変異体ＦＧＦ
【課題】骨癒合症に関与し得る遺伝子変異を見出し、それに基づく該疾患の発症リスクの判定方法を提供すること。硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性や組織内拡散性が改変された変異体ＦＧＦを提供すること。
【解決手段】本発明は、ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法を提供する。また、本発明は、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換された変異体ＦＧＦポリペプチドを提供する。
【解決手段】本発明は、ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法を提供する。また、本発明は、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換された変異体ＦＧＦポリペプチドを提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異体ＦＧＦ及びその用途に関する。より具体的には、本発明は硫酸化プロテオグリカンに対する親和性の低下した変異体ＦＧＦ、該変異体ＦＧＦを含む医薬、該変異体ＦＧＦの有無を検出することを特徴とする骨癒合症の発症リスクの判定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格形態発生は、関節の協調した発生を伴い、その位置が骨格のレイアウトを決定する。関節は構造的及び機能的に不均一である。滑膜関節は、軟骨細胞の初期凝集から生じ、引き続き関節腔により隔てられた別々の骨格構造へ分化する。対照的に、縫合線は、未熟で急速に分裂している造骨性の前駆体（このうちの一部は骨芽細胞となり、新たな骨を産生する）を含む、狭い領域により隔てられた２つの骨の板を含む。
【０００３】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体における機能獲得型の変異は、軟骨異形成症及び頭蓋骨縫合線早期癒合症を生じ、骨および関節の両方の発生におけるＦＧＦシグナリングの機能に脚光を当てている。特に、線維芽細胞増殖因子受容体２（Ｆｇｆｒ２）ローカスにおける優性変異が関与しているアントレー−ビクスラー症候群（Ａｎｔｌｅｙ−Ｂｉｘｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＢＳ）において橈上腕（radiohumeral）骨癒合症及び頭蓋骨縫合線早期癒合症が同時発生することは、滑膜関節及び縫合線発生の両方におけるＦＧＦシグナリングの寄与を示唆する（非特許文献１）。同様の症候群性の関節欠陥が、クルーゾン症候群に関連するＦｇｆｒ２ｃの機能獲得型を発現するマウス(非特許文献２)や、異所性で恒常的に活性なＦＧＦＲ１キナーゼドメインを発現しているマウス(非特許文献３)においても見られる。これらの知見は、ＦＧＦシグナリングが関節及び縫合線発生を阻害する一方で、軟骨形成及び／又は骨形成を促進することを示唆する。従って、ＦＧＦシグナリングに対する時空間的な制約が、骨および関節の両方の協調した発生を達成するのかもしれない。
【０００４】
局所的なＦＧＦシグナリングは、いくつかの異なるレベルにおいて調節されている。第１に、ＦＧＦリガンドの時空間的に制限された発現がある。２２のＦＧＦリガンドのなかで、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８は肢芽及び発生中の骨格において発現している。これらのうち、機能欠失型の変異により、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９及びＦＧＦ１８の軟骨形成及び／又は骨形成への機能的関与が実証されている(非特許文献４〜７)。マウスにおけるＦＧＦ９の過剰発現による軟骨形成異常の表現型の誘導も、ＦＧＦ９が軟骨形成に影響を及ぼす能力を実証している(非特許文献８)。ＦＧＦシグナリングに関与する他のエレメントはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）である。マウス及びキイロショウジョウバエにおける遺伝学的研究は、ＨＳＰＧｓがＦＧＦリガンドの分布及び受容体結合を制御することを示唆する(非特許文献９及び１０)。マウスにおいて、ＨＳＰＧグリコサミノグリカン鎖合成に必要な鍵となるグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるＥｘｔ１における低形質変異は、肘及び膝関節の癒合を引き起こす(非特許文献１１)。特に、Ｅｘｔ１の神経特異的ノックアウトにより、脳パターン形成時のＦＧＦ８の適切な分布におけるヘパラン硫酸（ＨＳ）の必要性が明らかとなった。更に、他のＨＳ生合成遺伝子であるＮｄｓｔ１はレンズ発生の間のＦＧＦシグナリングに必要である。これらの知見を合わせると、ＦＧＦ／ＨＳ相互作用が、関節発生を含む器官発生時のＦＧＦシグナリングを制御していることが示唆される。最後に、ＦＧＦ９の構造解析により、ＦＧＦ９が、シグナル伝達能力に影響を与え得るホモ二量体を形成し得ることが示唆されている(非特許文献１２及び１３)。ＦＧＦ９のホモ二量体化は、ＦＧＦ９のいくつかの重要な受容体結合部位を閉鎖するため、自動阻害メカニズムがＦＧＦ９依存的シグナル伝達を調節するよう機能しているのかもしれない。しかしながら、この提唱された自動阻害メカニズムは、まだその機能の実証がなされていない。
【０００５】
以上のように、種々のＦＧＦが関節及び縫合線の発生に関与していること、そしてＦＧＦＲの機能獲得型変異により骨癒合症が誘導されることが報告されているが、そのリガンドであるＦＧＦの変異が骨癒合症を誘導することは全く知られていない。また、ＦＧＦの変異が硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性やその組織内拡散性に影響を及ぼすことも知られていない。
【０００６】
本発明者らは、自然発生マウス変異体、肘−膝関節癒合症（elbow-knee-synostosis、Eks）が、ＡＢＳ様骨格異常、橈上腕（radiohumeral）及び脛大腿（tibiofemoral）の骨癒合症、頭蓋骨縫合線早期癒合症及び肺形成不全を呈することを以前報告している（非特許文献１４）。
【０００７】
一方、特許文献１には、種々のＦＧＦ変異体が開示されている。該文献には、ＦＧＦの変異がその受容体特異性の変化を誘導することが記載されている。しかし、ＦＧＦの組織内拡散性や硫酸化グリコサミノグリカンとの親和性への影響については記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ０２／０３６７３２
【非特許文献１】Reardon, W., Smith, A., Honour, J.W., Hindmarsh, P., Das, D., Rumsby, G., Nelson, I., Malcolm, S., Ades, L., and Sillence, D. et al., (2000). Evidence for digenic inheritance in some cases of Antley-Bixler syndrome? J. Med. Genet. 37, 26-32.
【非特許文献２】Eswarakumar, V.P., Horowitz, M.C., Locklin, R., Morriss-Kay, G.M., and Lonai, P. (2004). A gain-of-function mutation of Fgfr2c demonstrates the roles of this receptor variant in osteogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12555-12560.
【非特許文献３】Wang, Q., Green, R.P., Zhao, G., and Ornitz, D.M. (2001). Differential regulation of endochondral bone growth and joint development by FGFR1 and FGFR3 tyrosine kinase domains. Development 128, 3867-3876.
【非特許文献４】Montero, A., Okada, Y., Tomita, M., Ito, M., Tsurukami, H., Nakamura, T., Doetschman, T., Coffin, J.D., and Hurley, M.M. (2000). Disruption of the fibroblast growth factor-2 gene results in decreased bone mass and bone formation. J. Clin. Invest. 105, 1085-1093.
【非特許文献５】Hung, I.H., Yu, K., Lavine, K.J., and Ornitz, D.M. (2007). FGF9 regulates early hypertrophic chondrocyte differentiation and skeketal vascularization in the developing stylopod. Dev. Biol. 307, 300-313.
【非特許文献６】Liu, Z., Xu, J., Colvin J.S., and Ornitz, D.M. (2002). Coordination of chondrogenesis and osteogenesis by fibroblast growth factor 18. Genes Dev. 16, 859-869.
【非特許文献７】Ohbayashi, N., Shibayama, M., Kurotaki, Y., Imanishi, M., Fujimori T., Itoh, N., and Takada, S. (2002). FGF18 is required for normal cell proliferation and differentiation during osteogenesis and chondrogenesis. Genes Dev. 16, 870-879.
【非特許文献８】Garofalo, S., Kliger-Spatz, M., Cooke, J.L., Wolstin, O., Lunstrum, G.P., Moshkovitz, S.M., Horton, W.A., and Yayon, A. (1999). Skeletal dysplasia and defective chondrocyte differentiation by targeted overexpression of fibroblast growth factor 9 in transgenic mice. J. Bone Miner. Res. 14, 1909-1915.
【非特許文献９】Ornitz, D.M. (2000). FGFs, heparan sulfate and FGFRs: complex interactions essential for development. BioEssays 22, 108-112.
【非特許文献１０】Nybakken, K., and Perrimon, N. (2002). Heparan sulfate proteoglycan modulation of developmental signaling in Drosophila. Biochim. Biophys. Acta 19, 280-291.
【非特許文献１１】Koziel, L., Kunath, M., Kelly, O.G., and Vortkamp, A. (2004). Ext1-dependent heparin sulfate regulates the range of Ihh signaling during endochondral ossification. Dev. Cell 6, 801-813.
【非特許文献１２】Plotnikov, A.N., Eliseenkova, A.V., Ibrahimi, O.A., Shriver, Z., Sasisekharan, R., Lemmon, M.A. and Mohammadi, M. (2001). Crystal structure of fibroblast growth factor 9 reveals regions implicated in dimerization and autoinhibition. J. Biol. Chem. 276, 4322-4329.
【非特許文献１３】Hecht, H.J., Adar, R., Hofmann, B., Bogin, O., Weich, H., and Yayon, A. (2001). Structure of fibroblast growth factor 9 shows a symmetric dimer with unique receptor- and heparin-binding interfaces. Acta. Cryst. D57, 378-384.
【非特許文献１４】Murakami, H., Okawa, A., Yoshida, H., Nishikawa, S., Moriya, H., and Koseki, H.(2002). Elbow knee synostosis (Eks): a new mutation on mouse Chromosome 14. Mamm. Genome 13, 341-344.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の第１の目的は、関節癒合症や縫合線早期癒合症に関与し得る遺伝子変異を見出し、それに基づく該疾患の発症リスクの判定方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、硫酸化グリコサミノグリカンに対する親和性や組織内拡散性が改変された変異体ＦＧＦを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｅｋｓ変異マウスにおいて、Ａｓｎ１４３がＴｈｒに置き換わるＦｇｆ９遺伝子の新たなミスセンス変異を同定した。本発明者らは、この変異アレルをＦｇｆ９Ｅｋｓと命名し、この変異がＦＧＦ９のホモ二量体化を妨げ、その結果、ＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性が減少し、またＦＧＦＲ結合及び活性化が減少することを見出した。同時に、ＦＧＦ９Ｅｋｓが発生中の組織においてより拡散速度が早いことを見出した。これらの結果より、ＦＧＦ９Ｅｋｓが関節予定部位及び縫合線において、異所性のＦＧＦ９シグナリングを引き起こし、肘膝関節癒合及び縫合線早期癒合を発症させると強く示唆された。分子動態計算により、ＦＧＦ９Ｅｋｓのヘパリンに対する親和性の低下は、そのヘパリンに対する固有の親和性の変化よりも、むしろ単量体型の優性によるものであることが示唆された。そこで本発明者らは、ＦＧＦシグナリングがそのＨＳへの親和性の制御を通して制限されており、その少なくとも一部は、ＦＧＦ９の単量体／二量体平衡によりコントロールされていることを示唆した。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
【００１０】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換された変異体ＦＧＦポリペプチド。
［２］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［１］記載のポリペプチド。
［３］ＡｓｎがＡｓｎ１４３である、［２］記載のポリペプチド。
［４］配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列を含む、［３］記載のポリペプチド。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
［６］配列番号１、３、５、７、１１又は１３で表されるヌクレオチド配列を含む、［５］記載のポリヌクレオチド。
［７］配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の塩基番号４２８のシトシンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなる配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の部分配列、又はその相補配列を含むポリヌクレオチド。
［８］［５］記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［９］［８］記載のベクターが導入された形質転換体。
［１０］［１］記載のポリペプチドを含む医薬。
［１１］［２］記載のポリペプチドを含む骨折治療剤。
［１２］ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法。
［１３］ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出するための試薬を含む、骨癒合症の発症リスクの診断剤。
［１４］被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否か検定すること、及びＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質をＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として得ることを含む、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、骨癒合症の発症リスクの新たな判定方法が提供される。従前には、ＦＧＦＲの変異が骨癒合症を引き起こすことが知られていたが、そのリガンドであるＦＧＦの変異の骨癒合症への関与は知られていない。従って、本発明は、従前とは全く異なる観点から骨癒合症の発症リスクを評価する方法を提供するものである。
また、本発明により、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低下した変異体ＦＧＦが提供される。本発明の変異体ＦＧＦは生体内での拡散性に優れており、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく、患部の深部にまで到達するので、浸透性の優れたＦＧＦ製剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．変異体ＦＧＦポリペプチド
本発明は、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するアスパラギン（Ａｓｎ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に置換された変異体ＦＧＦポリペプチドを提供するものである。本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦのアミノ酸配列又はその部分配列を含み、且つ該アミノ酸配列においてＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換されている。
【００１３】
ＦＧＦは、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列やヌクレオチド配列も公知である。本発明において用いられるＦＧＦは、哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。該哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（例えば、マウス）又は霊長類（例えば、ヒト）である。
【００１４】
ヒト及びマウスにおいては、ＦＧＦ１〜ＦＧＦ２３が確認されている（表１）。ヒトＦＧＦ１９はマウスＦＧＦ１５のオルソログであるので、ヒト及びマウスのＦＧＦファミリーは２２のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004、Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001）。本明細書において、ＦＧＦの呼称はヒトＦＧＦのノメンクラチャに従うものとする。表１に、ヒト及びマウスの野生型ＦＧＦのアミノ酸配列のGenbankアクセッション番号を示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
ＦＧＦは、系統発生学的解析に基づき７つのサブファミリー（ＦＧＦ１サブファミリー、ＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー、ＦＧＦ１１サブファミリー及びＦＧＦ１９サブファミリー）に分類される。ＦＧＦ１サブファミリーは、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）及びＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）からなる。ＦＧＦ４サブファミリーは、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５及びＦＧＦ６からなる。ＦＧＦ７サブファミリーは、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ２２からなる。ＦＧＦ８サブファミリーは、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８からなる。ＦＧＦ９サブファミリーは、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６及びＦＧＦ２０からなる。ＦＧＦ１１サブファミリーは、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４からなる。ＦＧＦ１９サブファミリーは、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３からなる。
【００１７】
本発明に用いられるＦＧＦは、好ましくはＦＧＦ９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくはＦＧＦ９である。
【００１８】
野生型のＦＧＦ９ポリペプチドは、溶液中で単量体とホモ二量体との間の平衡状態にある。ＦＧＦ９ポリペプチドのホモ二量体においては、ＦＧＦ９単量体同士が水素結合を介して会合している。後述の実施例の結果から、ＦＧＦ９ポリペプチドにおいては、この水素結合にアミノ酸番号１４３のアスパラギン（Ａｓｎ１４３）が寄与することが明らかになった。ＦＧＦのアミノ酸配列を配列同一性に基づき整列すると、ＦＧＦ９のＡｓｎ１４３に対応するＡｓｎが高度に保存されていることから（図８）、ＦＧＦ９以外のＦＧＦについても、このＡｓｎが単量体間水素結合に寄与している可能性が考えられる。各ＦＧＦにおいて単量体間水素結合に寄与するＡｓｎのアミノ酸番号を表１に示す。
【００１９】
尚、本明細書において、各ＦＧＦのアミノ酸番号は、野生型ＦＧＦの全長アミノ酸配列（即ち、シグナルペプチドが切断されていない未成熟フォームのアミノ酸配列）を基準として表す。基準となる野生型ＦＧＦの全長アミノ酸配列は、上記表１中のGenbankアクセッション番号で特定されるアミノ酸配列のうち２００８年３月１９日における最新バージョンのアミノ酸配列である。例えば、ヒトＦＧＦ９の基準アミノ酸配列のGenbankアクセッション番号のバージョンはBAA03572.1（GI:391719）であり、マウスＦＧＦ９の基準アミノ酸配列のGenbankアクセッション番号のバージョンはBAA07410.1（GI:1107459）である。
【００２０】
本発明のポリペプチドがＦＧＦの部分アミノ酸配列を含み、且つ該アミノ酸配列においてＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換されている場合、該部分アミノ酸配列は、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎを含み、且つ最終的に得られる変異体ＦＧＦポリペプチドが、野生型ＦＧＦの全長アミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性を有している限り、その長さは限定されない。通常、該部分配列の長さは、通常１００アミノ酸以上、好ましくは１２０アミノ酸以上である。「実質的に同質の活性」としては、ＦＧＦの全長アミノ酸配列からなるポリペプチドのＦＧＦ受容体活性化機能等が挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に（例：生理学的に、又は薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば約０．１〜約１０倍、好ましくは約０．５〜約２倍）。ＦＧＦ受容体活性化機能は、対応するＦＧＦ受容体を発現したＢａＦ３細胞を変異体ＦＧＦポリペプチドの存在下で培養し、その増殖の程度を［３Ｈ］チミジンの取り込みにより測定することにより評価することができる。例えば、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドの活性はＦＧＦＲ２受容体を発現したＢａＦ３細胞を用いて評価することができる。
【００２１】
通常、ＦＧＦポリペプチドは、Ｎ末端に細胞外分泌のためのシグナルペプチドが結合した未成熟フォームとしてまず産生される。その後、シグナルペプチドが切断され、未成熟ＦＧＦは成熟ＦＧＦとなる。従って、ＦＧＦの部分アミノ酸配列の好ましい態様としては、ＦＧＦの全長アミノ酸配列からそのシグナル配列を除去して得られるアミノ酸配列（成熟ＦＧＦのアミノ酸配列）を挙げることができる。それぞれのＦＧＦのシグナルペプチドは、SignalP等の公知の配列解析ツールを用いて、各アミノ酸配列から推測することが可能である。例えば、ＦＧＦ９のシグナルペプチドは、Ｎ末端の１〜３３アミノ酸である。
【００２２】
本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドにおいては、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換されている。例えば、本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドにおいては、Ａｓｎ１４３がＴｈｒに置換されている。この置換により、ＦＧＦのホモ二量体化に欠陥が生じ、硫酸化グリコサミノグリカン（ヘパリン、ヘパラン硫酸等）への親和性が低下し、生体内での拡散性が高まるものの、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦと実質的に同等の活性を有している。「実質的に同質の活性」としては、ＦＧＦの全長アミノ酸配列からなるポリペプチドのＦＧＦ受容体活性化機能等が挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に（例：生理学的に、又は薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば約０．１〜約１０倍、好ましくは約０．５〜約２倍）。ＦＧＦ受容体活性化機能は、対応するＦＧＦ受容体を発現したＢａＦ３細胞を変異体ＦＧＦポリペプチドの存在下で培養し、その増殖の程度を［３Ｈ］チミジンの取り込みにより測定することにより評価することができる。例えば、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドの活性はＦＧＦＲ２受容体を発現したＢａＦ３細胞を用いて評価することができる。
【００２３】
尚、本明細書中、ＦＧＦ９におけるＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換を「Ｎ１４３Ｔ」と表す場合がある。また、Ａｓｎ１４３がＴｈｒに置換されたＦＧＦ９ポリペプチドを、「ＦＧＦ９Ｅｋｓ」と表す場合がある。
【００２４】
本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、ＦＧＦに由来するアミノ酸配列に加え、１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜１００個程度、より好ましくは１〜１５個程度）の付加的なアミノ酸を含んでいてもよい。このようなアミノ酸付加は、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドが、対応するＦＧＦ受容体活性化機能を有する限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば、ファーストメチオニン、ポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることが出来る。タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を例示することが出来る。アミノ酸配列が付加される位置は、好ましくは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端である。
【００２５】
本発明のポリペプチドに含まれる具体的なアミノ酸配列としては、配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、野生型ヒトＦＧＦ９の全長アミノ酸配列のＡｓｎ１４３がＴｈｒに置換されたものである。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、野生型マウスＦＧＦ９の全長アミノ酸配列のＡｓｎ１４３がＴｈｒに置換されたものである。配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から、シグナル配列（Ｎ末端の３３アミノ酸残基）を除去したものである。配列番号８で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列から、シグナル配列（Ｎ末端の３３アミノ酸残基）を除去したものである。配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、配列番号６で表されるアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をＭｅｔに置換したものである。配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、配列番号８で表されるアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸（Ａｓｎ）をＭｅｔに置換したものである。
【００２６】
本発明のポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２７】
また、本明細書において用語「本発明のポリペプチド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ポリペプチドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの製造方法については特に制限はなく、該ポリペプチドは公知のペプチド合成法に従って製造してもよく、また公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよい。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを製造することができる。
【００２９】
遺伝子組み換え技術を用いて本発明のポリペプチドを製造する場合には、先ず後述するような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該ポリペプチドを製造することができる。該ポリヌクレオチド、遺伝子組み換え技術を用いた本発明のポリペプチドの製造方法については本明細書中後述する。
【００３０】
