心筋収縮性をｉｎｖｉｖｏで調節するための方法
うっ血性心不全の動物の心筋中のカルシウム輸送をｉｎ ｖｉｖｏで調節するための方法を開示する。本方法によれば、（うっ血性心不全の発症と同時に低減する）カルシウムＡＴＰアーゼ活性、及び心筋収縮性が、この酵素を作動的にコードしている遺伝子を心臓に送達することによって増大される。それだけには限らないが、アデノ随伴ウイルスベクターの使用を含めて、送達系が提供される。この遺伝子産物の発現及び心筋の性能に対するその効果をモニターする方法も提供される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願へのクロスリファレンス
本発明は、１９９５年１１月４日出願の現在も係属中の米国特許出願第０８／４２０，３０６号の一部継続出願である。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、心筋収縮性を調節するための方法に関する。より詳細には、本発明は、ＳＥＲＣＡ２蛋白質を作動的にコードする遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで送達することによって、心臓の筋小胞体（ＳＲ）カルシウム２＋＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２）のｉｎ ｖｉｖｏのレベルを上昇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．先行技術の変遷
うっ血性心不全は、米国において成人の主な死亡原因のうちの１つである。心虚血（心臓への血液供給が妨害され又は失われることにより生じる急性の事象）と比べて、うっ血性心不全は、心筋の収縮性及びストレスに対する心臓の適応性の漸進的な消失を伴う比較的潜行性の事象である。結局、有効な治療法はなく、ＣＨＦ心臓は、身体の代謝要求を満たすのに十分な速度で血液をポンプ輸送する能力を失う。
【０００４】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）に付随する心機能の異常は様々であるが、収縮性蛋白質の活性化に必要とされるＣａ２＋＋イオンのＳＲからの放出の低減は、ＣＨＦ症候群の共通の特徴である。この消失の意味は、カルシウム輸送が心臓の正常な機能活動において果たしている役割という文脈で最も良く理解することができる。
【０００５】
簡単に言うと、ＳＲは心筋の各筋原線維を取り囲む膜性構造物である。ＳＥＲＣＡ２は、ＳＲの膜内部に含まれており、心筋の拡張期弛緩の間にＳＲ内部空間に遊離カルシウムイオンの７０〜８０％を能動輸送する働きをする。輸送に利用可能な残存カルシウムイオンの多くは、ＳＲのナトリウム／カルシウム交換輸送系、並びに程度ははるかに低いが、筋細胞膜カルシウムイオンＡＴＰアーゼが触媒するＡＴＰ加水分解によって駆動される輸送、及びミトコンドリアのカルシウム取り込みによって、細胞質から取り除かれる（Ｂａｓｓａｎｉ他、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４５３：５９１〜６０８、１９９２年、及びＣａｒａｆｏｌｉ，Ｅ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６：３９５〜４３３、１９８７年）。
【０００６】
ＳＥＲＣＡ２のＡＴＰ加水分解活性とＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡの絶対レベルの双方がＣＨＦ心臓において低下することから（Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７５：４３４〜４４２、１９９４年、及びＳｔｕｄｅｒ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７５：４４３〜４５３、１９９４年）、ＣＨＦ心臓の低圧力で血液を受け取る能力の損傷は、ＳＥＲＣＡ２媒介による、収縮を活性化するカルシウムイオンのＳＲへの輸送の遅れに直接関連づけられ、その結果心臓の拡張期弛緩が遅れると広く想定されている（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｗ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２５：１５５７〜１５６４、１９９１年；Ｌｏｒｅｌｌ，ＢＨ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、４２：４１１〜４３６、１９９１年；及びＡｒａｉ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７４：５５５〜５６４、１９９４年を参照のこと）。これらの知見は、特にｍＲＮＡのＳＥＲＣＡ２コードレベルの低下に関して、ヒト並びに他の哺乳動物種において確かめられている。（ヒトＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡレベルについては、Ａｒａｉ他の上記論文、及びＭｅｒｃａｄｉｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８５：３０５〜３０９、１９９０年を参照のこと。また、他の哺乳動物種の肥大心臓組織におけるＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡレベルの低減については、Ｗａｎｇ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６７：Ｈ９１８〜Ｈ９２４、１９９４年（フェレット）；Ａｆｚａｌ及びＤｈｅｌｌａ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６２：Ｈ８６８〜Ｈ８７４、１９９２年（げっ歯類）；及びＦｅｌｄｍａｎ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７３：１８４〜１９２、１９９３年（げっ歯類）を参照のこと）。
【０００７】
ＣＨＦにおけるカルシウム輸送の役割に関して近年関心が持たれているにもかかわらず、ＳＥＲＣＡ２カルシウム輸送活性の損傷の分子的原理は少ししか理解されておらず、ＣＨＦの治療レジメンにまだ利用されていない。そうではなくて、ＣＨＦ症候群のための現在の治療様式は、ＣＨＦ心臓の不全につながる機能異常を引き起こさないとしてもそれに付随すると考えられている生化学的事象及び分子的事象を直接標的としていないという意味で、ほとんど非特異的である。例えば、アドレナリン様薬物を投与することによるＣＨＦの薬剤治療は、心筋収縮を刺激するが、筋肉の収縮性の減退を引き起こした根底にある状態を是正しない。
【０００８】
従って、ｉｎ ｖｉｖｏの心臓蛋白質レベルを補充及び／又は上昇させることは、ヒトのＣＨＦの進行を治療及び制御するための魅力的な代替方法である。しかし、心臓組織に心臓蛋白質又は心臓ペプチドを導入することによってこの目標を実現することは、成功する可能性が低い。特に蛋白質に対する生体反応を起こすのに十分な用量で、潜在的な毒性を生じる危険性が主要な懸念である。実用的な観点からは、これらの蛋白質を単離し精製すること、又は合成することに伴うコストの問題もある。さらに、標的組織中に存在するプロテアーゼによって分解されるため、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が比較的短いことにより、これらの蛋白質の臨床上の効果も限られるはずである。
【０００９】
