可視光・近赤外分光分析方法及びその装置
【課題】 ４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の可視光及び／又は近赤外光を利用して各試料中の成分の判別や成分の特性を測定する分光分析方法及びその装置において、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、また超低濃度成分の検出を可能とし、さらに成分の特性や、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化をリアルタイムに測定可能とする可視光・近赤外分光分析方法及びその装置を提供することである。
【解決手段】 試料検体に所定の条件を付加し摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えながら前記試料検体のスペクトル測定を行うことで応答スペクトルに変化を生じさせると共に、前記応答スペクトルの変遷を捉えてスペクトル解析もしくは多変量解析して、前記試料検体の成分の判別及び／又は成分の特性を判別可能とする構成とした。
【解決手段】 試料検体に所定の条件を付加し摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えながら前記試料検体のスペクトル測定を行うことで応答スペクトルに変化を生じさせると共に、前記応答スペクトルの変遷を捉えてスペクトル解析もしくは多変量解析して、前記試料検体の成分の判別及び／又は成分の特性を判別可能とする構成とした。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光及び／又は近赤外光を利用して各試料中の成分の判別や成分の特性を測定する分光分析方法及びその装置に関し、特に、得られる吸収スペクトルをスペクトル解析もしくは多変量解析して、各成分の判別や各成分の特性を測定する可視光・近赤外分光分析方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近では、種々の分野で近赤外光を用いた成分分析が行われている。例えば、可視光及び／又は近赤外光を検体試料に照射して、特定成分に吸収される波長または波長領域を検出することで、前記特定成分を定量分析することが行なわれている。
【０００３】
これは、例えば石英セル中に試料を注入し、これに近赤外分光器（例えば、ニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500）を用いて、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して、その透過光、反射光、又は透過反射光（以後これらを総称して透過反射光と称する）を分析することで行う。
【０００４】
一般に、近赤外光は、物質の吸光係数が非常に小さく散乱を受け難く、エネルギーの低い電磁波であるので、試料に損傷を与えることなく化学的・物理的情報を得ることができる。
【０００５】
そのために、試料検体からの透過反射光スペクトルの強度を検出して、試料検体による吸光度を求めて、得られた吸光度データを多変量解析することで、直ちに試料検体の情報を得ることができる。
【０００６】
そして、試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の領域の連続波長光を照射して試料検体のスペクトルを得る工程と、得られたスペクトル中のピークを分光学的手法により要素ピークに分解する工程と、その中の水分子の要素ピークを多変量解析して解析モデルを作成する工程とを備えるとした試料検体の情報を得る方法が既に公開されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
さらに、可視光及び／又は近赤外光領域における水分子の吸収バンドを用いて、得られた吸光度データを多変量解析することで、牛乳／又は乳房中の体細胞を測定して牛の乳房炎の診断を行うとした出願も公開されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００２−５８２７号公報（第１−９頁、第１図）
【特許文献２】国際公開ＷＯ０１／７５４２０号公報（第１−５頁、第１図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の可視光及び／又は近赤外光を用いた成分分析方法においては、特定条件下で４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を照射し、試料中に存在する水分子と被検体中の注目成分との相互作用で水分子の要素ピークが変化するのを検出することで、被検体の成分情報を得る方法であり、測定できる成分や測定の精度には限界がある。
【０００９】
本発明の目的は、上記問題点を解消するために、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を利用して各試料中の成分の判別や成分の特性を測定する分光分析方法において、従
来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、また超低濃度成分の検出を可能とし、さらに成分の特性や、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化をリアルタイムに測定可能とする可視光・近赤外分光分析方法およびその装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために請求項１に係る発明は、試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与えながらスペクトル測定を行い、スペクトル解析もしくは多変量解析して、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴としている。
【００１１】
上記の構成を有する請求項１に係る発明によれば、摂動を与えることで応答スペクトルに変化を生じさせると共に、前記応答スペクトルの変遷を捉えて解析することで、従来検出不可能であった成分の判別が可能となる。また、濃度や粒子の大きさ等の各成分の特性を測定することができる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating
perturbations：ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させ、全部又は一部の波長領域のスペクトル測定を行うことで、前記試料検体中の成分の特性に応じて変化する水分子の要素ピークを含む応答スペクトルをスペクトル解析もしくは多変量解析して、応答スペクトルのパターンの変遷を捉え、捉えられた前記パターンの変遷から各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴としている。
【００１３】
上記の構成を有する請求項２に係る発明によれば、水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えながら試料検体の各成分に応じてシフトする所定の水分子の応答の変化を測定して分光分析を行いスペクトル解析もしくは多変量解析を行うので、微小な変化を積極的に生じさせると共に、前記微小な変化を解析して捉えることができる。そのために、スペクトルのグラフからは直接視認できない応答スペクトルのパターンの変遷を捉えることで、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、さらに超低濃度成分の検出を可能とし、成分の特性をリアルタイムに測定可能とする精度の高いモデルを得ることができる。
【００１４】
請求項３に係る発明は、前記摂動が、前記試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更であって、光の繰り返し照射、試料検体の濃度変更、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更のいずれか、または、それらの組み合わせであることを特徴としている。
【００１５】
上記の構成を有する請求項３に係る発明によれば、試料検体の種類や特性に応じた条件を選択することで所定の効果的な摂動（ＷＡＰ）を与えることができる。
【００１６】
請求項４に係る発明は、前記摂動が、試料検体の１０倍ずつ（例えば１０-1〜１０-10まで）の濃度変更と、それぞれに少なくとも３回繰り返し照射の組み合わせであることを特徴とする。
【００１７】
上記の構成を有する請求項４に係る発明によれば、試料検体の濃度を広範囲に変更して希釈しているので、試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用により応答が変化する際に、水の影響が強調されて、水分子の特定の要素ピークを含む応答スペクトルのパターンの変化を明確にすることができる。この結果、水溶液中の微小濃度成分の測定も行うことが可能となる。
【００１８】
請求項５に係る発明は、前記試料検体がバクテリアであって、前記試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別を行うことを特徴とする。
【００１９】
上記の構成を有する請求項５に係る発明によれば、例えば、バクテリアの濃度を１０倍ずつ段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）とを判別する高精度なモデルを構築することができる。
【００２０】
請求項６に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）及び／又はＰｒＰ（Ｍｎ）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする。
【００２１】
上記の構成を有する請求項６に係る発明によれば、間隔を空けて光を繰り返し照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、特定の波長領域の応答スペクトルに変化が生じ、この応答スペクトルを多変量解析することで、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）とを判別することができるモデルを構築することができる。
【００２２】
請求項７に係る発明は、光路長及び／又は濃度を変更すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（metal）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする。
【００２３】
上記の構成を有する請求項７に係る発明によれば、光路長及び／又は濃度を変更し複数回照射する摂動（ＷＡＰ）を付与した近赤外分光分析方法により、金属成分をその構造体中に含有するプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）と金属成分を含有しないプリオン蛋白質ＰｒＰを判別することができる。
【００２４】
請求項８に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに繰り返し照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の抗原の濃度を測定することを特徴とする。
【００２５】
上記の構成を有する請求項８に係る発明によれば、抗原濃度を段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、試料検体中の抗体濃度を測定可能となるモデルを構築することができる。
【００２６】
請求項９に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中に溶解した粒子の溶解前の粒子径を測定することを特徴とする。
【００２７】
上記の構成を有する請求項９に係る発明によれば、各粒子径の粒子を溶解する濃度を段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ
）を与えることで、溶解前の粒子径を測定可能なモデルを構築することができる。
【００２８】
請求項１０に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の異なるバクテリアを判別することを特徴とする。
【００２９】
上記の構成を有する請求項１０に係る発明によれば、バクテリア濃度を段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、試料検体中の異なるバクテリアを微量濃度であっても判別可能とするモデルを構築することができる。
【００３０】
請求項１１に係る発明は、一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生乳から前記哺乳動物の血漿や胃液等の生体液の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする。
【００３１】
上記の構成を有する請求項１１に係る発明によれば、測定間隔と測定回数を変化させるという摂動（ＷＡＰ）を与えながら、牛等の哺乳動物の生乳を分光分析することで、前記牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液に含有される成分濃度を予測し測定することができ、牛等の生態情報を容易に取得可能なモデルを構築することができる。
【００３２】
請求項１２に係る発明は、一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生体液から前記哺乳動物の生乳の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする。
【００３３】
上記の構成を有する請求項１２に係る発明によれば、測定間隔と測定回数を変化させるという摂動（ＷＡＰ）を与えながら、牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液を分光分析することで、前記牛等の哺乳動物の生乳に含有される成分濃度を予測し測定することができ、生乳の品質特性を容易に判定可能なモデルを構築することができる。
【００３４】
請求項１３に係る発明は、光路長を変化すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えると共に、７００ｎｍ〜１１００ｎｍの第一の波長領域と、１１００ｎｍ〜２４００ｎｍの第二の波長領域において、前記第１の波長領域のみの又は前記第１、第２の波長領域の分光分析を行うことで、生乳の複数の成分の濃度を測定することを特徴とする。
【００３５】
上記の構成を有する請求項１３に係る発明によれば、光路長を変更して分光分析することで、短波長領域の第一の波長領域においても、成分の濃度を測定可能な高精度のモデルを構築することができる。
【００３６】
請求項１４に係る発明は、１０Ｖの電圧を付加すると共に、５００〜１０００ｎｍの波長領域の光を少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析を行うことで、生乳中の脂肪濃度を測定することを特徴とする。
【００３７】
上記の構成を有する請求項１４に係る発明によれば、電圧を付加して電磁場を変化させるという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで牛乳中の脂肪濃度を高精度に測定可能なモデルを構築することができる。
【００３８】
請求項１５に係る発明は、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を発生させるための近赤外光発生手段と、前記近赤外光発生手段からの可視光及び／又は近赤外光を試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段を備える可視光・近赤外分光分析装置において、前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を設けると共に、前記データ処理手段が、前記摂動を与えて得られる応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行うことを特徴とする。
【００３９】
上記の構成を有する請求項１５に係る発明によれば、摂動を与えることで応答スペクトルに変化を生じさせると共に、前記応答スペクトルの変遷を捉えて解析する装置とすることで、従来検出不可能であった成分の判別が可能となる。また、濃度や粒子の大きさ等の各成分の特性を測定することができる。
【００４０】
請求項１６に係る発明は、前記摂動手段が、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させる手段であって、照射時間と照射回数を設定可能な照射制御装置を備えていることを特徴とする。
【００４１】
上記の構成を有する請求項１６に係る発明によれば、水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えながら試料検体の各成分に応じて変化する所定の水分子のスペクトルを含むスペクトルパターンの応答の変化を測定して分光分析を行い多変量解析を行うことができるので、微小な変化を積極的に生じさせると共に、前記微小な変化を解析して捉えることができる。そのために、従来の方法では判別困難なものを判別し、超低濃度成分の検出を可能とし、成分の特性をリアルタイムに測定可能な可視光・近赤外分光分析装置となる。
【００４２】
請求項１７に係る発明は、前記摂動付与手段が、付加電磁力調整、光路長変更、温度変更が可能な手段の少なくとも一つを備えていると共に、前記光学手段と前記検知手段とを同時にまたは別々に備えるプローブから光の照射と受光を行いデータ処理を行うよう、前記摂動付与手段による摂動の付与と、光の照射と受光の作動タイミングを制御する制御手段を備えていることを特徴とする。
【００４３】
上記の構成を有する請求項１７に係る発明によれば、測定する試料検体の種類や特性に応じた条件を選択することで所定の摂動（ＷＡＰ）を与えて、これまで判別困難であった成分の判別や、超低濃度成分の検出が可能な可視光・近赤外分光分析装置を得ることができる。
【００４４】
請求項１８に係る発明は、前記データ処理手段が、応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行い、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化を捉えて解析する手段であることを特徴とする。
【００４５】
上記の構成を有する請求項１８に係る発明によれば、所定の摂動（ＷＡＰ）を与えることで、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化程度を直接的にまたリアルタイムに得ることができる可視光・近赤外分光分析装置とすることができる。
【００４６】
請求項１９に係る発明は、試料検体収容部と該収容部に収容された試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を備えると共に、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光であって、試料検体に応じて予め選定された特定波長領域の光を前記試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペク
トルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段と、測定結果を表示する表示手段を備える可視光・近赤外分光分析装置であることを特徴とする。
【００４７】
上記の構成を有する請求項１９に係る発明によれば、摂動（ＷＡＰ）を付与してスペクト測定することで得られる近赤外領域の応答スペクトルから、試料検体の特定成分を測定可能な可視光・近赤外分光分析装置とすることができる。
【００４８】
請求項２０に係る発明は、請求項６から１５のいずれかに記載の可視光・近赤外分光分析方法を実施するための可視光・近赤外分光分析装置であって、それぞれの試料検体を測定するのに適した特有の波長（Important wavelengths）領域を予め設定していることを特徴とする。
【００４９】
上記の構成を有する請求項２０に係る発明によれば、それぞれの試料検体を測定するのに適した特有の波長（Important wavelengths）領域の分光分析を行うことで、簡易に特定の試料検体の測定をすることができる。
【発明の効果】
【００５０】
本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法及びその装置によれば、試料検体に所定の条件を付加することで、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えながら、前記試料検体の各成分に応じて変化する所定の水分子のスペクトルを含むスペクトルパターンの応答の変化を測定して分光分析を行いスペクトル解析もしくは多変量解析を行うので、スペクトルのグラフからは判別できない応答の変化を捉えることができ、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、また超低濃度成分の検出を可能とし、さらに成分の特性や、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化をリアルタイムに測定可能となる可視光・近赤外分光分析方法及びその装置を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法及びその装置の実施の形態について、図１から図３１に基づいて説明する。
【００５２】
本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法は、市販の分光分析器（例えば、ニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500）を用いて、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の領域の連続波長光（可視光及び／又は近赤外光）を照射して得られる透過反射光のスペクトルを解析することで行う。
