単離ＧＲＰ９４リガンド結合ドメインポリペプチドおよびそれをコードする核酸、その結晶、およびそれを用いるスクリーニング方法
【課題】単離GRP94リガンド結合ドメインポリペプチド、その三次元結晶構造、およびそれを用いたHsp90タンパク質のモジュレーターの設計方法を提供する。
【解決手段】実質的に純粋な結晶であるGRP94リガンド結合ドメインポリペプチド、及び該結晶化ポリペプチドの作成方法。また、Hsp90タンパク質のモジュレーターを決定する方法、GRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを設計する方法、及びGRP94モジュレーターを同定する方法。更に１つのHsp90ポリペプチドの生物学的活性をGRP94と比較して選択的にモジュレートするHsp90モジュレーターを同定する方法。
【解決手段】実質的に純粋な結晶であるGRP94リガンド結合ドメインポリペプチド、及び該結晶化ポリペプチドの作成方法。また、Hsp90タンパク質のモジュレーターを決定する方法、GRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを設計する方法、及びGRP94モジュレーターを同定する方法。更に１つのHsp90ポリペプチドの生物学的活性をGRP94と比較して選択的にモジュレートするHsp90モジュレーターを同定する方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に純粋な結晶であるGRP94リガンド結合ドメインポリペプチド。
【請求項２】
結晶が、格子定数 a = 99.889 Å, b =89.614 Å, c = 60.066 Å; α = β = γ =90.132°; 空間群対称性 C2; および対称単位における2 GRP94 + NECA 複合体を有する単位格子を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
結晶が、格子定数 a = 89.200 Å, b =99.180 Å, c = 63.071 Å; α = β = γ =90.0°; 空間群対称性 C222(1); および対称単位における1 GRP94 + NECA 複合体を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
GRP94ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項４のポリペプチド。
【請求項５】
GRP94ポリペプチドは、リガンドとの複合体である、請求項１のポリペプチド。
【請求項６】
リガンドがNECAである、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
GRP94ポリペプチドは、表１、２または３に相当する座標により更に特徴付けられる結晶構造を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項８】
結晶が、結晶化GRP94ポリペプチドの三次元構造が、約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定され得るようなものである、請求項１のポリペプチド。
【請求項９】
結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造を約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを結晶化すること、および
(b)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを分析し、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造を決定し、それにより、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造が約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定されること、
を含む当該方法。
【請求項１０】
分析がＸ線回折による、請求項９の方法。
【請求項１１】
結晶化が、ハンギングドロップ法により行われ、そしてGRP94リガンド結合ドメインは、リザーバーと混合される、請求項９の方法。
【請求項１２】
リザーバーは、100 mM Tris-HCl, pH 7.6、150-250 mM MgCl2、および33-38% ポリエチレングリコールを含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
結晶化が、リガンドを伴うGRP94リガンド結合ドメインを結晶化することを更に含む、請求項９の方法。
【請求項１４】
リガンドが、アデノシン誘導体である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを作成する方法であって、
(a)リザーバーを伴うGRP94リガンド結合ドメインを含む溶液をインキュベーションすること、
(b)ハンギングドロップ法を用い、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを結晶化し、それにより、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドが作成されること、
を含む当該方法。
【請求項１７】
インキュベーションが、リガンドを伴うGRP94リガンド結合ドメインをインキュベーションすることを更に含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項16の方法により産生された結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチド。
【請求項２１】
Hsp90タンパク質のモジュレーターを設計する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの原子構造座標に基づき、Hsp90タンパク質のリガンド結合部位中のアミノ酸との相互作用を形成するであろうHsp90タンパク質のモジュレーター候補を設計すること、
(b)当該モジュレーターを合成すること、および
(c)当該モジュレーター候補がHsp90タンパク質の活性をモジュレートするかどうか決定し、それにより、Hsp90タンパク質のモジュレーターを設計すること、
を含む当該方法。
