安定なポリオール脱水素酵素組成物
【課題】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥時の失活を抑えるとともに、凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供する。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【解決手段】補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたグリセロールの定量法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えると共に、凍結乾燥後の酵素の安定性を向上させたＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたグリセロールの定量法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在しており、グルコノバクター属等から抽出、精製する方法が知られている。また、このＰＱＱ依存性ＰＤＨは、グリセロールやソルビトール、ならびに中性脂肪など、様々な物質の定量に利用可能であることが知られている。
【０００３】
例えば、グリセロールに関しては、試料中のグリセロールは、従来から、下記式で示すように、グルセロールオキシダーゼを用いてグリセロールを定量する方法が知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかしながら、この方法は、上記反応式からも分かるように、溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。
【０００６】
また、別の方法として、下記式で示すように、グリセロールキナーゼとグリセロール−３リン酸オキシダーゼもしくはグリセロール−３リン酸デヒドゲナーゼを用いてグリセロールを定量する方法が知られている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかしながら、この方法は、上記反応式からも分かるように、二つの酵素を用いるため反応が煩雑であるという問題点がある。
【０００９】
それ以外にも、下記式で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いてグリセロールを定量する方法が知られている。
【００１０】
【化３】
【００１１】
しかしながら、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素結合型酵素ではないため、高価なＮＡＤを添加しなければならないという問題がある。
【００１２】
上述したように、より安価で簡便なグリセロール測定法が求められてきた。上記要求を満たすために、様々な研究が行なわれ、その結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を用いてグリセロールを定量する方法が開発された。この補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素は、下記反応式に示されるように、人工電子受容体を利用できるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、補酵素結合型酵素であるため、高価なＰＱＱを添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１３】
【化４】
【００１４】
しかしながら、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、膜結合型酵素であるため、安定性が低いという問題がある。
【００１５】
このため、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上することが重要な課題となる。従来から酵素の安定化剤としては、牛血清アルブミン、卵白アルブミンなどのタンパク質、グルコース、トレハロース、ラフィノースなどの糖、グリセロール、エチレングリコールなどの多価アルコール、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの塩類、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などが知られている。しかしながら、これらの安定化剤が、補欠分子族としてＰＱＱを含むポリオール脱水素酵素に対して効果があるかは知られていない。
【００１６】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと類似の、補欠分子族としてＰＱＱを含むグルコース脱水素酵素に関しては、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに、（ｉ）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれる１種または２種以上の化合物および（ｉｉ）アルブミンを共存せしめることにより、従来よりもはるかに安定な酵素組成物を得たと報告されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００１−２２４３６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、膜結合型であるＰＱＱ依存性ＰＤＨは安定性に乏しい酵素であることがよく知られており、上記特許文献１に記載の安定化剤では、酵素の安定性を顕著に向上させることができないという問題がある。
【００１８】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、酵素の安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。
【００１９】
本発明の他の目的は、正確にグリセロールを定量できる上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を含むポリオール測定試薬、および上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を用いたグリセロールの定量法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑みてＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定化について鋭意研究を行なった結果、カルシウムやマグネシウム等の２価の金属イオンを有する化合物と、ラフィノースやトレハロースなどの非還元糖と、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００等の界面活性剤とを、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと共存させることにより、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えることができると共に、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、上記目的は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物によって達成される。
【００２２】
本発明の他の目的は、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬；および本発明のポリオール脱水素酵素組成物をグリセロールと反応させる段階を有する、グリセロールの定量法によって達成される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができ、特に、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えることができると共に、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できる。特に、非還元糖としてトレハロースおよび／またはラフィノースを、また、２価の金属イオンを有する化合物としてマグネシウムイオンおよび／またはカルシウムイオンを有する化合物を、さらに界面活性剤としてトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を使用した場合には、上記効果は顕著に達成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明の第一は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物に関するものである。
