１つの実施例では３回受けさせた。材料を濃縮し９ｍｌにした後、膜を０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで濯いだ。濃縮液を数枚の０．４５μｍのボタンフィルターに通して濾過した。１つの実施例では、２．０ｍｌの濾液に凍結乾燥をそのまま行い、また２．０ｍｌの濾液を脱イオン水で希釈し１２ｍｌにした場合に曇りが生じ、その後凍結乾燥を行い、また２．０ｍｌの濾液を０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで希釈して１２ｍｌにした場合は透明なままであり、その後凍結乾燥を受けさせた。
【実施例４】
【００３９】
組換え型蛋白質米にＰＢＳおよび重炭酸アンモニウムによる抽出を行う試行の比較
濃縮および透析濾過で用いる条件は体積、速度、費用などに応じて変化する。これらの条件は全部本明細書の開示に関する技術分野で標準的なものである。磁気撹拌子を用いて組換え型蛋白質米粉と抽出用緩衝液を約１００ｇ／Ｌの率で約１時間混合する。１つの２Ｌビーカーに入れた抽出用緩衝液はＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、これにＮａＣｌを０．３５Ｍ加えた。別の２Ｌのビーカーに入れた抽出用緩衝液は０．５Ｍの重炭酸アンモニウムである。１５ｃｍのブフナー漏斗を約６ｇのＣｅｌ−ｐｕｒｅ Ｃ３００で前もって覆った後、Ｃｅｌ−ｐｕｒｅ Ｃ３００を更に２０ｇ加える。前記混合物を約３〜４Ｈｇで濾過する。次に、濾過したものを約１００ｍｌづつの抽出用緩衝液で２回洗浄する。抽出濾液を集めて限外濾過カートリッジ、つまり５Ｋ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、５Ｋ ＰＥＳおよび１Ｋ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅで濃縮した。濃縮液を凍結乾燥し、組換え型血中蛋白質活性含有量に関する分析を行った。重炭酸アンモニウムとＰＢＳ（ｐＨ７．４）プラス０．３５ＭのＮａＣｌの両方はほぼ等しい量のｒＡＡＴを抽出する。使用した限外濾過法装置のいずれを用いた時にも、透過液中の組換え型蛋白質単位の損失はほとんど無い。
また、遺伝子組換え米粒の中で発現させた組換え型蛋白質を抽出する目的で他の抽出用緩衝液を用いることも可能であり、例えば用途に応じてトリス緩衝液、酢酸アンモニウムなどを用いることも可能である。
【実施例５】
【００４０】
組換え型血中蛋白質を含有する米抽出液の生産
濃縮および透析濾過で用いる条件は体積、速度、費用などに応じて変化する。これらの条件は全部本明細書の開示に関する技術分野で標準的なものである。全ての装置を出発温度が約５５℃の熱い０．１ＭのＮａＯＨに浸漬する。米粉を０．５Ｍの重炭酸アンモニウムを入れておいた約２５０〜５００ガロン（約９４６．４〜１８９２．７立法デシメートル）のステンレス鋼製タンクに９５〜１０５ｇ／Ｌの比率で加える。そして約９℃で約６０〜８０分間混合する。
１２枚の３６インチフィルタープレスＣ３００を約３〜６ｋｇのＣｅｌ−ｐｕｒｅ Ｃ３００で前もって覆った。前記抽出液にＣｅｌ−ｐｕｒｅを約１９〜２６ｇ／Ｌ加えて徹底的に混合する。この混合物を約８２リットル／分の流量で流して約２２ポンド毎平方インチ（約１５１６８５パスカル）の圧力で圧縮する。その濾液を集めて２５０ガロン（約９４６．４立方デシメートル）のステンレス鋼製タンクに入れた後、０．５Ｍの重炭酸アンモニウムで洗浄する。その圧縮物をブロー乾燥させる。この過程を約１０℃で実施する。
対照実験の後に０．１ＭのＮａＯＨで洗浄して貯蔵しておいた３００ＮＭＷカットオフ膜［ポリスルホン（Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）］を、脱イオン水で徹底的に濯ぐ。前記抽出液を濃縮した後、１００ガロン（約３７８．５立方デシメートル）のステンレス鋼タンクの中に入れる。前記膜と濃縮用タンクを０．１Ｍ重炭酸アンモニウムでフラッシュ洗浄することで残存する抽出液の全部を回収した。その生成物をプラスチックで覆って、１００ガロン（約３７８．５立方デシメートル）のタンクの中に室温で一晩放置した。その濃縮液を１μｍの螺旋巻きフィルターに通して濾過した後、５ガロン（約１８．９立方デシメートル）のポリ容器に入れる。
【実施例６】
【００４１】
組換え型蛋白質を含有する米抽出液を非経口用、吸入、鼻内および局所用製剤の中に混合
組換え型血中蛋白質（例えばＡＡＴ）を医学／薬学用途で用いる目的で、穀粒から高度に精製した粒にすることができる。ヒトＡＡＴを発現したイネ種子抽出液を精製するプロトコルが開発されたが（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、２００２年）、このプロトコルは、上述の実施例に従ってイネ種子抽出液を調製しそしてＣｏｎ−Ａ、ＤＥＡＥおよびＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーのそれぞれを用いて抽出液調製物を更に精製することから成る。この手順を用いると、ＡＡＴを均質性が９０％を超える度合にまで精製することができる（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、２００２年）。精製ＡＡＴを下記の適応の潜在的薬学／医学用途で用いることができる。ＡＡＴ増強／置換治療（サンドハウス（Ｓａｎｄｈａｕｓ）、１９９３年；ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）他、１９８９年、のう胞性線維症（マックエルバニー（ＭｃＥｌｖａｎｅｙ）他、１９９１年；アレン（Ａｌｌｅｎ）、１９９６年）、乾癬、脂肪織炎および皮膚血管炎（オリョーダン（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ）他、１９９７年；ダウド（Ｄｏｗｄ）他、１９９５年）および肺の炎症（ビングル（Ｂｉｎｇｌｅ）およびテトレー（Ｔｅｔｌｅｙ）、１９９６年）。そのような適応のいくつかでは、精製ＡＡＴ蛋白質調剤を静脈内（ｉｖ）方法で０．０９％の食塩溶液の状態で投与してもよい。別法として、前記食塩溶液に血清アルブミンを０．５％用いた緩衝または他のある種の薬学的に受け入れられる蛋白質担体分子を用いた緩衝を受けさせることも可能である。ＡＡＴ投薬量は一般に約６０ｍｇ／ｋｇである。エーロゾル送達では、液滴の大きさが下気道に付着させるに適切な（空気動力学的直径が＜３ｕｍの）エーロゾルを発生させる能力を基にして選択した圧縮空気推進噴霧器を用いたエーロゾル発生装置を用いることができる（ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）他、１９８９年）。再び、蛋白質を無菌水または薬学的に受け入れられる蛋白質担体を含む緩衝食塩溶液のいずれかに入れて懸濁させてもよい。別法として、前記精製蛋白質成分を含有する乾燥蛋白質粉末を分散剤として用いることも可能であり、乾燥蛋白質粉末は、ＡＡＴ成分が少なくとも５０重量％以上の米が基になった抽出物であってもよい。
別のケースでは、ＡＡＴ及びフィブリノゲンのようなヒト血中蛋白質を発現及び抽出した組換え型米を局所的に用いることも可能である。フィブリンシーラント／包帯の使用は医学界で幅広く受け入れられて使用されてきた。フィブリンシーラントは有効な止血剤であり（マンカッド（Ｍａｎｋａｄ）およびコディスポッティ（Ｃｏｄｉｓｐｏｔｉ）、２００１年）、組織接着を達成し、流体蓄積を防止しおよび創傷治癒を促進する手段である（スポットニッツ（Ｓｐｏｔｎｉｔｚ）、２００１年）である。フィブリンシーラントは薬剤徐放手段としても使用可能であり、抗生物質、成長因子および他の薬剤を含む（スポットニッツ（Ｓｐｏｔｎｉｔｚ）、１９９７年）。フィブリノゲンを発現した米はまたそれらの適応にとって効力のある、低コストで動物ウイルスを含まない源にも成り得る。
【００４２】
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ここに挙げた全ての刊行物は本明細書に明確に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１に、各々がイネグルテリンプロモーターＧｔ１の制御下にある、フィブリノゲンポリペプチドα（ｐＡＰＩ ３９８）、β（ｐＡＰＩ ４１７）およびγ（ｐＡＰＩ ３２７）をエンコードする３個のコドン最適化遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３）を含有する構築物を伴うプラスミドを示す。ヒグロマイシン選択可能マーカーを含有するプラスミド（図示せず）を包含する前記プラスミドをエンブリオジェニック（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ）イネカルスに衝突させて入り込ませることで、前記３個の遺伝子を成熟イネ種子の中に発現する遺伝子組換えイネ植物を作り出した。
【図２】図２に、ヒトフィブリノゲンの個々のサブユニットを発現する、遺伝子組換えイネ株のウエスタンブロット分析を示す。レーン１は、正の対照である精製天然ヒトフィブリノゲン（赤十字社から入手した）であり、これは３種類のポリペプチド鎖全部を示し、レーン２は、遺伝子組換え型ではないイネ品種であるＴａｐｅｌ ３０９から得た抽出物であり、レーン３は、分子量標準であり、レーン４は、フィブリノゲンα鎖を発現するイネ種子の抽出物であり、レーン５は、フィブリノゲンβ鎖を発現するイネ種子の抽出物であり、レーン６は、フィブリノゲンγ鎖を発現するイネ種子の抽出物である。イネ種子の蛋白質抽出の全部を２％ＳＤＳ、１Ｍ尿素、１％βＭｅおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で実施した。３種の鎖全部または個々の鎖のみを認識する抗体を用いてフィブリノゲンポリペプチドを検出した。
【図３】図３は、前記３種類のフィブリノゲンポリペプチド鎖（α、βおよびγ）が遺伝子組換えイネ種子の中に同時発現させ、ウエスタンブロット分析で分析したものを示す。３種類の鎖全部を認識する抗体を用いてフィブリノゲンポリペプチドおよび蛋白質凝集物を検出した。図３Ａは、非変性条件［３５０ｍＭのＮａＣｌ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ−１００／ＣＨＡＰＳ］下で非変性１０％アクリルアミドゲル上で流すことでイネ種子から抽出した全蛋白質を示す。レーン１は、１μｇの精製ヒトフィブリノゲンであり、レーン２および３は、遺伝子組換え型ではないイネ品種であるＴａｐｅｌ ３０９から得た抽出物であり、レーン４は、分子量マーカーであり、レーン５および７は、抽出用緩衝液にβＭｅを１．０％含有させた２種類の遺伝子組換えイネ株から得た抽出物であり、レーン６および８は、抽出用緩衝液にβＭｅを入れていない２種類の遺伝子組換えイネ株から得た抽出物である。レーン６および８は、遺伝子組換え株を非変性条件下で複合天然ヒトフィブリノゲンのおおよその位置の所に流すことで抽出した大型の蛋白質凝集物を示している。図３Ｂに、イネ種子を２％ＳＤＳ、１Ｍ尿素、１％βＭｅおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）に入れてＳＤＳ−ＰＡＧＥの上で流すことで抽出した全蛋白質を示す。レーン１は、正の対照である天然ヒトフィブリノゲン（赤十字社から入手した）であり、これは３種類のポリペプチド鎖全部を示し、レーン２は、分子量標準であり、レーン３〜５は、３種類のフィブリノゲンペプチドの全部を発現する３種類の遺伝子組換えイネ株の各々である。
【図４】図４に、アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）のコドン最適化遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をイネグルテリンプロモーターＧｔ１の制御下で発現するプラスミドｐＡＰＩ ２５０を示す。このプラスミドを、ヒグロマイシン選択可能マーカー遺伝子を含有するプラスミド（図示せず）と共に、エンブリオジェニックイネカルスに衝突させて入り込ませることで、ＡＡＴを成熟イネ種子の中に発現する遺伝子組換えイネ植物を作り出した。
【図５】図５に、ヒト組換え型ＡＡＴを発現する遺伝子組換え米粒の、水相抽出液のクマシーブリリアントブルー染色を示す。形質転換していないイネ（イネ品種Ｋｉｔａａｋｅ）および形質転換イネ（個別の５遺伝子組換え植物からプールした〜１０個のＲ１種子）両方の種子をＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液と一緒にして粉砕した。その結果として得た抽出液を４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。上澄み液を集めた後、サンプル充填用緩衝液の中にその可溶蛋白質抽出液を〜２０μｇ入れて再懸濁させた後、前もって成形しておいたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に充填した。レーン１は、分子量蛋白質マーカーであり、レーン２は、精製非組換え型ヒトＡＡＴであり、レーン３は、形質転換していない対照Ｋｉｔａａｋｅ品種から得た抽出液である。個々の５遺伝子組換え植物の抽出液を用いて得た結果を、レーン２と３の間に示す。
【図６】図６に、遺伝子組換え米粒の中に発現した組換え型ヒトＡＡＴのウエスタンブロット分析を示す。個々の７遺伝子組換えイネ形質転換体からプールしたＲ１種子の可溶蛋白質抽出物（〜１０μｇの全蛋白質）を上述の図５のように調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離させた後、ニトロセルロースフィルターの上にブロットした。イネ種子の中に発現したＡＡＴの同定を抗ＡＡＴ抗体を用いたウエスタン分析で実施した。レーン１は、分子量蛋白質マーカーであり、レーン２および３は、それぞれ１μｇおよび２μｇの精製非組換え型ヒトＡＡＴであり、レーン４および５は、形質転換していない対照イネ（Ｋｉｔａａｋｅ品種）の抽出液である。最後の７レーンに、個々の７遺伝子組換え植物の抽出液を用いて得た結果を示す。７種類の遺伝子組換え系の中の２つから得た抽出物はＡＡＴを発現していなかった。組換え型ではないヒト形態と組換え型イネが発現する形態の間にゲル可動性のシフトが見られたが、それは、ヒト蛋白質と組換え型イネが発現した蛋白質の種類およびグリコシル化に差があることによる。
【図７】図７に、クマシー染色およびウエスタンブロット分析で測定した時に米抽出液から得た精製組換え型ＡＡＴ（ｒＡＡＴ）が、精製ブタ膵エラスターゼ（ＰＰＥ）に対して示した活性を示す。ＡＡＴプロテアーゼの基質であるエラスターゼを用いた帯シフト検定を用いて、ｒＡＡＴが示す活性を立証する。ヒトおよび米抽出液から得たＡＡＴサンプルを等モル数のＰＰＥと共に３７℃で１５分間インキュベートした。帯シフト検定の負の対照は、ＡＡＴサンプルをこれに等体積で添加したＰＰＥと共にインキュベートすることで調製された。レーンＭＷは、分子量マーカーを指す。図７Ａのレーン１は、ヒト血漿から得た精製非組換え型ＡＡＴであり、レーン２は、ヒト血漿＋ＰＰＥから得た精製ＡＡＴであり、レーン３は、遺伝子組換えイネ種子から得たＡＡＴ含有可溶蛋白質抽出液であり、レーン４は、遺伝子組換えイネ種子＋ＰＰＥから得たＡＡＴ含有蛋白質抽出液であり、レーン５は、形質転換していないイネ種子の抽出液であり、レーン６は、形質転換していないイネ種子の抽出液＋ＰＰＥである。図７Ｂは、レーン１、２および３に帯のシフトが見られることを示している。そのような帯のシフト、即ちＰＰＥとＡＡＴフラグメントの間の複合体がＡＡＴを含有することをウエスタンブロット分析で立証する。図７Ｂに示したレーンは図７Ａに示したそれらと類似している。
