安定化単一ドメイン抗体
【課題】 本発明は、治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であって、前記構築物の生体循環系における存在期間が長期である構築物に関する。さらに、本発明は、生体循環系においてＶＨＨを安定化させる方法に関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物、ｉｎ ｖｉｖｏで安定性が改良されている前記構築物、ならびに診断および治療でのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチド治療薬、特に抗体を基にした治療薬は、薬物として著しい潜在能力を有している。というのは、これらの治療薬は、その標的に対して極めて優れた特異性を有し、固有の毒性も低いからである。しかし、治療薬として有効であるためには、その薬物動態プロフィールを最適化すべきである。現在の抗体適用例の大部分は、急性疾患向けである。しかし、慢性症状用に抗体治療薬を開発する機会は多数ある。これには、長期にわたって多量の蛋白質が必要となる。哺乳動物細胞中での抗体産生費用は高いので、これらの適用例に向けての従来の抗体治療薬の開発は魅力の乏しいものであった。代替の手法によって酵母や細菌などの微生物発現系でＦａｂや一本鎖Ｆｖなどの抗体断片が発現されている。しかし、これらの断片は、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環時間が非常に短い。
【０００３】
血中での蛋白質およびペプチドの循環を高める初期の手法のいくつかは、ＰＥＧ化（ＵＳ４，１７９，３３７号）など、化学的改変に基づいている。このような生成物の例には、ＰＥＧイントロン、すなわち、ＨＣＶの治療にＰＥＧ化インターフェロンα‐２ｂ、およびＰＥＧ改変抗体による慢性疾患の治療（Ａ．Ｐ Ｃｈａｐｍａｎ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２），５４，５３１‐５４５）がある。しかし、そのような化学的方法には、ある種のアミノ酸側鎖の化学的変化のための標的蛋白質またはペプチドの不活化や、化学反応中に標的蛋白質／ペプチドが不安定であることなど、いくつかの短所がある。
【０００４】
これらの限界を克服するために、第一に、従来にない、または改変した蛋白質を使用することによって、第二に、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期を延長するための代替方法を使用することによって、代替手法が開発されている。したがって、本質的に安定した蛋白質骨格を選択すること、および高濃度で生じる、免疫グロブリンやアルブミンなどの血漿蛋白質にそのような骨格を結合させる方法を提供することによって、蛋白質薬物の安定化を実施することができる。血漿蛋白質に結合させることは、一般に、分子の薬物動態特性を改善するための有効な手段であり得る。より正確には、蛋白質の半減期を改善するためのアルブミンへの結合が、Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｎｉｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３３，２３８３‐９０，２００２）、「血清アルブミンに親和性を有する単離ペプチド（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）」に記載されている。Ｆａｂ分子に結合させると、ＰＥＧ化Ｆａｂの半減期に匹敵する半減期が得られた。ＩｇＧまたは血清アルブミンに親和性であるペプチドリガンドが開示されている（ＷＯ０１／４５７４６号）。Ｃｅｍｕ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ社（Ｎｙｇｒｅｎ、Ｗｉｇｚｅｌｌ、Ｕｈｌｅｎ、ＥＰ４８６５２５Ｂ１号、ＵＳ６，２６７，９６４号）は、活性蛋白質またはペプチドと、血清アルブミン（たとえばＳｔａｐｈ Ａ）に結合する細菌起源のポリペプチドとの融合体を説明した。これらのペプチドを基にした手法の欠点は、ペプチドが適正に折り畳まれ、かつ治療用蛋白質に融合した場合、血清アルブミンに結合することが可能でなければならないことである。したがって、これらのペプチドは、本質的に不安定であり、従来の抗体での事例のように、ナノモル以下または低ナノモル範囲ではなく、マイクロモル以下の範囲で親和性を有する。従来の抗体分子など、大型の蛋白質の一部として、これらのペプチドのアルブミンへの結合は立体的に阻害されかねない。
【０００５】
２個の機能単位を有する代替ハイブリッド分子は異種特異的抗体に基づく。そのようなハイブリッドは、標的に特異性および親和性を有する第１の実体、およびアルブミンなどの血清蛋白質に特異性および親和性を有する第２の実体を有する、二機能性または異種特異的抗体構築物からなるはずである。しかし、従来の抗体またはＦａｂ断片に基づく、そのような異種特異的構築物には、以下のようないくつかの重大な欠点がある。これらは、複雑であり、２個のポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）から構成される大きい分子であり、したがって哺乳動物発現系で多量に産生するには困難であり、高価なものとなる。さらに、４本鎖（２本のＶＨおよび２本のＶＬ）から構成される二機能性抗体の産生は、非生産的ＶＨ‐ＶＬの組合せを有する分子をもたらし、結果として活性が消失するという固有の危険がある。二重特異性抗体や二機能性ｓｃＦｖなど、従来の抗体のペプチド誘導体に基づく結果を混ぜ合わせた、いくつかの代替法が試行されてきた（ＷＯ０２２０６１５号、ＷＯ９４１３８０４号、ＷＯ９１１９７３９号、ＷＯ９４０９１３１号）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，６３２‐６３６，１９７９）は、血清免疫グロブリン（ＩｇＧ）に二重特異性抗体（従来の抗体に由来する二重特異性構築物）の抗体断片の１つを結合することによって、そのような二重特異性抗体の血清滞留時間が延長することを示唆しているが、血清ＩｇＧではなく血清蛋白質に対する抗体を使用し、二重特異性抗体を安定化できるとは示唆していない。二重特異性抗体は、その露出表面の粘着性、および異なる４つのＶ領域（２つのＶＨ＋２つのＶＬ）間の非生産的会合のために産生が本質的に難しいことが知られている。
【０００６】
たとえば、ＥＰ０７９３５０６Ｂ１号、ＵＳ５，６１２，０３４号、同６，１０３，２３３号、およびＵＳ２００２０００９４４１号に開示されている、血清蛋白質または細胞と安定した共有結合を形成する反応基を使用する、血清蛋白質への共有結合には、反応基による望ましくない標的の修飾という本質的な欠点がある。
【０００７】
アルブミンなどの大型で長命な蛋白質への融合体（Ｓｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ、８９，３２４３‐３２５２（１９９７）、Ｙｅｈら、ＰＮＡＳ、８９，１９０４‐１９０８（１９９２）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ（ＷＯ００２７４３５号））、アルブミンポリペプチドのＮ末端融合体（Ｄｅｌｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＨＧＳ、ＵＳ５，３８０，７１２号、ＵＳ５，７６６，８８３号）、またはＩｇＧのＦｃ部分のＮ末端融合体（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７，５２５‐５３１（１９８９）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１９５‐２００（１９９７）が記載されてきた。そのような融合体は、産生が非効率的であり、望ましくない免疫反応が引き起こされるという欠点がある。
【０００８】
インターフェロンの血清半減期を延長するためのインターフェロンとモノクローナル抗体の複合体が、ＵＳ５，０５５，２８９号に記載されている。そのような手法には、インターフェロンの生体活性を損なうという本質的な危険がある。構築物の大きさが、立体障害問題を引き起こすからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当業界の治療用抗体の問題、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでの短い半減期、不十分な折畳み、発現不足、および不十分な安定性を克服する治療用異種特異的抗体ポリペプチド構築物を提供することが本発明の目的である。さらに、前記異種特異的抗体を得る方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態は、
治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに
血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物である。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、
抗標的単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗標的単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する上記のポリペプチド構築物である。
【００１２】
本発明の一実施形態は、
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する上記のポリペプチド構築物である。
【００１３】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である上記のポリペプチド構築物である。
【００１４】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ヒト化ラクダ科ＶＨＨ抗体である上記のポリペプチド構築物である。
【００１５】
本発明の一実施形態は、前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである上記のポリペプチド構築物である。
【００１６】
本発明の一実施形態は、単一ドメイン抗血清蛋白質抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００１７】
本発明の一実施形態は、標的が、ＴＮＦαである上記のポリペプチド構築物である。
【００１８】
本発明の一実施形態は、配列番号５〜１８のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００１９】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００２０】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００２１】
本発明の一実施形態は、炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００２２】
本発明の一実施形態は、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００２３】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症のどれかである、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００２４】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００２５】
本発明の一実施形態は、標的が、ｖＷＦである上記のポリペプチド構築物である。
【００２６】
本発明の一実施形態は、標的が、コラーゲンである上記のポリペプチド構築物である。
【００２７】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ｖＷＦ ＶＨＨである上記のポリペプチド構築物である。
【００２８】
本発明の一実施形態は、配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００２９】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００３０】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００３１】
本発明の一実施形態は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００３２】
本発明の一実施形態は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００３３】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄のどれかであり、前記状態が冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じている状態である、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００３４】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００３５】
本発明の一実施形態は、標的が、ＩｇＥである上記のポリペプチド構築物である。
【００３６】
本発明の一実施形態は、少なくとも抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩｇＥ ＶＨＨである上記のポリペプチド構築物である。
【００３７】
本発明の一実施形態は、配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００３８】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００３９】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００４０】
本発明の一実施形態は、アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００４１】
本発明の一実施形態は、アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００４２】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、および食事性アレルギーのどれかである、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００４３】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００４４】
本発明の一実施形態は、標的が、ＩＦＮγである上記のポリペプチド構築物である。
【００４５】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩＦＮγ ＶＨＨである上記のポリペプチド構築物である。
【００４６】
本発明の一実施形態は、配列番号２５〜２７によって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００４７】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００４８】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、免疫系が、過敏である疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００５０】
本発明の一実施形態は、免疫系が、過敏である疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００５１】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患のどれかである、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００５２】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００５３】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００５４】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００５５】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００５６】
本発明の一実施形態は、前記標的が疾患の過程に関与している単一標的を対象とする上記のポリペプチド構築物である。
【００５７】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、上記のポリペプチド構築物である。
【００５８】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００５９】
本発明の一実施形態は、前記標的が関与する疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００６０】
本発明の一実施形態は、前記標的が関与する疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００６１】
本発明の一実施形態は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００６２】
本発明の一実施形態は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００６３】
本発明の一実施形態は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００６４】
本発明の一実施形態は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００６５】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００６６】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは上記の核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００６７】
本発明の一実施形態は、
（ａ）上記のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞をポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ、および
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収するステップ
を含む上記の産生方法である。
【００６８】
本発明の一実施形態は、前記宿主細胞が細菌または酵母である上記の方法である。
【００６９】
本発明の一実施形態は、対象の血流中の単一ドメイン抗体の半減期を延長するための方法であって、その抗体に血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を結合することによって、前記抗体が治療用および／または診断用標的を対象とする方法である。
【００７０】
本発明の一実施形態は、前記抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない上記の方法である。
【００７１】
本発明の一実施形態は、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない上記の方法である。
【００７２】
本発明の一実施形態は、前記単一ドメイン抗体がラクダ科ＶＨＨ抗体である上記の方法である。
【００７３】
本発明の一実施形態は、前記血清蛋白質が血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである上記の方法である。
【００７４】
本発明の一実施形態は、前記血清蛋白質が配列番号１〜４のどれかに対応する配列、相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列を含む上記の方法である。
【００７５】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチドもしくは該ポリペプチドをコードすることができる核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明は、それぞれが対象の血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体、およびそれぞれが標的分子を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、ならびに抗標的単一ドメイン抗体がそのような構築物の一部ではない場合の半減期と比較して、前記対象の循環中で構築物の半減期が極めて長期であるという知見に関する。
【００７７】
単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例には、それだけには限らないが、重鎖抗体、元々軽鎖を欠く抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、設計された抗体、および抗体に由来する骨格ではない単一ドメイン骨格が含まれる。単一ドメイン抗体は、当該技術の単一ドメイン抗体のどれでも、またはどんな未来の単一ドメイン抗体でもよい。単一ドメイン抗体は、それだけには限らないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むどんな種からも得ることができる。本発明の一態様によれば、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている自然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、たとえば、ＷＯ９４０４６７８号に開示されている。明瞭にするために、従来の４本鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、本明細書では元々軽鎖を欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインをＶＨＨまたはナノ体として示す。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、たとえば、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコで生じた抗体から得ることができる。ラクダ科に加え他の種も元々軽鎖を欠く重鎖抗体を産生することができ、そのようなＶＨＨも本発明の範囲に属する。
【００７８】
標的を対象とするポリペプチド構築物の１個または複数の単一ドメイン抗体は、同じ配列のものでよい。あるいは、それらの抗体は、すべてが同じ配列を有していなくてもよい。すべてが同じ配列を共有しなくてよいが、同じ標的、その断片、あるいはその１種または複数の抗原を対象とする抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物は本発明の範囲に属する。
【００７９】
本発明によれば、異種特異的分子の結合活性および／または親和性を増大するための、複数の抗標的および／または抗血清蛋白質単一ドメイン抗体の利用方法が提供される。この方式で、本発明にしたがって改変した分子の血清半減期は延長することができる。そのような改変によって特定の治療分子の治療空白（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）が変更され、かつ／または延長される。血清蛋白質に特異的なペプチド、多価形態では産生が困難である二重特異性抗体、（ＰＥＧ化やアシル化などの）化学的修飾を使用する場合など、当該技術分野の代替方法ではこの融通性は得られない。
【００８０】
血清蛋白質を対象とする、ポリペプチド構築物の１個または複数の単一ドメイン抗体は同じ配列でよい。あるいは、これらの抗体は、すべてが同じ配列を有していなくてもよい。すべてが同じ配列を共有しなくてよいが、血清蛋白質、その断片、またはその１種または複数の抗原を対象とする抗血清蛋白質単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物は本発明の範囲内に属する。
【００８１】
別の実施形態では、ポリペプチド構築物の１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体は、１種を超える標的（たとえば、ｖＷＦやコラーゲン）を対象とすることができる。同様に、ポリペプチド構築物の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、１種を超える血清蛋白質（たとえば、血清アルブミンやフィブリノーゲン）を対象としてよい。
【００８２】
本発明により、さらに当業者に知られているＶＨＨは、ＷＯ９４０４６７８号に記載されている、ラクダ科に由来する免疫グロブリンなど、元々軽鎖を欠く免疫グロブリンに由来する重鎖可変ドメインである（以後、ＶＨＨドメインまたはナノ体と呼ぶ）。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子の約１０分の１の大きさである。これらは、単一ポリペプチドであり、極端なｐＨおよび温度条件に耐えて非常に安定している。さらに、これらは、プロテアーゼの作用にも耐性であり、この耐性は従来の抗体では見られない。さらに、ＶＨＨのｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現では、高収量で好適に折り畳まれた機能性ＶＨＨが産生される。さらに、ラクダ科で生じた抗体は、抗体ライブラリを用いて、またはラクダ科以外の哺乳動物の免疫化によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じた抗体によって認識されるエピトープ以外のエピトープを認識する（ＷＯ９７４９８０５号）。そのようなものとして、抗アルブミンＶＨＨは、より効率的な方式で担体蛋白質であることが知られている血清アルブミンと相互に作用し得る。担体蛋白質として、血清アルブミンのエピトープのいくつかは、結合した蛋白質、ペプチド、および小化合物が利用することができない。ＶＨＨは、「異常な」または従来にはない陥凹部などのエピトープに結合（ＷＯ９７４９８０５号）することが知られているので、循環アルブミンへのそのようなＶＨＨの親和性は増大し得る。
【００８３】
本発明は、１個または複数の対象の血清蛋白質を対象とする１個または複数のＶＨＨ、ならびに前記対象の１個または複数の標的分子を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物は、驚くべきことに、抗標的ＶＨＨが前記構築物の一部でない場合の半減期と比較して、前記対象の循環で半減期が極めて長期であるという知見にも関する。さらに、そのような長期の半減期は、アルブミンに特異的な低親和性ペプチドを使用した場合（Ｄｅｎｎｉｓら、ＪＢＣ，２７７，３５０３５号）の数時間と比較して、高親和性抗血清アルブミンＶＨＨのために数日という範囲である。半減期の延長は、本発明者らにより本明細書で、たとえば、実施例１６で、および配列番号５によって表されるポリペプチドによって実証される。さらに、前記構築物は、少なくとも１９日間マウスで依然として無傷でいられる高安定性（実施例１６）、極端なｐＨ耐性、高温安定性、高標的親和性など、ＶＨＨと同じ好都合な特性示すことが判明した。
【００８４】
本発明による標的は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物に結合することができる任意の生体物質である。標的は、たとえば、蛋白質、ペプチド、核酸、オリゴ核酸、糖類、多糖類、糖蛋白でよい。例には、それだけには限らないが、治療用標的、診断用標的、受容体、受容体リガンド、ウイルスコート蛋白質、免疫系蛋白質、ホルモン、酵素、抗原、細胞シグナル伝達蛋白質、またはそれらの断片が含まれる。標的は、未変性蛋白質、またはそれらの断片、その相同配列、その機能部分、または相同配列機能部分でよい。
【００８５】
単一ドメイン抗体、特にＶＨＨの特性は、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどの供給源に由来する抗体（すなわち従来の抗体）およびそのヒト化誘導体の特性に有利に匹敵する。従来の抗体は、室温で安定しておらず、必須の冷蔵研究設備、冷蔵庫、および冷蔵輸送が不可欠であり、調製および貯蔵は冷蔵しなければならず、このことは時間および費用の上昇の一因となる。発展途上国では、冷蔵が実施不可能な場合もある。さらに、前記抗体の作製または小規模産生は高価である。というのは、無傷で活性な抗体の発現に必要な哺乳動物細胞系は、時間および装置の点で高度の支援が必要であるが収量は極めて少ないからである。さらに、従来の抗体の結合活性はｐＨ次第であり、したがって、たとえば、胃出血の治療や胃手術など、通常の生理ｐＨ範囲外の環境における使用には不適当である。さらに、従来の抗体は、低ｐＨまたは高ｐＨで不安定であり、したがって経口投与には適当でない。しかし、ＶＨＨは、極端なｐＨ、変性試薬、高温などの過酷な条件に耐えることが実証されているので（Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年３月１９日、４１（１１），３６２８‐３６）、それらの抗体は経口投与による送達に相応しいものとなる。さらに、従来の抗体の結合活性は、温度次第であり、したがって生体活性温度範囲外（たとえば、３７±２０?Ｃ）の温度で実施するアッセイやキットで使用するのには不適当である。
【００８６】
さらに、ＶＨＨは、より溶解性であり、それは従来の抗体と比較してより高濃度で貯蔵および／または投与できることを意味している。本発明のポリペプチドは、通常の生理範囲を超えたｐＨおよび温度でも結合活性を保持し、それは極端なｐＨおよび温度条件でペプチドを使用できることを意味し、その極端な条件とは胃手術、胃出血の制御、室温で実施する検定など、血小板介在凝集の調節を必要とするものである。本発明のポリペプチドは、極端なｐＨで長期の安定性も示し、これは経口投与による送達に適当であることを意味している。高価な哺乳動物細胞培養施設も必要とする従来の抗体とは異なって、本発明のポリペプチドは、大腸菌や酵母などの好都合な組換え宿主生物中で発酵によって費用効率よく生成することができ、実現可能な発現レベルは高い。本発明のポリペプチドの収量の例は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの（大腸菌）であり、１ｇ／ｌ（酵母）までである。本発明のポリペプチドは、広範な異なる抗原型への高結合親和性、および従来の抗体によって認識されないエピトープへ結合する能力も示し、たとえば、このポリペプチドは、陥凹部に浸透し酵素機能阻害を示す潜在能力を持つ、長いＣＤＲを基にしたループ構造体を示す。さらに、結合は、しばしば、ＣＤＲ３ループのみによって生じるので、ＣＤＲ３に由来するペプチドを治療に使用することは可能なはずであると想定される（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６：２６２８５‐９０）。本発明のポリペプチドは、酵素または毒素との融合蛋白質として完全な結合能力を保持することもできる。
【００８７】
本発明は、それぞれが１個または複数の対象の血清蛋白質を対象とする１個または複数のＶＨＨ、ならびにそれぞれが１個または複数の標的分子を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物であって、ＶＨＨがラクダ科単一ドメイン重鎖抗体の従来クラスに属する構築物にも関する。本発明は、それぞれが対象の１個または複数の血清蛋白質を対象とする１個または複数のＶＨＨ、ならびにそれぞれが１個または複数の標的分子を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物であって、ＶＨＨがヒト様配列を有する、ラクダ科単一ドメイン重鎖抗体クラスに属する構築物にも関する。ＴＮＦαに結合する配列番号１２によって表されるＶＨＨ配列、およびマウスアルブミンに結合する第２のＶＨＨは、このクラスのＶＨＨペプチドに属する。そのようなものとして、このクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に高アミノ酸配列相同性を示し、そこからの望ましくない免疫応答を懸念することなく、さらにヒト化する負担もなく、前記ペプチドを患者に直接投与することができるであろう。
【００８８】
配列番号１、３、および４によって表されるラクダ科単一ドメイン抗体のヒト様クラスは、ＷＯ０３０３５６９４号記載されており、ヒト起源の従来の抗体または他の種由来の抗体に通常見られる疎水性ＦＲ２残基を含むが、親水性におけるこの損失は位置１０３で他の置換基によって補われ、この位置１０３は二重鎖抗体由来のＶＨ中に存在する保存トリプトファン残基に取って代わる。そのようなものとして、これら２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に高アミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、そこからの望ましくない免疫応答を懸念することなく、さらにヒト化する負担もなく、ヒトに直接投与されるであろう。
【００８９】
したがって、本発明の一態様は、それを必要とする患者に抗血清アルブミンポリペプチドを直接投与することを可能にすることであり、その場合、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨのヒト化クラスに属し、配列番号１、３、または４のどれかによって表される配列を含む。
【００９０】
本明細書で使用される対象は、循環液に血清蛋白質が含まれる循環系を有する任意の哺乳動物である。循環系の例には、血液およびリンパ系が含まれる。動物の例は、それだけには限らないが、ウサギ、ヒト、ヤギ、マウス、ラット、ウシ、子ウシ、ラクダ、ラマ、サル、ロバ、モルモット、ニワトリ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマなどが含まれる。
【００９１】
本発明の一実施形態は、治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびにそれぞれが１個または複数の血清蛋白質またはポリペプチドを対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物。既に上記したように、抗標的単一ドメイン抗体は、同じ配列を有してよい。あるいは、少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体は、異なる配列を有してよいが、同じ標的、その断片、またはその抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープを対象とする。同様に、抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、同じ配列を有してよい。あるいは、少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、異なる配列を有してよいが、同じ血清蛋白質、その断片、またはその抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープを対象とする。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、１個を超える抗標的単一ドメイン抗体が、異種特異的ポリペプチド構築物中に存在する場合、各抗標的単一ドメイン抗体は異なる標的を対象（たとえばｖＷＦやコラーゲンを対象）とすることができる。同様に、１個を超える抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が存在する場合、各抗血清単一ドメイン抗体は、異なる血清蛋白質を対象（たとえば血清アルブミンやフィブリノーゲンを対象）とすることができる。
【００９３】
本発明の一実施形態は、抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する異種特異的ポリペプチドである。
【００９４】
本明細書で開示した構築物は、単一ドメイン抗体の有利な特性（たとえばＶＨＨ）を保持し、個体の循環中で存在期間が長い。したがって、そのような構築物は、数日間対象の血清中を循環することができ、治療の頻度や対象の不便を減少させ、治療費を削減する。さらに、異種特異的ポリペプチド構築物の半減期が、構築物中に存在する抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数によって制御することができることは本発明の態様である。制御可能な半減期は、いくつかの状況、たとえば、治療異種特異的ポリペプチド構築物の時間調節投与の適用で、または所望の治療効果を得る際に望ましい。
【００９５】
本発明の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は、全長異種特異的ポリペプチド構築物の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は全長異種特異的ポリペプチド構築物の機能部分でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は、全長異種特異的ポリペプチド構築物の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は、全長異種特異的ポリペプチド構築物の相同配列の機能部分でよい。本発明の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物には、異種特異的ポリペプチド構築物配列を含めてよい。
【００９６】
本発明の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）またはその相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体の機能部分でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体の相同配列の機能部分でよい。
【００９７】
本発明の別の態様によれば異種特異的ポリペプチド構築物は親配列の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は機能部分親配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は親配列の相同配列の機能部分でよい。
【００９８】
本明細書では、本発明の相同配列には、本発明のポリペプチドの機能特性を実質上変化させない、１個または複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含めてよい。アミノ酸の欠失または置換数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０アミノ酸までであることが好ましい。
【００９９】
本発明の相同配列には、ヒト化されている本発明の単一ドメイン抗体を含めてよい。
【０１００】
ヒト化とは変異させることを意味し、その結果ヒト患者に投与したとき免疫原性は低くまたは存在しなくなる。本発明による単一ドメイン抗体のヒト化には、ポリペプチドがその通常の特性を失うことなく、ヒトコンセンサス配列中に見られるそれらのヒト対照物によって、１個または複数のアミノ酸を置換するステップが含まれ、すなわち、ヒト化は得られたポリペプチドの抗原結合能力にあまり影響を与えない。そのような方法が当業者によって知られている。ラクダ科ＶＨＨに応用されるヒト化技術は、以下の残基のどれかの置換を単独でまたは組み合わせて含む方法によって実施することもできる。すなわち、いくつかのＶＨＨは、親水性特性を有する典型的なラクダ科本来の残基を位置３７、４４、４５、および４７に含む。位置４４および４５（Ｅ４４ＧおよびＲ４５Ｌ）で親水性残基をヒト疎水性残基によって置換しても、結合および／または阻害に対して影響を与えなかった。ＦＲ１の位置１、５、２８、３０など、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、９４など、およびＦＲ４の位置１０３、１０４、１０８、１１１などの残基の置換によってさらにヒト化を行う必要が生じるかもしれない（数字はすべてＫａｂａｔによる）。
【０１０１】
本発明の一実施形態は、以下の残基のどれかを単独でまたは組み合わせて置換するステップを含む、ＶＨＨをヒト化する方法である。
ＦＲ１の位置１、５、２８、および３０
ＦＲ２の位置４４および４５の本来のアミノ酸
ＦＲ３の残基７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ならびに
ＦＲ４の位置１０３、１０４、１０８、および１１１
（番号付けはＫａｂａｔの番号付けによる）
【０１０２】
いくつかのラクダ科ＶＨＨ配列は、ヒトＶＨフレームワーク領域に高い配列相同性を示し、したがってそれに由来する免疫応答の懸念および追加のヒト化の負担なしに前記ＶＨＨを患者に直接投与することができる。したがって、本発明の一態様は、前記ＶＨＨが、ヒトＶＨフレームワーク領域に高い相同性を示す場合、ＶＨＨをヒト化することなく異種特異的ポリペプチド構築物を形成できるようにする。
【０１０３】
本発明の相同配列は、たとえば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、グアナコなど、別の種に由来する本発明の配列でよい。
【０１０４】
相同配列が、配列相同性を示す場合、それは本発明の単一ドメイン抗体で高い配列相同性（７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超える配列相同性）を提供する配列を意味し、親配列に類似する特性、すなわち、親和性を特徴とすることが好ましく、前記同一性は周知の方法を使用して算出される。
【０１０５】
本発明による相同配列は、厳密なハイブリッド形成条件下で、未変性配列をコードすることができるヌクレオチド配列の逆相補鎖にハイブリッド形成することができる、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、または１０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチド配列（ＳＡＭＢＲＯＯＫら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、実験マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州、によって記載されているものなど）をさしてよい。
【０１０６】
本明細書では、機能部分は、当該相互作用が１×１０−６Ｍ以上の親和性で維持されるのに十分な長さの単一ドメイン抗体をさす。
【０１０７】
あるいは、本発明の単一ドメイン抗体の機能部分は、完全なアミノ酸配列の部分的欠失を含むが、依然として標的または血清蛋白質との結合および相互作用に必要な結合部位および蛋白質ドメインを維持する。
【０１０８】
本明細書では、本発明の単一ドメイン抗体の機能部分は、この配列の１００％未満（たとえば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、など）をさすが、５以上のアミノ酸または１５以上のヌクレオチドを含む。
【０１０９】
本発明の単一ドメイン抗体の部分は、この配列の１００％未満（たとえば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％など）をさすが、５以上のアミノ酸または１５以上のヌクレオチドを含む。
【０１１０】
ＴＮＦα、ＩＦＮγ受容体、血清蛋白質（たとえば、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリン、フィブリノーゲン）、ＩＦＮγなど、本明細書に記載した標的は前記標的の断片でよい。したがって、標的は、免疫応答を引き出すことができる、前記標的の断片でもある。標的は、完全長標的に対して引き起こされた単一ドメイン抗体に結合することができる、前記標的の断片でもある。
【０１１１】
本明細書で使用される断片は、この配列の１００％未満（たとえば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％など）をさすが、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のアミノ酸を含む。断片は、当該相互作用が１×１０−６Ｍ以上の親和性で維持されるのに十分な長さのものである。
【０１１２】