【請求項２２】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
原子構造座標が、表１、２または３に示す原子構造の座標である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
GRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを設計する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの結晶を得ること、
(b)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの結晶である三次元構造を決定すること、および
(c)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの結晶である三次元構造に基づき、モジュレーターを合成し、それにより、GRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを設計すること、
を含む当該方法。
【請求項２７】
当該方法が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドをモジュレーター候補と接触させること；および当該モジュレーター候補の結合について、当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの活性の変化について、またはその両方についてGRP94リガンド結合ドメインポリペプチドをアッセイすることを更に含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
結晶が、斜方晶型である、請求項２６の方法。
【請求項２９】
結晶が、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造が約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定され得るようなものである、請求項２６の方法。
【請求項３０】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項２６の方法。
【請求項３１】
原子構造座標が、表１、２または３に示すような原子構造の座標である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項３０の方法。
【請求項３３】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項３２の方法。
【請求項３４】
GRP94モジュレーターを同定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインの原子座標をコンピューターモデリングシステムに供すること、
(b)GRP94リガンド結合ドメインの結合ポケット中に空間的に適合するリガンドをモデリングし、それにより、GRP94 モジュレーターを同定すること、
を含む当該方法。
【請求項３５】
方法が、GRP94の活性を増大または減少するモデル化リガンドを、GRP94仲介活性についてアッセイで同定することを更に含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
原子座標が、表１、２または３に示す原子座標である、請求項３４の方法。
【請求項３７】
他のHsp90ポリペプチドと比較してGRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを同定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの原子座標をコンピューターモデリングシステムに供すること、および
(b)GRP94リガンド結合ドメインの結合ポケット中に適合し、そしてHsp90サブタイプ間に保存されるGRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの、コンホメーション的に制限された残基と相互作用する、リガンドをモデリングし、それにより、他のHsp90ポリペプチドに比較してGRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを同定すること、
を含む当該方法。
【請求項３８】
方法が、GRP94に選択的に結合し、当該GRP94の活性を増大または減少するモデル化リガンドを、GRP94活性について生物学的アッセイで同定することを更に含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む請求項３７の方法。
【請求項４０】
原子構造座標が、表1-2に示す原子構造の座標である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
１つのHsp90ポリペプチドの生物学的活性をGRP94と比較して選択的にモジュレートするHsp90 モジュレーターを同定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを記載する原子構造座標のセットおよびHsp90リガンド結合ドメインを記載する少なくとも１つの他の原子構造座標のセットを提供すること、ここで、それぞれのリガンド結合ドメインはリガンド結合部位を含む、
(b)当該原子構造座標のセットを比較し、少なくとも１つの当該セット間の相違を同定すること、
(c)ステップ(b)の相違に相互作用すると予測される候補リガンドを設計すること、
(d)当該候補リガンドを合成すること、および
(e)GRP94との比較として、Hsp90を選択的にモジュレートする能力について、当該合成候補リガンドを試験し、それにより、Hsp90の生物学的活性をGRP94と比較して選択的にモジュレートするHsp90 モジュレーターが同定されること、
を含む当該方法。
【請求項４４】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの原子構造座標が、表1-2に示す原子構造の座標である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
GRP94ポリペプチドのモジュレーターを設計する方法であって、
(a)候補GRP94リガンドを選択すること、