【図８】図８に、米細胞抽出液を最初にＣｏｎ−ＡおよびＤＥＡＥ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のそれぞれに通した後にオクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに充填することによる精製で得たＡＡＴを示す。オクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）が最終的精製段階であり、それによって、活性のあるＡＡＴを不活性な形態の蛋白質から分離する。レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、標準としての２μｇの精製非組換え型ヒトＡＡＴであり、レーン３は、ＤＥＡＥ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムから溶離した液をプールした溶離液である。残りの縦列に、オクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムを通り抜けた液および溶離液を示す。各カラム画分の約５０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に充填して、蛋白質をクマシー染色で可視化した。オクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を通り抜けた液は不活性なＡＡＴ蛋白質を示す一方、溶離液は活性のあるＡＡＴを溶離する。
【図９】図９Ａに、組換え型ではないヒトＡＡＴを対照として用いて図7における手順に示されるように測定した時に、精製組換え型ＡＡＴがＰＰＥに対して示した活性に関するＡＡＴ結合速度定数を示す。図７の記述のように、クマシー蛋白質染色およびウエスタンブロット分析を用いてデータを得た。図９Ｂに、ＰＰＥ阻害検定で測定した時に植物由来組換え型ＡＡＴが示した熱安定性を天然のヒトＡＡＴと対比させて示す。
【図１０】図１０に、コドン最適化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をイネＡｍｙ１Ａプロモーター／シグナルペプチドの制御下で発現するプラスミドｐＡＰ１９を示す。このプラスミドは、発芽したイネ種子の中にＨＳＡを発現させるに有用である。
【図１１】図１１に、遺伝子組換えイネ種子の中で起こるＨＳＡ発現を示す。遺伝子組換えイネ株３−１１−２からプールした種子を水の中に２４時間浸漬した後、ギベレリックアシッド（ＧＡ）を２μＭ添加した。ウエスタン分析を行う目的で、ＧＡを添加した後に２４、４８、７２および１２０時間の種子サンプルを取り出し、可溶蛋白質を抽出した。形質転換していない負の対照株ＴＰ３０９から単離した蛋白質と共に１５μｇの可溶蛋白質を各レーンに充填した。ＨＳＡに対して調整したモノクローナル抗体を用いてブロットを検査した。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト用および動物用の局所組成物およびヒト用の治療組成物を製造する時に用いる目的で、単子葉植物の種子の中で産生したヒト血中蛋白質に関する。
【背景技術】
【０００２】
好ましい治療効果をもたらすヒト血中蛋白質の必要量が多いため、あるいは特定の病気にかかっている世界中の患者人口が必要とするヒト血中蛋白質の量が多いため、多くのヒト血中蛋白質が不足又は供給が制限されている。また、通常は血液製剤から抽出される血中蛋白質を作物植物のような代替源などを用いて生産することも望ましい。植物から血中蛋白質を生産することにより、血中蛋白質画分のヒトウイルスおよびヒトもしくは動物用血液製剤画分の中に存在する他の病気の原因となる媒介物による汚染が軽減される。
ヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン（「ＡＡＴ」）、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子（例えば第Ｖ−ＸＩＩＩ因子）などの血中蛋白質が数多くのヒトの病気に治療効力を有することが知られている。
ヘモグロビンは酸素を細胞に輸送する主要な血液成分分子である。哺乳動物のヘモグロビンは２個のα様ポリペプチドサブユニットと２個の非α（通常はβ、γもしくはδ）サブユニットで構成されている四量体蛋白質である。それらのサブユニットは主要アミノ酸配列の点で異なるが、それらの二次的および三次的構造は類似している。各グロビンサブユニットは酸素が結合するヘム基として知られるＦｅ２＋−ポルフィリン錯体に非共有相互作用により結合している。成体型赤血球中の主なヘモグロビンはヘモグロビンＡ１（ＨｂＡ）として知られるα２β２である。各ヘモグロビン四量体の分子量は６４ｋＤであり、そして各α様およびβ様鎖の分子量はそれぞれ約１５．７ｋＤ（１４１個のアミノ酸）および約１６．５ｋＤ（１４６個のアミノ酸）である。
【０００３】
ＡＡＴはセルピン阻害剤の種類に属していてヒト血漿の中に存在する主要プロテアーゼ阻害剤の１種である。ＡＡＴはアミノ酸数が３９４で分子質量が約５２ｋＤの単一ポリペプチドであり、この分子の天然ヒト形態では炭水化物を約１５％含有する。ヒト血漿中のＡＡＴ濃度は１０００〜３０００ｍｇ／Ｌの範囲であり、ヒト乳中での濃度は１００から４００ｍｇ／Ｌの範囲である。ＡＡＴの主要な生理学的役割は好中球エラスターゼの抑制であるが、不足した場合肺気腫の発生がもたらされる。エラスターゼの活性が過剰になると、気腫、肝炎およびいろいろな皮膚疾患がもたらされる。ＡＡＴがヒト好中球エラスターゼに対して示す結合親和力は最大であるが、また、ＡＡＴは膵臓のプロテアーゼ、例えばキモトリプシンおよびトリプシンなどにも親和性を示す。ＡＡＴ欠乏症の治療で現在行われている主な起点は、ヒト血漿からＡＡＴを単離することにある。
【０００４】
フィブリノゲンは血液凝固カスケードに関与していて、天然の凝固剤であるトロンビンと相互作用することでフィブリンに変化する。フィブリンが主要な血液凝固成分である。成熟したヒトフィブリノゲンは２対の３独立ポリペプチド鎖（α、βおよびγ）で構成されていて、前記３本の独立したポリペプチド鎖が２９個の分子内および分子間ジスルフィド結合で共に連結することで３４０ｋＤの天然蛋白質を形成しており、ヒト血漿中に約２５００ｍｇ／Ｌの濃度で存在する。個々のフィブリノゲンドメインの三次元構造分析によって、ヒトフィブリノゲンが多機能的役割を果たすことに対する重要な手掛かりを与える詳細な構造的特徴が発見された。フィブリノゲンの前記ポリペプチドはそれぞれ約７２ｋＤ（α）、５２ｋＤ（β）および４８ｋＤ（γ）であり、βポリペプチド鎖によって天然の分子組み立てが決まる。フィブリノゲンの構造は、フィブリノゲン、他の蛋白質、特定の細胞型との相互作用を助長しかつフィブリノゲンが血液凝固、炎症、血管形成、創縫合、動脈形成および腫瘍形成を包む数多くの重要な生理学的プロセスに参与することを可能にする、複数の結合部位を含有する構造的および機能的ドメインを数多く有することを特徴とする。凝固の観点によるフィブリン形成に天然のフィブリノゲンとその天然の凝固剤である第ＸＩＩＩ因子およびトロンビンとの相互作用が介在するが、その相互作用は血液に可溶なカルシウムの存在下で起こる。
【０００５】
アルブミンは、哺乳動物の血清生物学でいろいろな機能、注目すべきは、ホルモンおよび他の可溶リガンドを部位から部位に運ぶ機能を果たし、また主として哺乳動物の一般的生物化学に寄与する他の活動を行う輸送蛋白質分子である。また、ヒト血清アルブミン（「ＨＳＡ」）も血液の主要な蛋白質成分であり、これは約３０，０００〜５０，０００ｍｇ／Ｌの血清濃度で活動的に存在する。ＨＳＡは６６．５ｋＤの単一ポリペプチド鎖であり、これは最初に肝臓の中でプレプロアルブミン分子として合成され、そしてＮ−末端およびＣ−末端がゴルジプロセシングされた後に小胞体から放出される。その結果として生じる成熟した蛋白質の長さはアミノ酸５８５個分である。遺伝子組換えタバコの葉の中でＨＳＡの天然のプレプロシーケンスが植物細胞膜をまたがる的確な蛋白質標的／プロセシングで機能し得ることが示された（非特許文献１）。
【０００６】
血漿糖蛋白質であるプロトロンビンはセリンプロテアーゼトロンビンの酵素原であり、フィブリノゲンからフィブリンへの変換に触媒作用を及ぼすばかりでなく、血液凝固にとって重要であり得る他のいくつかの反応にも触媒作用を及ぼす。プロトロンビンは分子量が約７２，０００の大きさの単一ポリペプチド鎖である。完全なヒトトロンビンｃＤＮＡは６２２個のアミノ酸残基で構成されていて、３６個のアミノ酸残基で出来ているリーダー配列を包含する。活動的なトロンビンの見かけ分子量は３６，０００であり、これはプロトロンビンが開裂を起こす結果としてもたらされる２個のジスルフィドで連結しているポリペプチド鎖で構成されている。蛋白質分解が起こるとヒトプロトロンビンがインビトロで活性化されて活性のあるトロンビンに変化することが、極めて良好に特徴づけられている。
【０００７】
第Ｖ−ＸＩＩＩ因子は、血液凝固の古典的なカスケード機構の「固有の経路」に関与する蛋白質（大部分のプロテアーゼは活性状態にある）である。そのような分子は大部分が前駆体として存在していて、前記前駆体は秩序のある変換順でプロセシングされて、不活性な形態から触媒的に活性のある形態になる。第Ｖ因子はプロアクセレリン（促進性グロブリン）である一方、第ＶＩ因子は第Ｖ因子の活性形態である。第ＶＩＩ因子はプロコンバーチン、即ち血漿トロンボプラスチン成分である一方、第ＶＩＩＩ因子（抗血友病因子）および第ＩＸ因子（クリスマス抗血友病因子）は両方とも血友病状態に関連している。第Ｘ因子（Ｓｔｕａｒｔ−Ｐｏｗｅｒ因子）、第ＸＩ因子（血漿トロンボプラスチン前駆物質）および第ＸＩＩ因子（ハーゲマン因子）は全部トロンビンの成熟／安定化に関与している。第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）は凝固過程中にフィブリンに直接作用する血漿トランスグルタミナーゼである。前記因子はすべて血清血漿中に比較的低濃度（０．００１から５０ｍｇ／Ｌ）で存在する。血液凝固カスケードに関与している他の蛋白質因子には、フレッチャー因子（プレカリクレイン）、フィッツジェラルド因子（キニノゲン）およびフォン・ヴィレブランド因子が含まれる。
【０００８】
ヒトに存在する免疫グロブリン（抗体）は患者が接触した可能性のあるいろいろな病原体に対して抵抗力を与える働きをする。免疫グロブリン分子はヒト血清中の質量の１５〜２０％を占めていて、主にＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＡ型の抗体で構成されており、これらは、血液系および潜在的に体の残りの部分に侵入して来るいろいろな感染症との戦いに関与している。ＩｇＧ型の抗体が最も優勢で６〜１８ｇ／Ｌの血清濃度で存在する。血液系はまた、結果として起こる感染および潜在的腫瘍標的に対抗する目的で、そのような分子を体の特定領域に向かわせる担体としても働く。成熟した抗体は２個のポリペプチド（軽および重鎖）で構成されており、それらが機能的実体を形成するため等モル量で発現して一緒になる必要がある。軽鎖（〜２５ｋＤ）はアミノ酸〜２１０−２４０個分の長さを有する蛋白質である一方、重鎖（〜５０ｋＤ）はアミノ酸〜４５０−４６０個分の長さを有する蛋白質である。軽鎖および重鎖は共にプロセシングされて血液の流れの中に分泌されるようにシグナルペプチドを有する。２種類の遺伝子が発現し、２種類の蛋白質が合成されそして四量体蛋白質が正確に組み立てられる結果として機能的抗体がもたらされる必要があるため、植物の中で起こるモノクローナル抗体の発現に特に関心が持たれている。
植物における抗体に関する初期の研究は、ＩｇＧ抗体の種類に焦点が当てられていた（非特許文献２、３）が、より最近の研究で複雑な抗体分子、例えば分泌型ＩｇＡ抗体（４個の遺伝子）およびより複雑な抗体形態の植物内発現が研究されている（非特許文献４、５）。
【０００９】
遺伝子組換えタバコ植物の葉の中に抗体分子を産生させることが特許文献１、２、３および４（全部関連した特許である）に開示されている。
タバコ植物の葉、幹、花および根の中に免疫グロブリン含有保護蛋白質を産生させることが、特許文献５に開示されている。
タバコ植物の色素体の中に抗体を産生させることが、特許文献６に開示されている。
遺伝子組換え植物の中に異種蛋白質を商業的に産生させるに適するように制御した環境の農業用生物反応器が、特許文献７に開示されている。この特許文献７には哺乳動物血中蛋白質の産生を達成可能であることが開示されている。実施例７にジャガイモ、タバコおよびアルファルファ植物の葉の中にヒト血液因子を産生させることが開示されている。
タバコ植物の葉の中にヘモグロビンおよびミオグロビンを産生させることが、特許文献８に開示されている。実施例Ｘに組換え型ヘモグロビンをタバコの種子から抽出して、ある程度精製することが開示されている。同時発現プラスミドｐＢＩＯＣ５９の形質転換でそのような発現を得ているが、前記ｐＢＩＯＣ５９は葉緑体の中で標的に向かうように構築されており、その目的のため、ピスム・サチブムＬ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ）のリブロース１，５−ジホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニットの前駆体のトランジットペプチドを含有している。種子において、抽出される可溶蛋白質全体を基準にした組換え型ヘモグロビンの最大濃度が０．０５％である度合の発現が起こると報告された。
【００１０】
特許文献８の実施例ＸＩに、トウモロコシの種子の中で構成的発現またはアルブミン中の発現が起こるように、ヘモグロビンのαまたはβ鎖の一方を含有させたプラスミドの構築が開示されている。特許文献８によれば、ヘモグロビン鎖の構成的またはアルブミン特異的発現を起こさせるには以下の調節配列が必要であった。構成的発現を可能にする３種類のプロモーター［（ｉ）プラスミドｐＡｃｔ１−Ｆ４の中に含まれているイネアクチンプロモーターに続くイネアクチンイントロン、（ｉｉ）カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓ二重構成プロモーター、または（ｉｉｉ）プラスミドｐｙ６３の中に含まれているトウモロコシｙゼイン遺伝子のプロモーター］の中の１つそして２種類のターミネータ［（ｉ）３５ＳポリＡターミネータまたは（ｉｉ）ＮＯＳポリＡターミネータ］の中の１つである。そのようなプラスミドの形質転換または発現をトウモロコシまたはトウモロコシの種子の中で起こさせることに関しては、実験もデータも示されていない。
