単球由来の自己寛容誘導性自家細胞および薬学的組成物におけるその使用
自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための改良された方法を提供することが、本発明の根底にある問題である。本発明は、自己寛容障害、特に自己免疫疾患およびアレルギーを伴う疾患の予防および／または治療に適切な単球由来の細胞、およびこれらの細胞を含む薬学的調製物に関する。上記細胞は、投与を受けている患者自身に対して自己由来である。さらに本発明は、自己の調節性Ｔ細胞を産生および／または増殖する方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者において免疫学的自己寛容を誘発しうる単球由来の自家細胞に関する。これらの細胞は、これ以降「ＳＴＩＣ」（自己寛容誘発細胞）と言う。さらに本発明は、自己寛容障害、特に自己免疫疾患およびアレルギーを伴う疾患の予防および／または治療のための薬学的調製物におけるＳＴＩＣの使用に関する。
【０００２】
本発明において、語句「自己（由来）」とは、ＳＴＩＣが、該ＳＴＩＣを投与している各患者の血液中の単球に由来することを言う。
【０００３】
本発明の細胞が調節性Ｔ細胞（ＴｒｅｇＣＤ４＋２５＋）を誘発しうることが本発明者によって示された。したがって本発明は、調節性Ｔ細胞の誘導および／またはインビトロ製造にも関する。
【背景技術】
【０００４】
免疫機構は、存在する微生物に関して、潜在的病原性抗原から体を保護する一方で、本来なら、体それ自身の構成成分と反応することは避け、すなわち、健康な免疫機構は「自己抗原」を黙認する。
【０００５】
自己寛容障害は、特別な適応（後天的な）免疫応答が自己抗原に取り付けられた時に起こる。
【０００６】
外来性抗原に対する適応免疫応答の正常な帰結は、体から抗原を浄化することである。しかし、適応免疫応答が自己抗原に対して発症した場合、免疫効果機序が抗原を完全に除去することは通常不可能であり、したがって、持続的反応が起こる。その結果、免疫能のエフェクター経路は、組織に慢性の炎症性障害を起こし、それは死に至る場合もある（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ２００１，Ｃｈａｐｔｅｒ １３，ｐａｇｅｓ５０１−５２２参照）。
【０００７】
適応免疫応答は、抗原−特定のＴおよび／またはＢ細胞の活性によって開始され、自己免疫も同じように開始されると信じられている（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．ｐ５０１）。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態の１つは、ＳＴＩＣを含む薬学的調製物を使用した、自己免疫疾患の治療および／または予防に関する。
【０００９】
自己免疫疾患は、主として２つのパターンに区別される。自己免疫症状の発現が体の特定の器官に限定される疾患は、「器官特異」自己免疫疾患として知られ、一方、「全身性」自己免疫疾患においては、体の多くの組織が影響を受ける。器官特異自己免疫疾患の例として、橋本病、グレーブス病（これらはそれぞれ優先的に甲状腺に影響する）、およびＩ型インスリン依存性糖尿病（これは膵島に影響する）が挙げられる。全身性自己免疫疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡および原発性シェーグレン症候群（これは皮膚、腎臓および脳の多種多様な組織が全て影響を受ける）（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌｏｃ．ｃｉｔ，５０３ページ、参照）が挙げられる。
【００１０】
Ｔ細胞媒介性であると主に信じられている自己免疫疾患、たとえば、インスリン依存性糖尿病、リウマチ性関節炎および多発性硬化症があり、一方、細胞表面やマトリックス抗原への抗体の形成が主な役割を果たす、たとえば、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡あるいは急性リウマチ熱におけるような事例もあり、さらに別に、たとえば混合型クリオグロブリン血症、全身性紅斑性狼瘡あるいはリウマチ性関節炎のような、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方が関与する免疫複合疾患のグループもある（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌｏｃ．ｃｉｔ，５０２頁の図１３．１参照）。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的調製物として製剤化された本発明のＳＴＩＣによるアレルギーの治療に関する。
【００１２】
近年、調節性Ｔ細胞が、免疫恒常性維持の調整において重要な役割を果たすこと、すなわち、免疫学的自己寛容を始めとして、いかなる感染あるいは抗原関連標的に対しても免疫応答ができあがっていることが示唆されている（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｎ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，２２５，１−３２（２００３）；Ｓｈｉｍｏｎ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ８３，１５１−１５３（２００２），Ｋａｔｈｒｙｎ Ｊ．Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｎ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１９９−２１０（２００３）参照）。
【００１３】
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．ｐａｇｅ１，Ａｂｓｔｒａｃｔが述べるように、「自己反応性Ｔ細胞のＴ細胞媒介性優勢遺伝子調整は、免疫学的自己寛容の維持を助長し、その交代が自己免疫疾患の発症を促すことを示唆する証拠が蓄積されている。そのような調節性Ｔ細胞集団を描く努力によって、ヒトを始めとする正常な未処理動物におけるＣＤ４＋細胞集団内のＣＤ２５＋細胞が制御活性を有することが明らかになった。ＣＤ２５＋プラスＣＤ４＋調節性Ｔ細胞は、Ｔ細胞の機能的に区別されたサブ集団として、正常な胸線によって産生される。これらは、自己免疫予防においてだけでなく、種々の免疫反応の調整においても重要な役割を果たす。」
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の他にも、免疫機構のＢ細胞コンパートメントが、自家細胞（マスト細胞を含む）、組織および器官構造に対する抗体の産生を伴う自己攻撃性疾患を誘発できる。
【００１４】
Ｂ細胞活性化は、ヘルパーＴ細胞が特定の抗原位上でクローナルＢ細胞性増加を刺激するといった方法で、Ｔ細胞ヘルプに依存することはよく知られている。該抗原は断片化されたアレルゲンから誘導されてもよく、これらは次いでＴ細胞内で小分子ペプチドにされる。次いで、抗原特異的活性化を促すために、ＭＨＣ制限の形で提供される。
【００１５】
特定のアレルゲンによって引き起こされ、一方でアレルギー性疾患を起こし、また他方で自己寛容障害を誘発しうる（前述を参照）、調整不可能なあるいは過剰なＢ細胞の活性化を回避するために、調節性Ｔ細胞は、Ｂ細胞の活性化と関係しているＴ細胞を阻害する能力を持ち、過剰で調整不可能な抗体産生を妨げる。
【００１６】
したがって、自己免疫疾患と同じように、アレルギー性疾患もまた、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の量が増加することによって、影響を受け、コントロールされうる。特に、ＥＡＥ（「実験アレルギー性脳脊髄炎」）を患うマウスにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞をこれらの動物に投与して２週間で疾患は軽減され、治療にはさらなる疾患の誘発を伴うことがないことが示された（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．’’Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｓｃｒｕｔｉｎｙ’’Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３：１８９−１９８（２００３）；Ｌａｎｄｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．’’Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ＥＡＥ’’Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：２１５５６−２１６０（１９７９））。これらの効果は、自己免疫性糖尿病の進行をＣＤ４＋細胞の投与によって止まらせ、さらに新たに自己免疫疾患が出現することを阻止したＮＯＤマウス（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）で示された効果と似ている。
【００１７】
自己免疫反応を伴ってもよい、アレルギー性疾患の例は、自己のものでないタンパク質、体が出会う有機および無機物質によって誘発されるアレルギーの全てのタイプである。この点で特に重要なものは、花粉によって誘発されるアレルギー、たとえば花粉症、および薬、化学薬品、ウイルス、バクテリア、菌類、ハウスダスト、食品成分、金属、ガス、皮膚落屑や髪の毛のような動物の体の成分および動物の排泄物のようなアレルゲンによって誘発されるアレルギーである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
現時点で、自己寛容障害によって起こる疾患の予防および／または治療に関する効果的な治療は入手できていない。
【００１９】
器官特異自己免疫疾患に関しては、代替治療、移植、コルチゾンのような抗炎症薬を使用する症候性治療が通常行われている。全身性自己免疫疾患に関しては、免疫抑制剤が治療のためにしばしば使用される。明らかに、これらの「治療」は多くの点で問題があり、重篤な副作用を発症する。
【００２０】
集団の５％までは、自己免疫疾患に冒されていると推定される（Ｓａｋａｇｕｓｈｉ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．，１５１頁、左欄）。したがって、扱いやすく、健康を脅かす副作用を伴わず、このような治療に適用される現時点で方法および薬剤に関し高い費用の掛からない、自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための有効な手段の存在が早急に求められている。
【００２１】
したがって、自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための改良された方法を提供することが、本発明の根底にある問題である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この問題の解決のために、脊椎動物、特に哺乳動物、さらに好ましくはヒトからの単球由来の自己由来の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）を使用することが提案されている。これらの細胞は、以下に記載する本発明の方法によって得られ、該方法によって個体の中の調節性Ｔリンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の量を増やすことができる変性細胞が得られる。約１０５個の細胞／ｋｇ体重（ＢＷ）の投与の後、これらの細胞は、自己寛容障害を伴う疾患を適切に予防および／または治療する。
【００２３】
（発明の要旨）
単球由来の自己に由来する自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）を生成する方法の基本的な工程は、
（ａ）細胞を投与すべき患者のそれぞれの血液から単球を単離する工程と、
（ｂ）成長促進剤としてマクロファージコロニー刺激因子（以下Ｍ−ＣＳＦという）を含む適切な培地中で、単球を増殖させる工程と、
（ｃ）単球をγ−インターフェロン（以下γ−ＩＦＮという）で刺激する工程と、
（ｄ）工程ｃ）で形成された自己寛容誘発細胞を、培地から細胞を分離することによって得る工程、
とを含む。
【００２４】
類似の方法がドイツ特許出願第ＤＥ１０２３１６５５．４号明細書および国際特許出願国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の明細書に記載されている。上記の先願の特許出願には、生成された細胞は、「移植受容誘発細胞」（ＴＡＩＣ）と呼ばれる。これらは、受容者における同種異系のドナー組織の受容を誘発するために使用される。重要なことは、ドイツ特許出願第ＤＥ１０２３１６５５．４号明細書および国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書に記載されているＴＡＩＣは、ドナーの単球から誘導されたものであり、移植の受容を誘発するために、受容者に投与することである。これは、ＴＡＩＣは、ＴＡＩＣで処置すべき個体に対し同種異系であることを意味する。
【００２５】
これに対して本発明は、「自己由来の治療」の概念に基礎を置く。これは、自己寛容障害、特に自己免疫疾患および／またはアレルギーを患う個体が、自己由来の単球から誘導される、自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）で処置されることを意味する。
【００２６】
したがって、ＴＡＩＣとＳＴＩＣとは両方とも、本質的に同じ方法によって単球から誘導されるが、ＴＡＩＣは処置されるべき患者に対して同種異系であり、一方、ＳＴＩＣはこの点において自己由来である。
【００２７】
ＳＴＩＣを生成する方法に関しては、γ−ＩＦＮによる刺激が決定的な工程を表すことが示されている（実施例２参照）。
【００２８】
本明細書において、語句、単球由来の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）は、上記方法の工程ｄ）で得られる細胞集団をいう。この細胞集団は、自己寛容、またリンパ球の誘発（実施例４参照）において効果のある単球から誘導される細胞に加えて、リンパ球も含み（実施例４参照）、さらに、場合によっては、たとえば顆粒球のような単核球細胞画分から誘導される細胞も含む。ＳＴＩＣ集団内の単球から誘導される細胞の量は、好ましくは全細胞数の５０〜９０％、さらに好ましくは６０〜７０％である。
【００２９】
本発明に関して、語句「全細胞の数」は、考慮中の細胞集団中の生活細胞の量をいう。この量は、染料が、光学的手段によって非生活細胞から生活細胞を区別することが可能であるから、「トリパンブルー分染法」によって測定することができる。
【００３０】
自己寛容を誘発するのに、ＳＴＩＣは、通常、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０６個の細胞が使用され、好ましくは体重１ｋｇ当たり１０５個の細胞が使用される。ＳＴＩＣの投与は繰り返し行ってもよい。
【００３１】
本発明によるＳＴＩＣは、悪性腫瘍の形成に関し、動物実験でも培養物においても危険性がないことが証明されている。これは、本発明による細胞が誘導されるオリジナル単球細胞の性質ゆえ、他のどんな方法においても予測できなかった結果である。
【００３２】
以下で詳しく説明するように、さらに最適に自己寛容を誘発する特性を有する細胞のサブ集団も、ＳＴＩＣ中に存在する細胞の画分から単離することができ、これらは単球から誘導される。
【００３３】
γ−インターフェロンでオリジナル細胞（単球）をインビトロで培養および刺激した後、細胞のサブ集団を含むＳＴＩＣを形成する（実施例３参照）。これは、モノクローナル抗体ＧＭ−７に結合し、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって発現する。該モノクローナル抗体ＧＭ−７は、イムノグロブリンイソ型ＩｇＧ２ａの抗体であって、その軽鎖は、カッパーイソ型を発現する。オリジナル単球細胞は認識されない、すなわち、オリジナル細胞に対する抗体の結合は起こらない（実施例３参照）ため、この抗体の特徴的特性は、本発明による培養条件によって変性された単球に対し結合する緊縮な能力にある。さらに、ＧＭ−７は抹梢血液中のヒト細胞には結合しないことが２０人のボランティアによって実証された（図５参照）。
【００３４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５５１号明細書に記載されているように、抗体は、ヒト単球から誘導されたＴＡＩＣ（ＳＴＩＣに相当する）で、当業者に知られた方法を使用して、マウスに免疫化することによって生成された（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’’，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，１９９５）。次いで、該マウスから、抗体と骨髄腫細胞とを産生するＢ細胞の融合によってハイブリドーマ細胞株を製造した。このような細胞株の生成のために使用される方法は、現在の技術水準で公知である（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’’，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，１９９５；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．’’Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ’’，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））。抗体ＧＭ７を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ ＧｍｂＨ、ブラウンシュバイク、ドイツ）でのブタペスト会議の規則に従って、登録Ｎｏ．ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２にて寄託した。
【００３５】
図１に、フローサイトメトリーによって測定した本発明によるインビトロ変性後のＧＭ−７の単球に対する結合能力を示す。単核球細胞画分から直接得たＣＤ１４陽性単球は、抗体ＧＭ−７（影の付いた灰色の部分が、影のない抗体コントロールと一致する）に結合しないことがわかる。対照的に、Ｍ−ＣＳＦの存在下で培養しγ−ＩＦＮで刺激した後、単球の一部は、モノクローナル抗体ＧＭ−７によって認められる抗原を発現する。該モノクローナル抗体ＧＭ−７は、イソ型κ−ＩｇＧ２ａとして特徴付けられる。したがって、本発明の方法は、変性された単球の細胞膜上の抗原発現の表現パターンの変化をもたらす（図１）。
【００３６】
モノクローナル抗体ＧＭ−７は、本発明による方法によって生成された細胞の中でも、最も効果のある自己寛容誘発細胞を誘発する細胞集団に特に結合する（図５参照）。
【００３７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、そのような、つまり抗体ＧＭ−７を結合することができるＳＴＩＣに関する。これらの細胞をこれ以降ＳＴＩＣＧＭ７と言う。
【００３８】
したがって、本発明による抗体ＧＭ−７は、非常に効果的で、自己寛容を誘発する細胞（ＳＴＩＣ）を選択し精製するための薬剤の取り扱いが簡単であることを示す。該抗体を用いて、本発明により、均質で効果が非常に高いＳＴＩＣ集団を産生することが可能である。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記本発明の方法の工程ｃ）で形成された、抗体ＧＭ−７に結合する抗原を発現する自己寛容誘発細胞は、工程ｃ）の後、その培地から直接選択してもよいし、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって生成した抗体ＧＭ−７に結合することによって、上記本発明の方法の工程ｄ）による培地からそれぞれ細胞を分離した後、得られた細胞集団から選択してもよい。
【００４０】
本発明によるＳＴＩＣを選択するには、抗体がサンプル中に存在する自己寛容誘発細胞に結合できる条件下で、抗体をサンプルに接触させる。結合反応により得られた反応複合体を、次いで、サンプルから分離する。この目的のために、サンプルとの接触の前に、抗体を担体材上で培養することができ、たとえば、クロマトグラフの目的にまたは所謂「磁気ビーズ」に適切なマトリックスに結合することができる。この手順は、体積の大きなサンプルから自己寛容誘発細胞を選択、濃縮することを可能にする。
【００４１】
自己寛容誘発細胞を得るために、抗体と自己寛容誘発細胞との間の結合は、サンプルから反応複合体を単離した後は分離される。これは、現在の技術水準で知られている方法、たとえば、競合置換または塩溶液によって洗浄することによって達成することができる。相当する方法が、たとえば、Ｕｔｚ Ｕ． ｅｔ ａｌ．によって記載されている（’’Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−ｌ（ＨＴＬＶ−１）Ｔａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＴＬＶ−１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ’’Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６年２月、８４３−８５１頁）。
【００４２】
さらに、モノクローナル抗体ＧＭ−７は、インビトロで、患者の血液および／または組織サンプル中にある、本発明による単球由来の自己寛容誘発細胞の定性および定量測定を可能にする。自己寛容誘発細胞の存在を示し、該当する場合は、その量も示す、サンプル中での反応複合体の形成は、公知の方法によって検出される。
【００４３】
反応複合体を検出するには、この場合、抗体ＧＭ−７を、検出する分子、たとえば、抗体に共有結合で結合しているものに直接結合する（標識化する）ことが可能である。検出すべき適切な分子は、分子学的診断の分野に数多く記載され、なかでも、イソチオシアン酸フルオレセインやテトラメチルローダミン−５−イソチオシアネートのような蛍光染料、発光染料、放射能ラベルされた分子および酵素パーオキシダーゼが挙げられる（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．’’Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ’’，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８を検討せよ）。
【００４４】
抗体の検出は、抗体の標識化のために選択される分子に基づいて行われる。本発明については、抗体の検出がフローサイトメトリーおよび／または蛍光顕微鏡法によって行うことができるように、抗体ＧＭ−７と蛍光分子、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）とを結合した。抗体をＦＩＴＣで標識化する方法は当業者に公知である。
【００４５】
あるいは、反応複合体は二次抗体を使用した二段法で検出することもできる。この点において、標識化されていない抗体ＧＭ−７は、さらに他の標識化された抗体を含む反応複合体中で検出することができる（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．’’Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ’’，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８を検討せよ）。この二段法の検出は、数個の標識化された二次抗体が１個のＧＭ−７抗体（信号増幅）に結合できるため、本発明による抗体結合を直接検出するより、はるかに感度が高い。
【００４６】
したがって、抗体ＧＭ−７は、ＳＴＩＣで処置された患者の末梢血液中のＳＴＩＣの検出を可能にする。たとえば、「モニタリング」という形で、末梢血液中の細胞の数を特定の時間間隔で検出する。
【００４７】
当業者には明らかなように、ヒト以外の脊椎動物の単球、特に本発明によって変性された霊長類およびブタの単球からもＳＴＩＣに対するモノクローナル抗体を生成することが可能である。この点に関して、対応する宿主動物の免疫および対応するハイブリドーマ細胞株の産生は、ヒト由来のＳＴＩＣについては、上記したように行われる。
【００４８】
本発明の特に好ましい実施形態は、本発明のＳＴＩＣのサブ集団に関し、これは、細胞表面にＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原が共発現している。これらの細胞を以下、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｌ４＋と記載する。以下にさらに詳しく説明するように、これらの細胞は調節性Ｔリンパ球の形成を誘発することが示されている。
【００４９】
表面抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を共発現するＳＴＩＣは、上記した本発明の方法の工程ｃ）において形成された自己寛容誘発細胞から直接選択してもよいし、上記本発明の方法の工程ｄ）による培地から細胞を分離した後得られる細胞集団から選択してもよいし、あるいは、ＳＴＩＣＧＭ７集団から選択してもよい。
【００５０】
さらに、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書のＴＡＩＣを参照することにより、本明細書によって生成された細胞は、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７を強く発現することが示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１２に相当する実施例６を参照）。対照的に、これらの遺伝子は、オリジナル単球によっては全くあるいは少ししか発現しない。したがって、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現のアップレギュレーションは、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞に特異的である。
【００５１】
実施例６で述べるように、マーカーＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現は、以前は調節性Ｔリンパ球のみについて記載されていた。表面抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を共発現するＴリンパ球は、調節性Ｔリンパ球のサブ集団であり、「抑制細胞」とも言われる。それは、体の免疫応答を抑制するそれらの機能である。特に、Ｆｏｘｐ３は特定の転写因子として見られ、調節性Ｔ細胞の発症に関し、コントロール遺伝子として働き、これらの細胞により特異的に発現する。本発明によれば、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｌ４＋細胞は、全ＲＮＡ１μｇに対し、Ｆｏｘｐ３−ＲＮＡが少なくとも１×１０−９μｇ発現するのが好ましく、より好ましくは少なくとも５×１０−９μｇ、特に好ましくは少なくとも１×１０−８μｇである。
【００５２】
ＣＴＬＡ４も同様にＴリンパ球、特にＣＤ４／ＣＤ２５陽性Ｔリンパ球の調整機能の検出のためのマーカーと見なされる（実施例６に列挙された文献を参照）。本発明によれば、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｍ４＋細胞は、好ましくは全ＲＮＡ１μｇに対し、ＣＴＬＡ４−ＲＮＡが少なくとも５×１０−７μｇ発現するのが好ましく、より好ましくは少なくとも３×１０−６μｇ、特に好ましくは少なくとも５×１０−６μｇである。
【００５３】
上皮カドヘリンを認識するインテグリンαＥβ７は、近年、Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．によってＰＮＡＳ ９９，１３０３１−１３０３６頁（２００２）に、非常に強力な、上皮環境と影響しあう調節性Ｔリンパ球のサブ集団に関する新しいマーカーとして記載された。本発明によれば、インテグリンαＥβ７−ＲＮＡの発現は、その量がＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞において、好ましくは全ＲＮＡ１μｇに対して、少なくとも１×１０−１２μｇ、より好ましくは少なくとも１×１０−１ｌμｇ、特に好ましくは少なくとも１×１０−１０μｇ、最も好ましくは少なくとも１×１０−９μｇである。
【００５４】
実施例６の表に示すように、本発明の細胞とリンパ球との直接的な共培養によって、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の強くアップレギュレートされた発現を伴うリンパ球集団における調節性Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の数が大幅に増加する。該実施例はさらに、本発明の細胞がもし間接的にリンパ球と共培養されれば、この効果は観察されないことを実証する。
【００５５】
これらの結果は、本発明の細胞による調節性Ｔリンパ球の形成および／または増殖の刺激は、これらの細胞による自己寛容の誘発が関与していることを示唆する。
【００５６】
実施例７（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／β７５５１号明細書の実施例１３に相当）によって、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書（上記参照）のＴＡＩＣを参照して、免疫応答抑制の誘発において、本発明の細胞の関与に関する仮説が確認された。この実施例においては、インビトロで、受容動物からのリンパ球を、それぞれのドナー動物からの免疫抑制細胞で培養した。寛容性を誘発するために、ＴＡＩＣ由来のドナーでプレインキュベートされた受容者からのリンパ球を、ＴＡＩＣの代わりに、動物に注射した。ドナー特異的寛容性は、この方法でも誘発することができたが、一方、ＴＡＩＣ由来ドナーで共培養されていない受容リンパ球を投与された動物は、寛容性を発症しなかった。
【００５７】
本発明のＳＴＩＣは、そのような薬学的調製物としても使用することができる。上記本発明の方法の工程ｄ）で得られる細胞は、直接使用することができる。そのようにして得られた集団の細胞の合計の約１０〜５０％が、初期単球単離物（単核球細胞画分）由来するリンパ球および顆粒球によって形成される。これらの細胞は、培養工程における単球に由来する、本発明のＳＴＩＣの生成をサポートする（実施例４参照）。これらは、本発明のＳＴＩＣが薬学的調製物として使用される場合、自己寛容の誘発を疎外しない。
【００５８】
しかし、本発明のさらに好ましい実施形態によれば、サブ集団ＳＴＩＣＧＭ７および／またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋は、本発明の方法で得られたＳＴＩＣ集団（上記参照）全体から単離して、自己寛容誘発するために使用してもよい。
