可動検出モジュールを用いる蛍光検出システム及び方法
【課題】サーマルサイクラと共に使用するための可動励起／検出モジュールを有する蛍光検出システムを提供する。
【解決手段】サーマルサイクラの複数のウエルに配置されたサンプルを分析する蛍光検出装置及び使用方法。一実施形態では、装置は、サーマルサイクラに取付可能な支持構造体と支持構造体上に移動可能に取付け可能な検出モジュールとを含む。検出モジュールは、共に検出モジュール内に配置された励起光発生器と放出光検出器を各々有する１以上のチャンネルを含む。支持構造体がサーマルサイクラに取り付けられて検出モジュールが支持構造体に取付けられた時、検出器は、複数のウエルのうちの異なるウエルと光学連通状態に配置されるように移動可能である。検出モジュールは、容易な交換を可能にするために支持構造体から取外し可能である。
【解決手段】サーマルサイクラの複数のウエルに配置されたサンプルを分析する蛍光検出装置及び使用方法。一実施形態では、装置は、サーマルサイクラに取付可能な支持構造体と支持構造体上に移動可能に取付け可能な検出モジュールとを含む。検出モジュールは、共に検出モジュール内に配置された励起光発生器と放出光検出器を各々有する１以上のチャンネルを含む。支持構造体がサーマルサイクラに取り付けられて検出モジュールが支持構造体に取付けられた時、検出器は、複数のウエルのうちの異なるウエルと光学連通状態に配置されるように移動可能である。検出モジュールは、容易な交換を可能にするために支持構造体から取外し可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的には、蛍光検出システム、詳細には、サーマルサイクラと共に使用するための可動励起／検出モジュールを有する蛍光検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
サーマルサイクラは、当業技術で公知である。このような装置は、研究、医療、及び産業分野において、関連の様々な分子、例えば、核酸配列を作成して検出するための様々な処理で使用される。従来のサーマルサイクラを使用して実行することができる処理には、これに限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような手順を使用する核酸の増幅が含まれる。このような増幅処理は、核酸サンプル中に存在するターゲット配列の量を増加させるために使用される。
【０００３】
サーマルサイクラによって処理されたサンプル中のターゲット分子の存在及び／又は濃度を検出するための多くの技術もまた公知である。例えば、蛍光標識法が使用される。蛍光標識（又は蛍光プローブ）は、一般的に、適切な電磁信号又は放射によって誘導された時に、その放射を吸収して誘導放射が継続する間、持続する信号（通常は、例えば波長によって誘導放射から識別可能な放射）、すなわち蛍光を発する物質である。一部の蛍光プローブは、サンプルからの蛍光応答がターゲット分子の存在を示すように、ターゲット分子（例えば、特定の核酸配列）が存在する時だけ活性であるように設計されるのが一般的である。他の種類の蛍光プローブは、反応中に存在する二本鎖ＤＮＡの量に比例してそれらの蛍光が増加する。これらのプローブは、増幅反応がターゲット分子上だけで作動するように設計された場合に使用されるのが一般的である。
【０００４】
蛍光分析法は、適切な波長の光源のような誘導（励起とも呼ばれる）放射に蛍光標識又はプローブを含むサンプルを曝し、それによってプローブを励起して蛍光を生じさせるステップを伴う。生成された放射は、フォトダイオード、光電子倍増管、又は電荷結合素子（ＣＣＤ）などのような適切な検出器を使用して検出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光標識サンプルと共に使用される蛍光光度計は、当業者に公知である。１つの種類の蛍光光度計は、米国特許第６，０４３，８８０号明細書でＡｎｄｒｅｗｓ他によって説明されているような光学式読取装置である。励起光にサンプルを曝し放出された放射を検出する光学式読取装置に、サンプルのアレイを収容したサンプルプレートが挿入される。光学式読取装置の利便性は、サーマルサイクラからサンプルプレートを取り外さなければならず増幅の進度をモニタすることが困難であるということによって、制限されている。
【０００６】
１つの改善方法は、サンプルプレートをサーマルサイクラから取り外さないで、又はＰＣＲ処理を中断せずにサンプルプレートを分析することができるように、光学式読取装置をサーマルサイクラに一体化することである。そのような組み合わせた装置の例は、米国特許第５，９２８，９０７号明細書、米国特許第６，０１５，６７４号明細書、米国特許第６，０４３，８８０号明細書、米国特許第６，１４４，４４８号明細書、米国特許第６，３３７，４３５号明細書、及び米国特許第６，３６９，８６３号明細書に説明されている。このような組合せた装置は、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号明細書、米国特許第５，９９４，０５６号明細書、米国特許第６，１４０，０５４号明細書、及び米国特許第６，１７４，６７０号明細書に説明されているように様々な用途で有用である。
【０００７】
既存の蛍光光度計は、様々な欠点に持っている。例えば、一部の既存の設計では、アレイ内の異なるサンプルウエルに対して異なる光源と検出器が設けられている。光源及び／又は検出器間の変動は、１つのウエルから次のウエルへの検出蛍光応答の変動をもたらす。代替的に、光源及び／又は検出器は、各ウエルまでの及び／又はそれからの光学経路が異なる１つよりも多いウエルと光学連通するように配置することができる。光学経路が異なるために、検出された蛍光応答は、１つのサンプルウエルから次のサンプルウエルまで変動する。そのような変動を補正するために、各サンプルウエルに対する応答は、個々に較正されるべきである。アレイ内のサンプルウエルの数が増加すると、これがますます時間を浪費する作業になり、較正誤差が次の測定値に大きな誤差を生じさせる場合がある。
【０００８】
更に、既存の蛍光光度計は、一般的に、光源と検出器が計器の固定部分であるように設計されている。これが蛍光光度計を異なる用途に適応させる実験者の能力を制約する。例えば、異なる蛍光標識の検出は、一般的に、異なる光源及び／又は検出器の使用を必要とする。多くの既存の蛍光光度計は、実験者が光源と検出器を再構成することを困難にし、従って、使用することができる様々な蛍光標識を制約している。
【０００９】
また、サンプル中（又は異なるサンプル中）に存在する場合があるいくつかの異なる蛍光標識の同時測定を実行することも困難である。上述のように、分析で得られるデータを最大にするために、実験者は、異なる励起及び／又は放射波長を有する複数の蛍光標識物質を含めることが多い。各標識物質は、異なるターゲット配列に結合するようになっており、同一のサンプル中で複数のターゲット配列が検出されることを原理的に可能にする。しかし、既存の蛍光光度計は、そのような多重標識実験を容易に行うことができない。多くの蛍光光度計は、励起及び放射波長の一つの組合せ用に設計されている。他のものは、多重標識の検出を可能にする多重光源及び検出器を提供するが、これらの構成は、１つの標識の励起波長が別の標識の放射波長と重なる場合があるので、多くの場合に一度に一標識のみの探査を可能にするものであり、検出器に進入する励起光線は、誤った結果をもたらすと考えられる。多重標識の探査は、一般的に並列に行うことができず、データ収集処理を遅くするものである。
【００１０】
従って、これらの欠点を克服するサーマルサイクラのための改善された蛍光光度計が望ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、サーマルサイクル装置内での蛍光検出を提供する。本発明の１つの態様によれば、サーマルサイクラの複数のウエルに配置されたサンプルを分析するための蛍光検出装置は、サーマルサイクラに取付可能な支持構造体と、支持構造体に移動可能に取り付けることができる検出モジュールとを含む。検出モジュールは、共に検出モジュール内に配置された励起光発生器と放出光検出器を含む。支持構造体がサーマルサイクラに取り付けられ検出モジュールが支持構造体に取り付けられた時に、検出モジュールは、複数のウエルのうちの異なるウエルと光学連通した状態に位置決めされるように移動可能である。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、検出モジュールは、２または３以上の励起／検出対を形成するように配置された２または３以上の励起光発生器と２または３以上の放出光検出器を含むことができる。一実施形態では、励起／検出対は、各励起／検出対が複数のウエルの異なるウエルと光学接触して同時に配置することができるように構成される。代替的な実施形態では、励起／検出対は、第１の励起／検出対が複数のウエルのいずれか１つと光学接触して配置された時に、別の励起／検出対が複数のウエルのいずれとも光学接触しないように構成される。一部の実施形態では、検出モジュールは、支持構造体に取外し可能に取り付けられ、それによってユーザは、検出モジュールを異なる検出モジュールと交換することができる。
【００１３】
本発明の更に別の態様によれば、溶液中のターゲット分子の存在を検出する方法が提供される。複数のサンプルが用意され、各サンプルは、ターゲット分子に結合するようになった蛍光標識を含む。各サンプルは、サーマルサイクラ装置の複数のサンプルウエルのそれぞれのウエル内に配置され、サーマルサイクラ装置は、検出モジュールを移動可能に取付け、検出モジュールは、励起／検出チャンネルを含み、励起／検出チャンネルは、検出モジュール内に配置された励起光発生器と検出モジュール内に配置された放出光検出器とを含む。サーマルサイクラ機器は、反応を誘導するために使用され、検出モジュールを移動して励起／検出チャンネルを作動することにより、サンプルウエルが走査されて蛍光応答を検出する。走査中に、検出モジュールは、励起／検出チャンネルが複数のサンプルウエルのそれぞれと光学連通した状態に順番に配置されるように移動される。検出モジュールが複数の励起／検出対又はチャンネルを含む場合は、チャンネルは、並行して又は順番に作動する。
【００１４】
添付図面と共に以下の詳細説明は、本発明の特質と利点のより良い理解を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の例示的な装置の実施形態を、同じ参照数字が対応する部分を表す添付図面を参照して説明する。装置を使用する方法も以下に説明する。本明細書に示して説明する実施形態は例示的であり、本発明を制約するものではない。
【００１６】
Ｉ．例示的な装置
図１は、本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置１００の概略図である。装置１００は、ベースユニット１１０と蓋アセンブリ１１２から成る。ベースユニット１１０は、従来の設計とすることができ、プログラマブルプロセッサ及びクロックなどのような従来の電子構成要素（図示せず）を通じてサーマルサイクル処理のための電力と制御機能を提供する。ベースユニット１１０は、キーパッド１１８とＬＣＤディスプレイスクリーン１２０を含むことができ、ユーザがサーマルサイクラの作動を制御してモニタすることができるユーザインタフェース１１６もまた提供する。ベースユニット１１０は、電源ケーブル１２１を通じて外部電源（例えば、標準の１２０Ｖ交流電源）に接続される。ベースユニット１１０のいくつかの例は、本発明の譲受人であるＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドから販売されている「ＤＮＡエンジン（登録商標）」、「Ｄｙａｄ（登録商標）」、及び「Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）」サーマルサイクラを含む。
【００１７】
蓋アセンブリ１１２は、蓋１２２内に配置されたサンプルユニットと蛍光検出装置を含み、以下、これらの構成要素を説明する。蓋１２２は、ベースユニット１１０への配置とそれからの取外しを助けるハンドル１２４と、通気口１２６とを有する。蓋１２２は、蓋アセンブリ１１２内部の構成要素に対して光学的及び熱的分離を提供するものである。
【００１８】
図２は、蓋アセンブリ１１２の内部の分解組立図である。示されているのは、サンプルユニット２０２、蓋加熱器２０４、及び蛍光光度計アセンブリ２０６である。サンプルユニット２０２は、規則的なアレイ（例えば、８ｘ１２の格子）に配置された、いくつかのサンプルウエル２１０を含む。一実施形態では、各サンプルウエル２１０は、ターゲット核酸配列に結合するか又はその存在に応答するようになった少なくとも１つの蛍光標識又はプローブを含む適切なＰＣＲ反応物質（緩衝剤、プライマーとプローブ、及びヌクレオチドなど）と共に、試験される核酸サンプルを含むチューブのような取外し可能な反応容器（図示せず）を保持する。反応容器には、処理中のサンプルの交差汚染又は流出を回避するために、容器の上部を覆って確実に嵌る透明なサンプルキャップ（図示せず）が設けられるのが好ましい。反応容器はまた、「Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ」（ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッド製）のようなフィルム、「Ｃｈｉｌｌ−ｏｕｔ（登録商標）」（ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッド製）のようなワックス製品、又は鉱物油の使用を含む他の方法で、シールすることができる。代替の構成として、１または２以上の個別のサンプルをサンプルウエル２１０に対応する位置に保持する取外し可能なサンプルトレイ（図示せず）を使用してもよい。サンプルトレイはまた、上述のいずれかの方法でシールすることができる。
【００１９】
サンプルユニット２０２はまた、加熱要素（例えば、ペルチエ効果熱電装置）、熱交換要素、加熱要素をベースユニット１１０に接続するための電気的接続要素、及び機械的接続要素を含む。これらの要素（図示せず）は、従来技術の設計にすることができる。サンプルユニット２０２はまた、コネクタ２１４に取外し可能に接続したマルチワイヤ式ケーブル２１２を介して蓋加熱器２０４と蛍光光度計アセンブリ２０６のための電気接続を提供する。
【００２０】
蓋加熱器２０４には、サンプルウエル２１０と電子制御された加熱要素（図示せず）との大きさと間隔に適合する孔２２０が貫通している。蓋加熱器２０４は、蓋１２２に連結される。連結機構（図示せず）は、蓋１２２がサンプルユニット２０２から取り外された時に、蛍光光度計アセンブリ２０６にアクセスできるように移動可能である（例えば、蓋加熱器２０４はヒンジによって蓋１２２に取り付けることができる）のが好ましい。蓋１２２がサンプルユニット２０２の所定位置にある時に、支持体２２４は、蓋加熱器２０４を所定位置に保持する。支持体２２４の下方部分２２６は、蓋加熱器２０４をサンプルユニットに向けて圧縮するように設計され、それによって装置１００の作動中にサンプルが蒸発する可能性を低くするのが好ましい。この圧縮はまた、異なる大きさの反応容器の使用を可能にする。蓋加熱器２０４は、サーマルサイクル作動中にキャップ上での結露を回避するために、反応容器のサンプルウエル２１０のサンプルキャップ（又は他のシーラント）の温度を制御するために使用される。
【００２１】