菜種およびタバコ植物の中で起こる種子油の発現に影響を与えて、それを変える目的でブラシカ・ナパス（Ｂｒａｓｓｃｉｃａ ｎａｐｕｓ）のＡＣＰから得た種子特異的プロモーターの使用が特許文献９に開示されている。特許文献９には、血液因子またはヒト血清アルブミンなどの薬学的蛋白質の発現のためそのような種子特異的プロモーターを用いることができることが一般的に開示されてはいるが、しかしながら、それに関して如何なる実験データも示されていない。
【００１１】
非特許文献６は、植物の中に抗体および蛋白質を産生させることを包含する医学的分子養殖分野における最近の進展を考察している総論である。
ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に高収率で産生させることは、前記特許または前記出版物のいずれにも開示されていない。特別な血中蛋白質を投与することによって治療可能な状態のヒトを治療しようとする時に、そのような蛋白質を患者集団に充分な供給量で供給することができるように、汚染源物が入っていないヒト血中蛋白質を高収率で生産することが望ましい。
【特許文献１】米国特許第６，４１７，４２９号
【特許文献２】米国特許第５，９５９，１７７号
【特許文献３】米国特許第５，６３９，９４７号
【特許文献４】米国特許第５，２０２，４２２号
【特許文献５】米国特許第６，３０３，３４１号
【特許文献６】公開された米国特許出願２００２／０１７４４５３
【特許文献７】公開された米国特許出願２００２／００４６４１８
【特許文献８】米国特許第６，３４４，６００号
【特許文献９】米国特許第５，７６７，３６３号
【非特許文献１】シズモンズ（Ｓｉｊｍｏｎｓ）他、１９９０年
【非特許文献２】ヒアット（Ｈｉａｔｔｅ）他、１９８９年
【非特許文献３】ヒアット（Ｈｉａｔｔｅ）およびマー（Ｍａ）、１９９２年
【非特許文献４】マー (Ｍａ)他、１９９５年
【非特許文献５】ヴァイン（Ｖｉｎｅ）他、２００１年
【非特許文献６】ダニエル（Ｄａｎｉｅｌｌ）他、２００１年
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の１つの局面は、組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法を包み、この方法は、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していてこれと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする、単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法である。
【００１３】
本発明は、また、本方法で得た精製ヒト血中蛋白質も包含する。前記ヒト血中蛋白質は好ましくは１種以上の植物グリコシル基を含有する。
本発明は、また、本発明の方法で得た収穫した種子から調製した単子葉植物種子製品、好ましくは全種子、粉、抽出物およびモルトから選択した単子葉植物種子製品も提供する。好ましくは、前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する。
本発明は、更に、精製ヒト血中蛋白質、好ましくは少なくとも１種の植物グリコシル基を含有する精製ヒト血中蛋白質および少なくとも１種の薬学的に受け入れられる賦形剤または栄養素を含んで成る組成物も提供し、前記ヒト血中蛋白質はヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列を含有する単子葉植物の中で産生され、前記単子葉植物から収穫した種子から精製したものである。前記栄養素は前記単子葉植物以外の原料から採ったものである。このような調合物を非経口、腸内、吸入、鼻内または局所送達の目的で用いることができる。
本発明の以下の詳細な説明を添付図および請求の範囲と合わせて読むことで、本発明の前記および他の目的および特徴がより詳細に明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
特に明記しない限り、本明細書で用いる用語は全部以下に示す意味を有するか、或は一般的に当業者にとって当該用語が持つ意味に一致する。実施者は、技術的定義及び表現に関し、特にサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（１９８９年）モレキュラー クローニング、ア ラボラトリー マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（第２版）、コールド スプリング ハーバー プレス、ニューヨーク州プレインビュー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．）、オースベル エフエム（Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ）他（１９９３年）カレント プロトコルズ イン モレキュラー バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ジョン ウィリー アンド サンズ、ニューヨーク州ニューヨーク（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）およびヘルフィン（Ｇｅｌｖｉｎ）およびスヒルペロー（Ｓｃｈｉｌｐｅｒｏｏｔ）編集（１９９７年）プラント モレキュラー バイオロジー マニュアル（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｍａｎｕａｌ）、クルウェール アカデミック パブリッシャーズ、オランダ国（Ｋｌｕｗｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）が参考になるであろう。
【００１５】
本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡの形態またはＤＮＡの形態でもよく、これらにはメッセンジャーＲＮＡ、合成ＲＮＡおよびＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが含まれる。そのようなＤＮＡは二本鎖または一本鎖でもよく、そして一本鎖の場合にはコード鎖または非コード（アンチセンス、相補）鎖でもよい。
植物細胞を言及する時の用語「安定に形質転換された」は、その植物細胞がゲノムの中に一体化されている外来（異種）核酸配列を有していてそれが二世代以上に亘って保持されることを意味する。
「宿主細胞」は、ベクターを含有しかつ異種核酸配列の複製および／または転写および／または発現を支援する細胞を意味する。本発明による宿主細胞は単子葉植物細胞が好ましい。ＤＮＡを所望植物宿主細胞に移動させるための細菌、酵母、昆虫、両生類または哺乳動物の細胞のような他の宿主細胞を二次的宿主として用いることも可能である。
「植物細胞」は、植物に由来する細胞のいずれかを指し、未分化組織（例えばカルス）ばかりでなく植物の種子、花粉、珠芽、胚、懸濁培養物、分裂領域、葉、根、芽、配偶体、胞子体および小胞子が含まれる。
【００１６】
用語「成熟した植物」は完全に分化した植物を指す。
用語「種子製品」には、これらに限定するものでないが、種子画分、例えば皮が剥かれた全種子、粉（製粉によって皮が剥かれかつ粉末になるまで粉砕された種子）、種子抽出物、好適には蛋白質抽出物（粉の蛋白質画分を炭水化物画分から分離した場合）、モルト（モルト抽出液またはモルトシロップを包含）および／または遺伝子組換え穀類から得られた精製蛋白質画分が含まれる。
用語「生物学的活性」は、本分野の技術者が当該蛋白質に典型的に帰すると考えるいかなる生物学的活性をも指す。
用語「血中蛋白質」は、正常なヒト血液に存在する１種以上の蛋白質またはそれらの生物学的に活性なフラグメントを指し、ヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、プロトロンビン／トロンビン、抗体、血液凝固因子（第Ｖ因子、第ＶＩ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、第ＸＩ因子、第ＸＩＩ因子、第ＸＩＩＩ因子、フレッチャー因子、フィッツジェラルド因子およびフォン・ヴィレブランド因子）およびそれらの生物学的に活性なフラグメントが含まれるが、これらに限定するものではない。
用語「非栄養的」は、主要な効果として受容者に栄養を与えることのない薬学的に受け入れられる賦形剤を指す。好ましくは、その賦形剤は腸に送達される調合物に下記のうちの一つの役割を提供する。治療用蛋白質用の担体として働くこと、消化管の中で当該蛋白質を酸から保護すること、送達すべき活性材料を持続放出させること、または当該血中蛋白質を当該患者に投与するに有用な品質を当該製剤に与えることである。
【００１７】
「単子葉植物種子成分」は、単子葉植物の種子、典型的には成熟した単子葉植物の種子から抽出可能な炭水化物、蛋白質および脂質成分を指す。
「種子成熟」は、受精から出発して代謝貯蔵物、例えば糖、オリゴ糖、澱粉、フェノール成分、アミノ酸および蛋白質などが種子（穀類）の中のいろいろな組織、例えば胚乳、種皮、アリューロン層および小鱗片上皮などに空胞標的の有り無しで蓄積する結果として起こる種子の増大、登熟そして種子の乾燥で終わる期間を指す。
「成熟特異的蛋白質プロモーター」は、種子成熟中に実質的に上方調節される活性（２５％を超える度合で）を示すプロモーターを指す。
「異種ＤＮＡ」は、植物細胞の中に別の源から導入されたか或はある植物源（同じ植物源を包含）に由来するが異種ＤＮＡの発現を正常には調節しないプロモーターの制御下にあるＤＮＡを指す。
「異種蛋白質」は、異種ＤＮＡがエンコードする蛋白質である。
「シグナル配列」は、Ｎ末端もしくはＣ末端ポリペプチド配列であり、結合されるペプチドまたは蛋白質が選択された細胞内もしくは細胞外領域にあると特定するのに有効である。本発明によれば、好ましくは、シグナル配列は結合されたペプチド又は蛋白質を胚乳細胞、より好ましくは細胞内空胞または他の蛋白質貯蔵体、葉緑体、ミトコンドリアまたは小胞体などの胚乳細胞小器官、または細胞外空間部のような位置に宿主細胞からの分泌後に配置させることを目標とする。
【００１８】
本発明で用いるに適した発現ベクターは、植物の中で関連した上流および下流配列と一緒になって機能するように考案したキメラ核酸構築物（または発現ベクターまたはカセット）である。
一般的に、本発明の実施で用いる発現ベクターは、キメラ遺伝子を構成する下記の機能的にリンクした成分を含む。熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、前記プロモーターと機能的にリンクしていて、リンクしたポリペプチドが胚乳細胞、好ましくは蛋白質貯蔵体などの胚乳細胞の小器官を標的にすることが可能な単子葉植物種子特異的シグナル配列（例えばＮ末端リーダー配列またはＣ末端トレーラ配列）をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中でリンクしていてヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列である。好ましくは、前記シグナル配列が植物細胞の中で前記ヒト血中蛋白質から開裂するようにする。
次に、前記キメラ遺伝子は通常適切な植物形質転換用ベクターの中に配置される。前記ベクターは、（ｉ）前記キメラ遺伝子の上流および／または下流に位置する伴配列（これはプラスミドまたはウイルスが源になっておりかつ当該ベクターがＤＮＡを細菌から所望の植物宿主に移動させることを可能にするに必要な特徴を前記ベクターに与える）、（ｉｉ）選択可能マーカー配列、および（ｉｉｉ）転写終結領域（これは一般に当該ベクターの転写開始調節領域とは反対側の末端部に位置する）を有する。
【００１９】
本技術分野ではいろいろな植物宿主細胞に適した数多くの種類の発現ベクターおよび適切な調節配列が知られている。種子成熟条件下で誘導可能な様式で調節されるようにプロモーター領域を選択する。本発明のそのような実施例の１つの面において、本発現構築物は、種子成熟中に特異的に上方調節される活性を示すプロモーターを含む。本発明で用いるプロモーターは、通常、イネ、大麦、小麦、カラスムギ、ライムギ、トウモロコシ、粟、ライ小麦またはソルガムなどの穀類に由来するプロモーターである。そのようなプロモーターの例には、下記の成熟特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の中の１つと関連する成熟特異的プロモーター領域が含まれる。それらは、イネのグルテリン、オリジンおよびプロラミン、大麦のホルデイン、小麦のグリアジンおよびグルテリン、トウモロコシのゼインおよびグルテリン、カラスムギのグルテリン、およびソルガムのカフィリン、粟のペニセチンおよびライムギのセカリンである。そのような遺伝子に由来する代表的な調節領域の例はＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：６〜１４である。特にそのようなプロモーターを転写因子と協力させて用いる場合、種子成熟における発現に適した他のプロモーターには大麦の胚乳特異的Ｂ１−ホルデインプロモーター、ＧｌｕＢ−２プロモーター、Ｂｘ７プロモーター、Ｇｔ３プロモーター、ＧｌｕＢ−１プロモーターおよびＲｐ−６プロモーターが含まれる。
【００２０】
植物種子組織の中で優先的に発現するプロモーターを用いてヒト血中蛋白質をエンコードする核酸を発現させることに特に関心が持たれている。そのようなプロモーター配列の例には、植物貯蔵蛋白質遺伝子をエンコードする配列に由来する配列または脂肪種子の中で起こる脂肪酸生合成に関与する遺伝子に由来する配列が含まれる。好ましい典型的プロモーターには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で例示するような胚乳の外側層の中で遺伝子発現を起こすグルテリン（Ｇｔ１）プロモーター、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７で例示するような胚乳の中心部で遺伝子発現を起こすグロブリン（Ｇｌｂ）プロモーターが含まれる。プロモーター配列は自身と機能的にリンクした遺伝子コード配列の転写を制御し、それらの中には、天然に存在するプロモーター又は種子特異的転写を方向付けし得る天然プロモーターの領域と、２種以上のプロモーター要素が組み合わされているハイブリッドプロモーターとが含まれる。そのようなハイブリッドプロモーターを構築する方法は本技術分野で良く知られている。
【００２１】
ある場合には、プロモーターは本キメラ核酸構築物を導入すべき植物細胞と同じ植物種に由来する。別の実施例では、プロモーターは植物宿主細胞とは異種である。
別法として、ある種類の単子葉植物に由来する種子特異的プロモーターを用いて異なる単子葉植物または穀類以外の単子葉植物に由来する核酸コード配列の転写を調節することも可能である。
重要な蛋白質をエンコードすることに加え、本発現カセットまたは異種核酸構築物は、必要に応じて、当該蛋白質のプロセシングおよび転位を可能にするシグナルペプチドをエンコードするＤＮＡを含有する。典型的なシグナル配列は、単子葉植物成熟特異的遺伝子に関連した配列であり、それらは、グルテリン、プロラミン、ホルデイン、グリアジン、グルテニン、ゼイン、アルブミン、グロブリン、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ、澱粉合成酵素、分枝酵素、Ｅｍおよびリー(ｌｅａ)である。蛋白質貯蔵体用のシグナルペプチドをエンコードする典型的な配列を本明細書ではＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１５〜２１として識別する。
