単純ヘルペスウイルスおよびウイルス複製法
単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルスを開示する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルスの複製法、および疾患の治療における単純ヘルペスウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規増殖阻害剤４（ＩＮＧ４）は、候補腫瘍抑制因子タンパク質の新規増殖阻害剤ファミリーのメンバーであり、該タンパク質のうち６つがヒトにおいて報告されている（Ｇａｒｋａｖｓｔｅｖら １９９６）。ＩＮＧ４遺伝子の喪失が、頭部および頸部扁平上皮癌（Ｇｕｎｄｕｚら ２００５）およびグリオーマ（Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら ２００４）において報告されてきており、そしてこのタンパク質に関してはいくつかの異なる機能が記載されてきているが、その正確な作用様式は、まだ解明されていない。
【０００３】
ＩＮＧ遺伝子産物は、細胞増殖を阻害し（Ｒｕｓｓｅｌｌら ２００６、Ｃａｍｐｏｓら ２００４、ＳｈｉおよびＧｏｚａｎｉ ２００５）、そしてその過剰発現は、アポトーシス増加と関連づけられる（Ｎａｇａｓｈｉｍａら ２００１）。ＩＮＧ４による細胞増殖の阻害は、おそらく、ＩＮＧ４がｐ５３およびアセチルトランスフェラーゼｐ３００に結合し、こうしてｐ５３のアセチル化および活性化を促進することによって仲介される（Ｓｈｉｓｅｋｉら ２００３）。ＩＮＧ４は、正常細胞周期進行およびヒストンＨ４アセチル化の大部分に必要とされるＨＢＯ１ ＨＡＴ複合体の構成要素として報告されてきており（Ｄｏｙｏｎら ２００６）、クロマチンリモデリングおよび転写制御における役割が示唆される。ヒト癌発展中にヒストンＨ４アセチル化が広範に喪失することから、ＩＮＧ４が腫瘍抑制因子の役割を果たすことが強く示唆される。ＩＮＧ４は、ＮＦ−κＢのＲｅｌＡサブユニットと相互作用して、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＣｏｘ−２などの血管形成関連遺伝子の発現抑制を生じることが示されてきており（Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら ２００４）、そしてグリオーマにおけるその喪失は、より攻撃的な腫瘍増殖および血管新生と関連づけられる。腫瘍抑制因子遺伝子の喪失は、癌進行の共通の特徴である。多発性骨髄腫細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＮＧ４抑制は、おそらく、低酸素中の血管形成遺伝子の上方制御に関与する低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）の活性増加を通じて、血管形成促進性ＩＬ−８およびオステオポンチンの発現増加を生じ、そして多発性骨髄腫患者において、ＩＮＧ４レベルの減少は、高いＩＬ−８産生および高密度の微小血管の両方と関連づけられる（Ｃｏｌｌａら ２００７）。やはり血管形成遺伝子を制御する際に関与するＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＨＰＨ）−２との相互作用を介しておそらく仲介される、ＨＩＦ転写因子のＩＮＧ４抑制もまた、報告されてきている（Ｏｚｅｒら ２００５、Ｃｏｌｌａら ２００７）。
【０００４】
単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムは、長（Ｌ）および短（Ｓ）と称される２つの共有結合したセグメントを含む。各セグメントは、逆位末端反復配列対が隣接するユニークな配列を含有する。長反復（ＲＬまたはＲＬ）および短反復（ＲＳまたはＲＳ）が特徴的である。
【０００５】
広範に研究されているＨＳＶ ＩＣＰ３４．５（γ３４．５とも称する）遺伝子が、ＨＳＶ−１ Ｆ株およびｓｙｎ１７＋株、ならびにＨＳＶ−２ ＨＧ５２株において配列決定されている。ＩＣＰ３４．５遺伝子の１コピーがＲＬ反復領域の各々の内部に位置する。ＩＣＰ３４．５遺伝子の両方のコピーを不活性化する突然変異体（すなわちヌル突然変異体）、例えばＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６（ＨＳＶ １７１６）、あるいはＦ株における突然変異体Ｒ３６１６またはＲ４００９は、神経毒性を欠く、すなわち非病原性（非神経毒性）であることが知られており、そして遺伝子送達ベクターとして、または腫瘍退縮（oncolysis）による腫瘍の治療においての両方で有用性を有する。ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６は、各ＲＬ反復のＢａｍＨＩ ｓ制限断片内に位置するＩＣＰ３４．５遺伝子の各コピーにおいて、７５９ｂｐ欠失を有する。
【０００６】
ＨＳＶ１７１６などのＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体は、事実上、第一世代腫瘍退縮ウイルスである。大部分の腫瘍は個々の特性を示し、そして広域性第一世代腫瘍退縮ウイルスが、すべての腫瘍タイプにおいて複製するか、またはすべての腫瘍タイプに関して有効な治療を提供する能力は、保証されない。
【０００７】
ＨＳＶ１７１６は、腫瘍退縮性、非神経毒性ＨＳＶであり、そしてＥＰ ０５７１４１０およびＷＯ ９２／１３９４３に記載されている。ＨＳＶ１７１６は、１９９２年１月２８日、寄託番号Ｖ９２０１２８０３のもとに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（本明細書において、「ブダペスト条約」と称する）の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に寄託されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ ０５７１４１０
【特許文献２】ＷＯ ９２／１３９４３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇａｒｋａｖｓｔｅｖら １９９６
【非特許文献２】Ｇｕｎｄｕｚら ２００５
【非特許文献３】Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら ２００４
【非特許文献４】Ｒｕｓｓｅｌｌら ２００６
【非特許文献５】Ｃａｍｐｏｓら ２００４
【非特許文献６】ＳｈｉおよびＧｏｚａｎｉ ２００５
【非特許文献７】Ｎａｇａｓｈｉｍａら ２００１
【非特許文献８】Ｓｈｉｓｅｋｉら ２００３
【非特許文献９】Ｄｏｙｏｎら ２００６
【非特許文献１０】Ｃｏｌｌａら ２００７
【非特許文献１１】Ｏｚｅｒら ２００５
【発明の概要】
【００１０】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルスは、腫瘍増殖を遅延させる能力が増進されていることが、現在、見出されている。特に、本発明者らは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む変異体単純ヘルペスウイルスを生成し、そしてこの変異体を、腫瘍移植物を持つマウスに投与した効果を調べた。本発明者らは、単純ヘルペスウイルス変異体を投与されたマウスの生存期間が、対照に比較して有意に改善され、そしてさらに、変異体を投与されたマウスが、有意により小さい平均腫瘍体積を有することを見出した。これらの結果は、ＩＮＧ４ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスが仲介する腫瘍退縮を増進させることを立証する。
【００１１】
これらの観察のありうる説明の１つは、ＩＮＧ４ポリペプチドが血管形成を阻害し、それによって腫瘍が増殖可能な速度を減少させることである。したがって、この機構は、単純ヘルペスウイルスが腫瘍細胞殺傷能改善を提供する、腫瘍退縮能と相乗的に相互作用する。
【００１２】
しかし、さらなる研究を行う一方、本発明者らは、ＩＮＧ４をコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルス変異体に感染した腫瘍細胞が、対照に比較して、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、子孫ビリオンの有意により高い産出量を有することを予期せず見出した。さらなる実験によって、ＩＮＧ４ポリペプチドを恒常的に発現し、そして野生型単純ヘルペスウイルスに感染した細胞もまた、対照に比較して、子孫ビリオンのより高い産出量を有することも示された。これによって、ＩＮＧ４発現が単純ヘルペスウイルスに対して増殖上の利点を与えることが示される。
【００１３】
これらの結果は、単純ヘルペスウイルスの投与を伴う治療の有効性を改善するための新規アプローチの基礎を提供する。特に、これらの結果は、非常に必要とされる、癌および他の状態のための新規でそして改善された治療につながる潜在能力を有する。
【００１４】
ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＰＯ Ｂｏｘ １７１６， Ｇｌａｓｇｏｗ， Ｇ５１ ４ＷＦ， 英国に住所を有するＣｒｕｓａｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名のもとに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（本明細書において、「ブダペスト条約」と称する）の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に寄託されている。
【００１５】
広い側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。他の広い側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが単純ヘルペスウイルスの複製効率を増進させるポリペプチドをコードする核酸を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。抗血管形成ポリペプチドは、ＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドであってもよい。
【００１６】
抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドは、好ましくは、ＨＳＶに対して異種であり、すなわち通常、対応する野生型ＨＳＶによってコードされずまた発現されない。より好ましくは、抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドまたはタンパク質である。さらにより好ましくは、これは候補腫瘍抑制因子遺伝子である。ＨＳＶは、好ましくは、抗血管形成ポリペプチドまたはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドを発現可能である。抗血管形成ポリペプチドまたはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドは、好ましくは、ＩＮＧ４ポリペプチドである。
【００１７】
より詳細には、本発明は、ＩＮＧ４を発現可能なＨＳＶ、およびＨＳＶの複製効率を改善する際のＩＮＧ４の使用に関する。
したがって、１つの側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが抗血管形成ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。好ましい態様において、抗血管形成ポリペプチドはＩＮＧ４である。単純ヘルペスウイルスはまた、非神経毒性であってもよい。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムがＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。単純ヘルペスウイルスは、非神経毒性であってもよい。
【００１９】
ＨＳＶは、腫瘍退縮性ＨＳＶであってもよい。本発明において使用可能なＨＳＶ、例えば腫瘍退縮性ＨＳＶには、それぞれの遺伝子が、機能するＩＣＰ３４．５タンパク質を発現すること、例えばコードすることが不能であるように、γ３４．５（ＩＣＰ３４．５とも称される）遺伝子の一方または両方が修飾されている（例えば欠失、挿入、付加または置換であってもよい突然変異によって）ＨＳＶが含まれる。好ましくは、本発明記載のＨＳＶにおいて、修飾されたＨＳＶが、機能するＩＣＰ３４．５タンパク質を発現すること、例えば産生することが不能であるように、γ３４．５遺伝子の両コピーが修飾されている。ウイルス、例えば腫瘍退縮性ウイルスは、好ましくは非神経毒性である。
【００２０】
特定の配置において、単純ヘルペスウイルスは、ＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体などの遺伝子特異的ヌル突然変異体であってもよい。単純ヘルペスウイルスが、機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を産生不能であるように、単純ヘルペスウイルスゲノムに存在するＩＣＰ３４．５遺伝子のすべてのコピー（通常、２コピーが存在する）が破壊されている場合、ウイルスはＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体であると見なされる。他の配置において、単純ヘルペスウイルスは、少なくとも１つの発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠いていてもよい。別の配置において、単純ヘルペスウイルスは、１つの発現可能ＩＣＰ３４．５遺伝子のみを欠いていてもよい。他の配置において、単純ヘルペスウイルスは、両方の発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠いていてもよい。さらに他の配置において、単純ヘルペスウイルス中に存在する各ＩＣＰ３４．５遺伝子は発現可能でなくてもよい。発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子の欠如は、例えば、ＩＣＰ３４．５遺伝子の発現が、機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を生じないことを意味する。
【００２１】
本発明記載のＨＳＶのゲノムは、ポリペプチドが核酸から発現可能であるように、抗血管形成ポリペプチドの少なくとも１コピーをコードする核酸を含有するようにさらに修飾されている。該ポリペプチドをコードする核酸は、単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つのＲＬ１遺伝子座に位置してもよい。例えば、該核酸は、単純ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の少なくとも１つの中に位置するか、または該配列と重複していてもよい。これは、ＩＣＰ３４．５遺伝子を不活性化し、それによって非神経毒性を提供する、好都合な方式を提供する。
【００２２】
抗血管形成ポリペプチドまたは複製効率を増進させるポリペプチドは、選択されたＩＮＧ４ポリペプチドであってもよい。こうしたものとして、好ましい態様において、修飾されたＨＳＶは、抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは細胞、好ましくは哺乳動物細胞の感染に際して複製効率を増進させるＨＳＶポリペプチド（例えばＩＮＧ４）を発現可能な発現ベクターである。別の好ましい態様において、ＨＳＶは腫瘍退縮性発現ベクターである。
【００２３】
抗血管形成ポリペプチドまたは複製効率を増進させるポリペプチド（例えばＩＮＧ４）の発現を達成するため、該ポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、該ポリペプチドをコードする核酸の転写を達成可能な制御配列、例えばプロモーターに、機能可能であるように連結されている。ヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されている制御配列（例えばプロモーター）は、制御配列が該ヌクレオチド配列の産物の発現を達成および／または調節可能であるように、その配列に隣接して、またはごく近接して位置してもよい。ヌクレオチド配列にコードされる産物は、したがって、その制御配列から発現可能であってもよい。
【００２４】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結された」には、ヌクレオチド配列の発現を制御配列の影響または調節下に置く方式で、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列が共有結合している状況が含まれうる。したがって、制御配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部またはすべてを形成するヌクレオチド配列の転写を達成可能であるならば、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されている。次いで、適切な場合、生じた転写物を所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳してもよい。
【００２５】
本発明の単純ヘルペスウイルスを生成するのに有用な核酸ベクターが、例えば、ＷＯ ２００５／０４９８４５の４１ページ１９行目〜５５ページ３０行目に記載される。これは、本明細書に援用される。本発明者らによって提供される１つのこうしたベクターは、Ｃｒｕｓａｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名のもとに、ブダペスト条約の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に、寄託番号０３０９０３０３のもとに寄託される、プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰである。
【００２６】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、選択された単純ヘルペスウイルスのゲノム中に相同組換えによって挿入されている核酸カセットの一部を形成してもよい。カセットの一部であってもまたはなくても、挿入部位は、選択された任意のゲノム位置中であってもよい。１つの好ましい挿入部位は、長反復領域（ＲＬ）の一方または両方の中にあり、そしてカセットの１つのコピーは、好ましくは、長反復（ＲＬ）の各コピー中に挿入される。より好ましくは、挿入部位は、少なくとも一方（好ましくは両方）のＲＬ１遺伝子座にあり、そして最も好ましくはＨＳＶゲノムＤＮＡのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の少なくとも一方（好ましくは両方）の中に挿入される。挿入が、２つの反復領域、ＲＬ１遺伝子座またはＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の各々の同一のまたは実質的に類似の位で起こることが好ましい。
【００２７】
挿入は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞へのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのトランスフェクションに際して、コードされるＩＮＧ４ポリペプチドを発現可能な非神経毒性突然変異体である修飾ウイルスを産生するようなものであってもよい。非神経毒性突然変異体は、ＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体であってもよい。
【００２８】
核酸カセットは、任意のサイズ、例えば長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｋｂｐまでであってもよい。
本発明記載のＨＳＶは、疾患の医学的治療、より詳細には癌性状態の治療に使用するために提供される。本発明記載のＨＳＶをこうした治療の必要がある個体に、例えば治療上有効な量で投与する工程を含む、癌性状態の治療法を提供する。また、癌性状態の治療用の薬剤の製造において使用するためにもまた、本発明記載のＨＳＶを提供する。腫瘍の治療、例えば腫瘍の腫瘍退縮治療で使用するためにもまた、本発明記載のＨＳＶを提供する。
【００２９】
本発明記載の単純ヘルペスウイルスを含む、薬剤、薬学的組成物またはワクチンもまた提供し、これらは、本発明記載のＨＳＶを、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と一緒に含んでもよい。
【００３０】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶの任意の実験室株または臨床単離体（非実験室株）を含む、任意のＨＳＶに由来してもよい。好ましくは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の突然変異体である。あるいは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の種間（ｉｎｔｅｒｔｙｐｉｃ）組換え体であってもよい。突然変異体は、実験室株ＨＳＶ−１ １７株、ＨＳＶ−１ Ｆ株またはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つのものであってもよい。突然変異体は、非実験室株ＪＳ−１のものであってもよい。好ましくは、突然変異体は、ＨＳＶ−１ １７株の突然変異体である。単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｒ３６１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｇ２０７、ＨＳＶ−１突然変異体ＮＶ１０２０の１つのさらなる突然変異体であってもよい。好ましくは、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６の１つのさらなる突然変異体である。
【００３１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの「遺伝子送達」法で本発明の単純ヘルペスウイルスを用いてもよい。本発明の非神経毒性単純ヘルペスウイルスは発現ベクターであり、そして抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは単純ヘルペスウイルスゲノムにコードされるＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチド（ＩＮＧ４）を発現するため、選択された細胞または組織を感染させるのに使用可能である。
【００３２】
１つの配置において、本発明の単純ヘルペスウイルスに感染した患者、ドナー、または任意の他の供給源から、細胞を採取してもよく、場合によって、コードされるＩＮＧ４の発現および／または機能に関してスクリーニングし、そして場合によって患者の体内に、例えば注射によって戻しても／導入してもよい。
【００３３】
裸のウイルスを用いて、あるいはキャリアー、例えばナノ粒子、リポソームまたは他の小胞にウイルスを被包することによって、選択された細胞への本発明の単純ヘルペスウイルスの送達を実行してもよい。
【００３４】
本発明のウイルスで形質転換されたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞、好ましくはヒトまたは哺乳動物細胞、ならびに好ましくはＩＮＧ４ポリペプチドを発現している細胞、ならびに前記ウイルスを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこうした細胞を形質転換する方法は、本発明のさらなる側面を形成する。
【００３５】
ＨＳＶゲノムは、さらなる突然変異および／または異種ヌクレオチド配列を含有してもよい。さらなる突然変異には、無能化突然変異が含まれてもよく、こうした突然変異は、ウイルスの毒性または複製能に影響を及ぼしてもよい。例えば、突然変異は、ＩＣＰ６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７の任意の１以上で作製されてもよい。好ましくは、これらの遺伝子の１つ（場合によって、適切な場合、遺伝子の両コピー）における突然変異は、対応する機能ポリペプチドをＨＳＶが発現するのを不能にする（またはその能力を減少させる）。例えば、ＨＳＶゲノムのさらなる突然変異は、ヌクレオチドの付加、欠失、挿入または置換によって達成可能である。
【００３６】
癌性状態は、任意の望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖によって自然に現れる任意の疾患）、新生物または腫瘍、あるいは望ましくない細胞増殖、新生物または腫瘍のリスクまたはこれらに対する素因の増加であってもよい。癌性状態は、癌であってもよいし、そして良性または悪性癌であってもよいし、そして原発性または続発性（転移性）であってもよい。新生物または腫瘍は、細胞のいかなる異常な成長または増殖であってもよいし、そしていかなる組織に位置してもよい。組織の例には、結腸、膵臓、肺、乳房、子宮、胃、腎臓、精巣、中枢神経系（脳を含む）、末梢神経系、皮膚、血液またはリンパが含まれる。
【００３７】
治療可能な癌／腫瘍タイプは、原発性または続発性（転移性）腫瘍であってもよい。治療すべき腫瘍は、中枢または末梢神経系に由来する神経系腫瘍、例えばグリオーマ、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫および乏突起膠腫であってもよいし、あるいは非神経系組織に由来する非神経系腫瘍、例えば黒色腫、中皮腫、リンパ腫、肝癌、類表皮癌、前立腺癌、乳癌細胞、肺癌細胞または結腸癌細胞であってもよい。本発明のＨＳＶ突然変異体を用いて、非神経系組織に由来する中枢または末梢神経系の転移性腫瘍を治療してもよい。例えば、本発明によって治療可能な癌性状態には、扁平上皮癌、卵巣腫瘍／癌、肝細胞癌、および乳腺癌が含まれる。
【００３８】
本明細書において、非神経毒性は、動物、例えばマウス、またはヒト患者におけるＬＤ５０が≧１０６ｐｆｕのおよその範囲であるように、致死的脳炎を引き起こすことなく、動物または患者に高力価のウイルス（およそ１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ））を導入する能力によって定義される。
【００３９】
治療しようとする患者は、任意の動物またはヒトであってもよい。患者は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒト患者である。患者は男性または女性であってもよい。
【００４０】
本発明はまた、細胞に本発明の単純ヘルペスウイルスを投与する工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を溶解するかまたは殺傷する方法も提供する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＩＮＧ４ポリペプチドを発現する方法であって、本発明の単純ヘルペスウイルスに、関心対象の少なくとも１つの細胞または組織を感染させる工程を含む、前記方法も提供する。
【００４１】
さらなる側面において、本発明は、細胞に、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において、単純ヘルペスウイルスの複製効率を増加させるｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
【００４２】
複製増加は、細胞によって産生されるビリオン量の増加、例えばＨＳＶ収量の増加であってもよい。ＨＳＶ複製効率の増加は、対照に比較したもの、例えば野生型レベルでＩＮＧ４を発現する細胞に比較したものであってもよい。細胞に、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる、例えばそのように細胞を刺激する工程は、例えば対照に比較して、細胞におけるＩＮＧ４ポリペプチド濃度の増加を引き起こしそして／または達成する工程を含んでもよい。例えば、方法は、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸の発現を増加させる工程を含んでもよい。これは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を細胞内に導入することによって達成可能であり、例えば、異種という用語は、構築物が通常、野生型細胞に存在しないことを意味する。ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＩＮＧ４ポリペプチドの転写を調節する際に役割を果たす制御ヌクレオチド配列に、機能可能であるように連結されてもよい。ＩＮＧ４をコードする核酸の発現は恒常性であってもよい。
【００４３】
ＨＳＶに感染した細胞におけるＩＮＧ４の存在（該細胞種に通常存在するＩＮＧ４の内因性レベルより高いレベル）は、ＨＳＶの複製効率増加を導きうる。これは、感染細胞（単数または複数）からのＨＳＶビリオンのより高い収量を生じうる。複製効率は、ＨＳＶに感染し、そして過剰なＩＮＧ４（すなわち内因性発現のために通常存在するものに付加されたＩＮＧ４）が存在する細胞によって産生されるビリオンの数を、同じＨＳＶに感染しているが過剰なＩＮＧ４が存在しない対照細胞と比較することによって、複製効率を測定可能であり、すなわち対照細胞は、同じＨＳＶに感染しているが通常の内因性レベルより高いＩＮＧ４ポリペプチドを産生しない。場合によって、ＩＮＧ４が存在する細胞および存在しない細胞に関して、感染ＨＳＶのｐｆｕあたりに産生されるＨＳＶビリオンの数に関する値を決定してもよい。過剰なＩＮＧ４が存在する細胞が、対照に比較して、産生されるＨＳＶビリオン量の増加、好ましくは統計的に有意な増加を示す場合、複製効率の増加が存在する。複製効率の増加は、対照のものの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００（またはそれ以上）倍であるビリオン産生レベルを導きうる。
【００４４】
細胞は、ＨＳＶに感染可能な任意の細胞であってもよいが、好ましくは腫瘍細胞、例えばＨＳＶによって溶解されることが可能な腫瘍細胞、例えば扁平上皮癌、卵巣腫瘍、ヒト乳腺癌、卵巣癌および肝細胞癌である。
【００４５】
さらなる側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞であって、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を含む前記細胞を提供する。ＩＮＧ４をコードする核酸の発現は、恒常性であってもよい。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者に非神経毒性単純ヘルペスウイルスを投与する工程を含む療法において使用するための、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者にＩＮＧ４をコードする核酸を投与する工程を含む療法において使用するための、非神経毒性単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００４７】
さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者に非神経毒性単純ヘルペスウイルスを投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸の使用を提供する。さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者にＩＮＧ４をコードする核酸を投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、非神経毒性単純ヘルペスウイルスの使用を提供する。
【００４８】
さらなる側面において、本発明は、非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する工程を含む、患者を治療する方法を提供する。
【００４９】
治療の必要がある患者は、癌性状態を持つ患者であってもよい。治療は癌および／または腫瘍の治療であってもよい。
治療法で使用するためのＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を、ベクター中で提供してもよい。ベクターは遺伝子治療ベクターであってもよく、例えば投与に際して患者の細胞に進入してもよい。例えば、ベクターはウイルスベクターであってもよく、例えば非腫瘍退縮性ＨＳＶであってもよい。
【００５０】
さらなる側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルス、ならびにＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸および／またはＩＮＧ４ポリペプチドを含む組成物を提供する。組成物は、例えば、非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む薬学的組成物であってもよい。
【００５１】