本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦポリペプチドと同様の生理活性を有しており、且つ野生型ＦＧＦポリペプチドと比較して、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低く、生体内での拡散性に優れている。本発明のポリペプチドを生体に投与すると、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく患部の深部にまで到達し得る。従って、本発明のポリペプチドは、創傷、褥創、火傷、血栓症、閉塞性動脈硬化症、骨疾患、脱毛症、肝臓病、膵臓病、糖尿病、腎臓病、心臓病、筋萎縮性側索硬化症等の治療薬として有用である。また、本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドは、骨癒合症の発症メカニズムの研究のための試薬や、後述の骨癒合症の発症リスクの判定方法におけるポジティブコントロールとしても有用である。
【００３１】
２．ポリヌクレオチド
本発明は上記本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１又は配列番号１３で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。配列番号１で表されるヌクレオチド配列は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号３で表されるヌクレオチド配列は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号５で表されるヌクレオチド配列は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号７で表されるヌクレオチド配列は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列は配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、それぞれコードする。
【００３３】
尚、本明細書において、Ａｓｎ１４３をコードするコドンがＴｈｒをコードするコドンに置換されたＦｇｆ９遺伝子変異アレルを「Ｆｇｆ９Ｅｋｓ」又は「Ｅｋｓアレル」と表す場合がある。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、ＦＧＦをコードするＤＮＡクローンやｃＤＮＡ等を鋳型として用い、ＰＣＲによって直接増幅することができる。或いは、配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により変異体ＦＧＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００３５】
取得された本発明のポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの製造（後述）や、本発明の判定方法（後述）に有用である。
【００３７】
また、本発明は、配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の塩基番号４２８のシトシンを含む１５塩基以上（例えば１８塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上）の連続したヌクレオチド配列からなる部分配列、又はその相補配列を含むポリヌクレオチド（本発明の部分ポリヌクレオチド）を提供する。
【００３８】
本発明の部分ポリヌクレオチドは、後述の判定方法において、変異ＦＧＦ９アレルを検出するためのプローブとして有用である。
【００３９】
３．ベクター及び形質転換体
本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものである。ベクターとしては発現ベクター、クローニングベクター等を挙げることができ、目的に応じて選択することが可能であるが、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。該発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができ、用いる宿主に応じて適宜選択することが出来る。
【００４０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（ラット神経細胞、サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）等が用いられる。
【００４１】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オラウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００４２】
プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミドベクター（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）等を挙げることができ、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することが出来る。
【００４３】
ウイルスベクターの種類は、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することが出来る。例えば、宿主として昆虫細胞を用いる場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることが出来る。また、宿主として哺乳動物細胞を用いる場合には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることが出来る。
【００４４】
また、プロモーターは、用いる宿主の種類に対応して、該宿主内で転写を開始可能なものを選択することが出来る。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。宿主が哺乳動物細胞である場合、サブゲノミック（２６Ｓ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
【００４５】
本発明のベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。
【００４６】
上記本発明のベクターを、自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入法等）に従って上記宿主へ導入することにより、該ベクターが導入された形質転換体（本発明の形質転換体）を製造することができる。導入されるベクターとして発現ベクターを使用することにより、該形質転換体は本発明のポリペプチドを発現し得る。本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドの製造などに有用である。
【００４７】
本発明の形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物から本発明のポリペプチドを単離することにより、本発明のポリペプチドを製造することが出来る。宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、ＬＢ培地やＭ９培地等の適切な培地中、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、適切な培地中、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。宿主が酵母である形質転換体の培養は、バークホールダー培地等の適切な培地中、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたGrace’s Insect medium等の適切な培地中、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。宿主が動物細胞である形質転換体の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたＭＥＭ培地等の適切な培地中、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。いずれの培養においても、必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。培養物からの本発明のポリペプチドの単離・精製は、例えば、菌体溶解液や培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーに供することにより達成することができる。
【００４８】
４．医薬
上述の通り、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦポリペプチドと実質的に同質の活性を維持しており、且つ野生型ＦＧＦポリペプチドと比較して、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低く、生体内での拡散性に優れている。本発明のポリペプチドを生体に投与すると、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく患部の深部にまで到達し得る。
【００４９】
一方、各ＦＧＦは、創傷、褥創、火傷、血栓症、閉塞性動脈硬化症、骨疾患、脱毛症、肝臓病、膵臓病、糖尿病、腎臓病、心臓病、筋萎縮性側索硬化症等の疾患の治療に有用であることが知られているか、もしくは示唆されている。
【００５０】
特にＦＧＦ２は、創傷、褥創、閉塞性動脈硬化症（血管新生効果）、ＦＧＦ５は閉塞性動脈硬化症（血管新生効果）、ＦＧＦ９は骨折、筋萎縮性側索硬化症、ＦＧＦ１８は骨折、脱毛症（発毛、育毛効果）の治療に有用であることが知られている。また、ＦＧＦ５は脱毛効果が知られている。
【００５１】
従って、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、患部への浸透性に優れた、上記各疾患の治療薬として有用である。
【００５２】
本発明のポリペプチドを含有する医薬製剤は、活性成分として該ポリペプチド単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００５３】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は、経皮、静脈内又は骨髄内等の非経口で投与される。
【００５４】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。これら非経口剤には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することもできる。また、非経口に適当な製剤は、本発明のポリペプチドを注射用蒸留水または植物油に懸濁して調製したものであってもよく、この場合、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。また、非経口に適当な製剤は、本発明のポリペプチドの粉末又は凍結乾燥品を用時溶解する形であってもよく、必要に応じて賦形剤等を添加することができる。
【００５５】
本発明のポリペプチドの投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り約０．００１ｍｇ〜１ｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００５６】
４．骨癒合症の発症リスクの判定方法
後述の実施例に示されるように、Ｆｇｆ９遺伝子においてＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異を有するＥｋｓマウスは、橈上腕（radiohumeral）、脛大腿（tibiofemoral）及び頭蓋骨縫合線において骨癒合症を発症する。従って、本発明は、ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法を提供するものである。
【００５７】
ポリペプチドにおける変異を直接検出する場合は、例えば、本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的手法により、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドの存在が免疫特異的に検出される。あるいは、マススペクトルにより、ポリペプチドの質量の変化として検出することも可能である。
【００５８】
免疫学的手法を用いる場合、例えば、まず被検脊椎動物から採取した生体試料より、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドを測定可能なサンプルを調製する。生体試料としては、ＦＧＦ９を発現し得る部位（骨組織、軟骨組織、結合組織、腎臓組織、血清等）を用いることが好ましい。
【００５９】
変異体ＦＧＦ９をＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、スポット法、凝集法、抗体アレイ、表面プラズモン共鳴等の免疫学的方法により検出する場合、通常、生体試料より液体サンプルが調製される。例えば、生体試料が組織や細胞の場合、これらを機械的に破砕したり、可溶化剤で処理すること等により可溶化物を調製する。本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドをフローサイトメトリー法や免疫学的組織染色等の免疫学的方法により検出する場合は、組織や細胞等の生体試料は適宜固定等の処理に付され、抗体により染色される。
【００６０】
上記検出の結果、本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドが検出された場合、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することが出来る。反対に、本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドが検出されなかった場合は、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが低いと判定することが出来る。
【００６１】
また、後述の実施例に示すように、Ｅｋｓマウスにおいては、Ｆｇｆ９遺伝子座の一方のアレルのみがＮ１４３Ｔ変異を有している場合には、両方のアレルがＮ１４３Ｔ変異を有している場合と比較して骨癒合症の症状は軽微である。従って、上記検出の結果、本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドが検出された場合であっても、同時に野生型ＦＧＦ９が検出された場合には、野生型ＦＧＦ９が検出されなかった場合と比較して、発症し得る骨癒合症の症状は軽微であると判定することが出来る。逆に野生型ＦＧＦ９が検出されなかった場合は、同時に野生型ＦＧＦ９が検出された場合と比較して、より重篤な骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することができる。
【００６２】
Ｆｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出する場合は、まず、被検脊椎動物から採取した生体試料から染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。生体試料としては、上述の細胞、組織又は器官等が用いられるが、入手の容易性を考慮すれば、血液、毛髪、つめ、皮膚、粘膜等が用いられることが好ましい。また、変異の解析という観点からは、ＦＧＦ９ポリペプチドを発現し得る部位（骨組織、軟骨組織、結合組織、腎臓組織、血清等）を用いることが好ましい。生体試料からの染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの調製は、当該分野で周知の方法によって行なうことができ、また、市販のキットを用いてもよい。
【００６３】
上述のようにして得られた染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡに含まれる、ＦＧＦ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異を有するか否かを決定する。Ａｓｎ１４３をコードするコドンは、通常ＡＡＴ又はＡＡＣであり、好ましくはＡＡＣである。Ｔｈｒをコードするコドンは、通常ＡＣＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ又はＡＣＧであり、好ましくはＡＣＣである。
【００６４】
当該変異は周知の方法によって解析することができる。当該方法としては、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法（例えば、Biotechniques, 16, 296-297 (1994)参照）、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（例えば、Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)参照、ダイレクトシークエンス法（例えば、Biotechniques, 11, 246-249 (1991)参照）、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法（例えば、Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)参照）、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法（例えば、Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)参照）、ＲＮａｓｅＡ切断法（例えば、DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)参照）、化学切断法（例えば、Biotechniques, 21, 216-218 (1996)参照）、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法（例えば、Genome Res., 8, 549-556 (1998)参照）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（例えば、Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)参照）、インベーダー法（例えば、Science, 5109, 778-783 (1993); Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999) 参照）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997)参照）、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)参照)、サザンブロッティング法等が挙げられる。
【００６５】
例えば上述の本発明のポリヌクレオチドや部分ポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、ＡＳＯハイブリダイゼーション法や、ＲＮａｓｅＡ切断法によって変異の有無を検出することが可能である。或いは、配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２又は４についてはアミノ酸番号１４３のアミノ酸（Ａｓｎ又はＴｈｒである）を、配列番号６、８、１２又は１４についてはアミノ酸番号１１０のアミノ酸（Ａｓｎ又はＴｈｒである）をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマーを用いたＰＣＲの産物のヌクレオチド配列を解析することによって変異の有無を検出することが可能である。更に、変異により消失する制限酵素部位（例えばＢｓｒＩ）を利用して、ＰＣＲ産物の制限酵素消化産物の大きさを測定することによっても変異の有無を検出することが可能である。
【００６６】
上記検出の結果、上記変異が検出された場合、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することが出来る。反対に、上記変異が検出されなかった場合は、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが低いと判定することが出来る。
【００６７】
また、後述の実施例に示すように、Ｅｋｓマウスにおいては、Ｆｇｆ９遺伝子座の一方のアレルのみがＮ１４３Ｔ変異を有している場合には、両方のアレルがＮ１４３Ｔ変異を有している場合と比較して骨癒合症の症状は軽微である。従って、上記検出の結果、上記変異が検出された場合であっても、同時に野生型アレル（Ａｓｎ１４３をコードするコドン）が検出された場合には、野生型アレルが検出されなかった場合と比較して、発症し得る骨癒合症の症状は軽微であると判定することが出来る。逆に野生型アレルが検出されなかった場合は、同時に野生型アレルが検出された場合と比較して、より重篤な骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することができる。
【００６８】
また、本発明は、ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出するための試薬を含む、骨癒合症の発症リスクの診断剤を提供する。該診断剤を用いることにより、上述の骨癒合症の発症リスクの判定を容易に実施することが可能である。
【００６９】
該試薬としては、特に限定されないが、例えば、
（１）本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（２）本発明のポリヌクレオチド；
（３）本発明の部分ポリヌクレオチド；
（４）配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２又は４についてはアミノ酸番号１４３のアミノ酸（該アミノ酸はＡｓｎ又はＴｈｒである）を、配列番号６、８、１２又は１４についてはアミノ酸番号１１０のアミノ酸（該アミノ酸はＡｓｎ又はＴｈｒである）をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマー；
等を挙げることが出来る。
【００７０】
上述の試薬に加えて、更に上記検査方法において用いられる種々の試薬（例えば、タンパク質抽出用試薬、標識抗体、染色体ＤＮＡ調製試薬、全ＲＮＡ調製試薬、ｍＲＮＡ調製試薬、制限酵素（例えばＢｓｒＩ）、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、反応容器、検査プロトコールを記載した指示書など）を含めることにより、骨癒合症の発症リスクの判定用キットとしてもよい。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくことも出来る。また、必要に応じて保存剤や防腐剤を各要素に加えることも出来る。該判定用キットは、上記骨癒合症の発症リスクの判定を簡便に実施することを可能とするため極めて有用である。
【００７１】
５．スクリーニング方法
後述の実施例に示されるように、ＦＧＦのホモ二量体化が阻害され、単量体の存在量が多くなると、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低下する。従って、ＦＧＦのホモ二量体化をコントロールすることにより、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節することができる。そこで、本発明は、被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否か検定すること、及びＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質をＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として得ることを含む、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００７３】
被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否かの検定においては、適当な緩衝液中でＦＧＦを被検物質と接触させ、被検物質の存在下におけるＦＧＦのホモ二量体化の程度を測定する。ホモ二量体化の程度の測定は、分析的超遠心分離やゲル濾過クロマトグラフィー等の公知の方法により行うことが出来る。例えば、分析的超遠心分離によれば、溶液中のＦＧＦの平均分子量を測定することが可能である。溶液中のＦＧＦが全て単量体の場合は、この平均分子量は、ＦＧＦ単量体の計算上の分子量と同一となる。一方、溶液中のＦＧＦが全て二量体である場合には、平均分子量はＦＧＦ単量体の計算上の分子量の２倍になる。そして、単量体と二量体とが共存する場合には、平均分子量はＦＧＦ単量体の計算上の分子量の１〜２倍の間の値を示し、二量体化が促進すると平均分子量は高くなるので、この平均分子量を指標に単量体／二量体比を算出することができる。
【００７４】
次いで、被検物質の存在下におけるＦＧＦのホモ二量体化の程度が、被検物質の非存在下におけるＦＧＦのホモ二量体化の程度と比較される。ホモ二量体化の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質の非存在下におけるホモ二量体化の程度は、被検物質の存在中でのホモ二量体化の程度の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００７５】
比較の結果、ＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質が選択され、該物質がＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として獲得される。即ち、ＦＧＦのホモ二量体化を促進した被検物質はＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を増強する物質として獲得され、ＦＧＦのホモ二量体化を阻害した被検物質はＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を低下させる物質として獲得される。
【００７６】
上記スクリーニング方法により得られる物質を、ＦＧＦを含有する医薬と併用すると、ＦＧＦの生体内での拡散性を調節することができる。例えば、ＦＧＦを投与局所に局在化させたい場合には、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を増強する物質をＦＧＦと併用すればよい。一方、ＦＧＦを患部の深部にまで到達させたい場合には、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を低下させる物質をＦＧＦと併用すればよい。
【００７７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７８】
（方法）
Ｆｇｆ９遺伝子の変異の検出
Ｅｋｓ変異体表現型に寄与する変異を同定するために、ｍＲＮＡの逆転写―ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びＲＴ−ＰＣＲ産物の直接シークエンシング(ABI PRIZM 310 Genetic Analyzer; Applied Biosystems, Foster City, CA)を通じて、正常マウス（＋／＋）、ヘテロ接合体マウス（Ｅｋｓ／＋）及びホモ接合体マウス（Ｅｋｓ／Ｅｋｓ）からのｃＤＮＡの配列を調べた。Ｅｋｓアレルのジェノタイピングのため、Ｅｋｓ変異をまたぐゲノムＤＮＡを、特異的プライマー（5'-CACAGGAATGTGTGTTCAGA -3'（配列番号：９）及び5'- GGTCCACTGGTCTAGGTAAA -3'（配列番号：１０））を用いたＰＣＲにより増幅し、続いてＰＣＲ産物をＢｓｒＩ制限酵素により消化した。野生型マウスは、１４７ｂｐ及び４２ｂｐの２つのバンドを示し、一方Ｅｋｓアレルは１８９ｂｐの１つのバンドを示す。
【００７９】
骨格及び組織学的標本調製
既述(Kessel and Gruss. 1990)の様に、Ｅ１７．５胎仔の骨および軟骨をアリザリンレッド及びアルシアンブルーにより染色した。組織学的標本作製のため、組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍに薄切し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。
【００８０】
In situ ハイブリダイゼーション
既述(Kessell and Gruss. 1991)の様に、放射線標識されたＦｇｆ９(MGI: 104723)、Ｇｄｆ５(MGI: 95688)、Ｃｏｌ２ａ１(MGI: 88452)、Ｓｐｐ１(MGI: 98389)、Ｒｕｎｘ２(MGI: 99829)、Ｆｇｆｒ１(MGI: 95522)、Ｆｇｆｒ２(MGI: 95523)及びＦｇｆｒ３(MGI: 95524)のＲＮＡを用いて、パラフィン切片のＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ホールマウントＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを既述(Iseki et al., 1997)の様に行った。
【００８１】
分析的超遠心分離
全ての分析的超遠心分離は、Beckman Coulter XL-I分析的超遠心分離機を用いて行った。サンプルを１２０ｍＭ ＮａＣｌを含む、２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に溶解した。比容積はSEDNTERP ソフトウェアにより０．７３１７ｍＬ／ｇ(正常型ＦＧＦ９タンパク質；ＦＧＦ９ＷＴ)又は０．７３２２ｍＬ／ｇ(Ｅｋｓ変異型ＦＧＦ９タンパク質；ＦＧＦ９Ｅｋｓ)と見積もられた。全ての実験は２０℃、２８０ｎｍの吸光波長で行われた。沈降平衡試験は、６チャンネルセンターピースにより、０．８、０．４及び０．２ｍｇ／ｍｌで行った。ＦＧＦ９ＷＴについては１２、１４及び１６ｋｒｐｍで、ＦＧＦ９Ｅｋｓについては１４、１６及び１８ｋｒｐｍでデータを取得した。、１２、１４及び１６時間において各スピードについてのスキャンを取るために１６時間の全平衡時間を用いた。沈降平衡データをBeckman XL-A/XL-Iデータ解析ソフトウェアを用いて解析した。沈降速度試験は、ダブルセクターセンターピースにより行った。タンパク質濃度は０．４、０．３又は０．２ｍｇ／ｍｌで行った。吸光度データは４０ｋｒｐｍで５分間毎に１００回スキャンした。測定データはSEDFITソフトウェアで解析した。
【００８２】
マイトジェニックアッセイ
ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓがＦＧＦＲを介してシグナルを伝達する能力を、特定のＦＧＦＲを発現しているＢａＦ３細胞を用いたマイトジェニックアッセイにより、既述(Ornitz et al., 1996)の様に解析した。９６ウェルアッセイプレートの１ウェルあたり５０００個の細胞を、多様な濃度のＦＧＦ９及びヘパリン(Wako)を含む培地中へ播種した。ヘパリンとＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓを各ウェルに加え、全量を１ウェルあたり２００μｌとした。次に細胞を３７℃で３６時間インキュベートした。２０μｌの培地に溶解した１μＣｉの［３Ｈ］チミジンを各ウェルに加えた。４時間後に、グラスファイバー紙を通す濾過により細胞を回収し、取り込まれた［３Ｈ］チミジンをWallac MicroBeta TriLuxシンチレーションカウンター(PerkinElmer)でカウントした。
【００８３】
ヘパリン親和性クロマトグラフィー
３ｍｇのＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを、１２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した１ｍｌのHiTrapヘパリンカラム（GE healthcare）にロードした。結合したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを、同一の緩衝液中でのＮａＣｌの線形グラジエント（１２０ｍＭ〜２．０Ｍ）で溶出した。