【００２６】
本発明で使用できる補欠分子族としてＰＱＱを含むポリオール脱水素酵素としては、ポリオールに作用するものであれば特に制限されず、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。例えば、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが基質とするポリオールとしては、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、ソルビトール（ピロロキノリンキノン依存性ソルビトール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、及びマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）などがある。これらのうち、グリセロールを基質とするもの（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）が特に本発明では好ましく使用される。該ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記したような基質に作用して所望の酵素活性を発揮するものであれば特に制限されないが、例えば、グリセロールの場合には、下記式に示されるような反応を触媒する。
【００２７】
【化５】
【００２８】
本発明によるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等がある。
【００２９】
また、上記例ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記酵素を有するものであればいずれの源であってもよく、例えば、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）など、様々な細菌が生成することが知られている。これらＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌が生産するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。これらの中でも本発明では、特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター属、特には、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１７１、３２５３、３２５８、３２８５、３２８９、３２９０、３２９１、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２８６、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２等を使用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１がある。
【００３０】
本発明で使用されるＰＱＱ依存性ＰＤＨを調製する方法は、特に制限されず、上記した微生物から公知の方法を単独で若しくは修飾してまたはこれらを適宜組合わせて使用できる。具体的には、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを採取すればよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、ソルビトール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産誘導物質として、ポリオールを培地に０．５〜１０％程度添加しておくことが望ましい。培地は通常、振とう培養、あるいは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、培養ｐＨは５〜１０の範囲で、好ましくは６〜９に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜５日が好ましく、菌体内にＰＱＱ依存性ＰＤＨが生産蓄積される。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、菌体培養より精製して得られた酵素でも、ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３１】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製する。精製方法は一般に使用される精製法を用いることができ、例えば、抽出法には超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤などいずれを用いてもよい。さらに抽出液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。また、これらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、そのままの形態で使用されても、あるいは化学修飾された形態で使用されてもよい。
【００３２】
本発明において、２価の金属イオンを有する化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上でき、かつ２価のイオンを形成する金属を有する化合物であれば特に制限されない。具体的には、２価のイオンを形成する金属としては、マグネシウム、カルシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛及び亜鉛などが挙げられ、これらのうち、マグネシウム及びカルシウムが好ましい。また、２価のイオンを形成する金属を有する化合物の形態もまた、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属の塩化物等のハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられるが、これらのうち、塩化物等のハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩が好ましい。なお、これらの２価の金属イオンを有する化合物は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００３３】
上記２価の金属イオンを有する化合物の組成物中の割合は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できる量であれば特に制限されない。好ましくは、２価の金属イオンを有する化合物が、対タンパク質量当たり、１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％の量で組成物中に存在する。この際、２価の金属イオンを有する化合物の量が１質量％未満であると、量が少なすぎて安定化剤としての効果が十分発揮できない可能性があり、逆に３０質量％を超えると、添加に見合う効果の向上が認められず、また、溶解性が低下する場合がある。
【００３４】
本明細書において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基を持たないために還元性を有しない糖類を意味する。このような非還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型少糖類、糖類の還元基と非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型少糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。これらのうち、ラフィノース、トレハロース、スクロースが好ましく、特にラフィノース及びトレハロースが好ましい。これらの非還元糖は、単独で使用されても、あるいは２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３５】