蓋加熱器２０４は、選択された孔２２０の間、又は蓋加熱器２０４の周囲近辺のような孔から離れた別の位置に位置決めされた１または２以上の較正要素２２２を含むのが好ましい。較正要素２２２は、既知の蛍光応答を提供し、蛍光光度計アセンブリ内の蛍光検出器を較正するために使用することができる。較正要素２２２は、ガラス又はプラスチック基板に蛍光コーティングを施して作ることができ、又は色素が含浸されたプラスチック、蛍光ガラス、又はポリエーテルイミド（ＰＥＩ）のような蛍光プラスチックで構成することができる。蛍光検出器の飽和を回避するために、蛍光材料の上にニュートラル又は他の種類のフィルタを配置することができる。一般的に、蛍光特性が光（光漂白）と熱を付与された期間に亘って十分に安定していることを条件として、あらゆる材料を使用することができる。実用上、蛍光応答に対する温度の影響が最小にされるのが好ましい。複数の較正要素２２２が提供される場合、構成要素の異なるものに対して異なる材料を使用することができる。他の実施形態では、蓋加熱器２０４を省略し、較正要素２２２をサンプルユニット２０２の表面に配置することができる。
【００２２】
サンプルユニット２０２と蓋加熱器２０４は、従来の設計にすることができる。適切な設計の例は、本発明の譲受人であるＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドから販売されている様々な「Ａｌｐｈａ（登録商標）」モジュールのサンプルユニット及び蓋加熱器構成要素を含む。
【００２３】
蛍光光度計アセンブリ２０６は、内側蓋１２２に固定された支持フレーム又はプラットフォーム２３０を含む。シャトル２３２が、支持フレーム２３０の下側に移動可能に取り付けられ、このシャトル２３２が検出モジュール２３４を保持する。シャトル２３２は、蓋加熱器２０４の対応する孔２２０を通してサンプルユニット２０２の異なったサンプルウエル２１０と光学連通するように検出モジュール２３４を位置決めできるように、二次元的に移動可能であり。支持フレーム２３０と支持体２２４は、蓋１２２がベースユニット１１０内に配置されて閉じられた時に、検出モジュール２３４が蓋加熱器２０４の近くに保持されるような寸法とされるのが好ましく、この配置が、サンプルウエルと検出モジュールの間の光損失を低減することがわかる。
【００２４】
図３は、蛍光光度計アセンブリ２０６の底面図であり、シャトル２３２と検出モジュール２３４の移動可能な取付けを示している。この実施形態では、検出モジュール２３４が取外し可能に連結されたシャトル２３２を望ましい位置まで移動させるために、ステッパモータによって駆動される並進ステージが使用される。特に、支持フレーム２３０は、ｘ軸ステッパモータ３０２とそれに取り付けられたリードスクリュー３０４とを有する。ステッパモータ３０２は、リードスクリュー３０４を回転させるように作動し、それによって並進ステージ３０６をｘ方向（矢印で示された）に移動させる。リミットスイッチ３０８が設け、並進ステージ３０６の動きを、検出モジュール２３４をいずれのウエルとも光学接触して配置できるように十分に大きく、且つ並進ステージ３０６がステッパモータ３０２のような他のシステム要素との接触を回避できる適切な範囲に制限するが好ましい。
【００２５】
並進ステージ３０６は、ｙ軸ステッパモータ３１６とこれに取り付けられたリードスクリュー３１８とを有する。ステッパモータ３１６は、リードスクリュー３１８を回転させるように作動し、それによってシャトル２３２をｙ方向（矢印で示された）に沿って移動させる。リミットスイッチ３２０が設け、シャトル２３２の動きを、検出モジュール２３４をいずれのウエルとも光学接触して配置できるように十分に大きく、且つシャトル２３２がステッパモータ３１６のような他のシステム要素と接触するのを回避できるる適切な範囲に制限するのが好ましい。
【００２６】
ステッパモータ３０２及び３１６、リードスクリュー３０４及び３１８、及びリミットスイッチ３０８及び３２０は、通常は、従来技術の設計にすることができる。他の可動式の取付け方法で代用することができるがわかる。例えば、モータをリードスクリューに直接連結する代わりに、チェーン駆動又はベルト駆動のような間接連結を使用することができる。検出モジュールを配置するためにリードスクリューを使用せず、例えば、並進ステージをチェーン駆動、ベルト駆動、又は他の駆動機構に取り付けることにより、チェーン駆動、ベルト駆動、又は他の駆動機構も使用することができる。他の種類のモータ、例えば、サーボモータ又はリニアモータなども使用することができる。異なる自由度に対して、異なる駆動機構を使用することもできる。
【００２７】
シャトル２３２は、コネクタ３３０及び３３１を介して検出モジュール２３４を保持する。コネクタ３３０及び３３１は、設計によって変わる場合があるが、検出モジュール２３４をシャトル２３２の下部に支持し整列するように構成される。検出モジュールを簡単に取り替えることができるように、コネクタは検出モジュール２３４に簡単に挿入かつ取り外しすることができるようになっているのが好ましい。一実施形態では、コネクタ３３０は、検出モジュール２３４の縁部をピボット回転可能に保持する円筒形部材（図示せず）に対する取付けを提供し、一方でコネクタ３３１は、検出モジュール２３４上の対応するレセプタクルに挿入可能なシャトルに取り付けられたボールプランジャを含む。以下に説明するように、シャトル２３２と検出モジュール２３４の間の電気接続（図示せず）も提供される。
【００２８】
図４は、検出モジュール２３４の上面図である。検出モジュール２３４は、シャトル２３２の下側の対応するコネクタ３３０に連結することによりシャトル２３２と共にユニットとして動くように検出モジュール２３４を所定位置に固定する取り付け金具４２０を含む。検出モジュール２３４はまた、シャトル２３２の下側の対応する電気コネクタに接続する電気コネクタ４２４を含み、それによって検出モジュール２３４への制御信号の供給と検出モジュール２３４からの読取信号の取得が可能になる。
【００２９】
図５Ａは、検出モジュール２３４の一実施形態の底面図であり、検出モジュール２３４の本体内側に配置された４つの個々に制御された蛍光励起／検出チャンネル（「励起／検出対」とも呼ばれる）の４つの開口部５０２、５０４、５０６、及び５０８を示している。励起／検出チャンネルの例を以下に説明する。開口部５０２、５０４、５０６、及び５０８の間隔は、サンプルウエル２１０の間隔に対応する。従って、開口部５０２がサンプルウエル２１０の１つと光学連通状態に置かれた時に、開口部５０４、５０６、及び５０８は、それぞれ別々のサンプルウエル２１０との光学連通状態に置かれる。開口部５０２、５０４、５０６、及び５０８は、単に検出モジュール２３４の底面を通る孔とするか、又は各チャンネルの励起及び検出光線の波長に対して透過性が高いあらゆる物質で作ることができる。
【００３０】
図５Ｂは、本発明の他の実施形態による検出モジュール２３４’の底面図である。この実施形態では、４つの開口部５１２、５１４、５１６、及び５１８が設けられるが、それらは千鳥状に配置されるので、一度に１つの開口部だけがサンプルウエルのいずれかと光学連通することができる。この構成は、励起／検出対間のクロストークを低減するのに有用である。
【００３１】
図６は、本発明の実施形態による励起／検出チャンネル（又は励起／検出対）６００のための光学要素の構成を示す概略図である。検出モジュール２３４は、励起／検出対６００の１または２以上のインスタンスを含むことができ、各対は、独立した蛍光検出チャンネルを提供する。励起／検出対６００は、不透明な壁６０２の内側に配置され、この壁は、外部光源の他に検出モジュール２３４に含めることができる他の励起／検出対からの光学分離を提供する。励起光路６０４は、発光ダイオード（ＬＥＤ）又は他の光源６０６、フィルタ６０８、レンズ６１０、及びビームスプリッタ６１２を含む。検出光路６２０は、ビームスプリッタ６１２、フィルタ６２４、レンズ６２６、及びフォトダイオード又は他の光検出器を含む。ビームスプリッタ６１２は、励起波長の光に対して極めて透過性が高く、検出（蛍光応答）波長の光に良く反射するように選択されるのが好ましい。
【００３２】
励起光路６０４は、望ましい波長の励起光をサンプルブロック２０２のサンプルウエル２１０に保持された反応容器６１６に導くように配置される。望ましい波長は、反応容器６１６に含まれる特定の蛍光標識物質に依存し、適切なＬＥＤ６０６とフィルタ６０８の選択によって制御される。励起／検出対６００と反応容器６１６の間の光学連通は、上述のように不透明な壁６０２の開口部５０２と蓋加熱器２０４を通る孔２２０によって提供される。励起／検出対６００との光伝送を最大にするために、開口部５０２と蓋加熱器２０４の作動中の間隔は小さくされるのが好ましい。
【００３３】
反応容器６１６に入った励起光線は、蛍光を発する蛍光標識又はプローブを励起し、それによって波長が異なる光を生成させる。この光の一部は、検出光路６２０上で反応容器６１６を出て開口部５０２を通過する。ビームスプリッタ６１２は、蛍光光線の実質的な部分が、励起周波数を濾過するフィルタ６２４とフォトダイオード６２８の活性表面上に光を集束させるレンズ６２６とを通るように誘導する。フォトダイオード６２８は、入射光線に応答して電気信号を発生する。この電気信号は、読取信号経路６３０によって回路基板６３４に伝送され、この基板は、読取のために信号を電気コネクタ４２４にルーティングする。回路基板６３４及び／又は信号経路６３０はまた、フォトダイオード６２８からの電気信号を成形して精緻化するためにプリアンプのような別の構成要素を含むことができる。
【００３４】
ＬＥＤ６０６とフォトダイオード６２８は、各制御信号経路６３６及び６３８によって表示されるように、コネクタ４２４を通じて受信された信号によって制御することができる。ＬＥＤ６０６の制御信号は、ＬＥＤ６０６を望ましい時間に作動及び停止するように動作させることができ、フォトダイオード６２８の制御信号は、フォトダイオード６２８を望ましい時間に作動及び停止させたり、ゲインパラメータを調節する等の動作をおこなわせることができる。
【００３５】
図６は、１つの励起／検出対６００を示すが、検出モジュール２３４の実施形態は、各対が他から光学分離状態にあり、サンプルウエルとの光学連通のためのそれ自体の開口部（例えば、図５の開口部５０４、５０６、５０８）を有するあらゆる数のこのような対を含むことができることが好ましいことが分かる。様々な励起／検出対は単独に制御され、単独に読み出されるが、それらの各制御及び読取経路は、全て回路基板６３４と連結することができる。
【００３６】
励起／検出対の構成は、図示されたものから変更することができ、励起及び検出経路は、追加の構成要素、より少ない構成要素、又は望ましい構成要素のあらゆる組合せを含むことができる。光学構成要素は、特定用途に対して適切に修正することができ（例えば、蓋加熱器２０４がない場合は、光学経路をより短くすることができ）、以下に限定はしないが、レンズ、ビームスプリッタ、ミラー、及びフィルタを含めた構成要素のあらゆる数との組合せを使用することができる。ＬＥＤは、コンパクトで信頼性のある構成要素を提供するが、レーザダイオード及びフラッシュランプなどのような干渉性又は非干渉性の光源の使用も除外されない。同様に、検出器は、フォトダイオードに制約されず、光電子倍増管及び電荷結合素子（ＣＣＤ）を含めたあらゆる種類の光検出器で代用することができる。各励起／検出対は、自己完結型のアセンブリとして構成され、それを作動させるために外部電気接続のみを必要とするのが好ましい。励起及び検出経路の長さが１つの実験から次の実験まで変動しないので、作動中に更なる調節が必要ないように、製造中に各励起／検出対６００を検出モジュール２３４の内部に固定し、様々な光学構成要素を最適化することが望ましい。
【００３７】
図７は、蓋アセンブリ１１２の電気接続を示すブロック図である。主処理基板７０２が蓋アセンブリ１１２に取り付けられる。主処理基板７０２は、第１の信号プロセッサ７０４、ステッパモータ駆動ユニット７０６、電源用接点７０８、及び外部コンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ、すなわち、ＰＣ）用接点７１０を含む。主処理基板７０２はまた、蓋１２２に及びそれからの電気信号の伝送を行うケーブル２１２のためのコネクタ２１４を提供する。
【００３８】
蓋１２２は、主処理基板７０２と、ステッパモータ３０２、３０４、およびシャトル２３２間の通信を容易にする副処理基板７２０を含む。副処理基板７２０は、ケーブル２１２のコネクタ７２２、ケーブル７２６をシャトル２３２に接続するコネクタ７２４、及びｘ及びｙステッパモータ３０２及び３１６に制御信号を供給するケーブル７３６及び７３８のためのコネクタ７３２及び７３４を含む。副処理基板７２０内のルーティング経路（図示せず）は、様々なコネクタ間の適切な信号接続を設定する。
【００３９】
ケーブル７２６は、検出モジュール２３４に対して個々の光源を作動及び停止するような制御信号を伝達し、検出モジュール２３４に含まれた光検出器から信号を受信するために使用される。電気コネクタ７３０は、検出モジュール２３４に対して信号を送受信するためにシャトル２３２に設けられる。電気コネクタ７３０は、検出モジュール２３４がシャトル２３２に取り付けられた時に、検出モジュール２３４の上面の合わせコネクタ４２４を受け入れる。他の実施形態では、ケーブル７２６は、検出モジュール２３４に直接取り付けてもよい。
【００４０】
上述のように、主処理基板７０２は、外部コンピュータ（図示せず）に接点７１０を提供する。検出モジュール２３４から得られた蛍光光度計のデータの読取及び分析、並びにシャトル２３２の作動と検出モジュール２３４の作動を制御するために、外部コンピュータを使用することができる。
【００４１】
上述のように、検出モジュール２３４は、自己完結型でシャトルから取外し可能に設計される。これは、蛍光分析システムを再構成可能にし、異なる測定を実行するために実験者が要望通りに検出モジュールを変更することを可能にする。例えば、異なる蛍光標識物質（又は標識物質の組合せ）に対して異なる検出モジュールを最適化することができる。実験者が異なる標識物質の研究を望む場合、実験者は、単に適切な検出モジュールを組み込むだけである。組込みは、シャトル２３２の下部の対応するコネクタに対する望ましい検出モジュール２３４の電気コネクタ４２４と機械コネクタ４２０の取り付ければよい。一部の実施形態では、コネクタは、機械的に接続した時に自動的に電気接続が行われるように設計される。上に指摘したように、蓋加熱器２０４は、移動可能に取り付けられて蛍光光度計アセンブリ２３０へのアクセスが可能になり、それによって実験者は、検出モジュールを変更することができるようになるのが好ましい。
【００４２】
本明細書に説明した装置は例示的であり、変更及び修正が可能であることがわかる。例えば、基部とサンプルユニットは、一体化されたシステム、又はより小さなモジュール構成要素に更に分割されたものとして設計することができる。蛍光光度計アセンブリは、サンプルウエルに対して固定された位置に取り付けられる限り、蓋に取り付けられるか又は蓋と一体化される必要はない。変換ステージ又はステッパモータに限らず、サンプルウエルの異なるものと光学連通状態で検出モジュールを配置するように検出モジュールを可動にするあらゆる機構を使用することができる。検出モジュールは、単独の検出チャンネルとして作動するあらゆる数（１または２以上）の励起／検出対を含むことができ、同じ蛍光プローブ又は異なる蛍光プローブを検出するために異なる対を設計することができる。他の実施形態では、検出モジュールは、サンプルアレイの行と対応するように配置された光学ウインドウを有する励起／検出対の行を含み、検出モジュールは、アレイの異なる列を調べるために一方向に可動にされる。
