天然に葉酸塩を過剰生産する細菌
本発明は、高レベルで葉酸塩を含み、メトトレキセートに対して耐性の変異型細菌に関する。また、これらの細菌を含む食品および食品サプリメント組成物ならびに変異型細菌を単離する方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸塩の生産レベルが増大した変異型細菌を選択する方法に関する。これらの方法において、葉酸代謝拮抗薬メトトレキセート（ＭＴＸ）が、選択薬剤として使用される。変異型細菌または前記細菌の誘導体もしくは抽出物を含む食品および食品添加組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
葉酸塩類似体、および特にジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤は、それらが癌化学療法においておよびマラリア寄生虫に対する薬剤として潜在的な役割を有しているため、長年、研究のトピックとなっていた。文献に記載された最初の葉酸塩類似体の１つは、Ｌｅｄｅｒｌｅ研究室によるメトトレキセートである。この化合物は、１９４８年には既に、急性白血病の治療に使用されていた（Ｈｉｔｃｈｉｎｇｓ， Ｇ． Ｈ．， Ｊｒ．， １９８９， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５：３０３−１０）。
【０００３】
メトトレキセート（ＭＴＸ）の活性は、標的酵素であるジヒドロ葉酸還元酵素の競合阻害に基づく。この酵素は、ジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）を基質に用いて、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）を生産および再生するために必要である。メトトレキセートの特異性は、様々な種におけるジヒドロ葉酸還元酵素の小さな構造的違いによって説明することができる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１７−２４）。メトトレキセートは、メチオニン、ＤＮＡおよびＲＮＡの生合成のために細胞が十分なテトラヒドロ葉酸を生産することを妨げる。しかしながら、プリン、チミジン、グリシン、メチオニンおよびパントテン酸（何れも、それら自身の生合成のためにテトラヒドロ葉酸を必要とする代謝産物である）が存在すると、テトラヒドロ葉酸を合成しようとする細胞の要求性は低下し得る（Ｈａｒｖｅｙ， Ｒ． Ｊ．， １９７３， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １１４：３０９−２２）。にもかかわらず、何れにせよＭＴＸによって、細胞の増殖は常に妨害される。というのは、葉酸塩依存性代謝産物（ｆｏｌａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）の存在に関わらず、ＴＨＦは、タンパク質合成の開始に不可欠な化合物であるメチオニル−ｔＲＮＡｆｍｅｔの形成に必須であるからである（Ｂａｕｍｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １２９：４５７−７１）。
【０００４】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびラクトバチルス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）といった乳酸菌は、メトトレキセートおよびその他の葉酸塩類似体トリメトプリムに対する応答において、高度の多様性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を示す。Ｌ．ラクティスは、両葉酸代謝拮抗薬に対して非感受性であることが知られている（Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１：５６１−６）。多くの生物において、長期間葉酸代謝拮抗薬に曝露されると、耐性細胞種が選択されることが示されてきた。メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する、真核生物細胞株ならびに細菌の両方の耐性機構を説明するために、幾つかの根本的な機構が述べられてきた。Ｔａｍｕｒａらは、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）において、ＭＴＸ耐性をもたらす機構を研究した（１９９７， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３： ２６３９−４６）。彼らは、（ｉ）葉酸還元酵素（ＦＡＲ）活性の増大、（ｉｉ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性の増大、（ｉｉｉ）２つのグルタミル残基を含むＭＴＸの合成および細胞内維持の増大、（ｉｖ）葉酸塩の取り込みの減少を伴う、ＭＴＸの取り込みの減少；および（ｖ）葉酸塩結合能の低下を含む、幾つかの表現型の影響を発見した。培地中に存在する葉酸塩の形成は、耐性の発生の間、ＤＨＦＲおよびＦＡＲの活性および葉酸塩の移行に影響を及ぼした。
【０００５】
しかしながら、ＭＴＸへの曝露は、ＭＴＸに対する耐性が増大した細胞を選択するために使用することが可能である一方、ＭＴＸ耐性と細胞の葉酸塩レベルとの間のつながりは、先行する文献において開示されていなかった。上述のようなＭＴＸ耐性機構と対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、細菌細胞が、ＭＴＸ耐性を作り出す別の方法を有することを発見した。この機構は、高濃度の葉酸塩の生産である。この発見は、選択薬剤としてメトトレキセートを用いることによる、高濃度の葉酸塩を生産する（自然発生的）変異型細菌のスクリーニングおよび選択に利用することが可能である。そのような細菌、特に食品等級の細菌（ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、食料品における葉酸塩の強化に使用することが可能である。葉酸塩は、可溶性Ｂビタミンであり、適切な細胞増殖および機能に必要である。パン、シリアル、酪農製品等といった多くの食料品は、葉酸塩の適切な摂取を保証するために、葉酸が添加される。本発明による変異型細菌は、例えば変異型細菌を用いた発酵によって、食料品における天然の葉酸塩の強化を可能とする。
【定義】
【０００６】
本願にて使用される「乳酸菌」は、発酵の最終生成物として乳酸を生産する細菌であって、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、およびビフィドバクテリウム属といった細菌である。
【０００７】
細菌の「菌株（ｓｔｒａｉｎ）」または「単離株（ｉｓｏｌａｔｅ）」は、本願において互換的に使用され、成長または増殖しても遺伝的には変化しないまま維持される細菌を意味する。多数の同一の細菌も含まれる。
【０００８】
「変異型細菌」または「変異型細菌株または単離株」は、天然の（自発的、自然発生の）変異型細菌または誘導型変異型細菌であって、野生型ＤＮＡには存在しない、ゲノム（ＤＮＡ）における１以上の変異を含むものを意味する。「誘導型細菌」は、化学的変異剤、ＵＶまたはガンマ照射等の処理といった、人間による処理によって変異が誘導された細菌である。対照的に、「天然の」または「自発的変異体」は、人によって変異誘発されていない。本願において、変異型細菌は非ＧＭＯであり、すなわち、組換えＤＮＡ技術によって修飾されていない。
【０００９】
「野生型菌株」または「野生型単離株」とは、天然に見られるような、細菌の非変異体を意味する。
【００１０】
「葉酸塩依存性代謝産物」とは、葉酸塩の生合成または異化反応における代謝産物または前駆体であって、周囲の培地中に存在した場合に細胞のＭＴＸ感受性をマスクする（ｍａｓｋ）ことができるものを意味する。
【００１１】
「ＭＴＸの阻害的量」とは、細胞の増殖を実質的に阻害するために必要な量を意味する。一般に、真核生物細胞においては、少なくとも約１．２５ｍｇ／Ｌ増殖培地の量が、ＭＴＸ感受性細胞に対して阻害的である。
【００１２】
「全葉酸塩」とは、菌株によって生産された、細胞外の（分泌された）および細胞内の葉酸塩レベルを意味する。
【００１３】
「食品等級」微生物は、特に、ヒトまたは動物対象に摂取されたとき、有害ではないとみなされる生物である。
【００１４】
「含む」という用語は、明言された部分、段階または構成成分の存在を特定するものと解釈されるが、１以上の付加的な部分、段階または構成成分の存在を排除しない。細菌株Ｘを含む組成物は、従って、付加的な菌株、その他の構成成分等を含んでよい。
【００１５】
加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、内容が明らかに１つおよびただ１つの要素の存在を要求していない限り、１を超える要素の存在の可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、従って、普通、「少なくとも１つ」を意味する。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
組換え葉酸塩過剰生産細菌がＭＴＸに対して感受性の状態に改変されたかどうかの試験にて、阻害的量のＭＴＸ（１．２５ｍｇ／Ｌ）に約４０時間超インキュベートされた多くの野生型菌株のＬ．プランタラムはＭＴＸによって阻害されることがないが、その増殖速度はＭＴＸを欠く培地における場合と同様の速度を示すことがわかった。これらの菌株の葉酸塩レベルを分析すると、これらのコロニーの約５％が、（非変異型の）野生型菌株と比較して有意に高い葉酸塩生産を示した。全葉酸塩プールは、野生型の（平均）レベルと比較して４％から６３％高かった。この発見によって、ＭＴＸが、天然の（非ＧＭＯの）葉酸塩過剰生産細菌を効率的に選択するために使用可能であることが実証された。ＭＴＸを欠く培地において菌株を５０世代超増殖させた場合でさえ、ＭＴＸに対する耐性は維持された。このことは、この耐性が、細菌のゲノムにおける（自発的な）安定的変異に起因することを意味していた。
【００１７】
同様な効果、即ち、増大した葉酸塩生産によってＭＴＸに対する高い耐性がもたらされるという効果が、強力なプロモーターの下流で調節される完全な葉酸塩生合成遺伝子クラスターが形質転換された組換えＬ．プランタラム株において見られた。これらの組換え株は、高いレベルの葉酸塩を生産し、葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地にて増殖した場合、ＭＴＸに耐性であった。本発明の範囲を限定することなく、細胞内ジヒドロ葉酸レベルが、酵素ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の活性部位について、蓄積したＭＴＸと競合することが推測される。
【００１８】
この発見は、ＭＴＸの存在下における増殖に基づき、葉酸塩過剰生産細菌株を選択するための、迅速なスクリーニング方法の開発に応用された。この研究にて特定された葉酸塩過剰生産体は、野生型の葉酸塩生産体と比較して、葉酸塩レベルにおいて高い増大を示した。全葉酸塩レベルは、野生型のレベルの２０から６０倍に亘った。葉酸塩過剰生産体で見られる細胞内葉酸塩プールは、野生型菌株で見られるレベルと比較して１０から２０倍高かった。これらの細胞内葉酸塩レベルの増大は、ＭＴＸに対する感受性の減少（すなわち耐性）を引き起こす。これは、なぜ葉酸塩過剰生産菌株の増殖が、ＭＴＸによって有意に影響を受けないのかを説明した。野生型株におけるＭＴＸに対する感受性は、葉酸塩に関係のある全ての代謝産物が培地から取り除かれた場合にのみ観察された。
【００１９】
本発明による細菌
それゆえ、本発明の一実施態様において、野生型と比較して細胞内および／または細胞外葉酸塩の量が増大し、および、（少なくとも）１．２５ｍｇ／ｌのメトトレキセートを含み葉酸塩依存性代謝産物を欠いた培地にて増殖させたときに、少なくとも０．１ｈ−１の増殖速度（μ）を示す（即ち、ＭＴＸに「耐性」であると言われる）変異型細菌が提供される。好ましくは、これらの増殖条件の下、変異型細菌の増殖速度は、ＭＴＸを欠いた同じ培地にて増殖させた場合の野生型菌株の増殖速度と有意に異ならない（即ち、「正常な増殖」である）。最も重要なことに、変異型細菌は、野生型菌株にとって阻害的なＭＴＸ濃度において有意な増殖を示す。「阻害的な濃度」とは、野生型菌株が実質的に増殖しないＭＴＸの濃度である。例えば、図３から、１．２５、１．５、２．０および２．５ｍｇ／ｌのＭＴＸの濃度において、野生型がゼロに近い増殖速度を示し（μ＜０．０５ｈ−１）、一方、葉酸塩過剰生産菌株は、約０．１ｈ−１の増殖速度（μ）、特に約０．１５ｈ−１付近の増殖速度を示すことがわかる。増殖培地に、葉酸塩依存性代謝産物を添加すべきではない。というのは、それらが存在すると、ＭＴＸ耐性において有意な差をみることができず、それはおそらく、野生型菌株が、培地の葉酸塩代謝産物を用いて、より低い葉酸塩レベルを補うためである。適した増殖培地は、例えば、グリシン、イノシン、オロト酸、チミジン、グアニン、アデニン、ウラシルおよびキサンチンを欠く、改変型ＣＤＭ（化学的確定培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ））である。
【００２０】
増殖速度は、様々な手段によって測定することができる。例えば、細菌株または単離株を培地に播種した後の特定の時点において、分光光度的な測定値を取得することができ、ある期間にわたって増殖速度を算出することができる。
【００２１】
変異型細菌は、好ましくは、野生型菌株と比較して、増大した量の細胞内および／または細胞外葉酸塩を含む。好ましくは、全葉酸塩の量は、野生型菌株の細胞内葉酸塩の平均量よりも、少なくとも約４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、より高い割合、より好ましくは、少なくとも約６０％、６３％（またはより高い％）高い。ある細菌種では、その野生型菌株が細胞内葉酸塩レベルの有意な変動を示すため、多数の異なる野生型菌株（例えば、２、３、４、またはそれを越える菌株）について細胞内葉酸塩レベルを分析し、平均葉酸塩レベルを算出することが好ましい。
【００２２】
