子宮頸癌の予防及び治療のためのヒトパピローマウイルスポリペプチドと免疫増強剤を含む組成物
本発明は、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチド、これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質、これをコードするポリヌクレオチド及び上記ポリヌクレオチドを含むベクトルに関するものである。また、本発明は上記融合タンパク質または上記ベクトルを含む薬剤学的組成物及びこれらの薬剤学的組成物を用いて、個体で、上記ヒトパピローマウイルスによる疾患を治療する方法に関するものである。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒ1トパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチド；これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質；これをコードするポリヌクレオチド及び上記ポリヌクレオチドを含むベクトル；上記融合タンパク質または上記ベクトルを含む薬剤学的組成物；及び上記薬剤学的組成物を用いて、ヒトパピローマウイルスによる疾患を治療する方法；に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌（cervical cancer）は全世界的に年毎２５０，０００名の死亡の原因となっており、腫瘍による死亡原因の第２位になっている。子宮頸癌は大部分ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染によって発生すると知られている（非特許文献１）。１００種類のＨＰＶの中、ＨＰＶ１６が最も子宮頸癌の誘発と関係が高いものと知られている（非特許文献２）。ＨＰＶタンパク質の中でＥ６とＥ７タンパク質が子宮頸癌形成に主要な役割を果たし、またＨＰＶによって発病される腫瘍の約９９％で発現される主要タンパク質であることが知らされ、子宮頸癌治療及び予防ワクチンを製造するのに主要な目標物質となった（非特許文献３）。Ｅ６は腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の分解を誘導して細胞がアポトーシス（apoptosis）されることを防止し、Ｅ７は細胞性腫瘍抑制因子網膜母細胞種タンパク質（Ｒｂ）に結合し、これを不活性化させ、細胞が細胞周期のＳ期に入るようにする（非特許文献４）
【０００３】
子宮頸癌を治療するためにＨＰＶ１６ Ｅ６とＥ７タンパク質を同時に発現する核酸塩基配列を発現する組成物を用いて臨床実験を行ったが、治療効果が有意ではなかった（非特許文献５）。また、特許文献１はＥ６がアミノ末端またはカルボキシ末端にあるＥ６及びＥ７を含む融合ポリペプチド及びこれを暗号化するポリヌクレオチドに関して開示している。しかし、上記文献に開示されたポリペプチドは、依然としてＨＰＶによって引き起こされる子宮頸癌などの疾患を治療するのに限界がある。
【０００４】
そこで、本発明者らはＨＰＶのＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドに分泌ペプチド及び免疫増強ペプチドを結合した融合タンパク質が免疫反応を向上させ、ＨＰＶによって誘発される腫瘍の治療及び予防効果に効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３０６３６
【非特許文献１】zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78
【非特許文献２】Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964
【非特許文献３】von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834
【非特許文献４】Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5
【非特許文献５】Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一つの目的は、ＨＰＶによって引き起こされる疾患の治療及び予防効果に優れた融合タンパク質を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の目的は、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、上記ポリヌクレオチドを含む組換えベクトルを提供することにある。
本発明のさらに別の目的は上記融合タンパク質及び組換えベクトルを含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに別の目的は、上記薬剤学的組成物を用いる、個体でＨＰＶによって引き起こされる疾患を治療または予防する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一つの様態として、本発明はヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチド、これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質に関するものである。
【０００９】
本発明の融合ポリペプチドを構成するＥ６とＥ７は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６、１８、３１、３３、４５及び５１などから由来する抗原タンパク質であり、好ましくはヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）または１８（ＨＰＶ１８）から由来するＥ６及びＥ７抗原タンパク質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、“ヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチド”とは、Ｅ６とＥ７のそれぞれが天然型アミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはＥ６及びＥ７中の一つ以上が上記の天然型アミノ酸配列のアミノ酸変異体を有するポリペプチドが融合されたタンパク質である。本発明で使われた用語“変異体”とは、一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、保存的置換されるか、またはこれらの組合せによって天然アミノ酸配列と異なる配列を有するポリペプチドであり、天然型Ｅ６とＥ７ポリペプチドと実質的に同じ免疫原性を有し、自然的に発生するか、人為的に発生しうる。具体的な様態として、上記変異体は、ヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）のＥ６ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で６３位及び１０６位のシステインがグリシンで置換された配列番号４、ＨＰＶ１６のＥ７ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で２４の位システイン及び２６位のグルタミン酸がグリシンで置換された配列番号６、ＨＰＶ１８のＥ６ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で６５位及び１０8位のシステインがグリシンで置換された配列番号１０またはＨＰＶ１８のＥ７ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で２７位のシステイン及び２９位のグルタミン酸がグリシンで置換された配列番号１２がある。
【００１１】
本発明のヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチドは、Ｅ６がＥ７に対してアミノ末端にある、即ち、Ｅ６がＥ７の次ぎに存在する融合ポリペプチド形態（Ｅ７Ｅ６融合ポリペプチド）またはＥ６がＥ７に対してカルボキシ末端にある、即ち、Ｅ７がＥ６の次ぎに存在する融合ポリペプチド形態（Ｅ６Ｅ７融合ポリペプチド）であってもよい。具体的な様態として、配列番号８のＨＰＶ１６ Ｅ６Ｅ７融合ポリペプチドまたは配列番号１４のＨＰＶ１８ Ｅ６Ｅ７融合ポリペプチドがある。
【００１２】
本発明において、“シグナルペプチド”は、約２０〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり、細胞内で発現されたタンパク質、特にＥ６とＥ７融合ポリペプチドを含むタンパク質を細胞外へ分泌させるペプチドを意味する。また、これを暗号化している核酸配列を“分泌シグナル配列”という。本発明のＥ６及びＥ７抗原は、ウイルスに感染された細胞の核内で発現されるタンパク質（nucleus protein）であることから、自主的な免疫性が弱い。従って、分泌シグナル配列により発現されたシグナルペプチドがＥ６及びＥ７抗原の細胞外への分泌を誘導することによって、抗原特異的体液性免疫反応（humoral immune response）及び細胞性免疫反応（cellular immune response）の増加をもたらす。従って、本発明のシグナルペプチドはｔＰＡ、ＨＳＶ ｇＤｓ、成長ホルモンの分泌シグナル配列などが用いられるが、これに制限されるものではない。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使われるシグナルペプチドを使用することができ、より好ましくは、ｔＰＡ（tissue plasminogen activation）を使用することができる。
【００１３】
本発明において、“免疫増強ペプチド”とは免疫反応に関係する細胞（例えば、樹枝状細胞等）を活性化させて免疫反応を増加させるペプチドをいう。このような免疫増強ペプチドにはＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＯＸ４０などがある。本発明では、これらの免疫増強ペプチドを一つ以上選択して使用することができ、好ましくはそれぞれのペプチドを選択して使用することができる。本発明の具体的実施例では、ＣＤ４０リガンド及びＦｌｔ３リガンドをそれぞれ、または組み合わせて使用した。本発明の“Ｆｌｔ３リガンド”は、樹枝状細胞（ＤＣ）の増殖と成熟を誘導する因子であり、抗原による免疫反応を増加させて腫瘍抗原と融合された状態で優れた腫瘍減少効果を示す。本発明の“ＣＤ４０リガンド”は樹枝状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に位置したＣＤ４０と相互作用し、樹枝状細胞などを活性化させる。
【００１４】
本発明で、"個体”はヒト、サル、マウス、ブタ、ウシ及びウサギなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。
【００１５】
本発明の融合タンパク質は抗原特異的免疫反応及び腫瘍抑制効果に優れている。従来に、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７それぞれの抗原特異的免疫反応よりヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチドが、抗原特異的免疫反応に優れていることは知られている。しかし、これらのヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドにシグナルペプチド及び免疫増強ペプチドを結合した融合タンパク質の形態が、従来に期待し得た抗原特異的免疫反応及び腫瘍抑制効果に比べて、優れた効果があることを明らかにした。具体的な実施で、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドにシグナルペプチドとしてｔＰａ、免疫増強物質としてＦｌｔ３リガンド及び／又はＣＤ４０リガンドが融合された形態が、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７それぞれ、またはその融合ポリペプチドに比べて、抗原特異的免疫反応、腫瘍サイズ抑制及び腫瘍生成抑制において優れた効果を示した。これによって、本発明の融合タンパク質は腫瘍の治療及び予防のために利用できる。