これらの理由により、この蛋白質を発現する遺伝子の送達により、患者に蛋白質を導入することは、蛋白質それ自体の投与に代わる魅力的な代替方法である。この目的で、標的細胞に外来遺伝子を導入するための様々な戦略が開発されている。ヒトで使用するために今日までに提案されている遺伝子治療プロトコールの大半は、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子移入に焦点を合わせている。例えば、標的組織に移植するための細胞のレトロウイルスによるトランスフェクションなどがある（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＷＦ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：８０８〜８１３、１９９２年、及びＭｉｌｌｅｒ，ＡＤ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７：４５５〜４６０、１９９２年（アデノシン脱アミノ酵素欠損の治療）を参照のこと）。しかし、これらのプロトコールの有用性は、蛋白質発現が比較的非効率的であること並びに標的器官及び組織への到達性が限られていることにより、限定的であることが判明した。
【００１０】
従って、ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達方法は、当技術分野で関心の高いテーマである。この目的で、「裸の（ｎａｋｅｄ）」ポリヌクレオチド（プラスミド）、ウイルスに連結したプラスミド、ウイルスに取り込ませた（ｃｏｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）プラスミドの導入、並びにリポソームによる遺伝子構築体のカプセル化及び送達を含めて、この目標を達成するためにいくつかの系が開発されている。
【００１１】
例えば、リス肝炎の裸のクローン化プラスミドＤＮＡをリスに肝臓内注入したところ、ウイルス感染及び抗ウイルス性抗体の形成が共にリスで生じたというＮＩＨ（米国国立衛生研究所）の研究が１９８４年に報告された（Ｓｅｅｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８１：５８４９〜５８５２、１９８４年）。数年後、Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、骨格筋組織に注入した「裸の」ポリヌクレオチド（すなわち、リポソーム又はウイルス発現ベクターを伴わないＤＮＡ又はＲＮＡ）から蛋白質発現を得たことを報告した（Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５、１９９０年。また、ＰＣＴ国際特許出願公開第９０／１１０９２号も参照のこと）。Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、筋組織が、多核細胞、筋小胞体、及び筋細胞の深部まで伸びる横行の管状系からなる独特な構造を有するため、筋細胞がポリヌクレオチドを効率的に取込み発現すると推測した。
【００１２】
標的組織に直接遺伝子を送達するための同様の系が、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１１２７７〜１１２８１、１９９２年（リポゾームにカプセル化した遺伝子のエアロゾル送達後に検出された蛋白質発現）及びＴａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：１５２〜１５４、１９９２年（ワクチン「銃」を用いてコロイド性の金粒に結合させたｈＧＨプラスミドをマウスの皮膚に注入した結果、注入された遺伝子に対する免疫応答を誘発せずにｈＧＨ蛋白質を発現した）によって報告されている。筋細胞内で高レベルの蛋白質発現を起こすのに一般に有効ではあるが、長期治療のための筋組織へのＤＮＡ又はＲＮＡの直接注入では、遺伝子の分解による発現の損失を補うために注入を繰り返し利用する必要がある。この手法は、時間がかかり高価であるだけでなく、注入部位及びその周辺で炎症が引き起こされるため、長期治療には非実用的であるかもしれない。従って、短期治療又は救急治療では有用であるが、標的組織に発現可能な遺伝子を導入するための侵襲性のより低い手段が、標的組織への直接注入よりも一般に好ましい。
【００１３】
さらに、組換え発現ベクターを使用しないｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達方法の大半は、標的細胞のトランスフェクションが非効率的で蛋白質発現が比較的弱いという欠点がある。従って、組換え発現ベクター（特に複製不能型のベクター）が現在もなおｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達のための好ましい運搬体（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。
【００１４】
心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達に適した標的であることが示されている。例えば、ＣＨＦの治療に対する近年の１つの提案を用いれば、ＣＨＦ心臓の筋細胞の活性β２−アドレナリン受容体の数が補充及び／又は増加されるはずである。マウスでの研究により、直接移植技術を使用してこれらの受容体をコードする遺伝子を導入したところ、外因性のアドレナリン供給源の不在下でさえ心筋の収縮性をｉｎ ｖｉｖｏで増大させたことが示されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：５８２〜５８６、１９９４年）。特に、アデノ随伴ウイルスベクターが、心筋細胞への遺伝子送達のための成功裡の運搬体として示されている（例えば、Ｇｕｚｍａｎ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７３：１２０２〜１２０７、１９９３年、及びＭｕｈｌｈａｕｓｅｒ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８８（Ｐａｒｔ２）：１〜４７５、１９９３年を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の詳細を、添付図及び以下の説明に示す。本発明の詳細が知られれば、非常に多くのさらなる革新及び変更が当業者には明らかになるであろう。
【００１６】
本発明は、ＳＥＲＣＡ２を作動的にコードするポリヌクレオチドを心筋などの組織に導入することにより触媒活性のあるＳＥＲＣＡ２の発現をｉｎ ｖｉｖｏで高めることによって、心筋のＳＲへのカルシウム輸送を増大させる方法である。標的細胞のトランスフェクション効率の点で好ましい実施形態では、ＳＥＲＣＡ２をコードしているポリヌクレオチドを、複製不能型のウイルス組換え発現ベクター、最も好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）構築体を用いて心臓組織に送達する。
【００１７】
或いは、ＳＥＲＣＡ２コード遺伝子を、リポソームによるカプセル化又は「裸の」ヌクレオチドの投与によって提供してもよい。ＳＥＲＣＡ２遺伝子の送達は、外科的に（即ち、ベクター又はトランスフェクトした細胞の標的組織への直接導入によって）又は冠動脈内輸注法によって行ってよい。
【００１８】
ＳＲ中のＳＥＲＣＡ２活性上昇によってもたらされるＳＲへのカルシウムイオン輸送の増大により、心臓の筋原線維収縮の活性化が緩和されることになる。従って、本発明の方法の特に有利な点は、特に心筋の拡張期弛緩の初期段階を短くすることにより、ＣＨＦに関連する異常に対して心臓が調整するのを助けることである。
【００１９】
本発明の方法の一使用は、インターベンション治療（例えば移植）を待機している、且つ／又は既にＣＨＦ治療を受けている患者のＣＨＦの短期改善を目的としている。本発明の方法の使用はまた、ＣＨＦに関連する心機能の異常を生じるリスクがある、或いは既に異常を生じ始めている患者に恩恵をもたらすと予想される。
【００２０】
本発明の他の態様では、本発明の方法で使用するためのベクターを開発する際及び本発明の方法の適用を試験する際に使用するためのトランスジェニック動物が提供される。ＣＨＦの治療に使用したときの本発明の方法の有効性をモニターする方法も説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
この説明を通じて、ここに示す好ましい実施形態及び実施例は例とみなすべきで、本発明を限定するものとみなすべきではない。