また、本発明の組成物中に存在する非還元糖の割合は、本発明の組成物の酵素安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、非還元糖が、対タンパク質量当たり、１〜１５０質量％、より好ましくは５〜１００質量％の割合で組成物中に存在することが好ましい。この際、非還元糖の量が１質量％未満であると、量が少なすぎて安定化剤としての効果が十分発揮できない可能性があり、逆に１５０質量％を超えると、酵素組成物を緩衝液等で再溶解した際、溶液の粘度が高すぎる場合がある。
【００３６】
一般に、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含めて酵素は、保存時のｐＨによりその安定性に影響がある。このため、本発明の組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ、２価の金属イオンを有する化合物、界面活性剤、及び非還元糖の必須の成分に加えて、安定ｐＨ域の種々の緩衝液を使用することが好ましい。このような緩衝液は、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液；酢酸緩衝液；ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のＧＯＯＤ緩衝液；グリシン−ＮａＯＨ等のアミノ酸系緩衝液；ホウ酸緩衝液；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液が好ましい。また、上記緩衝液の濃度は、特に制限されないが、好ましくは１〜２００ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭである。上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、通常、４．０〜１１．０程度、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。
【００３７】
本発明の組成物中に存在する界面活性剤としては、一般的に膜タンパク質の可溶化に用いられているものであればよく、例えば、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどがある。これらのうち、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００が好ましく使用される。また、界面活性剤の割合は、本発明の組成物の酵素安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、界面活性剤が、対タンパク質量当たり、２０〜１０００質量％、より好ましくは２０〜５００質量％の割合で組成物中に存在することが好ましい。
【００３８】
本発明の組成物を粉末状にする場合は、上記記載の液状の組成物を凍結後、凍結乾燥等により粉末状にすることができる。なお、この際、凍結乾燥方法は、特に限定されるものではなく、常法に従って行えばよい。
【００３９】
本発明の第二は、本発明の組成物を含むポリオール測定試薬である。また、本発明の第三は、本発明の組成物をグリセロールと反応させることを特徴とする、グリセロールの定量法である。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物は、酵素が凍結乾燥により粉末状にされたとしても、凍結乾燥による酵素の失活が有意に抑制・防止でき、また、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できるため、酵素を長期間にわたって安定して（酵素活性を有意に低下させることなく）保存することができる。このため、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物は、ポリオールを正確に安定して定量するのに使用でき、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。
【００４０】
本発明のポリオール測定試薬は、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオールを測定するために使用する試薬である。ポリオール脱水素酵素として本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素に代えて本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを本発明のポリオール測定試薬として使用することができる。
【００４１】
本発明の定量法において、ポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿や全血等がある。また本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清や血奬、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわちこれらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いればグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【００４２】
上述したように、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができ、特に、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えることができると共に、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できる。したがって、本発明の第四は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の安定化方法である。本発明の方法によると、下記実施例において詳述されるように、凍結乾燥によるポリオール脱水素酵素の失活が有意に抑制できる；および凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上されるという効果が達成できる。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法によって測定した。
【００４４】
（酵素活性）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＭＳ）、４００ｍＭ グリセロールを含んだ０．２％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。この際、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は、１６．３ｍＭ−１とした。
【００４５】
実施例１〜５、比較例１〜５
ソルビトール ２質量％、酵母エキス ０．３質量％、肉エキス ０．３質量％、コーン・スティープ・リカー ０．３質量％、ポリペプトン １質量％、尿素 ０．１質量％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２質量％、ＣａＣｌ２ ０．１質量％、ｐＨ ７．０よりなる培地４００ｍｌを調製し、５００ｍｌ容の坂口フラスコに一本あたり該培地１００ｍｌずつを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブした。
【００４６】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、培養し、これを種培養液とした。
【００４７】
次に、上記と同じ組成で調製した培地 ６．６Ｌを１０Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で２０分間、オートクレーブを行ない、放冷した。この培地に、上記で得られた種培養液４００ｍｌを加えた。これを、７５０ｒｐｍ、通気量７Ｌ／分、３０℃で２４時間培養した。
【００４８】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離して集菌し、蒸留水で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分、４℃）し、さらに得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００４９】
