変異体ＬＩＧＨＴによるＴ細胞腫瘍浸潤の増大
腫瘍環境内で発現した変異体ＬＩＧＨＴは、大量のナイーブＴリンパ球の浸潤を伴う、高レベルのケモカイン及び接着分子を誘出した。変異体ＬＩＧＨＴを使用する腫瘍体積の減少及び転移の減少を含む、腫瘍に対する免疫反応を誘出するための方法及び組成物を開示する。腫瘍（特に、固形腫瘍）を処置する新しい方法は、変異体ＬＩＧＨＴ分子を使用することによって、ナイーブＴ細胞を初回抗原刺激して活性化Ｔ細胞を増殖させるのに必要なケモカイン並びに接着分子、共刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作り出すことである。幅広いＴ細胞が、腫瘍に対して産生される。変異体ＬＩＧＨＴをコードする配列を含むアデノウイルスベクターは、腫瘍及び転移に対して有効である。ベクターが変異体ＬＩＧＨＴを腫瘍に送達した場合、コントロールベクターで注入した腫瘍と比較して、インビボにおける腫瘍の体積が減少した。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（開示の背景）
免疫応答性宿主において確立された腫瘍を浸潤する活性化Ｔ細胞が少量であることは、宿主が腫瘍を処理できないことを説明する。動物モデル及び臨床研究における実験は、免疫系は個々の腫瘍細胞を認識して殺傷させ得る死滅させ得るが、一般に宿主は確立された固形腫瘍を根絶し得ないことを示している。宿主が確立された腫瘍に対して効果的に応答できないことに対するいくつかの説明があり得る：１）組織に移動する腫瘍細胞（特に、非造血系起源の腫瘍細胞）の不適当な数のためにリンパ組織において直接または間接の提示が弱いことが原因で、初期Ｔ細胞初回抗原刺激が欠如していること；２）腫瘍組織周囲の生物学的障壁が原因で、腫瘍部位へ移動する免疫細胞の数が不適当であること；３）レパートリーが限定されていることが原因で、腫瘍増殖と戦うことができない活性化された抗原特異的Ｔ細胞が消耗しているか、または短命であること；４）Ｔ細胞が腫瘍に対して非応答性であるか、または腫瘍を認識しないこと；５）免疫系を活性化するための阻害的微小環境であるか、または腫瘍内部の刺激が欠如していること。
【０００２】
臨床学的に、腫瘍部位へのＴ細胞の浸潤の増大はよりよい予後と密接に関係している。従来の研究によって、接種腫瘍細胞の拒絶反応を誘発する際に予防的ワクチン接種が有効であることが示されている。しかし、腫瘍の増殖が確立された後では、通常、治療的ワクチン接種によって腫瘍を拒絶することができない。腫瘍の外科的な切除は、腫瘍に対する免疫反応を増進しない。さらに、たとえ腫瘍細胞上に強力な抗原が発現していても、リンパ組織に抗原特異的Ｔ細胞が過量に存在するのにもかかわらず、確立された腫瘍の拒絶反応を促進するには不十分であったことが報告された。Ｔ細胞の初回抗原刺激および／または確立された腫瘍への浸潤の欠如は、抗原性癌に対する自然または治療のアプローチのどちらかについての主要な障害のうちの一つである。加えて、腫瘍組織内部の共刺激分子の発現が不十分であることは、浸潤Ｔ細胞の活性化が行われず、このため腫瘍反応性Ｔ細胞のアネルギーを生じ得る。
【０００３】
初期Ｔ細胞の初回抗原刺激の欠如はおそらく、直接提示のために固形組織からリンパ組織へ移動する腫瘍細胞が極めて少ないことに起因する。骨髄キメラを用いた遺伝子分析によって、ＭＨＣ−Ｉを制限するＣＤ８＋Ｔ細胞の初回抗原刺激に対する抗原提示の２つの様式が明らかにされている。直接初回抗原刺激は、Ｔ細胞と抗原性エピトープを有するタンパク質を合成する細胞との関係によって仲介され、クロスプライミング（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）は、他の細胞によって合成された抗原を取り込む、宿主の抗原提示細胞によって仲介される。腫瘍特異的Ｔ細胞を初回抗原刺激するための機構は活発に議論されており、これまでの所結論には至っていないままである。どこでどうのように腫瘍抗原がＴ細胞に提示されるかを理解することは、腫瘍に対する治療行為を見出す助けになる。
【０００４】
ＬＴβＲを介するシグナル伝達は組織化されたリンパ組織を形成するのに必要とされる。リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）は、リンパ構造の形成に重要な役割を果たしている。ＬＴβＲは、ＴＮＦファミリーの二つのメンバー（膜リンホトキシンαβ並びにＬＩＧＨＴ）によって活性化される（図１）。ＬＴβＲは、ＬＮの形成、および二次リンパ器官におけるＴ、Ｂ領域の明確な組織化において中枢的役割を果たしている。ＬＴβＲを介するシグナル伝達は、二次リンパ器官内でケモカイン及び接着分子の発現を制御する。ケモカイン並びに接着分子は、脾臓におけるＤＣ並びにリンパ球の移動及び位置決めを制御する。非リンパ組織における可溶性ＬＴまたはＴＮＦの過剰発現は、機能性リンパ新生を促進するために十分であった。
【０００５】
ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞活性化及びリンパ組織の形成において独自の役割を果たしている。ＬＩＧＨＴは、ＬＴβＲ及びヘルペスウイルス進入メディエーター（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ）に対するリガンドである。ＬＩＧＨＴは、リンパ組織上で優勢的に発現する。ＬＩＧＴＨとＬＴβＲとの間の相互作用が、ＬＴα−／−マウスの脾臓においてリンパ構造を回復する。さらに、ＬＩＧＴＨのアップレギュレートは、Ｔ細胞の活性化および非リンパ組織への移動を引き起こし、リンパ様構造が形成される。逆に、ＬＩＧＨＴ−／−マウスは、Ｔ細胞活性化に障害が見られ、心臓の拒絶反応を遅延した。従って、ＬＩＧＨＴは、強力な共刺激分子であって、リンパ組織の形成をも促進して局所免疫反応を推進する。
【０００６】
リンパ組織の枯渇における効果的なナイーブＴ細胞の初回抗原刺激の欠如、並びに腫瘍内部において腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖ができないことが、癌の根絶が妨げられている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
変異体ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞の初回抗原刺激のためのケモカイン、接着分子、および共刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作り出し、腫瘍細胞を殺傷する。
【０００８】
変異体ＬＩＧＨＴ（ＬＩＧＨＴｍ）は、プロテアーゼタンパク消化を阻害するために作製され、このためＬＩＧＨＴは、腫瘍細胞上で発現され得る。非変異体ＬＩＧＨＴは、腫瘍表面で発現されず、効果的な抗腫瘍活性を誘発しない。
【０００９】
リンホトキシンレセプターを発現した支質並びにＨＶＥＭを発現したＴ細胞に対するリガンドである変異体ＬＩＧＨＴｍを腫瘍環境内部へ導入することは、大量のナイーブＴリンパ球の浸潤を伴う、高レベルのケモカイン及び接着分子が誘発した。変異体ｌｉｇｈｔ（ＬＩＧＨＴｍと称する）は、正常ＬＩＧＨＴのアミノ酸配列から欠失した７９〜８２位由来のタンパク質分解部位ＥＫＬＩを有する（図３Ａ）（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＬＩＧＨＴは局所並びに遠位の部位において、確立された高度進行性親腫瘍の拒絶反応を促進する。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞は、十分に確立された親腫瘍を根絶し転移による新たな腫瘍の形成を防ぐための、医学が関係する治療的及び予防的ワクチンに基づいている。
【００１０】
治療的ワクチンとしてのＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍は、より多くのナイーブＴ細胞を誘引し、次いでこれを活性化してより多くの抗腫瘍特異的Ｔ細胞を作り出し、局所並びに遠位の腫瘍と戦う。
【００１１】
ＬＩＧＨＴｍ並びに腫瘍（または腫瘍抗原）は、Ｔ細胞を初回抗原刺激し、予防ワクチンとして長期間の防御を導く。
【００１２】
腫瘍（特に、固形腫瘍）を処置する新しい方法は、変異体ＬＩＧＨＴ分子を使用することによって、ナイーブＴ細胞を初回抗原刺激して活性化Ｔ細胞を増殖させるのに必要なケモカイン並びに接着分子、共刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作り出すことである。幅広いＴ細胞が、腫瘍に対して産生される。変異体ＬＩＧＨＴをコードする配列を含むアデノウイルスベクターは、腫瘍及び転移に対して有効である。ベクターが変異体ＬＩＧＨＴを腫瘍に送達した場合、コントロールベクターで注入した腫瘍と比較して、インビボにおける腫瘍の体積が減少した。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
腫瘍細胞上のＬＩＧＨＴｍの発現は、腫瘍拒絶反応を促進する。腫瘍Ａｇ１０４Ａおよびその誘導体を腫瘍モデルの一つとして使用した。Ａｇ１０４Ａは元来、Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）マウスの自然骨肉腫に由来し、Ｃ３ＨマウスまたはＢ６Ｃ３Ｆ１マウスにおいて、極低用量のＡｇ１０４Ａ投与（１０４）でも、浸潤をほとんど生じずに累進的に増殖し得る。強力な抗原Ｌｄを腫瘍に導入する場合、その腫瘍は免疫認識に対して耐性であり続け、このことが強力な腫瘍障壁である可能性が示唆される。変異したＬＩＨＧＴｍをレトロウイルスによってトランスフェクトしたＡｇ１０４Ｌｄは、その表面上にＬＩＧＨＴｍを安定に発現する。
【００１４】
最初にＬＩＧＨＴｍ−Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍をＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに２週間接種し、次に１Ｘ１０６の２Ｃ Ｔ細胞を、確立した腫瘍を有するマウスに移植した。印象的なことに、全ての確立したＬＩＧＨＴｍ−Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍（１０／１０）が２Ｃ Ｔ細胞移植後１週間で拒絶された一方、Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍は拒絶されなかった（０／１０）。Ｂ７−１はＴ細胞の活性化と増殖に関わる強力な共刺激分子であるが、ＬＩＧＨＴｍと対照的に、Ａｇ１０４ＬｄのＢ７−１発現が、腫瘍の拒絶反応には十分でない。これらのデータは、ＬＩＧＨＴｍが、Ｂ７−１よりも腫瘍寛容を打破するためにより強力であり得ることを示唆する。ＬＩＧＨＴｍの二重効果を考えると、腫瘍部位におけるＬＩＧＨＴｍの局所的な発現により、リンパ組織のケモカイン及び接着分子の発現が制御することによって、腫瘍の「障壁」を通過して樹状細胞及びＴ細胞が誘引され得る。さらに、ＬＩＧＨＴｍの局所的な発現は抗原特異的Ｔ細胞に対する腫瘍抗原の直接提示を強化し得、腫瘍微小環境内の浸潤するＴ細胞のアネルギーを妨ぎ得る、強力な共刺激分子となる。ＬＩＧＨＴｍを発現するもしくは発現しない、Ｈ−２ｂバックグラウンドの腫瘍、ＭＣ５７腫瘍（繊維肉腫）、ＭＣ５７−Ｌｄ、およびＭＣ５７−ＳＩＹが作製され、腫瘍免疫におけるＬＩＧＨＴｍ及びそのレセプターの役割の特性をさらに明確にするため、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴｍ、およびＨＶＥＭ ＫＯマウスを含むＢ６マウスモデルにおいて使用される。ＬＩＧＨＴｍは腫瘍免疫の媒介において複数の機能を有するようである。またＬＩＧＨＴｍはインビボで腫瘍のアポトーシスを促進し得る。興味深いことに、ＬＩＧＨＴｍをコードするｃＤＮＡを腫瘍内部に注入すると、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞反応が誘発され、確立したマウス腫瘍Ｐ８１５に対する治療免疫が誘導された。
【００１５】
（腫瘍内で発現したＬＩＧＨＴｍは、宿主抵抗力を５００倍以上増大させた）
繊維肉腫Ａｇ１０４Ｌｄは高い腫瘍形成能を持ち、１０４の細胞をレシピエントマウスＣ３Ｂ６Ｆ１に皮下注射した場合、１００％増殖した（表１）。腫瘍上に発現した抗原Ｌｄに対するＴ細胞が充満する、２Ｃ Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスは、同一の抗原を含む皮膚移植が拒絶された後でさえこれを根絶することができなかったと報告されている（Ｈａｎｓ，１９９７）。腫瘍特異的Ｔ細胞を腫瘍内へ向かわせ、腫瘍部位にてこれを活性化する方法は、臨床的な癌免疫治療と同様に、拒絶反応についての決定的な超えるべき障害物であると思われる。腫瘍環境内で発現したＬＩＧＨＴは、それぞれＬＴβＲ並びにＨＶＥＭを介して、腫瘍内部へＴ細胞を誘引して活性化し、腫瘍拒絶反応へ導くことによって、寛容性を打破し得る（図２）。これを実証するため、レトロウイルスベクターＭＦＧを利用するレトロウイルス形質導入によって、ＬＩＧＨＴをこの腫瘍細胞株で発現させた。当初、形質導入後、腫瘍細胞表面にてＬＩＧＨＴ発現は検出されなかった。ＬＩＧＨＴは、その配列上に、腫瘍細胞株の表面上で安定して存在することを妨げ得るタンパク質分解部位を有しているので、膜上のＬＩＧＨＴタンパク質分解を減少させるＬＩＧＨＴの変異版（ＬＩＧＨＴｍ）が使用された（図３Ａ）。変異体ＬＩＧＨＴｍ／ＭＦＧのＡｇ１０４Ｌｄへのレトロウイルスによる形質導入の後、ＬＴβＲ−Ｉｇによって、形質導入された腫瘍細胞の表面上でＬＩＧＨＴｍ発現を検出した（図３Ｂ）。このような細胞をＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルクと定義した。さらに、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を限界希釈法によってクローニングした。他に指定されていない限り、ほとんどの実験において、このクローンの一つであるＨ１０を使用した。変異体ＬＩＧＨＴｍはそのレセプターであるＬＴβＲ及びＨＶＥＭの双方に結合することができた。試験したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルク並びに全クローンは、ＬＩＧＨＴｍ、ＬＴβＲ及びＨＶＥＭのレセプターに結合し、可溶性ＬＴβＲ及びＨＶＥＭによって染色可能であることによって示した。ＬＴβＲ−Ｉｇ及びＨＶＥＭ−Ｉｇによる、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルク及びクローンＨ１０の典型的な染色プロフィールを示した（図３Ｂ）。親腫瘍細胞並びにＬＩＧＨＴトランスフェクト体の増殖は、組織培養物並びにＲＡＧ−１−／−マウスの双方において同じであった（図３Ｄ）。様々な数のＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞、バルクもしくはクローンＨ１０を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下接種した。レシピエントは、５Ｘ１０６の最高用量の注入投与したＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞を拒絶した。これは親腫瘍が１００％累進的に増殖する用量の５００倍であった（表１）。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞バルク並びにクローＨ１０の代表的な増殖反応速度、ならびに親腫瘍を５Ｘ１０６接種した時の、典型的な増殖反応速度を図３Ｃに示した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは、接種後初めの２週間は増殖し、続いて親腫瘍が増殖を続ける場合に退行し、３〜４週間で宿主を殺傷した（図３Ｃ）。
可溶性ＬＴβＲでＬＩＧＨＴｍの機能を遮断する場合、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍が増殖したことから、腫瘍拒絶反応はＬＩＧＨＴｍ依存的であるもようである（表１）。腫瘍拒絶反応はリンパ球に依存する。リンパ球が欠如したＲＡＧ−１−／−マウスでは、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄは親腫瘍と同程度累進的に増殖した（図３Ｄ）。抗ＣＤ８＋抗体によってＣＤ８＋Ｔ細胞が失活しているＣ３Ｂ６Ｆ１マウスはこれらの腫瘍を拒絶しなかったため、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなくＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＩＧＨＴ発現Ａｇ１０４Ｌｄの拒絶反応を媒介するのに必須であった（表１）。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はこの腫瘍拒絶に必要ではない。
【００１６】
（ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境では、より多くの浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞を有する）
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍拒絶反応の基礎となる可能性のある機構を調べるため、５Ｘ１０６のＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄもしくは同じメンバーの親腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下注射した。腫瘍接種後１０〜１４日目、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞が拒絶される前に腫瘍組織を回収した。この腫瘍組織をＨＥ染色すると、大量のリンパ球が浸潤していることが示された（図５）一方、親腫瘍ではごく僅かな浸潤しか見られなかった（図５）。免疫蛍光染色によって、浸潤しているリンパ球の内、大量のＴｈｙ１．２＋Ｔ細胞（図５）、特にＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内部に存在していることを確認した（図５）。
【００１７】
（ＬＩＧＨＴの改変した細胞外ドメインはＴ細胞の共刺激に十分である）
ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞増殖を導く強力な共刺激活性を有することが報告されている。ＬＩＧＨＴの変異体形態では、分子の膜貫通部位に極近い、細胞外ドメインにおけるタンパク質分解部位に相当する４つのアミノ酸を欠失させた（図３Ａ）。ＬＩＧＨＴｍ分子内の変異は、ＬＩＧＨＴｍの共刺激効果に影響する。細胞外ドメインを短くした形態であるアミノ酸８５〜２３９のみを含有し、精製を容易にするためのフラッグペプチドを有する組み換えＬＩＧＨＴｍタンパク質を作製した（組み換えＬＩＧＨＴｍ）（図４Ａ）。改変したＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインは、Ｔ細胞を共刺激するに十分であった。この試験のため、プレート結合組み換えＬＩＧＨＴｍを用いたインビトロ共刺激アッセイを用いて、準最適用量のＣＤ３に対する固定化抗ＣＤ３モノクローナル抗体存在下で精製マウスＴ細胞を刺激した。固定化組み換えＬＩＧＨＴｍは、準最適量のＣＤ３に対する抗体存在下で、用量依存の様式で強力に精製マウスＴ細胞の増殖を刺激した（図４Ｂ）。ＬＩＧＨＴｍ分子から欠失しているタンパク質分解部位を除いたアミノ酸８５〜２３９である、改変されたＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインは、Ｔ細胞レセプターの関係が生じる場合、Ｔ細胞増殖の共刺激に十分であった。
【００１８】
（Ｂ７．１分子を発現する腫瘍は、親腫瘍と同程度の浸潤するＴ細胞を含有する）
ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤はＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境よる腫瘍拒絶に相関した。ＬＩＧＨＴｍはＴ細胞に対する強力な共刺激効果を有するので、別の強力な共刺激分子であるＢ７．１が大量のＴ細胞の浸潤に関連した腫瘍拒絶反応を媒介するために十分か否かが問題となった。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍと同じ方法で形質導入した５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１腫瘍細胞を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下接種した。これらの腫瘍はレシピエントにおいて累進的に増殖した。この腫瘍組織に対するＨＥ染色は、リンパ球の浸潤をほとんど示さなかった（図５）。抗Ｔｈｙ−１．２並びに抗ＣＤ８を用いた免疫蛍光染色は、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１腫瘍組織が、親の腫瘍Ａｇ１０４Ｌｄと比較して同等のレベルのＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を含む）を含むことを明らかにし（図５）、これはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ（図５）と比較して実質的に少ない。このデータは、二つの共刺激分子（Ｂ７．１並びにＣＤ４８）を発現するＡｇ１０４Ｌｄが２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックマウスによって拒絶されなかった（Ｈａｎｓ，１９９７ ＪＥＭ）という従来の所見と一致した。これら一連の証拠は、これらの腫瘍モデルにおいて、強力な共刺激だけでは腫瘍拒絶反応を媒介するのに十分ではないことが示唆された。
【００１９】
（ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、高レベルのケモカインＳＬＣ及びアップレギュレートされた接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１を含有する）
問題は、ＬＩＧＨＴ媒介腫瘍環境について何が特異であるかということであった。ＬＩＧＨＴｍはＴ細胞上に発現されるレセプターＨＶＥＭに結合し、これを介してＬＩＧＨＴｍはＴ細胞の共刺激を媒介する模様であるが、ＬＴβＲはＬＩＧＨＴｍと相互作用する別のレセプターである。ＬＴβＲシグナル伝達は、ケモカインＳＬＣ及び接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１に対する重要な制御因子であり、ナイーブＴ細胞が二次リンパ組織へ帰着するのを制御する。腫瘍環境におけるＬＩＧＨＴｍはこれらの腫瘍間質細胞上のＬＴβＲと相互作用して、腫瘍環境内のＳＬＣ及びＭＡｄＣＡＭ−１をアップレギュレートすると思われる。接種後１０〜１４日目に、親Ａｇ１０４ＬｄあるいはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄのいずれかから腫瘍組織を回収した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ＬＩＧＨＴｍ陽性腫瘍塊は親腫瘍よりもＳＬＣを高レベルに発現することが示された（図６Ａ）。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ中のＳＬＣ量を検出するＥＬＩＳＡによって、この結果を独立して確認した（図６Ｂ）。親腫瘍ではＳＬＣはごく僅かにしか検出されなかった（図６Ｂ）。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍において、より高いＳＬＣが検出されたことが、単に、腫瘍環境（ＲＡＧ−１−／−腫瘍担体からの組織）中により多く存在するＴ細胞に対する反応がより活発に進行していることに起因する可能性を除くため。リンパ球欠損マウス中で増殖するＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのＳＬＣを含有していた（図６Ｂ）。さらに、ＲＡＧ−１−／−マウスにおいてＬＩＧＨＴｍ陽性及びＬＩＧＨＴｍ陰性腫瘍の双方が等しく増殖したことは、ケモカインＳＬＣ単独では腫瘍拒絶の媒介に不十分であることを示唆している。これらのデータは、Ｃ３Ｂ６Ｆ１腫瘍保持動物（ＴＢＡ）から回収された他の５対のＬＩＧＨＴｍ陽性及びＬＩＧＨＴｍ陰性腫瘍試料由来の組織切片の免疫化学的染色に一致した。ＳＬＣ及びヘマトキシリンで二重染色した腫瘍組織で明確に示されたように、高密度の浸潤するリンパ球に囲まれたＬＩＧＨＴ発現腫瘍内の間質に富む部位領域で、ＳＬＣの非常に強い染色が検出された（図６Ｃ）。しかし、ＬＩＧＨＴｍ陰性の腫瘍組織上の間質に富む部位領域においてはＳＬＣは検出されなかった（図６Ｃ）。また、コントロール腫瘍の場合と同じく、Ｂ７．１発現腫瘍由来の組織もまた、ＳＬＣ染色は見られず、浸潤するリンパ球はほとんど存在しなかった（図６Ｃ）。