本発明者らは、細胞への過剰なＩＮＧ４ポリペプチドの導入（すなわち細胞によって通常発現されるものを超えるさらなるＩＮＧ４）が、野生型および突然変異体ＨＳＶの発現レベル増加につながることを示してきた。したがって、本発明は、（ｉ）過剰なＩＮＧ４を有する単数または複数の細胞を提供し、そして（ｉｉ）細胞（単数または複数）を感染させることが可能なＨＳＶと細胞（単数または複数）を接触させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＨＳＶを複製する方法を提供する。感染細胞における複製を通じたＨＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のため、このアプローチは、ＨＳＶ複製の有意な改善を導き、そしてより高いウイルス力価が得られることを可能にしうる。該方法は、細胞（単数または複数）に、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程を含んでもよい。これは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を、細胞（単数または複数）内に導入する工程を含んでもよい。
【００５２】
細胞に、細胞内にトランスフェクションされたベクターからＩＮＧ４を発現させる、例えば発現ベクターから組換えＩＮＧ４を発現させることによって、細胞に過剰なＩＮＧ４を導入してもよい。ベクターは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４などのＨＳＶであってもよいが、また、任意の適切な発現ベクター、例えばプラスミドベクターであってもよい。さらにまたはあるいは、例えば対応するプロモーターの制御または増進を通じて、細胞に、内因性ＩＮＧ４を過剰発現させてもよい。さらにまたはあるいは、細胞をＩＮＧ４ポリペプチドと接触させてもよく、該ＩＮＧ４ポリペプチドは、例えばＩＮＧ４をコードする発現ベクターでトランスフェクションされた細菌の発酵を通じて、組換えＩＮＧ４として得られてもよい。
【００５３】
したがって、本発明のさらなる側面は、ＩＮＧ４ポリペプチドと細胞を接触させる工程を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において単純ヘルペスウイルスを複製する方法を提供する。さらなる側面において、本発明は、ＩＮＧ４をコードする核酸ベクターと細胞を接触させ、そして細胞にＩＮＧ４を発現させる工程を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において単純ヘルペスウイルスを複製する方法を提供する。
【００５４】
上記にしたがって、さらにさらなる側面において、（ｉ）単数または複数の細胞に過剰なＩＮＧ４を提供し、（ｉｉ）細胞（単数または複数）をＨＳＶに感染させ、（ｉｉｉ）細胞（単数または複数）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、そして（ｉｖ）細胞（単数または複数）からウイルス子孫を採取する工程を含む、ＨＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ複製のための方法を提供する。
【００５５】
ＨＳＶは、本明細書に記載するような任意のＨＳＶであってもよい。
細胞は、ＨＳＶによる感染が可能であり、そしてＨＳＶが該細胞中で複製可能である、任意の細胞であってもよい。これらはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞であってもよい。これらはヒトまたは非ヒト細胞であってもよい。例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類（げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）中の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類あるいは他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物細胞；および／またはヒト細胞由来であってもよい。
【００５６】
本発明のさらなる側面において、本発明は、寄託番号・・・のもとに、ブダペスト条約にしたがってＥＣＡＣＣに寄託されている、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を提供する。
ＩＮＧ４
本明細書におけるＩＮＧ４に対する言及には、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において、寄託番号ＮＭ＿０１６１６２ ＧＩ：３８２０１６６９のもとに記載されるアミノ酸配列を有するＩＮＧ４ポリペプチドに対する言及が含まれる。ＩＮＧ４に対する言及にはまた、ＩＮＧ４のアイソフォーム、相同体および誘導体に対する言及も含まれる。誘導体は、個体間またはファミリーメンバー間に存在しうる天然変異体または多型を含んでもよい。Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中に寄託されるＩＮＧ４ポリペプチドの多くの相同体がある。例えば、データベースのＢｌａｓｔ検索は、およそ１００の相同体を同定した。相同体には、例えば、ＢＣ００７７８１などの他のヒトＩＮＧ４アイソフォーム、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩＮＧ４（例えば、ＮＰ＿５７９９２３．１）、イヌ（Ｃａｎｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＩＮＧ４（ＸＰ＿５３４９０７．２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿００１０７３３５６．１）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＩＮＧ４（ＸＰ＿００１１６９０９１．１）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）（ＸＰ＿００１４９６６１７．１）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ＩＮＧ４（ＮＰ＿００１００６２４１．１）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（ＸＰ＿００１１１８２７０．１）、オオカンガルー（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（ＸＰ＿００１３６５０１６．１）、ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）（ＮＰ＿００１０３０４６６．１）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）（ＮＰ＿００１０１８３０４．１）、アフリカツメガエル（Ｘｏｎｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（ＮＰ＿００１０８８２２４．１）が含まれる。本発明が関連するＩＮＧ４ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくはヒトＩＮＧ４である。
【００５７】
すべてのこうした相同体および誘導体が、本発明の範囲内に含まれる。純粋に例として、こうした多型中に見られてもよい保存的置換は、以下の群内のアミノ酸間であってもよい：
（ｉ）アラニン、セリン、スレオニン；
（ｉｉ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；
（ｉｉｉ）アルギニンおよびロイシン；
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミン；
（ｖ）イソロイシン、ロイシンおよびバリン；
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００５８】
特に、寄託番号ＮＭ＿０１６１６２ ＧＴ：３８２０１６６９のもとに示されるＩＮＧ４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の１つの配列同一性を有するペプチドおよびポリペプチドが、本明細書の目的のためのＩＮＧ４ポリペプチドとして含まれる。これらのＩＮＧ４ポリペプチドの任意の１つをコードする核酸配列を、本発明にしたがったＩＮＧ４発現の目的のために用いてもよい。
【００５９】
高ストリンジェンシー条件下で、配列番号４または配列番号５の核酸にハイブリダイズする能力によって、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を選択してもよい。
ＩＮＧ４ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドであってもよい。特に、ＩＮＧ４ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株に感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株の複製効率の増加を導くポリペプチドであってもよい。
【００６０】
例えば、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞におけるＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列の発現増加は、単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導く。上述のように、複製効率の増加、例えばより高い複製効率は、例えば、細胞がより多数の子孫ビリオンを産生する、例えば細胞由来のＨＳＶ粒子の収量がより大きいことを意味する。複製効率の増加は、対照に比較してであってもよく、例えば、内因性レベルを発現するか、またはＩＮＧ４を発現しない細胞に比較してであってもよい。例えば、ＨＳＶゲノムがＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む場合、ＨＳＶ複製効率の増加は、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含まない、対応するＨＳＶに感染した同じ細胞に比較してであってもよい。
【００６１】
ＨＳＶは、１７株または１７１６株であってもよい。好ましくは、複製効率の増加は統計的に有意であり、例えばスチューデントｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて決定した際、例えばｐ＜０．０５である。
【００６２】
発現増加は：ＢＨＫ、Ａ４３１ヒト扁平上皮癌、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌からなる群より選択される細胞株における発現の増加であってもよい。実施例２の実験は、複製効率を比較するのに適した方法を示す。例えば、腫瘍細胞を、１０００ｐｆｕで７２時間感染させてもよい。
【００６３】
ＩＮＧ４ヌクレオチド配列は、全長転写物またはポリペプチドをコードしてもよい（すなわち完全ＩＮＧ４タンパク質コード配列を含んでもよい）。あるいは、ポリペプチド産物がＩＮＧ４活性、例えば増加したＨＳＶ複製効率を保持するという条件で、ＩＮＧ４ヌクレオチド配列は、全長転写物の断片または一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ポリペプチドをそれぞれコードする、全長配列の１以上の断片を含んでもよい。
【００６４】
断片は、対応する全長配列の少なくとも１０％をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、より好ましくは、対応する全長配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％を含む。好ましくは、断片は、少なくとも２０ヌクレオチドを含み、すなわちこうした最小の長さを有し、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ヌクレオチドを含む。断片は、２０ヌクレオチドの最大の長さを有してもよく、すなわちこれより長くなくてもよく、より好ましくは、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ヌクレオチドより長くなくてもよい。断片長は、前記の最小および最大の長さの間のいずれかであってもよい。
【００６５】
１つの好ましい配置において、単純ヘルペスウイルスは、ＰＯ Ｂｏｘ １７１６， Ｇｌａｓｇｏｗ， Ｇ５１ ４ＷＦ， 英国に住所を有するＣｒｕｓａｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名のもとに、ブダペスト条約の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に寄託されるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４である。
【００６６】
ＮＣＢＩデータベースの寄託番号ＮＭ＿０１６１６２．２ ＧＩ：３８２０１６６９のもとに示されるようなヒトＩＮＧ４のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号３および配列番号４として、以下にコピーされる。
【００６７】
アミノ酸配列：
【００６８】
【化１】
【００６９】
ヌクレオチド配列：
【００７０】
【化２−１】
【００７１】
【化２−２】
【００７２】
【化２−３】
【００７３】
【化２−４】
【００７４】
ヒトＩＮＧ４（配列番号５）をコードする７４７ｂｐ ｃＤＮＡ配列は、配列番号４中の３８〜７８４位（包括的）の間に見られる。
単純ヘルペスウイルス
本明細書において、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、任意の単純ヘルペスウイルスであってもよい。適切なＨＳＶには、ＨＳＶの任意の実験室株または臨床単離体（非実験室株）が含まれる。好ましくは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２である。あるいは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の種間組換え体であってもよい。ＨＳＶは、実験室株ＨＳＶ−１ １７株、ＨＳＶ−１ Ｆ株またはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つであってもよい。ＨＳＶは、非実験室株ＪＳ−１であってもよい。好ましくは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１ １７株またはその突然変異体である。ＨＳＶは、ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｒ３６１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｇ２０７、ＨＳＶ−１突然変異体ＮＶ１０２０の１つのさらなる突然変異体であってもよい。
【００７５】
本発明のウイルスが由来する親単純ヘルペスウイルスは、任意の種類、例えばＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２であってもよい。１つの好ましい配置において、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株の変異体であり、そして１７株ゲノムＤＮＡの修飾によって得られてもよい。適切な修飾には、単純ヘルペスウイルスゲノムＤＮＡ内への、抗血管形成性ポリペプチドまたは複製効率を増進させるポリペプチドをコードする核酸配列の挿入が含まれる。挿入は、選択された単純ヘルペスウイルスゲノム内への外因性核酸配列の相同組換えによって実行可能である。
【００７６】
本発明の単純ヘルペスウイルスの非神経毒性表現型は、ＲＬ１遺伝子座における核酸配列の挿入の結果であってもよいが、本発明記載の単純ヘルペスウイルスは、非神経毒性親株、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， 英国に、寄託番号Ｖ９２０１２８０３のもとに、ブダペスト条約のもとで寄託されるＨＳＶ１７１６を利用して、そして標準的遺伝子操作技術、例えば相同組換えによって、ゲノムの別の位置に核酸配列を挿入することによって得られうる。この側面において、ＩＮＧ４核酸配列または前記配列を含有するカセットの挿入のために選択される単純ヘルペスウイルスゲノムの位置は、中立の位置であってもよい。
【００７７】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、本発明の単純ヘルペスウイルスが由来した、既知の「親」株の変異体であってもよい。特に好ましい親株は、ＨＳＶ−１ １７株である。他の親株には、ＨＳＶ−１ Ｆ株またはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株、あるいは上述の任意の実験室または非実験室株あるいは他の任意のＨＳＶが含まれてもよい。変異体は、ゲノムが実質的に親のものに似ているＨＳＶを含み、核酸配列を含有し、そして単純ヘルペスウイルスの病原性特性を不能にさせるように導入されてもよい、限定された数の他の修飾、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは１０未満の他の特定の突然変異、例えばリボヌクレオチド還元酵素（ＲＰ）遺伝子、６５Ｋトランス誘導因子（ＴＩＦ）における突然変異、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの複製および選択中に天然に取り込まれうる天然変異から生じる少数の突然変異を含有してもよい。それ以外は、変異体ゲノムは、親株のものであろう。
【００７８】
例えば、いくつかの態様において、単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子中に突然変異を有してもよく、例えばＩＣＰ３４．５およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子は、機能する産物を産生不能であるが、ゲノムは、それ以外は、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のゲノムに実質的に似ていてもよい。他の態様において、単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子中に突然変異を有してもよく、例えばＩＣＰ３４．５およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子は、機能する産物を産生不能であるが、ゲノムは、それ以外は、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のゲノムであってもよい。用語「実質的に似ている」は、単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のゲノムに、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９または９９．９９％同一であることを意味してもよい。
【００７９】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、好ましくは、突然変異体単純ヘルペスウイルスである。突然変異体単純ヘルペスウイルスは、非野生型単純ヘルペスウイルスであり、そして組換え単純ヘルペスウイルスであってもよい。突然変異体単純ヘルペスウイルスは、野生型に比較して修飾を含有するゲノムを含んでもよい。修飾には、少なくとも１つの欠失、挿入、付加または置換が含まれてもよい。
【００８０】
上述のように、単純ヘルペスウイルスは、実験室ＨＳＶ株または非実験室株であってもよい。実験室株は、例えば、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株であってもよい。実験室株は、場合によって、連続継代ＨＳＶ株、例えば少なくとも１００、２００、５００、１０００、または１００００回連続継代されている株であってもよい。非実験室株は、臨床単離体、例えば最近の臨床単離体であってもよい。実験室株は、例えば、最近の臨床単離体ではない。
【００８１】
配列同一性
配列同一性パーセント（％）は、配列を並列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、所定の列挙される配列（配列番号によって言及される）中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。配列同一性は、好ましくは、それぞれの配列の全長に渡って計算される。
【００８２】
並列配列が異なる長さである場合、より短い比較配列の配列同一性を、より長い所定の配列の全長に渡って決定してもよいし、または比較配列が所定の配列より長い場合、比較配列の配列同一性を、より短い所定の配列の全長に渡って決定してもよい。
【００８３】
例えば、所定の配列が１００アミノ酸を含み、そして候補配列が１０アミノ酸を含む場合、候補配列は、所定の配列の全長に対して１０％の最大同一性しか持つことができない。これはさらに、以下の例において例示される：
（Ａ）
所定の配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（１５アミノ酸）
比較配列 ：ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹ（１２アミノ酸）
所定の配列は、例えばＩＮＧ４をコードするもの（例えば配列番号３）であってもよい。
【００８４】
配列同一性％＝より長い所定の配列中のアミノ酸残基総数によって割った、並列後の同一マッチアミノ酸残基数、すなわち（５割る１５）ｘ１００＝３３．３％。
比較配列が所定の配列より長い場合、配列同一性は所定の配列の全長に渡って決定可能である。例えば：
（Ｂ）
所定の配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（１０アミノ酸）
比較配列 ：ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＺＺＹＺＺＺＺＺＺ（２０アミノ酸）
ここでも、所定の配列は、例えばＩＮＧ４をコードするもの（例えば配列番号３）であってもよい。
【００８５】
配列同一性％＝所定の配列中のアミノ酸残基総数によって割った、並列後の同一アミノ酸数、すなわち（５割る１０）ｘ１００＝５０％。
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための並列は、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ １．８２ Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて、当業者に知られる多様な方法で達成可能である。こうしたソフトウェアを用いる場合、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関して、好ましくはデフォルトパラメーターを用いる。ＣｌｕｓｔａｌＷ １．８２のデフォルトパラメーターは：タンパク質ギャップオープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
【００８６】
核酸配列の同一性は、配列を並列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入し、そしてそれぞれの配列の全長に渡って配列同一性を計算する工程を伴う類似の方式で、決定可能である。並列配列が異なる長さである場合、配列同一性は、上記のようにそして実施例（Ａ）および（Ｂ）に例示するように決定可能である。
【００８７】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシー
本発明にしたがって、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることによって、核酸配列を同定してもよい。
【００８８】
相補的核酸配列は、ワトソン−クリック結合相互作用を通じて、互いにハイブリダイズするであろう。１００％相補性でない配列もまたハイブリダイズ可能であるが、ハイブリダイゼーションの強度は、通常、相補性の減少とともに減少する。したがって、ハイブリダイゼーション強度を用いて、互いに結合可能な配列の相補性の度合いを区別することも可能である。
【００８９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能である。
所定の反応のストリンジェンシーは、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度などの要因に応じうる。長いプローブの適切なアニーリングには、一般的に、より高い温度が必要である一方、より短いプローブはより低い温度でアニーリング可能である。プローブおよびハイブリダイズ可能な配列間の望ましい相補性の度合いがより高くなれば、使用可能な相対的温度はより高くなる。その結果、より高い相対的温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向がある一方、より低い温度は、その傾向がより少ないということになる。
【００９０】
例えば：５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト試薬、０．５〜１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび最大５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）の方法にしたがって、ハイブリダイゼーションを実行してもよい。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で、少なくとも６時間行われる。ハイブリダイゼーション後、以下のようにフィルターを洗浄する：（１）２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間；（３）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間；（４）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３０分ごとに溶液を変えながら、４２〜６５℃で２時間。
【００９１】
核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための１つの一般的な式は、融点Ｔｍを計算することである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｎ
式中、ｎはオリゴヌクレオチド中の塩基数である。
【００９２】
上記式の例として、４２％のＧＣ含量および２００塩基の平均プローブサイズとともに［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを用いると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、配列相補性が１％減少するごとに、１〜１．５℃減少する。
【００９３】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、Ｔｍ−１５以上の温度で、ハイブリダイゼーションを実行することを伴いうる。中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍ−２５〜Ｔｍ−１５と見なされうる。低ストリンジェンシーは、Ｔｍ−３５〜Ｔｍ−２５と見なされうる。
【００９４】
したがって、ヌクレオチド配列は、上記等式を用いることによって選択可能な、異なるハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシー条件下で、ターゲット配列にハイブリダイズする能力によって分類可能である。Ｔｍを用いて、ハイブリダイゼーション強度の指標を提供してもよい。
【００９５】
条件のストリンジェンシーに基づいて、配列を区別する概念は、当業者によってよく理解され、そして容易に適用可能である。
９５〜１００％の配列相補性を示す配列は、非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、８５〜９５％の相補性を示す配列は、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、７０〜８５％の相補性を示す配列は、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、６０〜７０％の相補性を示す配列は、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、そして５０〜６０％の相補性を示す配列は、非常に低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能である。
【００９６】
核酸およびポリペプチド
本明細書において、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４または配列番号５、これらの配列のいずれか１つのＲＮＡ転写物、先行する配列のいずれか１つの断片、あるいはこれらの配列または断片のいずれか１つの相補配列に、特定の度合いの配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、任意の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であってもよい。あるいは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸は、高いまたは非常に高いストリンジェンシー条件下で、これらの配列の１つにハイブリダイズするものであってもよい。特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６０％〜１００％の配列同一性であってもよい。より好ましくは、特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性の１つであってもよい。
【００９７】
本明細書において、ＩＮＧ４ポリペプチドは、配列番号３またはこれらの配列の１つの断片に特定の度合いの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってもよい。特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６０％〜１００％の配列同一性であってもよい。より好ましくは、特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性の１つであってもよい。
【００９８】
投与
本発明で使用するためのＨＳＶは、臨床的使用のための薬剤および薬学的組成物としての製剤とされてもよいし、そして薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤またはアジュバントを含んでもよい。組成物は、局所、非経口、全身、静脈内、動脈内、筋内、クモ膜下腔、眼内、腫瘍内、皮下、経口または経皮投与経路用の製剤とされてもよく、これには注射が含まれてもよい。注射可能な製剤は、無菌または等張媒体中の選択される化合物を含んでもよい。薬剤および薬学的組成物は、液体または固体（例えば錠剤）型の製剤とされてもよい。液体製剤は、ヒトまたは動物の体の選択される領域への注射による投与用の製剤とされてもよい。
【００９９】
投与は、好ましくは、「治療上有効な量」で行われ、この量は、個体に利益を示すのに十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療中の疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量に関する決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および開業医に知られる他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第２０版， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【０１００】
あるいは、ターゲティング療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドなどのターゲティング系の使用によって、特定の種類の細胞に対してより特異的に活性剤を送達してもよい。ターゲティングは、多様な理由のために望ましい可能性もあり；例えば剤が許容不能なほど毒性である場合、またはそうでなければ非常に高い投薬量を必要とする場合、またはそうでなければターゲット細胞に進入不能である場合に望ましい可能性もある。
【０１０１】
細胞および組織をターゲティングすることが可能なＨＳＶは、本明細書にその全体が援用される（ＰＣＴ／ＧＢ２００３／０００６０３； ＷＯ ０３／０６８８０９）に記載される。
【０１０２】
治療しようとする状態に応じて、組成物を単独で、あるいは同時にまたは連続してのいずれかで、他の治療と組み合わせて投与してもよい。
本発明には、こうした組み合わせが明らかに許容しえないかまたは明確に回避される場合を除いて、記載される側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
【０１０３】
本発明の側面および態様は、ここで、付随する図に言及して、例として例示されるであろう。さらなる側面および態様が当業者には明らかであろう。この本文に言及されるすべての文書は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
ここで、本発明の原理を例示する態様および実験を付随する図に言及して論じる：
【図１】図１は、肝臓（レーン１）または胎盤（レーン２および３）ｃＤＮＡライブラリーのいずれかから増幅されたＰＣＲ産物を示す１％アガロース／ＴＡＥゲルを示す。ｃ７５０ｂｐ ＩＮＧ４ ｃＤＮＡを矢印で示す。レーンＭ＝２−ｌｏｇ ＤＮＡラダー。