【００４３】
外部コンピュータもまた任意的であり、その機能のいずれもサーマルサイクル装置内に統合することができ、逆に、サーマルサイクラの制御機能を、外部コンピュータを作動させるように実施することができ、それによって全体の装置に対して単一の制御装置を提供することができる。一実施形態では、外部コンピュータは、サンプルウエルに対する検出モジュール２３４の位置と光源及び検出器の作動とを制御するために使用される。更に、外部コンピュータは、専用の制御及び信号処理装置、並びにＰＣのような汎用コンピュータとすることができる。
【００４４】
ＩＩ．使用の方法
本明細書に説明する装置は、蛍光量を検出することによって、増幅反応で生成された増幅生成物の量を検出するために使用することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡサンプル中に存在するターゲット配列を定量化するために、様々な増幅技術を使用することができる。増幅される配列に対して相補的な配列を含む核酸アンプリコン（コピー）の酵素的合成を伴うそのような技術は、当業技術では公知であり、広く使用されている。これらは、以下に限定はしないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写ベースの増幅反応、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、及びその他（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｆａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ著「ＰＣＲプライマー：実験用マニュアル」、１９９５年；米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号、Ｉｎｎｉｓ他編集「ＰＣＲプロトコル：方法及び応用のためのガイド」、１９９０年；Ｗａｌｋｅｒ他、「核酸研究」、２０（７）、１６９１−６、１９９２年；Ｗａｌｋｅｒ、「ＰＣＲ方法応用」、３（１）：１−６、１９９３年；Ｐｈｙｆｆｅｒ他、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、３４：８３４−８４１、１９９６年；Ｖｕｏｒｉｎｅｎ他、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、３３：１８５６−１８５９、１９９５年；Ｃｏｍｐｔｏｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」、３５０（６３１３）：９１−２、１９９１年；Ｌｉｓｂｙ、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、１２（１）：７５−９９、１９９９年；Ｈａｔｃｈ他、「Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．」、１５（２）：３５−４０、１９９９年；及びＩｑｂａｌ他、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ」、１３（４）：３１５−３２０、１９９９年を参照されたい）を含む。核酸増幅は、サンプル中に存在するターゲット配列の量が非常に少ない時に特に有益である。関連の有機体又はウイルスに属するサンプル中の核酸の検出をより確実にするのに検定の始めで必要なターゲット配列のコピーがより少ないので、ターゲット配列を増幅して合成されたアンプリコンを検出することにより、検定の感度を大幅に改善することができる。
【００４５】
増幅生成物の測定は、反応が終了した後か又はリアルタイムに（すなわち、実質的に連続して）実行することができる。増幅が終了した後に累積された増幅生成物の測定が実行された場合、検出の試薬（例えば、蛍光プローブ）は、増幅反応の後に追加することができる。代替的に、増幅反応の前に又はその間に反応にプローブを追加することができ、従って、増幅の終了後か又はリアルタイムに増幅生成物の測定が可能になる。増幅生成物がリアルタイムに測定された場合、信号が閾値を超えるサイクル数を判断し、指数増幅を仮定して最初のコピー数に投影して戻すことにより、最初のコピー数を見積もることができる。
【００４６】
Ａ．蛍光プローブ
蛍光プローブを利用するいくつかのフォーマットが利用可能である。これらのフォーマットは、多くの場合、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）に基づいており、分子標識と「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブを含む。ＦＲＥＴは、供与体及び受容体分子間の距離依存型相互作用である。供与体及び受容体分子は、燐光体である。燐光体が部分的に重なる励起及び放射スペクトルを有する場合、非常に近傍で（通常、約１０−１００オングストローム）、供与体燐光体の励起は、受容体燐光体に転送される。その結果、供与体分子の寿命が短縮されてその燐光体は消失し、一方で受容体分子の燐光体輝度は、増強されて消極される。供与体の励起状態エネルギが非燐光受容体に転送される時に、供与体の蛍光は、受容体による蛍光のその後の放射なしに消失する。この場合、受容体は、消失試薬として機能する。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲに対する１つのＦＲＥＴベースのフォーマットは、「分子標識」として公知のＤＮＡプローブを使用する（例えば、Ｔｙａｇｉ他、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」、１６：４９−５３、１９９８年；及び米国特許第５，９２５，５１７号を参照されたい）。分子標識は、消光色素とレポーター色素がヘアピン軸の端部で互いに密接に接触するヘアピン構造を有する。相補的な配列と混成化する時に、ヘアピン構造のループが二本鎖となって消失及びレポーター色素を強制的に分離し、従って、蛍光信号を発生する。関連の検出方法は、蛍光発生プローブとしてヘアピンプライマーを使用する（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ他、「核酸研究」、２５：２５１６−２５２１、１９９７年；米国特許第５，８６６，３３６号、米国特許第５，９５８，７００号）。ＰＣＲプライマーは、プライマーが線形構造を使用する、すなわち、ＰＣＲ生成物に組み込まれる時だけ蛍光信号が生成される方法で設計することができる。
【００４８】
増幅生成物はまた、蛍光発生５’ヌクレアーゼ検定、すなわち、「ＴａｑＭａｎ」検定を使用して溶液中で検出することができる。Ｈｏｌｌａｎｄ他、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７２７６−７２８０、１９９１年；米国特許第５，５３８，８４８号、第５，７２３，５９１号、及び第５，８７６，９３０号を参照されたい。「ＴａｑＭａｎ」プローブは、望ましいＰＣＲ生成物内の配列に対して混成化するように設計される。「ＴａｑＭａｎ」プローブの５’端部は、蛍光レポーター色素を含む。プローブの３’端部は、ブロックされてプローブの拡張を防止し、５’燐光体の蛍光発色を消失させることになる色素を含む。続く増幅中に、反応において５’エキソヌクレアーゼ活動を有するポリメラーゼが存在する場合は、５’蛍光標識は開裂される。５’燐光体の切除は、検出することができる蛍光の増加をもたらすことになる。
【００４９】
ヘアピンと５’−ヌクレアーゼＰＣＲ検定に加えて、ＦＲＥＴ機構を使用する他のフォーマットも開発されてきた。例えば、第１の色素の蛍光が第２の色素によって消失されるという方法で、単一鎖信号プライマーが２つの色素に対するリンクによって修正され、供与体／受容体色素対を形成した。この信号プライマーは、制限部位（米国特許第５，８４６，７２６号）を含み、ターゲットに混成化された時に適切な制限酵素がプライマーに刻みを付けるのを可能にする。この裂け目は、２つの色素を分離し、消失の現象による蛍光の変化が観測される。配位子にオリゴヌクレオチドを連結する非ヌクレオチドリンク試薬もまた説明されている（米国特許第５，６９６，２５１号）。
【００５０】
蛍光の読みを使用してモニタすることができる他の増幅反応は、増幅生成物に結合されたＤＮＡ結合色素の量を測定することによって定量化されるものを含む。そのような検定は、例えば、臭化エチジウム又は「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ」（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッド；米国特許第５，４３６，１３４号及び第５，６５８，７５１号）のような蛍光色素を使用し、それらは、ＤＮＡ中に介在する時に蛍光の増加を呈する（例えば、米国特許第５，９９４，０５６号及び第６，１７１，７８５号を参照されたい）。蛍光の増加は、増幅反応によって生成された二本鎖ＤＮＡの量の増加に反映される。
【００５１】
他の蛍光プローブは、無機分子、有機及び／又は無機分子の多分子混合物、結晶、及びヘテロポリマーなどを含む。例えば、シリカシェル中に封入されたＣｄＳｅ−ＣｄＳコアシェル・ナノ結晶は、生物分子に連結するために簡単に変成される（Ｂｒｕｃｈｅｚ他（１９９８年）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高蛍光量子ドット（硫化亜鉛キャップド・セレン化カドミウム）は、超高感度生物学検出（Ｗａｒｒｅｎ及びＮｉｅ（１９９８年）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２８１：２０１６−２０１８）で使用するために生体分子と共有結合されている。
【００５２】
装置１００を使用して多重検定もまた実行することができる。多重ＰＣＲは、同一反応で複数ポリヌクレオチド断片の増幅をもたらすものである。例えば、「ＰＣＲプライマー、実験用マニュアル」（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編、１９９５年）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１５７−１７１ページを参照されたい。例えば、異なるターゲットテンプレートを追加し、同一の反応容器内で並行に増幅することができる。多重検定は、一般的に、異なる蛍光標識法の使用を含み、増幅された異なるターゲット配列を検出する。
【００５３】
Ｂ．ＰＣＲ条件及び成分
例示的なＰＣＲ反応条件は、一般的に、２又は３ステップサイクルを含む。２ステップサイクルは、変成ステップを有し、混成化／伸長ステップへと続く。３ステップサイクルは、変成ステップを有し、混成化ステップに続き、別の伸長ステップへと続く。ポリメラーゼ反応は、プライマーがターゲット配列に混成化されてポリメラーゼによって伸張される条件下で培養される。増幅の反応サイクル条件は、プライマーが特にターゲット配列に混成化されて伸張されるように選択される。
【００５４】
成功するＰＣＲ増幅は、各ステップで高い処理量、高い選択性、及び制御された反応速度を必要とする。処理量、選択性、及び反応速度は、通常は温度に依存し、最適な温度は、反応システム内のポリヌクレオチド、酵素、及び他の成分の組成と長さに依存する。更に、異なるステップに対しては異なる温度が最適になる場合がある。最適な反応条件は、ターゲット配列とプライマーの組成次第で変動する場合がある。装置１００のようなサーマルサイクラは、反応条件の必要な制御を行い、特定の検定のためにＰＣＲ処理を最適化する。例えば、装置１００は、維持される温度、各サイクルの継続時間、サイクル数などを選択することにより、プログラムすることができる。一部の実施形態では、異なる温度で異なるサンプルウエルを維持することができるなどのために、温度勾配をプログラムすることができる。
【００５５】
塩基リンク又は末端リンクのフッ素及び消光剤を含む蛍光オリゴヌクレオチド（プライマー又はプローブ）は、当業技術で公知である。それらは、例えば、ライフ・テクノロジーズ（米国メリーランド州ガイサーバーグ）、シグマ−ゲノシス（米国テキサス州ザ・ウッドランズ）、ゲンセット・コーポレーション（米国カリフォルニア州、ラホーヤ）、又はシンセティック・ジェネティクス（米国カリフォルニア州サンジエゴ）から入手可能である。塩基リンクフッ素は、塩基にリンクした反応基と合成されたオリゴヌクレオチドの合成後改質により、オリゴヌクレオチド内に取り込まれる。米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブズのような市販の供給元からのものを含む、多数の異なる燐光体が入手可能であり、他の燐光体も当業者に公知であることを当業者は認識するであろう。有用な燐光体には、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ・テトラクロロ・フルオレセイン（ＴＥＴ）、ＮＨＳ−フルオレセイン、５及び／又は６−カルボキシ・フルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（又は６−）ヨードアセトアミド・フルオレセイン、５−｛〔２（及び３）−５−（アセチルメルカプト）−スクシニル〕アミノ｝フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン）、及び他のフルオレセイン派生物、ローダミン、「Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ」ローダミンＢ塩化スルホニル、テキサスレッド・塩化スルホニル、５及び／又は６カルボキシ・ローダミン（ＲＯＸ）、及び他のローダミン派生物、クマリン、７−アミノ−メチル−クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３酢酸（ＡＭＣＡ）、及び他のクマリン派生物、「ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）」燐光体、８−メチル・オキシピレン−１，３，６−三スルホン酸三ナトリウム塩のような「Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）」燐光体、３，６−二スルホン酸塩−４−アミノ・ナフタルイミドのような黄燐燐光体、フィコビリンプロテイン派生物、アレクサフッ素色素（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブズから入手可能）、及び当業者に公知の他の燐光体が含まれる。有用な燐光体の一般的なリストに関しては、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．著「生態共役技術」（アカデミック・プレス、サンジエゴ、１９９６年）も参照されたい。
【００５６】
増幅反応のためのプライマーは、既知のアルゴリズムに従って設計される。例えば、市販で入手可能であるか又はカスタムソフトウエアで実施されるアルゴリズムは、ターゲット配列を増幅するプライマーを設計するために使用することができる。一般的に、プライマーは１２塩基であり、より多くの場合に、長さが１５、１８、又は２０塩基である。一般的に、プライマーは、特定の反応に関与する全てのプライマーが、互いの５℃以内、最も好ましくは２℃以内の溶融温度を有するように設計される。プライマーは、更に、それ自体に又は互いにプライミングすることを避けるように設計される。プライマーの濃度は、増幅された配列の量の正確な評価を提供するように、増幅されるターゲット配列の量に結合するのに十分であるべきである。プライマーの濃度は、結合される配列の大きさと同様にプライマーの結合親和性に従って変動することを当業者は認識するであろう。一般的なプライマー濃度は、０．０１μＭから０．５μＭの範囲であることになる。