【００５９】
培養培地（実施例２参照）としては、ＳＴＩＣおよび／またはＳＴＩＣＧＭ７および／またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ｃＤｌ４＋が、それらの自己寛容誘発効果を落とし始めることなく少なくとも４８時間保つ。
【００６０】
薬学的調製物の使用に関して、たとえば、ヒトＡＢ０適合血清（国際的に使用に適する）中に懸濁させたＳＴＩＣおよび／またはサブ集団ＳＴＩＣＧＭ７および／またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋を、短輸血として静注的に投与することができる。
【００６１】
本明細書において、薬学的調製物は、本発明のＳＴＩＣと、これに組み合わせて、ステロイド、特にコルチゾン、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、ＴＮＦ−α抗体、α−インターフェロンのような、従来の抗炎症薬および／または従来の免疫抑制剤、および、たとえばリツキサンのようなＢ細胞抗体とを、特異的な器官または全身性自己免疫疾患の治療のために含んでもよい。
【００６２】
さらに、本発明のＳＴＩＣは、抗ヒスタミン剤、テオフィリン製剤、Ｒ−ミメティック、ステロイド、特にコルチゾンおよびクロモグリシン酸と組み合わせて、アレルギーの治療のために使用してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
（発明の詳細な説明）
本発明による方法のための出発細胞は、自己由来の血液単球、すなわち、本発明の細胞を投与すべき個々の患者の血液からの単球である。該自己由来の単球はヒト血液のものが好ましい。単球は、どのような単離方法によって得てもよく、特に白血球搬出法によって、または全血（バッフィーコート）からの単核球細胞画分から得てもよい。特に、白血球搬出法が好ましい。
【００６４】
白血球搬出法は、市販のアフェレーシス装置を使用した多段階方式の一般用語であり、ヒト被験者からの全血を採取し、複数の画分に分離し、単核球細胞画分以外の画分を上記ヒト被験者に返血する方法である。この方式は、欧州特許公開第０５９１１９４ Ｂ１号公報にさらに詳しく概説するように行う。
【００６５】
あるいは、凝血防止剤を使用した通常の治療の後に、先ず、公知の方法、好ましくは遠心分離法で、血液を血漿と白血球および赤血球に分離する。遠心分離の後は、血漿が上澄み液中に存在し、その下に全体に白血球が含まれた層がある。この層はまた、バッフィーコートと呼ばれる。この下に赤血球を含む相（ヘマトクリット）がある。
【００６６】
本発明による方法に関して、単核球細胞画分は先ず単離分離して、たとえば公知の方法で遠心分離することによって単球を得る。好ましい方法実施形態によれば、単核球細胞画分をリンパ球分離培地（フィコール−ハイパーク）に塗布し、遠心分離する（実施例１参照）。実施例１は、本発明の好ましい実施形態を記載する。実施例１では、単核球細胞画分にまだ含まれている赤血球と死細胞を遠心分離によって分離し、単球を含む白血球を分離培地上に単離物として置く。その後、白相を注意深くピペットで取り、単離物中の単球を濃縮するために、繰り返し遠心分離し洗浄する。この方法で、単球はリンパ球の一部とともに遠心分離槽の底に集まる。
【００６７】
本発明の方法の特に好ましい実施形態によれば、単球を含有する単離物を得るための条件は、単離物が、単球に加えて、細胞の総数に対して約１０〜５０％のリンパ球を含むように調整されている。単離物は、総細胞数に対して、好ましくは約５０〜９０％の、特に好ましくは６０〜７０％の単球を含み、リンパ球は約１０〜５０％、特に好ましくは２０〜５０％を含み、ここでの相違は場合によっては顆粒球によって提供されうる。
【００６８】
実施例４に示すように、ＭＣＳＦおよびγインターフェロンでオリジナル単球を培養している間、総細胞数の２０〜３０％の量のリンパ球が存在すると、リンパ球（約５％）がほとんど存在しない場合（図３参照）のように、ＣＤ３／ＣＤ１４−ダブル陽性ＳＴＩＣの量が非常に多く産生する。
【００６９】
ＳＴＩＣを充分な量を生成するためには、先ず、単球の増殖を可能にする必要がある。この目的のため、単球に適した公知の増殖培地を使用することができる。しかし、該培地は、増殖因子Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を含まなければならない。Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）は、単球、線維芽細胞、リンパ球および内皮細胞によって生成される。培地中のＭ−ＣＳＦの濃度は、２〜２０μｇ／Ｌ培地が好ましく、さらに好ましく４〜６μｇ／Ｌ培地、特に好ましくは５μｇ／Ｌ培地である。
【００７０】
ＳＴＩＣの収量は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在によって減少するため、増殖培地はこの因子を含まないことが好ましい。
【００７１】
次いであるいは同時に、細胞はγ−ＩＦＮで刺激されなければならない。すなわち、細胞はγ−ＩＦＮの存在下で培養されなければならない。γ−ＩＦＮによる単球の刺激は、増殖因子を含む培地において３〜６日を費やす初期増殖段階の後に行う。好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの存在下での培養の始まりから４日目にＹ−ＩＦＮ刺激を始め、この刺激はインキュベータ条件下、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気中で、好ましくは２４〜７２時間、さらに好ましくは４８時間続ける。
【００７２】
培地中のγ−ＩＦＮの濃度は、０．１〜２０ｎｇ／ｍＬであり、１〜１０ｎｇ／ｍＬが好ましく、５ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００７３】
γ−ＩＦＮによる刺激は、増殖因子を含む培地中の単球の増殖と同時に始めてもよい。しかし、上述したように、３〜６日の初期増殖段階後の刺激が好ましい。概して、γ−ＩＦＮによる細胞増殖および刺激は、８日を超えない期間で行うのが好ましい。いずれにしても、γ−ＩＦＮによる治療は、増殖段階の後、少なくとも２４時間で最高７２時間、好ましくは４８時間で行うべきである。したがって、細胞の増殖および刺激の時間は、合計で４〜８日間費やすのが好ましい。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態によれば、γ−インターフェロンによる増殖および刺激は、実施例２で示したように行われる。すなわち、単球を先ず増殖因子を含む培地中で増殖し、３〜６日後に０．１〜２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは５ｎｇ／ｍＬの濃度が培地中で得られるような量のγ−ＩＦＮを培地に加える。
【００７５】
本発明による方法は、表面があらかじめウシ胎児血清（ＦＣＳ）、あるいは好ましくはヒトＡＢ０適合血清（実施例２参照）で塗布された培養槽中で行われるのが好ましい。ＦＣＳの塗布は、使用の前にＦＣＳで培養槽の表面を被覆し、数時間、特に４〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間、特に２４時間の相互作用の時間の後、適切な方法で表面に付着していないＦＣＳを取り除くことによって行うことができる。ヒトＡＢ０適合血清での塗布も、上記した方法と同じようにして行う。
【００７６】
培養ステップの間に、細胞は約２４時間後培養容器の底に沈殿する。接着特性のため、単球および該プロセス中に該単球に誘導されたＳＴＩＣは、それぞれの培養槽の底に付着する。実施例２に記載するように、培養中に培地は変化し、最初に上澄み液を、たとえば、ピペットであるいはデカントして注意深く取り除き、続けて新しい培地を充填する。しかし、底に付着する細胞は洗浄しないか、あるいは注意深く洗浄して、存在するどんなリンパ球も取り除かないようにするのが好ましい。
【００７７】
付着する細胞を取り除くには、機械的に、たとえば、微細細胞スクレーパーまたはスパチュラを使用して行うことができる。
【００７８】
しかし、本発明による方法の好ましい実施形態によれば、細胞の完全な除去は、適切な酵素、たとえば、トリプシン（実施例２参照）による治療によって行われる。トリプシン溶液（０．１〜０．０２５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ）は、２〜１０分間、３５℃〜３９℃、好ましくは３７℃で、５％ＣＯ２の存在下で細胞に作用することができる。
【００７９】
次いで、酵素活性は、通常の方法でブロックされ、今や自由に浮遊するＳＴＩＣを遠心分離することによって通常の方法で得ることができる。次いで、これらはすぐに利用することもでき、場合によっては、たとえばＰＢＳのような適切な培地中の懸濁物として利用することもできる。また、これらは数日、特に２、３日程度栄養培地中に保存することもでき（実施例２参照）、この保存培地は、増殖因子もγ−ＩＦＮも含むべきではない。細胞は、そのような栄養培地中でＳＴＩＣとして少なくとも４８時間保存することができる。
【００８０】
より長い時間保存するために、細胞を冷凍することができる。生存細胞の冷凍のプロトコルは、現在の技術水準で知られているＧｒｉｆｆｉｔｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．を比較せよ。（’’Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｏｒｎｅａ’’，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｔａｌａ Ａ．ａｎｄ Ｌａｎｚａ Ｒ．Ｐ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００２，第４章，１３１〜１４０頁））。本発明による細胞の冷凍に好ましい懸濁培地は、ＡＢ０適合血清またはＦＣＳであって両方ともＤＭＳＯが加えられている。
【００８１】
本発明の実施形態の一つによれば、ステップｃ）またはｄ）で得られる、自己寛容誘発細胞を含む細胞懸濁物は、ＳＴＩＣＧＭ７サブ集団として得るように、抗体ＧＭ−７に結合する細胞をさらに精製してもよい。このように精製する方法は上記に詳しく記載している。
【００８２】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、そのような細胞は細胞表面にＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原を共発現するＳＴＩＣ集団から選択される。そのような細胞を選択する方法は、業界で知られている。そのような方法の例示として、「蛍光活性細胞分離法」（ＦＡＣＳ）、「免疫磁気ビーズ分離法」および「磁気細胞分離」（ＭＡＣＳ）、あるいは所謂「ロゼッティング法」［Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ Ｆ．ｅｔ ａｌ．’’Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ− ａｎｄ ｎｏｎ−Ｔ−ｃｅｌｌｓ”，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．３３，５−８（１９７７）参照］が挙げられる。
【００８３】
ＳＴＩＣサブ集団ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋の選択は、上記本発明の方法の工程ｃ）またはｄ）で得られたＳＴＩＣ集団から、またはＳＴＩＣＧＭ７サブ集団から直接行うことができる。後者の方法は、結果的に、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋が段階的に高濃度化していく。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明によるＳＴＩＣＣＤ３＋／ｃＤｌ４＋サブ集団の細胞それ自体が、自己免疫疾患のインビボ予防および／または治療のための薬学的組成物の製造のために使用される。
【００８５】
そのような自己免疫疾患の例としては、以下のものがある：
自己免疫性特徴を伴うリウマチ性疾患、特にリウマチ性関節炎、ＳＬＥ、シューグレン病、皮膚硬化症、皮膚筋炎、多発作筋炎、ライター症候群；
糖尿病；
血液および血管の自己免疫疾患、特に自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質抗体症候群、血管炎（結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、過敏性血管炎、巨細胞性動脈炎）、全身性紅斑性狼瘡、混合型クリオグロブリン血症；
肝臓の自己免疫疾患、特に自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変、および原発性硬化性胆管炎；
甲状腺の自己免疫疾患、特に橋本病、バセドウ病；
中枢神経系の自己免疫疾患、特に多発性硬化症、無症筋無力症；
水疱性皮膚疾患、特に尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、セニアー−アッシャー症候群および落葉性ブラジル天疱瘡。
【００８６】
自己寛容を誘発するＳＴＩＣの有用性は、人為的に誘発された、自己免疫疾患に類似する大腸炎の２つのモデルシステムにおけるマウスによって示される（実施例８および９参照）。
【００８７】
これらのモデルは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）−誘発慢性大腸炎（実施例８）およびマウスにおける実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデル（実施例９）である。どちらのモデルマウスも、潰瘍性ヒト大腸炎に類似した症状を伴う慢性大腸炎を発症する。
【００８８】
どちらのモデルシステムにおいても、症状が発症してすぐにＳＴＩＣを投与すると、処置していない動物、あるいはＳＴＩＣを含まない「コントロール細胞」で処置した動物に比べ、大腸炎の典型的な症状が抑制される（実施例８および９参照）。
【００８９】
上記したように、過剰の免疫反応はまたアレルギーの発症に関与する。サブ集団としてＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞を含むＣＤ４＋細胞は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を緩和することができることがＢａｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって示されている。本明細書で示すように、ＳＴＩＣの投与はＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の増加を誘導する結果になるため、該細胞はまた、アレルギーの治療のためにも有用である。
【００９０】
したがって、本発明のさらに好ましい実施形態によれば、医薬品を含むＳＴＩＣは、アレルギーの予防および／または治療のためにも使用される。
【００９１】
薬学的調製物は、本発明の方法のステップｄ）で得られた本発明による生活ＳＴＩＣを、医薬的に許容しうる担体中に懸濁させて、好ましくは約１×１０５〜１×１０７個の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約１×１０６の細胞／ｍＬの量で含んでもよい。
【００９２】
本発明のさらに好ましい実施形態においては、本発明によるＳＴＩＣＧＭ７サブ集団細胞は、それ自身、自己寛容障害を伴う疾患のインビボ予防および／または治療のための薬学的組成物の製造のために使用される。
【００９３】
本発明の実施形態の一つでは、そのような薬学的調製物として、抗体ＧＭ−７に結合した本発明の生活ＳＴＩＣＧＭ７を、薬理学上許容しうる液体担体に懸濁させて、好ましくは約１×１０６〜１×１０８個の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約１×１０６個の細胞／ｍＬの量で含んでもよい。
【００９４】
本発明の最も好ましい実施形態では、そのような薬学的調製物として、ＣＤ３抗原とＣＤ１４抗原を共発現する、本発明による生活ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞を、好ましくは約５×１０５〜５×１０７個の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約５×１０６個の細胞／ｍＬの量で含んでもよい。
【００９５】
上記薬学的調製物は、生理学的に優れた認容性が認められる培地中に懸濁された本発明による細胞を含んでもよい。適切な培地として、たとえば、リンゲル液、生理食塩水または５〜２０％ヒトアルブミン溶液などが挙げられる。
【００９６】
本発明によるＳＴＩＣを含む薬学的組成物は、それぞれの疾患に感染されている身体部位に応じて、種々の投与の経路を経て投与されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、該薬学的組成物を静注的に、門脈内に、皮下的に、皮内に、腹腔内に、あるいは鞘内に投与することができる。薬学的組成物はさらに、肝臓や筋肉などの特定の器官に直接投与することも、吸入を通じてあるいは腹腔深部に投与することもできる。
【００９７】
活性成分としてＳＴＩＣを含む薬学的調製物は、疾患の発症に反応しうる遺伝子が知られている場合にも、自己免疫疾患の予防のためにも使用できる。もし個体が１以上の自己免疫疾患を伴う遺伝子のキャリアとして診断された場合、初期発育段階で、自己由来の単球のＳＴＩＣを投与することで疾患の発生を防止することができる。本発明の好ましい実施形態では、自己由来のＳＴＩＣを、自己由来のリンパ球およびそれぞれの遺伝子によって発現されたペプチドとともに培養する。これは、個々の遺伝子生成物に特有の自己由来の調節性Ｔリンパ球を発症する。次いで、これらの調節性Ｔリンパ球は、以下に記載する実施例７（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１３に対応）におけるように各個体に再度投与することができる。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態では、ＳＴＩＣは自己免疫疾患、たとえば、リウマチ性関節炎が合間に起こる場合の予防のために使用することができる。最初のあるいは後続の疾患の発生の後、もしＳＴＩＣを含む薬学的調製物が投与されると、さらなる発生を防ぐことができる。
【００９９】
本発明による細胞の調製物は、本発明の方法のステップｄ）で得られる生活ＳＴＩＣを含んでもよい。あるいは、該調製物は、抗体ＧＭ−７に結合するＳＴＩＣＧＭ７細胞、または細胞表面にＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原を共発現するＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｌ４＋細胞のサブ集団に属する細胞を含んでもよい。該調製物は、液体担体培地に個々の懸濁された細胞を好ましくは少なくとも１×１０５個／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも５×１０５個／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１×１０６個／ｍＬの量含んでもよい。培地は、５〜２０％ヒトアルブミン溶液のような、細胞によって優れた認容性が認められる、細胞培養または輸送培地であってよい。あるいは、調製物中の細胞は、冷凍され、５０％ヒトアルブミン溶液および１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩのような、適切な保存培地中に含まれてもよい。
【０１００】
最後に、本発明はまた、本発明の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ、ＳＴＩＣＧＭ７またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋）を、インビトロで自己由来の調節性Ｔリンパ球を産生または増やすために使用する方法に関する。実施例６（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１２に対応する）に示すように、リンパ球を有するＳＴＩＣに対応するＴＡＩＣの直接インビトロ共存培養によって、調節性Ｔリンパ球の、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球が著しく増殖される。したがって、自己由来のリンパ球を持つ個体の単球由来のＳＴＩＣを直接共培養することによって、自己由来の調節性Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球を産生および／または増やすことが可能になる。
【０１０１】
直接インビトロ培養手段とは、本発明によれば、ＳＴＩＣとリンパ球とを、上記したように実施例６に例示する培地と同じ培地中で、直接物理的接触で共培養することを言う。
【０１０２】
この方法では、培地は、各細胞すなわちＳＴＩＣおよびリンパ球をほぼ同じ細胞数で、それぞれ液体担体培地に懸濁されて、好ましくは少なくとも１×１０５個／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも５×１０５個／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１×１０６個／ｍＬの量の細胞を含むのが好ましく、培地は、５〜２０％ヒトアルブミン溶液のような細胞によって優れた認容性が認められる細胞培養または輸送培地であってもよい。共培養は、好ましくは、約３７℃のたとえばインキュベータ内で、好ましくは約３〜５日間、さらに好ましくは４日間という生理学的条件下で行われるべきである。
【０１０３】
実施例７（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１３に対応する）では、移植受容が、ドナー単球から産生されたＴＡＩＣを受容者に投与することによって誘発されるばかりでなく、受容者リンパ球を受容者に再度投与する、これはあらかじめ、上記したように、ドナー単球から生成されたＴＡＩＣとともにインビトロで直接共培養した、ことによっても誘発されることが示された。同様に、自己寛容は、自己由来のリンパ球を患者に再度投与する、これはあらかじめ患者自身の単球から生成したＳＴＩＣとともに直接共培養した、ことによっても誘発することができる。
【０１０４】
本発明のさらなる実施形態によれば、その結果、調節性Ｔリンパ球は、この個体からのリンパ球をこの個体の単球に由来するＳＴＩＣとともに直接共培養することによって、治療すべき個体に由来するリンパ球からインビトロで生成することができる。共培養されたリンパ球の受容者への再投与は、実施例７に示されるように、自己寛容を誘発する。
【０１０５】
そのように生成された調節性Ｔリンパ球は、本明細書に記載したように（上記を参照）ＦＡＣＳによって単離してもよいし、細胞が上記薬理学上許容しうる担体中に懸濁している、自己寛容障害を伴う疾患を予防および／または治療用の薬学的調製物において使用してもよい。
【実施例】
【０１０６】
本発明を、実施例を用いてさらに詳しく説明する。
【０１０７】
もし実施例中に定義がなければ、使用した培地および物質の組成は以下の通りである。
【０１０８】
（１．ペニシリン／ストレプトマイシン溶液）
ペニシリンＧのナトリウム塩として１０，０００単位のペニシリンとストレプトマイシン硫酸塩として１０００μｇのストレプトマイシン／１ｍＬの生理食塩水（ＮａＣｌ ０．８５％）（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ．１５１４０１２２）
（２．トリプシン−ＥＤＴＡ）
０．５ｇのトリプシンと０．２ｇのＥＤＴＡ（４ Ｎａ）／Ｌ
（３．Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０（１×，液体（１１８７５）））
ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地１６４０は、濃縮配合組成であり、哺乳動物細胞に広範に使用することができる。
【０１０９】
【表１】
参考文献：Ｍｏｏｒｅ Ｇ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．１９９：５１９（１９６７）
（４．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９８：１６７（１９５４）参照）
【０１１０】
【表２】
（５．フィコール−ハイパーク）
リンパ球分離培地（ショ糖／エピクロロヒドリン共重合体、Ｍｇ４００，０００、密度１．０７７、ジアトリゾ酸ナトリウムで調整）
（６．Ｌ−グルタミン）
液体：２９．２ｍｇ／ｍＬ
（７．マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ））
大腸菌からの組み替えヒトＭ−ＣＳＦ；モノマー（１８．５ｋＤ）として１３５個のＮ末端メチオニン含有アミノ酸残基を含み、３７ｋＤのモル質量をもつホモ二量体として存在する（ＳＩＧＭＡ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ．Ｍ６５１８）。
【０１１１】
（８．γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ））
大腸菌からの組み換えヒトγ−ＩＦＮ；１６．７ｋＤタンパク質を含有する１４３個のアミノ酸残基（ＣＨＥＭＩＣＯＮ ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｏ．ＩＦ００２）
（９．デキストラン硫酸ナトリウム）
シグマ−アルドリッチ３１４０３、塩、ＭＷ４０ｋＤ
（実施例１）
（全血からの単球の分離）
全血を２つの相違する方法によってヒト患者から得た。
【０１１２】
ａ）白血球搬出法：白血球搬出法を、ＣＯＢＥ(R)スペクトラＴＭ血液成分分離装置（Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ、レークウッド、コロラド州、ＵＳＡ）を使用し、単球モード（ＭＮＺ）で、製造業者の指示（ＣＯＢＥスペクトラバージョン４．７／５．１／６．０／７．０）に従って行った。
【０１１３】
ｂ）従来の血液成分分離法：４５０ｍＬの全血を、血液の凝固を避け細胞を仕込むために、１リットルの水に対して３．２７ｇのクエン酸、２６．３ｇのクエン酸三ナトリウム、２５．５ｇのデキストロースおよび２２．２２ｇのナトリウムジヒドロキシリン酸塩を含む安定剤６３ｍＬが入ったトリプルチェンバーバッグ中で混合した。溶液のｐＨは５．６〜５．８であった。
【０１１４】
次いで、血液の成分を分離するために、この混合物の「シャープな遠心分離」を、２０℃、４０００ｒｐｍで７分行った。これによって、３層内に血球成分と非血球成分の層状物を得た。次いで、この目的のために提供された圧縮機の中に置かれたバッグを使用して、赤血球を下側バッグに、血漿を上側バッグにしぼり出し、中間のバッグに約５０ｍＬの体積の所謂バッフィーコートを残した。
【０１１５】
次いで、両方法から、新しく得た単核球細胞画分５０ｍＬを、それぞれ２５ｍＬの２部分に分け、それぞれ、あらかじめ２本の５０ｍＬファルコンチューブにつながるフィコール−ハイパーク分離培地２５ｍＬ上に積層した。
【０１１６】
この調製物を制動なしで３０分間、２５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、単核球細胞画分にまだ存在したどのような赤血球および死細胞をフィコール相の下にし、そうすることで単球を含む白血球をフィコール層上に分離した。白色の中間相として分離した。
【０１１７】
次いで、単球を含む該白色中間相をピペットで注意深く取り除き、１０ｍＬのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）と混合した。
【０１１８】
次いで、この調製物を制動ありで３回、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各遠心分離操作と新しいＰＢＳの導入の後に、上澄み液をピペットで取り除いた。
【０１１９】
遠心分離容器（ファルコンチューブ）の底に集まった細胞ペレットは、単核球細胞画分、すなわち単球を含んでいた。
【０１２０】
ｃ）マウス実験８および９（遺伝的に同一性のあるマウスで行った）用に必要な単球を、同系のドナーマウスの脾臓から得た。脾臓を、多少圧力をかけた状態で細目ふるいを通過させ、このようにして分離した細胞をＰＢＳ中に再び懸濁した。懸濁した脾臓細胞を、あらかじめ５０ｍＬファルコンチューブにつないだフィコール−ハイパーク分離培地２５ｍＬ上に積層した。次いで、上記と同様の方法で手順を続けた。
【０１２１】
（実施例２）
（単球の増殖および変性）
単球の培養および増殖を下記の組成を持つ栄養培地上で行った。
【０１２２】
【表３】
栄養培地は、２．５μｇ／５００ｍＬＭ−ＣＳＦを含んでいた。
【０１２３】
実施例１で単離された単球を合計量で１０６個、１０ｍＬの栄養培地中に懸濁し、ペトリ皿（直径１００ｍｍ）に移した。該ペトリ皿は、あらかじめ純正な培養ＦＣＳで満たし、ＦＣＳで被覆された皿を得るために、このように、該ＦＣＳを２４時間後に流し出した。
【０１２４】
ペトリ皿を適切なカバーで被覆し、３７℃で３日間、インキュベータ内で保存した。２４時間後、ペトリ皿の底に細胞が沈殿した。２日目、上澄み液をピペットで取り出し、ペトリ皿を再び１０ｍＬの新しい栄養培地で満たした。
【０１２５】
４日目、１０ｍＬの栄養培地中の５０ｎｇのγ−インターフェロンを加え、皿を再び密閉し、さらに３７℃で４８時間、インキュベータ内で保存した。
【０１２６】
続いて、１０ｍＬのトリプシン溶液をＰＢＳでそれぞれ希釈（１：１０）し、ペトリ皿にピペットで移した。密閉したペトリ皿を３７℃で１０分間、インキュベータ内に保存した。
【０１２７】
その後、ペトリ皿の底に付着する細胞を、細胞スクレーパーを使用して、細胞の大部分（＞９０％）を上澄み液に浮遊させることによって分離した。
【０１２８】
全上澄み液（１０ｍＬのトリプシン溶液＋１０ｍＬの培地）をピペットで取り出し、５０ｍＬのファルコンチューブ中で合わせ、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上澄み液を捨て、新しい栄養培地（上記参照）を沈殿物（残存細胞ペレット）に加え、栄養を１０６個の細胞に対して１ｍＬ加えた。正確な投与量を測定するための細胞数の測定を、公知の方法に従って行った（Ｈａｙ Ｒ．Ｊ．，’’Ｃｅｌｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ’’，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００２，第４章、５５−８４頁を検討せよ）。
【０１２９】
この細胞懸濁物を遠心分離し（１８００ｒｐｍ、１０分、上記参照）、細胞ペレットをＰＢＳあるいはヒトへ適用するためＮａＣｌ（生理学の）へ導入した。続けて、直接あるいは４８時間以内に静脈内投与できる。
【０１３０】
あるいは、遠心分離し、トリプシンを含む上澄み液を捨てた後、ＦＣＳ／ＤＭＳＯを寒剤として細胞に加え、これらの体積１０ｍＬを冷凍した。
【０１３１】