【００８４】
ＦＧＦ９−ヘパリン相互作用の表面プラズモン共鳴分析
ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及びＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリンの相互作用を測定するための表面プラズモン共鳴分析をBIAcore 3000装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いて行った。ストレプトアビジン結合センサーチップＳＡ上へヘパリン(Wako)を固相化するために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の１００μｇ／ｍｌビオチン化ヘパリンを１０μｌ／分の流速で注入し、６３反応単位（ＲＵ）固相化した。全ての試験は室温で行い、容積容量効果（bulk solvent effects）による屈折率異常は、使用したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ濃度での非コートセンサーチップ上の反応を差し引くことにより補正した。動力学的なデータを得るために、ＨＢＳ−ＥＰ中の、異なる濃度の解析対象（ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ）を、２０μｌ／分の流速で、ヘパリンセンサーチップ上へ注入した。各サンプル注入の最後（１２０ｓ）に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液をセンサーの表面を通過させ、解離相をモニターした。１２０ｓの解離に続き、５μｌの１ＭのＮａＣｌ（ＨＢＳ−ＥＰ中）の注入によりセンサー表面を完全に再生した。各相互作用の動力学的パラメータを決定するために、５つの異なる解析対象濃度を用いた。動力学的パラメータは、BIAevaluationソフトウェアを用いてセンサグラムを包括的に１：１モデルにあてはめることにより得た。
【００８５】
分子動態（ＭＤ）シミュレーション
単量体ＦＧＦ９ＷＴ、二量体ＦＧＦ９ＷＴ、単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン、二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン、及びＦＧＦ９ＥｋｓについてのこれらのＭＤのためのスタートとなる構造は、PDB (PDB ID: 1IHK) (Plotnikov et al, 2001)から採用した。単量体ＦＧＦ９ＷＴ及び二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓの構造は、ＦＧＦ９ＷＴに基づき、分子モデリングソフトウェアＭＯＥ(Chemical Computing Group, Inc.)を用いて構築した。６糖(UAP-SGN-IDU-SGN-IDU-SGN)をヘパリンオリゴ糖として用いた。ＵＡＰは１，４−ダイデオキシ−５−デヒドロ−Ｏ２−スルホ−グルクロン酸、ＳＧＮはＯ６−ジスルホ−グルコサミン、ＩＤＵは１，４−ダイデオキシ−Ｏ２−スルホ−グルクロン酸である。単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及び二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリンシミュレーションのため、ヘパリンオリゴ糖を、ＭＤシミュレーションから獲得したＦＧＦ９ＷＴ構造へ、分子ドッキングプログラムＧＯＬＤ(version 3.0) (Verdonk et al, 2003)を用いて結合した。ドッキングプロトコールにおいては、標準的なＧＡパラメータの初期設定を用い、GoldScoreをスコアリング機能として用いた。単量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン及び二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリンの構造は、ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン複合体と同様に構築した。ＭＤシミュレーションのためのスタートとなる構造は、ＴＩＰ３Ｐ水分子で球状に囲んだ(Jorgensen et al., 1983)。エネルギー最小化の後、全てのＭＤシミュレーションは、MDGRAPE3システム(Narumi et al., 2006)のための改変Amber 8.0(Case et al., 2004)を用いて、３００Ｋで１０ｎｓの間行われた。アンバーｆｆ０３力場(Duan et al., 2003)を適用し、シミュレーション時間ステップを１ｆｓにセットした。結合自由エネルギーは、分子機能ポワソン−ボルツマン／表面面積(MM-PBSA)法(Srinivasan et al., 1998)により、最終２ｎｓ ＭＤ軌道を用いて計算した。
【００８６】
レトロウイルス性異所性発現
マウスＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓｃＤＮＡをRCASBP(A)ベクター(Hughes et al.,1987)中にクローニングした。ウイルス溶液を、ハンブルガー−ハミルトン（ＨＨ）段階１７のニワトリ胚の後肢芽中に注入した。マウスＦｇｆ９転写産物の発現及び骨格変化を、注入の２日及び５日後に、それぞれ調べた。
【００８７】
マウス胎仔頭蓋骨でのＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの皮下挿入
１００μｇ／ｍｌのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓに浸漬したAffiGel-Blueビーズ(Bio-Rad, Richmond, CA)をＥ１５マウス頭蓋骨上に、子宮外外科手術により既述(Iseki et al., 1997)の様に移植した。手術した頭を２４時間後に回収し、Ｓｐｐ１転写産物をホールマウントin situハイブリダイゼーションにより検出した。Ｓｐｐ１発現面積は、ＮＩＨイメージソフトウェアを用いて測定した。
【００８８】
マウス前肢芽内へのＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの移植
５００μｇ／ｍｌのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓに浸漬したAffiGel-Blueビーズ(Bio-Rad, Richmond, CA)を、Ｅ１０．５のＦｇｆ９−／−の前肢芽の背側及び中央領域内に移植した。次に、肢芽を、無血清培地［ＢＧＪｂ、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）］中で、湿性、３７℃及び５％ ＣＯ２環境にて、トランスウェルフィルター(Costar, Coaning)上で２時間培養した。外植片を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。ビーズの赤道を通る切片を、抗ヒトＦＧＦ９抗体(R&D Systems)並びに細胞及び組織染色キットHRP-AEC system (R&D Systems)を用いて、外因性のＦＧＦ９について解析した。シグナル面積及び強度をＮＩＨイメージソフトウェアを用いて解析した。
【００８９】
ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ発現及び精製
精製したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓは、Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えタンパク質製造を除き、本質的には既述(Koyama et al., 2001)の方法に従って製造した。最初の３３個のＮ末端残基は分泌にのみ関係しているので、本発明者らは、最初のＭｅｔ及びそれに続きＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの３５番目から２０８番目のポリペプチド配列をコードするｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲにより製造した。各断片をpColdIVバクテリア発現ベクター(Takara)内のNdeIとHindIII部位の間に挿入した。得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株に導入し、組換えタンパク質の生産を、１ｍＭ イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを補充したＳＢ培地中で、１５℃にて２４時間誘導した。バクテリアを回収し、続いてリソゾーム処理及び超音波処理により破砕した。遠心分離により細胞片を除去し、硫酸アンモニウムの２５％飽和による分画、及びそれに続いて５０％硫酸アンモニウムにより上清を沈降させることにより、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを上清から回収した(図９Ａ)。沈降物を２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、１％硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析した。得られた画分を、図１４に示すように、一連のクロマトグラフィーカラム（TOYOPEARL AF-Heparin HC- 650M カラム (TOSOH)、TOYOPEARL CM-650M カラム(TOSOH)、TOYOPEARL HW-50F カラム(TOSOH)）を通すことにより更に分画した。本発明者らは、これらのクロマトグラフィー工程を既述(Koyama et al., 2001)の緩衝液系を用いて行った。この方法により、２０ＬのＥ．ｃｏｌｉ培養液から、２００ｍｇの高度に精製されたＦＧＦ９ＷＴ及び１００ｍｇのＦＧＦ９Ｅｋｓを得た（図９Ｂ）。
【００９０】
分析的ゲル濾過クロマトグラフィー
精製したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（２ｍｇ／ｍｌを１００μｌ）を、１２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したSuperdex75 10/300 GLカラム (GE healthcare)にロードした。サンプルは同一の緩衝液で溶出した。
【００９１】
（結果）
ＥｋｓはＦｇｆ９におけるミスセンス変異により生じる
Ｅｋｓ変異はマウス第１４染色体上の多型マーカーD14Mit62とD14Mit5の間にマップされた(Murakami et al., 2002)。この区間に位置する１６９個の遺伝子の中から、Ｆｇｆ９に焦点をあてた。ホモのＥｋｓマウスからのＦｇｆ９ｃＤＮＡの配列解析の結果、第４２８位においてＡからＣへの置換が生じ、その結果Ａｓｎ１４３のＴｈｒへの置換が生じることが明らかとなった（図１Ａ）。興味深いことに、Ａｓｎ１４３残基はほとんどのＦＧＦタンパク質において高度に保存されている（図８）。
【００９２】
本発明者らは、遺伝学的なアプローチを用い、Ｆｇｆ９におけるＮ１４３Ｔ置換がＥｋｓ表現型に寄与するか否か決定した。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ変異によりC57BL/6、DBA/2J 及びJF1/Ms系統に存在するＢｓｒＩ制限酵素部位が除去されるので、ＰＣＲ断片をＢｓｒＩ消化することにより野生型と変異アレルとを区別することができる（図１Ｂ）。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ変異及びＥｋｓ座を遺伝学的に分離することができるか試験するため、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ/＋マウスを交雑受精させた。試験した９７６匹の子又は胎仔のうち、２３０匹（２４％）及び５１６匹（５３％）がそれぞれホモ接合性及びヘテロ接合性のＥｋｓ表現型を有しており、Ｎ１４３Ｔ変異についてそれぞれホモ接合性及びヘテロ接合性であった。従って、Ｅｋｓ表現型とＦｇｆ９における変異はすべての事例において共分離（co-segregate）されていた。
【００９３】
本発明者らは、次に、Ｅｋｓ表現型がＦｇｆ９ヌル変異の導入により改変され得るか試験した。ホモ接合性のＦｇｆ９ヌル変異体（Ｆｇｆ９−／−）は肺形成不全、雄から雌への性転換、及び近節短縮（rhizomelia）を呈するが、関節又は縫合線の骨癒合症は示さない(Colvin et al, 2001; Colvin et al., 2001; Hung et al., 2007)。本発明者らは、配合へテロ接合性変異体（Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−）の表現型を、Ｅｋｓホモ接合性マウス（Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ）及びＦｇｆ９−／−マウスと比較した。Ｆｇｆ９＋／−及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／＋マウスにおいて見られた微かな肺形成不全は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおいて顕著に悪化した（図１Ｃ）。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肺形成不全の程度は、Ｆｇｆ９−／−とＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓの中間であった。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肘骨癒合症は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて見られるように連結している軟骨の骨化を伴っていたが、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／＋、Ｆｇｆ９−／−及びＦｇｆ９＋／−マウスにおいては観察されなかった（図１Ｄ）。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスは性転換を示さなかった。２０００近くの減数分裂においてＥｋｓおよびＦｇｆ９の間での組換えがないこと、及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肺及び関節表現型がヘテロ接合体と比較して増強されていることは、Ｅｋｓ変異がＦｇｆ９における対立遺伝子であることの強力な証拠を提供する。
【００９４】
Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓと機能獲得型Ｆｇｆｒ変異体の表現型の類似
本発明者らは第１にＥｋｓ変異体と、Ｆｇｆｒ１(Wang et al., 2001)及びＦｇｆｒ２ｃ(Ｆｇｆｒ２Ｃ３４２Ｙ) (Eswarakumar et al., 2004)の機能獲得型変異体の間で表現型の類似点があるかどうか調べた。Ｆｇｆｒ１機能獲得型トランスジェニックマウスにおいては、肘関節発生の開始にまず障害が起こるので(Wang et al., 2001)、本発明者らはＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスの関節発生を調べた（図２Ａ）。Growth and differentiation factor 5 (Ｇｄｆ５）(Storm and Kingsley, 1996)及びprocollagen, type II alpha 1 (Ｃｏｌ２ａ１） (Nalin et al., 1995)が肘関節予定域と軟骨凝集でそれぞれ特異的に発現していた。関節腔予定域におけるＧｄｆ５発現が、Ｆｇｆ９＋／＋対照マウスにおいてＥ１１．５には観察されたが（図２Ａａ及び２Ａｅ）、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいては皆無であった（図２Ａｆ）。軟骨の解析により、Ｅ１１．５野生型胎仔では肘関節予定域におけるＣｏｌ２ａ１発現の欠失が観察された（図２Ａｇ）。Ｇｄｆ５発現の欠失と一致して、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／ＥｋｓマウスにおいてはＣｏｌ２ａ１発現の欠失部位が無かった（図２Ａｈ）。この分子表現型は、関節予定域において活性型Ｆｇｆｒ１キナーゼドメインを異所性に発現しているトランスジェニックマウスにおいて見られたものと極めて類似している(Wang et al., 2001)。
【００９５】
Ｆｇｆｒ２Ｃ３４２Ｙマウスにおける頭蓋骨縫合線の早期癒合は、頭蓋骨縫合線間充織内における過剰な造骨性の分化の結果である(Eswarakumar et al., 2004)。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスが同様の組織学的特徴を有しているか明らかにするため、本発明者らは、発生中の頭蓋骨縫合線における初期骨芽細胞分化マーカー、Secreted phosphoprotein 1 (Ｓｐｐ１、別名Osteopontin)(Iseki et al., 1997)及びRunt related transcription factor 2 (Ｒｕｎｘ２) (Yoshida et al., 2005)の発現を調べた。Ｅ１５．５において、Ｆｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスは、類似した頭蓋骨縫合線組織像を示した（図２Ｂａ−２Ｂｆ）。しかしながら、Ｅ１６．５では、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいては、Ｆｇｆ９＋／＋と比較して、前頭骨と頭頂骨の重なりが大きくなっていた（図２Ｂｇ及び２Ｂｈ）。前骨芽細胞及び骨芽細胞の分化マーカーあるＳｐｐ１の発現ドメインは、Ｆｇｆ９＋／＋マウスにおいては前頭骨及び頭頂骨の幅広い分離を示したが（図２Ｂｉ）、しかしながらＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいては顕著な重なりがあった（図２Ｂｊ）。Ｒｕｎｘ２は、前頭骨及び頭頂骨の先行端における未成熟な骨芽細胞において発現する。Ｅ１５．５及びＥ１６．５のＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスの両方において、Ｒｕｎｘ２発現が縫合を満たしたことは、頭蓋縫合線間充織内に未成熟な骨芽細胞が蓄積していることを示唆する（図２Ｂｆ及び２Ｂｌ）。更に、Ｒｕｎｘ２発現ドメインの強度は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて低いようであり（図２Ｂｌ）、このことは骨芽細胞の分化が亢進していることを示唆する。まとめると、これらの知見は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ変異が、将来の関節及び縫合線内における過剰なＦＧＦＲシグナルを媒介し、その結果、関節及び縫合線発生の開始を阻害することを示唆する。
【００９６】
Ｅｋｓ変異はＦＧＦ９のホモ二量体化を障害する
ＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質の二量体化の程度を分析的超遠心分離により比較した。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓをＥ．ｃｏｌｉで発現し、カラムクロマトグラフィーで精製した（図９）。
【００９７】
精製した組み換え型タンパク質ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの分子量及び平衡定数を沈降平衡遠心分離により決定した（図３Ａ及び３Ｂ）。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの測定された平均分子量は、それぞれ３９，２６４及び３２，９２９Ｄａであったのに対して、単量体の計算上の分子量は、それぞれ２０，０９０及び２０，０７７Ｄａであった。これらのデータは、ＦＧＦ９Ｅｋｓは単量体と二量体の両方として平衡状態で存在するが、ＦＧＦ９ＷＴはほとんどが二量体として存在することを示唆する。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの計算上の結合定数は、それぞれ１０．４μＭ−１及び０．１１９μＭ−１であった。これらの結果は、ゲル濾過カラムにおいてＦＧＦ９ＥｋｓがＦＧＦ９ＷＴと比較して遅れて溶出することと一致している（図１０）。本発明者らは更に沈降速度遠心分離によりＦＧＦ９Ｅｋｓの沈降係数を測定した。ｃ（ｓ）沈降係数分布のオーバーレイプロットは、ＦＧＦ９ＷＴが３．０Ｓに一峰性ピークを有するのに対して、ＦＧＦ９Ｅｋｓは二峰性のピーク（２．２Ｓ及び３．１Ｓ）を有する（図３Ｃ及び３Ｄ）。このことは、ＦＧＦ９Ｅｋｓが主に単量体として存在するのに対して、ＦＧＦ９ＷＴは主に二量体として存在することを示唆する。従って、ＦＧＦ９Ｅｋｓはホモ二量体形成が障害されており、このことは構造解析から推測されているＦＧＦ９の活性を制御する自己抑制機能に影響を及ぼし得る。
【００９８】
ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦＲｓを介した過剰なシグナリングを媒介しない
本発明者らは、次に個々の受容体を発現しているＢａＦ３細胞(Ornitz et al., 1996)に対するＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性を検定することにより、ＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９ＥｋｓのＦＧＦＲ活性化能力を比較した。ＦＧＦＲを発現しているＢａＦ３細胞株を、１μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で、様々な濃度のＦＧＦ９により処理した。ＦＧＦ９ＷＴと比較すると、ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦＲ１ｃ、−２ｂ、−２ｃ、−３ｂ及び−４を発現する細胞に対してより小さい活性を示した（表２、図１１Ａ−Ｇ）。
【００９９】
【表２】
【０１００】
表２は、ＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性とＦＧＦ９ＷＴのそれとの比較を示す。ＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性は、ＦＧＦ９濃度依存的アッセイについては２００及び１０００ｐＭ ＦＧＦ９の２つの濃度で、ヘパリン濃度依存的アッセイについては１．５６及び６．２５μｇ／ｍｌの濃度で平均化し、これらの濃度でのＦＧＦ９ＷＴの活性に対して標準化した。
【０１０１】
ヘパリンがＦＧＦ９活性を増強する能力を調べるために、ＢａＦ３細胞株を０．２nＭのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓの存在下で様々な濃度のヘパリンにより処理した。ＦＧＦ９Ｅｋｓは、一部のＦＧＦＲでヘパリン濃度依存的分裂促進応答を示さなかった（表２、図１１Ｈ−１１Ｎ）。ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦＲを介した過剰なシグナリングを示さなかったので、変異体タンパク質の他の特性がＥｋｓマウスの表現型に寄与すると考えられた。
【０１０２】
ＦＧＦ９におけるAsn143Thr変異はヘパリンに対する親和性を低減する
ＦＧＦ９Ｅｋｓの低減したヘパリン濃度依存的分裂促進活性は、ＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性が減少しているかもしれないことを示唆する。この可能性を調べるため、本発明者らはまず、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＦＧＦ９／ヘパリン親和性を測定した。ＦＧＦ９ＷＴは１．５０Ｍ ＮａＣｌで、単一ピークとしてヘパリン結合アガロースから溶出された（図４Ａ）。対照的に、ほとんどのＦＧＦ９Ｅｋｓは１．３８Ｍ ＮａＣｌで溶出され、少量の画分が１．１０Ｍ ＮａＣｌで溶出された。更に、ＦＧＦ９Ｅｋｓの溶出プロファイルはＦＧＦ９ＷＴのそれよりもブロードであった。
【０１０３】
本発明者らは、次に、表面プラズモン共鳴分析を用いてＦＧＦ９Ｅｋｓ／ヘパリン相互作用の速度定数を測定した（図４Ｂ及び４Ｃ）。得られたセンサーグラムを包括的に１：１相互作用モデルにあてはめ、動力学的パラメータを決定した(表３)。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
表３には、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓとヘパリンとの相互作用の動力学的パラメーターを示す。３つの独立した試験において、ｋａ、ｋｂ及びＫＤ値を分析対象（ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ）の５つの濃度を用いたセンサーグラムから算出した。
【０１０６】
ＦＧＦ９Ｅｋｓの結合速度定数（ｋａ）は、ＦＧＦ９ＷＴのそれよりもわずかに大きかったのに対し、ＦＧＦ９Ｅｋｓの解離速度定数（ｋｂ）は、ＦＧＦ９ＷＴのそれよりも１８倍大きかった。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの解離定数（ＫＤ）は、それぞれ０．７１±０．０２ｎＭ及び５．２４±０．０３ｎＭであり、このことはＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質のヘパリン親和性が８６％減少したことを意味する。
【０１０７】
単量体のＦＧＦ９は二量体のＦＧＦ９よりもヘパリンに対して低い親和性を有する
ＦＧＦ９Ｅｋｓ変異は、単量体／二量体平衡と同時に、ヘパリン／ＨＳへの親和性に影響を及ぼす。Ａｓｎ１４３Ｔｈｒ変異が、直接的にＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性に影響を及ぼしたのか、あるいは直接的にホモ二量体化に影響を及ぼし、二次的にヘパリン親和性に影響を及ぼしたのかは不明である。ＦＧＦ９の単量体型及び二量体型は平衡状態にあるので、この２種のＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性を直接生化学的に測定することは不可能である。本発明者らはそこで、分子動態（ＭＤ）シミュレーションを用いてＦＧＦ９の単量体及び二量体におけるヘパリン結合ドメインのコンフィギュレーションを解析し、ＭＭ−ＰＢＳＡ法を用いてＦＧＦ９とヘパリンの間の結合自由エネルギーを計算した。
【０１０８】
ＦＧＦ９ＷＴの二量体及びＦＧＦ９Ｅｋｓの二量体についてのＭＤシミュレーションは、Ｅｋｓ変異が２つのＦＧＦ９単量体の間の２つの水素結合の欠失を生じることを示した。二量体ＦＧＦ９ＷＴにおいてＡｓｎ１４３はＴｙｒ６７、Ａｒｇ６９、及びＴｙｒ１４５と単量体間水素結合を形成したが（図５Ａ）、Ｔｈｒ１４３は二量体ＦＧＦ９ＥｋｓにおいてＴｙｒ１４５のみと水素結合を形成した（図５Ｂ）。他の単量体間水素結合であるＡｒｇ６２−Ａｓｐ１９３及びＡｒｇ６４−Ａｓｐ１９３は、Ｅｋｓ変異により影響を受けなかった。結果として、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓについてのホモ二量体化の結合自由エネルギーは、それぞれ−１０１．２１及び−６９．４７ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。この違いから、ＦＧＦ９ＷＴと比較してＦＧＦ９Ｅｋｓは単量体／二量体平衡が単量体側へシフトしていると予想される。この予想は、図３に示した試験データとよく一致する。
【０１０９】
ＦＧＦ９のヘパリン結合親和性をモデル化するために、本発明者らは、２：２：２ ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン結晶構造(Protein Data Bank (PDB) ID: 1FQ9)(Schlessinger et al., 2000)に基づき、２：２ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及び２：２ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン複合体のＭＤシミュレーションを行った。それぞれの複合体における２つのヘパリンオリゴ糖の構造は強力な静電気的な反発により影響されるので、複合体から一方のヘパリンオリゴ糖がはじき出された(data not shown)。この解析は、２：２ ＦＧＦ９−ヘパリン複合体は不安定であることを示唆した。対照的に、２：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン、２：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン、１：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及び１：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン複合体のＭＤシミュレーションは、これらの複合体が安定であることを示唆した。ＦＧＦ９−ヘパリン複合体のＭＤシミュレーションは、２：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン）と２：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン）複合体とのヘパリン結合自由エネルギーの差を示さなかった（図５Ｃ及び５Ｄ）。これは、負にチャージしたヘパリンオリゴ糖鎖と、両方の二量体複合体における二量体接合面の溝のヘパリン結合部位に位置する塩基性アミノ酸残基の配列との間の強力な相互作用によるものである。更に、ヘパリンオリゴ糖鎖の可動性が静電的相互作用の維持を促進している。同様に、１：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン）と１：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（単量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン）複合体のヘパリン結合自由エネルギーに有意な差は無かった（図５Ｅ及び５Ｆ）。これもヘパリンオリゴ糖鎖の可動性、ヘパリンオリゴ糖鎖の強力な負のチャージ、及びヘパリン結合部位における多くの塩基性アミノ酸残基の存在によるものである。従って、Ｅｋｓ変異は単量体又は二量体ＦＧＦ９−ヘパリン複合体のヘパリン結合親和性に対して顕著には影響を与えない。二量体ＦＧＦ９のヘパリン結合自由エネルギー（図５Ｃ及び５Ｄ）は、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの両方の単量体ＦＧＦ９−ヘパリンよりも小さいので（図５Ｅ及び５Ｆ）、ＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質のヘパリンに対する親和性低下は、主には、単量体／二量体平衡が単量体側へシフトしたことによると強く示唆される。
【０１１０】
将来の肘関節及び頭蓋縫合線におけるＦｇｆ９及びＦｇｆｒの発現
本発明者らは、ＦＧＦ９Ｅｋｓはヘパリンに対する親和性が低いので、組織内におけるＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性が上昇し、正常なシグナリングドメインの外における異所性の局在を引き起こし、その結果としてＦＧＦＲｓの異所性の活性化を生じると仮説を立てた。
【０１１１】