【００５３】
スペクトルの解析とは、検出されたスペクトルを吸収スペクトルに変換するために、光反射率の逆数を対数変換し、得られたスペクトル中のピークを分光学的手法により要素ピークに分解し、該要素ピークを多変量解析し、帰属バンドを求めて、モデルを構築することである。
【００５４】
近赤外光を試料検体（液状試料）に照射すると、対象物に含まれる各種分子により特定の波長のみが吸収される。そして、分子構造（分子の種類）により吸収される光の波長が異なる。液状試料のように水分子が含まれるものでは、水分子に特有の波長領域帯にて複雑な吸光現象が起こる。また、水分子と被検体中の注目成分との相互作用で水分子の要素ピークがシフトする。
【００５５】
つまり、光を照射すると、特定分子が特定波長の光を吸収し、エネルギー準位が遷移する。また、前記エネルギー準位の遷移は分子間の相互作用や水分子と注目成分との相互作用や水素結合状態等により特定の波長領域でのスペクトルパターンが変化する。
【００５６】
分子のエネルギーとは振動エネルギーであり、エネルギー準位が遷移するとは、基底振動状態から第一励起振動状態に遷移することである。また、この遷移を基本音という。さらに、第二・第三励起振動状態に遷移することを倍音遷移と称する。また、二つ以上の基準振動が励起される遷移を結合音という。
【００５７】
近赤外光の波長領域においては、水素を含む官能基（例えばＯＨ）に帰属されるバンドが多く、その倍音や結合音も現れる。つまり、試料検体に近赤外光を照射することで、特定の波長領域に基本音や倍音や結合音に対応した変化が生じることになる。
【００５８】
上記したように、近赤外光を用いた分光分析方法においては、得られるスペクトルデータには多数の倍音や結合音のデータが重なって現れることになる。また、これらの倍音や結合音の強度は弱く、さらに、基本音→第一倍音→第二倍音、と進むに連れて強度が段階的に弱くなる。
【００５９】
そのために、従来の近赤外光を用いた分光分析方法においては、多くの情報量を有するけれども、弱いバンドが複雑に重なり合ったスペクトル解析を行う必要があり、正確な測定を行うことは困難であった。
【００６０】
しかし、試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更である、段階的値の濃度変更、光の繰り返し照射、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度、ｐＨ、圧力等の所定の条件を積極的に付加しながら摂動を与えることで、特定の波長領域に、後に算出可能なスペクトルパターンの変化（データ上からは視認不可能であるが）を生じさせることができた。つまり、所定の条件を積極的に付加しながら分光分析を行うことで、被検体成分特有のスペクトルパターンを動的に変化させて明確に発現し、得られるスペクトルデータを多変量解析することで、各試料の成分に応じた応答の変化を検出することができ、特定成分を判別あるいは測定可能となった。
【００６１】
上記したように、得られたスペクトルの検出吸光度（光の吸収される度合い）を波長ごとにプロットすることにより近赤外吸収スペクトルが得られる。また、この近赤外吸収スペクトルを用いて定量分析 を行うには、目的特性の値（濃度或いは特性値）とスペクトルデータとを関係づける関係式（検量線）が必要となる。通常検量線は、目的特性値が既知な試料のスペクトルを計測し、そのスペクトルデータを、オートスケール、スムージング処理、一次微分処理等の前処理を行った後で、部分二乗回帰分析（ＰＬＳ）により演算して得ることができる。さらに、クロスバリデーションにより検証を行いながら高精度なモデルを構築することができる。また、主成分分析（ＰＣＡ）により成分の判別を行うと共に、得られた各モデル間の距離をＳＩＭＣＡ法にて検定することができる。
【００６２】
上記の前処理や多変量解析等のデータ解析には、Pirouette3.02（ＧＬサイエンス社製）のデータ処理ソフトを使用した。
【００６３】
近赤外分光分析ではエネルギーレベルが弱いので同一物質に繰り返し照射しても損傷を与えず、所定の条件を加えながら（摂動を付与して）分光分析を行うことができる。また、前記摂動を与えながらスペクトル測定を行うことで、応答スペクトルが動的に変化していることが判った。そのために、動的に変化する応答スペクトルをスペクトル解析あるいは多変量解析することで、微小な応答スペクトルの変遷を検知することができ、今まで検知不能であった成分の判別や成分の特性が検知できるようになった。
【００６４】
本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法の流れの概略を図１に示す。既知の試料１に所定の条件を付加することで摂動を与えながら、スペクトル測定を行う。得られたスペク
トルをデータ変換・データ解析を行い、吸収バンドの強度の違いを検証しながら所定の試料の帰属バンドを求めてモデルを構築するものである。また、新たな試料２に同様な摂動を与えながらスペクトル測定を行い、前記モデルと比較することで、モデルの実証性を評価する流れである。
【００６５】
また、図２には、本発明方法の特徴部分を示している。図に示すように、本発明方法では、試料検体に濃度変更等の所定の条件を付与して摂動を与えながら複数回のスペクトル測定を行うことを特徴としている。また、少なくとも３回の照射データから応答スペクトルのパターンを求めて、照射の度に生じる、水分子と注目成分との相互作用による特定の波長領域の変化を捉えて前記応答スペクトルのパターンの変遷を捉えることができる。そのために、今まで検知不能であった成分の判別が可能となる定性モデルの作成や、成分の特性が検知可能となる定量モデルの作成を行うことができ、これらのモデルにより試料検体の成分の情報を得ることができる。
【００６６】
図３は本発明装置の特徴部分を示す概略説明図であって、近赤外発生手段１１からの可視光及び／又は近赤外光を試料検体Ｓ１に照射する光学手段１２Ａと、前記試料検体Ｓ１からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段１２Ｂを備えるプローブ１２を有する可視光・近赤外分光分析装置１０が示されている。また、前記装置１０には前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段１５と、温度やｐＨ等の環境条件を調整する試料検体環境調整手段１４と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段１３と、前記摂動付与手段１５による摂動の付与と、光の照射と受光の作動タイミングを制御する制御手段１６が配設されている。
【００６７】
前記データ処理手段１３は、得られる応答スペクトルを多変量解析して、ＰＬＳ法及び／又はクロスバリデーション法を用いて成分の特性を数値化する定量的解析、もしくは、ＰＣＡ法及び／又はＳＩＭＣＡ法を用いてクラス判別を行う定性的解析を行い、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とすべく構築されたモデルを使用する構成とされている。そのために、可視光・近赤外分光分析装置１０により、試料検体Ｓ１の成分の判別が可能で、成分の特性の測定が可能となる。
【００６８】
分光分析を行う際には、前述した分光分析器を用いて波長領域４００ｎｍ〜２５００ｎｍを波長分解能２ｎｍで走査する構成としているので、１走査で１０５１個のデータを取り込むことができる。また、連続的に３回走査すると３１５３個のデータが得られると共に、それらをデータ処理すると、水分子の所定の要素ピークに各成分との相互作用によるシフトが各種の波長域に現れていることが判る。
【００６９】
図４に水分子の吸収バンドの強度変化を示すが、これは１５分毎に６時間４００ｎｍ〜２５００ｎｍの連続波長光を水のみの試料検体に照射した際に、強度変化を生じるつまりシフトが生じる波長領域を示している。つまり、黒く塗りつぶした部分のバンドにて応答（response）が生じていることが判る。
【００７０】
また、前述した倍音や結合音に対応したシフトが生じ易い水分子に特有の波長領域帯として図５に６００〜８５０ｎｍの水の吸収バンドの強度変化（変化が同時に生じるSynchronousなもの）を等高線状に示している。さらに、図６にはその時に特徴的なスペクトルピーク（正の相関で生じるピークと負の相関で生じるピーク）を示している。つまり、６０６ｎｍの波長でのピークに対しては、６４０ｎｍ、７３８ｎｍの波長領域で同時に正の相関でピークが生じ、８０８ｎｍの波長領域で負の相関でピークが生じていることを示している。
【００７１】
また、同時に変化が生じるのではなく、特定の波長のスペクトル変化に対して追随して
生じるAsynchronousな変化も生じていることが判っている。このように水の情報を多く含む特定の波長領域において、それぞれのスペクトルが関連しあって複雑に変化している様子が理解できる。
【００７２】
そのために、特定の試料検体を分光分析する際に生じる水分子の所定の要素ピークの応答（response）は、前記試料検体の成分に応じて特定の波長領域において変化が生じていることになる。また、この変化の程度は、得られるスペクトルデータからは判別されず、多変量解析によるデータ処理を行って初めて確認される。
【００７３】
さらに、試料の成分濃度を段階的値に変化させて走査しても、光路長を変化して走査しても、温度やｐＨ等の外的条件を付加して走査しても、一回目と二回目、あるいは二回目と三回目とでその応答が僅かに変化しており、各試料成分に応じた水分子の所定の要素ピークに応答（response）の変化が生じていることが判る。
【００７４】
そのために前記摂動は、時間間隔をおいて複数回照射してスペクトル測定を行うことで、応答スペクトルに動的な変化を生じさせる条件の変更であって、本発明者は、この摂動を、ＷＡＰＯＴ（Water Activating Perturbation Over the Time）と称している。
【００７５】
つまり、試料検体に濃度変更、光の繰り返し照射、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更等の物理的または化学的な変化を与える所定の条件を付加して、水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えながら走査することで、各試料の成分に応じた応答（水分子の所定の要素ピークを含むスペクトルパターンの変動）を検知可能であることが明らかとなった。
【００７６】
以下に各試料の測定結果について説明する。
【実施例１】
【００７７】
実施例１は、試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別とそれぞれの濃度を測定した例であって、緩衝液ＢＰＷ（Buffer peptone water）中にそれぞれのバクテリアを混入した試料検体を作成し、石英セル１ｍｍに前記試料検体を注入して、それぞれの基準濃度ＣＦＵ（コロニーフォーミングユニット）を１０-1倍から１０-10倍まで１０倍毎に予め濃度変更して準備したサンプルに、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を３回連続して繰り返し照射し分光分析を行い、２ｎｍ間隔の測定を行った例である。
【００７８】
また、それぞれのバクテリアを判別する際には、試料検体として、前記緩衝液に替えて、牛乳中にそれぞれのバクテリアを混入した試料検体を採用してもよい。また、シャーレに培養したバクテリアをそのまま測定することも可能である。
【００７９】
この時に使用した分光分析器はニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500であり、測定温度は３７℃の一定温度とした。
【００８０】
図７には測定された吸収スペクトルを示しているが、網掛け部はノイズとしてデータから除去した部分を示している。この得られたデータを、Pirouette3.02（ＧＬサイエンス社製）のデータ処理ソフトを用いて、オートスケール、スムージング処理、一次微分処理の各種の前処理、及び変換を行った後で、ＰＬＳとクロスバリデーション解析によりそれぞれのバクテリアの濃度を測定するモデルを作成し検証を行う。また、主成分分析（ＰＣＡ）とＳＩＭＣＡ解析によりそれぞれの試料検体中のバクテリアの判別を行う。
【００８１】
ここで、図８にはＰＬＳ解析の結果得られたＣＮＳの濃度の回帰ベクトルを示し、図９
にはＣＰＳの濃度の回帰ベクトルを示している。この時に、得られる応答スペクトルが変遷する重要な波長（Important wavelengths）はそれぞれ、ＣＮＳの場合は、１４０６−１５００ｎｍ、１１８０ｎｍ、１３０６ｎｍであり、ＣＰＳの場合は、７４０ｎｍ、７７０ｎｍ、８０８ｎｍ，１１５６−１１９８ｎｍ、１４６６ｎｍ，１４７６ｎｍ、１６５０ｎｍ、１６８６ｎｍ、１７０４ｎｍ、１７２０ｎｍ、１７５０ｎｍ、１８４６ｎｍ、１８９０ｎｍであった。さらに、図１０にＣＮＳの濃度の検量線を示し、図１１にはＣＰＳの濃度の検量線を示している。
【００８２】
上記検量線を示す図は、測定値（既知の試料検体を薄めた従来方法による測定値）をＸ軸（横軸）とし、多変量解析して構築されるモデルから得られる予想値をＹ軸（縦軸）とした図である。
【００８３】
ここで、図１０に示すＣＮ＾６−２とは、ＣＮＳの濃度を１０-1倍から１０-10倍まで１０段階に希釈した時の６段階目の試料検体の２回目の走査データであることを示している。同様に図１１に示すＣＰ＾６−３とは、ＣＰＳの濃度が１０段階に希釈した時の６段階目の試料検体の３回目の走査データであることを示している。
【００８４】
図１０の横軸の数値はＣＮＳ濃度の自然対数目盛りであって、例えば１．１２×１０8ＣＦＵ／ｍｌ濃度のＣＮＳ原液を基準試料として用いて、この濃度を１０倍ずつ１０段階に希釈したサンプルで測定した結果を示している。すなわち、Ｉｎ（１．１２×１０8）＝１８．５３が基準濃度（図中のCNgen-2etc.）であり、これを初めに１０倍希釈したものは、ＣＰ＾１０＝Ｉｎ（１．１２×１０7）＝１６．２３となる。さらにもう１０倍希釈したものは、ＣＰ＾９＝Ｉｎ（１．１２×１０6）＝１３．９３となる。
【００８５】
図１１には、１．０５×１０8ＣＦＵ／ｍｌ濃度のＣＰＳを基準試料として用いて、この濃度を１０倍ずつ１０段階に希釈したサンプルを測定した結果を示している。図１０および図１１から判るように、ＣＮＳとＣＰＳとをその濃度が１０-1倍から１０-10倍までの範囲で測定可能な検量線を得ることが可能であり、特に人体に有害なバクテリアであるＣＰＳを、その濃度が１．０５×１０8ＣＦＵ／ｍｌの１０-10倍まで希釈した超低濃度の試料でも確実に測定できることができる。
【００８６】
さらに、図１２にはクロスバリデーションの解析結果を示しており、バリデーション誤差ＳＥＶとバリデーションの相関ｒＶａｌ等の結果を表示している。この結果から、例えばＣＰＳの検量線においては、Factor6の累積寄与率（cumulative）は９７．５６０９１％であり、その時のバリデーション誤差ＳＥＶが３．０９６２１８であることを示している。また、その時の相関係数ｒＶａｌ＝０．９４４９２６となり、精度の高い検量線が得られた。
【００８７】
また、ＣＮＳとＣＰＳとを混入した混合液の濃度を段階的値にまで希釈したサンプルを用いて前記ＣＮＳとＣＰＳとの判別を行った。各サンプルに対して３回測定したスペクトルのうち、２，３回目の測定データを用いて使用波長領域からノイズをカットしたサンプル群において主成分分析（ＰＣＡ）を行い、前記ＰＣＡにより得られた第１主成分（Factor1）、第３主成分（Factor3）、第５主成分（Factor5）に基づく３次元プロットを図１３に示している。この図から判るように、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法によれば、境界Ｌ１を境にＣＮＳとＣＰＳのクラスターを明確に分離することができる。つまり、従来困難であったＣＮＳとＣＰＳとの判別が、本実施例に係る可視光・近赤外分光分析方法により容易に判別することができる。
【００８８】
図１４（ａ）には各前処理や変換処理を変更した際のＳＩＭＣＡ解析の結果を示している。それぞれの測定条件Ａ１〜Ａ６に示している、水、ＢＰＷ、希釈サンプル、ノイズ除
外、３回とは、それぞれ、水分子のスペクトルを除去、緩衝液ＢＰＷを使用、予め濃度を所定の段階的値にまで希釈して準備したサンプルを使用、ノイズ除去処理、３回連続照射であることを示している。
【００８９】
また、Autoscaleとはオートスケール処理のことであり、smooth(15)とは１５ｎｍ毎にスムージング処理したことであり、1st Derivative(25)とは２５ｎｍ毎に一次微分処理したことをそれぞれ示している。
【００９０】
つまり、測定条件Ａ６に示す、水分子のスペクトルを除去、緩衝液ＢＰＷを使用、予め段階的値に希釈して準備したサンプルを使用、ノイズ除去処理、３回連続照射の測定条件において、オートスケ−ル、スムージング処理（１５ｎｍ毎に）、一次微分（２５ｎｍ毎に）のデータ処理を行いＳＩＭＣＡ解析した場合にＣＮＳとＣＰＳとのクラス間距離が４．２５４であることがわかる。
【００９１】
また、Ａ４とＡ８とを比較すると、この相違点は予め希釈しているかどうかであり、Ａ４でのクラス間距離１．１５６であったものが、予め希釈して準備された希釈サンプルを用いることで、クラス間距離４．１３２となっており、識別力が向上している。濃度の希釈にはこのように、予め所定濃度の原液に所定量の水や緩衝液を付加して所定の段階的値の濃度サンプルを準備しておく希釈法（以後、置注ぎ希釈と称する）と、所定濃度の原液をサンプルとして測定し、測定終了後に新たな水や緩衝液を追加して濃度を薄くしていく希釈法（以後、注足し希釈と称する）とがあるが、本実施例においては、予め極端に薄い濃度まで希釈した置注ぎ希釈サンプルを用いることで、バクテリアの判別が可能となることが判った。さらに、Ａ８とＡ６とを比較すると、この相違点は１回照射か３回照射かであり、３回照射であるＡ６でのクラス間距離が上記したように４．２５４と識別力が向上していることが判る。
【００９２】
一般に前記クラス間距離が３以上であればクラス判別が有意とされており、上記で得られたクラス間距離が４．２５４なので、ＣＮＳとＣＰＳを十分に判別可能なＳＩＭＣＡモデルが得られたことが判る。
【００９３】
また、図１４（ｂ）にはＳＩＭＣＡを使った判別結果を示しており、例えばＣＮＳでは３４回全て判別成功であり、ＣＮＳでないと誤判別した例は０回であった。またＣＰＳでは３６回全て判別成功であり、ＣＰＳでないと誤判別した例は０回であり、判別誤差が生じていないことを示している。
【００９４】
上記したように、摂動（ＷＡＰ）として、試料濃度の１０-1倍から１０-10倍までの広範囲な段階的希釈（置注ぎ希釈）と、３回繰り返し照射という条件の変化を与えながらの分光分析により、試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別と濃度測定を行う高精度なモデルを構築することが可能となった。
【００９５】
そのために、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法により、判別が困難で人体に有害なバクテリアを確実に判別することができ、従来の培養法によれば４８時間程度のバクテリア培養時間が必要であったものが、本発明によれば、培養する必要もなくリアルタイムに測定することができるという効果が得られる。
【実施例２】
【００９６】
実施例２は、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）の判別を行なった例であって、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光により分光分析を行うと共に、光を１５分毎に６時間繰り返し照射し
て分光分析を行い、ＰＣＡ法とＳＩＭＣＡ法により多変量解析を行ったものである。
【００９７】
また、プリオン蛋白質ＰｒＰのみの試料と分子構造内に銅を含有する試料ＰｒＰ（Ｃｕ）と分子構造内にマンガンを含有する試料ＰｒＰ（Ｍｎ）とをそれぞれ準備し、さらに、それぞれの濃度を、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌと予め変更して準備した複数の希釈サンプル（置注ぎ希釈）のプリオン水溶液をそれぞれ分光分析した。
【００９８】
得られたスペクトルをＰＣＡ法（主成分分析）により多変量解析を行い、その時に得られた第１主成分（Factor1）、第３主成分（Factor3）、第５主成分（Factor5）による判別結果およびローディングを図１５に示す。
【００９９】
図１５（ａ）は第１主成分（Factor1）と第３主成分（Factor3）によるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）との判別結果であり、図１５（ｂ）は第３主成分（Factor3）と第５主成分（Factor5）によるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）との判別結果を示している。また、図１５（ｃ）はそれぞれの主成分のローディングを示している。
【０１００】
図１５（ａ）からＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）とが明確に判別されていることが明らかである。ただ、図中に示すＰｒＰ１が破線で囲むＰｒＰグループから離れており、Ｃｕ１がＰｒＰ（Ｃｕ）グループから離れており、Ｍｎ１がＰｒＰ（Ｍｎ）グループから離れていることが判る。前記ＰｒＰ１、Ｃｕ１、Ｍｎ１とはそれぞれ一回目の照射時のデータであって、一回だけでは正確な判別を行うことができず、摂動（ＷＡＰ）を与えながら繰り返し測定することで、グループ判別が可能となるモデルが得られることを示している。
【０１０１】
図１５（ａ）（ｂ）から明らかなように、摂動（ＷＡＰ）として、試料濃度の段階的な希釈と、光を１５分毎に繰り返し照射という条件変化を与えながら分光分析を行うと、プリオン蛋白質ＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）との判別が可能となるモデルを得ることができる。