【００２２】
１つの好適な実施例における方法は、蛋白質を胚乳細胞、好ましくは蛋白質貯蔵体、ミトコンドリア、小胞体、空胞、葉緑体または他の色素体コンパートメントなどの胚乳細胞の小器官の中に局在化させることに向けたものである。例えば、蛋白質が葉緑体などの色素体を標的にする時には、発現を起こす目的で、本構築物は、当該遺伝子産物を当該色素体に向かわせる配列も使用する。そのような配列を本明細書では葉緑体運搬ペプチド（ＣＴＰ）または色素体運搬ペプチド（ＰＴＰ）と呼ぶ。このように、重要な遺伝子が葉緑体の中に直接挿入されない時には、本発現構築物は追加して重要な遺伝子が葉緑体に向かうようにする運搬ペプチドをエンコードする遺伝子も含有する。葉緑体運搬ペプチドは重要な遺伝子、或はＣＴＰを有する異種配列から得られ、本技術分野で公知である。例えばスミーケンス（Ｓｍｅｅｋｅｎｓ）他、１９８６年；ワスマン（Ｗａｓｍａｎｎ）他、１９８６年、ボン ヘイジン（Ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ）他、１９９１年、米国特許第４，９４０，８３５号および５，７２８，９２５号を参照のこと。また、当該蛋白質を小胞体（ＥＲ）に転位させるに適した追加的運搬ペプチド（クリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、１９９１年；ヴィターレ（Ｖｉｔａｌｅ）およびクリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）、１９９２年）、核内保留シグナル（シレー（Ｓｈｌｅｈ）他、１９９３年；ヴァラゴナ（Ｖａｒａｇｏｎａ）他、１９９２年）または空胞（ライケル（Ｒａｉｋｈｅｌ）およびクリスピールズ（Ｃｈｒｉｓｐｅｅｌｓ）１９９２年；ベドナレック（Ｂｅｄｎａｒｅｋ）およびライケル（Ｒａｉｋｅｌ）、１９９２年；また米国特許第５，３６０，７２６号も参照）を本発明の構築物で用いることも可能である。
【００２３】
別の典型的な種類のシグナル配列は、種子発芽中にアリューロン細胞が異種蛋白質を分泌するのを助長するに有効な配列であり、それには、アルファ−アミラーゼ、プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンドプロテアーゼ、リボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ、（１−３）−ベータ−グルカナーゼ、（１−３）（１−４）−ベータ−グルカナーゼ、エステラーゼ、酸性ホスファターゼ、ペントサミン、エンドキシラナーゼ、β−キシロピラノシダーゼ、アラビノフラノシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、（１−６）−ベータ−グルカナーゼ、ペリオキシダーゼおよびリソホスホリパーゼに関連したシグナル配列が含まれる。
いろいろな蛋白質貯蔵用蛋白質が成熟特異的プロモーターの制御下にあり、かつそのようなプロモーターを蛋白質体を標的にするシグナル配列と機能的にリンクさせることから、本キメラ遺伝子を構築する時、プロモーター配列とシグナル配列を単一の蛋白質貯蔵遺伝子から単離した後に血中蛋白質と機能的にリンクさせてもよい。１つの好ましい典型的プロモーター−シグナル配列は、イネのＧｔ１遺伝子に由来する配列であり、それはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６で識別する典型的な配列を有する。別法として、プロモーター配列とリーダー配列を異なる遺伝子から得ることも可能である。１つの好ましい典型的プロモーター−シグナル配列組み合わせは、イネのＧｔ１リーダー配列にリンクさせたイネのＧｌｂプロモーターであり、これの例はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７である。
好ましくは、植物の中で機能するように考案した発現ベクターもしくは異種核酸構築物は、発現カセットの上流および下流に伴配列を含有する。伴配列はプラスミドまたはウイルスが源の配列であり、当該ベクターがＤＮＡ、例えば複製起源と選択可能マーカーを含有する配列などを二次的宿主から植物宿主に移動可能とするのに必要な特徴を前記ベクターに与える。典型的な二次的宿主には細菌および酵母が含まれる。
１つの実施例における二次的宿主は大腸菌であり、複製起源はＣｏｌＥ１型であり、そして選択可能マーカーはアンピリシン耐性をエンコードする遺伝子である。そのような配列は本技術分野で良く知られておりかつ同様に商業的に入手可能である[例えばクロンテック社、カリフォルニア州パロアルト（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．）；ストラタジーン社、カリフォルニア州ラホラ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）]。
【００２４】
転写終結領域は、通常に転写開始領域と結合している遺伝子、或は異なる遺伝子から取ることが可能である。典型的な転写終結領域にはアグロバクテリウムＴｉプラスミドに由来するＮＯＳターミネータおよびイネα−アミラーゼターミネータが含まれる。
また、高レベルの転写および妥当な転写終結のそれぞれを最適にする目的で本発現カセットにポリアデニル化テールを付加させることも可能である。ポリアデニル化配列には、これらに限定するものでないが、アグロバクテリウムオクトピン合成酵素シグナルまたは同じ種のノパリン合成酵素が含まれる。
植物細胞における選択に適切な選択可能マーカーには、これらに限定するものでないが、カナマイシン（ｎｐｔｌｌ）、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラシクリンなどの抗生物質耐性遺伝子が含まれる。追加の選択可能マーカーには、ビアラホス耐性をコードするｂａｒ遺伝子、グリホセート耐性をエンコードする変異ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子、ブロモキシニル耐性を与えるニトリラーゼ遺伝子、イミダゾリノンもしくはスルホニル尿素耐性を与える変異アセトラクテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）、およびメトトレキセート耐性ＤＨＦＲ遺伝子が含まれる。
用いる個々のマーカー遺伝子は、当該ＤＮＡを導入しなかった細胞に比較して形質転換細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子である。好ましくは、それらは組織培養段階における選択を助長する選択可能マーカー遺伝子、例えばカナマイシン、ヒグロマイシンもしくはアンピシリン耐性遺伝子などである。
【００２５】
また、本発明のベクターを修正して、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ベクターに相同性を示す領域と、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに由来するＴ−ＤＮＡ境界領域とキメラ遺伝子または発現カセット（上述のもの）を含有する中間的植物形質転換用プラスミドを含有させることも可能である。その上、本発明のベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンスの武装解除した植物腫瘍誘発プラスミドを含有することも可能である。
一般的には、選択した核酸配列は本ベクターの中の適切な制限エンドヌクレアーゼの一部分或いは複数の部位の中に挿入される。本発明で用いるベクターを構築する時、当業者に公知の切断、連結反応そして二次的宿主細胞への形質転換の標準的な方法を用いる（一般的に、前記マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他、オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）他、およびヘルフィン（Ｇｅｌｖｉｎ）他を参照）。
植物の細胞または組織は発現構築物［例えば関心のある遺伝子が挿入されたプラスミドＤＮＡのような異種核酸構築物］と共にいろいろな標準的技術を用いて形質転換される。植物遺伝子発現の向上を助長する目的でベクターを有効に導入することが本発明の重要な面である。そのようなベクターの配列が安定に形質転換されること、好適には宿主のゲノムの中に一体化されるのが好ましい。
【００２６】
宿主植物細胞の形質転換の方法は本発明にとって重要ではない。当業者は、本分野の技術には多様な形質転換技術が存在し、かつ新規な技術が継続的に利用できるようになることを認識しているであろう。標的宿主植物に適切な如何なる技術も本発明の範囲内で使用可能である。例えば、本構築物はいろいろな形態で導入可能であり、そのような形態には、これらに限定するものでないが、ＤＮＡストランド、プラスミドまたは人工染色体が含まれる。本構築物の標的植物細胞への導入はいろいろな技術を用いて達成可能であり、そのような技術には、これらに限定するものでないが、燐酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、エレクトロポレーション、ミクロインジェクション、アグロバクテリウム媒介形質転換、リポソーム媒介形質転換、原形質融合またはミクロプロジェクタイルボンバードメント（クリストウ（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ）、１９９２年；サンフォード（Ｓａｎｆｏｒｄ）他、１９９３年）が含まれる。当業者は、詳細について文献を参考にし、本発明の方法の使用に適した技術を選択することが可能である。
植物細胞の形質転換にアグロバクテリウムを用いる場合、ベクターをアグロバクテリウム宿主の中に導入して、アグロバクテリウム宿主の中に存在するＴ−ＤＮＡまたはＴｉもしくはＲｉプラスミドによる相同的組換えを起こさせる。組換え用Ｔ−ＤＮＡを含有するＴｉもしくはＲｉプラスミドを武装させる（こぶの形成を可能にする）、又は武装解除させる（こぶの形成を不可能にする）ことが可能であるが、形質転換アグロバクテリウム宿主の中にｖｉｒ遺伝子が存在する限り、後者が許容される。武装したプラスミドを用いると正常な植物細胞とこぶの混合物が生じ得る。
【００２７】
アグロバクテリウムが宿主植物細胞の形質転換の際媒体として用いられる場合には、単数または複数のＴ−ＤＮＡ境界領域に隣接している発現もしくは転写用構築物は、大腸菌およびアグロバクテリウムの中で複製し得る広範宿主範囲ベクターの中に挿入されるが、ｐＲＫ２またはこれの誘導体などが広範宿主範囲ベクターの例として文献に記述されている。ディッタ（Ｄｉｔｔａ）他、１９８０年およびＥＰＡ ０ １２０ ５１５の文献を参照のこと。あるいは、植物細胞の中で発現される配列を個別の複製配列を含むベクターの中に挿入することも可能であるが、個別の複数配列の一方は大腸菌内でベクターを安定させ、他方はアグロバクテリウム内でベクターを安定させる。マックブライド（ＭｃＢｒｉｄｅ）およびサマーフェルト（Ｓｕｍｍｅｒｆｅｌｔ）１９９０年を参照すると、複製起源であるｐＲｉＨＲＩ（ジュアニン（Ｊｏｕａｎｉｎ）他、１９８５年）が用いられ、宿主アグロバクテリウム細胞における植物の発現ベクターの安定性を増加させる。
本発現構築物に組み込むＴ−ＤＮＡは、形質転換アグロバクテリウムと形質転換植物細胞の選択を可能にする１種以上の選択可能マーカーコード配列である。植物細胞に関する使用に適した抗生物質耐性マーカーが数多く開発されており、それらには、カナマイシン、アミノグリコシドＧ４１８、ヒグロマイシン等の抗生物質を不活性にする遺伝子が含まれる。使用する個々のマーカーは本発明にとって必須ではなく、好適な個々のマーカーは個々の宿主および構築様式に依存する。
【００２８】
植物細胞のアグロバクテリウム媒介形質転換では、外植片はアグロバクテリウムと共に結果として感染がもたらされるに充分な時間インキュベートし、細菌を殺した後、植物細胞を適切な選択用培地の中で培養する。カルス形成後、公知方法に従って適切な植物ホルモンを用いることで芽形成を促すことも可能で、その後芽を発根用培地に移して植物を再生させる。次に、その植物を生育させて結実させた後、その種子を用いて世代の繰り返しを確立しそして前記植物が産生した組換え型蛋白質を単離する。
２種以上の発現構築物を含有する植物細胞を得る方法は、数多く存在する。１つの方策として、植物細胞は１番目の構築物と２番目の構築物を単一の形質転換用ベクターの中に含有させるか或はその中の１つが所望遺伝子を発現する個別のベクターを用いることにより、両方の発現構築物で同時形質転換される。２番目の構築物はすでに１番目の発現構築物で形質転換された植物の中に導入されるか、或は別法として、１つが１番目のそして１つが２番目の構築物を有する形質転換植物を交雑させることで前記構築物を同じ植物の中に共に持ち込むことも可能である。
【００２９】
好ましい実施例において、本発明の方法で用いる植物はイネ科として知られる分類学的科の員に由来する植物である。それはイネ科の員全部を含み、その中で食用品種は穀類として知られる。そのような穀類には非常に多様な種、例えば小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｓｐｓ．）、イネ（Ｏｒｙｚａ ｓｐｓ．）、大麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ ｓｐｓ．）、カラスムギ（Ａｖｅｎａ ｓｐｓ．）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ ｓｐｓ．）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）（Ｚｅａ ｓｐｓ．）および粟（Ｐｅｎｎｉｓｑｔｔｕｍ ｓｐｓ．）などが含まれる。本発明の実施に好適な穀類はイネ、小麦、トウモロコシ、大麦、ライ麦およびライ小麦であり、イネが最も好ましい。
ヒト血中蛋白質を種子の中に発現する遺伝子組換え植物を生産する目的で、単子葉植物の細胞またはそれから得た組織はヒト血中蛋白質のコード配列を含んで成る発現ベクターで形質転換される。その遺伝子組換え植物細胞を適切な選択剤を含む培地の中で培養することで、異種核酸配列を発現する植物細胞を識別して選択する。異種核酸配列を発現する植物細胞を選択した後、選択した遺伝子組換え植物細胞から全植物体を再生させる。形質転換植物細胞から全植物体を再生させる技術は本技術分野で一般に公知である。遺伝子組換え植物株、例えばイネ、小麦、トウモロコシまたは大麦などを育成させそして通常の植物繁殖技術を用いて遺伝的交雑を行ってもよい。
【００３０】