【００２２】
Ａ．定義
以下の定義は、本発明の考察を簡単にするために提供される。しかし、これらの定義が本発明の正当な範囲又は趣旨から逸脱しない等価物を含むように拡張できることを、当業者なら理解するであろう。この理由から、これらの定義は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
１．「ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、本発明に従って行う治療の目的に適したセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むことができる。本明細書では、「ポリヌクレオチド」とは、分離した断片の形又は大きな構築体の成分としての、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの重合体を意味する。ポリヌクレオチドの配列は、遺伝コードから推測できるが、コードの縮重を考慮しなければならない。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝コードの結果として縮重した配列を含み、その配列は当業者によって容易に決定することができる。
２．「作動的にコードする」とは、所望の翻訳産物、例えばペプチド又は蛋白質の発現及び望むならその分泌に必要なプロモーター及び他の配列を含むように改変されたポリヌクレオチドを意味する。本発明の全ての実施形態は、公知の組換え発現ベクターを使用して実施することができる。これらのベクターは、所望の翻訳産物をコードするｃＤＮＡを含むことが好ましい。従って、文脈上別の意味で解釈する必要がない限り、「ポリヌクレオチド」とは、適切な組換え発現ベクター中に含まれ作動的にコードする配列を意味すると想定され、その例が本明細書で提供される。
３．「合成」とは、ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を合成する公知の手段を意味し、天然のポリヌクレオチド及び蛋白質の単離及び精製を含むことができる。
４．「ペプチド」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで所望の生体効果を有する小型ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、及び蛋白質を意味する。
５．「送達」とは、作動的にコードするポリヌクレオチドを宿主に導入する既知の方法を意味する。当業者なら、これらの送達手段を熟知しており、或いは容易に特定することができる。しかし、特に有用な送達手段に関しては、「新規の薬物送達系（Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２年）を参照することができ、その関連する開示内容を、薬物送達技術に関する当技術分野の知識状態を例示するために参照により本明細書に組み込む。
６．「宿主」とは、本発明に従って行われる治療の受容者を意味する。宿主はどんな脊椎動物でもよいが、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の場合は、宿主はヒトが好ましいが、飼育された家畜でもペット動物でもよい。
７．「標的組織」とは、作動的にコードするポリヌクレオチドの発現を得ようとする、宿主の組織を意味する。
８．「抗体」とは、任意のクラスの免疫グロブリン全体、キメラ抗体、２つ又は複数の抗原特異性を有するハイブリッド抗体、及びハイブリッド断片を含む断片を意味する。また、このような断片の結合体、例えば米国特許第４，７０４，６９２号に記載されているいわゆる抗原結合性蛋白質（単鎖抗体）、及び、例えば米国特許第４，６９９，８８０号に記載されている抗イディオタイプ抗体（他の抗体に結合する抗体）も、「抗体」の意味の範囲内に含まれる。
９．「組換え発現ベクター」は、真核生物又は原核生物で発現可能なポリペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドの系を意味する。真核生物又はウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物で発現する方法は当技術分野で公知である。宿主中で発現及び複製できる、生物的に機能的なウイルス及びプラスミドＤＮＡベクターも当技術分野で公知である。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、及び哺乳類生物を挙げることができる。
【００２３】
Ｂ．本発明の方法で使用するポリヌクレオチド構築体
ラットＳＥＲＣＡ２のゲノムクローンのヌクレオチド配列（Ｒｏｈｒｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６９４１〜６９４４、１９８８年（ラットＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡ）も参照のこと。この論文で報告された配列を、参照のために本明細書に組み込む）。このクローンは、Ｒｏｈｒｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：８６３８〜８６４６、１９９１年（その開示内容を参照のために本明細書に組み込む）に記載されているような従来のハイブリダイゼーション技術によって得られた（実施例１を参照のこと）。この論文は、クローンを転写するための開始コドン及び終止コドンも記載している。
【００２４】
カルシウムＡＴＰアーゼのＳＥＲＣＡ２アイソフォームのヌクレオチド配列（すなわち、横紋筋の「速筋型」アイソフォームに対する骨格筋の「遅筋型」アイソフォーム）は、哺乳動物種間で９０％以上保存されている。従って、ＳＥＲＣＡ２は、ヒト（ＧＥＮＢＡＮＫ ＃Ｊ４０２５、又、ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ２３１１４〜２３１１６、Ｍ２３２７７〜２３２７９、及びＬｙｔｔｏｎとＭａｃＬｅｎｎａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１５０２４〜１５０３１、１９８８年も参照のこと）、及びウサギ（ＭａｃＬｅｎｎａｎ，ＤＨ、Ｎａｔｕｒｅ、３１６：６９７〜７００、１９８５年、及びＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ３３８３４）を含めて、げっ歯類以外の哺乳動物の骨格筋組織からかなり容易に同定され、配列決定されている。当業者なら、ヒトＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの使用がヒトの治療では大いに好ましいことを理解するであろうが、ラットＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドが、実施例で記載した実験のためには使用しやすく好ましい。
【００２５】
ＳＥＲＣＡ２に関して詳細に本明細書に記載する本発明の方法は、ＣＨＦ心臓でその発現及び活性が損傷されている他の心臓蛋白質を送達するために使用するように適合させることができるので有利であることも、当業者なら理解するであろう。特に、哺乳動物のカルシウム／ナトリウム交換体をコードしている遺伝子は、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの送達に関して本明細書に記載したのと同じ方法で、本発明の方法に従って心臓に送達するための特に魅力的な対象である。
【００２６】