本明細書で使用される断片は、野生型標的に対して生じた単一ドメイン抗体に結合するための標的の能力を実質的に変化させない、１個または複数のアミノ酸の任意選択の挿入、欠失、および置換もさす。アミノ酸の挿入、欠失、または置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０アミノ酸までであることが好ましい。
【０１１３】
血清蛋白質は、対象の血清に見られるどんな適当な蛋白質またはその断片でもよい。本発明の一態様では、血清蛋白質は、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリン、またはフィブリノーゲンである。有効な治療に必要な半減期および／または標的抗原の区画化などの所期の使用に依存して、ＶＨＨパートナーは上記血清蛋白質の１種を対象とすることができる。
【０１１４】
標的を対象とする単一ドメイン抗体は、１０−６Ｍを超える親和性でその標的に結合することができる単一ドメイン抗体を意味する。
【０１１５】
本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、当該技術分野で知られている方法、またはいかなる未来の方法にしたがって、当業者が作製することができる。たとえば、ラクダを免疫化し、そこからハイブリドーマを得ること、または当該技術分野で知られている分子生物技術を使用して、単一ドメイン抗体ライブラリをクローニングし、続いてファージ提示法の使用による選択によってなど、当該技術分野で知られている方法を使用してＶＨＨを得ることができる。
【０１１６】
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、血清蛋白質のポリペプチドまたは蛋白質全体を対象とすることができる。抗標的単一ドメイン抗体は、標的全体の前記標的のポリペプチドを対象とすることができる。免疫原性ポリペプチドについて蛋白質を走査する方法は、当該技術分野で周知である。
【０１１７】
単一ドメイン抗体は、当該技術分野で知られている方法または任意の未来の方法を使用して結合することができる。たとえば、抗体は化学的に架橋することによって融合することができ、Ｂｌａｔｔｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４、１５１７‐１５２４、ＥＰ２９４７０３号に記載されているものなど、アミノ酸残基を有機誘導体化剤と反応させることによって融合することができる。あるいは、単一ドメイン抗体は、ＤＮＡレベルで遺伝子的に融合することができ、すなわち、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体、ならびに１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体を含む完全ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物を形成することができる。二価または多価ＶＨＨポリペプチド構築物を産生する方法が、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／３４１０３号に開示されている。多数の単一ドメイン抗体を相互に接合する一方式は、単一ドメイン抗体コード配列を直接またはペプチドリンカーを介して結合することによる遺伝子経路である。たとえば、第１の単一ドメイン抗体のＣ末端を次の単一ドメイン抗体のＮ末端と結合することができる。三価、四価などの機能性構築物の構築および産生に向けて追加の単一ドメイン抗体を結合するために、この結合方式は延長することができる。
【０１１８】
本発明の態様は、本発明による異種特異的ポリペプチド構築物の投与であり、これにより注射の必要性が回避される。従来の抗体を基にした治療薬は、薬物として著しい潜在能力を有している。というのは、これらは、その標的に対して極めて優れた特異性を有し、固有の毒性も低いからである。しかし、これらの抗体には１つの重大な欠点がある。これらは、複雑な大型の分子であり、したがって比較的不安定であり、プロテアーゼによる分解に敏感である。これは、従来の抗体薬物が、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与できないことを意味する。というのは、こうした薬物が、これらの部位での低ｐＨやこれらの部位および血中でのプロテアーゼの作用に耐性ではなく、かつ／またはその大きさのためである。こうした薬物は、これらの問題のいくつかを克服するために、（静脈内、皮下など）注射によって投与しなければならない。注射による投与は、皮下用注射器または針を正確安全に使用するために専門家の訓練を必要とする。さらに、滅菌装置、治療用ポリペプチド液体製剤、滅菌かつ安定形での前記ポリペプチドのバイアル包装、および対象で針の侵入に適当な部位が必要とされる。さらに、一般に、対象は注射を受ける前後で身体的および心理的ストレス経験する。本発明の態様は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を提供することによって、従来技術のこうした問題を克服する。前記構築物は、十分に小さく、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的な、または吸入による送達に耐性で安定しており、実質的に活性を消失することはない。本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、注射の必要性を回避し、費用／時間の削減になるのみならず、対象にとってより好都合、より快適である。
【０１１９】
本発明の一実施形態は、標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含み、抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物であり、この抗標的治療化合物は不活化されることなく胃環境を通過することができる。
【０１２０】
当業者によって知られているように、ひとたび、前記ポリペプチド構築物を得ることができれば、（胃、大腸などの）正しい部位で最大量のＶＨＨを放出するために、製剤技術を応用することができる。この送達方法は、その標的が消化器系内に位置する疾患症状の治療、予防、および／または緩和に重要である。
【０１２１】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的な１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく胃環境を通過できる治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１２２】
本発明の別の実施形態は、不活化されることなく胃環境を通過することができる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１２３】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく消化器系に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１２４】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１２５】
本発明の別の実施形態は、膣路および／または直腸路に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書の標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１２６】
非限定的な例では、本発明による製剤は、ゲル、クリーム、座薬、フィルムの形をした、またはスポンジの形をした、あるいは時間の経過につれて活性成分を静かに放出する膣リングとして、１個または複数の標的を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を含む（そのような製剤は、ＥＰ７０７４７３号、ＥＰ６８４８１４号、ＵＳ５６２９００１号に記載されている）。
【０１２７】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的な１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経膣投与および／または経直腸投与することによって、膣路および／または直腸路への治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、膣路および／または直腸路に送達される抗標的治療化合物によって、不活化されることなく調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１２９】
本発明の態様は、対象の膣路および／または直腸路に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく膣路および／または直腸路に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３０】
本発明の態様は、対象の膣路および／または直腸路に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は、鼻、上気道、および／または肺に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１３２】
非限定的な例では、本発明による製剤は、鼻内スプレー（たとえばエアロゾル）または吸入器の形をした、１個または複数の標的を対象とする、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を含む。本構築物は、小さいので、治療用ＩｇＧ分子より極めて効果的にその標的に到達することができる。
【０１３３】
本発明の態様は、口または鼻を通る吸入によって、対象に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することにより、上気道および肺に送達した治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法であり、その場合、１個または複数の単一ドメイン抗体は疾患に関係付けられる抗原に特異的である。
【０１３４】
本発明の別の態様は、分散可能ＶＨＨ組成物であり、特に、ＵＳ６５１４４９６号に記載されているものなど、ＶＨＨ組成物の分散可能な乾燥粉である。これらの乾燥粉組成物は、平均粒子径が０．４〜１０ｍｍ(nm)の範囲の複数の分離した乾燥粒子を含む。そのような粉は、吸入デバイスで容易に分散させることができる。ＶＨＨは、そのような組成物に特に適切である。凍結乾燥物質は、その高い可溶性（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７４，２７７‐３０３，（２００１））のために、（吸入後の肺で）容易に溶解することができる。あるいは、そのような凍結乾燥ＶＨＨ製剤を希釈液によって元に戻して、皮下投与に適した安定した再構成製剤を得ることができる。たとえば、アレルギー性喘息の治療に有用な抗ＩｇＥ抗体製剤（実施例１、ＵＳ６２６７９５８号、ＥＰ８４１９４６号）が調製されてきた。
【０１３５】
本発明の別の実施形態は、不活化されることなく、鼻、上気道、および／または肺に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１３６】
本発明の態様は、対象の鼻、上気道、および／または肺に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、鼻、上気道、および肺に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３７】
本発明の態様は、対象の鼻、上気道、および／または肺に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく、鼻、上気道、および／または肺に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３８】
本発明の態様は、対象の鼻、上気道、および／または肺に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３９】
本発明の一実施形態は、腸粘膜に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記疾患は腸粘膜透過性を高める。その小さい寸法のために、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、腸粘膜透過性の上昇を引き起こす疾患を患う対象で、より効率よく腸粘膜を通過し血流に到達することができる。
【０１４０】
本発明の態様は、対象に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、腸粘膜に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法であり、その場合、前記疾患が腸粘膜透過性を高める。
【０１４１】
この工程は、本発明の別の態様である能動輸送担体の使用によって、さらに強化することができる。本発明のこの態様では、腸壁を通り血流に至る移送を強化する担体にＶＨＨを融合する。非限定的な例では、この「担体」は、治療用ＶＨＨに融合される第２のＶＨＨである。そのような融合構築物は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製される。「担体」ＶＨＨは、腸壁を通り抜ける能動輸送を誘発する腸壁上の受容体に特異的に結合する。
【０１４２】
本発明の別の実施形態は、腸粘膜に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記疾患は腸粘膜透過性を高める。
【０１４３】
本発明の態様は、対象に本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく腸粘膜に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１４４】
本発明の態様は、対象に本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１４５】
この工程は、本発明の別の態様 能動輸送担体の使用によって、さらに強化することができる。本発明のこの態様では、腸壁を通り血流に至る移送を強化する担体に、本明細書に記載した異種特異的ポリペプチド構築物を融合する。非限定的な例では、この「担体」は前記ポリペプチドに融合されるＶＨＨである。そのような融合構築物は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製される。「担体」ＶＨＨは、腸壁を通り抜ける能動輸送を誘発する腸壁上の受容体に特異的に結合する。
【０１４６】
本発明の一実施形態は、標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含み、効率的に舌下組織を通過することが可能な抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物である。本明細書で開示した前記ポリペプチド構築物製剤、たとえば、錠剤、スプレー、ドロップは、舌下に置かれ粘膜を通り抜けて舌下毛細管網に吸収される。
【０１４７】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的なＶＨＨを舌下投与することによって、効率的に舌下組織を通過することが可能な治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、舌下組織を通り抜けることができる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１４９】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく舌下組織に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５０】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５１】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含み、効果的に皮膚を透過できる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物である。前記ポリペプチド構築物製剤、たとえば、クリーム、フィルム、スプレー、ドロップ、パッチは皮膚に載せられて透過する。
【０１５２】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的な１個または複数の単一ドメイン抗体を含む本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を局所投与することによって、効果的に皮膚を透過できる治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１５３】
本発明の別の態様は、アレルギー性疾患など、眼疾患を治療するための局所眼用組成物として、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を使用することであり、その方法は本明細書で開示したポリペプチド構築物を含む眼用組成物の局所投与を含み、前記構築物は１個または複数の抗ＩｇＥ ＶＨＨを含む（実施例１、実施例２）。
【０１５４】
本発明の別の実施形態は、効果的に皮膚を透過できる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１５５】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を局所投与することによって、不活化されることなく皮膚に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５６】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を局所投与することによって、対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５７】
本発明の別の実施形態では、異種特異的ポリペプチド構築物は、さらに、肺胞腔から血液に前記異種特異的ポリペプチド構築物を輸送するための能動輸送担体として作用する担体単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）を含む。
【０１５８】
担体をさらに含むポリペプチド構築物は、粘膜表面（気管支上皮細胞）上に存在する受容体に特異的に結合し、肺胞腔から血液にポリペプチドを能動輸送する。担体単一ドメイン抗体は、ポリペプチド構築物に融合させることができる。そのような融合構築物は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製され、本明細書に記載されている。「担体」単一ドメイン抗体は、表面を通り抜ける能動輸送を誘発する粘膜表面上の受容体に特異的に結合する。
【０１５９】
本発明の別の態様は、経鼻投与直後にどの単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）が血流に能動輸送されるかを決定する方法である。同様に、未処置のまたは免疫ＶＨＨファージライブラリを経鼻投与することができ、血流に能動輸送されているファージをレスキュー（RESCUE)するために、投与後の様々な時点後に血液または臓器を単離することができる。肺胞腔から血流への能動輸送用受容体の非限定的な例は、Ｆｃ受容体Ｎ（ＦｃＲｎ）である。本発明の一態様には、本方法によって同定したＶＨＨ分子が含まれる。次いで、経鼻投与直後、血流中で治療用ＶＨＨを対応する標的に送達するための担体ＶＨＨとしてそのようなＶＨＨを使用することができる。
【０１６０】
本発明の一実施形態は、治療化合物を静脈内送達する必要がある疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、血流によって治療化合物を送達する必要がある疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１６１】
本発明の別の実施形態は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。前記疾患を治療しまたは診断するために本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を使用することによって、前記構築物の枯渇が遅延される。
【０１６２】
本発明の別の実施形態は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、数日間患者の血清中を循環できる治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。前記疾患を治療しまたは診断するために、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を使用することによって、治療の頻度が減少するので治療費も減少する。
【０１６３】
本発明の別の実施形態は、アレルギーに関連付けられる疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、アレルギーに関連付けられる疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。
【０１６４】
上記の本発明の態様および実施形態は、前記異種特異的ポリペプチド構築物の抗血清単一ドメイン抗体が、配列番号１〜４によって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。
【０１６５】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号５〜１８のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗ＴＮＦαラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６６】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗ｖＷＦラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６７】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗ＩｇＥラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６８】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明による異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号２５〜２７のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗インターフェロンγラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６９】
アレルギーに関連し、抗標的単一ドメイン抗体が対象とすることができる標的の非限定的な例はＩｇＥである。対象は、生存中、ヤケヒョウヒダニやイエダニなどの無害な寄生虫、または凝集塊、プラスチック、金属などの物質対してアレルギー応答を引き起こし得る。これにより免疫応答カスケードを開始するＩｇＥ分子が誘導される。本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であ る。本発明の一態様では、前記抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体は、ＩｇＥと肥満細胞および好塩基球上のその受容体との相互作用を阻止するので、免疫学カスケードの開始と、それに続くアレルギー反応が遮断される。別の態様では、抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、対象の血清蛋白質の１種を対象とする。このようにして、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、一般的なまたは異常なアレルゲンによるアレルギー応答を低減しまたは防止する。さらに、構築物の血中での存在期間が長いので治療空白は延長される。
【０１７０】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）は、様々な疾患、たとえば、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患で重要な役割を果たすと考えられている。ＴＮＦ‐αおよびその受容体（ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ）はどちらも詳細に研究されてきた。生理活性形態のＴＮＦ‐αは、三量体であり、近傍サブユニットによって形成された溝は、サイトカイン受容体の相互作用に重要である。このサイトカインの作用を相殺するためのいくつかの戦略が開発されており、現在、様々な病態の治療に使用されている。
【０１７１】
ＴＮＦに対して十分な特異性および選択性を有するＴＮＦ阻害剤は、炎症性疾患を予防しまたは治療するための効果的な予防用または治療用薬剤化合物であり得る。しかし、そのような標的配列に対して、十分な作用強度および選択性を備えた小型の化学物質（ＮＣＥ）を開発することは、極めて困難であり工程も冗長である。他方で、抗体を基にした薬物は、薬物として顕著な可能性を有している。というのは、こうした薬物は、その標的に対する特異性が極めて優れており、固有の毒性も低いからである。さらに、新規化学物質（ＮＣＥ）の開発と比較して、開発時間をかなり削減することができる。しかし、ＴＮＦ‐αでの事例のように、リガンドの受容体結合ドメインが溝の中に包埋されている多量体蛋白質に対して、従来の抗体を引き出すことは困難である。
【０１７２】
抗標的単一ドメイン抗体がＴＮＦαを対象とする本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、安定性、大きさ、確実な発現などの特性を原因とする、従来技術のペプチド治療薬を使用して経験する問題を克服する。さらに、本発明者らは、多量体ＴＮＦα中に溝が存在するにもかかわらず、異種特異的ポリペプチド構築物は、依然としてＴＮＦαに強力に結合することができることを見出している。
【０１７３】
本発明の別の実施形態は、炎症分子が介在する疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、炎症分子が介在する疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、炎症分子が介在する疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。
【０１７４】
本発明の一態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物の単一ドメイン抗体の標的は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を対象とする。ＴＮＦαは、様々な疾患、たとえば、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患で重要な役割を果たすと考えられている。
【０１７５】
抗標的単一ドメイン抗体は、ＴＮＦα全体、それらの断片、またはその相同配列の断片を対象とすることができる。
【０１７６】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、前記異種特異的ポリペプチドの配列は配列番号５〜１８のどれかに対応する。その中の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体は、ＴＮＦαに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０１７７】
本発明の一実施形態は、炎症性疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。ＴＮＦαは、炎症過程に関与し、ＴＮＦαの作用を遮断することによって抗炎症作用を得ることができ、これは、たとえばクローン病など、ある種の疾患状態において非常に望ましい。こうした異種特異的ポリペプチド構築物の経口送達によって、そのような分子が大腸の罹患している部位に活性形で送達される。これらの部位は、重度の炎症状態にあり、ＴＮＦα産生細胞を含む。これらの異種特異的ポリペプチド構築物は、ＴＮＦαを局所的に無力化することができ、身体全体にわたって分配されるのを防ぎ、それによって負の副作用を制限する。ミクロコッカスラクティス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）などの遺伝子改変微生物は、抗体断片を分泌することができる。腸で抗体断片を局所的に産生し送達するために、そのような改変微生物をビヒクルとして使用することができる。ＴＮＦα無力化異種特異的ポリペプチド構築物を産生する株を使用することによって、炎症性腸疾患を治療できるはずである。
【０１７８】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０１７９】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０１８０】
本発明の別の態様は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含む、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１８１】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１８２】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１８３】
本発明の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体が、どんなクラスのＶＨＨからも得られることは本発明の態様である。たとえば、これらの抗体は、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい。
【０１８４】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記異種特異的ポリペプチドは、配列番号５〜１８のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。配列番号５〜１８には、抗ＴＮＦαラクダ科ＶＨＨ、および抗マウス血清アルブミンラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１８５】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、配列番号１〜４のどれか（抗血清蛋白質ラクダ科ＶＨＨ）、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０１８６】
驚くべきことに、配列番号５〜１８のどれかに対応する配列を含む異種特異的ポリペプチド構築物が、その標的に対して予想以上の親和性、および循環系で長期の半減期を示すことを本発明者らは見出している。
【０１８７】
血小板介在凝集は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）結合コラーゲンが、血小板および／または血小板受容体に接着し（両方の例はｇｐＩａ／ＩＩａ、ｇｐＩｂ、またはコラーゲン）、最終的に血小板を活性化させる過程である。血小板の活性化によって、フィブリノーゲン結合、および最終的に血小板の凝集がもたらされる。血小板介在凝集を撹乱できるかどうかに、以下に記載する疾患の治療を含む多くの適用例がかかっている。本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、凝固を有効に防止し、その半減期は制御可能なので、外科手順、たとえば、限られた時間で血小板介在凝集を阻害する必要がある手順にこれらの構築物を使用することができる。
【０１８８】
ＶＨＨなどの一価の単一ドメイン抗体は、高ずり応力下で血小板凝集阻害を測定するための実験で、驚くほど高い血小板凝集阻害を示す。すなわち、血小板凝集の５０％阻害は４〜２５ｎＭの濃度で得られた。比較では、コラーゲンとの相互作用を阻害するｖＷＦ特異的抗体に由来するＦａｂ断片８２Ｄ６Ａ３は、約２０倍高い濃度で血小板凝集を５０％阻害する（Ｖａｎｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８：３７８１５‐３７８２１）。ＥＬＩＳＡでの一価ＶＨＨのＩＣ５０値が、８２Ｄ６Ａ３のＩｇＧのＩＣ５０値の２２５分の１までであることを考慮すると、これらの結果は予想外であった。
【０１８９】
これは、ＩｇＧ抗体が巨大分子との相互作用には適さないことを明瞭に示しており、この巨大分子は、血小板介在凝集に関与するものなど、凝集の開始または途中の分子である。ｖＷＦは、６０モノマーまでの多量体を作製する（最終多量体は大きさが２０００万ダルトンまで）。実際、Ａ３ドメインがすべて、８２Ｄ６Ａ３に利用できるわけではないことは既にわかっている（Ｄｏｎｇｍｅｉ ＷＵ，Ｂｌｏｏｄ，２００２，９９，３６２３‐３６２８）。さらに、大型の従来の抗体は、たとえば、損傷血管壁部位で血小板が介在した凝集中、組織の透過を制限するはずである。
【０１９０】
単一ドメイン抗体の構造は特に特有である。たとえば、ラクダ科抗体に由来するＶＨＨ分子は、既知の中では最小（約１５ｋＤａ、すなわち、従来のＩｇＧの大きさの１０分の１）の無傷抗原結合ドメインであり、したがって高密度組織への送達に、かつ血小板介在凝集過程に参加し、またはこれを開始させている巨大分子間の限られた空間への往行に非常に適している。
【０１９１】
本発明者らの知る限り、実験によって、そのような大きい巨大分子間の相互作用の阻害には、大型の無傷抗体よりも小型のＶＨＨが有利であることが示されたのは初めてである。
【０１９２】
ナノ体は小型であり、したがって透過に有利であるにもかかわらず、そのような小分子が、（６０モノマーまでの）ｖＷＦやコラーゲンなどの大きいポリマー間の相互作用をそのような高効率で阻害できることは依然として驚くべきことである。ｖＷＦの大きい多量体形しか止血活性を持たないことは記載されている（Ｆｕｒｌａｎ，Ｍ，．１９９６，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７２：３４１‐３４８）。多量体ｖＷＦのコラーゲンへの結合は、単量体ｖＷＦ断片の結合の１００倍の親和性で生じる。
【０１９３】
高ずり応力実験の結果によって、患者への投与には低用量にする必要があることが示唆される。したがって、（免疫原性や出血問題など）副作用は少ないと予想される。
【０１９４】
血小板介在凝集、たとえば、ｖＷＦ‐コラーゲン結合、ｖＷＦ‐血小板受容体接着、コラーゲン‐血小板受容体接着、血小板の活性化、フィブリノーゲン結合、および／または血小板凝集などを含む過程を調節する異種特異的ポリペプチド構築物を提供することは本発明の態様である。前記異種特異的ポリペプチド構築物は、ｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲンを対象とする単一ドメイン抗体に由来する。
【０１９５】
抗標的単一ドメイン抗体は、ｖＷＦ全体、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲン、またはそれらの断片、あるいはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０１９６】
本発明の一態様によれば、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物が対象とする標的は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）である。本発明の別の態様によれば、標的は、ｖＷＦのＡ１またはＡ３ドメインである。本発明の別の態様によれば、標的はｇｐＩｂである。本発明の別の態様によれば、標的はｇｐＩａ／ＩＩＡである。本発明の別の態様によれば、標的はコラーゲンである。
【０１９７】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質ＶＨＨに融合された、１個または複数の抗ｖＷＦ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、前記異種特異的ポリペプチドの配列は配列番号１９〜２１のどれかに対応する。その中の抗ｖＷＦ単一ドメイン抗体は、ｖＷＦに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０１９８】
本発明の一実施形態は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体標的に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲンのどれかである。前記疾患には、一時的脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄が含まれる。前記状態には、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じた状態が含まれる。
【０１９９】
本発明の一態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかであり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２００】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体標的に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかであり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２０１】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法であって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体標的に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含み、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかであり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２０２】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかである。
【０２０３】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかである。
【０２０４】
本発明の抗ｖＷＦ、抗ｖＷＦ Ａ１もしくは抗ｖＷＦ Ａ３、または抗コラーゲンＶＨＨ類が、どんなクラスのＶＨＨからも得ることができることは本発明の態様である。たとえば、これらは、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨ、ドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい。
【０２０５】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗ｖＷＦ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記異種特異的ポリペプチドは、配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。配列番号１９〜２１には、抗ｖＷＦ ＶＨＨおよび抗マウス血清アルブミンＶＨＨが含まれる。
【０２０６】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲンのどれかであり、かつその場合、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、配列番号１〜４のどれか、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０２０７】
対象は、生存中、無害な寄生虫（たとえば、ヤケヒョウヒダニ、イエダニ）または物質（凝集塊、プラスチック、金属）に対してアレルギー応答を引き起こす可能性がある。これにより免疫応答カスケードを開始するＩｇＥ分子が誘導される。本発明の一態様は、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、ＩｇＥと肥満細胞および好塩基球上のその受容体との相互作用を防止する。そのようなものとして、これらの構築物は、免疫学カスケードの開始であるアレルギー反応を防止する。
【０２０８】
本発明の一態様によれば、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物が対象とする標的はＩｇＥである。前記抗体は、ＩｇＥ全体、またはそれらの断片、あるいはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０２０９】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、その場合、前記異種特異的ポリペプチドの配列は、配列番号２２〜２４のどれかに対応する。その中の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体は、ＩｇＥに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０２１０】
抗標的単一ドメイン抗体は、ＩｇＥα全体、またはそれらの断片、あるいはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０２１１】
本発明の一実施形態は、アレルギーに関連付けられる疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。前記疾患には、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、食事性アレルギーなど、広範なＩｇＥ介在疾患が含まれる。
【０２１２】
本発明の一態様は、アレルギーに関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記ＶＨＨは、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２１３】
本発明の別の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２１４】
本発明の別の態様は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含む、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０２１５】
本発明の別の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤の調製に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０２１６】
本発明の別の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０２１７】
本発明の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体が、どんなクラスのＶＨＨからも得ることができることは本発明の態様である。たとえば、これらは、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。前記ＶＨＨは、ラクダ科から得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨ、ドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい。
【０２１８】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、異種特異的ポリペプチドが、配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。配列番号２２〜２４には、抗ＩｇＥラクダ科ＶＨＨおよび抗マウス血清アルブミンラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０２１９】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、配列番号１〜４のどれか（抗蛋白質血清ラクダ科ＶＨＨ）、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０２２０】