【０１０２】
図１５（ｃ）から判るように、第１主成分（Factor1）を構成するファクターとしては
第１主成分（Factor1）のローディングを示すラインＰＣ１により１４６６ｎｍの波長光の寄与が大きく、第３主成分（Factor3）のローディングを示すラインＰＣ３により１３４０ｎｍ、１４２４ｎｍの波長光の寄与が大きく、第５主成分（Factor5）のローディングを示すラインＰＣ５により１３６４ｎｍ，１３９４ｎｍ、１４７６ｎｍの波長光の寄与が大きいことが判る。
【０１０３】
また、ＳＩＭＣＡ解析を行い、各クラス間の距離を算出した結果を図１６に示す。この図から、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）と距離が２８．８１であり、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰとの距離が４．１５であることが判る。前に説明したようにこの距離が３以上であれば、クラス判別が有意であるので、本方法によりプリオン蛋白質を明確に判別することが可能となる。
【０１０４】
つまり、光を時間間隔を空けて（１５分毎に）繰り返し照射する摂動（ＷＡＰ）を与えながら分光分析を行うことで、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）などの金属分子を含有した蛋白を検出可能となり、プリオン蛋白質ＰｒＰと、狂牛病に関係あると見られているプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）とを確実に判定可能なモデルを得ることができる。
【０１０５】
また、別のサンプルを用いて１５分毎に６時間繰り返し２６回照射した時の各測定時においてＳＩＭＣＡ処理を行い、得られるクラス間距離の変化を計測して得られた結果を図
１７に示す。この図から判るように、ある回数までの照射回数の増加に応じてクラス間距離が大きくなっている。つまり、判別力が大きくなっていることが判る。
【０１０６】
例えばＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）とのクラス間距離は、３回照射では５．６であったものが、２０回照射で２５．８まで増加している。しかし、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰとのクラス間距離は１１回照射で最大となっており違ったパターンとなっている。つまり、特定の成分を判別する最適な照射回数（摂動付与の条件）があることが判る。
【０１０７】
上記のように、似た構造のプリオン蛋白質であっても、成分の違いにより、摂動を付与された際の応答に変化が生じていることが判る。つまり、生体高分子の構造又は機能の違いやその変化により、摂動を付与した際の応答に変化が生じている。そのために、前記応答の変化を捉えることで生体高分子の構造や機能を検知することが可能となる。
【０１０８】
さらに、図１８に、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと、金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）と、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加したＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）との判別を行った時の各サンプル濃度によるクラス間距離の測定結果を示す。それそれ、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ所定量の原液と緩衝液を調合して複数のサンプル（置注ぎ希釈サンプル）を用意して、それぞれのクラス間距離を計測した。
【０１０９】
例えば、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰとのクラス間距離は、検体濃度が１ｍｇ／ｍｌの時には０．８６１５９５であり、濃度が０．５ｍｇ／ｍｌでは２．４３４４３３であり、濃度が０．１ｍｇ／ｍｌでは２．６７４９９４であり、濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌでは７．８６２９９９となっている。前述したように、このクラス間距離が３以上であれば、クラス判別が有意とされているので、検体濃度を薄くすると計測されるクラス間距離が大きくなり判定可能となる。
【０１１０】
上記の実験結果により、本分光分析方法によれば、置注ぎ希釈により検体濃度を広範囲に薄くしていくと、成分の判別力が向上していることが明らかである。
【実施例３】
【０１１１】
実施例３は、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）としての銅を含有する試料検体ＰｒＰ（Ｃｕ）の判別を、光路長を変更（１ｍｍと４ｍｍ）して行った例であって、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光により分光分析を行うと共に、光を６時間毎に４８時間繰り返して分光分析を行い、ＰＣＡ法とＳＩＭＣＡ法により多変量解析を行ったものである。また、この時に、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加したＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）の測定を行い、測定結果にどのような影響を及ぼすかを検討した。
【０１１２】
図１９には、得られた第３主成分（Factor３）と第９主成分（Factor９）のローディングを示し、図２０（ａ）にはＳＩＭＣＡによる解析結果を示し、図２０（ｂ）にはＳＩＭＣＡによるクラス間距離を示し、図２０（ｃ）には判別結果を示している。
【０１１３】
図２０（ａ）により、光路長を変更して測定した時に、ＰｒＰおよびＰｒＰ（Ｃｕ）はそのクラス分けが明確に判別できることが判った。また、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）とを混同することなく分別できることも判る。また、図２０（ｂ）より、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）とのクラス間距離は２４．８４であり、明確に判別されることが判る。ＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とのクラス間距離は１．１９と小さいが、図２０（ｃ）に示す判別の結果、誤判別が０であり、問題ないことが判る。
【０１１４】
上記のように、プリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）の判別は、光路長を変更して分光分析することで可能であることが判る。しかし、図２０（ａ）からは、ＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）の測定は、光路長を変更しても差が見られない。つまり、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加しただけの試料検体では、光路長を変更して分光分析を行っても、応答スペクトルにパターンの変化が生じず、水分子と注目成分との間に相互作用が生じていないことが判る。このことは逆に、本実施例に係る可視光・近赤外分光分析方法によれば、金属成分をその分子構造内に含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）の判別が可能となり有効といえる。
【０１１５】
このように、光路長を変更（１ｍｍと４ｍｍ）するという摂動を与えることでも、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）との判別を行うことができる。
【実施例４】
【０１１６】
実施例４は、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと、金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）と、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加したＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）との判別を、温度を変更（２１℃、３０℃、３５℃、３７℃）すると共に、それぞれの濃度を、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌと予め変更して準備した複数の希釈サンプル（置注ぎ希釈）のプリオン水溶液をそれぞれ分光分析した例である。
【０１１７】
それぞれの試料検体の前記４段階の濃度サンプルを、それぞれ温度を４段階に変更して分光分析を行い、スペクトルデータを得た。つまり、それぞれの所定濃度サンプルについてそれぞれ４個のスペクトルデータが得られる。つまり、温度を摂動として応答に変化を与えた際に得られる４個のスペクトルデータを主成分分析して、それぞれの濃度段階における試料検体のＳＩＭＣＡ距離を求めた。
【０１１８】
図２１に、得られたＳＩＭＣＡ距離を立体的にグラフ表示している。この図から明らかなように、全ての試料検体において、検体濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌと最も低い時に、ＳＩＭＣＡ距離が最大となっている。また、いずれもそのＳＩＭＣＡ距離は５以上であり、明確にクラス判別が行なわれていることが判る。
【０１１９】
また、それぞれの検体成分によりそのＳＩＭＣＡ距離のパターンが変化していることも明らかである。つまり、温度変更という摂動を与えた時の応答に、それぞれの検体成分に応じて変化が生じており、前記検体成分の構造及び機能の違いにより差が生じていることを示している。このように、試料検体の温度を変更することも、被検体成分特有の応答スペクトルのパターンを動的に変化させる摂動となる。
【実施例５】
【０１２０】
実施例５は、試料検体中の抗原濃度を測定した例であって、抗体としてAnti-bisphenol
A scFvを用い、抗原としてBisphenolAを用いて、緩衝液（ＰＢＳバッファー）中にそれぞれの濃度を段階的に希釈した希釈サンプルを試料検体として、光路長１ｍｍの石英セルに注入し、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を３回連続繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１２１】
前記抗体のサンプル濃度は１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの４段階であった。また、前記抗原の濃度は、１ｐｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌまでの６段階のサンプルを使用した。また、それぞれを混ぜ合わせた混合サンプルとして１６種を各２個の計３２サンプルと、それぞれの単独サンプル（１０種２２サンプル）及び水のみ（１サンプル）、緩衝液のみ（３サンプル）の合計５８サンプルの分光分析を行
った。
【０１２２】
得られたスペクトルデータをノイズ処理、スムージング処理、オートスケール処理を行い、ＰＬＳとクロスバリデーション解析を行った。
【０１２３】
解析結果を図２２に示す。図２２（ａ）は検量線であり、横軸Measured Yが従来法による測定値を示し、縦軸Pred Calが本発明による可視光・近赤外分光分析方法により得られた予測値を示している。この結果から、抗原の濃度が１ｐｐｔ（１兆分の１）の濃度まで測定可能であることが判った。
【０１２４】
またクロスバリデーション解析により得られるバリデーション誤差ＳＥＶを図２２（ｂ）に示しているが、１回の照射によるFactor5の累積寄与率（cumulative）は９９．９４１８８％であり、その時のバリデーション誤差ＳＥＶが３．５５８６０７であることを示している。しかし、３回繰り返し照射によるFactor9の累進寄与率が９９．９４５６７％の場合に、バリデーション誤差ＳＥＶが１．００８７８５であることを示している。
【０１２５】
つまり、複数回（３回）連続繰り返し照射による摂動（ＷＡＰ）を与えながらの分光分析により、バリデーション誤差ＳＥＶが三分の一となって、従来の３倍の精度で試料検体中の抗原濃度を測定可能となることが判った。
【０１２６】
また、図２２（ｃ）にはＳＩＭＣＡ処理して得られるクラス間距離を示している。これから判るように、１回照射では８．６５であったものが、２回までの照射（１＆２）で９．７９となり、３回までの繰り返し照射（１＆２＆３）では１０．１１まで向上していることが判る。つまり、複数回繰り返し照射することで、抗原の成分判別を精度よく行うことができる。
【実施例６】
【０１２７】
実施例６は、試料検体中に溶解した粒子の溶解前の粒子径を測定する例として、溶解前のコーヒー粒子径を測定した実施例であって、ミキサーによってインスタントコーヒーを粉砕する際に、０秒、２０秒、６０秒、９０秒とその粉砕時間を延長して、コーヒーの粒子径を段階的に粉砕して細かくしていったサンプルを用いると共に、それぞれの濃度を４％、３％、２％、１％と段階的に変更したサンプルを光路長１ｍｍの石英セルに注入し、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長範囲の光を３回連続繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１２８】
得られたスペクトルデータをノイズ処理、スムージング処理（１７ポイント、３４ｎｍ毎）、オートスケール処理を行い、前述したＰＬＳ法とクロスバリデーション解析を行い、回帰モデルを構築した。
【０１２９】
解析結果を図２３に示す。図２３（ａ）は横軸Measured Yが従来法による測定値を示し、縦軸Pred Calが本発明による可視光・近赤外分光分析方法により得られた予測値を示している。前記測定値Ｙは実際にコーヒー粒子の径を測定したものではなく、粉砕時間の対数表示としている。これは粉砕時間が長いと粒子径が小さくなると見なしたものである。この結果から、本発明によれば、溶解前のコーヒー粒子径を推測できるモデルが得られることが判った。
【０１３０】
またクロスバリデーション解析により得られるバリデーション誤差ＳＥＶを図２３（ｂ）に示しているが、１回の照射によるFactor5の累積寄与率（cumulative）は９８．３１８４９％であり、その時のバリデーション誤差ＳＥＶが０．９３７０３９であることを示している。しかし、３回繰り返し照射によるFactor6の累進寄与率が９９．８９０４％の
場合に、バリデーション誤差ＳＥＶが０．４６６６７５であることを示している。
【０１３１】
つまり、３回連続繰り返し照射による摂動（ＷＡＰ）を与えながらの分光分析により１回のみの照射による分光分析と比較して２倍の精度で溶解前のコーヒー粒子径を測定可能となることが判った。
【０１３２】
また、検体濃度を変更した時に、前述したクラス判別を行う定性的解析であるＳＩＭＣＡ解析により、溶解前の粒子径の違い、つまり、粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとの判別距離（SIMCA DISTANCE）がどのように変化するかを測定してみた。
【０１３３】
図２４（ａ）には、コーヒーの粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを判別した時のそれぞれの検体濃度毎に算出したＳＩＭＣＡ距離を示している。また、図２４（ｂ）には、砂糖（Sugar）の粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを判別した時のそれぞれの検体濃度毎に算出したＳＩＭＣＡ距離を示している。図２４（ｃ）には砂糖の粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のもののＰＬＳ解析とクロスバリデーション解析を行った時の回帰モデルの相関係数（Ｒｖ）とバリデーション誤差（ＳＥＶ）を示している。
【０１３４】
図２４（ａ）によれば、１〜４％のいずれの濃度においても、５以上のＳＩＭＣＡ距離となっており、本実施例に係る測定方法により、コーヒーの粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを十分判別可能であることを示している。また特に濃度１％と薄くした時には、ＳＩＭＣＡ距離が１５．９６と最大値となっており、判別力が最大であることを示している。
【０１３５】
図２４（ｂ）によれば、砂糖（Sugar）の粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを判別した時に、検体濃度が４％の時は、そのＳＩＭＣＡ距離が１．５９であり、値が小さく判別は困難であるが、濃度をその半分の２％以下とすると十分判別可能な程度の数値となっている。このように、測定する検体成分によって最適な検体濃度が異なっていることが判る。これは、すなわち、それぞれの検体成分により濃度変更という摂動を与えた時の応答に変化が生じており、前記検体成分の構造及び機能の違いにより差が生じていることを示している。
【０１３６】
また、図２４（ｃ）によれば、砂糖測定時の回帰モデルの相関係数が、粒状（Granule）のものでは０．９９５であり、粉状（Powder）のものでは０．９９９８となっており、非常に高い相関でその粒度を測定可能となる。
【０１３７】
上記のように、本実施例による可視光・近赤外分光分析方法により、コーヒーの粒子の大きさや砂糖粒子の大きさを高精度に判別することができる。
【実施例７】
【０１３８】
実施例７は、試料検体中の異なるバクテリアを判別した例であって、牛乳中のバクテリアStaphylococcus（msta）と、Streptococcus（mstr）をそれぞれ緩衝液（ＰＢＳバッファー）により段階的に希釈して、１０-1〜１０16（colony/ml）濃度とした７６サンプルを光路長１ｍｍの石英セルに注入し、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光をそれぞれ３回繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１３９】
得られたスペクトルデータから、前述したのと同様な解析方法である主成分分析（ＰＣＡ）とＳＩＭＣＡ解析を行った。
【０１４０】
解析結果を図２５に示す。図２５は第１主成分（Factor1）と第２主成分（Factor2）と
第３主成分（Factor3）でのmstaとmstrとの判別結果を表しており、バクテリアmsta群とバクテリアmstr群とが確実に判別されることを示している。
【０１４１】
上記したように、複数回（３回）連続繰り返し照射による摂動（ＷＡＰ）を与えながらの分光分析により、牛乳中のバクテリアmsta群とバクテリアmstr群とが確実に判別可能となることが判った。つまり、従来の培養法によれば、４８時間程度のバクテリア培養時間が必要であったものが、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法によれば、培養する必要もなく、異なるバクテリアをリアルタイムに判別することができるという効果が得られる。
【実施例８】
【０１４２】
実施例８は、牛等の哺乳動物の血漿や胃液や生乳の成分濃度を測定した例であって、牛の生体液を用いて、光路長１ｍｍの石英セルに注入した試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光により分光分析を行ったものである。測定は一日に２回（朝、夕各１回）の分光分析を三日連続して行った。さらに、その後３週間違う餌を与えた後で、同様に一日に２回（朝、夕各１回）の分光分析を三日連続して行い、その効果を確認したものである。
【０１４３】
上記の測定回数を朝夕各１回で三日連続としたが、一日に２回以上測定してもよく、また継続日数も三日以上としてもよいと思われる。このように測定間隔と測定回数を変化させて得られたスペクトルデータの前処理を行い、ＰＬＳ法とクロスバリデーション解析を行った。
【０１４４】
解析結果を図２６と図２７に示す。図２７（ａ）（ｂ）は牛の血漿（Blood Plasma）のスペクトルを計測することで、その牛の牛乳の成分濃度（Fat脂肪、Crude Protein粗蛋白質 、Caseinカゼイン 、True protein蛋白質 、MUN乳中尿素態窒素 、Lactose乳糖）を予測した結果であって、図２７（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルを計測することで、その牛の血漿の成分濃度（Albuminアルブミン、Glucoseグルコース、BUN血中尿素態窒素）を予測した結果である。
【０１４５】
また、図２７（ａ）（ｂ）は牛の胃液のスペクトルを計測することで、その牛の牛乳の成分濃度（Fat脂肪、Crude Protein粗蛋白質 、Caseinカゼイン 、True protein蛋白質 、MUN乳中尿素態窒素 、Lactose乳糖）を予測した結果であって、図２７（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルを計測することで、その牛の胃液の成分濃度（PHペーハー、NH3-Nアンモニア態窒素、C2脂肪酸、C3脂肪酸、C4脂肪酸）を予測した結果を示している。
【０１４６】
図２７（ｂ）から判るように、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法により、牛の血漿のスペクトルを計測して高い相関にて生乳の成分濃度が予測可能となった。特にカゼインではその相関係数Ｒ＝０．９３８であり、この時の統計的有意ｐ＜０．００１であって、１０００回に１回以下の予測誤差となる。また、図２７（ｂ）に示す牛の胃液のスペクトルを計測することで、生乳中に含有されるカゼイン濃度をＲ＝０．９０２、ｐ＜０．００１にて予測できることが判る。
【０１４７】