寒剤は、９５％のＦＣＳと５％のＤＭＳＯとを含んでいた。それぞれのケースで、約１０６個の細胞を１ｍＬの寒剤に導入し、下記のステップで冷やした：
氷上で３０分；
予冷スチロポールボックス中で２時間、−２０℃；
スチロポール中、２４時間、−８０℃；
液体窒素（Ｎ２）中の小さなチューブ中に保存、−１８０℃；
図１は、オリジナル単球細胞の培養およびγ−ＩＦＮ刺激の後に使用された単球上のフローサイトメトリーによる抗原発現の表現型変化を示す。オリジナル単球細胞の培養およびγ−ＩＦＮ刺激によって、変性前の細胞（図１の左側のグラフ）に比べると、変性後（図１の右側のグラフ）はＧＭ−７の結合が大幅に増大した。
【０１３２】
以下の実施例３〜７は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書から取る。これらは、そこで開示されている移植許容誘発細胞（ＴＡＩＣ）の特性を示す。国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書のＴＡＩＣと本発明の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）（上記参照）との類似性のため、これらの実施例で報告されている結果は、ＳＴＩＣにも適用する。
【０１３３】
さらに詳しくは、実施例３〜７の結果を以下に示す：
最適な抑制機能を持つ細胞集団は、モノクローナル抗体ＧＭ−７の利用可能性を通して、オリジナル単球のＭ−ＣＳＦによる培養とγ−ＩＦＮ刺激の後に得られるＴＡＩＣ集団単離することができる（実施例３）；
単球画分中に存在するリンパ球は、ＴＡＩＣとして効果的なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の産生に大きな影響を有する（実施例４）；
ＩＤＯ−阻害剤である１−メチルトリプトファンは、ＴＡＩＣの抑制機能には影響しない（実施例５）；
ドナーＢのリンパ球とともにドナーＡのＴＡＩＣを直接インビトロ共培養すると、調節性Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の形成を誘発する（実施例６）；そして
インビボでのドナーＴＡＩＣと受容者リンパ球との間の物理的な細胞間相互作用は、臓器移植拒絶を防止しうる調節性Ｔ細胞の産生を誘発する（実施例７）。
【０１３４】
（実施例３）
（抗体ＧＭ−７のＴＡＩＣへの結合）
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書に記載されたように生成したヒトＴＡＩＣでマウスを免疫化することによって、モノクローナル抗体ＧＭ−７を産生した。抗体を生み出すハイブリドーマ細胞を、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ」に登録Ｎｏ．ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２で寄託した。以下に報告するレポートにおいて、該抗体が、本発明に従ってＭ−ＣＳＦで実験室内変性を６日間行いγ−ＩＦＮ刺激を２日間行ったＣＤ１４＋細胞上でのみ発現する抗原に特異的に結合することを実証した。
【０１３５】
図１は、インビトロ変性後に、すなわちＴＡＩＣへの形質転換の後に、単球細胞へのＧＭ−７のフローサイトメトリーによって測定した結合能力を示す。バッフィーコートから直接得たＣＤ１４−陽性単球は、抗体ＧＭ−７（左側の図、灰色の影の付いた部分が抗体コントロールに対応する）に結合しないことがわかる。対照的に、単球の一部は、Ｍ−ＣＳＦ中での培養とγ−ＩＦＮによる刺激の後に抗原を発現する。これは、抗原がモノクローナル抗体ＧＭ−７によって認識されていることである。実施例２に記載したように、培養の後、約８０％の形質転換された単球は、モノクローナル抗体ＧＭ−７（右側の図）に結合することができる。
【０１３６】
更なる実験において、ＣＤ１４＋／ＧＭ−７＋細胞の抑制活性を、混合リンパ球培地（ＭＬＣ）中のＣＤ１４＋／ＧＭ−７−細胞の抑制活性と比較した。ＭＬＣは、Ｋｕｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｔ．’’Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｓｓａｙｓ’’ｉｎ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，［Ｃｏｌｖｉｎ Ｒ．Ｂ．，Ｂｈａｎ Ａ．Ｋ．，ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｒ．Ｕ．（ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，７５１−７７１頁（１９９４）］に記載されているように行った。
【０１３７】
この実施例において、ＴＡＩＣは、個体Ｂに起因する。図２に示すように、ＧＭ−７陽性ＴＡＩＣとＧＭ−７陰性ＴＡＩＣとの間には抑制活性に大きな相違がある。６日間のＭ−ＣＳＦによる治療と２日間のγ−ＩＦＮによる刺激後に得られたＧＭ−７陽性画分ＴＡＩＣ集団だけが、Ｂの細胞による刺激の後に、個体Ａのキラー細胞のＴ−細胞増殖活性に関して重大な抑制効果を発現する。
【０１３８】
（実施例４）
（単球培養中のＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞形成におけるリンパ球の影響）
ＴＡＩＣとして効果的なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の産生における単球画分中に存在するリンパ球の影響を、２つの相違するセットアップを比較することによって測定した。
【０１３９】
第一セットアップ（以下「Ｍｏ」と言う）として、先ず単球画分を実施例１に記載したバッフィーコートの界面相から採取した。次いで、実施例２に記載したように、細胞をＭ−ＣＳＦとの培養ステップに移した。培養の出発点から１時間以内に、組織培養フラスコの底に付着している単球を、それぞれ１０ｍＬのＰＢＳで５回洗浄し、培養物中に存在するリンパ球の量を＜５％（４．８±２．４％）に減らし、一方、そのようにして得た濃縮単球（ＣＤ１４＋）の量は、９０％（９２±５．６％）を超えていた。このセットアップ内の追加の細胞成分は、Ｂ−リンパ球と顆粒球であった。
【０１４０】
第２セットアップ（以下、「Ｍｏ＋Ｌｙ」と言う）中の細胞も実施例１に記載の単球画分のバッフィーコートの界面相から採取した。しかし、セットアップ「Ｍｏ」とは異なり、組織培養フラスコの底に付着した細胞は、実施例２に記載するように、培養段階の始まりから２４時間後に１回だけ洗浄した。その結果、４５±５．３％のＣＤ１４＋単球と２３．５±８．９％ＣＤ２＋リンパ球からなる細胞集団が得られた。セットアップ「Ｍｏ」のように、リンパ球と顆粒球とがこのセットアップにも存在した。
【０１４１】
セットアップ毎の全細胞集団中のそれぞれの細胞タイプの量の測定を、それぞれ３つの実験セットアップのフローサイトメトリーによって行った（図３参照）。結果を標準偏差を含む平均値として報告する。
【０１４２】
ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞は、セットアップ「Ｍｏ」においてもセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」においても培養の始め（ｄ０＝０日目）には測定することはできない。５日間の培養期間の後に、実験を終了し、細胞を、実施例２に記載するように、組織培養フラスコの底から細胞を取り外した後、ＦＡＣＳ分析によって特徴付けた。ＣＤ１４＋細胞の相対量は、これらのセットアップにおいて、セットアップ「Ｍｏ」で９２％から４２％に、セットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」で４５％から２８％に減少することが認められた。一見したところ、リンパ球は単球より速く増殖しているが、リンパ球の相対量は、セットアップ「Ｍｏ」で４．８％から６９．８％に、セットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」で２３．５％から５０．６％に増加した。培養中、ＴＡＩＣとして効果のあるＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞は、両培養物中に形成される。この点で、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞において、セットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」で３２．０±５．３％の有意に高い増加が観察され、これとは対照的にセットアップ「Ｍｏ」では７．２±３．２％だけであることは重要である。
【０１４３】
これらの結果は、培養の始めに相対量に対する単球の濃縮が９０％を超えるような細胞の精製は、ＴＡＩＣ集団における免疫抑制性ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の産生に悪影響を及ぼし、一方、実施例１および２に記載の方法は、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の有意に高い収量をもたらすことを実証する。
【０１４４】
（実施例５）
（ＴＡＩＣの免疫抑制活性におけるＩＤＯ阻害剤、１−メチル−トリプトファンの影響の測定）
酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）の阻害剤が「Ｍｏ」および「Ｍｏ＋Ｌｙ」セットアップ（実施例４参照）において産生したＴＡＩＣの抑制機能に影響を及ぼすかどうかを明確にするために、１−ＭＴの存在下あるいは非存在下でＰＨＡ（赤血球凝集物質）刺激Ｔ細胞を加えた種々の混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）を造った。
【０１４５】
これらの混合リンパ球培養物において、５０，０００個のリンパ球と２μｇのＰＨＡを９６ウェルプレートのウェルに移し、次いで増殖を１４４時間行った（「ＰｈａＬｙ」と言う）。ＰＨＡを添加せず、リンパ球だけを培地で培養したものだけをさらなるコントロールとして造った（「Ｌｙ」と言う）。
【０１４６】
相違する共培養におけるＰＨＡ−刺激リンパ球の増殖を測定するために、以下の４つのセットアップを造り、試験した：
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」
ＰＨＡ刺激リンパ球とＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの１０５個の細胞］；
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」＋１−ＭＴ
ＰＨＡ刺激リンパ球と２μモルの１−ＭＴ存在下でのＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの１０５個の細胞］；
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」
ＰＨＡ刺激リンパ球とＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ」からの１０５個の細胞］；
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」＋１−ＭＴ
ＰＨＡ刺激リンパ球と２μモルの１−ＭＴ存在下でのＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ」からの１０５個の細胞］。
【０１４７】
１４４時間の培養の後、全てのコントロールまたは共培養物を、さらに３［Ｈ］−チミジン（「パルス状」）の存在下、２４時間培養し、その後、導入された、放射性標識したチミジンの量をカウント／分（ｃｐｍ）として測定した。図４参照。この処理で測定された放射能の量は、ＤＮＡへ導入された標識化チミジンの量として測定され、したがって、リンパ球の増殖率として測定される。図４で報告されている値は、３つの実験の３組の測定からの平均値であり、それぞれ、標準偏差の適用もある。
【０１４８】
結果は、ＰＨＡで刺激されないリンパ球（「Ｌｙ」）は、有意に増殖せず、観察された平均放射能は、３６７ｃｐｍと実証した（図４参照）。これに対し、２μｇのＰＨＡで刺激した場合、リンパ球（「ＰｈａＬｙ」）の増殖率が有意に増加し、これらのサンプルの中で最も高い導入、すなわち平均値１８４５９ｃｐｍが測定された。
【０１４９】
リンパ球培養物へのＴＡＩＣ添加は、実施例４によるセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの細胞が加えられた場合（ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」、１４９８ｃｐｍの値を測定）は、明らかに増殖率を強く減少させ、実施例４によるセットアップ「Ｍｏ」からの細胞を加えた場合（ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」、３３６９ｃｐｍの値を測定）は、増加は減少気味であった。
【０１５０】
２μモルの１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）を、「Ｍｏ＋Ｌｙ」および「Ｍｏ」に刺激リンパ球を含むセットアップに加えた後に得られた結果は、１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）は、ＴＡＩＣの抑制機能を相乗的に増加させ、それによって、セットアップ’’Ｍｏ＋Ｌｙ’’からのＴＡＩＣの減少（２６７ｃｐｍの値を測定）は、セットアップ「Ｍｏ」からのＴＡＩＣの減少（３９０ｃｐｍの値を測定）より強いことを実証した。
【０１５１】
（実施例６）
（調節性Ｔ細胞を産生するための同種異系のリンパ球とのヒトＴＡＩＣインビトロ共培養）
受容者においてＴＡＩＣが調節性Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の生成を誘発するかどうか調べるために、ＴＡＩＣとリンパ球との数種の相違するインビトロ培養物を造り、そこから得られる調節性Ｔ細胞の生成について分析した。
【０１５２】
この目的のため、インビトロでドナーＡのＴＡＩＣを、直接あるいは間接的にドナーＢのリンパ球とともに共培養した。直接共培養においては、（ドナーＡの）ＴＡＩＣと（ドナーＢの）リンパ球との間の直接細胞−細胞接合が可能であった。一方、間接共培養では、膜（「細胞培養挿入片」、孔径０．４μｍ、ファルコン、注文番号３５３０９０）が培地の交換を可能にしたが、２つの細胞集団の物理的な接触は抑制された。直接または間接共培養は、好ましくは３〜５日間、さらに好ましくは４日間、インキュベータ条件下、すなわち、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で行う。
【０１５３】
培養後、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋）のそれぞれの数を、ＴＡＩＣまたはリンパ球がそれぞれ単独で培養されている両セットアップおよびコントロールにおいて測定した。さらに、混合リンパ球培養物中で最も有意な抑制機能を持つＴＡＩＣ細胞集団の成分を代表するＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞の数を、ＴＡＩＣのみが培養されたコントロールセットアップ中で測定した。
【０１５４】
全セットアップにおいて、ＦＡＣＳ分析ごとに細胞の表面抗原を測定し、細胞の総数における各細胞集団の量を分析した。
【０１５５】
さらに、調節性Ｔ細胞によって特異的に発現された３つの新しいマスター遺伝子（Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７）の相対的発現量を、それぞれの細胞集団でＰＣＲによって測定した（表を参照）。Ｆｏｘｐ３は特異的な転写因子であり、調節性Ｔ細胞発症のコントロール遺伝子として観察され、これらの細胞によって特異的に発現される［Ｈｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，’’Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｘｐ３’’，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１０５７−１０６１（２００３）参照］。
【０１５６】
ＣＴＬＡ−４は更なる因子であり、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞の調整機能の測定のためのマーカーとして使用される（Ｋｈａｔｔｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，’’Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｓｃｕｒｆｉｎ ｉｎ ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ９０９（２００３）；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．’’Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５＋／ＣＤ４＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＧＩＴＲ ｂｒｅａｋｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ’’，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ７５９（２００３）；Ｃｏｂｂｏｌｄ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．”Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．１６（２），６６−７５（２００３）参照］。
【０１５７】
インテグリンαＥβ７は、インテグリンであり、上皮キャサリンに結合し、調節性ＣＤ２５＋Ｔ細胞のほとんどの強力なサブ集団のためのマーカーとして使用してもよい［Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＥβ７ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｕｎｉｑｕｅ ｓｕｂ−ｓｅｔｓ ｏｆ ＣＤ２５＋ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＣＤ２５− ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ’’ＰＮＡＳ ９９（２０），１３０３１−１３０３６（２００２）参照］。
【０１５８】
Ｆｏｘｐ３発現、ＣＴＬＡ−４発現およびインテグリンαＥβ７発現の測定は、コントロールとして、ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチン、２個の「ハウスキーピング遺伝子」を使用した定量的ＰＣＲ法によって行い、測定値は、インビトロでＴＡＩＣによってなされた測定抑制機能と、それぞれの遺伝子の発現率をもつＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ダブル陽性細胞の形成とを相関させるために、一方で、互いとの関係に置き、１で設定されたＣＤ１４＋／ＣＤ３−細胞で得られた値であり、もう一方で、絶対ＲＮＡ量が総ＲＮＡ（μｇ）に対するμｇとして示した。標準法は、当業者に知られている定量ＰＣＲのため使用した（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．’’Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８参照）。
【０１５９】
表は、直接共培養から得られたリンパ球の集団内において、ダブル陽性細胞ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋の比率は８．７％と、間接共培養から得られたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の量２．３８％、これはコントロールの２．６５％にほぼ近い、これらの量と比較して、大きく増加したことを示す。
【０１６０】
ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞のサブ集団は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞における発現に比べ、テストした全てのマスター遺伝子の中で、ｍＲＮＡの最も高い相対量を発現した（表参照）。Ｆｏｘｐ３の発現は、第１０因子によって増加（３７対３．７５）したが、ＣＴＬＡ−４の発現はそれより高く、最高発現（４６９９対０．３７６）まで至った。共培養中のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞における第三マスター遺伝子インテグリンαＥβ７の発現の増大は、インテグリンαＥβ７ｍＲＮＡの絶対量がＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞中３．４×１０−１２μｇｍＲＮＡ／μｇ全ＲＮＡに比較して、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞中１．４×１０−９に上がったため、ＣＴＬＡ−４とほぼ同じくらい高い。
【０１６１】
【表４】
（表：直接および間接共培養後の細胞の全量における特異的な細胞集団の、これらの表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ２５を参照することによる、量の測定、およびこれらの細胞集団における３つの遺伝子（Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７）の相対的発現およびＲＮＡ絶対量の測定）
間接共培養の後、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋サブ集団におけるＦｏｘｐ３−ｍＲＮＡの相対量は、わずか１０で、コントロールのリンパ球により発現される相対量（Ｆｏｘｐ３−ｍＲＮＡの相対量１５を発現する）より低い。
【０１６２】
コントロールのリンパ球により発現されるＣＴＬＡ−４−ｍＲＮＡの相対量は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋集団において０．３７５、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−集団において０．１と低い。
【０１６３】
ＴＡＩＣ細胞のＣＤ１４＋／ＣＤ３＋サブ集団におけるＣＴＬＡ−４の発現は、Ｆｏｘｐ３の発現と類似し、全ての他の細胞集団よりも有意に高かった。
【０１６４】
この点ついて、ＣＴＬＡ−４発現（相対値１２．５００）は、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋サブ集団において、相対値５０を発現したＦｏｘｐ３−発現より非常に強かったことは注目に値する。
【０１６５】
他の２つの分析遺伝子の発現挙動と同様に、相対値ＲＮＡ（μｇ）／全ＲＮＡ（μｇ）として測定された、ＴＡＩＣのＣＤ１４＋／ＣＤ３＋サブ集団におけるインテグリンの発現は、最高値（３．４×１０９μｇ／全ＲＮＡの１ｕｇ）に達したにもかかわらず、インテグリンαＥβ７の発現は、ＴＡＩＣのＣＤ１４＋／ＣＤ３−サブ集団において検出不可であった。
【０１６６】
単球に由来するＴＡＩＣにおける３つのリンパ球マーカーであるＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７の、正常リンパ球に比べて有意に増加した発現は、まったく予期しえぬ結果であり、単球に由来する単球または細胞において、今まで観察されたことのないものである。
【０１６７】
要するに、上述のこの実施例の結果によって、以下のことが実証された。もし、Ｆｏｘｐ３発現、ＣＴＬＡ−４発現およびインテグリンαＥβ７発現の濃度が、それぞれの細胞の免疫調整機能と相関関係があるという仮定から出発するとすれば、ＴＡＩＣのＣＤ３＋／ＣＤ１４＋サブ集団の抑制活性は、これら３つの遺伝子の高い発現と関連することがここで実証された。これは、これらのマーカーが今までリンパ球のためにしか記載されたことがなく、単球由来の細胞においては記載されたことがないことを考えるとさらに驚くべきことである。
【０１６８】
さらに、リンパ球を伴うＴＡＩＣの直接共培養物は、間接共培養物やリンパ球のみの培養物に比べて、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の量が有意に多くなることが示された。これは、ＴＡＩＣの投与の後に、インビボ（すなわち患者において）での調節性Ｔ細胞も形成されるという仮説を支持する。これらの結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の公知の免疫調整機能、およびこれらの細胞におけるＦｏｘｐ３−ｍＲＭＡ、ＣＴＬＡ−４−ｍＲＭＡおよびインテグリンαＥβ７−ｍＲＭＡの含有量が、間接共培養されたリンパ球やコントロールリンパ球における含有量より有意に高いという事実にも合致している。
【０１６９】
（実施例７）
（インビトロでＴＡＩＣとともに共培養されたリンパ球による移植寛容性のインビボ誘発）
実施例６の結果および結論は、インビボ動物実験において確認された。この実施例では、選択された近交系組み合わせにおける動物にあらかじめ５日間に渡り、ドナーからのＴＡＩＣとともに直接共培養した、受容者からのリンパ球を注射した。他の動物には、コントロールとして、培地で単独で培養した、受容者からのリンパ球を注射した。
【０１７０】
同種異系の心臓移植の前に受容者からの自己由来共培養リンパ球を受けた動物は、ドナー特異的寛容性を発症し、一方、受容者からの未処理非共培養コントロールリンパ球を受けたコントロール動物は、１０〜１４日間の間に移植された心臓を急性拒絶した。
【０１７１】
これは、術後の患者の、ＴＡＩＣとともに共培養されたリンパ球を注射する前（左図）と後（右図）の血液中のＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定によっても示される。細胞に結合するＧＭ−７画分は、注射前の約０．５％から注射後には約２１％に上昇し、ＧＭ−７に結合しうる調節性Ｔ細胞の発症が示唆される。
【０１７２】
これらの結果は、ドナーＴＡＩＣと受容者リンパ球との間の細胞相互作用に対する物理的細胞は、調節性Ｔ細胞の産生を、それ自身、潜在的にアロ反応性のＴ細胞は抑制され、臓器移植の拒絶反応はこのようにして防止されるように、受容者の同系の免疫機構を変性することができるように誘発することを示唆する。
【０１７３】
（実施例８）
（デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に誘発された慢性大腸炎の治療のための自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）の使用）
大腸炎は、飲料水とともにデキストラン硫酸ナトリウムの経口投与によってマウスに化学的に誘発することができる。７日間にわたる投与によって急性大腸炎が発症し、ＤＳＳ投与の後１０日間の正常な水の投与を少なくとも４回繰り返す投与によって、ヒト潰瘍性大腸炎に類似する慢性大腸炎が発症する。
【０１７４】
この方式は、免疫学または分子学的試験法として充分確立され［たとえば、Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．’’Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ （ＤＳＳ）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ’’Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０，５９−６５（２０００）；Ｅｇｇｅｒ，Ｂ ｅｔ ａｌ．’’Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ α ｈａｖｅ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ’’Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１３，８２５−８３２（１９９７）参照］、本明細書において、ヒト自己免疫性潰瘍性大腸炎に類似するＤＳＳ誘発大腸炎の慢性のケースの治療において、ＳＴＩＣの可能性を調べるために使用する。
【０１７５】
正常な雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（それぞれ２０ｇ）を自由に水と標準食に接せられるように保った。これらのマウスは、以下のスキームに従って、５％（ｗ／ｖ）のデキストラン硫酸ナトリウムを含む水（ＤＳＳ；該溶液を以下ＤＳＳ水という）、次いで未処理の水のサイクルを４回受けた：
第一サイクル： １日目から７日目までＤＳＳ水（７日間）；
８日目から１７日目まで正常な水（１０日間）；
第二サイクル： １８日目から２４日目までＤＳＳ水（７日間）；
２５日目から３４日目まで正常な水（１０日間）；
第三サイクル： ３５日目から４１日目までＤＳＳ水（７日間）；
４２日目から５１日目まで正常な水（１０日間）；および
第四サイクル： ５２日目から５８日目までＤＳＳ水（７日間）
５８日目の後、全てのマウスは慢性大腸炎の症状を示し、個の症状は、少なくとも２ヶ月続く（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１７６】
次いで、マウスを無作為に４つの異なるグループに割り当てた：
グループ１（ｎ＝５）：＋１日目（５９日目）ＤＳＳ水を与える第四サイクルが終了した後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからのＳＴＩＣ（実施例２参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した；
グループ２（ｎ＝７）：＋７日目（６５日目）ＤＳＳ水を与える第四サイクルが終了した後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからのＳＴＩＣ（実施例２参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した；
グループ３（ｎ＝１２）：ＤＳＳ治療は受けたがどのような細胞注射も受けていない第一コントロールグループ；
グループ４（ｎ＝６）：ＤＳＳ治療を受けた第二コントロールグループ；＋１日目（５９日目）ＤＳＳ水を与える第四サイクルが終了した後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからの「コントロール細胞」（実施例１参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した。（「コントロール細胞」は、骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の混合物であって、実施例２によるＳＴＩＣを生成するために培養する前の細胞、すなわち、同系のマウスの脾臓から得られた培養されていない細胞である。）