本開示に含まれるＳＥＲＣＡ２配列及び当技術分野で公知のものを入手し使用するために、ＤＮＡ及びＲＮＡを当技術分野で公知の自動核酸合成装置を使用して合成することができる。公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用が、ポリヌクレオチド混合物を生成するのに特に好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２章及び４章、（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年）に記載のプロトコールのような当技術分野で公知の手段によって、ゲノム核酸を調製することができる。ｃＤＮＡは、当技術分野で公知の手段によって合成することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、米国ニューヨーク州、１９８２年）を参照のこと）。目的のポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡの発現ライブラリを、当技術分野で公知の手段によってスクリーニングすることもできる。
【００２７】
例えば、これらの手段には、それだけには限らないが、１）共通のヌクレオチド配列を検出するための、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリへのプローブのハイブリダイゼーション、２）共通の構造的特徴を検出するための発現ライブラリの抗体スクリーニング、及び３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成が含まれる。特定のＤＮＡコード配列又はその断片の開発は、１）ゲノムＤＮＡからの二重鎖ＤＮＡ配列の単離、２）目的のポリペプチドのために必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学的作製、及び３）真核性ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二重鎖ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によって行うことができる。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ相補物が、最終的に形成される。
【００２８】
ハイブリダイゼーション手順は、混合した合成オリゴヌクレオチド標識プローブを使用して、組換えクローンをスクリーニングするのに有用であり、この場合、各プローブは変性させた二重鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含むハイブリダイゼーション試料中にある特定のＤＮＡ配列の完全な相補物である可能性がある。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡ又は変性した二重鎖ＤＮＡ上でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少量しか存在しない供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的な結合を避けるようにした厳密なハイブリダイゼーション条件を使用することにより、例えば、混合物中のただ一つのプローブに標的ＤＮＡをハイブリダイゼーションすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーで可視化させることが可能である。
【００２９】
目的のポリヌクレオチドを含むと考えられるｃＤＮＡライブラリは、ｃＤＮＡから誘導した様々なｍＲＮＡを卵母細胞に注入し、十分な時間を与えてｃＤＮＡ遺伝子産物を発現させ、例えば目的のポリヌクレオチドにコードされたペプチドに特異的な抗体、又は目的のポリヌクレオチドにコードされたペプチドの特徴である繰り返しモチーフ及び組織の発現パターンを調べるためのプローブを使用して、所望のｃＤＮＡ発現産物が存在するかどうか試験することによって、スクリーニングすることができる。或いは、ｃＤＮＡライブラリは、少なくとも１種のエピトープを有する治療用及び／又は免疫原性ペプチドの発現について、それらのペプチドに特異的な抗体を使用して、間接的にスクリーニングすることもできる。これらの抗体は、ポリクローナル型又はモノクローナル型を作製し、目的のｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。
【００３０】
適切なプローブが利用可能であるならば、核酸ハイブリダイゼーションを利用するスクリーニング手順によって、任意の生物から任意の遺伝子配列を単離することが可能になる。問題の蛋白質をコードする配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチドプローブを、化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド区間がわかっていなければならない。蛋白質をコードしているＤＮＡの配列は、遺伝コードから推測できるが、コードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重しているときは、混合付加反応を行うことができる。これは、変性した二重鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含む。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡ又は変性した二重鎖ＤＮＡ上でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００３１】
本発明で使用するＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡでよいが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列であることが好ましい。本発明で使用するポリヌクレオチドは、（ａ）発現可能で、且つ（ｂ）複製不能、又は宿主ゲノム内に入って複製しないように当技術分野で公知の手段によって改変されたものでなければならない。ＳＥＲＣＡ２蛋白質を作動的にコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクター、最も好ましくはアデノウイルス構築体の一部として使用することが好ましい。
【００３２】
以下は、本発明で使用するのに適するポリヌクレオチドの調製の例であり、どのように特定のポリヌクレオチド組成物が作成されたかを示す特定の実施例が以下に提供される。しかし、複製不能なポリヌクレオチドを調製する他の既知の手段も適し得ることは、当業者には明らかであろう。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＳＥＲＣＡ２蛋白質を作動的にコードする既知のポリヌクレオチドの機能的誘導体を含む。「機能的誘導体」とは、ＳＥＲＣＡ２の「断片」、「変異体」、「類似体」、又は「化学的誘導体」をコードするポリヌクレオチドを意味する。分子の「断片」は、分子の任意のペプチド部分を含む。このような分子の「変異体」とは、分子全体又はその断片にかなり類似した天然の分子を意味する。分子の「類似体」とは、分子全体又はその断片にかなり類似した非天然の分子を意味する。
【００３４】
本明細書では、ある分子が普通ならその一部分ではない追加の化学的部分を含むとき、別の分子の「化学誘導体」であると言う。これらの部分は、分子の溶解性、吸収性、生物的半減期などを改善することができる。或いは、これらの部分は、分子の毒性を弱め、分子の望ましくない副作用を無くし又は減らすこともできる。このような効果をもたらすことができる当技術分野で既知の部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州、イーストン（１９８０年）に開示されている。
【００３５】
ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドは、これらのポリペプチドの発現を制御する調節蛋白質を作動的にコードする他のポリヌクレオチドに結合させ又はそれらと一緒に使用し、或いは、認識配列、プロモーター配列、及び分泌配列を含むことができる。当業者なら、過度に実験をすることなく、調節ポリヌクレオチドを選別し、それらを本発明のＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドに組み込むことができるであろう。例えば、ネズミ又はヒトの系で使用するのに適したプロモーター及びその使用法が、前述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの１章に記載されている。