【００２０】
接着分子はリンパ球が周辺組織へ移動するために重要であり、ＬＴβＲシグナル伝達は接着分子の一つであるＭＡｄＣＡＭ−１の発現に重要である（Ｋａｎｇ，２００２）。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍塊あるいは親腫瘍におけるＭＡｄＣＡＭ−１発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。親腫瘍と比較すると、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍塊において接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１の発現量が増加した（図６Ｄ）。これらの実験は、腫瘍環境中のＬＩＧＨＴが腫瘍間質由来のＬＴβＲと相互作用し、ケモカインＳＬＣ及び接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１をアップレギュレートしてリンパ球を腫瘍環境内に誘引することを強く示唆するものであった。
【００２１】
リンパ組織ケモカインに加えて、ＬＴβＲシグナル伝達はまた、ＩＮＦ−γ誘導ケモカインである、ＩＰ−１０及びＭｉｇのセットも制御する。ジーンアレイで他のケモカインの発現レベルを比較すると、活性化Ｔ細胞を誘引できる可能性のあるＩＰ−１０及びＭｉｇはまた、ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境では親腫瘍の場合と比較して特異的にアップレギュレートされ、一方試験した他のケモカインはＬＩＧＨＴｍ陽性とＬＩＧＨＴｍ陰性の間に差がなかったことが示された。従って、ＬＩＧＨＴｍは、ナイーブＴ細胞及びおそらくは活性化されたＴ細胞の動員のためのリンパ微小環境の形成において重要な役割を果たす。
【００２２】
（ナイーブＴ細胞はＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境内に動員され得、ここで増殖して、腫瘍を拒絶する）
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、ナイーブＴ細胞の導入を可能にする可能性のある高レベルのケモカインＳＬＣ及び接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１を含有する。直接に関連する三つの疑問は、１）このような環境がナイーブＴ細胞を動員することができるか否か、２）インビボにおいて、ＬＩＧＨＴｍ存在下でナイーブＴ細胞が腫瘍内で活性化され得るか否か、３）抗原を保時する腫瘍がこれらＴ細胞によって拒絶され得るか否か、であった。Ａｇ１０４が発現する抗原Ｌｄは、腫瘍細胞の表面で、ハウスキーピング遺伝子α−ケトグルタル酸脱水素酵素由来のペプチドを提示する同種異系ＭＨＣクラスＩ分子である。Ｃ３Ｂ６Ｆ１（Ｈ−２ｋＸｂ）あるいはＢ６（Ｈ−２ｋ）宿主において、２Ｃ Ｔ細胞反応は、抗原が修飾されて抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって交差提示されると宿主から消滅するＬｄを、そのナイーブ形態において必要とするため、養子移入した２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のみが直接Ｌｄを提示するＡｇ１０４腫瘍細胞を認識する。皮下で増殖する腫瘍はリンパ組織内の直接経路を介してＴ細胞を初回抗原刺激するには極めて無効果である。３〜５×１０５のＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞をこのＣ３Ｂ６Ｆ１宿主に養子移入して２４時間後にＡｇ１０４Ｌｄを皮下接種した。腫瘍流入リンパ節あるいは他の非流入リンパ節または脾臓において、２Ｃ Ｔ細胞の増殖は、Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍誘発後７日目まで、蛍光色素ＣＦＳＥ希釈液によって検出されないか、あるいは測定されなかった。この７日間の観察の間、二次リンパ器官における２Ｃ Ｔ細胞は、その表面のＣＤ２５あるいはＣＤ６９、ＣＤ４４が低量であることによって示されるように、ナイーブ表現型を維持した。これらは、多くの理由によって抗原を有効に交差提示することができない場合、腫瘍細胞上に発現した抗原に特異的なＴ細胞が活性化されない可能性のあることを示唆している。最終的に、５×１０６もの腫瘍抗原特異的２Ｃ Ｔ細胞を宿主に移入した時でさえ、１０６のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞はＣ３Ｂ６Ｆ１マウスによって拒絶されなかった。
【００２３】
ＬＩＧＨＴｍが腫瘍環境内部に存在する場合に、２Ｃ Ｔ細胞を養子移入すると何が起こるのかを調べる。Ｃ３Ｂ６Ｆ１宿主において、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍は２Ｃ Ｔ細胞移入が無い状態で内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって拒絶された。抗原特異的Ｔ細胞を追跡してそのトラフィッキング並びにプライミング、腫瘍拒絶能力をモニタリングするため、Ｂ６（Ｈ−２ｂ）／ＲＡＧ−１−／−バックグラウンドのＨ−ＹあるいはＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウスを、腫瘍誘発のためのレシピエントとして使用した。これらのマウスはＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍に反応しないモノクローナルＣＤ８＋Ｔ細胞を内包する。従って、Ａｇ１０４ＬｄまたはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄの双方とも、ＲＡＧ−１−／−マウスにおける場合と同様に、このマウスにて精力的に増殖した（図７Ｄ）。しかしこれらのマウスにおけるＣＤ８＋ Ｈ−ＹまたはＯＴ−１トランスジェニックＴ細胞の存在に起因して、１４日目まで継続的に観察をしても、養子移入した２Ｃ Ｔ細胞は活発で恒常的な増殖を見せない（図７Ｂ）。従って、養子移入後１４日以内でのこれらの宿主における２Ｃ Ｔ細胞の活発な増殖は、抗原Ｌｄが駆動源であった。表面上に抗原Ｌｄを同レベルに発現した（図７Ａ）、１０６のＡｇ１０４ＬｄまたはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍをこれらのマウスに皮下接種した。次に腫瘍誘発後１０〜１４日目に、３×１０６のＣＦＳＥ標識した２Ｃ Ｔ細胞をこのマウスに養子移入した。Ｔ細胞移入後４８時間後、１３２時間後、１６８時間後及び３３６時間後にマウスを安楽死させて、腫瘍流入リンパ節（ＤＬＮ）、他の非流入リンパ節（ＮＤＬＮ）、脾臓（ＳＰＬ）及び腫瘍塊を回収した。コラーゲナーゼ消化によって、腫瘍塊の単細胞懸濁液を得た。必要に応じて、陽性選択磁性システムを用いて腫瘍細胞からＴ細胞腫瘍浸潤（ＴＩＬ）を精製した。２Ｃ Ｔ細胞のトラフィッキング及び増殖を評価した。Ｔ細胞移入後４８時間後に、高ＣＤ６２Ｌかつ低ＣＤ４４の、ＣＦＳＥで濃く染色されるナイーブＴ細胞は、Ａｇ１０４ＬｄまたはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍを保持するマウスの両方で二次リンパ器官において同程度に存在した（図７Ｂ及び７Ｃ）。しかし顕著な数の、ＣＤ６２ｈｉｇｈ且つＣＤ４４ｌｏｗであるナイーブ２Ｃ Ｔ細胞がＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内部で検出され、親腫瘍では検出されなかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。Ｔ細胞移入後１３２時間後に、この２Ｃ Ｔ細胞の集団はＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内部で増殖し、これはＣＦＳＥ希釈液によって示された（図７Ｂ）。この時点で親腫瘍では、ナイーブあるいは増殖した２Ｃ Ｔ細胞を検出することはできなかった（図７Ｂ）。２Ｃ Ｔ細胞移入後１６８時間後には、大量の増殖した２Ｃ Ｔ細胞がＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内のみに存在した。２Ｃ Ｔ細胞移入後７日（１６８時間）までは、ＬＩＧＨＴｍ陽性あるいはＬＩＧＨＴｍ陰性腫瘍を保持するマウスの二次リンパ組織内でＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞もしくは増殖した２Ｃ Ｔ細胞を有意に検出することはできなかった（図５Ｂ）。抗原Ｌｄによる２Ｃ Ｔ細胞の活性化は、腫瘍流入リンパ節あるいは他のリンパ節、脾臓では発生せず、ＬＩＧＨＴｍ陽性腫瘍内のみで発生した。２Ｃ Ｔ細胞移入後１４日後に、低ＣＦＳＥの、十分増殖した２Ｃ Ｔ細胞を、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍を保持するマウスの二次リンパ器官で検出した。このリンパ節内に存在する２Ｃ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌを発現した。しかし、この脾臓へトラフィッキングする２Ｃ Ｔ細胞はＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ集団とＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ集団との混合体であった（図５Ｃ）。この結果は、中心性記憶Ｔ細胞はリンパ節へ移動し、中心性及び末端性記憶Ｔ細胞の両方が脾臓へ行くことができるという従来の知見に一致した（Ａｈｍｅｄ参照）。親腫瘍を保持するマウスにおいては、１４日後に、二次リンパ器官内に存在する２Ｃ Ｔ細胞は顕著な増殖をせずにナイーブ表現型（ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ並びにＣＤ４４ｌｏｗ）を維持した（図７Ｂ及び７Ｃ）。さらに、この親腫瘍内部では、ナイーブあるいは活性化された２Ｃ Ｔ細胞を検出することができなかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。
【００２４】
さらに重要なことに、２Ｃ Ｔ細胞の増殖は腫瘍拒絶と相関していた。これらのＨ−Ｙトランスジェニックマウスにおいて１０日間定着したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は完全に抑制されたが、親腫瘍は２Ｃ Ｔ細胞を移入しないマウスと同程度増殖した（図７Ｄ）。
【００２５】
Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスを腫瘍レシピエントとして使用した。５×１０６のＡｇ１０４ＬｄまたはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴをＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下接種した。１０〜１４日後、３×１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞をこの宿主に養子移入し、４８時間後と１６８時間後に、腫瘍流入リンパ節あるいは他の非流入リンパ節、脾臓、腫瘍塊におけるＴ細胞のトラフィッキング及び増殖を調べた。Ｈ−ＹあるいはＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウスの場合と同様の結果が生じた。
【００２６】
ＬＩＧＨＴｍ媒介環境において、抗原が十分交差提示されなくても、ナイーブ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を腫瘍部位へ動員することができ、そこでこのＴ細胞は効果的に増殖し、腫瘍細胞を死滅させた。さらに意味あることには、これらのＴ細胞はＬＩＧＨＴｍがなくてもインサイチュで腫瘍の増殖を抑制することができた。興味深いことに、ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、腫瘍部位から離れ、再循環してＬＩＧＨＴｍを持たず同じ抗原を保持する遠位部位にある他の腫瘍を拒絶する可能性が考えられる腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を大量に産生した（表３）。
【００２７】
（ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄでの治療的ワクチン接種は、定着した親腫瘍を根絶する）
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境はナイーブＴ細胞を動員することができ、この腫瘍内部でナイーブＴ細胞を活性化して腫瘍拒絶を引き起こす。この発見の潜在的治療効果は、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞を定着した親腫瘍に注入することによって示された。これらの定着した腫瘍の拒絶を導く抗原の存在下で、当該処置によってリンパ様環境を作り出し、ナイーブＴ細胞を誘引することができ、続いて共刺激を介して腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化することができた。１０５のＡｇ１０４ＬｄをＣ３Ｂ６Ｆ１レシピエントに皮下接種し、この腫瘍を１４日間定着させた。次に１０６のＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をこの定着した親腫瘍内部に注入した。コントロールとして同量のＰＢＳを同じ方法で親腫瘍に注入した。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞で処理した定着した親腫瘍は、退縮して消失し始めるまでの１０〜１５日間増殖を続けた（図８）。ＰＢＳで処理したＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍は攻撃的に増殖した。
【００２８】
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、循環に戻る多数の腫瘍抗原特異的中心性並びにエフェクター記憶Ｔ細胞を産生した。当該リンパ球群の産生は、原発腫瘍を外科的に除去した後の転移の根絶に重要であり得る。ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境由来の、多量の腫瘍抗原特異的記憶Ｔ細胞によって、遠位の定着した親腫瘍を拒絶され得る。臨床関連モデルを作り出すため、１０４のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１宿主の左脇腹に注射し、腫瘍を２０日間定着させた。２０日後、１０６のＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞をこのマウスの右脇腹に注射した。あるいは、同量のＰＢＳをコントロールグループのＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍保持マウスに注射した。ＬＩＧＨＴｍ保持腫瘍細胞で処理したマウスの１００％が、定着した親腫瘍を拒絶した。コントロールグループでは、１００％のマウスでＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍は累進的に増殖した（表２）。
【００２９】
ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞の治療効果を、臨床的転移腫瘍により近く類似する別のモデルで立証した。１０６（原発腫瘍）並びに５×１０４（遠位腫瘍）のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を、それぞれレシピエントマウスの左並びに右の脇腹に接種した。腫瘍接種後１４日目に原発腫瘍を外科切除し、１０６のＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をこのマウスの背面上部に注入した。定着した遠位腫瘍の増殖を観察した。処理グループのマウスは全て、遠位腫瘍を拒絶した。しかし、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍で処理しなかった、コントロールグループでは全ての宿主が遠位腫瘍によって死亡した（表２）。
【００３０】
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境はインサイチュで、ナイーブＴ細胞及び、活性化し増殖した腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を動員して、抗原を有する腫瘍細胞を拒絶することができる。さらに、多量の腫瘍抗原特異的中心性Ｔ細胞及びエフェクター記憶型Ｔ細胞がその環境内部に生じ、遠位部位へ移動して同じ抗原を有する腫瘍を拒絶することができた（表３）。
【００３１】
（アデノウイルスによってＬＩＧＨＴ変異体（ＬＩＧＨＴｍ）を腫瘍組織へ送達すると、効果的な免疫反応と腫瘍拒絶が得られる）
図１０は、腫瘍細胞におけるインビボの変異体ＬＩＧＨＴの発現の存在に相関して、腫瘍体積が減少することを図示する。
【００３２】
図１１は、接種後１４日目と１７日目、及び３４日までの、マウスにおける自然転移の減少を図示する。Ｔ細胞を刺激する抗体である抗４１ＢＢの、腫瘍の縮小に対する相乗効果が存在する。
【００３３】
図１２は、クローン形成アッセイによってＬＩＧＨＴ変異体処理後に転移の痕跡が見られないことを示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【実施例】
【００３７】
（材料と方法）
（マウス、細胞株及び試薬）
４〜８週齢のメスＣ３ＨＸＣ５７ＢＬ／６ Ｆ１（Ｃ３Ｂ６Ｆ１）マウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６−ＲＡＧ−１−欠損（ＲＡＧ−１−／−）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。ＲＡＧ−２欠損／Ｂ６を遺伝子バックグラウンドとするＨ−Ｙ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｈ−Ｙマウス）はＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。Ｂ６にて１０代継代されたＲＡＧ−１欠損を遺伝子バックグラウンドとする２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックマウス（２Ｃマウス）はＪ．Ｃｈｅｎ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって提供された。ＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＴ−１マウス）はＡ．Ｍａ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ）によって提供された。ＲＡＧ−１−／−マウス、Ｈ−Ｙマウス、２Ｃマウス、ＯＴ−１マウスはシカゴ大学の特別な病原菌が存在しない施設内で繁殖及び飼育した。動物の飼育と使用は施設ガイドラインに従った。
【００３８】
ＡＧ１０４Ａ線維肉腫は老齢のＣ３Ｈマウスにて自然増殖して現れたもので、記載されているように培養に適合した（Ｗａｒｄ １９８９ ＪＥＭ）。ＡＧ１０４Ａ細胞の遺伝子導入体である、ＡＧ１０４Ａ発現マウスＨ−２Ｌｄ（Ａｇ１０４−Ｌｄ）についてはこれまでに記載されている（Ｗｉｃｋ Ｍ，１９９７，ＪＥＭ）。これらの腫瘍細胞株は、１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を添加したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）内で維持した。抗Ｌｄ抗体（クローン３０−５−７）並びに抗２Ｃ ＴＣＲ（１Ｂ２）抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、それぞれＤ．Ｓａｃｈｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）並びにＴ．Ｇａｊｗｅｓｋｉ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ）から入手した。
【００３９】
ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体は、標準的な手順によってＧタンパク質カラムを使用して、培養物上清から精製した。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏによって、１Ｂ２抗体はＦＩＴＣあるいはビオチンに結合された。ＰＥ結合抗ＣＤ８抗体、Ｃｙクロム（ＣｙＣ）結合ストレプトアビジン、ＣｙＣ結合抗ＣＤ４４抗体、ＰＥ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体及びＰＥ結合Ｔｈ１．２抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体はＣａｌｔａｇから購入した。ＰＥ結合ストレプトアビジンはＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈから購入した。ＰＥ結合ロバ抗ヒトＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ（Ｗｅｓｔ ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。ビオチン化ヤギ抗ＳＬＣ抗体はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＡＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇ抗体はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入した。精製ヤギ抗ＳＬＣ抗体はＰｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋ ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入した。コラゲナーゼ（４型）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＣＦＳＥはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入した。
【００４０】
本研究で使用したＨＶＥＭ−ＩｇとＬＴβＲ−Ｉｇとの融合タンパク質については、以前に記載されている（ｊｉｎｇ’ｓ ＪＣＩ及びＱ．Ｗｕ ＪＥＭ １９９９）。
【００４１】
（Ｂ７．１または変異体ＬＩＧＨＴｍ発現ベクター及びクローンの作製）
ｐＭＦＧ−Ｓ−変異体ＬＩＧＨＴｍを産生するため、ｐｃＤＮＡ３．１−変異体ＬＩＧＨＴｍをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで分解し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ分解ｐＭＦＧ−Ｓ−ＴＰＡプラスミドに連結させた（Ｄｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。変異ＬＩＧＨＴｍを含有するウイルスを産生するφＮｘＥｃｏパッケージング細胞は、カルシウム沈降法によるＭＦＧ−Ｓ−変異ＬＩＧＨＴｍを用いた一過性トランスフェクションによって作製した。感染したＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルク）による変異体ＬＩＧＨＴｍの発現を、変異体ＬＩＧＨＴｍを認識するウサギ抗血清を用いた細胞染色によって分析した。続いて、この形質移入した変異体ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を限界希釈法によってクローニングした。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍクローンＨ１０は、今回の実験で使用したこれらクローンの一つである。
【００４２】
（インビボにおける腫瘍増殖）