【図２】図２は、１：５００の抗ＩＮＧ４抗体で探査したウェスタンブロットを示す。矢印は、１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染させたＢＨＫ細胞由来の全細胞抽出物に存在する２９ｋＤＡ ＩＮＧ４タンパク質のレーン１および２中の位置を指す。このバンドはまた、０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染した細胞（レーン３および４）でもかすかに可視であるが、偽感染細胞（レーン５）では存在しない。
【図３】ＰＢＳ、ＨＳＶ１７９０またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の腫瘍内注射後の、ＣＰ７０皮下腫瘍移植物を所持する６匹のマウスの群由来の生存データ。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下卵巣腫瘍移植物を持つマウスにおいて腫瘍殺傷を改善する。ＩＮＧ４の発現減少は、グリオーマ進行と関連する。ＩＮＧ４は、血管形成の阻害によって新規増殖を防止する。
【図４】ＰＢＳ、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の腫瘍内注射後の、Ａ４３１皮下腫瘍移植物を所持する６匹のマウスの群由来の腫瘍増殖データ。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下ＳＣＣ腫瘍移植物を持つマウスにおいて腫瘍負荷を減少させる。
【図５】ＰＢＳ、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の腫瘍内注射後の、Ａ４３１皮下腫瘍移植物を所持する６匹のマウスの群由来の生存データ。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下ＳＣＣ腫瘍移植物を持つマウスにおいて腫瘍殺傷を改善する。
【図６】生存中央値。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下ＳＣＣ腫瘍移植物を持つマウスにおいて生存期間を延長する。
【図７】ＰＢＳ、１ｘ１０６ｐｆｕ ＨＳＶ１７１６または１ｘ１０６ｐｆｕ ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の静脈内注射後の、Ａ４３１皮下腫瘍移植物を所持する１０匹のマウスの群由来の腫瘍増殖データ。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明を実行するため、本発明者によって意図される最適な様式の具体的な詳細を、例として以下に示す。本発明が、これらの具体的な詳細に限定されずに実施可能であることが、当業者には明らかであろう。
【０１０６】
腫瘍抑制因子遺伝子、新規増殖阻害剤４を発現するＨＳＶ１７１６変異体
方法および結果
ＩＮＧ４腫瘍抑制因子遺伝子を発現するＨＳＶ１７１６変異体を以下のように構築した。ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／寄託番号ＮＭ＿０１６１６２ ＧＩ：３８２０１６６９のもと）に寄託されるヒトＩＮＧ４配列を用いて、ＩＮＧ４のＰＣＲ増幅用のプライマーを設計した。順方向プライマー
【０１０７】
【化３】
【０１０８】
は、ＩＮＧ４（太字）のＡＴＧ開始コドンでハイブリダイズし、そして翻訳開始部位の上流にＥｃｏＲ１およびＮｏｔ１制限部位（下線）を取り込む。逆方向プライマー
【０１０９】
【化４】
【０１１０】
は、ＩＮＧ４のＴＡＧ停止コドンから３６ヌクレオチド下流（太字のＩＮＧ４配列）にハイブリダイズし、そしてＸｈｏ１およびＸｂａ１部位（下線）を取り込む。ＩＮＧ４をコードするｃ７５０ｂｐ ｃＤＮＡ（配列番号５）は、商業的に入手可能なヒト肝臓および胎盤ｃＤＮＡライブラリーから成功裡に増幅され（図１）、そして胎盤ｃＤＮＡ（レーン２および３）ライブラリーでより強いバンドが得られたため、これをＩＮＧ４クローニングに用いた。
【０１１１】
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター内に連結し、そして配列決定によって、ＮＭ０１６１６２との１００％マッチが確認された。次いで、ＰＣＲ産物を直接ＥｃｏＲ１、その後、Ｘｂａ１で消化し、そして同様に消化した哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ４−ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国ペーズリー）内に連結した。ミニプレップしたＤＮＡのＢａｍＨＩ消化によって陽性クローンを同定し（ヌクレオチド６０８に、内部ＩＮＧ４ ＢａｍＨＩ部位がある）、そして陽性クローンから、ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ消化によって、ＩＮＧ４発現カセット（ＩＮＧ４ ｃＤＮＡを加えたプラスミド由来のＣＭＶ−ＩＥプロモーター）を切除し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて平滑末端化し、そしてＢｇｌＩＩ消化し、平滑末端化し、そしてＣＩＡＰ処理した、相同組換えによるＨＳＶ１７１６変異体の産生に用いたＲＬ１シャトルベクターｐＲＬ１ｄｅｌ／ｇｆｐ内にクローニングした。ＲＬ１ｄｅｌ／ｇｆｐは、ｐＲＬ１−ｄｅｌの修飾型であり、ｇｆｐの発現カセット（ＰＧＫ−ｇｆｐ）を含有する。ＲＬ１−ｄｅｌはプロモーターを含まないクローニングベクターであり、ＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１を生成するのに適している。該ベクターは、以前はＲＬ１遺伝子および隣接配列からなったＨＳＶ−１断片であって、ＲＬ１遺伝子の大部分が除去されて、そしてマルチクローニング配列（ＭＣＳ）で置き換えられた、前記ＨＳＶ−１断片を含有する。ＲＬ１遺伝子座内に挿入しようとする導入遺伝子を、ＲＬ１−ｄｅｌのＭＣＳ内に連結し、そしてＲＬ１隣接配列によって駆動されるＨＳＶ−１ ＤＮＡとの相同組換えの結果、ＩＣＰ３４．５オープンリーディングフレームが同時に欠失され、そして適切な導入遺伝子が取り込まれる。組換えウイルスのプラーク精製を補助するため、緑色蛍光タンパク質遺伝子もまた、ＲＬ１−ｄｅｌのＭＣＳ内に挿入する。
【０１１２】
ＲＬ１−ｄｅｌは、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ ｋ ＤＮＡ断片１２３４５９−１２９４０３を含有し、これにはプラスミドｐＧｅｍ−３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国サザンプトン）のＢａｍＨＩ部位内にクローニングされたＲＬ１遺伝子およびその隣接配列が含まれる。ＲＬ１ ＯＲＦ（１２５２９２−１２５７６９）由来の４７７ｂｐ ＰｆｌＭＩ／ＢｓｔＥＩＩ断片は、ＩＣＰ３４．５遺伝子を不活性化するために取り除かれて、そしてＢｇｌＩＩ、ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩに関するものを含めて、多様な制限酵素を提供するＭＣＳで置き換えられている。
【０１１３】
ＲＬ１−ｄｅｌは、ＷＯ２００５／０４９８４４に記載されている。
ＲＬ１−ｄｅｌ／ｇｆｐを生成するため、ＰＧＫプロモーター／ｇｆｐ遺伝子を含有する１．３ｋｂｐの平滑末端化ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、ベクターｐＳＮＲＧ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、米国ワシントン州シアトル）から制限消化後にＫｌｅｎｏｗ処理することによって得て、そして制限酵素ＮｒｕＩで切断し、次いで、アルカリホスファターゼ処理したＲＬ１−ｄｅｌベクター内に連結した。
【０１１４】
制限酵素消化によって、ｐＲＬ１−ｄｅｌ／ｇｆｐにおけるＩＮＧ４発現カセットの挿入を確認し、そしてＳｃａＩ消化によってプラスミド５０μｇを直線化し、そしてＧＦＸキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国リトルチャルフォント）を用いてカラム精製した後、ＨＳＶ−１ ＤＮＡと組み合わせて用いて、ＢＨＫ細胞を同時トランスフェクションした。ＲＬ１−ｄｅｌ／ｇｆｐ／ＩＮＧ４およびウイルスＤＮＡ（ｃ１００μｇ）を、２５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２血清不含培地中の２０μｌのリポフェクタミン２０００と混合し、そして５０％集密ＢＨＫ細胞を含有する６０ｍｍプレートに添加した。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地を取り除き、そして細胞を正確に４分間、２５％ＤＭＳＯで刺激した。５ｍｌ培地で３回洗浄した後、細胞を５ｍｌのＢＨＫ培地とともに３７℃に戻し、そして７２時間放置した。次いで、細胞を上清内に掻き取り、混合物を超音波槽中で２分間超音波処理し、そして必要になるまで、−７０℃で保存した。次いで、６０ｍｍプレート中、Ｖｅｒｏ細胞上に連続希釈をプレーティングし、個々の緑色蛍光プラークを摘み取り、１ｍｌ培地に添加し、そして超音波槽中で２分間超音波処理した後、連続希釈を再び、Ｖｅｒｏ細胞上にプレーティングした。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４のストックを産生する前に、プラーク精製を６回反復した。プラスミドｐＧＥＭ３４．５由来のＡｌｕＩ／ＲｓａＩ ＩＣＰ３４．５断片を用いたサザンブロッティング、およびＨＳＶ１７１６のＩＣＰ３４．５欠失領域に渡って増幅するプライマーを用いたＰＣＲの両方によって、ＨＳＶ１７１６のＲＬ１遺伝子座中のＩＮＧ発現カセットの存在を確認した。挿入されたＩＮＧ４導入遺伝子の発現を確認するため、６０ｍｍプレート中のＢＨＫ細胞の集密単層を、０．１または１ｐｆｕ／細胞いずれかのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染させ、そして２４時間後、０．２ｍｌのＳＤＳ ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって、全細胞抽出物を調製した。ＩＮＧ４抗体（Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングによって、１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染した細胞において、ｃ２９ｋＤａタンパク質が同定された（図２、レーン１および２）。０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染した細胞において、より弱いバンドが観察され（図２；レーン３および４）、そしてこのタンパク質は、偽感染細胞では存在しなかった（図２、レーン５）。
【実施例】
【０１１５】
実施例１−ｉｎ ｖｉｖｏ実験
皮下腫瘍移植物を所持するヌードマウスの腫瘍内注射
最初の実験において、ＣＰ７０卵巣腫瘍細胞株の皮下移植物を所持する６匹のマウスに、第１日および第３日に、１ｘ１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を腫瘍内注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日監視した。対照マウスには、ＨＳＶ１７９０、酵素、ニトロ還元酵素を発現するＨＳＶ１７１６変異体のいずれかを注射するか、あるいは同様の体積のＰＢＳを注射した。生存データを図３に示す。
【０１１６】
ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置した６匹のマウスのうち、１つの腫瘍が完全退縮を示し、４つの腫瘍が未処置腫瘍よりも緩慢な速度で増殖し、そして１つの腫瘍は潰瘍化し、そして該マウスは分析から取り除かれた。各処置を評価するため、生存期間（腫瘍が許容されうる上限に達した時点によって測定されるようなもの）を用いると、それぞれ１１日または１８日の生存期間を有した、ウイルスなしで処置した動物またはＨＳＶ１７９０で処置した動物に比較すると、ＩＮＧ４ウイルスで処置した動物は、２３．５日の平均生存を有した。図３に示す生存曲線の対数順位比較は、有意な相違を示し、ｐ値は０．０３であった。ＨＳＶ１７９０に感染したマウスにはＣＢ１９５４はまったく投与されず、そしてこれらの状況下では、このウイルスがＨＳＶ１７１６と同等であることに注目されたい。
【０１１７】
続く実験において、ヒトＳＣＣ Ａ４３１腫瘍細胞の皮下移植物を所持する６匹のマウス群に、１ｘ１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６のいずれか、あるいは同等の体積のＰＢＳを、第１日および第３日に注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日決定した。
【０１１８】
図４は、平均腫瘍体積を示し、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置した群が、ウイルスなしで処置したか、または親ＨＳＶ１７１６で処置した群のいずれよりも小さい平均腫瘍体積を有したことを示す。第１５日でのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６間、ならびにＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびウイルスなしの間の腫瘍体積相違は有意に異なり、それぞれｐ＝０．０３およびｐ＝０．００７であることが、統計分析によって示された。
【０１１９】
図５は、ウイルスなし、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置した腫瘍所持マウスに関するＫＭ生存グラフを示す。ウイルスなしで処置したマウスは、８日間の生存中央値を有し、ＨＳＶ１７１６で処置したものは、１２日の生存中央値を有し、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置したものは、２１日の生存中央値を有した。対数順位分析による図５の曲線の比較は、これらの間の相違が、ｐ＝０．００４で有意であることを示し、したがってこの腫瘍モデルにおいて、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が腫瘍負荷を有意に減少させ、そして生存を増進させることを明らかに立証する。
【０１２０】
静脈内注射
皮下ヒトＳＣＣ Ａ４３１腫瘍を所持する１０匹のマウスの群に、第１日および第３日に、ＰＢＳ（ウイルスなし）、あるいは１ｘ１０６ｐｆｕのＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を静脈内注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日監視した。静脈内注射後、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ウイルスなしの対照または非修飾ＨＳＶ１７１６に比較して、腫瘍増殖を有意に減少させた（図６）。注射１０日後、ＨＳＶ１７１６注射マウスの平均腫瘍体積は、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４注射マウスの１９３±１５２ｍｍ２に比較して、４２１±５５ｍｍ２であり、そしてスチューデントｔ検定を用いると、この相違は、ｐ＝０．００２２で非常に有意である。同様に、第１４日または２０日、ＨＳＶ１７１６注射マウスの平均腫瘍体積は、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスの、それぞれ４７６±４４８ｍｍ２または７７６±４３８ｍｍ２に対して、それぞれ１０９６±４０２ｍｍ２または１２５３±１５５ｍｍ２であり、そしてスチューデントｔ検定を用いると、これらの相違は、それぞれｐ＝０．０１２５または０．０１６２で、どちらも有意である。ウイルスを投与されないか、または１ｘ１０６ｐｆｕのＨＳＶ１７１６を投与されたマウスは、およそ１４日の生存中央値を有し、一方、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスは１７日の生存中央値を有し、４／１０のマウスが第２０日を超えて生存し、この時点では、ＰＢＳまたはＨＳＶ１７１６を注射されたすべてのマウスは屠殺されていた。マウス群各々からいくつかの腫瘍を屠殺時点で取り除き、そして機械的にホモジナイズした後、腫瘍抽出物中のウイルスを力価決定し、結果を表１に示した。
【０１２１】
ウイルスは、静脈内ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスから採取した３つの腫瘍すべてから容易に抽出されたが、ＨＳＶ１７１６を投与されたマウスの１／３でしか検出されず、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４腫瘍で検出されるウイルスの量は、ＨＳＶ１７１６腫瘍から抽出された量よりもおよそ１０００倍多く、腫瘍内ではＨＳＶ１７１６よりもＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の複製がより優れていることが示唆された。先の研究は、免疫適格性ラットにおけるものであるが、投与２４時間後、０．００１％の静脈内注射ウイルスのみが、腫瘍中に留まることを示しており（Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒｈｏｕｔら １９９８、２０００）、そしてこれがＳＣＩＤマウスに関して合理的な近似値を提供すると仮定すると、静脈内投与された２ｘ１０６ｐｆｕのうち、最初には、２０ｐｆｕのみが腫瘍に到達するであろう。ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４間で、生体分布の相違がないと仮定すると、上記データは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、ＨＳＶ１７１６よりもヒトＡ４３１ ＳＣＣ腫瘍移植物内での複製が有意に優れており、そしてこの増進された増殖が生存を改善することを立証する。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４マウスの１匹は、第３０日まで生存し、この時点までに、腫瘍は増殖を停止し、そしてほぼ完全に退縮した。このマウスを屠殺した後、残った腫瘍組織を含めてすべての臓器を採取し、そして機械的ホモジナイズおよび力価決定後、これらの組織のいずれにもウイルスはまったく見られず、このマウスにおける完全な回復およびウイルスクリアランスが示唆された。実際、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスのいずれにもウイルス毒性の証拠はまったくなく、ウイルスが親ＨＳＶ１７１６の制限された複製適格性を保持し、その増殖が活発に分裂中の腫瘍細胞に限定されることが示された。
【０１２２】
実施例２−ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
異なる細胞株上でのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の増殖
上記ｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、非修飾ＨＳＶ１７１６より高い効率で複製することによって、増進された腫瘍退縮を示すことを示唆し、そして低い感染多重度で感染した多様な異なる細胞株を用いて、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。用いた細胞株は、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、Ａ４３１ヒトＳＣＣ、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌であり、そしてこれらの株におけるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の増殖を、野生型ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲ（ＩＮＧ４とほぼ同じ分子量のターゲティング部分を発現するＥＧＦＲターゲティング化ＨＳＶ１７１６変異体）と比較した。
【０１２３】
細胞を６０ｍｍプレートにプレーティングし、そして２４時間後、およそ１００ｐｆｕ（ＢＨＫのみ）または１０００ｐｆｕ（すべての他の細胞種）のＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。これらの感染に関する各ウイルス調製の希釈をＢＨＫ細胞上で力価決定して、投入ウイルスの量を正確に確認した。各細胞種上の各ウイルス感染を少なくとも４つ組で実行した。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。以下の表２〜８に、ＡＮＯＶＡを用いて行った統計的比較とともに、結果を収量／投入ビリオンで報告する。
【０１２４】
ＢＨＫ細胞に関しては、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する高いウイルス収量／投入ビリオンは非常に類似であり、これらの３つのウイルスが、この細胞種において類似の複製効率を有し、そして投入ビリオンあたりおよそ５ｘ１０６ウイルスに同等である収量は、おそらくこの実験において、ＢＨＫ細胞の１００ｐｆｕ感染から達成可能な最大産出量であろうことが示される。ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関しては、収量／投入ウイルスは、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関してよりもおよそ１０倍少なく、これはこの実験において、このウイルスがＢＨＫ細胞におけるよりより効率的に複製しないことを示唆する。表２を参照されたい。
【０１２５】
Ｖｅｒｏ細胞において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンは少なくとも２倍増加する。表３を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と比較すると、これらの相違が有意であることが示された。表３におけるデータのＡＮＯＶＡ分析によって、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較したＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５またはｐ＜０．００１の有意なｐ値が生じ、そしてこれらの値はすべて９５％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４中のＩＮＧ４発現カセットの存在が、この細胞種においてウイルス複製を改善すると結論づけ可能である。
【０１２６】
別個の実験において、５ｘ１０５ Ｖｅｒｏ細胞を６０ｍｍプレートにプレーティングし、そして１ｐｆｕ／細胞の感染多重度で、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに２つ組で感染させる前に、６時間付着させた。正確に２４時間培養した後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関しては、ウイルス収量／感染細胞は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関するウイルス収量／感染細胞のおよそ２倍であった。１ｐｆｕ投入／細胞では、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋の５０／７０、ＨＳＶ１７１６の８０／８８またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの５０／７０に比較して、１４０／２５０のビリオン／感染細胞を生じた。したがって、Ｖｅｒｏ細胞における２４時間の感染中（ウイルス複製の１周期と同等）、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製するはずである。
【０１２７】
ヒト卵巣癌細胞株Ｏｖｃａｒ３細胞に関しては、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンは２〜４倍増加する。表４を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と比較すると、相違が有用であることが示される。表４のデータをＡＮＯＶＡ分析すると、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの各々に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、すべてｐ＜０．００１のｐ値が生じ、そしてこれらはすべて非常に有意であり、９９．９％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、この細胞種においてより効率的に複製するはずである。
【０１２８】
ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１に関しては、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりもより効率的に複製し、ＨＳＶ１７１６に比較して収量／投入ビリオンは１００倍増加し、そしてＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して１０倍増加する。表５を参照されたい。ＡＮＯＶＡによって、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲいずれかに関する収量／投入ビリオンと統計的に比較すると、両方に関してｐ＜０．０５のｐ値が生じ、相違が有意であり、９５％信頼限界より高いことが示され、これは親ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６変異体ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、この細胞種においてより効率的に複製するはずであることを示す。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する平均収量／投入ビリオンは、野生型ＨＳＶ−１ １７＋に関する平均収量／投入ビリオンよりも高いが、相違は有意ではない（ｐ＞０．０５）。しかし、ＨＳＶ−１ １７＋はＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりも高い平均収量／投入ビリオンを有するが、これらの相違のいずれも有意ではない（どちらもｐ＞０．０５）。同様に、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する平均収量／投入ビリオンは、ＨＳＶ １７１６に関する平均収量／投入ビリオンよりも高いが、相違は有意ではない（ｐ＞０．０５）。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ−１ １７＋に関する収量／投入ビリオンを、より厳密でないスチューデントｔ検定を用いて比較すると、相違はｐ＝０．００４で有意であり、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４がＨＳＶ−１ １７＋よりもＡ４３１細胞においてより効率的に複製することが示唆される。
【０１２９】
ヒト乳腺癌細胞において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンがおよそ１０倍増加する。表６を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と比較すると、相違が有意であることが示される。表６のデータのＡＮＯＶＡ分析によって、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの各々に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、すべてｐ＜０．００１の有意なｐ値が生じ、そしてこれらは非常に有意であり、９９．９％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、この細胞株においてより効率的に複製することが示される。
【０１３０】
ヒト卵巣癌細胞株ＣＰ７０に関して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりもより効率的に複製し、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して収量／投入ビリオンは３倍増加する。表７を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲいずれかに関する収量／投入ビリオンと、ＡＮＯＶＡによって統計的に比較すると、両方に関してｐ＜０．０１のｐ値が生じ、相違は有意であり、９９％信頼限界より高いことが示され、これは、親ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６変異体ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、この細胞種においてより効率的に複製するはずであることを示す。ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオン間に、有意な相違はなかった（ｐ＜０．０５）。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する平均収量／投入ビリオンは、野生型ＨＳＶ−１ １７＋に関する平均収量／投入ビリオンとは有意には異ならなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、ＨＳＶ−１ １７＋はＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりもより効率的に複製し、そしてこれらの相違は有意であり（ｐ＜０．０１）、ＨＳＶ１７１６／ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲは、この細胞種において複製に関して損傷されていることが示される。重要なことに、ＩＮＧ４の発現は、この損傷を克服し、そして複製効率を野生型レベルに回復させる。
【０１３１】
ヒトＨｕＨ７肝細胞癌細胞において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンはおよそ５倍増加する。表８を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と収量／投入ビリオンを比較すると、相違が有意であることが示された。表８中のデータのＡＮＯＶＡ分析によって、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの各々に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、すべてｐ＜０．００１の有意なｐ値が生じ、そしてこれらは非常に有意であり、９９．９％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、この細胞株においてより効率的に複製するはずである。
【０１３２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの弱毒化ＨＳＶ１７１６表現型の特質は、ウイルスがＮＩＨ ３Ｔ６細胞において複製不能であることであり、一方、これらの細胞は、ＨＳＶ−１ １７＋複製に関して完全に許容性である。６０ｍｍプレート中、２つ組で、ＮＩＨ ３Ｔ６細胞を１０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取して、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲで３Ｔ６細胞を感染させた後、ウイルスはまったく検出されず、一方、２つ組の３Ｔ６細胞のＨＳＶ−１ １７＋感染からの収量は、２．０ｘ１０６／３．０ｘ１０６ｐｆｕであった。したがって、ＩＮＧ４発現がＨＳＶ１７１６の複製を増進させる能力は、弱毒化表現型の負担分には到達せず、そして感染細胞内のＩＮＧ４活性は、ＩＣＰ３４．５遺伝子の欠失によって引き起こされる複製制限を克服することは不可能である。
【０１３３】
恒常的にＩＮＧ４を発現するよう操作されたＢＨＫ細胞上での増殖
ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を生成するため、ＩＮＧ４ ｃＤＮＡをまず、哺乳動物発現プラスミドｐＣＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ内にクローニングし、そしてこのベクターを用いて、ＩＮＧ４を恒常的に発現するＢＨＫ細胞株を生成した。２５０μｌの血清不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の１０μｌリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した１００μｇのＩＮＧ４発現ベクターまたは空のｐＣＤＮＡ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミドでＢＨＫ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション７２時間後、細胞をトリプシン処理し、そして１ｍｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する増殖培地を用いてプレーティングした。ゼオシン抗生物質を用いて細胞を２〜３週間選択し、その後、個々のクローンは明らかに可視であった。細胞をトリプシン処理し、そして２４ウェルプレート中の限界希釈によってクローニングした。ＢＨＫ／ＩＮＧ４またはＢＨＫ／ｐＣＤＮＡ４の５クローンを拡大し、そして０．５ｍｇ／ｍｌゼオシンを含有する適切な培地中で維持した。