(b)結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元モデルを用い、GRP94ポリペプチドのどのアミノ酸またはアミノ酸群が当該リガンドと相互作用するかを決定すること、
(c)当該リガンドがGRP94ポリペプチドの活性をモジュレートする程度を、GRP94活性について生物学的アッセイで同定すること、
(d)当該リガンドの化学的修飾を選択すること、ここで、GRP94ポリペプチドのアミノ酸と当該リガンドとの間の相互作用が当該化学的修飾によりモジュレートされると予測される、
(e)当該選択した化学的修飾で化学的化合物を合成し、修飾リガンドを形成すること、
(f)当該修飾リガンドを当該GRP94ポリペプチドと接触させること、
(g)当該修飾リガンドが、GRP94ポリペプチドの生物学的活性をモジュレートする程度をGRP94活性について生物学的アッセイで同定すること、および
(h)修飾リガンドの存在下での当該GRP94ポリペプチドの生物学的活性を、非修飾リガンドの存在下でのGRP94ポリペプチドの生物学的活性と比較し、それより、GRP94ポリペプチドのモジュレーターを設計すること、
を含む当該方法。
【請求項４９】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項４８の方法。
【請求項５０】
原子構造座標が、表１、２または３に示す原子構造の座標である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項４９の方法。
【請求項５２】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項５１の方法。
【請求項５３】
修飾リガンドの存在下でのGRP94ポリペプチドの生物学的活性が、非修飾リガンドの存在下でのGRP94ポリペプチドの生物学的活性から変化するならば、方法が、ステップ(a)から(f)までを繰り返すことを更に含む、請求項４８の方法。
【請求項５４】
GRP94ポリペプチドに対するリガンドの結合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元原子座標に基づき、試験インヒビター化合物を設計すること、
(b)GRP94ポリペプチドを、試験インヒビター化合物の存在下でリガンドと共にインキュベーションすること、
(c)GRP94ポリペプチドに結合するリガンドの量を決定すること、ここで、当該試験インヒビター化合物の非存在下でのリガンドの結合に比例して、当該試験インヒビター化合物の存在下でのGRP94タンパク質に対するリガンドの結合が減少することは阻害を示す、
(d)リガンド結合の減少が観察されるならば、リガンド結合のインヒビターとしての試験化合物を同定し、これにより、GRP94ポリペプチドに対するリガンドの結合を阻害する化合物を同定すること、
を含む当該アッセイ方法。
【請求項５５】
原子構造座標は、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項５４の方法。
【請求項５６】
原子構造座標が、表１および２に示す原子構造の座標である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項５５の方法。
【請求項５８】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項５７の方法。
【請求項５９】
GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドのモジュレーターについて複数の化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験サンプルのライブラリーを提供すること、
(b)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを各試験サンプルと接触させること、
(c)試験サンプルと当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドとの間の相互作用を検出すること、
(d)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドと相互作用する試験サンプルを同定すること、
(e)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドと相互作用する試験サンプルを単離し、これにより、複数の化合物を、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドのモジュレーターについてスクリーニングすること、
を含む当該方法。
【請求項６０】
試験サンプルがサブストレートに結合する、請求項５８の方法。
【請求項６１】
試験サンプルをサブストレートにおいて直接合成する、請求項５８の方法。
【請求項６２】
リガンド結合ドメインポリペプチドが結晶である、請求項５８の方法。
【請求項６３】
以下を含む、単離GRP94リガンド結合ドメイン(LBD)ポリペプチド：
(a)配列番号3または5の何れか１つのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、
(b)配列番号3または5の何れか１つと実質的に同一である核酸分子によりコードされるポリペプチド、
(c)配列番号4または6の何れか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(d)配列番号4または6の何れか１つのポリペプチドの生物学的等価物であるポリペプチド、または
(e)配列番号4または6の何れか１つのポリペプチドとの特異的結合を示す抗体と免疫学的に交差反応するポリペプチド。
【請求項６４】
以下を含む、GRP94リガンド結合ドメイン(LBD)ポリペプチドをコードする単離核酸分子：
(a)配列番号3または5の何れか１つのヌクレオチド配列、
(b)配列番号3または5の何れか１つと実質的に同一である単離核酸分子、
(c) ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号3または5の何れか１つに開示の核酸配列にハイブリダイズし、GRP94 LBD ポリペプチドをコードする単離核酸分子、または
(d)遺伝学コードの同義性のため、ヌクレオチド配列中の上記核酸分子(a)、(b)または(c)とは異なり、そして上記核酸分子(a)、(b)または(c)によりコードされるGRP94 LBD ポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項６５】