本発明者らは、Ｅ１０．５及びＥ１１．５マウスの前肢芽におけるＦｇｆ９並びにＦｇｆｒ１、−２及び−３の発現を調べた。Ｆｇｆ９は、Ｆｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓの両方において、主に筋芽細胞において発現していた（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｉ、及び１２Ｊ）。Ｅ１０．５では、Ｆｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ組織の両方において、Ｆｇｆｒ１、−２及び−３は肢芽間充織において分散して発現しており、Ｃｏｌ２ａ１の発現ドメインと重なっていた（図１２Ｃ−１２Ｈ）。Ｅ１１．５ではＦｇｆｒ２及びＦｇｆｒ３が主に軟骨性凝集部位に発現し、Ｆｇｆｒ１は軟骨性凝集部位を囲むように発現していた（図１２Ｋ−１２Ｐ）。従って、肘関節予定域の間充織細胞でＦｇｆｒｓが発現している。
【０１１２】
以前の報告は、Ｆｇｆ９が発生中の前頭骨及び頭頂骨において発現し、特にその骨の周辺部において強く発現していることを示している(Hajihosseini and Heath, 2002)。Ｆｇｆｒ１、−２及び−３は発生中の前頭骨及び頭頂骨ドメインの中および周囲に発現している(Johnson et al., 2000)。従って、Ｆｇｆ９及びＦｇｆｒｓの発現パターンは、本発明者らの癒合発症機序モデルと矛盾がない。
【０１１３】
ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの異所性の発現はどちらも関節及び縫合線の発生を阻害し得る
本発明者らは次に、レトロウイルス（ＲＣＡＳ）形質導入によってニワトリ肢芽内にＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを異所性に発現させることにより、関節発生に対するＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの阻害効果を調べた。ＲＣＡＳ−ＦＧＦ９ＷＴ、ＲＣＡＳ−ＦＧＦ９Ｅｋｓ、又は空ＲＣＡＳウイルスを、側板中胚葉の将来の後肢芽領域に感染させた。外因性のＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓが感染の２日後には後肢芽全体に発現していた（図６Ａａ及び６Ａｂ）。空ウイルスを用いたときには、異常は観察されなかったが（図６Ａｃ−６Ａｅ）、ＦＧＦ９ＷＴの異所性発現は顕著な後肢関節癒合及び骨格の萎縮を引き起こした（図６Ａｃ）。骨格の萎縮は、Ｆｇｆ９をＣｏｌ２ａ１プロモーター及びエンハンサーの下で過剰発現させたトランスジェニックマウスにおいて観察されたそれと類似していた(Garofalo et al., 1999)。興味深いことに、ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９Ｅｋｓウイルスを感染に用いた場合には、膝関節形成は再現性よく障害されたが、後肢の萎縮は観察されなかった（図６Ａｄ）。このＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９Ｅｋｓとの違いは、あるＦＧＦＲを介したＦＧＦ９Ｅｋｓシグナリングが弱いことによるものかもしれない。関節形成の欠損は、後肢の遠位関節においてもみられ（図１３）、これはＦｇｆｒ１の機能獲得型トランスジェニックマウスにおいても見られた表現型である(Wang et al., 2001)。
【０１１４】
縫合線発生に対するＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの阻害効果を調べるため、ＦＧＦ９浸漬Ａｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅビーズを、Ｅ１５の正常マウス胎仔頭蓋骨の縫合線へ子宮外外科手術により移植した。移植手術の前に、本発明者らは１つのＡｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅビーズに含まれるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの量を調べ、およそ等量が含まれていることを確認した（図１４）。ＦＧＦ９により発現が誘導される初期骨芽細胞分化マーカーであるＳｐｐ１の発現を子宮内インキュベーションの２４時間後に調べた。正常なマウス胎仔では前頭骨原基と頭頂骨原基の間の縫合部ではＳｐｐ１発現が観察されないが、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの移植時は、双方とも、縫合部でＳｐｐ１発現が観察された（図６Ｂａ及び６Ｂｃ）。
【０１１５】
ＦＧＦ９Ｅｋｓは発生中の組織内においてＦＧＦ９ＷＴよりも拡散性が増大している
ＦＧＦ９Ｅｋｓの組織内拡散性増大がＥｋｓマウスにおける関節癒合表現型を説明し得るという仮説を更に検証するため、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性をビーズ移植後の頭蓋において測定した（図６Ｂ）。ＦＧＦ９はＳｐｐ１発現を誘導するので、本発明者らはＳｐｐ１の高発現領域を、ＦＧＦ９がその効果を及ぼす距離の指標として測定した。ＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの移植は、ＦＧＦ９ＷＴビーズの移植と比較して、Ｓｐｐ１が発現誘導された領域をより大きく拡大させ、このことはＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質はより広範な領域にわたり拡散し得ることを示唆する。
【０１１６】
次に、本発明者らはＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性を前肢芽において調べた。ＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ浸漬Ａｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅビーズを、Ｅ１０．５のＦｇｆ９−／−胎仔の背側及び中央の前肢芽領域内へ移植した。移植から２時間後に組織を固定、包埋し、ビーズの赤道部で切片を作成し、ビーズから間充織組織内へ放出されたＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質を、ＦＧＦ９抗体を用いて免疫組織化学的に検出した（図６Ｃａ及び６Ｃｂ）。ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦ９ＷＴよりもより広い範囲で肢芽間充織中に浸透しており（図６Ｃｃ）、ＦＧＦ９ＥｋｓがＦＧＦ９ＷＴよりも高拡散性であるという仮説を支持した。まとめると、本発明者らの結果は、Ｅｋｓ変異体マウスにおける関節形成阻害及び縫合線早期癒合は、細胞間隙を経由したＦＧＦ９Ｅｋｓの組織内高拡散による異所性のＦＧＦ９シグナリングによって生じたものであることを強く示唆する（図６Ｄ及び６Ｅ）。
【０１１７】
ホモ二量体化はＦＧＦ９／１６／２０サブファミリー(Mohammadi et al., 2005)及びＦＧＦ２(Ornitz et al., 1992; Venkataraman et al., 1999)でも報告されている。他のＦＧＦではホモ二量体化がその活性にどの程度影響を及ぼすのかはまだ知られていない。Ｆｇｆ９における変異が、ホモ二量体化、ヘパリン／ＨＳへの親和性及び生物学的活性に影響を与えたことは、ＦＧＦホモ二量体化に影響を与える医薬が、ＦＧＦ活性を調節するツールとして有用であることを示唆する。
【０１１８】
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【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、骨癒合症の発症リスクの新たな判定方法が提供される。従前には、ＦＧＦＲの変異が骨癒合症を引き起こすことが知られていたが、そのリガンドであるＦＧＦの変異の骨癒合症への関与は知られていない。従って、本発明は、従前とは全く異なる観点から骨癒合症の発症リスクを評価する方法を提供するものである。
また、本発明により、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低下した変異体ＦＧＦが提供される。本発明の変異体ＦＧＦは生体内での拡散性に優れており、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく、患部の深部にまで到達するので、浸透性の優れたＦＧＦ製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】ＥｋｓマウスのＦｇｆ９遺伝子におけるミスセンス変異。（Ａ）+/+ 及び Eks/Eksマウス由来のＦｇｆ９ ｃＤＮＡの核酸配列。Ｅｋｓ変異体は、４２８位にＡからＣへの置換を有しており、Ａｓｎ１４３のＴｈｒへの置換を生じる。Ｅｋｓミスセンス変異を矢頭で示し、対応するアミノ酸を紫で示す。（Ｂ）Ｅｋｓ変異のジェノタイピング。（Ａ）において検出されたＥｋｓ変異体におけるＦｇｆ９遺伝子の核酸置換を含む１８９ｂｐのゲノムＰＣＲ断片はＢｓｒＩ制限酵素により消化されないが、＋／＋、C57BL/6、DBA/2J及びJF1/Ms マウスからのＰＣＲ断片は消化された。（Ｃ）Ｆｇｆ９ヌルアレルの導入による、Ｅｋｓマウスにおける肺表現型の相乗的増強。Ｅ１７．５胎仔の肺の体重量比を各遺伝子型の間で比較した。データは、少なくとも５匹の胚の平均値±標準誤差により表す。Ｆｇｆ９＋／−及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／＋胚で見られる肺形成不全はＥｋｓ／−において有意に悪化する（アスタリスク）（ｐ＜０．００１）。（Ｄ）Ｆｇｆ９ヌルアレルの導入によるＥｋｓマウスにおける肘関節骨癒合症の状態の変化。Ｆｇｆ９＋／＋、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／＋、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／ＥｋｓマウスのＥ１７．５における前肢をアルシアンブルーおよびアリザリンレッドにより染色した。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肘関節骨癒合症の程度は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／＋とＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓとの間であった。
【図２】Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスの肘関節予定域における異所性軟骨細胞分化、および頭蓋縫合線における異常な骨芽細胞局在。（Ａ）肢芽における関節発生の解析。Ｅ１０．５およびＥ１１．５におけるＦｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ胎仔の前肢におけるＧｄｆ５およびＣｏｌ２ａｌ遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーションにより検出した。ｇにおける矢印は、肘関節予定域におけるＣｏｌ２ａｌ発現の間隙を示す。バー、１００μｍ。（Ｂ）頭蓋縫合線発生の解析。Ｅ１５．５及びＥ１６．５におけるＦｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ胎仔の頭蓋縫合線の切片を、ヘマトキシリン及びエオジン（ＨＥ）で染色し(a、b、g及びh)、示したプローブを用いたin situハイブリダイゼーション(c-f 及びi-l)により調べた。fb, 前頭骨； pb, 頭頂骨。バー、１００μｍ。
【図３】ＦＧＦ９Ｅｋｓは二量体形成が阻害されている。 分析的超遠心分離によりＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓのホモ二量体化を調べた。（Ａ及びＢ）沈降平衡法解析。０．４ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ９ＷＴ（Ａ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｂ）を用いたときの、１６０００ｒｐｍ、２０℃での沈降平衡状態における吸光度分布を示す。実線は、単一種と仮定する非相互作用分離モデルでのグローバル解析を行ったベストフィットプロットである。沈降平衡法のデータはBeckman XL-A/XL-I解析ソフトウェアで解析した。上のパネルは残差分析の結果である。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの平均分子量は、それぞれ、39,264 及び 32,929 Daと見積もられた。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの結合定数は、それぞれ、１０．４μＭ−１及び０．１１９μＭ−１と求められた。（Ｃ及びＤ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの沈降速度法解析。０．２、０．３及び０．４ｍｇ／ｍｌでの、ＦＧＦ９ＷＴ（Ｃ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｄ）の沈降係数分布。ＦＧＦ９ＷＴは３．０Ｓにおいて一峰性ピークを示す。ＦＧＦ９Ｅｋｓは二峰性のピーク（２．２Ｓ及び３．１Ｓ）を示す。
【図４】ＦＧＦ９Ｅｋｓのヘパリン親和性低下。 ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓのヘパリン親和性を、ヘパリン親和性クロマトグラフィー（Ａ）及び表面プラズモン共鳴解析（Ｂ及びＣ）を用いて調べた。（Ａ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓをヘパリン結合アガロースカラムにロードし、１２０ｍＭから２．０ＭへのＮａＣｌの線形グラジエントにより溶出した（黒線）。ＦＧＦ９ＷＴ（青線）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤線）の溶出は２８０ｎｍにおける吸光度により測定した。（Ｂ及びＣ）固相化したヘパリンとのＦＧＦ９ＷＴ（Ｂ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｃ）の相互作用のセンサーグラム。ＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ濃度を以下のように示す：６２．５ｎＭは赤、３１．３ｎＭは茶色、１５．６ｎＭは青色、７．８ｎＭは緑色、３．９ｎＭは紫色。バイオセンサーチップ反応を、Ｘ軸は時間、Ｙ軸はΔＲＵで示した。測定は室温で行った。
【図５】ＦＧＦ９のホモ二量体化はそのヘパリン親和性を制御する。 ＭＤシミュレーションの最終構造。重要な水素結合を形成するヘパリンとタンパク質残基を球及び棒及び空間充填モードで示す。各残基の名前を１文字表記アミノ酸コード、残基番号、及び鎖コードで示す。（Ａ及びＢ）二量体ＦＧＦ９ＷＴ（Ａ）及び二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｂ）についてのＭＤシミュレーションの最終構造。ＦＧＦ９のＮ１４３Ｔ置換は、単量体間水素結合の欠失を生じる。（Ｃ−Ｆ）二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（Ｃ）、二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（Ｄ）、単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（Ｅ）及び単量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（Ｆ）についてのＭＤシミュレーションの最終構造。各複合体について計算された結合自由エネルギーを構造の下に示す。データは、各々２００個のＭＤスナップショットから得たエネルギーの平均値±標準偏差として示す。
【図６】関節癒合及び頭蓋骨縫合線早期癒合症は、ＦＧＦ９Ｅｋｓの組織内高拡散性に由来するＦＧＦ９Ｅｋｓの異所性シグナル伝達が発症原因である可能性が高い。（Ａ）ニワトリ後肢芽におけるＦｇｆ９ＷＴ及びＦｇｆ９Ｅｋｓの異所性発現による関節癒合。ＨＨステージ１７のニワトリにＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９ＷＴ、ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９Ｅｋｓ又は空ＲＣＡＳウイルスを感染させ、Ｆｇｆ９ＷＴ又はＦｇｆ９Ｅｋｓの発現を誘導した。感染の２日後に、Ｆｇｆ９プローブを用いたin situハイブリダイゼーション（ａ及びｂ）及び感染の５日後に、アルシアンブルーでの染色（ｃ−ｅ）により後肢を調べた。ｃ−ｅ中の矢印は膝関節位置を示す。Ｆｇｆ９ＷＴ及びＦｇｆ９Ｅｋｓの異所性発現は膝関節癒合（ｃ−ｄ）を生じた。Ｆｇｆ９ＷＴの異所性発現は後肢の重篤な関節癒合を生じ（ｃ）、Ｆｇｆ９Ｅｋｓの異所性発現は骨格萎縮を生じなかった（ｄ）。（Ｂ）頭蓋骨原基におけるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散能測定。ＦＧＦ９タンパク質を含有するAffiGel-BlueビーズをＥ１５マウス頭蓋へ移植し、２４時間後にＥ１６でin situハイブリダイゼーションによりＳｐｐ１ ｍＲＮＡを検出し、頭蓋骨原基における外因性ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散能を評価した。（ａ−ｄ）Ｓｐｐ１についてのホールマウントin situハイブリダイゼーション。ＦＧＦ９ＷＴ（ａ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（ｃ）ビーズを移植した側は、局在化した強いシグナルを示し、これは外因性のＦＧＦ９タンパク質の拡散部位を意味している。移植していない対照側（ｂ及びｄ）は、前頭骨原基及び頭頂骨原基における内在性の発現を表す弱いシグナルのみ検出された。（ｅ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性。前頭骨原基及び頭頂骨原基における拡散面積（％）を、全シグナルに対する強いシグナルの面積比から推定した。データは６回の操作の平均値±標準誤差で示す（ｐ＜０．００５）。ＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤色バー）はＦＧＦ９ＷＴ（青色バー）よりも高い拡散性を示す。（Ｃ）ＦＧＦ９タンパク質を含有するAffiGel-Blueビーズの移植による、Ｅ１０．５前肢芽におけるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性の試験。移植２時間後の外因性のＦＧＦ９ＷＴ（ａ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（ｂ）の拡散をＦＧＦ９抗体により検出した。（ｃ）ＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散面積の比較。データは５回の操作の平均値（ＦＧＦ９ＷＴ＝１００％）±標準誤差で表す。ＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤色バー）の拡散性がＦＧＦ９ＷＴ（青色バー）の拡散性よりも高いことは統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。（Ｄ）Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおける肘関節癒合症の発症メカニズム。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて、肘関節予定域におけるＦＧＦ９Ｅｋｓの過剰拡散による異所性ＦＧＦ９シグナリングが関節癒合症を誘導し得る。（Ｅ）Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおける頭蓋骨縫合線早期癒合症の発症メカニズム。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて、頭蓋縫合線におけるＦＧＦ９Ｅｋｓの過剰拡散による異所性ＦＧＦ９シグナリングが縫合線早期癒合を誘導し得る。
【図７】Ｅｋｓホモ接合性マウスにおける肺形成不全。（Ａ−Ｂ）出生時の＋／＋（Ａ）及びＥｋｓ／Ｅｋｓ（Ｂ）マウスの肺。
【図８】構造に基づくヒトＦＧＦの配列アライメント。 ＦＧＦ９ＥｋｓにおけるＮ１４３Ｔ変異周辺のアミノ酸配列と、他のヒトＦＧＦファミリータンパク質の対応するドメインの配列とを配列同一性に基づき整列した。ＦＧＦ９におけるＡｓｎ１４３と平行する位置の各ＦＧＦタンパク質のアミノ酸を赤色ボックスで示す。
【図９】ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質の精製。（Ａ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質の精製に用いた方法の概要。（Ｂ）精製したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓのＳＤＳ／ＰＡＧＥ。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの両方とも、約２０ｋＤａの分子量に検出された。
【図１０】ゲル濾過クロマトグラフィー上で、ＦＧＦ９Ｅｋｓの分子量はＦＧＦ９ＷＴの分子量よりも小さい。 サンプルを別々にSuperdex 75 10/300 GLカラムへアプライした。溶出されたＦＧＦ９ＷＴ（青線）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤線）は２８０ｎｍでの吸光度で検出した。矢印は分子量マーカーの溶出位置を示す：６７ｋＤａ、アルブミン；４３ｋＤａ、オボアルブミン；２５ｋＤａキモトリプシノゲン；１３．７ｋＤａ、リボヌクレアーゼＡ。
【図１１】ＦＧＦ９ＥｋｓのＦＧＦＲを介したシグナル伝達能力の部分変化。（Ａ−Ｇ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓのＦＧＦ９濃度用量依存的細胞分裂促進活性。ＦＧＦＲ１ｂ（Ａ）、ＦＧＦＲ１ｃ（Ｂ）、ＦＧＦＲ２ｂ（Ｃ）、ＦＧＦＲ２ｃ（Ｄ）、ＦＧＦＲ３ｂ（Ｅ）、ＦＧＦＲ３ｃ（Ｆ）又はＦＧＦＲ４（Ｇ）を発現しているＢａＦ３細胞を、１μｇ／ｍｌヘパリンの存在下で、様々な濃度のＦＧＦ９ＷＴ（青丸）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤三角）で処理した。細胞増殖は、３６時間培養後の［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定した。ヘパリン濃度依存的なＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性。ＦＧＦＲ１ｂ（Ｈ）、ＦＧＦＲ１ｃ（Ｉ）、ＦＧＦＲ２ｂ（Ｊ）、ＦＧＦＲ２ｃ（Ｋ）、ＦＧＦＲ３ｂ（Ｌ）、ＦＧＦＲ３ｃ（Ｍ）又はＦＧＦＲ４（Ｎ）を発現しているＢａＦ３細胞を、０．２ｎＭのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓの存在下で様々な濃度のヘパリンにより処理した。細胞増殖を上述のように決定した。データは三連の測定結果の平均値±標準誤差である。これらのデータは少なくとも２つの独立した試験のうちの代表的なものである。
【図１２】Ｆｇｆ９は筋芽細胞に発現しており、一方Ｆｇｆｒｓは肘関節予定域の間充織細胞に発現している。 Ｅ１０．５及びＥ１１．５の両方でのＦｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ胎仔の前肢芽におけるＦｇｆ９、Ｆｇｆｒ１、Ｆｇｆｒ２及びＦｇｆｒ３の発現をin situハイブリダイゼーションにより検出した。バー、１００μｍ。
【図１３】Ｆｇｆ９ＷＴ及びＦｇｆ９Ｅｋｓ異所性発現後のニワトリ後肢の遠位関節癒合。 ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９ＷＴ（Ａ）、ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９Ｅｋｓ（Ｂ）、又は空ＲＣＡＳウイルス（Ｃ）を感染させた後のニワトリ後肢をアルシアンブルーで染色した。Ａ−Ｃにおける矢印は遠位関節を示す。
【図１４】AffiGel-BlueビーズのＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ容量。 AffiGel-BlueビーズのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ保持量を測定した。ビーズをＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ溶液（５００μｇ／ｍｌ）中に浸漬し、続けてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング解析によりＦＧＦ９を検出することで決定した。レーン１−６、１レーンあたり、ＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ溶液（５００μｇ／ｍｌ）に浸漬した１個のビーズのウェスタンブロッティング。レーン７、８、組換えＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（１００ｎｇ）。１個のAffiGel-Blueに含まれるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの量はおよそ等しい。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異体ＦＧＦ及びその用途に関する。より具体的には、本発明は硫酸化プロテオグリカンに対する親和性の低下した変異体ＦＧＦ、該変異体ＦＧＦを含む医薬、該変異体ＦＧＦの有無を検出することを特徴とする骨癒合症の発症リスクの判定方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格形態発生は、関節の協調した発生を伴い、その位置が骨格のレイアウトを決定する。関節は構造的及び機能的に不均一である。滑膜関節は、軟骨細胞の初期凝集から生じ、引き続き関節腔により隔てられた別々の骨格構造へ分化する。対照的に、縫合線は、未熟で急速に分裂している造骨性の前駆体（このうちの一部は骨芽細胞となり、新たな骨を産生する）を含む、狭い領域により隔てられた２つの骨の板を含む。
【０００３】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）受容体における機能獲得型の変異は、軟骨異形成症及び頭蓋骨縫合線早期癒合症を生じ、骨および関節の両方の発生におけるＦＧＦシグナリングの機能に脚光を当てている。特に、線維芽細胞増殖因子受容体２（Ｆｇｆｒ２）ローカスにおける優性変異が関与しているアントレー−ビクスラー症候群（Ａｎｔｌｅｙ−Ｂｉｘｌｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＡＢＳ）において橈上腕（radiohumeral）骨癒合症及び頭蓋骨縫合線早期癒合症が同時発生することは、滑膜関節及び縫合線発生の両方におけるＦＧＦシグナリングの寄与を示唆する（非特許文献１）。同様の症候群性の関節欠陥が、クルーゾン症候群に関連するＦｇｆｒ２ｃの機能獲得型を発現するマウス(非特許文献２)や、異所性で恒常的に活性なＦＧＦＲ１キナーゼドメインを発現しているマウス(非特許文献３)においても見られる。これらの知見は、ＦＧＦシグナリングが関節及び縫合線発生を阻害する一方で、軟骨形成及び／又は骨形成を促進することを示唆する。従って、ＦＧＦシグナリングに対する時空間的な制約が、骨および関節の両方の協調した発生を達成するのかもしれない。
【０００４】
局所的なＦＧＦシグナリングは、いくつかの異なるレベルにおいて調節されている。第１に、ＦＧＦリガンドの時空間的に制限された発現がある。２２のＦＧＦリガンドのなかで、ＦＧＦ２、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８は肢芽及び発生中の骨格において発現している。これらのうち、機能欠失型の変異により、ＦＧＦ２、ＦＧＦ９及びＦＧＦ１８の軟骨形成及び／又は骨形成への機能的関与が実証されている(非特許文献４〜７)。マウスにおけるＦＧＦ９の過剰発現による軟骨形成異常の表現型の誘導も、ＦＧＦ９が軟骨形成に影響を及ぼす能力を実証している(非特許文献８)。ＦＧＦシグナリングに関与する他のエレメントはヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧｓ）である。マウス及びキイロショウジョウバエにおける遺伝学的研究は、ＨＳＰＧｓがＦＧＦリガンドの分布及び受容体結合を制御することを示唆する(非特許文献９及び１０)。マウスにおいて、ＨＳＰＧグリコサミノグリカン鎖合成に必要な鍵となるグリコシルトランスフェラーゼ酵素であるＥｘｔ１における低形質変異は、肘及び膝関節の癒合を引き起こす(非特許文献１１)。特に、Ｅｘｔ１の神経特異的ノックアウトにより、脳パターン形成時のＦＧＦ８の適切な分布におけるヘパラン硫酸（ＨＳ）の必要性が明らかとなった。更に、他のＨＳ生合成遺伝子であるＮｄｓｔ１はレンズ発生の間のＦＧＦシグナリングに必要である。これらの知見を合わせると、ＦＧＦ／ＨＳ相互作用が、関節発生を含む器官発生時のＦＧＦシグナリングを制御していることが示唆される。最後に、ＦＧＦ９の構造解析により、ＦＧＦ９が、シグナル伝達能力に影響を与え得るホモ二量体を形成し得ることが示唆されている(非特許文献１２及び１３)。ＦＧＦ９のホモ二量体化は、ＦＧＦ９のいくつかの重要な受容体結合部位を閉鎖するため、自動阻害メカニズムがＦＧＦ９依存的シグナル伝達を調節するよう機能しているのかもしれない。しかしながら、この提唱された自動阻害メカニズムは、まだその機能の実証がなされていない。
【０００５】
以上のように、種々のＦＧＦが関節及び縫合線の発生に関与していること、そしてＦＧＦＲの機能獲得型変異により骨癒合症が誘導されることが報告されているが、そのリガンドであるＦＧＦの変異が骨癒合症を誘導することは全く知られていない。また、ＦＧＦの変異が硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性やその組織内拡散性に影響を及ぼすことも知られていない。
【０００６】
本発明者らは、自然発生マウス変異体、肘−膝関節癒合症（elbow-knee-synostosis、Eks）が、ＡＢＳ様骨格異常、橈上腕（radiohumeral）及び脛大腿（tibiofemoral）の骨癒合症、頭蓋骨縫合線早期癒合症及び肺形成不全を呈することを以前報告している（非特許文献１４）。
【０００７】
一方、特許文献１には、種々のＦＧＦ変異体が開示されている。該文献には、ＦＧＦの変異がその受容体特異性の変化を誘導することが記載されている。しかし、ＦＧＦの組織内拡散性や硫酸化グリコサミノグリカンとの親和性への影響については記載されていない。
【特許文献１】ＷＯ０２／０３６７３２
【非特許文献１】Reardon, W., Smith, A., Honour, J.W., Hindmarsh, P., Das, D., Rumsby, G., Nelson, I., Malcolm, S., Ades, L., and Sillence, D. et al., (2000). Evidence for digenic inheritance in some cases of Antley-Bixler syndrome? J. Med. Genet. 37, 26-32.
【非特許文献２】Eswarakumar, V.P., Horowitz, M.C., Locklin, R., Morriss-Kay, G.M., and Lonai, P. (2004). A gain-of-function mutation of Fgfr2c demonstrates the roles of this receptor variant in osteogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12555-12560.