本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、一般的なまたは異常なアレルゲンによるアレルギー応答を予防し、すなわち、低減しまたは防止する。さらに、構築物の血中での存在期間が長いので治療空白が延長される。
【０２２１】
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、様々な疾患、たとえば、リューマチ性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、眼の過免疫反応などの炎症性疾患において重要な役割を果たすと考えられている。ＩＦＮγが、自己免疫疾患の病理において重要な役割を果たすことも分かってきた。たとえば、ＩＦＮγの存在は、リューマチ性関節炎に関与してきた（Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．、３１、２９３‐８（１９９２））。これらのサイトカインの作用に抗するためのいくつかの戦略が開発されており、現在、様々な病態の治療に使用されている。
【０２２２】
ＩＦＮγは、その生理活性形が二量体であり、２個のサブユニットによって形成された溝は、ＩＦＮγ受容体との相互作用によってその生体活性に重要である。ＩＦＮγに対して十分な特異性および選択性を有するＩＦＮγ阻害剤は、炎症性疾患を予防しまたは治療するための効果的な予防用または治療用薬剤化合物であり得る。ＩＦＮγに関連付けられる疾患には、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、若年性リューマチ性関節炎、乾癬性関節炎（ＵＳ６，３３３，０３２号、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．）が含まれる。他の疾患には、クローン病や乾癬（ＵＳ６，３２９，５１１号、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）が含まれる。さらに他の疾患は、腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病である（ＥＰ０６９５１８９号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。
【０２２３】
現在入手可能な薬物はどれも、自己免疫疾患の治療には完全に有効ではなく、ほとんどは深刻な毒性によって制限されている。さらに、そのような標的配列に対して十分な作用強度および選択性を備えた新規な化学物質（ＮＣＥ）を開発することは、極めて困難であり工程も冗長である。他方で、抗体を基にした治療薬は、薬物として顕著な潜在能力を有している。というのは、こうした薬物は、その標的に対して極めて優れた特異性を有し固有の毒性も低い。さらに、新規な化学物質（ＮＣＥ）の開発と比較した場合、開発時間を相当に減少させることができる。しかし、従来の抗体は、多量体蛋白質に対して生じさせることが困難である。それらの蛋白質では、ＩＦＮγの場合のように、リガンドの受容体結合ドメインが溝に包埋されている。
【０２２４】
抗標的単一ドメイン抗体がＴＮＦαを対象とする本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、安定性、大きさ、確実な発現などのその特性を原因とする、従来技術のペプチド治療薬を使用して経験する問題を克服する。さらに、本発明者らは、多量体ＩＦＮγ中に溝が存在するにもかかわらず、異種特異的ポリペプチド構築物が依然としてＩＦＮＡγに強力に結合できることを見出している。
【０２２５】
本発明の一態様によれば、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体が対象とする標的は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）である。ＩＦＮγは、いくつかのＴ細胞によって分泌される。その抗ウイルス活性の他に、ＩＦＮγは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞を刺激し、マクロファージを活性化し、細胞表面のＭＨＣ分子の発現を刺激する。したがって、一般に、ＩＦＮγは、免疫機能の多くの特徴を強化するために働き、免疫系が過敏である疾患、たとえば、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患を治療するための候補である。
【０２２６】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、前記異種特異的ポリペプチドの配列は、配列番号２５〜２７のどれかに対応する。その中の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体は、ＩＦＮγに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０２２７】
抗標的単一ドメイン抗体は、ＩＦＮγ全体、それらの断片、またはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０２２８】
本発明の一実施形態は、上記した免疫系が過敏である疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。現在の治療は、抗ＩＦＮγ抗体の静脈内投与からなる。これらの異種特異的ポリペプチド構築物の経口送達によって、そのような分子は大腸の罹患している部位に活性形で送達される。これらの部位は、重度の炎症状態にあり、ＩＦＮγ産生細胞を含む。こうした異種特異的ポリペプチド構築物は、ＩＦＮγを局所的に無力化することができ、身体全体にわたって分配されるのを防ぎ、それによって負の副作用を制限する。ミクロコッカスラクティスなどの遺伝子改変微生物は、抗体断片を分泌することができる。腸における抗体断片の局所的な産生および送達のために、そのような改変微生物をビヒクルとして使用することができる。ＩＦＮγ無力化異種特異的ポリペプチド構築物を産生する株を使用することによって、炎症性腸疾患を治療できるはずである。
【０２２９】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２３０】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２３１】
本発明の別の態様は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含む、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０２３２】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤の調製に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に結合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０２３３】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤の調製に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０２３４】
本発明の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体が、どんなクラスのＶＨＨからも得ることができることはは本発明の態様である。たとえば、これらの抗体は、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨ、ドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい．
【０２３５】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ ＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記異種特異的ポリペプチドは、配列番号２５〜２７のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する。配列番号２５〜２７には、抗ＩＦＮγ ＶＨＨおよび抗マウス血清アルブミンＶＨＨが含まれる。
【０２３６】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質ＶＨＨに融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記抗血清蛋白質ＶＨＨは、配列番号１〜４のどれか、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０２３７】
本発明の一実施形態は、本発明による異種特異的ポリペプチド構築物をコードする核酸を含む組換えクローンである。本発明の一態様では、前記核酸は、それぞれが治療用または診断用標的抗原を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体、および血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体をコードし、前記単一ドメイン抗体類はリンカーの介在なしに、または１個または複数のペプチドリンカー配列によって結合する。本発明の一態様によれば、リンカー配列は、当該技術分野で知られている任意の適当なリンカー配列である。本発明の別の態様によれば、リンカー配列は自然に存在する配列である。リンカー配列の特性は、これらが免疫原性ではない、または著しく免疫原性ではないこと、異種特異的ポリペプチド構築物に十分な融通性を提供できること、および蛋白質分解に耐性であることが好ましい。本発明によるリンカーの一例は、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１７２５号に開示されているものであり、このリンカーはＶＨＨのヒンジドメインに由来する。
【０２３８】
本発明の別の態様によれば、クローンは、配列番号１〜４のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応するポリペプチドをコードする核酸、ならびに１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列をコードする核酸を含む。
【０２３９】
本発明の別の態様によれば、クローンは、配列番号５〜２７のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応するポリペプチドをコードすることができる核酸を含む。
【０２４０】
多数の抗標的および／または多数の抗血清ＶＨＨをコードする核酸が本発明中のクローンに存在することは、本発明の範囲内に属する。
【０２４１】
本発明の異種特異的ポリペプチド構築物をコードするクローンに適した宿主を形質転換することによって、治療で使用するための異種特異的ポリペプチド構築物を十分な量で産生することができる。その中で前記クローンを形質転換できる生物の例には、それだけには限らないが、大腸菌やサッカロミセスセレビシエが含まれる。
【０２４２】
本発明の別の実施形態は、抗標的ＶＨＨに１個または複数の抗血清アルブミン単一ドメイン抗体を結合するステップを含む、抗標的ＶＨＨの半減期を延長するための方法である。既に上記したように、結合方法は、当該技術分野で知られており、またはどんな未来の方法でよく、たとえば、化学的カップリングによって、またはＤＮＡレベルでこれらのＶＨＨを融合することができる。
【０２４３】
本明細書に記載した１個または複数の疾患症状の治療、予防、および／または緩和は、一般に、対象に異種特異的ポリペプチド構築物の「治療有効量」を投与するステップを含む。「治療有効量」、「治療上有効な用量」、および「有効量」は、所望の結果を得るのに必要な量を意味する。当該技術分野の通常の技術者は、作用強度すなわち「有効量」が、本発明で使用される、疾患経路を阻害する様々な化合物によって変化し得ることを理解するものとする。当業者ならば、化合物の作用強度を容易に評価することができる。
【０２４４】
本明細書では、用語「化合物」は、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物、配列番号５〜２７によって表されるポリペプチド、その相同配列、その相同物、または該ポリペプチドをコードすることができる核酸をさす。
【０２４５】
「薬剤として許容される」は、生物学的にせよ、そうでないにせよ望ましくないことはない物質を意味し、すなわち、この物質はどんな望ましくない生物学的影響を引き起こすことも、またはそれが含まれている薬剤組成物の他の成分のどれとも有害な方式で相互作用することもなく、その化合物と共に個体に投与することができる。
【０２４６】
本明細書で開示した発明は、対象で本明細書に記載した疾患（たとえば、アレルギーおよび／または炎症）に関連付けられる状態の治療または予防に有用であり、疾患経路に関与する成分（たとえば、血中のＩｇＥおよび／またはＴＮＦα）に結合する化合物または組成物の薬剤有効量を投与することを含み、それによって疾患経路および疾患を阻害する。
【０２４７】
本発明の一態様は、対象で本明細書に記載した疾患（たとえば、アレルギーおよび／または炎症）に関連付けられる状態を治療しまたは予防するための本発明の化合物の使用であり、たとえばアスピリンなどの別の化合物と組み合せて、化合物の薬剤有効量を投与することを含む。
【０２４８】
本発明は、本発明の単一化合物を含む製剤の投与だけには限らない。１種を超える本発明の化合物を含む製剤をそれを必要とする患者に投与する併用治療を提供することは本発明の範囲内に属する。
【０２４９】
本明細書に記載の標準的試験を使用し、または他の同様の試験を使用し、疾患経路の阻害を定量する方法は当該技術分野で周知である。好ましくは、方法は、疾患の指標で少なくとも１０％の減少をもたらすはずであり、たとえば、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％，６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの間のどんな量も含み、９０％の減少がより好ましい。たとえば、本発明のペプチドによるＩｇＥの阻害によってアレルギー経路を阻害することは、食物特異的ＩｇＥ濃度を１０％減少させるであろう。
【０２５０】
本発明で有用な化合物は、薬剤組成物として製剤し、ヒト患者や任意の動物などの哺乳動物宿主に、選択した投与経路、すなわち、経口もしくは非経口、吸入による経鼻、経静脈、経筋肉内、経局所、または経皮下的投与に適合するようになされた様々な形態で投与することができる。
【０２５１】
本発明の化合物は、遺伝子治療送達法を使用し投与することもできる。たとえば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい。その全体を参照により本明細書に組み込む。遺伝子治療送達法を使用して、本発明の化合物用の遺伝子を形質移入した１次細胞に、さらに、標的特異的な臓器、組織、移植片、腫瘍、または細胞に対する組織特異的プロモータを形質移入することができる。
【０２５２】
したがって、本発明の化合物は、全身的に、たとえば、不活性希釈剤や吸収性食用可能な担体など、薬剤として許容されるビヒクルと組み合わせて経口的に投与することができる。これらの化合物は、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入し、打錠し、または患者食の食物に直接組み込むことができる。経口治療投与には、活性化合物を１種または複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、頬腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの形で使用することができる。そのような組成物や調製物には、活性化合物を少なくとも０．１％含めるべきである。もちろん、組成物および調製物の割合は、変化してよく、好都合に所与の単位投与形重量の約２〜約６０％にすることができる。そのような治療上使用可能な組成物の活性化合物量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
【０２５３】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などには以下：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびショ糖、果糖、乳糖、またはアスパルテームなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑樹油、サクランボ香味料などの矯味剤を加えることができる。単位投与形をカプセル剤にする場合は、上の種類の物質の他に、これに植物油やポリエチレングリコールなどの液体担体を含めてもよい。コーティングとして、そうでない場合は、固体単位投与形の物理的形状を改変するための様々な他の物質を含めてよい。たとえば、錠剤、丸剤、カプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラック、糖などによってコートすることができる。シロップまたはエリキシルには、活性化合物、甘味剤としてショ糖や果糖、保存料としてメチルやプロピルパラベン、着色料、およびサクランボ味やオレンジ味などの香味料を含めてもよい。もちろん、どんな単位投与形の調製に使用されるどんな物質も薬剤として許容され、使用量で実質上無毒であるべきである。さらに、活性化合物は、持続放出調製物やデバイスに組み込むこともできる。
【０２５４】
活性化合物は、注入または注射によって静脈内または腹腔内に投与することもできる。活性化合物またはその塩の溶液は、水で、場合によっては無害の界面活性剤と混合した水で調製することができる。分散剤もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、それらの混合物、および油類で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物には、微生物の繁殖を防止するための保存料が含まれる。
【０２５５】
注射または注入に適当な薬剤投与形には、滅菌水溶液、分散剤、あるいは必要に応じて滅菌注射溶液もしくは注入溶液または分散剤を調合するようになされ、場合によってはリポソームに封入されている活性成分を含む滅菌粉を含めてもよい。すべての場合に、最良の剤形は、滅菌液体であり製造および保存条件下で安定していなければならない。液体担体またはビヒクルは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（ｐｏｌｙｏｌ）（たとえば、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、液体ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）など）、植物油、無毒グリセリルエステル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）、それらの適当な混合物を含む溶媒または液体分散媒体であってよい。適切な流動性は、たとえば、リポソームの形成よって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎｓ）、クロロブタノール（ｃｈｌｏｒｏｂｕｔａｎｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、ソルビン酸（ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）などによって防止する。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖類、緩衝液、塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。組成物に吸収遅延剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）やゼラチンを使用することによって注射組成物を長時間にわたって吸収させることができる。
【０２５６】
滅菌注射溶液は、必要とされる先に列挙した他の成分のいくつかを含む適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製する。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術によって活性成分に予め滅菌ろ過した溶液中に存在する任意の追加の所望成分を加えた粉がもたらされる。
【０２５７】
局所投与には、すなわち、化合物が液体のときは、本発明の化合物を純粋形で適用することができる。しかし、一般に、化合物は、皮膚に許容される担体と組み合わせて、皮膚に組成物または製剤として投与されることが望ましく、この化合物は固体または液体であってよい。
【０２５８】
使用可能な固体担体には、タルク、クレイ、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化固体が含まれる。使用可能な液体担体には、水、ヒドロキシアルキル、グリコール、または水‐アルコール／グリコールブレンドが含まれ、その場合、本発明の化合物は有効濃度で、場合によっては無毒の界面活性剤を用いて、溶解しまたは分散させることができる。香料や追加の抗菌剤などのアジュバントを加えて、所与の使用に向けた特性を最適化することができる。得られた液体組成物は、吸着パッドから塗布し、絆創膏および他の包帯剤を含浸するために使用し、またはポンプ型もしくはエアロゾルスプレーを使用し患部上に噴霧することができる。
【０２５９】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪族アルコール、改変セルロース、改変ミネラル物質など、増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することもできる。
【０２６０】
皮膚に化合物を送達するために使用できる使用可能な外用組成物の例は、当該技術分野で公知であり、たとえば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）、およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
【０２６１】
使用可能な化合物の用量は、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性と動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することによって定量することができる。マウス、およびヒトまでの他の動物の有効な用量の推定方法は当該技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
【０２６２】
一般に、ローションなどの液体組成物中の化合物の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ％であり、約０．５〜１０ｗｔ％が好ましい。ゲルなどの半固体もしくは固体組成物または粉での濃度は約０．１〜５ｗｔ％であり、約０．５〜２．５ｗｔ％が好ましい。
【０２６３】
治療での使用に必要な本化合物、活性塩、またはその誘導体の量は、選択した特定の塩のみならず、投与経路、治療対象の状態の性質、年齢、および患者の状態によっても変化し、最終的に担当する内科医または臨床医の裁量に任せられる。化合物の用量も標的とする細胞、腫瘍、組織、移植片、または臓器に応じて変わる。
【０２６４】
所望用量は、単一用量で、あるいは適切な間隔、たとえば、１日当たり２回、３回、４回以上の副用量で投与する分割用量として好都合に提供することができる。副用量自体、たとえば、散布器からの多数の吸入または複数の点眼の適用など、さらに大まかに間隔を空けて分けた数回の投与に分割することができる。
【０２６５】
治療計画には、長期の毎日治療を含めてもよい。「長期」は、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヵ月、または数年の持続時間を意味する。この用量範囲で必要な変更は、本明細書に教示した定型の実験のみを使用して当業者が決定することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｗ．編第４版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，米国ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎを参照されたい。どんな合併症の場合にも、内科医個人も用量を調整することができる。
【実施例１】
【０２６６】
ラマの免疫化
１頭のラマをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で免疫化した。免疫化スキームを表１に要約する。
【０２６７】
実施例１による免疫化スキーム
【表１】
【実施例２】
【０２６８】
レパートリークローニング
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ、アマシャムバイオサイエンス社）によって単離した。ＰＢＬを使用して全ＲＮＡを抽出した（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８７年）。オリゴｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチドを使用し、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により１００μｇの全ＲＮＡでｃＤＮＡを調製した。フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によってｃＤＮＡを精製し、続いて鋳型として使用してＶＨＨレパートリーを増幅した。
【０２６９】
第１のＰＣＲでは、従来抗体（１．６ｋｂ）および重鎖（１．３ｋｂ）抗体遺伝子セグメントのレパートリーをリーダー特異的プライマー（５'‐ＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴ ３'）およびオリゴｄ（Ｔ）プライマー（５'‐ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ‐３'）を使用し増幅した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、アガロースゲルから重鎖抗体セグメントをコードする１．３ｋｂの断片を精製した。ＦＲ１逆進プライマーおよび同じオリゴｄ（Ｔ）前進プライマーの混合物を使用し第２のＰＣＲを実施した。（ＦＲ１プライマーに導入した）ＳｆｉＩおよび（ＦＲ４に自然に存在する）ＢｓｔＥＩＩでＰＣＲ産生物を消化した。ゲル電気泳動後、約４００塩基対のＤＮＡ断片をゲルから精製し、ファージミドｐＡＸ００４の対応する制限部位連結して、大腸菌ＴＧ１の電気穿孔後にクローン化ＶＨＨのライブラリを得た。ライブラリの大きさは１．４×１０７ｃｆｕであり、クローンにはすべて、正確な大きさの挿入物が含まれていた。
【実施例３】
【０２７０】
ライブラリのレスキュー（RESCUE)、ファージ調製
ライブラリは、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで、２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌの２×ＴＹ培地で３７℃で増殖させた。Ｍ１３ＫＯ７ファージ（１０１２）を加え、混合物を３７℃で１回目は振盪せずに、次いで１００ｒｐｍで振盪しながら２×３０分間培養した。室温で４５００ｒｐｍで１０分間細胞を遠心分離した。細菌のペレットを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの２×ＴＹ培地中に再懸濁し、２５０ｒｐｍで勢いよく振盪しながら終夜３７℃で培養した。終夜培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ファージをＰＥＧ沈殿（２０％ポリ‐エチレン‐グリコールおよび１．５ＭのＮａＣｌ）し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳ２０ｍｌ中に再懸濁した。ファージを再度ＰＥＧ沈殿させ、４℃、２０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットを１％カゼインのＰＢＳ溶液５ｍｌに溶解した。ＯＤ６００ｎｍ＝０．５のＴＧ１細胞に感染させることによってファージを滴定し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％ブドウ糖を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。形質転換体数は、ファージ数（＝ｐｆｕ）を示す。１５％グリセロールを用いて−８０℃でファージを貯蔵した。
【実施例４】
【０２７１】
ファージＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１％カゼインのＰＢＳ溶液または５μｇ／ｍｌのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）で終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、１％カゼインのＰＢＳ溶液２００μｌにより室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ファージを上記のように調製し、ウェルに２倍段階希釈で入れた。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ＰＢＳで１／２０００希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させたマウスモノクローナル抗体の抗Ｍ１３と結合したファージを検出した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２によって染色を行い、３０分後にシグナルを４０５ｎｍで測定した。結果を図１に示し、ライブラリ中にＨＳＡ特異的ナノ体が存在することを示している。
【実施例５】
【０２７２】
選択：第１回目および第２回目のバイオパニング
マイクロタイタープレートのウェルを１０μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）または１％カゼイン含有ＰＢＳでコートした。４℃で終夜培養後、ウェルを１％カゼイン含有ＰＢＳにより室温で３時間ブロックした。２００μｌのファージをウェルに加えた。室温で２時間培養後、ウェルをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ１０回およびＰＢＳで１０回洗浄した。結合したファージを１００μｌの０．２Ｍのグリシン緩衝液ｐＨ＝２．４で溶出させた。室温で２０分間溶出を行った。溶出したファージを指数関数的に増殖している大腸菌ＴＧ１細胞に放置して感染させ、次いで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％ブドウ糖を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。第２回目も上記と同じ条件で実施した。結果を表２に要約する。
【０２７３】
実施例５に記載した、マウス血清アルブミンでの１回および２回のパニングした後の結果
【表２】
【実施例６】
【０２７４】
バイオパニング後の個々のクローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡ：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）への結合
単一コロニーを使用して２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢで終夜培養を開始した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地でこの終夜培養物を１００倍に希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで３７℃で培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３７℃でさらに３時間または２８℃で終夜培養した。培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを終夜または−２０℃で１時間凍結した。次に、ペレットを室温で４０分間解凍し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。周辺質画分を４℃、２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。ＶＨＨを含む上清をさらに分析するために使用した。
【０２７５】
マイクロタイタープレートを終夜４℃で５μｇ／ｍｌのＨＳＡ、５μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、または１％カゼインのＰＢＳ溶液でコートした。１％カゼインのＰＢＳ溶液３００μｌにより室温で２時間プレートをブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。第１目および第２回目の選択の後、２３個の個々のクローン用に周辺質画分を調製し、マイクロタイタープレートのウェルに放置して結合させた。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、その後、マウス抗ヒスチジンモノクローナル抗体Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ１３９６（１／１０００希釈）を含むＰＢＳにより室温で１時間培養し、続いて抗マウス‐アルカリホスファターゼ共役１／２０００を含むＰＢＳにより同様に室温で１時間培養することによってナノ体の結合を検出した。基質ＰＮＰＰ（ｐ‐ニトロフェニルリン酸２ｍｇ／ｍｌを含む１Ｍのジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇ２ＳＯ４、ｐＨ９．８）によって染色を行い、３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。結果を表３に要約する。
【０２７６】
１回および２回の選別後、クローンを選択し周辺質抽出物を調製した。実施例６に記載した、これらのクローンのヒトおよびマウスアルブミンへの結合をＥＬＩＳＡで分析した。
【表３】
【実施例７】
【０２７７】
ＨｉｎｆＩパターンおよび配列決定
第２回目のパニング後、ベクターの配列に結合している１組のプライマーを用いて陽性クローンでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産生物を制限酵素ＨｉｎｆＩで消化し、アガロースゲル上に載せた。さらに評価するために異なるＨｉｎｆＩ‐パターンによって４個のクローンを選択した。これらのクローンを配列決定した。結果を表４に要約する（配列番号１、２、３、および４）。
【実施例８】
【０２７８】
異なる種のアルブミンによる交差反応試験
異なる種（ヒヒ、ブタ、ハムスター、ヒト、ラット、マウス、およびウサギ）から得た血漿（１／１０希釈）についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥを実施し、ニトロセルロース膜上にブロットした。実施例３に記載したように、クローンＭＳＡ２１、ＭＳＡ２４、ＭＳＡ２１０、ＭＳＡ２１２、および対照ナノ体用にファージを調製した。ニトロセルロースにブロットした血清アルブミンにファージを放置して結合させ、未結合ファージを洗い流した。ＨＲＰに結合させた抗Ｍ１３ポリクローナル抗体によって結合を検出した。検出にＤＡＰを基質として使用した。結果を図２に示す。
【０２７９】
これらの結果から、本発明者らは、４個全ての結合剤は、ブタ、ヒト、マウス（ＭＳＡ２１２では低）、およびハムスターの血清アルブミン間で交差反応すると推断することができる。ＭＳＡ２１は、ウサギ血清アルブミンとも交差反応する。不適切なナノ体によっては、結合は観察されなかった（図示せず）。
【０２８０】
対照実験として、ＰＢＳで１／１００希釈した異なる血漿試料でＳＤＳ‐ＰＡＧＥを実施した。ゲルは、クーマシーで染色した。図３から、本発明者らは、全血漿試料のアルブミン濃度は、アルブミン濃度が低いウサギ血漿を除いて高いと推断することができる。
【実施例９】
【０２８１】
発現および精製
結合剤用にプラスミドを調製し、ＷＫ６電気適応性細胞に形質転換した。単一コロニーを使用して、２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で終夜培養を開始した。この終夜培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地３００ｍｌで１００倍に希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで３７℃で培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３７℃でさらに３時間または２８℃で終夜培養した。培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを終夜または−２０℃で１時間凍結した。次に、ペレットを室温で４０分間解凍し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。周辺質画分を４℃、２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。ナノ体を含む上清をＮｉ‐ＮＴＡ上に載せ精製して均質にした。
【実施例１０】
【０２８２】
精製ナノ体のＭＳＡによるＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのＭＳＡによって終夜４℃でコートした。洗浄後、１％カゼインのＰＢＳ溶液によって室温で２時間プレートをブロックした。試料を２組、濃度２５００ｎＭ、１／３希釈で出発して適用し、室温で２時間放置して結合させた。ポリクローナルウサギ抗ナノ体血清を１／１０００（Ｋ２０８）で室温で１時間加えた。実施例６に記載したように、検出を抗ウサギアルカリホスファターゼ共役体を用いて１／１０００で行い、染色をＰＮＰＰで行った。結果を図４に示す。
【実施例１１】
【０２８３】
二重特異性構築物の構築
大腸菌産生ベクターｐＡＸ１１を構築して、二価または二重特異性ＶＨＨの２段階クローニングを可能にした（図５）。
【０２８４】
カルボキシ末端ＶＨＨを最初にＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩでクローン化する一方で、第２段階では他のＶＨＨをＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって挿入した。これらは第１の遺伝子断片内を切断しない。この手順によって増幅による新規な部位の実施、それによるＰＣＲ間違いの導入の危険性が回避される。ラマの中位のヒンジをナノ体間のリンカーとして使用した。ヒトＴＮＦαに対するＶＨＨをＭＳＡ特異的ナノ体のＣＯＯＨ末端でクローン化した。配列を表４に要約する（配列番号５、６、７、および８）。プラスミドを調製し、ＷＫ６電気適応性細胞に形質転換した。単一コロニーを使用して、２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢで終夜培養を開始した。この終夜培養物を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地３００μｌで１００倍希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで３７℃で培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３７℃でさらに３時間培養した。
【０２８５】
培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを−２０℃で終夜凍結した。翌朝、ペレットを低温室で４０分間解凍し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。周辺質画分を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。上清をＮｉ‐ＮＴＡ上に載せ、精製して均質にした。配列を表４に示す（配列番号５、６、７、および８）。ゲルろ過上のいくらかの分解生成物（５％）を除去するために、追加の精製ステップが必要であった。
【０２８６】
ヒトＴＮＦα（ＭＰ７１２ｂ）に対する別の二重特異性ＶＨＨを表４に示す（配列番号１５、１６、１７、および１８）。
【実施例１２】
【０２８７】
サンドウィッチＥＬＩＳＡでの二重特異性構築物の試験
マイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのＭＳＡで終夜４℃でコートした。プレートを１％カゼインのＰＢＳ溶液３００μｌにより室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ＭＳＡ２１、ＭＳＡ２４、ＭＳＡ２１０、およびＭＳＡ２１２に対して、二重特異性構築物用に精製した蛋白質を、それぞれ、濃度０．４、０．５、２．５、および２．５μｇ／ｍｌで放置してマイクロタイタープレートのウェルに結合させた。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、ビオチン化ＴＮＦを濃度１０μｇ／ｍｌ加え、３倍に希釈し、室温で２時間放置して結合させた。マウス・エクストラアビジン・アルカリ・ホスファターゼ共役（Ｓｉｇｍａ）１／２０００を含むＰＢＳにより室温で１時間培養することによって結合を検出した。基質ＰＮＰＰ（ｐ‐ニトロフェニルリン酸２ｍｇ／ｍｌを含む１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇ２ＳＯ４、ｐＨ９．８）で染色を行い、３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。結果を図６に示し、二重特異性構築物が同時に両抗原に結合できることを示す。
【実施例１３】
【０２８８】
ＢＩＡＣＯＲＥでアルブミン結合剤の親和性を定量
ＥＤＣ‐ＮＨＳ共有結合カップリングを使用し、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップ上にマウスアルブミンを固定化することによって、ＢＩＡＣＯＲＥでマウスアルブミンへの親和性を定量し、表５に要約する。結果は、アルブミンへの親和性が二重特異性構築物に保持されていることを示している。
【０２８９】
実施例１３に記載した、ＢＩＡＣＯＲＥにより測定したアルブミン結合剤に対する親和力（ｋｏｆｆ、ｋｏｎ、およびＫＤ）
【表５】
【実施例１４】
【０２９０】
血漿または血液でのＥＬＩＳＡの最適化
ＴＮＦα結合剤ＴＮＦ３Ｅのマウスでの半減期をＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３ＥおよびＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅを用いて比較するための薬物動態実験を開始した。したがって、試料が血液または血漿中にある場合、本発明者らのＥＬＩＳＡを最適化させて低い背景値を得なければならなかった。マイクロタイタープレートをニュートラアビジンでコートした。終夜４℃で培養後、プレートを洗浄し、１％カゼインのＰＢＳ溶液により室温で２時間ブロックした。１μｇ／ｍｌのビオチン化ＴＮＦαを室温で３０分間放置して結合させ、プレートを洗浄した。試料（一価のＶＨＨ＃３ＥおよびＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅ）を濃度１μｇ／ｍｌで出発に利用し、ＰＢＳ、１０％血漿、または１０％血液で希釈し、２時間放置して結合させた。プレートを洗浄後、ウサギ抗血清を１／２０００の希釈で加え、重鎖クラス（Ｋ２０８）を認識させ、または従来のクラス（ＵＲＬ４９）を認識させた。１時間培養後、プレートを洗浄し、抗ウサギアルカリホスファターゼ共役（Ｓｉｇｍａ）を１／１０００の希釈で加えた。室温で１時間培養後、プレートを洗浄し、基質で結合を検出した。結果を図７−１及び７−２に示す。結果は、ウサギ抗血清（Ｋ２０８およびＵＲＬ４９）での背景値は、試料を１０％血液または１０％血漿で希釈した場合、ＰＢＳと比較して非常に低いことを明瞭に示している。ＵＲＬ４９抗血清は、ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅ二重特異性ナノ体のみを認識し、一価のＶＨＨ＃３Ｅを認識せず、したがってこの抗血清はマウスに投与直後の本発明者らの二重特異性ナノ体の統合性の試験に使用することができる。