形質転換植物細胞を選別し、選択剤濃度が閾値の選択培地の中で培養可能かどうかを調べる。通常、選択培地の上または中で増殖した植物細胞は新しく供給した同じ培地に移され再び培養される。次に、その外植片を再生条件下で培養することで再生した植物芽を生じさせる。芽形成後、その芽を選択的発根用培地に移すことで完全な植物体を生じさせる。次に、その植物体を生育させて結実させ、切り取ることなどで、形質転換植物を繁殖させることも可能である。そのような方法は植物細胞の効率良い形質転換そして組換え型ヒト血中蛋白質を産生し得る遺伝子組換え植物の再生を可能にする。
組換え型ヒト血中蛋白質の発現は標準的分析技術、例えばウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、ＨＰＬＣ、ＮＭＲまたは質量分析などを用いることに加えて、発現させるべき個々の蛋白質に特異的な生物学的活性を検定することで立証可能である。
本発明はまた、植物細胞の中に組換えて産生した精製血中蛋白質、好ましくは宿主植物細胞が実質的に汚染されておらず、かつ好適には少なくとも１種の植物グリコシル基を含有する血中蛋白質も提供する。植物グリコシル基は、血中蛋白質が植物の中に産生されたことを示すと同時に、適用される治療事情のいずれにおいても血中蛋白質の生物学的活性を著しく損ねることはない（組換のないヒト血中蛋白質と比較した時の活性損失度合は好適には２５％未満であり、より好ましくは１０％未満である）。本発明のいくつかの実施例によれば、通常、ヒト血中蛋白質は遺伝子組換え植物から収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約０．５％、少なくとも約１．０％または少なくとも約２．０％を構成する。しかしながら、好ましい実施例における蛋白質発現は以前に報告された発現よりもずっと高い、即ち少なくとも約３．０％であり、よって、商業的生産の実現性が極めて高い。蛋白質の発現は可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％または少なくとも約４０％でさえあるのが好ましい。
【００３１】
本発明は、その収穫した種子から製造した植物種子製品も包含する。好ましくは、ヒト血中蛋白質は本種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％、より好適には少なくとも約５．０％、最も好ましくは少なくとも約１０．０％を構成する。本図に示すように、ＡＡＴに代表される米粒中のヒト血中蛋白質、３種類のフィブリノゲンポリペプチドおよびＨＳＡの発現は可溶蛋白質全体の少なくとも約１０％を占める。
本発明は、また、単子葉植物の種子の中に組換えて産生したヒト血中蛋白質を含んで成る組成物、及びその組成物を製造する方法も提供する。本発明の実施において、ヒト血中蛋白質はその核酸コード配列を発現する遺伝子組換え植物の種子または粒の中に産生される。発現後、血中蛋白質を実質的に未精製形態（即ち、当該組成物の少なくとも２０％が植物材料を含んで成る）で患者に提供するか、或はその血中蛋白質を成熟した種子の製品（例えば、粉、抽出物、モルトまたは全種子など）から単離または精製しそして調合することで患者に提供することも可能である。
そのような組成物には、意図される送達の種類に適した配合物が含まれる。送達の種類には、非経口、腸内、吸入、鼻内または局所送達などが含まれる。非経口送達には、静脈内、筋肉内または座薬などが含まれ、腸内送達には、ピル、カプセル、または他の非栄養的な薬学的に許容可能な賦形剤で作られた製剤、または例えば蛋白質が作られる穀類の抽出液内のような遺伝子組換え植物に由来する栄養素、あるいは遺伝子組換え植物以外の源に由来する栄養素を含む組成物を経口投与することなどが含まれる。そのような栄養素には、塩、糖、ビタミン、鉱物、アミノ酸、ペプチド、そして当該ヒト血中蛋白質以外の蛋白質などが含まれる。鼻内および吸入送達システムには、鼻孔または口の中に入れるスプレーまたはエーロゾルが含まれる。局所送達には、クリーム、局所的スプレーまたは軟膏などが含まれる。好ましくは、そのような組成物は実質的に遺伝子組換え植物の汚染物を含まず、植物材料含有量を好適には２０％未満、より好適には１０％未満、最も好適には５％未満にする。好適な投与経路は腸内であり、組成物は非栄養的であるのが好ましい。
血中蛋白質は、前記種子製品から粉砕、濾過、加熱、加圧、塩抽出、蒸発またはクロマトグラフィーなどの方法で精製可能である。
【００３２】
本発明に従って産生させるヒト血中蛋白質はまた、対立遺伝子変異体或は合成変異体であるかに拘わらずあらゆる変異体を含む。「変異」ヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列は、天然の血中蛋白質配列からの１個以上のアミノ酸により変化される変異ヒト血中蛋白質アミノ酸配列をエンコード可能であり、少なくとも１個のアミノ酸が置換、欠失または挿入されるのが好ましい。変異体をもたらす核酸の置換、挿入または欠失は、エンコードされるアミノ酸配列が天然のヒト血中蛋白質の生物学的活性と実質的に同じ活性を維持している限り、配列内のいずれかの残基において発生する可能性がある。別の実施例では、変異ヒト血中蛋白質核酸配列は天然の配列と同じポリペプチドをエンコードし得るが、遺伝子コードが縮重していることが理由で、変異体は天然のポリヌクレオチド配列からの１個以上の塩基により変化される核酸配列を有する。
変異核酸配列は、「保存」置換を含む変異アミノ酸配列をエンコード可能であり、前記保存置換においては、置換されたアミノ酸は置換する前のアミノ酸と同様な構造的または化学的特性、及び自然界に見られる相同蛋白質における物理化学的アミノ酸側鎖特性および高置換度を有する（標準的ＤａｙｈｏｆｆフレクエンシーエクスチェンジマトリックスまたはＢＬＯＳＵＭマトリックスなどで測定したもの）。加えて、或は別法として、変異核酸配列は、「非保存」置換を含む変異アミノ酸配列をエンコード可能であり、前記非保存置換においては、置換されたアミノ酸は置換する前のアミノ酸と異なる構造的または化学的特性を有する。当業者に一般的に知られているように、標準的置換の種類には自然界に見られる相同蛋白質が示す共通の側鎖特性および最大置換度を基にした６種類のアミノ酸が含まれ、変異ヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列を発展させるのに用いられる。
【００３３】
当業者に理解されるように、ある場合には、天然には存在しないコドンを持たせたヒト血中蛋白質をエンコードするヌクレオチド配列を用いるのも有利と考えられる。個々の真核細胞宿主に好適なコドンは、例えばヒト血中蛋白質発現速度を速めるため、または天然に存在する配列がもたらす転写物よりも半減期が長いといったような望ましい特性を有する組換え型ＲＮＡ転写産物を生産するために選択される。例として、イネの中で発現させた遺伝子のコドンでは３番目のコドン位置の中のグアニン（Ｇ）またはシトシン（Ｃ）が豊富であることが示されている（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、１９９０年）。低いＧ＋Ｃ含有量から高いＧ＋Ｃ含有量に変えると大麦粒の中の外来蛋白質遺伝子の発現レベルが高くなることが分かっている（ホーバス（Ｈｏｒｖａｔｈ）他、２０００年）。本発明で用いる血中蛋白質をエンコードする遺伝子は、イネ遺伝子コドンバイアス（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、１９９０年）を遺伝子クローニング用の適切な制限部位と共に用いることを基にしたオペロン技術［カリフォルニア州アラメダ（Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）］を用いて合成された。これらの「コドン最適化」遺伝子を種子指向単子葉植物発現用の調節/分泌配列と連結させた後、これらのキメラ遺伝子を適切な植物形質転換用ベクターの中に挿入した。
【００３４】
ヒト血中蛋白質をエンコードするヌクレオチド配列は、これらに限定するものでないが、細胞によるヒト血中蛋白質のクローニング、プロセシングおよび／または発現を修正する変化を含む様々な理由で、ヒト血中蛋白質コード配列を変えるために操作される。
異種核酸構築物は所定のヒト血中蛋白質のコード配列を含むことが可能であるが、それは（ｉ）孤立した状態、（ｉｉ）ヒト血中蛋白質コード配列が主要なコード配列である融合蛋白質またはシグナルペプチドのような追加的コード配列と組み合わされた状態、（ｉｉｉ）コード配列を適切な宿主の中で発現させるに有効である、イントロン、或いはプロモーターやターミネータ要素もしくは５’および／または３’非翻訳領域を始めとする制御要素等の非コード配列と組み合わされた状態、および／または（ｉｖ）ベクター或いはヒト血中蛋白質コード配列が異種遺伝子である宿主環境の中に存在する状態で含むことが可能である。
発現構築物は、意図した用途に応じて、ヒト血中蛋白質全体をエンコードする核酸配列か或はその一部を含有可能である。例えば、プローブとして用いられる構築物にヒト血中蛋白質配列を用いる場合は、高度に保存されているヒト血中蛋白質領域をエンコードすることが確認されている配列のようなヒト血中蛋白質エンコード配列の特別な部分のみを含む構築物を調製する方が有利と思われる。
【００３５】
本発明は、１つの実施例において、成熟した単子葉植物種子から得た粉、抽出物またはモルト及び種子が産生した１種以上のヒト血中蛋白質を未精製形態で含有する種子組成物を提供する。そのような粉から血中蛋白質を単離することに伴い、種子を粉砕して粉にし、その粉を緩衝水溶液で抽出しそして場合に応じて抽出物を部分的に濃縮および／または不要な成分を除去することで抽出組成物を形成することが可能である。好ましい方法では、イネの種子のような成熟した単子葉植物種子を粉砕して粉にした後、その粉を食塩水または燐酸塩緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）、重炭酸アンモニウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液またはトリス緩衝液のような緩衝液に入れて懸濁させる。重炭酸アンモニウムまたは酢酸アンモニウムのような揮発性緩衝剤又は塩は、塩を除去する段階は必要でなく、よって抽出処理方法が簡単になる。
前記粉懸濁液を振とうしながら２０〜５５℃の範囲の温度で典型的には３０分から４時間インキュベートする。その結果として得たホモジェネートを濾過または遠心分離のいずれかで浄化する。浄化した濾液または上澄み液に脂質、糖および塩のような汚染物を除去するため、限外濾過もしくは透析または両方などのさらなる処理を加えてもよい。最後に、材料を例えば凍結乾燥などで乾燥させ、乾燥したケーキまたは粉末を生じさせてもよい。そのような抽出物は血中蛋白質の収率が高いことに加えて、蛋白質精製に伴う損失が本質的に限られていると言った利点を有する。
一般的には、蛋白質が成熟した種子産物の中に産生された時点で、本技術分野で公知の濾過、アフィニティーカラム、ゲル電気泳動および他の標準的手順のような標準的方法を用いて前記蛋白質を更に精製してもよい。次に、精製した蛋白質をヒト患者に送達するのに望ましい様式で調合してもよい。治療用製剤では２種以上の蛋白質を結合することが可能である。蛋白質を食料以外の目的で投与することが要求される生物医学用途では、その蛋白質を精製して用いてもよい。
以下の実施例は本発明を説明するものであり、決して本発明を制限することを意図するものでない。
【実施例１】
【００３６】
ＡＡＴとフィブリノゲンポリペプチドをエンコードする遺伝子組換えイネの生産
粒子ボンバードメント媒介イネ形質転換および植物再生の基本的手順を、ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、（２００１年）が記述した如く実施した。イネ変異体ＴＰ３０９種子の皮を剥き、５０％（体積／体積）の市販漂白剤に２５分間入れることで殺菌した後、無菌水で洗浄した。殺菌した種子をＮ６塩（Ｓｉｇｍａ）、Ｂ５ビタミン（Ｓｉｇｍａ）、２，４−Ｄを２ｍｇ／ｌおよびスクロースを３％入れたイネカルス誘発培地（ＲＣＩ）プレートの上に置いた。前記イネ種子を１０日間インキュベートすることでカルス形成を誘発した。前記種子から一次カルスを切り取って、ＲＣＩの上に３週間置いた。これを更に２回行うことでボンバードメントで用いる二次および三次カルスを形成し二次培養を継続した。ボンバードメントを行う前に、直径が１〜４ｍｍのカルスを、マンニトールを０．３Ｍとソルビトールを０．３Ｍ入れたＲＣＩの上に４ｃｍの円の状態で５〜２４時間置いた。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＣ−１０００／Ｈｅ装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてミクロプロジェクタイルボンバードメントを実施した。この手順では１．５ｍｇの金粒子（６０ｕｇ／ｍｌ）を２．５ｕｇのＤＮＡで被覆する必要がある。１１００ポンド毎平方インチ（約７．５８４２３ｘ１０６パスカル）のＨｅ圧力を用いて、ＤＮＡで被覆しておいた金粒子をイネカルスに衝突させた。ボンバードメント後のカルスを４８時間かけて回復させた後、選択の目的でヒグロマイシンＢを３０ｍｇ／ｌ入れておいたＲＣＩに移して、２６℃の暗所で４５日間インキュベートした。形質転換カルスを選択して、ＡＢＡを５ｍｇ／ｌ、ＢＡＰを２ｍｇ／ｌ、ＮＡＡを１ｍｇ／ｌおよびヒグロマイシンＢを３０ｍｇ／ｌ入れたＲＣＩ（２，４−Ｄを除く）に移して９〜１２日間置いた。形質転換カルスを、ヒグロマイシンＢを含まずＢＡＰを３ｍｇ／ｌおよびＮＡＡを０．５ｍｇ／ｌ入れたＲＣＩ（２，４−Ｄを除く）からなる再生用培地に移して、連続照明条件下で２〜４週間培養した。再生した植物体（高さが１〜３ｃｍ）を、濃度がＭＳ培地（Ｓｉｇｍａ）の濃度の半分であり、スクロースを１％およびＮＡＡを０．０５ｍｇ／ｌ加えた発根用培地に移した。植物体は発根用培地上で２週間後に根を出し、芽が約１０ｃｍになるまで生育させた。植物を商業的土壌（Ｓｕｎｓｈｉｎｅ ＃１）が５０％、田圃の土壌が５０％に混合した６．５ｘ６．５ｃｍのポットに移した。植物をプラスチック製容器で覆ってほぼ１００％の湿度を保持しそして連続光の下で１週間生育させた。その透明なプラスチック製カバーを１日かけてゆっくり移動させることで、湿度と水を徐々に少なくしそして必要に応じて肥料を加えた。遺伝子組換えＲ０植物の高さが約２０ｃｍになった時点で、それらを温室に移して、その中で成熟するまで生育させた。
個々のＲ０再生植物から得た個々のＲ１種子粒を胚と胚乳に切り裂いた。その単離したイネ胚乳の中の組換え型血中蛋白質（ＡＡＴおよびフィブリノゲンポリペプチド）の発現レベルを検査した。組換え型蛋白質発現の度合が高い個々のＲ１粒から得た胚を、５０％の漂白液に入れて２５分間殺菌した後、無菌蒸留水で洗浄した。殺菌した胚をスクロースを１％とＮＡＡを０．０５ｍｇ／ｌ添加した１／２のＭＳ基礎塩を含む組織培養管の中に入れた。約２週間で、胚が発芽し７ｃｍまでの芽と健康な根系を有する植物体を得た。成熟したＲ１植物が再生体として得られた。
【実施例２】
【００３７】
組換え型血中蛋白質を含有する米抽出物の製造、さらに非経口および腸内用製剤での前記抽出物の使用
一般的な米抽出物製造手順