【００３６】
本発明で使用するためのＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの特に好ましい形態は、組換え発現ベクターに組み込まれたものとなる。組換え発現ベクターを使用すると、標的組織における遺伝子の発現が長くなる。
【００３７】
適切な組換え発現ベクターは当技術分野で公知であり、前述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの１章に記載されているベクターが含まれる。２種の特に好ましいプラスミドプロモーターベクターは、ｐＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ））及びｐＣＭＶ（サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））であり、特に後者である。この選択は、ＣＭＶプロモーターを使用すると、より高レベルの発現がこの状況で得られるという観察結果に基づく。
【００３８】
ＲＳＶプロモーターを単離し、プラスミドベクターの構築にそれを使用するための適切なプロトコールは、Ｇｏｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：６７７７、（１９８２年）に記載されている。他の好ましいプラスミドベクターは、カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から市販されているｐＲＥＰ７及びｐＲＥＶである。ポリヌクレオチドのクローニングにおいて、ｍＲＮＡの産生に特に適したプラスミドは、Ｋｒｅｉｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：７０５７〜７０７０（１９８４年）に記載のｐＳＰ６４Ｔクローニングベクターである。従来技術を使用して、開始コドンを含む任意のｃＤＮＡをこのプラスミドに導入し、発現されたＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡを調製することができる。
【００３９】
組換え発現ベクターで使用するための特徴が良く分かっている「ｏｎ／ｏｆｆ」スイッチは、抗生物質（テトラサイクリン）で調節されるプロモーター系である。このような系を構築する手段は、当技術分野で公知である。この点に関する総説について、当業者なら、Ｆｕｒｔｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２〜９３０６、１９９４年（トランスジェニックマウスにおける、テトラサイクリンに調節された遺伝子発現制御）、Ｆｉｓｈｍａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９３：１８６４〜１８６８、１９９３年（心臓の遺伝子発現のテトラサイクリンによる制御）、及びＮｉｗａ他、Ｇｅｎｅ、１０８：１９３〜２００、１９９１年（高発現のトランスフェクトタントのためのプロモーター系の使用）を参照できよう。テトラサイクリンプロモーター系の制御下でＳＥＲＣＡ２をコードするプラスミドを、実施例４に記載する。
【００４０】
本発明で利用できる様々なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、又はレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが含まれる。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、それだけには限らないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ）（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（Ｈａｒｖｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）（ＭｕＭＴＶ）及びラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）が含まれる。いくつかの他のレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターの全ては、形質導入された細胞を同定及び生成できるように、選択マーカーとして遺伝子を移入又は組み込むことができる。
【００４１】
組換えレトロウイルスは欠損があるため、感染性のベクター粒子を産生するためには助けを必要とする。例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下にあるレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードしているプラスミドを含むヘルパー細胞系を使用して助けることができる。これらのプラスミドは、パッケージング機序でキャプシド形成のためのＲＮＡ転写物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列を欠失している。パッケージングシグナルを欠失しているヘルパー細胞系には、それだけに限らないが、例えば、ψ２、ＰＡ３１７、及びＰＡ１２が含まれる。これらの細胞系は、ゲノムが全くパッケージされない（詰め込まれない）ため、空のウイルス粒子を産生する。パッケージングシグナルは損なわれていないが構造遺伝子が目的の他の遺伝子で置き換えられているこのようなヘルパー細胞系にレトロウイルスベクターが導入されると、ベクターはパッケージされることができ、ベクターウイルス粒子を産生することができる。
【００４２】
ＤＮＡ発現ベクターのうちでは、トランスフェクション効率（心筋細胞で最大７０％）の点からＡＡＶベクターが好ましい。このようなベクターは、外来ＤＮＡの比較的大きなセグメントを受け入れることができ、低い免疫原性で高タイターで生成することができるので好ましい。ＡＡＶベクターは、（例えばＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドのポリリジン結合体と比べて）冠動脈内輸注法に良く耐えるので有利である。
【００４３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、単純な非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスである。パッケージング配列を含むそのｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの先頭及び末尾を決めている逆方向反復配列の間に挟まれている。ｃａｐ遺伝子は、ウイルスのキャプシド（ｃａｐｓｉｌ）（莢膜）蛋白質をコードし、ｒｅｐ遺伝子産物は、ウイルスの複製及び組み込みに関与している。ＡＡＶは、複製のために、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスによって提供される追加の遺伝子を必要とする。ＡＡＶは様々な細胞型に感染する。そのウイルスＤＮＡは、ヒト染色体１９に優先的に組み込まれることができる。
【００４４】
ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を導入遺伝子で置き換えることによって、ＡＡＶベクターを作製し、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。ヒト因子ＩＸのｃＤＮＡを含むＡＡＶベクターが構築され、免疫適格性マウスの肝臓細胞及び筋肉細胞に感染させるために使用されている。これらのマウスは、６ヶ月以上の間、治療効果のある量の因子ＩＸ蛋白質を血液中に産生することができた。ＡＡＶベクターを大量調製するための組成物及び方法は、米国特許第６，４１６，９９２号に開示されている。
【００４５】