【００１６】
他の一つの様態として、本発明は上記の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的合成法または遺伝子操作技術によって製造できる。化学的合成法は、当業者によく知られており、任意の方法を使用することができる。また、商業的核酸合成及びメーカーに依頼して購入することができる。遺伝子操作技術によって製造する場合、例えば、従来に知らされたＥ６及びＥ７の融合ポリペプチド、シグナルペプチド及び免疫増強ペプチドをコードする核酸断片をそれぞれ得て、これらの断片をフレームにフィットして連結することによって製作することができる。上記核酸断片を得る方法は、当業界によく知られ、当業者であれば適切な制限酵素を用いて容易に連結しうる。本発明の具体的実施例では、化学的合成法によって製造する方法が開示される。
【００１８】
他の一つの様態として、本発明は上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクトルに関するものである。
【００１９】
本発明において、“ベクトル”とは、ポリペプチドを暗号化するゲノム内に挿入された外部ＤＮＡを含む遺伝子構築物をいう。本発明と関連した発現ベクトルは、分泌シグナル配列、ヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコードする核酸配列、及び免疫増強ペプチドをコードする核酸配列などがゲノム内に挿入されたベクトルであり、これらのベクトルはプラスミドベクトル、コスミッドベクトル、バクテリオファージベクトル、酵母ベクトル、またはアデノウイルスベクトル、レトロウイルスベクトル、アデノ随伴ウイルスベクトルのようなウイルスベクトルが挙げられる。
【００２０】
本発明において、“分泌シグナル配列”とは細胞内で発現された腫瘍抗原を細胞外へ分泌し、免疫細胞が認識できるようにするペプチドを暗号化している核酸配列であり、例えば、ｔＰＡ、ＨＳＶ ｇＤｓ、成長ホルモンの分泌シグナル配列などが挙げられる。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使われる分泌シグナル配列を使用することができ、より好ましくは、ｔＰＡ（tissue plasminogen activation）を使用することができる。また本発明の分泌シグナル配列は、宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換して使用することができる。
【００２１】
本発明において、“免疫増強ペプチドをコードする核酸配列”とは免疫反応に関係する細胞（例えば、樹枝状細胞など）を活性化させて免疫反応を増加させるペプチドをコードする核酸配列をいう。上記免疫増強ペプチドには、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＯＸ４０などがあり、本発明では、これらの免疫増強ペプチドを一つ以上選択して使用することができ、好ましくはそれぞれのペプチドを選択して使用することができる。本発明の具体的実施では、ＣＤ４０リガンド及びＦｌｔ３リガンドをそれぞれ、または組み合わせて使用した。本発明の免疫増強ペプチドをコードする核酸配列は、また宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換して使用することができる。
【００２２】
本発明の組換えベクトルに含まれる上記のポリヌクレオチドは、宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換され得る。発明で使われた“宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換されたもの”または“コドン最適化”とは宿主細胞内でＤＮＡがタンパク質に転写及び翻訳（translation）される時、アミノ酸を指令するコドン間に宿主によって選好度の高いコドンが存在することになるが、これらの選好度の高いコドンで置換することで、その核酸が暗号化するアミノ酸またはタンパク質の発現効率を増加させることを意味する。ここで、“宿主細胞”とは原核または真核細胞を含み、真核細胞は真菌、酵母などを含む下等真核細胞だけでなく、哺乳動物などを含む高等真核細胞を含む。
【００２３】
本発明の組換えベクトルに含まれる上記ヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化の外に腫瘍原性を引き起こす性質をなくすために、Ｅ６及びＥ７をコードする核酸配列中の一部配列を置換しうる。
【００２４】
本発明のヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチドは、Ｅ６及びＥ７をそれぞれ発現させて免疫原（immunogen）として使用する場合より、Ｅ６及びＥ７を融合ポリペプチド形態に発現させて免疫原として使用する場合が、抗原特異的免疫反応をさらに效果的に誘導する。またＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換することが、置換しない場合より、抗原特異的免疫反応を效果的に誘導し、Ｅ６及びＥ７の一部核酸配列で腫瘍原性を削除されるための突然変異がある場合にも免疫反応を效果的に誘導しうる。
【００２５】
具体的様態として、これらのコドン最適化され、突然変異されたＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７、またはＨＰＶ１８ Ｅ６及びＥ７のポリペプチドを融合したＥ６及びＥ７融合ポリペプチドの核酸配列を配列番号７及び１３に示した。また、上記のＥ６とＥ７の融合ポリペプチドのほかに分泌シグナル配列によるシグナルペプチド及び免疫増強ペプチドを、共に発現させる場合がＥ６とＥ７の融合ポリペプチドを単独で発現する場合より、抗原特異的免疫反応、腫瘍の大きさ及び生成を抑制する効果に優れていた。
【００２６】
本発明の組換えベクトルは、宿主細胞で本発明の融合タンパク質をコードする核酸の発現に適した形態で上記融合タンパク質をコードする核酸を含むことができる。即ち、本発明の組換えベクトルは、発現に使われる宿主細胞に基づいて選択される、一つ以上の調節配列を含み、これらは発現されるべき核酸配列と作動可能に連結されている。“作動可能に連結されている”とは目的とするヌクレオチド配列が（例えば、インビトロ転写／翻訳システムで、または宿主細胞で）その発現がなされるようにする方式であり、上記調節配列に連結されているということを意味する。“調節配列”の用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の調節要素（例、ポリアデニル化シグナル）を含む意味である。調節配列には多くの宿主細胞で目的とする核酸が構成的に発現しうるように指示すること、及び特定の宿主細胞でのみ目的とする核酸が発現されるように指示すること（例、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクトルの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び所望のタンパク質発現の水準などのような因子によって変わることは当業者であれば、理解することができる。本発明の発現ベクトルは宿主細胞に導入され、上記融合タンパク質を発現することができる。
【００２７】
本発明のベクトルは例えば、標準組換えＤＮＡ技術によって製造でき、標準組換えＤＮＡ技術には例えば、平滑末端及び接着末端ライゲーション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、適しない結合を防止するためにアルカリホスファターゼ処理によるリン酸基除去及びＴ４ ＤＮＡリガーゼによる酵素的連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び免疫増強ペプチドをコードするＤＮＡを適切な調節配列が含まれているベクトルに組換えすることで、本発明のベクトルが製造できる。上記調節配列が含まれているベクトルは、商業的に購入または製造でき、本発明では大韓民国特許出願公開第２００３−４７６６７号に開示されたＤＮＡワクチン製造用ベクトルであるｐＧＸ１０を製造して使用した。
【００２８】
他の一つの具体的様態として、本発明はコドン最適化され、一部アミノ酸をコードする核酸が置換された配列番号７または配列番号１３のＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクトルに関するものである。
【００２９】
本発明の配列番号７または配列番号１３の核酸配列を含む組換えベクトルはさらに、分泌シグナル配列及び免疫増強ペプチドをコードするアミノ酸配列を含むことができる。上記の分泌シグナル配列はｔＰＡ、ＨＳＶ、ｇＤｓ、成長ホルモンの分泌シグナル配列などがあり、好ましくは哺乳動物などを含む高等真核細胞で使われる分泌シグナル配列を含み、より好ましくは、ｔＰａ（tissue plasminogen activation）を含む。上記の免疫増強ペプチドをコードする配列はＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＯＸ４０などをコードするアミノ酸配列を含み、これらの免疫増強ペプチドをコードする核酸配列を一つ以上選択して使用することができ、好ましくは、それぞれのペプチドを選択して使用することができる。本発明の具体的実施では、ＣＤ４０リガンド及びＦｌｔ３リガンドをそれぞれ、または組み合わせて使用した。上記の分泌シグナル配列及び免疫増強ペプチドをコードする核酸配列はまた宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換することが好ましい。具体的様態として、ｔＰａは配列番号１、Ｆｌｔ３リガンドは配列番号１５及びＣＤ４０リガンドは配列番号１７の核酸配列を有している。
【００３０】
他の一つの様態として、本発明の組換えベクトルは、本発明の融合タンパク質を生産するための細胞を製造する使用、遺伝子治療において遺伝子伝達のためのベクトルまたはそれ自体として個体内に投与される薬剤学的活性成分として用いられる。
【００３１】
他の一つの様態として、本発明は、また本発明の融合タンパク質及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び予防用薬剤学的組成物に関するものである。本発明において、個体はヒト、サル、マウスなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。また、上記ウイルスによって誘発される疾患は子宮頸癌、尖圭コンジローマ、イボなどが含まれる。
【００３２】
本発明の組成物に使用される薬剤学的に許容しうる担体には、ラクトース、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及びミネラル油などが含まれる。上記組成物には、さらに、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤及び防腐剤などが含まれていてもよい。
【００３３】
本発明の組成物は例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、経鼻内（intranasal）、気管内（intratracheal）または皮下投与のような、任意の手段によって個体内に直接的に投与できるが、これらの方法に限定されるものではない。本発明の組成物は、インビトロで培養された細胞に投与され、上記培養された細胞を体内に投与することで間接的に個体内に投与することができる。本発明の組成物は全身的にまたは局部的に投与できる。
【００３４】
本発明の組成物は、粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、または乾燥シロップ剤等の経口用製剤または注射剤等の非経口用製剤に製剤化することができるが、このような製剤に限定されるものではない。好ましくは本発明の組成物は液剤または注射剤の形態であってもよい。