異種ポリペプチドを含有する遺伝子組換え米を乾式製粉または湿式製粉方法のいずれかで米抽出物に変化させることができる。乾式製粉方法では、異種ポリペプチドを含有する遺伝子組換え水稲種子の皮を皮剥き機で剥いた。その米を例えば１つの実験ではＫ−ＴＥＣのモデル９１ Ｋｉｔｃｈｅｎ Ｍｉｌｌを速度３で用いるなどして乾式製粉工程で粉砕して微細な粉にした。この米粉に燐酸緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）が加えられ、ＰＢＳは、０．１３５ＮのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４をｐＨ７．４で含み、さらに場合によっては０．３５ＮのＮａＣｌのような追加のＮａＣｌも含む。いくつかの実験では、粉１ｇ当たり約１０ｍｌの抽出用緩衝液を用いた。他の実験では、初期の粉／緩衝液の比率を１ｇ／４０ｍｌから１ｇ／１０ｍｌの範囲で変化させた。混合物を穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。別の実験では、インキュベートの温度を例えば約２２℃から約６０℃のように低く或は高くし、インキュベーション時間を例えば約１０分から約２４時間のように長く或は短くした。Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ ＶａｒｉＭｉｘプラットフォームミキサーを高速に設定して用いることで粒子を懸濁状態に保持した。
いくつかの実験では、ＰＢＳの代わりに他の緩衝剤、例えば重炭酸アンモニウムなどを用いた。１つの実施例では、１ｋｇの米粉に０．５Ｍの重炭酸アンモニウムを１０リットル加えた。
その結果として得られるホモジェネートを濾過または遠心分離のいずれかで浄化した。濾過の方法として、混合物を室温で約３０分間沈降させた後、ホモジェネートを集めて濾過した。ポール ゲマンサイエンシーズ（Ｐａｌｌ Ｇｅｍａｎｓｃｉｅｎｃｅｓ）から購入した異なる３種類の形態のフィルターが用いられ、それらは３μｍのひだ付きカプセル、１．２μｍの血清用カプセルおよびＳｕｐｏｒｃａｐカプセル５０（０．２μｍ）であった。遠心分離はＢｅｃｋｍａｎ Ｊ２−ＨＣ遠心分離機を用いて、前記混合物に３０，０００ｇの遠心分離を４℃で約１時間行った。その上澄み液を保持しそして沈澱物を廃棄した。
１つの実施例では、その濾液および上澄み液にさらなる処理、例えば限外濾過法や透析または両方などによる処理を受けさせることで、脂質、糖および塩などの成分を除去した。
次に、上記の濾過手順で得た濾液（これは浄化抽出液とも呼ばれる）をバッチ式循環様式で操作された螺旋巻きタンジェンシャルフローフィルターを用いて濃縮した。１つの実施例では、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）３０００〜４０００分子量カットオフ膜をこの段階で用いた。濃縮された最終的な抽出液を冷室の中に一晩保持した。
次に、前記濃縮抽出液を凍結乾燥で乾燥させて粉末にした。凍結乾燥材料を凍結乾燥機のトレーからすくい取って、共にプラスチック製バッグの中に入れた。バッグに真空をかけることで乾燥材料を圧縮した後、この材料をプラスチックを通して手でこねることで混合し、かつ粒径を小さくした。
また、湿式製粉手順を用いて米抽出液を製造することも可能である。組換え型ヒト血中蛋白質を含有する遺伝子組換え水稲種子は３０℃で０から２８８時間再水和させてもよい。再水和した種子を抽出用ＰＢＳ緩衝液の中で粉砕する。初期の種子／緩衝液の比率を例えば１ｇ／４０ｍｌから１ｇ／１０ｍｌの範囲で変化させてもよい。
そのような湿式製粉方法を用いるとヒト血中蛋白質を２０％を超える度合で回収することができる。湿式製粉の結果として、血中蛋白質標的の安定性に応じて、初期の抽出液を冷えた状態（４℃）に保持することができるか或は使用時まで凍結状態で貯蔵することが可能になる。初期抽出液を処理して乾燥した抽出物を得る様式はこの章の乾式製粉に関する記述のものと同様である。
【実施例３】
【００３８】
組換え型血中蛋白質および対照イネ抽出物の濃縮および透析濾過
濃縮および透析濾過で用いる条件は体積、速度、費用などに応じて変化する。これらの条件は本明細書の開示に関する本技術分野で標準的なものである。凍結した初期抽出物を冷室（約２〜８℃）の中で６時間かけて解凍させた。その解凍材料を０．４５μｍのフィルターに通すことで浄化した後、ポリエーテルスルホンの５０００ノミナル（Ｎｏｍｉｎａｌ）分子量カットオフ膜を用いて濃縮した。
９０ｍｌの対照抽出物の濾液を濃縮して１０ｍｌにした後、濃縮濾液に脱イオン水をさらに１０ｍｌ加えてもよい。希釈した濾液に水を用いた透析濾過をもう一度行ってもよい。沈澱物は１６ｍＳの時に生じ始めイオン強度を低くするにつれて増加する。イオン強度を高める目的で１．０Ｍの重炭酸アンモニウム溶液を保持液に添加した。曇りが完全には消失しなかったが減少した。その材料に水を用いた透析濾過を数回、１つの実施例では３回受けさせ、そして０．１Ｍの重炭酸アンモニウムを用いて数回、１つの実施例では３回受けさせた。材料を濃縮して９ｍｌにした後、膜を０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで濯いだ。濃縮液を数枚の０．２μｍのボタンフィルターに通して濾過した。１つの実施例では、２．３ｍｌの濾液に凍結乾燥をそのまま行い、また２．３ｍｌの濾液を脱イオン水で希釈し１２ｍｌにした後に凍結乾燥を行い、また２．０ｍｌの濾液を脱イオン水で希釈し２５ｍｌにした後に凍結乾燥を行った。これらの濾液は全部透明なままであった。
全体で８９ｍｌの組換え型蛋白質抽出液の濾液を濃縮して１０ｍｌにした後、０．１Ｍの重炭酸アンモニウムをさらに１０ｍｌ加える。結果として得られる混合物を濃縮し１０ｍｌに戻し、さらに０．１Ｍの重炭酸アンモニウムを１０ｍｌ加える。保持液が曇り始める。その材料に０．１Ｍの重炭酸アンモニウムによる透析濾過を数回、１つの実施例では３回受けさせた。材料を濃縮し９ｍｌにした後、膜を０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで濯いだ。濃縮液を数枚の０．４５μｍのボタンフィルターに通して濾過した。１つの実施例では、２．０ｍｌの濾液に凍結乾燥をそのまま行い、また２．０ｍｌの濾液を脱イオン水で希釈し１２ｍｌにした場合に曇りが生じ、その後凍結乾燥を行い、また２．０ｍｌの濾液を０．１Ｍの重炭酸アンモニウムで希釈して１２ｍｌにした場合は透明なままであり、その後凍結乾燥を受けさせた。
【実施例４】
【００３９】
組換え型蛋白質米にＰＢＳおよび重炭酸アンモニウムによる抽出を行う試行の比較
濃縮および透析濾過で用いる条件は体積、速度、費用などに応じて変化する。これらの条件は全部本明細書の開示に関する技術分野で標準的なものである。磁気撹拌子を用いて組換え型蛋白質米粉と抽出用緩衝液を約１００ｇ／Ｌの率で約１時間混合する。１つの２Ｌビーカーに入れた抽出用緩衝液はＰＢＳ（ｐＨ７．４）であり、これにＮａＣｌを０．３５Ｍ加えた。別の２Ｌのビーカーに入れた抽出用緩衝液は０．５Ｍの重炭酸アンモニウムである。１５ｃｍのブフナー漏斗を約６ｇのＣｅｌ−ｐｕｒｅ Ｃ３００で前もって覆った後、Ｃｅｌ−ｐｕｒｅ Ｃ３００を更に２０ｇ加える。前記混合物を約３〜４Ｈｇで濾過する。次に、濾過したものを約１００ｍｌづつの抽出用緩衝液で２回洗浄する。抽出濾液を集めて限外濾過カートリッジ、つまり５Ｋ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ、５Ｋ ＰＥＳおよび１Ｋ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅで濃縮した。濃縮液を凍結乾燥し、組換え型血中蛋白質活性含有量に関する分析を行った。重炭酸アンモニウムとＰＢＳ（ｐＨ７．４）プラス０．３５ＭのＮａＣｌの両方はほぼ等しい量のｒＡＡＴを抽出する。使用した限外濾過法装置のいずれを用いた時にも、透過液中の組換え型蛋白質単位の損失はほとんど無い。
また、遺伝子組換え米粒の中で発現させた組換え型蛋白質を抽出する目的で他の抽出用緩衝液を用いることも可能であり、例えば用途に応じてトリス緩衝液、酢酸アンモニウムなどを用いることも可能である。
【実施例５】
【００４０】
組換え型血中蛋白質を含有する米抽出液の生産
濃縮および透析濾過で用いる条件は体積、速度、費用などに応じて変化する。これらの条件は全部本明細書の開示に関する技術分野で標準的なものである。全ての装置を出発温度が約５５℃の熱い０．１ＭのＮａＯＨに浸漬する。米粉を０．５Ｍの重炭酸アンモニウムを入れておいた約２５０〜５００ガロン（約９４６．４〜１８９２．７立法デシメートル）のステンレス鋼製タンクに９５〜１０５ｇ／Ｌの比率で加える。そして約９℃で約６０〜８０分間混合する。
１２枚の３６インチフィルタープレスＣ３００を約３〜６ｋｇのＣｅｌ−ｐｕｒｅ Ｃ３００で前もって覆った。前記抽出液にＣｅｌ−ｐｕｒｅを約１９〜２６ｇ／Ｌ加えて徹底的に混合する。この混合物を約８２リットル／分の流量で流して約２２ポンド毎平方インチ（約１５１６８５パスカル）の圧力で圧縮する。その濾液を集めて２５０ガロン（約９４６．４立方デシメートル）のステンレス鋼製タンクに入れた後、０．５Ｍの重炭酸アンモニウムで洗浄する。その圧縮物をブロー乾燥させる。この過程を約１０℃で実施する。
対照実験の後に０．１ＭのＮａＯＨで洗浄して貯蔵しておいた３００ＮＭＷカットオフ膜［ポリスルホン（Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｎｅ）］を、脱イオン水で徹底的に濯ぐ。前記抽出液を濃縮した後、１００ガロン（約３７８．５立方デシメートル）のステンレス鋼タンクの中に入れる。前記膜と濃縮用タンクを０．１Ｍ重炭酸アンモニウムでフラッシュ洗浄することで残存する抽出液の全部を回収した。その生成物をプラスチックで覆って、１００ガロン（約３７８．５立方デシメートル）のタンクの中に室温で一晩放置した。その濃縮液を１μｍの螺旋巻きフィルターに通して濾過した後、５ガロン（約１８．９立方デシメートル）のポリ容器に入れる。
【実施例６】
【００４１】
組換え型蛋白質を含有する米抽出液を非経口用、吸入、鼻内および局所用製剤の中に混合
組換え型血中蛋白質（例えばＡＡＴ）を医学／薬学用途で用いる目的で、穀粒から高度に精製した粒にすることができる。ヒトＡＡＴを発現したイネ種子抽出液を精製するプロトコルが開発されたが（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、２００２年）、このプロトコルは、上述の実施例に従ってイネ種子抽出液を調製しそしてＣｏｎ−Ａ、ＤＥＡＥおよびＯｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィーのそれぞれを用いて抽出液調製物を更に精製することから成る。この手順を用いると、ＡＡＴを均質性が９０％を超える度合にまで精製することができる（ホワン（Ｈｕａｎｇ）他、２００２年）。精製ＡＡＴを下記の適応の潜在的薬学／医学用途で用いることができる。ＡＡＴ増強／置換治療（サンドハウス（Ｓａｎｄｈａｕｓ）、１９９３年；ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）他、１９８９年、のう胞性線維症（マックエルバニー（ＭｃＥｌｖａｎｅｙ）他、１９９１年；アレン（Ａｌｌｅｎ）、１９９６年）、乾癬、脂肪織炎および皮膚血管炎（オリョーダン（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ）他、１９９７年；ダウド（Ｄｏｗｄ）他、１９９５年）および肺の炎症（ビングル（Ｂｉｎｇｌｅ）およびテトレー（Ｔｅｔｌｅｙ）、１９９６年）。そのような適応のいくつかでは、精製ＡＡＴ蛋白質調剤を静脈内（ｉｖ）方法で０．０９％の食塩溶液の状態で投与してもよい。別法として、前記食塩溶液に血清アルブミンを０．５％用いた緩衝または他のある種の薬学的に受け入れられる蛋白質担体分子を用いた緩衝を受けさせることも可能である。ＡＡＴ投薬量は一般に約６０ｍｇ／ｋｇである。エーロゾル送達では、液滴の大きさが下気道に付着させるに適切な（空気動力学的直径が＜３ｕｍの）エーロゾルを発生させる能力を基にして選択した圧縮空気推進噴霧器を用いたエーロゾル発生装置を用いることができる（ハバード（Ｈｕｂｂａｒｄ）他、１９８９年）。再び、蛋白質を無菌水または薬学的に受け入れられる蛋白質担体を含む緩衝食塩溶液のいずれかに入れて懸濁させてもよい。別法として、前記精製蛋白質成分を含有する乾燥蛋白質粉末を分散剤として用いることも可能であり、乾燥蛋白質粉末は、ＡＡＴ成分が少なくとも５０重量％以上の米が基になった抽出物であってもよい。
別のケースでは、ＡＡＴ及びフィブリノゲンのようなヒト血中蛋白質を発現及び抽出した組換え型米を局所的に用いることも可能である。フィブリンシーラント／包帯の使用は医学界で幅広く受け入れられて使用されてきた。フィブリンシーラントは有効な止血剤であり（マンカッド（Ｍａｎｋａｄ）およびコディスポッティ（Ｃｏｄｉｓｐｏｔｉ）、２００１年）、組織接着を達成し、流体蓄積を防止しおよび創傷治癒を促進する手段である（スポットニッツ（Ｓｐｏｔｎｉｔｚ）、２００１年）である。フィブリンシーラントは薬剤徐放手段としても使用可能であり、抗生物質、成長因子および他の薬剤を含む（スポットニッツ（Ｓｐｏｔｎｉｔｚ）、１９９７年）。フィブリノゲンを発現した米はまたそれらの適応にとって効力のある、低コストで動物ウイルスを含まない源にも成り得る。
【００４２】
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ここに挙げた全ての刊行物は本明細書に明確に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】図１に、各々がイネグルテリンプロモーターＧｔ１の制御下にある、フィブリノゲンポリペプチドα（ｐＡＰＩ ３９８）、β（ｐＡＰＩ ４１７）およびγ（ｐＡＰＩ ３２７）をエンコードする３個のコドン最適化遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜３）を含有する構築物を伴うプラスミドを示す。ヒグロマイシン選択可能マーカーを含有するプラスミド（図示せず）を包含する前記プラスミドをエンブリオジェニック（ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ）イネカルスに衝突させて入り込ませることで、前記３個の遺伝子を成熟イネ種子の中に発現する遺伝子組換えイネ植物を作り出した。
【図２】図２に、ヒトフィブリノゲンの個々のサブユニットを発現する、遺伝子組換えイネ株のウエスタンブロット分析を示す。レーン１は、正の対照である精製天然ヒトフィブリノゲン（赤十字社から入手した）であり、これは３種類のポリペプチド鎖全部を示し、レーン２は、遺伝子組換え型ではないイネ品種であるＴａｐｅｌ ３０９から得た抽出物であり、レーン３は、分子量標準であり、レーン４は、フィブリノゲンα鎖を発現するイネ種子の抽出物であり、レーン５は、フィブリノゲンβ鎖を発現するイネ種子の抽出物であり、レーン６は、フィブリノゲンγ鎖を発現するイネ種子の抽出物である。イネ種子の蛋白質抽出の全部を２％ＳＤＳ、１Ｍ尿素、１％βＭｅおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で実施した。３種の鎖全部または個々の鎖のみを認識する抗体を用いてフィブリノゲンポリペプチドを検出した。