腫瘍細胞を背面下部、即ちマウスの尾付け根から０．５〜１ｃｍ上部に、皮下接種した。腫瘍の増殖を３〜４日ごとにキャリパーを使用して測定した。立方センチメートルで表す体積は式Ｖ＝πａｂｃ／６によって算出した。ここでａ、ｂ及びｃは３つの直交する径である。
【００４３】
（組織学）
組織学的試験のための腫瘍組織を、記載した時に採取して１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋してヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＳＬＣの免疫組織化学染色のために、腫瘍組織を採取し、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）内に包埋して−７０℃で凍結した。凍結切片（厚さ５〜１０μｍ）を、ＰＢＳ中の冷２％ホルマリンで固定し、０．１％サポニン／ＰＢＳで透過性を持たせた。この切片を、加湿チャンバー内において常温で３０分、０．１％サポニン／ＰＢＳ中の５％ヤギ血清で前ブロッキングした。ＳＬＣに対する染色は、最初に、ブロッキング緩衝液中に１／２５に希釈したビオチン化ヤギ抗ＳＬＣ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でインキュベートして行った。２時間後にアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を加えた。免疫蛍光染色のため、加湿チャンバー内において常温で３０分、切片をＰＢＳ中の２％正常マウス血清、ウサギ血清及びヤギ血清でブロッキングした。ブロッキング溶液を、ブロッキング溶液で１／１００に希釈した５０μｌの一次抗体ＰＥ結合抗Ｔｈ１．２抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）またはＰＥ結合抗ＣＤ８（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に置き換え、切片を加湿チャンバー内にて常温で１時間インキュベートした。検体は、１０％の１，４−ジアゾビシクロ［２．２．２］オクタンを含有するＭｏｗｉｏｌ ４−８８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）上にのせた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）及びＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＰＸＬ ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して、サンプルは４８時間以内に分析した。Ｏｐｅｎｌａｂ ｖ２．０．６（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、非隣接デコンボリューションを行った。
【００４４】
（ＣＣＬ２１に対するＥＬＩＳＡ）
腫瘍ホモジェネートを調製してＣＣＬ２１についてアッセイを行った。腫瘍保持マウスから相当量の腫瘍組織を回収して秤量し、タンパク質分解酵素阻害剤を含有するＰＢＳ中でホモジェナイズして遠心分離し、その上清を回収した。ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）をＰＢＳ中の２μｍｌヤギ抗マウスＣＣＬ２１でコーティングし、次に常温で３０分間、ＰＢＳ中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。洗浄後、既知濃度の標準液（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＣＬ２１，５０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ）の連続希釈物とサンプルとを加え、常温で２時間インキュベートした。３回の洗浄後、ビオチン化ウサギ抗ＳＬＣ抗体をウェルに加えた。２時間インキュベーションおよび洗浄後、５０μｌの１／１０００希釈アルカリホスファターゼ結合アビジン（Ｄａｋｏ）を１時間加えて発色させた。自動プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｍａｘ ３４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上にて４０５ｎｍで発色を測定した。ＣＣＬ２１の量をＥＬＩＳＡによって標準曲線から判定し、組織重量に応じて正規化した。データは平均値±標準偏差である。
【００４５】
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）
リアルタイムＰＣＲを行った。Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて腫瘍から全ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で消化して染色体ＤＮＡを除去した。残存するＤＮａｓｅＩを、７５℃、２０分間で不活化し、ＲＮＡの保全性は臭化エチジウム染色ゲルによる可視化によって評価した。Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、５μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。このリアルタイム定量ＰＣＲ分析はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ＣＣＬ２１に対するプライマー配列は、５’−ＡＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡ−３’（順方向プライマー）および５’−ＧＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴ−３’（逆方向プライマー）であり、ＣＣＬ２１に対するプローブは、５’−ＣＣＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＴＣ−３’であった。ＭＡｄＣＡＭ−１に対するプライマーは、５’−ＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴ−３’（順方向プライマー）および５’−ＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＧ−３’（逆方向プライマー）であり、ＭＡｄＣＡＭ−１に対するプローブは、５’−ＣＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＣ−３’であった。ＧＡＰＤＨに対するプライマーは、５’−ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（順方向プライマー）および５’−ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡ−３’（逆方向プライマー）であり、ＧＡＰＤＨに対するプローブは、５’−ＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ−３’であった。ＣＣＬ２１ならびにＭＡｄＣＡＭ−１プローブを６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識した。ＧＡＰＤＨプローブをテトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）で標識した。各ｃＤＮＡサンプルをＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを含むＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の使用説明書に従って用いて、ＣＣＬ２１およびＧＡＰＤＨまたはＭＡｄＣＡＭ−１およびＧＡＰＤＨについて二本鎖で増幅した。ＰＣＲの条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクルであった。比較ＣＴ（増幅プロットと臨界値との間の交差する点にある臨界サイクル数）法を使用して標的遺伝子の濃度を決定し、内部ＧＡＰＤＨコントロールに対して標準化した。
【００４６】
（腫瘍組織ケモカインのマイクロアレイ）
これらの実験のため、ＧＥＡｒｒａｙ Ｑ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｏｕｓｅ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用した。Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて腫瘍由来の全ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で消化して染色体ＤＮＡを除去した。残存するＤＮａｓｅＩを、７５℃、２０分間で不活性化した。ＲＮＡの保全性は臭化エチジウム染色ゲルで可視化することによって評価した。このマイクロアレイは、製造者の使用説明書に従って使用された。簡単には、提供された試薬を使用して、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いた逆転写によって全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、［−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍＭ）で放射性物質標識し、次いで正確に特定された条件下で整列されたＤＮＡを含む陽性荷電のナイロン膜とハイブリダイズした。洗浄後、このアレイをホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）によって可視化した。ハウスキーピング遺伝子ＰＵＣ１８、アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するハイブリダイゼーションシグナルの強度に基づいて積荷を調整し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウエアを使用してホスホイメージャーにより記録したデジタル画像をデジタルデータに変換して後に、遺伝子発現を定量した。ＧＥＡｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエアを製造者の使用説明書に従って使用して生データを解析した。
【００４７】
（Ｔ細胞共刺激アッセイ）
製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）による指示どおりに磁場におけるネガティブ選択法によってＴ細胞を精製した。単離したＴ細胞の精製度は、９５％を超えており、これはＣＤ３に対するモノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーで評価した。０．２ｇ／ｍｌのＣＤ３に対するモノクローナル抗体でコーティングしたプレートをさらに３７℃で４時間、ＬＩＧＨＴｍ−ｆｌａｇでコーティングした。洗浄後、精製Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をこのウェル内で培養した。ＣＤ２８に対するモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を可溶化形態で使用した。全てのアッセイにおいて、３日間の培養中最後の１５時間に１Ｃｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加して、Ｔ細胞の増殖を測定した。３Ｈ−チミジンの取り込みは、ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）にて測定した。
【００４８】
（ＦＡＣＳによる細胞分析）
変異体ＬＩＧＨＴｍがＬＴｂＲおよびＨＶＥＭに結合することを確認するために、変異体ＬＩＧＨＴをトランスフェクトしたＡＧ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（ＡＧ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ）を、ＬＴｂＲ−ＩｇまたはＨＶＥＭ−Ｉｇ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートして洗浄し、それぞれＰＥ結合ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体またはＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色した。Ｌｄの発現分析のため、腫瘍細胞を抗Ｌｄ抗体とインキュベートして洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。ＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞の増殖を検出するため、単離したリンパ節（ＬＮ）細胞、脾細胞、および腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）を、ビオチン化１Ｂ２抗体で染色して洗浄し、ＣｙＣ結合ストレプトアビジンおよびＰＥ結合抗ＣＤ８抗体で染色した。ＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞およびＣＤ４４の発現を分析するため、単離したＬＮ細胞、脾細胞またはＴＩＬをビオチン化１Ｂ２抗体で染色して洗浄し、ＰＥ結合ストレプトアビジンとＣｙＣ結合抗ＣＤ４４抗体との混合物で染色した。ＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞とＣＤ６２Ｌ発現の分析のため、単離したＬＮ細胞、脾細胞またはＴＩＬをビオチン化１Ｂ２抗体で染色して洗浄し、ＣｙＣ結合ストレプトアビジンおよびＰＥ結合抗ＣＤ６２Ｌで染色した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｎで分析し、データをＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウエアまたはＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて分析した。
【００４９】
（２Ｃ Ｔ細胞の養子移入）
ＬＮ細胞および脾細胞を２Ｃマウスから単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブ選択した。分析の際、濃縮されたＣＤ８＋細胞のうちの＞９０％が２Ｃレセプターを発現していた。腫瘍増殖のアッセイのため、約３×１０６の２Ｃ Ｔ細胞をＨ−ＹマウスまたはＯＴ−１マウスに移入した。同数の２Ｃ Ｔ細胞を各実験にて各マウスに移入した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を移入するため、２×１０７／ｍｌのＴ細胞を、１０μＭ ＣＦＳＥを用いてＰＢＳ溶液中３７℃、３０分間で標識した。この細胞を同量のＦＣＳ用いて１分間でクエンチして３回洗浄した。３×１０６のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、０．２ｍｌ容量で腫瘍保有マウスの後眼窩叢内に静脈内注射した。指示した時間に、鼡径リンパ節（ＤＬＮ）、他のリンパ節（非流入リンパ節［ＮＤＬＮ］）、脾臓または腫瘍から細胞を単離した。
【００５０】
（細胞除去およびＬＴｂＲ−ＩｇによるＬＩＧＨＴｍ活性のインビボ遮断）
ＣＤ４＋細胞についてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＧＫ１．５（Ｄｉａｌｙｎａｓ ＤＭ ＪＩ １９８３）、ＣＤ８＋細胞についてｍＡｂ ２，３４（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ Ｍ １９８０ ＪＩ）を使用する標準的手順（免疫学に関する現在のプロトコール）によって、マウスのリンパ球サブセットを除去した。ＦＡＣＳによる脾細胞およびリンパ節の実験によって、除去したサブセットが、全リンパ球のうちの＜０．５％であり、他のサブセットは正常レベルであることが示された。マウス内でＬＩＧＨＴｍを遮断するため、腫瘍誘発の同日および誘発の１週間後にＬＴβＲ−Ｉｇ（１００μｇ／注射）を腹膜内で投与した。
【００５１】
（腫瘍組織からの細胞単離）
最初に腫瘍組織内の血液混入を減少させるためにマウスを飼育した。腫瘍組織を採取してＰＢＳで洗浄し、切断して小片とした。これを３７℃の振盪インキュベーターにて、２％ ＦＣＳおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（コラゲナーゼＤ溶液）を添加したＤＭＥＭに４０分間再懸濁した。４０分後に単細胞懸濁液を回収し、全腫瘍組織が解離して単細胞懸濁液となるまで、細胞凝集塊をさらに４０分間コラゲナーゼＤ溶液中で消化した。
【００５２】
（ＬＩＧＨＴｍおよびＬＩＧＨＴｍ発現細胞の送達）
ＬＩＧＨＴｍをコードする核酸の患者への送達は、患者が直接、核酸あるいは核酸保有ベクターに暴露される直接送達、または最初に生検から得た腫瘍細胞をインビトロでこの核酸で形質転換して放射線処理し、次いで患者へ移植する間接送達のいずれかであり得る。これらの手法は、腫瘍の抑制あるいは他の疾患の治療のための遺伝子治療にて施行されている。
【００５３】
（核酸の送達）
核酸配列をインビボに直接投与し、そこでそれらを発現させてコードされるタンパク質を産生した。これは、以下による当該分野で公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る：例えば、この核酸塩基配列を適当な核酸発現ベクターの一部分として構築し、それらが細胞内に入るように投与すること、欠損させたもしくは弱毒化したレトロウイルスベクターあるいは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）を使用して感染させること、または裸のＤＮＡを直接注射、または微粒子照射、もしくは脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト試薬を用いたコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルによるカプセル化、の使用、または核に入ることが知られているペプチドと結合させてそれらを投与すること、またはレセプター媒介性エンドサイトーシスに関わるリガンドに結合させてそれを投与すること（これは、このレセプターを発現する細胞型を特異的に標的とするために使用され得る）など。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現のために相同組み換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませ得る。
【００５４】
また、核酸をカプセル化する生分解性ミクロスフェアも遺伝子送達に使用されている。マトリックス、フィルム、ゲルおよびジヒドラジドで誘導体化され、かつ徐放性ミクロスフェアを形成する核酸に架橋されたヒアルロン酸（ＨＡ）を含むハイドロゲルのようなミクロスフェアが、核酸を送達するために使用されている。米国特許第６０４８５５１号は、ポリ（ラクチド‐グリコリド）（ＰＬＧＡ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸セルロースアセテート、および遺伝子ベクターをカプセル化するコポリマーミクロスフェアを利用する、徐放性遺伝子送達系を開示している。
【００５５】
前記の方法を実行する際に使用される治療的組成物は、所望の送達法に適したキャリアを含有する薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療的組成物と組み合わされたときに、この治療的組成物の抗腫瘍機能を保持する物質が挙げられる。例としては、滅菌リン酸緩衝液、静菌水のようなあらゆる多数の標準的薬学的キャリアが挙げられるが、これらに限定されない。治療的処方物は可溶化され得、治療的組成物を腫瘍部位へ送達し得る任意の経路を介して投与され得る。可能性のある有効的な投与経路としては、静脈内、非経口、腹膜内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正所性などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌生鮮水の溶液中、および／または注射用滅菌塩化ナトリウムを含むポリ塩化ビニルバッグもしくはポリエチレンバッグ内で希釈された治療的組成物を含む。治療的タンパク質調製物は、好ましくは減圧下で、凍結乾燥され、滅菌粉体として保存され得、次いで注射前に静菌水（例えばベンジルアルコール保存剤が挙げられる）または滅菌水中で再構成され得る。前記方法を使用する癌治療のための投薬量および投与プロトコールは、方法および標的の癌で変化し、一般的に当該分野にて認識される多数の他の要因に依存する。
【００５６】
（ウイルスベクターを使用する送達）
本発明の抗体をコードする核酸塩基配列を含むウイルスベクターは、特定の核酸の送達するために使用される。例えば、レトロウイルスベクターが、使用され得る。このレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含む。遺伝子治療で使用する、所望のタンパク質をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター内にクローン化され、これによって、遺伝子の患者への送達が容易になる。アデノウイルスは、遺伝子治療に使用され得る別のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に呼吸器上皮へ遺伝子を送達するのに魅力的なビヒクルであり、アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療での使用が提案されている（米国特許第５，４３６，１４６号）。レンタウイルス（Ｌｅｎｔａｖｉｒｕｓ）は、遺伝子治療での使用に有望である。
【００５７】
（組織培養物中のトランスフェクト細胞、およびその後の患者への送達）
遺伝子治療の別の手法は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクトまたはウイルス感染のような方法によって組織培養物中の細胞に遺伝子の移入する工程を包含する。通常、移入の方法としては、選別可能なマーカーの細胞への移入が挙げられる。次いで、細胞は選別を受け、移入遺伝子を取り込み発現している細胞が単離される。次いで、この細胞は患者へ送達される。この方法で核酸は、得られる組み換え細胞をインビボ投与するのに先立って細胞内に導入される。そのような導入は、当該分野で公知の任意の方法（トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、この核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性トランスフェクト、微小核体媒介性トランスフェクト、スフェロプラストなどが挙げられるが、これらに限定されない）によって実行され得る。この技術は、細胞への安定した核酸移入を提供するはずであり、この結果、核酸は、その細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、そしてその細胞の子孫によって発現可能である。
【００５８】
生じる組み換え細胞は、放射線照射され得、当該分野で公知の種々の方法によって患者へ送達され得る。組み換え細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは静脈内に投与される。想定される細胞の使用量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。遺伝子治療を目的とする核酸が導入され得る細胞としては、任意の所望の入手可能な細胞型が挙げられ、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、血液細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨大核細胞、顆粒球）、種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
（ワクチン）