配列番号3または5の何れか１つの連続20のヌクレオチド配列と同一である20のヌクレオチド配列を更に含む、請求項６４の単離核酸分子。
【請求項６６】
異種性プロモーターに作動可能なように連結した請求項６４の核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項６７】
請求項６６のキメラ遺伝子を含むベクター。
【請求項６８】
請求項６６のキメラ遺伝子を含む宿主細胞。
【請求項６９】
GRP94ポリペプチドをコードする核酸分子を検出する方法であって、
(a)核酸物質を含む生体サンプルを獲得すること、
(b)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、請求項６４の核酸分子を(a)の当該生体サンプルにハイブリダイズさせ、それにより、請求項６４の核酸と当該生体サンプル中の核酸との間に二重鎖構造を形成させること、および
(c)(b)の二重鎖構造を検出し、それにより、核酸分子をコードするGRP94を検出すること、
を含む当該方法。
【請求項７０】
請求項６３のGRP94ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項７１】
GRP94ポリペプチドを特異的に認識する抗体を産生するための方法であって、
(a)請求項６３のGRP94ポリペプチドまたはその部分を組換え的または合成的に産生すること、
(b)(a)のポリペプチドを製剤化し、それにより、有効な免疫源とすること、
(c)(b)の当該製剤を動物に投与し、抗体の産生を含む免疫応答を動物で生じさせること、ここで、抗体は、当該動物の血清中に存在する、および
(d)(c)の動物から当該血清を回収すること、ここで当該血清は、GRP94ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含んでいる、
を含む当該方法。
【請求項７２】
GRP94ポリペプチドのレベルを検出するための方法であって、
(a)ペプチド物質を含む生体サンプルを得ること、および
(b)(a)の生体サンプル中のGRP94ポリペプチドを、請求項７０の抗体との免疫学的反応により検出し、それによって、サンプル中のGRP94ポリペプチドの量を決定すること、
を含む当該方法。
【請求項７３】
GRP94 LBD機能をモジュレートする物質を同定するための方法であって、
(a)GRP94 LBDを単離すること、
(b)当該単離GRP94ポリペプチドを複数の物質にさらすこと、
(c)当該単離GRP94ポリペプチドに対する物質の結合をアッセイすること、および
(d)当該単離GRP94 LBDポリペプチドに対する特異的結合を示す物質を選択すること、
を含む当該方法。
【請求項１】
実質的に純粋な結晶であるGRP94リガンド結合ドメインポリペプチド。
【請求項２】
結晶が、格子定数 a = 99.889 Å, b =89.614 Å, c = 60.066 Å; α = β = γ =90.132°; 空間群対称性 C2; および対称単位における2 GRP94 + NECA 複合体を有する単位格子を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
結晶が、格子定数 a = 89.200 Å, b =99.180 Å, c = 63.071 Å; α = β = γ =90.0°; 空間群対称性 C222(1); および対称単位における1 GRP94 + NECA 複合体を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
GRP94ポリペプチドは配列番号６のアミノ酸配列を有する、請求項４のポリペプチド。
【請求項５】
GRP94ポリペプチドは、リガンドとの複合体である、請求項１のポリペプチド。
【請求項６】
リガンドがNECAである、請求項５のポリペプチド。
【請求項７】
GRP94ポリペプチドは、表１、２または３に相当する座標により更に特徴付けられる結晶構造を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項８】
結晶が、結晶化GRP94ポリペプチドの三次元構造が、約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定され得るようなものである、請求項１のポリペプチド。
【請求項９】
結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造を約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを結晶化すること、および
(b)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを分析し、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造を決定し、それにより、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造が約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定されること、
を含む当該方法。
【請求項１０】
分析がＸ線回折による、請求項９の方法。
【請求項１１】
結晶化が、ハンギングドロップ法により行われ、そしてGRP94リガンド結合ドメインは、リザーバーと混合される、請求項９の方法。
【請求項１２】
リザーバーは、100 mM Tris-HCl, pH 7.6、150-250 mM MgCl2、および33-38% ポリエチレングリコールを含む、請求項１１の方法。
【請求項１３】
結晶化が、リガンドを伴うGRP94リガンド結合ドメインを結晶化することを更に含む、請求項９の方法。
【請求項１４】
リガンドが、アデノシン誘導体である、請求項１３の方法。
【請求項１５】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項１４の方法。
【請求項１６】
結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを作成する方法であって、
(a)リザーバーを伴うGRP94リガンド結合ドメインを含む溶液をインキュベーションすること、