細菌の単離株または菌株によって生産される、全、細胞内または細胞外葉酸塩の量は、例えば、Ｓｙｂｅｓｍａによって記述されるＬ．カセイ微生物学的アッセイ（Ｌ． ｃａｓｅｉ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ）（実施例１．３参照）またはその変形方法といった当該分野において既知の方法によって、ＨＰＬＣ分析またはその他の既知の方法によって、測定および定量することが可能である。微生物学的試験は、例えば、試験菌株によって生産される葉酸塩中で増殖する指標菌株（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ）（例えば、Ｌ．カセイ菌株）を使用してよい。大量の葉酸塩が試験菌株によって生産されると、指標菌株はよく増殖し、特定の増殖期間の後のＯＤ測定値が高くなる。対照的に、試験菌株によって生産される葉酸塩の量が低い場合、より低いＯＤ測定値が測定されるだろう。
【００２３】
変異型細菌は、好ましくは、例えば本発明による方法（さらに以下の記載を参照）を用いて選択された自発的（天然の）変異株である。細菌は、野生型菌株がＭＴＸに対して天然で感受性を示す何れの種であってもよく、例えば、Ｌ．プランタラム、Ｌ．カセイ、または乳酸菌の群におけるその他の種である。ＭＴＸに対して感受性があるということは、菌株を葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地中で増殖させたときに、細菌の増殖が、少なくとも１．２５ｍｇ／ＬのＭＴＸによって実質的に阻害されるということを意味する。細菌種がＭＴＸに感受性を示すかどうかは、ＭＴＸが添加され及び葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地で細菌を増殖させることで容易に試験することができる。細菌は、好ましくは食品等級の細菌であり、一実施態様において、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属およびストレプトコッカス属から成る群から選択される属に属する。
【００２４】
好ましくは、それは、食品等級の乳酸菌である。それは、ラクトバチルス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．アシドフィラス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．クリスパタス（ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．ガッセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ジョンソニー（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．カセイ、Ｌ．プランタラム、Ｌ．パラカセイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ）、Ｌ．ジェンセニー（ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．サリバリアス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．ミヌティス（ｍｉｎｕｔｉｓ）、Ｌ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｌ．アミロボラス（ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィリス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌｃ．ラクティス、ペディオコッカス・ダムノサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ）、Ｐ．アシディラクティシ（ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、Ｐ．パルバラス（ｐａｒｖｕｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ブレベ（ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．アドレッセンテ（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｅ）、Ｂ．アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．マグナム（ｍａｇｎｕｍ）、およびＢ．サーモフィラム（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）から成る群から選択される種であってよい。
【００２５】
代わりとなる実施態様において、変異型細菌は、葉酸塩が増大し、ＭＴＸに耐性である誘導型変異体であってよい。そのような変異体は、スクリーニング法の前に突然変異誘発の工程を含めるということ以外は、天然の変異体の選択に用いたものと同じ方法（本願の下部に記載）を用いて取得してよい。当然変異誘発の工程は、化学物質および／または物理的変異原への曝露（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；ＵＶ照射、ガンマ照射等）といった、１以上の既知の突然変異誘発法を含んでよい。突然変異誘発の後に、細菌を阻害的量のＭＴＸを含む培地中／上で増殖させ、増殖する単離株を選択し、および葉酸塩含有量を分析する。
【００２６】
さらに別の実施態様において、本発明による変異型細菌は、それらの遺伝子発現パターンによって特徴付けることが可能である。このことは、野生型と比較して少なくとも５０％の葉酸塩を更に生産するメトトレキセート耐性Ｌ．プランタラム株が、ゲノム中の１以上のｆｏｌＣ遺伝子を２倍（またはそれより高く）過剰発現するという知見によって例証される。ｆｏｌＣ遺伝子は、ジヒドロ葉酸合成酵素をコードする。一実施態様において、本発明による細菌は、葉酸塩生合成経路の酵素をコードする１以上の遺伝子において、野生型と比較して過剰発現を示す。葉酸塩生合成に直接関与する遺伝子に加えて、以下の遺伝子もまた、高い転写レベルを示した：ＦＫ（フルクトキナーゼをコードする）、ＰＯＸ（ピルビン酸オキシダーゼ）、ＬＯＸ（乳酸オキシダーゼ）およびＰＤＨ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ）。野生型と比較して、ＤＡＫ（ジヒドロキシアセトンリン酸転移酵素またはグリセロンキナーゼ）では、有意に低い転写物レベルが見られた。従って、本発明の一実施態様において、本発明による細菌は、ジヒドロ葉酸合成酵素（ＥＣ ６．３．２．１７）、フルクトキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．３）、６−ホスホ−β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．８６）をコードする群の１以上の遺伝子において、有意に増強したｍＲＮＡ転写物レベルを含む。加えて又はあるいは、細菌は、ジヒドロキシアセトンリン酸転移酵素（＝グリセロンキナーゼ）（ＥＣ． ２．７．１．２９）をコードする遺伝子において、有意に低下したｍＲＮＡ転写物レベルを含む。
【００２７】
「アプレギュレートされる」または「ダウンレギュレートされる」という用語は、野生型菌株の遺伝子と比較して、ｍＲＮＡ転写レベルの増大またはｍＲＮＡ転写レベルの減少を意味する。
【００２８】
「有意に増強した転写物レベル」または「有意に増強した転写レベル」とは、野生型において見られる転写物レベルと比較して、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、またはさらに約４倍もしくはそれより高い量のｍＲＮＡ転写物を意味する。同様に、「有意に低下した転写物レベル」または「転写レベル」とは、野生型において見られるよりも、少なくとも約２倍、３倍等少ない量のｍＲＮＡ転写物を意味する。
【００２９】
１以上の遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルは、日常的な分子生物学的方法を用いて、例えば、ノーザン分析および定量的逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲによって、測定しおよび定量することが可能である。これらの遺伝子のＤＮＡ／ｃＤＮＡ配列情報が利用可能であるので、標的ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリダイズするのに適したプライマーおよびプローブが利用可能であり、転写物レベルの分析には日常的な実験しか必要としない。例えば、Ｌ．プランタラム（そのゲノムは配列決定されている）の核酸配列は、その他の種の細菌由来のオルソロガスな（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕ）遺伝子を同定し（例えばシリコ（ｓｉｌｉｃｏ）分析によって）、クローン化し（例えば、ＰＣＲを基礎とした方法、ハイブリダイゼーションを基礎とした方法等を用いて）、および／または配列決定するために使用してよい。これらの遺伝子の核酸配列またはその部分は、次に、標的遺伝子の検出および定量のためのプライマーまたはプローブを作製するために使用してよい。
【００３０】
任意に、転写パターン（すなわち、上述した１以上の遺伝子の転写物レベルの増強または低下）は、選択基準として使用してよい。例えば、細菌は、まず第１のスクリーニングにおいて発現レベルの変化についてスクリーニングされ、続いてメトトレキセート耐性および／または葉酸塩レベルが分析される（下記に記載）。同様に、それは、下記の方法において、付加的なスクリーニング／選択工程として使用してよい（例えば、工程（ｂ）および（ｃ）の間にもしくは工程（ｄ）の後に入れてよく、またはそれは、工程（ａ）および（ｂ）と取替えてもよい）。
【００３１】
本願に記載されるメトトレキセート耐性菌株（ラクトバチルス・プランタラムＮＩＺＯ Ｂ２５５０）の１つの転写プロファイルは、親菌株のそれと比較されている（ラクトバチルス・プランタラム ＷＣＦＳ１（Ｌ．プランタラム ＷＣＦＳ１の全配列は、アクセス番号ＡＬ９３５２６３の下、ＥＭＢＬデータベースに預けられている））。これは、ラクトバチルス・プランタラム ＷＣＦＳ１の全ゲノムＤＮＡマイクロアレイを用いて行われた。親菌株およびメトトレキセート耐性変異体の全ｍＲＮＡサンプルが単離され、続いて、逆転写酵素で処理をして、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成された。親菌株および変異体のサンプルは、互いに異なるように標識した。続いて、標識ｃＤＮＡサンプルの混合物をＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズさせて、Ｌ．プランタラムの親菌株に対する、変異体の全遺伝子のｍＲＮＡの相対的な存在量を決定した。
【００３２】
一実施態様において、変異菌株は、ブダペスト条約の下、ＮＩＺＯ食品研究所（Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ ２０， ６７１０ ＢＡ Ｅｄｅ、オランダ）によって、ＣＢＳ １１７１２０という受託番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）にて、ＣＢＳ (カビ培養中央局（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）, ウプサララーン（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ） ８， ３５８４ ＣＴユトレヒト、オランダ)に預けられている細菌株（またはその何れかの誘導体）である。
【００３３】
本発明による組成物
本発明の更なる側面は、本願にて上述したような変異型細菌またはその誘導体または抽出物を含む組成物に関し、ならびにそのような組成物を製造する方法に関する。本発明による細菌は適切な条件の下培養され、任意に培養培地から回収され、任意に意図される使用に適した組成物に処方される。そのような組成物の製造方法は、それ自体、既知である。
【００３４】
好ましくは、変異型細菌、その誘導体または抽出物は、天然の葉酸塩を含む食品または食品サプリメント組成物を作製するために使用される。
【００３５】
本発明による好ましい組成物は、被験対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）によって、好ましくはヒトまたは動物によって消費されるのに適している。そのような組成物は、食品サプリメントまたは全食品（ｗｈｏｌｅ ｆｏｏｄ）または食品組成物の形態であってよく、それらは、本発明による細菌に加えて、適した食品ベース（ｆｏｏｄ ｂａｓｅ）を含む。食品または食品組成物は、ここにおいて、固体および半固体組成物のみでなく、ヒトまたは動物による消費のための液体、即ち飲み物（ｄｒｉｎｋ）または飲料（ｂｅｖｅｒａｇｅ）をも含むと理解される。食品または食品組成物は、固体、半固体および／または液体の食品または食品組成物であってよく、特に、ヨーグルト、ヨーグルトベースの飲料またはバターミルクを含むがこれらに限定されない、発酵酪農食品といった、酪農食品を含んでよい。そのような食品または食品組成物は、それ自体既知の様式によって製造してよく、例えば、適切な食品または食品ベースに、適した量で、本発明による１以上の変異型細菌を添加することによって製造してよい。
【００３６】
また、適した量の１以上の変異型細菌株またはそれ由来の抽出物（例えば、部分的にまたは実質的に精製した天然葉酸塩）を含む、食品サプリメントを作製することが可能である。食品サプリメントは、例えば、葉酸塩を含む様々なビタミンの推奨される１日量を含む、ビタミン錠剤、ピル、カプセルまたは粉剤を含む。普通そのような調合品（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）にて使用される合成葉酸は、本発明による天然葉酸塩に置き換えてよい。
【００３７】