本発明で使用するのに特に好ましいＡＡＶ構築体を、実施例１に示す。この構築体は、プロモーター、ポリリンカー、及びその他のものを含むシャトルベクター中にＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをクローニングすることによって、形成される。試料中で使用する特定のアデノ随伴シャトルベクターは、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他によって記載の（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３（９）：３８２２〜３８２８、１９８９年）プラスミドｐＳｕｂ２０１から誘導した。このプラスミドのＸｂａ Ｉ断片を、マルチクローニングサイト及びポリアデニル化シグナルの前にある５７２塩基対のヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター断片に連結させた。このプラスミドをＡＡＶ−シャトルと呼び、サイズは約５０００塩基対である。
【００４６】
３’末端でフラッグシグナルペプチドに融着させたラットＳＥＲＣＡ２ａのコード配列が報告されている（Ｈｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １００：９７４〜９８０、１９９９年）。Ｋｐｎ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ又はＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ酵素を使用して、緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をＡＡＶ−シャトル中に好都合にクローニングすることができる（Ｈｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １００：９７４〜９８０、１９９９年）。組換えクローンはＤＮＡ配列決定により確認され、大量のプラスミドｐＤＧが記載され、ＣｓＣｌ大量調製プロトコールによって精製されている（Ｇｒｉｍｍ他、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２７４５〜２７６０、１９９８年）。
【００４７】
純粋な感染性ウイルス粒子を調製するために、挿入されたｃＤＮＡを含むＡＡＶ−シャトルプラスミド及びｐＤＧプラスミドは共に、ＣａＰＯ４共沈法を使用して細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションに続いて、細胞は新鮮な培地で培養され、次いでウイルス粒子が回収され精製される。クローニングスキーム及び適切な制限部位の略図を図４に示す。
【００４８】
（以下のセクションＣで記載の）リポソーム送達のためのＳＥＲＣＡ２のカプセル化も、複製可能なＡＡＶ構築体を使用する場合と同様に、ウイルスの免疫破壊を制限するはずである。しかし、ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みに伴う可能性のある危険性を考えると、このようなベクターの使用は、ベクター産生物の長期間の発現が患者の生存に極めて重要である状況に限られることになる可能性が高い。
【００４９】
例えば、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードするもう１つの遺伝子といっしょに１種又は複数の目的の配列をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターを標的特異性にすることができる。例えば、糖、糖脂質、又は蛋白質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって、レトロウイルスベクターを標的特異性にすることができる。
【００５０】
心臓に特異的なプロモーターを使用することにより、標的筋細胞以外の心筋細胞への本発明の組換え発現ベクターの非特異的トランスフェクションを回避することが好ましい。いくつかのこのようなプロモーターが現在知られており、トリβ−アクチンが挙げられる（実施例１を参照のこと）。当業者なら、ウイルスゲノムに挿入され、目的のＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にすることができる他の特定のポリヌクレオチド配列について知っているか、過度に実験をすることなく容易に確認することができよう。
【００５１】
心臓組織へのＳＥＲＣＡ２導入遺伝子の送達のためにＡＡＶベクターを使用することの利点は、このベクターに対して免疫応答が起こらず、導入遺伝子の発現が最大７ヶ月持続することである。ＳＥＲＣＡ２導入遺伝子の送達のためのＡＡＶベクターの使用に関する詳細な説明を、以下の実施例１に示す。
【００５２】
Ｃ．ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの薬剤調製物
ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの組成物及びＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの混合物は、製薬上許容される懸濁液、溶液、又は乳濁液中に入れてよい。適切な媒体は生理食塩水を含み、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを標的組織に送達するために抗原提示細胞を使用しない実施形態の場合は、リポソーム調製物を含んでよい。
【００５３】
より詳細には、製薬上許容される担体は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液を含んでよい。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びエチルオレエートなどの注射可能な有機エステルがある。水性の担体には、生理食塩水及び緩衝処理した媒体を含めて、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液、又は懸濁液が含まれる。非経口用ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖入りリンガー液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンガー液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、（ブドウ糖入りリンガー液をベースとしたものなどの）流動性で栄養性の補充液及び電解質補充液などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの保存剤及び他の添加剤も存在してよい。さらに、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの組成物を、本発明に従って後で再構成し使用するために、当技術分野で公知の手段を使用して凍結乾燥してもよい。
【００５４】
上記に論じた標的化ベクター送達系に加えて、コロイド分散系も標的化送達に使用してよい。コロイド分散系には、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含めて、高分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、及び脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。
【００５５】
リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの送達運搬体として有用な人工膜小胞である。大きさ０．２〜４．０ｎｍの大きな一枚膜小胞（ＬＵＶ）が、大きな高分子を含む水性緩衝液のかなりの割合をカプセル化できることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び無傷のウイルス粒子は、水性の内部にカプセル化され、生物活性のある形で細胞に送達されることができる（Ｆｒａｌｅｙ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６：７７、１９８１年）。リポソームは、哺乳動物細胞に加えて、作動的にコードするポリヌクレオチドを植物、酵母、細菌細胞中に送達するのに使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移入運搬体となるためには、以下の特徴がなければならない。すなわち、（１）アンチセンスポリヌクレオチドをコードしている遺伝子を高効率でカプセル化するが、それらの生物活性は損なわないこと、（２）標的ではない細胞と比べて標的細胞に優先的且つ有意に結合すること、（３）運搬体中の水性内容物を、高効率で標的細胞の細胞質に送達すること、及び（４）遺伝情報を正確且つ有効に発現することである（Ｍａｎｎｉｎｏ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６８２、１９８８年）。
【００５６】
リポソームの組成物は、通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質又は他の脂質も使用してよい。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価の陽イオンの有無によって決まる。
【００５７】
リポソーム調製に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドなどのホスファチジル化合物が含まれる。特に、脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールが有用である。リン脂質の例には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【００５８】
リポソームの標的化は、解剖学的及び機械的要因に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、器官特異性、細胞特異性、及び細胞小器官特異性に基づく。機械的標的化は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的化は、洞様毛細血管を含む器官において細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するというリポソームの本来の傾向を利用する。一方、能動的標的化では、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、蛋白質など特定のリガンドにリポソームを結合させること、又は本来の所在位置以外の器官及び細胞型を標的させるためにリポソームの組成又は大きさを変更することによってリポソームを改変する。
【００５９】
標的化送達系の表面は、様々な方法で改変してよい。リポソームによる標的化送達系の場合は、リポソームの二重層と安定に結合した状態で標的リガンドを維持するために、脂質類をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。標的リガンドに脂質鎖を結合させるために、様々な結合基を使用できる。
【００６０】
これらの技術（及び薬物送達を容易にするために通常使用される他の技術）は、当業者によって過度に実験をすることなく、本発明の方法で使用するためのＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの調製に適合されることができると予想される。特に、上記のパラグラフで論じた手法は、発明者の知る限りでは、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏで筋細胞に送達するためにこれまで使用されていないが、この目的に使用するのに適していると考えられる。このため、上記に挙げた参照は、本発明の方法に必須ではないが、参照により本明細書に組み込む。それが適していることを示す特定の実施例を、以下に示す。
【００６１】
Ｄ．心臓のＳＥＲＣＡ２活性をＩＮ ＶＩＶＯで増大させるための方法
本発明では、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドが、それがコードする生物的に活性なペプチドを発現させるのに十分な用量で供給されれば十分である。実現される発現レベルが、「通常の」内在性ＳＥＲＣＡ２の活性を実質的に補充するのに十分であることが好ましい。ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドが、組換え発現ベクター、好ましくはＡＡＶベクターに含まれ、（セクションＣで前述したように）製薬上許容される組成物に配合されると有利である。
【００６２】
「通常の」ＳＥＲＣＡ２レベル及び活性は個体間で様々であり、従って、特定の種について絶対的に決定することはできない。しかし、ＳＥＲＣＡ２蛋白質の治療前後のレベル、並びにＣＨＦ心臓における増強された収縮性及び心臓性能の臨床的兆候をモニターすることによって、特定の治療目的を達成するために望ましいＳＥＲＣＡ２発現レベル（「治療上有益な量」）を確認し、それを許容される臨床制限内に維持することができる。ＳＥＲＣＡ２レベルをモニターする手段は、以下のセクションＦに説明する。
【００６３】
心臓性能、及びＣＨＦに伴うストレスに対する適応力の改善の臨床的兆候は、心臓病分野の当業者には公知であり、例えば、血流、心臓のポンプ容量、及び心室圧（例えば、血管造影及び心エコー検査による）、カルシウム輸送速度（心臓液試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価による）、耐性試験（例えば、心臓への圧力過負荷なストレスに対する心拍のモニタリングによる）、及びＣＨＦ症状の減退の一般的な臨床的兆候（例えば、宿主の持久力が増え、呼吸が容易になる）をモニターすることによって、判定することができる。投与用量は、個々の治療目的を達成するために変更してよい（例えば、急性のＣＨＦ病態の宿主においてカルシウム輸送を増大するためのＳＥＲＣＡ２の過剰発現）。最大及び最小範囲は、前述のモデル及び大型の哺乳動物種の使用などから得られるヒト以外の動物データの結果を外挿することによっても決定される。
【００６４】
ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチド送達は、静脈内又は冠動脈内輸注法により（好ましくは、ポリヌクレオチドの大動脈起始部への逆流を最小限にするためにカテーテル法を使用して）行うことが好ましい。或いは、より強くより即時的なＳＥＲＣＡ２発現を実現するために、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを（例えば、開胸技術を使って）心室壁に注入しても、（例えば、血管造影カテーテル法によって）直接心室に導入してもよい。その後、ＳＥＲＣＡ２発現をモニターし、必要なだけ送達を繰り返す。処理した宿主を、ポリヌクレオチド又はＳＥＲＣＡ２に対する免疫応答などの副作用、及び（例えば、拡張期の過度の延長によって示されるような）過度のＳＥＲＣＡ２発現がないかどうかについても注意深くモニターすべきである。
【００６５】
しかし、通常、以下の実施例で記載する結果に基づくと、ｉｎ ｖｉｖｏで筋細胞にＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをＡＡＶ送達することに関係した細胞変性又は他の有害な影響を生じる危険性は低いようであり、野生型のベクターの混入物を排除すること及び他の方法によって（リポソームによるベクターのカプセル化などによって）ベクターの免疫原性を低減させることによって最小限に抑えることができる。
【００６６】
Ｅ．本発明の方法を試験するための動物モデル