このように、測定間隔と測定回数を変化させるという摂動（ＷＡＰ）を与えながら分光分析を行うことで、牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液から、前記牛等の哺乳動物の生乳に含有される成分濃度を予測し測定することができる。また、前記生乳から、前記牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液の成分濃度を測定することが可能となるので、乳牛等の生態情報を容易に得ることができる。
【実施例９】
【０１４８】
実施例９は、牛乳の複数の成分濃度を測定した例であって、光路長を変更して複数回の測定を行うという摂動を与えながら、石英セルに注入した試料検体に対して７００ｎｍ〜１１００ｎｍの第一の波長領域と、１１００ｎｍ〜２４００ｎｍの第二の波長領域の分光分析を行ったものである。
【０１４９】
近赤外光であっても短波長域、具体的には７００ｎｍ〜１１００ｎｍの領域の近赤外光であれば、長波長域よりも１０〜１００倍ほど透過力が大きく、短波長域の近赤外光を用いれば光路長を１〜２ｃｍ程度にすることができる。さらに、特殊な石英セルに替えて試験管等の安価な容器を使用することもできる。
【０１５０】
そのために、光路長がそれぞれ１ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍの石英セル／又は試験管に注入した試料検体を用いて、７００ｎｍ〜１１００ｎｍの短波長領域の分光分析を行うことができる。
【０１５１】
また、図２８（ａ）に示す幅１ｍｍの矩形試料検体注入部３Ａを備える石英セル３に試料検体を注入した後で、図２８（ｂ）に示す方向４，５に所定の光を照射することで、任意の光路長に設定することができる。この方法により同一試料検体の光路長を１ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍと変化させて測定したところ、光路長が長くなる程ノイズが減り、高精度となることが判った。
【０１５２】
得られたスペクトルをＰＬＳ法とクロスバリデーションにより解析し得られたＳＥＣＶ（クロスバリデーション誤差）を図２９（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す。
【０１５３】
図２９（ａ）にはＦＡＴ（牛乳中の脂肪濃度）を測定した時のＳＥＣＶであり、図２９（ｂ）にはＰＲＯＴＥＩＮ（牛乳中の蛋白質濃度）を測定した際のＳＥＣＶであり、図２９（ｃ）にはＬＡＣＴＯＳＥ（牛乳中の乳糖濃度）を測定した際のＳＥＣＶを示している。
【０１５４】
図２９（ａ）に示す脂肪分の測定結果から、光路長１ｍｍでは波長領域７００〜１１００ｎｍのＳＥＣＶが０．４５であるが、光路長４ｍｍおよび１０ｍｍで波長領域７００〜１１００ｎｍでのＳＥＣＶは０．２となるので、光路長を長くすることで短波長領域７００〜１１００ｎｍにおいても十分精度よく測定可能であることが確認される。
【０１５５】
また図２９（ｃ）に示す乳糖の測定結果からは、短波長領域７００〜１１００ｎｍと長波長領域１１００〜２４００ｎｍでのＳＥＣＶが共に０．０９であり、高精度の測定が短波長領域７００〜１１００ｎｍで測定可能であることを示している。
【０１５６】
上記したように短波長領域にて長い光路長にて、試料検体を測定可能となるので、ノイズの少ない、誤差の小さい判定を行うことができると共に、特殊な石英セルではなく、通常の試験管等により測定することもできる。
【０１５７】
また、光路長を変化させて多数のデータを測定することでさらに精度のよいモデルが得られることは明らかである。
【実施例１０】
【０１５８】
実施例１０は牛乳中の脂肪濃度を測定した例であって、試料検体を光路長１ｍｍの石英セルに注入し、摂動（ＷＡＰ）として１０Ｖの電圧を付加しながら、５００〜１０００ｎｍの波長領域の光を３回繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１５９】
電圧付加手段として牛乳の電気伝導度を測定するための装置であるMilk Checker（オリ
エンタルインスツルメント社製）を使用し、１０Ｖの電圧を付加しながら、クボタ社製の分光分析器を用いて５００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長領域の光を３回連続繰り返し照射して分光分析を行った。また、分光分析器としてその他の分光分析器（例えば、ニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500）を用いてもよく、特に限定するものではない。
【０１６０】
その時に得られたスペクトルをＰＬＳ法とクロスバリデーションにより解析した例を図３０に示す。図３０（ａ）は解析された回帰ベクトルを示しており、図３０（ｂ）には解析結果を示している。
【０１６１】
図３０（ｂ）から、電圧を付加しない場合（Without EMF）にはFactor10のバリデーション相関（rVal）が０．９８であり、その時のバリデーション誤差（SEV）が０．２０４２６９であることを示している。
【０１６２】
また、電圧を付加した後（After Applying EMF）では、Factor9でそれぞれrVal＝０．９９６２５６でSEV ＝０．０８７２１２である。さらに、電圧を付加しながら（In the presence of EMF）の測定では、Factor9でrVal＝０．９９７４８３でSEV＝０．０７１５２８となっている。
【０１６３】
つまり、摂動（ＷＡＰ）として１０Ｖの電圧を付加しながら分光分析すれば、バリデーション誤差が１／３となるので、測定の精度が３倍となるモデルが得られたことが判る。
【０１６４】
上記の実施例１から実施例１０で説明したように、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を利用して各試料中の成分の特性を測定する分光分析方法において、試料検体に所定の条件を付加することで、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えながら分光分析を行い、前記試料検体の各成分に応じて変化する所定の応答スペクトルのパターンを計測してスペクトル解析もしくは多変量解析を行うことにより、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、さらに超低濃度成分の検出や成分の判別及び／又は成分の特性をリアルタイムに測定可能とする可視光・近赤外分光分析方法を得ることができる。
【０１６５】
さらには、測定する検体成分により、所定の検体成分を判別容易とする最適な摂動（ＷＡＰ）があるので、所定の摂動を付与しながら分光分析を行うことで、所定の検体成分の測定を簡易に行なうことも可能である。
【０１６６】
上記のように、本発明でいう摂動とは、試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更であって、光の繰り返し照射、試料検体の濃度変更、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更以外にも、実施例８で示した、牛に与える飼料の変更もある。また、さらには、試料検体に振動や音波や圧力を付与することで前記試料検体に物理的または化学的な変化を与えるようにしてもよい。
【０１６７】
上記したように、ある特定の波長（Important wavelengths）の光が、試料検体の特定成分を判別あるいは測定するのに重要な光であるので、簡易型の可視光・近赤外分光分析装置としては、ある特定の波長（Important wavelengths）の光を照射して分光分析可能な装置であればよい。そのために、図３１に示すような簡易構成の特定成分測定用の可視光・近赤外分光分析装置２０とすることができる。
【０１６８】
前記可視光・近赤外分光分析装置２０は、試料検体収容部２１に収容された試料検体Ｓ２に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段２２を備えると共に、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光であって
、試料検体Ｓ２に応じて予め選定された特定波長領域の光を前記試料検体に照射する光学手段２３と、前記試料検体Ｓ２からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段２４と、得られたスペクトルについて所定のスペクトル解析もしくは多変量解析を行う処理ソフトを内蔵するデータ処理手段２５を備える構成とされている。さらには、処理された結果を判別して判別結果を表示する表示手段２６を備える構成とすることもできる。
【０１６９】
上記の構成の可視光・近赤外分光分析装置２０であれば、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定するのに適した特定の波長（Important wavelengths）の光を照射して分光分析することができるので、それぞれの特定成分を短時間にまた容易に推定可能となる。また、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とすべく構築されたモデルを使用することで、特定成分の簡易判定や簡易測定が可能となる可視光・近赤外分光分析装置２０を構成することができる
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法の流れを示すブロック図である。
【図２】本発明方法の特徴部分を示す概略説明図である。
【図３】本発明装置の特徴部分を示す概略説明図である。
【図４】水分子の吸収バンドの強度変化を示す概略説明図である。
【図５】水分子の吸収バンドの強度変化を等高線状に示す。
【図６】Synchronousに変化する波長を示す一覧図である。
【図７】試料検体中のバクテリアを測定した際の吸収スペクトルを示す。
【図８】ＣＮＳの回帰ベクトルを示す。
【図９】ＣＰＳの回帰ベクトルを示す。
【図１０】ＣＮＳの検量線を示す。
【図１１】ＣＰＳの検量線を示す。
【図１２】クロスバリデーション解析後の検量結果を示す。
【図１３】第１主成分（Factor1）、第３主成分（Factor3）、第５主成分（Factor5）に基づくＣＮＳとＣＰＳの３次元プロットである。
【図１４】（ａ）にはＣＮＳとＣＰＳのクラス間距離を求めたＳＩＭＣＡ解析の結果を示し、（ｂ）にはＳＩＭＣＡを使った判別結果を示している。
【図１５】（ａ）は第１主成分（Factor1）と第３主成分（Factor3）とによるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）の判別結果を示しており、（ｂ）は第３主成分（Factor3）と第５主成分（Factor5）とによる判別結果を示し、（ｃ）はそれぞれの主成分のローディングを示している。
【図１６】ＳＩＭＣＡ解析によるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）の各クラス間の距離を示す。
【図１７】繰り返し照射によるＳＩＭＣＡ解析の結果を示している。
【図１８】プリオン蛋白質の濃度を変更した時のクラス間距離の結果を示している。
【図１９】光路長を変更してＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）を判別した時の回帰ベクトルを示している。
【図２０】光路長を変更してＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）を判別した結果であり、（ａ）はＳＩＭＣＡ解析の結果を示し、（ｂ）はクラス間距離を示し、（ｃ）は判別結果を示している。
【図２１】温度変更の摂動を与えてプリオン蛋白質の判別を行なった時のＳＩＭＣＡ距離を示すグラフである。
【図２２】（ａ）は試料検体中の抗原濃度を測定した際の検量線を示し、（ｂ）にはクロスバリデーションによる解析結果を示し、（ｃ）にはＳＩＭＣＡ解析によるクラス間距離を示している。
【図２３】（ａ）は溶解前のコーヒー粒子径を測定した際の検量線を示し、（ｂ）にはクロスバリデーションによる解析結果を示す。
【図２４】粒子の大きさを判別した例を示し、（ａ）にはコーヒー粒子を判別した時のＳＩＭＣＡ距離を示し、（ｂ）には砂糖粒子を判別した時のＳＩＭＣＡ距離を示し、（ｃ）には砂糖粒子を測定した時の相関係数とバリデーション誤差を示している。
【図２５】試料検体中のバクテリアを測定した際の第１主成分（Factor1）と第２主成分（Factor2）と第３主成分（Factor3）とによるmstaとmstrの判別結果を表している。
【図２６】（ａ）（ｂ）は牛の血漿スペクトルから、その牛の牛乳の成分濃度を予測した結果を示し、（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルから、その牛の血漿の成分濃度を予測した結果を示している。
【図２７】（ａ）（ｂ）は牛の胃液のスペクトルから、その牛の牛乳の成分濃度を予測した結果を示し、（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルから、その牛の胃液の成分濃度を予測した結果を示している。
【図２８】石英セルを示しており、（ａ）は全体斜視図であり、（ｂ）は平面図である。
【図２９】牛乳の複数の成分濃度を測定した際のＳＥＣＶを示し、（ａ）にはＦＡＴ（脂肪分）のＳＥＣＶであり、（ｂ）はＰＲＯＴＥＩＮ（蛋白質）のＳＥＣＶであり、（ｃ）はＬＡＣＴＯＳＥのＳＥＣＶを示している。
【図３０】（ａ）は牛乳中の脂肪濃度を測定した際の回帰ベクトルＹ１を示し、（ｂ）にはクロスバリデーションによる解析結果を示す。
【図３１】特性成分測定用の可視光・近赤外分光分析装置の一例を示す。
【符号の説明】
【０１７１】
１ 既知の試料
２ 新たな試料
３ 石英セル
３Ａ 試料検体注入部
４ 照射方向
５ 照射方向
１０ 可視光・近赤外分光分析装置
２０ 可視光・近赤外分光分析装置（特定成分用の）
Ｌ１ 境界
Ｓ１ 試料検体
Ｓ２ （特定の）試料検体
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可視光及び／又は近赤外光を利用して各試料中の成分の判別や成分の特性を測定する分光分析方法及びその装置に関し、特に、得られる吸収スペクトルをスペクトル解析もしくは多変量解析して、各成分の判別や各成分の特性を測定する可視光・近赤外分光分析方法及びその装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
最近では、種々の分野で近赤外光を用いた成分分析が行われている。例えば、可視光及び／又は近赤外光を検体試料に照射して、特定成分に吸収される波長または波長領域を検出することで、前記特定成分を定量分析することが行なわれている。
【０００３】
これは、例えば石英セル中に試料を注入し、これに近赤外分光器（例えば、ニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500）を用いて、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して、その透過光、反射光、又は透過反射光（以後これらを総称して透過反射光と称する）を分析することで行う。
【０００４】
一般に、近赤外光は、物質の吸光係数が非常に小さく散乱を受け難く、エネルギーの低い電磁波であるので、試料に損傷を与えることなく化学的・物理的情報を得ることができる。
【０００５】
そのために、試料検体からの透過反射光スペクトルの強度を検出して、試料検体による吸光度を求めて、得られた吸光度データを多変量解析することで、直ちに試料検体の情報を得ることができる。
【０００６】
そして、試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の領域の連続波長光を照射して試料検体のスペクトルを得る工程と、得られたスペクトル中のピークを分光学的手法により要素ピークに分解する工程と、その中の水分子の要素ピークを多変量解析して解析モデルを作成する工程とを備えるとした試料検体の情報を得る方法が既に公開されている（例えば、特許文献１参照）。
【０００７】
さらに、可視光及び／又は近赤外光領域における水分子の吸収バンドを用いて、得られた吸光度データを多変量解析することで、牛乳／又は乳房中の体細胞を測定して牛の乳房炎の診断を行うとした出願も公開されている（例えば、特許文献２参照）。
【特許文献１】特開２００２−５８２７号公報（第１−９頁、第１図）
【特許文献２】国際公開ＷＯ０１／７５４２０号公報（第１−５頁、第１図）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来の可視光及び／又は近赤外光を用いた成分分析方法においては、特定条件下で４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を照射し、試料中に存在する水分子と被検体中の注目成分との相互作用で水分子の要素ピークが変化するのを検出することで、被検体の成分情報を得る方法であり、測定できる成分や測定の精度には限界がある。
【０００９】
本発明の目的は、上記問題点を解消するために、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を利用して各試料中の成分の判別や成分の特性を測定する分光分析方法において、従
来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、また超低濃度成分の検出を可能とし、さらに成分の特性や、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化をリアルタイムに測定可能とする可視光・近赤外分光分析方法およびその装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記の目的を達成するために請求項１に係る発明は、試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与えながらスペクトル測定を行い、スペクトル解析もしくは多変量解析して、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴としている。
【００１１】
上記の構成を有する請求項１に係る発明によれば、摂動を与えることで応答スペクトルに変化を生じさせると共に、前記応答スペクトルの変遷を捉えて解析することで、従来検出不可能であった成分の判別が可能となる。また、濃度や粒子の大きさ等の各成分の特性を測定することができる。
【００１２】
請求項２に係る発明は、試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating
perturbations：ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させ、全部又は一部の波長領域のスペクトル測定を行うことで、前記試料検体中の成分の特性に応じて変化する水分子の要素ピークを含む応答スペクトルをスペクトル解析もしくは多変量解析して、応答スペクトルのパターンの変遷を捉え、捉えられた前記パターンの変遷から各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴としている。
【００１３】
上記の構成を有する請求項２に係る発明によれば、水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えながら試料検体の各成分に応じてシフトする所定の水分子の応答の変化を測定して分光分析を行いスペクトル解析もしくは多変量解析を行うので、微小な変化を積極的に生じさせると共に、前記微小な変化を解析して捉えることができる。そのために、スペクトルのグラフからは直接視認できない応答スペクトルのパターンの変遷を捉えることで、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、さらに超低濃度成分の検出を可能とし、成分の特性をリアルタイムに測定可能とする精度の高いモデルを得ることができる。
【００１４】
請求項３に係る発明は、前記摂動が、前記試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更であって、光の繰り返し照射、試料検体の濃度変更、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更のいずれか、または、それらの組み合わせであることを特徴としている。
【００１５】
上記の構成を有する請求項３に係る発明によれば、試料検体の種類や特性に応じた条件を選択することで所定の効果的な摂動（ＷＡＰ）を与えることができる。
【００１６】
請求項４に係る発明は、前記摂動が、試料検体の１０倍ずつ（例えば１０-1〜１０-10まで）の濃度変更と、それぞれに少なくとも３回繰り返し照射の組み合わせであることを特徴とする。
【００１７】
上記の構成を有する請求項４に係る発明によれば、試料検体の濃度を広範囲に変更して希釈しているので、試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用により応答が変化する際に、水の影響が強調されて、水分子の特定の要素ピークを含む応答スペクトルのパターンの変化を明確にすることができる。この結果、水溶液中の微小濃度成分の測定も行うことが可能となる。
【００１８】
請求項５に係る発明は、前記試料検体がバクテリアであって、前記試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別を行うことを特徴とする。
【００１９】
上記の構成を有する請求項５に係る発明によれば、例えば、バクテリアの濃度を１０倍ずつ段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）とを判別する高精度なモデルを構築することができる。
【００２０】
請求項６に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）及び／又はＰｒＰ（Ｍｎ）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする。
【００２１】