【００３５】
活性成分として本発明の融合タンパク質の効果的な量は約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、単回投与及び数回に分けて投与することができる。しかし、投与される活性成分の量は、治療条件、患者の年齢及び体重、症状の軽重などの様々な因子を考慮し、決定するべきであるが、上記した範囲に限定されるものではない。
【００３６】
他の一つの様態として、本発明は、本発明の組換えベクトル及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び予防用組成物に関するものである。本発明において、個体はヒト、サル、マウスなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。また、上記ウイルスによって誘発される疾患は子宮頸癌、尖圭コンジローマ、イボなどが含まれる。
【００３７】
本発明の組成物に使われる薬剤学的に許容しうる担体にはラクトース、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及びミネラル油などが含まれる。上記組成物には、さらに、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤及び防腐剤などが含まれていてもよい。
【００３８】
本発明の組成物は例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、経鼻内（intranasal）、気管内（intratracheal）または皮下投与のような、任意の手段によって個体内に直接的に投与できるが、これらの方法に限定されるものではない、本発明の組成物はインビトロで培養された細胞に投与され、上記培養された細胞を体内に投与することで間接的に個体内に投与できる。本発明の組成物は全身的にまたは局部的に投与できる。
【００３９】
本発明の組成物は粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、または乾燥シロップ剤等の経口用製剤または注射剤等の非経口用製剤に製剤化することができるが、このような製剤に限定されるものではない。好ましくは本発明の組成物は液剤または注射剤の形態であってもよい。
【００４０】
活性成分として本発明のベクトルの効果的な量は約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、単回投与及び数回に分けて投与することができる。しかし、投与される活性成分の量は、治療条件、患者の年齢及び体重、症状の軽重などの様々な因子を考慮し、決定するべきであるが、上記した範囲に限定されるものではない。
【００４１】
他の一つの様態として、本発明は治療学的に効果的な量の本発明の薬剤学的組成物を個体に投与する工程を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患を治療する方法に関するものである。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物、その効能、投与方法及び投与量などに関する内容は、上記同様である。本発明の方法において、個体はヒト、サル、マウス、ブタ、ウシ及びウサギなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。
【００４３】
以下、実施例を通して本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明をさらに具体的に説明するだけのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＤＮＡの構築
本発明の実施例で使われた略語は次ぎの通り定義する。
“Ｃｏ”はコドン最適化された核酸配列、“ｔＰａ”または“ｔ”は組織プラスミノーゲン活性剤の分泌シグナル配列、“Ｆ”はＦｌｔ３リガンド、“Ｌ”はＣＤ４０リガンドを意味する。
配列番号１の核酸配列を有するコドン最適化されたｔＰａ分泌シグナル配列は化学的に合成した。末端にＥＣＯＲＩ−ＫｐｎＩ（５’）とＥｃｏ４７ＩＩＩ−ＮｈｅＩ（３’）サイトを添加した。配列番号７の核酸配列を有するコドン最適化されたＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７は化学的に合成しており、ベクトルに挿入しやすくするため末端に、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ−ＮｈｅＩ（５’）、ＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ（３'）サイトを添加した。Ｅ６とＥ７の接合部分にＢａｍＨＩサイトを添加した。腫瘍原性を引き起こす性質をなくすために、Ｅ６の６３位コドン（システイン）をグリシンに、１０６位コドン（システイン）を、グリシンを指令するコドンに変えており（配列番号３）、Ｅ７は２４位コドン（システイン）をグリシンに、２６にコドン（グルタミン）を、グリシンを指令するコドンに変えた（配列番号５）。ＤＮＡワクチン製造用ベクトルであるｐＧＸ１０（大韓民国特許出願公開第２００３−００４７６６７号）をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩ酵素（エンザイム）で処理した後、合成した分泌シグナル配列であるｔＰａをリガーゼ（ligase）で連結した、これを再度ＮｈｅＩとＸｈｏＩ酵素で切り裂いて合成したＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７をリガーゼで連結してｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏを製作した。
【００４５】
実施例２：ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７ＣｏＤＮＡの構築
配列番号１の核酸配列を有するコドン最適化されたｔＰａ分泌シグナル配列と配列番号１５の核酸配列を有するコドン最適化されたＦｌｔ３Ｌは連結された形態で化学的に合成した。ベクトルに挿入しやすくするために末端にＫｐｎＩ（５'）、ＥｃｏＲＶ（３'）サイトを添加した。実施例１で製造したｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏをＫｐｎＩとＥｃｏ４７ＩＩＩ酵素で処理し、分泌シグナル配列であるｔＰａのみを除去した後、ｔＦＣｏを、リガーゼで連結してｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏを製作した。
【００４６】
実施例３：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏＤＮＡの構築
配列番号１７の核酸配列を有するコドン最適化されたＣＤ４０Ｌ化学的に合成した。ベクトルに挿入しやすくするために末端にＡｓｃＩ（５'）、ＸｈｏＩ（３'）サイトを添加した。実施例１で製造したｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏをＡｓｃＩとＸｈｏＩ酵素で処理した後、ＣＤ４０ＬＣｏをリガーゼで連結してｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏを製作した。
【００４７】
実施例４：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌予防効果の確認
ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌予防効果を確認するために、マウスＣ５７ＢＬ／６に４週間隔で２度にわたって５０μgずつ筋肉注射しており、対照群としてｐＧＸ１０、ｐＧＸ１０．Ｅ６Ｃｏ、ｐＧＸ１０／Ｅ７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／Ｅ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／Ｅ６７を同じ投与量と間隔で筋肉注射した。最初筋肉注射した日より、６．５週後、マウスの脾臓を摘出し、３μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ抗体（BD Pharmingen, Sandiego, CA）５０μＬでコートされたプレートに、１×１０６細胞をＩＬ−２とＥ６またはＥ７ ＣＤ８ Ｔ細胞抗原決定基（epitope）（E648-57; EVYDFAFRDL, E749−57; RAHYNIVTF, Peptron, Korea.）を共に入れ、３７℃、５％ＣＯ２培養器（Forma, Minnesota, USA）で２４時間培養した。プレートをＰＢＳＴで洗浄後、垂れ下がったビオチンを有するＩＦＮ−γ探知（detecting）抗体（BD Pharmingen, Sandiego, CA）２μｇ／ｍＬを５０μＬずつ入れ、約３時間程度、常温で培養した。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＫＰ(アルカリ性リン酸）を１：２０００に希釈し、５０μＬずつ入れ、常温で１時間培養した。ＰＢＳＴで洗浄後、１０ｍＬのアルカリ性リン酸緩衝液当たり６６μＬのＮＢＴ（Promega, Madison, WT）と３３μＬのＢＣＩＰ（Promega, Madison, WT）の混合液の５０μＬを入れて反応させた。反応による色がよく現れるように、３７℃培養器で約３０分、放置した後、滅菌された水（distilled water, D.W）で洗浄し、生成された点の個数を読取機で読み取った（図１及び図２参照）。
【００４８】
Ｅ６ ＣＤ８ Ｔ細胞抗原決定基（epitope）とＥ７ ＣＤ８ Ｔ細胞抗原決定基を使用して、Ｅ６とＥ７に対する特異的Ｔ細胞免疫反応をＥＬＩＳＰＯＴで測定した結果、ｐＧＸ１０／Ｅ６７ＣｏはｐＧＸ１０／Ｅ６７より高い抗原特異的免疫反応が誘導されており、これはコドン最適化が抗原特異的免疫反応を増進させるのに効果的であることを示している。また、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏがｐＧＸ１０／Ｅ６７Ｃｏよりさらに高いＣＤ８ Ｔ細胞免疫反応を誘導することから、分泌シグナル配列であるｔＰａも抗原特異的免疫反応を向上させるのに効果的であることを確認した。ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの場合、Ｅ６特異的免疫反応の誘導はｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏに比べて、多少低く誘導されたが、他の対照群らに比べては、高く誘導されており、Ｅ７特異的反応は、ほぼ同じ水準で誘導され、免疫反応増進に効果的であることを確認した。ｐＧＸ１０／ｔＦＥ６７Ｃｏの場合は、Ｅ６及びＥ７特異的免疫反応の誘導において最も高い効果があることを確認した。
【００４９】
最初注射後、６．５週目にＨＰＶ１６ Ｅ６とＥ７を発現する腫瘍細胞であるＴＣ−１を個体当たり５×１０５細胞を皮下注射し、腫瘍細胞の体積増加を測定した（図３参考）。特に、Ｅ６とＥ７特異的な免疫反応で融合体であるＥ６７Ｃｏが、それぞれ、Ｅ６ＣｏとＥ７Ｃｏより免疫反応が低く誘導されたが（図１及び図２参照）、注入されたＴＣ−１腫瘍細胞については顕著に優れた抗癌予防効果を示した。これにより、抗癌効果において、腫瘍抗原であるＥ６とＥ７に対するそれぞれの強い免疫反応よりは、２抗原に対する免疫反応が同時に誘導され得るＥ６７融合体が、さらに優れていることが分かった。ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏを注射したマウスでは、腫瘍細胞を注射した後、２４日目まで腫瘍の生成がなく、他の対照群は腫瘍細胞を注射した後、９日目になる時点から腫瘍の体積が急激に増加することが観察された。従って、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏが子宮頸癌を予防する能力に優れていること確認することができた。