【００５７】
当業者は、更に、関連の全ての反応の機能を考慮するために緩衝条件を設計することが望ましいことを認識するであろう。従って、プローブからの信号生成に関連するあらゆる酵素的反応と同様に、増幅反応をサポートするように緩衝条件を設計することができる。特定の反応緩衝は、個々に及び組合せでの反応を試験することにより、様々な反応をサポートする機能を試験することができる。塩又はマグネシウムのような反応の成分の濃度はまた、ターゲット核酸まで焼き戻すプライマー又は検出プローブの能力に影響する可能性がある。これらは、当業技術で公知の手引き、例えば、Ｉｎｎｉｓ他、前出に基づいて調節することができる。
【００５８】
Ｃ．例示的なＰＣＲ処理
図８は、装置１００を使用する核酸増幅と測定処理８００のフローチャートである。この例では、装置１００は、ＰＣＲ増幅処理を制御し、核酸サンプル中の複数のターゲット配列の存在を検出する。
【００５９】
ステップ８０２で反応容器６１６が準備される。この準備は、容器への反応成分の配置と、流出と二次汚染を防止するための容器のシールとを含む。反応成分は、緩衝剤、ターゲット核酸、適切なプライマーとプローブ、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、並びに任意的な付加的な成分を含む。一実施形態では、４つの蛍光プローブが含まれ、各プローブは、異なるターゲット配列を検出するようになっており、特定の反応容器は、１または２以上の蛍光プローブのいずれかを含むことができる。各プローブは、異なる入射波長の光に応答して異なる波長の光を放射するのが好ましい。
【００６０】
ステップ８０６で、検出モジュール２３４は、シャトル２３２に取り付けられる。上述のように、検出モジュール２３４は、いくつかの検出チャンネル（すなわち、励起／検出対）を含んでもよい。一実施形態では、検出モジュール２３４は、４つの検出チャンネルを含む。各チャンネルは、反応容器６１６に含まれる、異なる蛍光プローブが最適化される。
【００６１】
ステップ８０８で、反応容器６１６は、サンプルユニット２０２のサンプルウエル２１０の中に配置される。ステップ８１０で、蓋アセンブリ１１２は、閉じられてベースユニット１１０に位置決めされる。
【００６２】
ステップ８１２で、検出モジュール２３４の各チャンネルが較正される。較正は、位置検出モジュールのチャンネルの少なくとも１つが較正位置２２２と光学連通するように位置検出モジュール２３４に対してステッパモータ３０２及び３１６を作動することにより実行される。上述のように、各較正位置は、既知の蛍光応答を提供する。従って、較正測定値は、検出器応答の変動又はばらつきに対して次のサンプル測定値を訂正するために使用することができる。多くの較正技術が当業技術が公知である。検出モジュール２３４が複数のチャンネルを有する場合、各チャンネルは、個別に較正することができる。
【００６３】
ステップ８１４で、ＰＣＲサイクルが実行される。一般的に、ステップ８１４は、サンプルユニット２０２の温度を調節するためのベースユニット１１０の作動を含み、それによって反応容器を望ましい時間に亘って望ましい温度に保持し、２ステップ又は３ステップのＰＣＲサイクルを完了させる。ベースユニット１１０は、ユーザインタフェースを通じて又は外部コンピュータによって制御することができる。
【００６４】
ステップ８１６で、蛍光光度計アセンブリ２０６は、反応容器６１６を走査して調べる。蛍光光度計アセンブリ２０６の作動は、外部コンピュータによって制御され、測定値がＰＣＲ処理の特定の時間に対応するものとして識別可能なようにベースユニット１１０の作動と同期されるのが好ましい。
【００６５】
より詳細には、ステップ８１６ａで、ステッパモータ３０２及び３１６又は他の移動装置は、４つの検出チャンネルの各々が対応する光学ウインドウ５０２、５０４、５０６、５０８を通じて異なるサンプルウエル２１０と光学連通するように検出モジュール２３４を配置するために作動される。ステップ８１６ｂでは、各チャンネルのＬＥＤ又は他の光源が作動され（短時間に亘って点滅）、蛍光を誘導する。一実施形態では、異なるチャンネルのＬＥＤが並行して作動し、他の実施形態では、別のチャンネルの光検出器内で誤信号を引き起こす１つのチャンネルからの反射ＬＥＤ光線を回避するために、それらは順番に作動される。
【００６６】
ステップ８１６ｃで、得られた蛍光は、対応するフォトダイオード又はチャンネルの他の検出器により検出され、これは、外部コンピュータに読み出される。検出器は、様々な方法で読み取ることができる。例えば、ピーク信号を検出してもよく、信号をある一定の時間間隔に亘って積分、又は、ＬＥＤが停止された後の蛍光信号の減衰を測定してもよい。
【００６７】
ステップ８１６ａ−ｃは繰り返され、検出モジュールの位置は、検出モジュール２３４の各チャンネルが最終的にサンプルウエル２１０の各々を調べるようにその度に変更されるのが好ましい。一実施形態では、９６サンプルの各々に対する４チャンネルの走査と調査には約１５秒かかる。外部コンピュータは、ユーザが収集した測定データを図及び／又は表の形態で見ることができるプログラム（例えば、ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドが販売している「Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ」プログラム）を実行する。そのようなプログラムは、当業技術で公知である。例としては、ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドが販売している「Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）」プログラムが含まれるのが好ましい。
【００６８】
ステップ８１４と８１６は、何回の反応サイクルに亘って繰り返すことができる。処理８００からのリアルタイムの蛍光測定値を使用して各ターゲット配列の存在を検出して定量化することができることを当業者は認識できる。そのような測定値はまた、反応速度の判断、効率を改善するための反応パラメータの調節、並びに特定の実験において付加的な反応サイクルがそれ以上必要でなくなる時（例えば、ターゲット配列の十分な量が生成された時）の判断のような目的のために使用することができる。
【００６９】
処理８００は例示的なものであり、変形と修正が可能であることが認められるであろう。順次的として説明したステップは並行に実行することができ、ステップの順序は変更することができ、ステップを修正するか又は組み合わせることもできる。例えば、蛍光測定は、ＰＣＲサイクル中のどの点でも実行することができ、各ＰＣＲサイクル中（サンプルウエルの実質的に連続した走査を含む）に複数回実行することもでき、又はある回数のＰＣＲサイクルの後まで実行されない場合もある。あらゆる数の認識可能な蛍光プローブを単一の反応容器で使用することができ、検出モジュールは、使用されているプローブの数と少なくとも同じくらい多いチャンネルを含むように適応させることができる。一部の実施形態では、検出モジュールは、同じプローブに対して最適化された複数のチャンネルを含む。これは、特定のサンプルウエルを質問するのにこれらのチャンネルの１つだけを使用すればよいので、走査時間を短縮することができる。
【００７０】
更に、上述のように、他の実施形態では、検出モジュール２３４の様々なチャンネルは、チャンネルの１つがサンプルウエル２１０と光学連通状態にある時に他のチャンネルがそうでないように配置される。この構成は、ウエルの上を走査が通過する間に検出モジュール２３４が実質的に連続して運動中である作動の「フライオーバー」モードを考慮したものである。一度に１つだけのサンプルウエルがあらゆる励起光を受け取るので、チャンネル間のクロストークが減少する。
【００７１】
結論
本発明を特定的な実施形態に関連して説明したが、多くの修正が可能であることを当業者は認識するであろう。例えば、本明細書に説明した蛍光検出アセンブリは、広範囲のサーマルサイクラシステムと共に使用するように適応させることができ、特定機器の設計に応じてあらゆる方向（例えば、上方又は下方）からサンプルウエルを調べることができる。更に、システムは、蛍光標識又はプローブによって識別可能な生物的に関連する広範囲の分子を検出するようになっており、それは、核酸にも又はあらゆる特定の増幅処理にも限定されないものである。
【００７２】
すなわち、本発明を特定的な実施形態に関連して説明したが、本発明は、特許請求の範囲内の全ての修正と均等物を網羅するように意図されていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置の斜視図である。
【図２】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置のための蓋アセンブリの分解組立図である。
【図３】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置のための蛍光光度計アセンブリの底面図である。
【図４】本発明の実施形態による検出モジュールの上面図である。
【図５Ａ】本発明の他の実施形態の検出モジュールの底面図である。
【図５Ｂ】本発明の他の実施形態の検出モジュールの底面図である。
【図６】本発明の実施形態による検出モジュールのための励起／検出対の概略図である。
【図７】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置のための蓋アセンブリに対する電気接続を示すブロック図である。
【図８】本発明の実施形態による蛍光検出システムを有するサーマルサイクラを使用するための処理のフローチャートである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概略的には、蛍光検出システム、詳細には、サーマルサイクラと共に使用するための可動励起／検出モジュールを有する蛍光検出システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
サーマルサイクラは、当業技術で公知である。このような装置は、研究、医療、及び産業分野において、関連の様々な分子、例えば、核酸配列を作成して検出するための様々な処理で使用される。従来のサーマルサイクラを使用して実行することができる処理には、これに限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような手順を使用する核酸の増幅が含まれる。このような増幅処理は、核酸サンプル中に存在するターゲット配列の量を増加させるために使用される。
【０００３】
サーマルサイクラによって処理されたサンプル中のターゲット分子の存在及び／又は濃度を検出するための多くの技術もまた公知である。例えば、蛍光標識法が使用される。蛍光標識（又は蛍光プローブ）は、一般的に、適切な電磁信号又は放射によって誘導された時に、その放射を吸収して誘導放射が継続する間、持続する信号（通常は、例えば波長によって誘導放射から識別可能な放射）、すなわち蛍光を発する物質である。一部の蛍光プローブは、サンプルからの蛍光応答がターゲット分子の存在を示すように、ターゲット分子（例えば、特定の核酸配列）が存在する時だけ活性であるように設計されるのが一般的である。他の種類の蛍光プローブは、反応中に存在する二本鎖ＤＮＡの量に比例してそれらの蛍光が増加する。これらのプローブは、増幅反応がターゲット分子上だけで作動するように設計された場合に使用されるのが一般的である。
【０００４】
蛍光分析法は、適切な波長の光源のような誘導（励起とも呼ばれる）放射に蛍光標識又はプローブを含むサンプルを曝し、それによってプローブを励起して蛍光を生じさせるステップを伴う。生成された放射は、フォトダイオード、光電子倍増管、又は電荷結合素子（ＣＣＤ）などのような適切な検出器を使用して検出される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
蛍光標識サンプルと共に使用される蛍光光度計は、当業者に公知である。１つの種類の蛍光光度計は、米国特許第６，０４３，８８０号明細書でＡｎｄｒｅｗｓ他によって説明されているような光学式読取装置である。励起光にサンプルを曝し放出された放射を検出する光学式読取装置に、サンプルのアレイを収容したサンプルプレートが挿入される。光学式読取装置の利便性は、サーマルサイクラからサンプルプレートを取り外さなければならず増幅の進度をモニタすることが困難であるということによって、制限されている。
【０００６】
１つの改善方法は、サンプルプレートをサーマルサイクラから取り外さないで、又はＰＣＲ処理を中断せずにサンプルプレートを分析することができるように、光学式読取装置をサーマルサイクラに一体化することである。そのような組み合わせた装置の例は、米国特許第５，９２８，９０７号明細書、米国特許第６，０１５，６７４号明細書、米国特許第６，０４３，８８０号明細書、米国特許第６，１４４，４４８号明細書、米国特許第６，３３７，４３５号明細書、及び米国特許第６，３６９，８６３号明細書に説明されている。このような組合せた装置は、例えば、米国特許第５，２１０，０１５号明細書、米国特許第５，９９４，０５６号明細書、米国特許第６，１４０，０５４号明細書、及び米国特許第６，１７４，６７０号明細書に説明されているように様々な用途で有用である。
【０００７】
既存の蛍光光度計は、様々な欠点に持っている。例えば、一部の既存の設計では、アレイ内の異なるサンプルウエルに対して異なる光源と検出器が設けられている。光源及び／又は検出器間の変動は、１つのウエルから次のウエルへの検出蛍光応答の変動をもたらす。代替的に、光源及び／又は検出器は、各ウエルまでの及び／又はそれからの光学経路が異なる１つよりも多いウエルと光学連通するように配置することができる。光学経路が異なるために、検出された蛍光応答は、１つのサンプルウエルから次のサンプルウエルまで変動する。そのような変動を補正するために、各サンプルウエルに対する応答は、個々に較正されるべきである。アレイ内のサンプルウエルの数が増加すると、これがますます時間を浪費する作業になり、較正誤差が次の測定値に大きな誤差を生じさせる場合がある。
【０００８】
更に、既存の蛍光光度計は、一般的に、光源と検出器が計器の固定部分であるように設計されている。これが蛍光光度計を異なる用途に適応させる実験者の能力を制約する。例えば、異なる蛍光標識の検出は、一般的に、異なる光源及び／又は検出器の使用を必要とする。多くの既存の蛍光光度計は、実験者が光源と検出器を再構成することを困難にし、従って、使用することができる様々な蛍光標識を制約している。
【０００９】
また、サンプル中（又は異なるサンプル中）に存在する場合があるいくつかの異なる蛍光標識の同時測定を実行することも困難である。上述のように、分析で得られるデータを最大にするために、実験者は、異なる励起及び／又は放射波長を有する複数の蛍光標識物質を含めることが多い。各標識物質は、異なるターゲット配列に結合するようになっており、同一のサンプル中で複数のターゲット配列が検出されることを原理的に可能にする。しかし、既存の蛍光光度計は、そのような多重標識実験を容易に行うことができない。多くの蛍光光度計は、励起及び放射波長の一つの組合せ用に設計されている。他のものは、多重標識の検出を可能にする多重光源及び検出器を提供するが、これらの構成は、１つの標識の励起波長が別の標識の放射波長と重なる場合があるので、多くの場合に一度に一標識のみの探査を可能にするものであり、検出器に進入する励起光線は、誤った結果をもたらすと考えられる。多重標識の探査は、一般的に並列に行うことができず、データ収集処理を遅くするものである。