【非特許文献３】Wang, Q., Green, R.P., Zhao, G., and Ornitz, D.M. (2001). Differential regulation of endochondral bone growth and joint development by FGFR1 and FGFR3 tyrosine kinase domains. Development 128, 3867-3876.
【非特許文献４】Montero, A., Okada, Y., Tomita, M., Ito, M., Tsurukami, H., Nakamura, T., Doetschman, T., Coffin, J.D., and Hurley, M.M. (2000). Disruption of the fibroblast growth factor-2 gene results in decreased bone mass and bone formation. J. Clin. Invest. 105, 1085-1093.
【非特許文献５】Hung, I.H., Yu, K., Lavine, K.J., and Ornitz, D.M. (2007). FGF9 regulates early hypertrophic chondrocyte differentiation and skeketal vascularization in the developing stylopod. Dev. Biol. 307, 300-313.
【非特許文献６】Liu, Z., Xu, J., Colvin J.S., and Ornitz, D.M. (2002). Coordination of chondrogenesis and osteogenesis by fibroblast growth factor 18. Genes Dev. 16, 859-869.
【非特許文献７】Ohbayashi, N., Shibayama, M., Kurotaki, Y., Imanishi, M., Fujimori T., Itoh, N., and Takada, S. (2002). FGF18 is required for normal cell proliferation and differentiation during osteogenesis and chondrogenesis. Genes Dev. 16, 870-879.
【非特許文献８】Garofalo, S., Kliger-Spatz, M., Cooke, J.L., Wolstin, O., Lunstrum, G.P., Moshkovitz, S.M., Horton, W.A., and Yayon, A. (1999). Skeletal dysplasia and defective chondrocyte differentiation by targeted overexpression of fibroblast growth factor 9 in transgenic mice. J. Bone Miner. Res. 14, 1909-1915.
【非特許文献９】Ornitz, D.M. (2000). FGFs, heparan sulfate and FGFRs: complex interactions essential for development. BioEssays 22, 108-112.
【非特許文献１０】Nybakken, K., and Perrimon, N. (2002). Heparan sulfate proteoglycan modulation of developmental signaling in Drosophila. Biochim. Biophys. Acta 19, 280-291.
【非特許文献１１】Koziel, L., Kunath, M., Kelly, O.G., and Vortkamp, A. (2004). Ext1-dependent heparin sulfate regulates the range of Ihh signaling during endochondral ossification. Dev. Cell 6, 801-813.
【非特許文献１２】Plotnikov, A.N., Eliseenkova, A.V., Ibrahimi, O.A., Shriver, Z., Sasisekharan, R., Lemmon, M.A. and Mohammadi, M. (2001). Crystal structure of fibroblast growth factor 9 reveals regions implicated in dimerization and autoinhibition. J. Biol. Chem. 276, 4322-4329.
【非特許文献１３】Hecht, H.J., Adar, R., Hofmann, B., Bogin, O., Weich, H., and Yayon, A. (2001). Structure of fibroblast growth factor 9 shows a symmetric dimer with unique receptor- and heparin-binding interfaces. Acta. Cryst. D57, 378-384.
【非特許文献１４】Murakami, H., Okawa, A., Yoshida, H., Nishikawa, S., Moriya, H., and Koseki, H.(2002). Elbow knee synostosis (Eks): a new mutation on mouse Chromosome 14. Mamm. Genome 13, 341-344.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の第１の目的は、関節癒合症や縫合線早期癒合症に関与し得る遺伝子変異を見出し、それに基づく該疾患の発症リスクの判定方法を提供することである。
本発明の第２の目的は、硫酸化グリコサミノグリカンに対する親和性や組織内拡散性が改変された変異体ＦＧＦを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、Ｅｋｓ変異マウスにおいて、Ａｓｎ１４３がＴｈｒに置き換わるＦｇｆ９遺伝子の新たなミスセンス変異を同定した。本発明者らは、この変異アレルをＦｇｆ９Ｅｋｓと命名し、この変異がＦＧＦ９のホモ二量体化を妨げ、その結果、ＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性が減少し、またＦＧＦＲ結合及び活性化が減少することを見出した。同時に、ＦＧＦ９Ｅｋｓが発生中の組織においてより拡散速度が早いことを見出した。これらの結果より、ＦＧＦ９Ｅｋｓが関節予定部位及び縫合線において、異所性のＦＧＦ９シグナリングを引き起こし、肘膝関節癒合及び縫合線早期癒合を発症させると強く示唆された。分子動態計算により、ＦＧＦ９Ｅｋｓのヘパリンに対する親和性の低下は、そのヘパリンに対する固有の親和性の変化よりも、むしろ単量体型の優性によるものであることが示唆された。そこで本発明者らは、ＦＧＦシグナリングがそのＨＳへの親和性の制御を通して制限されており、その少なくとも一部は、ＦＧＦ９の単量体／二量体平衡によりコントロールされていることを示唆した。
以上の知見に基づき、本発明が完成された。
【００１０】
即ち、本発明は以下に関する。
［１］ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換された変異体ＦＧＦポリペプチド。
［２］ＦＧＦがＦＧＦ９である、［１］記載のポリペプチド。
［３］ＡｓｎがＡｓｎ１４３である、［２］記載のポリペプチド。
［４］配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列を含む、［３］記載のポリペプチド。
［５］［１］〜［４］のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
［６］配列番号１、３、５、７、１１又は１３で表されるヌクレオチド配列を含む、［５］記載のポリヌクレオチド。
［７］配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の塩基番号４２８のシトシンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなる配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の部分配列、又はその相補配列を含むポリヌクレオチド。
［８］［５］記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［９］［８］記載のベクターが導入された形質転換体。
［１０］［１］記載のポリペプチドを含む医薬。
［１１］［２］記載のポリペプチドを含む骨折治療剤。
［１２］ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法。
［１３］ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出するための試薬を含む、骨癒合症の発症リスクの診断剤。
［１４］被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否か検定すること、及びＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質をＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として得ることを含む、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、骨癒合症の発症リスクの新たな判定方法が提供される。従前には、ＦＧＦＲの変異が骨癒合症を引き起こすことが知られていたが、そのリガンドであるＦＧＦの変異の骨癒合症への関与は知られていない。従って、本発明は、従前とは全く異なる観点から骨癒合症の発症リスクを評価する方法を提供するものである。
また、本発明により、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低下した変異体ＦＧＦが提供される。本発明の変異体ＦＧＦは生体内での拡散性に優れており、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく、患部の深部にまで到達するので、浸透性の優れたＦＧＦ製剤として有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
１．変異体ＦＧＦポリペプチド
本発明は、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するアスパラギン（Ａｓｎ）がスレオニン（Ｔｈｒ）に置換された変異体ＦＧＦポリペプチドを提供するものである。本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦのアミノ酸配列又はその部分配列を含み、且つ該アミノ酸配列においてＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換されている。
【００１３】
ＦＧＦは、公知のサイトカインであり、そのアミノ酸配列やヌクレオチド配列も公知である。本発明において用いられるＦＧＦは、哺乳動物由来のものであれば特に限定されない。該哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類等を挙げることが出来る。哺乳動物は、好ましくはげっ歯類（例えば、マウス）又は霊長類（例えば、ヒト）である。
【００１４】
ヒト及びマウスにおいては、ＦＧＦ１〜ＦＧＦ２３が確認されている（表１）。ヒトＦＧＦ１９はマウスＦＧＦ１５のオルソログであるので、ヒト及びマウスのＦＧＦファミリーは２２のメンバーで構成される（TRENDS in Genetics, Vol.20, No.11, p.563-569, 2004、Genome Biol., vol.2, 3005.1-3005.12, 2001）。本明細書において、ＦＧＦの呼称はヒトＦＧＦのノメンクラチャに従うものとする。表１に、ヒト及びマウスの野生型ＦＧＦのアミノ酸配列のGenbankアクセッション番号を示す。
【００１５】
【表１】
【００１６】
ＦＧＦは、系統発生学的解析に基づき７つのサブファミリー（ＦＧＦ１サブファミリー、ＦＧＦ４サブファミリー、ＦＧＦ７サブファミリー、ＦＧＦ８サブファミリー、ＦＧＦ９サブファミリー、ＦＧＦ１１サブファミリー及びＦＧＦ１９サブファミリー）に分類される。ＦＧＦ１サブファミリーは、ＦＧＦ１（ａＦＧＦ）及びＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）からなる。ＦＧＦ４サブファミリーは、ＦＧＦ４、ＦＧＦ５及びＦＧＦ６からなる。ＦＧＦ７サブファミリーは、ＦＧＦ３、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ１０及びＦＧＦ２２からなる。ＦＧＦ８サブファミリーは、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７及びＦＧＦ１８からなる。ＦＧＦ９サブファミリーは、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１６及びＦＧＦ２０からなる。ＦＧＦ１１サブファミリーは、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１３及びＦＧＦ１４からなる。ＦＧＦ１９サブファミリーは、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２１及びＦＧＦ２３からなる。
【００１７】
本発明に用いられるＦＧＦは、好ましくはＦＧＦ９サブファミリーのメンバーであり、より好ましくはＦＧＦ９である。
【００１８】
野生型のＦＧＦ９ポリペプチドは、溶液中で単量体とホモ二量体との間の平衡状態にある。ＦＧＦ９ポリペプチドのホモ二量体においては、ＦＧＦ９単量体同士が水素結合を介して会合している。後述の実施例の結果から、ＦＧＦ９ポリペプチドにおいては、この水素結合にアミノ酸番号１４３のアスパラギン（Ａｓｎ１４３）が寄与することが明らかになった。ＦＧＦのアミノ酸配列を配列同一性に基づき整列すると、ＦＧＦ９のＡｓｎ１４３に対応するＡｓｎが高度に保存されていることから（図８）、ＦＧＦ９以外のＦＧＦについても、このＡｓｎが単量体間水素結合に寄与している可能性が考えられる。各ＦＧＦにおいて単量体間水素結合に寄与するＡｓｎのアミノ酸番号を表１に示す。
【００１９】
尚、本明細書において、各ＦＧＦのアミノ酸番号は、野生型ＦＧＦの全長アミノ酸配列（即ち、シグナルペプチドが切断されていない未成熟フォームのアミノ酸配列）を基準として表す。基準となる野生型ＦＧＦの全長アミノ酸配列は、上記表１中のGenbankアクセッション番号で特定されるアミノ酸配列のうち２００８年３月１９日における最新バージョンのアミノ酸配列である。例えば、ヒトＦＧＦ９の基準アミノ酸配列のGenbankアクセッション番号のバージョンはBAA03572.1（GI:391719）であり、マウスＦＧＦ９の基準アミノ酸配列のGenbankアクセッション番号のバージョンはBAA07410.1（GI:1107459）である。
【００２０】
本発明のポリペプチドがＦＧＦの部分アミノ酸配列を含み、且つ該アミノ酸配列においてＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換されている場合、該部分アミノ酸配列は、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎを含み、且つ最終的に得られる変異体ＦＧＦポリペプチドが、野生型ＦＧＦの全長アミノ酸配列からなるポリペプチドと実質的に同質の活性を有している限り、その長さは限定されない。通常、該部分配列の長さは、通常１００アミノ酸以上、好ましくは１２０アミノ酸以上である。「実質的に同質の活性」としては、ＦＧＦの全長アミノ酸配列からなるポリペプチドのＦＧＦ受容体活性化機能等が挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に（例：生理学的に、又は薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば約０．１〜約１０倍、好ましくは約０．５〜約２倍）。ＦＧＦ受容体活性化機能は、対応するＦＧＦ受容体を発現したＢａＦ３細胞を変異体ＦＧＦポリペプチドの存在下で培養し、その増殖の程度を［３Ｈ］チミジンの取り込みにより測定することにより評価することができる。例えば、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドの活性はＦＧＦＲ２受容体を発現したＢａＦ３細胞を用いて評価することができる。
【００２１】
通常、ＦＧＦポリペプチドは、Ｎ末端に細胞外分泌のためのシグナルペプチドが結合した未成熟フォームとしてまず産生される。その後、シグナルペプチドが切断され、未成熟ＦＧＦは成熟ＦＧＦとなる。従って、ＦＧＦの部分アミノ酸配列の好ましい態様としては、ＦＧＦの全長アミノ酸配列からそのシグナル配列を除去して得られるアミノ酸配列（成熟ＦＧＦのアミノ酸配列）を挙げることができる。それぞれのＦＧＦのシグナルペプチドは、SignalP等の公知の配列解析ツールを用いて、各アミノ酸配列から推測することが可能である。例えば、ＦＧＦ９のシグナルペプチドは、Ｎ末端の１〜３３アミノ酸である。
【００２２】
本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドにおいては、ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換されている。例えば、本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドにおいては、Ａｓｎ１４３がＴｈｒに置換されている。この置換により、ＦＧＦのホモ二量体化に欠陥が生じ、硫酸化グリコサミノグリカン（ヘパリン、ヘパラン硫酸等）への親和性が低下し、生体内での拡散性が高まるものの、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦと実質的に同等の活性を有している。「実質的に同質の活性」としては、ＦＧＦの全長アミノ酸配列からなるポリペプチドのＦＧＦ受容体活性化機能等が挙げられる。「実質的に同質」とは、それらの活性が定性的に（例：生理学的に、又は薬理学的に）同質であることを意味する。したがって、上記の活性の程度といった量的要素については同等であることが好ましいが、異なっていてもよい（例えば約０．１〜約１０倍、好ましくは約０．５〜約２倍）。ＦＧＦ受容体活性化機能は、対応するＦＧＦ受容体を発現したＢａＦ３細胞を変異体ＦＧＦポリペプチドの存在下で培養し、その増殖の程度を［３Ｈ］チミジンの取り込みにより測定することにより評価することができる。例えば、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドの活性はＦＧＦＲ２受容体を発現したＢａＦ３細胞を用いて評価することができる。
【００２３】
尚、本明細書中、ＦＧＦ９におけるＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換を「Ｎ１４３Ｔ」と表す場合がある。また、Ａｓｎ１４３がＴｈｒに置換されたＦＧＦ９ポリペプチドを、「ＦＧＦ９Ｅｋｓ」と表す場合がある。
【００２４】
本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、ＦＧＦに由来するアミノ酸配列に加え、１または２個以上（例えば１〜５００個、好ましくは１〜１００個程度、より好ましくは１〜１５個程度）の付加的なアミノ酸を含んでいてもよい。このようなアミノ酸付加は、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドが、対応するＦＧＦ受容体活性化機能を有する限り許容される。付加されるアミノ酸配列は、特に限定されないが、例えば、ファーストメチオニン、ポリペプチドの検出や精製等を容易にならしめるためのタグを挙げることが出来る。タグとしては、Flagタグ、ヒスチジンタグ、c-Mycタグ、HAタグ、AU1タグ、GSTタグ、MBPタグ、蛍光タンパク質タグ（例えばGFP、YFP、RFP、CFP、BFP等）、イムノグロブリンFcタグ等を例示することが出来る。アミノ酸配列が付加される位置は、好ましくは、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端である。
【００２５】
本発明のポリペプチドに含まれる具体的なアミノ酸配列としては、配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列を挙げることができる。配列番号２で表されるアミノ酸配列は、野生型ヒトＦＧＦ９の全長アミノ酸配列のＡｓｎ１４３がＴｈｒに置換されたものである。配列番号４で表されるアミノ酸配列は、野生型マウスＦＧＦ９の全長アミノ酸配列のＡｓｎ１４３がＴｈｒに置換されたものである。配列番号６で表されるアミノ酸配列は、配列番号２で表されるアミノ酸配列から、シグナル配列（Ｎ末端の３３アミノ酸残基）を除去したものである。配列番号８で表されるアミノ酸配列は、配列番号４で表されるアミノ酸配列から、シグナル配列（Ｎ末端の３３アミノ酸残基）を除去したものである。配列番号１２で表されるアミノ酸配列は、配列番号６で表されるアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸（Ｓｅｒ）をＭｅｔに置換したものである。配列番号１４で表されるアミノ酸配列は、配列番号８で表されるアミノ酸配列の第１番目のアミノ酸（Ａｓｎ）をＭｅｔに置換したものである。
【００２６】
本発明のポリペプチドは修飾されていてもよい。該修飾としては、脂質鎖の付加（脂肪族アシル化（パルミトイル化、ミリストイル化等）、プレニル化（ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化等）等）、リン酸化（セリン残基、スレオニン残基、チロシン残基等におけるリン酸化）、アセチル化、糖鎖の付加（Ｎグリコシル化、Ｏグリコシル化）等を挙げることが出来る。
【００２７】
また、本明細書において用語「本発明のポリペプチド」は、その塩をも含む意味として用いられる。ポリペプチドの塩としては生理学的に許容される酸（例：無機酸、有機酸）や塩基（例：アルカリ金属塩）などとの塩が用いられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが挙げられる。
【００２８】
本発明のポリペプチドの製造方法については特に制限はなく、該ポリペプチドは公知のペプチド合成法に従って製造してもよく、また公知の遺伝子組み換え技術を用いて製造してもよい。ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。本発明のポリペプチドを構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするポリペプチドを製造することができる。
【００２９】
遺伝子組み換え技術を用いて本発明のポリペプチドを製造する場合には、先ず後述するような本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該ポリペプチドを製造することができる。該ポリヌクレオチド、遺伝子組み換え技術を用いた本発明のポリペプチドの製造方法については本明細書中後述する。
【００３０】
本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦポリペプチドと同様の生理活性を有しており、且つ野生型ＦＧＦポリペプチドと比較して、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低く、生体内での拡散性に優れている。本発明のポリペプチドを生体に投与すると、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく患部の深部にまで到達し得る。従って、本発明のポリペプチドは、創傷、褥創、火傷、血栓症、閉塞性動脈硬化症、骨疾患、脱毛症、肝臓病、膵臓病、糖尿病、腎臓病、心臓病、筋萎縮性側索硬化症等の治療薬として有用である。また、本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドは、骨癒合症の発症メカニズムの研究のための試薬や、後述の骨癒合症の発症リスクの判定方法におけるポジティブコントロールとしても有用である。
【００３１】
２．ポリヌクレオチド
本発明は上記本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供するものである。該ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該ポリヌクレオチドは二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドとしては、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号１１又は配列番号１３で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを挙げることが出来る。配列番号１で表されるヌクレオチド配列は配列番号２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号３で表されるヌクレオチド配列は配列番号４で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号５で表されるヌクレオチド配列は配列番号６で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号７で表されるヌクレオチド配列は配列番号８で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号１１で表されるヌクレオチド配列は配列番号１２で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、配列番号１３で表されるヌクレオチド配列は配列番号１４で表されるアミノ酸配列からなる本発明のポリペプチドを、それぞれコードする。
【００３３】
尚、本明細書において、Ａｓｎ１４３をコードするコドンがＴｈｒをコードするコドンに置換されたＦｇｆ９遺伝子変異アレルを「Ｆｇｆ９Ｅｋｓ」又は「Ｅｋｓアレル」と表す場合がある。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、公知の配列情報や本明細書の配列表に記載された配列情報を利用することにより適当なプライマーを設計し、ＦＧＦをコードするＤＮＡクローンやｃＤＮＡ等を鋳型として用い、ＰＣＲによって直接増幅することができる。或いは、配列情報に基づいて、ポリヌクレオチド合成装置により変異体ＦＧＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成してもよい。
【００３５】
取得された本発明のポリヌクレオチドは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ポリヌクレオチドはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
【００３６】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの製造（後述）や、本発明の判定方法（後述）に有用である。
【００３７】
また、本発明は、配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の塩基番号４２８のシトシンを含む１５塩基以上（例えば１８塩基以上、好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２５塩基以上）の連続したヌクレオチド配列からなる部分配列、又はその相補配列を含むポリヌクレオチド（本発明の部分ポリヌクレオチド）を提供する。
【００３８】
本発明の部分ポリヌクレオチドは、後述の判定方法において、変異ＦＧＦ９アレルを検出するためのプローブとして有用である。
【００３９】
３．ベクター及び形質転換体
本発明は、上記本発明のポリヌクレオチドを含むベクターを提供するものである。ベクターとしては発現ベクター、クローニングベクター等を挙げることができ、目的に応じて選択することが可能であるが、好ましくは、ベクターは発現ベクターである。該発現ベクターは、本発明のポリヌクレオチドを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に機能的に連結することにより製造することができる。ベクターの種類としては、プラスミドベクター、ウイルスベクター等を挙げることができ、用いる宿主に応じて適宜選択することが出来る。
【００４０】
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌（エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等）、バチルス属菌（バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）等）、酵母（サッカロマイセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）等）、昆虫細胞（夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Ｓｆ細胞）等）、昆虫（カイコの幼虫等）、哺乳動物細胞（ラット神経細胞、サル細胞（COS-7等）、チャイニーズハムスター細胞（CHO細胞等）等）等が用いられる。
【００４１】
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類やウサギ等の実験動物、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ミンク等の家畜、イヌ、ネコ等のペット、ヒト、サル、アカゲザル、マーモセット、オラウータン、チンパンジーなどの霊長類を挙げることが出来る。