７９日目、ＤＳＳ水の栄養分の第四サイクルを終了した後３週間目にマウスは全て屠殺する。
【０１７７】
実験の間、ＤＳＳ誘発期間と次の３週間は動物の体重を１週間に３回測定した。動物の体重の変化を、細胞治療を受けた５９日目のマウスの体重に対する比率（体重減少または増加）で表す。約５〜１５％の範囲内の変化は有意であると考えられる。
【０１７８】
ＤＳＳ治療の終了後３週間のマウスの体重変化を図７に示す。見てわかるように、ＳＴＩＣ投与＋１日目（グループ１＝白四角）は、年齢依存性の適切な体重増加となり、これは、処置されていない動物（グループ３＝黒逆三角）にも、「コントロール細胞」で処置された動物の＋１日目（グループ４＝黒丸）にも、疾患が進行中の、ＳＴＩＣで処置された動物の＋７日目（グループ２＝黒三角）に見ることができない。値は、１グループ当たり５〜７匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【０１７９】
更なる実験で、大腸組織をヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）で組織学的に染色した。ＨＥ染色は、Ｗｏｏｄｓ，Ａ．Ｅ．およびＥｌｌｉｓ，Ｒ．Ｃ．（ｅｄｓ．）（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１＆２；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ＆Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９９４）によって記載されたように行った。染色された粘膜の状態を、実験計画については知らされてない、それぞれ別々に行動する２人の病理学者によって、以下の判断基準に従って評価された：
スコア０ 健康で、影響は見出せない；
スコア１ 軽い大腸炎；
スコア２ 中程度の大腸炎；
スコア３ 重い大腸炎；および
スコア４ 全粘膜の破壊を伴う潰瘍性大腸炎。
【０１８０】
該スコアの結果を図８に示す。ＤＳＳ水の食餌投与の第四サイクルが完了した後３週間で、グループ３のコントロールアニマル（注射せず）は平均スコア約４を得、一方グループ１（＋１日目にＳＴＩＣを投与された）、あるいはグループ２（７日目にＳＴＩＣを投与）の動物は、平均スコアを約１（グループ１）および約１．５（グループ２）にそれぞれ有意に減少させた。「コントロール細胞」で処置された動物（グループ４）は、約３の平均スコアを有し、これは処置していないマウス（グループ３）のスコアと同じ程度である。
【０１８１】
これらの結果は、図６からわかるように、染色された大腸部位（ＨＥ染色、上記参照）の組織学的評価の確認事項と一致している。この評価は、ＳＴＩＣによる治療の効果の測定に最も重大な意味を持つ。図６Ａ（倍率２．５倍）および図６Ｂ（倍率１０倍）は、大きく破壊されている粘膜を持ち、そのまわりの組織は炎症性細胞が濃密に広がる、グループ３の処置されていない動物の大腸の状態を示す。これらの図は大腸炎の進行期を示す。処置されていない動物における大腸炎の進行した状態（図６Ａ／Ｂ）とは対照的に、＋１日目にＳＴＩＣを受けたグループ１の動物の粘膜の形態は、広い範囲で保たれている（図６Ｃ（倍率２．５倍）および図６Ｄ（倍率１０倍））。これらの動物には、粘膜の炎症および破壊の僅かな兆候だけが見られるが、まわりの組織への侵入は見られない。＋１日目に「コントロール細胞」で処置されたグループ４の動物の大腸部位（図６Ｅ、倍率２．５倍）および＋７日目にＳＴＩＣを受けたグループ２の動物（図６Ｆ、倍率２．５倍）は、両方とも、処置されていない動物（図６Ａ／Ｂ）に見られたと同じような、大きく破壊された粘膜とそのまわりの組織は炎症性細胞が濃密に広がる、進行した大腸炎の症状を示す。
【０１８２】
上記試験の結果は、＋１日目のＳＴＩＣ投与とそれに続く大腸炎を誘発するＤＳＳ治療の終了が大腸炎の症状を抑制しうる、あるいは明らかに軽減しうることを示す。ＳＴＩＣが投与された動物は、体重を有意に落とさず（図７）、これらの組織学的スコアを処置されていない動物（図８）に比べて有意に減少し、大腸部位（図６Ｃ／Ｄ）の組織学的染色によって見られるように、大腸粘膜の全状態は殆ど正常である。＋７日目のＳＴＩＣ投与（グループ２）は、ＳＴＩＣ投与の前の７日間の間に進行した大腸炎を治療することができない。起こりつつある大腸炎の進行を反転することはできないが、処置されていないグループ３の動物と比べてグループ２の動物がもつより低い組織学的スコア（図８）から、疾患の進行を止めることはできる。この現象は、この実施例で使用されたＤＳＳ誘発大腸炎のモデルでは特異的であり、容易に他の状態に移すことはできない。
【０１８３】
同系のマウスの脾臓から得た培養されていない細胞を表す、骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の配合物は、これらの細胞で処置された動物（グループ４）が処置されていない動物と同じくらい重篤な症状を示した（図６Ｅ／Ｆ、図７および図８）ため、大腸炎の治療には相応しくない。これは、ＳＴＩＣだけが大腸炎を治療することができ、細胞ＳＴＩＣの配合物中に存在する他の細胞は、培養中発症しないという明らかな証拠を提供する。
【０１８４】
（実施例９）
（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋リンパ球の移植によりＳＣＩＤマウスに誘発した大腸炎の治療のための自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）の使用）
ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウスにおける大腸炎の人工的な誘発は、ＳＴＩＣの分析および自己免疫疾患の治療の可能性のための別の取り組みである。
【０１８５】
ＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞もＢ細胞も持っていない。彼らの免疫機構は、甲状腺細胞の特異的なサブ集団の移植によって再構成することができる。ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞またはＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞と呼ばれるこれらの細胞は、免疫機構を再増殖するが、制御不可のため、慢性の炎症を伴う自発大腸炎の発症も誘発する。このモデルシステムは、自己免疫疾患の例のように、大腸炎における発症に関与する細胞集団のより特異的な分析を可能にする、所謂「マウスにおける実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデル」［たとえば、Ｍｕｄｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．’’Ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ’’Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７０，１７０−１７６（２００２）参照］である。
【０１８６】
ここでのモデルは、脱調整免疫システムによって誘発された大腸炎の治療において、ＳＴＩＣの使用に可能性があるか試験するために使用される。このモデルは、より機序的な研究を可能にするが、免疫機構は完全に再増殖しないため、ＤＳＳモデルシステム（上記実施例８参照）に比べると弱いシステムと考えられる。
【０１８７】
ＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウス（それぞれ１８〜２２ｇ）に、ＰＢＳ中の「Ｍａｃｓ」磁気ビーズ細胞分級システム（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離したＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−セレクチンｈｉｇｈＴ細胞を１×１０６個を腹腔内注射する。マウスを自由に水と標準食に接せられるように保った。
【０１８８】
ＣＤ４＋／ＣＤ６２ＬセレクチンｈｉｇｈＴ細胞の移植から４〜６週間以内に、該マウスは大腸炎を発症した。大腸炎の発症は、重さの変化の判断によって決定した。
【０１８９】
次いで、マウスを無作為に３つの異なるグループに割り当てた：
グループ１（ｎ＝１０）：ＣＤ４＋／ＣＤ６２ＬセレクチンｈｉｇｈＴ細胞の投与による大腸炎誘発の開始から６週間後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからのＳＴＩＣ（実施例２１参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した；
グループ２（ｎ＝１０）：６週間後、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−セレクチンｈｉｇｈＴ細胞だけを受けたが、他のどのような細胞注射も受けていない第一コントロールグループ；
グループ３（ｎ＝１０）：ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−セレクチンｈｉｇｈＴ細胞を受けた第二コントロールグループ。６週間後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからの「コントロール細胞」（実施例２参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した。「コントロール細胞」は実施例８と同一のもの（骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の非培養配合物）。
【０１９０】
疾患誘発Ｔ細胞の移植から１０〜１２週間で、あるいはコントロール動物が基本的なコントロールグループ２内での体重変化によって判断して、大腸炎の兆候を発症した時、全てのラットを全て致死させる。
【０１９１】
実施例８で記載したＤＳＳモデルと同様に、実験の全期間の間、動物の体重を１週間に３回測定した。動物の体重の変化を、細胞治療を受けたときの実験開始から６週間後のマウスの体重に対する比率（体重減少または増加）で表す。再度、約５〜１５％の範囲内の変化は有意であると考えられる。
【０１９２】
全実験期間中のマウスの体重変化を図９に示す。６週間後の全てのグループのマウスは、ほぼ同じ体重である。その後、６週間後のＳＴＩＣの投与（グループ１＝黒菱形）は、年齢依存性の適切な体重増加となるが、処置されていない動物（グループ２＝黒四角）についても、６週間後に「コントロール細胞」で処置されたマウス（グループ３＝黒三角）についても、疾患が進行、比較的体重増加が減少した（グループ２）または増加が全く見られない（グループ３）。値は、１グループ当たり６匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【０１９３】
動物を屠殺した直後、これらの動物の大腸の長さと脾臓の重量を測定した。両値とも炎症の広がりは認められたものの、あまり影響は受けていない。
【０１９４】
図１０に大腸の長さ（図１０Ａ）と脾臓の重量（図１０Ｂ）の測定の結果を示す。この図からわかるように、コントロール動物と比べて、ＳＴＩＣで処置した動物（グループ１）の大腸は有意に長く（約１１ｃｍ）、それらの脾臓は有意に小さい（約５０ｍｇ）。グループ２のコントロール動物は、重篤な炎症を示唆する、短くなった大腸（約１０．３ｃｍ）と肥大した脾臓（約１００ｍｇ）を有する。一方、コントロール細胞を受けた動物（グループ３）は、コントロール動物（グループ２）と比べると大腸炎の重篤な症状は発症していない（大腸の長さが約１０．６ｃｍ、および脾臓の重量が約６０ｍｇ）が、ＳＴＩＣで処置した動物（グループ１）に比べると、大腸炎はより進行している。
【０１９５】
続いて、更なる実験で、大腸組織をヘマトキシリンエオシンで組織学的に染色した（ＨＥ染色；Ｗｏｏｄｓ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｃ．（ｅｄｓ．）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１＆２；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ＆Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９９４）。すでに実施例８で記載したように、実験計画については知らされてない、それぞれ別々に行動する２人の病理学者によって、粘膜の状態が評価された。粘膜のスコア方法は実施例８と同じである：
スコア０ 健康で、影響は見出せない；
スコア１ 軽い大腸炎；
スコア２ 中程度の大腸炎；
スコア３ 重い大腸炎；および
スコア４ 全粘膜の破壊を伴う潰瘍性大腸炎。
【０１９６】
平均スコアを図１１に示す。治療の移植を行って６週間後、細胞注射を受けていないグループ２のコントロール動物は、重い大腸炎を示唆する約３の平均スコアを有する。６週間後にＳＴＩＣを受けたグループ１のマウスおよびコントロール細胞を受けたグループ２のマウスは、有意に減少し、それぞれ平均スコアが約１．５（軽い大腸炎を示す；グループ１）および約２．５（中程度の大腸炎を示す；グループ２）を有する。
【０１９７】
これらの結果も、図１２（倍率１００倍）からわかるように、ＨＥ染色された大腸部位の組織学的評価の確認事項と一致する。図１２Ａ／Ｂは、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴ細胞での大腸炎誘発後、処置しないままのグループ３の動物の大腸の状態を示す。両実施例は、単核球細胞による著しい侵入と、粘膜下組織および固有筋層の粘膜一体性の実質的な欠損、クリピト損傷、および侵入を示す。記載したように、「コントロール細胞」（血液、ウシ骨髄および脾臓組織に由来する非Ｍ−ＣＳＦおよびγ−インターフェロン刺激単球）の注射は、図１２Ｃ／Ｄでわかるように、単核球細胞侵入および粘膜の欠損を予防しなかった。また、両検体は、リンパ球の実質的な粘膜下組織侵入を示すが、固有筋層はまだ損なわれていない。ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴ細胞による大腸炎誘発の後、ＳＴＩＣを投与することで、粘膜一体化を著しく回復した（図１２Ｅ／Ｆ）。両検体の大腸部位において、軽いリンパ球侵入だけが見られ、分析した大腸部位の範囲内では、クリプト損失も粘膜下組織および固有筋層への損傷も見られない。
【０１９８】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎の治療のためのＳＴＩＣの投与で得られた結果（上記実施例８参照）と同様に、マウスにおける実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルを使用したここでも、ＳＴＩＣは誘発大腸炎の症状を抑制するまたは明らかに軽減することができることを示される。ＳＴＩＣで処置されたマウスは、年齢依存性の適切な重さの増加を示し（図９）、大腸の重篤な炎症を患うコントロールグループのマウスと比べて、それらの大腸は有意に長く（図１０Ａ）、それらの脾臓の重量は有意に低い（図１０Ｂ）。最後に、ＳＴＩＣで処置されたマウスの組織学的スコアは、処置されていない動物（図１１）に比べ、有意に低く、ＳＴＩＣで処置されたマウスの大腸部位の組織学的分析は、大腸炎の症状がほんの僅かもしくは症状がないことを示す（図１２）。
【０１９９】
同系のマウスの脾臓から得た非培養細胞を示す骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の配合物は、これらの細胞で処置された動物（グループ３）はＳＴＩＣで処置された動物に見られたものより重篤な症状を示している（図９、１０Ａ／Ｂ、１１および１２）ため、ＳＴＩＣによる大腸炎治療の効果と比べて、有意に低下した評価を示す。ＤＳＳモデルシステムを使用した実施例８で得られた結果とは対照的に、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞による大腸炎誘発のモデルでは、コントロール細胞は、コントロール細胞を受けた動物は、いかなる細胞も受けていないコントロール動物に比べて、それほど重篤な症状を示さないため、症状をいくらか軽減することができる。
【０２００】
実施例８の結果によって、本発明のＳＴＩＣは自己免疫疾患を治療することが可能であるという明らかな証拠が再び提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】本発明による細胞の変性の前（左側のグラフ）および後（右側のグラフ）のオリジナル単球細胞のＧＭ−７結合能力のフローサイトメトリー測定。ｘ軸は結合細胞の数を示す。
【図２】個体Ｂ（ＧＭ−７−：グレイのカラム；ＧＭ−７＋：黒のカラム）からのＣＤ１４＋単球の混合リンパ球培養物、ＣＤ１４＋／ＧＭ−７＋細胞とＣＤ１４＋／ＧＭ−７−細胞の抑制活性を比較するためのＭＨＣ非調和ドナーＡからのキラー細胞、およびドナーＢからの照射細胞。
【図３】免疫抑制性ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の形成における培養の開始時に、単球を濃縮するために細胞を精製する際の影響を測定するための、単球画分中のＣＤ１４＋単球の量、ＣＤ２＋リンパ球の量およびＴＡＩＣとしての効果があるＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の量のフローサイトメトリー測定。
【図４】ＴＡＩＣの抑制活性における阻害剤（１−ＭＴ）の影響を測定するための、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤（１−ＭＴ）が加えられた２つの試験においてプレインキュベートされたＰＨＡ刺激リンパ球（ＰｈａＬｙ）およびＴＡＩＣ（「Ｍｏ＋Ｌｙ」または「Ｍｏ」）の混合リンパ球培養物。
【図５】血液細胞のインビボＧＭ−７発現におけるＴＡＩＣの影響を測定するための、ＴＡＩＣの注射の前（左図）および後（右図）の手術後の患者の血液中のＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定。
【図６】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎を患っているマウスの大腸部のＨＥ染色であって、処置されていないグループ３の動物（図６Ａ／Ｂ）、＋１日目にＳＴＩＣを与えられ次いでＤＳＳ治療されたグループ１の動物（図６Ｃ／Ｄ）、「コントロール細胞」を＋１日目に与えられたグループ４の動物（図６Ｅ）、およびＳＴＩＣを＋７日目に与えられた動物（図６Ｆ）の大腸の状態を示す。（図６Ａ／Ｃ／Ｅでは倍率２．５倍、図６Ｂ／Ｄ／Ｆでは倍率１０倍）
【図７】ＤＳＳ治療の終了後３週間の間の、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎を患っているマウスの体重の変化。グループ１（黒四角）の動物はＳＴＩＣを＋１日目に与えられ、グループ２（黒三角）の動物はＳＴＩＣを＋７日目に与えられ、グループ３（黒逆三角）の動物は処置されず、一方、グループ４（黒丸）の動物は、「コントロール細胞」を＋１日目に与えられた。値は、１グループ毎に５〜７匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【図８】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎を患っているマウスの組織学的に染色された大腸部のスコアの結果である。グループ１の動物はＳＴＩＣを＋１日目に与えられ、グループ２の動物はＳＴＩＣを＋７日目に与えられ、グループ３の動物は処置されず、一方、グループ４の動物は「コントロール細胞」を＋１日目に与えられた。（採点０＝健康で影響のない結果；採点１＝マイナーな大腸炎；採点２＝中程度の大腸炎；採点３＝重い大腸炎；および４＝粘膜全体の破壊を伴う潰瘍性大腸炎）
【図９】細胞治療を受けた場合の実験開始後６週間のマウスの体重に関する、実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルにおける、マウスの体重の変化。グループ１の動物（黒菱形）は６週間後にＳＴＩＣを与えられ、グループ２の動物（黒四角）は処置されず、グループ３の動物（黒三角）は６週間後に「コントロール細胞」を与えられた。値は１グループ毎に６匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【図１０】実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルにおける、ＳＴＩＣを受けたマウス（グループ１）、処置されていないコントロールマウス（グループ２）、および「コントロール細胞」を受けたマウス（グループ３）の大腸の長さ（図１０Ａ）および脾臓重量（図１０Ｂ）の測定。値はＳＥＭ平均値である。
【図１１】細胞移植後６週間の実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルのマウスの組織学的に染色された大腸部のスコア。グループ１の動物はＳＴＩＣを受け、グループ２の動物は無処置で細胞注射を受けておらず、グループ３の動物は、「コントロール細胞」を受けた。値はＳＥＭ平均値である（採点０＝健康で影響のない結果；採点１＝軽い大腸炎；採点２＝中程度の大腸炎；採点３＝重い大腸炎；および４＝粘膜全体の破壊を伴う潰瘍性大腸炎）。
【図１２】実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルのマウスの大腸部のＨＥ染色であって、２匹の無処置の動物のグループ２（図１２Ａ／Ｂ）、２匹の「コントロール細胞」を与えた動物のグループ３（図１２Ｃ／Ｄ）、および２匹のＳＴＩＣを与えた動物のグループ１（図１２Ｅ／Ｆ）の大腸の状態を示す（倍率：１００倍）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、患者において免疫学的自己寛容を誘発しうる単球由来の自家細胞に関する。これらの細胞は、これ以降「ＳＴＩＣ」（自己寛容誘発細胞）と言う。さらに本発明は、自己寛容障害、特に自己免疫疾患およびアレルギーを伴う疾患の予防および／または治療のための薬学的調製物におけるＳＴＩＣの使用に関する。
【０００２】
本発明において、語句「自己（由来）」とは、ＳＴＩＣが、該ＳＴＩＣを投与している各患者の血液中の単球に由来することを言う。
【０００３】
本発明の細胞が調節性Ｔ細胞（ＴｒｅｇＣＤ４＋２５＋）を誘発しうることが本発明者によって示された。したがって本発明は、調節性Ｔ細胞の誘導および／またはインビトロ製造にも関する。
【背景技術】
【０００４】
免疫機構は、存在する微生物に関して、潜在的病原性抗原から体を保護する一方で、本来なら、体それ自身の構成成分と反応することは避け、すなわち、健康な免疫機構は「自己抗原」を黙認する。
【０００５】
自己寛容障害は、特別な適応（後天的な）免疫応答が自己抗原に取り付けられた時に起こる。
【０００６】
外来性抗原に対する適応免疫応答の正常な帰結は、体から抗原を浄化することである。しかし、適応免疫応答が自己抗原に対して発症した場合、免疫効果機序が抗原を完全に除去することは通常不可能であり、したがって、持続的反応が起こる。その結果、免疫能のエフェクター経路は、組織に慢性の炎症性障害を起こし、それは死に至る場合もある（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ２００１，Ｃｈａｐｔｅｒ １３，ｐａｇｅｓ５０１−５２２参照）。
【０００７】
適応免疫応答は、抗原−特定のＴおよび／またはＢ細胞の活性によって開始され、自己免疫も同じように開始されると信じられている（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．ｐ５０１）。
【０００８】
本発明の好ましい実施形態の１つは、ＳＴＩＣを含む薬学的調製物を使用した、自己免疫疾患の治療および／または予防に関する。
【０００９】
自己免疫疾患は、主として２つのパターンに区別される。自己免疫症状の発現が体の特定の器官に限定される疾患は、「器官特異」自己免疫疾患として知られ、一方、「全身性」自己免疫疾患においては、体の多くの組織が影響を受ける。器官特異自己免疫疾患の例として、橋本病、グレーブス病（これらはそれぞれ優先的に甲状腺に影響する）、およびＩ型インスリン依存性糖尿病（これは膵島に影響する）が挙げられる。全身性自己免疫疾患の例としては、全身性紅斑性狼瘡および原発性シェーグレン症候群（これは皮膚、腎臓および脳の多種多様な組織が全て影響を受ける）（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌｏｃ．ｃｉｔ，５０３ページ、参照）が挙げられる。
【００１０】
Ｔ細胞媒介性であると主に信じられている自己免疫疾患、たとえば、インスリン依存性糖尿病、リウマチ性関節炎および多発性硬化症があり、一方、細胞表面やマトリックス抗原への抗体の形成が主な役割を果たす、たとえば、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡あるいは急性リウマチ熱におけるような事例もあり、さらに別に、たとえば混合型クリオグロブリン血症、全身性紅斑性狼瘡あるいはリウマチ性関節炎のような、Ｔ細胞およびＢ細胞の両方が関与する免疫複合疾患のグループもある（Ｉｍｍｕｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｌｏｃ．ｃｉｔ，５０２頁の図１３．１参照）。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、薬学的調製物として製剤化された本発明のＳＴＩＣによるアレルギーの治療に関する。
【００１２】
近年、調節性Ｔ細胞が、免疫恒常性維持の調整において重要な役割を果たすこと、すなわち、免疫学的自己寛容を始めとして、いかなる感染あるいは抗原関連標的に対しても免疫応答ができあがっていることが示唆されている（Ｔａｋｅｓｈｉ Ｔａｋａｈａｓｈｉ ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｎ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ，２２５，１−３２（２００３）；Ｓｈｉｍｏｎ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ８３，１５１−１５３（２００２），Ｋａｔｈｒｙｎ Ｊ．Ｗｏｏｄ ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｎ Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３．１９９−２１０（２００３）参照）。
【００１３】
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．ｐａｇｅ１，Ａｂｓｔｒａｃｔが述べるように、「自己反応性Ｔ細胞のＴ細胞媒介性優勢遺伝子調整は、免疫学的自己寛容の維持を助長し、その交代が自己免疫疾患の発症を促すことを示唆する証拠が蓄積されている。そのような調節性Ｔ細胞集団を描く努力によって、ヒトを始めとする正常な未処理動物におけるＣＤ４＋細胞集団内のＣＤ２５＋細胞が制御活性を有することが明らかになった。ＣＤ２５＋プラスＣＤ４＋調節性Ｔ細胞は、Ｔ細胞の機能的に区別されたサブ集団として、正常な胸線によって産生される。これらは、自己免疫予防においてだけでなく、種々の免疫反応の調整においても重要な役割を果たす。」
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患の他にも、免疫機構のＢ細胞コンパートメントが、自家細胞（マスト細胞を含む）、組織および器官構造に対する抗体の産生を伴う自己攻撃性疾患を誘発できる。
【００１４】
Ｂ細胞活性化は、ヘルパーＴ細胞が特定の抗原位上でクローナルＢ細胞性増加を刺激するといった方法で、Ｔ細胞ヘルプに依存することはよく知られている。該抗原は断片化されたアレルゲンから誘導されてもよく、これらは次いでＴ細胞内で小分子ペプチドにされる。次いで、抗原特異的活性化を促すために、ＭＨＣ制限の形で提供される。
【００１５】
特定のアレルゲンによって引き起こされ、一方でアレルギー性疾患を起こし、また他方で自己寛容障害を誘発しうる（前述を参照）、調整不可能なあるいは過剰なＢ細胞の活性化を回避するために、調節性Ｔ細胞は、Ｂ細胞の活性化と関係しているＴ細胞を阻害する能力を持ち、過剰で調整不可能な抗体産生を妨げる。
【００１６】
したがって、自己免疫疾患と同じように、アレルギー性疾患もまた、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の量が増加することによって、影響を受け、コントロールされうる。特に、ＥＡＥ（「実験アレルギー性脳脊髄炎」）を患うマウスにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞をこれらの動物に投与して２週間で疾患は軽減され、治療にはさらなる疾患の誘発を伴うことがないことが示された（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．’’Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｕｎｄｅｒ Ｓｃｒｕｔｉｎｙ’’Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３：１８９−１９８（２００３）；Ｌａｎｄｏ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．’’Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ ｏｎ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ−ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｔｏ ＥＡＥ’’Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：２１５５６−２１６０（１９７９））。これらの効果は、自己免疫性糖尿病の進行をＣＤ４＋細胞の投与によって止まらせ、さらに新たに自己免疫疾患が出現することを阻止したＮＯＤマウス（Ｂａｃｈ，Ｊ．Ｆ．，ｌｏｃ．ｃｉｔ．）で示された効果と似ている。
【００１７】
自己免疫反応を伴ってもよい、アレルギー性疾患の例は、自己のものでないタンパク質、体が出会う有機および無機物質によって誘発されるアレルギーの全てのタイプである。この点で特に重要なものは、花粉によって誘発されるアレルギー、たとえば花粉症、および薬、化学薬品、ウイルス、バクテリア、菌類、ハウスダスト、食品成分、金属、ガス、皮膚落屑や髪の毛のような動物の体の成分および動物の排泄物のようなアレルゲンによって誘発されるアレルギーである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
現時点で、自己寛容障害によって起こる疾患の予防および／または治療に関する効果的な治療は入手できていない。
【００１９】