【実施例１５】
【０２９１】
大規模発現、ならびにマウスでの薬物動態研究に向けた７Ａ７６ＶＨＨ＃３Ｅ、ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅ、およびＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅの精製
一価ＴＮＦ３Ｅ、ならびに二重特異性ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３ＥまたはＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅ用に３リットル培養を開始し、実施例１１に記載したように精製した。エンドトキシンの除去に追加の精製ステップが必要であった。したがって、試料をポリミキシンカラム（ＢＩＯ‐ＲＡＤ）で精製した。試料の細菌エンドトキシン濃度をＬＡＬ検定（カブトガニ血球抽出物（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）、Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で分析した。結果を表６に要約する。
【０２９２】
実施例１５に記載した、ポリミキシンでの精製後の一価および二重特異性ナノ体のＬＡＬ検定結果
【表６】
【実施例１６】
【０２９３】
マウスでの薬物動態
構築物ごとに９頭のマウス（ＣＢ５７／ＢＩ６）に１００μｇのナノ体を尾の静脈に投与した。様々な時点で血液（各時点につき３頭のマウス）を回収し血清を調製した。実施例１４に記載したように、一価または二重特異性ナノ体が存在するかどうか、試料をＥＬＩＳＡによって分析した。分子の統合性を確認するために二重特異性構築物についてＫ２０８をＵＲＬ４９とも比較した。結果を図８〜１１に示す。
【０２９４】
本発明者らは、一価のナノ体の半減期（４０〜４５分間）が、アルブミンＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３ＥおよびＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅに特異的な二重特異性ナノ体を作製することによって劇的に改善された（半減期２．５〜３日間）という結果から結論を得ることができる。ＵＲＬ４９でのＥＬＩＳＡに示すように、二重特異性ナノ体ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅは、マウス中で１９日を経ても無傷のままである（図１１）。
【実施例１７】
【０２９５】
ナノ体の半減期をさらに延長
ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３ＥおよびＭＳＡ２４／ＴＮＦ３Ｅの半減期をさらに延長するために、三価のナノ体を二価ＭＳＡ２１‐ＭＳＡ２１構築物を標的特異的ナノ体ＴＮＦ３Ｅに融合することによって調製した。得られたＭＳＡ２１／ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３Ｅ（表７、および配列番号９）を実施例１６の方法によってｉｎ ｖｉｖｏで試験した。
【実施例１８】
【０２９６】
ラマ００２の免疫化
１頭のラマをｖＷＦで免疫化した。表７に免疫化スキームを要約する。
【０２９７】
実施例１７による、ラマ００２に使用した免疫化スキーム
【表７】
【実施例１９】
【０２９８】
レパートリークローニングおよびファージの調製
実施例２に記載した通りにライブラリを調製した。ライブラリの大きさは、１．４×１０７ｃｆｕであり、９０％を超えるクローンには正確な大きさの挿入物が含まれていた。実施例３に記載した通りにファージを調製した。
【実施例２０】
【０２９９】
コラーゲンとの相互作用を阻害するｖＷＦ用の結合剤の選択：第１回目および第２回目のパニング
マイクロタイタープレートのウェルを２μｇ／ｍｌのｖＷＦまたは１％カゼイン含有ＰＢＳでコートした。４℃で終夜培養後、ウェルを１％カゼイン含有ＰＢＳにより室温で３時間ブロックした。２００μｌのファージをウェルに加えた。室温で２時間培養後、ウェルをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで１０回およびＰＢＳで１０回洗浄した。ファージを１００μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＩＩ型１００μｌによって特異的に溶出させた。室温で終夜溶出を行った。溶出したファージを指数関数的に増殖しているＴＧ１細胞に放置して感染させ、次いで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％ブドウ糖を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。上記した同じ条件下で、この実験を第２回目のパニングに向けて繰り返した。パニングの結果を表８および９に示す。
【０３００】
実施例１９に記載した、ＰＢＳ‐カゼインと比較する、ｖＷＦ上での１回および２回のパニングの後のプラーク形成単位（ｐｆｕ）。Ｐｆｕ ｖＷＦ（抗原）は、ｐｆｕカゼインによって分割（特異的結合）＝濃縮
【表８】
【０３０１】
実施例２０に記述した、１回目および２回目のパニング後の阻害剤数対試験クローン数
【表９】
【実施例２１】
【０３０２】
ｖＷＦ結合剤の機能特徴付け：ＶＨＨがｖＷＦのコラーゲンへの結合を阻害
マイクロタイタープレートを２５μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＩＩ型のＰＢＳ溶液により終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、１％カゼイン含有ＰＢＳにより室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。２μｇ／ｍｌのｖＷＦ１００μｌ（ｖＷＦは３７℃で１５分間予備培養する）を（実施例６に記載した）ＶＨＨ抗体含有周辺質抽出液２０μｌと混合し、マイクロタイタープレートのウェル中で室温で９０分間培養した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。抗ｖＷＦ‐ＨＲＰモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ）をＰＢＳで３，０００倍に希釈し１時間培養した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２でｖＷＦ結合を検出した。３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。結果を表１０に示し、第１目および第２回目のパニング後に阻害剤が得られることが示されている。
【実施例２２】
【０３０３】
ＶＨＨの発現および精製
実施例９に記載したように蛋白質を調製し精製した。
【実施例２３】
【０３０４】
ＥＬＩＳＡ：ｖＷＦへの結合
マイクロタイタープレートを２μｇ／ｍｌのｖＷＦにより４℃で終夜コートした。プレートを１％カゼインのＰＢＳ溶液３００μｌによって室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。全精製試料の希釈系列を室温で２時間培養した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、その後、マウス抗ｍｙｃ ｍＡＢ１／２０００のＰＢＳ溶液により室温で１時間培養し、続いて抗マウス‐ＨＲＰ共役体１／１０００のＰＢＳ溶液で同様に室温で１時間培養することによってＶＨＨの結合を検出した。基質ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２によって染色を行い、３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。精製ＶＨＨの濃度に応じた結合を図１２に示す。
【実施例２４】
【０３０５】
精製ＶＨＨによる阻害ＥＬＩＳＡ
実施例２０に記載したように、阻害ＥＬＩＳＡを実施したが、精製ｖＷＦの代わりに減少濃度のＶＨＨおよび１／６０希釈のヒト血漿を用いた。結果を図１３に示す。５０％阻害（ＩＣ５０）をもたらすＶＨＨ濃度を表１０に示す。
【０３０６】
実施例２３に記載した、ｖＷＦのコラーゲンへの結合を５０％阻害（ＩＣ５０）するのに必要なＶＨＨ濃度（ｎＭ）
【表１０】
【実施例２５】
【０３０７】
二重特異性構築物の構築および配列
アルブミンに特異的な第１のＶＨＨ（ＭＳＡ２１）およびｖＷＦに特異的な第２ＶＨＨで二重特異性構築物を調製した。実施例１１に記載したように構築物を作製した。配列を表４−１〜４−７に示す（配列番号１９〜２１）。
【０３０８】
配列表
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【表４−６】
【表４−７】
【実施例２６】
【０３０９】
二重特異性構築物の発現および精製
実施例９に記載したように蛋白質を発現させ精製した。いくらかの一価分解生成物（５〜１０％）を除去するためには、ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５での追加の精製ステップが必要であった。
【実施例２７】
【０３１０】
二重特異性構築物中の両ＶＨＨの機能性
マイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミンにより４℃で終夜でコートした。プレートを洗浄後、ウェルを１％カゼインのＰＢＳ溶液により２時間ブロックした。二重特異性蛋白質を室温で２時間放置してウェルに結合させた。洗浄後、ヒト、イヌ、およびブタの血漿を様々な希釈で加え、室温で２時間放置して結合させた。ＤＡＫＯ社製抗ｖＷＦ‐ＨＲＰにより１／３０００希釈でｖＷＦの結合を検出した。ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２で染色を行った。結果を図１４−１、１４−２、１４−３に示す。両ＶＨＨの機能性が二重特異性構築物に保持されていることを示している。
【実施例２８】
【０３１１】
一価ＶＨＨと比較する二重特異性構築物によるｖＷＦのコラーゲンへの結合の阻害
実施例２０に記載したように、ｖＷＦのコラーゲンへの結合の阻害を、二重特異性構築物と比較して一価について試験した。ＩＣ５０値を表１１に要約する。結果は、ＶＨＨの阻害特性が二重特異性構築物に保持されていることを示している。
【０３１２】
実施例２８に記載した、二重特異性ナノ体の対アルブミンおよび対ｖＷＦのＩＣ５０値
【表１１】
【実施例２９】
【０３１３】
抗血清アルブミンＶＨＨに融合されたＶＨＨ‐ＣＤＲ３断片を含む二重特異性構築物の構築
フレームワーク４領域に位置するセンスプライマー（Ｆ６のＣＲＤ３前進：ＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＣＣ）およびフレームワーク３領域に位置するアンチセンスプライマー（Ｆ６のＣＤＲ３逆進プライマー：ＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣ）の使用によって、機能部分であるＭＰ２Ｆ６ＳＲのＣＤＲ３領域を増幅した。
【０３１４】
ＣＤＲ‐３断片を抗血清アルブミンＶＨＨＭＳＡ‐２１と融合するために、第２回目のＰＣＲ増幅は、以下のプライマーを実施した。
Ｆ６ ＣＤＲ３逆進プライマーＳｆｉ１：
ＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣ
Ｆ６ ＣＤＲ３前進プライマーＮｏｔ１：
ＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＣＣ
【０３１５】
反応容量５０ｍｌで各プライマー５０ｐｍｏｌを使用しＰＣＲ反応を実施した。第１回目のＰＣＲの反応条件は、９４℃で１１分、続いて９４／５５／７２℃で３０／６０／１２０秒で３０サイクル、および７２℃で５分であった。２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのｄＮＴＰ、および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｄ ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュダイアグノスティクス、ベルギー国ブリュッセル）を用いて全反応を実施した。
【０３１６】
ＭＳＡクローンのＶＨＨ遺伝子を制限酵素Ｐｓｔ１／ＢｓｔＥＩＩによって切断後、消化生成物をｐＡＸ１１中でクローン化して、マルチクローニング部位のＣ末端にＶＨＨを有するクローンを得た。ベクターを基にしたプライマーを使用しＰＣＲによってクローンを検査した。クローンから６５０ｂｐの産生物が得られ、ＰＣＲ産生物を制限酵素Ｓｆｉ１／Ｎｏｔ１で切断して、ＭＳＡ ＶＨＨと融合したＣＤＲ３のＮ末端発現を可能にした後、ＤＮＡを調製し、アクセプタベクターとして使用してＭＰ２Ｆ６ＳＲのＣＤＲ３をクローンした。
【実施例３０】
【０３１７】
本発明の抗標的単一ドメイン抗体間相互の相同性の計算
本発明の抗標的単一ドメイン抗体間のアミノ酸配列相同性の程度は、Ｂｉｏｅｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒを使用し算出した。ＣｌｕｓｔａｌＷにより整列化されるので、計算によって全配列間の同一残基の比率が示される。［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．、およびＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬＷ：配列重み付け、位置特異的空隙ペナルティ、および重量マトリックスの選択による、進化性多重配列整列の感受性の改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年６月提出］。表１２は、本発明の抗血清アルブミンＶＨＨ間相互の部分相同性を示す。表１３は、本発明の抗ＴＮＦ‐αのＶＨＨ間相互の部分相同性を示す。表１４は、本発明の抗ＩＦＮγのＶＨＨ間相互の百分比相同性を示す。表１５は、本発明の抗ｖＷＦ ＶＨＨ間相互の画分相同性を示す。
【０３１８】
本発明の抗マウス血清アルブミンＶＨＨのアミノ酸配列間相互の部分的相同性
【表１２】
【０３１９】
本発明の抗ＴＮＦα ＶＨＨ間相互の部分的相同性
【表１３】
【０３２０】
本発明の抗ＩＦＮγ ＶＨＨ間相互の％相同性
【表１４】
【０３２１】
本発明の抗ｖＷＦ ＶＨＨ間相互の部分的相同性
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】実施例４に記載した、ＨＳＡ特異的ナノ体がライブラリに存在することを示すファージＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２】実施例８に記載した、ニトロセルロース上にブロットされた、アルブミン結合剤を発現するファージの血漿への結合を示す図である。
【図３】実施例８に記載した、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上での血漿試料のクーマシー染色である。
【図４】実施例１０に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量した、精製ナノ体のマウスアルブミンへの結合を示す図である。
【図５】実施例１１に記載した、二重特異性ナノ体の構築のためのＰＡＸ０１１の多数のクローニング部位を示す図である。
【図６】実施例１２に記載した、二重特異性構築物中の両ナノ体の機能性を示すためのサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図７−１】実施例１４に記載した、１０％血漿中または１０％血液中のナノ体の濃度を定量するためのＥＬＩＳＡの最適化を示す図である。
【図７−２】実施例１４に記載した、１０％血漿中または１０％血液中のナノ体の濃度を定量するためのＥＬＩＳＡの最適化を示す図である。
【図８】実施例１６に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの一価抗ＴＮＦαナノ体の薬物動態を示す図である。
【図９】実施例１６に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの二重特異性ナノ体ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３Ｅの薬物動態を示す図である。
【図１０】実施例１６に記載した、ＵＲＬ４９と比較してＫ２０８を用いた、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの二重特異性ナノ体ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３Ｅの薬物動態を示す図である。
【図１１】実施例１６に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの二重特異性ナノ体ＭＳＡ２４／ＴＮＦ３Ｅ薬物動態を示す図である。
【図１２】実施例２３に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量した精製ＶＨＨによるｖＷＦへの結合を示す図である。
【図１３】実施例２４に記載した、ＶＨＨによるｖＷＦのコラーゲンへの結合の阻害を試験するためのＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１４−１】実施例２７に記載した、二重特異性構築物中の両ＶＨＨ機能性を示すサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１４−２】実施例２７に記載した、二重特異性構築物中の両ＶＨＨ機能性を示すサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１４−３】実施例２７に記載した、二重特異性構築物中の両ＶＨＨ機能性を示すサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物、ｉｎ ｖｉｖｏで安定性が改良されている前記構築物、ならびに診断および治療でのその使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ポリペプチド治療薬、特に抗体を基にした治療薬は、薬物として著しい潜在能力を有している。というのは、これらの治療薬は、その標的に対して極めて優れた特異性を有し、固有の毒性も低いからである。しかし、治療薬として有効であるためには、その薬物動態プロフィールを最適化すべきである。現在の抗体適用例の大部分は、急性疾患向けである。しかし、慢性症状用に抗体治療薬を開発する機会は多数ある。これには、長期にわたって多量の蛋白質が必要となる。哺乳動物細胞中での抗体産生費用は高いので、これらの適用例に向けての従来の抗体治療薬の開発は魅力の乏しいものであった。代替の手法によって酵母や細菌などの微生物発現系でＦａｂや一本鎖Ｆｖなどの抗体断片が発現されている。しかし、これらの断片は、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環時間が非常に短い。
【０００３】
血中での蛋白質およびペプチドの循環を高める初期の手法のいくつかは、ＰＥＧ化（ＵＳ４，１７９，３３７号）など、化学的改変に基づいている。このような生成物の例には、ＰＥＧイントロン、すなわち、ＨＣＶの治療にＰＥＧ化インターフェロンα‐２ｂ、およびＰＥＧ改変抗体による慢性疾患の治療（Ａ．Ｐ Ｃｈａｐｍａｎ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ（２００２），５４，５３１‐５４５）がある。しかし、そのような化学的方法には、ある種のアミノ酸側鎖の化学的変化のための標的蛋白質またはペプチドの不活化や、化学反応中に標的蛋白質／ペプチドが不安定であることなど、いくつかの短所がある。
【０００４】
これらの限界を克服するために、第一に、従来にない、または改変した蛋白質を使用することによって、第二に、ｉｎ ｖｉｖｏで半減期を延長するための代替方法を使用することによって、代替手法が開発されている。したがって、本質的に安定した蛋白質骨格を選択すること、および高濃度で生じる、免疫グロブリンやアルブミンなどの血漿蛋白質にそのような骨格を結合させる方法を提供することによって、蛋白質薬物の安定化を実施することができる。血漿蛋白質に結合させることは、一般に、分子の薬物動態特性を改善するための有効な手段であり得る。より正確には、蛋白質の半減期を改善するためのアルブミンへの結合が、Ｍ．Ｓ．Ｄｅｎｎｉｓら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３３，２３８３‐９０，２００２）、「血清アルブミンに親和性を有する単離ペプチド（Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｈａｖｉｎｇ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）」に記載されている。Ｆａｂ分子に結合させると、ＰＥＧ化Ｆａｂの半減期に匹敵する半減期が得られた。ＩｇＧまたは血清アルブミンに親和性であるペプチドリガンドが開示されている（ＷＯ０１／４５７４６号）。Ｃｅｍｕ Ｂｉｏｔｅｋｎｉｋ社（Ｎｙｇｒｅｎ、Ｗｉｇｚｅｌｌ、Ｕｈｌｅｎ、ＥＰ４８６５２５Ｂ１号、ＵＳ６，２６７，９６４号）は、活性蛋白質またはペプチドと、血清アルブミン（たとえばＳｔａｐｈ Ａ）に結合する細菌起源のポリペプチドとの融合体を説明した。これらのペプチドを基にした手法の欠点は、ペプチドが適正に折り畳まれ、かつ治療用蛋白質に融合した場合、血清アルブミンに結合することが可能でなければならないことである。したがって、これらのペプチドは、本質的に不安定であり、従来の抗体での事例のように、ナノモル以下または低ナノモル範囲ではなく、マイクロモル以下の範囲で親和性を有する。従来の抗体分子など、大型の蛋白質の一部として、これらのペプチドのアルブミンへの結合は立体的に阻害されかねない。
【０００５】
２個の機能単位を有する代替ハイブリッド分子は異種特異的抗体に基づく。そのようなハイブリッドは、標的に特異性および親和性を有する第１の実体、およびアルブミンなどの血清蛋白質に特異性および親和性を有する第２の実体を有する、二機能性または異種特異的抗体構築物からなるはずである。しかし、従来の抗体またはＦａｂ断片に基づく、そのような異種特異的構築物には、以下のようないくつかの重大な欠点がある。これらは、複雑であり、２個のポリペプチド鎖（ＶＨおよびＶＬ）から構成される大きい分子であり、したがって哺乳動物発現系で多量に産生するには困難であり、高価なものとなる。さらに、４本鎖（２本のＶＨおよび２本のＶＬ）から構成される二機能性抗体の産生は、非生産的ＶＨ‐ＶＬの組合せを有する分子をもたらし、結果として活性が消失するという固有の危険がある。二重特異性抗体や二機能性ｓｃＦｖなど、従来の抗体のペプチド誘導体に基づく結果を混ぜ合わせた、いくつかの代替法が試行されてきた（ＷＯ０２２０６１５号、ＷＯ９４１３８０４号、ＷＯ９１１９７３９号、ＷＯ９４０９１３１号）。Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５，６３２‐６３６，１９７９）は、血清免疫グロブリン（ＩｇＧ）に二重特異性抗体（従来の抗体に由来する二重特異性構築物）の抗体断片の１つを結合することによって、そのような二重特異性抗体の血清滞留時間が延長することを示唆しているが、血清ＩｇＧではなく血清蛋白質に対する抗体を使用し、二重特異性抗体を安定化できるとは示唆していない。二重特異性抗体は、その露出表面の粘着性、および異なる４つのＶ領域（２つのＶＨ＋２つのＶＬ）間の非生産的会合のために産生が本質的に難しいことが知られている。
【０００６】
たとえば、ＥＰ０７９３５０６Ｂ１号、ＵＳ５，６１２，０３４号、同６，１０３，２３３号、およびＵＳ２００２０００９４４１号に開示されている、血清蛋白質または細胞と安定した共有結合を形成する反応基を使用する、血清蛋白質への共有結合には、反応基による望ましくない標的の修飾という本質的な欠点がある。
【０００７】
アルブミンなどの大型で長命な蛋白質への融合体（Ｓｙｅｄら、Ｂｌｏｏｄ、８９，３２４３‐３２５２（１９９７）、Ｙｅｈら、ＰＮＡＳ、８９，１９０４‐１９０８（１９９２）、Ｃｅｌｌｔｅｃｈ（ＷＯ００２７４３５号））、アルブミンポリペプチドのＮ末端融合体（Ｄｅｌｔａ Ｂｉｏｔｅｃｈ／ＨＧＳ、ＵＳ５，３８０，７１２号、ＵＳ５，７６６，８８３号）、またはＩｇＧのＦｃ部分のＮ末端融合体（Ｃａｐｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３７，５２５‐５３１（１９８９）、Ａｓｈｋｅｎａｚｉら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９，１９５‐２００（１９９７）が記載されてきた。そのような融合体は、産生が非効率的であり、望ましくない免疫反応が引き起こされるという欠点がある。
【０００８】
インターフェロンの血清半減期を延長するためのインターフェロンとモノクローナル抗体の複合体が、ＵＳ５，０５５，２８９号に記載されている。そのような手法には、インターフェロンの生体活性を損なうという本質的な危険がある。構築物の大きさが、立体障害問題を引き起こすからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
当業界の治療用抗体の問題、すなわち、ｉｎ ｖｉｖｏでの短い半減期、不十分な折畳み、発現不足、および不十分な安定性を克服する治療用異種特異的抗体ポリペプチド構築物を提供することが本発明の目的である。さらに、前記異種特異的抗体を得る方法を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施形態は、
治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに
血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物である。
【００１１】
本発明の別の実施形態は、
抗標的単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗標的単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する上記のポリペプチド構築物である。
【００１２】
本発明の一実施形態は、
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する上記のポリペプチド構築物である。
【００１３】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である上記のポリペプチド構築物である。
【００１４】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ヒト化ラクダ科ＶＨＨ抗体である上記のポリペプチド構築物である。
【００１５】
本発明の一実施形態は、前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである上記のポリペプチド構築物である。
【００１６】
本発明の一実施形態は、単一ドメイン抗血清蛋白質抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００１７】
本発明の一実施形態は、標的が、ＴＮＦαである上記のポリペプチド構築物である。
【００１８】
本発明の一実施形態は、配列番号５〜１８のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００１９】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００２０】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００２１】
本発明の一実施形態は、炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００２２】
本発明の一実施形態は、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００２３】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症のどれかである、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００２４】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００２５】
本発明の一実施形態は、標的が、ｖＷＦである上記のポリペプチド構築物である。
【００２６】
本発明の一実施形態は、標的が、コラーゲンである上記のポリペプチド構築物である。
【００２７】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ｖＷＦ ＶＨＨである上記のポリペプチド構築物である。
【００２８】
本発明の一実施形態は、配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００２９】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００３０】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００３１】
本発明の一実施形態は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００３２】
本発明の一実施形態は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００３３】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄のどれかであり、前記状態が冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じている状態である、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００３４】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００３５】
本発明の一実施形態は、標的が、ＩｇＥである上記のポリペプチド構築物である。
【００３６】
本発明の一実施形態は、少なくとも抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩｇＥ ＶＨＨである上記のポリペプチド構築物である。
【００３７】
本発明の一実施形態は、配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００３８】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００３９】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００４０】
本発明の一実施形態は、アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００４１】
本発明の一実施形態は、アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００４２】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、および食事性アレルギーのどれかである、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００４３】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００４４】
本発明の一実施形態は、標的が、ＩＦＮγである上記のポリペプチド構築物である。
【００４５】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩＦＮγ ＶＨＨである上記のポリペプチド構築物である。
【００４６】
本発明の一実施形態は、配列番号２５〜２７によって表される配列に対応する上記のポリペプチド構築物である。
【００４７】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である上記のポリペプチド構築物である。
【００４８】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００４９】
本発明の一実施形態は、免疫系が、過敏である疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００５０】
本発明の一実施形態は、免疫系が、過敏である疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００５１】
本発明の一実施形態は、前記疾患が、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患のどれかである、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００５２】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物の使用である。
【００５３】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００５４】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００５５】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００５６】
本発明の一実施形態は、前記標的が疾患の過程に関与している単一標的を対象とする上記のポリペプチド構築物である。
【００５７】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、上記のポリペプチド構築物である。
【００５８】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物をコードする核酸である。
【００５９】
本発明の一実施形態は、前記標的が関与する疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００６０】
本発明の一実施形態は、前記標的が関与する疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００６１】
本発明の一実施形態は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００６２】
本発明の一実施形態は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００６３】
本発明の一実施形態は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸である。
【００６４】
本発明の一実施形態は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、上記のポリペプチド構築物または上記の核酸の使用である。
【００６５】
本発明の一実施形態は、前記ポリペプチド構築物が経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、上記のポリペプチド構築物または核酸、あるいは上記のポリペプチド構築物または核酸の使用である。
【００６６】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチド構築物もしくは上記の核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【００６７】
本発明の一実施形態は、
（ａ）上記のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞をポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ、および
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収するステップ
を含む上記の産生方法である。
【００６８】
本発明の一実施形態は、前記宿主細胞が細菌または酵母である上記の方法である。
【００６９】
本発明の一実施形態は、対象の血流中の単一ドメイン抗体の半減期を延長するための方法であって、その抗体に血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を結合することによって、前記抗体が治療用および／または診断用標的を対象とする方法である。
【００７０】
本発明の一実施形態は、前記抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない上記の方法である。
【００７１】
本発明の一実施形態は、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない上記の方法である。
【００７２】
本発明の一実施形態は、前記単一ドメイン抗体がラクダ科ＶＨＨ抗体である上記の方法である。
【００７３】
本発明の一実施形態は、前記血清蛋白質が血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである上記の方法である。
【００７４】
本発明の一実施形態は、前記血清蛋白質が配列番号１〜４のどれかに対応する配列、相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列を含む上記の方法である。
【００７５】
本発明の一実施形態は、上記のポリペプチドもしくは該ポリペプチドをコードすることができる核酸、および薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
本発明は、それぞれが対象の血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体、およびそれぞれが標的分子を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、ならびに抗標的単一ドメイン抗体がそのような構築物の一部ではない場合の半減期と比較して、前記対象の循環中で構築物の半減期が極めて長期であるという知見に関する。
【００７７】
単一ドメイン抗体は、その相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例には、それだけには限らないが、重鎖抗体、元々軽鎖を欠く抗体、従来の４本鎖抗体に由来する単一ドメイン抗体、設計された抗体、および抗体に由来する骨格ではない単一ドメイン骨格が含まれる。単一ドメイン抗体は、当該技術の単一ドメイン抗体のどれでも、またはどんな未来の単一ドメイン抗体でもよい。単一ドメイン抗体は、それだけには限らないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むどんな種からも得ることができる。本発明の一態様によれば、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖を欠く重鎖抗体として知られている自然に存在する単一ドメイン抗体である。そのような単一ドメイン抗体は、たとえば、ＷＯ９４０４６７８号に開示されている。明瞭にするために、従来の４本鎖免疫グロブリンのＶＨと区別するために、本明細書では元々軽鎖を欠く重鎖抗体に由来するこの可変ドメインをＶＨＨまたはナノ体として示す。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、たとえば、ラクダ、ヒトコブラクダ、アルパカ、およびグアナコで生じた抗体から得ることができる。ラクダ科に加え他の種も元々軽鎖を欠く重鎖抗体を産生することができ、そのようなＶＨＨも本発明の範囲に属する。
【００７８】
標的を対象とするポリペプチド構築物の１個または複数の単一ドメイン抗体は、同じ配列のものでよい。あるいは、それらの抗体は、すべてが同じ配列を有していなくてもよい。すべてが同じ配列を共有しなくてよいが、同じ標的、その断片、あるいはその１種または複数の抗原を対象とする抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物は本発明の範囲に属する。
【００７９】
本発明によれば、異種特異的分子の結合活性および／または親和性を増大するための、複数の抗標的および／または抗血清蛋白質単一ドメイン抗体の利用方法が提供される。この方式で、本発明にしたがって改変した分子の血清半減期は延長することができる。そのような改変によって特定の治療分子の治療空白（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）が変更され、かつ／または延長される。血清蛋白質に特異的なペプチド、多価形態では産生が困難である二重特異性抗体、（ＰＥＧ化やアシル化などの）化学的修飾を使用する場合など、当該技術分野の代替方法ではこの融通性は得られない。
【００８０】
血清蛋白質を対象とする、ポリペプチド構築物の１個または複数の単一ドメイン抗体は同じ配列でよい。あるいは、これらの抗体は、すべてが同じ配列を有していなくてもよい。すべてが同じ配列を共有しなくてよいが、血清蛋白質、その断片、またはその１種または複数の抗原を対象とする抗血清蛋白質単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物は本発明の範囲内に属する。
【００８１】
別の実施形態では、ポリペプチド構築物の１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体は、１種を超える標的（たとえば、ｖＷＦやコラーゲン）を対象とすることができる。同様に、ポリペプチド構築物の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、１種を超える血清蛋白質（たとえば、血清アルブミンやフィブリノーゲン）を対象としてよい。
【００８２】
本発明により、さらに当業者に知られているＶＨＨは、ＷＯ９４０４６７８号に記載されている、ラクダ科に由来する免疫グロブリンなど、元々軽鎖を欠く免疫グロブリンに由来する重鎖可変ドメインである（以後、ＶＨＨドメインまたはナノ体と呼ぶ）。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子の約１０分の１の大きさである。これらは、単一ポリペプチドであり、極端なｐＨおよび温度条件に耐えて非常に安定している。さらに、これらは、プロテアーゼの作用にも耐性であり、この耐性は従来の抗体では見られない。さらに、ＶＨＨのｉｎ ｖｉｔｒｏでの発現では、高収量で好適に折り畳まれた機能性ＶＨＨが産生される。さらに、ラクダ科で生じた抗体は、抗体ライブラリを用いて、またはラクダ科以外の哺乳動物の免疫化によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生じた抗体によって認識されるエピトープ以外のエピトープを認識する（ＷＯ９７４９８０５号）。そのようなものとして、抗アルブミンＶＨＨは、より効率的な方式で担体蛋白質であることが知られている血清アルブミンと相互に作用し得る。担体蛋白質として、血清アルブミンのエピトープのいくつかは、結合した蛋白質、ペプチド、および小化合物が利用することができない。ＶＨＨは、「異常な」または従来にはない陥凹部などのエピトープに結合（ＷＯ９７４９８０５号）することが知られているので、循環アルブミンへのそのようなＶＨＨの親和性は増大し得る。
【００８３】
本発明は、１個または複数の対象の血清蛋白質を対象とする１個または複数のＶＨＨ、ならびに前記対象の１個または複数の標的分子を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物は、驚くべきことに、抗標的ＶＨＨが前記構築物の一部でない場合の半減期と比較して、前記対象の循環で半減期が極めて長期であるという知見にも関する。さらに、そのような長期の半減期は、アルブミンに特異的な低親和性ペプチドを使用した場合（Ｄｅｎｎｉｓら、ＪＢＣ，２７７，３５０３５号）の数時間と比較して、高親和性抗血清アルブミンＶＨＨのために数日という範囲である。半減期の延長は、本発明者らにより本明細書で、たとえば、実施例１６で、および配列番号５によって表されるポリペプチドによって実証される。さらに、前記構築物は、少なくとも１９日間マウスで依然として無傷でいられる高安定性（実施例１６）、極端なｐＨ耐性、高温安定性、高標的親和性など、ＶＨＨと同じ好都合な特性示すことが判明した。
【００８４】