この膜画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、終濃度が１質量％となるようにトライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．２質量％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００５０】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣにてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍｌで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．２質量％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析することにより、比活性１２．７Ｕ／ｍｇタンパク質の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。
【００５１】
次に、このようにして得られたグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性１２．７Ｕ/ｍｇタンパク質、タンパク質濃度１．０ｍｇ/ｍＬ）０．８ｍＬに、終濃度が１質量％になるように、５質量％グルタルアルデヒド溶液２００μＬを加え、これを室温にて５分間緩やかに攪拌した。反応後、０．２（ｗ／ｖ）％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析することによって、架橋反応を停止させると共に、低分子量のものを取り除き、これをグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨと称する。
【００５２】
ついで、このようにして得られたグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨを限外濾過により濃縮した。得られた濃縮グルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨ（比活性１０Ｕ/ｍｇタンパク質、タンパク質濃度２．５ｍｇ/ｍＬ）に、表１に記載の安定化剤を表１に記載の量加え、凍結乾燥を１６時間行なった。この際、凍結乾燥直後の酵素活性を測定した。なお、本実施例において、凍結乾燥は、上記添加剤含有酵素溶液を凍結後、凍結乾燥機を用いて約１０Ｐａ、約−５０℃の条件で１６時間行なった。また、比較対照として、凍結乾燥直前の酵素活性を測定した。
【００５３】
上記条件で凍結乾燥した後のグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨの酵素活性を測定して、凍結乾燥前の酵素活性を１００％とした場合の凍結乾燥後の残存活性（％）を算出した。その結果を下記表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
上記表１に示される結果から、２価の金属イオンを有する化合物（硫酸マグネシウムおよび硝酸カルシウム）、非還元糖（トレハロースおよびラフィノース）、及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を組合わせることによって、上記いずれか１種もしくは２種を組合わせた場合と比べて、凍結乾燥による酵素の失活を有意に抑制できることが確認された。以上の結果から、本発明の組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、凍結乾燥による酵素活性の低下を有意に抑制することができると考察される。
【００５６】
実施例６〜１０、比較例６〜１０
実施例１に記載の方法と同様にして得られた酵素組成物を、３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。この際、凍結乾燥直後の酵素活性を比較対照として測定した。
【００５７】
上記条件で保存した後のグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨの酵素活性を測定して、凍結乾燥直後の酵素活性を１００％とした場合の３７℃で１週間インキュベートした際の残存活性（％）を算出した。その結果を下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
上記表２に示される結果から、２価の金属イオンを有する化合物（硫酸マグネシウムおよび硝酸カルシウム）、非還元糖（トレハロースおよびラフィノース）、及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を組合わせることによって、上記いずれか１種もしくは２種を組合わせた場合と比べて、粉末状酵素の安定性が有意に向上できることが確認された。以上の結果から、本発明の組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、経時的な酵素活性の低下を有意に抑制することができると考察される。
【００６０】
また、上記表１及び表２に示される結果から、トレハロースもしくはラフィノースと、２価のマグネシウムイオンもしくは２価のカルシウムイオンと、界面活性剤（トライトンＸ−１００）とを、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに添加することにより、凍結乾燥時の及び凍結乾燥後の酵素組成物の安定性を向上できる（凍結乾燥による酵素の失活及び経時的な酵素活性の低下の抑制／防止）ことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥時の失活を抑えるとともに、凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能であるため、本発明の組成物は、正確にグリセロールを定量するのに好適に使用できる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素（以下、「ＰＱＱ依存性ＰＤＨ」または単に「ポリオール脱水素酵素」とも称する）の安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたグリセロールの定量法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えると共に、凍結乾燥後の酵素の安定性を向上させたＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物、当該組成物を含むポリオール測定試薬、および当該組成物を用いたグリセロールの定量法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、バクテリアの細胞膜に存在しており、グルコノバクター属等から抽出、精製する方法が知られている。また、このＰＱＱ依存性ＰＤＨは、グリセロールやソルビトール、ならびに中性脂肪など、様々な物質の定量に利用可能であることが知られている。
【０００３】
例えば、グリセロールに関しては、試料中のグリセロールは、従来から、下記式で示すように、グルセロールオキシダーゼを用いてグリセロールを定量する方法が知られている。
【０００４】
【化１】
【０００５】
しかしながら、この方法は、上記反応式からも分かるように、溶存酸素の影響を受けるという問題点がある。
【０００６】
また、別の方法として、下記式で示すように、グリセロールキナーゼとグリセロール−３リン酸オキシダーゼもしくはグリセロール−３リン酸デヒドゲナーゼを用いてグリセロールを定量する方法が知られている。
【０００７】
【化２】
【０００８】
しかしながら、この方法は、上記反応式からも分かるように、二つの酵素を用いるため反応が煩雑であるという問題点がある。
【０００９】
それ以外にも、下記式で示すように、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼを用いてグリセロールを定量する方法が知られている。
【００１０】
【化３】
【００１１】