【００５０】
実施例５：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌治療効果の確認
ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌治療効果を確認するために、マウスＣ５７ＢＬ／６にＴＣ−１腫瘍細胞５×１０５細胞を皮下注射し、３日目、８日目になる日、５０μgの量で筋肉注射した。腫瘍細胞を注射した日から、２１日目になる日まで腫瘍細胞の体積変化を観察し、２２日目になる日、マウスの脾臓を摘出し、実施例４で説明した方法（ＥＬＩＳＰＯＴ）でＥ６及びＥ７に対する抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞免疫反応の誘導程度を測定した。対照群のｐＧＸ１０に比べて、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏで治療したマウスで、高い抗原特異的免疫反応が誘導され、特に、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏで治療したマウスでの免疫反応が最も高く測定され、抗癌免疫反応を誘導するのに卓越した効能があることを確認した（図４及び図５参照）。
【００５１】
ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏでＴＣ−１腫瘍細胞に対する免疫治療を行ったマウスでは、対照群のｐＧＸ１０を注入したマウスに比べて、顕著な腫瘍体積の減少を確認することができた。腫瘍細胞注射後、１２日目まで継続的な腫瘍体積の増加を示したが、１２日目以後では、体積が減少し始め、特に、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７ＣｏとｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏで免疫治療を行ったマウスでは、２１日目に腫瘍体積がほとんど消えていることを確認し、子宮頸癌に対する治療効果を確認した（図６参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルでｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏを発現するプラスミドＤＮＡを予防接種し、生成されるＥ７特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を、Ｍｏｃｋ、Ｅ６Ｃｏ、Ｅ７Ｃｏ、Ｅ６７及びＥ６７Ｃｏと比較して示したグラフである。
【図２】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルでｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏを予防接種後、生成されるＥ６特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を、Ｍｏｃｋ、Ｅ６Ｃｏ、Ｅ７Ｃｏ、Ｅ６７及びＥ６７Ｃｏと比較して示したグラフである。
【図３】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルでｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏを予防接種後、腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入し、その体積増減を比較して現れた抗癌予防効果を、Ｍｏｃｋ、Ｅ６Ｃｏ、Ｅ７Ｃｏ、Ｅ６７及びＥ６７Ｃｏと比較して示したグラフである。
【図４】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルで腫瘍細胞株であるＴＣ−１を移植した後、ｍｏｃｋ、ｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏの治療によって現れるＥ７特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を比較して示したグラフである。
【図５】抗癌治療モデルでマウスＣ５７ＢＬ／６に、腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、ｍｏｃｋ、ｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏの治療によって現れるＥ６特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を比較して示したグラフである。
【図６】治療モデルとしてのマウスＣ５７ＢＬ／６モデルで腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、ｍｏｃｋ、ｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏの治療によって現れる抗癌効果を比較して示したグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒ1トパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチド；これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質；これをコードするポリヌクレオチド及び上記ポリヌクレオチドを含むベクトル；上記融合タンパク質または上記ベクトルを含む薬剤学的組成物；及び上記薬剤学的組成物を用いて、ヒトパピローマウイルスによる疾患を治療する方法；に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸癌（cervical cancer）は全世界的に年毎２５０，０００名の死亡の原因となっており、腫瘍による死亡原因の第２位になっている。子宮頸癌は大部分ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の感染によって発生すると知られている（非特許文献１）。１００種類のＨＰＶの中、ＨＰＶ１６が最も子宮頸癌の誘発と関係が高いものと知られている（非特許文献２）。ＨＰＶタンパク質の中でＥ６とＥ７タンパク質が子宮頸癌形成に主要な役割を果たし、またＨＰＶによって発病される腫瘍の約９９％で発現される主要タンパク質であることが知らされ、子宮頸癌治療及び予防ワクチンを製造するのに主要な目標物質となった（非特許文献３）。Ｅ６は腫瘍抑制タンパク質ｐ５３の分解を誘導して細胞がアポトーシス（apoptosis）されることを防止し、Ｅ７は細胞性腫瘍抑制因子網膜母細胞種タンパク質（Ｒｂ）に結合し、これを不活性化させ、細胞が細胞周期のＳ期に入るようにする（非特許文献４）
【０００３】
子宮頸癌を治療するためにＨＰＶ１６ Ｅ６とＥ７タンパク質を同時に発現する核酸塩基配列を発現する組成物を用いて臨床実験を行ったが、治療効果が有意ではなかった（非特許文献５）。また、特許文献１はＥ６がアミノ末端またはカルボキシ末端にあるＥ６及びＥ７を含む融合ポリペプチド及びこれを暗号化するポリヌクレオチドに関して開示している。しかし、上記文献に開示されたポリペプチドは、依然としてＨＰＶによって引き起こされる子宮頸癌などの疾患を治療するのに限界がある。
【０００４】
そこで、本発明者らはＨＰＶのＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドに分泌ペプチド及び免疫増強ペプチドを結合した融合タンパク質が免疫反応を向上させ、ＨＰＶによって誘発される腫瘍の治療及び予防効果に効果があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【特許文献１】ＷＯ２００４／０３０６３６
【非特許文献１】zur Hausen, H et al. Biochem Biophys Acta 1996, 1288; F55-F78
【非特許文献２】Mark H et al. J Natl Cancer Inst 1993, 85; 958-964
【非特許文献３】von Knebel Doeberitz et al. Int. J. Cancer 1992, 51; 831-834
【非特許文献４】Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992, 17:312-5
【非特許文献５】Garcia F et al. Obstet Gynecol 2004, 103; 317-326
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の一つの目的は、ＨＰＶによって引き起こされる疾患の治療及び予防効果に優れた融合タンパク質を提供することにある。
【０００６】
本発明の別の目的は、上記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
本発明のさらに別の目的は、上記ポリヌクレオチドを含む組換えベクトルを提供することにある。
本発明のさらに別の目的は上記融合タンパク質及び組換えベクトルを含む薬剤学的組成物を提供することにある。
【０００７】
本発明のさらに別の目的は、上記薬剤学的組成物を用いる、個体でＨＰＶによって引き起こされる疾患を治療または予防する方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一つの様態として、本発明はヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチド、これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質に関するものである。
【０００９】
本発明の融合ポリペプチドを構成するＥ６とＥ７は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タイプ１６、１８、３１、３３、４５及び５１などから由来する抗原タンパク質であり、好ましくはヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）または１８（ＨＰＶ１８）から由来するＥ６及びＥ７抗原タンパク質である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明において、“ヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチド”とは、Ｅ６とＥ７のそれぞれが天然型アミノ酸配列を有するポリペプチドであるか、またはＥ６及びＥ７中の一つ以上が上記の天然型アミノ酸配列のアミノ酸変異体を有するポリペプチドが融合されたタンパク質である。本発明で使われた用語“変異体”とは、一つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、保存的置換されるか、またはこれらの組合せによって天然アミノ酸配列と異なる配列を有するポリペプチドであり、天然型Ｅ６とＥ７ポリペプチドと実質的に同じ免疫原性を有し、自然的に発生するか、人為的に発生しうる。具体的な様態として、上記変異体は、ヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）のＥ６ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で６３位及び１０６位のシステインがグリシンで置換された配列番号４、ＨＰＶ１６のＥ７ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で２４の位システイン及び２６位のグルタミン酸がグリシンで置換された配列番号６、ＨＰＶ１８のＥ６ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で６５位及び１０8位のシステインがグリシンで置換された配列番号１０またはＨＰＶ１８のＥ７ポリペプチドをコードするアミノ酸配列で２７位のシステイン及び２９位のグルタミン酸がグリシンで置換された配列番号１２がある。