【０１３４】
ゼオシンを含まない培地中、各クローンを６０ｍｍプレート中にプレーティングし、そして２４時間後、およそ１０ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋またはＨＳＶ１７１６に感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。感染用に調製した各ウイルスの希釈もまた力価決定して、投入ウイルス量を正確に確認し、そして以下の表９および１０に、スチューデントＴ検定を用いて行った統計的比較とともに、収量／投入ビリオンの結果を報告する。
【０１３５】
トランスフェクション／抗生物質選択によって、恒常的にＩＮＧ４を発現するように操作されたＢＨＫ細胞上のＨＳＶ−１ １７＋の増殖は、空のｐＣＤＮＡ．ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを用いて産生されたゼオシン耐性ＢＨＫ細胞上の増殖と比較すると、およそ１０倍より効率的である。スチューデントｔ検定を用いて平均を比較することによって、この相違がｐ＜０．０００１で非常に有意であることが示され、９９．９９％を超える信頼限界で、ＩＮＧ４発現がＢＨＫ細胞におけるＨＳＶ−１ １７＋複製を改善することが示される。
【０１３６】
トランスフェクション／抗生物質選択によって、ＩＮＧ４を恒常的に発現するように操作されたＢＨＫ細胞上のＨＳＶ１７１６の増殖は、空のｐＣＤＮＡ４．ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターでのトランスフェクションによって生成されたゼオシン耐性ＢＨＫ細胞上の増殖と比較すると、およそ１０倍より効率的である。スチューデントｔ検定を用いて平均を比較することによって、この相違がｐ＝０．０２で非常に有意であることが示され、９８％信頼限界で、ＩＮＧ４発現がＢＨＫ細胞におけるＨＳＶ１７１６複製を改善することが示される。
【０１３７】
実施例３−予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
ｉｎ ｖｉｖｏデータによって、非修飾ＨＳＶ１７１６よりも高い効率で、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が複製することが示唆された。これは、最初に、以下に記載するように、低い感染多重度で感染した多様な異なる細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで確認された。これらの実験には、実施例２に記載する実験が続いた。
【０１３８】
用いた細胞株は、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、３Ｔ６、Ａ４３１ヒトＳＣＣ、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡヒト乳癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＵＶＷヒト神経膠芽腫であり、そしてこれらを主に、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。
【０１３９】
実験１．細胞を６０ｍｍプレートにプレーティングし、そして２４時間後、１、１０または１００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてこれらのウイルスの各々がｇｆｐを発現しているため、ＴＣＩＤ法を用いて、各試料中のウイルス量を概算した。結果を以下の表１１〜１４に示す。
【０１４０】
実験１は、３Ｔ６細胞を除くすべての細胞種において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４がＨＳＶ１７１６よりもより効率的に複製し、１、１０および１００ｐｆｕの投入量でウイルスのより高い収量を生じることを明らかに立証する。用いた３つのウイルスはすべて、３Ｔ６細胞において複製できず、これらがＨＳＶ１７１６表現型であることが確認された。
【０１４１】
実験２．細胞を６０ｍｍプレート中にプレーティングし、そして２４時間後、２つ組で、５または２０ｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてこれらのウイルスの各々がｇｆｐを発現しているため、ＴＣＩＤ法を用いて、各試料中のウイルス量を概算した。結果を以下の表１５〜１７に示す。
【０１４２】
再び、実験２は、すべての細胞種において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４がＨＳＶ１７１６よりもより効率的に複製し、５または２０ｐｆｕの投入量で子孫ウイルスのより高い収量を生じることを明らかに立証する。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４増殖の増進は、特にＯｖｃａｒ３およびＡ４３１細胞において、５ｐｆｕウイルスでより顕著であり、ここで、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４収量は、ＨＳＶ１７１６より最大１００倍大きい。
【０１４３】
実験３．上記細胞種の各々をＴ１７５フラスコに植え付け、そしてひとたび集密となったら、細胞をＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。９６時間培養した後、脱離細胞および上清の両方から高速遠心分離によってウイルスを採取し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。フラスコを感染させるのに用いた希釈もまた、ＢＨＫ細胞上で力価決定して、投入ウイルス量を正確に定量化した。各細胞種に関して、ウイルス総量／フラスコ、投入由来の収量％およびＨＳＶ１７１６収量比％に比較した収量比％を表１８に提示する。
【０１４４】
結論
候補腫瘍抑制因子遺伝子ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６変異体は、ＨＳＶ１７１６単独と比較した際、有意に増進された腫瘍増殖阻害、および延長された生存期間を示す。実際、上記実験において直接比較したのではないが、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置したＣＰ７０腫瘍所持マウスの生存期間は、プロドラッグＣＢ１９５４と組み合わせたニトロ還元酵素発現変異体ＨＳＶ１７９０での処置後に得られるものと類似であった。転写を制御する際に関与する多様な複合体のサブユニットとしてのＩＮＧ４の仮定される活性を考慮すると、感染した腫瘍細胞におけるこうした作用様式が、ＨＳＶ１７１６溶解性感染の背景に対して、細胞毒性に対するこうした劇的な効果を有するとは予期されないため、２つのモデルにおける生存期間の増進は予期されず、そして驚くべきことである。したがって、ウイルス自体は、ＩＮＧ４過剰発現から生じるいかなる毒性効果よりも迅速に、分裂中の腫瘍細胞を、効率的に殺す。ＩＮＧ４発現は、感染しているがウイルス腫瘍退縮に耐性である腫瘍細胞を破壊する可能性があるが、いかなる所定の腫瘍中のこれらの細胞の比率もＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で見られる腫瘍破壊増進を説明するのに十分ではないため、これは可能性が低いようである。
【０１４５】
あるいは、感染腫瘍細胞中で発現されるＩＮＧ４は、ＩＬ−６またはＩＬ−８などの抗血管形成剤の放出を生じ、これらは腫瘍内部にある周囲の未感染細胞に局所的に作用して、血管形成を抑制し、腫瘍破壊増進を導きうる。したがって、この仮説によれば、ＩＮＧ４発現は、感染細胞からの局所作用メッセンジャーの放出を刺激し、これが隣接する未感染細胞に作用する結果、血管形成を促進する遺伝子の発現抑制を生じ、腫瘍血管新生の減少および腫瘍破壊の増進を導くであろう。
【０１４６】
さらに、ＣＰ７０ヒト卵巣癌細胞またはＡ４３１ ＳＣＣ移植物のいずれかへのＰＢＳ腫瘍内注射を受けたマウスは、それぞれ１１日または８日の生存中央値を有した。ＨＳＶ１７１６による腫瘍細胞の腫瘍退縮性感染は、これらのモデル両方で、生存中央値を、それぞれ１８日または１２日まで延長した。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を注射すると、生存期間が２３．５日または２１日までさらに延長され、これによって、ＩＮＧ４発現がＨＳＶ１７１６腫瘍退縮強度を有意に増大させることが示された。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の静脈内投与はまた、静脈内注射されたＨＳＶ１７１６に比較して、腫瘍増殖を減少させ、そして生存を延長し、そして屠殺マウスの腫瘍移植物由来のウイルスの抽出および力価決定によって、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４による腫瘍細胞殺傷増進のための潜在的な作用様式が示された。非修飾ＨＳＶ１７１６で処置されたマウスに比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を静脈内注射されたマウスの腫瘍から、少なくとも１０００倍多いウイルスが抽出され、これによって、ＨＳＶ１７１６感染細胞におけるＩＮＧ４の発現は、ウイルス複製の効率を改善して、増大した子孫産生を生じることが示唆される。したがって、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４感染中、ＩＮＧ４タンパク質は、ＨＳＶ１７１６複製のために改善された環境を提供するように、細胞を調整する。その結果、感染した腫瘍細胞あたり、より多くの子孫ビリオンが産生され、そして腫瘍退縮のこの増進は腫瘍細胞数を減少させ、そして生存を促進する。一団の異なる細胞株を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験によって、ＩＮＧ４発現が一団の異なるヒト腫瘍細胞株におけるＨＳＶ１７１６複製の効率を改善することが確認された。
【０１４７】
ＢＨＫ細胞は、この細胞株がウイルス複製の優れた支持体であり、そして常に高い収量が得られるため、野生型ＨＳＶ−１ １７＋およびＨＳＶ１７１６ならびにその変異体の増殖にルーチンで用いられる。ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関しては、６０ｍｍプレートをｃ１００ｐｆｕウイルスに感染させることによって、およそ５ｘ１０８〜１ｘ１０９ｐｆｕが得られ、そしておそらく、これがこの培養形式でのＢＨＫ細胞に関する最大産出量であるため、収量／投入ビリオンにはほとんど相違はなかった。ＨＳＶ−１増殖にはまた、Ｖｅｒｏ細胞も用いてもよいが、この実験では、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンは、ＢＨＫ細胞に関するより低かった。低いｍｏｉでは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、２倍高い効率で複製し、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４のこれらの他のウイルス各々との厳密なＡＮＯＶＡ検定を用いた統計的比較によって、相違が有意であることが示された。ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの間では、収量／投入ビリオンにおいて、有意な相違は検出されなかった。さらに、１回の溶解周期に関して、Ｖｅｒｏ細胞を感染させるのに１ｐｆｕ／細胞のはるかにより高いｍｏｉを用いると、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４はやはり、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、２倍の効率で複製し、ＩＮＧ４発現によって与えられる増殖の利点が、単回溶解周期内で起こることが示された。
【０１４８】
一団のヒト腫瘍細胞株（ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌、ＵＶＷヒト神経膠芽腫およびＡ４３１ ＳＣＣ細胞）を用いた予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲいずれに比較しても、これらの細胞種各々で、複製増進を示した。統計的に意味がある比較を可能にするいくつかの複写物を用いた、続く実験において、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンに比較して有意に増加したＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンが、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌、ＨｕＨ７ヒト肝細胞癌およびＡ４３１ ＳＣＣ細胞において得られ、これらの細胞種において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４産出量は、それぞれ２倍、１０倍、５倍、５倍および１０〜１００倍増進した。有意な相違はまた、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌細胞におけるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ−１ １７＋複製間でも得られたが、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍細胞においてこれらの２つのウイルス間で複製効率の相違はなかった。Ａ４３１ ＳＣＣ細胞に関しては、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４産出量は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、それぞれ１００倍または１０倍、有意に増加し、そしてＡＮＯＶＡを用いると、２倍高いＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４収量／投入ビリオンは、ＨＳＶ−１ １７＋のものと有意には異ならなかったが、スチューデントｔ検定を用いて平均を比較した場合、相違は有意であった。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌細胞に関しては、Ａ４３１細胞において、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンに有意な相違はなかった。したがって、５／５ヒト癌細胞株において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４複製は、親ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６変異体ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲ（類似のサイズのタンパク質ターゲティング部分を発現する）に比較して、有意により効率的であり、そして野生型ＨＳＶ−１ １７＋に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４複製は、これらの株の４／５において改善された。
【０１４９】
さらに、１０ｐｆｕ ＨＳＶ−１ １７＋または１０ｐｆｕ ＨＳＶ１７１６のいずれかに感染した場合、収量／投入ビリオンは、空のｐＣＤＮＡ４ベクターでのトランスフェクションから抗生物質耐性を得たＢＨＫ細胞に比較して、トランスフェクション／抗生物質選択によって、ＩＮＧ４を恒常的に発現するように操作されたＢＨＫ細胞の５つの異なるクローンにおいて、有意に１０倍増進された。ＩＮＧ４を恒常的に発現するこうしたＢＨＫ細胞は、ＨＳＶ１７１６およびその変異体、特にウイルス増殖を制限するＤＮＡ挿入物を含むものの増殖のための改善された支持体を提供しうる。
【０１５０】
ＨＳＶ−１ １７＋／ＨＳＶ１７１６感染中のＩＮＧ４発現は、細胞内のウイルス複製効率を改善するように作用するはずであり、感染細胞あたりの子孫ビリオンのより多い産出量を生じる。重要なことに、ＩＮＧ４による複製効率のこの増進は、動物腫瘍モデルにおいて、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が毒性でなく、そして該ウイルスがＨＳＶ１７１６耐性３Ｔ６細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで複製に失敗するため、ＨＳＶ１７１６表現型を損なわなかった。ＩＮＧ４は、ウイルス遺伝子に直接作用して、発現を改善するか、またはウイルスタンパク質と直接相互作用して、その活性を増進させるか、あるいは細胞遺伝子／タンパク質に作用して、細胞環境がウイルス複製をより受け入れるように、細胞環境を調整しうる。ｉｎ ｖｉｖｏで、このウイルス複製改善は、ＨＳＶ１７１６の腫瘍退縮強度を増大させ、より優れた腫瘍細胞殺傷のために、より多くのウイルスを生じる。さらに、血管形成の抑制などの、腫瘍血管新生の減少につながる、他の認識されるＩＮＧ４の活性もまた、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の腫瘍退縮強度増進に寄与しうる。
【０１５１】
参考文献
【０１５２】
【化５】
【０１５３】
表１．
第１日および第３日に、ＰＢＳあるいは１ｘ１０６ｐｆｕのＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の２回の静脈内注射後、皮下Ａ４３１ ＳＣＣ腫瘍から抽出されたウイルスの量。
【０１５４】
【表１】
【０１５５】
表２． １００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したＢＨＫ細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
表３． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したＶｅｒｏ細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
表４． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト卵巣癌Ｏｖｃａｒ３細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
表５． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したＡ４３１ヒトＳＣＣ細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６２】
【表５】
【０１６３】
表６． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６４】
【表６】
【０１６５】
表７． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト卵巣癌細胞株ＣＰ７０由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６６】
【表７】
【０１６７】
表８． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト肝細胞癌細胞株ＨｕＨ７に関する収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６８】
【表８】
【０１６９】
表９． １００ｐｆｕのＨＳＶ１７＋に感染したＢＨＫ／ＩＮＧ４またはＢＨＫ／ｐＣＤＮＡ４いずれかの５つの異なるクローン由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１７０】
【表９】
【０１７１】
表１０． １００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６に感染したＢＨＫ／ＩＮＧ４またはＢＨＫ／ｐＣＤＮＡ４いずれかの５つの異なるクローン由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１７２】
【表１０】
【０１７３】
表１１． １ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に感染した後の、異なる細胞種由来の総収量
【０１７４】
【表１１】
【０１７５】
表１２． １０ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に感染した後の、異なる細胞種由来の総収量
【０１７６】
【表１２】
【０１７７】
表１３． １００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に感染した後の、異なる細胞種由来の総収量
【０１７８】
【表１３】
【０１７９】
表１４． １、１０または１００ｐｆｕでの感染後の、異なる細胞種各々における収量の比（ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４：ＨＳＶ１７１６）
【０１８０】
【表１４】
【０１８１】
＊ｎ．ｄ．＝ＨＳＶ１７１６に関する収量が０であったため、決定不能。
表１５． ５ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に２つ組で感染した後の、異なる細胞種由来の総ウイルス収量
【０１８２】
【表１５】
【０１８３】
表１６． ２０ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に２つ組で感染した後の、異なる細胞種由来の総ウイルス収量
【０１８４】
【表１６】
【０１８５】
表１７． ５または２０ｐｆｕで感染した後の、異なる細胞種各々におけるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４：ＨＳＶ１７１６の収量比
【０１８６】
【表１７】
【０１８７】
表１８． ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４でのＴ１７５フラスコの感染に関する、産生ウイルス総量／フラスコ、収量％（産出量／投入量）およびＨＳＶ１７１６収量％／細胞種に比較した収量比／細胞種。
【０１８８】
【表１８−１】
【０１８９】
表１８続き
【０１９０】
【表１８−２】
【０１９１】
＊産出ウイルス量／投入ウイルス量
＊＊ＨＳＶ１７１６収量％に比較したウイルス収量％の比
【技術分野】
【０００１】
本発明は、単純ヘルペスウイルス、単純ヘルペスウイルスの複製法、および疾患の治療における単純ヘルペスウイルスの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
新規増殖阻害剤４（ＩＮＧ４）は、候補腫瘍抑制因子タンパク質の新規増殖阻害剤ファミリーのメンバーであり、該タンパク質のうち６つがヒトにおいて報告されている（Ｇａｒｋａｖｓｔｅｖら １９９６）。ＩＮＧ４遺伝子の喪失が、頭部および頸部扁平上皮癌（Ｇｕｎｄｕｚら ２００５）およびグリオーマ（Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら ２００４）において報告されてきており、そしてこのタンパク質に関してはいくつかの異なる機能が記載されてきているが、その正確な作用様式は、まだ解明されていない。
【０００３】
ＩＮＧ遺伝子産物は、細胞増殖を阻害し（Ｒｕｓｓｅｌｌら ２００６、Ｃａｍｐｏｓら ２００４、ＳｈｉおよびＧｏｚａｎｉ ２００５）、そしてその過剰発現は、アポトーシス増加と関連づけられる（Ｎａｇａｓｈｉｍａら ２００１）。ＩＮＧ４による細胞増殖の阻害は、おそらく、ＩＮＧ４がｐ５３およびアセチルトランスフェラーゼｐ３００に結合し、こうしてｐ５３のアセチル化および活性化を促進することによって仲介される（Ｓｈｉｓｅｋｉら ２００３）。ＩＮＧ４は、正常細胞周期進行およびヒストンＨ４アセチル化の大部分に必要とされるＨＢＯ１ ＨＡＴ複合体の構成要素として報告されてきており（Ｄｏｙｏｎら ２００６）、クロマチンリモデリングおよび転写制御における役割が示唆される。ヒト癌発展中にヒストンＨ４アセチル化が広範に喪失することから、ＩＮＧ４が腫瘍抑制因子の役割を果たすことが強く示唆される。ＩＮＧ４は、ＮＦ−κＢのＲｅｌＡサブユニットと相互作用して、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＣｏｘ−２などの血管形成関連遺伝子の発現抑制を生じることが示されてきており（Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら ２００４）、そしてグリオーマにおけるその喪失は、より攻撃的な腫瘍増殖および血管新生と関連づけられる。腫瘍抑制因子遺伝子の喪失は、癌進行の共通の特徴である。多発性骨髄腫細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏのＩＮＧ４抑制は、おそらく、低酸素中の血管形成遺伝子の上方制御に関与する低酸素誘導性因子−１（ＨＩＦ−１）の活性増加を通じて、血管形成促進性ＩＬ−８およびオステオポンチンの発現増加を生じ、そして多発性骨髄腫患者において、ＩＮＧ４レベルの減少は、高いＩＬ−８産生および高密度の微小血管の両方と関連づけられる（Ｃｏｌｌａら ２００７）。やはり血管形成遺伝子を制御する際に関与するＨＩＦプロリルヒドロキシラーゼ（ＨＰＨ）−２との相互作用を介しておそらく仲介される、ＨＩＦ転写因子のＩＮＧ４抑制もまた、報告されてきている（Ｏｚｅｒら ２００５、Ｃｏｌｌａら ２００７）。
【０００４】
単純ヘルペスウイルス
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ゲノムは、長（Ｌ）および短（Ｓ）と称される２つの共有結合したセグメントを含む。各セグメントは、逆位末端反復配列対が隣接するユニークな配列を含有する。長反復（ＲＬまたはＲＬ）および短反復（ＲＳまたはＲＳ）が特徴的である。
【０００５】
広範に研究されているＨＳＶ ＩＣＰ３４．５（γ３４．５とも称する）遺伝子が、ＨＳＶ−１ Ｆ株およびｓｙｎ１７＋株、ならびにＨＳＶ−２ ＨＧ５２株において配列決定されている。ＩＣＰ３４．５遺伝子の１コピーがＲＬ反復領域の各々の内部に位置する。ＩＣＰ３４．５遺伝子の両方のコピーを不活性化する突然変異体（すなわちヌル突然変異体）、例えばＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６（ＨＳＶ １７１６）、あるいはＦ株における突然変異体Ｒ３６１６またはＲ４００９は、神経毒性を欠く、すなわち非病原性（非神経毒性）であることが知られており、そして遺伝子送達ベクターとして、または腫瘍退縮（oncolysis）による腫瘍の治療においての両方で有用性を有する。ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６は、各ＲＬ反復のＢａｍＨＩ ｓ制限断片内に位置するＩＣＰ３４．５遺伝子の各コピーにおいて、７５９ｂｐ欠失を有する。
【０００６】
ＨＳＶ１７１６などのＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体は、事実上、第一世代腫瘍退縮ウイルスである。大部分の腫瘍は個々の特性を示し、そして広域性第一世代腫瘍退縮ウイルスが、すべての腫瘍タイプにおいて複製するか、またはすべての腫瘍タイプに関して有効な治療を提供する能力は、保証されない。
【０００７】
ＨＳＶ１７１６は、腫瘍退縮性、非神経毒性ＨＳＶであり、そしてＥＰ ０５７１４１０およびＷＯ ９２／１３９４３に記載されている。ＨＳＶ１７１６は、１９９２年１月２８日、寄託番号Ｖ９２０１２８０３のもとに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（本明細書において、「ブダペスト条約」と称する）の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ， Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に寄託されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＥＰ ０５７１４１０
【特許文献２】ＷＯ ９２／１３９４３
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｇａｒｋａｖｓｔｅｖら １９９６
【非特許文献２】Ｇｕｎｄｕｚら ２００５
【非特許文献３】Ｇａｒｋａｖｔｓｅｖら ２００４
【非特許文献４】Ｒｕｓｓｅｌｌら ２００６
【非特許文献５】Ｃａｍｐｏｓら ２００４
【非特許文献６】ＳｈｉおよびＧｏｚａｎｉ ２００５
【非特許文献７】Ｎａｇａｓｈｉｍａら ２００１
【非特許文献８】Ｓｈｉｓｅｋｉら ２００３
【非特許文献９】Ｄｏｙｏｎら ２００６
【非特許文献１０】Ｃｏｌｌａら ２００７
【非特許文献１１】Ｏｚｅｒら ２００５
【発明の概要】
【００１０】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルスは、腫瘍増殖を遅延させる能力が増進されていることが、現在、見出されている。特に、本発明者らは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む変異体単純ヘルペスウイルスを生成し、そしてこの変異体を、腫瘍移植物を持つマウスに投与した効果を調べた。本発明者らは、単純ヘルペスウイルス変異体を投与されたマウスの生存期間が、対照に比較して有意に改善され、そしてさらに、変異体を投与されたマウスが、有意により小さい平均腫瘍体積を有することを見出した。これらの結果は、ＩＮＧ４ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスが仲介する腫瘍退縮を増進させることを立証する。
【００１１】
これらの観察のありうる説明の１つは、ＩＮＧ４ポリペプチドが血管形成を阻害し、それによって腫瘍が増殖可能な速度を減少させることである。したがって、この機構は、単純ヘルペスウイルスが腫瘍細胞殺傷能改善を提供する、腫瘍退縮能と相乗的に相互作用する。
【００１２】
しかし、さらなる研究を行う一方、本発明者らは、ＩＮＧ４をコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルス変異体に感染した腫瘍細胞が、対照に比較して、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方で、子孫ビリオンの有意により高い産出量を有することを予期せず見出した。さらなる実験によって、ＩＮＧ４ポリペプチドを恒常的に発現し、そして野生型単純ヘルペスウイルスに感染した細胞もまた、対照に比較して、子孫ビリオンのより高い産出量を有することも示された。これによって、ＩＮＧ４発現が単純ヘルペスウイルスに対して増殖上の利点を与えることが示される。
【００１３】
これらの結果は、単純ヘルペスウイルスの投与を伴う治療の有効性を改善するための新規アプローチの基礎を提供する。特に、これらの結果は、非常に必要とされる、癌および他の状態のための新規でそして改善された治療につながる潜在能力を有する。
【００１４】
ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＰＯ Ｂｏｘ １７１６， Ｇｌａｓｇｏｗ， Ｇ５１ ４ＷＦ， 英国に住所を有するＣｒｕｓａｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名のもとに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約（本明細書において、「ブダペスト条約」と称する）の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に寄託されている。
【００１５】
広い側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。他の広い側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが単純ヘルペスウイルスの複製効率を増進させるポリペプチドをコードする核酸を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。抗血管形成ポリペプチドは、ＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドであってもよい。
【００１６】
抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドは、好ましくは、ＨＳＶに対して異種であり、すなわち通常、対応する野生型ＨＳＶによってコードされずまた発現されない。より好ましくは、抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドまたはタンパク質である。さらにより好ましくは、これは候補腫瘍抑制因子遺伝子である。ＨＳＶは、好ましくは、抗血管形成ポリペプチドまたはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドを発現可能である。抗血管形成ポリペプチドまたはＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチドは、好ましくは、ＩＮＧ４ポリペプチドである。
【００１７】
より詳細には、本発明は、ＩＮＧ４を発現可能なＨＳＶ、およびＨＳＶの複製効率を改善する際のＩＮＧ４の使用に関する。