本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」は、腫瘍特異的免疫反応を誘発する組成物（例えば、ＬＩＧＨＴｍ抗原およびアジュバント）をいう。これらのワクチンとしては、予防的なもの（新たな腫瘍を予防する）および治療的なもの（親腫瘍を根絶する）が挙げられる。変異体ＬＩＧＨＴをコードするＤＮＡワクチンのようなワクチンベクターは、腫瘍に対する免疫応答を誘発するために使用され得る。ワクチン組成物を一部位（例えば、腫瘍から離れた部位）へ投与することによって、この応答は、患者自身の免疫系により誘発される。この免疫反応は、身体中の腫瘍細胞（例えば、原発腫瘍細胞および転移腫瘍細胞の両方）の根絶をもたらし得る。腫瘍ワクチンを作製する方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，９９４，５２３号および同第６，２０７，１４７号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）を参照する）。
【００６０】
ワクチンは、薬学的組成物中に一つ以上の腫瘍抗原を含み得る。いくつかの例では、腫瘍抗原は、投与の前に不活化される。他の実施形態では、このワクチンは、一つ以上のさらなる治療薬剤（例えば、サイトカインまたはサイトカイン発現細胞）をさらに含み得る。
【００６１】
特定の場合、例えば通常の皮膚生検から得られる、患者から選別された細胞（例えば、繊維芽細胞）は、一般に所望の一タンパク質のうちの一つを発現するよう遺伝的に改変される。あるいは、免疫系における抗原提示細胞として通常役立ち得る患者細胞（マクロファージ、単球、およびリンパ球）はまた、遺伝的に改変されて、所望の抗原のうちの一つ以上が発現され得る。次いで、この抗原発現細胞は、例えば、放射線照射した腫瘍細胞の形態、あるいは、精製天然腫瘍抗原もしくは組換え腫瘍抗原の形態の、患者の腫瘍細胞（例えば、腫瘍抗原）と混合され、例えば、皮下にて免疫化において使用されて、全身性抗腫瘍免疫が誘導される。これらのワクチンは、任意の適切な方法を使用して投与され得、これらの方法としては、上記の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
（クローン形成アッセイ）
（肺のクローン形成アッセイ）
（材料）
１）ＤＭＥＭ ５％ ＦＣＳ（＋ｐ／ｓ、ＨＥＰＥＳ）
２）コラゲナーゼ４型（Ｓｉｇｍａ）
３）６０μＭ ６−チオグアニン
４）５０ｍｌ コニカルチューブ
５）６ウェル組織培養プレート
６）３７℃振盪インキュベーター／組織インキュベーター
７）解剖器具：ハサミ、膝状ハサミおよび鉗子
８）７０μｍナイロン細胞ストレーナー
９）ＡＣＫ溶解液
１０）メタノール
１１）０．０３％（ｗ／ｖ）メチレンブルー溶液
注意：全ての溶液および器具は滅菌でなければならず、従って無菌操作が使用されるべきである。
【００６３】
（コラゲナーゼ培地の調製）
肺一個当たり約２５ｍｌの培地にコラゲナーゼを加えて１．５ｍｇ／ｍｌ濃度の培地を作製する。
【００６４】
（肺サンプルの調製）
１．マウスから肺を取り出し、６ウェルのプレートへ移す
２．約２００μｌの培地を肺に加える
３．膝状ハサミを用いて、肺を小片に切り刻む
４．閉じたハサミの曲線部分を利用して、切り刻んだ肺を５ｍｌコラゲナーゼ培地の５０ｍｌコニカルチューブへ移す
５．ウェルへ５ｍｌの培地を加えてピペットで取り出し、残りの肺小片をコニカルチューブへ移す
６．３７℃で２０分間、１７５ｒｐｍの振盪インキュベーターに置く
７．上清を細胞ストレーナーに通してきれいな５０ｍｌコニカルチューブへそそぐ−細胞ストレーナー上の任意の肺小片は、二次消化のためにコニカルチューブへ戻す
ａ．消化物からの上清を含む試験管を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して遠心沈降させる
ｂ．遠心沈降後、上清を捨てる
ｃ．１ｍｌのコラゲナーゼを含まない新鮮培地に、ペレットを再懸濁する
８．５分間ＡＣＫ溶解する
９．細胞数を数える
１０．３×１０５、３×１０４、３×１０３の細胞を１２ウェルプレートにプレーティングする
１１．６０μＭの６−チオグアニンを各ウェルに加える
１２．プレートを、５％ ＣＯ２、５〜１０日間、３７℃の組織インキュベーター内に置く。
【００６５】
（クローン形成性転移コロニーの収集）
（必ずしも必要ではないが、コロニー数の計数が容易になる）
１．組織培養プレートから培養培地を捨てる
２．各プレートに５ｍｌのメタノールを加えて揺り回し、細胞を固定する。室温で５分間インキュベートする
ａ．注意：コロニーは白色に変わるはずである
３．メタノールを捨て、各プレートを５ｍｌの蒸留水穏やかにリンスする
ａ．重要な注意：細胞が固定されるまで、細胞を水と接触させない
４．各プレートに５ｍｌの０．０３％（ｗ／ｖ）メチレンブルー溶液を添加する。揺り回してプレート全体が覆われるようにし、室温で５分間インキュベートする
５．染色液を捨て、５ｍｌの蒸留水で穏やかにリンスする
６．プレートを空気乾燥させ、その後、青色のコロニーを計数する
１つのコロニーが、１つのクローン形成性転移細胞を表す。
【００６６】
（引用された刊行物）
引用された刊行物は、それらが本発明に関する範囲で参考として援用される。
【００６７】
【化１】
【００６８】
【化２】
【００６９】
【化３】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ＴＮＦ／ＬＴ／ＬＩＧＨＴファミリーメンバーの間の相互作用に関する現在のモデルを説明する。ＬＴβＲは膜ＬＴと膜ＬＩＧＨＴとの両方に結合する一方、ＨＶＥＭはＬＩＧＨＴに結合する。可溶性ＴＮＦ３及びＬＴα３はＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩＩに結合する。
【図２】図２は、ＬＩＧＨＴｍと抗原特異的Ｔ細胞との両方が最適な腫瘍拒絶反応に必要であることを示す。腫瘍細胞（５ｘ１０５）をＣＢ６Ｆ１に接種した。左図がＬＩＧＨＴｍでトランスフェクトした腫瘍、右図がコントロールの腫瘍である。１４日後、２Ｃ Ｔ細胞（１０ｘ１０５）をこのマウスに移植し、腫瘍の増殖をモニタリングした。腫瘍増殖曲線を示す。
【図３】図３は、Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウス並びにＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスにおけるＬＩＧＨＴ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍の増殖反応速度を示す。Ａ．ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインからタンパク質分解部位に対応する４アミノ酸を欠失して腫瘍細胞表面上での安定した発現を確保した。Ｂ．バルクもしくはクローン化した、Ａｇ１０４Ｌｄ親腫瘍細胞、ＬＩＧＨＴｍでトランスフェクトしたＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を、ＬＴβＲヒトＩｇ、ＨＶＥＭマウスＩｇ染色し、続いてヒトＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ロバ抗体またはマウスＩｇＧに対するヤギ抗体でそれぞれ染色した（実線）。二次抗体のみで染色した腫瘍細胞を点線で示した。Ｃ．Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ親腫瘍細胞（黒ひし形）あるいはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（白ひし形）を皮下接種した。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスにおいて、Ａｇ１０４Ｌｄは累進的に増殖したが、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは拒絶された。Ｄ．Ｂ６／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（黒ひし形）あるいはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（白ひし形）を皮下注射することによって、誘発した。Ｂ６／ＲＡＧ−１−／−マウスでは、双方の腫瘍とも累進的に増殖した。
【図４】図４は、改変されたＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインが、精製Ｔ細胞反応を共刺激するのに十分であることを示す。Ａ．ＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメイン（アミノ酸８５〜２３９）及び、組み換えタンパク質の精製を容易にするためのフラッグ配列を含む組み換えタンパク質。Ｂ．ＣＤ３に対する抗体（抗ＣＤ３）存在下で、精製Ｔ細胞は固定されたＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインで刺激された。
【図５】図５は、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍組織において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤が増加したことを示す写真説明である。５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、またはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下注射した。腫瘍を接種して１０〜１４日後に腫瘍組織を回収した。腫瘍組織の凍結切片を、記載の通りＨＥ（上図）もしくは抗Ｔｈ１．２−ＰＥ（中図）、抗ＣＤ８−ＰＥ（下図）で染色した。
【図６−１】図６Ａは、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍においてＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子が増加することを説明する。（１）５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ、（２）Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、または（３）Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１もしくはＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスに皮下接種した。腫瘍誘発後１０〜１４日目に腫瘍組織を回収した。Ｂ．同量の腫瘍組織を、プロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳ中で完全に粉砕した。遠心分離の後、上清中のＳＬＣをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスおよびＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスの双方から記載のように回収したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのＳＬＣを含んでいた。Ｃ．Ａｇ１０４Ｌｄ、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、またはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ由来の腫瘍組織を１０％中性ホルマリンで固定し、切片にして抗マウスＳＬＣ、続いて二次抗体で染色した。発色（赤色）を矢印で示した。バックグラウンドはヘモトキシリンで対比染色した（青色）。Ｄ．腫瘍組織から全ＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行って接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１及びケモカインＳＬＣの発現を分析した。Ｅ．腫瘍組織から精製した全ＲＮＡを用いて、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍において示される他のケモカインの発現を分析するために、遺伝子アレイを行った。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍組織にて、ＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子の増加が認められた。相対的発現レベルを左のパネルに示した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍによる発現の増加の倍数を右のパネルに示した。全ＲＮＡを腫瘍組織から単離し、記載の通りに遺伝子アレイを実施してＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍におけるケモカインの発現を分析した。
【図６−２】図６Ａは、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍においてＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子が増加することを説明する。（１）５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ、（２）Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、または（３）Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１もしくはＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスに皮下接種した。腫瘍誘発後１０〜１４日目に腫瘍組織を回収した。Ｂ．同量の腫瘍組織を、プロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳ中で完全に粉砕した。遠心分離の後、上清中のＳＬＣをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスおよびＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスの双方から記載のように回収したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのＳＬＣを含んでいた。Ｃ．Ａｇ１０４Ｌｄ、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、またはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ由来の腫瘍組織を１０％中性ホルマリンで固定し、切片にして抗マウスＳＬＣ、続いて二次抗体で染色した。発色（赤色）を矢印で示した。バックグラウンドはヘモトキシリンで対比染色した（青色）。Ｄ．腫瘍組織から全ＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行って接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１及びケモカインＳＬＣの発現を分析した。Ｅ．腫瘍組織から精製した全ＲＮＡを用いて、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍において示される他のケモカインの発現を分析するために、遺伝子アレイを行った。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍組織にて、ＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子の増加が認められた。相対的発現レベルを左のパネルに示した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍによる発現の増加の倍数を右のパネルに示した。全ＲＮＡを腫瘍組織から単離し、記載の通りに遺伝子アレイを実施してＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍におけるケモカインの発現を分析した。
【図７−１】図７は、ＬＩＧＨＴｍが媒介するＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍環境がナイーブ２Ｃ Ｔ細胞を強化し、それらを活性化し、そして腫瘍拒絶反応を引き起こすことを示す。Ａ．Ａｇ１０４Ｌｄ並びにＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは、同レベルの抗原Ｌｄを発現した。Ａｇ１０４Ｌｄ（黒実線）もしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ（灰色実線）腫瘍細胞を抗Ｌｄ、続いてマウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体による二次染色を行った。二次抗体のみで染色した腫瘍細胞を点線で示した。Ｂ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間、１３２時間、１６８時間、および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍を浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗ＣＤ−８及び２Ｃ ＴＣＲクローン型抗体１Ｂ２で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ８及び１Ｂ２二重陽性の２Ｃ Ｔ細胞の増殖を示した。Ｃ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍に浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗体１Ｂ２および活性化マーカーＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４に対する抗体で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。１Ｂ２陽性２Ｃ Ｔ細胞によって発現されたＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４を示した。Ｄ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に３Ｘ１０６の２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−宿主において、養子移入された２Ｃ Ｔ細胞はＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄの増殖を抑制することができたが、親腫瘍においてはできなかった。
【図７−２】図７は、ＬＩＧＨＴｍが媒介するＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍環境がナイーブ２Ｃ Ｔ細胞を強化し、それらを活性化し、そして腫瘍拒絶反応を引き起こすことを示す。Ａ．Ａｇ１０４Ｌｄ並びにＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは、同レベルの抗原Ｌｄを発現した。Ａｇ１０４Ｌｄ（黒実線）もしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ（灰色実線）腫瘍細胞を抗Ｌｄ、続いてマウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体による二次染色を行った。二次抗体のみで染色した腫瘍細胞を点線で示した。Ｂ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間、１３２時間、１６８時間、および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍を浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗ＣＤ−８及び２Ｃ ＴＣＲクローン型抗体１Ｂ２で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ８及び１Ｂ２二重陽性の２Ｃ Ｔ細胞の増殖を示した。Ｃ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍に浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗体１Ｂ２および活性化マーカーＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４に対する抗体で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。１Ｂ２陽性２Ｃ Ｔ細胞によって発現されたＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４を示した。Ｄ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に３Ｘ１０６の２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−宿主において、養子移入された２Ｃ Ｔ細胞はＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄの増殖を抑制することができたが、親腫瘍においてはできなかった。
【図８】図８は、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄを腫瘍内に注入すると、確立した親腫瘍が根絶することを示す。１０５のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに接種し、次いで記載の通り、親腫瘍の誘発後１４日目に、１０６のＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞、もしくはコントロールとしてＰＢＳを腫瘍内に注射した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍで処理したＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍は拒絶されたが、ＰＢＳで処理したものは累進的に増殖した。
【図９】図９は、ＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸の塩基配列を示す。開始コドンＡＴＧは太字で示し、ＬＩＧＨＴｍにおいて欠失されているタンパク質分解部位をコードする領域には下線を引いている。
【図１０】図１０は、アデノウイルスによって変異体ＬＩＧＴＨが腫瘍組織に送達されることにより、効果的な免疫反応および腫瘍拒絶反応を可能にすることを示す。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに２Ｘ１０５のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を接種し、次いで親腫瘍誘発後１４日目に記載の通り、５Ｘ１０１０のＬＩＧＨＴ発現アデノウイルス（左）あるいはＬａｃＺ発現アデノウイルス（右）を腫瘍内に注射した。腫瘍の体積は式（長さＸ幅Ｘ高さ）／２によって算出した。
【図１１】図１１は、４Ｔ１腫瘍増殖の阻害、および自然転移性腫瘍の減少を示す。０日目に４Ｔ１マウスにコントロール、変異体ＬＩＧＨＴ、またはＬＩＧＨＴｍおよび抗４−１ ＢＢを接種した。７日目に、Ａｄ−ＬＧＨＴｍ（またはＤ１０ ２Ａ）はいくらかの減少を示し、１４日目及び１７日目にこの体積の減少はよりはっきりした。１９日目に腫瘍は除去された。３４日目、肺転移に関して組織を検査した。
【図１２】図１２は、図１１の処理群の、クローン原性アッセイの結果を示す。Ａｄ−変異体ＬＩＧＨＴｍで処置したマウスにおける転移は、４１ ＢＢを使用したものとしていないものについて妨げられた。
【背景技術】
【０００１】
（開示の背景）
免疫応答性宿主において確立された腫瘍を浸潤する活性化Ｔ細胞が少量であることは、宿主が腫瘍を処理できないことを説明する。動物モデル及び臨床研究における実験は、免疫系は個々の腫瘍細胞を認識して殺傷させ得る死滅させ得るが、一般に宿主は確立された固形腫瘍を根絶し得ないことを示している。宿主が確立された腫瘍に対して効果的に応答できないことに対するいくつかの説明があり得る：１）組織に移動する腫瘍細胞（特に、非造血系起源の腫瘍細胞）の不適当な数のためにリンパ組織において直接または間接の提示が弱いことが原因で、初期Ｔ細胞初回抗原刺激が欠如していること；２）腫瘍組織周囲の生物学的障壁が原因で、腫瘍部位へ移動する免疫細胞の数が不適当であること；３）レパートリーが限定されていることが原因で、腫瘍増殖と戦うことができない活性化された抗原特異的Ｔ細胞が消耗しているか、または短命であること；４）Ｔ細胞が腫瘍に対して非応答性であるか、または腫瘍を認識しないこと；５）免疫系を活性化するための阻害的微小環境であるか、または腫瘍内部の刺激が欠如していること。