本発明による標的は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物に結合することができる任意の生体物質である。標的は、たとえば、蛋白質、ペプチド、核酸、オリゴ核酸、糖類、多糖類、糖蛋白でよい。例には、それだけには限らないが、治療用標的、診断用標的、受容体、受容体リガンド、ウイルスコート蛋白質、免疫系蛋白質、ホルモン、酵素、抗原、細胞シグナル伝達蛋白質、またはそれらの断片が含まれる。標的は、未変性蛋白質、またはそれらの断片、その相同配列、その機能部分、または相同配列機能部分でよい。
【００８５】
単一ドメイン抗体、特にＶＨＨの特性は、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどの供給源に由来する抗体（すなわち従来の抗体）およびそのヒト化誘導体の特性に有利に匹敵する。従来の抗体は、室温で安定しておらず、必須の冷蔵研究設備、冷蔵庫、および冷蔵輸送が不可欠であり、調製および貯蔵は冷蔵しなければならず、このことは時間および費用の上昇の一因となる。発展途上国では、冷蔵が実施不可能な場合もある。さらに、前記抗体の作製または小規模産生は高価である。というのは、無傷で活性な抗体の発現に必要な哺乳動物細胞系は、時間および装置の点で高度の支援が必要であるが収量は極めて少ないからである。さらに、従来の抗体の結合活性はｐＨ次第であり、したがって、たとえば、胃出血の治療や胃手術など、通常の生理ｐＨ範囲外の環境における使用には不適当である。さらに、従来の抗体は、低ｐＨまたは高ｐＨで不安定であり、したがって経口投与には適当でない。しかし、ＶＨＨは、極端なｐＨ、変性試薬、高温などの過酷な条件に耐えることが実証されているので（Ｅｗｅｒｔ Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年３月１９日、４１（１１），３６２８‐３６）、それらの抗体は経口投与による送達に相応しいものとなる。さらに、従来の抗体の結合活性は、温度次第であり、したがって生体活性温度範囲外（たとえば、３７±２０?Ｃ）の温度で実施するアッセイやキットで使用するのには不適当である。
【００８６】
さらに、ＶＨＨは、より溶解性であり、それは従来の抗体と比較してより高濃度で貯蔵および／または投与できることを意味している。本発明のポリペプチドは、通常の生理範囲を超えたｐＨおよび温度でも結合活性を保持し、それは極端なｐＨおよび温度条件でペプチドを使用できることを意味し、その極端な条件とは胃手術、胃出血の制御、室温で実施する検定など、血小板介在凝集の調節を必要とするものである。本発明のポリペプチドは、極端なｐＨで長期の安定性も示し、これは経口投与による送達に適当であることを意味している。高価な哺乳動物細胞培養施設も必要とする従来の抗体とは異なって、本発明のポリペプチドは、大腸菌や酵母などの好都合な組換え宿主生物中で発酵によって費用効率よく生成することができ、実現可能な発現レベルは高い。本発明のポリペプチドの収量の例は、１〜１０ｍｇ／ｍｌの（大腸菌）であり、１ｇ／ｌ（酵母）までである。本発明のポリペプチドは、広範な異なる抗原型への高結合親和性、および従来の抗体によって認識されないエピトープへ結合する能力も示し、たとえば、このポリペプチドは、陥凹部に浸透し酵素機能阻害を示す潜在能力を持つ、長いＣＤＲを基にしたループ構造体を示す。さらに、結合は、しばしば、ＣＤＲ３ループのみによって生じるので、ＣＤＲ３に由来するペプチドを治療に使用することは可能なはずであると想定される（Ｄｅｓｍｙｔｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２００１，２７６：２６２８５‐９０）。本発明のポリペプチドは、酵素または毒素との融合蛋白質として完全な結合能力を保持することもできる。
【００８７】
本発明は、それぞれが１個または複数の対象の血清蛋白質を対象とする１個または複数のＶＨＨ、ならびにそれぞれが１個または複数の標的分子を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物であって、ＶＨＨがラクダ科単一ドメイン重鎖抗体の従来クラスに属する構築物にも関する。本発明は、それぞれが対象の１個または複数の血清蛋白質を対象とする１個または複数のＶＨＨ、ならびにそれぞれが１個または複数の標的分子を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物であって、ＶＨＨがヒト様配列を有する、ラクダ科単一ドメイン重鎖抗体クラスに属する構築物にも関する。ＴＮＦαに結合する配列番号１２によって表されるＶＨＨ配列、およびマウスアルブミンに結合する第２のＶＨＨは、このクラスのＶＨＨペプチドに属する。そのようなものとして、このクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に高アミノ酸配列相同性を示し、そこからの望ましくない免疫応答を懸念することなく、さらにヒト化する負担もなく、前記ペプチドを患者に直接投与することができるであろう。
【００８８】
配列番号１、３、および４によって表されるラクダ科単一ドメイン抗体のヒト様クラスは、ＷＯ０３０３５６９４号記載されており、ヒト起源の従来の抗体または他の種由来の抗体に通常見られる疎水性ＦＲ２残基を含むが、親水性におけるこの損失は位置１０３で他の置換基によって補われ、この位置１０３は二重鎖抗体由来のＶＨ中に存在する保存トリプトファン残基に取って代わる。そのようなものとして、これら２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に高アミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、そこからの望ましくない免疫応答を懸念することなく、さらにヒト化する負担もなく、ヒトに直接投与されるであろう。
【００８９】
したがって、本発明の一態様は、それを必要とする患者に抗血清アルブミンポリペプチドを直接投与することを可能にすることであり、その場合、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨのヒト化クラスに属し、配列番号１、３、または４のどれかによって表される配列を含む。
【００９０】
本明細書で使用される対象は、循環液に血清蛋白質が含まれる循環系を有する任意の哺乳動物である。循環系の例には、血液およびリンパ系が含まれる。動物の例は、それだけには限らないが、ウサギ、ヒト、ヤギ、マウス、ラット、ウシ、子ウシ、ラクダ、ラマ、サル、ロバ、モルモット、ニワトリ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマなどが含まれる。
【００９１】
本発明の一実施形態は、治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびにそれぞれが１個または複数の血清蛋白質またはポリペプチドを対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物。既に上記したように、抗標的単一ドメイン抗体は、同じ配列を有してよい。あるいは、少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体は、異なる配列を有してよいが、同じ標的、その断片、またはその抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープを対象とする。同様に、抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、同じ配列を有してよい。あるいは、少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、異なる配列を有してよいが、同じ血清蛋白質、その断片、またはその抗原上の同じエピトープまたは異なるエピトープを対象とする。
【００９２】
本発明の別の実施形態では、１個を超える抗標的単一ドメイン抗体が、異種特異的ポリペプチド構築物中に存在する場合、各抗標的単一ドメイン抗体は異なる標的を対象（たとえばｖＷＦやコラーゲンを対象）とすることができる。同様に、１個を超える抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が存在する場合、各抗血清単一ドメイン抗体は、異なる血清蛋白質を対象（たとえば血清アルブミンやフィブリノーゲンを対象）とすることができる。
【００９３】
本発明の一実施形態は、抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する異種特異的ポリペプチドである。
【００９４】
本明細書で開示した構築物は、単一ドメイン抗体の有利な特性（たとえばＶＨＨ）を保持し、個体の循環中で存在期間が長い。したがって、そのような構築物は、数日間対象の血清中を循環することができ、治療の頻度や対象の不便を減少させ、治療費を削減する。さらに、異種特異的ポリペプチド構築物の半減期が、構築物中に存在する抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数によって制御することができることは本発明の態様である。制御可能な半減期は、いくつかの状況、たとえば、治療異種特異的ポリペプチド構築物の時間調節投与の適用で、または所望の治療効果を得る際に望ましい。
【００９５】
本発明の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は、全長異種特異的ポリペプチド構築物の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は全長異種特異的ポリペプチド構築物の機能部分でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は、全長異種特異的ポリペプチド構築物の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は、全長異種特異的ポリペプチド構築物の相同配列の機能部分でよい。本発明の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物には、異種特異的ポリペプチド構築物配列を含めてよい。
【００９６】
本発明の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）またはその相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体の機能部分でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物を形成するために使用される単一ドメイン抗体は、完全単一ドメイン抗体の相同配列の機能部分でよい。
【００９７】
本発明の別の態様によれば異種特異的ポリペプチド構築物は親配列の相同配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は機能部分親配列でよい。本発明の別の態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物は親配列の相同配列の機能部分でよい。
【００９８】
本明細書では、本発明の相同配列には、本発明のポリペプチドの機能特性を実質上変化させない、１個または複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換を含めてよい。アミノ酸の欠失または置換数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０アミノ酸までであることが好ましい。
【００９９】
本発明の相同配列には、ヒト化されている本発明の単一ドメイン抗体を含めてよい。
【０１００】
ヒト化とは変異させることを意味し、その結果ヒト患者に投与したとき免疫原性は低くまたは存在しなくなる。本発明による単一ドメイン抗体のヒト化には、ポリペプチドがその通常の特性を失うことなく、ヒトコンセンサス配列中に見られるそれらのヒト対照物によって、１個または複数のアミノ酸を置換するステップが含まれ、すなわち、ヒト化は得られたポリペプチドの抗原結合能力にあまり影響を与えない。そのような方法が当業者によって知られている。ラクダ科ＶＨＨに応用されるヒト化技術は、以下の残基のどれかの置換を単独でまたは組み合わせて含む方法によって実施することもできる。すなわち、いくつかのＶＨＨは、親水性特性を有する典型的なラクダ科本来の残基を位置３７、４４、４５、および４７に含む。位置４４および４５（Ｅ４４ＧおよびＲ４５Ｌ）で親水性残基をヒト疎水性残基によって置換しても、結合および／または阻害に対して影響を与えなかった。ＦＲ１の位置１、５、２８、３０など、ＦＲ３の位置７４、７５、７６、８３、８４、９３、９４など、およびＦＲ４の位置１０３、１０４、１０８、１１１などの残基の置換によってさらにヒト化を行う必要が生じるかもしれない（数字はすべてＫａｂａｔによる）。
【０１０１】
本発明の一実施形態は、以下の残基のどれかを単独でまたは組み合わせて置換するステップを含む、ＶＨＨをヒト化する方法である。
ＦＲ１の位置１、５、２８、および３０
ＦＲ２の位置４４および４５の本来のアミノ酸
ＦＲ３の残基７４、７５、７６、８３、８４、９３、および９４、ならびに
ＦＲ４の位置１０３、１０４、１０８、および１１１
（番号付けはＫａｂａｔの番号付けによる）
【０１０２】
いくつかのラクダ科ＶＨＨ配列は、ヒトＶＨフレームワーク領域に高い配列相同性を示し、したがってそれに由来する免疫応答の懸念および追加のヒト化の負担なしに前記ＶＨＨを患者に直接投与することができる。したがって、本発明の一態様は、前記ＶＨＨが、ヒトＶＨフレームワーク領域に高い相同性を示す場合、ＶＨＨをヒト化することなく異種特異的ポリペプチド構築物を形成できるようにする。
【０１０３】
本発明の相同配列は、たとえば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、アルパカ、グアナコなど、別の種に由来する本発明の配列でよい。
【０１０４】
相同配列が、配列相同性を示す場合、それは本発明の単一ドメイン抗体で高い配列相同性（７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％を超える配列相同性）を提供する配列を意味し、親配列に類似する特性、すなわち、親和性を特徴とすることが好ましく、前記同一性は周知の方法を使用して算出される。
【０１０５】
本発明による相同配列は、厳密なハイブリッド形成条件下で、未変性配列をコードすることができるヌクレオチド配列の逆相補鎖にハイブリッド形成することができる、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、８００、または１０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチド配列（ＳＡＭＢＲＯＯＫら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、実験マニュアル、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク州、によって記載されているものなど）をさしてよい。
【０１０６】
本明細書では、機能部分は、当該相互作用が１×１０−６Ｍ以上の親和性で維持されるのに十分な長さの単一ドメイン抗体をさす。
【０１０７】
あるいは、本発明の単一ドメイン抗体の機能部分は、完全なアミノ酸配列の部分的欠失を含むが、依然として標的または血清蛋白質との結合および相互作用に必要な結合部位および蛋白質ドメインを維持する。
【０１０８】
本明細書では、本発明の単一ドメイン抗体の機能部分は、この配列の１００％未満（たとえば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、など）をさすが、５以上のアミノ酸または１５以上のヌクレオチドを含む。
【０１０９】
本発明の単一ドメイン抗体の部分は、この配列の１００％未満（たとえば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％など）をさすが、５以上のアミノ酸または１５以上のヌクレオチドを含む。
【０１１０】
ＴＮＦα、ＩＦＮγ受容体、血清蛋白質（たとえば、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリン、フィブリノーゲン）、ＩＦＮγなど、本明細書に記載した標的は前記標的の断片でよい。したがって、標的は、免疫応答を引き出すことができる、前記標的の断片でもある。標的は、完全長標的に対して引き起こされた単一ドメイン抗体に結合することができる、前記標的の断片でもある。
【０１１１】
本明細書で使用される断片は、この配列の１００％未満（たとえば、９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％など）をさすが、５、６、７、８、９、１０、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５以上のアミノ酸を含む。断片は、当該相互作用が１×１０−６Ｍ以上の親和性で維持されるのに十分な長さのものである。
【０１１２】
本明細書で使用される断片は、野生型標的に対して生じた単一ドメイン抗体に結合するための標的の能力を実質的に変化させない、１個または複数のアミノ酸の任意選択の挿入、欠失、および置換もさす。アミノ酸の挿入、欠失、または置換の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０アミノ酸までであることが好ましい。
【０１１３】
血清蛋白質は、対象の血清に見られるどんな適当な蛋白質またはその断片でもよい。本発明の一態様では、血清蛋白質は、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリン、またはフィブリノーゲンである。有効な治療に必要な半減期および／または標的抗原の区画化などの所期の使用に依存して、ＶＨＨパートナーは上記血清蛋白質の１種を対象とすることができる。
【０１１４】
標的を対象とする単一ドメイン抗体は、１０−６Ｍを超える親和性でその標的に結合することができる単一ドメイン抗体を意味する。
【０１１５】
本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、当該技術分野で知られている方法、またはいかなる未来の方法にしたがって、当業者が作製することができる。たとえば、ラクダを免疫化し、そこからハイブリドーマを得ること、または当該技術分野で知られている分子生物技術を使用して、単一ドメイン抗体ライブラリをクローニングし、続いてファージ提示法の使用による選択によってなど、当該技術分野で知られている方法を使用してＶＨＨを得ることができる。
【０１１６】
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、血清蛋白質のポリペプチドまたは蛋白質全体を対象とすることができる。抗標的単一ドメイン抗体は、標的全体の前記標的のポリペプチドを対象とすることができる。免疫原性ポリペプチドについて蛋白質を走査する方法は、当該技術分野で周知である。
【０１１７】
単一ドメイン抗体は、当該技術分野で知られている方法または任意の未来の方法を使用して結合することができる。たとえば、抗体は化学的に架橋することによって融合することができ、Ｂｌａｔｔｌｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２４、１５１７‐１５２４、ＥＰ２９４７０３号に記載されているものなど、アミノ酸残基を有機誘導体化剤と反応させることによって融合することができる。あるいは、単一ドメイン抗体は、ＤＮＡレベルで遺伝子的に融合することができ、すなわち、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体、ならびに１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体を含む完全ポリペプチド構築物をコードするポリヌクレオチド構築物を形成することができる。二価または多価ＶＨＨポリペプチド構築物を産生する方法が、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９６／３４１０３号に開示されている。多数の単一ドメイン抗体を相互に接合する一方式は、単一ドメイン抗体コード配列を直接またはペプチドリンカーを介して結合することによる遺伝子経路である。たとえば、第１の単一ドメイン抗体のＣ末端を次の単一ドメイン抗体のＮ末端と結合することができる。三価、四価などの機能性構築物の構築および産生に向けて追加の単一ドメイン抗体を結合するために、この結合方式は延長することができる。
【０１１８】
本発明の態様は、本発明による異種特異的ポリペプチド構築物の投与であり、これにより注射の必要性が回避される。従来の抗体を基にした治療薬は、薬物として著しい潜在能力を有している。というのは、これらは、その標的に対して極めて優れた特異性を有し、固有の毒性も低いからである。しかし、これらの抗体には１つの重大な欠点がある。これらは、複雑な大型の分子であり、したがって比較的不安定であり、プロテアーゼによる分解に敏感である。これは、従来の抗体薬物が、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与できないことを意味する。というのは、こうした薬物が、これらの部位での低ｐＨやこれらの部位および血中でのプロテアーゼの作用に耐性ではなく、かつ／またはその大きさのためである。こうした薬物は、これらの問題のいくつかを克服するために、（静脈内、皮下など）注射によって投与しなければならない。注射による投与は、皮下用注射器または針を正確安全に使用するために専門家の訓練を必要とする。さらに、滅菌装置、治療用ポリペプチド液体製剤、滅菌かつ安定形での前記ポリペプチドのバイアル包装、および対象で針の侵入に適当な部位が必要とされる。さらに、一般に、対象は注射を受ける前後で身体的および心理的ストレス経験する。本発明の態様は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を提供することによって、従来技術のこうした問題を克服する。前記構築物は、十分に小さく、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的な、または吸入による送達に耐性で安定しており、実質的に活性を消失することはない。本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、注射の必要性を回避し、費用／時間の削減になるのみならず、対象にとってより好都合、より快適である。
【０１１９】
本発明の一実施形態は、標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含み、抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物であり、この抗標的治療化合物は不活化されることなく胃環境を通過することができる。
【０１２０】
当業者によって知られているように、ひとたび、前記ポリペプチド構築物を得ることができれば、（胃、大腸などの）正しい部位で最大量のＶＨＨを放出するために、製剤技術を応用することができる。この送達方法は、その標的が消化器系内に位置する疾患症状の治療、予防、および／または緩和に重要である。
【０１２１】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的な１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく胃環境を通過できる治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１２２】
本発明の別の実施形態は、不活化されることなく胃環境を通過することができる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１２３】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく消化器系に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１２４】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１２５】
本発明の別の実施形態は、膣路および／または直腸路に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書の標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１２６】
非限定的な例では、本発明による製剤は、ゲル、クリーム、座薬、フィルムの形をした、またはスポンジの形をした、あるいは時間の経過につれて活性成分を静かに放出する膣リングとして、１個または複数の標的を対象とする１個または複数のＶＨＨを含む、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を含む（そのような製剤は、ＥＰ７０７４７３号、ＥＰ６８４８１４号、ＵＳ５６２９００１号に記載されている）。
【０１２７】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的な１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経膣投与および／または経直腸投与することによって、膣路および／または直腸路への治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１２８】
本発明の別の実施形態は、膣路および／または直腸路に送達される抗標的治療化合物によって、不活化されることなく調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１２９】
本発明の態様は、対象の膣路および／または直腸路に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく膣路および／または直腸路に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３０】
本発明の態様は、対象の膣路および／または直腸路に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３１】
本発明の別の実施形態は、鼻、上気道、および／または肺に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１３２】
非限定的な例では、本発明による製剤は、鼻内スプレー（たとえばエアロゾル）または吸入器の形をした、１個または複数の標的を対象とする、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を含む。本構築物は、小さいので、治療用ＩｇＧ分子より極めて効果的にその標的に到達することができる。
【０１３３】
本発明の態様は、口または鼻を通る吸入によって、対象に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することにより、上気道および肺に送達した治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法であり、その場合、１個または複数の単一ドメイン抗体は疾患に関係付けられる抗原に特異的である。
【０１３４】
本発明の別の態様は、分散可能ＶＨＨ組成物であり、特に、ＵＳ６５１４４９６号に記載されているものなど、ＶＨＨ組成物の分散可能な乾燥粉である。これらの乾燥粉組成物は、平均粒子径が０．４〜１０ｍｍ(nm)の範囲の複数の分離した乾燥粒子を含む。そのような粉は、吸入デバイスで容易に分散させることができる。ＶＨＨは、そのような組成物に特に適切である。凍結乾燥物質は、その高い可溶性（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｓ．，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、７４，２７７‐３０３，（２００１））のために、（吸入後の肺で）容易に溶解することができる。あるいは、そのような凍結乾燥ＶＨＨ製剤を希釈液によって元に戻して、皮下投与に適した安定した再構成製剤を得ることができる。たとえば、アレルギー性喘息の治療に有用な抗ＩｇＥ抗体製剤（実施例１、ＵＳ６２６７９５８号、ＥＰ８４１９４６号）が調製されてきた。
【０１３５】
本発明の別の実施形態は、不活化されることなく、鼻、上気道、および／または肺に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１３６】
本発明の態様は、対象の鼻、上気道、および／または肺に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、鼻、上気道、および肺に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３７】
本発明の態様は、対象の鼻、上気道、および／または肺に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく、鼻、上気道、および／または肺に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３８】
本発明の態様は、対象の鼻、上気道、および／または肺に、前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１３９】
本発明の一実施形態は、腸粘膜に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記疾患は腸粘膜透過性を高める。その小さい寸法のために、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、腸粘膜透過性の上昇を引き起こす疾患を患う対象で、より効率よく腸粘膜を通過し血流に到達することができる。
【０１４０】
本発明の態様は、対象に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、腸粘膜に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法であり、その場合、前記疾患が腸粘膜透過性を高める。
【０１４１】
この工程は、本発明の別の態様である能動輸送担体の使用によって、さらに強化することができる。本発明のこの態様では、腸壁を通り血流に至る移送を強化する担体にＶＨＨを融合する。非限定的な例では、この「担体」は、治療用ＶＨＨに融合される第２のＶＨＨである。そのような融合構築物は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製される。「担体」ＶＨＨは、腸壁を通り抜ける能動輸送を誘発する腸壁上の受容体に特異的に結合する。
【０１４２】
本発明の別の実施形態は、腸粘膜に送達される抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記疾患は腸粘膜透過性を高める。
【０１４３】
本発明の態様は、対象に本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく腸粘膜に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１４４】
本発明の態様は、対象に本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１４５】
この工程は、本発明の別の態様 能動輸送担体の使用によって、さらに強化することができる。本発明のこの態様では、腸壁を通り血流に至る移送を強化する担体に、本明細書に記載した異種特異的ポリペプチド構築物を融合する。非限定的な例では、この「担体」は前記ポリペプチドに融合されるＶＨＨである。そのような融合構築物は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製される。「担体」ＶＨＨは、腸壁を通り抜ける能動輸送を誘発する腸壁上の受容体に特異的に結合する。
【０１４６】
本発明の一実施形態は、標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含み、効率的に舌下組織を通過することが可能な抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物である。本明細書で開示した前記ポリペプチド構築物製剤、たとえば、錠剤、スプレー、ドロップは、舌下に置かれ粘膜を通り抜けて舌下毛細管網に吸収される。
【０１４７】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的なＶＨＨを舌下投与することによって、効率的に舌下組織を通過することが可能な治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１４８】
本発明の別の実施形態は、舌下組織を通り抜けることができる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１４９】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく舌下組織に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５０】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を経口投与することによって、不活化されることなく対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５１】
本発明の一実施形態は、少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含み、効果的に皮膚を透過できる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物である。前記ポリペプチド構築物製剤、たとえば、クリーム、フィルム、スプレー、ドロップ、パッチは皮膚に載せられて透過する。
【０１５２】
本発明の態様は、対象に疾患に関係付けられる抗原に特異的な１個または複数の単一ドメイン抗体を含む本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を局所投与することによって、効果的に皮膚を透過できる治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１５３】
本発明の別の態様は、アレルギー性疾患など、眼疾患を治療するための局所眼用組成物として、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を使用することであり、その方法は本明細書で開示したポリペプチド構築物を含む眼用組成物の局所投与を含み、前記構築物は１個または複数の抗ＩｇＥ ＶＨＨを含む（実施例１、実施例２）。
【０１５４】
本発明の別の実施形態は、効果的に皮膚を透過できる抗標的治療化合物によって調節が可能な疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０１５５】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を局所投与することによって、不活化されることなく皮膚に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５６】
本発明の態様は、対象に前記標的を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を局所投与することによって、対象の血流に抗標的治療化合物を送達する方法である。
【０１５７】
本発明の別の実施形態では、異種特異的ポリペプチド構築物は、さらに、肺胞腔から血液に前記異種特異的ポリペプチド構築物を輸送するための能動輸送担体として作用する担体単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）を含む。
【０１５８】
担体をさらに含むポリペプチド構築物は、粘膜表面（気管支上皮細胞）上に存在する受容体に特異的に結合し、肺胞腔から血液にポリペプチドを能動輸送する。担体単一ドメイン抗体は、ポリペプチド構築物に融合させることができる。そのような融合構築物は、当該技術分野で知られている方法を使用して作製され、本明細書に記載されている。「担体」単一ドメイン抗体は、表面を通り抜ける能動輸送を誘発する粘膜表面上の受容体に特異的に結合する。
【０１５９】
本発明の別の態様は、経鼻投与直後にどの単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）が血流に能動輸送されるかを決定する方法である。同様に、未処置のまたは免疫ＶＨＨファージライブラリを経鼻投与することができ、血流に能動輸送されているファージをレスキュー（RESCUE)するために、投与後の様々な時点後に血液または臓器を単離することができる。肺胞腔から血流への能動輸送用受容体の非限定的な例は、Ｆｃ受容体Ｎ（ＦｃＲｎ）である。本発明の一態様には、本方法によって同定したＶＨＨ分子が含まれる。次いで、経鼻投与直後、血流中で治療用ＶＨＨを対応する標的に送達するための担体ＶＨＨとしてそのようなＶＨＨを使用することができる。
【０１６０】
本発明の一実施形態は、治療化合物を静脈内送達する必要がある疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、血流によって治療化合物を送達する必要がある疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１６１】
本発明の別の実施形態は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。前記疾患を治療しまたは診断するために本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を使用することによって、前記構築物の枯渇が遅延される。
【０１６２】
本発明の別の実施形態は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、数日間患者の血清中を循環できる治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。前記疾患を治療しまたは診断するために、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物を使用することによって、治療の頻度が減少するので治療費も減少する。
【０１６３】
本発明の別の実施形態は、アレルギーに関連付けられる疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、アレルギーに関連付けられる疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。
【０１６４】
上記の本発明の態様および実施形態は、前記異種特異的ポリペプチド構築物の抗血清単一ドメイン抗体が、配列番号１〜４によって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。
【０１６５】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号５〜１８のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗ＴＮＦαラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６６】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗ｖＷＦラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６７】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明の異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗ＩｇＥラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６８】
上記の本発明の態様および実施形態は、本発明による異種特異的ポリペプチド構築物が、配列番号２５〜２７のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する場合にも適用される。前記配列には、抗インターフェロンγラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１６９】
アレルギーに関連し、抗標的単一ドメイン抗体が対象とすることができる標的の非限定的な例はＩｇＥである。対象は、生存中、ヤケヒョウヒダニやイエダニなどの無害な寄生虫、または凝集塊、プラスチック、金属などの物質対してアレルギー応答を引き起こし得る。これにより免疫応答カスケードを開始するＩｇＥ分子が誘導される。本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であ る。本発明の一態様では、前記抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体は、ＩｇＥと肥満細胞および好塩基球上のその受容体との相互作用を阻止するので、免疫学カスケードの開始と、それに続くアレルギー反応が遮断される。別の態様では、抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、対象の血清蛋白質の１種を対象とする。このようにして、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、一般的なまたは異常なアレルゲンによるアレルギー応答を低減しまたは防止する。さらに、構築物の血中での存在期間が長いので治療空白は延長される。
【０１７０】
腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ‐α）は、様々な疾患、たとえば、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患で重要な役割を果たすと考えられている。ＴＮＦ‐αおよびその受容体（ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ）はどちらも詳細に研究されてきた。生理活性形態のＴＮＦ‐αは、三量体であり、近傍サブユニットによって形成された溝は、サイトカイン受容体の相互作用に重要である。このサイトカインの作用を相殺するためのいくつかの戦略が開発されており、現在、様々な病態の治療に使用されている。
【０１７１】
ＴＮＦに対して十分な特異性および選択性を有するＴＮＦ阻害剤は、炎症性疾患を予防しまたは治療するための効果的な予防用または治療用薬剤化合物であり得る。しかし、そのような標的配列に対して、十分な作用強度および選択性を備えた小型の化学物質（ＮＣＥ）を開発することは、極めて困難であり工程も冗長である。他方で、抗体を基にした薬物は、薬物として顕著な可能性を有している。というのは、こうした薬物は、その標的に対する特異性が極めて優れており、固有の毒性も低いからである。さらに、新規化学物質（ＮＣＥ）の開発と比較して、開発時間をかなり削減することができる。しかし、ＴＮＦ‐αでの事例のように、リガンドの受容体結合ドメインが溝の中に包埋されている多量体蛋白質に対して、従来の抗体を引き出すことは困難である。
【０１７２】
抗標的単一ドメイン抗体がＴＮＦαを対象とする本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、安定性、大きさ、確実な発現などの特性を原因とする、従来技術のペプチド治療薬を使用して経験する問題を克服する。さらに、本発明者らは、多量体ＴＮＦα中に溝が存在するにもかかわらず、異種特異的ポリペプチド構築物は、依然としてＴＮＦαに強力に結合することができることを見出している。
【０１７３】
本発明の別の実施形態は、炎症分子が介在する疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物である。本発明の態様は、炎症分子が介在する疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための前記構築物の使用である。本発明の別の態様は、個体に本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物を投与することによって、炎症分子が介在する疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。本発明によれば、前記異種特異的ポリペプチドの抗標的単一ドメイン抗体は、前記疾患の原因または徴候に関与し、あるいはその症状の誘発に関与する標的を対象とする。
【０１７４】
本発明の一態様によれば、異種特異的ポリペプチド構築物の単一ドメイン抗体の標的は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を対象とする。ＴＮＦαは、様々な疾患、たとえば、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患で重要な役割を果たすと考えられている。