(b)ハンギングドロップ法を用い、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを結晶化し、それにより、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドが作成されること、
を含む当該方法。
【請求項１７】
インキュベーションが、リガンドを伴うGRP94リガンド結合ドメインをインキュベーションすることを更に含む、請求項１６の方法。
【請求項１８】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項１７の方法。
【請求項１９】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項１８の方法。
【請求項２０】
請求項16の方法により産生された結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチド。
【請求項２１】
Hsp90タンパク質のモジュレーターを設計する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの原子構造座標に基づき、Hsp90タンパク質のリガンド結合部位中のアミノ酸との相互作用を形成するであろうHsp90タンパク質のモジュレーター候補を設計すること、
(b)当該モジュレーターを合成すること、および
(c)当該モジュレーター候補がHsp90タンパク質の活性をモジュレートするかどうか決定し、それにより、Hsp90タンパク質のモジュレーターを設計すること、
を含む当該方法。
【請求項２２】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項２１の方法。
【請求項２３】
原子構造座標が、表１、２または３に示す原子構造の座標である、請求項２２の方法。
【請求項２４】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
GRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを設計する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの結晶を得ること、
(b)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの結晶である三次元構造を決定すること、および
(c)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの結晶である三次元構造に基づき、モジュレーターを合成し、それにより、GRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを設計すること、
を含む当該方法。
【請求項２７】
当該方法が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドをモジュレーター候補と接触させること；および当該モジュレーター候補の結合について、当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの活性の変化について、またはその両方についてGRP94リガンド結合ドメインポリペプチドをアッセイすることを更に含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
結晶が、斜方晶型である、請求項２６の方法。
【請求項２９】
結晶が、結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元構造が約1.8 Åまたはそれよりよいレゾリューションに決定され得るようなものである、請求項２６の方法。
【請求項３０】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項２６の方法。
【請求項３１】
原子構造座標が、表１、２または３に示すような原子構造の座標である、請求項３０の方法。
【請求項３２】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項３０の方法。
【請求項３３】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項３２の方法。
【請求項３４】
GRP94モジュレーターを同定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインの原子座標をコンピューターモデリングシステムに供すること、
(b)GRP94リガンド結合ドメインの結合ポケット中に空間的に適合するリガンドをモデリングし、それにより、GRP94 モジュレーターを同定すること、
を含む当該方法。
【請求項３５】
方法が、GRP94の活性を増大または減少するモデル化リガンドを、GRP94仲介活性についてアッセイで同定することを更に含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
原子座標が、表１、２または３に示す原子座標である、請求項３４の方法。
【請求項３７】
他のHsp90ポリペプチドと比較してGRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを同定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの原子座標をコンピューターモデリングシステムに供すること、および
(b)GRP94リガンド結合ドメインの結合ポケット中に適合し、そしてHsp90サブタイプ間に保存されるGRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの、コンホメーション的に制限された残基と相互作用する、リガンドをモデリングし、それにより、他のHsp90ポリペプチドに比較してGRP94ポリペプチドの活性を選択的にモジュレートするモジュレーターを同定すること、
を含む当該方法。
【請求項３８】
方法が、GRP94に選択的に結合し、当該GRP94の活性を増大または減少するモデル化リガンドを、GRP94活性について生物学的アッセイで同定することを更に含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む請求項３７の方法。
【請求項４０】
原子構造座標が、表1-2に示す原子構造の座標である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項３９の方法。