【０００２】
臨床学的に、腫瘍部位へのＴ細胞の浸潤の増大はよりよい予後と密接に関係している。従来の研究によって、接種腫瘍細胞の拒絶反応を誘発する際に予防的ワクチン接種が有効であることが示されている。しかし、腫瘍の増殖が確立された後では、通常、治療的ワクチン接種によって腫瘍を拒絶することができない。腫瘍の外科的な切除は、腫瘍に対する免疫反応を増進しない。さらに、たとえ腫瘍細胞上に強力な抗原が発現していても、リンパ組織に抗原特異的Ｔ細胞が過量に存在するのにもかかわらず、確立された腫瘍の拒絶反応を促進するには不十分であったことが報告された。Ｔ細胞の初回抗原刺激および／または確立された腫瘍への浸潤の欠如は、抗原性癌に対する自然または治療のアプローチのどちらかについての主要な障害のうちの一つである。加えて、腫瘍組織内部の共刺激分子の発現が不十分であることは、浸潤Ｔ細胞の活性化が行われず、このため腫瘍反応性Ｔ細胞のアネルギーを生じ得る。
【０００３】
初期Ｔ細胞の初回抗原刺激の欠如はおそらく、直接提示のために固形組織からリンパ組織へ移動する腫瘍細胞が極めて少ないことに起因する。骨髄キメラを用いた遺伝子分析によって、ＭＨＣ−Ｉを制限するＣＤ８＋Ｔ細胞の初回抗原刺激に対する抗原提示の２つの様式が明らかにされている。直接初回抗原刺激は、Ｔ細胞と抗原性エピトープを有するタンパク質を合成する細胞との関係によって仲介され、クロスプライミング（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ）は、他の細胞によって合成された抗原を取り込む、宿主の抗原提示細胞によって仲介される。腫瘍特異的Ｔ細胞を初回抗原刺激するための機構は活発に議論されており、これまでの所結論には至っていないままである。どこでどうのように腫瘍抗原がＴ細胞に提示されるかを理解することは、腫瘍に対する治療行為を見出す助けになる。
【０００４】
ＬＴβＲを介するシグナル伝達は組織化されたリンパ組織を形成するのに必要とされる。リンホトキシンβレセプター（ＬＴβＲ）は、リンパ構造の形成に重要な役割を果たしている。ＬＴβＲは、ＴＮＦファミリーの二つのメンバー（膜リンホトキシンαβ並びにＬＩＧＨＴ）によって活性化される（図１）。ＬＴβＲは、ＬＮの形成、および二次リンパ器官におけるＴ、Ｂ領域の明確な組織化において中枢的役割を果たしている。ＬＴβＲを介するシグナル伝達は、二次リンパ器官内でケモカイン及び接着分子の発現を制御する。ケモカイン並びに接着分子は、脾臓におけるＤＣ並びにリンパ球の移動及び位置決めを制御する。非リンパ組織における可溶性ＬＴまたはＴＮＦの過剰発現は、機能性リンパ新生を促進するために十分であった。
【０００５】
ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞活性化及びリンパ組織の形成において独自の役割を果たしている。ＬＩＧＨＴは、ＬＴβＲ及びヘルペスウイルス進入メディエーター（ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ ｅｎｔｒｙ ｍｅｄｉａｔｏｒ）（ＨＶＥＭ）に対するリガンドである。ＬＩＧＨＴは、リンパ組織上で優勢的に発現する。ＬＩＧＴＨとＬＴβＲとの間の相互作用が、ＬＴα−／−マウスの脾臓においてリンパ構造を回復する。さらに、ＬＩＧＴＨのアップレギュレートは、Ｔ細胞の活性化および非リンパ組織への移動を引き起こし、リンパ様構造が形成される。逆に、ＬＩＧＨＴ−／−マウスは、Ｔ細胞活性化に障害が見られ、心臓の拒絶反応を遅延した。従って、ＬＩＧＨＴは、強力な共刺激分子であって、リンパ組織の形成をも促進して局所免疫反応を推進する。
【０００６】
リンパ組織の枯渇における効果的なナイーブＴ細胞の初回抗原刺激の欠如、並びに腫瘍内部において腫瘍特異的Ｔ細胞の増殖ができないことが、癌の根絶が妨げられている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
変異体ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞の初回抗原刺激のためのケモカイン、接着分子、および共刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作り出し、腫瘍細胞を殺傷する。
【０００８】
変異体ＬＩＧＨＴ（ＬＩＧＨＴｍ）は、プロテアーゼタンパク消化を阻害するために作製され、このためＬＩＧＨＴは、腫瘍細胞上で発現され得る。非変異体ＬＩＧＨＴは、腫瘍表面で発現されず、効果的な抗腫瘍活性を誘発しない。
【０００９】
リンホトキシンレセプターを発現した支質並びにＨＶＥＭを発現したＴ細胞に対するリガンドである変異体ＬＩＧＨＴｍを腫瘍環境内部へ導入することは、大量のナイーブＴリンパ球の浸潤を伴う、高レベルのケモカイン及び接着分子が誘発した。変異体ｌｉｇｈｔ（ＬＩＧＨＴｍと称する）は、正常ＬＩＧＨＴのアミノ酸配列から欠失した７９〜８２位由来のタンパク質分解部位ＥＫＬＩを有する（図３Ａ）（Ｔａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＬＩＧＨＴは局所並びに遠位の部位において、確立された高度進行性親腫瘍の拒絶反応を促進する。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞は、十分に確立された親腫瘍を根絶し転移による新たな腫瘍の形成を防ぐための、医学が関係する治療的及び予防的ワクチンに基づいている。
【００１０】
治療的ワクチンとしてのＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍は、より多くのナイーブＴ細胞を誘引し、次いでこれを活性化してより多くの抗腫瘍特異的Ｔ細胞を作り出し、局所並びに遠位の腫瘍と戦う。
【００１１】
ＬＩＧＨＴｍ並びに腫瘍（または腫瘍抗原）は、Ｔ細胞を初回抗原刺激し、予防ワクチンとして長期間の防御を導く。
【００１２】
腫瘍（特に、固形腫瘍）を処置する新しい方法は、変異体ＬＩＧＨＴ分子を使用することによって、ナイーブＴ細胞を初回抗原刺激して活性化Ｔ細胞を増殖させるのに必要なケモカイン並びに接着分子、共刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作り出すことである。幅広いＴ細胞が、腫瘍に対して産生される。変異体ＬＩＧＨＴをコードする配列を含むアデノウイルスベクターは、腫瘍及び転移に対して有効である。ベクターが変異体ＬＩＧＨＴを腫瘍に送達した場合、コントロールベクターで注入した腫瘍と比較して、インビボにおける腫瘍の体積が減少した。
【００１３】
（発明の詳細な説明）
腫瘍細胞上のＬＩＧＨＴｍの発現は、腫瘍拒絶反応を促進する。腫瘍Ａｇ１０４Ａおよびその誘導体を腫瘍モデルの一つとして使用した。Ａｇ１０４Ａは元来、Ｃ３Ｈ（Ｈ−２ｋ）マウスの自然骨肉腫に由来し、Ｃ３ＨマウスまたはＢ６Ｃ３Ｆ１マウスにおいて、極低用量のＡｇ１０４Ａ投与（１０４）でも、浸潤をほとんど生じずに累進的に増殖し得る。強力な抗原Ｌｄを腫瘍に導入する場合、その腫瘍は免疫認識に対して耐性であり続け、このことが強力な腫瘍障壁である可能性が示唆される。変異したＬＩＨＧＴｍをレトロウイルスによってトランスフェクトしたＡｇ１０４Ｌｄは、その表面上にＬＩＧＨＴｍを安定に発現する。
【００１４】
最初にＬＩＧＨＴｍ−Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍をＢ６Ｃ３Ｆ１マウスに２週間接種し、次に１Ｘ１０６の２Ｃ Ｔ細胞を、確立した腫瘍を有するマウスに移植した。印象的なことに、全ての確立したＬＩＧＨＴｍ−Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍（１０／１０）が２Ｃ Ｔ細胞移植後１週間で拒絶された一方、Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍は拒絶されなかった（０／１０）。Ｂ７−１はＴ細胞の活性化と増殖に関わる強力な共刺激分子であるが、ＬＩＧＨＴｍと対照的に、Ａｇ１０４ＬｄのＢ７−１発現が、腫瘍の拒絶反応には十分でない。これらのデータは、ＬＩＧＨＴｍが、Ｂ７−１よりも腫瘍寛容を打破するためにより強力であり得ることを示唆する。ＬＩＧＨＴｍの二重効果を考えると、腫瘍部位におけるＬＩＧＨＴｍの局所的な発現により、リンパ組織のケモカイン及び接着分子の発現が制御することによって、腫瘍の「障壁」を通過して樹状細胞及びＴ細胞が誘引され得る。さらに、ＬＩＧＨＴｍの局所的な発現は抗原特異的Ｔ細胞に対する腫瘍抗原の直接提示を強化し得、腫瘍微小環境内の浸潤するＴ細胞のアネルギーを妨ぎ得る、強力な共刺激分子となる。ＬＩＧＨＴｍを発現するもしくは発現しない、Ｈ−２ｂバックグラウンドの腫瘍、ＭＣ５７腫瘍（繊維肉腫）、ＭＣ５７−Ｌｄ、およびＭＣ５７−ＳＩＹが作製され、腫瘍免疫におけるＬＩＧＨＴｍ及びそのレセプターの役割の特性をさらに明確にするため、ＬＴβＲ、ＬＩＧＨＴｍ、およびＨＶＥＭ ＫＯマウスを含むＢ６マウスモデルにおいて使用される。ＬＩＧＨＴｍは腫瘍免疫の媒介において複数の機能を有するようである。またＬＩＧＨＴｍはインビボで腫瘍のアポトーシスを促進し得る。興味深いことに、ＬＩＧＨＴｍをコードするｃＤＮＡを腫瘍内部に注入すると、抗原特異的細胞溶解性Ｔ細胞反応が誘発され、確立したマウス腫瘍Ｐ８１５に対する治療免疫が誘導された。
【００１５】
（腫瘍内で発現したＬＩＧＨＴｍは、宿主抵抗力を５００倍以上増大させた）
繊維肉腫Ａｇ１０４Ｌｄは高い腫瘍形成能を持ち、１０４の細胞をレシピエントマウスＣ３Ｂ６Ｆ１に皮下注射した場合、１００％増殖した（表１）。腫瘍上に発現した抗原Ｌｄに対するＴ細胞が充満する、２Ｃ Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスは、同一の抗原を含む皮膚移植が拒絶された後でさえこれを根絶することができなかったと報告されている（Ｈａｎｓ，１９９７）。腫瘍特異的Ｔ細胞を腫瘍内へ向かわせ、腫瘍部位にてこれを活性化する方法は、臨床的な癌免疫治療と同様に、拒絶反応についての決定的な超えるべき障害物であると思われる。腫瘍環境内で発現したＬＩＧＨＴは、それぞれＬＴβＲ並びにＨＶＥＭを介して、腫瘍内部へＴ細胞を誘引して活性化し、腫瘍拒絶反応へ導くことによって、寛容性を打破し得る（図２）。これを実証するため、レトロウイルスベクターＭＦＧを利用するレトロウイルス形質導入によって、ＬＩＧＨＴをこの腫瘍細胞株で発現させた。当初、形質導入後、腫瘍細胞表面にてＬＩＧＨＴ発現は検出されなかった。ＬＩＧＨＴは、その配列上に、腫瘍細胞株の表面上で安定して存在することを妨げ得るタンパク質分解部位を有しているので、膜上のＬＩＧＨＴタンパク質分解を減少させるＬＩＧＨＴの変異版（ＬＩＧＨＴｍ）が使用された（図３Ａ）。変異体ＬＩＧＨＴｍ／ＭＦＧのＡｇ１０４Ｌｄへのレトロウイルスによる形質導入の後、ＬＴβＲ−Ｉｇによって、形質導入された腫瘍細胞の表面上でＬＩＧＨＴｍ発現を検出した（図３Ｂ）。このような細胞をＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルクと定義した。さらに、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を限界希釈法によってクローニングした。他に指定されていない限り、ほとんどの実験において、このクローンの一つであるＨ１０を使用した。変異体ＬＩＧＨＴｍはそのレセプターであるＬＴβＲ及びＨＶＥＭの双方に結合することができた。試験したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルク並びに全クローンは、ＬＩＧＨＴｍ、ＬＴβＲ及びＨＶＥＭのレセプターに結合し、可溶性ＬＴβＲ及びＨＶＥＭによって染色可能であることによって示した。ＬＴβＲ−Ｉｇ及びＨＶＥＭ−Ｉｇによる、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルク及びクローンＨ１０の典型的な染色プロフィールを示した（図３Ｂ）。親腫瘍細胞並びにＬＩＧＨＴトランスフェクト体の増殖は、組織培養物並びにＲＡＧ−１−／−マウスの双方において同じであった（図３Ｄ）。様々な数のＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞、バルクもしくはクローンＨ１０を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下接種した。レシピエントは、５Ｘ１０６の最高用量の注入投与したＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞を拒絶した。これは親腫瘍が１００％累進的に増殖する用量の５００倍であった（表１）。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞バルク並びにクローＨ１０の代表的な増殖反応速度、ならびに親腫瘍を５Ｘ１０６接種した時の、典型的な増殖反応速度を図３Ｃに示した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは、接種後初めの２週間は増殖し、続いて親腫瘍が増殖を続ける場合に退行し、３〜４週間で宿主を殺傷した（図３Ｃ）。
可溶性ＬＴβＲでＬＩＧＨＴｍの機能を遮断する場合、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍が増殖したことから、腫瘍拒絶反応はＬＩＧＨＴｍ依存的であるもようである（表１）。腫瘍拒絶反応はリンパ球に依存する。リンパ球が欠如したＲＡＧ−１−／−マウスでは、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄは親腫瘍と同程度累進的に増殖した（図３Ｄ）。抗ＣＤ８＋抗体によってＣＤ８＋Ｔ細胞が失活しているＣ３Ｂ６Ｆ１マウスはこれらの腫瘍を拒絶しなかったため、ＣＤ４＋Ｔ細胞ではなくＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＩＧＨＴ発現Ａｇ１０４Ｌｄの拒絶反応を媒介するのに必須であった（表１）。一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞はこの腫瘍拒絶に必要ではない。
【００１６】
（ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境では、より多くの浸潤するＣＤ８＋Ｔ細胞を有する）
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍拒絶反応の基礎となる可能性のある機構を調べるため、５Ｘ１０６のＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄもしくは同じメンバーの親腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下注射した。腫瘍接種後１０〜１４日目、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞が拒絶される前に腫瘍組織を回収した。この腫瘍組織をＨＥ染色すると、大量のリンパ球が浸潤していることが示された（図５）一方、親腫瘍ではごく僅かな浸潤しか見られなかった（図５）。免疫蛍光染色によって、浸潤しているリンパ球の内、大量のＴｈｙ１．２＋Ｔ細胞（図５）、特にＣＤ８＋Ｔ細胞がＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内部に存在していることを確認した（図５）。
【００１７】
（ＬＩＧＨＴの改変した細胞外ドメインはＴ細胞の共刺激に十分である）
ＬＩＧＨＴは、Ｔ細胞増殖を導く強力な共刺激活性を有することが報告されている。ＬＩＧＨＴの変異体形態では、分子の膜貫通部位に極近い、細胞外ドメインにおけるタンパク質分解部位に相当する４つのアミノ酸を欠失させた（図３Ａ）。ＬＩＧＨＴｍ分子内の変異は、ＬＩＧＨＴｍの共刺激効果に影響する。細胞外ドメインを短くした形態であるアミノ酸８５〜２３９のみを含有し、精製を容易にするためのフラッグペプチドを有する組み換えＬＩＧＨＴｍタンパク質を作製した（組み換えＬＩＧＨＴｍ）（図４Ａ）。改変したＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインは、Ｔ細胞を共刺激するに十分であった。この試験のため、プレート結合組み換えＬＩＧＨＴｍを用いたインビトロ共刺激アッセイを用いて、準最適用量のＣＤ３に対する固定化抗ＣＤ３モノクローナル抗体存在下で精製マウスＴ細胞を刺激した。固定化組み換えＬＩＧＨＴｍは、準最適量のＣＤ３に対する抗体存在下で、用量依存の様式で強力に精製マウスＴ細胞の増殖を刺激した（図４Ｂ）。ＬＩＧＨＴｍ分子から欠失しているタンパク質分解部位を除いたアミノ酸８５〜２３９である、改変されたＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインは、Ｔ細胞レセプターの関係が生じる場合、Ｔ細胞増殖の共刺激に十分であった。
【００１８】
（Ｂ７．１分子を発現する腫瘍は、親腫瘍と同程度の浸潤するＴ細胞を含有する）
ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤はＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境よる腫瘍拒絶に相関した。ＬＩＧＨＴｍはＴ細胞に対する強力な共刺激効果を有するので、別の強力な共刺激分子であるＢ７．１が大量のＴ細胞の浸潤に関連した腫瘍拒絶反応を媒介するために十分か否かが問題となった。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍと同じ方法で形質導入した５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１腫瘍細胞を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下接種した。これらの腫瘍はレシピエントにおいて累進的に増殖した。この腫瘍組織に対するＨＥ染色は、リンパ球の浸潤をほとんど示さなかった（図５）。抗Ｔｈｙ−１．２並びに抗ＣＤ８を用いた免疫蛍光染色は、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１腫瘍組織が、親の腫瘍Ａｇ１０４Ｌｄと比較して同等のレベルのＴ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を含む）を含むことを明らかにし（図５）、これはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ（図５）と比較して実質的に少ない。このデータは、二つの共刺激分子（Ｂ７．１並びにＣＤ４８）を発現するＡｇ１０４Ｌｄが２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックマウスによって拒絶されなかった（Ｈａｎｓ，１９９７ ＪＥＭ）という従来の所見と一致した。これら一連の証拠は、これらの腫瘍モデルにおいて、強力な共刺激だけでは腫瘍拒絶反応を媒介するのに十分ではないことが示唆された。
【００１９】
（ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、高レベルのケモカインＳＬＣ及びアップレギュレートされた接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１を含有する）
問題は、ＬＩＧＨＴ媒介腫瘍環境について何が特異であるかということであった。ＬＩＧＨＴｍはＴ細胞上に発現されるレセプターＨＶＥＭに結合し、これを介してＬＩＧＨＴｍはＴ細胞の共刺激を媒介する模様であるが、ＬＴβＲはＬＩＧＨＴｍと相互作用する別のレセプターである。ＬＴβＲシグナル伝達は、ケモカインＳＬＣ及び接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１に対する重要な制御因子であり、ナイーブＴ細胞が二次リンパ組織へ帰着するのを制御する。腫瘍環境におけるＬＩＧＨＴｍはこれらの腫瘍間質細胞上のＬＴβＲと相互作用して、腫瘍環境内のＳＬＣ及びＭＡｄＣＡＭ−１をアップレギュレートすると思われる。接種後１０〜１４日目に、親Ａｇ１０４ＬｄあるいはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄのいずれかから腫瘍組織を回収した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって、ＬＩＧＨＴｍ陽性腫瘍塊は親腫瘍よりもＳＬＣを高レベルに発現することが示された（図６Ａ）。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ中のＳＬＣ量を検出するＥＬＩＳＡによって、この結果を独立して確認した（図６Ｂ）。親腫瘍ではＳＬＣはごく僅かにしか検出されなかった（図６Ｂ）。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍において、より高いＳＬＣが検出されたことが、単に、腫瘍環境（ＲＡＧ−１−／−腫瘍担体からの組織）中により多く存在するＴ細胞に対する反応がより活発に進行していることに起因する可能性を除くため。リンパ球欠損マウス中で増殖するＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのＳＬＣを含有していた（図６Ｂ）。さらに、ＲＡＧ−１−／−マウスにおいてＬＩＧＨＴｍ陽性及びＬＩＧＨＴｍ陰性腫瘍の双方が等しく増殖したことは、ケモカインＳＬＣ単独では腫瘍拒絶の媒介に不十分であることを示唆している。これらのデータは、Ｃ３Ｂ６Ｆ１腫瘍保持動物（ＴＢＡ）から回収された他の５対のＬＩＧＨＴｍ陽性及びＬＩＧＨＴｍ陰性腫瘍試料由来の組織切片の免疫化学的染色に一致した。ＳＬＣ及びヘマトキシリンで二重染色した腫瘍組織で明確に示されたように、高密度の浸潤するリンパ球に囲まれたＬＩＧＨＴ発現腫瘍内の間質に富む部位領域で、ＳＬＣの非常に強い染色が検出された（図６Ｃ）。しかし、ＬＩＧＨＴｍ陰性の腫瘍組織上の間質に富む部位領域においてはＳＬＣは検出されなかった（図６Ｃ）。また、コントロール腫瘍の場合と同じく、Ｂ７．１発現腫瘍由来の組織もまた、ＳＬＣ染色は見られず、浸潤するリンパ球はほとんど存在しなかった（図６Ｃ）。
【００２０】
接着分子はリンパ球が周辺組織へ移動するために重要であり、ＬＴβＲシグナル伝達は接着分子の一つであるＭＡｄＣＡＭ−１の発現に重要である（Ｋａｎｇ，２００２）。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍塊あるいは親腫瘍におけるＭＡｄＣＡＭ−１発現レベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。親腫瘍と比較すると、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍塊において接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１の発現量が増加した（図６Ｄ）。これらの実験は、腫瘍環境中のＬＩＧＨＴが腫瘍間質由来のＬＴβＲと相互作用し、ケモカインＳＬＣ及び接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１をアップレギュレートしてリンパ球を腫瘍環境内に誘引することを強く示唆するものであった。
【００２１】
リンパ組織ケモカインに加えて、ＬＴβＲシグナル伝達はまた、ＩＮＦ−γ誘導ケモカインである、ＩＰ−１０及びＭｉｇのセットも制御する。ジーンアレイで他のケモカインの発現レベルを比較すると、活性化Ｔ細胞を誘引できる可能性のあるＩＰ−１０及びＭｉｇはまた、ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境では親腫瘍の場合と比較して特異的にアップレギュレートされ、一方試験した他のケモカインはＬＩＧＨＴｍ陽性とＬＩＧＨＴｍ陰性の間に差がなかったことが示された。従って、ＬＩＧＨＴｍは、ナイーブＴ細胞及びおそらくは活性化されたＴ細胞の動員のためのリンパ微小環境の形成において重要な役割を果たす。
【００２２】
（ナイーブＴ細胞はＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境内に動員され得、ここで増殖して、腫瘍を拒絶する）