したがって、１つの側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムが抗血管形成ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。好ましい態様において、抗血管形成ポリペプチドはＩＮＧ４である。単純ヘルペスウイルスはまた、非神経毒性であってもよい。
【００１８】
さらなる側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルスゲノムがＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルスに関する。単純ヘルペスウイルスは、非神経毒性であってもよい。
【００１９】
ＨＳＶは、腫瘍退縮性ＨＳＶであってもよい。本発明において使用可能なＨＳＶ、例えば腫瘍退縮性ＨＳＶには、それぞれの遺伝子が、機能するＩＣＰ３４．５タンパク質を発現すること、例えばコードすることが不能であるように、γ３４．５（ＩＣＰ３４．５とも称される）遺伝子の一方または両方が修飾されている（例えば欠失、挿入、付加または置換であってもよい突然変異によって）ＨＳＶが含まれる。好ましくは、本発明記載のＨＳＶにおいて、修飾されたＨＳＶが、機能するＩＣＰ３４．５タンパク質を発現すること、例えば産生することが不能であるように、γ３４．５遺伝子の両コピーが修飾されている。ウイルス、例えば腫瘍退縮性ウイルスは、好ましくは非神経毒性である。
【００２０】
特定の配置において、単純ヘルペスウイルスは、ＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体などの遺伝子特異的ヌル突然変異体であってもよい。単純ヘルペスウイルスが、機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を産生不能であるように、単純ヘルペスウイルスゲノムに存在するＩＣＰ３４．５遺伝子のすべてのコピー（通常、２コピーが存在する）が破壊されている場合、ウイルスはＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体であると見なされる。他の配置において、単純ヘルペスウイルスは、少なくとも１つの発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠いていてもよい。別の配置において、単純ヘルペスウイルスは、１つの発現可能ＩＣＰ３４．５遺伝子のみを欠いていてもよい。他の配置において、単純ヘルペスウイルスは、両方の発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子を欠いていてもよい。さらに他の配置において、単純ヘルペスウイルス中に存在する各ＩＣＰ３４．５遺伝子は発現可能でなくてもよい。発現可能なＩＣＰ３４．５遺伝子の欠如は、例えば、ＩＣＰ３４．５遺伝子の発現が、機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を生じないことを意味する。
【００２１】
本発明記載のＨＳＶのゲノムは、ポリペプチドが核酸から発現可能であるように、抗血管形成ポリペプチドの少なくとも１コピーをコードする核酸を含有するようにさらに修飾されている。該ポリペプチドをコードする核酸は、単純ヘルペスウイルスの少なくとも１つのＲＬ１遺伝子座に位置してもよい。例えば、該核酸は、単純ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の少なくとも１つの中に位置するか、または該配列と重複していてもよい。これは、ＩＣＰ３４．５遺伝子を不活性化し、それによって非神経毒性を提供する、好都合な方式を提供する。
【００２２】
抗血管形成ポリペプチドまたは複製効率を増進させるポリペプチドは、選択されたＩＮＧ４ポリペプチドであってもよい。こうしたものとして、好ましい態様において、修飾されたＨＳＶは、抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは細胞、好ましくは哺乳動物細胞の感染に際して複製効率を増進させるＨＳＶポリペプチド（例えばＩＮＧ４）を発現可能な発現ベクターである。別の好ましい態様において、ＨＳＶは腫瘍退縮性発現ベクターである。
【００２３】
抗血管形成ポリペプチドまたは複製効率を増進させるポリペプチド（例えばＩＮＧ４）の発現を達成するため、該ポリペプチドをコードする核酸は、好ましくは、該ポリペプチドをコードする核酸の転写を達成可能な制御配列、例えばプロモーターに、機能可能であるように連結されている。ヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されている制御配列（例えばプロモーター）は、制御配列が該ヌクレオチド配列の産物の発現を達成および／または調節可能であるように、その配列に隣接して、またはごく近接して位置してもよい。ヌクレオチド配列にコードされる産物は、したがって、その制御配列から発現可能であってもよい。
【００２４】
本明細書において、用語「機能可能であるように連結された」には、ヌクレオチド配列の発現を制御配列の影響または調節下に置く方式で、選択されたヌクレオチド配列および制御ヌクレオチド配列が共有結合している状況が含まれうる。したがって、制御配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部またはすべてを形成するヌクレオチド配列の転写を達成可能であるならば、制御配列は、選択されたヌクレオチド配列に機能可能であるように連結されている。次いで、適切な場合、生じた転写物を所望のタンパク質またはポリペプチドに翻訳してもよい。
【００２５】
本発明の単純ヘルペスウイルスを生成するのに有用な核酸ベクターが、例えば、ＷＯ ２００５／０４９８４５の４１ページ１９行目〜５５ページ３０行目に記載される。これは、本明細書に援用される。本発明者らによって提供される１つのこうしたベクターは、Ｃｒｕｓａｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名のもとに、ブダペスト条約の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に、寄託番号０３０９０３０３のもとに寄託される、プラスミドＲＬ１．ｄＩＲＥＳ−ＧＦＰである。
【００２６】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、選択された単純ヘルペスウイルスのゲノム中に相同組換えによって挿入されている核酸カセットの一部を形成してもよい。カセットの一部であってもまたはなくても、挿入部位は、選択された任意のゲノム位置中であってもよい。１つの好ましい挿入部位は、長反復領域（ＲＬ）の一方または両方の中にあり、そしてカセットの１つのコピーは、好ましくは、長反復（ＲＬ）の各コピー中に挿入される。より好ましくは、挿入部位は、少なくとも一方（好ましくは両方）のＲＬ１遺伝子座にあり、そして最も好ましくはＨＳＶゲノムＤＮＡのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の少なくとも一方（好ましくは両方）の中に挿入される。挿入が、２つの反復領域、ＲＬ１遺伝子座またはＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の各々の同一のまたは実質的に類似の位で起こることが好ましい。
【００２７】
挿入は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞へのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのトランスフェクションに際して、コードされるＩＮＧ４ポリペプチドを発現可能な非神経毒性突然変異体である修飾ウイルスを産生するようなものであってもよい。非神経毒性突然変異体は、ＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体であってもよい。
【００２８】
核酸カセットは、任意のサイズ、例えば長さ５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｋｂｐまでであってもよい。
本発明記載のＨＳＶは、疾患の医学的治療、より詳細には癌性状態の治療に使用するために提供される。本発明記載のＨＳＶをこうした治療の必要がある個体に、例えば治療上有効な量で投与する工程を含む、癌性状態の治療法を提供する。また、癌性状態の治療用の薬剤の製造において使用するためにもまた、本発明記載のＨＳＶを提供する。腫瘍の治療、例えば腫瘍の腫瘍退縮治療で使用するためにもまた、本発明記載のＨＳＶを提供する。
【００２９】
本発明記載の単純ヘルペスウイルスを含む、薬剤、薬学的組成物またはワクチンもまた提供し、これらは、本発明記載のＨＳＶを、薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤と一緒に含んでもよい。
【００３０】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶの任意の実験室株または臨床単離体（非実験室株）を含む、任意のＨＳＶに由来してもよい。好ましくは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２の突然変異体である。あるいは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の種間（ｉｎｔｅｒｔｙｐｉｃ）組換え体であってもよい。突然変異体は、実験室株ＨＳＶ−１ １７株、ＨＳＶ−１ Ｆ株またはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つのものであってもよい。突然変異体は、非実験室株ＪＳ−１のものであってもよい。好ましくは、突然変異体は、ＨＳＶ−１ １７株の突然変異体である。単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｒ３６１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｇ２０７、ＨＳＶ−１突然変異体ＮＶ１０２０の１つのさらなる突然変異体であってもよい。好ましくは、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６の１つのさらなる突然変異体である。
【００３１】
ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの「遺伝子送達」法で本発明の単純ヘルペスウイルスを用いてもよい。本発明の非神経毒性単純ヘルペスウイルスは発現ベクターであり、そして抗血管形成ポリペプチドまたはタンパク質、あるいは単純ヘルペスウイルスゲノムにコードされるＨＳＶ複製効率を増進させるポリペプチド（ＩＮＧ４）を発現するため、選択された細胞または組織を感染させるのに使用可能である。
【００３２】
１つの配置において、本発明の単純ヘルペスウイルスに感染した患者、ドナー、または任意の他の供給源から、細胞を採取してもよく、場合によって、コードされるＩＮＧ４の発現および／または機能に関してスクリーニングし、そして場合によって患者の体内に、例えば注射によって戻しても／導入してもよい。
【００３３】
裸のウイルスを用いて、あるいはキャリアー、例えばナノ粒子、リポソームまたは他の小胞にウイルスを被包することによって、選択された細胞への本発明の単純ヘルペスウイルスの送達を実行してもよい。
【００３４】
本発明のウイルスで形質転換されたｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞、好ましくはヒトまたは哺乳動物細胞、ならびに好ましくはＩＮＧ４ポリペプチドを発現している細胞、ならびに前記ウイルスを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでこうした細胞を形質転換する方法は、本発明のさらなる側面を形成する。
【００３５】
ＨＳＶゲノムは、さらなる突然変異および／または異種ヌクレオチド配列を含有してもよい。さらなる突然変異には、無能化突然変異が含まれてもよく、こうした突然変異は、ウイルスの毒性または複製能に影響を及ぼしてもよい。例えば、突然変異は、ＩＣＰ６、ＩＣＰ０、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７の任意の１以上で作製されてもよい。好ましくは、これらの遺伝子の１つ（場合によって、適切な場合、遺伝子の両コピー）における突然変異は、対応する機能ポリペプチドをＨＳＶが発現するのを不能にする（またはその能力を減少させる）。例えば、ＨＳＶゲノムのさらなる突然変異は、ヌクレオチドの付加、欠失、挿入または置換によって達成可能である。
【００３６】
癌性状態は、任意の望ましくない細胞増殖（または望ましくない細胞増殖によって自然に現れる任意の疾患）、新生物または腫瘍、あるいは望ましくない細胞増殖、新生物または腫瘍のリスクまたはこれらに対する素因の増加であってもよい。癌性状態は、癌であってもよいし、そして良性または悪性癌であってもよいし、そして原発性または続発性（転移性）であってもよい。新生物または腫瘍は、細胞のいかなる異常な成長または増殖であってもよいし、そしていかなる組織に位置してもよい。組織の例には、結腸、膵臓、肺、乳房、子宮、胃、腎臓、精巣、中枢神経系（脳を含む）、末梢神経系、皮膚、血液またはリンパが含まれる。
【００３７】
治療可能な癌／腫瘍タイプは、原発性または続発性（転移性）腫瘍であってもよい。治療すべき腫瘍は、中枢または末梢神経系に由来する神経系腫瘍、例えばグリオーマ、髄芽腫、髄膜腫、神経線維腫、上衣腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、星状細胞腫および乏突起膠腫であってもよいし、あるいは非神経系組織に由来する非神経系腫瘍、例えば黒色腫、中皮腫、リンパ腫、肝癌、類表皮癌、前立腺癌、乳癌細胞、肺癌細胞または結腸癌細胞であってもよい。本発明のＨＳＶ突然変異体を用いて、非神経系組織に由来する中枢または末梢神経系の転移性腫瘍を治療してもよい。例えば、本発明によって治療可能な癌性状態には、扁平上皮癌、卵巣腫瘍／癌、肝細胞癌、および乳腺癌が含まれる。
【００３８】
本明細書において、非神経毒性は、動物、例えばマウス、またはヒト患者におけるＬＤ５０が≧１０６ｐｆｕのおよその範囲であるように、致死的脳炎を引き起こすことなく、動物または患者に高力価のウイルス（およそ１０６プラーク形成単位（ｐｆｕ））を導入する能力によって定義される。
【００３９】
治療しようとする患者は、任意の動物またはヒトであってもよい。患者は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒト患者である。患者は男性または女性であってもよい。
【００４０】
本発明はまた、細胞に本発明の単純ヘルペスウイルスを投与する工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を溶解するかまたは殺傷する方法も提供する。
本発明はまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＩＮＧ４ポリペプチドを発現する方法であって、本発明の単純ヘルペスウイルスに、関心対象の少なくとも１つの細胞または組織を感染させる工程を含む、前記方法も提供する。
【００４１】
さらなる側面において、本発明は、細胞に、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において、単純ヘルペスウイルスの複製効率を増加させるｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法に関する。
【００４２】
複製増加は、細胞によって産生されるビリオン量の増加、例えばＨＳＶ収量の増加であってもよい。ＨＳＶ複製効率の増加は、対照に比較したもの、例えば野生型レベルでＩＮＧ４を発現する細胞に比較したものであってもよい。細胞に、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる、例えばそのように細胞を刺激する工程は、例えば対照に比較して、細胞におけるＩＮＧ４ポリペプチド濃度の増加を引き起こしそして／または達成する工程を含んでもよい。例えば、方法は、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸の発現を増加させる工程を含んでもよい。これは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を細胞内に導入することによって達成可能であり、例えば、異種という用語は、構築物が通常、野生型細胞に存在しないことを意味する。ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列は、ＩＮＧ４ポリペプチドの転写を調節する際に役割を果たす制御ヌクレオチド配列に、機能可能であるように連結されてもよい。ＩＮＧ４をコードする核酸の発現は恒常性であってもよい。
【００４３】
ＨＳＶに感染した細胞におけるＩＮＧ４の存在（該細胞種に通常存在するＩＮＧ４の内因性レベルより高いレベル）は、ＨＳＶの複製効率増加を導きうる。これは、感染細胞（単数または複数）からのＨＳＶビリオンのより高い収量を生じうる。複製効率は、ＨＳＶに感染し、そして過剰なＩＮＧ４（すなわち内因性発現のために通常存在するものに付加されたＩＮＧ４）が存在する細胞によって産生されるビリオンの数を、同じＨＳＶに感染しているが過剰なＩＮＧ４が存在しない対照細胞と比較することによって、複製効率を測定可能であり、すなわち対照細胞は、同じＨＳＶに感染しているが通常の内因性レベルより高いＩＮＧ４ポリペプチドを産生しない。場合によって、ＩＮＧ４が存在する細胞および存在しない細胞に関して、感染ＨＳＶのｐｆｕあたりに産生されるＨＳＶビリオンの数に関する値を決定してもよい。過剰なＩＮＧ４が存在する細胞が、対照に比較して、産生されるＨＳＶビリオン量の増加、好ましくは統計的に有意な増加を示す場合、複製効率の増加が存在する。複製効率の増加は、対照のものの１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００（またはそれ以上）倍であるビリオン産生レベルを導きうる。
【００４４】
細胞は、ＨＳＶに感染可能な任意の細胞であってもよいが、好ましくは腫瘍細胞、例えばＨＳＶによって溶解されることが可能な腫瘍細胞、例えば扁平上皮癌、卵巣腫瘍、ヒト乳腺癌、卵巣癌および肝細胞癌である。
【００４５】
さらなる側面において、本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞であって、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を含む前記細胞を提供する。ＩＮＧ４をコードする核酸の発現は、恒常性であってもよい。
【００４６】
さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者に非神経毒性単純ヘルペスウイルスを投与する工程を含む療法において使用するための、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を提供する。さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者にＩＮＧ４をコードする核酸を投与する工程を含む療法において使用するための、非神経毒性単純ヘルペスウイルスを提供する。
【００４７】
さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者に非神経毒性単純ヘルペスウイルスを投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸の使用を提供する。さらなる側面において、本発明は、治療の必要がある患者にＩＮＧ４をコードする核酸を投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、非神経毒性単純ヘルペスウイルスの使用を提供する。
【００４８】
さらなる側面において、本発明は、非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する工程を含む、患者を治療する方法を提供する。
【００４９】
治療の必要がある患者は、癌性状態を持つ患者であってもよい。治療は癌および／または腫瘍の治療であってもよい。
治療法で使用するためのＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を、ベクター中で提供してもよい。ベクターは遺伝子治療ベクターであってもよく、例えば投与に際して患者の細胞に進入してもよい。例えば、ベクターはウイルスベクターであってもよく、例えば非腫瘍退縮性ＨＳＶであってもよい。
【００５０】
さらなる側面において、本発明は、単純ヘルペスウイルス、ならびにＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸および／またはＩＮＧ４ポリペプチドを含む組成物を提供する。組成物は、例えば、非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む薬学的組成物であってもよい。
【００５１】
本発明者らは、細胞への過剰なＩＮＧ４ポリペプチドの導入（すなわち細胞によって通常発現されるものを超えるさらなるＩＮＧ４）が、野生型および突然変異体ＨＳＶの発現レベル増加につながることを示してきた。したがって、本発明は、（ｉ）過剰なＩＮＧ４を有する単数または複数の細胞を提供し、そして（ｉｉ）細胞（単数または複数）を感染させることが可能なＨＳＶと細胞（単数または複数）を接触させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＨＳＶを複製する方法を提供する。感染細胞における複製を通じたＨＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ産生のため、このアプローチは、ＨＳＶ複製の有意な改善を導き、そしてより高いウイルス力価が得られることを可能にしうる。該方法は、細胞（単数または複数）に、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を発現させる工程を含んでもよい。これは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を、細胞（単数または複数）内に導入する工程を含んでもよい。
【００５２】
細胞に、細胞内にトランスフェクションされたベクターからＩＮＧ４を発現させる、例えば発現ベクターから組換えＩＮＧ４を発現させることによって、細胞に過剰なＩＮＧ４を導入してもよい。ベクターは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４などのＨＳＶであってもよいが、また、任意の適切な発現ベクター、例えばプラスミドベクターであってもよい。さらにまたはあるいは、例えば対応するプロモーターの制御または増進を通じて、細胞に、内因性ＩＮＧ４を過剰発現させてもよい。さらにまたはあるいは、細胞をＩＮＧ４ポリペプチドと接触させてもよく、該ＩＮＧ４ポリペプチドは、例えばＩＮＧ４をコードする発現ベクターでトランスフェクションされた細菌の発酵を通じて、組換えＩＮＧ４として得られてもよい。
【００５３】
したがって、本発明のさらなる側面は、ＩＮＧ４ポリペプチドと細胞を接触させる工程を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において単純ヘルペスウイルスを複製する方法を提供する。さらなる側面において、本発明は、ＩＮＧ４をコードする核酸ベクターと細胞を接触させ、そして細胞にＩＮＧ４を発現させる工程を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において単純ヘルペスウイルスを複製する方法を提供する。
【００５４】
上記にしたがって、さらにさらなる側面において、（ｉ）単数または複数の細胞に過剰なＩＮＧ４を提供し、（ｉｉ）細胞（単数または複数）をＨＳＶに感染させ、（ｉｉｉ）細胞（単数または複数）をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、そして（ｉｖ）細胞（単数または複数）からウイルス子孫を採取する工程を含む、ＨＳＶのｉｎ ｖｉｔｒｏ複製のための方法を提供する。
【００５５】
ＨＳＶは、本明細書に記載するような任意のＨＳＶであってもよい。
細胞は、ＨＳＶによる感染が可能であり、そしてＨＳＶが該細胞中で複製可能である、任意の細胞であってもよい。これらはｉｎ ｖｉｔｒｏ培養細胞であってもよい。これらはヒトまたは非ヒト細胞であってもよい。例えば、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のげっ歯類（げっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）中の任意の動物由来の細胞を含む）、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、非ヒト霊長類あるいは他の非ヒト脊椎動物生物；および／または非ヒト哺乳動物細胞；および／またはヒト細胞由来であってもよい。
【００５６】
本発明のさらなる側面において、本発明は、寄託番号・・・のもとに、ブダペスト条約にしたがってＥＣＡＣＣに寄託されている、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を提供する。
ＩＮＧ４
本明細書におけるＩＮＧ４に対する言及には、ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において、寄託番号ＮＭ＿０１６１６２ ＧＩ：３８２０１６６９のもとに記載されるアミノ酸配列を有するＩＮＧ４ポリペプチドに対する言及が含まれる。ＩＮＧ４に対する言及にはまた、ＩＮＧ４のアイソフォーム、相同体および誘導体に対する言及も含まれる。誘導体は、個体間またはファミリーメンバー間に存在しうる天然変異体または多型を含んでもよい。Ｇｅｎｂａｎｋデータベース中に寄託されるＩＮＧ４ポリペプチドの多くの相同体がある。例えば、データベースのＢｌａｓｔ検索は、およそ１００の相同体を同定した。相同体には、例えば、ＢＣ００７７８１などの他のヒトＩＮＧ４アイソフォーム、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＩＮＧ４（例えば、ＮＰ＿５７９９２３．１）、イヌ（Ｃａｎｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＩＮＧ４（ＸＰ＿５３４９０７．２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿００１０７３３５６．１）、チンパンジー（Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）ＩＮＧ４（ＸＰ＿００１１６９０９１．１）、ウマ（Ｅｑｕｕｓ ｃａｂａｌｌｕｓ）（ＸＰ＿００１４９６６１７．１）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ）ＩＮＧ４（ＮＰ＿００１００６２４１．１）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（ＸＰ＿００１１１８２７０．１）、オオカンガルー（Ｍｏｎｏｄｅｌｐｈｉｓ ｄｏｍｅｓｔｉｃａ）（ＸＰ＿００１３６５０１６．１）、ウシ（Ｂｏｓ Ｔａｕｒｕｓ）（ＮＰ＿００１０３０４６６．１）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）（ＮＰ＿００１０１８３０４．１）、アフリカツメガエル（Ｘｏｎｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）（ＮＰ＿００１０８８２２４．１）が含まれる。本発明が関連するＩＮＧ４ポリペプチドまたはタンパク質は、好ましくはヒトＩＮＧ４である。
【００５７】
すべてのこうした相同体および誘導体が、本発明の範囲内に含まれる。純粋に例として、こうした多型中に見られてもよい保存的置換は、以下の群内のアミノ酸間であってもよい：
（ｉ）アラニン、セリン、スレオニン；
（ｉｉ）グルタミン酸およびアスパラギン酸；
（ｉｉｉ）アルギニンおよびロイシン；
（ｉｖ）アスパラギンおよびグルタミン；
（ｖ）イソロイシン、ロイシンおよびバリン；
（ｖｉ）フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン。
【００５８】
特に、寄託番号ＮＭ＿０１６１６２ ＧＴ：３８２０１６６９のもとに示されるＩＮＧ４のアミノ酸配列と、少なくとも７０％、より好ましくは７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の１つの配列同一性を有するペプチドおよびポリペプチドが、本明細書の目的のためのＩＮＧ４ポリペプチドとして含まれる。これらのＩＮＧ４ポリペプチドの任意の１つをコードする核酸配列を、本発明にしたがったＩＮＧ４発現の目的のために用いてもよい。
【００５９】
高ストリンジェンシー条件下で、配列番号４または配列番号５の核酸にハイブリダイズする能力によって、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を選択してもよい。
ＩＮＧ４ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドであってもよい。特に、ＩＮＧ４ポリペプチドは、単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株に感染した細胞におけるその存在が、前記細胞における単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株の複製効率の増加を導くポリペプチドであってもよい。
【００６０】
例えば、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞におけるＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列の発現増加は、単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導く。上述のように、複製効率の増加、例えばより高い複製効率は、例えば、細胞がより多数の子孫ビリオンを産生する、例えば細胞由来のＨＳＶ粒子の収量がより大きいことを意味する。複製効率の増加は、対照に比較してであってもよく、例えば、内因性レベルを発現するか、またはＩＮＧ４を発現しない細胞に比較してであってもよい。例えば、ＨＳＶゲノムがＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む場合、ＨＳＶ複製効率の増加は、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含まない、対応するＨＳＶに感染した同じ細胞に比較してであってもよい。
【００６１】
ＨＳＶは、１７株または１７１６株であってもよい。好ましくは、複製効率の増加は統計的に有意であり、例えばスチューデントｔ検定または分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて決定した際、例えばｐ＜０．０５である。
【００６２】
発現増加は：ＢＨＫ、Ａ４３１ヒト扁平上皮癌、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌からなる群より選択される細胞株における発現の増加であってもよい。実施例２の実験は、複製効率を比較するのに適した方法を示す。例えば、腫瘍細胞を、１０００ｐｆｕで７２時間感染させてもよい。
【００６３】
ＩＮＧ４ヌクレオチド配列は、全長転写物またはポリペプチドをコードしてもよい（すなわち完全ＩＮＧ４タンパク質コード配列を含んでもよい）。あるいは、ポリペプチド産物がＩＮＧ４活性、例えば増加したＨＳＶ複製効率を保持するという条件で、ＩＮＧ４ヌクレオチド配列は、全長転写物の断片または一部切除（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ポリペプチドをそれぞれコードする、全長配列の１以上の断片を含んでもよい。
【００６４】
断片は、対応する全長配列の少なくとも１０％をコードするヌクレオチド配列を含んでもよく、より好ましくは、対応する全長配列の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％を含む。好ましくは、断片は、少なくとも２０ヌクレオチドを含み、すなわちこうした最小の長さを有し、より好ましくは少なくとも３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ヌクレオチドを含む。断片は、２０ヌクレオチドの最大の長さを有してもよく、すなわちこれより長くなくてもよく、より好ましくは、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００または２０００ヌクレオチドより長くなくてもよい。断片長は、前記の最小および最大の長さの間のいずれかであってもよい。
【００６５】
１つの好ましい配置において、単純ヘルペスウイルスは、ＰＯ Ｂｏｘ １７１６， Ｇｌａｓｇｏｗ， Ｇ５１ ４ＷＦ， 英国に住所を有するＣｒｕｓａｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名のもとに、ブダペスト条約の規定にしたがって、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， ＳＰ４ ０ＪＧ， 英国に寄託されるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４である。
【００６６】
ＮＣＢＩデータベースの寄託番号ＮＭ＿０１６１６２．２ ＧＩ：３８２０１６６９のもとに示されるようなヒトＩＮＧ４のアミノ酸およびヌクレオチド配列は、配列番号３および配列番号４として、以下にコピーされる。