【請求項４２】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項４１の方法。
【請求項４３】
１つのHsp90ポリペプチドの生物学的活性をGRP94と比較して選択的にモジュレートするHsp90 モジュレーターを同定する方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを記載する原子構造座標のセットおよびHsp90リガンド結合ドメインを記載する少なくとも１つの他の原子構造座標のセットを提供すること、ここで、それぞれのリガンド結合ドメインはリガンド結合部位を含む、
(b)当該原子構造座標のセットを比較し、少なくとも１つの当該セット間の相違を同定すること、
(c)ステップ(b)の相違に相互作用すると予測される候補リガンドを設計すること、
(d)当該候補リガンドを合成すること、および
(e)GRP94との比較として、Hsp90を選択的にモジュレートする能力について、当該合成候補リガンドを試験し、それにより、Hsp90の生物学的活性をGRP94と比較して選択的にモジュレートするHsp90 モジュレーターが同定されること、
を含む当該方法。
【請求項４４】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項４３の方法。
【請求項４５】
GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの原子構造座標が、表1-2に示す原子構造の座標である、請求項４４の方法。
【請求項４６】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項４４の方法。
【請求項４７】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項４６の方法。
【請求項４８】
GRP94ポリペプチドのモジュレーターを設計する方法であって、
(a)候補GRP94リガンドを選択すること、
(b)結晶化GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元モデルを用い、GRP94ポリペプチドのどのアミノ酸またはアミノ酸群が当該リガンドと相互作用するかを決定すること、
(c)当該リガンドがGRP94ポリペプチドの活性をモジュレートする程度を、GRP94活性について生物学的アッセイで同定すること、
(d)当該リガンドの化学的修飾を選択すること、ここで、GRP94ポリペプチドのアミノ酸と当該リガンドとの間の相互作用が当該化学的修飾によりモジュレートされると予測される、
(e)当該選択した化学的修飾で化学的化合物を合成し、修飾リガンドを形成すること、
(f)当該修飾リガンドを当該GRP94ポリペプチドと接触させること、
(g)当該修飾リガンドが、GRP94ポリペプチドの生物学的活性をモジュレートする程度をGRP94活性について生物学的アッセイで同定すること、および
(h)修飾リガンドの存在下での当該GRP94ポリペプチドの生物学的活性を、非修飾リガンドの存在下でのGRP94ポリペプチドの生物学的活性と比較し、それより、GRP94ポリペプチドのモジュレーターを設計すること、
を含む当該方法。
【請求項４９】
原子構造座標が、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項４８の方法。
【請求項５０】
原子構造座標が、表１、２または３に示す原子構造の座標である、請求項４９の方法。
【請求項５１】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項４９の方法。
【請求項５２】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項５１の方法。
【請求項５３】
修飾リガンドの存在下でのGRP94ポリペプチドの生物学的活性が、非修飾リガンドの存在下でのGRP94ポリペプチドの生物学的活性から変化するならば、方法が、ステップ(a)から(f)までを繰り返すことを更に含む、請求項４８の方法。
【請求項５４】
GRP94ポリペプチドに対するリガンドの結合を阻害する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、
(a)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドの三次元原子座標に基づき、試験インヒビター化合物を設計すること、
(b)GRP94ポリペプチドを、試験インヒビター化合物の存在下でリガンドと共にインキュベーションすること、
(c)GRP94ポリペプチドに結合するリガンドの量を決定すること、ここで、当該試験インヒビター化合物の非存在下でのリガンドの結合に比例して、当該試験インヒビター化合物の存在下でのGRP94タンパク質に対するリガンドの結合が減少することは阻害を示す、
(d)リガンド結合の減少が観察されるならば、リガンド結合のインヒビターとしての試験化合物を同定し、これにより、GRP94ポリペプチドに対するリガンドの結合を阻害する化合物を同定すること、
を含む当該アッセイ方法。
【請求項５５】
原子構造座標は、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドに結合するリガンドを更に含む、請求項５４の方法。
【請求項５６】
原子構造座標が、表１および２に示す原子構造の座標である、請求項５５の方法。
【請求項５７】
リガンドがアデノシン誘導体である、請求項５５の方法。
【請求項５８】
アデノシン誘導体がNECAである、請求項５７の方法。
【請求項５９】
GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドのモジュレーターについて複数の化合物をスクリーニングする方法であって、
(a)試験サンプルのライブラリーを提供すること、
(b)GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドを各試験サンプルと接触させること、
(c)試験サンプルと当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドとの間の相互作用を検出すること、
(d)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドと相互作用する試験サンプルを同定すること、