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、ナイーブＴ細胞の導入を可能にする可能性のある高レベルのケモカインＳＬＣ及び接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１を含有する。直接に関連する三つの疑問は、１）このような環境がナイーブＴ細胞を動員することができるか否か、２）インビボにおいて、ＬＩＧＨＴｍ存在下でナイーブＴ細胞が腫瘍内で活性化され得るか否か、３）抗原を保時する腫瘍がこれらＴ細胞によって拒絶され得るか否か、であった。Ａｇ１０４が発現する抗原Ｌｄは、腫瘍細胞の表面で、ハウスキーピング遺伝子α−ケトグルタル酸脱水素酵素由来のペプチドを提示する同種異系ＭＨＣクラスＩ分子である。Ｃ３Ｂ６Ｆ１（Ｈ−２ｋＸｂ）あるいはＢ６（Ｈ−２ｋ）宿主において、２Ｃ Ｔ細胞反応は、抗原が修飾されて抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって交差提示されると宿主から消滅するＬｄを、そのナイーブ形態において必要とするため、養子移入した２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞のみが直接Ｌｄを提示するＡｇ１０４腫瘍細胞を認識する。皮下で増殖する腫瘍はリンパ組織内の直接経路を介してＴ細胞を初回抗原刺激するには極めて無効果である。３〜５×１０５のＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞をこのＣ３Ｂ６Ｆ１宿主に養子移入して２４時間後にＡｇ１０４Ｌｄを皮下接種した。腫瘍流入リンパ節あるいは他の非流入リンパ節または脾臓において、２Ｃ Ｔ細胞の増殖は、Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍誘発後７日目まで、蛍光色素ＣＦＳＥ希釈液によって検出されないか、あるいは測定されなかった。この７日間の観察の間、二次リンパ器官における２Ｃ Ｔ細胞は、その表面のＣＤ２５あるいはＣＤ６９、ＣＤ４４が低量であることによって示されるように、ナイーブ表現型を維持した。これらは、多くの理由によって抗原を有効に交差提示することができない場合、腫瘍細胞上に発現した抗原に特異的なＴ細胞が活性化されない可能性のあることを示唆している。最終的に、５×１０６もの腫瘍抗原特異的２Ｃ Ｔ細胞を宿主に移入した時でさえ、１０６のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞はＣ３Ｂ６Ｆ１マウスによって拒絶されなかった。
【００２３】
ＬＩＧＨＴｍが腫瘍環境内部に存在する場合に、２Ｃ Ｔ細胞を養子移入すると何が起こるのかを調べる。Ｃ３Ｂ６Ｆ１宿主において、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍は２Ｃ Ｔ細胞移入が無い状態で内因性ＣＤ８＋Ｔ細胞によって拒絶された。抗原特異的Ｔ細胞を追跡してそのトラフィッキング並びにプライミング、腫瘍拒絶能力をモニタリングするため、Ｂ６（Ｈ−２ｂ）／ＲＡＧ−１−／−バックグラウンドのＨ−ＹあるいはＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウスを、腫瘍誘発のためのレシピエントとして使用した。これらのマウスはＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍に反応しないモノクローナルＣＤ８＋Ｔ細胞を内包する。従って、Ａｇ１０４ＬｄまたはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄの双方とも、ＲＡＧ−１−／−マウスにおける場合と同様に、このマウスにて精力的に増殖した（図７Ｄ）。しかしこれらのマウスにおけるＣＤ８＋ Ｈ−ＹまたはＯＴ−１トランスジェニックＴ細胞の存在に起因して、１４日目まで継続的に観察をしても、養子移入した２Ｃ Ｔ細胞は活発で恒常的な増殖を見せない（図７Ｂ）。従って、養子移入後１４日以内でのこれらの宿主における２Ｃ Ｔ細胞の活発な増殖は、抗原Ｌｄが駆動源であった。表面上に抗原Ｌｄを同レベルに発現した（図７Ａ）、１０６のＡｇ１０４ＬｄまたはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍをこれらのマウスに皮下接種した。次に腫瘍誘発後１０〜１４日目に、３×１０６のＣＦＳＥ標識した２Ｃ Ｔ細胞をこのマウスに養子移入した。Ｔ細胞移入後４８時間後、１３２時間後、１６８時間後及び３３６時間後にマウスを安楽死させて、腫瘍流入リンパ節（ＤＬＮ）、他の非流入リンパ節（ＮＤＬＮ）、脾臓（ＳＰＬ）及び腫瘍塊を回収した。コラーゲナーゼ消化によって、腫瘍塊の単細胞懸濁液を得た。必要に応じて、陽性選択磁性システムを用いて腫瘍細胞からＴ細胞腫瘍浸潤（ＴＩＬ）を精製した。２Ｃ Ｔ細胞のトラフィッキング及び増殖を評価した。Ｔ細胞移入後４８時間後に、高ＣＤ６２Ｌかつ低ＣＤ４４の、ＣＦＳＥで濃く染色されるナイーブＴ細胞は、Ａｇ１０４ＬｄまたはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍを保持するマウスの両方で二次リンパ器官において同程度に存在した（図７Ｂ及び７Ｃ）。しかし顕著な数の、ＣＤ６２ｈｉｇｈ且つＣＤ４４ｌｏｗであるナイーブ２Ｃ Ｔ細胞がＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内部で検出され、親腫瘍では検出されなかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。Ｔ細胞移入後１３２時間後に、この２Ｃ Ｔ細胞の集団はＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内部で増殖し、これはＣＦＳＥ希釈液によって示された（図７Ｂ）。この時点で親腫瘍では、ナイーブあるいは増殖した２Ｃ Ｔ細胞を検出することはできなかった（図７Ｂ）。２Ｃ Ｔ細胞移入後１６８時間後には、大量の増殖した２Ｃ Ｔ細胞がＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍内のみに存在した。２Ｃ Ｔ細胞移入後７日（１６８時間）までは、ＬＩＧＨＴｍ陽性あるいはＬＩＧＨＴｍ陰性腫瘍を保持するマウスの二次リンパ組織内でＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞もしくは増殖した２Ｃ Ｔ細胞を有意に検出することはできなかった（図５Ｂ）。抗原Ｌｄによる２Ｃ Ｔ細胞の活性化は、腫瘍流入リンパ節あるいは他のリンパ節、脾臓では発生せず、ＬＩＧＨＴｍ陽性腫瘍内のみで発生した。２Ｃ Ｔ細胞移入後１４日後に、低ＣＦＳＥの、十分増殖した２Ｃ Ｔ細胞を、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍を保持するマウスの二次リンパ器官で検出した。このリンパ節内に存在する２Ｃ Ｔ細胞は、高レベルのＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌを発現した。しかし、この脾臓へトラフィッキングする２Ｃ Ｔ細胞はＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗ集団とＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ集団との混合体であった（図５Ｃ）。この結果は、中心性記憶Ｔ細胞はリンパ節へ移動し、中心性及び末端性記憶Ｔ細胞の両方が脾臓へ行くことができるという従来の知見に一致した（Ａｈｍｅｄ参照）。親腫瘍を保持するマウスにおいては、１４日後に、二次リンパ器官内に存在する２Ｃ Ｔ細胞は顕著な増殖をせずにナイーブ表現型（ＣＤ６２Ｌｈｉｇｈ並びにＣＤ４４ｌｏｗ）を維持した（図７Ｂ及び７Ｃ）。さらに、この親腫瘍内部では、ナイーブあるいは活性化された２Ｃ Ｔ細胞を検出することができなかった（図７Ｂ及び７Ｃ）。
【００２４】
さらに重要なことに、２Ｃ Ｔ細胞の増殖は腫瘍拒絶と相関していた。これらのＨ−Ｙトランスジェニックマウスにおいて１０日間定着したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は完全に抑制されたが、親腫瘍は２Ｃ Ｔ細胞を移入しないマウスと同程度増殖した（図７Ｄ）。
【００２５】
Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスを腫瘍レシピエントとして使用した。５×１０６のＡｇ１０４ＬｄまたはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴをＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下接種した。１０〜１４日後、３×１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞をこの宿主に養子移入し、４８時間後と１６８時間後に、腫瘍流入リンパ節あるいは他の非流入リンパ節、脾臓、腫瘍塊におけるＴ細胞のトラフィッキング及び増殖を調べた。Ｈ−ＹあるいはＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウスの場合と同様の結果が生じた。
【００２６】
ＬＩＧＨＴｍ媒介環境において、抗原が十分交差提示されなくても、ナイーブ腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を腫瘍部位へ動員することができ、そこでこのＴ細胞は効果的に増殖し、腫瘍細胞を死滅させた。さらに意味あることには、これらのＴ細胞はＬＩＧＨＴｍがなくてもインサイチュで腫瘍の増殖を抑制することができた。興味深いことに、ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、腫瘍部位から離れ、再循環してＬＩＧＨＴｍを持たず同じ抗原を保持する遠位部位にある他の腫瘍を拒絶する可能性が考えられる腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を大量に産生した（表３）。
【００２７】
（ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄでの治療的ワクチン接種は、定着した親腫瘍を根絶する）
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境はナイーブＴ細胞を動員することができ、この腫瘍内部でナイーブＴ細胞を活性化して腫瘍拒絶を引き起こす。この発見の潜在的治療効果は、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞を定着した親腫瘍に注入することによって示された。これらの定着した腫瘍の拒絶を導く抗原の存在下で、当該処置によってリンパ様環境を作り出し、ナイーブＴ細胞を誘引することができ、続いて共刺激を介して腫瘍特異的Ｔ細胞を活性化することができた。１０５のＡｇ１０４ＬｄをＣ３Ｂ６Ｆ１レシピエントに皮下接種し、この腫瘍を１４日間定着させた。次に１０６のＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をこの定着した親腫瘍内部に注入した。コントロールとして同量のＰＢＳを同じ方法で親腫瘍に注入した。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞で処理した定着した親腫瘍は、退縮して消失し始めるまでの１０〜１５日間増殖を続けた（図８）。ＰＢＳで処理したＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍は攻撃的に増殖した。
【００２８】
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境は、循環に戻る多数の腫瘍抗原特異的中心性並びにエフェクター記憶Ｔ細胞を産生した。当該リンパ球群の産生は、原発腫瘍を外科的に除去した後の転移の根絶に重要であり得る。ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境由来の、多量の腫瘍抗原特異的記憶Ｔ細胞によって、遠位の定着した親腫瘍を拒絶され得る。臨床関連モデルを作り出すため、１０４のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１宿主の左脇腹に注射し、腫瘍を２０日間定着させた。２０日後、１０６のＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞をこのマウスの右脇腹に注射した。あるいは、同量のＰＢＳをコントロールグループのＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍保持マウスに注射した。ＬＩＧＨＴｍ保持腫瘍細胞で処理したマウスの１００％が、定着した親腫瘍を拒絶した。コントロールグループでは、１００％のマウスでＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍は累進的に増殖した（表２）。
【００２９】
ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞の治療効果を、臨床的転移腫瘍により近く類似する別のモデルで立証した。１０６（原発腫瘍）並びに５×１０４（遠位腫瘍）のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を、それぞれレシピエントマウスの左並びに右の脇腹に接種した。腫瘍接種後１４日目に原発腫瘍を外科切除し、１０６のＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をこのマウスの背面上部に注入した。定着した遠位腫瘍の増殖を観察した。処理グループのマウスは全て、遠位腫瘍を拒絶した。しかし、ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍で処理しなかった、コントロールグループでは全ての宿主が遠位腫瘍によって死亡した（表２）。
【００３０】
ＬＩＧＨＴｍ媒介腫瘍環境はインサイチュで、ナイーブＴ細胞及び、活性化し増殖した腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を動員して、抗原を有する腫瘍細胞を拒絶することができる。さらに、多量の腫瘍抗原特異的中心性Ｔ細胞及びエフェクター記憶型Ｔ細胞がその環境内部に生じ、遠位部位へ移動して同じ抗原を有する腫瘍を拒絶することができた（表３）。
【００３１】
（アデノウイルスによってＬＩＧＨＴ変異体（ＬＩＧＨＴｍ）を腫瘍組織へ送達すると、効果的な免疫反応と腫瘍拒絶が得られる）
図１０は、腫瘍細胞におけるインビボの変異体ＬＩＧＨＴの発現の存在に相関して、腫瘍体積が減少することを図示する。
【００３２】
図１１は、接種後１４日目と１７日目、及び３４日までの、マウスにおける自然転移の減少を図示する。Ｔ細胞を刺激する抗体である抗４１ＢＢの、腫瘍の縮小に対する相乗効果が存在する。
【００３３】
図１２は、クローン形成アッセイによってＬＩＧＨＴ変異体処理後に転移の痕跡が見られないことを示す。
【００３４】
【表１】
【００３５】
【表２】
【００３６】
【表３】
【実施例】
【００３７】
（材料と方法）
（マウス、細胞株及び試薬）
４〜８週齢のメスＣ３ＨＸＣ５７ＢＬ／６ Ｆ１（Ｃ３Ｂ６Ｆ１）マウスは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ， ＭＤ）から購入した。Ｃ５７ＢＬ／６−ＲＡＧ−１−欠損（ＲＡＧ−１−／−）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から購入した。ＲＡＧ−２欠損／Ｂ６を遺伝子バックグラウンドとするＨ−Ｙ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｈ−Ｙマウス）はＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から購入した。Ｂ６にて１０代継代されたＲＡＧ−１欠損を遺伝子バックグラウンドとする２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックマウス（２Ｃマウス）はＪ．Ｃｈｅｎ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって提供された。ＯＴ−１ ＴＣＲトランスジェニックマウス（ＯＴ−１マウス）はＡ．Ｍａ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ）によって提供された。ＲＡＧ−１−／−マウス、Ｈ−Ｙマウス、２Ｃマウス、ＯＴ−１マウスはシカゴ大学の特別な病原菌が存在しない施設内で繁殖及び飼育した。動物の飼育と使用は施設ガイドラインに従った。
【００３８】
ＡＧ１０４Ａ線維肉腫は老齢のＣ３Ｈマウスにて自然増殖して現れたもので、記載されているように培養に適合した（Ｗａｒｄ １９８９ ＪＥＭ）。ＡＧ１０４Ａ細胞の遺伝子導入体である、ＡＧ１０４Ａ発現マウスＨ−２Ｌｄ（Ａｇ１０４−Ｌｄ）についてはこれまでに記載されている（Ｗｉｃｋ Ｍ，１９９７，ＪＥＭ）。これらの腫瘍細胞株は、１０％ ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１００Ｕ／ｍｌペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）を添加したＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）内で維持した。抗Ｌｄ抗体（クローン３０−５−７）並びに抗２Ｃ ＴＣＲ（１Ｂ２）抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、それぞれＤ．Ｓａｃｈｓ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）並びにＴ．Ｇａｊｗｅｓｋｉ（Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ）から入手した。
【００３９】
ハイブリドーマが産生したモノクローナル抗体は、標準的な手順によってＧタンパク質カラムを使用して、培養物上清から精製した。Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆａｃｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏによって、１Ｂ２抗体はＦＩＴＣあるいはビオチンに結合された。ＰＥ結合抗ＣＤ８抗体、Ｃｙクロム（ＣｙＣ）結合ストレプトアビジン、ＣｙＣ結合抗ＣＤ４４抗体、ＰＥ結合抗ＣＤ６２Ｌ抗体及びＰＥ結合Ｔｈ１．２抗体はＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体はＣａｌｔａｇから購入した。ＰＥ結合ストレプトアビジンはＩｍｍｕｎｏｔｅｃｈから購入した。ＰＥ結合ロバ抗ヒトＩｇＧはＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ（Ｗｅｓｔ ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から購入した。ビオチン化ヤギ抗ＳＬＣ抗体はＲ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から購入した。ＡＰ結合ウサギ抗ヤギＩｇ抗体はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）から購入した。精製ヤギ抗ＳＬＣ抗体はＰｅｐｒｏ Ｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋ ｈｉｌｌ，ＮＪ）から購入した。コラゲナーゼ（４型）はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ＣＦＳＥはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから購入した。
【００４０】
本研究で使用したＨＶＥＭ−ＩｇとＬＴβＲ−Ｉｇとの融合タンパク質については、以前に記載されている（ｊｉｎｇ’ｓ ＪＣＩ及びＱ．Ｗｕ ＪＥＭ １９９９）。
【００４１】
（Ｂ７．１または変異体ＬＩＧＨＴｍ発現ベクター及びクローンの作製）
ｐＭＦＧ−Ｓ−変異体ＬＩＧＨＴｍを産生するため、ｐｃＤＮＡ３．１−変異体ＬＩＧＨＴｍをＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで分解し、ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ分解ｐＭＦＧ−Ｓ−ＴＰＡプラスミドに連結させた（Ｄｒ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＲＣ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）。変異ＬＩＧＨＴｍを含有するウイルスを産生するφＮｘＥｃｏパッケージング細胞は、カルシウム沈降法によるＭＦＧ−Ｓ−変異ＬＩＧＨＴｍを用いた一過性トランスフェクションによって作製した。感染したＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍバルク）による変異体ＬＩＧＨＴｍの発現を、変異体ＬＩＧＨＴｍを認識するウサギ抗血清を用いた細胞染色によって分析した。続いて、この形質移入した変異体ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を限界希釈法によってクローニングした。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍクローンＨ１０は、今回の実験で使用したこれらクローンの一つである。
【００４２】
（インビボにおける腫瘍増殖）
腫瘍細胞を背面下部、即ちマウスの尾付け根から０．５〜１ｃｍ上部に、皮下接種した。腫瘍の増殖を３〜４日ごとにキャリパーを使用して測定した。立方センチメートルで表す体積は式Ｖ＝πａｂｃ／６によって算出した。ここでａ、ｂ及びｃは３つの直交する径である。
【００４３】
（組織学）
組織学的試験のための腫瘍組織を、記載した時に採取して１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィン包埋してヘマトキシリン及びエオシンで染色した。ＳＬＣの免疫組織化学染色のために、腫瘍組織を採取し、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ，Ｒｅｈｏｖｏｔ，Ｉｓｒａｅｌ）内に包埋して−７０℃で凍結した。凍結切片（厚さ５〜１０μｍ）を、ＰＢＳ中の冷２％ホルマリンで固定し、０．１％サポニン／ＰＢＳで透過性を持たせた。この切片を、加湿チャンバー内において常温で３０分、０．１％サポニン／ＰＢＳ中の５％ヤギ血清で前ブロッキングした。ＳＬＣに対する染色は、最初に、ブロッキング緩衝液中に１／２５に希釈したビオチン化ヤギ抗ＳＬＣ抗体（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）でインキュベートして行った。２時間後にアルカリホスファターゼ結合ウサギ抗ヤギＩｇ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を加えた。免疫蛍光染色のため、加湿チャンバー内において常温で３０分、切片をＰＢＳ中の２％正常マウス血清、ウサギ血清及びヤギ血清でブロッキングした。ブロッキング溶液を、ブロッキング溶液で１／１００に希釈した５０μｌの一次抗体ＰＥ結合抗Ｔｈ１．２抗体（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）またはＰＥ結合抗ＣＤ８（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に置き換え、切片を加湿チャンバー内にて常温で１時間インキュベートした。検体は、１０％の１，４−ジアゾビシクロ［２．２．２］オクタンを含有するＭｏｗｉｏｌ ４−８８（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｅｉｅｎｃｅｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）上にのせた。Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，ドイツ）及びＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ ＰＸＬ ＣＣＤカメラ（Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，Ｔｕｃｓｏｎ，ＡＺ）を使用して、サンプルは４８時間以内に分析した。Ｏｐｅｎｌａｂ ｖ２．０．６（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して、非隣接デコンボリューションを行った。
【００４４】
（ＣＣＬ２１に対するＥＬＩＳＡ）