さらに好ましい実施態様において、生きた細菌は、例えば発酵によって、食品または食品組成物の製造において、またはそれらの製造のために使用してよい。その際、本発明による細菌は、そのような発酵食品または食品組成物の製造のための、それ自体既知の様式にて使用してよく、例えば、乳酸菌を用いた発酵酪農製品の製造のためのそれ自体既知の様式にて使用してよい。そのような方法において、本発明による細菌細胞は、通常使用される微生物に加えて使用してよく、および／または、通常使用される１以上のまたは一部の微生物と置き換えてよい。例えば、ヨーグルトまたはヨーグルトベースの飲料といった発酵酪農製品の製造において、本発明による食品等級の変異型細菌は、開始培養液（ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）に添加してよくもしくはその一部として使用してよく、または、そのような発酵の間に適切に添加してよい。この場合の細菌の「増殖培地」は、ミルクベースのものといった、食品等級の培地である。
【００３８】
更なる実施態様において、使用される細菌は、死亡している（例えば、溶解している）もしくは非生存可能（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）であってよく、または凍結乾燥されていてよい。
【００３９】
本発明による１以上の変異型細菌株を用いて製造される組成物、または適した量の１以上の菌株が追加された組成物は、増強された量の、細菌によって生産される天然の葉酸塩を含む。葉酸塩を高度に過剰生産する１以上の菌株を混合してよく、またはそれらを経時的に組成物に添加してよくもしくはその製造の間に添加してよい。最終生成物中に存在する葉酸塩の全量は、例えばＨＰＬＣ分析を用いて分析することができる。
【００４０】
本発明による方法および使用
メトトレキセートは、細胞内葉酸塩レベルおよび全葉酸塩レベルが増大した細菌の選択のために使用される。
【００４１】
一実施態様において、細胞内葉酸塩レベルおよび／または全葉酸塩レベルが増大した細菌の選択の方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）細菌を、メトトレキセートを含む培地上（またはその中）で増殖させる、ここにおいて、前記培地は、葉酸塩依存性代謝産物が追加されていない、
（ｂ）増殖速度（μ）が少なくとも１時間当り０．１である細菌を選択する、
（ｃ）工程ｂで選択した細菌の葉酸塩レベルを測定する、
（ｄ）野生型またはその他の適した対照と比較して葉酸塩レベルが増大した細菌を選択する、
（ｅ）任意に、工程（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）を繰り返す。
【００４２】
工程（ａ）における「増殖」は、細菌をそのような培地と接触させることも含んでよい。培地は、様々な濃度のＭＴＸを含んでよい。例えば、最初の回の選択は、相対的に低い濃度、例えば、１．２５、１．５、２．０、２．５ｍｇ／ｌの培地にて行ってよい。１以上のこれらの濃度で増殖する単離株は、次に、葉酸塩濃度で直接スクリーニングしてよく、または、例えばより高いＭＴＸ濃度、例えば４、５、１０ｍｇ／ｌまたはそれより高い濃度による、１回以上のＭＴＸ選択に更に供してよい。選択過程の厳密性は、例えば高濃度で高い増殖性を示す単離株には、より高い厳密性を選択し、相対的に低いＭＴＸ濃度で中程度の増殖を示す単離株にはより低い厳密性を選択することにより、変化させることが可能である。好ましくは、それぞれのＭＴＸ選択工程において、単離株は、少なくとも４０時間、より好ましくは少なくとも５０時間またはそれより長い時間、培地上またはその中で増殖する。適した対照、例えば野生型単離株を常に含めるべきである。というのは、変異体は、変異体と対照（例えば、野生型）との間の増殖の差に基づいて選択されるためである。対照は、必ずしも野生型であるべきでなく、以前に選択された菌株とすることも可能である。最適なインキュベート温度、培地のｐＨ、およびその他のパラメーターは、当業者が容易に決定することが可能である。正確な条件は、使用する細菌種に依存する。
【００４３】
好ましくは、方法は、大量の単離株が、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート等にて、同時にスクリーニングできるように設定される。
【００４４】
方法は、メトトレキセートに天然の感受性を示す全ての細菌に適用することが可能である。葉酸塩類似体メトトレキセートを用いて、上述したように葉酸塩濃度が増大した発酵食品製品の製造に使用することが可能な、天然に葉酸塩を過剰生産する細菌を、効率的に選択および単離することが可能である。
【００４５】
方法によって得ることが可能であり、有意に葉酸塩レベルが増大した何れかの細菌が、本願に含まれる。
【００４６】
特に記載がない限り、本発明の実践は、分子生物学、ウイルス学、微生物学または生化学の標準的な従来の方法を利用するだろう。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる、「分子クローニング、研究室マニュアル（第２版）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ））」（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによる、「分子クローニング：研究室マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（２００１）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）；Ａｕｓｕｂｅｌらによる、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９４）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＵＳＡ）の１巻および２巻；Ｂｒｏｗｎによる「分子生物学ＬａｂＦａｘ第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（１９９８）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （ＵＫ））；Ｎ． Ｇａｉｔ編集、「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編集、「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」に記載されており、これらの文献は全て、本願に援用される。
【実施例】
【００４７】
１．材料および方法
１．１ 菌株および培養条件
野生型Ｌ．プランタラム ＷＣＦＳ１菌株およびその誘導体を、１９ｇ／Ｌ β−ホスホグリセリン酸（６）を含む化学的確定培地（ＣＤＭ）、または改変型ＣＤＭ上で、３７℃で増殖させた。この改変型ＣＤＭは、グリシン、イノシン、オロチン酸、チミジン、グアニン、アデニン、ウラシルおよびキサンチンが、通常のＣＤＭから除かれたものであった。さらに、８ｎｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを、使用する全ての培地に添加した。メトトレキセート（Ｓｉｇｍａ、アミノプテリン）を、０から１０ｍｇ／ｌの範囲の濃度で、両種のＣＤＭに添加した。
【００４８】
１．２ ＤＮＡ技術、プラスミドの構築および形質転換
この研究で使用したプラスミドを表１に挙げる。
【表１】
【００４９】
ベクターｐＮＺ８１４８は、ナイシン誘導性プロモーター（ｎｉｓｉｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、マルチプル・クローニング・サイト、およびクロラムフェニコール耐性マーカーを含む空ベクターである。ｐＮＺ８１４８誘導体およびＬ．プランタラムのゲノムＤＮＡを、確立された方法を用いて単離した。以下のサイクルによって、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ、ドイツ）にてＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、イギリス）をもちいてＰＣＲを行った：１０００ｂｐｓ当り、９４℃３０秒の変性（最初のサイクルは３分）、４５℃２５秒のアニーリング、および６８℃１分の伸長で、全３０サイクル。
【００５０】
ベクターｐＮＺ８１４８を、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩを用いて消化し、それによってナイシンプロモーターを切除した。並行した実験において、Ｌ．ラクティスの恒常的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）なプロモーターｐｅｐＮ（Ｖａｎ Ａｌｅｎ−Ｂｏｅｒｒｉｇｔｅｒらによる、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５７：２５５５−６１）を、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩを用いてベクターｐＮＺ７０１７から消化した。その後、両断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて連結し、出来るプラスミドを、ベクターｐＮＺ７０２０と名付けた。Ｌ．プランタラムの葉酸塩遺伝子クラスターを、以下のプライマーを用いて、染色体ＤＮＡから増幅した：（ｉ）ｆｏｌＢＫｐｎ−Ｆ （５’−ＧＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＴＴＣ−３’）、（これは、ＫｐｎＩ制限部位によって５’が伸長しており、それによってｆｏｌＢ遺伝子の開始コドンにオーバーラップする）、および（ｉｉ）リバースプライマーＬｐｆＰｘｂａ−Ｒ（５’−ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＡＴＣＧ−３’）（これは、ＸｂａＩ制限部位をつくるために５’末端が伸長しており、ｆｏｌＣの停止コドンとベクターとの間の融合を可能にする）。増幅したＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、ｆｏｌＢ−ｆｏｌＰ遺伝子クラスターの切断されたものを得た（ｆｏｌＰはＸｂａＩ制限部位を含む）。ベクターｐＮＺ７０２０もまた、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、その後、両断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、得られたベクターをｐＺＮ７０２０ａと名付けた。ｆｏｌＰ遺伝子の失っている部分は、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：ｌｐｆＰ−Ｆ （５’−ＣＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＧ−３’）およびｌｐｆＰｘｂａ−Ｒプライマー（５’−ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＡＴＣＧ−３’）。増幅したＤＮＡをＸｂａＩで消化した。次に、ベクターｐＺＮ７０２０ａをＸｂａＩで消化し、続いて、アルカリホスファターゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてリン酸化し、自己連結を予防した。ＸｂａＩ消化したＤＮＡの断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、挿入した断片の向きを、ＰＣＲを用いて確認した。出来たベクターをｐＮＺ７０２１と名付けた。表１に挙げられる３つのベクターを、その後、ｙｌｇＧバックグラウンドにて、Ｌ．ラクティスＮＺ９０００のコンピテントセルに移した。続いて、３つのベクターのミディプレップ（ｍｉｄｉｐｒｅｐ）を、確立された方法を用いてＬ．プランタラムに形質転換した。
【００５１】
１．３ 微生物学的アッセイを用いた葉酸塩の定量
３つの遺伝的に操作を行ったＬ．プランタラム株の葉酸塩レベルを、以前に記載されるようなラクトバチルス・カセイ微生物学的アッセイ（Ｓｙｂｅｓｍａら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００３）６９：３０６９−７６．）を用いて分析した。
【００５２】
１．４ 菌株の増殖のモニタリング
異なるベクターを有する３つのＬ．プランタラム株の増殖速度の測定を、マイクロタイタープレートを用いて行った。３つの株の増殖を、分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標登録）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーヴェール、カリフォルニア、アメリカ）を用いて、３５時間、９６ウェルマイクロタイタープレートにてモニターした。増殖は、２種類の培地にて試験し、およびそれぞれの構築物を、以下のＭＴＸ濃度で両培地にて、三重で分析した：０、０．３１２５、０．６２５、１．２５および２．５ｍｇ／Ｌ。
【００５３】
１．５ 天然の葉酸塩過剰生産体の選択
ｐＮＺ８１４８を含む野生型Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１を、２．５ｍｇ／Ｌ ＭＴＸを含む改変型ＣＤＭにて再び培養したが、この増殖培地は、マイクロタイタープレートの９６ウェルに分割した。このマイクロタイタープレートを３日間インキュベートし、その後、それぞれの９６ウェルからの一定分量を、今回は１０ｍｇ／Ｌ ＭＴＸの入った改変型ＣＤＭを含む、２つの新鮮な９６ウェルマイクロタイタープレートに分配した。それぞれの工程を通して、オリジナルのマイクロタイタープレートは、６０％グリセロールと混合し、−８０℃の冷凍庫で保存した。グリセロール保存したマイクロタイタープレートは、新鮮な改変型ＣＤＭ培地上にて、変異させたまたは順応させた（ａｄａｐｔｅｄ）細胞に播種するために使用した。これらの２８８ＭＴＸ耐性培養液の葉酸塩レベルは、迅速なスクリーニング法を用いて確認した。この方法は、以前に記述された通常の微生物学的アッセイに基づくが、幾つかの変更点が採用されている。この迅速なスクリーニング法において、野生型によって生産された葉酸塩が、変異菌株によって生産された葉酸塩と比較される。野生型によって生産された葉酸塩における指標菌株の培養は、相対的に低い光学的密度をもたらす。葉酸塩過剰生産体における、指標菌株の光学的密度は、野生型のそれより高くなるだろう。指標菌株において光学的密度を上昇させる菌株は、拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）Ｌｂ．カセイ微生物学的アッセイによって再分析した。