器官特異自己免疫疾患に関しては、代替治療、移植、コルチゾンのような抗炎症薬を使用する症候性治療が通常行われている。全身性自己免疫疾患に関しては、免疫抑制剤が治療のためにしばしば使用される。明らかに、これらの「治療」は多くの点で問題があり、重篤な副作用を発症する。
【００２０】
集団の５％までは、自己免疫疾患に冒されていると推定される（Ｓａｋａｇｕｓｈｉ，ｌｏｃ．ｃｉｔ．，１５１頁、左欄）。したがって、扱いやすく、健康を脅かす副作用を伴わず、このような治療に適用される現時点で方法および薬剤に関し高い費用の掛からない、自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための有効な手段の存在が早急に求められている。
【００２１】
したがって、自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための改良された方法を提供することが、本発明の根底にある問題である。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
この問題の解決のために、脊椎動物、特に哺乳動物、さらに好ましくはヒトからの単球由来の自己由来の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）を使用することが提案されている。これらの細胞は、以下に記載する本発明の方法によって得られ、該方法によって個体の中の調節性Ｔリンパ球（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の量を増やすことができる変性細胞が得られる。約１０５個の細胞／ｋｇ体重（ＢＷ）の投与の後、これらの細胞は、自己寛容障害を伴う疾患を適切に予防および／または治療する。
【００２３】
（発明の要旨）
単球由来の自己に由来する自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）を生成する方法の基本的な工程は、
（ａ）細胞を投与すべき患者のそれぞれの血液から単球を単離する工程と、
（ｂ）成長促進剤としてマクロファージコロニー刺激因子（以下Ｍ−ＣＳＦという）を含む適切な培地中で、単球を増殖させる工程と、
（ｃ）単球をγ−インターフェロン（以下γ−ＩＦＮという）で刺激する工程と、
（ｄ）工程ｃ）で形成された自己寛容誘発細胞を、培地から細胞を分離することによって得る工程、
とを含む。
【００２４】
類似の方法がドイツ特許出願第ＤＥ１０２３１６５５．４号明細書および国際特許出願国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の明細書に記載されている。上記の先願の特許出願には、生成された細胞は、「移植受容誘発細胞」（ＴＡＩＣ）と呼ばれる。これらは、受容者における同種異系のドナー組織の受容を誘発するために使用される。重要なことは、ドイツ特許出願第ＤＥ１０２３１６５５．４号明細書および国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書に記載されているＴＡＩＣは、ドナーの単球から誘導されたものであり、移植の受容を誘発するために、受容者に投与することである。これは、ＴＡＩＣは、ＴＡＩＣで処置すべき個体に対し同種異系であることを意味する。
【００２５】
これに対して本発明は、「自己由来の治療」の概念に基礎を置く。これは、自己寛容障害、特に自己免疫疾患および／またはアレルギーを患う個体が、自己由来の単球から誘導される、自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）で処置されることを意味する。
【００２６】
したがって、ＴＡＩＣとＳＴＩＣとは両方とも、本質的に同じ方法によって単球から誘導されるが、ＴＡＩＣは処置されるべき患者に対して同種異系であり、一方、ＳＴＩＣはこの点において自己由来である。
【００２７】
ＳＴＩＣを生成する方法に関しては、γ−ＩＦＮによる刺激が決定的な工程を表すことが示されている（実施例２参照）。
【００２８】
本明細書において、語句、単球由来の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）は、上記方法の工程ｄ）で得られる細胞集団をいう。この細胞集団は、自己寛容、またリンパ球の誘発（実施例４参照）において効果のある単球から誘導される細胞に加えて、リンパ球も含み（実施例４参照）、さらに、場合によっては、たとえば顆粒球のような単核球細胞画分から誘導される細胞も含む。ＳＴＩＣ集団内の単球から誘導される細胞の量は、好ましくは全細胞数の５０〜９０％、さらに好ましくは６０〜７０％である。
【００２９】
本発明に関して、語句「全細胞の数」は、考慮中の細胞集団中の生活細胞の量をいう。この量は、染料が、光学的手段によって非生活細胞から生活細胞を区別することが可能であるから、「トリパンブルー分染法」によって測定することができる。
【００３０】
自己寛容を誘発するのに、ＳＴＩＣは、通常、体重１ｋｇ当たり１０４〜１０６個の細胞が使用され、好ましくは体重１ｋｇ当たり１０５個の細胞が使用される。ＳＴＩＣの投与は繰り返し行ってもよい。
【００３１】
本発明によるＳＴＩＣは、悪性腫瘍の形成に関し、動物実験でも培養物においても危険性がないことが証明されている。これは、本発明による細胞が誘導されるオリジナル単球細胞の性質ゆえ、他のどんな方法においても予測できなかった結果である。
【００３２】
以下で詳しく説明するように、さらに最適に自己寛容を誘発する特性を有する細胞のサブ集団も、ＳＴＩＣ中に存在する細胞の画分から単離することができ、これらは単球から誘導される。
【００３３】
γ−インターフェロンでオリジナル細胞（単球）をインビトロで培養および刺激した後、細胞のサブ集団を含むＳＴＩＣを形成する（実施例３参照）。これは、モノクローナル抗体ＧＭ−７に結合し、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって発現する。該モノクローナル抗体ＧＭ−７は、イムノグロブリンイソ型ＩｇＧ２ａの抗体であって、その軽鎖は、カッパーイソ型を発現する。オリジナル単球細胞は認識されない、すなわち、オリジナル細胞に対する抗体の結合は起こらない（実施例３参照）ため、この抗体の特徴的特性は、本発明による培養条件によって変性された単球に対し結合する緊縮な能力にある。さらに、ＧＭ−７は抹梢血液中のヒト細胞には結合しないことが２０人のボランティアによって実証された（図５参照）。
【００３４】
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５５１号明細書に記載されているように、抗体は、ヒト単球から誘導されたＴＡＩＣ（ＳＴＩＣに相当する）で、当業者に知られた方法を使用して、マウスに免疫化することによって生成された（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’’，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，１９９５）。次いで、該マウスから、抗体と骨髄腫細胞とを産生するＢ細胞の融合によってハイブリドーマ細胞株を製造した。このような細胞株の生成のために使用される方法は、現在の技術水準で公知である（Ｄａｖｉｓ，Ｗ．Ｃ．’’Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’’，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｔｏｔｏｗａ，１９９５；Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．’’Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｏｆ ｆｕｓｅｄ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ’’，Ｎａｔｕｒｅ ２５６，４９５−４９７（１９７５））。抗体ＧＭ７を産生するハイブリドーマ細胞株は、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒ ＧｍｂＨ、ブラウンシュバイク、ドイツ）でのブタペスト会議の規則に従って、登録Ｎｏ．ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２にて寄託した。
【００３５】
図１に、フローサイトメトリーによって測定した本発明によるインビトロ変性後のＧＭ−７の単球に対する結合能力を示す。単核球細胞画分から直接得たＣＤ１４陽性単球は、抗体ＧＭ−７（影の付いた灰色の部分が、影のない抗体コントロールと一致する）に結合しないことがわかる。対照的に、Ｍ−ＣＳＦの存在下で培養しγ−ＩＦＮで刺激した後、単球の一部は、モノクローナル抗体ＧＭ−７によって認められる抗原を発現する。該モノクローナル抗体ＧＭ−７は、イソ型κ−ＩｇＧ２ａとして特徴付けられる。したがって、本発明の方法は、変性された単球の細胞膜上の抗原発現の表現パターンの変化をもたらす（図１）。
【００３６】
モノクローナル抗体ＧＭ−７は、本発明による方法によって生成された細胞の中でも、最も効果のある自己寛容誘発細胞を誘発する細胞集団に特に結合する（図５参照）。
【００３７】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、そのような、つまり抗体ＧＭ−７を結合することができるＳＴＩＣに関する。これらの細胞をこれ以降ＳＴＩＣＧＭ７と言う。
【００３８】
したがって、本発明による抗体ＧＭ−７は、非常に効果的で、自己寛容を誘発する細胞（ＳＴＩＣ）を選択し精製するための薬剤の取り扱いが簡単であることを示す。該抗体を用いて、本発明により、均質で効果が非常に高いＳＴＩＣ集団を産生することが可能である。
【００３９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記本発明の方法の工程ｃ）で形成された、抗体ＧＭ−７に結合する抗原を発現する自己寛容誘発細胞は、工程ｃ）の後、その培地から直接選択してもよいし、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって生成した抗体ＧＭ−７に結合することによって、上記本発明の方法の工程ｄ）による培地からそれぞれ細胞を分離した後、得られた細胞集団から選択してもよい。
【００４０】
本発明によるＳＴＩＣを選択するには、抗体がサンプル中に存在する自己寛容誘発細胞に結合できる条件下で、抗体をサンプルに接触させる。結合反応により得られた反応複合体を、次いで、サンプルから分離する。この目的のために、サンプルとの接触の前に、抗体を担体材上で培養することができ、たとえば、クロマトグラフの目的にまたは所謂「磁気ビーズ」に適切なマトリックスに結合することができる。この手順は、体積の大きなサンプルから自己寛容誘発細胞を選択、濃縮することを可能にする。
【００４１】
自己寛容誘発細胞を得るために、抗体と自己寛容誘発細胞との間の結合は、サンプルから反応複合体を単離した後は分離される。これは、現在の技術水準で知られている方法、たとえば、競合置換または塩溶液によって洗浄することによって達成することができる。相当する方法が、たとえば、Ｕｔｚ Ｕ． ｅｔ ａｌ．によって記載されている（’’Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ−ｌ（ＨＴＬＶ−１）Ｔａｘ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ８＋ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＴＬＶ−１ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｉｓｅａｓｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ’’Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９６年２月、８４３−８５１頁）。
【００４２】
さらに、モノクローナル抗体ＧＭ−７は、インビトロで、患者の血液および／または組織サンプル中にある、本発明による単球由来の自己寛容誘発細胞の定性および定量測定を可能にする。自己寛容誘発細胞の存在を示し、該当する場合は、その量も示す、サンプル中での反応複合体の形成は、公知の方法によって検出される。
【００４３】
反応複合体を検出するには、この場合、抗体ＧＭ−７を、検出する分子、たとえば、抗体に共有結合で結合しているものに直接結合する（標識化する）ことが可能である。検出すべき適切な分子は、分子学的診断の分野に数多く記載され、なかでも、イソチオシアン酸フルオレセインやテトラメチルローダミン−５−イソチオシアネートのような蛍光染料、発光染料、放射能ラベルされた分子および酵素パーオキシダーゼが挙げられる（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．’’Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ’’，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８を検討せよ）。
【００４４】
抗体の検出は、抗体の標識化のために選択される分子に基づいて行われる。本発明については、抗体の検出がフローサイトメトリーおよび／または蛍光顕微鏡法によって行うことができるように、抗体ＧＭ−７と蛍光分子、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）とを結合した。抗体をＦＩＴＣで標識化する方法は当業者に公知である。
【００４５】
あるいは、反応複合体は二次抗体を使用した二段法で検出することもできる。この点において、標識化されていない抗体ＧＭ−７は、さらに他の標識化された抗体を含む反応複合体中で検出することができる（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．’’Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ’’，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８を検討せよ）。この二段法の検出は、数個の標識化された二次抗体が１個のＧＭ−７抗体（信号増幅）に結合できるため、本発明による抗体結合を直接検出するより、はるかに感度が高い。
【００４６】
したがって、抗体ＧＭ−７は、ＳＴＩＣで処置された患者の末梢血液中のＳＴＩＣの検出を可能にする。たとえば、「モニタリング」という形で、末梢血液中の細胞の数を特定の時間間隔で検出する。
【００４７】
当業者には明らかなように、ヒト以外の脊椎動物の単球、特に本発明によって変性された霊長類およびブタの単球からもＳＴＩＣに対するモノクローナル抗体を生成することが可能である。この点に関して、対応する宿主動物の免疫および対応するハイブリドーマ細胞株の産生は、ヒト由来のＳＴＩＣについては、上記したように行われる。
【００４８】
本発明の特に好ましい実施形態は、本発明のＳＴＩＣのサブ集団に関し、これは、細胞表面にＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原が共発現している。これらの細胞を以下、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｌ４＋と記載する。以下にさらに詳しく説明するように、これらの細胞は調節性Ｔリンパ球の形成を誘発することが示されている。
【００４９】
表面抗原ＣＤ３およびＣＤ１４を共発現するＳＴＩＣは、上記した本発明の方法の工程ｃ）において形成された自己寛容誘発細胞から直接選択してもよいし、上記本発明の方法の工程ｄ）による培地から細胞を分離した後得られる細胞集団から選択してもよいし、あるいは、ＳＴＩＣＧＭ７集団から選択してもよい。
【００５０】
さらに、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書のＴＡＩＣを参照することにより、本明細書によって生成された細胞は、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７を強く発現することが示されている（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１２に相当する実施例６を参照）。対照的に、これらの遺伝子は、オリジナル単球によっては全くあるいは少ししか発現しない。したがって、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現のアップレギュレーションは、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞に特異的である。
【００５１】
実施例６で述べるように、マーカーＦｏｘＰ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の発現は、以前は調節性Ｔリンパ球のみについて記載されていた。表面抗原ＣＤ４およびＣＤ２５を共発現するＴリンパ球は、調節性Ｔリンパ球のサブ集団であり、「抑制細胞」とも言われる。それは、体の免疫応答を抑制するそれらの機能である。特に、Ｆｏｘｐ３は特定の転写因子として見られ、調節性Ｔ細胞の発症に関し、コントロール遺伝子として働き、これらの細胞により特異的に発現する。本発明によれば、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｌ４＋細胞は、全ＲＮＡ１μｇに対し、Ｆｏｘｐ３−ＲＮＡが少なくとも１×１０−９μｇ発現するのが好ましく、より好ましくは少なくとも５×１０−９μｇ、特に好ましくは少なくとも１×１０−８μｇである。
【００５２】
ＣＴＬＡ４も同様にＴリンパ球、特にＣＤ４／ＣＤ２５陽性Ｔリンパ球の調整機能の検出のためのマーカーと見なされる（実施例６に列挙された文献を参照）。本発明によれば、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｍ４＋細胞は、好ましくは全ＲＮＡ１μｇに対し、ＣＴＬＡ４−ＲＮＡが少なくとも５×１０−７μｇ発現するのが好ましく、より好ましくは少なくとも３×１０−６μｇ、特に好ましくは少なくとも５×１０−６μｇである。
【００５３】
上皮カドヘリンを認識するインテグリンαＥβ７は、近年、Ｌｅｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．によってＰＮＡＳ ９９，１３０３１−１３０３６頁（２００２）に、非常に強力な、上皮環境と影響しあう調節性Ｔリンパ球のサブ集団に関する新しいマーカーとして記載された。本発明によれば、インテグリンαＥβ７−ＲＮＡの発現は、その量がＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞において、好ましくは全ＲＮＡ１μｇに対して、少なくとも１×１０−１２μｇ、より好ましくは少なくとも１×１０−１ｌμｇ、特に好ましくは少なくとも１×１０−１０μｇ、最も好ましくは少なくとも１×１０−９μｇである。
【００５４】
実施例６の表に示すように、本発明の細胞とリンパ球との直接的な共培養によって、遺伝子Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ４およびインテグリンαＥβ７の強くアップレギュレートされた発現を伴うリンパ球集団における調節性Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞の数が大幅に増加する。該実施例はさらに、本発明の細胞がもし間接的にリンパ球と共培養されれば、この効果は観察されないことを実証する。
【００５５】
これらの結果は、本発明の細胞による調節性Ｔリンパ球の形成および／または増殖の刺激は、これらの細胞による自己寛容の誘発が関与していることを示唆する。
【００５６】
実施例７（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／β７５５１号明細書の実施例１３に相当）によって、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書（上記参照）のＴＡＩＣを参照して、免疫応答抑制の誘発において、本発明の細胞の関与に関する仮説が確認された。この実施例においては、インビトロで、受容動物からのリンパ球を、それぞれのドナー動物からの免疫抑制細胞で培養した。寛容性を誘発するために、ＴＡＩＣ由来のドナーでプレインキュベートされた受容者からのリンパ球を、ＴＡＩＣの代わりに、動物に注射した。ドナー特異的寛容性は、この方法でも誘発することができたが、一方、ＴＡＩＣ由来ドナーで共培養されていない受容リンパ球を投与された動物は、寛容性を発症しなかった。
【００５７】
本発明のＳＴＩＣは、そのような薬学的調製物としても使用することができる。上記本発明の方法の工程ｄ）で得られる細胞は、直接使用することができる。そのようにして得られた集団の細胞の合計の約１０〜５０％が、初期単球単離物（単核球細胞画分）由来するリンパ球および顆粒球によって形成される。これらの細胞は、培養工程における単球に由来する、本発明のＳＴＩＣの生成をサポートする（実施例４参照）。これらは、本発明のＳＴＩＣが薬学的調製物として使用される場合、自己寛容の誘発を疎外しない。
【００５８】
しかし、本発明のさらに好ましい実施形態によれば、サブ集団ＳＴＩＣＧＭ７および／またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋は、本発明の方法で得られたＳＴＩＣ集団（上記参照）全体から単離して、自己寛容誘発するために使用してもよい。
【００５９】
培養培地（実施例２参照）としては、ＳＴＩＣおよび／またはＳＴＩＣＧＭ７および／またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ｃＤｌ４＋が、それらの自己寛容誘発効果を落とし始めることなく少なくとも４８時間保つ。
【００６０】
薬学的調製物の使用に関して、たとえば、ヒトＡＢ０適合血清（国際的に使用に適する）中に懸濁させたＳＴＩＣおよび／またはサブ集団ＳＴＩＣＧＭ７および／またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋を、短輸血として静注的に投与することができる。
【００６１】
本明細書において、薬学的調製物は、本発明のＳＴＩＣと、これに組み合わせて、ステロイド、特にコルチゾン、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリン、５−アミノサリチル酸（５−ＡＳＡ）、ＴＮＦ−α抗体、α−インターフェロンのような、従来の抗炎症薬および／または従来の免疫抑制剤、および、たとえばリツキサンのようなＢ細胞抗体とを、特異的な器官または全身性自己免疫疾患の治療のために含んでもよい。
【００６２】
さらに、本発明のＳＴＩＣは、抗ヒスタミン剤、テオフィリン製剤、Ｒ−ミメティック、ステロイド、特にコルチゾンおよびクロモグリシン酸と組み合わせて、アレルギーの治療のために使用してもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６３】
（発明の詳細な説明）
本発明による方法のための出発細胞は、自己由来の血液単球、すなわち、本発明の細胞を投与すべき個々の患者の血液からの単球である。該自己由来の単球はヒト血液のものが好ましい。単球は、どのような単離方法によって得てもよく、特に白血球搬出法によって、または全血（バッフィーコート）からの単核球細胞画分から得てもよい。特に、白血球搬出法が好ましい。
【００６４】
白血球搬出法は、市販のアフェレーシス装置を使用した多段階方式の一般用語であり、ヒト被験者からの全血を採取し、複数の画分に分離し、単核球細胞画分以外の画分を上記ヒト被験者に返血する方法である。この方式は、欧州特許公開第０５９１１９４ Ｂ１号公報にさらに詳しく概説するように行う。
【００６５】
あるいは、凝血防止剤を使用した通常の治療の後に、先ず、公知の方法、好ましくは遠心分離法で、血液を血漿と白血球および赤血球に分離する。遠心分離の後は、血漿が上澄み液中に存在し、その下に全体に白血球が含まれた層がある。この層はまた、バッフィーコートと呼ばれる。この下に赤血球を含む相（ヘマトクリット）がある。
【００６６】
本発明による方法に関して、単核球細胞画分は先ず単離分離して、たとえば公知の方法で遠心分離することによって単球を得る。好ましい方法実施形態によれば、単核球細胞画分をリンパ球分離培地（フィコール−ハイパーク）に塗布し、遠心分離する（実施例１参照）。実施例１は、本発明の好ましい実施形態を記載する。実施例１では、単核球細胞画分にまだ含まれている赤血球と死細胞を遠心分離によって分離し、単球を含む白血球を分離培地上に単離物として置く。その後、白相を注意深くピペットで取り、単離物中の単球を濃縮するために、繰り返し遠心分離し洗浄する。この方法で、単球はリンパ球の一部とともに遠心分離槽の底に集まる。
【００６７】
本発明の方法の特に好ましい実施形態によれば、単球を含有する単離物を得るための条件は、単離物が、単球に加えて、細胞の総数に対して約１０〜５０％のリンパ球を含むように調整されている。単離物は、総細胞数に対して、好ましくは約５０〜９０％の、特に好ましくは６０〜７０％の単球を含み、リンパ球は約１０〜５０％、特に好ましくは２０〜５０％を含み、ここでの相違は場合によっては顆粒球によって提供されうる。
【００６８】
実施例４に示すように、ＭＣＳＦおよびγインターフェロンでオリジナル単球を培養している間、総細胞数の２０〜３０％の量のリンパ球が存在すると、リンパ球（約５％）がほとんど存在しない場合（図３参照）のように、ＣＤ３／ＣＤ１４−ダブル陽性ＳＴＩＣの量が非常に多く産生する。
【００６９】
ＳＴＩＣを充分な量を生成するためには、先ず、単球の増殖を可能にする必要がある。この目的のため、単球に適した公知の増殖培地を使用することができる。しかし、該培地は、増殖因子Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージコロニー刺激因子）を含まなければならない。Ｍ−ＣＳＦ（ＣＳＦ−１とも呼ばれる）は、単球、線維芽細胞、リンパ球および内皮細胞によって生成される。培地中のＭ−ＣＳＦの濃度は、２〜２０μｇ／Ｌ培地が好ましく、さらに好ましく４〜６μｇ／Ｌ培地、特に好ましくは５μｇ／Ｌ培地である。
【００７０】
ＳＴＩＣの収量は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の存在によって減少するため、増殖培地はこの因子を含まないことが好ましい。
【００７１】
次いであるいは同時に、細胞はγ−ＩＦＮで刺激されなければならない。すなわち、細胞はγ−ＩＦＮの存在下で培養されなければならない。γ−ＩＦＮによる単球の刺激は、増殖因子を含む培地において３〜６日を費やす初期増殖段階の後に行う。好ましくは、Ｍ−ＣＳＦの存在下での培養の始まりから４日目にＹ−ＩＦＮ刺激を始め、この刺激はインキュベータ条件下、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気中で、好ましくは２４〜７２時間、さらに好ましくは４８時間続ける。
【００７２】
培地中のγ−ＩＦＮの濃度は、０．１〜２０ｎｇ／ｍＬであり、１〜１０ｎｇ／ｍＬが好ましく、５ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
【００７３】
γ−ＩＦＮによる刺激は、増殖因子を含む培地中の単球の増殖と同時に始めてもよい。しかし、上述したように、３〜６日の初期増殖段階後の刺激が好ましい。概して、γ−ＩＦＮによる細胞増殖および刺激は、８日を超えない期間で行うのが好ましい。いずれにしても、γ−ＩＦＮによる治療は、増殖段階の後、少なくとも２４時間で最高７２時間、好ましくは４８時間で行うべきである。したがって、細胞の増殖および刺激の時間は、合計で４〜８日間費やすのが好ましい。
【００７４】
本発明の好ましい実施形態によれば、γ−インターフェロンによる増殖および刺激は、実施例２で示したように行われる。すなわち、単球を先ず増殖因子を含む培地中で増殖し、３〜６日後に０．１〜２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは５ｎｇ／ｍＬの濃度が培地中で得られるような量のγ−ＩＦＮを培地に加える。
【００７５】
本発明による方法は、表面があらかじめウシ胎児血清（ＦＣＳ）、あるいは好ましくはヒトＡＢ０適合血清（実施例２参照）で塗布された培養槽中で行われるのが好ましい。ＦＣＳの塗布は、使用の前にＦＣＳで培養槽の表面を被覆し、数時間、特に４〜７２時間、好ましくは１２〜４８時間、特に２４時間の相互作用の時間の後、適切な方法で表面に付着していないＦＣＳを取り除くことによって行うことができる。ヒトＡＢ０適合血清での塗布も、上記した方法と同じようにして行う。
【００７６】
培養ステップの間に、細胞は約２４時間後培養容器の底に沈殿する。接着特性のため、単球および該プロセス中に該単球に誘導されたＳＴＩＣは、それぞれの培養槽の底に付着する。実施例２に記載するように、培養中に培地は変化し、最初に上澄み液を、たとえば、ピペットであるいはデカントして注意深く取り除き、続けて新しい培地を充填する。しかし、底に付着する細胞は洗浄しないか、あるいは注意深く洗浄して、存在するどんなリンパ球も取り除かないようにするのが好ましい。
【００７７】
付着する細胞を取り除くには、機械的に、たとえば、微細細胞スクレーパーまたはスパチュラを使用して行うことができる。
【００７８】
しかし、本発明による方法の好ましい実施形態によれば、細胞の完全な除去は、適切な酵素、たとえば、トリプシン（実施例２参照）による治療によって行われる。トリプシン溶液（０．１〜０．０２５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５ｇ／Ｌ）は、２〜１０分間、３５℃〜３９℃、好ましくは３７℃で、５％ＣＯ２の存在下で細胞に作用することができる。
【００７９】
次いで、酵素活性は、通常の方法でブロックされ、今や自由に浮遊するＳＴＩＣを遠心分離することによって通常の方法で得ることができる。次いで、これらはすぐに利用することもでき、場合によっては、たとえばＰＢＳのような適切な培地中の懸濁物として利用することもできる。また、これらは数日、特に２、３日程度栄養培地中に保存することもでき（実施例２参照）、この保存培地は、増殖因子もγ−ＩＦＮも含むべきではない。細胞は、そのような栄養培地中でＳＴＩＣとして少なくとも４８時間保存することができる。
【００８０】
より長い時間保存するために、細胞を冷凍することができる。生存細胞の冷凍のプロトコルは、現在の技術水準で知られているＧｒｉｆｆｉｔｈ Ｍ．ｅｔ ａｌ．を比較せよ。（’’Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｃｏｒｎｅａ’’，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｔａｌａ Ａ．ａｎｄ Ｌａｎｚａ Ｒ．Ｐ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００２，第４章，１３１〜１４０頁））。本発明による細胞の冷凍に好ましい懸濁培地は、ＡＢ０適合血清またはＦＣＳであって両方ともＤＭＳＯが加えられている。
【００８１】
本発明の実施形態の一つによれば、ステップｃ）またはｄ）で得られる、自己寛容誘発細胞を含む細胞懸濁物は、ＳＴＩＣＧＭ７サブ集団として得るように、抗体ＧＭ−７に結合する細胞をさらに精製してもよい。このように精製する方法は上記に詳しく記載している。