しかしながら、ＮＡＤ依存性グリセロールデヒドロゲナーゼは、補酵素結合型酵素ではないため、高価なＮＡＤを添加しなければならないという問題がある。
【００１２】
上述したように、より安価で簡便なグリセロール測定法が求められてきた。上記要求を満たすために、様々な研究が行なわれ、その結果、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素を用いてグリセロールを定量する方法が開発された。この補欠分子族としてピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）を含むポリオール脱水素酵素は、下記反応式に示されるように、人工電子受容体を利用できるため、溶存酸素の影響を受けない、反応が簡便で複数の酵素を用いる必要がない、補酵素結合型酵素であるため、高価なＰＱＱを添加する必要がないなどのメリットがある。
【００１３】
【化４】
【００１４】
しかしながら、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素は、膜結合型酵素であるため、安定性が低いという問題がある。
【００１５】
このため、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上することが重要な課題となる。従来から酵素の安定化剤としては、牛血清アルブミン、卵白アルブミンなどのタンパク質、グルコース、トレハロース、ラフィノースなどの糖、グリセロール、エチレングリコールなどの多価アルコール、アルギニン、グルタミン酸などのアミノ酸、カルシウムイオンやマグネシウムイオンなどの塩類、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール等の還元剤などが知られている。しかしながら、これらの安定化剤が、補欠分子族としてＰＱＱを含むポリオール脱水素酵素に対して効果があるかは知られていない。
【００１６】
また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと類似の、補欠分子族としてＰＱＱを含むグルコース脱水素酵素に関しては、ＰＱＱ依存性グルコースデヒドロゲナーゼに、（ｉ）アスパラギン酸、グルタミン酸、α−ケトグルタル酸、リンゴ酸、α−ケトグルコン酸、α−サイクロデキストリンおよびそれらの塩からなる群から選ばれる１種または２種以上の化合物および（ｉｉ）アルブミンを共存せしめることにより、従来よりもはるかに安定な酵素組成物を得たと報告されている（特許文献１）。
【特許文献１】特開２００１−２２４３６８号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかしながら、膜結合型であるＰＱＱ依存性ＰＤＨは安定性に乏しい酵素であることがよく知られており、上記特許文献１に記載の安定化剤では、酵素の安定性を顕著に向上させることができないという問題がある。
【００１８】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、酵素の安定性が向上したポリオール脱水素酵素組成物を提供することを目的とする。
【００１９】
本発明の他の目的は、正確にグリセロールを定量できる上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を含むポリオール測定試薬、および上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物を用いたグリセロールの定量法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明者らは、上記従来の問題点に鑑みてＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定化について鋭意研究を行なった結果、カルシウムやマグネシウム等の２価の金属イオンを有する化合物と、ラフィノースやトレハロースなどの非還元糖と、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００等の界面活性剤とを、ＰＱＱ依存性ＰＤＨと共存させることにより、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えることができると共に、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００２１】
すなわち、上記目的は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物によって達成される。
【００２２】
本発明の他の目的は、本発明のポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬；および本発明のポリオール脱水素酵素組成物をグリセロールと反応させる段階を有する、グリセロールの定量法によって達成される。
【発明の効果】
【００２３】
本発明によれば、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができ、特に、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えることができると共に、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できる。特に、非還元糖としてトレハロースおよび／またはラフィノースを、また、２価の金属イオンを有する化合物としてマグネシウムイオンおよび／またはカルシウムイオンを有する化合物を、さらに界面活性剤としてトライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を使用した場合には、上記効果は顕著に達成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２５】
本発明の第一は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物に関するものである。
【００２６】
本発明で使用できる補欠分子族としてＰＱＱを含むポリオール脱水素酵素としては、ポリオールに作用するものであれば特に制限されず、従来公知の酵素をいずれも好ましく使用することができる。例えば、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが基質とするポリオールとしては、グリセロール（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）、ソルビトール（ピロロキノリンキノン依存性ソルビトール脱水素酵素）、アラビトール（ピロロキノリンキノン依存性アラビトール脱水素酵素）、及びマンニトール（ピロロキノリンキノン依存性マンニトール脱水素酵素）などがある。これらのうち、グリセロールを基質とするもの（ピロロキノリンキノン依存性グリセロール脱水素酵素）が特に本発明では好ましく使用される。該ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記したような基質に作用して所望の酵素活性を発揮するものであれば特に制限されないが、例えば、グリセロールの場合には、下記式に示されるような反応を触媒する。
【００２７】
【化５】
【００２８】
本発明によるＰＱＱ依存性ＰＤＨは、ポリオールと電子受容体とを、対応する脱水素物と還元型電子受容体とに変換することができる。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨが好適に使用できる電子受容体としては、フェリシアン化カリウム、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール（ＤＣＩＰ）、Ｗｕｒｓｔｅｒ’ｓ ｂｌｕｅ、ニトロテトラゾリウムブルー等がある。
【００２９】