【００５４】
２．結果
２．１ 組換え菌株
ｐＮＺ８１４８および２つの遺伝的構築物ｐＮＺ７０１９およびｐＮＺ７０２１を保持するＬ．プランタラム野生型の葉酸塩生産レベルを、通常のＣＤＭ培地にて研究した。空ベクターｐＮＺ８１４８を含むＬ．プランタラムＷＣＦＳ１株の葉酸塩生産は、１００ｎｇ葉酸塩／ｍｌ培養液とわかった（図１）。ｐＮＺ７０１９（Ｌ．ラクティスの葉酸塩生合成遺伝子クラスター）を保持するＬ．プランタラムは、培養液中において２０００ｎｇ／ｍｌを超える葉酸塩を生産する（図１）。これは、野生型と比較して、約２０倍の過剰生産に相当する。Ｌ．プランタラムの葉酸塩生合成遺伝子クラスターを保持する、ベクターｐＮＺ７０２１の、Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１への形質転換によって、６０００ｎｇ／ｍｌ培養液の葉酸塩レベルを生産する菌株をもたらす（図１）。
【００５５】
次に、２つの葉酸塩過剰生産菌株および野生型菌株の特異的な増殖速度を、ある濃度範囲におけるメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下、葉酸塩依存性代謝産物が入ったＣＤＭと入らないＣＤＭで比較した（図２）。葉酸塩依存性代謝産物が存在すると、試験した菌株の何れも、ＭＴＸによって有意に阻害されなかった（図２ａ）。プラスミドｐＮＺ７０２１を保持するＬ．プランタラムの増殖速度は、試験した全てのＭＴＸ濃度において、その他の２つの菌株と比較して低い。葉酸塩依存性代謝産物を含む培地では、完全に異なるグラフとなっている。この培地では、葉酸塩過剰生産体は、野生型菌株と比較して、明らかにＭＴＸに対して耐性が強い（図２ｂ）。２．５ｍｇ／Ｌの濃度のＭＴＸでは、野生型菌株の完全な増殖阻害が改変型ＣＤＭにおいて見られ、一方で葉酸塩過剰生産菌株の両方は、この培地において良好に増殖した。０から２．５ｍｇ／Ｌの間のＭＴＸでは、濃度依存的な増殖阻害が、野生型Ｌ．プランタナム菌株において観察された。これらの結果は、適切な増殖培地で解析すると、葉酸塩の過剰生産はＭＴＸ耐性をもたらす、ということを示している。それゆえ、ＭＴＸは、野生型菌株から、葉酸塩過剰生産菌株を区別するために使用することが可能である。
【００５６】
２．２ 野生型菌株
２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを追加した改変型ＣＤＭにおける、野生型Ｌ．プランタラム ＷＣＦＳ１の長期間のインキュベーション（＞４０時間）は、カルチャーの有意な増殖をもたらす。このカルチャーを、２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸが追加された新鮮な改変型ＣＤＭに希釈すると、カルチャーの急速な増殖が観察された。このカルチャーから単一のコロニーを単離し、ＭＴＸ耐性が増大した天然変異体が選択されたか、またはある種の一時的な順応が起こったのかを試験した。２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを含む改変型ＣＤＭに、ＭＴＸ耐性培養菌由来の単一コロニーを播種した。次に、増殖培地を２つのカルチャーに分けた；その１つは、２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを含む改変型ＣＤＭで５０世代増殖させ、もう一方のカルチャーは、ＭＴＸを含まない同じ培地にて５０世代増殖させた。５０世代の増殖の後、両カルチャーを、再び２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを含む改変型ＣＤＭに移した。異なる経緯をたどった両株は、この培地において同等の増殖速度を示した。このことは、安定した変異がＭＴＸ耐性の表現型をもたらしていることを示している。
【００５７】
我々は、２．５ｍｇ／Ｌおよび１０ｍｇ／ＬのＭＴＸを含むカルチャーから２８８のコロニーを単離した。
【００５８】
これらのコロニーを、迅速なプレスクリーニング法を用いて、葉酸塩の過剰生産について分析した。この迅速なスクリーニングに基づいて、２８８コロニーの内５つが、野生型と比較して高い葉酸塩レベルのカルチャーを示した。これらの５つのカルチャーを、続いて、２．５ｍｇ／ＬのＭＴＸが追加された改変型ＣＤＭにプレーティングした。それぞれのプレートから、３つの単一コロニーを単離し、保存し、および再び以下の方法において葉酸塩生産を分析した。１５の陽性コロニー由来のカルチャーにおける葉酸塩レベルをモニターした（図３）。平均葉酸塩レベルは、野生型と比較して２０％から６０％高い。全てのコロニーが、まだなおＬ．プランタラムであることを確認するために、我々はＲＡＰＤ分析を行った。試験した全てのコロニーが、親菌株との高い類似性を示した。
【００５９】
２．３． 転写プロファイリング
ゲノムワイドな転写プロファイリングのためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術を用いて、我々は、メトトレキセート耐性変異体Ｌ．プランタラムＮＩＺＯ Ｂ２５５０（Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１由来）にて、野生型と比較して特異的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子を同定した。Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１およびＮＩＺＯ Ｂ２５５０のカルチャーを改変型ＣＤＭにて増殖させ、濁度（ＯＤ６００）が１のときに細胞を回収し、ｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡサンプルを、ＤＮＡマイクロアレイの分析のために処理した。特異的なｍＲＮＡの相対的な存在量を、メトトレキセート耐性菌株における遺伝子と親菌株における相当する遺伝子とを比較し、その発現が何倍変化したか（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）で表した。トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）プロファイルの分析により、親菌株との比較において、ジヒドロ葉酸合成酵素をコードする遺伝子ｆｏｌＣ１は、野生型と比較してメトトレキセート耐性変異体では特異的に４倍アップレギュレートされている（表２参照）。この酵素は、Ｌ−グルタミンとジヒドロプロテロイン酸塩とからジヒドロ葉酸を作る酵素であり、このジヒドロ葉酸は、メトトレキセートの構造的類似体であり、ジヒドロ葉酸還元酵素の基質となる。ｆｏｌＣ１の過剰発現によってジヒドロ葉酸合成酵素が増えると、細胞内のジヒドロ葉酸のプールが増大することが予想され、その結果、これらが、ジヒドロ葉酸還元酵素による転換において、メトトレキセートと競合することができる。この発見は、単離された変異体におけるメトトレキセート耐性の機構を明らかにしている。これはまた、何故これらの変異体が、メトトレキセートの非存在下に葉酸塩を高いレベルで生産するかを説明する。
【００６０】
Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１は、２つのｆｏｌＣ１遺伝子（ｆｏｌＣ１およびｆｏｌＣ２）を有している。興味深いことに、ｆｏｌＣ１のみが、メトトレキセート耐性変異体においてアップレギュレートされる。この遺伝子は機能的なクラスターに位置しておらず、葉酸塩生合成クラスターに位置するｆｏｌＣ２と対照的である。
【００６１】
ｆｏｌＣ１に加えて、多くのその他の代謝性の遺伝子（フルクトキナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼおよび６−ホスホ−ベータ−グルコシダーゼをコードする遺伝子）が、メトトレキセート耐性菌株においてアップレギュレートされることがわかった（表２参照）。グリセロンキナーゼ（ジヒドロキシアセトンホスホトランスフェラーゼ）をコードする３つの遺伝子（ｄａｋ１Ａ、ｄａｋ１Ｂおよびｄａｋ２）は、親菌株と比較して、変異体ではダウンレギュレートされることがわかった。
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＣＤＭ上での培養における、Ｌ．プランタラム野生型菌株（１）およびｐＮＺ７０１９を有するＬ．プランタラム株（２）およびｐＮＺ７０２１を有するＬ．プランタラム株（３）の葉酸塩生産。説明文：細胞外葉酸塩レベル；（白色のバー）、細胞内葉酸塩レベル；（灰色のバー）、全葉酸塩レベル；（黒色のバー）。
【図２ａ】野生型Ｌ．プランタラム株（１）、ベクターｐＮＺ７０１９を有するＬ．プランタラム株（２）、およびベクターｐＮＺ７０２１を有するＬ．プランタラム株（３）の増殖速度。３つのＬ．プランタラム株の増殖能力を、メトトレキセートを０、０．３１２５、０．６２５、１．２５および２．５ｍｇ／Ｌ（ＭＴＸ）に増大する濃度で含むＣＤＭ上にて（ａ）および改変したＣＤＭ上にて（ｂ）試験した。
【図２ｂ】野生型Ｌ．プランタラム株（１）、ベクターｐＮＺ７０１９を有するＬ．プランタラム株（２）、およびベクターｐＮＺ７０２１を有するＬ．プランタラム株（３）の増殖速度。３つのＬ．プランタラム株の増殖能力を、メトトレキセートを０、０．３１２５、０．６２５、１．２５および２．５ｍｇ／Ｌ（ＭＴＸ）に増大する濃度で含むＣＤＭ上にて（ａ）および改変したＣＤＭ上にて（ｂ）試験した。
【図３】ＭＴＸ耐性に基づいて選択される、１５の葉酸塩過剰生産菌株の葉酸塩生産レベル。１５菌株の葉酸塩生産が、野生型の葉酸塩生産と比較される。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、葉酸塩の生産レベルが増大した変異型細菌を選択する方法に関する。これらの方法において、葉酸代謝拮抗薬メトトレキセート（ＭＴＸ）が、選択薬剤として使用される。変異型細菌または前記細菌の誘導体もしくは抽出物を含む食品および食品添加組成物も提供される。
【背景技術】
【０００２】
葉酸塩類似体、および特にジヒドロ葉酸還元酵素の阻害剤は、それらが癌化学療法においておよびマラリア寄生虫に対する薬剤として潜在的な役割を有しているため、長年、研究のトピックとなっていた。文献に記載された最初の葉酸塩類似体の１つは、Ｌｅｄｅｒｌｅ研究室によるメトトレキセートである。この化合物は、１９４８年には既に、急性白血病の治療に使用されていた（Ｈｉｔｃｈｉｎｇｓ， Ｇ． Ｈ．， Ｊｒ．， １９８９， Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ ２５：３０３−１０）。
【０００３】
メトトレキセート（ＭＴＸ）の活性は、標的酵素であるジヒドロ葉酸還元酵素の競合阻害に基づく。この酵素は、ジヒドロ葉酸（ＤＨＦ）を基質に用いて、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）を生産および再生するために必要である。メトトレキセートの特異性は、様々な種におけるジヒドロ葉酸還元酵素の小さな構造的違いによって説明することができる（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９７８， Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１７−２４）。メトトレキセートは、メチオニン、ＤＮＡおよびＲＮＡの生合成のために細胞が十分なテトラヒドロ葉酸を生産することを妨げる。しかしながら、プリン、チミジン、グリシン、メチオニンおよびパントテン酸（何れも、それら自身の生合成のためにテトラヒドロ葉酸を必要とする代謝産物である）が存在すると、テトラヒドロ葉酸を合成しようとする細胞の要求性は低下し得る（Ｈａｒｖｅｙ， Ｒ． Ｊ．， １９７３， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １１４：３０９−２２）。にもかかわらず、何れにせよＭＴＸによって、細胞の増殖は常に妨害される。というのは、葉酸塩依存性代謝産物（ｆｏｌａｔｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）の存在に関わらず、ＴＨＦは、タンパク質合成の開始に不可欠な化合物であるメチオニル−ｔＲＮＡｆｍｅｔの形成に必須であるからである（Ｂａｕｍｓｔａｒｋ ｅｔ ａｌ．， １９７７， Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １２９：４５７−７１）。
【０００４】
ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）およびラクトバチルス・カセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）といった乳酸菌は、メトトレキセートおよびその他の葉酸塩類似体トリメトプリムに対する応答において、高度の多様性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ）を示す。Ｌ．ラクティスは、両葉酸代謝拮抗薬に対して非感受性であることが知られている（Ｌｅｓｚｃｚｙｎｓｋａ ｅｔ ａｌ．， １９９５， Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６１：５６１−６）。多くの生物において、長期間葉酸代謝拮抗薬に曝露されると、耐性細胞種が選択されることが示されてきた。メトトレキセート（ＭＴＸ）に対する、真核生物細胞株ならびに細菌の両方の耐性機構を説明するために、幾つかの根本的な機構が述べられてきた。Ｔａｍｕｒａらは、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｉｒａｅ）において、ＭＴＸ耐性をもたらす機構を研究した（１９９７， Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４３： ２６３９−４６）。彼らは、（ｉ）葉酸還元酵素（ＦＡＲ）活性の増大、（ｉｉ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性の増大、（ｉｉｉ）２つのグルタミル残基を含むＭＴＸの合成および細胞内維持の増大、（ｉｖ）葉酸塩の取り込みの減少を伴う、ＭＴＸの取り込みの減少；および（ｖ）葉酸塩結合能の低下を含む、幾つかの表現型の影響を発見した。培地中に存在する葉酸塩の形成は、耐性の発生の間、ＤＨＦＲおよびＦＡＲの活性および葉酸塩の移行に影響を及ぼした。