上記の構成を有する請求項６に係る発明によれば、間隔を空けて光を繰り返し照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、特定の波長領域の応答スペクトルに変化が生じ、この応答スペクトルを多変量解析することで、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）とを判別することができるモデルを構築することができる。
【００２２】
請求項７に係る発明は、光路長及び／又は濃度を変更すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（metal）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする。
【００２３】
上記の構成を有する請求項７に係る発明によれば、光路長及び／又は濃度を変更し複数回照射する摂動（ＷＡＰ）を付与した近赤外分光分析方法により、金属成分をその構造体中に含有するプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）と金属成分を含有しないプリオン蛋白質ＰｒＰを判別することができる。
【００２４】
請求項８に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに繰り返し照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の抗原の濃度を測定することを特徴とする。
【００２５】
上記の構成を有する請求項８に係る発明によれば、抗原濃度を段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、試料検体中の抗体濃度を測定可能となるモデルを構築することができる。
【００２６】
請求項９に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中に溶解した粒子の溶解前の粒子径を測定することを特徴とする。
【００２７】
上記の構成を有する請求項９に係る発明によれば、各粒子径の粒子を溶解する濃度を段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ
）を与えることで、溶解前の粒子径を測定可能なモデルを構築することができる。
【００２８】
請求項１０に係る発明は、試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の異なるバクテリアを判別することを特徴とする。
【００２９】
上記の構成を有する請求項１０に係る発明によれば、バクテリア濃度を段階的値に濃度変更するという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで、試料検体中の異なるバクテリアを微量濃度であっても判別可能とするモデルを構築することができる。
【００３０】
請求項１１に係る発明は、一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生乳から前記哺乳動物の血漿や胃液等の生体液の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする。
【００３１】
上記の構成を有する請求項１１に係る発明によれば、測定間隔と測定回数を変化させるという摂動（ＷＡＰ）を与えながら、牛等の哺乳動物の生乳を分光分析することで、前記牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液に含有される成分濃度を予測し測定することができ、牛等の生態情報を容易に取得可能なモデルを構築することができる。
【００３２】
請求項１２に係る発明は、一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生体液から前記哺乳動物の生乳の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする。
【００３３】
上記の構成を有する請求項１２に係る発明によれば、測定間隔と測定回数を変化させるという摂動（ＷＡＰ）を与えながら、牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液を分光分析することで、前記牛等の哺乳動物の生乳に含有される成分濃度を予測し測定することができ、生乳の品質特性を容易に判定可能なモデルを構築することができる。
【００３４】
請求項１３に係る発明は、光路長を変化すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えると共に、７００ｎｍ〜１１００ｎｍの第一の波長領域と、１１００ｎｍ〜２４００ｎｍの第二の波長領域において、前記第１の波長領域のみの又は前記第１、第２の波長領域の分光分析を行うことで、生乳の複数の成分の濃度を測定することを特徴とする。
【００３５】
上記の構成を有する請求項１３に係る発明によれば、光路長を変更して分光分析することで、短波長領域の第一の波長領域においても、成分の濃度を測定可能な高精度のモデルを構築することができる。
【００３６】
請求項１４に係る発明は、１０Ｖの電圧を付加すると共に、５００〜１０００ｎｍの波長領域の光を少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析を行うことで、生乳中の脂肪濃度を測定することを特徴とする。
【００３７】
上記の構成を有する請求項１４に係る発明によれば、電圧を付加して電磁場を変化させるという摂動（ＷＡＰ）と、複数回連続照射するという摂動（ＷＡＰ）を与えることで牛乳中の脂肪濃度を高精度に測定可能なモデルを構築することができる。
【００３８】
請求項１５に係る発明は、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を発生させるための近赤外光発生手段と、前記近赤外光発生手段からの可視光及び／又は近赤外光を試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段を備える可視光・近赤外分光分析装置において、前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を設けると共に、前記データ処理手段が、前記摂動を与えて得られる応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行うことを特徴とする。
【００３９】
上記の構成を有する請求項１５に係る発明によれば、摂動を与えることで応答スペクトルに変化を生じさせると共に、前記応答スペクトルの変遷を捉えて解析する装置とすることで、従来検出不可能であった成分の判別が可能となる。また、濃度や粒子の大きさ等の各成分の特性を測定することができる。
【００４０】
請求項１６に係る発明は、前記摂動手段が、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させる手段であって、照射時間と照射回数を設定可能な照射制御装置を備えていることを特徴とする。
【００４１】
上記の構成を有する請求項１６に係る発明によれば、水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えながら試料検体の各成分に応じて変化する所定の水分子のスペクトルを含むスペクトルパターンの応答の変化を測定して分光分析を行い多変量解析を行うことができるので、微小な変化を積極的に生じさせると共に、前記微小な変化を解析して捉えることができる。そのために、従来の方法では判別困難なものを判別し、超低濃度成分の検出を可能とし、成分の特性をリアルタイムに測定可能な可視光・近赤外分光分析装置となる。
【００４２】
請求項１７に係る発明は、前記摂動付与手段が、付加電磁力調整、光路長変更、温度変更が可能な手段の少なくとも一つを備えていると共に、前記光学手段と前記検知手段とを同時にまたは別々に備えるプローブから光の照射と受光を行いデータ処理を行うよう、前記摂動付与手段による摂動の付与と、光の照射と受光の作動タイミングを制御する制御手段を備えていることを特徴とする。
【００４３】
上記の構成を有する請求項１７に係る発明によれば、測定する試料検体の種類や特性に応じた条件を選択することで所定の摂動（ＷＡＰ）を与えて、これまで判別困難であった成分の判別や、超低濃度成分の検出が可能な可視光・近赤外分光分析装置を得ることができる。
【００４４】
請求項１８に係る発明は、前記データ処理手段が、応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行い、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化を捉えて解析する手段であることを特徴とする。
【００４５】
上記の構成を有する請求項１８に係る発明によれば、所定の摂動（ＷＡＰ）を与えることで、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化程度を直接的にまたリアルタイムに得ることができる可視光・近赤外分光分析装置とすることができる。
【００４６】
請求項１９に係る発明は、試料検体収容部と該収容部に収容された試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を備えると共に、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光であって、試料検体に応じて予め選定された特定波長領域の光を前記試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペク
トルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段と、測定結果を表示する表示手段を備える可視光・近赤外分光分析装置であることを特徴とする。
【００４７】
上記の構成を有する請求項１９に係る発明によれば、摂動（ＷＡＰ）を付与してスペクト測定することで得られる近赤外領域の応答スペクトルから、試料検体の特定成分を測定可能な可視光・近赤外分光分析装置とすることができる。
【００４８】
請求項２０に係る発明は、請求項６から１５のいずれかに記載の可視光・近赤外分光分析方法を実施するための可視光・近赤外分光分析装置であって、それぞれの試料検体を測定するのに適した特有の波長（Important wavelengths）領域を予め設定していることを特徴とする。
【００４９】
上記の構成を有する請求項２０に係る発明によれば、それぞれの試料検体を測定するのに適した特有の波長（Important wavelengths）領域の分光分析を行うことで、簡易に特定の試料検体の測定をすることができる。
【発明の効果】
【００５０】
本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法及びその装置によれば、試料検体に所定の条件を付加することで、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えながら、前記試料検体の各成分に応じて変化する所定の水分子のスペクトルを含むスペクトルパターンの応答の変化を測定して分光分析を行いスペクトル解析もしくは多変量解析を行うので、スペクトルのグラフからは判別できない応答の変化を捉えることができ、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、また超低濃度成分の検出を可能とし、さらに成分の特性や、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化をリアルタイムに測定可能となる可視光・近赤外分光分析方法及びその装置を得ることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５１】
以下、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法及びその装置の実施の形態について、図１から図３１に基づいて説明する。
【００５２】
本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法は、市販の分光分析器（例えば、ニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500）を用いて、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の領域の連続波長光（可視光及び／又は近赤外光）を照射して得られる透過反射光のスペクトルを解析することで行う。
【００５３】
スペクトルの解析とは、検出されたスペクトルを吸収スペクトルに変換するために、光反射率の逆数を対数変換し、得られたスペクトル中のピークを分光学的手法により要素ピークに分解し、該要素ピークを多変量解析し、帰属バンドを求めて、モデルを構築することである。
【００５４】
近赤外光を試料検体（液状試料）に照射すると、対象物に含まれる各種分子により特定の波長のみが吸収される。そして、分子構造（分子の種類）により吸収される光の波長が異なる。液状試料のように水分子が含まれるものでは、水分子に特有の波長領域帯にて複雑な吸光現象が起こる。また、水分子と被検体中の注目成分との相互作用で水分子の要素ピークがシフトする。
【００５５】
つまり、光を照射すると、特定分子が特定波長の光を吸収し、エネルギー準位が遷移する。また、前記エネルギー準位の遷移は分子間の相互作用や水分子と注目成分との相互作用や水素結合状態等により特定の波長領域でのスペクトルパターンが変化する。
【００５６】
分子のエネルギーとは振動エネルギーであり、エネルギー準位が遷移するとは、基底振動状態から第一励起振動状態に遷移することである。また、この遷移を基本音という。さらに、第二・第三励起振動状態に遷移することを倍音遷移と称する。また、二つ以上の基準振動が励起される遷移を結合音という。
【００５７】
近赤外光の波長領域においては、水素を含む官能基（例えばＯＨ）に帰属されるバンドが多く、その倍音や結合音も現れる。つまり、試料検体に近赤外光を照射することで、特定の波長領域に基本音や倍音や結合音に対応した変化が生じることになる。
【００５８】
上記したように、近赤外光を用いた分光分析方法においては、得られるスペクトルデータには多数の倍音や結合音のデータが重なって現れることになる。また、これらの倍音や結合音の強度は弱く、さらに、基本音→第一倍音→第二倍音、と進むに連れて強度が段階的に弱くなる。
【００５９】
そのために、従来の近赤外光を用いた分光分析方法においては、多くの情報量を有するけれども、弱いバンドが複雑に重なり合ったスペクトル解析を行う必要があり、正確な測定を行うことは困難であった。
【００６０】
しかし、試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更である、段階的値の濃度変更、光の繰り返し照射、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度、ｐＨ、圧力等の所定の条件を積極的に付加しながら摂動を与えることで、特定の波長領域に、後に算出可能なスペクトルパターンの変化（データ上からは視認不可能であるが）を生じさせることができた。つまり、所定の条件を積極的に付加しながら分光分析を行うことで、被検体成分特有のスペクトルパターンを動的に変化させて明確に発現し、得られるスペクトルデータを多変量解析することで、各試料の成分に応じた応答の変化を検出することができ、特定成分を判別あるいは測定可能となった。
【００６１】
上記したように、得られたスペクトルの検出吸光度（光の吸収される度合い）を波長ごとにプロットすることにより近赤外吸収スペクトルが得られる。また、この近赤外吸収スペクトルを用いて定量分析 を行うには、目的特性の値（濃度或いは特性値）とスペクトルデータとを関係づける関係式（検量線）が必要となる。通常検量線は、目的特性値が既知な試料のスペクトルを計測し、そのスペクトルデータを、オートスケール、スムージング処理、一次微分処理等の前処理を行った後で、部分二乗回帰分析（ＰＬＳ）により演算して得ることができる。さらに、クロスバリデーションにより検証を行いながら高精度なモデルを構築することができる。また、主成分分析（ＰＣＡ）により成分の判別を行うと共に、得られた各モデル間の距離をＳＩＭＣＡ法にて検定することができる。
【００６２】
上記の前処理や多変量解析等のデータ解析には、Pirouette3.02（ＧＬサイエンス社製）のデータ処理ソフトを使用した。
【００６３】
近赤外分光分析ではエネルギーレベルが弱いので同一物質に繰り返し照射しても損傷を与えず、所定の条件を加えながら（摂動を付与して）分光分析を行うことができる。また、前記摂動を与えながらスペクトル測定を行うことで、応答スペクトルが動的に変化していることが判った。そのために、動的に変化する応答スペクトルをスペクトル解析あるいは多変量解析することで、微小な応答スペクトルの変遷を検知することができ、今まで検知不能であった成分の判別や成分の特性が検知できるようになった。
【００６４】
本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法の流れの概略を図１に示す。既知の試料１に所定の条件を付加することで摂動を与えながら、スペクトル測定を行う。得られたスペク
トルをデータ変換・データ解析を行い、吸収バンドの強度の違いを検証しながら所定の試料の帰属バンドを求めてモデルを構築するものである。また、新たな試料２に同様な摂動を与えながらスペクトル測定を行い、前記モデルと比較することで、モデルの実証性を評価する流れである。
【００６５】
また、図２には、本発明方法の特徴部分を示している。図に示すように、本発明方法では、試料検体に濃度変更等の所定の条件を付与して摂動を与えながら複数回のスペクトル測定を行うことを特徴としている。また、少なくとも３回の照射データから応答スペクトルのパターンを求めて、照射の度に生じる、水分子と注目成分との相互作用による特定の波長領域の変化を捉えて前記応答スペクトルのパターンの変遷を捉えることができる。そのために、今まで検知不能であった成分の判別が可能となる定性モデルの作成や、成分の特性が検知可能となる定量モデルの作成を行うことができ、これらのモデルにより試料検体の成分の情報を得ることができる。
【００６６】
図３は本発明装置の特徴部分を示す概略説明図であって、近赤外発生手段１１からの可視光及び／又は近赤外光を試料検体Ｓ１に照射する光学手段１２Ａと、前記試料検体Ｓ１からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段１２Ｂを備えるプローブ１２を有する可視光・近赤外分光分析装置１０が示されている。また、前記装置１０には前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段１５と、温度やｐＨ等の環境条件を調整する試料検体環境調整手段１４と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段１３と、前記摂動付与手段１５による摂動の付与と、光の照射と受光の作動タイミングを制御する制御手段１６が配設されている。
【００６７】
前記データ処理手段１３は、得られる応答スペクトルを多変量解析して、ＰＬＳ法及び／又はクロスバリデーション法を用いて成分の特性を数値化する定量的解析、もしくは、ＰＣＡ法及び／又はＳＩＭＣＡ法を用いてクラス判別を行う定性的解析を行い、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とすべく構築されたモデルを使用する構成とされている。そのために、可視光・近赤外分光分析装置１０により、試料検体Ｓ１の成分の判別が可能で、成分の特性の測定が可能となる。
【００６８】
分光分析を行う際には、前述した分光分析器を用いて波長領域４００ｎｍ〜２５００ｎｍを波長分解能２ｎｍで走査する構成としているので、１走査で１０５１個のデータを取り込むことができる。また、連続的に３回走査すると３１５３個のデータが得られると共に、それらをデータ処理すると、水分子の所定の要素ピークに各成分との相互作用によるシフトが各種の波長域に現れていることが判る。
【００６９】
図４に水分子の吸収バンドの強度変化を示すが、これは１５分毎に６時間４００ｎｍ〜２５００ｎｍの連続波長光を水のみの試料検体に照射した際に、強度変化を生じるつまりシフトが生じる波長領域を示している。つまり、黒く塗りつぶした部分のバンドにて応答（response）が生じていることが判る。
【００７０】
また、前述した倍音や結合音に対応したシフトが生じ易い水分子に特有の波長領域帯として図５に６００〜８５０ｎｍの水の吸収バンドの強度変化（変化が同時に生じるSynchronousなもの）を等高線状に示している。さらに、図６にはその時に特徴的なスペクトルピーク（正の相関で生じるピークと負の相関で生じるピーク）を示している。つまり、６０６ｎｍの波長でのピークに対しては、６４０ｎｍ、７３８ｎｍの波長領域で同時に正の相関でピークが生じ、８０８ｎｍの波長領域で負の相関でピークが生じていることを示している。
【００７１】
また、同時に変化が生じるのではなく、特定の波長のスペクトル変化に対して追随して
生じるAsynchronousな変化も生じていることが判っている。このように水の情報を多く含む特定の波長領域において、それぞれのスペクトルが関連しあって複雑に変化している様子が理解できる。
【００７２】
そのために、特定の試料検体を分光分析する際に生じる水分子の所定の要素ピークの応答（response）は、前記試料検体の成分に応じて特定の波長領域において変化が生じていることになる。また、この変化の程度は、得られるスペクトルデータからは判別されず、多変量解析によるデータ処理を行って初めて確認される。
【００７３】
さらに、試料の成分濃度を段階的値に変化させて走査しても、光路長を変化して走査しても、温度やｐＨ等の外的条件を付加して走査しても、一回目と二回目、あるいは二回目と三回目とでその応答が僅かに変化しており、各試料成分に応じた水分子の所定の要素ピークに応答（response）の変化が生じていることが判る。
【００７４】