【図３】図３は、前記３種類のフィブリノゲンポリペプチド鎖（α、βおよびγ）が遺伝子組換えイネ種子の中に同時発現させ、ウエスタンブロット分析で分析したものを示す。３種類の鎖全部を認識する抗体を用いてフィブリノゲンポリペプチドおよび蛋白質凝集物を検出した。図３Ａは、非変性条件［３５０ｍＭのＮａＣｌ、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ−１００／ＣＨＡＰＳ］下で非変性１０％アクリルアミドゲル上で流すことでイネ種子から抽出した全蛋白質を示す。レーン１は、１μｇの精製ヒトフィブリノゲンであり、レーン２および３は、遺伝子組換え型ではないイネ品種であるＴａｐｅｌ ３０９から得た抽出物であり、レーン４は、分子量マーカーであり、レーン５および７は、抽出用緩衝液にβＭｅを１．０％含有させた２種類の遺伝子組換えイネ株から得た抽出物であり、レーン６および８は、抽出用緩衝液にβＭｅを入れていない２種類の遺伝子組換えイネ株から得た抽出物である。レーン６および８は、遺伝子組換え株を非変性条件下で複合天然ヒトフィブリノゲンのおおよその位置の所に流すことで抽出した大型の蛋白質凝集物を示している。図３Ｂに、イネ種子を２％ＳＤＳ、１Ｍ尿素、１％βＭｅおよびＰＢＳ（ｐＨ７．４）に入れてＳＤＳ−ＰＡＧＥの上で流すことで抽出した全蛋白質を示す。レーン１は、正の対照である天然ヒトフィブリノゲン（赤十字社から入手した）であり、これは３種類のポリペプチド鎖全部を示し、レーン２は、分子量標準であり、レーン３〜５は、３種類のフィブリノゲンペプチドの全部を発現する３種類の遺伝子組換えイネ株の各々である。
【図４】図４に、アルファ−１−アンチトリプシン（ＡＡＴ）のコドン最適化遺伝子（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）をイネグルテリンプロモーターＧｔ１の制御下で発現するプラスミドｐＡＰＩ ２５０を示す。このプラスミドを、ヒグロマイシン選択可能マーカー遺伝子を含有するプラスミド（図示せず）と共に、エンブリオジェニックイネカルスに衝突させて入り込ませることで、ＡＡＴを成熟イネ種子の中に発現する遺伝子組換えイネ植物を作り出した。
【図５】図５に、ヒト組換え型ＡＡＴを発現する遺伝子組換え米粒の、水相抽出液のクマシーブリリアントブルー染色を示す。形質転換していないイネ（イネ品種Ｋｉｔａａｋｅ）および形質転換イネ（個別の５遺伝子組換え植物からプールした〜１０個のＲ１種子）両方の種子をＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液と一緒にして粉砕した。その結果として得た抽出液を４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間回転させた。上澄み液を集めた後、サンプル充填用緩衝液の中にその可溶蛋白質抽出液を〜２０μｇ入れて再懸濁させた後、前もって成形しておいたＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に充填した。レーン１は、分子量蛋白質マーカーであり、レーン２は、精製非組換え型ヒトＡＡＴであり、レーン３は、形質転換していない対照Ｋｉｔａａｋｅ品種から得た抽出液である。個々の５遺伝子組換え植物の抽出液を用いて得た結果を、レーン２と３の間に示す。
【図６】図６に、遺伝子組換え米粒の中に発現した組換え型ヒトＡＡＴのウエスタンブロット分析を示す。個々の７遺伝子組換えイネ形質転換体からプールしたＲ１種子の可溶蛋白質抽出物（〜１０μｇの全蛋白質）を上述の図５のように調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを用いて分離させた後、ニトロセルロースフィルターの上にブロットした。イネ種子の中に発現したＡＡＴの同定を抗ＡＡＴ抗体を用いたウエスタン分析で実施した。レーン１は、分子量蛋白質マーカーであり、レーン２および３は、それぞれ１μｇおよび２μｇの精製非組換え型ヒトＡＡＴであり、レーン４および５は、形質転換していない対照イネ（Ｋｉｔａａｋｅ品種）の抽出液である。最後の７レーンに、個々の７遺伝子組換え植物の抽出液を用いて得た結果を示す。７種類の遺伝子組換え系の中の２つから得た抽出物はＡＡＴを発現していなかった。組換え型ではないヒト形態と組換え型イネが発現する形態の間にゲル可動性のシフトが見られたが、それは、ヒト蛋白質と組換え型イネが発現した蛋白質の種類およびグリコシル化に差があることによる。
【図７】図７に、クマシー染色およびウエスタンブロット分析で測定した時に米抽出液から得た精製組換え型ＡＡＴ（ｒＡＡＴ）が、精製ブタ膵エラスターゼ（ＰＰＥ）に対して示した活性を示す。ＡＡＴプロテアーゼの基質であるエラスターゼを用いた帯シフト検定を用いて、ｒＡＡＴが示す活性を立証する。ヒトおよび米抽出液から得たＡＡＴサンプルを等モル数のＰＰＥと共に３７℃で１５分間インキュベートした。帯シフト検定の負の対照は、ＡＡＴサンプルをこれに等体積で添加したＰＰＥと共にインキュベートすることで調製された。レーンＭＷは、分子量マーカーを指す。図７Ａのレーン１は、ヒト血漿から得た精製非組換え型ＡＡＴであり、レーン２は、ヒト血漿＋ＰＰＥから得た精製ＡＡＴであり、レーン３は、遺伝子組換えイネ種子から得たＡＡＴ含有可溶蛋白質抽出液であり、レーン４は、遺伝子組換えイネ種子＋ＰＰＥから得たＡＡＴ含有蛋白質抽出液であり、レーン５は、形質転換していないイネ種子の抽出液であり、レーン６は、形質転換していないイネ種子の抽出液＋ＰＰＥである。図７Ｂは、レーン１、２および３に帯のシフトが見られることを示している。そのような帯のシフト、即ちＰＰＥとＡＡＴフラグメントの間の複合体がＡＡＴを含有することをウエスタンブロット分析で立証する。図７Ｂに示したレーンは図７Ａに示したそれらと類似している。
【図８】図８に、米細胞抽出液を最初にＣｏｎ−ＡおよびＤＥＡＥ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）のそれぞれに通した後にオクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに充填することによる精製で得たＡＡＴを示す。オクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）が最終的精製段階であり、それによって、活性のあるＡＡＴを不活性な形態の蛋白質から分離する。レーン１は、分子量マーカーであり、レーン２は、標準としての２μｇの精製非組換え型ヒトＡＡＴであり、レーン３は、ＤＥＡＥ セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムから溶離した液をプールした溶離液である。残りの縦列に、オクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムを通り抜けた液および溶離液を示す。各カラム画分の約５０μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの上に充填して、蛋白質をクマシー染色で可視化した。オクチル セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）を通り抜けた液は不活性なＡＡＴ蛋白質を示す一方、溶離液は活性のあるＡＡＴを溶離する。
【図９】図９Ａに、組換え型ではないヒトＡＡＴを対照として用いて図7における手順に示されるように測定した時に、精製組換え型ＡＡＴがＰＰＥに対して示した活性に関するＡＡＴ結合速度定数を示す。図７の記述のように、クマシー蛋白質染色およびウエスタンブロット分析を用いてデータを得た。図９Ｂに、ＰＰＥ阻害検定で測定した時に植物由来組換え型ＡＡＴが示した熱安定性を天然のヒトＡＡＴと対比させて示す。
【図１０】図１０に、コドン最適化ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）をイネＡｍｙ１Ａプロモーター／シグナルペプチドの制御下で発現するプラスミドｐＡＰ１９を示す。このプラスミドは、発芽したイネ種子の中にＨＳＡを発現させるに有用である。
【図１１】図１１に、遺伝子組換えイネ種子の中で起こるＨＳＡ発現を示す。遺伝子組換えイネ株３−１１−２からプールした種子を水の中に２４時間浸漬した後、ギベレリックアシッド（ＧＡ）を２μＭ添加した。ウエスタン分析を行う目的で、ＧＡを添加した後に２４、４８、７２および１２０時間の種子サンプルを取り出し、可溶蛋白質を抽出した。形質転換していない負の対照株ＴＰ３０９から単離した蛋白質と共に１５μｇの可溶蛋白質を各レーンに充填した。ＨＳＡに対して調整したモノクローナル抗体を用いてブロットを検査した。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項３】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項４】
前記収穫した種子から前記ヒト血中蛋白質を精製することを含む請求項１記載の産生方法。
【請求項５】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項１記載の産生方法。
【請求項６】
前記方法で産生されるヒト血中蛋白質が、１種以上の植物グリコシル基を含む請求項１記載の産生方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法で得た精製ヒト血中蛋白質であって、１種以上の植物グリコシル基を含むヒト血中蛋白質。
【請求項８】
ヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される、請求項７記載のヒト血中蛋白質。
【請求項９】
請求項１記載の方法で得られる収穫した種子から調製された全種子、粉、抽出物およびモルトから成る群から選択される単子葉植物種子製品であって、前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する種子製品。
【請求項１０】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項９記載の種子製品。
【請求項１１】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項９記載の種子製品。
【請求項１２】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項９記載の種子製品。
【請求項１３】
少なくとも１種の植物グリコシル基及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤または栄養素を含む精製されたヒト血中蛋白質から成る組成物であって、前記ヒト血中蛋白質はヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列を含有する単子葉植物の中で産生され、かつ前記単子葉植物から収穫された種子から精製され、前記少なくとも１種の栄養素は前記単子葉植物以外の源に由来する組成物。
【請求項１４】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が実質的に前記単子葉植物の汚染物質を含有していない、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の栄養素が、塩、糖、ビタミン、鉱物、アミノ酸、ペプチド及び前記ヒト血中蛋白質以外の蛋白質から成る群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が非経口、腸内、吸入、鼻内または局所送達用に調合される請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が腸内送達用に調合されていて、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有しかつ非栄養的である請求項１３記載の組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項３】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項４】
前記収穫した種子から前記ヒト血中蛋白質を精製することを含む請求項１記載の産生方法。
【請求項５】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項１記載の産生方法。
【請求項６】
前記方法で産生されるヒト血中蛋白質が、１種以上の植物グリコシル基を含む請求項１記載の産生方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法で得られる収穫した種子から調製された全種子、粉、抽出物およびモルトから成る群から選択される単子葉植物種子製品であって、前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する種子製品。
【請求項８】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項７記載の種子製品。
【請求項９】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項７記載の種子製品。
【請求項１０】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項７記載の種子製品。
【請求項１１】
組換え型抗体を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、抗体をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列と抗体を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記抗体を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項１２】
前記抗体がIgG（免疫グロブリンG）である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がIgA（免疫グロブリンA）である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がIgM（免疫グロブリンM）である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１１記載の産生方法。
【請求項１６】
前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１１記載の産生方法。
【請求項１７】
前記収穫した種子から前記抗体を精製することを含む請求項１１記載の産生方法。
【請求項１８】
組換え型ヒト血清アルブミンを単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血清アルブミンをエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血清アルブミンを含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血清アルブミンを含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血清アルブミンが前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項１９】