【０１７５】
抗標的単一ドメイン抗体は、ＴＮＦα全体、それらの断片、またはその相同配列の断片を対象とすることができる。
【０１７６】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、前記異種特異的ポリペプチドの配列は配列番号５〜１８のどれかに対応する。その中の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体は、ＴＮＦαに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０１７７】
本発明の一実施形態は、炎症性疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。ＴＮＦαは、炎症過程に関与し、ＴＮＦαの作用を遮断することによって抗炎症作用を得ることができ、これは、たとえばクローン病など、ある種の疾患状態において非常に望ましい。こうした異種特異的ポリペプチド構築物の経口送達によって、そのような分子が大腸の罹患している部位に活性形で送達される。これらの部位は、重度の炎症状態にあり、ＴＮＦα産生細胞を含む。これらの異種特異的ポリペプチド構築物は、ＴＮＦαを局所的に無力化することができ、身体全体にわたって分配されるのを防ぎ、それによって負の副作用を制限する。ミクロコッカスラクティス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）などの遺伝子改変微生物は、抗体断片を分泌することができる。腸で抗体断片を局所的に産生し送達するために、そのような改変微生物をビヒクルとして使用することができる。ＴＮＦα無力化異種特異的ポリペプチド構築物を産生する株を使用することによって、炎症性腸疾患を治療できるはずである。
【０１７８】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０１７９】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０１８０】
本発明の別の態様は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含む、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０１８１】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１８２】
本発明の別の態様は、炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０１８３】
本発明の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体が、どんなクラスのＶＨＨからも得られることは本発明の態様である。たとえば、これらの抗体は、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい。
【０１８４】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記異種特異的ポリペプチドは、配列番号５〜１８のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。配列番号５〜１８には、抗ＴＮＦαラクダ科ＶＨＨ、および抗マウス血清アルブミンラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０１８５】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＴＮＦα単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、配列番号１〜４のどれか（抗血清蛋白質ラクダ科ＶＨＨ）、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０１８６】
驚くべきことに、配列番号５〜１８のどれかに対応する配列を含む異種特異的ポリペプチド構築物が、その標的に対して予想以上の親和性、および循環系で長期の半減期を示すことを本発明者らは見出している。
【０１８７】
血小板介在凝集は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）結合コラーゲンが、血小板および／または血小板受容体に接着し（両方の例はｇｐＩａ／ＩＩａ、ｇｐＩｂ、またはコラーゲン）、最終的に血小板を活性化させる過程である。血小板の活性化によって、フィブリノーゲン結合、および最終的に血小板の凝集がもたらされる。血小板介在凝集を撹乱できるかどうかに、以下に記載する疾患の治療を含む多くの適用例がかかっている。本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、凝固を有効に防止し、その半減期は制御可能なので、外科手順、たとえば、限られた時間で血小板介在凝集を阻害する必要がある手順にこれらの構築物を使用することができる。
【０１８８】
ＶＨＨなどの一価の単一ドメイン抗体は、高ずり応力下で血小板凝集阻害を測定するための実験で、驚くほど高い血小板凝集阻害を示す。すなわち、血小板凝集の５０％阻害は４〜２５ｎＭの濃度で得られた。比較では、コラーゲンとの相互作用を阻害するｖＷＦ特異的抗体に由来するＦａｂ断片８２Ｄ６Ａ３は、約２０倍高い濃度で血小板凝集を５０％阻害する（Ｖａｎｈｏｏｒｅｌｂｅｋｅ Ｋ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，２７８：３７８１５‐３７８２１）。ＥＬＩＳＡでの一価ＶＨＨのＩＣ５０値が、８２Ｄ６Ａ３のＩｇＧのＩＣ５０値の２２５分の１までであることを考慮すると、これらの結果は予想外であった。
【０１８９】
これは、ＩｇＧ抗体が巨大分子との相互作用には適さないことを明瞭に示しており、この巨大分子は、血小板介在凝集に関与するものなど、凝集の開始または途中の分子である。ｖＷＦは、６０モノマーまでの多量体を作製する（最終多量体は大きさが２０００万ダルトンまで）。実際、Ａ３ドメインがすべて、８２Ｄ６Ａ３に利用できるわけではないことは既にわかっている（Ｄｏｎｇｍｅｉ ＷＵ，Ｂｌｏｏｄ，２００２，９９，３６２３‐３６２８）。さらに、大型の従来の抗体は、たとえば、損傷血管壁部位で血小板が介在した凝集中、組織の透過を制限するはずである。
【０１９０】
単一ドメイン抗体の構造は特に特有である。たとえば、ラクダ科抗体に由来するＶＨＨ分子は、既知の中では最小（約１５ｋＤａ、すなわち、従来のＩｇＧの大きさの１０分の１）の無傷抗原結合ドメインであり、したがって高密度組織への送達に、かつ血小板介在凝集過程に参加し、またはこれを開始させている巨大分子間の限られた空間への往行に非常に適している。
【０１９１】
本発明者らの知る限り、実験によって、そのような大きい巨大分子間の相互作用の阻害には、大型の無傷抗体よりも小型のＶＨＨが有利であることが示されたのは初めてである。
【０１９２】
ナノ体は小型であり、したがって透過に有利であるにもかかわらず、そのような小分子が、（６０モノマーまでの）ｖＷＦやコラーゲンなどの大きいポリマー間の相互作用をそのような高効率で阻害できることは依然として驚くべきことである。ｖＷＦの大きい多量体形しか止血活性を持たないことは記載されている（Ｆｕｒｌａｎ，Ｍ，．１９９６，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７２：３４１‐３４８）。多量体ｖＷＦのコラーゲンへの結合は、単量体ｖＷＦ断片の結合の１００倍の親和性で生じる。
【０１９３】
高ずり応力実験の結果によって、患者への投与には低用量にする必要があることが示唆される。したがって、（免疫原性や出血問題など）副作用は少ないと予想される。
【０１９４】
血小板介在凝集、たとえば、ｖＷＦ‐コラーゲン結合、ｖＷＦ‐血小板受容体接着、コラーゲン‐血小板受容体接着、血小板の活性化、フィブリノーゲン結合、および／または血小板凝集などを含む過程を調節する異種特異的ポリペプチド構築物を提供することは本発明の態様である。前記異種特異的ポリペプチド構築物は、ｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲンを対象とする単一ドメイン抗体に由来する。
【０１９５】
抗標的単一ドメイン抗体は、ｖＷＦ全体、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲン、またはそれらの断片、あるいはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０１９６】
本発明の一態様によれば、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物が対象とする標的は、フォンウィルブランド因子（ｖＷＦ）である。本発明の別の態様によれば、標的は、ｖＷＦのＡ１またはＡ３ドメインである。本発明の別の態様によれば、標的はｇｐＩｂである。本発明の別の態様によれば、標的はｇｐＩａ／ＩＩＡである。本発明の別の態様によれば、標的はコラーゲンである。
【０１９７】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質ＶＨＨに融合された、１個または複数の抗ｖＷＦ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、前記異種特異的ポリペプチドの配列は配列番号１９〜２１のどれかに対応する。その中の抗ｖＷＦ単一ドメイン抗体は、ｖＷＦに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０１９８】
本発明の一実施形態は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体標的に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲンのどれかである。前記疾患には、一時的脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄が含まれる。前記状態には、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じた状態が含まれる。
【０１９９】
本発明の一態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかであり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２００】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体標的に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかであり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２０１】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法であって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体標的に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含み、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかであり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２０２】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかである。
【０２０３】
本発明の別の態様は、血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、またはコラーゲンのどれかである。
【０２０４】
本発明の抗ｖＷＦ、抗ｖＷＦ Ａ１もしくは抗ｖＷＦ Ａ３、または抗コラーゲンＶＨＨ類が、どんなクラスのＶＨＨからも得ることができることは本発明の態様である。たとえば、これらは、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨ、ドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい。
【０２０５】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗ｖＷＦ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記異種特異的ポリペプチドは、配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。配列番号１９〜２１には、抗ｖＷＦ ＶＨＨおよび抗マウス血清アルブミンＶＨＨが含まれる。
【０２０６】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、標的はｖＷＦ、ｖＷＦのＡ１もしくはＡ３ドメイン、ｇｐＩｂ、またはコラーゲンのどれかであり、かつその場合、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、配列番号１〜４のどれか、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０２０７】
対象は、生存中、無害な寄生虫（たとえば、ヤケヒョウヒダニ、イエダニ）または物質（凝集塊、プラスチック、金属）に対してアレルギー応答を引き起こす可能性がある。これにより免疫応答カスケードを開始するＩｇＥ分子が誘導される。本発明の一態様は、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、ＩｇＥと肥満細胞および好塩基球上のその受容体との相互作用を防止する。そのようなものとして、これらの構築物は、免疫学カスケードの開始であるアレルギー反応を防止する。
【０２０８】
本発明の一態様によれば、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物が対象とする標的はＩｇＥである。前記抗体は、ＩｇＥ全体、またはそれらの断片、あるいはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０２０９】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、その場合、前記異種特異的ポリペプチドの配列は、配列番号２２〜２４のどれかに対応する。その中の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体は、ＩｇＥに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０２１０】
抗標的単一ドメイン抗体は、ＩｇＥα全体、またはそれらの断片、あるいはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０２１１】
本発明の一実施形態は、アレルギーに関連付けられる疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。前記疾患には、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、食事性アレルギーなど、広範なＩｇＥ介在疾患が含まれる。
【０２１２】
本発明の一態様は、アレルギーに関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記ＶＨＨは、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２１３】
本発明の別の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２１４】
本発明の別の態様は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含む、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０２１５】
本発明の別の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤の調製に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０２１６】
本発明の別の態様は、アレルギーに関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０２１７】
本発明の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体が、どんなクラスのＶＨＨからも得ることができることは本発明の態様である。たとえば、これらは、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。前記ＶＨＨは、ラクダ科から得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨ、ドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい。
【０２１８】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、異種特異的ポリペプチドが、配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。配列番号２２〜２４には、抗ＩｇＥラクダ科ＶＨＨおよび抗マウス血清アルブミンラクダ科ＶＨＨが含まれる。
【０２１９】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩｇＥ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体は、配列番号１〜４のどれか（抗蛋白質血清ラクダ科ＶＨＨ）、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０２２０】
本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物は、一般的なまたは異常なアレルゲンによるアレルギー応答を予防し、すなわち、低減しまたは防止する。さらに、構築物の血中での存在期間が長いので治療空白が延長される。
【０２２１】
インターフェロンγ（ＩＦＮγ）は、様々な疾患、たとえば、リューマチ性関節炎、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症、眼の過免疫反応などの炎症性疾患において重要な役割を果たすと考えられている。ＩＦＮγが、自己免疫疾患の病理において重要な役割を果たすことも分かってきた。たとえば、ＩＦＮγの存在は、リューマチ性関節炎に関与してきた（Ｂｒｅｎｎａｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｒｈｅｕｍ．、３１、２９３‐８（１９９２））。これらのサイトカインの作用に抗するためのいくつかの戦略が開発されており、現在、様々な病態の治療に使用されている。
【０２２２】
ＩＦＮγは、その生理活性形が二量体であり、２個のサブユニットによって形成された溝は、ＩＦＮγ受容体との相互作用によってその生体活性に重要である。ＩＦＮγに対して十分な特異性および選択性を有するＩＦＮγ阻害剤は、炎症性疾患を予防しまたは治療するための効果的な予防用または治療用薬剤化合物であり得る。ＩＦＮγに関連付けられる疾患には、多発性硬化症、リューマチ性関節炎、強直性脊椎炎、若年性リューマチ性関節炎、乾癬性関節炎（ＵＳ６，３３３，０３２号、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ Ｃｏｎｃｅｐｔｓ，Ｉｎｃ．）が含まれる。他の疾患には、クローン病や乾癬（ＵＳ６，３２９，５１１号、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌａｂｓ）が含まれる。さらに他の疾患は、腸疾患、潰瘍性大腸炎、およびクローン病である（ＥＰ０６９５１８９号、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）。
【０２２３】
現在入手可能な薬物はどれも、自己免疫疾患の治療には完全に有効ではなく、ほとんどは深刻な毒性によって制限されている。さらに、そのような標的配列に対して十分な作用強度および選択性を備えた新規な化学物質（ＮＣＥ）を開発することは、極めて困難であり工程も冗長である。他方で、抗体を基にした治療薬は、薬物として顕著な潜在能力を有している。というのは、こうした薬物は、その標的に対して極めて優れた特異性を有し固有の毒性も低い。さらに、新規な化学物質（ＮＣＥ）の開発と比較した場合、開発時間を相当に減少させることができる。しかし、従来の抗体は、多量体蛋白質に対して生じさせることが困難である。それらの蛋白質では、ＩＦＮγの場合のように、リガンドの受容体結合ドメインが溝に包埋されている。
【０２２４】
抗標的単一ドメイン抗体がＴＮＦαを対象とする本発明の異種特異的ポリペプチド構築物は、安定性、大きさ、確実な発現などのその特性を原因とする、従来技術のペプチド治療薬を使用して経験する問題を克服する。さらに、本発明者らは、多量体ＩＦＮγ中に溝が存在するにもかかわらず、異種特異的ポリペプチド構築物が依然としてＩＦＮＡγに強力に結合できることを見出している。
【０２２５】
本発明の一態様によれば、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体が対象とする標的は、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）である。ＩＦＮγは、いくつかのＴ細胞によって分泌される。その抗ウイルス活性の他に、ＩＦＮγは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびヘルパーＴ１（Ｔｈ１）細胞を刺激し、マクロファージを活性化し、細胞表面のＭＨＣ分子の発現を刺激する。したがって、一般に、ＩＦＮγは、免疫機能の多くの特徴を強化するために働き、免疫系が過敏である疾患、たとえば、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患を治療するための候補である。
【０２２６】
本発明の一態様は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に関し、前記異種特異的ポリペプチドの配列は、配列番号２５〜２７のどれかに対応する。その中の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体は、ＩＦＮγに結合するラクダ科重鎖抗体（ＶＨＨ）に由来する。
【０２２７】
抗標的単一ドメイン抗体は、ＩＦＮγ全体、それらの断片、またはそれらの相同配列の断片を対象とすることができる。
【０２２８】
本発明の一実施形態は、上記した免疫系が過敏である疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。現在の治療は、抗ＩＦＮγ抗体の静脈内投与からなる。これらの異種特異的ポリペプチド構築物の経口送達によって、そのような分子は大腸の罹患している部位に活性形で送達される。これらの部位は、重度の炎症状態にあり、ＩＦＮγ産生細胞を含む。こうした異種特異的ポリペプチド構築物は、ＩＦＮγを局所的に無力化することができ、身体全体にわたって分配されるのを防ぎ、それによって負の副作用を制限する。ミクロコッカスラクティスなどの遺伝子改変微生物は、抗体断片を分泌することができる。腸における抗体断片の局所的な産生および送達のために、そのような改変微生物をビヒクルとして使用することができる。ＩＦＮγ無力化異種特異的ポリペプチド構築物を産生する株を使用することによって、炎症性腸疾患を治療できるはずである。
【０２２９】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２３０】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用であり、その場合、前記異種特異的ポリペプチド構築物は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって投与される。
【０２３１】
本発明の別の態様は、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸的に、または吸入によって、対象に１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物を投与するステップを含む、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和する方法である。
【０２３２】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤の調製に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に結合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物である。
【０２３３】
本発明の別の態様は、免疫系が過敏である疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤の調製に使用するための、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物の使用である。
【０２３４】
本発明の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体が、どんなクラスのＶＨＨからも得ることができることはは本発明の態様である。たとえば、これらの抗体は、ヒトＶＨ配列に対して高い相同性を有するＶＨＨクラスから得ることができ、またはＶＨＨの主なクラスを含む他のＶＨＨクラスのどれからも得ることができる。これらのＶＨＨには、完全長ラクダ科ＶＨＨ、ドメインが含まれ、エフェクタ機能が必要とされる場合には、ヒトＦｃドメインを含めてよい．
【０２３５】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体に融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ ＶＨＨを含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記異種特異的ポリペプチドは、配列番号２５〜２７のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応する。配列番号２５〜２７には、抗ＩＦＮγ ＶＨＨおよび抗マウス血清アルブミンＶＨＨが含まれる。
【０２３６】
上記の態様および実施形態は、１個または複数の抗血清蛋白質ＶＨＨに融合された、１個または複数の抗ＩＦＮγ単一ドメイン抗体を含む異種特異的ポリペプチド構築物に適用され、その場合、前記抗血清蛋白質ＶＨＨは、配列番号１〜４のどれか、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応する。
【０２３７】
本発明の一実施形態は、本発明による異種特異的ポリペプチド構築物をコードする核酸を含む組換えクローンである。本発明の一態様では、前記核酸は、それぞれが治療用または診断用標的抗原を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体、および血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体をコードし、前記単一ドメイン抗体類はリンカーの介在なしに、または１個または複数のペプチドリンカー配列によって結合する。本発明の一態様によれば、リンカー配列は、当該技術分野で知られている任意の適当なリンカー配列である。本発明の別の態様によれば、リンカー配列は自然に存在する配列である。リンカー配列の特性は、これらが免疫原性ではない、または著しく免疫原性ではないこと、異種特異的ポリペプチド構築物に十分な融通性を提供できること、および蛋白質分解に耐性であることが好ましい。本発明によるリンカーの一例は、ＰＣＴ／ＥＰ９６／０１７２５号に開示されているものであり、このリンカーはＶＨＨのヒンジドメインに由来する。
【０２３８】
本発明の別の態様によれば、クローンは、配列番号１〜４のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、または機能部分の相同配列に対応するポリペプチドをコードする核酸、ならびに１個または複数の抗標的単一ドメイン抗体、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列をコードする核酸を含む。
【０２３９】
本発明の別の態様によれば、クローンは、配列番号５〜２７のどれかによって表される配列、その相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列に対応するポリペプチドをコードすることができる核酸を含む。
【０２４０】
多数の抗標的および／または多数の抗血清ＶＨＨをコードする核酸が本発明中のクローンに存在することは、本発明の範囲内に属する。
【０２４１】
本発明の異種特異的ポリペプチド構築物をコードするクローンに適した宿主を形質転換することによって、治療で使用するための異種特異的ポリペプチド構築物を十分な量で産生することができる。その中で前記クローンを形質転換できる生物の例には、それだけには限らないが、大腸菌やサッカロミセスセレビシエが含まれる。
【０２４２】
本発明の別の実施形態は、抗標的ＶＨＨに１個または複数の抗血清アルブミン単一ドメイン抗体を結合するステップを含む、抗標的ＶＨＨの半減期を延長するための方法である。既に上記したように、結合方法は、当該技術分野で知られており、またはどんな未来の方法でよく、たとえば、化学的カップリングによって、またはＤＮＡレベルでこれらのＶＨＨを融合することができる。
【０２４３】
本明細書に記載した１個または複数の疾患症状の治療、予防、および／または緩和は、一般に、対象に異種特異的ポリペプチド構築物の「治療有効量」を投与するステップを含む。「治療有効量」、「治療上有効な用量」、および「有効量」は、所望の結果を得るのに必要な量を意味する。当該技術分野の通常の技術者は、作用強度すなわち「有効量」が、本発明で使用される、疾患経路を阻害する様々な化合物によって変化し得ることを理解するものとする。当業者ならば、化合物の作用強度を容易に評価することができる。
【０２４４】
本明細書では、用語「化合物」は、本明細書で開示した異種特異的ポリペプチド構築物、配列番号５〜２７によって表されるポリペプチド、その相同配列、その相同物、または該ポリペプチドをコードすることができる核酸をさす。
【０２４５】
「薬剤として許容される」は、生物学的にせよ、そうでないにせよ望ましくないことはない物質を意味し、すなわち、この物質はどんな望ましくない生物学的影響を引き起こすことも、またはそれが含まれている薬剤組成物の他の成分のどれとも有害な方式で相互作用することもなく、その化合物と共に個体に投与することができる。
【０２４６】
本明細書で開示した発明は、対象で本明細書に記載した疾患（たとえば、アレルギーおよび／または炎症）に関連付けられる状態の治療または予防に有用であり、疾患経路に関与する成分（たとえば、血中のＩｇＥおよび／またはＴＮＦα）に結合する化合物または組成物の薬剤有効量を投与することを含み、それによって疾患経路および疾患を阻害する。
【０２４７】
本発明の一態様は、対象で本明細書に記載した疾患（たとえば、アレルギーおよび／または炎症）に関連付けられる状態を治療しまたは予防するための本発明の化合物の使用であり、たとえばアスピリンなどの別の化合物と組み合せて、化合物の薬剤有効量を投与することを含む。
【０２４８】
本発明は、本発明の単一化合物を含む製剤の投与だけには限らない。１種を超える本発明の化合物を含む製剤をそれを必要とする患者に投与する併用治療を提供することは本発明の範囲内に属する。
【０２４９】
本明細書に記載の標準的試験を使用し、または他の同様の試験を使用し、疾患経路の阻害を定量する方法は当該技術分野で周知である。好ましくは、方法は、疾患の指標で少なくとも１０％の減少をもたらすはずであり、たとえば、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％，６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはこれらの間のどんな量も含み、９０％の減少がより好ましい。たとえば、本発明のペプチドによるＩｇＥの阻害によってアレルギー経路を阻害することは、食物特異的ＩｇＥ濃度を１０％減少させるであろう。
【０２５０】
本発明で有用な化合物は、薬剤組成物として製剤し、ヒト患者や任意の動物などの哺乳動物宿主に、選択した投与経路、すなわち、経口もしくは非経口、吸入による経鼻、経静脈、経筋肉内、経局所、または経皮下的投与に適合するようになされた様々な形態で投与することができる。
【０２５１】
本発明の化合物は、遺伝子治療送達法を使用し投与することもできる。たとえば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい。その全体を参照により本明細書に組み込む。遺伝子治療送達法を使用して、本発明の化合物用の遺伝子を形質移入した１次細胞に、さらに、標的特異的な臓器、組織、移植片、腫瘍、または細胞に対する組織特異的プロモータを形質移入することができる。
【０２５２】
したがって、本発明の化合物は、全身的に、たとえば、不活性希釈剤や吸収性食用可能な担体など、薬剤として許容されるビヒクルと組み合わせて経口的に投与することができる。これらの化合物は、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに封入し、打錠し、または患者食の食物に直接組み込むことができる。経口治療投与には、活性化合物を１種または複数の賦形剤と組み合わせ、摂取可能な錠剤、頬腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェーハなどの形で使用することができる。そのような組成物や調製物には、活性化合物を少なくとも０．１％含めるべきである。もちろん、組成物および調製物の割合は、変化してよく、好都合に所与の単位投与形重量の約２〜約６０％にすることができる。そのような治療上使用可能な組成物の活性化合物量は、有効な用量レベルが得られるような量である。
【０２５３】
錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などには以下：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ、ゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびショ糖、果糖、乳糖、またはアスパルテームなどの甘味剤；ペパーミント、冬緑樹油、サクランボ香味料などの矯味剤を加えることができる。単位投与形をカプセル剤にする場合は、上の種類の物質の他に、これに植物油やポリエチレングリコールなどの液体担体を含めてもよい。コーティングとして、そうでない場合は、固体単位投与形の物理的形状を改変するための様々な他の物質を含めてよい。たとえば、錠剤、丸剤、カプセル剤は、ゼラチン、ワックス、セラック、糖などによってコートすることができる。シロップまたはエリキシルには、活性化合物、甘味剤としてショ糖や果糖、保存料としてメチルやプロピルパラベン、着色料、およびサクランボ味やオレンジ味などの香味料を含めてもよい。もちろん、どんな単位投与形の調製に使用されるどんな物質も薬剤として許容され、使用量で実質上無毒であるべきである。さらに、活性化合物は、持続放出調製物やデバイスに組み込むこともできる。
【０２５４】
活性化合物は、注入または注射によって静脈内または腹腔内に投与することもできる。活性化合物またはその塩の溶液は、水で、場合によっては無害の界面活性剤と混合した水で調製することができる。分散剤もグリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン、それらの混合物、および油類で調製することができる。通常の保存および使用条件下では、これらの調製物には、微生物の繁殖を防止するための保存料が含まれる。
【０２５５】
注射または注入に適当な薬剤投与形には、滅菌水溶液、分散剤、あるいは必要に応じて滅菌注射溶液もしくは注入溶液または分散剤を調合するようになされ、場合によってはリポソームに封入されている活性成分を含む滅菌粉を含めてもよい。すべての場合に、最良の剤形は、滅菌液体であり製造および保存条件下で安定していなければならない。液体担体またはビヒクルは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（ｐｏｌｙｏｌ）（たとえば、グリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、液体ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌｓ）など）、植物油、無毒グリセリルエステル（ｇｌｙｃｅｒｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）、それらの適当な混合物を含む溶媒または液体分散媒体であってよい。適切な流動性は、たとえば、リポソームの形成よって、分散剤の場合には必要な粒径を維持することによって、または界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎｓ）、クロロブタノール（ｃｈｌｏｒｏｂｕｔａｎｏｌ）、フェノール（ｐｈｅｎｏｌ）、ソルビン酸（ｓｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ）、チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓａｌ）などによって防止する。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖類、緩衝液、塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。組成物に吸収遅延剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）やゼラチンを使用することによって注射組成物を長時間にわたって吸収させることができる。
【０２５６】
滅菌注射溶液は、必要とされる先に列挙した他の成分のいくつかを含む適切な溶媒に必要量の活性化合物を組み込み、続いてろ過滅菌することによって調製する。滅菌注射溶液調製用の滅菌粉の場合には、好ましい調製方法は真空乾燥技術および凍結乾燥技術であり、これらの技術によって活性成分に予め滅菌ろ過した溶液中に存在する任意の追加の所望成分を加えた粉がもたらされる。
【０２５７】
局所投与には、すなわち、化合物が液体のときは、本発明の化合物を純粋形で適用することができる。しかし、一般に、化合物は、皮膚に許容される担体と組み合わせて、皮膚に組成物または製剤として投与されることが望ましく、この化合物は固体または液体であってよい。
【０２５８】
使用可能な固体担体には、タルク、クレイ、微結晶セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化固体が含まれる。使用可能な液体担体には、水、ヒドロキシアルキル、グリコール、または水‐アルコール／グリコールブレンドが含まれ、その場合、本発明の化合物は有効濃度で、場合によっては無毒の界面活性剤を用いて、溶解しまたは分散させることができる。香料や追加の抗菌剤などのアジュバントを加えて、所与の使用に向けた特性を最適化することができる。得られた液体組成物は、吸着パッドから塗布し、絆創膏および他の包帯剤を含浸するために使用し、またはポンプ型もしくはエアロゾルスプレーを使用し患部上に噴霧することができる。
【０２５９】
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪族アルコール、改変セルロース、改変ミネラル物質など、増粘剤を液体担体と共に使用して、使用者の皮膚に直接塗布するための塗布用ペースト、ゲル、軟膏、石鹸などを形成することもできる。
【０２６０】
皮膚に化合物を送達するために使用できる使用可能な外用組成物の例は、当該技術分野で公知であり、たとえば、Ｊａｃｑｕｅｔら（米国特許第４，６０８，３９２号）、Ｇｅｒｉａ（米国特許第４，９９２，４７８号）、Ｓｍｉｔｈら（米国特許第４，５５９，１５７号）、およびＷｏｒｔｚｍａｎ（米国特許第４，８２０，５０８号）を参照されたい。
【０２６１】
使用可能な化合物の用量は、そのｉｎ ｖｉｔｒｏ活性と動物モデルでのｉｎ ｖｉｖｏ活性を比較することによって定量することができる。マウス、およびヒトまでの他の動物の有効な用量の推定方法は当該技術分野で公知であり、たとえば、米国特許第４，９３８，９４９号を参照されたい。
【０２６２】
一般に、ローションなどの液体組成物中の化合物の濃度は、約０．１〜２５ｗｔ％であり、約０．５〜１０ｗｔ％が好ましい。ゲルなどの半固体もしくは固体組成物または粉での濃度は約０．１〜５ｗｔ％であり、約０．５〜２．５ｗｔ％が好ましい。
【０２６３】
治療での使用に必要な本化合物、活性塩、またはその誘導体の量は、選択した特定の塩のみならず、投与経路、治療対象の状態の性質、年齢、および患者の状態によっても変化し、最終的に担当する内科医または臨床医の裁量に任せられる。化合物の用量も標的とする細胞、腫瘍、組織、移植片、または臓器に応じて変わる。
【０２６４】
所望用量は、単一用量で、あるいは適切な間隔、たとえば、１日当たり２回、３回、４回以上の副用量で投与する分割用量として好都合に提供することができる。副用量自体、たとえば、散布器からの多数の吸入または複数の点眼の適用など、さらに大まかに間隔を空けて分けた数回の投与に分割することができる。
【０２６５】
治療計画には、長期の毎日治療を含めてもよい。「長期」は、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヵ月、または数年の持続時間を意味する。この用量範囲で必要な変更は、本明細書に教示した定型の実験のみを使用して当業者が決定することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｒｔｉｎ，Ｅ．Ｗ．編第４版）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，米国ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎを参照されたい。どんな合併症の場合にも、内科医個人も用量を調整することができる。
【実施例１】
【０２６６】
ラマの免疫化
１頭のラマをヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）で免疫化した。免疫化スキームを表１に要約する。
【０２６７】
実施例１による免疫化スキーム
【表１】
【実施例２】
【０２６８】
レパートリークローニング
末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を密度勾配遠心分離（Ｆｉｃｏｌｌ‐Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ、アマシャムバイオサイエンス社）によって単離した。ＰＢＬを使用して全ＲＮＡを抽出した（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ、１９８７年）。オリゴｄ（Ｔ）オリゴヌクレオチドを使用し、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）により１００μｇの全ＲＮＡでｃＤＮＡを調製した。フェノール／クロロホルム抽出後、エタノール沈殿によってｃＤＮＡを精製し、続いて鋳型として使用してＶＨＨレパートリーを増幅した。
【０２６９】
第１のＰＣＲでは、従来抗体（１．６ｋｂ）および重鎖（１．３ｋｂ）抗体遺伝子セグメントのレパートリーをリーダー特異的プライマー（５'‐ＧＧＣＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴ ３'）およびオリゴｄ（Ｔ）プライマー（５'‐ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ‐３'）を使用し増幅した。得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、アガロースゲルから重鎖抗体セグメントをコードする１．３ｋｂの断片を精製した。ＦＲ１逆進プライマーおよび同じオリゴｄ（Ｔ）前進プライマーの混合物を使用し第２のＰＣＲを実施した。（ＦＲ１プライマーに導入した）ＳｆｉＩおよび（ＦＲ４に自然に存在する）ＢｓｔＥＩＩでＰＣＲ産生物を消化した。ゲル電気泳動後、約４００塩基対のＤＮＡ断片をゲルから精製し、ファージミドｐＡＸ００４の対応する制限部位連結して、大腸菌ＴＧ１の電気穿孔後にクローン化ＶＨＨのライブラリを得た。ライブラリの大きさは１．４×１０７ｃｆｕであり、クローンにはすべて、正確な大きさの挿入物が含まれていた。