【００８２】
本発明のさらに好ましい実施形態によれば、そのような細胞は細胞表面にＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原を共発現するＳＴＩＣ集団から選択される。そのような細胞を選択する方法は、業界で知られている。そのような方法の例示として、「蛍光活性細胞分離法」（ＦＡＣＳ）、「免疫磁気ビーズ分離法」および「磁気細胞分離」（ＭＡＣＳ）、あるいは所謂「ロゼッティング法」［Ｇｍｅｌｉｇ−Ｍｅｙｌｉｎｇ Ｆ．ｅｔ ａｌ．’’Ｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｔ− ａｎｄ ｎｏｎ−Ｔ−ｃｅｌｌｓ”，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．３３，５−８（１９７７）参照］が挙げられる。
【００８３】
ＳＴＩＣサブ集団ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋の選択は、上記本発明の方法の工程ｃ）またはｄ）で得られたＳＴＩＣ集団から、またはＳＴＩＣＧＭ７サブ集団から直接行うことができる。後者の方法は、結果的に、ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋が段階的に高濃度化していく。
【００８４】
本発明の好ましい実施形態においては、本発明によるＳＴＩＣＣＤ３＋／ｃＤｌ４＋サブ集団の細胞それ自体が、自己免疫疾患のインビボ予防および／または治療のための薬学的組成物の製造のために使用される。
【００８５】
そのような自己免疫疾患の例としては、以下のものがある：
自己免疫性特徴を伴うリウマチ性疾患、特にリウマチ性関節炎、ＳＬＥ、シューグレン病、皮膚硬化症、皮膚筋炎、多発作筋炎、ライター症候群；
糖尿病；
血液および血管の自己免疫疾患、特に自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、抗リン脂質抗体症候群、血管炎（結節性多発性動脈炎、ウェゲナー肉芽腫症、過敏性血管炎、巨細胞性動脈炎）、全身性紅斑性狼瘡、混合型クリオグロブリン血症；
肝臓の自己免疫疾患、特に自己免疫肝炎、原発性胆汁性肝硬変、および原発性硬化性胆管炎；
甲状腺の自己免疫疾患、特に橋本病、バセドウ病；
中枢神経系の自己免疫疾患、特に多発性硬化症、無症筋無力症；
水疱性皮膚疾患、特に尋常性天疱瘡、増殖性天疱瘡、落葉状天疱瘡、セニアー−アッシャー症候群および落葉性ブラジル天疱瘡。
【００８６】
自己寛容を誘発するＳＴＩＣの有用性は、人為的に誘発された、自己免疫疾患に類似する大腸炎の２つのモデルシステムにおけるマウスによって示される（実施例８および９参照）。
【００８７】
これらのモデルは、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）−誘発慢性大腸炎（実施例８）およびマウスにおける実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデル（実施例９）である。どちらのモデルマウスも、潰瘍性ヒト大腸炎に類似した症状を伴う慢性大腸炎を発症する。
【００８８】
どちらのモデルシステムにおいても、症状が発症してすぐにＳＴＩＣを投与すると、処置していない動物、あるいはＳＴＩＣを含まない「コントロール細胞」で処置した動物に比べ、大腸炎の典型的な症状が抑制される（実施例８および９参照）。
【００８９】
上記したように、過剰の免疫反応はまたアレルギーの発症に関与する。サブ集団としてＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞を含むＣＤ４＋細胞は、実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の進行を緩和することができることがＢａｃｈ ｅｔ ａｌ．（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）によって示されている。本明細書で示すように、ＳＴＩＣの投与はＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞集団の増加を誘導する結果になるため、該細胞はまた、アレルギーの治療のためにも有用である。
【００９０】
したがって、本発明のさらに好ましい実施形態によれば、医薬品を含むＳＴＩＣは、アレルギーの予防および／または治療のためにも使用される。
【００９１】
薬学的調製物は、本発明の方法のステップｄ）で得られた本発明による生活ＳＴＩＣを、医薬的に許容しうる担体中に懸濁させて、好ましくは約１×１０５〜１×１０７個の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約１×１０６の細胞／ｍＬの量で含んでもよい。
【００９２】
本発明のさらに好ましい実施形態においては、本発明によるＳＴＩＣＧＭ７サブ集団細胞は、それ自身、自己寛容障害を伴う疾患のインビボ予防および／または治療のための薬学的組成物の製造のために使用される。
【００９３】
本発明の実施形態の一つでは、そのような薬学的調製物として、抗体ＧＭ−７に結合した本発明の生活ＳＴＩＣＧＭ７を、薬理学上許容しうる液体担体に懸濁させて、好ましくは約１×１０６〜１×１０８個の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約１×１０６個の細胞／ｍＬの量で含んでもよい。
【００９４】
本発明の最も好ましい実施形態では、そのような薬学的調製物として、ＣＤ３抗原とＣＤ１４抗原を共発現する、本発明による生活ＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞を、好ましくは約５×１０５〜５×１０７個の細胞／ｍＬ、さらに好ましくは約５×１０６個の細胞／ｍＬの量で含んでもよい。
【００９５】
上記薬学的調製物は、生理学的に優れた認容性が認められる培地中に懸濁された本発明による細胞を含んでもよい。適切な培地として、たとえば、リンゲル液、生理食塩水または５〜２０％ヒトアルブミン溶液などが挙げられる。
【００９６】
本発明によるＳＴＩＣを含む薬学的組成物は、それぞれの疾患に感染されている身体部位に応じて、種々の投与の経路を経て投与されてもよい。本発明の好ましい実施形態では、該薬学的組成物を静注的に、門脈内に、皮下的に、皮内に、腹腔内に、あるいは鞘内に投与することができる。薬学的組成物はさらに、肝臓や筋肉などの特定の器官に直接投与することも、吸入を通じてあるいは腹腔深部に投与することもできる。
【００９７】
活性成分としてＳＴＩＣを含む薬学的調製物は、疾患の発症に反応しうる遺伝子が知られている場合にも、自己免疫疾患の予防のためにも使用できる。もし個体が１以上の自己免疫疾患を伴う遺伝子のキャリアとして診断された場合、初期発育段階で、自己由来の単球のＳＴＩＣを投与することで疾患の発生を防止することができる。本発明の好ましい実施形態では、自己由来のＳＴＩＣを、自己由来のリンパ球およびそれぞれの遺伝子によって発現されたペプチドとともに培養する。これは、個々の遺伝子生成物に特有の自己由来の調節性Ｔリンパ球を発症する。次いで、これらの調節性Ｔリンパ球は、以下に記載する実施例７（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１３に対応）におけるように各個体に再度投与することができる。
【００９８】
本発明のさらなる実施形態では、ＳＴＩＣは自己免疫疾患、たとえば、リウマチ性関節炎が合間に起こる場合の予防のために使用することができる。最初のあるいは後続の疾患の発生の後、もしＳＴＩＣを含む薬学的調製物が投与されると、さらなる発生を防ぐことができる。
【００９９】
本発明による細胞の調製物は、本発明の方法のステップｄ）で得られる生活ＳＴＩＣを含んでもよい。あるいは、該調製物は、抗体ＧＭ−７に結合するＳＴＩＣＧＭ７細胞、または細胞表面にＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原を共発現するＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤｌ４＋細胞のサブ集団に属する細胞を含んでもよい。該調製物は、液体担体培地に個々の懸濁された細胞を好ましくは少なくとも１×１０５個／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも５×１０５個／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１×１０６個／ｍＬの量含んでもよい。培地は、５〜２０％ヒトアルブミン溶液のような、細胞によって優れた認容性が認められる、細胞培養または輸送培地であってよい。あるいは、調製物中の細胞は、冷凍され、５０％ヒトアルブミン溶液および１０％ＤＭＳＯを含むＲＰＭＩのような、適切な保存培地中に含まれてもよい。
【０１００】
最後に、本発明はまた、本発明の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ、ＳＴＩＣＧＭ７またはＳＴＩＣＣＤ３＋／ＣＤ１４＋）を、インビトロで自己由来の調節性Ｔリンパ球を産生または増やすために使用する方法に関する。実施例６（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１２に対応する）に示すように、リンパ球を有するＳＴＩＣに対応するＴＡＩＣの直接インビトロ共存培養によって、調節性Ｔリンパ球の、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球が著しく増殖される。したがって、自己由来のリンパ球を持つ個体の単球由来のＳＴＩＣを直接共培養することによって、自己由来の調節性Ｔリンパ球、特にＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球を産生および／または増やすことが可能になる。
【０１０１】
直接インビトロ培養手段とは、本発明によれば、ＳＴＩＣとリンパ球とを、上記したように実施例６に例示する培地と同じ培地中で、直接物理的接触で共培養することを言う。
【０１０２】
この方法では、培地は、各細胞すなわちＳＴＩＣおよびリンパ球をほぼ同じ細胞数で、それぞれ液体担体培地に懸濁されて、好ましくは少なくとも１×１０５個／ｍＬ、さらに好ましくは少なくとも５×１０５個／ｍＬ、最も好ましくは少なくとも１×１０６個／ｍＬの量の細胞を含むのが好ましく、培地は、５〜２０％ヒトアルブミン溶液のような細胞によって優れた認容性が認められる細胞培養または輸送培地であってもよい。共培養は、好ましくは、約３７℃のたとえばインキュベータ内で、好ましくは約３〜５日間、さらに好ましくは４日間という生理学的条件下で行われるべきである。
【０１０３】
実施例７（国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書の実施例１３に対応する）では、移植受容が、ドナー単球から産生されたＴＡＩＣを受容者に投与することによって誘発されるばかりでなく、受容者リンパ球を受容者に再度投与する、これはあらかじめ、上記したように、ドナー単球から生成されたＴＡＩＣとともにインビトロで直接共培養した、ことによっても誘発されることが示された。同様に、自己寛容は、自己由来のリンパ球を患者に再度投与する、これはあらかじめ患者自身の単球から生成したＳＴＩＣとともに直接共培養した、ことによっても誘発することができる。
【０１０４】
本発明のさらなる実施形態によれば、その結果、調節性Ｔリンパ球は、この個体からのリンパ球をこの個体の単球に由来するＳＴＩＣとともに直接共培養することによって、治療すべき個体に由来するリンパ球からインビトロで生成することができる。共培養されたリンパ球の受容者への再投与は、実施例７に示されるように、自己寛容を誘発する。
【０１０５】
そのように生成された調節性Ｔリンパ球は、本明細書に記載したように（上記を参照）ＦＡＣＳによって単離してもよいし、細胞が上記薬理学上許容しうる担体中に懸濁している、自己寛容障害を伴う疾患を予防および／または治療用の薬学的調製物において使用してもよい。
【実施例】
【０１０６】
本発明を、実施例を用いてさらに詳しく説明する。
【０１０７】
もし実施例中に定義がなければ、使用した培地および物質の組成は以下の通りである。
【０１０８】
（１．ペニシリン／ストレプトマイシン溶液）
ペニシリンＧのナトリウム塩として１０，０００単位のペニシリンとストレプトマイシン硫酸塩として１０００μｇのストレプトマイシン／１ｍＬの生理食塩水（ＮａＣｌ ０．８５％）（Ｇｉｂｃｏ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ．１５１４０１２２）
（２．トリプシン−ＥＤＴＡ）
０．５ｇのトリプシンと０．２ｇのＥＤＴＡ（４ Ｎａ）／Ｌ
（３．Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０（１×，液体（１１８７５）））
ＲＰＭＩ（Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）培地１６４０は、濃縮配合組成であり、哺乳動物細胞に広範に使用することができる。
【０１０９】
【表１】
参考文献：Ｍｏｏｒｅ Ｇ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａ．Ｍ．Ａ．１９９：５１９（１９６７）
（４．ＰＢＳ（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．９８：１６７（１９５４）参照）
【０１１０】
【表２】
（５．フィコール−ハイパーク）
リンパ球分離培地（ショ糖／エピクロロヒドリン共重合体、Ｍｇ４００，０００、密度１．０７７、ジアトリゾ酸ナトリウムで調整）
（６．Ｌ−グルタミン）
液体：２９．２ｍｇ／ｍＬ
（７．マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ））
大腸菌からの組み替えヒトＭ−ＣＳＦ；モノマー（１８．５ｋＤ）として１３５個のＮ末端メチオニン含有アミノ酸残基を含み、３７ｋＤのモル質量をもつホモ二量体として存在する（ＳＩＧＭＡ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｏ．Ｍ６５１８）。
【０１１１】
（８．γ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ））
大腸菌からの組み換えヒトγ−ＩＦＮ；１６．７ｋＤタンパク質を含有する１４３個のアミノ酸残基（ＣＨＥＭＩＣＯＮ ＣａｔａｌｏｇｕｅＮｏ．ＩＦ００２）
（９．デキストラン硫酸ナトリウム）
シグマ−アルドリッチ３１４０３、塩、ＭＷ４０ｋＤ
（実施例１）
（全血からの単球の分離）
全血を２つの相違する方法によってヒト患者から得た。
【０１１２】
ａ）白血球搬出法：白血球搬出法を、ＣＯＢＥ(R)スペクトラＴＭ血液成分分離装置（Ｇａｍｂｒｏ ＢＣＴ、レークウッド、コロラド州、ＵＳＡ）を使用し、単球モード（ＭＮＺ）で、製造業者の指示（ＣＯＢＥスペクトラバージョン４．７／５．１／６．０／７．０）に従って行った。
【０１１３】
ｂ）従来の血液成分分離法：４５０ｍＬの全血を、血液の凝固を避け細胞を仕込むために、１リットルの水に対して３．２７ｇのクエン酸、２６．３ｇのクエン酸三ナトリウム、２５．５ｇのデキストロースおよび２２．２２ｇのナトリウムジヒドロキシリン酸塩を含む安定剤６３ｍＬが入ったトリプルチェンバーバッグ中で混合した。溶液のｐＨは５．６〜５．８であった。
【０１１４】
次いで、血液の成分を分離するために、この混合物の「シャープな遠心分離」を、２０℃、４０００ｒｐｍで７分行った。これによって、３層内に血球成分と非血球成分の層状物を得た。次いで、この目的のために提供された圧縮機の中に置かれたバッグを使用して、赤血球を下側バッグに、血漿を上側バッグにしぼり出し、中間のバッグに約５０ｍＬの体積の所謂バッフィーコートを残した。
【０１１５】
次いで、両方法から、新しく得た単核球細胞画分５０ｍＬを、それぞれ２５ｍＬの２部分に分け、それぞれ、あらかじめ２本の５０ｍＬファルコンチューブにつながるフィコール−ハイパーク分離培地２５ｍＬ上に積層した。
【０１１６】
この調製物を制動なしで３０分間、２５００ｒｐｍで遠心分離した。その後、単核球細胞画分にまだ存在したどのような赤血球および死細胞をフィコール相の下にし、そうすることで単球を含む白血球をフィコール層上に分離した。白色の中間相として分離した。
【０１１７】
次いで、単球を含む該白色中間相をピペットで注意深く取り除き、１０ｍＬのリン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）と混合した。
【０１１８】
次いで、この調製物を制動ありで３回、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、各遠心分離操作と新しいＰＢＳの導入の後に、上澄み液をピペットで取り除いた。
【０１１９】
遠心分離容器（ファルコンチューブ）の底に集まった細胞ペレットは、単核球細胞画分、すなわち単球を含んでいた。
【０１２０】
ｃ）マウス実験８および９（遺伝的に同一性のあるマウスで行った）用に必要な単球を、同系のドナーマウスの脾臓から得た。脾臓を、多少圧力をかけた状態で細目ふるいを通過させ、このようにして分離した細胞をＰＢＳ中に再び懸濁した。懸濁した脾臓細胞を、あらかじめ５０ｍＬファルコンチューブにつないだフィコール−ハイパーク分離培地２５ｍＬ上に積層した。次いで、上記と同様の方法で手順を続けた。
【０１２１】
（実施例２）
（単球の増殖および変性）
単球の培養および増殖を下記の組成を持つ栄養培地上で行った。
【０１２２】
【表３】
栄養培地は、２．５μｇ／５００ｍＬＭ−ＣＳＦを含んでいた。
【０１２３】
実施例１で単離された単球を合計量で１０６個、１０ｍＬの栄養培地中に懸濁し、ペトリ皿（直径１００ｍｍ）に移した。該ペトリ皿は、あらかじめ純正な培養ＦＣＳで満たし、ＦＣＳで被覆された皿を得るために、このように、該ＦＣＳを２４時間後に流し出した。
【０１２４】
ペトリ皿を適切なカバーで被覆し、３７℃で３日間、インキュベータ内で保存した。２４時間後、ペトリ皿の底に細胞が沈殿した。２日目、上澄み液をピペットで取り出し、ペトリ皿を再び１０ｍＬの新しい栄養培地で満たした。
【０１２５】
４日目、１０ｍＬの栄養培地中の５０ｎｇのγ−インターフェロンを加え、皿を再び密閉し、さらに３７℃で４８時間、インキュベータ内で保存した。
【０１２６】
続いて、１０ｍＬのトリプシン溶液をＰＢＳでそれぞれ希釈（１：１０）し、ペトリ皿にピペットで移した。密閉したペトリ皿を３７℃で１０分間、インキュベータ内に保存した。
【０１２７】
その後、ペトリ皿の底に付着する細胞を、細胞スクレーパーを使用して、細胞の大部分（＞９０％）を上澄み液に浮遊させることによって分離した。
【０１２８】
全上澄み液（１０ｍＬのトリプシン溶液＋１０ｍＬの培地）をピペットで取り出し、５０ｍＬのファルコンチューブ中で合わせ、１８００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。次いで、上澄み液を捨て、新しい栄養培地（上記参照）を沈殿物（残存細胞ペレット）に加え、栄養を１０６個の細胞に対して１ｍＬ加えた。正確な投与量を測定するための細胞数の測定を、公知の方法に従って行った（Ｈａｙ Ｒ．Ｊ．，’’Ｃｅｌｌ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ’’，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００２，第４章、５５−８４頁を検討せよ）。
【０１２９】
この細胞懸濁物を遠心分離し（１８００ｒｐｍ、１０分、上記参照）、細胞ペレットをＰＢＳあるいはヒトへ適用するためＮａＣｌ（生理学の）へ導入した。続けて、直接あるいは４８時間以内に静脈内投与できる。
【０１３０】
あるいは、遠心分離し、トリプシンを含む上澄み液を捨てた後、ＦＣＳ／ＤＭＳＯを寒剤として細胞に加え、これらの体積１０ｍＬを冷凍した。
【０１３１】
寒剤は、９５％のＦＣＳと５％のＤＭＳＯとを含んでいた。それぞれのケースで、約１０６個の細胞を１ｍＬの寒剤に導入し、下記のステップで冷やした：
氷上で３０分；
予冷スチロポールボックス中で２時間、−２０℃；
スチロポール中、２４時間、−８０℃；
液体窒素（Ｎ２）中の小さなチューブ中に保存、−１８０℃；
図１は、オリジナル単球細胞の培養およびγ−ＩＦＮ刺激の後に使用された単球上のフローサイトメトリーによる抗原発現の表現型変化を示す。オリジナル単球細胞の培養およびγ−ＩＦＮ刺激によって、変性前の細胞（図１の左側のグラフ）に比べると、変性後（図１の右側のグラフ）はＧＭ−７の結合が大幅に増大した。
【０１３２】
以下の実施例３〜７は、国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書から取る。これらは、そこで開示されている移植許容誘発細胞（ＴＡＩＣ）の特性を示す。国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書のＴＡＩＣと本発明の自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）（上記参照）との類似性のため、これらの実施例で報告されている結果は、ＳＴＩＣにも適用する。
【０１３３】
さらに詳しくは、実施例３〜７の結果を以下に示す：
最適な抑制機能を持つ細胞集団は、モノクローナル抗体ＧＭ−７の利用可能性を通して、オリジナル単球のＭ−ＣＳＦによる培養とγ−ＩＦＮ刺激の後に得られるＴＡＩＣ集団単離することができる（実施例３）；
単球画分中に存在するリンパ球は、ＴＡＩＣとして効果的なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の産生に大きな影響を有する（実施例４）；
ＩＤＯ−阻害剤である１−メチルトリプトファンは、ＴＡＩＣの抑制機能には影響しない（実施例５）；
ドナーＢのリンパ球とともにドナーＡのＴＡＩＣを直接インビトロ共培養すると、調節性Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の形成を誘発する（実施例６）；そして
インビボでのドナーＴＡＩＣと受容者リンパ球との間の物理的な細胞間相互作用は、臓器移植拒絶を防止しうる調節性Ｔ細胞の産生を誘発する（実施例７）。
【０１３４】
（実施例３）
（抗体ＧＭ−７のＴＡＩＣへの結合）
国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ０３／０７５５１号明細書に記載されたように生成したヒトＴＡＩＣでマウスを免疫化することによって、モノクローナル抗体ＧＭ−７を産生した。抗体を生み出すハイブリドーマ細胞を、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ」に登録Ｎｏ．ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２で寄託した。以下に報告するレポートにおいて、該抗体が、本発明に従ってＭ−ＣＳＦで実験室内変性を６日間行いγ−ＩＦＮ刺激を２日間行ったＣＤ１４＋細胞上でのみ発現する抗原に特異的に結合することを実証した。
【０１３５】
図１は、インビトロ変性後に、すなわちＴＡＩＣへの形質転換の後に、単球細胞へのＧＭ−７のフローサイトメトリーによって測定した結合能力を示す。バッフィーコートから直接得たＣＤ１４−陽性単球は、抗体ＧＭ−７（左側の図、灰色の影の付いた部分が抗体コントロールに対応する）に結合しないことがわかる。対照的に、単球の一部は、Ｍ−ＣＳＦ中での培養とγ−ＩＦＮによる刺激の後に抗原を発現する。これは、抗原がモノクローナル抗体ＧＭ−７によって認識されていることである。実施例２に記載したように、培養の後、約８０％の形質転換された単球は、モノクローナル抗体ＧＭ−７（右側の図）に結合することができる。
【０１３６】
更なる実験において、ＣＤ１４＋／ＧＭ−７＋細胞の抑制活性を、混合リンパ球培地（ＭＬＣ）中のＣＤ１４＋／ＧＭ−７−細胞の抑制活性と比較した。ＭＬＣは、Ｋｕｒｎｉｃｋ，Ｊ．Ｔ．’’Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｓｓａｙｓ’’ｉｎ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，［Ｃｏｌｖｉｎ Ｒ．Ｂ．，Ｂｈａｎ Ａ．Ｋ．，ＭｃＣｌｕｓｋｅｙ，Ｒ．Ｕ．（ｅｄ．），Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，ニューヨーク，７５１−７７１頁（１９９４）］に記載されているように行った。
【０１３７】
この実施例において、ＴＡＩＣは、個体Ｂに起因する。図２に示すように、ＧＭ−７陽性ＴＡＩＣとＧＭ−７陰性ＴＡＩＣとの間には抑制活性に大きな相違がある。６日間のＭ−ＣＳＦによる治療と２日間のγ−ＩＦＮによる刺激後に得られたＧＭ−７陽性画分ＴＡＩＣ集団だけが、Ｂの細胞による刺激の後に、個体Ａのキラー細胞のＴ−細胞増殖活性に関して重大な抑制効果を発現する。
【０１３８】
（実施例４）
（単球培養中のＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞形成におけるリンパ球の影響）
ＴＡＩＣとして効果的なＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の産生における単球画分中に存在するリンパ球の影響を、２つの相違するセットアップを比較することによって測定した。
【０１３９】
第一セットアップ（以下「Ｍｏ」と言う）として、先ず単球画分を実施例１に記載したバッフィーコートの界面相から採取した。次いで、実施例２に記載したように、細胞をＭ−ＣＳＦとの培養ステップに移した。培養の出発点から１時間以内に、組織培養フラスコの底に付着している単球を、それぞれ１０ｍＬのＰＢＳで５回洗浄し、培養物中に存在するリンパ球の量を＜５％（４．８±２．４％）に減らし、一方、そのようにして得た濃縮単球（ＣＤ１４＋）の量は、９０％（９２±５．６％）を超えていた。このセットアップ内の追加の細胞成分は、Ｂ−リンパ球と顆粒球であった。
【０１４０】
第２セットアップ（以下、「Ｍｏ＋Ｌｙ」と言う）中の細胞も実施例１に記載の単球画分のバッフィーコートの界面相から採取した。しかし、セットアップ「Ｍｏ」とは異なり、組織培養フラスコの底に付着した細胞は、実施例２に記載するように、培養段階の始まりから２４時間後に１回だけ洗浄した。その結果、４５±５．３％のＣＤ１４＋単球と２３．５±８．９％ＣＤ２＋リンパ球からなる細胞集団が得られた。セットアップ「Ｍｏ」のように、リンパ球と顆粒球とがこのセットアップにも存在した。
【０１４１】
セットアップ毎の全細胞集団中のそれぞれの細胞タイプの量の測定を、それぞれ３つの実験セットアップのフローサイトメトリーによって行った（図３参照）。結果を標準偏差を含む平均値として報告する。
【０１４２】
ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞は、セットアップ「Ｍｏ」においてもセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」においても培養の始め（ｄ０＝０日目）には測定することはできない。５日間の培養期間の後に、実験を終了し、細胞を、実施例２に記載するように、組織培養フラスコの底から細胞を取り外した後、ＦＡＣＳ分析によって特徴付けた。ＣＤ１４＋細胞の相対量は、これらのセットアップにおいて、セットアップ「Ｍｏ」で９２％から４２％に、セットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」で４５％から２８％に減少することが認められた。一見したところ、リンパ球は単球より速く増殖しているが、リンパ球の相対量は、セットアップ「Ｍｏ」で４．８％から６９．８％に、セットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」で２３．５％から５０．６％に増加した。培養中、ＴＡＩＣとして効果のあるＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞は、両培養物中に形成される。この点で、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞において、セットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」で３２．０±５．３％の有意に高い増加が観察され、これとは対照的にセットアップ「Ｍｏ」では７．２±３．２％だけであることは重要である。
【０１４３】
これらの結果は、培養の始めに相対量に対する単球の濃縮が９０％を超えるような細胞の精製は、ＴＡＩＣ集団における免疫抑制性ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の産生に悪影響を及ぼし、一方、実施例１および２に記載の方法は、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の有意に高い収量をもたらすことを実証する。
【０１４４】
（実施例５）
（ＴＡＩＣの免疫抑制活性におけるＩＤＯ阻害剤、１−メチル−トリプトファンの影響の測定）
酵素インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）の阻害剤が「Ｍｏ」および「Ｍｏ＋Ｌｙ」セットアップ（実施例４参照）において産生したＴＡＩＣの抑制機能に影響を及ぼすかどうかを明確にするために、１−ＭＴの存在下あるいは非存在下でＰＨＡ（赤血球凝集物質）刺激Ｔ細胞を加えた種々の混合リンパ球培養物（ＭＬＣ）を造った。
【０１４５】
これらの混合リンパ球培養物において、５０，０００個のリンパ球と２μｇのＰＨＡを９６ウェルプレートのウェルに移し、次いで増殖を１４４時間行った（「ＰｈａＬｙ」と言う）。ＰＨＡを添加せず、リンパ球だけを培地で培養したものだけをさらなるコントロールとして造った（「Ｌｙ」と言う）。
【０１４６】
相違する共培養におけるＰＨＡ−刺激リンパ球の増殖を測定するために、以下の４つのセットアップを造り、試験した：
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」
ＰＨＡ刺激リンパ球とＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの１０５個の細胞］；
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」＋１−ＭＴ
ＰＨＡ刺激リンパ球と２μモルの１−ＭＴ存在下でのＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの１０５個の細胞］；
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」
ＰＨＡ刺激リンパ球とＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ」からの１０５個の細胞］；
ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」＋１−ＭＴ
ＰＨＡ刺激リンパ球と２μモルの１−ＭＴ存在下でのＴＡＩＣ［実施例４によるセットアップ「Ｍｏ」からの１０５個の細胞］。
【０１４７】