【００１０】
従って、これらの欠点を克服するサーマルサイクラのための改善された蛍光光度計が望ましいと考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の実施形態は、サーマルサイクル装置内での蛍光検出を提供する。本発明の１つの態様によれば、サーマルサイクラの複数のウエルに配置されたサンプルを分析するための蛍光検出装置は、サーマルサイクラに取付可能な支持構造体と、支持構造体に移動可能に取り付けることができる検出モジュールとを含む。検出モジュールは、共に検出モジュール内に配置された励起光発生器と放出光検出器を含む。支持構造体がサーマルサイクラに取り付けられ検出モジュールが支持構造体に取り付けられた時に、検出モジュールは、複数のウエルのうちの異なるウエルと光学連通した状態に位置決めされるように移動可能である。
【００１２】
本発明の別の態様によれば、検出モジュールは、２または３以上の励起／検出対を形成するように配置された２または３以上の励起光発生器と２または３以上の放出光検出器を含むことができる。一実施形態では、励起／検出対は、各励起／検出対が複数のウエルの異なるウエルと光学接触して同時に配置することができるように構成される。代替的な実施形態では、励起／検出対は、第１の励起／検出対が複数のウエルのいずれか１つと光学接触して配置された時に、別の励起／検出対が複数のウエルのいずれとも光学接触しないように構成される。一部の実施形態では、検出モジュールは、支持構造体に取外し可能に取り付けられ、それによってユーザは、検出モジュールを異なる検出モジュールと交換することができる。
【００１３】
本発明の更に別の態様によれば、溶液中のターゲット分子の存在を検出する方法が提供される。複数のサンプルが用意され、各サンプルは、ターゲット分子に結合するようになった蛍光標識を含む。各サンプルは、サーマルサイクラ装置の複数のサンプルウエルのそれぞれのウエル内に配置され、サーマルサイクラ装置は、検出モジュールを移動可能に取付け、検出モジュールは、励起／検出チャンネルを含み、励起／検出チャンネルは、検出モジュール内に配置された励起光発生器と検出モジュール内に配置された放出光検出器とを含む。サーマルサイクラ機器は、反応を誘導するために使用され、検出モジュールを移動して励起／検出チャンネルを作動することにより、サンプルウエルが走査されて蛍光応答を検出する。走査中に、検出モジュールは、励起／検出チャンネルが複数のサンプルウエルのそれぞれと光学連通した状態に順番に配置されるように移動される。検出モジュールが複数の励起／検出対又はチャンネルを含む場合は、チャンネルは、並行して又は順番に作動する。
【００１４】
添付図面と共に以下の詳細説明は、本発明の特質と利点のより良い理解を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明の例示的な装置の実施形態を、同じ参照数字が対応する部分を表す添付図面を参照して説明する。装置を使用する方法も以下に説明する。本明細書に示して説明する実施形態は例示的であり、本発明を制約するものではない。
【００１６】
Ｉ．例示的な装置
図１は、本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置１００の概略図である。装置１００は、ベースユニット１１０と蓋アセンブリ１１２から成る。ベースユニット１１０は、従来の設計とすることができ、プログラマブルプロセッサ及びクロックなどのような従来の電子構成要素（図示せず）を通じてサーマルサイクル処理のための電力と制御機能を提供する。ベースユニット１１０は、キーパッド１１８とＬＣＤディスプレイスクリーン１２０を含むことができ、ユーザがサーマルサイクラの作動を制御してモニタすることができるユーザインタフェース１１６もまた提供する。ベースユニット１１０は、電源ケーブル１２１を通じて外部電源（例えば、標準の１２０Ｖ交流電源）に接続される。ベースユニット１１０のいくつかの例は、本発明の譲受人であるＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドから販売されている「ＤＮＡエンジン（登録商標）」、「Ｄｙａｄ（登録商標）」、及び「Ｔｅｔｒａｄ（登録商標）」サーマルサイクラを含む。
【００１７】
蓋アセンブリ１１２は、蓋１２２内に配置されたサンプルユニットと蛍光検出装置を含み、以下、これらの構成要素を説明する。蓋１２２は、ベースユニット１１０への配置とそれからの取外しを助けるハンドル１２４と、通気口１２６とを有する。蓋１２２は、蓋アセンブリ１１２内部の構成要素に対して光学的及び熱的分離を提供するものである。
【００１８】
図２は、蓋アセンブリ１１２の内部の分解組立図である。示されているのは、サンプルユニット２０２、蓋加熱器２０４、及び蛍光光度計アセンブリ２０６である。サンプルユニット２０２は、規則的なアレイ（例えば、８ｘ１２の格子）に配置された、いくつかのサンプルウエル２１０を含む。一実施形態では、各サンプルウエル２１０は、ターゲット核酸配列に結合するか又はその存在に応答するようになった少なくとも１つの蛍光標識又はプローブを含む適切なＰＣＲ反応物質（緩衝剤、プライマーとプローブ、及びヌクレオチドなど）と共に、試験される核酸サンプルを含むチューブのような取外し可能な反応容器（図示せず）を保持する。反応容器には、処理中のサンプルの交差汚染又は流出を回避するために、容器の上部を覆って確実に嵌る透明なサンプルキャップ（図示せず）が設けられるのが好ましい。反応容器はまた、「Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ（登録商標）Ｂ」（ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッド製）のようなフィルム、「Ｃｈｉｌｌ−ｏｕｔ（登録商標）」（ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッド製）のようなワックス製品、又は鉱物油の使用を含む他の方法で、シールすることができる。代替の構成として、１または２以上の個別のサンプルをサンプルウエル２１０に対応する位置に保持する取外し可能なサンプルトレイ（図示せず）を使用してもよい。サンプルトレイはまた、上述のいずれかの方法でシールすることができる。
【００１９】
サンプルユニット２０２はまた、加熱要素（例えば、ペルチエ効果熱電装置）、熱交換要素、加熱要素をベースユニット１１０に接続するための電気的接続要素、及び機械的接続要素を含む。これらの要素（図示せず）は、従来技術の設計にすることができる。サンプルユニット２０２はまた、コネクタ２１４に取外し可能に接続したマルチワイヤ式ケーブル２１２を介して蓋加熱器２０４と蛍光光度計アセンブリ２０６のための電気接続を提供する。
【００２０】
蓋加熱器２０４には、サンプルウエル２１０と電子制御された加熱要素（図示せず）との大きさと間隔に適合する孔２２０が貫通している。蓋加熱器２０４は、蓋１２２に連結される。連結機構（図示せず）は、蓋１２２がサンプルユニット２０２から取り外された時に、蛍光光度計アセンブリ２０６にアクセスできるように移動可能である（例えば、蓋加熱器２０４はヒンジによって蓋１２２に取り付けることができる）のが好ましい。蓋１２２がサンプルユニット２０２の所定位置にある時に、支持体２２４は、蓋加熱器２０４を所定位置に保持する。支持体２２４の下方部分２２６は、蓋加熱器２０４をサンプルユニットに向けて圧縮するように設計され、それによって装置１００の作動中にサンプルが蒸発する可能性を低くするのが好ましい。この圧縮はまた、異なる大きさの反応容器の使用を可能にする。蓋加熱器２０４は、サーマルサイクル作動中にキャップ上での結露を回避するために、反応容器のサンプルウエル２１０のサンプルキャップ（又は他のシーラント）の温度を制御するために使用される。
【００２１】
蓋加熱器２０４は、選択された孔２２０の間、又は蓋加熱器２０４の周囲近辺のような孔から離れた別の位置に位置決めされた１または２以上の較正要素２２２を含むのが好ましい。較正要素２２２は、既知の蛍光応答を提供し、蛍光光度計アセンブリ内の蛍光検出器を較正するために使用することができる。較正要素２２２は、ガラス又はプラスチック基板に蛍光コーティングを施して作ることができ、又は色素が含浸されたプラスチック、蛍光ガラス、又はポリエーテルイミド（ＰＥＩ）のような蛍光プラスチックで構成することができる。蛍光検出器の飽和を回避するために、蛍光材料の上にニュートラル又は他の種類のフィルタを配置することができる。一般的に、蛍光特性が光（光漂白）と熱を付与された期間に亘って十分に安定していることを条件として、あらゆる材料を使用することができる。実用上、蛍光応答に対する温度の影響が最小にされるのが好ましい。複数の較正要素２２２が提供される場合、構成要素の異なるものに対して異なる材料を使用することができる。他の実施形態では、蓋加熱器２０４を省略し、較正要素２２２をサンプルユニット２０２の表面に配置することができる。
【００２２】
サンプルユニット２０２と蓋加熱器２０４は、従来の設計にすることができる。適切な設計の例は、本発明の譲受人であるＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドから販売されている様々な「Ａｌｐｈａ（登録商標）」モジュールのサンプルユニット及び蓋加熱器構成要素を含む。
【００２３】
蛍光光度計アセンブリ２０６は、内側蓋１２２に固定された支持フレーム又はプラットフォーム２３０を含む。シャトル２３２が、支持フレーム２３０の下側に移動可能に取り付けられ、このシャトル２３２が検出モジュール２３４を保持する。シャトル２３２は、蓋加熱器２０４の対応する孔２２０を通してサンプルユニット２０２の異なったサンプルウエル２１０と光学連通するように検出モジュール２３４を位置決めできるように、二次元的に移動可能であり。支持フレーム２３０と支持体２２４は、蓋１２２がベースユニット１１０内に配置されて閉じられた時に、検出モジュール２３４が蓋加熱器２０４の近くに保持されるような寸法とされるのが好ましく、この配置が、サンプルウエルと検出モジュールの間の光損失を低減することがわかる。
【００２４】
図３は、蛍光光度計アセンブリ２０６の底面図であり、シャトル２３２と検出モジュール２３４の移動可能な取付けを示している。この実施形態では、検出モジュール２３４が取外し可能に連結されたシャトル２３２を望ましい位置まで移動させるために、ステッパモータによって駆動される並進ステージが使用される。特に、支持フレーム２３０は、ｘ軸ステッパモータ３０２とそれに取り付けられたリードスクリュー３０４とを有する。ステッパモータ３０２は、リードスクリュー３０４を回転させるように作動し、それによって並進ステージ３０６をｘ方向（矢印で示された）に移動させる。リミットスイッチ３０８が設け、並進ステージ３０６の動きを、検出モジュール２３４をいずれのウエルとも光学接触して配置できるように十分に大きく、且つ並進ステージ３０６がステッパモータ３０２のような他のシステム要素との接触を回避できる適切な範囲に制限するが好ましい。
【００２５】
並進ステージ３０６は、ｙ軸ステッパモータ３１６とこれに取り付けられたリードスクリュー３１８とを有する。ステッパモータ３１６は、リードスクリュー３１８を回転させるように作動し、それによってシャトル２３２をｙ方向（矢印で示された）に沿って移動させる。リミットスイッチ３２０が設け、シャトル２３２の動きを、検出モジュール２３４をいずれのウエルとも光学接触して配置できるように十分に大きく、且つシャトル２３２がステッパモータ３１６のような他のシステム要素と接触するのを回避できるる適切な範囲に制限するのが好ましい。
【００２６】
ステッパモータ３０２及び３１６、リードスクリュー３０４及び３１８、及びリミットスイッチ３０８及び３２０は、通常は、従来技術の設計にすることができる。他の可動式の取付け方法で代用することができるがわかる。例えば、モータをリードスクリューに直接連結する代わりに、チェーン駆動又はベルト駆動のような間接連結を使用することができる。検出モジュールを配置するためにリードスクリューを使用せず、例えば、並進ステージをチェーン駆動、ベルト駆動、又は他の駆動機構に取り付けることにより、チェーン駆動、ベルト駆動、又は他の駆動機構も使用することができる。他の種類のモータ、例えば、サーボモータ又はリニアモータなども使用することができる。異なる自由度に対して、異なる駆動機構を使用することもできる。
【００２７】
シャトル２３２は、コネクタ３３０及び３３１を介して検出モジュール２３４を保持する。コネクタ３３０及び３３１は、設計によって変わる場合があるが、検出モジュール２３４をシャトル２３２の下部に支持し整列するように構成される。検出モジュールを簡単に取り替えることができるように、コネクタは検出モジュール２３４に簡単に挿入かつ取り外しすることができるようになっているのが好ましい。一実施形態では、コネクタ３３０は、検出モジュール２３４の縁部をピボット回転可能に保持する円筒形部材（図示せず）に対する取付けを提供し、一方でコネクタ３３１は、検出モジュール２３４上の対応するレセプタクルに挿入可能なシャトルに取り付けられたボールプランジャを含む。以下に説明するように、シャトル２３２と検出モジュール２３４の間の電気接続（図示せず）も提供される。
【００２８】
図４は、検出モジュール２３４の上面図である。検出モジュール２３４は、シャトル２３２の下側の対応するコネクタ３３０に連結することによりシャトル２３２と共にユニットとして動くように検出モジュール２３４を所定位置に固定する取り付け金具４２０を含む。検出モジュール２３４はまた、シャトル２３２の下側の対応する電気コネクタに接続する電気コネクタ４２４を含み、それによって検出モジュール２３４への制御信号の供給と検出モジュール２３４からの読取信号の取得が可能になる。
【００２９】
図５Ａは、検出モジュール２３４の一実施形態の底面図であり、検出モジュール２３４の本体内側に配置された４つの個々に制御された蛍光励起／検出チャンネル（「励起／検出対」とも呼ばれる）の４つの開口部５０２、５０４、５０６、及び５０８を示している。励起／検出チャンネルの例を以下に説明する。開口部５０２、５０４、５０６、及び５０８の間隔は、サンプルウエル２１０の間隔に対応する。従って、開口部５０２がサンプルウエル２１０の１つと光学連通状態に置かれた時に、開口部５０４、５０６、及び５０８は、それぞれ別々のサンプルウエル２１０との光学連通状態に置かれる。開口部５０２、５０４、５０６、及び５０８は、単に検出モジュール２３４の底面を通る孔とするか、又は各チャンネルの励起及び検出光線の波長に対して透過性が高いあらゆる物質で作ることができる。
【００３０】
図５Ｂは、本発明の他の実施形態による検出モジュール２３４’の底面図である。この実施形態では、４つの開口部５１２、５１４、５１６、及び５１８が設けられるが、それらは千鳥状に配置されるので、一度に１つの開口部だけがサンプルウエルのいずれかと光学連通することができる。この構成は、励起／検出対間のクロストークを低減するのに有用である。
【００３１】