また、上記例ＰＱＱ依存性ＰＤＨは、上記酵素を有するものであればいずれの源であってもよく、例えば、グルコノバクター属（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）など、様々な細菌が生成することが知られている。これらＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌が生産するいずれのＰＱＱ依存性ＰＤＨも好適に使用することができる。これらの中でも本発明では、特にグルコノバクター属に属する細菌の膜画分に存在するＰＱＱ依存性ＰＤＨを好適に使用することができる。さらに、入手の容易さから、グルコノバクター属、特には、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３１７１、３２５３、３２５８、３２８５、３２８９、３２９０、３２９１、グルコノバクター・フラテウリ（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｆｒａｔｅｕｒｉｉ）ＮＢＲＣ ３２５１、３２６０、３２６４、３２６５、３２６８、３２８６、グルコノバクター・セリナス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｃｅｒｉｎｕｓ）ＮＢＲＣ ３２６２等を使用することができる。このような微生物の代表菌株として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１がある。
【００３０】
本発明で使用されるＰＱＱ依存性ＰＤＨを調製する方法は、特に制限されず、上記した微生物から公知の方法を単独で若しくは修飾してまたはこれらを適宜組合わせて使用できる。具体的には、上記ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からＰＱＱ依存性ＰＤＨを採取すればよい。ＰＱＱ依存性ＰＤＨ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール、ソルビトール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。また、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの生産誘導物質として、ポリオールを培地に０．５〜１０％程度添加しておくことが望ましい。培地は通常、振とう培養、あるいは通気撹はん培養で行う。培養温度は２０〜５０℃、好ましくは２０〜４０℃、培養ｐＨは５〜１０の範囲で、好ましくは６〜９に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜５日が好ましく、菌体内にＰＱＱ依存性ＰＤＨが生産蓄積される。なお、これらのＰＱＱ依存性ＰＤＨは、菌体培養より精製して得られた酵素でも、ＰＤＨ遺伝子を大腸菌等に形質導入して得られた組換え酵素であってもよい。
【００３１】
次いで、得られたＰＱＱ依存性ＰＤＨを精製する。精製方法は一般に使用される精製法を用いることができ、例えば、抽出法には超音波破砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレス、界面活性剤などいずれを用いてもよい。さらに抽出液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。また、これらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、そのままの形態で使用されても、あるいは化学修飾された形態で使用されてもよい。
【００３２】
本発明において、２価の金属イオンを有する化合物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上でき、かつ２価のイオンを形成する金属を有する化合物であれば特に制限されない。具体的には、２価のイオンを形成する金属としては、マグネシウム、カルシウム、バリウム、マンガン、鉄、銅、コバルト、ニッケル、水銀、鉛及び亜鉛などが挙げられ、これらのうち、マグネシウム及びカルシウムが好ましい。また、２価のイオンを形成する金属を有する化合物の形態もまた、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できるものであれば特に制限されないが、例えば、上記金属の塩化物等のハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩などが挙げられるが、これらのうち、塩化物等のハロゲン化物、硫酸塩、硝酸塩が好ましい。なお、これらの２価の金属イオンを有する化合物は、単独で使用されてもあるいは２種以上の混合物の形態で使用されてもよい。
【００３３】
上記２価の金属イオンを有する化合物の組成物中の割合は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を向上できる量であれば特に制限されない。好ましくは、２価の金属イオンを有する化合物が、対タンパク質量当たり、１〜３０質量％、より好ましくは１〜２０質量％の量で組成物中に存在する。この際、２価の金属イオンを有する化合物の量が１質量％未満であると、量が少なすぎて安定化剤としての効果が十分発揮できない可能性があり、逆に３０質量％を超えると、添加に見合う効果の向上が認められず、また、溶解性が低下する場合がある。
【００３４】
本明細書において、「非還元糖」とは、遊離性のアルデヒド基やケトン基を持たないために還元性を有しない糖類を意味する。このような非還元糖としては、上記したような性質を有するものであればよく、例えば、還元基同士の結合したトレハロース型少糖類、糖類の還元基と非糖類が結合した配糖体、糖類に水素添加して還元した糖アルコールなどがある。より具体的には、スクロース、トレハロース、ラフィノース等のトレハロース型少糖類；アルキル配糖体、フェノール配糖体、カラシ油配糖体等の配糖体；およびアラビトール、キシリトール、ソルビトール等の糖アルコールなどが挙げられる。これらのうち、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの基質となる糖アルコールは、好ましくない場合がある。これらのうち、ラフィノース、トレハロース、スクロースが好ましく、特にラフィノース及びトレハロースが好ましい。これらの非還元糖は、単独で使用されても、あるいは２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３５】
また、本発明の組成物中に存在する非還元糖の割合は、本発明の組成物の酵素安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、非還元糖が、対タンパク質量当たり、１〜１５０質量％、より好ましくは５〜１００質量％の割合で組成物中に存在することが好ましい。この際、非還元糖の量が１質量％未満であると、量が少なすぎて安定化剤としての効果が十分発揮できない可能性があり、逆に１５０質量％を超えると、酵素組成物を緩衝液等で再溶解した際、溶液の粘度が高すぎる場合がある。
【００３６】
一般に、ＰＱＱ依存性ＰＤＨを含めて酵素は、保存時のｐＨによりその安定性に影響がある。このため、本発明の組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨ、２価の金属イオンを有する化合物、界面活性剤、及び非還元糖の必須の成分に加えて、安定ｐＨ域の種々の緩衝液を使用することが好ましい。このような緩衝液は、所望のｐＨを有するものであれば公知の緩衝液が適宜使用でき、特に限定されるものではないが、例えば、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液；酢酸緩衝液；ＢＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＴＥＳ、ビシン、トリシン等のＧＯＯＤ緩衝液；グリシン−ＮａＯＨ等のアミノ酸系緩衝液；ホウ酸緩衝液；Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ｐｒｏｐａｎｅ緩衝液、イミダゾール緩衝液などが用いられる。これらのうち、リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、ＧＯＯＤ緩衝液が好ましい。また、上記緩衝液の濃度は、特に制限されないが、好ましくは１〜２００ｍＭ、より好ましくは５〜１００ｍＭである。上記緩衝液のｐＨは、酵素の安定ｐＨから極端に外れていなければよく、通常、４．０〜１１．０程度、より好ましくは５．０〜１０．０の範囲である。
【００３７】