１４４時間の培養の後、全てのコントロールまたは共培養物を、さらに３［Ｈ］−チミジン（「パルス状」）の存在下、２４時間培養し、その後、導入された、放射性標識したチミジンの量をカウント／分（ｃｐｍ）として測定した。図４参照。この処理で測定された放射能の量は、ＤＮＡへ導入された標識化チミジンの量として測定され、したがって、リンパ球の増殖率として測定される。図４で報告されている値は、３つの実験の３組の測定からの平均値であり、それぞれ、標準偏差の適用もある。
【０１４８】
結果は、ＰＨＡで刺激されないリンパ球（「Ｌｙ」）は、有意に増殖せず、観察された平均放射能は、３６７ｃｐｍと実証した（図４参照）。これに対し、２μｇのＰＨＡで刺激した場合、リンパ球（「ＰｈａＬｙ」）の増殖率が有意に増加し、これらのサンプルの中で最も高い導入、すなわち平均値１８４５９ｃｐｍが測定された。
【０１４９】
リンパ球培養物へのＴＡＩＣ添加は、実施例４によるセットアップ「Ｍｏ＋Ｌｙ」からの細胞が加えられた場合（ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ＋Ｌｙ」、１４９８ｃｐｍの値を測定）は、明らかに増殖率を強く減少させ、実施例４によるセットアップ「Ｍｏ」からの細胞を加えた場合（ＰｈａＬｙ＋「Ｍｏ」、３３６９ｃｐｍの値を測定）は、増加は減少気味であった。
【０１５０】
２μモルの１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）を、「Ｍｏ＋Ｌｙ」および「Ｍｏ」に刺激リンパ球を含むセットアップに加えた後に得られた結果は、１−メチルトリプトファン（１−ＭＴ）は、ＴＡＩＣの抑制機能を相乗的に増加させ、それによって、セットアップ’’Ｍｏ＋Ｌｙ’’からのＴＡＩＣの減少（２６７ｃｐｍの値を測定）は、セットアップ「Ｍｏ」からのＴＡＩＣの減少（３９０ｃｐｍの値を測定）より強いことを実証した。
【０１５１】
（実施例６）
（調節性Ｔ細胞を産生するための同種異系のリンパ球とのヒトＴＡＩＣインビトロ共培養）
受容者においてＴＡＩＣが調節性Ｔ細胞、すなわちＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の生成を誘発するかどうか調べるために、ＴＡＩＣとリンパ球との数種の相違するインビトロ培養物を造り、そこから得られる調節性Ｔ細胞の生成について分析した。
【０１５２】
この目的のため、インビトロでドナーＡのＴＡＩＣを、直接あるいは間接的にドナーＢのリンパ球とともに共培養した。直接共培養においては、（ドナーＡの）ＴＡＩＣと（ドナーＢの）リンパ球との間の直接細胞−細胞接合が可能であった。一方、間接共培養では、膜（「細胞培養挿入片」、孔径０．４μｍ、ファルコン、注文番号３５３０９０）が培地の交換を可能にしたが、２つの細胞集団の物理的な接触は抑制された。直接または間接共培養は、好ましくは３〜５日間、さらに好ましくは４日間、インキュベータ条件下、すなわち、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で行う。
【０１５３】
培養後、調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋）のそれぞれの数を、ＴＡＩＣまたはリンパ球がそれぞれ単独で培養されている両セットアップおよびコントロールにおいて測定した。さらに、混合リンパ球培養物中で最も有意な抑制機能を持つＴＡＩＣ細胞集団の成分を代表するＣＤ３＋／ＣＤ１４＋細胞の数を、ＴＡＩＣのみが培養されたコントロールセットアップ中で測定した。
【０１５４】
全セットアップにおいて、ＦＡＣＳ分析ごとに細胞の表面抗原を測定し、細胞の総数における各細胞集団の量を分析した。
【０１５５】
さらに、調節性Ｔ細胞によって特異的に発現された３つの新しいマスター遺伝子（Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７）の相対的発現量を、それぞれの細胞集団でＰＣＲによって測定した（表を参照）。Ｆｏｘｐ３は特異的な転写因子であり、調節性Ｔ細胞発症のコントロール遺伝子として観察され、これらの細胞によって特異的に発現される［Ｈｏｒｉ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，’’Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ−ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｂｙ ｔｈｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｆｏｘｐ３’’，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９，１０５７−１０６１（２００３）参照］。
【０１５６】
ＣＴＬＡ−４は更なる因子であり、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋Ｔ細胞の調整機能の測定のためのマーカーとして使用される（Ｋｈａｔｔｒｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，’’Ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅ ｆｏｒ Ｓｃｕｒｆｉｎ ｉｎ ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｃｅｌｌｓ”，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ９０９（２００３）；Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．’’Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ２５＋／ＣＤ４＋ Ｔ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＧＩＴＲ ｂｒｅａｋｓ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ’’，Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｏｎｌｉｎｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｉ７５９（２００３）；Ｃｏｂｂｏｌｄ，Ｓ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．”Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ ｏｆ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ”，Ｔｒａｎｓｐｌ．Ｉｎｔ．１６（２），６６−７５（２００３）参照］。
【０１５７】
インテグリンαＥβ７は、インテグリンであり、上皮キャサリンに結合し、調節性ＣＤ２５＋Ｔ細胞のほとんどの強力なサブ集団のためのマーカーとして使用してもよい［Ｌｅｈｍａｎｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．”Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｇｒｉｎ αＥβ７ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｕｎｉｑｕｅ ｓｕｂ−ｓｅｔｓ ｏｆ ＣＤ２５＋ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ＣＤ２５− ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ’’ＰＮＡＳ ９９（２０），１３０３１−１３０３６（２００２）参照］。
【０１５８】
Ｆｏｘｐ３発現、ＣＴＬＡ−４発現およびインテグリンαＥβ７発現の測定は、コントロールとして、ＧＡＰＤＨおよびβ−アクチン、２個の「ハウスキーピング遺伝子」を使用した定量的ＰＣＲ法によって行い、測定値は、インビトロでＴＡＩＣによってなされた測定抑制機能と、それぞれの遺伝子の発現率をもつＣＤ４＋／ＣＤ２５＋ダブル陽性細胞の形成とを相関させるために、一方で、互いとの関係に置き、１で設定されたＣＤ１４＋／ＣＤ３−細胞で得られた値であり、もう一方で、絶対ＲＮＡ量が総ＲＮＡ（μｇ）に対するμｇとして示した。標準法は、当業者に知られている定量ＰＣＲのため使用した（Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｆ．，Ｚｏｒｂａｓ，Ｈ．’’Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”，Ｓｐｅｋｔｒｕｍ Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ−Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８参照）。
【０１５９】
表は、直接共培養から得られたリンパ球の集団内において、ダブル陽性細胞ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋の比率は８．７％と、間接共培養から得られたＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の量２．３８％、これはコントロールの２．６５％にほぼ近い、これらの量と比較して、大きく増加したことを示す。
【０１６０】
ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞のサブ集団は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞における発現に比べ、テストした全てのマスター遺伝子の中で、ｍＲＮＡの最も高い相対量を発現した（表参照）。Ｆｏｘｐ３の発現は、第１０因子によって増加（３７対３．７５）したが、ＣＴＬＡ−４の発現はそれより高く、最高発現（４６９９対０．３７６）まで至った。共培養中のＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞における第三マスター遺伝子インテグリンαＥβ７の発現の増大は、インテグリンαＥβ７ｍＲＮＡの絶対量がＣＤ４＋／ＣＤ２５−細胞中３．４×１０−１２μｇｍＲＮＡ／μｇ全ＲＮＡに比較して、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋細胞中１．４×１０−９に上がったため、ＣＴＬＡ−４とほぼ同じくらい高い。
【０１６１】
【表４】
（表：直接および間接共培養後の細胞の全量における特異的な細胞集団の、これらの表面マーカーＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ２５を参照することによる、量の測定、およびこれらの細胞集団における３つの遺伝子（Ｆｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７）の相対的発現およびＲＮＡ絶対量の測定）
間接共培養の後、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋サブ集団におけるＦｏｘｐ３−ｍＲＮＡの相対量は、わずか１０で、コントロールのリンパ球により発現される相対量（Ｆｏｘｐ３−ｍＲＮＡの相対量１５を発現する）より低い。
【０１６２】
コントロールのリンパ球により発現されるＣＴＬＡ−４−ｍＲＮＡの相対量は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋集団において０．３７５、ＣＤ４＋／ＣＤ２５−集団において０．１と低い。
【０１６３】
ＴＡＩＣ細胞のＣＤ１４＋／ＣＤ３＋サブ集団におけるＣＴＬＡ−４の発現は、Ｆｏｘｐ３の発現と類似し、全ての他の細胞集団よりも有意に高かった。
【０１６４】
この点ついて、ＣＴＬＡ−４発現（相対値１２．５００）は、ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋サブ集団において、相対値５０を発現したＦｏｘｐ３−発現より非常に強かったことは注目に値する。
【０１６５】
他の２つの分析遺伝子の発現挙動と同様に、相対値ＲＮＡ（μｇ）／全ＲＮＡ（μｇ）として測定された、ＴＡＩＣのＣＤ１４＋／ＣＤ３＋サブ集団におけるインテグリンの発現は、最高値（３．４×１０９μｇ／全ＲＮＡの１ｕｇ）に達したにもかかわらず、インテグリンαＥβ７の発現は、ＴＡＩＣのＣＤ１４＋／ＣＤ３−サブ集団において検出不可であった。
【０１６６】
単球に由来するＴＡＩＣにおける３つのリンパ球マーカーであるＦｏｘｐ３、ＣＴＬＡ−４およびインテグリンαＥβ７の、正常リンパ球に比べて有意に増加した発現は、まったく予期しえぬ結果であり、単球に由来する単球または細胞において、今まで観察されたことのないものである。
【０１６７】
要するに、上述のこの実施例の結果によって、以下のことが実証された。もし、Ｆｏｘｐ３発現、ＣＴＬＡ−４発現およびインテグリンαＥβ７発現の濃度が、それぞれの細胞の免疫調整機能と相関関係があるという仮定から出発するとすれば、ＴＡＩＣのＣＤ３＋／ＣＤ１４＋サブ集団の抑制活性は、これら３つの遺伝子の高い発現と関連することがここで実証された。これは、これらのマーカーが今までリンパ球のためにしか記載されたことがなく、単球由来の細胞においては記載されたことがないことを考えるとさらに驚くべきことである。
【０１６８】
さらに、リンパ球を伴うＴＡＩＣの直接共培養物は、間接共培養物やリンパ球のみの培養物に比べて、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の量が有意に多くなることが示された。これは、ＴＡＩＣの投与の後に、インビボ（すなわち患者において）での調節性Ｔ細胞も形成されるという仮説を支持する。これらの結果は、ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋リンパ球の公知の免疫調整機能、およびこれらの細胞におけるＦｏｘｐ３−ｍＲＭＡ、ＣＴＬＡ−４−ｍＲＭＡおよびインテグリンαＥβ７−ｍＲＭＡの含有量が、間接共培養されたリンパ球やコントロールリンパ球における含有量より有意に高いという事実にも合致している。
【０１６９】
（実施例７）
（インビトロでＴＡＩＣとともに共培養されたリンパ球による移植寛容性のインビボ誘発）
実施例６の結果および結論は、インビボ動物実験において確認された。この実施例では、選択された近交系組み合わせにおける動物にあらかじめ５日間に渡り、ドナーからのＴＡＩＣとともに直接共培養した、受容者からのリンパ球を注射した。他の動物には、コントロールとして、培地で単独で培養した、受容者からのリンパ球を注射した。
【０１７０】
同種異系の心臓移植の前に受容者からの自己由来共培養リンパ球を受けた動物は、ドナー特異的寛容性を発症し、一方、受容者からの未処理非共培養コントロールリンパ球を受けたコントロール動物は、１０〜１４日間の間に移植された心臓を急性拒絶した。
【０１７１】
これは、術後の患者の、ＴＡＩＣとともに共培養されたリンパ球を注射する前（左図）と後（右図）の血液中のＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定によっても示される。細胞に結合するＧＭ−７画分は、注射前の約０．５％から注射後には約２１％に上昇し、ＧＭ−７に結合しうる調節性Ｔ細胞の発症が示唆される。
【０１７２】
これらの結果は、ドナーＴＡＩＣと受容者リンパ球との間の細胞相互作用に対する物理的細胞は、調節性Ｔ細胞の産生を、それ自身、潜在的にアロ反応性のＴ細胞は抑制され、臓器移植の拒絶反応はこのようにして防止されるように、受容者の同系の免疫機構を変性することができるように誘発することを示唆する。
【０１７３】
（実施例８）
（デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）に誘発された慢性大腸炎の治療のための自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）の使用）
大腸炎は、飲料水とともにデキストラン硫酸ナトリウムの経口投与によってマウスに化学的に誘発することができる。７日間にわたる投与によって急性大腸炎が発症し、ＤＳＳ投与の後１０日間の正常な水の投与を少なくとも４回繰り返す投与によって、ヒト潰瘍性大腸炎に類似する慢性大腸炎が発症する。
【０１７４】
この方式は、免疫学または分子学的試験法として充分確立され［たとえば、Ｈｅｒｆａｒｔｈ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．’’Ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ κＢ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｐｈａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ （ＤＳＳ）−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ ｂｙ ｇｌｉｏｔｏｘｉｎ’’Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２０，５９−６５（２０００）；Ｅｇｇｅｒ，Ｂ ｅｔ ａｌ．’’Ｍｉｃｅ ｌａｃｋｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ α ｈａｖｅ ａｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｏｌｉｔｉｓ ’’Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １１３，８２５−８３２（１９９７）参照］、本明細書において、ヒト自己免疫性潰瘍性大腸炎に類似するＤＳＳ誘発大腸炎の慢性のケースの治療において、ＳＴＩＣの可能性を調べるために使用する。
【０１７５】
正常な雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（それぞれ２０ｇ）を自由に水と標準食に接せられるように保った。これらのマウスは、以下のスキームに従って、５％（ｗ／ｖ）のデキストラン硫酸ナトリウムを含む水（ＤＳＳ；該溶液を以下ＤＳＳ水という）、次いで未処理の水のサイクルを４回受けた：
第一サイクル： １日目から７日目までＤＳＳ水（７日間）；
８日目から１７日目まで正常な水（１０日間）；
第二サイクル： １８日目から２４日目までＤＳＳ水（７日間）；
２５日目から３４日目まで正常な水（１０日間）；
第三サイクル： ３５日目から４１日目までＤＳＳ水（７日間）；
４２日目から５１日目まで正常な水（１０日間）；および
第四サイクル： ５２日目から５８日目までＤＳＳ水（７日間）
５８日目の後、全てのマウスは慢性大腸炎の症状を示し、個の症状は、少なくとも２ヶ月続く（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１７６】
次いで、マウスを無作為に４つの異なるグループに割り当てた：
グループ１（ｎ＝５）：＋１日目（５９日目）ＤＳＳ水を与える第四サイクルが終了した後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからのＳＴＩＣ（実施例２参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した；
グループ２（ｎ＝７）：＋７日目（６５日目）ＤＳＳ水を与える第四サイクルが終了した後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからのＳＴＩＣ（実施例２参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した；
グループ３（ｎ＝１２）：ＤＳＳ治療は受けたがどのような細胞注射も受けていない第一コントロールグループ；
グループ４（ｎ＝６）：ＤＳＳ治療を受けた第二コントロールグループ；＋１日目（５９日目）ＤＳＳ水を与える第四サイクルが終了した後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからの「コントロール細胞」（実施例１参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した。（「コントロール細胞」は、骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の混合物であって、実施例２によるＳＴＩＣを生成するために培養する前の細胞、すなわち、同系のマウスの脾臓から得られた培養されていない細胞である。）
７９日目、ＤＳＳ水の栄養分の第四サイクルを終了した後３週間目にマウスは全て屠殺する。
【０１７７】
実験の間、ＤＳＳ誘発期間と次の３週間は動物の体重を１週間に３回測定した。動物の体重の変化を、細胞治療を受けた５９日目のマウスの体重に対する比率（体重減少または増加）で表す。約５〜１５％の範囲内の変化は有意であると考えられる。
【０１７８】
ＤＳＳ治療の終了後３週間のマウスの体重変化を図７に示す。見てわかるように、ＳＴＩＣ投与＋１日目（グループ１＝白四角）は、年齢依存性の適切な体重増加となり、これは、処置されていない動物（グループ３＝黒逆三角）にも、「コントロール細胞」で処置された動物の＋１日目（グループ４＝黒丸）にも、疾患が進行中の、ＳＴＩＣで処置された動物の＋７日目（グループ２＝黒三角）に見ることができない。値は、１グループ当たり５〜７匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【０１７９】
更なる実験で、大腸組織をヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）で組織学的に染色した。ＨＥ染色は、Ｗｏｏｄｓ，Ａ．Ｅ．およびＥｌｌｉｓ，Ｒ．Ｃ．（ｅｄｓ．）（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１＆２；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ＆Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９９４）によって記載されたように行った。染色された粘膜の状態を、実験計画については知らされてない、それぞれ別々に行動する２人の病理学者によって、以下の判断基準に従って評価された：
スコア０ 健康で、影響は見出せない；
スコア１ 軽い大腸炎；
スコア２ 中程度の大腸炎；
スコア３ 重い大腸炎；および
スコア４ 全粘膜の破壊を伴う潰瘍性大腸炎。
【０１８０】
該スコアの結果を図８に示す。ＤＳＳ水の食餌投与の第四サイクルが完了した後３週間で、グループ３のコントロールアニマル（注射せず）は平均スコア約４を得、一方グループ１（＋１日目にＳＴＩＣを投与された）、あるいはグループ２（７日目にＳＴＩＣを投与）の動物は、平均スコアを約１（グループ１）および約１．５（グループ２）にそれぞれ有意に減少させた。「コントロール細胞」で処置された動物（グループ４）は、約３の平均スコアを有し、これは処置していないマウス（グループ３）のスコアと同じ程度である。
【０１８１】
これらの結果は、図６からわかるように、染色された大腸部位（ＨＥ染色、上記参照）の組織学的評価の確認事項と一致している。この評価は、ＳＴＩＣによる治療の効果の測定に最も重大な意味を持つ。図６Ａ（倍率２．５倍）および図６Ｂ（倍率１０倍）は、大きく破壊されている粘膜を持ち、そのまわりの組織は炎症性細胞が濃密に広がる、グループ３の処置されていない動物の大腸の状態を示す。これらの図は大腸炎の進行期を示す。処置されていない動物における大腸炎の進行した状態（図６Ａ／Ｂ）とは対照的に、＋１日目にＳＴＩＣを受けたグループ１の動物の粘膜の形態は、広い範囲で保たれている（図６Ｃ（倍率２．５倍）および図６Ｄ（倍率１０倍））。これらの動物には、粘膜の炎症および破壊の僅かな兆候だけが見られるが、まわりの組織への侵入は見られない。＋１日目に「コントロール細胞」で処置されたグループ４の動物の大腸部位（図６Ｅ、倍率２．５倍）および＋７日目にＳＴＩＣを受けたグループ２の動物（図６Ｆ、倍率２．５倍）は、両方とも、処置されていない動物（図６Ａ／Ｂ）に見られたと同じような、大きく破壊された粘膜とそのまわりの組織は炎症性細胞が濃密に広がる、進行した大腸炎の症状を示す。
【０１８２】
上記試験の結果は、＋１日目のＳＴＩＣ投与とそれに続く大腸炎を誘発するＤＳＳ治療の終了が大腸炎の症状を抑制しうる、あるいは明らかに軽減しうることを示す。ＳＴＩＣが投与された動物は、体重を有意に落とさず（図７）、これらの組織学的スコアを処置されていない動物（図８）に比べて有意に減少し、大腸部位（図６Ｃ／Ｄ）の組織学的染色によって見られるように、大腸粘膜の全状態は殆ど正常である。＋７日目のＳＴＩＣ投与（グループ２）は、ＳＴＩＣ投与の前の７日間の間に進行した大腸炎を治療することができない。起こりつつある大腸炎の進行を反転することはできないが、処置されていないグループ３の動物と比べてグループ２の動物がもつより低い組織学的スコア（図８）から、疾患の進行を止めることはできる。この現象は、この実施例で使用されたＤＳＳ誘発大腸炎のモデルでは特異的であり、容易に他の状態に移すことはできない。
【０１８３】
同系のマウスの脾臓から得た培養されていない細胞を表す、骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の配合物は、これらの細胞で処置された動物（グループ４）が処置されていない動物と同じくらい重篤な症状を示した（図６Ｅ／Ｆ、図７および図８）ため、大腸炎の治療には相応しくない。これは、ＳＴＩＣだけが大腸炎を治療することができ、細胞ＳＴＩＣの配合物中に存在する他の細胞は、培養中発症しないという明らかな証拠を提供する。
【０１８４】
（実施例９）
（ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋リンパ球の移植によりＳＣＩＤマウスに誘発した大腸炎の治療のための自己寛容誘発細胞（ＳＴＩＣ）の使用）
ＳＣＩＤ（重症複合型免疫不全症）マウスにおける大腸炎の人工的な誘発は、ＳＴＩＣの分析および自己免疫疾患の治療の可能性のための別の取り組みである。
【０１８５】
ＳＣＩＤマウスは、Ｔ細胞もＢ細胞も持っていない。彼らの免疫機構は、甲状腺細胞の特異的なサブ集団の移植によって再構成することができる。ＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞またはＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞と呼ばれるこれらの細胞は、免疫機構を再増殖するが、制御不可のため、慢性の炎症を伴う自発大腸炎の発症も誘発する。このモデルシステムは、自己免疫疾患の例のように、大腸炎における発症に関与する細胞集団のより特異的な分析を可能にする、所謂「マウスにおける実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデル」［たとえば、Ｍｕｄｔｅｒ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．’’Ａ ｎｅｗ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｃｏｌｉｔｉｓ ｉｎ ＳＣＩＤ ｍｉｃｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ＣＤ６２Ｌ＋ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ：Ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６ ｏｎ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ’’Ｐａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ ７０，１７０−１７６（２００２）参照］である。
【０１８６】
ここでのモデルは、脱調整免疫システムによって誘発された大腸炎の治療において、ＳＴＩＣの使用に可能性があるか試験するために使用される。このモデルは、より機序的な研究を可能にするが、免疫機構は完全に再増殖しないため、ＤＳＳモデルシステム（上記実施例８参照）に比べると弱いシステムと考えられる。
【０１８７】
ＳＣＩＤ ＢＡＬＢ／ｃマウス（それぞれ１８〜２２ｇ）に、ＰＢＳ中の「Ｍａｃｓ」磁気ビーズ細胞分級システム（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、正常ＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離したＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−セレクチンｈｉｇｈＴ細胞を１×１０６個を腹腔内注射する。マウスを自由に水と標準食に接せられるように保った。
【０１８８】
ＣＤ４＋／ＣＤ６２ＬセレクチンｈｉｇｈＴ細胞の移植から４〜６週間以内に、該マウスは大腸炎を発症した。大腸炎の発症は、重さの変化の判断によって決定した。
【０１８９】
次いで、マウスを無作為に３つの異なるグループに割り当てた：
グループ１（ｎ＝１０）：ＣＤ４＋／ＣＤ６２ＬセレクチンｈｉｇｈＴ細胞の投与による大腸炎誘発の開始から６週間後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからのＳＴＩＣ（実施例２１参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した；
グループ２（ｎ＝１０）：６週間後、ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−セレクチンｈｉｇｈＴ細胞だけを受けたが、他のどのような細胞注射も受けていない第一コントロールグループ；
グループ３（ｎ＝１０）：ＣＤ４＋／ＣＤ６２Ｌ−セレクチンｈｉｇｈＴ細胞を受けた第二コントロールグループ。６週間後、マウスに０．２５ｍＬＰＢＳ中の６２．５国際単位のヘパリンを静注的に与え（血栓症を予防するために）、続けて３０秒後に遺伝的に同一のドナーマウスからの「コントロール細胞」（実施例２参照）を１ｍＬＰＢＳ中５×１０６個静注的に投与した。「コントロール細胞」は実施例８と同一のもの（骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の非培養配合物）。
【０１９０】
疾患誘発Ｔ細胞の移植から１０〜１２週間で、あるいはコントロール動物が基本的なコントロールグループ２内での体重変化によって判断して、大腸炎の兆候を発症した時、全てのラットを全て致死させる。
【０１９１】
実施例８で記載したＤＳＳモデルと同様に、実験の全期間の間、動物の体重を１週間に３回測定した。動物の体重の変化を、細胞治療を受けたときの実験開始から６週間後のマウスの体重に対する比率（体重減少または増加）で表す。再度、約５〜１５％の範囲内の変化は有意であると考えられる。
【０１９２】
全実験期間中のマウスの体重変化を図９に示す。６週間後の全てのグループのマウスは、ほぼ同じ体重である。その後、６週間後のＳＴＩＣの投与（グループ１＝黒菱形）は、年齢依存性の適切な体重増加となるが、処置されていない動物（グループ２＝黒四角）についても、６週間後に「コントロール細胞」で処置されたマウス（グループ３＝黒三角）についても、疾患が進行、比較的体重増加が減少した（グループ２）または増加が全く見られない（グループ３）。値は、１グループ当たり６匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【０１９３】