そのために前記摂動は、時間間隔をおいて複数回照射してスペクトル測定を行うことで、応答スペクトルに動的な変化を生じさせる条件の変更であって、本発明者は、この摂動を、ＷＡＰＯＴ（Water Activating Perturbation Over the Time）と称している。
【００７５】
つまり、試料検体に濃度変更、光の繰り返し照射、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更等の物理的または化学的な変化を与える所定の条件を付加して、水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えながら走査することで、各試料の成分に応じた応答（水分子の所定の要素ピークを含むスペクトルパターンの変動）を検知可能であることが明らかとなった。
【００７６】
以下に各試料の測定結果について説明する。
【実施例１】
【００７７】
実施例１は、試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別とそれぞれの濃度を測定した例であって、緩衝液ＢＰＷ（Buffer peptone water）中にそれぞれのバクテリアを混入した試料検体を作成し、石英セル１ｍｍに前記試料検体を注入して、それぞれの基準濃度ＣＦＵ（コロニーフォーミングユニット）を１０-1倍から１０-10倍まで１０倍毎に予め濃度変更して準備したサンプルに、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を３回連続して繰り返し照射し分光分析を行い、２ｎｍ間隔の測定を行った例である。
【００７８】
また、それぞれのバクテリアを判別する際には、試料検体として、前記緩衝液に替えて、牛乳中にそれぞれのバクテリアを混入した試料検体を採用してもよい。また、シャーレに培養したバクテリアをそのまま測定することも可能である。
【００７９】
この時に使用した分光分析器はニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500であり、測定温度は３７℃の一定温度とした。
【００８０】
図７には測定された吸収スペクトルを示しているが、網掛け部はノイズとしてデータから除去した部分を示している。この得られたデータを、Pirouette3.02（ＧＬサイエンス社製）のデータ処理ソフトを用いて、オートスケール、スムージング処理、一次微分処理の各種の前処理、及び変換を行った後で、ＰＬＳとクロスバリデーション解析によりそれぞれのバクテリアの濃度を測定するモデルを作成し検証を行う。また、主成分分析（ＰＣＡ）とＳＩＭＣＡ解析によりそれぞれの試料検体中のバクテリアの判別を行う。
【００８１】
ここで、図８にはＰＬＳ解析の結果得られたＣＮＳの濃度の回帰ベクトルを示し、図９
にはＣＰＳの濃度の回帰ベクトルを示している。この時に、得られる応答スペクトルが変遷する重要な波長（Important wavelengths）はそれぞれ、ＣＮＳの場合は、１４０６−１５００ｎｍ、１１８０ｎｍ、１３０６ｎｍであり、ＣＰＳの場合は、７４０ｎｍ、７７０ｎｍ、８０８ｎｍ，１１５６−１１９８ｎｍ、１４６６ｎｍ，１４７６ｎｍ、１６５０ｎｍ、１６８６ｎｍ、１７０４ｎｍ、１７２０ｎｍ、１７５０ｎｍ、１８４６ｎｍ、１８９０ｎｍであった。さらに、図１０にＣＮＳの濃度の検量線を示し、図１１にはＣＰＳの濃度の検量線を示している。
【００８２】
上記検量線を示す図は、測定値（既知の試料検体を薄めた従来方法による測定値）をＸ軸（横軸）とし、多変量解析して構築されるモデルから得られる予想値をＹ軸（縦軸）とした図である。
【００８３】
ここで、図１０に示すＣＮ＾６−２とは、ＣＮＳの濃度を１０-1倍から１０-10倍まで１０段階に希釈した時の６段階目の試料検体の２回目の走査データであることを示している。同様に図１１に示すＣＰ＾６−３とは、ＣＰＳの濃度が１０段階に希釈した時の６段階目の試料検体の３回目の走査データであることを示している。
【００８４】
図１０の横軸の数値はＣＮＳ濃度の自然対数目盛りであって、例えば１．１２×１０8ＣＦＵ／ｍｌ濃度のＣＮＳ原液を基準試料として用いて、この濃度を１０倍ずつ１０段階に希釈したサンプルで測定した結果を示している。すなわち、Ｉｎ（１．１２×１０8）＝１８．５３が基準濃度（図中のCNgen-2etc.）であり、これを初めに１０倍希釈したものは、ＣＰ＾１０＝Ｉｎ（１．１２×１０7）＝１６．２３となる。さらにもう１０倍希釈したものは、ＣＰ＾９＝Ｉｎ（１．１２×１０6）＝１３．９３となる。
【００８５】
図１１には、１．０５×１０8ＣＦＵ／ｍｌ濃度のＣＰＳを基準試料として用いて、この濃度を１０倍ずつ１０段階に希釈したサンプルを測定した結果を示している。図１０および図１１から判るように、ＣＮＳとＣＰＳとをその濃度が１０-1倍から１０-10倍までの範囲で測定可能な検量線を得ることが可能であり、特に人体に有害なバクテリアであるＣＰＳを、その濃度が１．０５×１０8ＣＦＵ／ｍｌの１０-10倍まで希釈した超低濃度の試料でも確実に測定できることができる。
【００８６】
さらに、図１２にはクロスバリデーションの解析結果を示しており、バリデーション誤差ＳＥＶとバリデーションの相関ｒＶａｌ等の結果を表示している。この結果から、例えばＣＰＳの検量線においては、Factor6の累積寄与率（cumulative）は９７．５６０９１％であり、その時のバリデーション誤差ＳＥＶが３．０９６２１８であることを示している。また、その時の相関係数ｒＶａｌ＝０．９４４９２６となり、精度の高い検量線が得られた。
【００８７】
また、ＣＮＳとＣＰＳとを混入した混合液の濃度を段階的値にまで希釈したサンプルを用いて前記ＣＮＳとＣＰＳとの判別を行った。各サンプルに対して３回測定したスペクトルのうち、２，３回目の測定データを用いて使用波長領域からノイズをカットしたサンプル群において主成分分析（ＰＣＡ）を行い、前記ＰＣＡにより得られた第１主成分（Factor1）、第３主成分（Factor3）、第５主成分（Factor5）に基づく３次元プロットを図１３に示している。この図から判るように、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法によれば、境界Ｌ１を境にＣＮＳとＣＰＳのクラスターを明確に分離することができる。つまり、従来困難であったＣＮＳとＣＰＳとの判別が、本実施例に係る可視光・近赤外分光分析方法により容易に判別することができる。
【００８８】
図１４（ａ）には各前処理や変換処理を変更した際のＳＩＭＣＡ解析の結果を示している。それぞれの測定条件Ａ１〜Ａ６に示している、水、ＢＰＷ、希釈サンプル、ノイズ除
外、３回とは、それぞれ、水分子のスペクトルを除去、緩衝液ＢＰＷを使用、予め濃度を所定の段階的値にまで希釈して準備したサンプルを使用、ノイズ除去処理、３回連続照射であることを示している。
【００８９】
また、Autoscaleとはオートスケール処理のことであり、smooth(15)とは１５ｎｍ毎にスムージング処理したことであり、1st Derivative(25)とは２５ｎｍ毎に一次微分処理したことをそれぞれ示している。
【００９０】
つまり、測定条件Ａ６に示す、水分子のスペクトルを除去、緩衝液ＢＰＷを使用、予め段階的値に希釈して準備したサンプルを使用、ノイズ除去処理、３回連続照射の測定条件において、オートスケ−ル、スムージング処理（１５ｎｍ毎に）、一次微分（２５ｎｍ毎に）のデータ処理を行いＳＩＭＣＡ解析した場合にＣＮＳとＣＰＳとのクラス間距離が４．２５４であることがわかる。
【００９１】
また、Ａ４とＡ８とを比較すると、この相違点は予め希釈しているかどうかであり、Ａ４でのクラス間距離１．１５６であったものが、予め希釈して準備された希釈サンプルを用いることで、クラス間距離４．１３２となっており、識別力が向上している。濃度の希釈にはこのように、予め所定濃度の原液に所定量の水や緩衝液を付加して所定の段階的値の濃度サンプルを準備しておく希釈法（以後、置注ぎ希釈と称する）と、所定濃度の原液をサンプルとして測定し、測定終了後に新たな水や緩衝液を追加して濃度を薄くしていく希釈法（以後、注足し希釈と称する）とがあるが、本実施例においては、予め極端に薄い濃度まで希釈した置注ぎ希釈サンプルを用いることで、バクテリアの判別が可能となることが判った。さらに、Ａ８とＡ６とを比較すると、この相違点は１回照射か３回照射かであり、３回照射であるＡ６でのクラス間距離が上記したように４．２５４と識別力が向上していることが判る。
【００９２】
一般に前記クラス間距離が３以上であればクラス判別が有意とされており、上記で得られたクラス間距離が４．２５４なので、ＣＮＳとＣＰＳを十分に判別可能なＳＩＭＣＡモデルが得られたことが判る。
【００９３】
また、図１４（ｂ）にはＳＩＭＣＡを使った判別結果を示しており、例えばＣＮＳでは３４回全て判別成功であり、ＣＮＳでないと誤判別した例は０回であった。またＣＰＳでは３６回全て判別成功であり、ＣＰＳでないと誤判別した例は０回であり、判別誤差が生じていないことを示している。
【００９４】
上記したように、摂動（ＷＡＰ）として、試料濃度の１０-1倍から１０-10倍までの広範囲な段階的希釈（置注ぎ希釈）と、３回繰り返し照射という条件の変化を与えながらの分光分析により、試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別と濃度測定を行う高精度なモデルを構築することが可能となった。
【００９５】
そのために、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法により、判別が困難で人体に有害なバクテリアを確実に判別することができ、従来の培養法によれば４８時間程度のバクテリア培養時間が必要であったものが、本発明によれば、培養する必要もなくリアルタイムに測定することができるという効果が得られる。
【実施例２】
【００９６】
実施例２は、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）の判別を行なった例であって、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光により分光分析を行うと共に、光を１５分毎に６時間繰り返し照射し
て分光分析を行い、ＰＣＡ法とＳＩＭＣＡ法により多変量解析を行ったものである。
【００９７】
また、プリオン蛋白質ＰｒＰのみの試料と分子構造内に銅を含有する試料ＰｒＰ（Ｃｕ）と分子構造内にマンガンを含有する試料ＰｒＰ（Ｍｎ）とをそれぞれ準備し、さらに、それぞれの濃度を、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌと予め変更して準備した複数の希釈サンプル（置注ぎ希釈）のプリオン水溶液をそれぞれ分光分析した。
【００９８】
得られたスペクトルをＰＣＡ法（主成分分析）により多変量解析を行い、その時に得られた第１主成分（Factor1）、第３主成分（Factor3）、第５主成分（Factor5）による判別結果およびローディングを図１５に示す。
【００９９】
図１５（ａ）は第１主成分（Factor1）と第３主成分（Factor3）によるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）との判別結果であり、図１５（ｂ）は第３主成分（Factor3）と第５主成分（Factor5）によるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）との判別結果を示している。また、図１５（ｃ）はそれぞれの主成分のローディングを示している。
【０１００】
図１５（ａ）からＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）とが明確に判別されていることが明らかである。ただ、図中に示すＰｒＰ１が破線で囲むＰｒＰグループから離れており、Ｃｕ１がＰｒＰ（Ｃｕ）グループから離れており、Ｍｎ１がＰｒＰ（Ｍｎ）グループから離れていることが判る。前記ＰｒＰ１、Ｃｕ１、Ｍｎ１とはそれぞれ一回目の照射時のデータであって、一回だけでは正確な判別を行うことができず、摂動（ＷＡＰ）を与えながら繰り返し測定することで、グループ判別が可能となるモデルが得られることを示している。
【０１０１】
図１５（ａ）（ｂ）から明らかなように、摂動（ＷＡＰ）として、試料濃度の段階的な希釈と、光を１５分毎に繰り返し照射という条件変化を与えながら分光分析を行うと、プリオン蛋白質ＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）との判別が可能となるモデルを得ることができる。
【０１０２】
図１５（ｃ）から判るように、第１主成分（Factor1）を構成するファクターとしては
第１主成分（Factor1）のローディングを示すラインＰＣ１により１４６６ｎｍの波長光の寄与が大きく、第３主成分（Factor3）のローディングを示すラインＰＣ３により１３４０ｎｍ、１４２４ｎｍの波長光の寄与が大きく、第５主成分（Factor5）のローディングを示すラインＰＣ５により１３６４ｎｍ，１３９４ｎｍ、１４７６ｎｍの波長光の寄与が大きいことが判る。
【０１０３】
また、ＳＩＭＣＡ解析を行い、各クラス間の距離を算出した結果を図１６に示す。この図から、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）と距離が２８．８１であり、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰとの距離が４．１５であることが判る。前に説明したようにこの距離が３以上であれば、クラス判別が有意であるので、本方法によりプリオン蛋白質を明確に判別することが可能となる。
【０１０４】
つまり、光を時間間隔を空けて（１５分毎に）繰り返し照射する摂動（ＷＡＰ）を与えながら分光分析を行うことで、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）などの金属分子を含有した蛋白を検出可能となり、プリオン蛋白質ＰｒＰと、狂牛病に関係あると見られているプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）とを確実に判定可能なモデルを得ることができる。
【０１０５】
また、別のサンプルを用いて１５分毎に６時間繰り返し２６回照射した時の各測定時においてＳＩＭＣＡ処理を行い、得られるクラス間距離の変化を計測して得られた結果を図
１７に示す。この図から判るように、ある回数までの照射回数の増加に応じてクラス間距離が大きくなっている。つまり、判別力が大きくなっていることが判る。
【０１０６】
例えばＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）とのクラス間距離は、３回照射では５．６であったものが、２０回照射で２５．８まで増加している。しかし、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰとのクラス間距離は１１回照射で最大となっており違ったパターンとなっている。つまり、特定の成分を判別する最適な照射回数（摂動付与の条件）があることが判る。
【０１０７】
上記のように、似た構造のプリオン蛋白質であっても、成分の違いにより、摂動を付与された際の応答に変化が生じていることが判る。つまり、生体高分子の構造又は機能の違いやその変化により、摂動を付与した際の応答に変化が生じている。そのために、前記応答の変化を捉えることで生体高分子の構造や機能を検知することが可能となる。
【０１０８】
さらに、図１８に、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと、金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）と、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加したＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）との判別を行った時の各サンプル濃度によるクラス間距離の測定結果を示す。それそれ、サンプル濃度を１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ所定量の原液と緩衝液を調合して複数のサンプル（置注ぎ希釈サンプル）を用意して、それぞれのクラス間距離を計測した。
【０１０９】
例えば、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰとのクラス間距離は、検体濃度が１ｍｇ／ｍｌの時には０．８６１５９５であり、濃度が０．５ｍｇ／ｍｌでは２．４３４４３３であり、濃度が０．１ｍｇ／ｍｌでは２．６７４９９４であり、濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌでは７．８６２９９９となっている。前述したように、このクラス間距離が３以上であれば、クラス判別が有意とされているので、検体濃度を薄くすると計測されるクラス間距離が大きくなり判定可能となる。
【０１１０】
上記の実験結果により、本分光分析方法によれば、置注ぎ希釈により検体濃度を広範囲に薄くしていくと、成分の判別力が向上していることが明らかである。
【実施例３】
【０１１１】
実施例３は、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）としての銅を含有する試料検体ＰｒＰ（Ｃｕ）の判別を、光路長を変更（１ｍｍと４ｍｍ）して行った例であって、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光により分光分析を行うと共に、光を６時間毎に４８時間繰り返して分光分析を行い、ＰＣＡ法とＳＩＭＣＡ法により多変量解析を行ったものである。また、この時に、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加したＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）の測定を行い、測定結果にどのような影響を及ぼすかを検討した。
【０１１２】
図１９には、得られた第３主成分（Factor３）と第９主成分（Factor９）のローディングを示し、図２０（ａ）にはＳＩＭＣＡによる解析結果を示し、図２０（ｂ）にはＳＩＭＣＡによるクラス間距離を示し、図２０（ｃ）には判別結果を示している。
【０１１３】
図２０（ａ）により、光路長を変更して測定した時に、ＰｒＰおよびＰｒＰ（Ｃｕ）はそのクラス分けが明確に判別できることが判った。また、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）とを混同することなく分別できることも判る。また、図２０（ｂ）より、ＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）とのクラス間距離は２４．８４であり、明確に判別されることが判る。ＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とのクラス間距離は１．１９と小さいが、図２０（ｃ）に示す判別の結果、誤判別が０であり、問題ないことが判る。
【０１１４】
上記のように、プリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）の判別は、光路長を変更して分光分析することで可能であることが判る。しかし、図２０（ａ）からは、ＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）の測定は、光路長を変更しても差が見られない。つまり、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加しただけの試料検体では、光路長を変更して分光分析を行っても、応答スペクトルにパターンの変化が生じず、水分子と注目成分との間に相互作用が生じていないことが判る。このことは逆に、本実施例に係る可視光・近赤外分光分析方法によれば、金属成分をその分子構造内に含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）の判別が可能となり有効といえる。
【０１１５】
このように、光路長を変更（１ｍｍと４ｍｍ）するという摂動を与えることでも、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（metal）との判別を行うことができる。
【実施例４】
【０１１６】
実施例４は、金属成分を含まないプリオン蛋白質ＰｒＰと、金属成分を含むプリオン蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）と、ＰｒＰ水溶液中に金属成分Ｃｕを添加したＰｒＰｉｎＷ（Ｃｕ）との判別を、温度を変更（２１℃、３０℃、３５℃、３７℃）すると共に、それぞれの濃度を、１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．１ｍｇ／ｍｌ、０．０５ｍｇ／ｍｌと予め変更して準備した複数の希釈サンプル（置注ぎ希釈）のプリオン水溶液をそれぞれ分光分析した例である。
【０１１７】
それぞれの試料検体の前記４段階の濃度サンプルを、それぞれ温度を４段階に変更して分光分析を行い、スペクトルデータを得た。つまり、それぞれの所定濃度サンプルについてそれぞれ４個のスペクトルデータが得られる。つまり、温度を摂動として応答に変化を与えた際に得られる４個のスペクトルデータを主成分分析して、それぞれの濃度段階における試料検体のＳＩＭＣＡ距離を求めた。
【０１１８】
図２１に、得られたＳＩＭＣＡ距離を立体的にグラフ表示している。この図から明らかなように、全ての試料検体において、検体濃度が０．０５ｍｇ／ｍｌと最も低い時に、ＳＩＭＣＡ距離が最大となっている。また、いずれもそのＳＩＭＣＡ距離は５以上であり、明確にクラス判別が行なわれていることが判る。
【０１１９】
また、それぞれの検体成分によりそのＳＩＭＣＡ距離のパターンが変化していることも明らかである。つまり、温度変更という摂動を与えた時の応答に、それぞれの検体成分に応じて変化が生じており、前記検体成分の構造及び機能の違いにより差が生じていることを示している。このように、試料検体の温度を変更することも、被検体成分特有の応答スペクトルのパターンを動的に変化させる摂動となる。
