本発明は、標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率の決定方法と、キットと、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するためのエンドリソソーム系の形成に関与するタンパク質または脂質の使用とに関する。それには、特に、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ治療薬の（１つまたは複数の）標的を同定するための方法において、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬による治療の効率を決定するための方法において、ならびにヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるためおよび／またはその状態の特性を決定するための方法において、多くの適用がある。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的器官または標的細胞への／標的器官または標的細胞中のｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは関連分子の送達速度および／または効率を決定する方法であって、前記標的器官または標的細胞のエキソソームまたは小胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ、ならびに／あるいは前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡのレベルを測定することを含む方法。
【請求項２】
（ｉ）好ましくは以前にｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡで治療された患者の体液からエキソソームまたは小胞を単離するステップと、
（ｉｉ）前記エキソソーム中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するステップと、
（ｉｉｉ）場合により、前記レベルを対照と比較し、次いで、内在形態または治療薬形態のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達速度および／または効率を決定するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記体液が、血液産物、尿、肺洗浄液および唾液、他の体液、または培養細胞の上清から選択される、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルの前記測定が、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、あるいはマイクロアレイまたは他のチップ上のハイブリダイゼーションにより、あるいはゲルもしくは膜上または溶液中でのハイブリダイゼーションにより実施される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対照が、治療された、治療されていない、または対照で治療された個体、動物または細胞のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡおよび／または他のＲＮＡおよび／または小胞の定量を許容する他の分子、あるいはその成分である、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ステップ（ｉ）〜（ｉｉｉ）が、ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療の前および後、および最終的にはその間に実施される、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
標的器官または標的細胞へのｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性を決定するための、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡの送達効率または活性が、治療後のエキソソーム中のｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたは標的ｍＲＮＡのレベルの低下または変化によって認識される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
全細胞のｍＲＮＡの含量を決定する前記ステップが、ｍＲＮＡマイクロアレイ、ｍｉＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡが標的とするｍＲＮＡまたは他のＲＮＡもしくはＤＮＡを同定する大規模方法、ｑＲＴ−ＰＣＲ、大規模多重遺伝子アプローチから選択される方法を用いて実施される、請求項７乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的器官または標的細胞の膜画分中および全細胞中の、前記ｓｉＲＮＡおよび／または前記ｍｉＲＮＡ、および／または前記ｍｉＲＮＡおよび／または前記ｓｉＲＮＡが標的とする前記ｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項７乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
エキソソーム、膜画分および全細胞の中におけるｍｉ／ｓｉＲＮＡ標的ｍＲＮＡの比を比較するステップを含む、請求項７乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ治療薬の（１つまたは複数の）標的を同定するための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ治療薬または他の分子により行われる治療の効率を決定するための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療が、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するための多胞体（ＭＶＢ）の形成、相互作用または活性に関与するタンパク質、脂質、ＲＮＡまたは他の分子により実施される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラスから成る群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法を含む、ヒト、腫瘍または胎児の遺伝子型を調べるため、および／またはその状態の特性を決定するための方法。