【００４２】
プラスミドベクターとしては、大腸菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）、枯草菌由来のプラスミドベクター（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）、酵母由来プラスミドベクター（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）等を挙げることができ、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することが出来る。
【００４３】
ウイルスベクターの種類は、用いる宿主の種類や使用目的に応じて適宜選択することが出来る。例えば、宿主として昆虫細胞を用いる場合には、バキュロウイルスベクター等を用いることが出来る。また、宿主として哺乳動物細胞を用いる場合には、モロニーマウス白血病ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等のレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター等を用いることが出来る。
【００４４】
また、プロモーターは、用いる宿主の種類に対応して、該宿主内で転写を開始可能なものを選択することが出来る。例えば、宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。宿主が哺乳動物細胞である場合、サブゲノミック（２６Ｓ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
【００４５】
本発明のベクターは、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを、それぞれ機能可能な態様で含有していてもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎｅｏｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。
【００４６】
上記本発明のベクターを、自体公知の遺伝子導入法（例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム法、マイクロインジェクション法、プロプラスト融合法、エレクトロポレーション法、DEAEデキストラン法、Gene Gunによる遺伝子導入法等）に従って上記宿主へ導入することにより、該ベクターが導入された形質転換体（本発明の形質転換体）を製造することができる。導入されるベクターとして発現ベクターを使用することにより、該形質転換体は本発明のポリペプチドを発現し得る。本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドの製造などに有用である。
【００４７】
本発明の形質転換体を、宿主の種類に応じて、自体公知の方法で培養し、培養物から本発明のポリペプチドを単離することにより、本発明のポリペプチドを製造することが出来る。宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、ＬＢ培地やＭ９培地等の適切な培地中、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、適切な培地中、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。宿主が酵母である形質転換体の培養は、バークホールダー培地等の適切な培地中、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたGrace’s Insect medium等の適切な培地中、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。宿主が動物細胞である形質転換体の培養は、約１０％のウシ血清が添加されたＭＥＭ培地等の適切な培地中、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。いずれの培養においても、必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。培養物からの本発明のポリペプチドの単離・精製は、例えば、菌体溶解液や培養上清を、逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーなどの複数のクロマトグラフィーに供することにより達成することができる。
【００４８】
４．医薬
上述の通り、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、野生型ＦＧＦポリペプチドと実質的に同質の活性を維持しており、且つ野生型ＦＧＦポリペプチドと比較して、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低く、生体内での拡散性に優れている。本発明のポリペプチドを生体に投与すると、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく患部の深部にまで到達し得る。
【００４９】
一方、各ＦＧＦは、創傷、褥創、火傷、血栓症、閉塞性動脈硬化症、骨疾患、脱毛症、肝臓病、膵臓病、糖尿病、腎臓病、心臓病、筋萎縮性側索硬化症等の疾患の治療に有用であることが知られているか、もしくは示唆されている。
【００５０】
特にＦＧＦ２は、創傷、褥創、閉塞性動脈硬化症（血管新生効果）、ＦＧＦ５は閉塞性動脈硬化症（血管新生効果）、ＦＧＦ９は骨折、筋萎縮性側索硬化症、ＦＧＦ１８は骨折、脱毛症（発毛、育毛効果）の治療に有用であることが知られている。また、ＦＧＦ５は脱毛効果が知られている。
【００５１】
従って、本発明の変異体ＦＧＦポリペプチドは、患部への浸透性に優れた、上記各疾患の治療薬として有用である。
【００５２】
本発明のポリペプチドを含有する医薬製剤は、活性成分として該ポリペプチド単独で、あるいは任意の他の治療のための有効成分との混合物として含有することができる。また、それら医薬製剤は、活性成分を薬理学的に許容される一種もしくはそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られている任意の方法により製造される。
【００５３】
投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ましく、通常は、経皮、静脈内又は骨髄内等の非経口で投与される。
【００５４】
非経口投与に適当な製剤は、好ましくは受容者の血液と等張である活性化合物を含む滅菌水性剤からなる。例えば、注射剤の場合は、塩溶液、ブドウ糖溶液または塩水とブドウ糖溶液の混合物からなる担体等を用いて注射用の溶液を調製する。これら非経口剤には、更に、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することもできる。また、非経口に適当な製剤は、本発明のポリペプチドを注射用蒸留水または植物油に懸濁して調製したものであってもよく、この場合、必要に応じて基剤、懸濁化剤、粘調剤等を添加することができる。また、非経口に適当な製剤は、本発明のポリペプチドの粉末又は凍結乾燥品を用時溶解する形であってもよく、必要に応じて賦形剤等を添加することができる。
【００５５】
本発明のポリペプチドの投与量および投与回数は、投与形態、患者の年齢、体重、治療すべき症状の性質もしくは重篤度により異なるが、通常、静脈内投与等の非経口投与の場合、成人一人当り約０．００１ｍｇ〜１ｇを一日一回ないし数回投与する。しかしながら、これら投与量および投与回数に関しては、前述の種々の条件により変動する。
【００５６】
４．骨癒合症の発症リスクの判定方法
後述の実施例に示されるように、Ｆｇｆ９遺伝子においてＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異を有するＥｋｓマウスは、橈上腕（radiohumeral）、脛大腿（tibiofemoral）及び頭蓋骨縫合線において骨癒合症を発症する。従って、本発明は、ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法を提供するものである。
【００５７】
ポリペプチドにおける変異を直接検出する場合は、例えば、本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドを特異的に認識する抗体を用いた免疫学的手法により、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドの存在が免疫特異的に検出される。あるいは、マススペクトルにより、ポリペプチドの質量の変化として検出することも可能である。
【００５８】
免疫学的手法を用いる場合、例えば、まず被検脊椎動物から採取した生体試料より、変異体ＦＧＦ９ポリペプチドを測定可能なサンプルを調製する。生体試料としては、ＦＧＦ９を発現し得る部位（骨組織、軟骨組織、結合組織、腎臓組織、血清等）を用いることが好ましい。
【００５９】
変異体ＦＧＦ９をＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、スポット法、凝集法、抗体アレイ、表面プラズモン共鳴等の免疫学的方法により検出する場合、通常、生体試料より液体サンプルが調製される。例えば、生体試料が組織や細胞の場合、これらを機械的に破砕したり、可溶化剤で処理すること等により可溶化物を調製する。本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドをフローサイトメトリー法や免疫学的組織染色等の免疫学的方法により検出する場合は、組織や細胞等の生体試料は適宜固定等の処理に付され、抗体により染色される。
【００６０】
上記検出の結果、本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドが検出された場合、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することが出来る。反対に、本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドが検出されなかった場合は、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが低いと判定することが出来る。
【００６１】
また、後述の実施例に示すように、Ｅｋｓマウスにおいては、Ｆｇｆ９遺伝子座の一方のアレルのみがＮ１４３Ｔ変異を有している場合には、両方のアレルがＮ１４３Ｔ変異を有している場合と比較して骨癒合症の症状は軽微である。従って、上記検出の結果、本発明の変異ＦＧＦ９ポリペプチドが検出された場合であっても、同時に野生型ＦＧＦ９が検出された場合には、野生型ＦＧＦ９が検出されなかった場合と比較して、発症し得る骨癒合症の症状は軽微であると判定することが出来る。逆に野生型ＦＧＦ９が検出されなかった場合は、同時に野生型ＦＧＦ９が検出された場合と比較して、より重篤な骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することができる。
【００６２】
Ｆｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出する場合は、まず、被検脊椎動物から採取した生体試料から染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡを調製する。生体試料としては、上述の細胞、組織又は器官等が用いられるが、入手の容易性を考慮すれば、血液、毛髪、つめ、皮膚、粘膜等が用いられることが好ましい。また、変異の解析という観点からは、ＦＧＦ９ポリペプチドを発現し得る部位（骨組織、軟骨組織、結合組織、腎臓組織、血清等）を用いることが好ましい。生体試料からの染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの調製は、当該分野で周知の方法によって行なうことができ、また、市販のキットを用いてもよい。
【００６３】
上述のようにして得られた染色体ＤＮＡ、全ＲＮＡ又はｍＲＮＡに含まれる、ＦＧＦ９ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異を有するか否かを決定する。Ａｓｎ１４３をコードするコドンは、通常ＡＡＴ又はＡＡＣであり、好ましくはＡＡＣである。Ｔｈｒをコードするコドンは、通常ＡＣＴ、ＡＣＡ、ＡＣＣ又はＡＣＧであり、好ましくはＡＣＣである。
【００６４】
当該変異は周知の方法によって解析することができる。当該方法としては、例えば、ＲＦＬＰ（制限酵素切断断片長多型）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析）法（例えば、Biotechniques, 16, 296-297 (1994)参照）、ＡＳＯ（Allele Specific Oligonucleotide）ハイブリダイゼーション法（例えば、Clin. Chim. Acta, 189, 153-157 (1990)参照、ダイレクトシークエンス法（例えば、Biotechniques, 11, 246-249 (1991)参照）、ＡＲＭＳ（Amplification Refracting Mutation System）法（例えば、Nuc. Acids. Res., 19, 3561-3567 (1991)参照）、変性濃度勾配ゲル電気泳動（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis）法（例えば、Biotechniqus, 27, 1016-1018 (1999)参照）、ＲＮａｓｅＡ切断法（例えば、DNA Cell. Biol., 14, 87-94 (1995)参照）、化学切断法（例えば、Biotechniques, 21, 216-218 (1996)参照）、ＤＯＬ（Dye-labeled Oligonucleotide Ligation）法（例えば、Genome Res., 8, 549-556 (1998)参照）、ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ法（例えば、Genet. Anal., 14, 143-149 (1999)参照）、インベーダー法（例えば、Science, 5109, 778-783 (1993); Nat. Biotechnol., 17, 292-296 (1999) 参照）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption-time of Flight/Mass Spectrometry）法（Genome Res., 7, 378-388 (1997)参照）、ＴＤＩ（Template-directed Dye-terminator Incorporation）法(例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94, 10756-10761 (1997)参照)、サザンブロッティング法等が挙げられる。
【００６５】
例えば上述の本発明のポリヌクレオチドや部分ポリヌクレオチドをプローブとして用いることにより、ＡＳＯハイブリダイゼーション法や、ＲＮａｓｅＡ切断法によって変異の有無を検出することが可能である。或いは、配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２又は４についてはアミノ酸番号１４３のアミノ酸（Ａｓｎ又はＴｈｒである）を、配列番号６、８、１２又は１４についてはアミノ酸番号１１０のアミノ酸（Ａｓｎ又はＴｈｒである）をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマーを用いたＰＣＲの産物のヌクレオチド配列を解析することによって変異の有無を検出することが可能である。更に、変異により消失する制限酵素部位（例えばＢｓｒＩ）を利用して、ＰＣＲ産物の制限酵素消化産物の大きさを測定することによっても変異の有無を検出することが可能である。
【００６６】
上記検出の結果、上記変異が検出された場合、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することが出来る。反対に、上記変異が検出されなかった場合は、測定対象の脊椎動物個体は骨癒合症を発症するリスクが低いと判定することが出来る。
【００６７】
また、後述の実施例に示すように、Ｅｋｓマウスにおいては、Ｆｇｆ９遺伝子座の一方のアレルのみがＮ１４３Ｔ変異を有している場合には、両方のアレルがＮ１４３Ｔ変異を有している場合と比較して骨癒合症の症状は軽微である。従って、上記検出の結果、上記変異が検出された場合であっても、同時に野生型アレル（Ａｓｎ１４３をコードするコドン）が検出された場合には、野生型アレルが検出されなかった場合と比較して、発症し得る骨癒合症の症状は軽微であると判定することが出来る。逆に野生型アレルが検出されなかった場合は、同時に野生型アレルが検出された場合と比較して、より重篤な骨癒合症を発症するリスクが高いと判定することができる。
【００６８】
また、本発明は、ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出するための試薬を含む、骨癒合症の発症リスクの診断剤を提供する。該診断剤を用いることにより、上述の骨癒合症の発症リスクの判定を容易に実施することが可能である。
【００６９】
該試薬としては、特に限定されないが、例えば、
（１）本発明の変異体ＦＧＦ９ポリペプチドを特異的に認識する抗体；
（２）本発明のポリヌクレオチド；
（３）本発明の部分ポリヌクレオチド；
（４）配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドにおいて、配列番号２又は４についてはアミノ酸番号１４３のアミノ酸（該アミノ酸はＡｓｎ又はＴｈｒである）を、配列番号６、８、１２又は１４についてはアミノ酸番号１１０のアミノ酸（該アミノ酸はＡｓｎ又はＴｈｒである）をコードするコドンを含む領域を増幅し得るプライマー；
等を挙げることが出来る。
【００７０】
上述の試薬に加えて、更に上記検査方法において用いられる種々の試薬（例えば、タンパク質抽出用試薬、標識抗体、染色体ＤＮＡ調製試薬、全ＲＮＡ調製試薬、ｍＲＮＡ調製試薬、制限酵素（例えばＢｓｒＩ）、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、反応容器、検査プロトコールを記載した指示書など）を含めることにより、骨癒合症の発症リスクの判定用キットとしてもよい。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくことも出来る。また、必要に応じて保存剤や防腐剤を各要素に加えることも出来る。該判定用キットは、上記骨癒合症の発症リスクの判定を簡便に実施することを可能とするため極めて有用である。
【００７１】
５．スクリーニング方法
後述の実施例に示されるように、ＦＧＦのホモ二量体化が阻害され、単量体の存在量が多くなると、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低下する。従って、ＦＧＦのホモ二量体化をコントロールすることにより、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節することができる。そこで、本発明は、被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否か検定すること、及びＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質をＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として得ることを含む、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質のスクリーニング方法を提供する。
【００７２】
本発明のスクリーニング方法に供される被検物質は、いかなる公知化合物及び新規化合物であってもよく、例えば、核酸、糖質、脂質、蛋白質、ペプチド、有機低分子化合物、コンビナトリアルケミストリー技術を用いて作製された化合物ライブラリー、固相合成やファージディスプレイ法により作製されたランダムペプチドライブラリー、あるいは微生物、動植物、海洋生物等由来の天然成分等が挙げられる。
【００７３】
被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否かの検定においては、適当な緩衝液中でＦＧＦを被検物質と接触させ、被検物質の存在下におけるＦＧＦのホモ二量体化の程度を測定する。ホモ二量体化の程度の測定は、分析的超遠心分離やゲル濾過クロマトグラフィー等の公知の方法により行うことが出来る。例えば、分析的超遠心分離によれば、溶液中のＦＧＦの平均分子量を測定することが可能である。溶液中のＦＧＦが全て単量体の場合は、この平均分子量は、ＦＧＦ単量体の計算上の分子量と同一となる。一方、溶液中のＦＧＦが全て二量体である場合には、平均分子量はＦＧＦ単量体の計算上の分子量の２倍になる。そして、単量体と二量体とが共存する場合には、平均分子量はＦＧＦ単量体の計算上の分子量の１〜２倍の間の値を示し、二量体化が促進すると平均分子量は高くなるので、この平均分子量を指標に単量体／二量体比を算出することができる。
【００７４】
次いで、被検物質の存在下におけるＦＧＦのホモ二量体化の程度が、被検物質の非存在下におけるＦＧＦのホモ二量体化の程度と比較される。ホモ二量体化の程度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行なわれる。被検物質の非存在下におけるホモ二量体化の程度は、被検物質の存在中でのホモ二量体化の程度の測定に対し、事前に測定した値であっても、同時に測定した値であってもよいが、実験の精度、再現性の観点から同時に測定した値であることが好ましい。
【００７５】
比較の結果、ＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質が選択され、該物質がＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として獲得される。即ち、ＦＧＦのホモ二量体化を促進した被検物質はＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を増強する物質として獲得され、ＦＧＦのホモ二量体化を阻害した被検物質はＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を低下させる物質として獲得される。
【００７６】
上記スクリーニング方法により得られる物質を、ＦＧＦを含有する医薬と併用すると、ＦＧＦの生体内での拡散性を調節することができる。例えば、ＦＧＦを投与局所に局在化させたい場合には、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を増強する物質をＦＧＦと併用すればよい。一方、ＦＧＦを患部の深部にまで到達させたい場合には、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を低下させる物質をＦＧＦと併用すればよい。
【００７７】
以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下に示す実施例によって何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００７８】
（方法）
Ｆｇｆ９遺伝子の変異の検出
Ｅｋｓ変異体表現型に寄与する変異を同定するために、ｍＲＮＡの逆転写―ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びＲＴ−ＰＣＲ産物の直接シークエンシング(ABI PRIZM 310 Genetic Analyzer; Applied Biosystems, Foster City, CA)を通じて、正常マウス（＋／＋）、ヘテロ接合体マウス（Ｅｋｓ／＋）及びホモ接合体マウス（Ｅｋｓ／Ｅｋｓ）からのｃＤＮＡの配列を調べた。Ｅｋｓアレルのジェノタイピングのため、Ｅｋｓ変異をまたぐゲノムＤＮＡを、特異的プライマー（5'-CACAGGAATGTGTGTTCAGA -3'（配列番号：９）及び5'- GGTCCACTGGTCTAGGTAAA -3'（配列番号：１０））を用いたＰＣＲにより増幅し、続いてＰＣＲ産物をＢｓｒＩ制限酵素により消化した。野生型マウスは、１４７ｂｐ及び４２ｂｐの２つのバンドを示し、一方Ｅｋｓアレルは１８９ｂｐの１つのバンドを示す。
【００７９】
骨格及び組織学的標本調製
既述(Kessel and Gruss. 1990)の様に、Ｅ１７．５胎仔の骨および軟骨をアリザリンレッド及びアルシアンブルーにより染色した。組織学的標本作製のため、組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン中に包埋し、５μｍに薄切し、ヘマトキシリン及びエオジンで染色した。
【００８０】
In situ ハイブリダイゼーション
既述(Kessell and Gruss. 1991)の様に、放射線標識されたＦｇｆ９(MGI: 104723)、Ｇｄｆ５(MGI: 95688)、Ｃｏｌ２ａ１(MGI: 88452)、Ｓｐｐ１(MGI: 98389)、Ｒｕｎｘ２(MGI: 99829)、Ｆｇｆｒ１(MGI: 95522)、Ｆｇｆｒ２(MGI: 95523)及びＦｇｆｒ３(MGI: 95524)のＲＮＡを用いて、パラフィン切片のＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行った。ホールマウントＩｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを既述(Iseki et al., 1997)の様に行った。
【００８１】
分析的超遠心分離
全ての分析的超遠心分離は、Beckman Coulter XL-I分析的超遠心分離機を用いて行った。サンプルを１２０ｍＭ ＮａＣｌを含む、２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）中に溶解した。比容積はSEDNTERP ソフトウェアにより０．７３１７ｍＬ／ｇ(正常型ＦＧＦ９タンパク質；ＦＧＦ９ＷＴ)又は０．７３２２ｍＬ／ｇ(Ｅｋｓ変異型ＦＧＦ９タンパク質；ＦＧＦ９Ｅｋｓ)と見積もられた。全ての実験は２０℃、２８０ｎｍの吸光波長で行われた。沈降平衡試験は、６チャンネルセンターピースにより、０．８、０．４及び０．２ｍｇ／ｍｌで行った。ＦＧＦ９ＷＴについては１２、１４及び１６ｋｒｐｍで、ＦＧＦ９Ｅｋｓについては１４、１６及び１８ｋｒｐｍでデータを取得した。、１２、１４及び１６時間において各スピードについてのスキャンを取るために１６時間の全平衡時間を用いた。沈降平衡データをBeckman XL-A/XL-Iデータ解析ソフトウェアを用いて解析した。沈降速度試験は、ダブルセクターセンターピースにより行った。タンパク質濃度は０．４、０．３又は０．２ｍｇ／ｍｌで行った。吸光度データは４０ｋｒｐｍで５分間毎に１００回スキャンした。測定データはSEDFITソフトウェアで解析した。
【００８２】
マイトジェニックアッセイ
ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓがＦＧＦＲを介してシグナルを伝達する能力を、特定のＦＧＦＲを発現しているＢａＦ３細胞を用いたマイトジェニックアッセイにより、既述(Ornitz et al., 1996)の様に解析した。９６ウェルアッセイプレートの１ウェルあたり５０００個の細胞を、多様な濃度のＦＧＦ９及びヘパリン(Wako)を含む培地中へ播種した。ヘパリンとＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓを各ウェルに加え、全量を１ウェルあたり２００μｌとした。次に細胞を３７℃で３６時間インキュベートした。２０μｌの培地に溶解した１μＣｉの［３Ｈ］チミジンを各ウェルに加えた。４時間後に、グラスファイバー紙を通す濾過により細胞を回収し、取り込まれた［３Ｈ］チミジンをWallac MicroBeta TriLuxシンチレーションカウンター(PerkinElmer)でカウントした。
【００８３】
ヘパリン親和性クロマトグラフィー
３ｍｇのＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを、１２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化した１ｍｌのHiTrapヘパリンカラム（GE healthcare）にロードした。結合したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを、同一の緩衝液中でのＮａＣｌの線形グラジエント（１２０ｍＭ〜２．０Ｍ）で溶出した。
【００８４】
ＦＧＦ９−ヘパリン相互作用の表面プラズモン共鳴分析
ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及びＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリンの相互作用を測定するための表面プラズモン共鳴分析をBIAcore 3000装置(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を用いて行った。ストレプトアビジン結合センサーチップＳＡ上へヘパリン(Wako)を固相化するために、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中の１００μｇ／ｍｌビオチン化ヘパリンを１０μｌ／分の流速で注入し、６３反応単位（ＲＵ）固相化した。全ての試験は室温で行い、容積容量効果（bulk solvent effects）による屈折率異常は、使用したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ濃度での非コートセンサーチップ上の反応を差し引くことにより補正した。動力学的なデータを得るために、ＨＢＳ−ＥＰ中の、異なる濃度の解析対象（ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ）を、２０μｌ／分の流速で、ヘパリンセンサーチップ上へ注入した。各サンプル注入の最後（１２０ｓ）に、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液をセンサーの表面を通過させ、解離相をモニターした。１２０ｓの解離に続き、５μｌの１ＭのＮａＣｌ（ＨＢＳ−ＥＰ中）の注入によりセンサー表面を完全に再生した。各相互作用の動力学的パラメータを決定するために、５つの異なる解析対象濃度を用いた。動力学的パラメータは、BIAevaluationソフトウェアを用いてセンサグラムを包括的に１：１モデルにあてはめることにより得た。