動物を屠殺した直後、これらの動物の大腸の長さと脾臓の重量を測定した。両値とも炎症の広がりは認められたものの、あまり影響は受けていない。
【０１９４】
図１０に大腸の長さ（図１０Ａ）と脾臓の重量（図１０Ｂ）の測定の結果を示す。この図からわかるように、コントロール動物と比べて、ＳＴＩＣで処置した動物（グループ１）の大腸は有意に長く（約１１ｃｍ）、それらの脾臓は有意に小さい（約５０ｍｇ）。グループ２のコントロール動物は、重篤な炎症を示唆する、短くなった大腸（約１０．３ｃｍ）と肥大した脾臓（約１００ｍｇ）を有する。一方、コントロール細胞を受けた動物（グループ３）は、コントロール動物（グループ２）と比べると大腸炎の重篤な症状は発症していない（大腸の長さが約１０．６ｃｍ、および脾臓の重量が約６０ｍｇ）が、ＳＴＩＣで処置した動物（グループ１）に比べると、大腸炎はより進行している。
【０１９５】
続いて、更なる実験で、大腸組織をヘマトキシリンエオシンで組織学的に染色した（ＨＥ染色；Ｗｏｏｄｓ，Ａ．Ｅ．ａｎｄ Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｃ．（ｅｄｓ．）；Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｖｏｌ．１＆２；Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ＆Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，１９９４）。すでに実施例８で記載したように、実験計画については知らされてない、それぞれ別々に行動する２人の病理学者によって、粘膜の状態が評価された。粘膜のスコア方法は実施例８と同じである：
スコア０ 健康で、影響は見出せない；
スコア１ 軽い大腸炎；
スコア２ 中程度の大腸炎；
スコア３ 重い大腸炎；および
スコア４ 全粘膜の破壊を伴う潰瘍性大腸炎。
【０１９６】
平均スコアを図１１に示す。治療の移植を行って６週間後、細胞注射を受けていないグループ２のコントロール動物は、重い大腸炎を示唆する約３の平均スコアを有する。６週間後にＳＴＩＣを受けたグループ１のマウスおよびコントロール細胞を受けたグループ２のマウスは、有意に減少し、それぞれ平均スコアが約１．５（軽い大腸炎を示す；グループ１）および約２．５（中程度の大腸炎を示す；グループ２）を有する。
【０１９７】
これらの結果も、図１２（倍率１００倍）からわかるように、ＨＥ染色された大腸部位の組織学的評価の確認事項と一致する。図１２Ａ／Ｂは、ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴ細胞での大腸炎誘発後、処置しないままのグループ３の動物の大腸の状態を示す。両実施例は、単核球細胞による著しい侵入と、粘膜下組織および固有筋層の粘膜一体性の実質的な欠損、クリピト損傷、および侵入を示す。記載したように、「コントロール細胞」（血液、ウシ骨髄および脾臓組織に由来する非Ｍ−ＣＳＦおよびγ−インターフェロン刺激単球）の注射は、図１２Ｃ／Ｄでわかるように、単核球細胞侵入および粘膜の欠損を予防しなかった。また、両検体は、リンパ球の実質的な粘膜下組織侵入を示すが、固有筋層はまだ損なわれていない。ＣＤ６２ＬｈｉｇｈＴ細胞による大腸炎誘発の後、ＳＴＩＣを投与することで、粘膜一体化を著しく回復した（図１２Ｅ／Ｆ）。両検体の大腸部位において、軽いリンパ球侵入だけが見られ、分析した大腸部位の範囲内では、クリプト損失も粘膜下組織および固有筋層への損傷も見られない。
【０１９８】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎の治療のためのＳＴＩＣの投与で得られた結果（上記実施例８参照）と同様に、マウスにおける実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルを使用したここでも、ＳＴＩＣは誘発大腸炎の症状を抑制するまたは明らかに軽減することができることを示される。ＳＴＩＣで処置されたマウスは、年齢依存性の適切な重さの増加を示し（図９）、大腸の重篤な炎症を患うコントロールグループのマウスと比べて、それらの大腸は有意に長く（図１０Ａ）、それらの脾臓の重量は有意に低い（図１０Ｂ）。最後に、ＳＴＩＣで処置されたマウスの組織学的スコアは、処置されていない動物（図１１）に比べ、有意に低く、ＳＴＩＣで処置されたマウスの大腸部位の組織学的分析は、大腸炎の症状がほんの僅かもしくは症状がないことを示す（図１２）。
【０１９９】
同系のマウスの脾臓から得た非培養細胞を示す骨髄細胞、末梢血液細胞および脾臓細胞の配合物は、これらの細胞で処置された動物（グループ３）はＳＴＩＣで処置された動物に見られたものより重篤な症状を示している（図９、１０Ａ／Ｂ、１１および１２）ため、ＳＴＩＣによる大腸炎治療の効果と比べて、有意に低下した評価を示す。ＤＳＳモデルシステムを使用した実施例８で得られた結果とは対照的に、ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ細胞による大腸炎誘発のモデルでは、コントロール細胞は、コントロール細胞を受けた動物は、いかなる細胞も受けていないコントロール動物に比べて、それほど重篤な症状を示さないため、症状をいくらか軽減することができる。
【０２００】
実施例８の結果によって、本発明のＳＴＩＣは自己免疫疾患を治療することが可能であるという明らかな証拠が再び提供される。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】本発明による細胞の変性の前（左側のグラフ）および後（右側のグラフ）のオリジナル単球細胞のＧＭ−７結合能力のフローサイトメトリー測定。ｘ軸は結合細胞の数を示す。
【図２】個体Ｂ（ＧＭ−７−：グレイのカラム；ＧＭ−７＋：黒のカラム）からのＣＤ１４＋単球の混合リンパ球培養物、ＣＤ１４＋／ＧＭ−７＋細胞とＣＤ１４＋／ＧＭ−７−細胞の抑制活性を比較するためのＭＨＣ非調和ドナーＡからのキラー細胞、およびドナーＢからの照射細胞。
【図３】免疫抑制性ＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の形成における培養の開始時に、単球を濃縮するために細胞を精製する際の影響を測定するための、単球画分中のＣＤ１４＋単球の量、ＣＤ２＋リンパ球の量およびＴＡＩＣとしての効果があるＣＤ１４＋／ＣＤ３＋細胞の量のフローサイトメトリー測定。
【図４】ＴＡＩＣの抑制活性における阻害剤（１−ＭＴ）の影響を測定するための、インドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害剤（１−ＭＴ）が加えられた２つの試験においてプレインキュベートされたＰＨＡ刺激リンパ球（ＰｈａＬｙ）およびＴＡＩＣ（「Ｍｏ＋Ｌｙ」または「Ｍｏ」）の混合リンパ球培養物。
【図５】血液細胞のインビボＧＭ−７発現におけるＴＡＩＣの影響を測定するための、ＴＡＩＣの注射の前（左図）および後（右図）の手術後の患者の血液中のＧＭ−７発現のフローサイトメトリー測定。
【図６】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎を患っているマウスの大腸部のＨＥ染色であって、処置されていないグループ３の動物（図６Ａ／Ｂ）、＋１日目にＳＴＩＣを与えられ次いでＤＳＳ治療されたグループ１の動物（図６Ｃ／Ｄ）、「コントロール細胞」を＋１日目に与えられたグループ４の動物（図６Ｅ）、およびＳＴＩＣを＋７日目に与えられた動物（図６Ｆ）の大腸の状態を示す。（図６Ａ／Ｃ／Ｅでは倍率２．５倍、図６Ｂ／Ｄ／Ｆでは倍率１０倍）
【図７】ＤＳＳ治療の終了後３週間の間の、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎を患っているマウスの体重の変化。グループ１（黒四角）の動物はＳＴＩＣを＋１日目に与えられ、グループ２（黒三角）の動物はＳＴＩＣを＋７日目に与えられ、グループ３（黒逆三角）の動物は処置されず、一方、グループ４（黒丸）の動物は、「コントロール細胞」を＋１日目に与えられた。値は、１グループ毎に５〜７匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【図８】デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発慢性大腸炎を患っているマウスの組織学的に染色された大腸部のスコアの結果である。グループ１の動物はＳＴＩＣを＋１日目に与えられ、グループ２の動物はＳＴＩＣを＋７日目に与えられ、グループ３の動物は処置されず、一方、グループ４の動物は「コントロール細胞」を＋１日目に与えられた。（採点０＝健康で影響のない結果；採点１＝マイナーな大腸炎；採点２＝中程度の大腸炎；採点３＝重い大腸炎；および４＝粘膜全体の破壊を伴う潰瘍性大腸炎）
【図９】細胞治療を受けた場合の実験開始後６週間のマウスの体重に関する、実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルにおける、マウスの体重の変化。グループ１の動物（黒菱形）は６週間後にＳＴＩＣを与えられ、グループ２の動物（黒四角）は処置されず、グループ３の動物（黒三角）は６週間後に「コントロール細胞」を与えられた。値は１グループ毎に６匹のマウスから得られた平均値であり、標準偏差は常に１５％未満である。
【図１０】実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルにおける、ＳＴＩＣを受けたマウス（グループ１）、処置されていないコントロールマウス（グループ２）、および「コントロール細胞」を受けたマウス（グループ３）の大腸の長さ（図１０Ａ）および脾臓重量（図１０Ｂ）の測定。値はＳＥＭ平均値である。
【図１１】細胞移植後６週間の実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルのマウスの組織学的に染色された大腸部のスコア。グループ１の動物はＳＴＩＣを受け、グループ２の動物は無処置で細胞注射を受けておらず、グループ３の動物は、「コントロール細胞」を受けた。値はＳＥＭ平均値である（採点０＝健康で影響のない結果；採点１＝軽い大腸炎；採点２＝中程度の大腸炎；採点３＝重い大腸炎；および４＝粘膜全体の破壊を伴う潰瘍性大腸炎）。
【図１２】実験的慢性大腸炎のＣＤ６２Ｌ＋／ＣＤ４＋ＳＣＩＤ転移モデルのマウスの大腸部のＨＥ染色であって、２匹の無処置の動物のグループ２（図１２Ａ／Ｂ）、２匹の「コントロール細胞」を与えた動物のグループ３（図１２Ｃ／Ｄ）、および２匹のＳＴＩＣを与えた動物のグループ１（図１２Ｅ／Ｆ）の大腸の状態を示す（倍率：１００倍）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための、自家細胞の調製のための方法であって、
（ａ）該細胞を投与すべき患者の血液から、単球を単離する工程と、
（ｂ）該単球を、細胞成長因子Ｍ−ＣＳＦを含む適切な培養培地中で増殖させる工程と、
（ｃ）該単球を、工程（ｂ）と同時にかまたは工程（ｂ）の後で、γ−ＩＦＮを含む培養培地中で培養する工程と、
（ｄ）該（ｃ）工程で形成された細胞を、該培養培地から該細胞を分離することによって得る工程とを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記単球がヒト由来であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単球が、該単球に加えてリンパ球もまた、単離物の全細胞数に対して少なくとも１０％の量で存在するような様式で、前記血液から単離されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）で形成される細胞か、または前記工程（ｄ）で得られる細胞が、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって産生された抗体に結合することによって選択されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１の工程（ｃ）で形成される細胞か、または請求項１の工程（ｄ）で得られる細胞か、または請求項４に記載の選択工程で得られる細胞の中で、それらの細胞表面でＣＤ３抗原とＣＤ１４抗原とが共発現する細胞が選択されることを特徴とする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
培地中のＭ−ＣＳＦ濃度が１〜２０μｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）に次いで、前記単球を２４〜７２時間、γ−ＩＦＮを含む培地中で培養し、γ−ＩＦＮ存在下での該培養を、培養工程（ｂ）の開始後３〜６日に始めることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地中の前記γ−ＩＦＮ濃度が０．１〜２０ｎｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）および工程（ｃ）の合計培養期間が４〜８日間であることを特徴とする、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１の工程（ｄ）に次いで、または請求項４および５に記載の選択工程に続いて、前記細胞を、適切な細胞培地、またはＰＢＳ溶液もしくはＮａＣｌ溶液に懸濁することを特徴とする、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が寒剤中に懸濁され、次いで冷凍されることを特徴とする、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記寒剤が、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはヒトＡＢ０適合性血清、およびＤＭＳＯを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための自家細胞であって、請求項１〜１２に記載の方法のいずれかによって得られる、細胞。
【請求項１４】
ＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原を細胞表面上で共発現していることを特徴とする、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
ヒト由来の細胞であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１３〜１５に記載の細胞を適切な培地中に含む、細胞調製物。
【請求項１７】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための、単球由来の自家細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１３〜１５の細胞または請求項１６の細胞調製物を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
自己免疫疾患の予防および／または治療のための、請求項１７および１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
アレルギーの予防および／または治療のための、請求項１７および１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための薬学的組成物を製造するための、請求項１３〜１５に記載の細胞または請求項１６に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２２】
自己免疫疾患の予防および／または治療のための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が、以下：自己免疫性特徴を伴うリウマチ性疾患、糖尿病、血液および血管の自己免疫疾患、肝臓の自己免疫疾患、甲状腺の自己免疫疾患、中枢神経系の自己免疫疾患、および水疱性皮膚疾患、から選択される疾患のうちの１つ以上であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
アレルギーの予防および／または治療のための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
前記アレルギーが、非自己タンパク質、有機物質および／または無機物質によって誘発されるアレルギーから選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記アレルギーが、花粉症、ならびに／または薬物、化学薬品、ウイルス、バクテリア、菌類、食品成分、金属、ガス、ネコ皮膚落屑および／もしくは動物の毛によって誘発されるアレルギーから選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
自己の調節性Ｔリンパ球をインビトロで産生および／または増殖させるための、請求項１３〜１５に記載の自己寛容誘発細胞または請求項１６に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２８】
前記調節性Ｔリンパ球が、ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原をそれらの細胞表面上で共発現している、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
自己由来の調節性Ｔリンパ球を産生および／または増殖させる方法であって、
ａ）請求項１３〜１５に記載の自己寛容誘発細胞または請求項１６に記載の細胞調製物を自己由来のＴ−リンパ球調製物とともに共培養し、
ｂ）該調節性Ｔリンパ球を、必要に応じて培地から得ること
を特徴とする、方法。
【請求項３０】
前記調節性Ｔリンパ球が前記ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原をそれらの細胞表面上で共発現していることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記調節性Ｔリンパ球が、ＦＡＣＳ分離法によって前記培地から得られることを特徴とする、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２９〜３１に記載の方法で得られた、調節性Ｔリンパ球。
【請求項３３】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のために適切な自家細胞の検出および／または選択のための、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって産生される抗体の使用。
【請求項３４】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための方法であって、薬学的有効量の請求項１３〜１５に記載の自家細胞または請求項１６に記載の自家細胞調製物を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患の予防および／または治療のための、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記自己免疫疾患が、以下：自己免疫性特徴を伴うリウマチ性疾患、糖尿病、血液および血管の自己免疫疾患、肝臓の自己免疫疾患、甲状腺の自己免疫疾患、中枢神経系の自己免疫疾患、および水疱性皮膚疾患、から選択される疾患のうちの１つ以上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
アレルギーの予防および／または治療のための、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記アレルギーが、非自己タンパク質、有機物質および／または無機物質によって誘発されるアレルギーから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アレルギーが、花粉症、ならびに／または薬、化学薬品、ウイルス、バクテリア、菌類、食品成分、金属、ガス、動物の皮膚落屑、毛および／もしくは動物の排泄物によって誘発されるアレルギーから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項１】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための、自家細胞の調製のための方法であって、
（ａ）該細胞を投与すべき患者の血液から、単球を単離する工程と、
（ｂ）該単球を、細胞成長因子Ｍ−ＣＳＦを含む適切な培養培地中で増殖させる工程と、
（ｃ）該単球を、工程（ｂ）と同時にかまたは工程（ｂ）の後で、γ−ＩＦＮを含む培養培地中で培養する工程と、
（ｄ）該（ｃ）工程で形成された細胞を、該培養培地から該細胞を分離することによって得る工程とを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記単球がヒト由来であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単球が、該単球に加えてリンパ球もまた、単離物の全細胞数に対して少なくとも１０％の量で存在するような様式で、前記血液から単離されることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（ｃ）で形成される細胞か、または前記工程（ｄ）で得られる細胞が、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって産生された抗体に結合することによって選択されることを特徴とする、請求項１〜３に記載の方法。
【請求項５】
請求項１の工程（ｃ）で形成される細胞か、または請求項１の工程（ｄ）で得られる細胞か、または請求項４に記載の選択工程で得られる細胞の中で、それらの細胞表面でＣＤ３抗原とＣＤ１４抗原とが共発現する細胞が選択されることを特徴とする、請求項１〜４に記載の方法。
【請求項６】
培地中のＭ−ＣＳＦ濃度が１〜２０μｇ／Ｌであることを特徴とする、請求項１〜５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｂ）に次いで、前記単球を２４〜７２時間、γ−ＩＦＮを含む培地中で培養し、γ−ＩＦＮ存在下での該培養を、培養工程（ｂ）の開始後３〜６日に始めることを特徴とする、請求項１〜６に記載の方法。
【請求項８】
前記培地中の前記γ−ＩＦＮ濃度が０．１〜２０ｎｇ／ｍＬであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｂ）および工程（ｃ）の合計培養期間が４〜８日間であることを特徴とする、請求項１〜８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１の工程（ｄ）に次いで、または請求項４および５に記載の選択工程に続いて、前記細胞を、適切な細胞培地、またはＰＢＳ溶液もしくはＮａＣｌ溶液に懸濁することを特徴とする、請求項１〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が寒剤中に懸濁され、次いで冷凍されることを特徴とする、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記寒剤が、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）またはヒトＡＢ０適合性血清、およびＤＭＳＯを含むことを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための自家細胞であって、請求項１〜１２に記載の方法のいずれかによって得られる、細胞。
【請求項１４】
ＣＤ３抗原およびＣＤ１４抗原を細胞表面上で共発現していることを特徴とする、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
ヒト由来の細胞であることを特徴とする、請求項１３または１４に記載の細胞。
【請求項１６】
請求項１３〜１５に記載の細胞を適切な培地中に含む、細胞調製物。
【請求項１７】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための、単球由来の自家細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１３〜１５の細胞または請求項１６の細胞調製物を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
自己免疫疾患の予防および／または治療のための、請求項１７および１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
アレルギーの予防および／または治療のための、請求項１７および１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための薬学的組成物を製造するための、請求項１３〜１５に記載の細胞または請求項１６に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２２】
自己免疫疾患の予防および／または治療のための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記自己免疫疾患が、以下：自己免疫性特徴を伴うリウマチ性疾患、糖尿病、血液および血管の自己免疫疾患、肝臓の自己免疫疾患、甲状腺の自己免疫疾患、中枢神経系の自己免疫疾患、および水疱性皮膚疾患、から選択される疾患のうちの１つ以上であることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
アレルギーの予防および／または治療のための、請求項２１に記載の使用。
【請求項２５】
前記アレルギーが、非自己タンパク質、有機物質および／または無機物質によって誘発されるアレルギーから選択されることを特徴とする、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記アレルギーが、花粉症、ならびに／または薬物、化学薬品、ウイルス、バクテリア、菌類、食品成分、金属、ガス、ネコ皮膚落屑および／もしくは動物の毛によって誘発されるアレルギーから選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
自己の調節性Ｔリンパ球をインビトロで産生および／または増殖させるための、請求項１３〜１５に記載の自己寛容誘発細胞または請求項１６に記載の細胞調製物の使用。
【請求項２８】
前記調節性Ｔリンパ球が、ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原をそれらの細胞表面上で共発現している、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
自己由来の調節性Ｔリンパ球を産生および／または増殖させる方法であって、
ａ）請求項１３〜１５に記載の自己寛容誘発細胞または請求項１６に記載の細胞調製物を自己由来のＴ−リンパ球調製物とともに共培養し、
ｂ）該調節性Ｔリンパ球を、必要に応じて培地から得ること
を特徴とする、方法。
【請求項３０】
前記調節性Ｔリンパ球が前記ＣＤ４抗原およびＣＤ２５抗原をそれらの細胞表面上で共発現していることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記調節性Ｔリンパ球が、ＦＡＣＳ分離法によって前記培地から得られることを特徴とする、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項２９〜３１に記載の方法で得られた、調節性Ｔリンパ球。
【請求項３３】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のために適切な自家細胞の検出および／または選択のための、ハイブリドーマ細胞株ＤＳＭ ＡＣＣ２５４２によって産生される抗体の使用。
【請求項３４】
患者における自己寛容障害を伴う疾患の予防および／または治療のための方法であって、薬学的有効量の請求項１３〜１５に記載の自家細胞または請求項１６に記載の自家細胞調製物を患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患の予防および／または治療のための、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記自己免疫疾患が、以下：自己免疫性特徴を伴うリウマチ性疾患、糖尿病、血液および血管の自己免疫疾患、肝臓の自己免疫疾患、甲状腺の自己免疫疾患、中枢神経系の自己免疫疾患、および水疱性皮膚疾患、から選択される疾患のうちの１つ以上である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
アレルギーの予防および／または治療のための、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記アレルギーが、非自己タンパク質、有機物質および／または無機物質によって誘発されるアレルギーから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記アレルギーが、花粉症、ならびに／または薬、化学薬品、ウイルス、バクテリア、菌類、食品成分、金属、ガス、動物の皮膚落屑、毛および／もしくは動物の排泄物によって誘発されるアレルギーから選択される、請求項３８に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５２５４７３（Ｐ２００７−５２５４７３Ａ）
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５１７９７４（Ｐ２００６−５１７９７４）
【出願日】平成１６年１月９日（２００４．１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０００１０９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００５６２０
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（５０４３６２１４５）ブラスティコン ビオテクノロギッシュ フォーシュング ゲーエムベーハー (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月６日（２００７．９．６）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月９日（２００４．１．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０００１０９
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００５６２０
【国際公開日】平成１７年１月２０日（２００５．１．２０）
【出願人】（５０４３６２１４５）ブラスティコン ビオテクノロギッシュ フォーシュング ゲーエムベーハー (2)
【Ｆターム（参考）】
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