【実施例５】
【０１２０】
実施例５は、試料検体中の抗原濃度を測定した例であって、抗体としてAnti-bisphenol
A scFvを用い、抗原としてBisphenolAを用いて、緩衝液（ＰＢＳバッファー）中にそれぞれの濃度を段階的に希釈した希釈サンプルを試料検体として、光路長１ｍｍの石英セルに注入し、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を３回連続繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１２１】
前記抗体のサンプル濃度は１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌの４段階であった。また、前記抗原の濃度は、１ｐｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌまでの６段階のサンプルを使用した。また、それぞれを混ぜ合わせた混合サンプルとして１６種を各２個の計３２サンプルと、それぞれの単独サンプル（１０種２２サンプル）及び水のみ（１サンプル）、緩衝液のみ（３サンプル）の合計５８サンプルの分光分析を行
った。
【０１２２】
得られたスペクトルデータをノイズ処理、スムージング処理、オートスケール処理を行い、ＰＬＳとクロスバリデーション解析を行った。
【０１２３】
解析結果を図２２に示す。図２２（ａ）は検量線であり、横軸Measured Yが従来法による測定値を示し、縦軸Pred Calが本発明による可視光・近赤外分光分析方法により得られた予測値を示している。この結果から、抗原の濃度が１ｐｐｔ（１兆分の１）の濃度まで測定可能であることが判った。
【０１２４】
またクロスバリデーション解析により得られるバリデーション誤差ＳＥＶを図２２（ｂ）に示しているが、１回の照射によるFactor5の累積寄与率（cumulative）は９９．９４１８８％であり、その時のバリデーション誤差ＳＥＶが３．５５８６０７であることを示している。しかし、３回繰り返し照射によるFactor9の累進寄与率が９９．９４５６７％の場合に、バリデーション誤差ＳＥＶが１．００８７８５であることを示している。
【０１２５】
つまり、複数回（３回）連続繰り返し照射による摂動（ＷＡＰ）を与えながらの分光分析により、バリデーション誤差ＳＥＶが三分の一となって、従来の３倍の精度で試料検体中の抗原濃度を測定可能となることが判った。
【０１２６】
また、図２２（ｃ）にはＳＩＭＣＡ処理して得られるクラス間距離を示している。これから判るように、１回照射では８．６５であったものが、２回までの照射（１＆２）で９．７９となり、３回までの繰り返し照射（１＆２＆３）では１０．１１まで向上していることが判る。つまり、複数回繰り返し照射することで、抗原の成分判別を精度よく行うことができる。
【実施例６】
【０１２７】
実施例６は、試料検体中に溶解した粒子の溶解前の粒子径を測定する例として、溶解前のコーヒー粒子径を測定した実施例であって、ミキサーによってインスタントコーヒーを粉砕する際に、０秒、２０秒、６０秒、９０秒とその粉砕時間を延長して、コーヒーの粒子径を段階的に粉砕して細かくしていったサンプルを用いると共に、それぞれの濃度を４％、３％、２％、１％と段階的に変更したサンプルを光路長１ｍｍの石英セルに注入し、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長範囲の光を３回連続繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１２８】
得られたスペクトルデータをノイズ処理、スムージング処理（１７ポイント、３４ｎｍ毎）、オートスケール処理を行い、前述したＰＬＳ法とクロスバリデーション解析を行い、回帰モデルを構築した。
【０１２９】
解析結果を図２３に示す。図２３（ａ）は横軸Measured Yが従来法による測定値を示し、縦軸Pred Calが本発明による可視光・近赤外分光分析方法により得られた予測値を示している。前記測定値Ｙは実際にコーヒー粒子の径を測定したものではなく、粉砕時間の対数表示としている。これは粉砕時間が長いと粒子径が小さくなると見なしたものである。この結果から、本発明によれば、溶解前のコーヒー粒子径を推測できるモデルが得られることが判った。
【０１３０】
またクロスバリデーション解析により得られるバリデーション誤差ＳＥＶを図２３（ｂ）に示しているが、１回の照射によるFactor5の累積寄与率（cumulative）は９８．３１８４９％であり、その時のバリデーション誤差ＳＥＶが０．９３７０３９であることを示している。しかし、３回繰り返し照射によるFactor6の累進寄与率が９９．８９０４％の
場合に、バリデーション誤差ＳＥＶが０．４６６６７５であることを示している。
【０１３１】
つまり、３回連続繰り返し照射による摂動（ＷＡＰ）を与えながらの分光分析により１回のみの照射による分光分析と比較して２倍の精度で溶解前のコーヒー粒子径を測定可能となることが判った。
【０１３２】
また、検体濃度を変更した時に、前述したクラス判別を行う定性的解析であるＳＩＭＣＡ解析により、溶解前の粒子径の違い、つまり、粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとの判別距離（SIMCA DISTANCE）がどのように変化するかを測定してみた。
【０１３３】
図２４（ａ）には、コーヒーの粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを判別した時のそれぞれの検体濃度毎に算出したＳＩＭＣＡ距離を示している。また、図２４（ｂ）には、砂糖（Sugar）の粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを判別した時のそれぞれの検体濃度毎に算出したＳＩＭＣＡ距離を示している。図２４（ｃ）には砂糖の粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のもののＰＬＳ解析とクロスバリデーション解析を行った時の回帰モデルの相関係数（Ｒｖ）とバリデーション誤差（ＳＥＶ）を示している。
【０１３４】
図２４（ａ）によれば、１〜４％のいずれの濃度においても、５以上のＳＩＭＣＡ距離となっており、本実施例に係る測定方法により、コーヒーの粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを十分判別可能であることを示している。また特に濃度１％と薄くした時には、ＳＩＭＣＡ距離が１５．９６と最大値となっており、判別力が最大であることを示している。
【０１３５】
図２４（ｂ）によれば、砂糖（Sugar）の粒状（Granule）のものと粉状（Powder）のものとを判別した時に、検体濃度が４％の時は、そのＳＩＭＣＡ距離が１．５９であり、値が小さく判別は困難であるが、濃度をその半分の２％以下とすると十分判別可能な程度の数値となっている。このように、測定する検体成分によって最適な検体濃度が異なっていることが判る。これは、すなわち、それぞれの検体成分により濃度変更という摂動を与えた時の応答に変化が生じており、前記検体成分の構造及び機能の違いにより差が生じていることを示している。
【０１３６】
また、図２４（ｃ）によれば、砂糖測定時の回帰モデルの相関係数が、粒状（Granule）のものでは０．９９５であり、粉状（Powder）のものでは０．９９９８となっており、非常に高い相関でその粒度を測定可能となる。
【０１３７】
上記のように、本実施例による可視光・近赤外分光分析方法により、コーヒーの粒子の大きさや砂糖粒子の大きさを高精度に判別することができる。
【実施例７】
【０１３８】
実施例７は、試料検体中の異なるバクテリアを判別した例であって、牛乳中のバクテリアStaphylococcus（msta）と、Streptococcus（mstr）をそれぞれ緩衝液（ＰＢＳバッファー）により段階的に希釈して、１０-1〜１０16（colony/ml）濃度とした７６サンプルを光路長１ｍｍの石英セルに注入し、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光をそれぞれ３回繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１３９】
得られたスペクトルデータから、前述したのと同様な解析方法である主成分分析（ＰＣＡ）とＳＩＭＣＡ解析を行った。
【０１４０】
解析結果を図２５に示す。図２５は第１主成分（Factor1）と第２主成分（Factor2）と
第３主成分（Factor3）でのmstaとmstrとの判別結果を表しており、バクテリアmsta群とバクテリアmstr群とが確実に判別されることを示している。
【０１４１】
上記したように、複数回（３回）連続繰り返し照射による摂動（ＷＡＰ）を与えながらの分光分析により、牛乳中のバクテリアmsta群とバクテリアmstr群とが確実に判別可能となることが判った。つまり、従来の培養法によれば、４８時間程度のバクテリア培養時間が必要であったものが、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法によれば、培養する必要もなく、異なるバクテリアをリアルタイムに判別することができるという効果が得られる。
【実施例８】
【０１４２】
実施例８は、牛等の哺乳動物の血漿や胃液や生乳の成分濃度を測定した例であって、牛の生体液を用いて、光路長１ｍｍの石英セルに注入した試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光により分光分析を行ったものである。測定は一日に２回（朝、夕各１回）の分光分析を三日連続して行った。さらに、その後３週間違う餌を与えた後で、同様に一日に２回（朝、夕各１回）の分光分析を三日連続して行い、その効果を確認したものである。
【０１４３】
上記の測定回数を朝夕各１回で三日連続としたが、一日に２回以上測定してもよく、また継続日数も三日以上としてもよいと思われる。このように測定間隔と測定回数を変化させて得られたスペクトルデータの前処理を行い、ＰＬＳ法とクロスバリデーション解析を行った。
【０１４４】
解析結果を図２６と図２７に示す。図２７（ａ）（ｂ）は牛の血漿（Blood Plasma）のスペクトルを計測することで、その牛の牛乳の成分濃度（Fat脂肪、Crude Protein粗蛋白質 、Caseinカゼイン 、True protein蛋白質 、MUN乳中尿素態窒素 、Lactose乳糖）を予測した結果であって、図２７（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルを計測することで、その牛の血漿の成分濃度（Albuminアルブミン、Glucoseグルコース、BUN血中尿素態窒素）を予測した結果である。
【０１４５】
また、図２７（ａ）（ｂ）は牛の胃液のスペクトルを計測することで、その牛の牛乳の成分濃度（Fat脂肪、Crude Protein粗蛋白質 、Caseinカゼイン 、True protein蛋白質 、MUN乳中尿素態窒素 、Lactose乳糖）を予測した結果であって、図２７（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルを計測することで、その牛の胃液の成分濃度（PHペーハー、NH3-Nアンモニア態窒素、C2脂肪酸、C3脂肪酸、C4脂肪酸）を予測した結果を示している。
【０１４６】
図２７（ｂ）から判るように、本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法により、牛の血漿のスペクトルを計測して高い相関にて生乳の成分濃度が予測可能となった。特にカゼインではその相関係数Ｒ＝０．９３８であり、この時の統計的有意ｐ＜０．００１であって、１０００回に１回以下の予測誤差となる。また、図２７（ｂ）に示す牛の胃液のスペクトルを計測することで、生乳中に含有されるカゼイン濃度をＲ＝０．９０２、ｐ＜０．００１にて予測できることが判る。
【０１４７】
このように、測定間隔と測定回数を変化させるという摂動（ＷＡＰ）を与えながら分光分析を行うことで、牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液から、前記牛等の哺乳動物の生乳に含有される成分濃度を予測し測定することができる。また、前記生乳から、前記牛等の哺乳動物の血漿や胃液等の生体液の成分濃度を測定することが可能となるので、乳牛等の生態情報を容易に得ることができる。
【実施例９】
【０１４８】
実施例９は、牛乳の複数の成分濃度を測定した例であって、光路長を変更して複数回の測定を行うという摂動を与えながら、石英セルに注入した試料検体に対して７００ｎｍ〜１１００ｎｍの第一の波長領域と、１１００ｎｍ〜２４００ｎｍの第二の波長領域の分光分析を行ったものである。
【０１４９】
近赤外光であっても短波長域、具体的には７００ｎｍ〜１１００ｎｍの領域の近赤外光であれば、長波長域よりも１０〜１００倍ほど透過力が大きく、短波長域の近赤外光を用いれば光路長を１〜２ｃｍ程度にすることができる。さらに、特殊な石英セルに替えて試験管等の安価な容器を使用することもできる。
【０１５０】
そのために、光路長がそれぞれ１ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍの石英セル／又は試験管に注入した試料検体を用いて、７００ｎｍ〜１１００ｎｍの短波長領域の分光分析を行うことができる。
【０１５１】
また、図２８（ａ）に示す幅１ｍｍの矩形試料検体注入部３Ａを備える石英セル３に試料検体を注入した後で、図２８（ｂ）に示す方向４，５に所定の光を照射することで、任意の光路長に設定することができる。この方法により同一試料検体の光路長を１ｍｍ、４ｍｍ、１０ｍｍと変化させて測定したところ、光路長が長くなる程ノイズが減り、高精度となることが判った。
【０１５２】
得られたスペクトルをＰＬＳ法とクロスバリデーションにより解析し得られたＳＥＣＶ（クロスバリデーション誤差）を図２９（ａ）（ｂ）（ｃ）に示す。
【０１５３】
図２９（ａ）にはＦＡＴ（牛乳中の脂肪濃度）を測定した時のＳＥＣＶであり、図２９（ｂ）にはＰＲＯＴＥＩＮ（牛乳中の蛋白質濃度）を測定した際のＳＥＣＶであり、図２９（ｃ）にはＬＡＣＴＯＳＥ（牛乳中の乳糖濃度）を測定した際のＳＥＣＶを示している。
【０１５４】
図２９（ａ）に示す脂肪分の測定結果から、光路長１ｍｍでは波長領域７００〜１１００ｎｍのＳＥＣＶが０．４５であるが、光路長４ｍｍおよび１０ｍｍで波長領域７００〜１１００ｎｍでのＳＥＣＶは０．２となるので、光路長を長くすることで短波長領域７００〜１１００ｎｍにおいても十分精度よく測定可能であることが確認される。
【０１５５】
また図２９（ｃ）に示す乳糖の測定結果からは、短波長領域７００〜１１００ｎｍと長波長領域１１００〜２４００ｎｍでのＳＥＣＶが共に０．０９であり、高精度の測定が短波長領域７００〜１１００ｎｍで測定可能であることを示している。
【０１５６】
上記したように短波長領域にて長い光路長にて、試料検体を測定可能となるので、ノイズの少ない、誤差の小さい判定を行うことができると共に、特殊な石英セルではなく、通常の試験管等により測定することもできる。
【０１５７】
また、光路長を変化させて多数のデータを測定することでさらに精度のよいモデルが得られることは明らかである。
【実施例１０】
【０１５８】
実施例１０は牛乳中の脂肪濃度を測定した例であって、試料検体を光路長１ｍｍの石英セルに注入し、摂動（ＷＡＰ）として１０Ｖの電圧を付加しながら、５００〜１０００ｎｍの波長領域の光を３回繰り返し照射して分光分析を行ったものである。
【０１５９】
電圧付加手段として牛乳の電気伝導度を測定するための装置であるMilk Checker（オリ
エンタルインスツルメント社製）を使用し、１０Ｖの電圧を付加しながら、クボタ社製の分光分析器を用いて５００ｎｍ〜１０００ｎｍの波長領域の光を３回連続繰り返し照射して分光分析を行った。また、分光分析器としてその他の分光分析器（例えば、ニレコ社製近赤外分光器NIRSystem6500）を用いてもよく、特に限定するものではない。
【０１６０】
その時に得られたスペクトルをＰＬＳ法とクロスバリデーションにより解析した例を図３０に示す。図３０（ａ）は解析された回帰ベクトルを示しており、図３０（ｂ）には解析結果を示している。
【０１６１】
図３０（ｂ）から、電圧を付加しない場合（Without EMF）にはFactor10のバリデーション相関（rVal）が０．９８であり、その時のバリデーション誤差（SEV）が０．２０４２６９であることを示している。
【０１６２】
また、電圧を付加した後（After Applying EMF）では、Factor9でそれぞれrVal＝０．９９６２５６でSEV ＝０．０８７２１２である。さらに、電圧を付加しながら（In the presence of EMF）の測定では、Factor9でrVal＝０．９９７４８３でSEV＝０．０７１５２８となっている。
【０１６３】
つまり、摂動（ＷＡＰ）として１０Ｖの電圧を付加しながら分光分析すれば、バリデーション誤差が１／３となるので、測定の精度が３倍となるモデルが得られたことが判る。
【０１６４】
上記の実施例１から実施例１０で説明したように、４００ｎｍ〜２５００ｎｍの波長領域の光を利用して各試料中の成分の特性を測定する分光分析方法において、試料検体に所定の条件を付加することで、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えながら分光分析を行い、前記試料検体の各成分に応じて変化する所定の応答スペクトルのパターンを計測してスペクトル解析もしくは多変量解析を行うことにより、従来の方法では判別困難なものを判別可能とし、成分特性の高精度な測定を可能とし、さらに超低濃度成分の検出や成分の判別及び／又は成分の特性をリアルタイムに測定可能とする可視光・近赤外分光分析方法を得ることができる。
【０１６５】
さらには、測定する検体成分により、所定の検体成分を判別容易とする最適な摂動（ＷＡＰ）があるので、所定の摂動を付与しながら分光分析を行うことで、所定の検体成分の測定を簡易に行なうことも可能である。
【０１６６】
上記のように、本発明でいう摂動とは、試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更であって、光の繰り返し照射、試料検体の濃度変更、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更以外にも、実施例８で示した、牛に与える飼料の変更もある。また、さらには、試料検体に振動や音波や圧力を付与することで前記試料検体に物理的または化学的な変化を与えるようにしてもよい。
【０１６７】
上記したように、ある特定の波長（Important wavelengths）の光が、試料検体の特定成分を判別あるいは測定するのに重要な光であるので、簡易型の可視光・近赤外分光分析装置としては、ある特定の波長（Important wavelengths）の光を照射して分光分析可能な装置であればよい。そのために、図３１に示すような簡易構成の特定成分測定用の可視光・近赤外分光分析装置２０とすることができる。
【０１６８】
前記可視光・近赤外分光分析装置２０は、試料検体収容部２１に収容された試料検体Ｓ２に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段２２を備えると共に、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光であって
、試料検体Ｓ２に応じて予め選定された特定波長領域の光を前記試料検体に照射する光学手段２３と、前記試料検体Ｓ２からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段２４と、得られたスペクトルについて所定のスペクトル解析もしくは多変量解析を行う処理ソフトを内蔵するデータ処理手段２５を備える構成とされている。さらには、処理された結果を判別して判別結果を表示する表示手段２６を備える構成とすることもできる。
【０１６９】
上記の構成の可視光・近赤外分光分析装置２０であれば、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定するのに適した特定の波長（Important wavelengths）の光を照射して分光分析することができるので、それぞれの特定成分を短時間にまた容易に推定可能となる。また、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とすべく構築されたモデルを使用することで、特定成分の簡易判定や簡易測定が可能となる可視光・近赤外分光分析装置２０を構成することができる
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】本発明に係る可視光・近赤外分光分析方法の流れを示すブロック図である。
【図２】本発明方法の特徴部分を示す概略説明図である。
【図３】本発明装置の特徴部分を示す概略説明図である。
【図４】水分子の吸収バンドの強度変化を示す概略説明図である。
【図５】水分子の吸収バンドの強度変化を等高線状に示す。
【図６】Synchronousに変化する波長を示す一覧図である。
【図７】試料検体中のバクテリアを測定した際の吸収スペクトルを示す。
【図８】ＣＮＳの回帰ベクトルを示す。
【図９】ＣＰＳの回帰ベクトルを示す。
【図１０】ＣＮＳの検量線を示す。
【図１１】ＣＰＳの検量線を示す。
【図１２】クロスバリデーション解析後の検量結果を示す。
【図１３】第１主成分（Factor1）、第３主成分（Factor3）、第５主成分（Factor5）に基づくＣＮＳとＣＰＳの３次元プロットである。
【図１４】（ａ）にはＣＮＳとＣＰＳのクラス間距離を求めたＳＩＭＣＡ解析の結果を示し、（ｂ）にはＳＩＭＣＡを使った判別結果を示している。
【図１５】（ａ）は第１主成分（Factor1）と第３主成分（Factor3）とによるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）の判別結果を示しており、（ｂ）は第３主成分（Factor3）と第５主成分（Factor5）とによる判別結果を示し、（ｃ）はそれぞれの主成分のローディングを示している。