【００１１】
本発明のヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチドは、Ｅ６がＥ７に対してアミノ末端にある、即ち、Ｅ６がＥ７の次ぎに存在する融合ポリペプチド形態（Ｅ７Ｅ６融合ポリペプチド）またはＥ６がＥ７に対してカルボキシ末端にある、即ち、Ｅ７がＥ６の次ぎに存在する融合ポリペプチド形態（Ｅ６Ｅ７融合ポリペプチド）であってもよい。具体的な様態として、配列番号８のＨＰＶ１６ Ｅ６Ｅ７融合ポリペプチドまたは配列番号１４のＨＰＶ１８ Ｅ６Ｅ７融合ポリペプチドがある。
【００１２】
本発明において、“シグナルペプチド”は、約２０〜３０個のアミノ酸を含むペプチドであり、細胞内で発現されたタンパク質、特にＥ６とＥ７融合ポリペプチドを含むタンパク質を細胞外へ分泌させるペプチドを意味する。また、これを暗号化している核酸配列を“分泌シグナル配列”という。本発明のＥ６及びＥ７抗原は、ウイルスに感染された細胞の核内で発現されるタンパク質（nucleus protein）であることから、自主的な免疫性が弱い。従って、分泌シグナル配列により発現されたシグナルペプチドがＥ６及びＥ７抗原の細胞外への分泌を誘導することによって、抗原特異的体液性免疫反応（humoral immune response）及び細胞性免疫反応（cellular immune response）の増加をもたらす。従って、本発明のシグナルペプチドはｔＰＡ、ＨＳＶ ｇＤｓ、成長ホルモンの分泌シグナル配列などが用いられるが、これに制限されるものではない。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使われるシグナルペプチドを使用することができ、より好ましくは、ｔＰＡ（tissue plasminogen activation）を使用することができる。
【００１３】
本発明において、“免疫増強ペプチド”とは免疫反応に関係する細胞（例えば、樹枝状細胞等）を活性化させて免疫反応を増加させるペプチドをいう。このような免疫増強ペプチドにはＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＯＸ４０などがある。本発明では、これらの免疫増強ペプチドを一つ以上選択して使用することができ、好ましくはそれぞれのペプチドを選択して使用することができる。本発明の具体的実施例では、ＣＤ４０リガンド及びＦｌｔ３リガンドをそれぞれ、または組み合わせて使用した。本発明の“Ｆｌｔ３リガンド”は、樹枝状細胞（ＤＣ）の増殖と成熟を誘導する因子であり、抗原による免疫反応を増加させて腫瘍抗原と融合された状態で優れた腫瘍減少効果を示す。本発明の“ＣＤ４０リガンド”は樹枝状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に位置したＣＤ４０と相互作用し、樹枝状細胞などを活性化させる。
【００１４】
本発明で、"個体”はヒト、サル、マウス、ブタ、ウシ及びウサギなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。
【００１５】
本発明の融合タンパク質は抗原特異的免疫反応及び腫瘍抑制効果に優れている。従来に、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７それぞれの抗原特異的免疫反応よりヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチドが、抗原特異的免疫反応に優れていることは知られている。しかし、これらのヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドにシグナルペプチド及び免疫増強ペプチドを結合した融合タンパク質の形態が、従来に期待し得た抗原特異的免疫反応及び腫瘍抑制効果に比べて、優れた効果があることを明らかにした。具体的な実施で、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドにシグナルペプチドとしてｔＰａ、免疫増強物質としてＦｌｔ３リガンド及び／又はＣＤ４０リガンドが融合された形態が、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７それぞれ、またはその融合ポリペプチドに比べて、抗原特異的免疫反応、腫瘍サイズ抑制及び腫瘍生成抑制において優れた効果を示した。これによって、本発明の融合タンパク質は腫瘍の治療及び予防のために利用できる。
【００１６】
他の一つの様態として、本発明は上記の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【００１７】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的合成法または遺伝子操作技術によって製造できる。化学的合成法は、当業者によく知られており、任意の方法を使用することができる。また、商業的核酸合成及びメーカーに依頼して購入することができる。遺伝子操作技術によって製造する場合、例えば、従来に知らされたＥ６及びＥ７の融合ポリペプチド、シグナルペプチド及び免疫増強ペプチドをコードする核酸断片をそれぞれ得て、これらの断片をフレームにフィットして連結することによって製作することができる。上記核酸断片を得る方法は、当業界によく知られ、当業者であれば適切な制限酵素を用いて容易に連結しうる。本発明の具体的実施例では、化学的合成法によって製造する方法が開示される。
【００１８】
他の一つの様態として、本発明は上記のポリヌクレオチドを含む組換えベクトルに関するものである。
【００１９】
本発明において、“ベクトル”とは、ポリペプチドを暗号化するゲノム内に挿入された外部ＤＮＡを含む遺伝子構築物をいう。本発明と関連した発現ベクトルは、分泌シグナル配列、ヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコードする核酸配列、及び免疫増強ペプチドをコードする核酸配列などがゲノム内に挿入されたベクトルであり、これらのベクトルはプラスミドベクトル、コスミッドベクトル、バクテリオファージベクトル、酵母ベクトル、またはアデノウイルスベクトル、レトロウイルスベクトル、アデノ随伴ウイルスベクトルのようなウイルスベクトルが挙げられる。
【００２０】
本発明において、“分泌シグナル配列”とは細胞内で発現された腫瘍抗原を細胞外へ分泌し、免疫細胞が認識できるようにするペプチドを暗号化している核酸配列であり、例えば、ｔＰＡ、ＨＳＶ ｇＤｓ、成長ホルモンの分泌シグナル配列などが挙げられる。好ましくは、哺乳動物などを含む高等真核細胞で使われる分泌シグナル配列を使用することができ、より好ましくは、ｔＰＡ（tissue plasminogen activation）を使用することができる。また本発明の分泌シグナル配列は、宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換して使用することができる。
【００２１】
本発明において、“免疫増強ペプチドをコードする核酸配列”とは免疫反応に関係する細胞（例えば、樹枝状細胞など）を活性化させて免疫反応を増加させるペプチドをコードする核酸配列をいう。上記免疫増強ペプチドには、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＯＸ４０などがあり、本発明では、これらの免疫増強ペプチドを一つ以上選択して使用することができ、好ましくはそれぞれのペプチドを選択して使用することができる。本発明の具体的実施では、ＣＤ４０リガンド及びＦｌｔ３リガンドをそれぞれ、または組み合わせて使用した。本発明の免疫増強ペプチドをコードする核酸配列は、また宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換して使用することができる。
【００２２】
本発明の組換えベクトルに含まれる上記のポリヌクレオチドは、宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換され得る。発明で使われた“宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換されたもの”または“コドン最適化”とは宿主細胞内でＤＮＡがタンパク質に転写及び翻訳（translation）される時、アミノ酸を指令するコドン間に宿主によって選好度の高いコドンが存在することになるが、これらの選好度の高いコドンで置換することで、その核酸が暗号化するアミノ酸またはタンパク質の発現効率を増加させることを意味する。ここで、“宿主細胞”とは原核または真核細胞を含み、真核細胞は真菌、酵母などを含む下等真核細胞だけでなく、哺乳動物などを含む高等真核細胞を含む。
【００２３】
本発明の組換えベクトルに含まれる上記ヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化の外に腫瘍原性を引き起こす性質をなくすために、Ｅ６及びＥ７をコードする核酸配列中の一部配列を置換しうる。
【００２４】
本発明のヒトパピローマウイルスＥ６とＥ７の融合ポリペプチドは、Ｅ６及びＥ７をそれぞれ発現させて免疫原（immunogen）として使用する場合より、Ｅ６及びＥ７を融合ポリペプチド形態に発現させて免疫原として使用する場合が、抗原特異的免疫反応をさらに效果的に誘導する。またＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードする核酸配列を宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換することが、置換しない場合より、抗原特異的免疫反応を效果的に誘導し、Ｅ６及びＥ７の一部核酸配列で腫瘍原性を削除されるための突然変異がある場合にも免疫反応を效果的に誘導しうる。
【００２５】
具体的様態として、これらのコドン最適化され、突然変異されたＨＰＶ１６ Ｅ６及びＥ７、またはＨＰＶ１８ Ｅ６及びＥ７のポリペプチドを融合したＥ６及びＥ７融合ポリペプチドの核酸配列を配列番号７及び１３に示した。また、上記のＥ６とＥ７の融合ポリペプチドのほかに分泌シグナル配列によるシグナルペプチド及び免疫増強ペプチドを、共に発現させる場合がＥ６とＥ７の融合ポリペプチドを単独で発現する場合より、抗原特異的免疫反応、腫瘍の大きさ及び生成を抑制する効果に優れていた。
【００２６】
本発明の組換えベクトルは、宿主細胞で本発明の融合タンパク質をコードする核酸の発現に適した形態で上記融合タンパク質をコードする核酸を含むことができる。即ち、本発明の組換えベクトルは、発現に使われる宿主細胞に基づいて選択される、一つ以上の調節配列を含み、これらは発現されるべき核酸配列と作動可能に連結されている。“作動可能に連結されている”とは目的とするヌクレオチド配列が（例えば、インビトロ転写／翻訳システムで、または宿主細胞で）その発現がなされるようにする方式であり、上記調節配列に連結されているということを意味する。“調節配列”の用語は、プロモーター、エンハンサー及び他の調節要素（例、ポリアデニル化シグナル）を含む意味である。調節配列には多くの宿主細胞で目的とする核酸が構成的に発現しうるように指示すること、及び特定の宿主細胞でのみ目的とする核酸が発現されるように指示すること（例、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクトルの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び所望のタンパク質発現の水準などのような因子によって変わることは当業者であれば、理解することができる。本発明の発現ベクトルは宿主細胞に導入され、上記融合タンパク質を発現することができる。
【００２７】