前記収穫した種子から前記ヒト血清アルブミンを精製することを含む請求項１８記載の産生方法。
【請求項２０】
前記ヒト血清アルブミンが前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１８記載の産生方法。
【請求項２１】
前記ヒト血清アルブミンが前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１８記載の産生方法。
【請求項２２】
組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に第1及び第2の発現構築物による形質転換を受けさせ、前記第1及び第2の発現構築物は異なるキメラ遺伝子を含み、前記キメラ遺伝子のそれぞれは、
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み、前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質の部分を含む融合蛋白質をエンコードし、前記ヒト血中蛋白質の部分は組み合わされてヒト血中蛋白質を形成し、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２３】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項２２記載の産生方法。
【請求項２４】
組換え型抗体を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に第1及び第2の発現構築物による形質転換を受けさせ、前記第1及び第2の発現構築物は異なるキメラ遺伝子を含み、前記キメラ遺伝子のそれぞれは、
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み、前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列と抗体の部分を含む融合蛋白質をエンコードし、前記抗体の部分は組み合わされて抗体を形成し、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記抗体を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２５】
前記抗体がIgG（免疫グロブリンG）である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がIgA（免疫グロブリンA）である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がIgM（免疫グロブリンM）である請求項２４記載の方法。
【請求項１】
組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項３】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項４】
前記収穫した種子から前記ヒト血中蛋白質を精製することを含む請求項１記載の産生方法。
【請求項５】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項１記載の産生方法。
【請求項６】
前記方法で産生されるヒト血中蛋白質が、１種以上の植物グリコシル基を含む請求項１記載の産生方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法で得た精製ヒト血中蛋白質であって、１種以上の植物グリコシル基を含むヒト血中蛋白質。
【請求項８】
ヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される、請求項７記載のヒト血中蛋白質。
【請求項９】
請求項１記載の方法で得られる収穫した種子から調製された全種子、粉、抽出物およびモルトから成る群から選択される単子葉植物種子製品であって、前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する種子製品。
【請求項１０】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項９記載の種子製品。
【請求項１１】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項９記載の種子製品。
【請求項１２】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項９記載の種子製品。
【請求項１３】
少なくとも１種の植物グリコシル基及び少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤または栄養素を含む精製されたヒト血中蛋白質から成る組成物であって、前記ヒト血中蛋白質はヒト血中蛋白質をエンコードする核酸配列を含有する単子葉植物の中で産生され、かつ前記単子葉植物から収穫された種子から精製され、前記少なくとも１種の栄養素は前記単子葉植物以外の源に由来する組成物。
【請求項１４】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が実質的に前記単子葉植物の汚染物質を含有していない、請求項１３記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１種の栄養素が、塩、糖、ビタミン、鉱物、アミノ酸、ペプチド及び前記ヒト血中蛋白質以外の蛋白質から成る群から選択される、請求項１３記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が非経口、腸内、吸入、鼻内または局所送達用に調合される請求項１３記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が腸内送達用に調合されていて、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を含有しかつ非栄養的である請求項１３記載の組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項３】
前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１記載の産生方法。
【請求項４】
前記収穫した種子から前記ヒト血中蛋白質を精製することを含む請求項１記載の産生方法。
【請求項５】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項１記載の産生方法。
【請求項６】
前記方法で産生されるヒト血中蛋白質が、１種以上の植物グリコシル基を含む請求項１記載の産生方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法で得られる収穫した種子から調製された全種子、粉、抽出物およびモルトから成る群から選択される単子葉植物種子製品であって、前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する種子製品。
【請求項８】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項７記載の種子製品。
【請求項９】
前記ヒト血中蛋白質が前記種子製品中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項７記載の種子製品。
【請求項１０】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項７記載の種子製品。
【請求項１１】
組換え型抗体を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、抗体をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列と抗体を含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記抗体を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項１２】
前記抗体がIgG（免疫グロブリンG）である請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がIgA（免疫グロブリンA）である請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がIgM（免疫グロブリンM）である請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１１記載の産生方法。
【請求項１６】
前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１１記載の産生方法。
【請求項１７】
前記収穫した種子から前記抗体を精製することを含む請求項１１記載の産生方法。
【請求項１８】
組換え型ヒト血清アルブミンを単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血清アルブミンをエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血清アルブミンを含む融合蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子
による形質転換を受けさせ、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血清アルブミンを含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血清アルブミンが前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項１９】
前記収穫した種子から前記ヒト血清アルブミンを精製することを含む請求項１８記載の産生方法。
【請求項２０】
前記ヒト血清アルブミンが前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約５．０％を構成する請求項１８記載の産生方法。
【請求項２１】
前記ヒト血清アルブミンが前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約１０．０％を構成する請求項１８記載の産生方法。
【請求項２２】
組換え型ヒト血中蛋白質を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に第1及び第2の発現構築物による形質転換を受けさせ、前記第1及び第2の発現構築物は異なるキメラ遺伝子を含み、前記キメラ遺伝子のそれぞれは、
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み、前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列とヒト血中蛋白質の部分を含む融合蛋白質をエンコードし、前記ヒト血中蛋白質の部分は組み合わされてヒト血中蛋白質を形成し、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記ヒト血中蛋白質を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記ヒト血中蛋白質が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２３】
前記ヒト血中蛋白質がヘモグロビン、アルファ−１−アンチトリプシン、フィブリノゲン、ヒト血清アルブミン、トロンビン、抗体および血液凝固因子から成る群から選択される請求項２２記載の産生方法。
【請求項２４】
組換え型抗体を単子葉植物の種子の中に産生する方法であって、
（ａ）単子葉植物細胞に第1及び第2の発現構築物による形質転換を受けさせ、前記第1及び第2の発現構築物は異なるキメラ遺伝子を含み、前記キメラ遺伝子のそれぞれは、
（ｉ）熟成特異的単子葉植物貯蔵蛋白質の遺伝子に由来するプロモーター、
（ｉｉ）前記プロモーターと機能的に連結していて、これと連結するポリペプチドが単子葉植物の種子の胚乳細胞を標的にすることを可能にする単子葉植物種子特異的シグナル配列をエンコードする１番目のＤＮＡ配列、および
（ｉｉｉ）前記１番目のＤＮＡ配列と共に翻訳フレームの中で連結し、ヒト血中蛋白質をエンコードする２番目のＤＮＡ配列、
を含み、前記１番目のＤＮＡ配列と前記２番目のＤＮＡ配列が一緒になってＮ−末端シグナル配列と抗体の部分を含む融合蛋白質をエンコードし、前記抗体の部分は組み合わされて抗体を形成し、
（ｂ）前記形質転換された単子葉植物細胞からの単子葉植物を前記抗体を含有する種子が産生されるのに充分な時間生育させ、そして
（ｃ）前記植物から前記種子を収穫する、
段階を含み、前記抗体が前記収穫した種子中の可溶蛋白質全体の少なくとも約３．０％を構成する産生方法。
【請求項２５】
前記抗体がIgG（免疫グロブリンG）である請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記抗体がIgA（免疫グロブリンA）である請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記抗体がIgM（免疫グロブリンM）である請求項２４記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【公表番号】特表２００６−５２２５８５（Ｐ２００６−５２２５８５Ａ）
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７１６１０（Ｐ２００４−５７１６１０）
【出願日】平成１５年４月１１日（２００３．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９２０９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４０５
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３２９３５２５）ベントリア バイオサイエンス (5)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年１０月５日（２００６．１０．５）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年４月１１日（２００３．４．１１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００９２０９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０９９４０５
【国際公開日】平成１６年１１月１８日（２００４．１１．１８）
【出願人】（５０３２９３５２５）ベントリア バイオサイエンス (5)
【Ｆターム（参考）】
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