腫瘍ホモジェネートを調製してＣＣＬ２１についてアッセイを行った。腫瘍保持マウスから相当量の腫瘍組織を回収して秤量し、タンパク質分解酵素阻害剤を含有するＰＢＳ中でホモジェナイズして遠心分離し、その上清を回収した。ポリスチレン９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｉｍｍｕｌｏｎ ４，Ｄｙｎａｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）をＰＢＳ中の２μｍｌヤギ抗マウスＣＣＬ２１でコーティングし、次に常温で３０分間、ＰＢＳ中の０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした。洗浄後、既知濃度の標準液（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＣＣＬ２１，５０ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ）の連続希釈物とサンプルとを加え、常温で２時間インキュベートした。３回の洗浄後、ビオチン化ウサギ抗ＳＬＣ抗体をウェルに加えた。２時間インキュベーションおよび洗浄後、５０μｌの１／１０００希釈アルカリホスファターゼ結合アビジン（Ｄａｋｏ）を１時間加えて発色させた。自動プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｍａｘ ３４０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）上にて４０５ｎｍで発色を測定した。ＣＣＬ２１の量をＥＬＩＳＡによって標準曲線から判定し、組織重量に応じて正規化した。データは平均値±標準偏差である。
【００４５】
（リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイ）
リアルタイムＰＣＲを行った。Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて腫瘍から全ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で消化して染色体ＤＮＡを除去した。残存するＤＮａｓｅＩを、７５℃、２０分間で不活化し、ＲＮＡの保全性は臭化エチジウム染色ゲルによる可視化によって評価した。Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用いて、５μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。このリアルタイム定量ＰＣＲ分析はＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出システム（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。ＣＣＬ２１に対するプライマー配列は、５’−ＡＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＧＣＡ−３’（順方向プライマー）および５’−ＧＴＴＧＡＡＧＣＡＧＧＧＣＡＡＧＧＧＴ−３’（逆方向プライマー）であり、ＣＣＬ２１に対するプローブは、５’−ＣＣＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＧＧＣＣＴＣＣＧＴＣ−３’であった。ＭＡｄＣＡＭ−１に対するプライマーは、５’−ＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＧＧＧＣＡＧＴＧＴ−３’（順方向プライマー）および５’−ＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＧＴＡＣＡＧＡＧ−３’（逆方向プライマー）であり、ＭＡｄＣＡＭ−１に対するプローブは、５’−ＣＡＧＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡＴＣＣ−３’であった。ＧＡＰＤＨに対するプライマーは、５’−ＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣ−３’（順方向プライマー）および５’−ＧＧＣＡＴＧＧＡＣＴＧＴＧＧＴＣＡＴＧＡ−３’（逆方向プライマー）であり、ＧＡＰＤＨに対するプローブは、５’−ＴＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＧ−３’であった。ＣＣＬ２１ならびにＭＡｄＣＡＭ−１プローブを６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）で標識した。ＧＡＰＤＨプローブをテトラクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＴＥＴ）で標識した。各ｃＤＮＡサンプルをＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼを含むＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅ（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造者の使用説明書に従って用いて、ＣＣＬ２１およびＧＡＰＤＨまたはＭＡｄＣＡＭ−１およびＧＡＰＤＨについて二本鎖で増幅した。ＰＣＲの条件は、５０℃で２分、９５℃で１０分、９５℃で１５秒および６０℃で１分を４０サイクルであった。比較ＣＴ（増幅プロットと臨界値との間の交差する点にある臨界サイクル数）法を使用して標的遺伝子の濃度を決定し、内部ＧＡＰＤＨコントロールに対して標準化した。
【００４６】
（腫瘍組織ケモカインのマイクロアレイ）
これらの実験のため、ＧＥＡｒｒａｙ Ｑ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｏｕｓｅ Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｇｅｎｅ Ａｒｒａｙ ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用した。Ａｂｓｏｌｕｔｅ ＲＮＡ ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて腫瘍由来の全ＲＮＡを単離し、ＤＮａｓｅＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）で消化して染色体ＤＮＡを除去した。残存するＤＮａｓｅＩを、７５℃、２０分間で不活性化した。ＲＮＡの保全性は臭化エチジウム染色ゲルで可視化することによって評価した。このマイクロアレイは、製造者の使用説明書に従って使用された。簡単には、提供された試薬を使用して、ＭＭＬＶ逆転写酵素を用いた逆転写によって全ＲＮＡからｃＤＮＡを調製し、［−３２Ｐ］ｄＣＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍＭ）で放射性物質標識し、次いで正確に特定された条件下で整列されたＤＮＡを含む陽性荷電のナイロン膜とハイブリダイズした。洗浄後、このアレイをホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ）によって可視化した。ハウスキーピング遺伝子ＰＵＣ１８、アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するハイブリダイゼーションシグナルの強度に基づいて積荷を調整し、Ｉｍａｇｅ Ｑｕａｎｔソフトウエアを使用してホスホイメージャーにより記録したデジタル画像をデジタルデータに変換して後に、遺伝子発現を定量した。ＧＥＡｒｒａｙ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエアを製造者の使用説明書に従って使用して生データを解析した。
【００４７】
（Ｔ細胞共刺激アッセイ）
製造者（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）による指示どおりに磁場におけるネガティブ選択法によってＴ細胞を精製した。単離したＴ細胞の精製度は、９５％を超えており、これはＣＤ３に対するモノクローナル抗体を使用するフローサイトメトリーで評価した。０．２ｇ／ｍｌのＣＤ３に対するモノクローナル抗体でコーティングしたプレートをさらに３７℃で４時間、ＬＩＧＨＴｍ−ｆｌａｇでコーティングした。洗浄後、精製Ｔ細胞（１×１０６細胞／ｍｌ）をこのウェル内で培養した。ＣＤ２８に対するモノクローナル抗体（１μｇ／ｍｌ）を可溶化形態で使用した。全てのアッセイにおいて、３日間の培養中最後の１５時間に１Ｃｉ／ウェルの３Ｈ−チミジンを添加して、Ｔ細胞の増殖を測定した。３Ｈ−チミジンの取り込みは、ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロプレートシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｍｅｒｉｄｅｎ，ＣＴ）にて測定した。
【００４８】
（ＦＡＣＳによる細胞分析）
変異体ＬＩＧＨＴｍがＬＴｂＲおよびＨＶＥＭに結合することを確認するために、変異体ＬＩＧＨＴをトランスフェクトしたＡＧ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（ＡＧ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ）を、ＬＴｂＲ−ＩｇまたはＨＶＥＭ−Ｉｇ（０．０２ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートして洗浄し、それぞれＰＥ結合ロバ抗ヒトＩｇＧ抗体またはＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体で染色した。Ｌｄの発現分析のため、腫瘍細胞を抗Ｌｄ抗体とインキュベートして洗浄し、ＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧ抗体と共にインキュベートした。ＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞の増殖を検出するため、単離したリンパ節（ＬＮ）細胞、脾細胞、および腫瘍浸潤Ｔ細胞（ＴＩＬ）を、ビオチン化１Ｂ２抗体で染色して洗浄し、ＣｙＣ結合ストレプトアビジンおよびＰＥ結合抗ＣＤ８抗体で染色した。ＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞およびＣＤ４４の発現を分析するため、単離したＬＮ細胞、脾細胞またはＴＩＬをビオチン化１Ｂ２抗体で染色して洗浄し、ＰＥ結合ストレプトアビジンとＣｙＣ結合抗ＣＤ４４抗体との混合物で染色した。ＣＦＳＥ標識２Ｃ Ｔ細胞とＣＤ６２Ｌ発現の分析のため、単離したＬＮ細胞、脾細胞またはＴＩＬをビオチン化１Ｂ２抗体で染色して洗浄し、ＣｙＣ結合ストレプトアビジンおよびＰＥ結合抗ＣＤ６２Ｌで染色した。サンプルを、ＦＡＣＳｃａｎで分析し、データをＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウエアまたはＦｌｏｗＪｏソフトウエアを用いて分析した。
【００４９】
（２Ｃ Ｔ細胞の養子移入）
ＬＮ細胞および脾細胞を２Ｃマウスから単離し、ＣＤ８＋Ｔ細胞濃縮キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞をネガティブ選択した。分析の際、濃縮されたＣＤ８＋細胞のうちの＞９０％が２Ｃレセプターを発現していた。腫瘍増殖のアッセイのため、約３×１０６の２Ｃ Ｔ細胞をＨ−ＹマウスまたはＯＴ−１マウスに移入した。同数の２Ｃ Ｔ細胞を各実験にて各マウスに移入した。ＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を移入するため、２×１０７／ｍｌのＴ細胞を、１０μＭ ＣＦＳＥを用いてＰＢＳ溶液中３７℃、３０分間で標識した。この細胞を同量のＦＣＳ用いて１分間でクエンチして３回洗浄した。３×１０６のＣＦＳＥ標識Ｔ細胞を、０．２ｍｌ容量で腫瘍保有マウスの後眼窩叢内に静脈内注射した。指示した時間に、鼡径リンパ節（ＤＬＮ）、他のリンパ節（非流入リンパ節［ＮＤＬＮ］）、脾臓または腫瘍から細胞を単離した。
【００５０】
（細胞除去およびＬＴｂＲ−ＩｇによるＬＩＧＨＴｍ活性のインビボ遮断）
ＣＤ４＋細胞についてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＧＫ１．５（Ｄｉａｌｙｎａｓ ＤＭ ＪＩ １９８３）、ＣＤ８＋細胞についてｍＡｂ ２，３４（Ｓａｒｍｉｅｎｔｏ Ｍ １９８０ ＪＩ）を使用する標準的手順（免疫学に関する現在のプロトコール）によって、マウスのリンパ球サブセットを除去した。ＦＡＣＳによる脾細胞およびリンパ節の実験によって、除去したサブセットが、全リンパ球のうちの＜０．５％であり、他のサブセットは正常レベルであることが示された。マウス内でＬＩＧＨＴｍを遮断するため、腫瘍誘発の同日および誘発の１週間後にＬＴβＲ−Ｉｇ（１００μｇ／注射）を腹膜内で投与した。
【００５１】
（腫瘍組織からの細胞単離）
最初に腫瘍組織内の血液混入を減少させるためにマウスを飼育した。腫瘍組織を採取してＰＢＳで洗浄し、切断して小片とした。これを３７℃の振盪インキュベーターにて、２％ ＦＣＳおよび１．２５ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＤ（コラゲナーゼＤ溶液）を添加したＤＭＥＭに４０分間再懸濁した。４０分後に単細胞懸濁液を回収し、全腫瘍組織が解離して単細胞懸濁液となるまで、細胞凝集塊をさらに４０分間コラゲナーゼＤ溶液中で消化した。
【００５２】
（ＬＩＧＨＴｍおよびＬＩＧＨＴｍ発現細胞の送達）
ＬＩＧＨＴｍをコードする核酸の患者への送達は、患者が直接、核酸あるいは核酸保有ベクターに暴露される直接送達、または最初に生検から得た腫瘍細胞をインビトロでこの核酸で形質転換して放射線処理し、次いで患者へ移植する間接送達のいずれかであり得る。これらの手法は、腫瘍の抑制あるいは他の疾患の治療のための遺伝子治療にて施行されている。
【００５３】
（核酸の送達）
核酸配列をインビボに直接投与し、そこでそれらを発現させてコードされるタンパク質を産生した。これは、以下による当該分野で公知の多数の方法のいずれかによって達成され得る：例えば、この核酸塩基配列を適当な核酸発現ベクターの一部分として構築し、それらが細胞内に入るように投与すること、欠損させたもしくは弱毒化したレトロウイルスベクターあるいは他のウイルスベクター（米国特許第４，９８０，２８６号）を使用して感染させること、または裸のＤＮＡを直接注射、または微粒子照射、もしくは脂質もしくは細胞表面レセプターもしくはトランスフェクト試薬を用いたコーティング、リポソーム、微粒子もしくはマイクロカプセルによるカプセル化、の使用、または核に入ることが知られているペプチドと結合させてそれらを投与すること、またはレセプター媒介性エンドサイトーシスに関わるリガンドに結合させてそれを投与すること（これは、このレセプターを発現する細胞型を特異的に標的とするために使用され得る）など。あるいは、核酸を細胞内に導入し、発現のために相同組み換えによって宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませ得る。
【００５４】
また、核酸をカプセル化する生分解性ミクロスフェアも遺伝子送達に使用されている。マトリックス、フィルム、ゲルおよびジヒドラジドで誘導体化され、かつ徐放性ミクロスフェアを形成する核酸に架橋されたヒアルロン酸（ＨＡ）を含むハイドロゲルのようなミクロスフェアが、核酸を送達するために使用されている。米国特許第６０４８５５１号は、ポリ（ラクチド‐グリコリド）（ＰＬＧＡ）、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸セルロースアセテート、および遺伝子ベクターをカプセル化するコポリマーミクロスフェアを利用する、徐放性遺伝子送達系を開示している。
【００５５】
前記の方法を実行する際に使用される治療的組成物は、所望の送達法に適したキャリアを含有する薬学的組成物中に処方され得る。適切なキャリアとしては、治療的組成物と組み合わされたときに、この治療的組成物の抗腫瘍機能を保持する物質が挙げられる。例としては、滅菌リン酸緩衝液、静菌水のようなあらゆる多数の標準的薬学的キャリアが挙げられるが、これらに限定されない。治療的処方物は可溶化され得、治療的組成物を腫瘍部位へ送達し得る任意の経路を介して投与され得る。可能性のある有効的な投与経路としては、静脈内、非経口、腹膜内、筋肉内、腫瘍内、皮内、器官内、正所性などが挙げられるが、これらに限定されない。静脈内注射のための好ましい処方物は、保存静菌水、滅菌生鮮水の溶液中、および／または注射用滅菌塩化ナトリウムを含むポリ塩化ビニルバッグもしくはポリエチレンバッグ内で希釈された治療的組成物を含む。治療的タンパク質調製物は、好ましくは減圧下で、凍結乾燥され、滅菌粉体として保存され得、次いで注射前に静菌水（例えばベンジルアルコール保存剤が挙げられる）または滅菌水中で再構成され得る。前記方法を使用する癌治療のための投薬量および投与プロトコールは、方法および標的の癌で変化し、一般的に当該分野にて認識される多数の他の要因に依存する。
【００５６】
（ウイルスベクターを使用する送達）
本発明の抗体をコードする核酸塩基配列を含むウイルスベクターは、特定の核酸の送達するために使用される。例えば、レトロウイルスベクターが、使用され得る。このレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な構成要素を含む。遺伝子治療で使用する、所望のタンパク質をコードする核酸配列は、一つ以上のベクター内にクローン化され、これによって、遺伝子の患者への送達が容易になる。アデノウイルスは、遺伝子治療に使用され得る別のウイルスベクターである。アデノウイルスは、特に呼吸器上皮へ遺伝子を送達するのに魅力的なビヒクルであり、アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）もまた、遺伝子治療での使用が提案されている（米国特許第５，４３６，１４６号）。レンタウイルス（Ｌｅｎｔａｖｉｒｕｓ）は、遺伝子治療での使用に有望である。
【００５７】
（組織培養物中のトランスフェクト細胞、およびその後の患者への送達）
遺伝子治療の別の手法は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクトまたはウイルス感染のような方法によって組織培養物中の細胞に遺伝子の移入する工程を包含する。通常、移入の方法としては、選別可能なマーカーの細胞への移入が挙げられる。次いで、細胞は選別を受け、移入遺伝子を取り込み発現している細胞が単離される。次いで、この細胞は患者へ送達される。この方法で核酸は、得られる組み換え細胞をインビボ投与するのに先立って細胞内に導入される。そのような導入は、当該分野で公知の任意の方法（トランスフェクション、電気穿孔、マイクロインジェクション、この核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターを用いる感染、細胞融合、染色体媒介性トランスフェクト、微小核体媒介性トランスフェクト、スフェロプラストなどが挙げられるが、これらに限定されない）によって実行され得る。この技術は、細胞への安定した核酸移入を提供するはずであり、この結果、核酸は、その細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、そしてその細胞の子孫によって発現可能である。
【００５８】
生じる組み換え細胞は、放射線照射され得、当該分野で公知の種々の方法によって患者へ送達され得る。組み換え細胞（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）は、好ましくは静脈内に投与される。想定される細胞の使用量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。遺伝子治療を目的とする核酸が導入され得る細胞としては、任意の所望の入手可能な細胞型が挙げられ、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞、血液細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨大核細胞、顆粒球）、種々の幹細胞または前駆細胞、特に造血幹細胞または前駆細胞（例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
（ワクチン）
本明細書中で使用される場合、用語「ワクチン」は、腫瘍特異的免疫反応を誘発する組成物（例えば、ＬＩＧＨＴｍ抗原およびアジュバント）をいう。これらのワクチンとしては、予防的なもの（新たな腫瘍を予防する）および治療的なもの（親腫瘍を根絶する）が挙げられる。変異体ＬＩＧＨＴをコードするＤＮＡワクチンのようなワクチンベクターは、腫瘍に対する免疫応答を誘発するために使用され得る。ワクチン組成物を一部位（例えば、腫瘍から離れた部位）へ投与することによって、この応答は、患者自身の免疫系により誘発される。この免疫反応は、身体中の腫瘍細胞（例えば、原発腫瘍細胞および転移腫瘍細胞の両方）の根絶をもたらし得る。腫瘍ワクチンを作製する方法は、当該分野で周知である（例えば、米国特許第５，９９４，５２３号および同第６，２０７，１４７号（これらの各々が、本明細書中で参考として援用される）を参照する）。
【００６０】
ワクチンは、薬学的組成物中に一つ以上の腫瘍抗原を含み得る。いくつかの例では、腫瘍抗原は、投与の前に不活化される。他の実施形態では、このワクチンは、一つ以上のさらなる治療薬剤（例えば、サイトカインまたはサイトカイン発現細胞）をさらに含み得る。
【００６１】
特定の場合、例えば通常の皮膚生検から得られる、患者から選別された細胞（例えば、繊維芽細胞）は、一般に所望の一タンパク質のうちの一つを発現するよう遺伝的に改変される。あるいは、免疫系における抗原提示細胞として通常役立ち得る患者細胞（マクロファージ、単球、およびリンパ球）はまた、遺伝的に改変されて、所望の抗原のうちの一つ以上が発現され得る。次いで、この抗原発現細胞は、例えば、放射線照射した腫瘍細胞の形態、あるいは、精製天然腫瘍抗原もしくは組換え腫瘍抗原の形態の、患者の腫瘍細胞（例えば、腫瘍抗原）と混合され、例えば、皮下にて免疫化において使用されて、全身性抗腫瘍免疫が誘導される。これらのワクチンは、任意の適切な方法を使用して投与され得、これらの方法としては、上記の方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
（クローン形成アッセイ）
（肺のクローン形成アッセイ）
（材料）
１）ＤＭＥＭ ５％ ＦＣＳ（＋ｐ／ｓ、ＨＥＰＥＳ）
２）コラゲナーゼ４型（Ｓｉｇｍａ）
３）６０μＭ ６−チオグアニン
４）５０ｍｌ コニカルチューブ
５）６ウェル組織培養プレート
６）３７℃振盪インキュベーター／組織インキュベーター
７）解剖器具：ハサミ、膝状ハサミおよび鉗子
８）７０μｍナイロン細胞ストレーナー
９）ＡＣＫ溶解液
１０）メタノール
１１）０．０３％（ｗ／ｖ）メチレンブルー溶液
注意：全ての溶液および器具は滅菌でなければならず、従って無菌操作が使用されるべきである。
【００６３】
（コラゲナーゼ培地の調製）
肺一個当たり約２５ｍｌの培地にコラゲナーゼを加えて１．５ｍｇ／ｍｌ濃度の培地を作製する。
【００６４】
（肺サンプルの調製）
１．マウスから肺を取り出し、６ウェルのプレートへ移す
２．約２００μｌの培地を肺に加える
３．膝状ハサミを用いて、肺を小片に切り刻む
４．閉じたハサミの曲線部分を利用して、切り刻んだ肺を５ｍｌコラゲナーゼ培地の５０ｍｌコニカルチューブへ移す
５．ウェルへ５ｍｌの培地を加えてピペットで取り出し、残りの肺小片をコニカルチューブへ移す
６．３７℃で２０分間、１７５ｒｐｍの振盪インキュベーターに置く
７．上清を細胞ストレーナーに通してきれいな５０ｍｌコニカルチューブへそそぐ−細胞ストレーナー上の任意の肺小片は、二次消化のためにコニカルチューブへ戻す
ａ．消化物からの上清を含む試験管を、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離して遠心沈降させる
ｂ．遠心沈降後、上清を捨てる
ｃ．１ｍｌのコラゲナーゼを含まない新鮮培地に、ペレットを再懸濁する
８．５分間ＡＣＫ溶解する
９．細胞数を数える
１０．３×１０５、３×１０４、３×１０３の細胞を１２ウェルプレートにプレーティングする
１１．６０μＭの６−チオグアニンを各ウェルに加える
１２．プレートを、５％ ＣＯ２、５〜１０日間、３７℃の組織インキュベーター内に置く。
【００６５】
（クローン形成性転移コロニーの収集）
（必ずしも必要ではないが、コロニー数の計数が容易になる）
１．組織培養プレートから培養培地を捨てる
２．各プレートに５ｍｌのメタノールを加えて揺り回し、細胞を固定する。室温で５分間インキュベートする
ａ．注意：コロニーは白色に変わるはずである
３．メタノールを捨て、各プレートを５ｍｌの蒸留水穏やかにリンスする
ａ．重要な注意：細胞が固定されるまで、細胞を水と接触させない