図６は、本発明の実施形態による励起／検出チャンネル（又は励起／検出対）６００のための光学要素の構成を示す概略図である。検出モジュール２３４は、励起／検出対６００の１または２以上のインスタンスを含むことができ、各対は、独立した蛍光検出チャンネルを提供する。励起／検出対６００は、不透明な壁６０２の内側に配置され、この壁は、外部光源の他に検出モジュール２３４に含めることができる他の励起／検出対からの光学分離を提供する。励起光路６０４は、発光ダイオード（ＬＥＤ）又は他の光源６０６、フィルタ６０８、レンズ６１０、及びビームスプリッタ６１２を含む。検出光路６２０は、ビームスプリッタ６１２、フィルタ６２４、レンズ６２６、及びフォトダイオード又は他の光検出器を含む。ビームスプリッタ６１２は、励起波長の光に対して極めて透過性が高く、検出（蛍光応答）波長の光に良く反射するように選択されるのが好ましい。
【００３２】
励起光路６０４は、望ましい波長の励起光をサンプルブロック２０２のサンプルウエル２１０に保持された反応容器６１６に導くように配置される。望ましい波長は、反応容器６１６に含まれる特定の蛍光標識物質に依存し、適切なＬＥＤ６０６とフィルタ６０８の選択によって制御される。励起／検出対６００と反応容器６１６の間の光学連通は、上述のように不透明な壁６０２の開口部５０２と蓋加熱器２０４を通る孔２２０によって提供される。励起／検出対６００との光伝送を最大にするために、開口部５０２と蓋加熱器２０４の作動中の間隔は小さくされるのが好ましい。
【００３３】
反応容器６１６に入った励起光線は、蛍光を発する蛍光標識又はプローブを励起し、それによって波長が異なる光を生成させる。この光の一部は、検出光路６２０上で反応容器６１６を出て開口部５０２を通過する。ビームスプリッタ６１２は、蛍光光線の実質的な部分が、励起周波数を濾過するフィルタ６２４とフォトダイオード６２８の活性表面上に光を集束させるレンズ６２６とを通るように誘導する。フォトダイオード６２８は、入射光線に応答して電気信号を発生する。この電気信号は、読取信号経路６３０によって回路基板６３４に伝送され、この基板は、読取のために信号を電気コネクタ４２４にルーティングする。回路基板６３４及び／又は信号経路６３０はまた、フォトダイオード６２８からの電気信号を成形して精緻化するためにプリアンプのような別の構成要素を含むことができる。
【００３４】
ＬＥＤ６０６とフォトダイオード６２８は、各制御信号経路６３６及び６３８によって表示されるように、コネクタ４２４を通じて受信された信号によって制御することができる。ＬＥＤ６０６の制御信号は、ＬＥＤ６０６を望ましい時間に作動及び停止するように動作させることができ、フォトダイオード６２８の制御信号は、フォトダイオード６２８を望ましい時間に作動及び停止させたり、ゲインパラメータを調節する等の動作をおこなわせることができる。
【００３５】
図６は、１つの励起／検出対６００を示すが、検出モジュール２３４の実施形態は、各対が他から光学分離状態にあり、サンプルウエルとの光学連通のためのそれ自体の開口部（例えば、図５の開口部５０４、５０６、５０８）を有するあらゆる数のこのような対を含むことができることが好ましいことが分かる。様々な励起／検出対は単独に制御され、単独に読み出されるが、それらの各制御及び読取経路は、全て回路基板６３４と連結することができる。
【００３６】
励起／検出対の構成は、図示されたものから変更することができ、励起及び検出経路は、追加の構成要素、より少ない構成要素、又は望ましい構成要素のあらゆる組合せを含むことができる。光学構成要素は、特定用途に対して適切に修正することができ（例えば、蓋加熱器２０４がない場合は、光学経路をより短くすることができ）、以下に限定はしないが、レンズ、ビームスプリッタ、ミラー、及びフィルタを含めた構成要素のあらゆる数との組合せを使用することができる。ＬＥＤは、コンパクトで信頼性のある構成要素を提供するが、レーザダイオード及びフラッシュランプなどのような干渉性又は非干渉性の光源の使用も除外されない。同様に、検出器は、フォトダイオードに制約されず、光電子倍増管及び電荷結合素子（ＣＣＤ）を含めたあらゆる種類の光検出器で代用することができる。各励起／検出対は、自己完結型のアセンブリとして構成され、それを作動させるために外部電気接続のみを必要とするのが好ましい。励起及び検出経路の長さが１つの実験から次の実験まで変動しないので、作動中に更なる調節が必要ないように、製造中に各励起／検出対６００を検出モジュール２３４の内部に固定し、様々な光学構成要素を最適化することが望ましい。
【００３７】
図７は、蓋アセンブリ１１２の電気接続を示すブロック図である。主処理基板７０２が蓋アセンブリ１１２に取り付けられる。主処理基板７０２は、第１の信号プロセッサ７０４、ステッパモータ駆動ユニット７０６、電源用接点７０８、及び外部コンピュータ（例えば、パーソナルコンピュータ、すなわち、ＰＣ）用接点７１０を含む。主処理基板７０２はまた、蓋１２２に及びそれからの電気信号の伝送を行うケーブル２１２のためのコネクタ２１４を提供する。
【００３８】
蓋１２２は、主処理基板７０２と、ステッパモータ３０２、３０４、およびシャトル２３２間の通信を容易にする副処理基板７２０を含む。副処理基板７２０は、ケーブル２１２のコネクタ７２２、ケーブル７２６をシャトル２３２に接続するコネクタ７２４、及びｘ及びｙステッパモータ３０２及び３１６に制御信号を供給するケーブル７３６及び７３８のためのコネクタ７３２及び７３４を含む。副処理基板７２０内のルーティング経路（図示せず）は、様々なコネクタ間の適切な信号接続を設定する。
【００３９】
ケーブル７２６は、検出モジュール２３４に対して個々の光源を作動及び停止するような制御信号を伝達し、検出モジュール２３４に含まれた光検出器から信号を受信するために使用される。電気コネクタ７３０は、検出モジュール２３４に対して信号を送受信するためにシャトル２３２に設けられる。電気コネクタ７３０は、検出モジュール２３４がシャトル２３２に取り付けられた時に、検出モジュール２３４の上面の合わせコネクタ４２４を受け入れる。他の実施形態では、ケーブル７２６は、検出モジュール２３４に直接取り付けてもよい。
【００４０】
上述のように、主処理基板７０２は、外部コンピュータ（図示せず）に接点７１０を提供する。検出モジュール２３４から得られた蛍光光度計のデータの読取及び分析、並びにシャトル２３２の作動と検出モジュール２３４の作動を制御するために、外部コンピュータを使用することができる。
【００４１】
上述のように、検出モジュール２３４は、自己完結型でシャトルから取外し可能に設計される。これは、蛍光分析システムを再構成可能にし、異なる測定を実行するために実験者が要望通りに検出モジュールを変更することを可能にする。例えば、異なる蛍光標識物質（又は標識物質の組合せ）に対して異なる検出モジュールを最適化することができる。実験者が異なる標識物質の研究を望む場合、実験者は、単に適切な検出モジュールを組み込むだけである。組込みは、シャトル２３２の下部の対応するコネクタに対する望ましい検出モジュール２３４の電気コネクタ４２４と機械コネクタ４２０の取り付ければよい。一部の実施形態では、コネクタは、機械的に接続した時に自動的に電気接続が行われるように設計される。上に指摘したように、蓋加熱器２０４は、移動可能に取り付けられて蛍光光度計アセンブリ２３０へのアクセスが可能になり、それによって実験者は、検出モジュールを変更することができるようになるのが好ましい。
【００４２】
本明細書に説明した装置は例示的であり、変更及び修正が可能であることがわかる。例えば、基部とサンプルユニットは、一体化されたシステム、又はより小さなモジュール構成要素に更に分割されたものとして設計することができる。蛍光光度計アセンブリは、サンプルウエルに対して固定された位置に取り付けられる限り、蓋に取り付けられるか又は蓋と一体化される必要はない。変換ステージ又はステッパモータに限らず、サンプルウエルの異なるものと光学連通状態で検出モジュールを配置するように検出モジュールを可動にするあらゆる機構を使用することができる。検出モジュールは、単独の検出チャンネルとして作動するあらゆる数（１または２以上）の励起／検出対を含むことができ、同じ蛍光プローブ又は異なる蛍光プローブを検出するために異なる対を設計することができる。他の実施形態では、検出モジュールは、サンプルアレイの行と対応するように配置された光学ウインドウを有する励起／検出対の行を含み、検出モジュールは、アレイの異なる列を調べるために一方向に可動にされる。
【００４３】
外部コンピュータもまた任意的であり、その機能のいずれもサーマルサイクル装置内に統合することができ、逆に、サーマルサイクラの制御機能を、外部コンピュータを作動させるように実施することができ、それによって全体の装置に対して単一の制御装置を提供することができる。一実施形態では、外部コンピュータは、サンプルウエルに対する検出モジュール２３４の位置と光源及び検出器の作動とを制御するために使用される。更に、外部コンピュータは、専用の制御及び信号処理装置、並びにＰＣのような汎用コンピュータとすることができる。
【００４４】
ＩＩ．使用の方法
本明細書に説明する装置は、蛍光量を検出することによって、増幅反応で生成された増幅生成物の量を検出するために使用することができる。ＤＮＡ又はＲＮＡサンプル中に存在するターゲット配列を定量化するために、様々な増幅技術を使用することができる。増幅される配列に対して相補的な配列を含む核酸アンプリコン（コピー）の酵素的合成を伴うそのような技術は、当業技術では公知であり、広く使用されている。これらは、以下に限定はしないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＲＴ−ＰＣＲ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写ベースの増幅反応、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、及びその他（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｆａｃｈ及びＤｖｅｋｓｌｅｒ著「ＰＣＲプライマー：実験用マニュアル」、１９９５年；米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号、Ｉｎｎｉｓ他編集「ＰＣＲプロトコル：方法及び応用のためのガイド」、１９９０年；Ｗａｌｋｅｒ他、「核酸研究」、２０（７）、１６９１−６、１９９２年；Ｗａｌｋｅｒ、「ＰＣＲ方法応用」、３（１）：１−６、１９９３年；Ｐｈｙｆｆｅｒ他、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、３４：８３４−８４１、１９９６年；Ｖｕｏｒｉｎｅｎ他、「Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」、３３：１８５６−１８５９、１９９５年；Ｃｏｍｐｔｏｎ、「Ｎａｔｕｒｅ」、３５０（６３１３）：９１−２、１９９１年；Ｌｉｓｂｙ、「Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、１２（１）：７５−９９、１９９９年；Ｈａｔｃｈ他、「Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．」、１５（２）：３５−４０、１９９９年；及びＩｑｂａｌ他、「Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ」、１３（４）：３１５−３２０、１９９９年を参照されたい）を含む。核酸増幅は、サンプル中に存在するターゲット配列の量が非常に少ない時に特に有益である。関連の有機体又はウイルスに属するサンプル中の核酸の検出をより確実にするのに検定の始めで必要なターゲット配列のコピーがより少ないので、ターゲット配列を増幅して合成されたアンプリコンを検出することにより、検定の感度を大幅に改善することができる。
【００４５】
増幅生成物の測定は、反応が終了した後か又はリアルタイムに（すなわち、実質的に連続して）実行することができる。増幅が終了した後に累積された増幅生成物の測定が実行された場合、検出の試薬（例えば、蛍光プローブ）は、増幅反応の後に追加することができる。代替的に、増幅反応の前に又はその間に反応にプローブを追加することができ、従って、増幅の終了後か又はリアルタイムに増幅生成物の測定が可能になる。増幅生成物がリアルタイムに測定された場合、信号が閾値を超えるサイクル数を判断し、指数増幅を仮定して最初のコピー数に投影して戻すことにより、最初のコピー数を見積もることができる。
【００４６】
Ａ．蛍光プローブ
蛍光プローブを利用するいくつかのフォーマットが利用可能である。これらのフォーマットは、多くの場合、蛍光共鳴エネルギ移動（ＦＲＥＴ）に基づいており、分子標識と「ＴａｑＭａｎ（登録商標）」プローブを含む。ＦＲＥＴは、供与体及び受容体分子間の距離依存型相互作用である。供与体及び受容体分子は、燐光体である。燐光体が部分的に重なる励起及び放射スペクトルを有する場合、非常に近傍で（通常、約１０−１００オングストローム）、供与体燐光体の励起は、受容体燐光体に転送される。その結果、供与体分子の寿命が短縮されてその燐光体は消失し、一方で受容体分子の燐光体輝度は、増強されて消極される。供与体の励起状態エネルギが非燐光受容体に転送される時に、供与体の蛍光は、受容体による蛍光のその後の放射なしに消失する。この場合、受容体は、消失試薬として機能する。
【００４７】
リアルタイムＰＣＲに対する１つのＦＲＥＴベースのフォーマットは、「分子標識」として公知のＤＮＡプローブを使用する（例えば、Ｔｙａｇｉ他、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．」、１６：４９−５３、１９９８年；及び米国特許第５，９２５，５１７号を参照されたい）。分子標識は、消光色素とレポーター色素がヘアピン軸の端部で互いに密接に接触するヘアピン構造を有する。相補的な配列と混成化する時に、ヘアピン構造のループが二本鎖となって消失及びレポーター色素を強制的に分離し、従って、蛍光信号を発生する。関連の検出方法は、蛍光発生プローブとしてヘアピンプライマーを使用する（Ｎａｚａｒｅｎｋｏ他、「核酸研究」、２５：２５１６−２５２１、１９９７年；米国特許第５，８６６，３３６号、米国特許第５，９５８，７００号）。ＰＣＲプライマーは、プライマーが線形構造を使用する、すなわち、ＰＣＲ生成物に組み込まれる時だけ蛍光信号が生成される方法で設計することができる。
【００４８】
増幅生成物はまた、蛍光発生５’ヌクレアーゼ検定、すなわち、「ＴａｑＭａｎ」検定を使用して溶液中で検出することができる。Ｈｏｌｌａｎｄ他、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」、Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：７２７６−７２８０、１９９１年；米国特許第５，５３８，８４８号、第５，７２３，５９１号、及び第５，８７６，９３０号を参照されたい。「ＴａｑＭａｎ」プローブは、望ましいＰＣＲ生成物内の配列に対して混成化するように設計される。「ＴａｑＭａｎ」プローブの５’端部は、蛍光レポーター色素を含む。プローブの３’端部は、ブロックされてプローブの拡張を防止し、５’燐光体の蛍光発色を消失させることになる色素を含む。続く増幅中に、反応において５’エキソヌクレアーゼ活動を有するポリメラーゼが存在する場合は、５’蛍光標識は開裂される。５’燐光体の切除は、検出することができる蛍光の増加をもたらすことになる。
【００４９】