【０００５】
しかしながら、ＭＴＸへの曝露は、ＭＴＸに対する耐性が増大した細胞を選択するために使用することが可能である一方、ＭＴＸ耐性と細胞の葉酸塩レベルとの間のつながりは、先行する文献において開示されていなかった。上述のようなＭＴＸ耐性機構と対照的に、本発明者らは、驚くべきことに、細菌細胞が、ＭＴＸ耐性を作り出す別の方法を有することを発見した。この機構は、高濃度の葉酸塩の生産である。この発見は、選択薬剤としてメトトレキセートを用いることによる、高濃度の葉酸塩を生産する（自然発生的）変異型細菌のスクリーニングおよび選択に利用することが可能である。そのような細菌、特に食品等級の細菌（ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ ｂａｃｔｅｒｉａ）は、食料品における葉酸塩の強化に使用することが可能である。葉酸塩は、可溶性Ｂビタミンであり、適切な細胞増殖および機能に必要である。パン、シリアル、酪農製品等といった多くの食料品は、葉酸塩の適切な摂取を保証するために、葉酸が添加される。本発明による変異型細菌は、例えば変異型細菌を用いた発酵によって、食料品における天然の葉酸塩の強化を可能とする。
【定義】
【０００６】
本願にて使用される「乳酸菌」は、発酵の最終生成物として乳酸を生産する細菌であって、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、およびビフィドバクテリウム属といった細菌である。
【０００７】
細菌の「菌株（ｓｔｒａｉｎ）」または「単離株（ｉｓｏｌａｔｅ）」は、本願において互換的に使用され、成長または増殖しても遺伝的には変化しないまま維持される細菌を意味する。多数の同一の細菌も含まれる。
【０００８】
「変異型細菌」または「変異型細菌株または単離株」は、天然の（自発的、自然発生の）変異型細菌または誘導型変異型細菌であって、野生型ＤＮＡには存在しない、ゲノム（ＤＮＡ）における１以上の変異を含むものを意味する。「誘導型細菌」は、化学的変異剤、ＵＶまたはガンマ照射等の処理といった、人間による処理によって変異が誘導された細菌である。対照的に、「天然の」または「自発的変異体」は、人によって変異誘発されていない。本願において、変異型細菌は非ＧＭＯであり、すなわち、組換えＤＮＡ技術によって修飾されていない。
【０００９】
「野生型菌株」または「野生型単離株」とは、天然に見られるような、細菌の非変異体を意味する。
【００１０】
「葉酸塩依存性代謝産物」とは、葉酸塩の生合成または異化反応における代謝産物または前駆体であって、周囲の培地中に存在した場合に細胞のＭＴＸ感受性をマスクする（ｍａｓｋ）ことができるものを意味する。
【００１１】
「ＭＴＸの阻害的量」とは、細胞の増殖を実質的に阻害するために必要な量を意味する。一般に、真核生物細胞においては、少なくとも約１．２５ｍｇ／Ｌ増殖培地の量が、ＭＴＸ感受性細胞に対して阻害的である。
【００１２】
「全葉酸塩」とは、菌株によって生産された、細胞外の（分泌された）および細胞内の葉酸塩レベルを意味する。
【００１３】
「食品等級」微生物は、特に、ヒトまたは動物対象に摂取されたとき、有害ではないとみなされる生物である。
【００１４】
「含む」という用語は、明言された部分、段階または構成成分の存在を特定するものと解釈されるが、１以上の付加的な部分、段階または構成成分の存在を排除しない。細菌株Ｘを含む組成物は、従って、付加的な菌株、その他の構成成分等を含んでよい。
【００１５】
加えて、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素の言及は、内容が明らかに１つおよびただ１つの要素の存在を要求していない限り、１を超える要素の存在の可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、従って、普通、「少なくとも１つ」を意味する。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
組換え葉酸塩過剰生産細菌がＭＴＸに対して感受性の状態に改変されたかどうかの試験にて、阻害的量のＭＴＸ（１．２５ｍｇ／Ｌ）に約４０時間超インキュベートされた多くの野生型菌株のＬ．プランタラムはＭＴＸによって阻害されることがないが、その増殖速度はＭＴＸを欠く培地における場合と同様の速度を示すことがわかった。これらの菌株の葉酸塩レベルを分析すると、これらのコロニーの約５％が、（非変異型の）野生型菌株と比較して有意に高い葉酸塩生産を示した。全葉酸塩プールは、野生型の（平均）レベルと比較して４％から６３％高かった。この発見によって、ＭＴＸが、天然の（非ＧＭＯの）葉酸塩過剰生産細菌を効率的に選択するために使用可能であることが実証された。ＭＴＸを欠く培地において菌株を５０世代超増殖させた場合でさえ、ＭＴＸに対する耐性は維持された。このことは、この耐性が、細菌のゲノムにおける（自発的な）安定的変異に起因することを意味していた。
【００１７】
同様な効果、即ち、増大した葉酸塩生産によってＭＴＸに対する高い耐性がもたらされるという効果が、強力なプロモーターの下流で調節される完全な葉酸塩生合成遺伝子クラスターが形質転換された組換えＬ．プランタラム株において見られた。これらの組換え株は、高いレベルの葉酸塩を生産し、葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地にて増殖した場合、ＭＴＸに耐性であった。本発明の範囲を限定することなく、細胞内ジヒドロ葉酸レベルが、酵素ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）の活性部位について、蓄積したＭＴＸと競合することが推測される。
【００１８】
この発見は、ＭＴＸの存在下における増殖に基づき、葉酸塩過剰生産細菌株を選択するための、迅速なスクリーニング方法の開発に応用された。この研究にて特定された葉酸塩過剰生産体は、野生型の葉酸塩生産体と比較して、葉酸塩レベルにおいて高い増大を示した。全葉酸塩レベルは、野生型のレベルの２０から６０倍に亘った。葉酸塩過剰生産体で見られる細胞内葉酸塩プールは、野生型菌株で見られるレベルと比較して１０から２０倍高かった。これらの細胞内葉酸塩レベルの増大は、ＭＴＸに対する感受性の減少（すなわち耐性）を引き起こす。これは、なぜ葉酸塩過剰生産菌株の増殖が、ＭＴＸによって有意に影響を受けないのかを説明した。野生型株におけるＭＴＸに対する感受性は、葉酸塩に関係のある全ての代謝産物が培地から取り除かれた場合にのみ観察された。
【００１９】
本発明による細菌
それゆえ、本発明の一実施態様において、野生型と比較して細胞内および／または細胞外葉酸塩の量が増大し、および、（少なくとも）１．２５ｍｇ／ｌのメトトレキセートを含み葉酸塩依存性代謝産物を欠いた培地にて増殖させたときに、少なくとも０．１ｈ−１の増殖速度（μ）を示す（即ち、ＭＴＸに「耐性」であると言われる）変異型細菌が提供される。好ましくは、これらの増殖条件の下、変異型細菌の増殖速度は、ＭＴＸを欠いた同じ培地にて増殖させた場合の野生型菌株の増殖速度と有意に異ならない（即ち、「正常な増殖」である）。最も重要なことに、変異型細菌は、野生型菌株にとって阻害的なＭＴＸ濃度において有意な増殖を示す。「阻害的な濃度」とは、野生型菌株が実質的に増殖しないＭＴＸの濃度である。例えば、図３から、１．２５、１．５、２．０および２．５ｍｇ／ｌのＭＴＸの濃度において、野生型がゼロに近い増殖速度を示し（μ＜０．０５ｈ−１）、一方、葉酸塩過剰生産菌株は、約０．１ｈ−１の増殖速度（μ）、特に約０．１５ｈ−１付近の増殖速度を示すことがわかる。増殖培地に、葉酸塩依存性代謝産物を添加すべきではない。というのは、それらが存在すると、ＭＴＸ耐性において有意な差をみることができず、それはおそらく、野生型菌株が、培地の葉酸塩代謝産物を用いて、より低い葉酸塩レベルを補うためである。適した増殖培地は、例えば、グリシン、イノシン、オロト酸、チミジン、グアニン、アデニン、ウラシルおよびキサンチンを欠く、改変型ＣＤＭ（化学的確定培地（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｄｅｆｉｎｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ））である。
【００２０】
増殖速度は、様々な手段によって測定することができる。例えば、細菌株または単離株を培地に播種した後の特定の時点において、分光光度的な測定値を取得することができ、ある期間にわたって増殖速度を算出することができる。
【００２１】
変異型細菌は、好ましくは、野生型菌株と比較して、増大した量の細胞内および／または細胞外葉酸塩を含む。好ましくは、全葉酸塩の量は、野生型菌株の細胞内葉酸塩の平均量よりも、少なくとも約４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、より高い割合、より好ましくは、少なくとも約６０％、６３％（またはより高い％）高い。ある細菌種では、その野生型菌株が細胞内葉酸塩レベルの有意な変動を示すため、多数の異なる野生型菌株（例えば、２、３、４、またはそれを越える菌株）について細胞内葉酸塩レベルを分析し、平均葉酸塩レベルを算出することが好ましい。
【００２２】
細菌の単離株または菌株によって生産される、全、細胞内または細胞外葉酸塩の量は、例えば、Ｓｙｂｅｓｍａによって記述されるＬ．カセイ微生物学的アッセイ（Ｌ． ｃａｓｅｉ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙ）（実施例１．３参照）またはその変形方法といった当該分野において既知の方法によって、ＨＰＬＣ分析またはその他の既知の方法によって、測定および定量することが可能である。微生物学的試験は、例えば、試験菌株によって生産される葉酸塩中で増殖する指標菌株（ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｓｔｒａｉｎ）（例えば、Ｌ．カセイ菌株）を使用してよい。大量の葉酸塩が試験菌株によって生産されると、指標菌株はよく増殖し、特定の増殖期間の後のＯＤ測定値が高くなる。対照的に、試験菌株によって生産される葉酸塩の量が低い場合、より低いＯＤ測定値が測定されるだろう。
【００２３】
変異型細菌は、好ましくは、例えば本発明による方法（さらに以下の記載を参照）を用いて選択された自発的（天然の）変異株である。細菌は、野生型菌株がＭＴＸに対して天然で感受性を示す何れの種であってもよく、例えば、Ｌ．プランタラム、Ｌ．カセイ、または乳酸菌の群におけるその他の種である。ＭＴＸに対して感受性があるということは、菌株を葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地中で増殖させたときに、細菌の増殖が、少なくとも１．２５ｍｇ／ＬのＭＴＸによって実質的に阻害されるということを意味する。細菌種がＭＴＸに感受性を示すかどうかは、ＭＴＸが添加され及び葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地で細菌を増殖させることで容易に試験することができる。細菌は、好ましくは食品等級の細菌であり、一実施態様において、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ストレプトコッカス属、ビフィドバクテリウム属、ロイコノストック属およびストレプトコッカス属から成る群から選択される属に属する。
【００２４】
好ましくは、それは、食品等級の乳酸菌である。それは、ラクトバチルス・ロイテリ（ｒｅｕｔｅｒｉ）、Ｌ．ファーメンタム（ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、Ｌ．アシドフィラス（ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．クリスパタス（ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、Ｌ．ガッセリ（ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｌ．ジョンソニー（ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、Ｌ．カセイ、Ｌ．プランタラム、Ｌ．パラカセイ（ｐａｒａｃａｓｅｉ）、Ｌ．ムリナス（ｍｕｒｉｎｕｓ）、Ｌ．ジェンセニー（ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、Ｌ．サリバリアス（ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．ミヌティス（ｍｉｎｕｔｉｓ）、Ｌ．ブレビス（ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｌ．アミロボラス（ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィリス（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌｃ．ラクティス、ペディオコッカス・ダムノサス（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ ｄａｍｎｏｓｕｓ）、Ｐ．アシディラクティシ（ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、Ｐ．パルバラス（ｐａｒｖｕｌｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ロンガム（ｌｏｎｇｕｍ）、Ｂ．インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、Ｂ．ブレベ（ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．アドレッセンテ（ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｅ）、Ｂ．アニマリス（ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ガリナラム（ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、Ｂ．マグナム（ｍａｇｎｕｍ）、およびＢ．サーモフィラム（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）から成る群から選択される種であってよい。