【００８５】
分子動態（ＭＤ）シミュレーション
単量体ＦＧＦ９ＷＴ、二量体ＦＧＦ９ＷＴ、単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン、二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン、及びＦＧＦ９ＥｋｓについてのこれらのＭＤのためのスタートとなる構造は、PDB (PDB ID: 1IHK) (Plotnikov et al, 2001)から採用した。単量体ＦＧＦ９ＷＴ及び二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓの構造は、ＦＧＦ９ＷＴに基づき、分子モデリングソフトウェアＭＯＥ(Chemical Computing Group, Inc.)を用いて構築した。６糖(UAP-SGN-IDU-SGN-IDU-SGN)をヘパリンオリゴ糖として用いた。ＵＡＰは１，４−ダイデオキシ−５−デヒドロ−Ｏ２−スルホ−グルクロン酸、ＳＧＮはＯ６−ジスルホ−グルコサミン、ＩＤＵは１，４−ダイデオキシ−Ｏ２−スルホ−グルクロン酸である。単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及び二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリンシミュレーションのため、ヘパリンオリゴ糖を、ＭＤシミュレーションから獲得したＦＧＦ９ＷＴ構造へ、分子ドッキングプログラムＧＯＬＤ(version 3.0) (Verdonk et al, 2003)を用いて結合した。ドッキングプロトコールにおいては、標準的なＧＡパラメータの初期設定を用い、GoldScoreをスコアリング機能として用いた。単量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン及び二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリンの構造は、ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン複合体と同様に構築した。ＭＤシミュレーションのためのスタートとなる構造は、ＴＩＰ３Ｐ水分子で球状に囲んだ(Jorgensen et al., 1983)。エネルギー最小化の後、全てのＭＤシミュレーションは、MDGRAPE3システム(Narumi et al., 2006)のための改変Amber 8.0(Case et al., 2004)を用いて、３００Ｋで１０ｎｓの間行われた。アンバーｆｆ０３力場(Duan et al., 2003)を適用し、シミュレーション時間ステップを１ｆｓにセットした。結合自由エネルギーは、分子機能ポワソン−ボルツマン／表面面積(MM-PBSA)法(Srinivasan et al., 1998)により、最終２ｎｓ ＭＤ軌道を用いて計算した。
【００８６】
レトロウイルス性異所性発現
マウスＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓｃＤＮＡをRCASBP(A)ベクター(Hughes et al.,1987)中にクローニングした。ウイルス溶液を、ハンブルガー−ハミルトン（ＨＨ）段階１７のニワトリ胚の後肢芽中に注入した。マウスＦｇｆ９転写産物の発現及び骨格変化を、注入の２日及び５日後に、それぞれ調べた。
【００８７】
マウス胎仔頭蓋骨でのＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの皮下挿入
１００μｇ／ｍｌのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓに浸漬したAffiGel-Blueビーズ(Bio-Rad, Richmond, CA)をＥ１５マウス頭蓋骨上に、子宮外外科手術により既述(Iseki et al., 1997)の様に移植した。手術した頭を２４時間後に回収し、Ｓｐｐ１転写産物をホールマウントin situハイブリダイゼーションにより検出した。Ｓｐｐ１発現面積は、ＮＩＨイメージソフトウェアを用いて測定した。
【００８８】
マウス前肢芽内へのＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの移植
５００μｇ／ｍｌのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓに浸漬したAffiGel-Blueビーズ(Bio-Rad, Richmond, CA)を、Ｅ１０．５のＦｇｆ９−／−の前肢芽の背側及び中央領域内に移植した。次に、肢芽を、無血清培地［ＢＧＪｂ、２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、ペニシリン（５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）］中で、湿性、３７℃及び５％ ＣＯ２環境にて、トランスウェルフィルター(Costar, Coaning)上で２時間培養した。外植片を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中に包埋した。ビーズの赤道を通る切片を、抗ヒトＦＧＦ９抗体(R&D Systems)並びに細胞及び組織染色キットHRP-AEC system (R&D Systems)を用いて、外因性のＦＧＦ９について解析した。シグナル面積及び強度をＮＩＨイメージソフトウェアを用いて解析した。
【００８９】
ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ発現及び精製
精製したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓは、Ｅ．ｃｏｌｉでの組換えタンパク質製造を除き、本質的には既述(Koyama et al., 2001)の方法に従って製造した。最初の３３個のＮ末端残基は分泌にのみ関係しているので、本発明者らは、最初のＭｅｔ及びそれに続きＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの３５番目から２０８番目のポリペプチド配列をコードするｃＤＮＡ断片をＲＴ−ＰＣＲにより製造した。各断片をpColdIVバクテリア発現ベクター(Takara)内のNdeIとHindIII部位の間に挿入した。得られたプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１株に導入し、組換えタンパク質の生産を、１ｍＭ イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドを補充したＳＢ培地中で、１５℃にて２４時間誘導した。バクテリアを回収し、続いてリソゾーム処理及び超音波処理により破砕した。遠心分離により細胞片を除去し、硫酸アンモニウムの２５％飽和による分画、及びそれに続いて５０％硫酸アンモニウムにより上清を沈降させることにより、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを上清から回収した(図９Ａ)。沈降物を２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解し、１％硫酸アンモニウムを含む２５ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）に対して透析した。得られた画分を、図１４に示すように、一連のクロマトグラフィーカラム（TOYOPEARL AF-Heparin HC- 650M カラム (TOSOH)、TOYOPEARL CM-650M カラム(TOSOH)、TOYOPEARL HW-50F カラム(TOSOH)）を通すことにより更に分画した。本発明者らは、これらのクロマトグラフィー工程を既述(Koyama et al., 2001)の緩衝液系を用いて行った。この方法により、２０ＬのＥ．ｃｏｌｉ培養液から、２００ｍｇの高度に精製されたＦＧＦ９ＷＴ及び１００ｍｇのＦＧＦ９Ｅｋｓを得た（図９Ｂ）。
【００９０】
分析的ゲル濾過クロマトグラフィー
精製したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（２ｍｇ／ｍｌを１００μｌ）を、１２０ｍＭ ＮａＣｌを含む２５ｍＭの酢酸アンモニウム緩衝液（ｐＨ５．５）で平衡化したSuperdex75 10/300 GLカラム (GE healthcare)にロードした。サンプルは同一の緩衝液で溶出した。
【００９１】
（結果）
ＥｋｓはＦｇｆ９におけるミスセンス変異により生じる
Ｅｋｓ変異はマウス第１４染色体上の多型マーカーD14Mit62とD14Mit5の間にマップされた(Murakami et al., 2002)。この区間に位置する１６９個の遺伝子の中から、Ｆｇｆ９に焦点をあてた。ホモのＥｋｓマウスからのＦｇｆ９ｃＤＮＡの配列解析の結果、第４２８位においてＡからＣへの置換が生じ、その結果Ａｓｎ１４３のＴｈｒへの置換が生じることが明らかとなった（図１Ａ）。興味深いことに、Ａｓｎ１４３残基はほとんどのＦＧＦタンパク質において高度に保存されている（図８）。
【００９２】
本発明者らは、遺伝学的なアプローチを用い、Ｆｇｆ９におけるＮ１４３Ｔ置換がＥｋｓ表現型に寄与するか否か決定した。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ変異によりC57BL/6、DBA/2J 及びJF1/Ms系統に存在するＢｓｒＩ制限酵素部位が除去されるので、ＰＣＲ断片をＢｓｒＩ消化することにより野生型と変異アレルとを区別することができる（図１Ｂ）。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ変異及びＥｋｓ座を遺伝学的に分離することができるか試験するため、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ/＋マウスを交雑受精させた。試験した９７６匹の子又は胎仔のうち、２３０匹（２４％）及び５１６匹（５３％）がそれぞれホモ接合性及びヘテロ接合性のＥｋｓ表現型を有しており、Ｎ１４３Ｔ変異についてそれぞれホモ接合性及びヘテロ接合性であった。従って、Ｅｋｓ表現型とＦｇｆ９における変異はすべての事例において共分離（co-segregate）されていた。
【００９３】
本発明者らは、次に、Ｅｋｓ表現型がＦｇｆ９ヌル変異の導入により改変され得るか試験した。ホモ接合性のＦｇｆ９ヌル変異体（Ｆｇｆ９−／−）は肺形成不全、雄から雌への性転換、及び近節短縮（rhizomelia）を呈するが、関節又は縫合線の骨癒合症は示さない(Colvin et al, 2001; Colvin et al., 2001; Hung et al., 2007)。本発明者らは、配合へテロ接合性変異体（Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−）の表現型を、Ｅｋｓホモ接合性マウス（Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ）及びＦｇｆ９−／−マウスと比較した。Ｆｇｆ９＋／−及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／＋マウスにおいて見られた微かな肺形成不全は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおいて顕著に悪化した（図１Ｃ）。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肺形成不全の程度は、Ｆｇｆ９−／−とＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓの中間であった。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肘骨癒合症は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて見られるように連結している軟骨の骨化を伴っていたが、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／＋、Ｆｇｆ９−／−及びＦｇｆ９＋／−マウスにおいては観察されなかった（図１Ｄ）。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスは性転換を示さなかった。２０００近くの減数分裂においてＥｋｓおよびＦｇｆ９の間での組換えがないこと、及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肺及び関節表現型がヘテロ接合体と比較して増強されていることは、Ｅｋｓ変異がＦｇｆ９における対立遺伝子であることの強力な証拠を提供する。
【００９４】
Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓと機能獲得型Ｆｇｆｒ変異体の表現型の類似
本発明者らは第１にＥｋｓ変異体と、Ｆｇｆｒ１(Wang et al., 2001)及びＦｇｆｒ２ｃ(Ｆｇｆｒ２Ｃ３４２Ｙ) (Eswarakumar et al., 2004)の機能獲得型変異体の間で表現型の類似点があるかどうか調べた。Ｆｇｆｒ１機能獲得型トランスジェニックマウスにおいては、肘関節発生の開始にまず障害が起こるので(Wang et al., 2001)、本発明者らはＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスの関節発生を調べた（図２Ａ）。Growth and differentiation factor 5 (Ｇｄｆ５）(Storm and Kingsley, 1996)及びprocollagen, type II alpha 1 (Ｃｏｌ２ａ１） (Nalin et al., 1995)が肘関節予定域と軟骨凝集でそれぞれ特異的に発現していた。関節腔予定域におけるＧｄｆ５発現が、Ｆｇｆ９＋／＋対照マウスにおいてＥ１１．５には観察されたが（図２Ａａ及び２Ａｅ）、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいては皆無であった（図２Ａｆ）。軟骨の解析により、Ｅ１１．５野生型胎仔では肘関節予定域におけるＣｏｌ２ａ１発現の欠失が観察された（図２Ａｇ）。Ｇｄｆ５発現の欠失と一致して、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／ＥｋｓマウスにおいてはＣｏｌ２ａ１発現の欠失部位が無かった（図２Ａｈ）。この分子表現型は、関節予定域において活性型Ｆｇｆｒ１キナーゼドメインを異所性に発現しているトランスジェニックマウスにおいて見られたものと極めて類似している(Wang et al., 2001)。
【００９５】
Ｆｇｆｒ２Ｃ３４２Ｙマウスにおける頭蓋骨縫合線の早期癒合は、頭蓋骨縫合線間充織内における過剰な造骨性の分化の結果である(Eswarakumar et al., 2004)。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスが同様の組織学的特徴を有しているか明らかにするため、本発明者らは、発生中の頭蓋骨縫合線における初期骨芽細胞分化マーカー、Secreted phosphoprotein 1 (Ｓｐｐ１、別名Osteopontin)(Iseki et al., 1997)及びRunt related transcription factor 2 (Ｒｕｎｘ２) (Yoshida et al., 2005)の発現を調べた。Ｅ１５．５において、Ｆｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスは、類似した頭蓋骨縫合線組織像を示した（図２Ｂａ−２Ｂｆ）。しかしながら、Ｅ１６．５では、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいては、Ｆｇｆ９＋／＋と比較して、前頭骨と頭頂骨の重なりが大きくなっていた（図２Ｂｇ及び２Ｂｈ）。前骨芽細胞及び骨芽細胞の分化マーカーあるＳｐｐ１の発現ドメインは、Ｆｇｆ９＋／＋マウスにおいては前頭骨及び頭頂骨の幅広い分離を示したが（図２Ｂｉ）、しかしながらＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいては顕著な重なりがあった（図２Ｂｊ）。Ｒｕｎｘ２は、前頭骨及び頭頂骨の先行端における未成熟な骨芽細胞において発現する。Ｅ１５．５及びＥ１６．５のＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスの両方において、Ｒｕｎｘ２発現が縫合を満たしたことは、頭蓋縫合線間充織内に未成熟な骨芽細胞が蓄積していることを示唆する（図２Ｂｆ及び２Ｂｌ）。更に、Ｒｕｎｘ２発現ドメインの強度は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて低いようであり（図２Ｂｌ）、このことは骨芽細胞の分化が亢進していることを示唆する。まとめると、これらの知見は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ変異が、将来の関節及び縫合線内における過剰なＦＧＦＲシグナルを媒介し、その結果、関節及び縫合線発生の開始を阻害することを示唆する。
【００９６】
Ｅｋｓ変異はＦＧＦ９のホモ二量体化を障害する
ＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質の二量体化の程度を分析的超遠心分離により比較した。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓをＥ．ｃｏｌｉで発現し、カラムクロマトグラフィーで精製した（図９）。
【００９７】
精製した組み換え型タンパク質ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの分子量及び平衡定数を沈降平衡遠心分離により決定した（図３Ａ及び３Ｂ）。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの測定された平均分子量は、それぞれ３９，２６４及び３２，９２９Ｄａであったのに対して、単量体の計算上の分子量は、それぞれ２０，０９０及び２０，０７７Ｄａであった。これらのデータは、ＦＧＦ９Ｅｋｓは単量体と二量体の両方として平衡状態で存在するが、ＦＧＦ９ＷＴはほとんどが二量体として存在することを示唆する。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの計算上の結合定数は、それぞれ１０．４μＭ−１及び０．１１９μＭ−１であった。これらの結果は、ゲル濾過カラムにおいてＦＧＦ９ＥｋｓがＦＧＦ９ＷＴと比較して遅れて溶出することと一致している（図１０）。本発明者らは更に沈降速度遠心分離によりＦＧＦ９Ｅｋｓの沈降係数を測定した。ｃ（ｓ）沈降係数分布のオーバーレイプロットは、ＦＧＦ９ＷＴが３．０Ｓに一峰性ピークを有するのに対して、ＦＧＦ９Ｅｋｓは二峰性のピーク（２．２Ｓ及び３．１Ｓ）を有する（図３Ｃ及び３Ｄ）。このことは、ＦＧＦ９Ｅｋｓが主に単量体として存在するのに対して、ＦＧＦ９ＷＴは主に二量体として存在することを示唆する。従って、ＦＧＦ９Ｅｋｓはホモ二量体形成が障害されており、このことは構造解析から推測されているＦＧＦ９の活性を制御する自己抑制機能に影響を及ぼし得る。
【００９８】
ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦＲｓを介した過剰なシグナリングを媒介しない
本発明者らは、次に個々の受容体を発現しているＢａＦ３細胞(Ornitz et al., 1996)に対するＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性を検定することにより、ＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９ＥｋｓのＦＧＦＲ活性化能力を比較した。ＦＧＦＲを発現しているＢａＦ３細胞株を、１μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で、様々な濃度のＦＧＦ９により処理した。ＦＧＦ９ＷＴと比較すると、ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦＲ１ｃ、−２ｂ、−２ｃ、−３ｂ及び−４を発現する細胞に対してより小さい活性を示した（表２、図１１Ａ−Ｇ）。
【００９９】
【表２】
【０１００】
表２は、ＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性とＦＧＦ９ＷＴのそれとの比較を示す。ＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性は、ＦＧＦ９濃度依存的アッセイについては２００及び１０００ｐＭ ＦＧＦ９の２つの濃度で、ヘパリン濃度依存的アッセイについては１．５６及び６．２５μｇ／ｍｌの濃度で平均化し、これらの濃度でのＦＧＦ９ＷＴの活性に対して標準化した。
【０１０１】
ヘパリンがＦＧＦ９活性を増強する能力を調べるために、ＢａＦ３細胞株を０．２nＭのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓの存在下で様々な濃度のヘパリンにより処理した。ＦＧＦ９Ｅｋｓは、一部のＦＧＦＲでヘパリン濃度依存的分裂促進応答を示さなかった（表２、図１１Ｈ−１１Ｎ）。ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦＲを介した過剰なシグナリングを示さなかったので、変異体タンパク質の他の特性がＥｋｓマウスの表現型に寄与すると考えられた。
【０１０２】
ＦＧＦ９におけるAsn143Thr変異はヘパリンに対する親和性を低減する
ＦＧＦ９Ｅｋｓの低減したヘパリン濃度依存的分裂促進活性は、ＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性が減少しているかもしれないことを示唆する。この可能性を調べるため、本発明者らはまず、ヘパリン親和性クロマトグラフィーによりＦＧＦ９／ヘパリン親和性を測定した。ＦＧＦ９ＷＴは１．５０Ｍ ＮａＣｌで、単一ピークとしてヘパリン結合アガロースから溶出された（図４Ａ）。対照的に、ほとんどのＦＧＦ９Ｅｋｓは１．３８Ｍ ＮａＣｌで溶出され、少量の画分が１．１０Ｍ ＮａＣｌで溶出された。更に、ＦＧＦ９Ｅｋｓの溶出プロファイルはＦＧＦ９ＷＴのそれよりもブロードであった。
【０１０３】
本発明者らは、次に、表面プラズモン共鳴分析を用いてＦＧＦ９Ｅｋｓ／ヘパリン相互作用の速度定数を測定した（図４Ｂ及び４Ｃ）。得られたセンサーグラムを包括的に１：１相互作用モデルにあてはめ、動力学的パラメータを決定した(表３)。
【０１０４】
【表３】
【０１０５】
表３には、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓとヘパリンとの相互作用の動力学的パラメーターを示す。３つの独立した試験において、ｋａ、ｋｂ及びＫＤ値を分析対象（ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ）の５つの濃度を用いたセンサーグラムから算出した。
【０１０６】
ＦＧＦ９Ｅｋｓの結合速度定数（ｋａ）は、ＦＧＦ９ＷＴのそれよりもわずかに大きかったのに対し、ＦＧＦ９Ｅｋｓの解離速度定数（ｋｂ）は、ＦＧＦ９ＷＴのそれよりも１８倍大きかった。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの解離定数（ＫＤ）は、それぞれ０．７１±０．０２ｎＭ及び５．２４±０．０３ｎＭであり、このことはＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質のヘパリン親和性が８６％減少したことを意味する。
【０１０７】
単量体のＦＧＦ９は二量体のＦＧＦ９よりもヘパリンに対して低い親和性を有する
ＦＧＦ９Ｅｋｓ変異は、単量体／二量体平衡と同時に、ヘパリン／ＨＳへの親和性に影響を及ぼす。Ａｓｎ１４３Ｔｈｒ変異が、直接的にＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性に影響を及ぼしたのか、あるいは直接的にホモ二量体化に影響を及ぼし、二次的にヘパリン親和性に影響を及ぼしたのかは不明である。ＦＧＦ９の単量体型及び二量体型は平衡状態にあるので、この２種のＦＧＦ９のヘパリンに対する親和性を直接生化学的に測定することは不可能である。本発明者らはそこで、分子動態（ＭＤ）シミュレーションを用いてＦＧＦ９の単量体及び二量体におけるヘパリン結合ドメインのコンフィギュレーションを解析し、ＭＭ−ＰＢＳＡ法を用いてＦＧＦ９とヘパリンの間の結合自由エネルギーを計算した。
【０１０８】
ＦＧＦ９ＷＴの二量体及びＦＧＦ９Ｅｋｓの二量体についてのＭＤシミュレーションは、Ｅｋｓ変異が２つのＦＧＦ９単量体の間の２つの水素結合の欠失を生じることを示した。二量体ＦＧＦ９ＷＴにおいてＡｓｎ１４３はＴｙｒ６７、Ａｒｇ６９、及びＴｙｒ１４５と単量体間水素結合を形成したが（図５Ａ）、Ｔｈｒ１４３は二量体ＦＧＦ９ＥｋｓにおいてＴｙｒ１４５のみと水素結合を形成した（図５Ｂ）。他の単量体間水素結合であるＡｒｇ６２−Ａｓｐ１９３及びＡｒｇ６４−Ａｓｐ１９３は、Ｅｋｓ変異により影響を受けなかった。結果として、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓについてのホモ二量体化の結合自由エネルギーは、それぞれ−１０１．２１及び−６９．４７ｋｃａｌ／ｍｏｌであった。この違いから、ＦＧＦ９ＷＴと比較してＦＧＦ９Ｅｋｓは単量体／二量体平衡が単量体側へシフトしていると予想される。この予想は、図３に示した試験データとよく一致する。
【０１０９】
ＦＧＦ９のヘパリン結合親和性をモデル化するために、本発明者らは、２：２：２ ＦＧＦ２−ＦＧＦＲ１−ヘパリン結晶構造(Protein Data Bank (PDB) ID: 1FQ9)(Schlessinger et al., 2000)に基づき、２：２ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及び２：２ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン複合体のＭＤシミュレーションを行った。それぞれの複合体における２つのヘパリンオリゴ糖の構造は強力な静電気的な反発により影響されるので、複合体から一方のヘパリンオリゴ糖がはじき出された(data not shown)。この解析は、２：２ ＦＧＦ９−ヘパリン複合体は不安定であることを示唆した。対照的に、２：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン、２：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン、１：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン及び１：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン複合体のＭＤシミュレーションは、これらの複合体が安定であることを示唆した。ＦＧＦ９−ヘパリン複合体のＭＤシミュレーションは、２：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン）と２：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン）複合体とのヘパリン結合自由エネルギーの差を示さなかった（図５Ｃ及び５Ｄ）。これは、負にチャージしたヘパリンオリゴ糖鎖と、両方の二量体複合体における二量体接合面の溝のヘパリン結合部位に位置する塩基性アミノ酸残基の配列との間の強力な相互作用によるものである。更に、ヘパリンオリゴ糖鎖の可動性が静電的相互作用の維持を促進している。同様に、１：１ ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン）と１：１ ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（単量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン）複合体のヘパリン結合自由エネルギーに有意な差は無かった（図５Ｅ及び５Ｆ）。これもヘパリンオリゴ糖鎖の可動性、ヘパリンオリゴ糖鎖の強力な負のチャージ、及びヘパリン結合部位における多くの塩基性アミノ酸残基の存在によるものである。従って、Ｅｋｓ変異は単量体又は二量体ＦＧＦ９−ヘパリン複合体のヘパリン結合親和性に対して顕著には影響を与えない。二量体ＦＧＦ９のヘパリン結合自由エネルギー（図５Ｃ及び５Ｄ）は、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの両方の単量体ＦＧＦ９−ヘパリンよりも小さいので（図５Ｅ及び５Ｆ）、ＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質のヘパリンに対する親和性低下は、主には、単量体／二量体平衡が単量体側へシフトしたことによると強く示唆される。
【０１１０】
将来の肘関節及び頭蓋縫合線におけるＦｇｆ９及びＦｇｆｒの発現
本発明者らは、ＦＧＦ９Ｅｋｓはヘパリンに対する親和性が低いので、組織内におけるＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性が上昇し、正常なシグナリングドメインの外における異所性の局在を引き起こし、その結果としてＦＧＦＲｓの異所性の活性化を生じると仮説を立てた。