ヘアピンと５’−ヌクレアーゼＰＣＲ検定に加えて、ＦＲＥＴ機構を使用する他のフォーマットも開発されてきた。例えば、第１の色素の蛍光が第２の色素によって消失されるという方法で、単一鎖信号プライマーが２つの色素に対するリンクによって修正され、供与体／受容体色素対を形成した。この信号プライマーは、制限部位（米国特許第５，８４６，７２６号）を含み、ターゲットに混成化された時に適切な制限酵素がプライマーに刻みを付けるのを可能にする。この裂け目は、２つの色素を分離し、消失の現象による蛍光の変化が観測される。配位子にオリゴヌクレオチドを連結する非ヌクレオチドリンク試薬もまた説明されている（米国特許第５，６９６，２５１号）。
【００５０】
蛍光の読みを使用してモニタすることができる他の増幅反応は、増幅生成物に結合されたＤＮＡ結合色素の量を測定することによって定量化されるものを含む。そのような検定は、例えば、臭化エチジウム又は「ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ」（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブズ・インコーポレーテッド；米国特許第５，４３６，１３４号及び第５，６５８，７５１号）のような蛍光色素を使用し、それらは、ＤＮＡ中に介在する時に蛍光の増加を呈する（例えば、米国特許第５，９９４，０５６号及び第６，１７１，７８５号を参照されたい）。蛍光の増加は、増幅反応によって生成された二本鎖ＤＮＡの量の増加に反映される。
【００５１】
他の蛍光プローブは、無機分子、有機及び／又は無機分子の多分子混合物、結晶、及びヘテロポリマーなどを含む。例えば、シリカシェル中に封入されたＣｄＳｅ−ＣｄＳコアシェル・ナノ結晶は、生物分子に連結するために簡単に変成される（Ｂｒｕｃｈｅｚ他（１９９８年）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２８１：２０１３−２０１６）。同様に、高蛍光量子ドット（硫化亜鉛キャップド・セレン化カドミウム）は、超高感度生物学検出（Ｗａｒｒｅｎ及びＮｉｅ（１９９８年）、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、２８１：２０１６−２０１８）で使用するために生体分子と共有結合されている。
【００５２】
装置１００を使用して多重検定もまた実行することができる。多重ＰＣＲは、同一反応で複数ポリヌクレオチド断片の増幅をもたらすものである。例えば、「ＰＣＲプライマー、実験用マニュアル」（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ編、１９９５年）、コールド・スプリング・ハーバー・プレス、１５７−１７１ページを参照されたい。例えば、異なるターゲットテンプレートを追加し、同一の反応容器内で並行に増幅することができる。多重検定は、一般的に、異なる蛍光標識法の使用を含み、増幅された異なるターゲット配列を検出する。
【００５３】
Ｂ．ＰＣＲ条件及び成分
例示的なＰＣＲ反応条件は、一般的に、２又は３ステップサイクルを含む。２ステップサイクルは、変成ステップを有し、混成化／伸長ステップへと続く。３ステップサイクルは、変成ステップを有し、混成化ステップに続き、別の伸長ステップへと続く。ポリメラーゼ反応は、プライマーがターゲット配列に混成化されてポリメラーゼによって伸張される条件下で培養される。増幅の反応サイクル条件は、プライマーが特にターゲット配列に混成化されて伸張されるように選択される。
【００５４】
成功するＰＣＲ増幅は、各ステップで高い処理量、高い選択性、及び制御された反応速度を必要とする。処理量、選択性、及び反応速度は、通常は温度に依存し、最適な温度は、反応システム内のポリヌクレオチド、酵素、及び他の成分の組成と長さに依存する。更に、異なるステップに対しては異なる温度が最適になる場合がある。最適な反応条件は、ターゲット配列とプライマーの組成次第で変動する場合がある。装置１００のようなサーマルサイクラは、反応条件の必要な制御を行い、特定の検定のためにＰＣＲ処理を最適化する。例えば、装置１００は、維持される温度、各サイクルの継続時間、サイクル数などを選択することにより、プログラムすることができる。一部の実施形態では、異なる温度で異なるサンプルウエルを維持することができるなどのために、温度勾配をプログラムすることができる。
【００５５】
塩基リンク又は末端リンクのフッ素及び消光剤を含む蛍光オリゴヌクレオチド（プライマー又はプローブ）は、当業技術で公知である。それらは、例えば、ライフ・テクノロジーズ（米国メリーランド州ガイサーバーグ）、シグマ−ゲノシス（米国テキサス州ザ・ウッドランズ）、ゲンセット・コーポレーション（米国カリフォルニア州、ラホーヤ）、又はシンセティック・ジェネティクス（米国カリフォルニア州サンジエゴ）から入手可能である。塩基リンクフッ素は、塩基にリンクした反応基と合成されたオリゴヌクレオチドの合成後改質により、オリゴヌクレオチド内に取り込まれる。米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブズのような市販の供給元からのものを含む、多数の異なる燐光体が入手可能であり、他の燐光体も当業者に公知であることを当業者は認識するであろう。有用な燐光体には、フルオレセイン、フルオレセイン・イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ・テトラクロロ・フルオレセイン（ＴＥＴ）、ＮＨＳ−フルオレセイン、５及び／又は６−カルボキシ・フルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（又は６−）ヨードアセトアミド・フルオレセイン、５−｛〔２（及び３）−５−（アセチルメルカプト）−スクシニル〕アミノ｝フルオレセイン（ＳＡＭＳＡ−フルオレセイン）、及び他のフルオレセイン派生物、ローダミン、「Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ」ローダミンＢ塩化スルホニル、テキサスレッド・塩化スルホニル、５及び／又は６カルボキシ・ローダミン（ＲＯＸ）、及び他のローダミン派生物、クマリン、７−アミノ−メチル−クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３酢酸（ＡＭＣＡ）、及び他のクマリン派生物、「ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）」燐光体、８−メチル・オキシピレン−１，３，６−三スルホン酸三ナトリウム塩のような「Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（登録商標）」燐光体、３，６−二スルホン酸塩−４−アミノ・ナフタルイミドのような黄燐燐光体、フィコビリンプロテイン派生物、アレクサフッ素色素（米国オレゴン州ユージーン所在のモレキュラー・プローブズから入手可能）、及び当業者に公知の他の燐光体が含まれる。有用な燐光体の一般的なリストに関しては、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．著「生態共役技術」（アカデミック・プレス、サンジエゴ、１９９６年）も参照されたい。
【００５６】
増幅反応のためのプライマーは、既知のアルゴリズムに従って設計される。例えば、市販で入手可能であるか又はカスタムソフトウエアで実施されるアルゴリズムは、ターゲット配列を増幅するプライマーを設計するために使用することができる。一般的に、プライマーは１２塩基であり、より多くの場合に、長さが１５、１８、又は２０塩基である。一般的に、プライマーは、特定の反応に関与する全てのプライマーが、互いの５℃以内、最も好ましくは２℃以内の溶融温度を有するように設計される。プライマーは、更に、それ自体に又は互いにプライミングすることを避けるように設計される。プライマーの濃度は、増幅された配列の量の正確な評価を提供するように、増幅されるターゲット配列の量に結合するのに十分であるべきである。プライマーの濃度は、結合される配列の大きさと同様にプライマーの結合親和性に従って変動することを当業者は認識するであろう。一般的なプライマー濃度は、０．０１μＭから０．５μＭの範囲であることになる。
【００５７】
当業者は、更に、関連の全ての反応の機能を考慮するために緩衝条件を設計することが望ましいことを認識するであろう。従って、プローブからの信号生成に関連するあらゆる酵素的反応と同様に、増幅反応をサポートするように緩衝条件を設計することができる。特定の反応緩衝は、個々に及び組合せでの反応を試験することにより、様々な反応をサポートする機能を試験することができる。塩又はマグネシウムのような反応の成分の濃度はまた、ターゲット核酸まで焼き戻すプライマー又は検出プローブの能力に影響する可能性がある。これらは、当業技術で公知の手引き、例えば、Ｉｎｎｉｓ他、前出に基づいて調節することができる。
【００５８】
Ｃ．例示的なＰＣＲ処理
図８は、装置１００を使用する核酸増幅と測定処理８００のフローチャートである。この例では、装置１００は、ＰＣＲ増幅処理を制御し、核酸サンプル中の複数のターゲット配列の存在を検出する。
【００５９】
ステップ８０２で反応容器６１６が準備される。この準備は、容器への反応成分の配置と、流出と二次汚染を防止するための容器のシールとを含む。反応成分は、緩衝剤、ターゲット核酸、適切なプライマーとプローブ、ヌクレオチド、ポリメラーゼ、並びに任意的な付加的な成分を含む。一実施形態では、４つの蛍光プローブが含まれ、各プローブは、異なるターゲット配列を検出するようになっており、特定の反応容器は、１または２以上の蛍光プローブのいずれかを含むことができる。各プローブは、異なる入射波長の光に応答して異なる波長の光を放射するのが好ましい。
【００６０】
ステップ８０６で、検出モジュール２３４は、シャトル２３２に取り付けられる。上述のように、検出モジュール２３４は、いくつかの検出チャンネル（すなわち、励起／検出対）を含んでもよい。一実施形態では、検出モジュール２３４は、４つの検出チャンネルを含む。各チャンネルは、反応容器６１６に含まれる、異なる蛍光プローブが最適化される。
【００６１】
ステップ８０８で、反応容器６１６は、サンプルユニット２０２のサンプルウエル２１０の中に配置される。ステップ８１０で、蓋アセンブリ１１２は、閉じられてベースユニット１１０に位置決めされる。
【００６２】
ステップ８１２で、検出モジュール２３４の各チャンネルが較正される。較正は、位置検出モジュールのチャンネルの少なくとも１つが較正位置２２２と光学連通するように位置検出モジュール２３４に対してステッパモータ３０２及び３１６を作動することにより実行される。上述のように、各較正位置は、既知の蛍光応答を提供する。従って、較正測定値は、検出器応答の変動又はばらつきに対して次のサンプル測定値を訂正するために使用することができる。多くの較正技術が当業技術が公知である。検出モジュール２３４が複数のチャンネルを有する場合、各チャンネルは、個別に較正することができる。
【００６３】
ステップ８１４で、ＰＣＲサイクルが実行される。一般的に、ステップ８１４は、サンプルユニット２０２の温度を調節するためのベースユニット１１０の作動を含み、それによって反応容器を望ましい時間に亘って望ましい温度に保持し、２ステップ又は３ステップのＰＣＲサイクルを完了させる。ベースユニット１１０は、ユーザインタフェースを通じて又は外部コンピュータによって制御することができる。
【００６４】
ステップ８１６で、蛍光光度計アセンブリ２０６は、反応容器６１６を走査して調べる。蛍光光度計アセンブリ２０６の作動は、外部コンピュータによって制御され、測定値がＰＣＲ処理の特定の時間に対応するものとして識別可能なようにベースユニット１１０の作動と同期されるのが好ましい。
【００６５】
より詳細には、ステップ８１６ａで、ステッパモータ３０２及び３１６又は他の移動装置は、４つの検出チャンネルの各々が対応する光学ウインドウ５０２、５０４、５０６、５０８を通じて異なるサンプルウエル２１０と光学連通するように検出モジュール２３４を配置するために作動される。ステップ８１６ｂでは、各チャンネルのＬＥＤ又は他の光源が作動され（短時間に亘って点滅）、蛍光を誘導する。一実施形態では、異なるチャンネルのＬＥＤが並行して作動し、他の実施形態では、別のチャンネルの光検出器内で誤信号を引き起こす１つのチャンネルからの反射ＬＥＤ光線を回避するために、それらは順番に作動される。
【００６６】
ステップ８１６ｃで、得られた蛍光は、対応するフォトダイオード又はチャンネルの他の検出器により検出され、これは、外部コンピュータに読み出される。検出器は、様々な方法で読み取ることができる。例えば、ピーク信号を検出してもよく、信号をある一定の時間間隔に亘って積分、又は、ＬＥＤが停止された後の蛍光信号の減衰を測定してもよい。
【００６７】
ステップ８１６ａ−ｃは繰り返され、検出モジュールの位置は、検出モジュール２３４の各チャンネルが最終的にサンプルウエル２１０の各々を調べるようにその度に変更されるのが好ましい。一実施形態では、９６サンプルの各々に対する４チャンネルの走査と調査には約１５秒かかる。外部コンピュータは、ユーザが収集した測定データを図及び／又は表の形態で見ることができるプログラム（例えば、ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドが販売している「Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ」プログラム）を実行する。そのようなプログラムは、当業技術で公知である。例としては、ＭＪ・リサーチ・インコーポレーテッドが販売している「Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ（登録商標）」プログラムが含まれるのが好ましい。
【００６８】
ステップ８１４と８１６は、何回の反応サイクルに亘って繰り返すことができる。処理８００からのリアルタイムの蛍光測定値を使用して各ターゲット配列の存在を検出して定量化することができることを当業者は認識できる。そのような測定値はまた、反応速度の判断、効率を改善するための反応パラメータの調節、並びに特定の実験において付加的な反応サイクルがそれ以上必要でなくなる時（例えば、ターゲット配列の十分な量が生成された時）の判断のような目的のために使用することができる。
【００６９】
処理８００は例示的なものであり、変形と修正が可能であることが認められるであろう。順次的として説明したステップは並行に実行することができ、ステップの順序は変更することができ、ステップを修正するか又は組み合わせることもできる。例えば、蛍光測定は、ＰＣＲサイクル中のどの点でも実行することができ、各ＰＣＲサイクル中（サンプルウエルの実質的に連続した走査を含む）に複数回実行することもでき、又はある回数のＰＣＲサイクルの後まで実行されない場合もある。あらゆる数の認識可能な蛍光プローブを単一の反応容器で使用することができ、検出モジュールは、使用されているプローブの数と少なくとも同じくらい多いチャンネルを含むように適応させることができる。一部の実施形態では、検出モジュールは、同じプローブに対して最適化された複数のチャンネルを含む。これは、特定のサンプルウエルを質問するのにこれらのチャンネルの１つだけを使用すればよいので、走査時間を短縮することができる。
【００７０】
更に、上述のように、他の実施形態では、検出モジュール２３４の様々なチャンネルは、チャンネルの１つがサンプルウエル２１０と光学連通状態にある時に他のチャンネルがそうでないように配置される。この構成は、ウエルの上を走査が通過する間に検出モジュール２３４が実質的に連続して運動中である作動の「フライオーバー」モードを考慮したものである。一度に１つだけのサンプルウエルがあらゆる励起光を受け取るので、チャンネル間のクロストークが減少する。
【００７１】
結論