【００２５】
代わりとなる実施態様において、変異型細菌は、葉酸塩が増大し、ＭＴＸに耐性である誘導型変異体であってよい。そのような変異体は、スクリーニング法の前に突然変異誘発の工程を含めるということ以外は、天然の変異体の選択に用いたものと同じ方法（本願の下部に記載）を用いて取得してよい。当然変異誘発の工程は、化学物質および／または物理的変異原への曝露（例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン；ＵＶ照射、ガンマ照射等）といった、１以上の既知の突然変異誘発法を含んでよい。突然変異誘発の後に、細菌を阻害的量のＭＴＸを含む培地中／上で増殖させ、増殖する単離株を選択し、および葉酸塩含有量を分析する。
【００２６】
さらに別の実施態様において、本発明による変異型細菌は、それらの遺伝子発現パターンによって特徴付けることが可能である。このことは、野生型と比較して少なくとも５０％の葉酸塩を更に生産するメトトレキセート耐性Ｌ．プランタラム株が、ゲノム中の１以上のｆｏｌＣ遺伝子を２倍（またはそれより高く）過剰発現するという知見によって例証される。ｆｏｌＣ遺伝子は、ジヒドロ葉酸合成酵素をコードする。一実施態様において、本発明による細菌は、葉酸塩生合成経路の酵素をコードする１以上の遺伝子において、野生型と比較して過剰発現を示す。葉酸塩生合成に直接関与する遺伝子に加えて、以下の遺伝子もまた、高い転写レベルを示した：ＦＫ（フルクトキナーゼをコードする）、ＰＯＸ（ピルビン酸オキシダーゼ）、ＬＯＸ（乳酸オキシダーゼ）およびＰＤＨ（ピルビン酸デヒドロゲナーゼ）。野生型と比較して、ＤＡＫ（ジヒドロキシアセトンリン酸転移酵素またはグリセロンキナーゼ）では、有意に低い転写物レベルが見られた。従って、本発明の一実施態様において、本発明による細菌は、ジヒドロ葉酸合成酵素（ＥＣ ６．３．２．１７）、フルクトキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．４）、ピルビン酸オキシダーゼ（ＥＣ １．２．３．３）、６−ホスホ−β−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．８６）をコードする群の１以上の遺伝子において、有意に増強したｍＲＮＡ転写物レベルを含む。加えて又はあるいは、細菌は、ジヒドロキシアセトンリン酸転移酵素（＝グリセロンキナーゼ）（ＥＣ． ２．７．１．２９）をコードする遺伝子において、有意に低下したｍＲＮＡ転写物レベルを含む。
【００２７】
「アプレギュレートされる」または「ダウンレギュレートされる」という用語は、野生型菌株の遺伝子と比較して、ｍＲＮＡ転写レベルの増大またはｍＲＮＡ転写レベルの減少を意味する。
【００２８】
「有意に増強した転写物レベル」または「有意に増強した転写レベル」とは、野生型において見られる転写物レベルと比較して、少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、またはさらに約４倍もしくはそれより高い量のｍＲＮＡ転写物を意味する。同様に、「有意に低下した転写物レベル」または「転写レベル」とは、野生型において見られるよりも、少なくとも約２倍、３倍等少ない量のｍＲＮＡ転写物を意味する。
【００２９】
１以上の遺伝子のｍＲＮＡ転写物レベルは、日常的な分子生物学的方法を用いて、例えば、ノーザン分析および定量的逆転写酵素（ＲＴ−）ＰＣＲによって、測定しおよび定量することが可能である。これらの遺伝子のＤＮＡ／ｃＤＮＡ配列情報が利用可能であるので、標的ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡとハイブリダイズするのに適したプライマーおよびプローブが利用可能であり、転写物レベルの分析には日常的な実験しか必要としない。例えば、Ｌ．プランタラム（そのゲノムは配列決定されている）の核酸配列は、その他の種の細菌由来のオルソロガスな（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕ）遺伝子を同定し（例えばシリコ（ｓｉｌｉｃｏ）分析によって）、クローン化し（例えば、ＰＣＲを基礎とした方法、ハイブリダイゼーションを基礎とした方法等を用いて）、および／または配列決定するために使用してよい。これらの遺伝子の核酸配列またはその部分は、次に、標的遺伝子の検出および定量のためのプライマーまたはプローブを作製するために使用してよい。
【００３０】
任意に、転写パターン（すなわち、上述した１以上の遺伝子の転写物レベルの増強または低下）は、選択基準として使用してよい。例えば、細菌は、まず第１のスクリーニングにおいて発現レベルの変化についてスクリーニングされ、続いてメトトレキセート耐性および／または葉酸塩レベルが分析される（下記に記載）。同様に、それは、下記の方法において、付加的なスクリーニング／選択工程として使用してよい（例えば、工程（ｂ）および（ｃ）の間にもしくは工程（ｄ）の後に入れてよく、またはそれは、工程（ａ）および（ｂ）と取替えてもよい）。
【００３１】
本願に記載されるメトトレキセート耐性菌株（ラクトバチルス・プランタラムＮＩＺＯ Ｂ２５５０）の１つの転写プロファイルは、親菌株のそれと比較されている（ラクトバチルス・プランタラム ＷＣＦＳ１（Ｌ．プランタラム ＷＣＦＳ１の全配列は、アクセス番号ＡＬ９３５２６３の下、ＥＭＢＬデータベースに預けられている））。これは、ラクトバチルス・プランタラム ＷＣＦＳ１の全ゲノムＤＮＡマイクロアレイを用いて行われた。親菌株およびメトトレキセート耐性変異体の全ｍＲＮＡサンプルが単離され、続いて、逆転写酵素で処理をして、蛍光標識されたｃＤＮＡが合成された。親菌株および変異体のサンプルは、互いに異なるように標識した。続いて、標識ｃＤＮＡサンプルの混合物をＤＮＡマイクロアレイ上でハイブリダイズさせて、Ｌ．プランタラムの親菌株に対する、変異体の全遺伝子のｍＲＮＡの相対的な存在量を決定した。
【００３２】
一実施態様において、変異菌株は、ブダペスト条約の下、ＮＩＺＯ食品研究所（Ｐ．Ｏ． Ｂｏｘ ２０， ６７１０ ＢＡ Ｅｄｅ、オランダ）によって、ＣＢＳ １１７１２０という受託番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ）にて、ＣＢＳ (カビ培養中央局（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）, ウプサララーン（Ｕｐｐｓａｌａｌａａｎ） ８， ３５８４ ＣＴユトレヒト、オランダ)に預けられている細菌株（またはその何れかの誘導体）である。
【００３３】
本発明による組成物
本発明の更なる側面は、本願にて上述したような変異型細菌またはその誘導体または抽出物を含む組成物に関し、ならびにそのような組成物を製造する方法に関する。本発明による細菌は適切な条件の下培養され、任意に培養培地から回収され、任意に意図される使用に適した組成物に処方される。そのような組成物の製造方法は、それ自体、既知である。
【００３４】
好ましくは、変異型細菌、その誘導体または抽出物は、天然の葉酸塩を含む食品または食品サプリメント組成物を作製するために使用される。
【００３５】
本発明による好ましい組成物は、被験対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）によって、好ましくはヒトまたは動物によって消費されるのに適している。そのような組成物は、食品サプリメントまたは全食品（ｗｈｏｌｅ ｆｏｏｄ）または食品組成物の形態であってよく、それらは、本発明による細菌に加えて、適した食品ベース（ｆｏｏｄ ｂａｓｅ）を含む。食品または食品組成物は、ここにおいて、固体および半固体組成物のみでなく、ヒトまたは動物による消費のための液体、即ち飲み物（ｄｒｉｎｋ）または飲料（ｂｅｖｅｒａｇｅ）をも含むと理解される。食品または食品組成物は、固体、半固体および／または液体の食品または食品組成物であってよく、特に、ヨーグルト、ヨーグルトベースの飲料またはバターミルクを含むがこれらに限定されない、発酵酪農食品といった、酪農食品を含んでよい。そのような食品または食品組成物は、それ自体既知の様式によって製造してよく、例えば、適切な食品または食品ベースに、適した量で、本発明による１以上の変異型細菌を添加することによって製造してよい。
【００３６】
また、適した量の１以上の変異型細菌株またはそれ由来の抽出物（例えば、部分的にまたは実質的に精製した天然葉酸塩）を含む、食品サプリメントを作製することが可能である。食品サプリメントは、例えば、葉酸塩を含む様々なビタミンの推奨される１日量を含む、ビタミン錠剤、ピル、カプセルまたは粉剤を含む。普通そのような調合品（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）にて使用される合成葉酸は、本発明による天然葉酸塩に置き換えてよい。
【００３７】
さらに好ましい実施態様において、生きた細菌は、例えば発酵によって、食品または食品組成物の製造において、またはそれらの製造のために使用してよい。その際、本発明による細菌は、そのような発酵食品または食品組成物の製造のための、それ自体既知の様式にて使用してよく、例えば、乳酸菌を用いた発酵酪農製品の製造のためのそれ自体既知の様式にて使用してよい。そのような方法において、本発明による細菌細胞は、通常使用される微生物に加えて使用してよく、および／または、通常使用される１以上のまたは一部の微生物と置き換えてよい。例えば、ヨーグルトまたはヨーグルトベースの飲料といった発酵酪農製品の製造において、本発明による食品等級の変異型細菌は、開始培養液（ｓｔａｒｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ）に添加してよくもしくはその一部として使用してよく、または、そのような発酵の間に適切に添加してよい。この場合の細菌の「増殖培地」は、ミルクベースのものといった、食品等級の培地である。
【００３８】
更なる実施態様において、使用される細菌は、死亡している（例えば、溶解している）もしくは非生存可能（ｎｏｎ−ｖｉａｂｌｅ）であってよく、または凍結乾燥されていてよい。
【００３９】
本発明による１以上の変異型細菌株を用いて製造される組成物、または適した量の１以上の菌株が追加された組成物は、増強された量の、細菌によって生産される天然の葉酸塩を含む。葉酸塩を高度に過剰生産する１以上の菌株を混合してよく、またはそれらを経時的に組成物に添加してよくもしくはその製造の間に添加してよい。最終生成物中に存在する葉酸塩の全量は、例えばＨＰＬＣ分析を用いて分析することができる。
【００４０】
本発明による方法および使用
メトトレキセートは、細胞内葉酸塩レベルおよび全葉酸塩レベルが増大した細菌の選択のために使用される。
【００４１】
一実施態様において、細胞内葉酸塩レベルおよび／または全葉酸塩レベルが増大した細菌の選択の方法が提供される。この方法は、以下の工程を含む：
（ａ）細菌を、メトトレキセートを含む培地上（またはその中）で増殖させる、ここにおいて、前記培地は、葉酸塩依存性代謝産物が追加されていない、
（ｂ）増殖速度（μ）が少なくとも１時間当り０．１である細菌を選択する、
（ｃ）工程ｂで選択した細菌の葉酸塩レベルを測定する、
（ｄ）野生型またはその他の適した対照と比較して葉酸塩レベルが増大した細菌を選択する、
（ｅ）任意に、工程（ｂ）、（ｃ）および／または（ｄ）を繰り返す。
【００４２】
工程（ａ）における「増殖」は、細菌をそのような培地と接触させることも含んでよい。培地は、様々な濃度のＭＴＸを含んでよい。例えば、最初の回の選択は、相対的に低い濃度、例えば、１．２５、１．５、２．０、２．５ｍｇ／ｌの培地にて行ってよい。１以上のこれらの濃度で増殖する単離株は、次に、葉酸塩濃度で直接スクリーニングしてよく、または、例えばより高いＭＴＸ濃度、例えば４、５、１０ｍｇ／ｌまたはそれより高い濃度による、１回以上のＭＴＸ選択に更に供してよい。選択過程の厳密性は、例えば高濃度で高い増殖性を示す単離株には、より高い厳密性を選択し、相対的に低いＭＴＸ濃度で中程度の増殖を示す単離株にはより低い厳密性を選択することにより、変化させることが可能である。好ましくは、それぞれのＭＴＸ選択工程において、単離株は、少なくとも４０時間、より好ましくは少なくとも５０時間またはそれより長い時間、培地上またはその中で増殖する。適した対照、例えば野生型単離株を常に含めるべきである。というのは、変異体は、変異体と対照（例えば、野生型）との間の増殖の差に基づいて選択されるためである。対照は、必ずしも野生型であるべきでなく、以前に選択された菌株とすることも可能である。最適なインキュベート温度、培地のｐＨ、およびその他のパラメーターは、当業者が容易に決定することが可能である。正確な条件は、使用する細菌種に依存する。
【００４３】
好ましくは、方法は、大量の単離株が、例えば９６ウェルマイクロタイタープレート等にて、同時にスクリーニングできるように設定される。
【００４４】
方法は、メトトレキセートに天然の感受性を示す全ての細菌に適用することが可能である。葉酸塩類似体メトトレキセートを用いて、上述したように葉酸塩濃度が増大した発酵食品製品の製造に使用することが可能な、天然に葉酸塩を過剰生産する細菌を、効率的に選択および単離することが可能である。
【００４５】
方法によって得ることが可能であり、有意に葉酸塩レベルが増大した何れかの細菌が、本願に含まれる。
【００４６】