【図１６】ＳＩＭＣＡ解析によるＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）とＰｒＰ（Ｍｎ）の各クラス間の距離を示す。
【図１７】繰り返し照射によるＳＩＭＣＡ解析の結果を示している。
【図１８】プリオン蛋白質の濃度を変更した時のクラス間距離の結果を示している。
【図１９】光路長を変更してＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）を判別した時の回帰ベクトルを示している。
【図２０】光路長を変更してＰｒＰとＰｒＰ（Ｃｕ）を判別した結果であり、（ａ）はＳＩＭＣＡ解析の結果を示し、（ｂ）はクラス間距離を示し、（ｃ）は判別結果を示している。
【図２１】温度変更の摂動を与えてプリオン蛋白質の判別を行なった時のＳＩＭＣＡ距離を示すグラフである。
【図２２】（ａ）は試料検体中の抗原濃度を測定した際の検量線を示し、（ｂ）にはクロスバリデーションによる解析結果を示し、（ｃ）にはＳＩＭＣＡ解析によるクラス間距離を示している。
【図２３】（ａ）は溶解前のコーヒー粒子径を測定した際の検量線を示し、（ｂ）にはクロスバリデーションによる解析結果を示す。
【図２４】粒子の大きさを判別した例を示し、（ａ）にはコーヒー粒子を判別した時のＳＩＭＣＡ距離を示し、（ｂ）には砂糖粒子を判別した時のＳＩＭＣＡ距離を示し、（ｃ）には砂糖粒子を測定した時の相関係数とバリデーション誤差を示している。
【図２５】試料検体中のバクテリアを測定した際の第１主成分（Factor1）と第２主成分（Factor2）と第３主成分（Factor3）とによるmstaとmstrの判別結果を表している。
【図２６】（ａ）（ｂ）は牛の血漿スペクトルから、その牛の牛乳の成分濃度を予測した結果を示し、（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルから、その牛の血漿の成分濃度を予測した結果を示している。
【図２７】（ａ）（ｂ）は牛の胃液のスペクトルから、その牛の牛乳の成分濃度を予測した結果を示し、（ｃ）（ｄ）は牛の牛乳のスペクトルから、その牛の胃液の成分濃度を予測した結果を示している。
【図２８】石英セルを示しており、（ａ）は全体斜視図であり、（ｂ）は平面図である。
【図２９】牛乳の複数の成分濃度を測定した際のＳＥＣＶを示し、（ａ）にはＦＡＴ（脂肪分）のＳＥＣＶであり、（ｂ）はＰＲＯＴＥＩＮ（蛋白質）のＳＥＣＶであり、（ｃ）はＬＡＣＴＯＳＥのＳＥＣＶを示している。
【図３０】（ａ）は牛乳中の脂肪濃度を測定した際の回帰ベクトルＹ１を示し、（ｂ）にはクロスバリデーションによる解析結果を示す。
【図３１】特性成分測定用の可視光・近赤外分光分析装置の一例を示す。
【符号の説明】
【０１７１】
１ 既知の試料
２ 新たな試料
３ 石英セル
３Ａ 試料検体注入部
４ 照射方向
５ 照射方向
１０ 可視光・近赤外分光分析装置
２０ 可視光・近赤外分光分析装置（特定成分用の）
Ｌ１ 境界
Ｓ１ 試料検体
Ｓ２ （特定の）試料検体
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、
前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与えながらスペクトル測定を行い、スペクトル解析もしくは多変量解析して、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴とする可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項２】
試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、
前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させ、全部又は一部の波長領域のスペクトル測定を行うことで、前記試料検体中の成分の特性に応じて変化する水分子の要素ピークを含む応答スペクトルをスペクトル解析もしくは多変量解析して、応答スペクトルのパターンの変遷を捉え、捉えられた前記パターンの変遷から各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴とする可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項３】
前記摂動が、前記試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更であって、光の繰り返し照射、試料検体の濃度変更、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更のいずれか、または、それらの組み合わせであることを特徴とする請求項１または２に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項４】
前記摂動が、試料検体の１０倍ずつ（例えば１０-1〜１０-10まで）の濃度変更と、それぞれに少なくとも３回繰り返し照射の組み合わせであることを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項５】
前記試料検体がバクテリアであって、前記試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別を行うことを特徴とする請求項４に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項６】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）及び／又はＰｒＰ（Ｍｎ）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項７】
光路長及び／又は濃度を変更すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（metal）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項８】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに繰り返し照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の抗原の濃度を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項９】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中に溶解した粒子の溶解前の粒子径を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１０】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の異なるバクテリアを判別することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１１】
一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生乳から前記哺乳動物の血漿や胃液等の生体液の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１２】
一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生体液から前記哺乳動物の生乳の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１３】
光路長を変化すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えると共に、７００ｎｍ〜１１００ｎｍの第一の波長領域と、１１００ｎｍ〜２４００ｎｍの第二の波長領域において、前記第１の波長領域のみの又は前記第１、第２の波長領域の分光分析を行うことで、生乳の複数の成分の濃度を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１４】
１０Ｖの電圧を付加すると共に、５００〜１０００ｎｍの波長領域の光を少なくとも３回の連続照射を行なうという摂動を与えて分光分析を行うことで、生乳中の脂肪濃度を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１５】
４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を発生させるための近赤外光発生手段と、前記近赤外光発生手段からの可視光及び／又は近赤外光を試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段を備える可視光・近赤外分光分析装置において、
前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を設けると共に、前記データ処理手段が、前記摂動を与えて得られる応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行うことを特徴とする可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１６】
前記摂動付与手段が、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させる手段であって、照射時間と照射回数を設定可能な照射制御装置を備えていることを特徴とする請求項１５に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１７】
前記摂動付与手段が、付加電磁力調整、光路長変更、温度変更が可能な手段の少なくとも一つを備えていると共に、前記光学手段と前記検知手段とを同時にまたは別々に備えるプローブから光の照射と受光を行いデータ処理を行うよう、前記摂動付与手段による摂動の付与と、光の照射と受光の作動タイミングを制御する制御手段を備えていることを特徴とする請求項１５または１６に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１８】
前記データ処理手段が、応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行い、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化を捉えて解析する手段であることを特徴とする請求項１７に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１９】
試料検体収容部と該収容部に収容された試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を備えると共に、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光であって、試料検体に応じて予め選定された特定波長領域の光を前記試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段を備えていることを特徴とする可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項２０】
請求項５から１４のいずれかに記載の可視光・近赤外分光分析方法を実施するための可視光・近赤外分光分析装置であって、
それぞれの試料検体を測定するのに適した特有の波長（Important wavelengths）領域を予め設定していることを特徴とする請求項１９に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１】
試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、
前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与えながらスペクトル測定を行い、スペクトル解析もしくは多変量解析して、各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴とする可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項２】
試料検体に４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を照射して試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを解析して各成分の判別や各成分の特性を測定する分光分析方法において、
前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（water activating perturbations：ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させ、全部又は一部の波長領域のスペクトル測定を行うことで、前記試料検体中の成分の特性に応じて変化する水分子の要素ピークを含む応答スペクトルをスペクトル解析もしくは多変量解析して、応答スペクトルのパターンの変遷を捉え、捉えられた前記パターンの変遷から各成分の判別及び／又は成分の特性を測定可能とするモデルを構築することを特徴とする可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項３】
前記摂動が、前記試料検体に物理的または化学的な変化を与える条件の変更であって、光の繰り返し照射、試料検体の濃度変更、照射時間の延長、電磁力付加、光路長変更、温度変更、ｐＨ変更、圧力変更のいずれか、または、それらの組み合わせであることを特徴とする請求項１または２に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項４】
前記摂動が、試料検体の１０倍ずつ（例えば１０-1〜１０-10まで）の濃度変更と、それぞれに少なくとも３回繰り返し照射の組み合わせであることを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項５】
前記試料検体がバクテリアであって、前記試料検体中のバクテリアのＣＮＳ（コアグラーゼ陰性ブドウ球菌）とＣＰＳ（コアグラーゼ陽性ブドウ球菌）の判別を行うことを特徴とする請求項４に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項６】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（Ｃｕ）及び／又はＰｒＰ（Ｍｎ）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項７】
光路長及び／又は濃度を変更すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、金属成分を含む蛋白質ＰｒＰ（metal）と金属成分を含まない蛋白質ＰｒＰとの判別を行うことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項８】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに繰り返し照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の抗原の濃度を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項９】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中に溶解した粒子の溶解前の粒子径を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１０】
試料検体の濃度を段階的値に濃度変更し、それぞれに少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えて分光分析することで、試料検体中の異なるバクテリアを判別することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１１】
一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生乳から前記哺乳動物の血漿や胃液等の生体液の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１２】
一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行い、さらに与える飼料を変更した後で、再度一日に少なくとも朝夕各１回の分光分析を複数日連続して行うという繰り返し照射の摂動を与えて分光分析することで、牛等の哺乳動物の生体液から前記哺乳動物の生乳の成分濃度を予測可能としたことを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１３】
光路長を変化すると共にその都度に少なくとも３回の連続照射を行うという摂動を与えると共に、７００ｎｍ〜１１００ｎｍの第一の波長領域と、１１００ｎｍ〜２４００ｎｍの第二の波長領域において、前記第１の波長領域のみの又は前記第１、第２の波長領域の分光分析を行うことで、生乳の複数の成分の濃度を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１４】
１０Ｖの電圧を付加すると共に、５００〜１０００ｎｍの波長領域の光を少なくとも３回の連続照射を行なうという摂動を与えて分光分析を行うことで、生乳中の脂肪濃度を測定することを特徴とする請求項３に記載の可視光・近赤外分光分析方法。
【請求項１５】
４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光を発生させるための近赤外光発生手段と、前記近赤外光発生手段からの可視光及び／又は近赤外光を試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段を備える可視光・近赤外分光分析装置において、
前記試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を設けると共に、前記データ処理手段が、前記摂動を与えて得られる応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行うことを特徴とする可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１６】
前記摂動付与手段が、前記試料検体中及び／又は周囲に存在する水を活性化する摂動（ＷＡＰ）を与えることにより、前記試料検体中に含まれる所定の成分と水分子との相互作用を促進させる手段であって、照射時間と照射回数を設定可能な照射制御装置を備えていることを特徴とする請求項１５に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１７】
前記摂動付与手段が、付加電磁力調整、光路長変更、温度変更が可能な手段の少なくとも一つを備えていると共に、前記光学手段と前記検知手段とを同時にまたは別々に備えるプローブから光の照射と受光を行いデータ処理を行うよう、前記摂動付与手段による摂動の付与と、光の照射と受光の作動タイミングを制御する制御手段を備えていることを特徴とする請求項１５または１６に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１８】
前記データ処理手段が、応答スペクトルの全部又は一部の波長領域のスペクトル解析を行い、生体高分子の構造又は機能及びそれらの変化を捉えて解析する手段であることを特徴とする請求項１７に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項１９】
試料検体収容部と該収容部に収容された試料検体に所定の条件を付加することで摂動を与える摂動付与手段を備えると共に、４００ｎｍ〜２５００ｎｍまでの又はその一部の波長領域の可視光及び／又は近赤外光であって、試料検体に応じて予め選定された特定波長領域の光を前記試料検体に照射する光学手段と、前記試料検体からの透過光、反射光、又は透過反射光のスペクトルを得る検出手段と、得られたスペクトルについて所定の多変量解析を行うデータ処理手段を備えていることを特徴とする可視光・近赤外分光分析装置。
【請求項２０】
請求項５から１４のいずれかに記載の可視光・近赤外分光分析方法を実施するための可視光・近赤外分光分析装置であって、
それぞれの試料検体を測定するのに適した特有の波長（Important wavelengths）領域を予め設定していることを特徴とする請求項１９に記載の可視光・近赤外分光分析装置。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０５０１７６
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５１５５８５（Ｐ２００５−５１５５８５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６６８０
【国際出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（８００００００５７）財団法人新産業創造研究機構 (99)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１７年６月２日（２００５．６．２）
【発行日】平成１９年６月７日（２００７．６．７）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００４／０１６６８０
【国際出願日】平成１６年１１月１０日（２００４．１１．１０）
【出願人】（８００００００５７）財団法人新産業創造研究機構 (99)
【Ｆターム（参考）】
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