本発明の組成物中に存在する界面活性剤としては、一般的に膜タンパク質の可溶化に用いられているものであればよく、例えば、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、オクチルグルコシド、コール酸ナトリウムなどがある。これらのうち、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００が好ましく使用される。また、界面活性剤の割合は、本発明の組成物の酵素安定性を向上できる量であれば特に制限されないが、界面活性剤が、対タンパク質量当たり、２０〜１０００質量％、より好ましくは２０〜５００質量％の割合で組成物中に存在することが好ましい。
【００３８】
本発明の組成物を粉末状にする場合は、上記記載の液状の組成物を凍結後、凍結乾燥等により粉末状にすることができる。なお、この際、凍結乾燥方法は、特に限定されるものではなく、常法に従って行えばよい。
【００３９】
本発明の第二は、本発明の組成物を含むポリオール測定試薬である。また、本発明の第三は、本発明の組成物をグリセロールと反応させることを特徴とする、グリセロールの定量法である。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物は、酵素が凍結乾燥により粉末状にされたとしても、凍結乾燥による酵素の失活が有意に抑制・防止でき、また、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できるため、酵素を長期間にわたって安定して（酵素活性を有意に低下させることなく）保存することができる。このため、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨ組成物は、ポリオールを正確に安定して定量するのに使用でき、ポリオール測定試薬として好適に使用することができる。
【００４０】
本発明のポリオール測定試薬は、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを含み、ポリオールを測定するために使用する試薬である。ポリオール脱水素酵素として本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用する点に特徴があり、例えば特許公報第３０４１８４０号、特許公報第３４５０９１１号、特許公報第３４９４３９８号などに記載されるポリオール測定で使用するポリオール脱水素酵素に代えて本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを本発明のポリオール測定試薬として使用することができる。
【００４１】
本発明の定量法において、ポリオールを含む試料としては、食品、血清、血漿や全血等がある。また本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは血清や血奬、全血等の中性脂肪測定にも使用することができる。すなわちこれらの試料に含まれる中性脂肪は、例えばリポプロテインリパーゼにより遊離脂肪酸とグリセロールに分解されるが、ここで生じたグリセロールを本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを使用して、定量することができる。中性脂肪測定時には精神病治療患者、透析患者では遊離グリセロールが問題になるが、本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨを用いればグリセロールを予め消去するか、もしくはその量を測定しておくことで真の中性脂肪値を求めることが可能である。本発明のＰＱＱ依存性ＰＤＨは溶液中に界面活性剤を含んでいてもポリオールを正確に定量することができる。
【００４２】
上述したように、本発明のポリオール脱水素酵素組成物は、ポリオール脱水素酵素の安定性を向上することができ、特に、凍結乾燥時の酵素の失活を抑えることができると共に、凍結乾燥後の経時的な酵素活性の低下を有意に抑制・防止できる。したがって、本発明の第四は、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の安定化方法である。本発明の方法によると、下記実施例において詳述されるように、凍結乾燥によるポリオール脱水素酵素の失活が有意に抑制できる；および凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上されるという効果が達成できる。
【実施例】
【００４３】
次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、これらの実施例は何ら本発明を制限するものではない。なお、本発明において、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、下記方法によって測定した。
【００４４】
（酵素活性）
ＰＱＱ依存性ＰＤＨの酵素活性は、５０μＭ ＤＣＩＰ、０．２ｍＭ ５−メチルフェナジニウムメチルスルファート（ＰＭＳ）、４００ｍＭ グリセロールを含んだ０．２％トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ ７．０中に、酵素溶液を加え、酵素と基質の反応をＤＣＩＰの６００ｎｍの吸光度変化によって追跡し、その吸光度の減少速度を酵素の反応速度とした。この際、１分間に１μｍｏｌのＤＣＩＰが還元される酵素活性を１単位（Ｕ）とした。なお、ＤＣＩＰのｐＨ７．０におけるモル吸光係数は、１６．３ｍＭ−１とした。
【００４５】
実施例１〜５、比較例１〜５
ソルビトール ２質量％、酵母エキス ０．３質量％、肉エキス ０．３質量％、コーン・スティープ・リカー ０．３質量％、ポリペプトン １質量％、尿素 ０．１質量％、ＫＨ２ＰＯ４ ０．１質量％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０２質量％、ＣａＣｌ２ ０．１質量％、ｐＨ ７．０よりなる培地４００ｍｌを調製し、５００ｍｌ容の坂口フラスコに一本あたり該培地１００ｍｌずつを移し、１２１℃、２０分間オートクレーブした。
【００４６】
上記培地に、種菌として、グルコノバクター・オキシダンス（Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）ＮＢＲＣ ３２９１を一白金耳植菌し、３０℃で２４時間、培養し、これを種培養液とした。
【００４７】
次に、上記と同じ組成で調製した培地 ６．６Ｌを１０Ｌ容ジャーファーメンターに移し、１２１℃で２０分間、オートクレーブを行ない、放冷した。この培地に、上記で得られた種培養液４００ｍｌを加えた。これを、７５０ｒｐｍ、通気量７Ｌ／分、３０℃で２４時間培養した。
【００４８】
所定時間培養した後、この培養液を遠心分離して集菌し、蒸留水で懸濁した後、フレンチプレスにより菌体を破砕した。破砕液を遠心分離（５，０００×ｇ、２０分、４℃）し、さらに得られた上清を超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）して、膜画分を沈殿物として得た。
【００４９】
この膜画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、終濃度が１質量％となるようにトライトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）を加え、４℃で２時間撹拌した。超遠心分離（４０，０００ｒｐｍ、９０分、４℃）し、上清を０．２質量％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析し、これを可溶化膜画分とした。
【００５０】
この可溶化膜画分をＦＰＬＣにてＲｅｓｏｕｒｃｅＱ ６ｍｌで夾雑するグルコース脱水素酵素を除いたポリオール脱水素酵素活性画分を得た。この画分を０．２質量％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析することにより、比活性１２．７Ｕ／ｍｇタンパク質の酵素標品を得た。これをグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨと称する。
【００５１】