特に記載がない限り、本発明の実践は、分子生物学、ウイルス学、微生物学または生化学の標準的な従来の方法を利用するだろう。そのような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらによる、「分子クローニング、研究室マニュアル（第２版）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ））」（１９８９）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌによる、「分子クローニング：研究室マニュアル第３版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（２００１）（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ）；Ａｕｓｕｂｅｌらによる、「分子生物学における現在のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９４）（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ＵＳＡ）の１巻および２巻；Ｂｒｏｗｎによる「分子生物学ＬａｂＦａｘ第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＬａｂＦａｘ， Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」（１９９８）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （ＵＫ））；Ｎ． Ｇａｉｔ編集、「オリゴヌクレオチド合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」；ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編集、「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」に記載されており、これらの文献は全て、本願に援用される。
【実施例】
【００４７】
１．材料および方法
１．１ 菌株および培養条件
野生型Ｌ．プランタラム ＷＣＦＳ１菌株およびその誘導体を、１９ｇ／Ｌ β−ホスホグリセリン酸（６）を含む化学的確定培地（ＣＤＭ）、または改変型ＣＤＭ上で、３７℃で増殖させた。この改変型ＣＤＭは、グリシン、イノシン、オロチン酸、チミジン、グアニン、アデニン、ウラシルおよびキサンチンが、通常のＣＤＭから除かれたものであった。さらに、８ｎｇ／ｍｌ クロラムフェニコールを、使用する全ての培地に添加した。メトトレキセート（Ｓｉｇｍａ、アミノプテリン）を、０から１０ｍｇ／ｌの範囲の濃度で、両種のＣＤＭに添加した。
【００４８】
１．２ ＤＮＡ技術、プラスミドの構築および形質転換
この研究で使用したプラスミドを表１に挙げる。
【表１】
【００４９】
ベクターｐＮＺ８１４８は、ナイシン誘導性プロモーター（ｎｉｓｉｎ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、マルチプル・クローニング・サイト、およびクロラムフェニコール耐性マーカーを含む空ベクターである。ｐＮＺ８１４８誘導体およびＬ．プランタラムのゲノムＤＮＡを、確立された方法を用いて単離した。以下のサイクルによって、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ装置（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ハンブルグ、ドイツ）にてＰｆｘ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ペーズリー、イギリス）をもちいてＰＣＲを行った：１０００ｂｐｓ当り、９４℃３０秒の変性（最初のサイクルは３分）、４５℃２５秒のアニーリング、および６８℃１分の伸長で、全３０サイクル。
【００５０】
ベクターｐＮＺ８１４８を、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩを用いて消化し、それによってナイシンプロモーターを切除した。並行した実験において、Ｌ．ラクティスの恒常的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）なプロモーターｐｅｐＮ（Ｖａｎ Ａｌｅｎ−Ｂｏｅｒｒｉｇｔｅｒらによる、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９１）５７：２５５５−６１）を、ＳｐｈＩおよびＢｇｌＩＩを用いてベクターｐＮＺ７０１７から消化した。その後、両断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて連結し、出来るプラスミドを、ベクターｐＮＺ７０２０と名付けた。Ｌ．プランタラムの葉酸塩遺伝子クラスターを、以下のプライマーを用いて、染色体ＤＮＡから増幅した：（ｉ）ｆｏｌＢＫｐｎ−Ｆ （５’−ＧＡＡＡＧＡＧＧＣＴＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＡＴＧＧＧＣＡＴＧＡＴＴＣ−３’）、（これは、ＫｐｎＩ制限部位によって５’が伸長しており、それによってｆｏｌＢ遺伝子の開始コドンにオーバーラップする）、および（ｉｉ）リバースプライマーＬｐｆＰｘｂａ−Ｒ（５’−ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＡＴＣＧ−３’）（これは、ＸｂａＩ制限部位をつくるために５’末端が伸長しており、ｆｏｌＣの停止コドンとベクターとの間の融合を可能にする）。増幅したＤＮＡ断片を、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、ｆｏｌＢ−ｆｏｌＰ遺伝子クラスターの切断されたものを得た（ｆｏｌＰはＸｂａＩ制限部位を含む）。ベクターｐＮＺ７０２０もまた、ＸｂａＩおよびＫｐｎＩで消化し、その後、両断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し、得られたベクターをｐＺＮ７０２０ａと名付けた。ｆｏｌＰ遺伝子の失っている部分は、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって増幅した：ｌｐｆＰ−Ｆ （５’−ＣＡＴＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＴＧＡＡＣＧＡＡＴＴＧ−３’）およびｌｐｆＰｘｂａ−Ｒプライマー（５’−ＣＴＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＡＧＡＣＧＴＡＡＴＡＴＣＧ−３’）。増幅したＤＮＡをＸｂａＩで消化した。次に、ベクターｐＺＮ７０２０ａをＸｂａＩで消化し、続いて、アルカリホスファターゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いてリン酸化し、自己連結を予防した。ＸｂａＩ消化したＤＮＡの断片を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、挿入した断片の向きを、ＰＣＲを用いて確認した。出来たベクターをｐＮＺ７０２１と名付けた。表１に挙げられる３つのベクターを、その後、ｙｌｇＧバックグラウンドにて、Ｌ．ラクティスＮＺ９０００のコンピテントセルに移した。続いて、３つのベクターのミディプレップ（ｍｉｄｉｐｒｅｐ）を、確立された方法を用いてＬ．プランタラムに形質転換した。
【００５１】
１．３ 微生物学的アッセイを用いた葉酸塩の定量
３つの遺伝的に操作を行ったＬ．プランタラム株の葉酸塩レベルを、以前に記載されるようなラクトバチルス・カセイ微生物学的アッセイ（Ｓｙｂｅｓｍａら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（２００３）６９：３０６９−７６．）を用いて分析した。
【００５２】
１．４ 菌株の増殖のモニタリング
異なるベクターを有する３つのＬ．プランタラム株の増殖速度の測定を、マイクロタイタープレートを用いて行った。３つの株の増殖を、分光光度計（ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ（商標登録）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、サニーヴェール、カリフォルニア、アメリカ）を用いて、３５時間、９６ウェルマイクロタイタープレートにてモニターした。増殖は、２種類の培地にて試験し、およびそれぞれの構築物を、以下のＭＴＸ濃度で両培地にて、三重で分析した：０、０．３１２５、０．６２５、１．２５および２．５ｍｇ／Ｌ。
【００５３】
１．５ 天然の葉酸塩過剰生産体の選択
ｐＮＺ８１４８を含む野生型Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１を、２．５ｍｇ／Ｌ ＭＴＸを含む改変型ＣＤＭにて再び培養したが、この増殖培地は、マイクロタイタープレートの９６ウェルに分割した。このマイクロタイタープレートを３日間インキュベートし、その後、それぞれの９６ウェルからの一定分量を、今回は１０ｍｇ／Ｌ ＭＴＸの入った改変型ＣＤＭを含む、２つの新鮮な９６ウェルマイクロタイタープレートに分配した。それぞれの工程を通して、オリジナルのマイクロタイタープレートは、６０％グリセロールと混合し、−８０℃の冷凍庫で保存した。グリセロール保存したマイクロタイタープレートは、新鮮な改変型ＣＤＭ培地上にて、変異させたまたは順応させた（ａｄａｐｔｅｄ）細胞に播種するために使用した。これらの２８８ＭＴＸ耐性培養液の葉酸塩レベルは、迅速なスクリーニング法を用いて確認した。この方法は、以前に記述された通常の微生物学的アッセイに基づくが、幾つかの変更点が採用されている。この迅速なスクリーニング法において、野生型によって生産された葉酸塩が、変異菌株によって生産された葉酸塩と比較される。野生型によって生産された葉酸塩における指標菌株の培養は、相対的に低い光学的密度をもたらす。葉酸塩過剰生産体における、指標菌株の光学的密度は、野生型のそれより高くなるだろう。指標菌株において光学的密度を上昇させる菌株は、拡張された（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）Ｌｂ．カセイ微生物学的アッセイによって再分析した。
【００５４】
２．結果
２．１ 組換え菌株
ｐＮＺ８１４８および２つの遺伝的構築物ｐＮＺ７０１９およびｐＮＺ７０２１を保持するＬ．プランタラム野生型の葉酸塩生産レベルを、通常のＣＤＭ培地にて研究した。空ベクターｐＮＺ８１４８を含むＬ．プランタラムＷＣＦＳ１株の葉酸塩生産は、１００ｎｇ葉酸塩／ｍｌ培養液とわかった（図１）。ｐＮＺ７０１９（Ｌ．ラクティスの葉酸塩生合成遺伝子クラスター）を保持するＬ．プランタラムは、培養液中において２０００ｎｇ／ｍｌを超える葉酸塩を生産する（図１）。これは、野生型と比較して、約２０倍の過剰生産に相当する。Ｌ．プランタラムの葉酸塩生合成遺伝子クラスターを保持する、ベクターｐＮＺ７０２１の、Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１への形質転換によって、６０００ｎｇ／ｍｌ培養液の葉酸塩レベルを生産する菌株をもたらす（図１）。
【００５５】
次に、２つの葉酸塩過剰生産菌株および野生型菌株の特異的な増殖速度を、ある濃度範囲におけるメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下、葉酸塩依存性代謝産物が入ったＣＤＭと入らないＣＤＭで比較した（図２）。葉酸塩依存性代謝産物が存在すると、試験した菌株の何れも、ＭＴＸによって有意に阻害されなかった（図２ａ）。プラスミドｐＮＺ７０２１を保持するＬ．プランタラムの増殖速度は、試験した全てのＭＴＸ濃度において、その他の２つの菌株と比較して低い。葉酸塩依存性代謝産物を含む培地では、完全に異なるグラフとなっている。この培地では、葉酸塩過剰生産体は、野生型菌株と比較して、明らかにＭＴＸに対して耐性が強い（図２ｂ）。２．５ｍｇ／Ｌの濃度のＭＴＸでは、野生型菌株の完全な増殖阻害が改変型ＣＤＭにおいて見られ、一方で葉酸塩過剰生産菌株の両方は、この培地において良好に増殖した。０から２．５ｍｇ／Ｌの間のＭＴＸでは、濃度依存的な増殖阻害が、野生型Ｌ．プランタナム菌株において観察された。これらの結果は、適切な増殖培地で解析すると、葉酸塩の過剰生産はＭＴＸ耐性をもたらす、ということを示している。それゆえ、ＭＴＸは、野生型菌株から、葉酸塩過剰生産菌株を区別するために使用することが可能である。
【００５６】
２．２ 野生型菌株
２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを追加した改変型ＣＤＭにおける、野生型Ｌ．プランタラム ＷＣＦＳ１の長期間のインキュベーション（＞４０時間）は、カルチャーの有意な増殖をもたらす。このカルチャーを、２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸが追加された新鮮な改変型ＣＤＭに希釈すると、カルチャーの急速な増殖が観察された。このカルチャーから単一のコロニーを単離し、ＭＴＸ耐性が増大した天然変異体が選択されたか、またはある種の一時的な順応が起こったのかを試験した。２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを含む改変型ＣＤＭに、ＭＴＸ耐性培養菌由来の単一コロニーを播種した。次に、増殖培地を２つのカルチャーに分けた；その１つは、２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを含む改変型ＣＤＭで５０世代増殖させ、もう一方のカルチャーは、ＭＴＸを含まない同じ培地にて５０世代増殖させた。５０世代の増殖の後、両カルチャーを、再び２．５ ｍｇ／ＬのＭＴＸを含む改変型ＣＤＭに移した。異なる経緯をたどった両株は、この培地において同等の増殖速度を示した。このことは、安定した変異がＭＴＸ耐性の表現型をもたらしていることを示している。
【００５７】
我々は、２．５ｍｇ／Ｌおよび１０ｍｇ／ＬのＭＴＸを含むカルチャーから２８８のコロニーを単離した。
【００５８】
これらのコロニーを、迅速なプレスクリーニング法を用いて、葉酸塩の過剰生産について分析した。この迅速なスクリーニングに基づいて、２８８コロニーの内５つが、野生型と比較して高い葉酸塩レベルのカルチャーを示した。これらの５つのカルチャーを、続いて、２．５ｍｇ／ＬのＭＴＸが追加された改変型ＣＤＭにプレーティングした。それぞれのプレートから、３つの単一コロニーを単離し、保存し、および再び以下の方法において葉酸塩生産を分析した。１５の陽性コロニー由来のカルチャーにおける葉酸塩レベルをモニターした（図３）。平均葉酸塩レベルは、野生型と比較して２０％から６０％高い。全てのコロニーが、まだなおＬ．プランタラムであることを確認するために、我々はＲＡＰＤ分析を行った。試験した全てのコロニーが、親菌株との高い類似性を示した。
【００５９】
２．３． 転写プロファイリング