【０１１１】
本発明者らは、Ｅ１０．５及びＥ１１．５マウスの前肢芽におけるＦｇｆ９並びにＦｇｆｒ１、−２及び−３の発現を調べた。Ｆｇｆ９は、Ｆｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓの両方において、主に筋芽細胞において発現していた（図１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｉ、及び１２Ｊ）。Ｅ１０．５では、Ｆｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ組織の両方において、Ｆｇｆｒ１、−２及び−３は肢芽間充織において分散して発現しており、Ｃｏｌ２ａ１の発現ドメインと重なっていた（図１２Ｃ−１２Ｈ）。Ｅ１１．５ではＦｇｆｒ２及びＦｇｆｒ３が主に軟骨性凝集部位に発現し、Ｆｇｆｒ１は軟骨性凝集部位を囲むように発現していた（図１２Ｋ−１２Ｐ）。従って、肘関節予定域の間充織細胞でＦｇｆｒｓが発現している。
【０１１２】
以前の報告は、Ｆｇｆ９が発生中の前頭骨及び頭頂骨において発現し、特にその骨の周辺部において強く発現していることを示している(Hajihosseini and Heath, 2002)。Ｆｇｆｒ１、−２及び−３は発生中の前頭骨及び頭頂骨ドメインの中および周囲に発現している(Johnson et al., 2000)。従って、Ｆｇｆ９及びＦｇｆｒｓの発現パターンは、本発明者らの癒合発症機序モデルと矛盾がない。
【０１１３】
ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの異所性の発現はどちらも関節及び縫合線の発生を阻害し得る
本発明者らは次に、レトロウイルス（ＲＣＡＳ）形質導入によってニワトリ肢芽内にＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓを異所性に発現させることにより、関節発生に対するＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの阻害効果を調べた。ＲＣＡＳ−ＦＧＦ９ＷＴ、ＲＣＡＳ−ＦＧＦ９Ｅｋｓ、又は空ＲＣＡＳウイルスを、側板中胚葉の将来の後肢芽領域に感染させた。外因性のＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓが感染の２日後には後肢芽全体に発現していた（図６Ａａ及び６Ａｂ）。空ウイルスを用いたときには、異常は観察されなかったが（図６Ａｃ−６Ａｅ）、ＦＧＦ９ＷＴの異所性発現は顕著な後肢関節癒合及び骨格の萎縮を引き起こした（図６Ａｃ）。骨格の萎縮は、Ｆｇｆ９をＣｏｌ２ａ１プロモーター及びエンハンサーの下で過剰発現させたトランスジェニックマウスにおいて観察されたそれと類似していた(Garofalo et al., 1999)。興味深いことに、ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９Ｅｋｓウイルスを感染に用いた場合には、膝関節形成は再現性よく障害されたが、後肢の萎縮は観察されなかった（図６Ａｄ）。このＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９Ｅｋｓとの違いは、あるＦＧＦＲを介したＦＧＦ９Ｅｋｓシグナリングが弱いことによるものかもしれない。関節形成の欠損は、後肢の遠位関節においてもみられ（図１３）、これはＦｇｆｒ１の機能獲得型トランスジェニックマウスにおいても見られた表現型である(Wang et al., 2001)。
【０１１４】
縫合線発生に対するＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの阻害効果を調べるため、ＦＧＦ９浸漬Ａｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅビーズを、Ｅ１５の正常マウス胎仔頭蓋骨の縫合線へ子宮外外科手術により移植した。移植手術の前に、本発明者らは１つのＡｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅビーズに含まれるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの量を調べ、およそ等量が含まれていることを確認した（図１４）。ＦＧＦ９により発現が誘導される初期骨芽細胞分化マーカーであるＳｐｐ１の発現を子宮内インキュベーションの２４時間後に調べた。正常なマウス胎仔では前頭骨原基と頭頂骨原基の間の縫合部ではＳｐｐ１発現が観察されないが、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの移植時は、双方とも、縫合部でＳｐｐ１発現が観察された（図６Ｂａ及び６Ｂｃ）。
【０１１５】
ＦＧＦ９Ｅｋｓは発生中の組織内においてＦＧＦ９ＷＴよりも拡散性が増大している
ＦＧＦ９Ｅｋｓの組織内拡散性増大がＥｋｓマウスにおける関節癒合表現型を説明し得るという仮説を更に検証するため、ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性をビーズ移植後の頭蓋において測定した（図６Ｂ）。ＦＧＦ９はＳｐｐ１発現を誘導するので、本発明者らはＳｐｐ１の高発現領域を、ＦＧＦ９がその効果を及ぼす距離の指標として測定した。ＦＧＦ９Ｅｋｓビーズの移植は、ＦＧＦ９ＷＴビーズの移植と比較して、Ｓｐｐ１が発現誘導された領域をより大きく拡大させ、このことはＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質はより広範な領域にわたり拡散し得ることを示唆する。
【０１１６】
次に、本発明者らはＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性を前肢芽において調べた。ＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ浸漬Ａｆｆｉｇｅｌ−Ｂｌｕｅビーズを、Ｅ１０．５のＦｇｆ９−／−胎仔の背側及び中央の前肢芽領域内へ移植した。移植から２時間後に組織を固定、包埋し、ビーズの赤道部で切片を作成し、ビーズから間充織組織内へ放出されたＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質を、ＦＧＦ９抗体を用いて免疫組織化学的に検出した（図６Ｃａ及び６Ｃｂ）。ＦＧＦ９ＥｋｓはＦＧＦ９ＷＴよりもより広い範囲で肢芽間充織中に浸透しており（図６Ｃｃ）、ＦＧＦ９ＥｋｓがＦＧＦ９ＷＴよりも高拡散性であるという仮説を支持した。まとめると、本発明者らの結果は、Ｅｋｓ変異体マウスにおける関節形成阻害及び縫合線早期癒合は、細胞間隙を経由したＦＧＦ９Ｅｋｓの組織内高拡散による異所性のＦＧＦ９シグナリングによって生じたものであることを強く示唆する（図６Ｄ及び６Ｅ）。
【０１１７】
ホモ二量体化はＦＧＦ９／１６／２０サブファミリー(Mohammadi et al., 2005)及びＦＧＦ２(Ornitz et al., 1992; Venkataraman et al., 1999)でも報告されている。他のＦＧＦではホモ二量体化がその活性にどの程度影響を及ぼすのかはまだ知られていない。Ｆｇｆ９における変異が、ホモ二量体化、ヘパリン／ＨＳへの親和性及び生物学的活性に影響を与えたことは、ＦＧＦホモ二量体化に影響を与える医薬が、ＦＧＦ活性を調節するツールとして有用であることを示唆する。
【０１１８】
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【産業上の利用可能性】
【０１１９】
本発明により、骨癒合症の発症リスクの新たな判定方法が提供される。従前には、ＦＧＦＲの変異が骨癒合症を引き起こすことが知られていたが、そのリガンドであるＦＧＦの変異の骨癒合症への関与は知られていない。従って、本発明は、従前とは全く異なる観点から骨癒合症の発症リスクを評価する方法を提供するものである。
また、本発明により、硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性が低下した変異体ＦＧＦが提供される。本発明の変異体ＦＧＦは生体内での拡散性に優れており、投与部位近辺の硫酸化グリコサミノグリカンにトラップされることなく、患部の深部にまで到達するので、浸透性の優れたＦＧＦ製剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】ＥｋｓマウスのＦｇｆ９遺伝子におけるミスセンス変異。（Ａ）+/+ 及び Eks/Eksマウス由来のＦｇｆ９ ｃＤＮＡの核酸配列。Ｅｋｓ変異体は、４２８位にＡからＣへの置換を有しており、Ａｓｎ１４３のＴｈｒへの置換を生じる。Ｅｋｓミスセンス変異を矢頭で示し、対応するアミノ酸を紫で示す。（Ｂ）Ｅｋｓ変異のジェノタイピング。（Ａ）において検出されたＥｋｓ変異体におけるＦｇｆ９遺伝子の核酸置換を含む１８９ｂｐのゲノムＰＣＲ断片はＢｓｒＩ制限酵素により消化されないが、＋／＋、C57BL/6、DBA/2J及びJF1/Ms マウスからのＰＣＲ断片は消化された。（Ｃ）Ｆｇｆ９ヌルアレルの導入による、Ｅｋｓマウスにおける肺表現型の相乗的増強。Ｅ１７．５胎仔の肺の体重量比を各遺伝子型の間で比較した。データは、少なくとも５匹の胚の平均値±標準誤差により表す。Ｆｇｆ９＋／−及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／＋胚で見られる肺形成不全はＥｋｓ／−において有意に悪化する（アスタリスク）（ｐ＜０．００１）。（Ｄ）Ｆｇｆ９ヌルアレルの導入によるＥｋｓマウスにおける肘関節骨癒合症の状態の変化。Ｆｇｆ９＋／＋、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／＋、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／ＥｋｓマウスのＥ１７．５における前肢をアルシアンブルーおよびアリザリンレッドにより染色した。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／−マウスにおける肘関節骨癒合症の程度は、Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／＋とＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓとの間であった。
【図２】Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスの肘関節予定域における異所性軟骨細胞分化、および頭蓋縫合線における異常な骨芽細胞局在。（Ａ）肢芽における関節発生の解析。Ｅ１０．５およびＥ１１．５におけるＦｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ胎仔の前肢におけるＧｄｆ５およびＣｏｌ２ａｌ遺伝子の発現をin situハイブリダイゼーションにより検出した。ｇにおける矢印は、肘関節予定域におけるＣｏｌ２ａｌ発現の間隙を示す。バー、１００μｍ。（Ｂ）頭蓋縫合線発生の解析。Ｅ１５．５及びＥ１６．５におけるＦｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ胎仔の頭蓋縫合線の切片を、ヘマトキシリン及びエオジン（ＨＥ）で染色し(a、b、g及びh)、示したプローブを用いたin situハイブリダイゼーション(c-f 及びi-l)により調べた。fb, 前頭骨； pb, 頭頂骨。バー、１００μｍ。
【図３】ＦＧＦ９Ｅｋｓは二量体形成が阻害されている。 分析的超遠心分離によりＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓのホモ二量体化を調べた。（Ａ及びＢ）沈降平衡法解析。０．４ｍｇ／ｍｌのＦＧＦ９ＷＴ（Ａ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｂ）を用いたときの、１６０００ｒｐｍ、２０℃での沈降平衡状態における吸光度分布を示す。実線は、単一種と仮定する非相互作用分離モデルでのグローバル解析を行ったベストフィットプロットである。沈降平衡法のデータはBeckman XL-A/XL-I解析ソフトウェアで解析した。上のパネルは残差分析の結果である。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの平均分子量は、それぞれ、39,264 及び 32,929 Daと見積もられた。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの結合定数は、それぞれ、１０．４μＭ−１及び０．１１９μＭ−１と求められた。（Ｃ及びＤ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの沈降速度法解析。０．２、０．３及び０．４ｍｇ／ｍｌでの、ＦＧＦ９ＷＴ（Ｃ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｄ）の沈降係数分布。ＦＧＦ９ＷＴは３．０Ｓにおいて一峰性ピークを示す。ＦＧＦ９Ｅｋｓは二峰性のピーク（２．２Ｓ及び３．１Ｓ）を示す。
【図４】ＦＧＦ９Ｅｋｓのヘパリン親和性低下。 ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓのヘパリン親和性を、ヘパリン親和性クロマトグラフィー（Ａ）及び表面プラズモン共鳴解析（Ｂ及びＣ）を用いて調べた。（Ａ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓをヘパリン結合アガロースカラムにロードし、１２０ｍＭから２．０ＭへのＮａＣｌの線形グラジエントにより溶出した（黒線）。ＦＧＦ９ＷＴ（青線）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤線）の溶出は２８０ｎｍにおける吸光度により測定した。（Ｂ及びＣ）固相化したヘパリンとのＦＧＦ９ＷＴ（Ｂ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｃ）の相互作用のセンサーグラム。ＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ濃度を以下のように示す：６２．５ｎＭは赤、３１．３ｎＭは茶色、１５．６ｎＭは青色、７．８ｎＭは緑色、３．９ｎＭは紫色。バイオセンサーチップ反応を、Ｘ軸は時間、Ｙ軸はΔＲＵで示した。測定は室温で行った。
【図５】ＦＧＦ９のホモ二量体化はそのヘパリン親和性を制御する。 ＭＤシミュレーションの最終構造。重要な水素結合を形成するヘパリンとタンパク質残基を球及び棒及び空間充填モードで示す。各残基の名前を１文字表記アミノ酸コード、残基番号、及び鎖コードで示す。（Ａ及びＢ）二量体ＦＧＦ９ＷＴ（Ａ）及び二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ（Ｂ）についてのＭＤシミュレーションの最終構造。ＦＧＦ９のＮ１４３Ｔ置換は、単量体間水素結合の欠失を生じる。（Ｃ−Ｆ）二量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（Ｃ）、二量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（Ｄ）、単量体ＦＧＦ９ＷＴ−ヘパリン（Ｅ）及び単量体ＦＧＦ９Ｅｋｓ−ヘパリン（Ｆ）についてのＭＤシミュレーションの最終構造。各複合体について計算された結合自由エネルギーを構造の下に示す。データは、各々２００個のＭＤスナップショットから得たエネルギーの平均値±標準偏差として示す。
【図６】関節癒合及び頭蓋骨縫合線早期癒合症は、ＦＧＦ９Ｅｋｓの組織内高拡散性に由来するＦＧＦ９Ｅｋｓの異所性シグナル伝達が発症原因である可能性が高い。（Ａ）ニワトリ後肢芽におけるＦｇｆ９ＷＴ及びＦｇｆ９Ｅｋｓの異所性発現による関節癒合。ＨＨステージ１７のニワトリにＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９ＷＴ、ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９Ｅｋｓ又は空ＲＣＡＳウイルスを感染させ、Ｆｇｆ９ＷＴ又はＦｇｆ９Ｅｋｓの発現を誘導した。感染の２日後に、Ｆｇｆ９プローブを用いたin situハイブリダイゼーション（ａ及びｂ）及び感染の５日後に、アルシアンブルーでの染色（ｃ−ｅ）により後肢を調べた。ｃ−ｅ中の矢印は膝関節位置を示す。Ｆｇｆ９ＷＴ及びＦｇｆ９Ｅｋｓの異所性発現は膝関節癒合（ｃ−ｄ）を生じた。Ｆｇｆ９ＷＴの異所性発現は後肢の重篤な関節癒合を生じ（ｃ）、Ｆｇｆ９Ｅｋｓの異所性発現は骨格萎縮を生じなかった（ｄ）。（Ｂ）頭蓋骨原基におけるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散能測定。ＦＧＦ９タンパク質を含有するAffiGel-BlueビーズをＥ１５マウス頭蓋へ移植し、２４時間後にＥ１６でin situハイブリダイゼーションによりＳｐｐ１ ｍＲＮＡを検出し、頭蓋骨原基における外因性ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散能を評価した。（ａ−ｄ）Ｓｐｐ１についてのホールマウントin situハイブリダイゼーション。ＦＧＦ９ＷＴ（ａ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（ｃ）ビーズを移植した側は、局在化した強いシグナルを示し、これは外因性のＦＧＦ９タンパク質の拡散部位を意味している。移植していない対照側（ｂ及びｄ）は、前頭骨原基及び頭頂骨原基における内在性の発現を表す弱いシグナルのみ検出された。（ｅ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性。前頭骨原基及び頭頂骨原基における拡散面積（％）を、全シグナルに対する強いシグナルの面積比から推定した。データは６回の操作の平均値±標準誤差で示す（ｐ＜０．００５）。ＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤色バー）はＦＧＦ９ＷＴ（青色バー）よりも高い拡散性を示す。（Ｃ）ＦＧＦ９タンパク質を含有するAffiGel-Blueビーズの移植による、Ｅ１０．５前肢芽におけるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散性の試験。移植２時間後の外因性のＦＧＦ９ＷＴ（ａ）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（ｂ）の拡散をＦＧＦ９抗体により検出した。（ｃ）ＦＧＦ９ＷＴとＦＧＦ９Ｅｋｓの拡散面積の比較。データは５回の操作の平均値（ＦＧＦ９ＷＴ＝１００％）±標準誤差で表す。ＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤色バー）の拡散性がＦＧＦ９ＷＴ（青色バー）の拡散性よりも高いことは統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。（Ｄ）Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおける肘関節癒合症の発症メカニズム。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて、肘関節予定域におけるＦＧＦ９Ｅｋｓの過剰拡散による異所性ＦＧＦ９シグナリングが関節癒合症を誘導し得る。（Ｅ）Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおける頭蓋骨縫合線早期癒合症の発症メカニズム。Ｆｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓマウスにおいて、頭蓋縫合線におけるＦＧＦ９Ｅｋｓの過剰拡散による異所性ＦＧＦ９シグナリングが縫合線早期癒合を誘導し得る。
【図７】Ｅｋｓホモ接合性マウスにおける肺形成不全。（Ａ−Ｂ）出生時の＋／＋（Ａ）及びＥｋｓ／Ｅｋｓ（Ｂ）マウスの肺。
【図８】構造に基づくヒトＦＧＦの配列アライメント。 ＦＧＦ９ＥｋｓにおけるＮ１４３Ｔ変異周辺のアミノ酸配列と、他のヒトＦＧＦファミリータンパク質の対応するドメインの配列とを配列同一性に基づき整列した。ＦＧＦ９におけるＡｓｎ１４３と平行する位置の各ＦＧＦタンパク質のアミノ酸を赤色ボックスで示す。
【図９】ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質の精製。（Ａ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓタンパク質の精製に用いた方法の概要。（Ｂ）精製したＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓのＳＤＳ／ＰＡＧＥ。ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの両方とも、約２０ｋＤａの分子量に検出された。
【図１０】ゲル濾過クロマトグラフィー上で、ＦＧＦ９Ｅｋｓの分子量はＦＧＦ９ＷＴの分子量よりも小さい。 サンプルを別々にSuperdex 75 10/300 GLカラムへアプライした。溶出されたＦＧＦ９ＷＴ（青線）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤線）は２８０ｎｍでの吸光度で検出した。矢印は分子量マーカーの溶出位置を示す：６７ｋＤａ、アルブミン；４３ｋＤａ、オボアルブミン；２５ｋＤａキモトリプシノゲン；１３．７ｋＤａ、リボヌクレアーゼＡ。
【図１１】ＦＧＦ９ＥｋｓのＦＧＦＲを介したシグナル伝達能力の部分変化。（Ａ−Ｇ）ＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９ＥｋｓのＦＧＦ９濃度用量依存的細胞分裂促進活性。ＦＧＦＲ１ｂ（Ａ）、ＦＧＦＲ１ｃ（Ｂ）、ＦＧＦＲ２ｂ（Ｃ）、ＦＧＦＲ２ｃ（Ｄ）、ＦＧＦＲ３ｂ（Ｅ）、ＦＧＦＲ３ｃ（Ｆ）又はＦＧＦＲ４（Ｇ）を発現しているＢａＦ３細胞を、１μｇ／ｍｌヘパリンの存在下で、様々な濃度のＦＧＦ９ＷＴ（青丸）及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（赤三角）で処理した。細胞増殖は、３６時間培養後の［３Ｈ］チミジン取り込みにより測定した。ヘパリン濃度依存的なＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの細胞分裂促進活性。ＦＧＦＲ１ｂ（Ｈ）、ＦＧＦＲ１ｃ（Ｉ）、ＦＧＦＲ２ｂ（Ｊ）、ＦＧＦＲ２ｃ（Ｋ）、ＦＧＦＲ３ｂ（Ｌ）、ＦＧＦＲ３ｃ（Ｍ）又はＦＧＦＲ４（Ｎ）を発現しているＢａＦ３細胞を、０．２ｎＭのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓの存在下で様々な濃度のヘパリンにより処理した。細胞増殖を上述のように決定した。データは三連の測定結果の平均値±標準誤差である。これらのデータは少なくとも２つの独立した試験のうちの代表的なものである。
【図１２】Ｆｇｆ９は筋芽細胞に発現しており、一方Ｆｇｆｒｓは肘関節予定域の間充織細胞に発現している。 Ｅ１０．５及びＥ１１．５の両方でのＦｇｆ９＋／＋及びＦｇｆ９Ｅｋｓ／Ｅｋｓ胎仔の前肢芽におけるＦｇｆ９、Ｆｇｆｒ１、Ｆｇｆｒ２及びＦｇｆｒ３の発現をin situハイブリダイゼーションにより検出した。バー、１００μｍ。
【図１３】Ｆｇｆ９ＷＴ及びＦｇｆ９Ｅｋｓ異所性発現後のニワトリ後肢の遠位関節癒合。 ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９ＷＴ（Ａ）、ＲＣＡＳ−Ｆｇｆ９Ｅｋｓ（Ｂ）、又は空ＲＣＡＳウイルス（Ｃ）を感染させた後のニワトリ後肢をアルシアンブルーで染色した。Ａ−Ｃにおける矢印は遠位関節を示す。
【図１４】AffiGel-BlueビーズのＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ容量。 AffiGel-BlueビーズのＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ保持量を測定した。ビーズをＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ溶液（５００μｇ／ｍｌ）中に浸漬し、続けてＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング解析によりＦＧＦ９を検出することで決定した。レーン１−６、１レーンあたり、ＦＧＦ９ＷＴ又はＦＧＦ９Ｅｋｓ溶液（５００μｇ／ｍｌ）に浸漬した１個のビーズのウェスタンブロッティング。レーン７、８、組換えＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓ（１００ｎｇ）。１個のAffiGel-Blueに含まれるＦＧＦ９ＷＴ及びＦＧＦ９Ｅｋｓの量はおよそ等しい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換された変異体ＦＧＦポリペプチド。
【請求項２】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＡｓｎがＡｓｎ１４３である、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１、３、５、７、１１又は１３で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の塩基番号４２８のシトシンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなる配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の部分配列、又はその相補配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項１記載のポリペプチドを含む医薬。
【請求項１１】
請求項２記載のポリペプチドを含む骨折治療剤。
【請求項１２】
ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法。
【請求項１３】
ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出するための試薬を含む、骨癒合症の発症リスクの診断剤。
【請求項１４】
被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否か検定すること、及びＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質をＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として得ることを含む、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【請求項１】
ＦＧＦホモ二量体内の単量体間水素結合に寄与するＡｓｎがＴｈｒに置換された変異体ＦＧＦポリペプチド。
【請求項２】
ＦＧＦがＦＧＦ９である、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＡｓｎがＡｓｎ１４３である、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】
配列番号２、４、６、８、１２又は１４で表されるアミノ酸配列を含む、請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１、３、５、７、１１又は１３で表されるヌクレオチド配列を含む、請求項５記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の塩基番号４２８のシトシンを含む１５塩基以上の連続したヌクレオチド配列からなる配列番号１又は３で表されるヌクレオチド配列の部分配列、又はその相補配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項５記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項９】
請求項８記載のベクターが導入された形質転換体。
【請求項１０】
請求項１記載のポリペプチドを含む医薬。
【請求項１１】
請求項２記載のポリペプチドを含む骨折治療剤。
【請求項１２】
ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出することを含む、骨癒合症の発症リスクの判定方法。
【請求項１３】
ＦＧＦ９ポリペプチドのＡｓｎ１４３のＴｈｒへの置換、又はＦｇｆ９遺伝子におけるＡｓｎ１４３をコードするコドンのＴｈｒをコードするコドンへの変異の有無を検出するための試薬を含む、骨癒合症の発症リスクの診断剤。
【請求項１４】
被検物質がＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害するか否か検定すること、及びＦＧＦのホモ二量体化を促進又は阻害した被検物質をＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質として得ることを含む、ＦＧＦの硫酸化グリコサミノグリカンへの親和性を調節し得る物質のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【公開番号】特開２００９−２３２７３２（Ｐ２００９−２３２７３２Ａ）
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−８１８２６（Ｐ２００８−８１８２６）
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１０月１５日（２００９．１０．１５）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月２６日（２００８．３．２６）
【出願人】（５０３３５９８２１）独立行政法人理化学研究所 (1,056)
【出願人】（３０４０２１８３１）国立大学法人 千葉大学 (601)
【Ｆターム（参考）】
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