本発明のベクトルは例えば、標準組換えＤＮＡ技術によって製造でき、標準組換えＤＮＡ技術には例えば、平滑末端及び接着末端ライゲーション、適切な末端を提供するための制限酵素処理、適しない結合を防止するためにアルカリホスファターゼ処理によるリン酸基除去及びＴ４ ＤＮＡリガーゼによる酵素的連結などが含まれる。化学的合成または遺伝子組換え技術によって得られたシグナルペプチドをコードするＤＮＡ、ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び免疫増強ペプチドをコードするＤＮＡを適切な調節配列が含まれているベクトルに組換えすることで、本発明のベクトルが製造できる。上記調節配列が含まれているベクトルは、商業的に購入または製造でき、本発明では大韓民国特許出願公開第２００３−４７６６７号に開示されたＤＮＡワクチン製造用ベクトルであるｐＧＸ１０を製造して使用した。
【００２８】
他の一つの具体的様態として、本発明はコドン最適化され、一部アミノ酸をコードする核酸が置換された配列番号７または配列番号１３のＥ６とＥ７融合ポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換えベクトルに関するものである。
【００２９】
本発明の配列番号７または配列番号１３の核酸配列を含む組換えベクトルはさらに、分泌シグナル配列及び免疫増強ペプチドをコードするアミノ酸配列を含むことができる。上記の分泌シグナル配列はｔＰＡ、ＨＳＶ、ｇＤｓ、成長ホルモンの分泌シグナル配列などがあり、好ましくは哺乳動物などを含む高等真核細胞で使われる分泌シグナル配列を含み、より好ましくは、ｔＰａ（tissue plasminogen activation）を含む。上記の免疫増強ペプチドをコードする配列はＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリン、ＯＸ４０などをコードするアミノ酸配列を含み、これらの免疫増強ペプチドをコードする核酸配列を一つ以上選択して使用することができ、好ましくは、それぞれのペプチドを選択して使用することができる。本発明の具体的実施では、ＣＤ４０リガンド及びＦｌｔ３リガンドをそれぞれ、または組み合わせて使用した。上記の分泌シグナル配列及び免疫増強ペプチドをコードする核酸配列はまた宿主細胞で発現頻度の高いコドンで置換することが好ましい。具体的様態として、ｔＰａは配列番号１、Ｆｌｔ３リガンドは配列番号１５及びＣＤ４０リガンドは配列番号１７の核酸配列を有している。
【００３０】
他の一つの様態として、本発明の組換えベクトルは、本発明の融合タンパク質を生産するための細胞を製造する使用、遺伝子治療において遺伝子伝達のためのベクトルまたはそれ自体として個体内に投与される薬剤学的活性成分として用いられる。
【００３１】
他の一つの様態として、本発明は、また本発明の融合タンパク質及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び予防用薬剤学的組成物に関するものである。本発明において、個体はヒト、サル、マウスなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。また、上記ウイルスによって誘発される疾患は子宮頸癌、尖圭コンジローマ、イボなどが含まれる。
【００３２】
本発明の組成物に使用される薬剤学的に許容しうる担体には、ラクトース、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及びミネラル油などが含まれる。上記組成物には、さらに、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤及び防腐剤などが含まれていてもよい。
【００３３】
本発明の組成物は例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、経鼻内（intranasal）、気管内（intratracheal）または皮下投与のような、任意の手段によって個体内に直接的に投与できるが、これらの方法に限定されるものではない。本発明の組成物は、インビトロで培養された細胞に投与され、上記培養された細胞を体内に投与することで間接的に個体内に投与することができる。本発明の組成物は全身的にまたは局部的に投与できる。
【００３４】
本発明の組成物は、粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、または乾燥シロップ剤等の経口用製剤または注射剤等の非経口用製剤に製剤化することができるが、このような製剤に限定されるものではない。好ましくは本発明の組成物は液剤または注射剤の形態であってもよい。
【００３５】
活性成分として本発明の融合タンパク質の効果的な量は約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、単回投与及び数回に分けて投与することができる。しかし、投与される活性成分の量は、治療条件、患者の年齢及び体重、症状の軽重などの様々な因子を考慮し、決定するべきであるが、上記した範囲に限定されるものではない。
【００３６】
他の一つの様態として、本発明は、本発明の組換えベクトル及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療及び予防用組成物に関するものである。本発明において、個体はヒト、サル、マウスなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。また、上記ウイルスによって誘発される疾患は子宮頸癌、尖圭コンジローマ、イボなどが含まれる。
【００３７】
本発明の組成物に使われる薬剤学的に許容しうる担体にはラクトース、ブドウ糖、蔗糖、ソルビトール、マンニトール、でんぷん、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微細結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾアート、プロピルヒドロキシベンゾアート、タルク、マグネシウムステアレート及びミネラル油などが含まれる。上記組成物には、さらに、潤滑剤、湿潤剤、風味剤、乳化剤及び防腐剤などが含まれていてもよい。
【００３８】
本発明の組成物は例えば、静脈内、筋肉内、経口、経皮、粘膜、経鼻内（intranasal）、気管内（intratracheal）または皮下投与のような、任意の手段によって個体内に直接的に投与できるが、これらの方法に限定されるものではない、本発明の組成物はインビトロで培養された細胞に投与され、上記培養された細胞を体内に投与することで間接的に個体内に投与できる。本発明の組成物は全身的にまたは局部的に投与できる。
【００３９】
本発明の組成物は粒剤、散剤、液剤、錠剤、カプセル剤、または乾燥シロップ剤等の経口用製剤または注射剤等の非経口用製剤に製剤化することができるが、このような製剤に限定されるものではない。好ましくは本発明の組成物は液剤または注射剤の形態であってもよい。
【００４０】
活性成分として本発明のベクトルの効果的な量は約０．０５〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、単回投与及び数回に分けて投与することができる。しかし、投与される活性成分の量は、治療条件、患者の年齢及び体重、症状の軽重などの様々な因子を考慮し、決定するべきであるが、上記した範囲に限定されるものではない。
【００４１】
他の一つの様態として、本発明は治療学的に効果的な量の本発明の薬剤学的組成物を個体に投与する工程を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患を治療する方法に関するものである。
【００４２】
本発明の薬剤学的組成物、その効能、投与方法及び投与量などに関する内容は、上記同様である。本発明の方法において、個体はヒト、サル、マウス、ブタ、ウシ及びウサギなどの哺乳動物を含むが、これらの例に限定されるものではない。
【００４３】
以下、実施例を通して本発明をさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明をさらに具体的に説明するだけのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＤＮＡの構築
本発明の実施例で使われた略語は次ぎの通り定義する。
“Ｃｏ”はコドン最適化された核酸配列、“ｔＰａ”または“ｔ”は組織プラスミノーゲン活性剤の分泌シグナル配列、“Ｆ”はＦｌｔ３リガンド、“Ｌ”はＣＤ４０リガンドを意味する。
配列番号１の核酸配列を有するコドン最適化されたｔＰａ分泌シグナル配列は化学的に合成した。末端にＥＣＯＲＩ−ＫｐｎＩ（５’）とＥｃｏ４７ＩＩＩ−ＮｈｅＩ（３’）サイトを添加した。配列番号７の核酸配列を有するコドン最適化されたＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７は化学的に合成しており、ベクトルに挿入しやすくするため末端に、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ−ＮｈｅＩ（５’）、ＡｓｃＩ−ＸｈｏＩ（３'）サイトを添加した。Ｅ６とＥ７の接合部分にＢａｍＨＩサイトを添加した。腫瘍原性を引き起こす性質をなくすために、Ｅ６の６３位コドン（システイン）をグリシンに、１０６位コドン（システイン）を、グリシンを指令するコドンに変えており（配列番号３）、Ｅ７は２４位コドン（システイン）をグリシンに、２６にコドン（グルタミン）を、グリシンを指令するコドンに変えた（配列番号５）。ＤＮＡワクチン製造用ベクトルであるｐＧＸ１０（大韓民国特許出願公開第２００３−００４７６６７号）をＥｃｏＲＩとＮｈｅＩ酵素（エンザイム）で処理した後、合成した分泌シグナル配列であるｔＰａをリガーゼ（ligase）で連結した、これを再度ＮｈｅＩとＸｈｏＩ酵素で切り裂いて合成したＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７をリガーゼで連結してｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏを製作した。
【００４５】
実施例２：ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７ＣｏＤＮＡの構築
配列番号１の核酸配列を有するコドン最適化されたｔＰａ分泌シグナル配列と配列番号１５の核酸配列を有するコドン最適化されたＦｌｔ３Ｌは連結された形態で化学的に合成した。ベクトルに挿入しやすくするために末端にＫｐｎＩ（５'）、ＥｃｏＲＶ（３'）サイトを添加した。実施例１で製造したｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏをＫｐｎＩとＥｃｏ４７ＩＩＩ酵素で処理し、分泌シグナル配列であるｔＰａのみを除去した後、ｔＦＣｏを、リガーゼで連結してｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏを製作した。
【００４６】
実施例３：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏＤＮＡの構築
配列番号１７の核酸配列を有するコドン最適化されたＣＤ４０Ｌ化学的に合成した。ベクトルに挿入しやすくするために末端にＡｓｃＩ（５'）、ＸｈｏＩ（３'）サイトを添加した。実施例１で製造したｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏをＡｓｃＩとＸｈｏＩ酵素で処理した後、ＣＤ４０ＬＣｏをリガーゼで連結してｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏを製作した。
【００４７】
実施例４：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌予防効果の確認
ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌予防効果を確認するために、マウスＣ５７ＢＬ／６に４週間隔で２度にわたって５０μgずつ筋肉注射しており、対照群としてｐＧＸ１０、ｐＧＸ１０．Ｅ６Ｃｏ、ｐＧＸ１０／Ｅ７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／Ｅ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／Ｅ６７を同じ投与量と間隔で筋肉注射した。最初筋肉注射した日より、６．５週後、マウスの脾臓を摘出し、３μｇ／ｍＬのａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩＦＮ−γ抗体（BD Pharmingen, Sandiego, CA）５０μＬでコートされたプレートに、１×１０６細胞をＩＬ−２とＥ６またはＥ７ ＣＤ８ Ｔ細胞抗原決定基（epitope）（E648-57; EVYDFAFRDL, E749−57; RAHYNIVTF, Peptron, Korea.）を共に入れ、３７℃、５％ＣＯ２培養器（Forma, Minnesota, USA）で２４時間培養した。プレートをＰＢＳＴで洗浄後、垂れ下がったビオチンを有するＩＦＮ−γ探知（detecting）抗体（BD Pharmingen, Sandiego, CA）２μｇ／ｍＬを５０μＬずつ入れ、約３時間程度、常温で培養した。その後、ＰＢＳＴで洗浄し、ストレプトアビジン−ＡＫＰ(アルカリ性リン酸）を１：２０００に希釈し、５０μＬずつ入れ、常温で１時間培養した。ＰＢＳＴで洗浄後、１０ｍＬのアルカリ性リン酸緩衝液当たり６６μＬのＮＢＴ（Promega, Madison, WT）と３３μＬのＢＣＩＰ（Promega, Madison, WT）の混合液の５０μＬを入れて反応させた。反応による色がよく現れるように、３７℃培養器で約３０分、放置した後、滅菌された水（distilled water, D.W）で洗浄し、生成された点の個数を読取機で読み取った（図１及び図２参照）。
【００４８】
Ｅ６ ＣＤ８ Ｔ細胞抗原決定基（epitope）とＥ７ ＣＤ８ Ｔ細胞抗原決定基を使用して、Ｅ６とＥ７に対する特異的Ｔ細胞免疫反応をＥＬＩＳＰＯＴで測定した結果、ｐＧＸ１０／Ｅ６７ＣｏはｐＧＸ１０／Ｅ６７より高い抗原特異的免疫反応が誘導されており、これはコドン最適化が抗原特異的免疫反応を増進させるのに効果的であることを示している。また、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏがｐＧＸ１０／Ｅ６７Ｃｏよりさらに高いＣＤ８ Ｔ細胞免疫反応を誘導することから、分泌シグナル配列であるｔＰａも抗原特異的免疫反応を向上させるのに効果的であることを確認した。ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの場合、Ｅ６特異的免疫反応の誘導はｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏに比べて、多少低く誘導されたが、他の対照群らに比べては、高く誘導されており、Ｅ７特異的反応は、ほぼ同じ水準で誘導され、免疫反応増進に効果的であることを確認した。ｐＧＸ１０／ｔＦＥ６７Ｃｏの場合は、Ｅ６及びＥ７特異的免疫反応の誘導において最も高い効果があることを確認した。
【００４９】
最初注射後、６．５週目にＨＰＶ１６ Ｅ６とＥ７を発現する腫瘍細胞であるＴＣ−１を個体当たり５×１０５細胞を皮下注射し、腫瘍細胞の体積増加を測定した（図３参考）。特に、Ｅ６とＥ７特異的な免疫反応で融合体であるＥ６７Ｃｏが、それぞれ、Ｅ６ＣｏとＥ７Ｃｏより免疫反応が低く誘導されたが（図１及び図２参照）、注入されたＴＣ−１腫瘍細胞については顕著に優れた抗癌予防効果を示した。これにより、抗癌効果において、腫瘍抗原であるＥ６とＥ７に対するそれぞれの強い免疫反応よりは、２抗原に対する免疫反応が同時に誘導され得るＥ６７融合体が、さらに優れていることが分かった。ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏを注射したマウスでは、腫瘍細胞を注射した後、２４日目まで腫瘍の生成がなく、他の対照群は腫瘍細胞を注射した後、９日目になる時点から腫瘍の体積が急激に増加することが観察された。従って、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏが子宮頸癌を予防する能力に優れていること確認することができた。
【００５０】
実施例５：ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌治療効果の確認
ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏの子宮頸癌治療効果を確認するために、マウスＣ５７ＢＬ／６にＴＣ−１腫瘍細胞５×１０５細胞を皮下注射し、３日目、８日目になる日、５０μgの量で筋肉注射した。腫瘍細胞を注射した日から、２１日目になる日まで腫瘍細胞の体積変化を観察し、２２日目になる日、マウスの脾臓を摘出し、実施例４で説明した方法（ＥＬＩＳＰＯＴ）でＥ６及びＥ７に対する抗原特異的ＣＤ８ Ｔ細胞免疫反応の誘導程度を測定した。対照群のｐＧＸ１０に比べて、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏで治療したマウスで、高い抗原特異的免疫反応が誘導され、特に、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏで治療したマウスでの免疫反応が最も高く測定され、抗癌免疫反応を誘導するのに卓越した効能があることを確認した（図４及び図５参照）。
【００５１】
ｐＧＸ１０／ｔＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ、ｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏでＴＣ−１腫瘍細胞に対する免疫治療を行ったマウスでは、対照群のｐＧＸ１０を注入したマウスに比べて、顕著な腫瘍体積の減少を確認することができた。腫瘍細胞注射後、１２日目まで継続的な腫瘍体積の増加を示したが、１２日目以後では、体積が減少し始め、特に、ｐＧＸ１０／ｔＦＣｏＥ６７ＣｏとｐＧＸ１０／ｔＥ６７ＣｏＬＣｏで免疫治療を行ったマウスでは、２１日目に腫瘍体積がほとんど消えていることを確認し、子宮頸癌に対する治療効果を確認した（図６参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルでｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏを発現するプラスミドＤＮＡを予防接種し、生成されるＥ７特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を、Ｍｏｃｋ、Ｅ６Ｃｏ、Ｅ７Ｃｏ、Ｅ６７及びＥ６７Ｃｏと比較して示したグラフである。
【図２】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルでｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏを予防接種後、生成されるＥ６特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を、Ｍｏｃｋ、Ｅ６Ｃｏ、Ｅ７Ｃｏ、Ｅ６７及びＥ６７Ｃｏと比較して示したグラフである。
【図３】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルでｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏを予防接種後、腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入し、その体積増減を比較して現れた抗癌予防効果を、Ｍｏｃｋ、Ｅ６Ｃｏ、Ｅ７Ｃｏ、Ｅ６７及びＥ６７Ｃｏと比較して示したグラフである。
【図４】マウスＣ５７ＢＬ／６モデルで腫瘍細胞株であるＴＣ−１を移植した後、ｍｏｃｋ、ｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏの治療によって現れるＥ７特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を比較して示したグラフである。
【図５】抗癌治療モデルでマウスＣ５７ＢＬ／６に、腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、ｍｏｃｋ、ｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏの治療によって現れるＥ６特異的ＣＤ８＋ｔ細胞反応を比較して示したグラフである。
【図６】治療モデルとしてのマウスＣ５７ＢＬ／６モデルで腫瘍細胞株であるＴＣ−１を皮下注入した後、ｍｏｃｋ、ｔＥ６７Ｃｏ、ｔＦＣｏＥ６７Ｃｏ及びｔＥ６７ＣｏＬＣｏの治療によって現れる抗癌効果を比較して示したグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチド、これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、ヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）または１８（ＨＰＶ１８）から由来されたものである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号８に示される請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号１４に示される融合タンパク質。
【請求項５】
シグナルペプチドがｔＰａ、ＨＳＶ ｇＤｓまたは成長ホルモン分泌シグナルペプチドである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ｔＰａが、配列番号２に示される請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
免疫増強ペプチドがＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリンまたはＯＸ４０である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｆｌｔ３リガンドが、配列番号１６に示される請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤ４０リガンドが、配列番号１８に示される請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードする配列が、ヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）または１８（ＨＰＶ１８）から由来されたものである請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードする配列が、遺伝子の発現率を高めるために哺乳類に最適化されたコドンで改変されたものである請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を有するものである請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号１４のアミノ酸配列を有するものである請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
シグナルペプチドが、ｔＰａ、ＨＳＶ ｇＤｓまたは成長ホルモン分泌シグナルペプチドである請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
シグナルペプチドをコードする配列が、遺伝子の発現率を高めるために哺乳類に最適化されたコドンで改変されたものである請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ｔＰａが、配列番号２のアミノ酸配列を有するものである請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
免疫増強ペプチドが、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリンまたはＯＸ４０である請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