ゲノムワイドな転写プロファイリングのためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術を用いて、我々は、メトトレキセート耐性変異体Ｌ．プランタラムＮＩＺＯ Ｂ２５５０（Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１由来）にて、野生型と比較して特異的にアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子を同定した。Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１およびＮＩＺＯ Ｂ２５５０のカルチャーを改変型ＣＤＭにて増殖させ、濁度（ＯＤ６００）が１のときに細胞を回収し、ｍＲＮＡを単離した。ｍＲＮＡサンプルを、ＤＮＡマイクロアレイの分析のために処理した。特異的なｍＲＮＡの相対的な存在量を、メトトレキセート耐性菌株における遺伝子と親菌株における相当する遺伝子とを比較し、その発現が何倍変化したか（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）で表した。トランスクリプトーム（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ）プロファイルの分析により、親菌株との比較において、ジヒドロ葉酸合成酵素をコードする遺伝子ｆｏｌＣ１は、野生型と比較してメトトレキセート耐性変異体では特異的に４倍アップレギュレートされている（表２参照）。この酵素は、Ｌ−グルタミンとジヒドロプロテロイン酸塩とからジヒドロ葉酸を作る酵素であり、このジヒドロ葉酸は、メトトレキセートの構造的類似体であり、ジヒドロ葉酸還元酵素の基質となる。ｆｏｌＣ１の過剰発現によってジヒドロ葉酸合成酵素が増えると、細胞内のジヒドロ葉酸のプールが増大することが予想され、その結果、これらが、ジヒドロ葉酸還元酵素による転換において、メトトレキセートと競合することができる。この発見は、単離された変異体におけるメトトレキセート耐性の機構を明らかにしている。これはまた、何故これらの変異体が、メトトレキセートの非存在下に葉酸塩を高いレベルで生産するかを説明する。
【００６０】
Ｌ．プランタラムＷＣＦＳ１は、２つのｆｏｌＣ１遺伝子（ｆｏｌＣ１およびｆｏｌＣ２）を有している。興味深いことに、ｆｏｌＣ１のみが、メトトレキセート耐性変異体においてアップレギュレートされる。この遺伝子は機能的なクラスターに位置しておらず、葉酸塩生合成クラスターに位置するｆｏｌＣ２と対照的である。
【００６１】
ｆｏｌＣ１に加えて、多くのその他の代謝性の遺伝子（フルクトキナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼおよび６−ホスホ−ベータ−グルコシダーゼをコードする遺伝子）が、メトトレキセート耐性菌株においてアップレギュレートされることがわかった（表２参照）。グリセロンキナーゼ（ジヒドロキシアセトンホスホトランスフェラーゼ）をコードする３つの遺伝子（ｄａｋ１Ａ、ｄａｋ１Ｂおよびｄａｋ２）は、親菌株と比較して、変異体ではダウンレギュレートされることがわかった。
【表２】
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】ＣＤＭ上での培養における、Ｌ．プランタラム野生型菌株（１）およびｐＮＺ７０１９を有するＬ．プランタラム株（２）およびｐＮＺ７０２１を有するＬ．プランタラム株（３）の葉酸塩生産。説明文：細胞外葉酸塩レベル；（白色のバー）、細胞内葉酸塩レベル；（灰色のバー）、全葉酸塩レベル；（黒色のバー）。
【図２ａ】野生型Ｌ．プランタラム株（１）、ベクターｐＮＺ７０１９を有するＬ．プランタラム株（２）、およびベクターｐＮＺ７０２１を有するＬ．プランタラム株（３）の増殖速度。３つのＬ．プランタラム株の増殖能力を、メトトレキセートを０、０．３１２５、０．６２５、１．２５および２．５ｍｇ／Ｌ（ＭＴＸ）に増大する濃度で含むＣＤＭ上にて（ａ）および改変したＣＤＭ上にて（ｂ）試験した。
【図２ｂ】野生型Ｌ．プランタラム株（１）、ベクターｐＮＺ７０１９を有するＬ．プランタラム株（２）、およびベクターｐＮＺ７０２１を有するＬ．プランタラム株（３）の増殖速度。３つのＬ．プランタラム株の増殖能力を、メトトレキセートを０、０．３１２５、０．６２５、１．２５および２．５ｍｇ／Ｌ（ＭＴＸ）に増大する濃度で含むＣＤＭ上にて（ａ）および改変したＣＤＭ上にて（ｂ）試験した。
【図３】ＭＴＸ耐性に基づいて選択される、１５の葉酸塩過剰生産菌株の葉酸塩生産レベル。１５菌株の葉酸塩生産が、野生型の葉酸塩生産と比較される。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内および／または細胞外葉酸塩の量が野生型と比較して増大し、及び、１．２５ｍｇ／ｌのメトトレキセートを含み葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地で増殖させた場合に、少なくとも１時間当り０．１μの増殖速度であることを特徴とする変異型細菌。
【請求項２】
前記細菌が、天然に発生した変異株または誘導型変異株である、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記細菌が、葉酸塩生合成経路の酵素をコードする１以上の遺伝子について、野生型と比較して過剰発現を示す請求項１または２に記載の細菌。
【請求項４】
ジヒドロ葉酸合成酵素、フルクトキナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼおよび６−ホスホ−β−グルコシダーゼをコードする遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現が、野生型と比較して少なくとも約２倍アップレギュレートされる、請求項１から３の何れか１項に記載の細菌。
【請求項５】
ジヒドロキシアセトンリン酸転移酵素をコードする遺伝子の発現が、野生型と比較して少なくとも約２倍ダウンレギュレートされる、請求項１、２または４に記載の細菌。
【請求項６】
変異型細菌の全葉酸塩の量が、野生型菌株の前記量よりも少なくとも１０％高い、請求項１から５の何れか１項に記載の細菌。
【請求項７】
前記細菌が、ラクトバチルス・プランタラム、Ｌ．カセイ、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ジョンソニー、Ｌ．パラカセイ、Ｌ．ムリナス、Ｌ．ジェンセニー、Ｌ．サリバリアス、Ｌ．ミヌティス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．アミロボラス、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィリス、ロイコノストック・メセンテロイデス、Ｌｃ．ラクティス、ペディオコッカス・ダムノサス、Ｐ．アシディラクティシ、Ｐ．パルバラス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、Ｂ．ロンガム、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ブレベ、Ｂ．アドレッセンテ、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ガリナラム、Ｂ．マグナム、およびＢ．サーモフィラムの種に属する、請求項１から６の何れか１項に記載の細菌。
【請求項８】
ラクトバチルス・プランタラムのＣＢＳ１１７１２０株。
【請求項９】
請求項１から８の何れか１項に記載の細菌を含む組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、食品組成物または食品サプリメント組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記食品組成物が発酵食品組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞内葉酸塩レベルが増大しおよび全葉酸塩レベルが増大した細菌の選択のための、メトトレキセートの使用。
【請求項１３】
以下の工程を含む、細胞内および／または全葉酸塩レベルが増大した細菌を選択する方法：
（ａ）細菌を、メトトレキセートを含む培地上またはその中で増殖させる、ここにおいて、前記培地は葉酸塩依存性代謝産物が追加されていない；
（ｂ）増殖速度（μ）が少なくとも１時間当り０．１である細菌を選択する；
（ｃ）工程（ｂ）で選択した細菌の葉酸塩レベルを測定し、野生型株と比較して葉酸塩レベルが増大した細菌を選択する；
（ｅ）任意に、工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）を繰り返す。
【請求項１４】
前記培地が少なくとも１．２５ｍｇ／ｌのメトトレキセートを含み、および、前記細菌を前記培地上で少なくとも４０時間増殖させる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１】
細胞内および／または細胞外葉酸塩の量が野生型と比較して増大し、及び、１．２５ｍｇ／ｌのメトトレキセートを含み葉酸塩依存性代謝産物を欠く培地で増殖させた場合に、少なくとも１時間当り０．１μの増殖速度であることを特徴とする変異型細菌。
【請求項２】
前記細菌が、天然に発生した変異株または誘導型変異株である、請求項１に記載の細菌。
【請求項３】
前記細菌が、葉酸塩生合成経路の酵素をコードする１以上の遺伝子について、野生型と比較して過剰発現を示す請求項１または２に記載の細菌。
【請求項４】
ジヒドロ葉酸合成酵素、フルクトキナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼおよび６−ホスホ−β−グルコシダーゼをコードする遺伝子から選択される１以上の遺伝子の発現が、野生型と比較して少なくとも約２倍アップレギュレートされる、請求項１から３の何れか１項に記載の細菌。
【請求項５】
ジヒドロキシアセトンリン酸転移酵素をコードする遺伝子の発現が、野生型と比較して少なくとも約２倍ダウンレギュレートされる、請求項１、２または４に記載の細菌。
【請求項６】
変異型細菌の全葉酸塩の量が、野生型菌株の前記量よりも少なくとも１０％高い、請求項１から５の何れか１項に記載の細菌。
【請求項７】
前記細菌が、ラクトバチルス・プランタラム、Ｌ．カセイ、Ｌ．ロイテリ、Ｌ．ファーメンタム、Ｌ．アシドフィラス、Ｌ．クリスパタス、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ジョンソニー、Ｌ．パラカセイ、Ｌ．ムリナス、Ｌ．ジェンセニー、Ｌ．サリバリアス、Ｌ．ミヌティス、Ｌ．ブレビス、Ｌ．ガリナラム、Ｌ．アミロボラス、ラクトコッカス・ラクティス、ストレプトコッカス・サーモフィリス、ロイコノストック・メセンテロイデス、Ｌｃ．ラクティス、ペディオコッカス・ダムノサス、Ｐ．アシディラクティシ、Ｐ．パルバラス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、Ｂ．ロンガム、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ブレベ、Ｂ．アドレッセンテ、Ｂ．アニマリス、Ｂ．ガリナラム、Ｂ．マグナム、およびＢ．サーモフィラムの種に属する、請求項１から６の何れか１項に記載の細菌。
【請求項８】
ラクトバチルス・プランタラムのＣＢＳ１１７１２０株。
【請求項９】
請求項１から８の何れか１項に記載の細菌を含む組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、食品組成物または食品サプリメント組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記食品組成物が発酵食品組成物である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞内葉酸塩レベルが増大しおよび全葉酸塩レベルが増大した細菌の選択のための、メトトレキセートの使用。
【請求項１３】
以下の工程を含む、細胞内および／または全葉酸塩レベルが増大した細菌を選択する方法：
（ａ）細菌を、メトトレキセートを含む培地上またはその中で増殖させる、ここにおいて、前記培地は葉酸塩依存性代謝産物が追加されていない；
（ｂ）増殖速度（μ）が少なくとも１時間当り０．１である細菌を選択する；
（ｃ）工程（ｂ）で選択した細菌の葉酸塩レベルを測定し、野生型株と比較して葉酸塩レベルが増大した細菌を選択する；
（ｅ）任意に、工程（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）を繰り返す。
【請求項１４】
前記培地が少なくとも１．２５ｍｇ／ｌのメトトレキセートを含み、および、前記細菌を前記培地上で少なくとも４０時間増殖させる、請求項１３に記載の方法。
【図１】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【公表番号】特表２００８−５３１０４３（Ｐ２００８−５３１０４３Ａ）
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５５７９５１（Ｐ２００７−５５７９５１）
【出願日】平成１８年３月１日（２００６．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５００４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９３４０８
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０５１５２４８０）シーエスエム・ネーデルランド・ビー．ブイ． (9)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２０年８月１４日（２００８．８．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月１日（２００６．３．１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＮＬ２００６／０５００４２
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０９３４０８
【国際公開日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（５０５１５２４８０）シーエスエム・ネーデルランド・ビー．ブイ． (9)
【Ｆターム（参考）】
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