(e)当該GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドと相互作用する試験サンプルを単離し、これにより、複数の化合物を、GRP94リガンド結合ドメインポリペプチドのモジュレーターについてスクリーニングすること、
を含む当該方法。
【請求項６０】
試験サンプルがサブストレートに結合する、請求項５８の方法。
【請求項６１】
試験サンプルをサブストレートにおいて直接合成する、請求項５８の方法。
【請求項６２】
リガンド結合ドメインポリペプチドが結晶である、請求項５８の方法。
【請求項６３】
以下を含む、単離GRP94リガンド結合ドメイン(LBD)ポリペプチド：
(a)配列番号3または5の何れか１つのヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド、
(b)配列番号3または5の何れか１つと実質的に同一である核酸分子によりコードされるポリペプチド、
(c)配列番号4または6の何れか１つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(d)配列番号4または6の何れか１つのポリペプチドの生物学的等価物であるポリペプチド、または
(e)配列番号4または6の何れか１つのポリペプチドとの特異的結合を示す抗体と免疫学的に交差反応するポリペプチド。
【請求項６４】
以下を含む、GRP94リガンド結合ドメイン(LBD)ポリペプチドをコードする単離核酸分子：
(a)配列番号3または5の何れか１つのヌクレオチド配列、
(b)配列番号3または5の何れか１つと実質的に同一である単離核酸分子、
(c) ストリンジェントな洗浄条件下で、配列番号3または5の何れか１つに開示の核酸配列にハイブリダイズし、GRP94 LBD ポリペプチドをコードする単離核酸分子、または
(d)遺伝学コードの同義性のため、ヌクレオチド配列中の上記核酸分子(a)、(b)または(c)とは異なり、そして上記核酸分子(a)、(b)または(c)によりコードされるGRP94 LBD ポリペプチドをコードする、単離核酸分子。
【請求項６５】
配列番号3または5の何れか１つの連続20のヌクレオチド配列と同一である20のヌクレオチド配列を更に含む、請求項６４の単離核酸分子。
【請求項６６】
異種性プロモーターに作動可能なように連結した請求項６４の核酸分子を含む、キメラ遺伝子。
【請求項６７】
請求項６６のキメラ遺伝子を含むベクター。
【請求項６８】
請求項６６のキメラ遺伝子を含む宿主細胞。
【請求項６９】
GRP94ポリペプチドをコードする核酸分子を検出する方法であって、
(a)核酸物質を含む生体サンプルを獲得すること、
(b)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下、請求項６４の核酸分子を(a)の当該生体サンプルにハイブリダイズさせ、それにより、請求項６４の核酸と当該生体サンプル中の核酸との間に二重鎖構造を形成させること、および
(c)(b)の二重鎖構造を検出し、それにより、核酸分子をコードするGRP94を検出すること、
を含む当該方法。
【請求項７０】
請求項６３のGRP94ポリペプチドを特異的に認識する抗体。
【請求項７１】
GRP94ポリペプチドを特異的に認識する抗体を産生するための方法であって、
(a)請求項６３のGRP94ポリペプチドまたはその部分を組換え的または合成的に産生すること、
(b)(a)のポリペプチドを製剤化し、それにより、有効な免疫源とすること、
(c)(b)の当該製剤を動物に投与し、抗体の産生を含む免疫応答を動物で生じさせること、ここで、抗体は、当該動物の血清中に存在する、および
(d)(c)の動物から当該血清を回収すること、ここで当該血清は、GRP94ポリペプチドを特異的に認識する抗体を含んでいる、
を含む当該方法。
【請求項７２】
GRP94ポリペプチドのレベルを検出するための方法であって、
(a)ペプチド物質を含む生体サンプルを得ること、および
(b)(a)の生体サンプル中のGRP94ポリペプチドを、請求項７０の抗体との免疫学的反応により検出し、それによって、サンプル中のGRP94ポリペプチドの量を決定すること、
を含む当該方法。
【請求項７３】
GRP94 LBD機能をモジュレートする物質を同定するための方法であって、
(a)GRP94 LBDを単離すること、
(b)当該単離GRP94ポリペプチドを複数の物質にさらすこと、
(c)当該単離GRP94ポリペプチドに対する物質の結合をアッセイすること、および
(d)当該単離GRP94 LBDポリペプチドに対する特異的結合を示す物質を選択すること、
を含む当該方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図１Ｄ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図７Ａ】
【図７Ｂ】
【図８】
【図９Ａ】
【図９Ｂ】
【図９Ｃ】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１０Ｃ】
【図１１】
【図１２】
【図１３Ａ】
【図１３Ｂ】
【図１４】
【公開番号】特開２０１０−１１０３２４（Ｐ２０１０−１１０３２４Ａ）
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２６４１２７（Ｐ２００９−２６４１２７）
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【分割の表示】特願２００３−５３２６３７（Ｐ２００３−５３２６３７）の分割
【原出願日】平成１４年９月３０日（２００２．９．３０）
【出願人】（５０２３４７０８７）デューク・ユニバーシティ (19)
【氏名又は名称原語表記】ＤＵＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年５月２０日（２０１０．５．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年１１月１９日（２００９．１１．１９）
【分割の表示】特願２００３−５３２６３７（Ｐ２００３−５３２６３７）の分割
【原出願日】平成１４年９月３０日（２００２．９．３０）
【出願人】（５０２３４７０８７）デューク・ユニバーシティ (19)
【氏名又は名称原語表記】ＤＵＫＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
【Ｆターム（参考）】
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