【００６７】
アミノ酸配列：
【００６８】
【化１】
【００６９】
ヌクレオチド配列：
【００７０】
【化２−１】
【００７１】
【化２−２】
【００７２】
【化２−３】
【００７３】
【化２−４】
【００７４】
ヒトＩＮＧ４（配列番号５）をコードする７４７ｂｐ ｃＤＮＡ配列は、配列番号４中の３８〜７８４位（包括的）の間に見られる。
単純ヘルペスウイルス
本明細書において、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、任意の単純ヘルペスウイルスであってもよい。適切なＨＳＶには、ＨＳＶの任意の実験室株または臨床単離体（非実験室株）が含まれる。好ましくは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２である。あるいは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の種間組換え体であってもよい。ＨＳＶは、実験室株ＨＳＶ−１ １７株、ＨＳＶ−１ Ｆ株またはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つであってもよい。ＨＳＶは、非実験室株ＪＳ−１であってもよい。好ましくは、ＨＳＶは、ＨＳＶ−１ １７株またはその突然変異体である。ＨＳＶは、ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｒ３６１６、ＨＳＶ−１ Ｆ株突然変異体Ｇ２０７、ＨＳＶ−１突然変異体ＮＶ１０２０の１つのさらなる突然変異体であってもよい。
【００７５】
本発明のウイルスが由来する親単純ヘルペスウイルスは、任意の種類、例えばＨＳＶ−１またはＨＳＶ−２であってもよい。１つの好ましい配置において、単純ヘルペスウイルスは、ＨＳＶ−１ １７株の変異体であり、そして１７株ゲノムＤＮＡの修飾によって得られてもよい。適切な修飾には、単純ヘルペスウイルスゲノムＤＮＡ内への、抗血管形成性ポリペプチドまたは複製効率を増進させるポリペプチドをコードする核酸配列の挿入が含まれる。挿入は、選択された単純ヘルペスウイルスゲノム内への外因性核酸配列の相同組換えによって実行可能である。
【００７６】
本発明の単純ヘルペスウイルスの非神経毒性表現型は、ＲＬ１遺伝子座における核酸配列の挿入の結果であってもよいが、本発明記載の単純ヘルペスウイルスは、非神経毒性親株、例えば、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）， Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ， Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ， Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ， Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ， 英国に、寄託番号Ｖ９２０１２８０３のもとに、ブダペスト条約のもとで寄託されるＨＳＶ１７１６を利用して、そして標準的遺伝子操作技術、例えば相同組換えによって、ゲノムの別の位置に核酸配列を挿入することによって得られうる。この側面において、ＩＮＧ４核酸配列または前記配列を含有するカセットの挿入のために選択される単純ヘルペスウイルスゲノムの位置は、中立の位置であってもよい。
【００７７】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、本発明の単純ヘルペスウイルスが由来した、既知の「親」株の変異体であってもよい。特に好ましい親株は、ＨＳＶ−１ １７株である。他の親株には、ＨＳＶ−１ Ｆ株またはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株、あるいは上述の任意の実験室または非実験室株あるいは他の任意のＨＳＶが含まれてもよい。変異体は、ゲノムが実質的に親のものに似ているＨＳＶを含み、核酸配列を含有し、そして単純ヘルペスウイルスの病原性特性を不能にさせるように導入されてもよい、限定された数の他の修飾、例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは１０未満の他の特定の突然変異、例えばリボヌクレオチド還元酵素（ＲＰ）遺伝子、６５Ｋトランス誘導因子（ＴＩＦ）における突然変異、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏの複製および選択中に天然に取り込まれうる天然変異から生じる少数の突然変異を含有してもよい。それ以外は、変異体ゲノムは、親株のものであろう。
【００７８】
例えば、いくつかの態様において、単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子中に突然変異を有してもよく、例えばＩＣＰ３４．５およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子は、機能する産物を産生不能であるが、ゲノムは、それ以外は、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のゲノムに実質的に似ていてもよい。他の態様において、単純ヘルペスウイルスゲノムは、ＩＣＰ３４．５遺伝子およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子中に突然変異を有してもよく、例えばＩＣＰ３４．５およびリボヌクレオチド還元酵素遺伝子は、機能する産物を産生不能であるが、ゲノムは、それ以外は、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のゲノムであってもよい。用語「実質的に似ている」は、単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株のゲノムに、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．９または９９．９９％同一であることを意味してもよい。
【００７９】
本発明の単純ヘルペスウイルスは、好ましくは、突然変異体単純ヘルペスウイルスである。突然変異体単純ヘルペスウイルスは、非野生型単純ヘルペスウイルスであり、そして組換え単純ヘルペスウイルスであってもよい。突然変異体単純ヘルペスウイルスは、野生型に比較して修飾を含有するゲノムを含んでもよい。修飾には、少なくとも１つの欠失、挿入、付加または置換が含まれてもよい。
【００８０】
上述のように、単純ヘルペスウイルスは、実験室ＨＳＶ株または非実験室株であってもよい。実験室株は、例えば、ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株であってもよい。実験室株は、場合によって、連続継代ＨＳＶ株、例えば少なくとも１００、２００、５００、１０００、または１００００回連続継代されている株であってもよい。非実験室株は、臨床単離体、例えば最近の臨床単離体であってもよい。実験室株は、例えば、最近の臨床単離体ではない。
【００８１】
配列同一性
配列同一性パーセント（％）は、配列を並列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後、そして配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、所定の列挙される配列（配列番号によって言及される）中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。配列同一性は、好ましくは、それぞれの配列の全長に渡って計算される。
【００８２】
並列配列が異なる長さである場合、より短い比較配列の配列同一性を、より長い所定の配列の全長に渡って決定してもよいし、または比較配列が所定の配列より長い場合、比較配列の配列同一性を、より短い所定の配列の全長に渡って決定してもよい。
【００８３】
例えば、所定の配列が１００アミノ酸を含み、そして候補配列が１０アミノ酸を含む場合、候補配列は、所定の配列の全長に対して１０％の最大同一性しか持つことができない。これはさらに、以下の例において例示される：
（Ａ）
所定の配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（１５アミノ酸）
比較配列 ：ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＹ（１２アミノ酸）
所定の配列は、例えばＩＮＧ４をコードするもの（例えば配列番号３）であってもよい。
【００８４】
配列同一性％＝より長い所定の配列中のアミノ酸残基総数によって割った、並列後の同一マッチアミノ酸残基数、すなわち（５割る１５）ｘ１００＝３３．３％。
比較配列が所定の配列より長い場合、配列同一性は所定の配列の全長に渡って決定可能である。例えば：
（Ｂ）
所定の配列：ＸＸＸＸＸＸＸＸＸＸ（１０アミノ酸）
比較配列 ：ＸＸＸＸＸＹＹＹＹＹＹＺＺＹＺＺＺＺＺＺ（２０アミノ酸）
ここでも、所定の配列は、例えばＩＮＧ４をコードするもの（例えば配列番号３）であってもよい。
【００８５】
配列同一性％＝所定の配列中のアミノ酸残基総数によって割った、並列後の同一アミノ酸数、すなわち（５割る１０）ｘ１００＝５０％。
アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のための並列は、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えばＣｌｕｓｔａｌＷ １．８２ Ｔ−ｃｏｆｆｅｅまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを用いて、当業者に知られる多様な方法で達成可能である。こうしたソフトウェアを用いる場合、例えばギャップペナルティおよび伸長ペナルティに関して、好ましくはデフォルトパラメーターを用いる。ＣｌｕｓｔａｌＷ １．８２のデフォルトパラメーターは：タンパク質ギャップオープンペナルティ＝１０．０、タンパク質ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、タンパク質マトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ、タンパク質／ＤＮＡ ＥＮＤＧＡＰ＝−１、タンパク質／ＤＮＡ ＧＡＰＤＩＳＴ＝４である。
【００８６】
核酸配列の同一性は、配列を並列させ、そして最大配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入し、そしてそれぞれの配列の全長に渡って配列同一性を計算する工程を伴う類似の方式で、決定可能である。並列配列が異なる長さである場合、配列同一性は、上記のようにそして実施例（Ａ）および（Ｂ）に例示するように決定可能である。
【００８７】
ハイブリダイゼーションストリンジェンシー
本発明にしたがって、適切なストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を用いることによって、核酸配列を同定してもよい。
【００８８】
相補的核酸配列は、ワトソン−クリック結合相互作用を通じて、互いにハイブリダイズするであろう。１００％相補性でない配列もまたハイブリダイズ可能であるが、ハイブリダイゼーションの強度は、通常、相補性の減少とともに減少する。したがって、ハイブリダイゼーション強度を用いて、互いに結合可能な配列の相補性の度合いを区別することも可能である。
【００８９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者によって容易に決定可能である。
所定の反応のストリンジェンシーは、プローブ長、洗浄温度、および塩濃度などの要因に応じうる。長いプローブの適切なアニーリングには、一般的に、より高い温度が必要である一方、より短いプローブはより低い温度でアニーリング可能である。プローブおよびハイブリダイズ可能な配列間の望ましい相補性の度合いがより高くなれば、使用可能な相対的温度はより高くなる。その結果、より高い相対的温度は、反応条件をよりストリンジェントにする傾向がある一方、より低い温度は、その傾向がより少ないということになる。
【００９０】
例えば：５ｘＳＳＣ、５ｘデンハルト試薬、０．５〜１．０％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌ変性断片化サケ精子ＤＮＡ、０．０５％ピロリン酸ナトリウムおよび最大５０％のホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液を用いて、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８９）の方法にしたがって、ハイブリダイゼーションを実行してもよい。ハイブリダイゼーションは、３７〜４２℃で、少なくとも６時間行われる。ハイブリダイゼーション後、以下のようにフィルターを洗浄する：（１）２ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、室温で５分間；（２）２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中、室温で１５分間；（３）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３７℃で３０分〜１時間；（４）１ｘＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、３０分ごとに溶液を変えながら、４２〜６５℃で２時間。
【００９１】
核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するのに必要なストリンジェンシー条件を計算するための１つの一般的な式は、融点Ｔｍを計算することである（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）：
Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６Ｌｏｇ［Ｎａ＋］＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．６３（％ホルムアミド）−６００／ｎ
式中、ｎはオリゴヌクレオチド中の塩基数である。
【００９２】
上記式の例として、４２％のＧＣ含量および２００塩基の平均プローブサイズとともに［Ｎａ＋］＝［０．３６８］および５０％ホルムアミドを用いると、Ｔｍは５７℃である。ＤＮＡ二重鎖のＴｍは、配列相補性が１％減少するごとに、１〜１．５℃減少する。
【００９３】
高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、Ｔｍ−１５以上の温度で、ハイブリダイゼーションを実行することを伴いうる。中程度のストリンジェンシーは、Ｔｍ−２５〜Ｔｍ−１５と見なされうる。低ストリンジェンシーは、Ｔｍ−３５〜Ｔｍ−２５と見なされうる。
【００９４】
したがって、ヌクレオチド配列は、上記等式を用いることによって選択可能な、異なるハイブリダイゼーションおよび洗浄ストリンジェンシー条件下で、ターゲット配列にハイブリダイズする能力によって分類可能である。Ｔｍを用いて、ハイブリダイゼーション強度の指標を提供してもよい。
【００９５】
条件のストリンジェンシーに基づいて、配列を区別する概念は、当業者によってよく理解され、そして容易に適用可能である。
９５〜１００％の配列相補性を示す配列は、非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、８５〜９５％の相補性を示す配列は、高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、７０〜８５％の相補性を示す配列は、中程度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、６０〜７０％の相補性を示す配列は、低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能であり、そして５０〜６０％の相補性を示す配列は、非常に低いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすると見なされることも可能である。
【００９６】
核酸およびポリペプチド
本明細書において、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸は、配列番号４または配列番号５、これらの配列のいずれか１つのＲＮＡ転写物、先行する配列のいずれか１つの断片、あるいはこれらの配列または断片のいずれか１つの相補配列に、特定の度合いの配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、任意の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）であってもよい。あるいは、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸は、高いまたは非常に高いストリンジェンシー条件下で、これらの配列の１つにハイブリダイズするものであってもよい。特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６０％〜１００％の配列同一性であってもよい。より好ましくは、特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性の１つであってもよい。
【００９７】
本明細書において、ＩＮＧ４ポリペプチドは、配列番号３またはこれらの配列の１つの断片に特定の度合いの配列同一性を有するアミノ酸配列を有する任意のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質であってもよい。特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６０％〜１００％の配列同一性であってもよい。より好ましくは、特定の度合いの配列同一性は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性の１つであってもよい。
【００９８】
投与
本発明で使用するためのＨＳＶは、臨床的使用のための薬剤および薬学的組成物としての製剤とされてもよいし、そして薬学的に許容されうるキャリアー、希釈剤またはアジュバントを含んでもよい。組成物は、局所、非経口、全身、静脈内、動脈内、筋内、クモ膜下腔、眼内、腫瘍内、皮下、経口または経皮投与経路用の製剤とされてもよく、これには注射が含まれてもよい。注射可能な製剤は、無菌または等張媒体中の選択される化合物を含んでもよい。薬剤および薬学的組成物は、液体または固体（例えば錠剤）型の製剤とされてもよい。液体製剤は、ヒトまたは動物の体の選択される領域への注射による投与用の製剤とされてもよい。
【００９９】
投与は、好ましくは、「治療上有効な量」で行われ、この量は、個体に利益を示すのに十分な量である。投与する実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、治療中の疾患の性質および重症度に応じるであろう。治療の処方、例えば投薬量に関する決定などは、一般開業医および他の医師の責任の範囲内であり、そして典型的には、治療すべき障害、個々の患者の状態、送達部位、投与法および開業医に知られる他の要因を考慮する。上述の技術およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， 第２０版， ２０００， Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ刊行に見出されうる。
【０１００】
あるいは、ターゲティング療法を用いて、抗体または細胞特異的リガンドなどのターゲティング系の使用によって、特定の種類の細胞に対してより特異的に活性剤を送達してもよい。ターゲティングは、多様な理由のために望ましい可能性もあり；例えば剤が許容不能なほど毒性である場合、またはそうでなければ非常に高い投薬量を必要とする場合、またはそうでなければターゲット細胞に進入不能である場合に望ましい可能性もある。
【０１０１】
細胞および組織をターゲティングすることが可能なＨＳＶは、本明細書にその全体が援用される（ＰＣＴ／ＧＢ２００３／０００６０３； ＷＯ ０３／０６８８０９）に記載される。
【０１０２】
治療しようとする状態に応じて、組成物を単独で、あるいは同時にまたは連続してのいずれかで、他の治療と組み合わせて投与してもよい。
本発明には、こうした組み合わせが明らかに許容しえないかまたは明確に回避される場合を除いて、記載される側面および好ましい特徴の組み合わせが含まれる。
【０１０３】
本発明の側面および態様は、ここで、付随する図に言及して、例として例示されるであろう。さらなる側面および態様が当業者には明らかであろう。この本文に言及されるすべての文書は、本明細書に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
ここで、本発明の原理を例示する態様および実験を付随する図に言及して論じる：
【図１】図１は、肝臓（レーン１）または胎盤（レーン２および３）ｃＤＮＡライブラリーのいずれかから増幅されたＰＣＲ産物を示す１％アガロース／ＴＡＥゲルを示す。ｃ７５０ｂｐ ＩＮＧ４ ｃＤＮＡを矢印で示す。レーンＭ＝２−ｌｏｇ ＤＮＡラダー。
【図２】図２は、１：５００の抗ＩＮＧ４抗体で探査したウェスタンブロットを示す。矢印は、１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染させたＢＨＫ細胞由来の全細胞抽出物に存在する２９ｋＤＡ ＩＮＧ４タンパク質のレーン１および２中の位置を指す。このバンドはまた、０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染した細胞（レーン３および４）でもかすかに可視であるが、偽感染細胞（レーン５）では存在しない。
【図３】ＰＢＳ、ＨＳＶ１７９０またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の腫瘍内注射後の、ＣＰ７０皮下腫瘍移植物を所持する６匹のマウスの群由来の生存データ。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下卵巣腫瘍移植物を持つマウスにおいて腫瘍殺傷を改善する。ＩＮＧ４の発現減少は、グリオーマ進行と関連する。ＩＮＧ４は、血管形成の阻害によって新規増殖を防止する。
【図４】ＰＢＳ、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の腫瘍内注射後の、Ａ４３１皮下腫瘍移植物を所持する６匹のマウスの群由来の腫瘍増殖データ。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下ＳＣＣ腫瘍移植物を持つマウスにおいて腫瘍負荷を減少させる。
【図５】ＰＢＳ、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の腫瘍内注射後の、Ａ４３１皮下腫瘍移植物を所持する６匹のマウスの群由来の生存データ。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下ＳＣＣ腫瘍移植物を持つマウスにおいて腫瘍殺傷を改善する。
【図６】生存中央値。ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６は、ＨＳＶ１７１６単独に比較して、皮下ＳＣＣ腫瘍移植物を持つマウスにおいて生存期間を延長する。
【図７】ＰＢＳ、１ｘ１０６ｐｆｕ ＨＳＶ１７１６または１ｘ１０６ｐｆｕ ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の第１日および第３日の静脈内注射後の、Ａ４３１皮下腫瘍移植物を所持する１０匹のマウスの群由来の腫瘍増殖データ。
【発明を実施するための形態】
【０１０５】
本発明を実行するため、本発明者によって意図される最適な様式の具体的な詳細を、例として以下に示す。本発明が、これらの具体的な詳細に限定されずに実施可能であることが、当業者には明らかであろう。
【０１０６】
腫瘍抑制因子遺伝子、新規増殖阻害剤４を発現するＨＳＶ１７１６変異体
方法および結果
ＩＮＧ４腫瘍抑制因子遺伝子を発現するＨＳＶ１７１６変異体を以下のように構築した。ＮＣＢＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／寄託番号ＮＭ＿０１６１６２ ＧＩ：３８２０１６６９のもと）に寄託されるヒトＩＮＧ４配列を用いて、ＩＮＧ４のＰＣＲ増幅用のプライマーを設計した。順方向プライマー
【０１０７】
【化３】
【０１０８】
は、ＩＮＧ４（太字）のＡＴＧ開始コドンでハイブリダイズし、そして翻訳開始部位の上流にＥｃｏＲ１およびＮｏｔ１制限部位（下線）を取り込む。逆方向プライマー
【０１０９】
【化４】
【０１１０】
は、ＩＮＧ４のＴＡＧ停止コドンから３６ヌクレオチド下流（太字のＩＮＧ４配列）にハイブリダイズし、そしてＸｈｏ１およびＸｂａ１部位（下線）を取り込む。ＩＮＧ４をコードするｃ７５０ｂｐ ｃＤＮＡ（配列番号５）は、商業的に入手可能なヒト肝臓および胎盤ｃＤＮＡライブラリーから成功裡に増幅され（図１）、そして胎盤ｃＤＮＡ（レーン２および３）ライブラリーでより強いバンドが得られたため、これをＩＮＧ４クローニングに用いた。
【０１１１】
ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔｅａｓｙベクター内に連結し、そして配列決定によって、ＮＭ０１６１６２との１００％マッチが確認された。次いで、ＰＣＲ産物を直接ＥｃｏＲ１、その後、Ｘｂａ１で消化し、そして同様に消化した哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ４−ｍｙｃ−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、英国ペーズリー）内に連結した。ミニプレップしたＤＮＡのＢａｍＨＩ消化によって陽性クローンを同定し（ヌクレオチド６０８に、内部ＩＮＧ４ ＢａｍＨＩ部位がある）、そして陽性クローンから、ＮｒｕＩ／ＸｈｏＩ消化によって、ＩＮＧ４発現カセット（ＩＮＧ４ ｃＤＮＡを加えたプラスミド由来のＣＭＶ−ＩＥプロモーター）を切除し、Ｋｌｅｎｏｗを用いて平滑末端化し、そしてＢｇｌＩＩ消化し、平滑末端化し、そしてＣＩＡＰ処理した、相同組換えによるＨＳＶ１７１６変異体の産生に用いたＲＬ１シャトルベクターｐＲＬ１ｄｅｌ／ｇｆｐ内にクローニングした。ＲＬ１ｄｅｌ／ｇｆｐは、ｐＲＬ１−ｄｅｌの修飾型であり、ｇｆｐの発現カセット（ＰＧＫ−ｇｆｐ）を含有する。ＲＬ１−ｄｅｌはプロモーターを含まないクローニングベクターであり、ＩＣＰ３４．５ヌルＨＳＶ−１を生成するのに適している。該ベクターは、以前はＲＬ１遺伝子および隣接配列からなったＨＳＶ−１断片であって、ＲＬ１遺伝子の大部分が除去されて、そしてマルチクローニング配列（ＭＣＳ）で置き換えられた、前記ＨＳＶ−１断片を含有する。ＲＬ１遺伝子座内に挿入しようとする導入遺伝子を、ＲＬ１−ｄｅｌのＭＣＳ内に連結し、そしてＲＬ１隣接配列によって駆動されるＨＳＶ−１ ＤＮＡとの相同組換えの結果、ＩＣＰ３４．５オープンリーディングフレームが同時に欠失され、そして適切な導入遺伝子が取り込まれる。組換えウイルスのプラーク精製を補助するため、緑色蛍光タンパク質遺伝子もまた、ＲＬ１−ｄｅｌのＭＣＳ内に挿入する。
【０１１２】
ＲＬ１−ｄｅｌは、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ ｋ ＤＮＡ断片１２３４５９−１２９４０３を含有し、これにはプラスミドｐＧｅｍ−３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ、英国サザンプトン）のＢａｍＨＩ部位内にクローニングされたＲＬ１遺伝子およびその隣接配列が含まれる。ＲＬ１ ＯＲＦ（１２５２９２−１２５７６９）由来の４７７ｂｐ ＰｆｌＭＩ／ＢｓｔＥＩＩ断片は、ＩＣＰ３４．５遺伝子を不活性化するために取り除かれて、そしてＢｇｌＩＩ、ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩに関するものを含めて、多様な制限酵素を提供するＭＣＳで置き換えられている。
【０１１３】
ＲＬ１−ｄｅｌは、ＷＯ２００５／０４９８４４に記載されている。
ＲＬ１−ｄｅｌ／ｇｆｐを生成するため、ＰＧＫプロモーター／ｇｆｐ遺伝子を含有する１．３ｋｂｐの平滑末端化ＥｃｏＲＩ／ＡｆｌＩＩ断片を、ベクターｐＳＮＲＧ（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ、米国ワシントン州シアトル）から制限消化後にＫｌｅｎｏｗ処理することによって得て、そして制限酵素ＮｒｕＩで切断し、次いで、アルカリホスファターゼ処理したＲＬ１−ｄｅｌベクター内に連結した。
【０１１４】
制限酵素消化によって、ｐＲＬ１−ｄｅｌ／ｇｆｐにおけるＩＮＧ４発現カセットの挿入を確認し、そしてＳｃａＩ消化によってプラスミド５０μｇを直線化し、そしてＧＦＸキット（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国リトルチャルフォント）を用いてカラム精製した後、ＨＳＶ−１ ＤＮＡと組み合わせて用いて、ＢＨＫ細胞を同時トランスフェクションした。ＲＬ１−ｄｅｌ／ｇｆｐ／ＩＮＧ４およびウイルスＤＮＡ（ｃ１００μｇ）を、２５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２血清不含培地中の２０μｌのリポフェクタミン２０００と混合し、そして５０％集密ＢＨＫ細胞を含有する６０ｍｍプレートに添加した。３７℃で４時間インキュベーションした後、培地を取り除き、そして細胞を正確に４分間、２５％ＤＭＳＯで刺激した。５ｍｌ培地で３回洗浄した後、細胞を５ｍｌのＢＨＫ培地とともに３７℃に戻し、そして７２時間放置した。次いで、細胞を上清内に掻き取り、混合物を超音波槽中で２分間超音波処理し、そして必要になるまで、−７０℃で保存した。次いで、６０ｍｍプレート中、Ｖｅｒｏ細胞上に連続希釈をプレーティングし、個々の緑色蛍光プラークを摘み取り、１ｍｌ培地に添加し、そして超音波槽中で２分間超音波処理した後、連続希釈を再び、Ｖｅｒｏ細胞上にプレーティングした。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４のストックを産生する前に、プラーク精製を６回反復した。プラスミドｐＧＥＭ３４．５由来のＡｌｕＩ／ＲｓａＩ ＩＣＰ３４．５断片を用いたサザンブロッティング、およびＨＳＶ１７１６のＩＣＰ３４．５欠失領域に渡って増幅するプライマーを用いたＰＣＲの両方によって、ＨＳＶ１７１６のＲＬ１遺伝子座中のＩＮＧ発現カセットの存在を確認した。挿入されたＩＮＧ４導入遺伝子の発現を確認するため、６０ｍｍプレート中のＢＨＫ細胞の集密単層を、０．１または１ｐｆｕ／細胞いずれかのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染させ、そして２４時間後、０．２ｍｌのＳＤＳ ＰＡＧＥ試料緩衝液を添加することによって、全細胞抽出物を調製した。ＩＮＧ４抗体（Ａｂｃａｍ、英国ケンブリッジ）を用いて、ＳＤＳ ＰＡＧＥ／ウェスタンブロッティングによって、１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染した細胞において、ｃ２９ｋＤａタンパク質が同定された（図２、レーン１および２）。０．１ｐｆｕ／細胞のＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に感染した細胞において、より弱いバンドが観察され（図２；レーン３および４）、そしてこのタンパク質は、偽感染細胞では存在しなかった（図２、レーン５）。
【実施例】
【０１１５】
実施例１−ｉｎ ｖｉｖｏ実験
皮下腫瘍移植物を所持するヌードマウスの腫瘍内注射
最初の実験において、ＣＰ７０卵巣腫瘍細胞株の皮下移植物を所持する６匹のマウスに、第１日および第３日に、１ｘ１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を腫瘍内注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日監視した。対照マウスには、ＨＳＶ１７９０、酵素、ニトロ還元酵素を発現するＨＳＶ１７１６変異体のいずれかを注射するか、あるいは同様の体積のＰＢＳを注射した。生存データを図３に示す。
【０１１６】
ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置した６匹のマウスのうち、１つの腫瘍が完全退縮を示し、４つの腫瘍が未処置腫瘍よりも緩慢な速度で増殖し、そして１つの腫瘍は潰瘍化し、そして該マウスは分析から取り除かれた。各処置を評価するため、生存期間（腫瘍が許容されうる上限に達した時点によって測定されるようなもの）を用いると、それぞれ１１日または１８日の生存期間を有した、ウイルスなしで処置した動物またはＨＳＶ１７９０で処置した動物に比較すると、ＩＮＧ４ウイルスで処置した動物は、２３．５日の平均生存を有した。図３に示す生存曲線の対数順位比較は、有意な相違を示し、ｐ値は０．０３であった。ＨＳＶ１７９０に感染したマウスにはＣＢ１９５４はまったく投与されず、そしてこれらの状況下では、このウイルスがＨＳＶ１７１６と同等であることに注目されたい。
【０１１７】
続く実験において、ヒトＳＣＣ Ａ４３１腫瘍細胞の皮下移植物を所持する６匹のマウス群に、１ｘ１０７ｐｆｕのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６のいずれか、あるいは同等の体積のＰＢＳを、第１日および第３日に注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日決定した。
【０１１８】