本発明を特定的な実施形態に関連して説明したが、多くの修正が可能であることを当業者は認識するであろう。例えば、本明細書に説明した蛍光検出アセンブリは、広範囲のサーマルサイクラシステムと共に使用するように適応させることができ、特定機器の設計に応じてあらゆる方向（例えば、上方又は下方）からサンプルウエルを調べることができる。更に、システムは、蛍光標識又はプローブによって識別可能な生物的に関連する広範囲の分子を検出するようになっており、それは、核酸にも又はあらゆる特定の増幅処理にも限定されないものである。
【００７２】
すなわち、本発明を特定的な実施形態に関連して説明したが、本発明は、特許請求の範囲内の全ての修正と均等物を網羅するように意図されていることがわかる。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置の斜視図である。
【図２】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置のための蓋アセンブリの分解組立図である。
【図３】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置のための蛍光光度計アセンブリの底面図である。
【図４】本発明の実施形態による検出モジュールの上面図である。
【図５Ａ】本発明の他の実施形態の検出モジュールの底面図である。
【図５Ｂ】本発明の他の実施形態の検出モジュールの底面図である。
【図６】本発明の実施形態による検出モジュールのための励起／検出対の概略図である。
【図７】本発明の実施形態によるサーマルサイクル装置のための蓋アセンブリに対する電気接続を示すブロック図である。
【図８】本発明の実施形態による蛍光検出システムを有するサーマルサイクラを使用するための処理のフローチャートである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サーマルサイクラの複数のウエル内に配置されたサンプルを分析する蛍光検出装置であって、
サーマルサイクラに取付可能な支持構造体と、
前記支持構造体上に移動可能に取付け可能な検出モジュールと、を備え、
該検出モジュールは、該検出モジュール内に配置された励起光発生器と、該検出モジュール内に配置された放出光検出器とを備え、
前記支持構造体が前記サーマルサイクラに取り付けられ前記検出モジュールは前記支持構造体に取付けられた時、該検出モジュールは、前記複数のウエルの異なるウエルと光学連通した状態で位置決めされるように移動可能である、
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記検出モジュールは、複数の励起／検出対を形成するように配置された複数の励起光発生器及び複数の放出光検出器を含む、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
各放出光検出器は、異なる範囲の波長を検出するように構成されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
各励起光発生器は、異なる範囲の波長で光を発生するように構成されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記複数の励起／検出対は、各励起／検出対が前記複数ウエルの異なるものと光学接触した状態で同時に位置決め可能なように配置されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記複数の励起／検出対は、該複数の励起／検出対の第１の対が前記複数のウエルのいずれか１つと光学接触した状態で位置決めされた時に、該励起／検出対の別の対が該複数のウエルのいずれとも光学接触しないように配置されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記検出モジュールは、前記支持構造体に取外し可能に取付けられ、それによってユーザが該検出モジュールを異なる検出モジュールと交換することを可能にする、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
較正要素であって、前記検出モジュールが前記較正要素と光学連通した状態で位置決めされるように移動可能であるように配置され、
既知の蛍光応答を供給する較正要素を備えている、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
前記較正要素は、前記複数のウエルの２または３以上の間に位置している、
請求項８に記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
前記ウエルに対する前記検出モジュールの位置決めは、外部コンピュータにより制御される、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項１１】
前記較正要素は、前記複数のウエルに対して周辺区域に位置している、
請求項８に記載の蛍光検出装置。
【請求項１２】
前記励起光発生器及び前記放出光検出器の作動は、外部コンピュータにより制御される、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項１３】
溶液中のターゲット分子の存在を検出する方法であって、
ターゲット分子と結合するようになった蛍光プローブを各々含む複数のサンプルを準備するステップと、
検出モジュールが移動可能に取付けられたサーマルサイクラ装置の複数のサンプルウエルのそれぞれのウエルに各サンプルを配置するステップと、を備え、
前記検出モジュールは、該検出モジュール内に配置された励起光発生器と該検出モジュール内に配置された放出光検出器とを含む励起／検出チャンネルを含み、
前記サーマルサイクラ装置を使用して反応を誘導するステップと、
前記検出モジュールを移動して前記励起／検出チャンネルを作動させることにより、蛍光応答を検出するために前記複数のサンプルウエルを走査するステップと、を更に備え、
前記走査ステップ中に、前記検出モジュールが、前記励起／検出チャンネルが前記複数のサンプルウエルの各々と光学連通した状態に順次、位置決めされるように移動させられる、
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ターゲット分子は、核酸配列である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記走査するステップは、
前記励起／検出チャンネルが前記サンプルウエルの１つと光学連通するように前記検出モジュールを位置決めするステップと、
前記励起／検出チャンネルの前記励起光発生器を一時的に作動させるステップと、
前記励起／検出チャンネルの前記放出光検出器を使用して蛍光応答を検出するステップと、
前記励起／検出チャンネルが前記サンプルウエルの異なるサンプルウエルと光学連通するように前記検出モジュールを再位置決めするステップと、を含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出モジュールは、少なくとも２つの励起／検出チャンネルを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出モジュールが、第１の励起／検出チャンネルが１の前記サンプルウエルと光学連通するように位置決めされた時、第２の励起／検出チャンネルが、別のサンプルウエルと光学連通している、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出モジュールが、第１の励起／検出チャンネルが１の前記サンプルウエルと光学連通するように位置決めされた時、第２の励起／検出チャンネルが、いずれのサンプルウエルとも光学連通していない、
請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記走査ステップ中、前記検出モジュールは、実質的に連続して動いている、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１】
サーマルサイクラの複数のウエル内に配置されたサンプルを分析する蛍光検出装置であって、
サーマルサイクラに取付可能な支持構造体と、
前記支持構造体上に移動可能に取付け可能な検出モジュールと、を備え、
該検出モジュールは、該検出モジュール内に配置された励起光発生器と、該検出モジュール内に配置された放出光検出器とを備え、
前記支持構造体が前記サーマルサイクラに取り付けられ前記検出モジュールは前記支持構造体に取付けられた時、該検出モジュールは、前記複数のウエルの異なるウエルと光学連通した状態で位置決めされるように移動可能である、
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記検出モジュールは、複数の励起／検出対を形成するように配置された複数の励起光発生器及び複数の放出光検出器を含む、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項３】
各放出光検出器は、異なる範囲の波長を検出するように構成されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項４】
各励起光発生器は、異なる範囲の波長で光を発生するように構成されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項５】
前記複数の励起／検出対は、各励起／検出対が前記複数ウエルの異なるものと光学接触した状態で同時に位置決め可能なように配置されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項６】
前記複数の励起／検出対は、該複数の励起／検出対の第１の対が前記複数のウエルのいずれか１つと光学接触した状態で位置決めされた時に、該励起／検出対の別の対が該複数のウエルのいずれとも光学接触しないように配置されている、
請求項２に記載の蛍光検出装置。
【請求項７】
前記検出モジュールは、前記支持構造体に取外し可能に取付けられ、それによってユーザが該検出モジュールを異なる検出モジュールと交換することを可能にする、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項８】
較正要素であって、前記検出モジュールが前記較正要素と光学連通した状態で位置決めされるように移動可能であるように配置され、
既知の蛍光応答を供給する較正要素を備えている、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項９】
前記較正要素は、前記複数のウエルの２または３以上の間に位置している、
請求項８に記載の蛍光検出装置。
【請求項１０】
前記ウエルに対する前記検出モジュールの位置決めは、外部コンピュータにより制御される、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項１１】
前記較正要素は、前記複数のウエルに対して周辺区域に位置している、
請求項８に記載の蛍光検出装置。
【請求項１２】
前記励起光発生器及び前記放出光検出器の作動は、外部コンピュータにより制御される、
請求項１に記載の蛍光検出装置。
【請求項１３】
溶液中のターゲット分子の存在を検出する方法であって、
ターゲット分子と結合するようになった蛍光プローブを各々含む複数のサンプルを準備するステップと、
検出モジュールが移動可能に取付けられたサーマルサイクラ装置の複数のサンプルウエルのそれぞれのウエルに各サンプルを配置するステップと、を備え、
前記検出モジュールは、該検出モジュール内に配置された励起光発生器と該検出モジュール内に配置された放出光検出器とを含む励起／検出チャンネルを含み、
前記サーマルサイクラ装置を使用して反応を誘導するステップと、
前記検出モジュールを移動して前記励起／検出チャンネルを作動させることにより、蛍光応答を検出するために前記複数のサンプルウエルを走査するステップと、を更に備え、
前記走査ステップ中に、前記検出モジュールが、前記励起／検出チャンネルが前記複数のサンプルウエルの各々と光学連通した状態に順次、位置決めされるように移動させられる、
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
前記ターゲット分子は、核酸配列である、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である、
請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記走査するステップは、
前記励起／検出チャンネルが前記サンプルウエルの１つと光学連通するように前記検出モジュールを位置決めするステップと、
前記励起／検出チャンネルの前記励起光発生器を一時的に作動させるステップと、
前記励起／検出チャンネルの前記放出光検出器を使用して蛍光応答を検出するステップと、
前記励起／検出チャンネルが前記サンプルウエルの異なるサンプルウエルと光学連通するように前記検出モジュールを再位置決めするステップと、を含む、
請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記検出モジュールは、少なくとも２つの励起／検出チャンネルを含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出モジュールが、第１の励起／検出チャンネルが１の前記サンプルウエルと光学連通するように位置決めされた時、第２の励起／検出チャンネルが、別のサンプルウエルと光学連通している、
請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出モジュールが、第１の励起／検出チャンネルが１の前記サンプルウエルと光学連通するように位置決めされた時、第２の励起／検出チャンネルが、いずれのサンプルウエルとも光学連通していない、
請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記走査ステップ中、前記検出モジュールは、実質的に連続して動いている、
請求項１６に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６】
【図７】
【図８】
【公表番号】特表２００７−５０４４７７（Ｐ２００７−５０４４７７Ａ）
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３２９１６（Ｐ２００６−５３２９１６）
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４５６６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５４７
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５９１１３１８４４）バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年５月１０日（２００４．５．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４５６６
【国際公開番号】ＷＯ２００４／１０４５４７
【国際公開日】平成１６年１２月２日（２００４．１２．２）
【出願人】（５９１１３１８４４）バイオ−ラッド ラボラトリーズ インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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