【請求項１７】
生物、細胞または植物におけるｍｉＲＮＡまたは小分子ＲＮＡの活性をコントロールするための方法であって、
タンパク質、またはこのタンパク質の活性を修飾する化学物質、またはこのタンパク質を標的とするｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡもしくはその関連分子を生物に投与することを含み、
このタンパク質が、Ａｌｉｘ、Ｈｒｓ、ｖｐｓ３６（液胞タンパク質選別会合タンパク質３６）、ＥＡＰ３０（３０ｋＤＡのＥＬＬ会合タンパク質、ＳＮＦ８）、ＥＦ１ａ（延長因子１ａ）およびＢＩＧ２、ｈｐｓ４（ヘルマンスキー−パドラック症候群４）、ｈｐｓ１（ヘルマンスキー−パドラック症候群１）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＳＣＦユビキチンリガーゼ（Ｓｋｐ１−Ｃｕｌｌｉｎ−Ｆ−ボックスタンパク質）、Ｓｕｒｆｅｉｔ−４、Ｖ０またはＶ１ＡＴＰアーゼ（Ｖ０またはＶ１アデノシン三リン酸分解酵素）、ｖｐｓ４１、ＣＯＧＣ４（保存されたオリゴマーゴルジ成分４）、ＡＴＧ３（オートファジー関連タンパク質３）、ＡＴＧ８、ＣＯＧ４、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ）、ＮＥＤＤ４Ｌ（発生的に発現が下方制御された神経前駆細胞４様）、ＡＲＦＧＥＦ４（ＡＤＰリボシル化因子グアニンヌクレオチド交換因子−４タンパク質）、ＣＨＭＬ（コロイデレミア様）、ＲＡＢ１０（ｒａｓ関連ＧＴＰ結合タンパク質１０）、ＲＡＢ３５、ＲＡＬＢ（Ｖ−ｒａｌサル白血病ウイルス癌遺伝子相同体Ｂ）、ＲＡＰＧＥＦ６（Ｒａｐグアニンヌクレオチド交換因子６）、ＳＣＤ（ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ）、ＧＩＰＣ１（ＧＩＰＣ ＰＤＺドメイン含有ファミリー、メンバー１）、ＳＣＧＢ１Ｄ１（セクレトグロビン、ファミリー１Ｄ、メンバー１）、ＵＢＥ２Ｍ（ユビキチン共役酵素Ｅ２Ｍ）、ＵＳＰ１０（ユビキチン特異的プロテアーゼ１０）、ＥＥＦ２（真核生物翻訳伸長因子２）、ＬＩＬＲＢ１（白血球免疫グロブリン様受容体、サブファミリーＢ）、ＲＡＢ３６、ＲＡＮＢＰ２（Ｒａｎ結合タンパク質２）、ＳＦＲＰ２（分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質２）、ＳＬＣ４Ａ４（溶質キャリアファミリー４、重炭酸ナトリウム共輸送体、メンバー４）、ＳＭＰＤ３（スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ３）、スフィンゴミエリナーゼ、スフィンゴミエリンシンターゼ１、スフィンゴミエリンシンターゼ２、Ｅｐｏｐａｍｉｌ結合タンパク質、ｕｓｐ２２（ユビキチン特異的プロテアーゼ２２）、ｔｒｐｃ３（一過性受容器電位カチオンチャネル、サブファミリーＣ、メンバー３）、ＣＬＣＮ７（クロライドチャネル７）、ＣＴＳＣ（カテプシンＣ）、ＬＡＭＲ１（ラミニン受容体１）、ＲＮＦ３２（リングフィンガータンパク質３２）、ＥＲＩ３（増強されたＲＮＡｉ−３）、ＨＭＧＣＲ（３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ還元酵素）、ＮＰＣ１（ニーマン−ピック病、Ｃ１型）、ＳＬＣ６Ａ４（ナトリウム依存性セロトニントランスポータ、溶質キャリアファミリー６メンバー４）、ＦＡＵ、ＴＨＥＡ（ＡＣＯＴ１１、アシル補酵素Ａチオエステラーゼ１１）、ＣＫＡＰ４、ＣＯＧ１−８タンパク質、ｖｐｓ１−４５タンパク質、ＣＨＭＰファミリータンパク質、選別ネキシン、ｒａｂ５、７、９、３８、Ａｒｆ２、Ａｒｆ６、ＧＧＡ１−３、スフィンゴミエリンおよびステロール代謝遺伝子および薬物（例えば、ＧＷ４８６９、スフィンゴミエリンエステラーゼ）、ＭＶＢまたはエキソソーム内への選別のその関与に関連するコレステロールまたは脂質ラフト分割および代謝に影響を及ぼす薬物および遺伝子、特にＮＰＣ１、ＨＭＧＣＲ、およびコレステロール低下薬のスタチンクラスから選択される、方法。
【請求項１８】
診断または治療のための候補分子のスクリーニングのための、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法の用途。
【請求項１９】
前記候補分子が、ＲＮＡ、小分子ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡの活性および／または細胞間移行を調節するための、多胞体（ＭＶＢ）の形成に関与するタンパク質または脂質から選択される、請求項１８に記載の用途。
【請求項２０】
（ａ）体液からエキソソームまたは小胞を単離するための手段と、
（ｂ）前記エキソソーム中のｓｉＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡおよび／または標的ｍＲＮＡのレベルを測定するための手段と
を含むキット。

【図８】

【図９−２】

【図２０】

【図１】

【図１−２】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図９】

【図９−３】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１６−２】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２１】

【公表番号】特表２０１１−５２４１６４（Ｐ２０１１−５２４１６４Ａ）
【公表日】平成２３年９月１日（２０１１．９．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１２２３９（Ｐ２０１１−５１２２３９）
【出願日】平成２１年６月５日（２００９．６．５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２００９／００５８７８
【国際公開番号】ＷＯ２００９／１４７５１９
【国際公開日】平成２１年１２月１０日（２００９．１２．１０）
【出願人】（３０９００７５７５）サントル・ナシオナル・ドウ・ラ・ルシエルシユ・シアンテイフイク（セー・エヌ・エール・エス） (11)
【Ｆターム（参考）】