免疫増強ペプチドをコードする配列が、遺伝子の発現率を高めるために哺乳類に最適化されたコドンで改変されたものである請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｆｌｔ３リガンドが、配列番号１６のアミノ酸配列を有するものである請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ＣＤ４０リガンドが、配列番号１８のアミノ酸配列を有するものである請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクトル。
【請求項２３】
配列番号７または配列番号１３の核酸配列を含む組換えベクトル。
【請求項２４】
分泌シグナル配列及び免疫増強ペプチドをコードする配列を、さらに含む請求項２３に記載のベクトル。
【請求項２５】
分泌シグナル配列が、ｔＰａ、ＨＳＶ ｇＤｓまたは成長ホルモン分泌シグナル配列である請求項２４に記載のベクトル。
【請求項２６】
分泌シグナル配列が、コドン最適化された請求項２５に記載のベクトル。
【請求項２７】
ｔＰａが、配列番号１に示される請求項２６に記載のベクトル。
【請求項２８】
免疫増強ペプチドが、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリンまたはＯＸ４０から１つ以上選択されるものである請求項２４に記載のベクトル。
【請求項２９】
配列がコドン最適化された請求項２８に記載のベクトル。
【請求項３０】
Ｆｌｔ３リガンドが、配列番号１５に示される請求項２９に記載のベクトル。
【請求項３１】
ＣＤ４０リガンドが、配列番号１７に示される請求項２９に記載のベクトル。
【請求項３２】
請求項２２に記載のベクトルで形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
請求項２３に記載のベクトルで形質転換された宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１に記載の融合タンパク質及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防用薬剤学的組成物。
【請求項３５】
疾患が子宮頸癌である請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
第２２項に記載のベクトル及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体で、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防用薬剤学的組成物。
【請求項３７】
疾患が子宮頸癌である請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
第２３項に記載のベクトル及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体で、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防用薬剤学的組成物。
【請求項３９】
疾患が子宮頸癌性急行３８に記載の組成物。
【請求項４０】
治療学的な量の請求項３４、３６または３８のいずれかに記載の薬剤学的組成物を個体に投与する工程を含む、個体で、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防する方法。
【請求項４１】
疾患が、子宮頸癌である請求項４０に記載の方法。
【請求項１】
ヒトパピローマウイルスＥ６及びＥ７の融合ポリペプチド、これを細胞外へ分泌させるためのシグナルペプチド及び個体内免疫増強ペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項２】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、ヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）または１８（ＨＰＶ１８）から由来されたものである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号８に示される請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号１４に示される融合タンパク質。
【請求項５】
シグナルペプチドがｔＰａ、ＨＳＶ ｇＤｓまたは成長ホルモン分泌シグナルペプチドである請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ｔＰａが、配列番号２に示される請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
免疫増強ペプチドがＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリンまたはＯＸ４０である請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｆｌｔ３リガンドが、配列番号１６に示される請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤ４０リガンドが、配列番号１８に示される請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１１】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードする配列が、ヒトパピローマウイルスタイプ１６（ＨＰＶ１６）または１８（ＨＰＶ１８）から由来されたものである請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドをコードする配列が、遺伝子の発現率を高めるために哺乳類に最適化されたコドンで改変されたものである請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号８のアミノ酸配列を有するものである請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
Ｅ６及びＥ７の融合ポリペプチドが、配列番号１４のアミノ酸配列を有するものである請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
シグナルペプチドが、ｔＰａ、ＨＳＶ ｇＤｓまたは成長ホルモン分泌シグナルペプチドである請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
シグナルペプチドをコードする配列が、遺伝子の発現率を高めるために哺乳類に最適化されたコドンで改変されたものである請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
ｔＰａが、配列番号２のアミノ酸配列を有するものである請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
免疫増強ペプチドが、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリンまたはＯＸ４０である請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
免疫増強ペプチドをコードする配列が、遺伝子の発現率を高めるために哺乳類に最適化されたコドンで改変されたものである請求項１８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
Ｆｌｔ３リガンドが、配列番号１６のアミノ酸配列を有するものである請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
ＣＤ４０リガンドが、配列番号１８のアミノ酸配列を有するものである請求項１９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクトル。
【請求項２３】
配列番号７または配列番号１３の核酸配列を含む組換えベクトル。
【請求項２４】
分泌シグナル配列及び免疫増強ペプチドをコードする配列を、さらに含む請求項２３に記載のベクトル。
【請求項２５】
分泌シグナル配列が、ｔＰａ、ＨＳＶ ｇＤｓまたは成長ホルモン分泌シグナル配列である請求項２４に記載のベクトル。
【請求項２６】
分泌シグナル配列が、コドン最適化された請求項２５に記載のベクトル。
【請求項２７】
ｔＰａが、配列番号１に示される請求項２６に記載のベクトル。
【請求項２８】
免疫増強ペプチドが、ＣＤ４０リガンド、Ｆｌｔ３リガンド、フラジェリンまたはＯＸ４０から１つ以上選択されるものである請求項２４に記載のベクトル。
【請求項２９】
配列がコドン最適化された請求項２８に記載のベクトル。
【請求項３０】
Ｆｌｔ３リガンドが、配列番号１５に示される請求項２９に記載のベクトル。
【請求項３１】
ＣＤ４０リガンドが、配列番号１７に示される請求項２９に記載のベクトル。
【請求項３２】
請求項２２に記載のベクトルで形質転換された宿主細胞。
【請求項３３】
請求項２３に記載のベクトルで形質転換された宿主細胞。
【請求項３４】
請求項１に記載の融合タンパク質及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体でヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防用薬剤学的組成物。
【請求項３５】
疾患が子宮頸癌である請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
第２２項に記載のベクトル及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体で、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防用薬剤学的組成物。
【請求項３７】
疾患が子宮頸癌である請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
第２３項に記載のベクトル及び薬剤学的に許容しうる担体を含む、個体で、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防用薬剤学的組成物。
【請求項３９】
疾患が子宮頸癌性急行３８に記載の組成物。
【請求項４０】
治療学的な量の請求項３４、３６または３８のいずれかに記載の薬剤学的組成物を個体に投与する工程を含む、個体で、ヒトパピローマウイルスによって引き起こされる疾患の治療または予防する方法。
【請求項４１】
疾患が、子宮頸癌である請求項４０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００９−５３４０２７（Ｐ２００９−５３４０２７Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６３９４（Ｐ２００９−５０６３９４）
【出願日】平成１８年４月１９日（２００６．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００１４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１９８９６
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０８３５５４９３）浦項工科大學校 産學協力團 (14)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年４月１９日（２００６．４．１９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＫＲ２００６／００１４４８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１１９８９６
【国際公開日】平成１９年１０月２５日（２００７．１０．２５）
【出願人】（５０８３５５４９３）浦項工科大學校 産學協力團 (14)
【Ｆターム（参考）】
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