図４は、平均腫瘍体積を示し、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置した群が、ウイルスなしで処置したか、または親ＨＳＶ１７１６で処置した群のいずれよりも小さい平均腫瘍体積を有したことを示す。第１５日でのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６間、ならびにＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびウイルスなしの間の腫瘍体積相違は有意に異なり、それぞれｐ＝０．０３およびｐ＝０．００７であることが、統計分析によって示された。
【０１１９】
図５は、ウイルスなし、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置した腫瘍所持マウスに関するＫＭ生存グラフを示す。ウイルスなしで処置したマウスは、８日間の生存中央値を有し、ＨＳＶ１７１６で処置したものは、１２日の生存中央値を有し、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置したものは、２１日の生存中央値を有した。対数順位分析による図５の曲線の比較は、これらの間の相違が、ｐ＝０．００４で有意であることを示し、したがってこの腫瘍モデルにおいて、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が腫瘍負荷を有意に減少させ、そして生存を増進させることを明らかに立証する。
【０１２０】
静脈内注射
皮下ヒトＳＣＣ Ａ４３１腫瘍を所持する１０匹のマウスの群に、第１日および第３日に、ＰＢＳ（ウイルスなし）、あるいは１ｘ１０６ｐｆｕのＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を静脈内注射し、そして腫瘍増殖および生存を毎日監視した。静脈内注射後、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ウイルスなしの対照または非修飾ＨＳＶ１７１６に比較して、腫瘍増殖を有意に減少させた（図６）。注射１０日後、ＨＳＶ１７１６注射マウスの平均腫瘍体積は、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４注射マウスの１９３±１５２ｍｍ２に比較して、４２１±５５ｍｍ２であり、そしてスチューデントｔ検定を用いると、この相違は、ｐ＝０．００２２で非常に有意である。同様に、第１４日または２０日、ＨＳＶ１７１６注射マウスの平均腫瘍体積は、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスの、それぞれ４７６±４４８ｍｍ２または７７６±４３８ｍｍ２に対して、それぞれ１０９６±４０２ｍｍ２または１２５３±１５５ｍｍ２であり、そしてスチューデントｔ検定を用いると、これらの相違は、それぞれｐ＝０．０１２５または０．０１６２で、どちらも有意である。ウイルスを投与されないか、または１ｘ１０６ｐｆｕのＨＳＶ１７１６を投与されたマウスは、およそ１４日の生存中央値を有し、一方、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスは１７日の生存中央値を有し、４／１０のマウスが第２０日を超えて生存し、この時点では、ＰＢＳまたはＨＳＶ１７１６を注射されたすべてのマウスは屠殺されていた。マウス群各々からいくつかの腫瘍を屠殺時点で取り除き、そして機械的にホモジナイズした後、腫瘍抽出物中のウイルスを力価決定し、結果を表１に示した。
【０１２１】
ウイルスは、静脈内ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスから採取した３つの腫瘍すべてから容易に抽出されたが、ＨＳＶ１７１６を投与されたマウスの１／３でしか検出されず、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４腫瘍で検出されるウイルスの量は、ＨＳＶ１７１６腫瘍から抽出された量よりもおよそ１０００倍多く、腫瘍内ではＨＳＶ１７１６よりもＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の複製がより優れていることが示唆された。先の研究は、免疫適格性ラットにおけるものであるが、投与２４時間後、０．００１％の静脈内注射ウイルスのみが、腫瘍中に留まることを示しており（Ｓｃｈｅｌｌｉｎｇｅｒｈｏｕｔら １９９８、２０００）、そしてこれがＳＣＩＤマウスに関して合理的な近似値を提供すると仮定すると、静脈内投与された２ｘ１０６ｐｆｕのうち、最初には、２０ｐｆｕのみが腫瘍に到達するであろう。ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４間で、生体分布の相違がないと仮定すると、上記データは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、ＨＳＶ１７１６よりもヒトＡ４３１ ＳＣＣ腫瘍移植物内での複製が有意に優れており、そしてこの増進された増殖が生存を改善することを立証する。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４マウスの１匹は、第３０日まで生存し、この時点までに、腫瘍は増殖を停止し、そしてほぼ完全に退縮した。このマウスを屠殺した後、残った腫瘍組織を含めてすべての臓器を採取し、そして機械的ホモジナイズおよび力価決定後、これらの組織のいずれにもウイルスはまったく見られず、このマウスにおける完全な回復およびウイルスクリアランスが示唆された。実際、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を投与されたマウスのいずれにもウイルス毒性の証拠はまったくなく、ウイルスが親ＨＳＶ１７１６の制限された複製適格性を保持し、その増殖が活発に分裂中の腫瘍細胞に限定されることが示された。
【０１２２】
実施例２−ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
異なる細胞株上でのＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の増殖
上記ｉｎ ｖｉｖｏデータは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、非修飾ＨＳＶ１７１６より高い効率で複製することによって、増進された腫瘍退縮を示すことを示唆し、そして低い感染多重度で感染した多様な異なる細胞株を用いて、これをｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。用いた細胞株は、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、Ａ４３１ヒトＳＣＣ、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌であり、そしてこれらの株におけるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の増殖を、野生型ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲ（ＩＮＧ４とほぼ同じ分子量のターゲティング部分を発現するＥＧＦＲターゲティング化ＨＳＶ１７１６変異体）と比較した。
【０１２３】
細胞を６０ｍｍプレートにプレーティングし、そして２４時間後、およそ１００ｐｆｕ（ＢＨＫのみ）または１０００ｐｆｕ（すべての他の細胞種）のＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。これらの感染に関する各ウイルス調製の希釈をＢＨＫ細胞上で力価決定して、投入ウイルスの量を正確に確認した。各細胞種上の各ウイルス感染を少なくとも４つ組で実行した。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。以下の表２〜８に、ＡＮＯＶＡを用いて行った統計的比較とともに、結果を収量／投入ビリオンで報告する。
【０１２４】
ＢＨＫ細胞に関しては、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する高いウイルス収量／投入ビリオンは非常に類似であり、これらの３つのウイルスが、この細胞種において類似の複製効率を有し、そして投入ビリオンあたりおよそ５ｘ１０６ウイルスに同等である収量は、おそらくこの実験において、ＢＨＫ細胞の１００ｐｆｕ感染から達成可能な最大産出量であろうことが示される。ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関しては、収量／投入ウイルスは、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関してよりもおよそ１０倍少なく、これはこの実験において、このウイルスがＢＨＫ細胞におけるよりより効率的に複製しないことを示唆する。表２を参照されたい。
【０１２５】
Ｖｅｒｏ細胞において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンは少なくとも２倍増加する。表３を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と比較すると、これらの相違が有意であることが示された。表３におけるデータのＡＮＯＶＡ分析によって、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較したＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、それぞれｐ＜０．０１、ｐ＜０．０５またはｐ＜０．００１の有意なｐ値が生じ、そしてこれらの値はすべて９５％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４中のＩＮＧ４発現カセットの存在が、この細胞種においてウイルス複製を改善すると結論づけ可能である。
【０１２６】
別個の実験において、５ｘ１０５ Ｖｅｒｏ細胞を６０ｍｍプレートにプレーティングし、そして１ｐｆｕ／細胞の感染多重度で、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに２つ組で感染させる前に、６時間付着させた。正確に２４時間培養した後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関しては、ウイルス収量／感染細胞は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関するウイルス収量／感染細胞のおよそ２倍であった。１ｐｆｕ投入／細胞では、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋の５０／７０、ＨＳＶ１７１６の８０／８８またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの５０／７０に比較して、１４０／２５０のビリオン／感染細胞を生じた。したがって、Ｖｅｒｏ細胞における２４時間の感染中（ウイルス複製の１周期と同等）、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製するはずである。
【０１２７】
ヒト卵巣癌細胞株Ｏｖｃａｒ３細胞に関しては、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンは２〜４倍増加する。表４を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と比較すると、相違が有用であることが示される。表４のデータをＡＮＯＶＡ分析すると、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの各々に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、すべてｐ＜０．００１のｐ値が生じ、そしてこれらはすべて非常に有意であり、９９．９％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、この細胞種においてより効率的に複製するはずである。
【０１２８】
ヒト扁平上皮癌細胞株Ａ４３１に関しては、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりもより効率的に複製し、ＨＳＶ１７１６に比較して収量／投入ビリオンは１００倍増加し、そしてＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して１０倍増加する。表５を参照されたい。ＡＮＯＶＡによって、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲいずれかに関する収量／投入ビリオンと統計的に比較すると、両方に関してｐ＜０．０５のｐ値が生じ、相違が有意であり、９５％信頼限界より高いことが示され、これは親ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６変異体ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、この細胞種においてより効率的に複製するはずであることを示す。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する平均収量／投入ビリオンは、野生型ＨＳＶ−１ １７＋に関する平均収量／投入ビリオンよりも高いが、相違は有意ではない（ｐ＞０．０５）。しかし、ＨＳＶ−１ １７＋はＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりも高い平均収量／投入ビリオンを有するが、これらの相違のいずれも有意ではない（どちらもｐ＞０．０５）。同様に、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する平均収量／投入ビリオンは、ＨＳＶ １７１６に関する平均収量／投入ビリオンよりも高いが、相違は有意ではない（ｐ＞０．０５）。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ−１ １７＋に関する収量／投入ビリオンを、より厳密でないスチューデントｔ検定を用いて比較すると、相違はｐ＝０．００４で有意であり、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４がＨＳＶ−１ １７＋よりもＡ４３１細胞においてより効率的に複製することが示唆される。
【０１２９】
ヒト乳腺癌細胞において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンがおよそ１０倍増加する。表６を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と比較すると、相違が有意であることが示される。表６のデータのＡＮＯＶＡ分析によって、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの各々に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、すべてｐ＜０．００１の有意なｐ値が生じ、そしてこれらは非常に有意であり、９９．９％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、この細胞株においてより効率的に複製することが示される。
【０１３０】
ヒト卵巣癌細胞株ＣＰ７０に関して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりもより効率的に複製し、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して収量／投入ビリオンは３倍増加する。表７を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンを、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲいずれかに関する収量／投入ビリオンと、ＡＮＯＶＡによって統計的に比較すると、両方に関してｐ＜０．０１のｐ値が生じ、相違は有意であり、９９％信頼限界より高いことが示され、これは、親ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６変異体ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が、この細胞種においてより効率的に複製するはずであることを示す。ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオン間に、有意な相違はなかった（ｐ＜０．０５）。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する平均収量／投入ビリオンは、野生型ＨＳＶ−１ １７＋に関する平均収量／投入ビリオンとは有意には異ならなかった（ｐ＞０．０５）。しかし、ＨＳＶ−１ １７＋はＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲのいずれよりもより効率的に複製し、そしてこれらの相違は有意であり（ｐ＜０．０１）、ＨＳＶ１７１６／ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲは、この細胞種において複製に関して損傷されていることが示される。重要なことに、ＩＮＧ４の発現は、この損傷を克服し、そして複製効率を野生型レベルに回復させる。
【０１３１】
ヒトＨｕＨ７肝細胞癌細胞において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲよりもより効率的に複製し、収量／投入ビリオンはおよそ５倍増加する。表８を参照されたい。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンの各々と収量／投入ビリオンを比較すると、相違が有意であることが示された。表８中のデータのＡＮＯＶＡ分析によって、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの各々に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関して、すべてｐ＜０．００１の有意なｐ値が生じ、そしてこれらは非常に有意であり、９９．９％信頼限界より高いため、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、この細胞株においてより効率的に複製するはずである。
【０１３２】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの弱毒化ＨＳＶ１７１６表現型の特質は、ウイルスがＮＩＨ ３Ｔ６細胞において複製不能であることであり、一方、これらの細胞は、ＨＳＶ−１ １７＋複製に関して完全に許容性である。６０ｍｍプレート中、２つ組で、ＮＩＨ ３Ｔ６細胞を１０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取して、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲで３Ｔ６細胞を感染させた後、ウイルスはまったく検出されず、一方、２つ組の３Ｔ６細胞のＨＳＶ−１ １７＋感染からの収量は、２．０ｘ１０６／３．０ｘ１０６ｐｆｕであった。したがって、ＩＮＧ４発現がＨＳＶ１７１６の複製を増進させる能力は、弱毒化表現型の負担分には到達せず、そして感染細胞内のＩＮＧ４活性は、ＩＣＰ３４．５遺伝子の欠失によって引き起こされる複製制限を克服することは不可能である。
【０１３３】
恒常的にＩＮＧ４を発現するよう操作されたＢＨＫ細胞上での増殖
ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を生成するため、ＩＮＧ４ ｃＤＮＡをまず、哺乳動物発現プラスミドｐＣＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ内にクローニングし、そしてこのベクターを用いて、ＩＮＧ４を恒常的に発現するＢＨＫ細胞株を生成した。２５０μｌの血清不含ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中の１０μｌリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合した１００μｇのＩＮＧ４発現ベクターまたは空のｐＣＤＮＡ／ｍｙｃ−ＨｉｓＡプラスミドでＢＨＫ細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション７２時間後、細胞をトリプシン処理し、そして１ｍｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する増殖培地を用いてプレーティングした。ゼオシン抗生物質を用いて細胞を２〜３週間選択し、その後、個々のクローンは明らかに可視であった。細胞をトリプシン処理し、そして２４ウェルプレート中の限界希釈によってクローニングした。ＢＨＫ／ＩＮＧ４またはＢＨＫ／ｐＣＤＮＡ４の５クローンを拡大し、そして０．５ｍｇ／ｍｌゼオシンを含有する適切な培地中で維持した。
【０１３４】
ゼオシンを含まない培地中、各クローンを６０ｍｍプレート中にプレーティングし、そして２４時間後、およそ１０ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋またはＨＳＶ１７１６に感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。感染用に調製した各ウイルスの希釈もまた力価決定して、投入ウイルス量を正確に確認し、そして以下の表９および１０に、スチューデントＴ検定を用いて行った統計的比較とともに、収量／投入ビリオンの結果を報告する。
【０１３５】
トランスフェクション／抗生物質選択によって、恒常的にＩＮＧ４を発現するように操作されたＢＨＫ細胞上のＨＳＶ−１ １７＋の増殖は、空のｐＣＤＮＡ．ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターを用いて産生されたゼオシン耐性ＢＨＫ細胞上の増殖と比較すると、およそ１０倍より効率的である。スチューデントｔ検定を用いて平均を比較することによって、この相違がｐ＜０．０００１で非常に有意であることが示され、９９．９９％を超える信頼限界で、ＩＮＧ４発現がＢＨＫ細胞におけるＨＳＶ−１ １７＋複製を改善することが示される。
【０１３６】
トランスフェクション／抗生物質選択によって、ＩＮＧ４を恒常的に発現するように操作されたＢＨＫ細胞上のＨＳＶ１７１６の増殖は、空のｐＣＤＮＡ４．ｍｙｃ−Ｈｉｓベクターでのトランスフェクションによって生成されたゼオシン耐性ＢＨＫ細胞上の増殖と比較すると、およそ１０倍より効率的である。スチューデントｔ検定を用いて平均を比較することによって、この相違がｐ＝０．０２で非常に有意であることが示され、９８％信頼限界で、ＩＮＧ４発現がＢＨＫ細胞におけるＨＳＶ１７１６複製を改善することが示される。
【０１３７】
実施例３−予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
ｉｎ ｖｉｖｏデータによって、非修飾ＨＳＶ１７１６よりも高い効率で、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が複製することが示唆された。これは、最初に、以下に記載するように、低い感染多重度で感染した多様な異なる細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで確認された。これらの実験には、実施例２に記載する実験が続いた。
【０１３８】
用いた細胞株は、ＢＨＫ、Ｖｅｒｏ、３Ｔ６、Ａ４３１ヒトＳＣＣ、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡヒト乳癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＵＶＷヒト神経膠芽腫であり、そしてこれらを主に、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。
【０１３９】
実験１．細胞を６０ｍｍプレートにプレーティングし、そして２４時間後、１、１０または１００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてこれらのウイルスの各々がｇｆｐを発現しているため、ＴＣＩＤ法を用いて、各試料中のウイルス量を概算した。結果を以下の表１１〜１４に示す。
【０１４０】
実験１は、３Ｔ６細胞を除くすべての細胞種において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４がＨＳＶ１７１６よりもより効率的に複製し、１、１０および１００ｐｆｕの投入量でウイルスのより高い収量を生じることを明らかに立証する。用いた３つのウイルスはすべて、３Ｔ６細胞において複製できず、これらがＨＳＶ１７１６表現型であることが確認された。
【０１４１】
実験２．細胞を６０ｍｍプレート中にプレーティングし、そして２４時間後、２つ組で、５または２０ｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。感染７２時間後、細胞および培地を採取し、１回の凍結／融解周期（−７０℃）に供し、そしてこれらのウイルスの各々がｇｆｐを発現しているため、ＴＣＩＤ法を用いて、各試料中のウイルス量を概算した。結果を以下の表１５〜１７に示す。
【０１４２】
再び、実験２は、すべての細胞種において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４がＨＳＶ１７１６よりもより効率的に複製し、５または２０ｐｆｕの投入量で子孫ウイルスのより高い収量を生じることを明らかに立証する。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４増殖の増進は、特にＯｖｃａｒ３およびＡ４３１細胞において、５ｐｆｕウイルスでより顕著であり、ここで、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４収量は、ＨＳＶ１７１６より最大１００倍大きい。
【０１４３】
実験３．上記細胞種の各々をＴ１７５フラスコに植え付け、そしてひとたび集密となったら、細胞をＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染させた。９６時間培養した後、脱離細胞および上清の両方から高速遠心分離によってウイルスを採取し、そしてＢＨＫ細胞上で力価決定した。フラスコを感染させるのに用いた希釈もまた、ＢＨＫ細胞上で力価決定して、投入ウイルス量を正確に定量化した。各細胞種に関して、ウイルス総量／フラスコ、投入由来の収量％およびＨＳＶ１７１６収量比％に比較した収量比％を表１８に提示する。
【０１４４】
結論
候補腫瘍抑制因子遺伝子ＩＮＧ４を発現するＨＳＶ１７１６変異体は、ＨＳＶ１７１６単独と比較した際、有意に増進された腫瘍増殖阻害、および延長された生存期間を示す。実際、上記実験において直接比較したのではないが、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で処置したＣＰ７０腫瘍所持マウスの生存期間は、プロドラッグＣＢ１９５４と組み合わせたニトロ還元酵素発現変異体ＨＳＶ１７９０での処置後に得られるものと類似であった。転写を制御する際に関与する多様な複合体のサブユニットとしてのＩＮＧ４の仮定される活性を考慮すると、感染した腫瘍細胞におけるこうした作用様式が、ＨＳＶ１７１６溶解性感染の背景に対して、細胞毒性に対するこうした劇的な効果を有するとは予期されないため、２つのモデルにおける生存期間の増進は予期されず、そして驚くべきことである。したがって、ウイルス自体は、ＩＮＧ４過剰発現から生じるいかなる毒性効果よりも迅速に、分裂中の腫瘍細胞を、効率的に殺す。ＩＮＧ４発現は、感染しているがウイルス腫瘍退縮に耐性である腫瘍細胞を破壊する可能性があるが、いかなる所定の腫瘍中のこれらの細胞の比率もＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４で見られる腫瘍破壊増進を説明するのに十分ではないため、これは可能性が低いようである。
【０１４５】
あるいは、感染腫瘍細胞中で発現されるＩＮＧ４は、ＩＬ−６またはＩＬ−８などの抗血管形成剤の放出を生じ、これらは腫瘍内部にある周囲の未感染細胞に局所的に作用して、血管形成を抑制し、腫瘍破壊増進を導きうる。したがって、この仮説によれば、ＩＮＧ４発現は、感染細胞からの局所作用メッセンジャーの放出を刺激し、これが隣接する未感染細胞に作用する結果、血管形成を促進する遺伝子の発現抑制を生じ、腫瘍血管新生の減少および腫瘍破壊の増進を導くであろう。
【０１４６】
さらに、ＣＰ７０ヒト卵巣癌細胞またはＡ４３１ ＳＣＣ移植物のいずれかへのＰＢＳ腫瘍内注射を受けたマウスは、それぞれ１１日または８日の生存中央値を有した。ＨＳＶ１７１６による腫瘍細胞の腫瘍退縮性感染は、これらのモデル両方で、生存中央値を、それぞれ１８日または１２日まで延長した。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を注射すると、生存期間が２３．５日または２１日までさらに延長され、これによって、ＩＮＧ４発現がＨＳＶ１７１６腫瘍退縮強度を有意に増大させることが示された。ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の静脈内投与はまた、静脈内注射されたＨＳＶ１７１６に比較して、腫瘍増殖を減少させ、そして生存を延長し、そして屠殺マウスの腫瘍移植物由来のウイルスの抽出および力価決定によって、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４による腫瘍細胞殺傷増進のための潜在的な作用様式が示された。非修飾ＨＳＶ１７１６で処置されたマウスに比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４を静脈内注射されたマウスの腫瘍から、少なくとも１０００倍多いウイルスが抽出され、これによって、ＨＳＶ１７１６感染細胞におけるＩＮＧ４の発現は、ウイルス複製の効率を改善して、増大した子孫産生を生じることが示唆される。したがって、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４感染中、ＩＮＧ４タンパク質は、ＨＳＶ１７１６複製のために改善された環境を提供するように、細胞を調整する。その結果、感染した腫瘍細胞あたり、より多くの子孫ビリオンが産生され、そして腫瘍退縮のこの増進は腫瘍細胞数を減少させ、そして生存を促進する。一団の異なる細胞株を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏでの実験によって、ＩＮＧ４発現が一団の異なるヒト腫瘍細胞株におけるＨＳＶ１７１６複製の効率を改善することが確認された。
【０１４７】
ＢＨＫ細胞は、この細胞株がウイルス複製の優れた支持体であり、そして常に高い収量が得られるため、野生型ＨＳＶ−１ １７＋およびＨＳＶ１７１６ならびにその変異体の増殖にルーチンで用いられる。ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関しては、６０ｍｍプレートをｃ１００ｐｆｕウイルスに感染させることによって、およそ５ｘ１０８〜１ｘ１０９ｐｆｕが得られ、そしておそらく、これがこの培養形式でのＢＨＫ細胞に関する最大産出量であるため、収量／投入ビリオンにはほとんど相違はなかった。ＨＳＶ−１増殖にはまた、Ｖｅｒｏ細胞も用いてもよいが、この実験では、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンは、ＢＨＫ細胞に関するより低かった。低いｍｏｉでは、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、２倍高い効率で複製し、そしてＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４のこれらの他のウイルス各々との厳密なＡＮＯＶＡ検定を用いた統計的比較によって、相違が有意であることが示された。ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６およびＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲの間では、収量／投入ビリオンにおいて、有意な相違は検出されなかった。さらに、１回の溶解周期に関して、Ｖｅｒｏ細胞を感染させるのに１ｐｆｕ／細胞のはるかにより高いｍｏｉを用いると、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４はやはり、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、２倍の効率で複製し、ＩＮＧ４発現によって与えられる増殖の利点が、単回溶解周期内で起こることが示された。
【０１４８】