【実施例３】
【０２７０】
ライブラリのレスキュー（RESCUE)、ファージ調製
ライブラリは、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで、２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌの２×ＴＹ培地で３７℃で増殖させた。Ｍ１３ＫＯ７ファージ（１０１２）を加え、混合物を３７℃で１回目は振盪せずに、次いで１００ｒｐｍで振盪しながら２×３０分間培養した。室温で４５００ｒｐｍで１０分間細胞を遠心分離した。細菌のペレットを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む５０ｍｌの２×ＴＹ培地中に再懸濁し、２５０ｒｐｍで勢いよく振盪しながら終夜３７℃で培養した。終夜培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。ファージをＰＥＧ沈殿（２０％ポリ‐エチレン‐グリコールおよび１．５ＭのＮａＣｌ）し、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットをＰＢＳ２０ｍｌ中に再懸濁した。ファージを再度ＰＥＧ沈殿させ、４℃、２０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。ペレットを１％カゼインのＰＢＳ溶液５ｍｌに溶解した。ＯＤ６００ｎｍ＝０．５のＴＧ１細胞に感染させることによってファージを滴定し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％ブドウ糖を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。形質転換体数は、ファージ数（＝ｐｆｕ）を示す。１５％グリセロールを用いて−８０℃でファージを貯蔵した。
【実施例４】
【０２７１】
ファージＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を１％カゼインのＰＢＳ溶液または５μｇ／ｍｌのＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）で終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、１％カゼインのＰＢＳ溶液２００μｌにより室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ファージを上記のように調製し、ウェルに２倍段階希釈で入れた。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ＰＢＳで１／２０００希釈したホースラディシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させたマウスモノクローナル抗体の抗Ｍ１３と結合したファージを検出した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２によって染色を行い、３０分後にシグナルを４０５ｎｍで測定した。結果を図１に示し、ライブラリ中にＨＳＡ特異的ナノ体が存在することを示している。
【実施例５】
【０２７２】
選択：第１回目および第２回目のバイオパニング
マイクロタイタープレートのウェルを１０μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）または１％カゼイン含有ＰＢＳでコートした。４℃で終夜培養後、ウェルを１％カゼイン含有ＰＢＳにより室温で３時間ブロックした。２００μｌのファージをウェルに加えた。室温で２時間培養後、ウェルをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎ１０回およびＰＢＳで１０回洗浄した。結合したファージを１００μｌの０．２Ｍのグリシン緩衝液ｐＨ＝２．４で溶出させた。室温で２０分間溶出を行った。溶出したファージを指数関数的に増殖している大腸菌ＴＧ１細胞に放置して感染させ、次いで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％ブドウ糖を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。第２回目も上記と同じ条件で実施した。結果を表２に要約する。
【０２７３】
実施例５に記載した、マウス血清アルブミンでの１回および２回のパニングした後の結果
【表２】
【実施例６】
【０２７４】
バイオパニング後の個々のクローンのスクリーニング
ＥＬＩＳＡ：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）への結合
単一コロニーを使用して２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢで終夜培養を開始した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地でこの終夜培養物を１００倍に希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで３７℃で培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３７℃でさらに３時間または２８℃で終夜培養した。培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを終夜または−２０℃で１時間凍結した。次に、ペレットを室温で４０分間解凍し、ＰＢＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。周辺質画分を４℃、２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。ＶＨＨを含む上清をさらに分析するために使用した。
【０２７５】
マイクロタイタープレートを終夜４℃で５μｇ／ｍｌのＨＳＡ、５μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）、または１％カゼインのＰＢＳ溶液でコートした。１％カゼインのＰＢＳ溶液３００μｌにより室温で２時間プレートをブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。第１目および第２回目の選択の後、２３個の個々のクローン用に周辺質画分を調製し、マイクロタイタープレートのウェルに放置して結合させた。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、その後、マウス抗ヒスチジンモノクローナル抗体Ｓｅｒｏｔｅｃ ＭＣＡ１３９６（１／１０００希釈）を含むＰＢＳにより室温で１時間培養し、続いて抗マウス‐アルカリホスファターゼ共役１／２０００を含むＰＢＳにより同様に室温で１時間培養することによってナノ体の結合を検出した。基質ＰＮＰＰ（ｐ‐ニトロフェニルリン酸２ｍｇ／ｍｌを含む１Ｍのジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇ２ＳＯ４、ｐＨ９．８）によって染色を行い、３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。結果を表３に要約する。
【０２７６】
１回および２回の選別後、クローンを選択し周辺質抽出物を調製した。実施例６に記載した、これらのクローンのヒトおよびマウスアルブミンへの結合をＥＬＩＳＡで分析した。
【表３】
【実施例７】
【０２７７】
ＨｉｎｆＩパターンおよび配列決定
第２回目のパニング後、ベクターの配列に結合している１組のプライマーを用いて陽性クローンでＰＣＲを実施した。ＰＣＲ産生物を制限酵素ＨｉｎｆＩで消化し、アガロースゲル上に載せた。さらに評価するために異なるＨｉｎｆＩ‐パターンによって４個のクローンを選択した。これらのクローンを配列決定した。結果を表４に要約する（配列番号１、２、３、および４）。
【実施例８】
【０２７８】
異なる種のアルブミンによる交差反応試験
異なる種（ヒヒ、ブタ、ハムスター、ヒト、ラット、マウス、およびウサギ）から得た血漿（１／１０希釈）についてＳＤＳ‐ＰＡＧＥを実施し、ニトロセルロース膜上にブロットした。実施例３に記載したように、クローンＭＳＡ２１、ＭＳＡ２４、ＭＳＡ２１０、ＭＳＡ２１２、および対照ナノ体用にファージを調製した。ニトロセルロースにブロットした血清アルブミンにファージを放置して結合させ、未結合ファージを洗い流した。ＨＲＰに結合させた抗Ｍ１３ポリクローナル抗体によって結合を検出した。検出にＤＡＰを基質として使用した。結果を図２に示す。
【０２７９】
これらの結果から、本発明者らは、４個全ての結合剤は、ブタ、ヒト、マウス（ＭＳＡ２１２では低）、およびハムスターの血清アルブミン間で交差反応すると推断することができる。ＭＳＡ２１は、ウサギ血清アルブミンとも交差反応する。不適切なナノ体によっては、結合は観察されなかった（図示せず）。
【０２８０】
対照実験として、ＰＢＳで１／１００希釈した異なる血漿試料でＳＤＳ‐ＰＡＧＥを実施した。ゲルは、クーマシーで染色した。図３から、本発明者らは、全血漿試料のアルブミン濃度は、アルブミン濃度が低いウサギ血漿を除いて高いと推断することができる。
【実施例９】
【０２８１】
発現および精製
結合剤用にプラスミドを調製し、ＷＫ６電気適応性細胞に形質転換した。単一コロニーを使用して、２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ中で終夜培養を開始した。この終夜培養物を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地３００ｍｌで１００倍に希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで３７℃で培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３７℃でさらに３時間または２８℃で終夜培養した。培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを終夜または−２０℃で１時間凍結した。次に、ペレットを室温で４０分間解凍し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。周辺質画分を４℃、２０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。ナノ体を含む上清をＮｉ‐ＮＴＡ上に載せ精製して均質にした。
【実施例１０】
【０２８２】
精製ナノ体のＭＳＡによるＥＬＩＳＡ
マイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのＭＳＡによって終夜４℃でコートした。洗浄後、１％カゼインのＰＢＳ溶液によって室温で２時間プレートをブロックした。試料を２組、濃度２５００ｎＭ、１／３希釈で出発して適用し、室温で２時間放置して結合させた。ポリクローナルウサギ抗ナノ体血清を１／１０００（Ｋ２０８）で室温で１時間加えた。実施例６に記載したように、検出を抗ウサギアルカリホスファターゼ共役体を用いて１／１０００で行い、染色をＰＮＰＰで行った。結果を図４に示す。
【実施例１１】
【０２８３】
二重特異性構築物の構築
大腸菌産生ベクターｐＡＸ１１を構築して、二価または二重特異性ＶＨＨの２段階クローニングを可能にした（図５）。
【０２８４】
カルボキシ末端ＶＨＨを最初にＰｓｔＩおよびＢｓｔＥＩＩでクローン化する一方で、第２段階では他のＶＨＨをＳｆｉＩおよびＮｏｔＩによって挿入した。これらは第１の遺伝子断片内を切断しない。この手順によって増幅による新規な部位の実施、それによるＰＣＲ間違いの導入の危険性が回避される。ラマの中位のヒンジをナノ体間のリンカーとして使用した。ヒトＴＮＦαに対するＶＨＨをＭＳＡ特異的ナノ体のＣＯＯＨ末端でクローン化した。配列を表４に要約する（配列番号５、６、７、および８）。プラスミドを調製し、ＷＫ６電気適応性細胞に形質転換した。単一コロニーを使用して、２％ブドウ糖および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢで終夜培養を開始した。この終夜培養物を１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＴＢ培地３００μｌで１００倍希釈し、ＯＤ６００ｎｍ＝０．５になるまで３７℃で培養した。１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３７℃でさらに３時間培養した。
【０２８５】
培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを−２０℃で終夜凍結した。翌朝、ペレットを低温室で４０分間解凍し、２０ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷上で１時間振盪した。周辺質画分を４℃、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することによって単離した。上清をＮｉ‐ＮＴＡ上に載せ、精製して均質にした。配列を表４に示す（配列番号５、６、７、および８）。ゲルろ過上のいくらかの分解生成物（５％）を除去するために、追加の精製ステップが必要であった。
【０２８６】
ヒトＴＮＦα（ＭＰ７１２ｂ）に対する別の二重特異性ＶＨＨを表４に示す（配列番号１５、１６、１７、および１８）。
【実施例１２】
【０２８７】
サンドウィッチＥＬＩＳＡでの二重特異性構築物の試験
マイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのＭＳＡで終夜４℃でコートした。プレートを１％カゼインのＰＢＳ溶液３００μｌにより室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。ＭＳＡ２１、ＭＳＡ２４、ＭＳＡ２１０、およびＭＳＡ２１２に対して、二重特異性構築物用に精製した蛋白質を、それぞれ、濃度０．４、０．５、２．５、および２．５μｇ／ｍｌで放置してマイクロタイタープレートのウェルに結合させた。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、ビオチン化ＴＮＦを濃度１０μｇ／ｍｌ加え、３倍に希釈し、室温で２時間放置して結合させた。マウス・エクストラアビジン・アルカリ・ホスファターゼ共役（Ｓｉｇｍａ）１／２０００を含むＰＢＳにより室温で１時間培養することによって結合を検出した。基質ＰＮＰＰ（ｐ‐ニトロフェニルリン酸２ｍｇ／ｍｌを含む１Ｍジエタノールアミン、１ｍＭのＭｇ２ＳＯ４、ｐＨ９．８）で染色を行い、３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。結果を図６に示し、二重特異性構築物が同時に両抗原に結合できることを示す。
【実施例１３】
【０２８８】
ＢＩＡＣＯＲＥでアルブミン結合剤の親和性を定量
ＥＤＣ‐ＮＨＳ共有結合カップリングを使用し、ＣＭ５ ＢＩＡｃｏｒｅチップ上にマウスアルブミンを固定化することによって、ＢＩＡＣＯＲＥでマウスアルブミンへの親和性を定量し、表５に要約する。結果は、アルブミンへの親和性が二重特異性構築物に保持されていることを示している。
【０２８９】
実施例１３に記載した、ＢＩＡＣＯＲＥにより測定したアルブミン結合剤に対する親和力（ｋｏｆｆ、ｋｏｎ、およびＫＤ）
【表５】
【実施例１４】
【０２９０】
血漿または血液でのＥＬＩＳＡの最適化
ＴＮＦα結合剤ＴＮＦ３Ｅのマウスでの半減期をＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３ＥおよびＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅを用いて比較するための薬物動態実験を開始した。したがって、試料が血液または血漿中にある場合、本発明者らのＥＬＩＳＡを最適化させて低い背景値を得なければならなかった。マイクロタイタープレートをニュートラアビジンでコートした。終夜４℃で培養後、プレートを洗浄し、１％カゼインのＰＢＳ溶液により室温で２時間ブロックした。１μｇ／ｍｌのビオチン化ＴＮＦαを室温で３０分間放置して結合させ、プレートを洗浄した。試料（一価のＶＨＨ＃３ＥおよびＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅ）を濃度１μｇ／ｍｌで出発に利用し、ＰＢＳ、１０％血漿、または１０％血液で希釈し、２時間放置して結合させた。プレートを洗浄後、ウサギ抗血清を１／２０００の希釈で加え、重鎖クラス（Ｋ２０８）を認識させ、または従来のクラス（ＵＲＬ４９）を認識させた。１時間培養後、プレートを洗浄し、抗ウサギアルカリホスファターゼ共役（Ｓｉｇｍａ）を１／１０００の希釈で加えた。室温で１時間培養後、プレートを洗浄し、基質で結合を検出した。結果を図７−１及び７−２に示す。結果は、ウサギ抗血清（Ｋ２０８およびＵＲＬ４９）での背景値は、試料を１０％血液または１０％血漿で希釈した場合、ＰＢＳと比較して非常に低いことを明瞭に示している。ＵＲＬ４９抗血清は、ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅ二重特異性ナノ体のみを認識し、一価のＶＨＨ＃３Ｅを認識せず、したがってこの抗血清はマウスに投与直後の本発明者らの二重特異性ナノ体の統合性の試験に使用することができる。
【実施例１５】
【０２９１】
大規模発現、ならびにマウスでの薬物動態研究に向けた７Ａ７６ＶＨＨ＃３Ｅ、ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅ、およびＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅの精製
一価ＴＮＦ３Ｅ、ならびに二重特異性ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３ＥまたはＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅ用に３リットル培養を開始し、実施例１１に記載したように精製した。エンドトキシンの除去に追加の精製ステップが必要であった。したがって、試料をポリミキシンカラム（ＢＩＯ‐ＲＡＤ）で精製した。試料の細菌エンドトキシン濃度をＬＡＬ検定（カブトガニ血球抽出物（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ）、Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ）で分析した。結果を表６に要約する。
【０２９２】
実施例１５に記載した、ポリミキシンでの精製後の一価および二重特異性ナノ体のＬＡＬ検定結果
【表６】
【実施例１６】
【０２９３】
マウスでの薬物動態
構築物ごとに９頭のマウス（ＣＢ５７／ＢＩ６）に１００μｇのナノ体を尾の静脈に投与した。様々な時点で血液（各時点につき３頭のマウス）を回収し血清を調製した。実施例１４に記載したように、一価または二重特異性ナノ体が存在するかどうか、試料をＥＬＩＳＡによって分析した。分子の統合性を確認するために二重特異性構築物についてＫ２０８をＵＲＬ４９とも比較した。結果を図８〜１１に示す。
【０２９４】
本発明者らは、一価のナノ体の半減期（４０〜４５分間）が、アルブミンＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３ＥおよびＭＳＡ２４／ＶＨＨ＃３Ｅに特異的な二重特異性ナノ体を作製することによって劇的に改善された（半減期２．５〜３日間）という結果から結論を得ることができる。ＵＲＬ４９でのＥＬＩＳＡに示すように、二重特異性ナノ体ＭＳＡ２１／ＶＨＨ＃３Ｅは、マウス中で１９日を経ても無傷のままである（図１１）。
【実施例１７】
【０２９５】
ナノ体の半減期をさらに延長
ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３ＥおよびＭＳＡ２４／ＴＮＦ３Ｅの半減期をさらに延長するために、三価のナノ体を二価ＭＳＡ２１‐ＭＳＡ２１構築物を標的特異的ナノ体ＴＮＦ３Ｅに融合することによって調製した。得られたＭＳＡ２１／ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３Ｅ（表７、および配列番号９）を実施例１６の方法によってｉｎ ｖｉｖｏで試験した。
【実施例１８】
【０２９６】
ラマ００２の免疫化
１頭のラマをｖＷＦで免疫化した。表７に免疫化スキームを要約する。
【０２９７】
実施例１７による、ラマ００２に使用した免疫化スキーム
【表７】
【実施例１９】
【０２９８】
レパートリークローニングおよびファージの調製
実施例２に記載した通りにライブラリを調製した。ライブラリの大きさは、１．４×１０７ｃｆｕであり、９０％を超えるクローンには正確な大きさの挿入物が含まれていた。実施例３に記載した通りにファージを調製した。
【実施例２０】
【０２９９】
コラーゲンとの相互作用を阻害するｖＷＦ用の結合剤の選択：第１回目および第２回目のパニング
マイクロタイタープレートのウェルを２μｇ／ｍｌのｖＷＦまたは１％カゼイン含有ＰＢＳでコートした。４℃で終夜培養後、ウェルを１％カゼイン含有ＰＢＳにより室温で３時間ブロックした。２００μｌのファージをウェルに加えた。室温で２時間培養後、ウェルをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで１０回およびＰＢＳで１０回洗浄した。ファージを１００μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＩＩ型１００μｌによって特異的に溶出させた。室温で終夜溶出を行った。溶出したファージを指数関数的に増殖しているＴＧ１細胞に放置して感染させ、次いで１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび２％ブドウ糖を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。上記した同じ条件下で、この実験を第２回目のパニングに向けて繰り返した。パニングの結果を表８および９に示す。
【０３００】
実施例１９に記載した、ＰＢＳ‐カゼインと比較する、ｖＷＦ上での１回および２回のパニングの後のプラーク形成単位（ｐｆｕ）。Ｐｆｕ ｖＷＦ（抗原）は、ｐｆｕカゼインによって分割（特異的結合）＝濃縮
【表８】
【０３０１】
実施例２０に記述した、１回目および２回目のパニング後の阻害剤数対試験クローン数
【表９】
【実施例２１】
【０３０２】
ｖＷＦ結合剤の機能特徴付け：ＶＨＨがｖＷＦのコラーゲンへの結合を阻害
マイクロタイタープレートを２５μｇ／ｍｌのコラーゲンＩＩＩ型のＰＢＳ溶液により終夜４℃でコートした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、１％カゼイン含有ＰＢＳにより室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。２μｇ／ｍｌのｖＷＦ１００μｌ（ｖＷＦは３７℃で１５分間予備培養する）を（実施例６に記載した）ＶＨＨ抗体含有周辺質抽出液２０μｌと混合し、マイクロタイタープレートのウェル中で室温で９０分間培養した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。抗ｖＷＦ‐ＨＲＰモノクローナル抗体（ＤＡＫＯ）をＰＢＳで３，０００倍に希釈し１時間培養した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２でｖＷＦ結合を検出した。３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。結果を表１０に示し、第１目および第２回目のパニング後に阻害剤が得られることが示されている。
【実施例２２】
【０３０３】
ＶＨＨの発現および精製
実施例９に記載したように蛋白質を調製し精製した。
【実施例２３】
【０３０４】
ＥＬＩＳＡ：ｖＷＦへの結合
マイクロタイタープレートを２μｇ／ｍｌのｖＷＦにより４℃で終夜コートした。プレートを１％カゼインのＰＢＳ溶液３００μｌによって室温で２時間ブロックした。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した。全精製試料の希釈系列を室温で２時間培養した。プレートをＰＢＳ‐Ｔｗｅｅｎで６回洗浄し、その後、マウス抗ｍｙｃ ｍＡＢ１／２０００のＰＢＳ溶液により室温で１時間培養し、続いて抗マウス‐ＨＲＰ共役体１／１０００のＰＢＳ溶液で同様に室温で１時間培養することによってＶＨＨの結合を検出した。基質ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２によって染色を行い、３０分後に４０５ｎｍでシグナルを測定した。精製ＶＨＨの濃度に応じた結合を図１２に示す。
【実施例２４】
【０３０５】
精製ＶＨＨによる阻害ＥＬＩＳＡ
実施例２０に記載したように、阻害ＥＬＩＳＡを実施したが、精製ｖＷＦの代わりに減少濃度のＶＨＨおよび１／６０希釈のヒト血漿を用いた。結果を図１３に示す。５０％阻害（ＩＣ５０）をもたらすＶＨＨ濃度を表１０に示す。
【０３０６】
実施例２３に記載した、ｖＷＦのコラーゲンへの結合を５０％阻害（ＩＣ５０）するのに必要なＶＨＨ濃度（ｎＭ）
【表１０】
【実施例２５】
【０３０７】
二重特異性構築物の構築および配列
アルブミンに特異的な第１のＶＨＨ（ＭＳＡ２１）およびｖＷＦに特異的な第２ＶＨＨで二重特異性構築物を調製した。実施例１１に記載したように構築物を作製した。配列を表４−１〜４−７に示す（配列番号１９〜２１）。
【０３０８】
配列表
【表４−１】
【表４−２】
【表４−３】
【表４−４】
【表４−５】
【表４−６】
【表４−７】
【実施例２６】
【０３０９】
二重特異性構築物の発現および精製
実施例９に記載したように蛋白質を発現させ精製した。いくらかの一価分解生成物（５〜１０％）を除去するためには、ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５での追加の精製ステップが必要であった。
【実施例２７】
【０３１０】
二重特異性構築物中の両ＶＨＨの機能性
マイクロタイタープレートを５μｇ／ｍｌのマウス血清アルブミンにより４℃で終夜でコートした。プレートを洗浄後、ウェルを１％カゼインのＰＢＳ溶液により２時間ブロックした。二重特異性蛋白質を室温で２時間放置してウェルに結合させた。洗浄後、ヒト、イヌ、およびブタの血漿を様々な希釈で加え、室温で２時間放置して結合させた。ＤＡＫＯ社製抗ｖＷＦ‐ＨＲＰにより１／３０００希釈でｖＷＦの結合を検出した。ＡＢＴＳ／Ｈ２Ｏ２で染色を行った。結果を図１４−１、１４−２、１４−３に示す。両ＶＨＨの機能性が二重特異性構築物に保持されていることを示している。
【実施例２８】
【０３１１】
一価ＶＨＨと比較する二重特異性構築物によるｖＷＦのコラーゲンへの結合の阻害
実施例２０に記載したように、ｖＷＦのコラーゲンへの結合の阻害を、二重特異性構築物と比較して一価について試験した。ＩＣ５０値を表１１に要約する。結果は、ＶＨＨの阻害特性が二重特異性構築物に保持されていることを示している。
【０３１２】
実施例２８に記載した、二重特異性ナノ体の対アルブミンおよび対ｖＷＦのＩＣ５０値
【表１１】
【実施例２９】
【０３１３】
抗血清アルブミンＶＨＨに融合されたＶＨＨ‐ＣＤＲ３断片を含む二重特異性構築物の構築
フレームワーク４領域に位置するセンスプライマー（Ｆ６のＣＲＤ３前進：ＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＣＣ）およびフレームワーク３領域に位置するアンチセンスプライマー（Ｆ６のＣＤＲ３逆進プライマー：ＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣ）の使用によって、機能部分であるＭＰ２Ｆ６ＳＲのＣＤＲ３領域を増幅した。
【０３１４】
ＣＤＲ‐３断片を抗血清アルブミンＶＨＨＭＳＡ‐２１と融合するために、第２回目のＰＣＲ増幅は、以下のプライマーを実施した。
Ｆ６ ＣＤＲ３逆進プライマーＳｆｉ１：
ＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＴＧＴＧＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＣＣ
Ｆ６ ＣＤＲ３前進プライマーＮｏｔ１：
ＧＴＣＣＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＡＧＡＡＧＴＣＡＴＡＣＣ
【０３１５】
反応容量５０ｍｌで各プライマー５０ｐｍｏｌを使用しＰＣＲ反応を実施した。第１回目のＰＣＲの反応条件は、９４℃で１１分、続いて９４／５５／７２℃で３０／６０／１２０秒で３０サイクル、および７２℃で５分であった。２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｍＭのｄＮＴＰ、および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｄ ＤＮＡポリメラーゼ（ロッシュダイアグノスティクス、ベルギー国ブリュッセル）を用いて全反応を実施した。
【０３１６】
ＭＳＡクローンのＶＨＨ遺伝子を制限酵素Ｐｓｔ１／ＢｓｔＥＩＩによって切断後、消化生成物をｐＡＸ１１中でクローン化して、マルチクローニング部位のＣ末端にＶＨＨを有するクローンを得た。ベクターを基にしたプライマーを使用しＰＣＲによってクローンを検査した。クローンから６５０ｂｐの産生物が得られ、ＰＣＲ産生物を制限酵素Ｓｆｉ１／Ｎｏｔ１で切断して、ＭＳＡ ＶＨＨと融合したＣＤＲ３のＮ末端発現を可能にした後、ＤＮＡを調製し、アクセプタベクターとして使用してＭＰ２Ｆ６ＳＲのＣＤＲ３をクローンした。
【実施例３０】
【０３１７】
本発明の抗標的単一ドメイン抗体間相互の相同性の計算
本発明の抗標的単一ドメイン抗体間のアミノ酸配列相同性の程度は、Ｂｉｏｅｄｉｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｅｄｉｔｏｒを使用し算出した。ＣｌｕｓｔａｌＷにより整列化されるので、計算によって全配列間の同一残基の比率が示される。［Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．、Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．、およびＧｉｂｓｏｎ，Ｔ．Ｊ．（１９９４）ＣＬＵＳＴＡＬＷ：配列重み付け、位置特異的空隙ペナルティ、および重量マトリックスの選択による、進化性多重配列整列の感受性の改善（ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ， ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇａｐ ｐｅｎａｌｔｉｅｓ ａｎｄ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｔｒｉｘ ｃｈｏｉｃｅ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９４年６月提出］。表１２は、本発明の抗血清アルブミンＶＨＨ間相互の部分相同性を示す。表１３は、本発明の抗ＴＮＦ‐αのＶＨＨ間相互の部分相同性を示す。表１４は、本発明の抗ＩＦＮγのＶＨＨ間相互の百分比相同性を示す。表１５は、本発明の抗ｖＷＦ ＶＨＨ間相互の画分相同性を示す。
【０３１８】
本発明の抗マウス血清アルブミンＶＨＨのアミノ酸配列間相互の部分的相同性
【表１２】
【０３１９】
本発明の抗ＴＮＦα ＶＨＨ間相互の部分的相同性
【表１３】
【０３２０】
本発明の抗ＩＦＮγ ＶＨＨ間相互の％相同性
【表１４】
【０３２１】
本発明の抗ｖＷＦ ＶＨＨ間相互の部分的相同性
【表１５】
【図面の簡単な説明】
【０３２２】
【図１】実施例４に記載した、ＨＳＡ特異的ナノ体がライブラリに存在することを示すファージＥＬＩＳＡを示す図である。
【図２】実施例８に記載した、ニトロセルロース上にブロットされた、アルブミン結合剤を発現するファージの血漿への結合を示す図である。
【図３】実施例８に記載した、ＳＤＳ‐ＰＡＧＥ上での血漿試料のクーマシー染色である。
【図４】実施例１０に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量した、精製ナノ体のマウスアルブミンへの結合を示す図である。
【図５】実施例１１に記載した、二重特異性ナノ体の構築のためのＰＡＸ０１１の多数のクローニング部位を示す図である。
【図６】実施例１２に記載した、二重特異性構築物中の両ナノ体の機能性を示すためのサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図７−１】実施例１４に記載した、１０％血漿中または１０％血液中のナノ体の濃度を定量するためのＥＬＩＳＡの最適化を示す図である。
【図７−２】実施例１４に記載した、１０％血漿中または１０％血液中のナノ体の濃度を定量するためのＥＬＩＳＡの最適化を示す図である。
【図８】実施例１６に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの一価抗ＴＮＦαナノ体の薬物動態を示す図である。
【図９】実施例１６に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの二重特異性ナノ体ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３Ｅの薬物動態を示す図である。
【図１０】実施例１６に記載した、ＵＲＬ４９と比較してＫ２０８を用いた、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの二重特異性ナノ体ＭＳＡ２１／ＴＮＦ３Ｅの薬物動態を示す図である。
【図１１】実施例１６に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量したマウスでの二重特異性ナノ体ＭＳＡ２４／ＴＮＦ３Ｅ薬物動態を示す図である。
【図１２】実施例２３に記載した、ＥＬＩＳＡによって定量した精製ＶＨＨによるｖＷＦへの結合を示す図である。
【図１３】実施例２４に記載した、ＶＨＨによるｖＷＦのコラーゲンへの結合の阻害を試験するためのＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１４−１】実施例２７に記載した、二重特異性構築物中の両ＶＨＨ機能性を示すサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１４−２】実施例２７に記載した、二重特異性構築物中の両ＶＨＨ機能性を示すサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【図１４−３】実施例２７に記載した、二重特異性構築物中の両ＶＨＨ機能性を示すサンドウィッチＥＬＩＳＡを示す図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに
血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物。
【請求項２】
抗標的単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗標的単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３】
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項５】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ヒト化ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項７】
単一ドメイン抗血清蛋白質抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する、請求項１から６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項８】
標的が、ＴＮＦαである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項９】
配列番号５〜１８のどれかによって表される配列に対応する、請求項７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項１２】
炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項１１に記載の核酸の使用。
【請求項１４】
前記疾患が、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症のどれかである、請求項１３に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項１２および１４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３および１４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項１６】
標的が、ｖＷＦである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１７】
標的が、コラーゲンである、請求項１から７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ｖＷＦ ＶＨＨである、請求項１６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１９】
配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列に対応する、請求項１８に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項１６から１９のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項２２】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項２１に記載の核酸の使用。
【請求項２４】
前記疾患が、脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄のどれかであり、かつ前記状態が、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じている状態である、請求項２２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項２５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項２２および２４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３および２４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項２６】
標的が、ＩｇＥである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２７】
少なくとも抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩｇＥ ＶＨＨである、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２８】
配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列に対応する、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２９】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項２６から２８のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３０】
請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項３１】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３３】
前記疾患が、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、および食事性アレルギーのどれかである、請求項３１に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項３４】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項３１および３３に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２および３３に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項３５】
標的が、ＩＦＮγである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３６】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩＦＮγ ＶＨＨである、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３７】
配列番号２５〜２７によって表される配列に対応する、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項３５から３７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３９】
請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項４０】
免疫系が、過敏である疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
免疫系が、過敏である疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３９に記載の核酸の使用。
【請求項４２】
前記疾患が、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患のどれかである、請求項４０に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項４３】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項４０および４２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１および４２に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項４４】
請求項８から１０、１２、１４、および１５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４５】
請求項１６から２０、２２、２４、および２５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４６】
請求項２６から２９、３１、３３、および３４のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４７】
前記標的が疾患の過程に関与している単一標的を対象とする、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項４８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、請求項４７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４９】
請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項５０】
前記標的が関与している疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
前記標的が関与している疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４７および４８のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５２】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５３】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５４】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５５】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５６】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項５０、５２、または５４のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項５１、５２、５３、または５５のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項５７】