次に、このようにして得られたグルコノバクター・オキシダンス由来ＰＤＨ（比活性１２．７Ｕ/ｍｇタンパク質、タンパク質濃度１．０ｍｇ/ｍＬ）０．８ｍＬに、終濃度が１質量％になるように、５質量％グルタルアルデヒド溶液２００μＬを加え、これを室温にて５分間緩やかに攪拌した。反応後、０．２（ｗ／ｖ）％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０）で一晩透析することによって、架橋反応を停止させると共に、低分子量のものを取り除き、これをグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨと称する。
【００５２】
ついで、このようにして得られたグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨを限外濾過により濃縮した。得られた濃縮グルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨ（比活性１０Ｕ/ｍｇタンパク質、タンパク質濃度２．５ｍｇ/ｍＬ）に、表１に記載の安定化剤を表１に記載の量加え、凍結乾燥を１６時間行なった。この際、凍結乾燥直後の酵素活性を測定した。なお、本実施例において、凍結乾燥は、上記添加剤含有酵素溶液を凍結後、凍結乾燥機を用いて約１０Ｐａ、約−５０℃の条件で１６時間行なった。また、比較対照として、凍結乾燥直前の酵素活性を測定した。
【００５３】
上記条件で凍結乾燥した後のグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨの酵素活性を測定して、凍結乾燥前の酵素活性を１００％とした場合の凍結乾燥後の残存活性（％）を算出した。その結果を下記表１に示す。
【００５４】
【表１】
【００５５】
上記表１に示される結果から、２価の金属イオンを有する化合物（硫酸マグネシウムおよび硝酸カルシウム）、非還元糖（トレハロースおよびラフィノース）、及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を組合わせることによって、上記いずれか１種もしくは２種を組合わせた場合と比べて、凍結乾燥による酵素の失活を有意に抑制できることが確認された。以上の結果から、本発明の組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、凍結乾燥による酵素活性の低下を有意に抑制することができると考察される。
【００５６】
実施例６〜１０、比較例６〜１０
実施例１に記載の方法と同様にして得られた酵素組成物を、３７℃で１週間、インキュベートした後の酵素活性を測定した。この際、凍結乾燥直後の酵素活性を比較対照として測定した。
【００５７】
上記条件で保存した後のグルコノバクター・オキシダンス由来修飾ＰＤＨの酵素活性を測定して、凍結乾燥直後の酵素活性を１００％とした場合の３７℃で１週間インキュベートした際の残存活性（％）を算出した。その結果を下記表２に示す。
【００５８】
【表２】
【００５９】
上記表２に示される結果から、２価の金属イオンを有する化合物（硫酸マグネシウムおよび硝酸カルシウム）、非還元糖（トレハロースおよびラフィノース）、及び界面活性剤（トライトンＸ−１００）を組合わせることによって、上記いずれか１種もしくは２種を組合わせた場合と比べて、粉末状酵素の安定性が有意に向上できることが確認された。以上の結果から、本発明の組成物は、ＰＱＱ依存性ＰＤＨの安定性を有意に向上でき、経時的な酵素活性の低下を有意に抑制することができると考察される。
【００６０】
また、上記表１及び表２に示される結果から、トレハロースもしくはラフィノースと、２価のマグネシウムイオンもしくは２価のカルシウムイオンと、界面活性剤（トライトンＸ−１００）とを、ＰＱＱ依存性ＰＤＨに添加することにより、凍結乾燥時の及び凍結乾燥後の酵素組成物の安定性を向上できる（凍結乾燥による酵素の失活及び経時的な酵素活性の低下の抑制／防止）ことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００６１】
本発明によれば、補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素の凍結乾燥時の失活を抑えるとともに、凍結乾燥後の経時的な酵素の安定性を向上させることが可能であるため、本発明の組成物は、正確にグリセロールを定量するのに好適に使用できる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項２】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロール脱水素酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項３】
前記２価の金属イオンを有する化合物は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を有する化合物及びカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項４】
前記非還元糖は、ラフィノース及びトレハロースの少なくとも一方を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項５】
前記界面活性剤は、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物をグリセロールと反応させる段階を有する、グリセロールの定量法。
【請求項８】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の安定化方法。
【請求項９】
凍結乾燥によるポリオール脱水素酵素の失活が抑制される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上される、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を含む、安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項２】
前記ポリオール脱水素酵素は、グリセロール脱水素酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項３】
前記２価の金属イオンを有する化合物は、マグネシウムイオン（Ｍｇ２＋）を有する化合物及びカルシウムイオン（Ｃａ２＋）を有する化合物からなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１または２に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項４】
前記非還元糖は、ラフィノース及びトレハロースの少なくとも一方を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項５】
前記界面活性剤は、トライトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物を含む、ポリオール測定試薬。
【請求項７】
請求項２〜５のいずれか１項に記載の安定なポリオール脱水素酵素組成物をグリセロールと反応させる段階を有する、グリセロールの定量法。
【請求項８】
補欠分子族としてピロロキノリンキノンを含むポリオール脱水素酵素に、２価の金属イオンを有する化合物、非還元糖、及び界面活性剤を安定化剤として添加する段階を有する、ポリオール脱水素酵素組成物の安定化方法。
【請求項９】
凍結乾燥によるポリオール脱水素酵素の失活が抑制される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
凍結乾燥後のポリオール脱水素酵素の安定性が向上される、請求項８または９に記載の方法。
【公開番号】特開２００７−２５９８１４（Ｐ２００７−２５９８１４Ａ）
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−９２１３３（Ｐ２００６−９２１３３）
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年１０月１１日（２００７．１０．１１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年３月２９日（２００６．３．２９）
【出願人】（０００１０６７７１）シーシーアイ株式会社 (245)
【出願人】（５０３１９５８５０）有限会社アルティザイム・インターナショナル (31)
【Ｆターム（参考）】
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