一団のヒト腫瘍細胞株（ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌、ＵＶＷヒト神経膠芽腫およびＡ４３１ ＳＣＣ細胞）を用いた予備的ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲいずれに比較しても、これらの細胞種各々で、複製増進を示した。統計的に意味がある比較を可能にするいくつかの複写物を用いた、続く実験において、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンに比較して有意に増加したＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４に関する収量／投入ビリオンが、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌、ＨｕＨ７ヒト肝細胞癌およびＡ４３１ ＳＣＣ細胞において得られ、これらの細胞種において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４産出量は、それぞれ２倍、１０倍、５倍、５倍および１０〜１００倍増進した。有意な相違はまた、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌細胞におけるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４およびＨＳＶ−１ １７＋複製間でも得られたが、ＣＰ７０ヒト卵巣腫瘍細胞においてこれらの２つのウイルス間で複製効率の相違はなかった。Ａ４３１ ＳＣＣ細胞に関しては、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４産出量は、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに比較して、それぞれ１００倍または１０倍、有意に増加し、そしてＡＮＯＶＡを用いると、２倍高いＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４収量／投入ビリオンは、ＨＳＶ−１ １７＋のものと有意には異ならなかったが、スチューデントｔ検定を用いて平均を比較した場合、相違は有意であった。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳腺癌、Ｏｖｃａｒ３ヒト卵巣癌およびＨｕＨ７ヒト肝細胞癌細胞に関しては、Ａ４３１細胞において、ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに関する収量／投入ビリオンに有意な相違はなかった。したがって、５／５ヒト癌細胞株において、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４複製は、親ＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６変異体ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲ（類似のサイズのタンパク質ターゲティング部分を発現する）に比較して、有意により効率的であり、そして野生型ＨＳＶ−１ １７＋に比較して、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４複製は、これらの株の４／５において改善された。
【０１４９】
さらに、１０ｐｆｕ ＨＳＶ−１ １７＋または１０ｐｆｕ ＨＳＶ１７１６のいずれかに感染した場合、収量／投入ビリオンは、空のｐＣＤＮＡ４ベクターでのトランスフェクションから抗生物質耐性を得たＢＨＫ細胞に比較して、トランスフェクション／抗生物質選択によって、ＩＮＧ４を恒常的に発現するように操作されたＢＨＫ細胞の５つの異なるクローンにおいて、有意に１０倍増進された。ＩＮＧ４を恒常的に発現するこうしたＢＨＫ細胞は、ＨＳＶ１７１６およびその変異体、特にウイルス増殖を制限するＤＮＡ挿入物を含むものの増殖のための改善された支持体を提供しうる。
【０１５０】
ＨＳＶ−１ １７＋／ＨＳＶ１７１６感染中のＩＮＧ４発現は、細胞内のウイルス複製効率を改善するように作用するはずであり、感染細胞あたりの子孫ビリオンのより多い産出量を生じる。重要なことに、ＩＮＧ４による複製効率のこの増進は、動物腫瘍モデルにおいて、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４が毒性でなく、そして該ウイルスがＨＳＶ１７１６耐性３Ｔ６細胞株においてｉｎ ｖｉｔｒｏで複製に失敗するため、ＨＳＶ１７１６表現型を損なわなかった。ＩＮＧ４は、ウイルス遺伝子に直接作用して、発現を改善するか、またはウイルスタンパク質と直接相互作用して、その活性を増進させるか、あるいは細胞遺伝子／タンパク質に作用して、細胞環境がウイルス複製をより受け入れるように、細胞環境を調整しうる。ｉｎ ｖｉｖｏで、このウイルス複製改善は、ＨＳＶ１７１６の腫瘍退縮強度を増大させ、より優れた腫瘍細胞殺傷のために、より多くのウイルスを生じる。さらに、血管形成の抑制などの、腫瘍血管新生の減少につながる、他の認識されるＩＮＧ４の活性もまた、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の腫瘍退縮強度増進に寄与しうる。
【０１５１】
参考文献
【０１５２】
【化５】
【０１５３】
表１．
第１日および第３日に、ＰＢＳあるいは１ｘ１０６ｐｆｕのＨＳＶ１７１６またはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４の２回の静脈内注射後、皮下Ａ４３１ ＳＣＣ腫瘍から抽出されたウイルスの量。
【０１５４】
【表１】
【０１５５】
表２． １００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したＢＨＫ細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１５６】
【表２】
【０１５７】
表３． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したＶｅｒｏ細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１５８】
【表３】
【０１５９】
表４． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト卵巣癌Ｏｖｃａｒ３細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６０】
【表４】
【０１６１】
表５． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したＡ４３１ヒトＳＣＣ細胞由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６２】
【表５】
【０１６３】
表６． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞株由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６４】
【表６】
【０１６５】
表７． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト卵巣癌細胞株ＣＰ７０由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６６】
【表７】
【０１６７】
表８． １０００ｐｆｕのＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４またはＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲに感染したヒト肝細胞癌細胞株ＨｕＨ７に関する収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１６８】
【表８】
【０１６９】
表９． １００ｐｆｕのＨＳＶ１７＋に感染したＢＨＫ／ＩＮＧ４またはＢＨＫ／ｐＣＤＮＡ４いずれかの５つの異なるクローン由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１７０】
【表９】
【０１７１】
表１０． １００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６に感染したＢＨＫ／ＩＮＧ４またはＢＨＫ／ｐＣＤＮＡ４いずれかの５つの異なるクローン由来の収量／投入ビリオン（ｐｆｕ）
【０１７２】
【表１０】
【０１７３】
表１１． １ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に感染した後の、異なる細胞種由来の総収量
【０１７４】
【表１１】
【０１７５】
表１２． １０ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に感染した後の、異なる細胞種由来の総収量
【０１７６】
【表１２】
【０１７７】
表１３． １００ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に感染した後の、異なる細胞種由来の総収量
【０１７８】
【表１３】
【０１７９】
表１４． １、１０または１００ｐｆｕでの感染後の、異なる細胞種各々における収量の比（ＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４：ＨＳＶ１７１６）
【０１８０】
【表１４】
【０１８１】
＊ｎ．ｄ．＝ＨＳＶ１７１６に関する収量が０であったため、決定不能。
表１５． ５ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に２つ組で感染した後の、異なる細胞種由来の総ウイルス収量
【０１８２】
【表１５】
【０１８３】
表１６． ２０ｐｆｕのＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６／ＩＮＧ４に２つ組で感染した後の、異なる細胞種由来の総ウイルス収量
【０１８４】
【表１６】
【０１８５】
表１７． ５または２０ｐｆｕで感染した後の、異なる細胞種各々におけるＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４：ＨＳＶ１７１６の収量比
【０１８６】
【表１７】
【０１８７】
表１８． ＨＳＶ−１ １７＋、ＨＳＶ１７１６、ＨＳＶ１７１６ＥＧＦＲまたはＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４でのＴ１７５フラスコの感染に関する、産生ウイルス総量／フラスコ、収量％（産出量／投入量）およびＨＳＶ１７１６収量％／細胞種に比較した収量比／細胞種。
【０１８８】
【表１８−１】
【０１８９】
表１８続き
【０１９０】
【表１８−２】
【０１９１】
＊産出ウイルス量／投入ウイルス量
＊＊ＨＳＶ１７１６収量％に比較したウイルス収量％の比
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルスゲノムがＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルス。
【請求項２】
ＩＮＧ４ポリペプチドがヒトＩＮＧ４ポリペプチドである、請求項１記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項３】
核酸配列が、配列番号４または配列番号５、あるいは配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１または請求項２記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項４】
核酸配列が、配列番号４または配列番号５、あるいは配列番号３のポリペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項５】
配列同一性の前記度合いが少なくとも９０％である、請求項４記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項６】
前記核酸配列が、配列番号４または配列番号５の核酸配列に、その相補体に、あるいは配列番号３のポリペプチドをコードする核酸配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、請求項１〜５のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項７】
ＩＮＧ４ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞に存在すると、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項８】
ＩＮＧ４ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株に感染した細胞に存在すると、前記細胞における単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株の複製効率の増加を導くポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項９】
前記単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＮＧ４をコードする前記核酸に機能可能であるように連結された制御ヌクレオチド配列をさらに含み、前記制御ヌクレオチド配列が前記ＩＮＧ４ポリペプチドの転写を調節する際に役割を果たす、請求項１〜８のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１０】
非神経毒性である、請求項１〜９のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１１】
ＩＣＰ３４．５遺伝子が機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現不能であるように、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方または両方が修飾されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１２】
ＩＣＰ３４．５遺伝子が機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現不能であるように、ＩＣＰ３４．５遺伝子のすべてのコピーが修飾されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１３】
ＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体である、請求項１２記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１４】
少なくとも１つの発現可能ＩＣＰ３４．５遺伝子を欠く、請求項１〜１１のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１５】
前記核酸が、単純ヘルペスウイルスゲノムの少なくとも１つのＲＬ１遺伝子座に位置する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１６】
前記核酸が、単純ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の少なくとも１つの中に位置するか、または該配列と重複する、請求項１〜１５のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１７】
腫瘍退縮性（oncolytic）である、請求項１〜１６のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１８】
ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つの突然変異体である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１９】
ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２０】
寄託番号・・・のもとに、・・・にＥＣＡＣＣに寄託されたＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４。
【請求項２１】
疾患の医学的治療法において使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルス。
【請求項２２】
癌性状態の治療において使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルス。
【請求項２３】
腫瘍の腫瘍退縮治療において使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルス。
【請求項２４】
癌性状態の治療用の薬剤の製造における請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項２５】
腫瘍の腫瘍退縮治療用の薬剤の製造における請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを含む、薬剤、薬学的組成物またはワクチン。
【請求項２７】
薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含む、請求項２６に請求されるような薬剤、薬学的組成物またはワクチン。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む、癌性状態の治療のための方法。
【請求項２９】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む、腫瘍の治療のための方法。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを、細胞に投与する工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を溶解させるかまたは殺傷する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるような単純ヘルペスウイルスに、関心対象の少なくとも１つの細胞または組織を感染させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＩＮＧ４ポリペプチドを発現する方法。
【請求項３２】
（ｉ）過剰なＩＮＧ４を有する単数または複数の細胞を提供し、そして（ｉｉ）細胞（単数または複数）を感染させることが可能なＨＳＶと細胞（単数または複数）を接触させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＨＳＶを複製する方法。
【請求項３３】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を、細胞（単数または複数）内に導入する工程を含む、請求項３２記載のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項３４】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞。
【請求項３５】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列が恒常的プロモーターに機能可能であるように連結されている、請求項３４記載の細胞。
【請求項３６】
ＩＮＧ４ポリペプチドおよび非神経毒性単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法において使用するための、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３７】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法において使用するための、非神経毒性単純ヘルペスウイルス。
【請求項３８】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸および非神経毒性単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項３９】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４をコードする核酸を、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、非神経毒性単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項４０】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する工程を含む、患者を治療する方法。
【請求項４１】
単純ヘルペスウイルス、ならびにＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸および／またはＩＮＧ４ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４２】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において前記単純ヘルペスウイルスの複製を増加させる方法における、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸またはＩＮＧ４ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項４４】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸が請求項２〜９のいずれか一項に定義される通りである、請求項３１〜４３のいずれか一項記載の方法、細胞、核酸、非神経毒性単純ヘルペスウイルス、使用、または組成物。
【請求項１】
単純ヘルペスウイルスゲノムがＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単純ヘルペスウイルス。
【請求項２】
ＩＮＧ４ポリペプチドがヒトＩＮＧ４ポリペプチドである、請求項１記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項３】
核酸配列が、配列番号４または配列番号５、あるいは配列番号３のポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項１または請求項２記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項４】
核酸配列が、配列番号４または配列番号５、あるいは配列番号３のポリペプチドをコードする核酸配列に、少なくとも７５％の配列同一性を有する、請求項１〜３のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項５】
配列同一性の前記度合いが少なくとも９０％である、請求項４記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項６】
前記核酸配列が、配列番号４または配列番号５の核酸配列に、その相補体に、あるいは配列番号３のポリペプチドをコードする核酸配列に、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、請求項１〜５のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項７】
ＩＮＧ４ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルスに感染した細胞に存在すると、前記細胞における単純ヘルペスウイルスの複製効率の増加を導くポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項８】
ＩＮＧ４ポリペプチドが、単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株に感染した細胞に存在すると、前記細胞における単純ヘルペスウイルス１７株または１７１６株の複製効率の増加を導くポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項９】
前記単純ヘルペスウイルスゲノムが、ＩＮＧ４をコードする前記核酸に機能可能であるように連結された制御ヌクレオチド配列をさらに含み、前記制御ヌクレオチド配列が前記ＩＮＧ４ポリペプチドの転写を調節する際に役割を果たす、請求項１〜８のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１０】
非神経毒性である、請求項１〜９のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１１】
ＩＣＰ３４．５遺伝子が機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現不能であるように、ＩＣＰ３４．５遺伝子の一方または両方が修飾されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１２】
ＩＣＰ３４．５遺伝子が機能するＩＣＰ３４．５遺伝子産物を発現不能であるように、ＩＣＰ３４．５遺伝子のすべてのコピーが修飾されている、請求項１〜１０のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１３】
ＩＣＰ３４．５ヌル突然変異体である、請求項１２記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１４】
少なくとも１つの発現可能ＩＣＰ３４．５遺伝子を欠く、請求項１〜１１のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１５】
前記核酸が、単純ヘルペスウイルスゲノムの少なくとも１つのＲＬ１遺伝子座に位置する、請求項１〜１４のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１６】
前記核酸が、単純ヘルペスウイルスゲノムのＩＣＰ３４．５タンパク質コード配列の少なくとも１つの中に位置するか、または該配列と重複する、請求項１〜１５のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１７】
腫瘍退縮性（oncolytic）である、請求項１〜１６のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１８】
ＨＳＶ−１ １７株またはＦ株、あるいはＨＳＶ−２ ＨＧ５２株の１つの突然変異体である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項１９】
ＨＳＶ−１ １７株突然変異体１７１６である、請求項１〜１７のいずれか一項記載の単純ヘルペスウイルス。
【請求項２０】
寄託番号・・・のもとに、・・・にＥＣＡＣＣに寄託されたＨＳＶ１７１６ＩＮＧ４。
【請求項２１】
疾患の医学的治療法において使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルス。
【請求項２２】
癌性状態の治療において使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルス。
【請求項２３】
腫瘍の腫瘍退縮治療において使用するための請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルス。
【請求項２４】
癌性状態の治療用の薬剤の製造における請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項２５】
腫瘍の腫瘍退縮治療用の薬剤の製造における請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項２６】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを含む、薬剤、薬学的組成物またはワクチン。
【請求項２７】
薬学的に許容されうるキャリアー、アジュバントまたは希釈剤をさらに含む、請求項２６に請求されるような薬剤、薬学的組成物またはワクチン。
【請求項２８】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む、癌性状態の治療のための方法。
【請求項２９】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む、腫瘍の治療のための方法。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか一項に請求されるような単純ヘルペスウイルスを、細胞に投与する工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を溶解させるかまたは殺傷する方法。
【請求項３１】
請求項１〜２０のいずれか一項に定義されるような単純ヘルペスウイルスに、関心対象の少なくとも１つの細胞または組織を感染させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＩＮＧ４ポリペプチドを発現する方法。
【請求項３２】
（ｉ）過剰なＩＮＧ４を有する単数または複数の細胞を提供し、そして（ｉｉ）細胞（単数または複数）を感染させることが可能なＨＳＶと細胞（単数または複数）を接触させる工程を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでＨＳＶを複製する方法。
【請求項３３】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を、細胞（単数または複数）内に導入する工程を含む、請求項３２記載のｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ法。
【請求項３４】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列を含む異種構築物を含む、単純ヘルペスウイルスに感染した、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞。
【請求項３５】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸配列が恒常的プロモーターに機能可能であるように連結されている、請求項３４記載の細胞。
【請求項３６】
ＩＮＧ４ポリペプチドおよび非神経毒性単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法において使用するための、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸。
【請求項３７】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法において使用するための、非神経毒性単純ヘルペスウイルス。
【請求項３８】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸および非神経毒性単純ヘルペスウイルスを、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸の使用。
【請求項３９】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４をコードする核酸を、治療の必要がある患者に投与する工程を含む療法用の薬剤の製造における、非神経毒性単純ヘルペスウイルスの使用。
【請求項４０】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を患者に投与する工程を含む、患者を治療する方法。
【請求項４１】
単純ヘルペスウイルス、ならびにＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸および／またはＩＮＧ４ポリペプチドを含む、組成物。
【請求項４２】
非神経毒性単純ヘルペスウイルスおよびＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸を含む、薬学的組成物。
【請求項４３】
単純ヘルペスウイルスに感染した細胞において前記単純ヘルペスウイルスの複製を増加させる方法における、ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸またはＩＮＧ４ポリペプチドのｉｎ ｖｉｔｒｏでの使用。
【請求項４４】
ＩＮＧ４ポリペプチドをコードする核酸が請求項２〜９のいずれか一項に定義される通りである、請求項３１〜４３のいずれか一項記載の方法、細胞、核酸、非神経毒性単純ヘルペスウイルス、使用、または組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公表番号】特表２０１０−５１８８１６（Ｐ２０１０−５１８８１６Ａ）
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５４９４７２（Ｐ２００９−５４９４７２）
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００５２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９９１８９
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０６１６４４５３）クルセイド ラボラトリーズ リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月３日（２０１０．６．３）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年２月１５日（２００８．２．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００５２７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／０９９１８９
【国際公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【出願人】（５０６１６４４５３）クルセイド ラボラトリーズ リミテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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