４．各プレートに５ｍｌの０．０３％（ｗ／ｖ）メチレンブルー溶液を添加する。揺り回してプレート全体が覆われるようにし、室温で５分間インキュベートする
５．染色液を捨て、５ｍｌの蒸留水で穏やかにリンスする
６．プレートを空気乾燥させ、その後、青色のコロニーを計数する
１つのコロニーが、１つのクローン形成性転移細胞を表す。
【００６６】
（引用された刊行物）
引用された刊行物は、それらが本発明に関する範囲で参考として援用される。
【００６７】
【化１】
【００６８】
【化２】
【００６９】
【化３】
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】図１は、ＴＮＦ／ＬＴ／ＬＩＧＨＴファミリーメンバーの間の相互作用に関する現在のモデルを説明する。ＬＴβＲは膜ＬＴと膜ＬＩＧＨＴとの両方に結合する一方、ＨＶＥＭはＬＩＧＨＴに結合する。可溶性ＴＮＦ３及びＬＴα３はＴＮＦＲＩ及びＴＮＦＲＩＩに結合する。
【図２】図２は、ＬＩＧＨＴｍと抗原特異的Ｔ細胞との両方が最適な腫瘍拒絶反応に必要であることを示す。腫瘍細胞（５ｘ１０５）をＣＢ６Ｆ１に接種した。左図がＬＩＧＨＴｍでトランスフェクトした腫瘍、右図がコントロールの腫瘍である。１４日後、２Ｃ Ｔ細胞（１０ｘ１０５）をこのマウスに移植し、腫瘍の増殖をモニタリングした。腫瘍増殖曲線を示す。
【図３】図３は、Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウス並びにＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスにおけるＬＩＧＨＴ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍の増殖反応速度を示す。Ａ．ＬＩＧＨＴの細胞外ドメインからタンパク質分解部位に対応する４アミノ酸を欠失して腫瘍細胞表面上での安定した発現を確保した。Ｂ．バルクもしくはクローン化した、Ａｇ１０４Ｌｄ親腫瘍細胞、ＬＩＧＨＴｍでトランスフェクトしたＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を、ＬＴβＲヒトＩｇ、ＨＶＥＭマウスＩｇ染色し、続いてヒトＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ロバ抗体またはマウスＩｇＧに対するヤギ抗体でそれぞれ染色した（実線）。二次抗体のみで染色した腫瘍細胞を点線で示した。Ｃ．Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ親腫瘍細胞（黒ひし形）あるいはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（白ひし形）を皮下接種した。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスにおいて、Ａｇ１０４Ｌｄは累進的に増殖したが、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは拒絶された。Ｄ．Ｂ６／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（黒ひし形）あるいはＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞（白ひし形）を皮下注射することによって、誘発した。Ｂ６／ＲＡＧ−１−／−マウスでは、双方の腫瘍とも累進的に増殖した。
【図４】図４は、改変されたＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインが、精製Ｔ細胞反応を共刺激するのに十分であることを示す。Ａ．ＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメイン（アミノ酸８５〜２３９）及び、組み換えタンパク質の精製を容易にするためのフラッグ配列を含む組み換えタンパク質。Ｂ．ＣＤ３に対する抗体（抗ＣＤ３）存在下で、精製Ｔ細胞は固定されたＬＩＧＨＴｍの細胞外ドメインで刺激された。
【図５】図５は、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ腫瘍組織において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤が増加したことを示す写真説明である。５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、またはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに皮下注射した。腫瘍を接種して１０〜１４日後に腫瘍組織を回収した。腫瘍組織の凍結切片を、記載の通りＨＥ（上図）もしくは抗Ｔｈ１．２−ＰＥ（中図）、抗ＣＤ８−ＰＥ（下図）で染色した。
【図６−１】図６Ａは、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍においてＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子が増加することを説明する。（１）５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ、（２）Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、または（３）Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１もしくはＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスに皮下接種した。腫瘍誘発後１０〜１４日目に腫瘍組織を回収した。Ｂ．同量の腫瘍組織を、プロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳ中で完全に粉砕した。遠心分離の後、上清中のＳＬＣをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスおよびＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスの双方から記載のように回収したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのＳＬＣを含んでいた。Ｃ．Ａｇ１０４Ｌｄ、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、またはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ由来の腫瘍組織を１０％中性ホルマリンで固定し、切片にして抗マウスＳＬＣ、続いて二次抗体で染色した。発色（赤色）を矢印で示した。バックグラウンドはヘモトキシリンで対比染色した（青色）。Ｄ．腫瘍組織から全ＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行って接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１及びケモカインＳＬＣの発現を分析した。Ｅ．腫瘍組織から精製した全ＲＮＡを用いて、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍において示される他のケモカインの発現を分析するために、遺伝子アレイを行った。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍組織にて、ＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子の増加が認められた。相対的発現レベルを左のパネルに示した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍによる発現の増加の倍数を右のパネルに示した。全ＲＮＡを腫瘍組織から単離し、記載の通りに遺伝子アレイを実施してＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍におけるケモカインの発現を分析した。
【図６−２】図６Ａは、Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍においてＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子が増加することを説明する。（１）５Ｘ１０６のＡｇ１０４Ｌｄ、（２）Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、または（３）Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を、Ｃ３Ｂ６Ｆ１もしくはＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスに皮下接種した。腫瘍誘発後１０〜１４日目に腫瘍組織を回収した。Ｂ．同量の腫瘍組織を、プロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳ中で完全に粉砕した。遠心分離の後、上清中のＳＬＣをＥＬＩＳＡによって測定した。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスおよびＢ６／ＲＡＧ−１−／−マウスの双方から記載のように回収したＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍は、親腫瘍よりも高レベルのＳＬＣを含んでいた。Ｃ．Ａｇ１０４Ｌｄ、Ａｇ１０４Ｌｄ−Ｂ７．１、またはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ由来の腫瘍組織を１０％中性ホルマリンで固定し、切片にして抗マウスＳＬＣ、続いて二次抗体で染色した。発色（赤色）を矢印で示した。バックグラウンドはヘモトキシリンで対比染色した（青色）。Ｄ．腫瘍組織から全ＲＮＡを単離し、リアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲを行って接着分子ＭＡｄＣＡＭ−１及びケモカインＳＬＣの発現を分析した。Ｅ．腫瘍組織から精製した全ＲＮＡを用いて、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍において示される他のケモカインの発現を分析するために、遺伝子アレイを行った。ＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍組織にて、ＬＴβＲ関連性のケモカイン及び接着分子の増加が認められた。相対的発現レベルを左のパネルに示した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍによる発現の増加の倍数を右のパネルに示した。全ＲＮＡを腫瘍組織から単離し、記載の通りに遺伝子アレイを実施してＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄ及び親腫瘍におけるケモカインの発現を分析した。
【図７−１】図７は、ＬＩＧＨＴｍが媒介するＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍環境がナイーブ２Ｃ Ｔ細胞を強化し、それらを活性化し、そして腫瘍拒絶反応を引き起こすことを示す。Ａ．Ａｇ１０４Ｌｄ並びにＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは、同レベルの抗原Ｌｄを発現した。Ａｇ１０４Ｌｄ（黒実線）もしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ（灰色実線）腫瘍細胞を抗Ｌｄ、続いてマウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体による二次染色を行った。二次抗体のみで染色した腫瘍細胞を点線で示した。Ｂ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間、１３２時間、１６８時間、および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍を浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗ＣＤ−８及び２Ｃ ＴＣＲクローン型抗体１Ｂ２で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ８及び１Ｂ２二重陽性の２Ｃ Ｔ細胞の増殖を示した。Ｃ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍に浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗体１Ｂ２および活性化マーカーＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４に対する抗体で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。１Ｂ２陽性２Ｃ Ｔ細胞によって発現されたＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４を示した。Ｄ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に３Ｘ１０６の２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−宿主において、養子移入された２Ｃ Ｔ細胞はＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄの増殖を抑制することができたが、親腫瘍においてはできなかった。
【図７−２】図７は、ＬＩＧＨＴｍが媒介するＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍環境がナイーブ２Ｃ Ｔ細胞を強化し、それらを活性化し、そして腫瘍拒絶反応を引き起こすことを示す。Ａ．Ａｇ１０４Ｌｄ並びにＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍは、同レベルの抗原Ｌｄを発現した。Ａｇ１０４Ｌｄ（黒実線）もしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ（灰色実線）腫瘍細胞を抗Ｌｄ、続いてマウスＩｇＧに対するＦＩＴＣ結合ヤギ抗体による二次染色を行った。二次抗体のみで染色した腫瘍細胞を点線で示した。Ｂ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間、１３２時間、１６８時間、および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍を浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗ＣＤ−８及び２Ｃ ＴＣＲクローン型抗体１Ｂ２で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。ＣＤ８及び１Ｂ２二重陽性の２Ｃ Ｔ細胞の増殖を示した。Ｃ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に、３Ｘ１０６のＣＦＳＥ標識２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。２Ｃ Ｔ細胞移植後４８時間および３３６時間目に、記載の通り腫瘍を枯渇したリンパ節、腫瘍を枯渇していないリンパ節、脾臓、および腫瘍組織を回収した。腫瘍に浸潤するＴ細胞を陽性選択磁性カラムによって単離した。抗体１Ｂ２および活性化マーカーＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４に対する抗体で染色した後に、リンパ節、脾臓、および腫瘍由来の細胞をＦＡＣＳ分析に供した。１Ｂ２陽性２Ｃ Ｔ細胞によって発現されたＣＤ６２ＬまたはＣＤ４４を示した。Ｄ．ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−マウスに１０６のＡｇ１０４ＬｄもしくはＡｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴ腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍誘発後１０〜１４日後に３Ｘ１０６の２Ｃ ＴＣＲトランスジェニックＴ細胞をこれらのマウスに移植した。ＯＴ−１／ＲＡＧ−１−／−宿主において、養子移入された２Ｃ Ｔ細胞はＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄの増殖を抑制することができたが、親腫瘍においてはできなかった。
【図８】図８は、ＬＩＧＨＴｍ発現Ａｇ１０４Ｌｄを腫瘍内に注入すると、確立した親腫瘍が根絶することを示す。１０５のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞をＣ３Ｂ６Ｆ１マウスに接種し、次いで記載の通り、親腫瘍の誘発後１４日目に、１０６のＬＩＧＨＴｍ発現腫瘍細胞、もしくはコントロールとしてＰＢＳを腫瘍内に注射した。Ａｇ１０４Ｌｄ−ＬＩＧＨＴｍで処理したＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍は拒絶されたが、ＰＢＳで処理したものは累進的に増殖した。
【図９】図９は、ＬＩＧＨＴタンパク質をコードする核酸の塩基配列を示す。開始コドンＡＴＧは太字で示し、ＬＩＧＨＴｍにおいて欠失されているタンパク質分解部位をコードする領域には下線を引いている。
【図１０】図１０は、アデノウイルスによって変異体ＬＩＧＴＨが腫瘍組織に送達されることにより、効果的な免疫反応および腫瘍拒絶反応を可能にすることを示す。Ｃ３Ｂ６Ｆ１マウスに２Ｘ１０５のＡｇ１０４Ｌｄ腫瘍細胞を接種し、次いで親腫瘍誘発後１４日目に記載の通り、５Ｘ１０１０のＬＩＧＨＴ発現アデノウイルス（左）あるいはＬａｃＺ発現アデノウイルス（右）を腫瘍内に注射した。腫瘍の体積は式（長さＸ幅Ｘ高さ）／２によって算出した。
【図１１】図１１は、４Ｔ１腫瘍増殖の阻害、および自然転移性腫瘍の減少を示す。０日目に４Ｔ１マウスにコントロール、変異体ＬＩＧＨＴ、またはＬＩＧＨＴｍおよび抗４−１ ＢＢを接種した。７日目に、Ａｄ−ＬＧＨＴｍ（またはＤ１０ ２Ａ）はいくらかの減少を示し、１４日目及び１７日目にこの体積の減少はよりはっきりした。１９日目に腫瘍は除去された。３４日目、肺転移に関して組織を検査した。
【図１２】図１２は、図１１の処理群の、クローン原性アッセイの結果を示す。Ａｄ−変異体ＬＩＧＨＴｍで処置したマウスにおける転移は、４１ ＢＢを使用したものとしていないものについて妨げられた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍に対するＴ細胞の有効な抗腫瘍活性を誘導するための方法であって、該方法は、
（ａ）変異体ＬＩＧＨＴをコードするｃＤＮＡ分子を該腫瘍に導入する工程；
および
（ｂ）該ｃＤＮＡ分子を発現させる工程、を包含する方法。
【請求項２】
変異体ＬＩＧＨＴ発現腫瘍細胞を含む、治療ワクチン。
【請求項３】
腫瘍細胞中に変異体ＬＩＧＨＴおよび腫瘍抗原を含む、予防ワクチン。
【請求項４】
ナイーブＴ細胞を初回抗原刺激するために必要とされるケモカイン、接着分子、および同時刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作製することによって、腫瘍を破壊または拒絶するための方法であって、該方法は、
（ａ）変異体ＬＩＧＨＴをコードするｃＤＮＡ分子を該腫瘍に導入する工程；
および
（ｂ）該ｃＤＮＡ分子を発現させる工程、を包含する方法。
【請求項５】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＬＩＧＨＴタンパク質の７９〜８２位に由来する、タンパク質分解性部位ＥＫＬＩをコードしない変異体ｃＤＮＡ。
【請求項７】
ＬＩＧＨＴの８５〜２３９位およびフラッグ配列に由来するアミノ酸配列を有する、変異体ＬＩＧＨＴタンパク質。
【請求項８】
組換えタンパク質である、請求項７に記載の変異体ＬＩＧＨＴタンパク質。
【請求項９】
プロテアーゼ消化のための部位を有さない、変異体ＬＩＧＨＴタンパク質。
【請求項１０】
変異体ＬＩＧＨＴで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１１】
変異体ＬＩＧＨＴ ｃＤＮＡ分子を有する、ベクター。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
候補抗腫瘍化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）変異体ＬＩＧＨＴ発現細胞およびコントロール細胞を得る工程；
（ｂ）該候補抗腫瘍化合物を該ＬＩＧＨＴ発現細胞およびコントロール細胞に投与する工程；ならびに
（ｃ）コントロール細胞と比較して該変異体ＬＩＧＨＴ発現細胞における腫瘍細胞の減少または死滅が起こるか否かを決定する工程、を包含する方法。
【請求項１】
腫瘍に対するＴ細胞の有効な抗腫瘍活性を誘導するための方法であって、該方法は、
（ａ）変異体ＬＩＧＨＴをコードするｃＤＮＡ分子を該腫瘍に導入する工程；
および
（ｂ）該ｃＤＮＡ分子を発現させる工程、を包含する方法。
【請求項２】
変異体ＬＩＧＨＴ発現腫瘍細胞を含む、治療ワクチン。
【請求項３】
腫瘍細胞中に変異体ＬＩＧＨＴおよび腫瘍抗原を含む、予防ワクチン。
【請求項４】
ナイーブＴ細胞を初回抗原刺激するために必要とされるケモカイン、接着分子、および同時刺激分子を発現するリンパ様微小環境を作製することによって、腫瘍を破壊または拒絶するための方法であって、該方法は、
（ａ）変異体ＬＩＧＨＴをコードするｃＤＮＡ分子を該腫瘍に導入する工程；
および
（ｂ）該ｃＤＮＡ分子を発現させる工程、を包含する方法。
【請求項５】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＬＩＧＨＴタンパク質の７９〜８２位に由来する、タンパク質分解性部位ＥＫＬＩをコードしない変異体ｃＤＮＡ。
【請求項７】
ＬＩＧＨＴの８５〜２３９位およびフラッグ配列に由来するアミノ酸配列を有する、変異体ＬＩＧＨＴタンパク質。
【請求項８】
組換えタンパク質である、請求項７に記載の変異体ＬＩＧＨＴタンパク質。
【請求項９】
プロテアーゼ消化のための部位を有さない、変異体ＬＩＧＨＴタンパク質。
【請求項１０】
変異体ＬＩＧＨＴで形質転換された、宿主細胞。
【請求項１１】
変異体ＬＩＧＨＴ ｃＤＮＡ分子を有する、ベクター。
【請求項１２】
アデノウイルスベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
候補抗腫瘍化合物をスクリーニングするための方法であって、該方法は、
（ａ）変異体ＬＩＧＨＴ発現細胞およびコントロール細胞を得る工程；
（ｂ）該候補抗腫瘍化合物を該ＬＩＧＨＴ発現細胞およびコントロール細胞に投与する工程；ならびに
（ｃ）コントロール細胞と比較して該変異体ＬＩＧＨＴ発現細胞における腫瘍細胞の減少または死滅が起こるか否かを決定する工程、を包含する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６−１】
【図６−２】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公表番号】特表２００７−５１６６９４（Ｐ２００７−５１６６９４Ａ）
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５３３７３３（Ｐ２００６−５３３７３３）
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８６３１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２６２８
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０５４０３２８９）ザ ユニバーシティー オブ シカゴ (4)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年６月２８日（２００７．６．２８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１８６３１
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００２６２８
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０５４０３２８９）ザ ユニバーシティー オブ シカゴ (4)
【Ｆターム（参考）】
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