請求項１から７、４７、４８、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載の核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項５８】
（ａ）請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ、ならびに
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収するステップ、
を含む請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
単一ドメイン抗体に血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を結合することによって、前記抗体が治療用および／または診断用標的を対象とする、対象の血流中の単一ドメイン抗体の半減期を延長する方法。
【請求項６１】
前記抗標的単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項６０から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記血清蛋白質が、配列番号１〜４のどれかに対応する配列、相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列を含む、請求項６０から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードすることができる核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに
血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物。
【請求項２】
抗標的単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗標的単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３】
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項５】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ヒト化ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項７】
単一ドメイン抗血清蛋白質抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する、請求項１から６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項８】
標的が、ＴＮＦααである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項９】
配列番号５〜１８のどれかによって表される配列に対応する、請求項７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項１２】
炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項１１に記載の核酸の使用。
【請求項１４】
前記疾患が、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症のどれかである、請求項１２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項１２および１４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３および１４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項１６】
標的が、ｖＷＦである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１７】
標的が、コラーゲンである、請求項１から７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ｖＷＦ ＶＨＨである、請求項１６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１９】
配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列に対応する、請求項１８に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項１６から１９のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項２２】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項２１に記載の核酸の使用。
【請求項２４】
前記疾患が、脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄のどれかであり、かつ前記状態が、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じている状態である、請求項２２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項２５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項２２および２４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３および２４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項２６】
標的が、ＩｇＥである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２７】
少なくとも抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩｇＥ ＶＨＨである、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２８】
配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列に対応する、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２９】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項２６から２８のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３０】
請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項３１】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３３】
前記疾患が、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、および食事性アレルギーのどれかである、請求項３１に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項３４】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項３１および３３に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２および３３に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項３５】
標的が、ＩＦＮγである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３６】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩＦＮγ ＶＨＨである、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３７】
配列番号２５〜２７によって表される配列に対応する、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項３５から３７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３９】
請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項４０】
免疫系が、過敏である疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
免疫系が、過敏である疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３９に記載の核酸の使用。
【請求項４２】
前記疾患が、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患のどれかである、請求項４０に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項４３】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項４０および４２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１および４２に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項４４】
請求項８から１０、１２、１４、および１５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４５】
請求項１６から２０、２２、２４、および２５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４６】
請求項２６から２９、３１、３３、および３４のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４７】
前記標的が疾患の過程に関与している単一標的を対象とする、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項４８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、請求項４７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４９】
請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項５０】
前記標的が関与している疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
前記標的が関与している疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４７および４８のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５２】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５３】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５４】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５５】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５６】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項５０、５２、または５４のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項５１、５２、５３、または５５のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項５７】
請求項１から７、４７、４８、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載の核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項５８】
（ａ）請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ、ならびに
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収するステップ、
を含む請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
単一ドメイン抗体に血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を結合することによって、前記抗体が治療用および／または診断用標的を対象とする、対象の血流中の単一ドメイン抗体の半減期を延長する方法。
【請求項６１】
前記抗標的単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項６０から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記血清蛋白質が、配列番号１〜４のどれかに対応する配列、相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列を含む、請求項６０から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードすることができる核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項１】
治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに
血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物。
【請求項２】
抗標的単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗標的単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３】
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項５】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ヒト化ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項７】
単一ドメイン抗血清蛋白質抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する、請求項１から６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項８】
標的が、ＴＮＦαである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項９】
配列番号５〜１８のどれかによって表される配列に対応する、請求項７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項１２】
炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項１１に記載の核酸の使用。
【請求項１４】
前記疾患が、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症のどれかである、請求項１３に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項１２および１４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３および１４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項１６】
標的が、ｖＷＦである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１７】
標的が、コラーゲンである、請求項１から７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ｖＷＦ ＶＨＨである、請求項１６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１９】
配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列に対応する、請求項１８に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項１６から１９のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項２２】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項２１に記載の核酸の使用。
【請求項２４】
前記疾患が、脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄のどれかであり、かつ前記状態が、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じている状態である、請求項２２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項２５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項２２および２４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３および２４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項２６】
標的が、ＩｇＥである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２７】
少なくとも抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩｇＥ ＶＨＨである、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２８】
配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列に対応する、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２９】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項２６から２８のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３０】
請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項３１】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３３】
前記疾患が、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、および食事性アレルギーのどれかである、請求項３１に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項３４】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項３１および３３に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２および３３に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項３５】
標的が、ＩＦＮγである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３６】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩＦＮγ ＶＨＨである、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３７】
配列番号２５〜２７によって表される配列に対応する、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項３５から３７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３９】
請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項４０】
免疫系が、過敏である疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
免疫系が、過敏である疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３９に記載の核酸の使用。
【請求項４２】
前記疾患が、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患のどれかである、請求項４０に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項４３】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項４０および４２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１および４２に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項４４】
請求項８から１０、１２、１４、および１５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４５】
請求項１６から２０、２２、２４、および２５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４６】
請求項２６から２９、３１、３３、および３４のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４７】
前記標的が疾患の過程に関与している単一標的を対象とする、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項４８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、請求項４７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４９】
請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項５０】
前記標的が関与している疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
前記標的が関与している疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４７および４８のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５２】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５３】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５４】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５５】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５６】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項５０、５２、または５４のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項５１、５２、５３、または５５のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項５７】
請求項１から７、４７、４８、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載の核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項５８】
（ａ）請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ、ならびに
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収するステップ、
を含む請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
単一ドメイン抗体に血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を結合することによって、前記抗体が治療用および／または診断用標的を対象とする、対象の血流中の単一ドメイン抗体の半減期を延長する方法。
【請求項６１】
前記抗標的単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項６０から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記血清蛋白質が、配列番号１〜４のどれかに対応する配列、相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列を含む、請求項６０から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードすることができる核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用および／または診断用標的を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体、ならびに
血清蛋白質を対象とする少なくとも１個の単一ドメイン抗体を含むポリペプチド構築物。
【請求項２】
抗標的単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗標的単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗標的単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３】
抗血清蛋白質単一ドメイン抗体数が少なくとも２個であり、かつ
該少なくとも２個の抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が同じ配列を共有しない、または該抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が全て、同じ配列を共有する、請求項１に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から３のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項５】
前記少なくとも１個の単一ドメイン抗体が、ヒト化ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項１から４のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項６】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項１から５のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項７】
単一ドメイン抗血清蛋白質抗体が、配列番号１〜４および２８〜４０のどれかによって表される配列に対応する、請求項１から６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項８】
標的が、ＴＮＦααである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項９】
配列番号５〜１８のどれかによって表される配列に対応する、請求項７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１１】
請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項１２】
炎症過程に関連付けられる疾患の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
炎症過程に関連付けられる疾患を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項８から１０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項１１に記載の核酸の使用。
【請求項１４】
前記疾患が、リューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、および多発性硬化症のどれかである、請求項１２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項１５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項１２および１４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項１３および１４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項１６】
標的が、ｖＷＦである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項１７】
標的が、コラーゲンである、請求項１から７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１８】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ｖＷＦ ＶＨＨである、請求項１６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項１９】
配列番号１９〜２１のどれかによって表される配列に対応する、請求項１８に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２０】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項１６から１９のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２１】
請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項２２】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項２１に記載の核酸。
【請求項２３】
血小板介在凝集またはその機能異常に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項１６から２０のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項２１に記載の核酸の使用。
【請求項２４】
前記疾患が、脳虚血発作、不安定狭心症、脳梗塞、心筋梗塞、末梢動脈閉塞性疾患、再狭窄のどれかであり、かつ前記状態が、冠動脈バイパス術、冠動脈弁置換術；および血管形成術、ステント術、粥腫切除などの冠血管処置から生じている状態である、請求項２２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項２５】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項２２および２４に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項２３および２４に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項２６】
標的が、ＩｇＥである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項２７】
少なくとも抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩｇＥ ＶＨＨである、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２８】
配列番号２２〜２４のどれかによって表される配列に対応する、請求項２６に記載のポリペプチド構築物。
【請求項２９】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項２６から２８のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３０】
請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項３１】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
アレルギー反応に関連付けられる疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項２６から２９のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３０に記載の核酸の使用。
【請求項３３】
前記疾患が、枯草熱、喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚反応、アレルギー性眼反応、および食事性アレルギーのどれかである、請求項３１に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項３４】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項３１および３３に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項３２および３３に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項３５】
標的が、ＩＦＮγである、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３６】
少なくとも１個の抗標的単一ドメイン抗体が、抗ＩＦＮγ ＶＨＨである、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３７】
配列番号２５〜２７によって表される配列に対応する、請求項３５に記載のポリペプチド構築物。
【請求項３８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、前記ポリペプチド構築物の機能部分、または前記ポリペプチド構築物の機能部分の相同配列である、請求項３５から３７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項３９】
請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項４０】
免疫系が、過敏である疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物、または請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
免疫系が、過敏である疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項３５から３８のいずれかに記載のポリペプチド構築物または請求項３９に記載の核酸の使用。
【請求項４２】
前記疾患が、クローン病、自己免疫疾患、臓器移植拒絶、さらにリューマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、多発性硬化症などの炎症性疾患のどれかである、請求項４０に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１に記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項４３】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項４０および４２に記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項４１および４２に記載のポリペプチド構築物の使用。
【請求項４４】
請求項８から１０、１２、１４、および１５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４５】
請求項１６から２０、２２、２４、および２５のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４６】
請求項２６から２９、３１、３３、および３４のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは該ポリペプチド構築物をコードする核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項４７】
前記標的が疾患の過程に関与している単一標的を対象とする、請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド構築物。
【請求項４８】
前記ポリペプチド構築物が、前記ポリペプチド構築物の相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列である、請求項４７に記載のポリペプチド構築物。
【請求項４９】
請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物をコードする核酸。
【請求項５０】
前記標的が関与している疾患または状態の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４７および４８に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５１】
前記標的が関与している疾患または状態を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４７および４８のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５２】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０に記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５３】
循環から急速には排出されない治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５４】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状の治療、予防、および／または緩和に使用するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９に記載の核酸。
【請求項５５】
長期間循環中で活性を維持し続ける治療用または診断用化合物を必要とする疾患症状を治療し、予防し、かつ／または緩和するための薬剤を調製するための、請求項４８および５０のいずれかに記載のポリペプチド構築物あるいは請求項４９に記載の核酸の使用。
【請求項５６】
前記ポリペプチド構築物が、経静脈、経口、経舌下、経局所、経鼻、経膣、経直腸、経皮下的に、または吸入によって投与される、請求項５０、５２、または５４のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸、あるいは請求項５１、５２、５３、または５５のいずれかに記載のポリペプチド構築物または核酸の使用。
【請求項５７】
請求項１から７、４７、４８、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載のポリペプチド構築物、あるいは請求項４９、５０、５２、５４、および５６のいずれかに記載の核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【請求項５８】
（ａ）請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞を、該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養するステップ、ならびに
（ｂ）産生されたポリペプチドを培養物から回収するステップ、
を含む請求項１から１０、１６から２０、２６から２９、４７、および４８のいずれかに記載のポリペプチドの産生方法。
【請求項５９】
前記宿主細胞が、細菌または酵母である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
単一ドメイン抗体に血清蛋白質を対象とする１個または複数の単一ドメイン抗体を結合することによって、前記抗体が治療用および／または診断用標的を対象とする、対象の血流中の単一ドメイン抗体の半減期を延長する方法。
【請求項６１】
前記抗標的単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記抗血清蛋白質単一ドメイン抗体が、同じ配列を共有しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記単一ドメイン抗体が、ラクダ科ＶＨＨ抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記血清蛋白質が、血清アルブミン、血清免疫グロブリン、チロキシン結合蛋白質、トランスフェリング、またはフィブリノーゲン、あるいはそれらの断片のどれかである、請求項６０から６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記血清蛋白質が、配列番号１〜４のどれかに対応する配列、相同配列、その機能部分、またはその機能部分の相同配列を含む、請求項６０から６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
請求項１から７のいずれかに記載のポリペプチド、または該ポリペプチドをコードすることができる核酸、ならびに薬剤として許容されるビヒクルを含む組成物。
【図５】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図６】
【図７−１】
【図７−２】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４−１】
【図１４−２】
【図１４−３】
【公表番号】特表２００６−５２０５８４（Ｐ２００６−５２０５８４Ａ）
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−５０２０８６（Ｐ２００５−５０２０８６）
【出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００３／０００１９３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４１８６５
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（５０５１６６２２５）アブリンクス エン．ヴェー． (28)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年９月１４日（２００６．９．１４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月７日（２００３．１１．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＢＥ２００３／０００１９３
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４１８６５
【国際公開日】平成１６年５月２１日（２００４．５．２１）
【出願人】（５０５１６６２２５）アブリンクス エン．ヴェー． (28)
【Ｆターム（参考）】
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