ラットが、その心臓には側副循環がないが、ヒトＣＨＦの状態を満足できる程度に予測できる、うっ血性心不全の再現性のある実験モデルであることが明らかになった。特に、冠動脈の外科的結紮を受けたラットは、ヒトの心筋梗塞後のＣＨＦの特に良いモデルである。ＣＨＦ動物モデルとしてのラットを作製及び使用するための実験プロトコールは、当技術分野で十分に記載されており、参照文献については、当業者なら、Ｐｆｉｅｆｆｅｒ他、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、７６：９９〜１０３、１９８４年；Ｊｏｈｎｓ及びＯｌｓｅｎ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、１４０：６７５〜６８２、１９５４年；並びに、Ｓｅｌｙｅ他、Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ、１１：３９８〜４０７、１９６０年（その開示内容を、ＣＨＦ動物モデルの開発及び使用に関する当技術分野の知識を例示するために参照により本明細書に組み込む）を参照できよう。さらに、甲状腺の状態が減退したマウス、又は心臓の収縮性が低減しカルシウムトランジェントが遅くなっている甲状腺機能低下マウスも、再現性のある実験モデルとして使用することができる。
【００６７】
さらに、本発明の方法によってＳＥＲＣＡ２活性を増大させたＣＨＦ心臓における心臓性能への効果を特に予測するトランスジェニック動物モデルが開発された。これらの（ＳＥＲＣＡ２導入遺伝子を発現する）トランスジェニック動物を複製するのに有用なプロトコールを以下に記載し、実施例１で説明する。このプロトコールは、発現可能な導入遺伝子を哺乳動物に導入するための従来技術におおむね従う。当技術分野の当業者なら、これらの適用例を熟知しており、過度に実験をすることなく本発明の状況でそれらの技術を適用することができよう。
【００６８】
例えば、様々な発達段階の胚性の標的細胞を、導入遺伝子を導入するのに使用することができる。胚性の標的細胞の発達段階に応じて様々な方法が使用される。受精卵は、マイクロインジェクションの最も良い標的である。マウスでは、オスの前核の大きさは直径約２０マイクロメートルに達するので１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液を複製可能に注入することができる。遺伝子移入の標的として受精卵を使用することは、多くの場合注入されたＤＮＡが第一卵割の前に宿主遺伝子に組み込まれることになるという点で、大きな利点がある（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４４３８〜４４４２、１９８５年）。その結果、トランスジェニック非ヒト動物の全細胞が、組み込まれた導入遺伝子を持つことになる。これはまた、通常、生殖細胞の５０％がその導入遺伝子を含むことになるため、初代の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達として反映されることにもなる。受精卵のマイクロインジェクションは、本発明を実施する際に導入遺伝子を組み込むための好ましい方法である。
【００６９】
レトロウイルス感染も、非ヒト動物に導入遺伝子を導入するのに使用することができる。発達途中の非ヒト胚は、胚盤胞段階までｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。この間、割球をレトロウイルス感染の標的とすることができる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、７３：１２６０〜１２６４、１９７６年）。酵素処理によって透明帯を除去することにより、割球の効率的な感染が得られる（Ｈｏｇａｎ他、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、米国ニューヨーク州、１９８６年）。導入遺伝子を導入するのに使用するウイルスベクター系は、通常、この導入遺伝子を含む複製欠損型レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６９２７〜６９３１、１９８５年；Ｖａｎｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ 他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２：６１４８〜６１５２）。ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって、容易に且つ効率的にトランスフェクションが得られる（前述のＶａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ；Ｓｔｅｗａｒｄ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３８３〜３８８、１９８７年）。
【００７０】
或いは、もっと後の段階で感染を実施してもよい。ウイルス又はウイルス産生細胞を分割腔に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９８：６２３〜６２８、１９８２年）。組込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の一部分でしか起こらないため、初代のほとんどは、導入遺伝子についてモザイク状となる。さらに、初代は、通常子孫に分かれていくゲノムの様々な位置に、導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入物を含むことができる。さらに、効率は低いが、妊娠中期の胚に子宮内でレトロウイルスを感染させて生殖細胞系に導入遺伝子を導入することも可能である（前述のＪａｈｎｅｒ他、１９８２年）。
【００７１】
導入遺伝子を導入するための第３の標的細胞は、胚性肝細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、着床前の胚から得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し胚と融合される（Ｅｖａｎｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１５４〜１５６、１９８１年；Ｂｒａｄｌｅｙ他、Ｎａｔｕｒｅ、３０９：２５５〜２５８、１９８４年；Ｇｏｓｓｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８３：９０６５〜９０６９、１９８６年；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：４４５〜４４８、１９８６年）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション又はレトロウイルスの媒介による形質導入によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。その後に、これらの形質転換されたＥＳ細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞に結合させることができる。ＥＳ細胞は、その後、胚に定着し、結果として得られるキメラ動物の生殖系の一部になる（総説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１４６８〜１４７４、１９８８年を参照のこと）。
【００７２】
本発明の状況で動物モデルとして使用するために、最適の導入遺伝子は、ＳＥＲＣＡ２の比較的高い発現レベルをもたらすことができるプロモーターを含むものが好ましい。この点で使用するのに好ましいプロモーターは、β−アクチンイントロンを含む、（例えば鳥類由来の）β−アクチンプロモーターに連結したヒトＣＭＶエンハンサーである。導入遺伝子の発現活性を検出するために、前述したフラッグ抗原エピトープのコード領域を、ＳＥＲＣＡ２のＣ末端領域をコードする導入遺伝子の領域に含ませた。実施例１で説明するように、導入遺伝子を発現した初代動物の子孫は成体になるまで生存し、導入遺伝子が初代系列の少なくとも約１５％の子孫に含まれていると予想できる。
【００７３】
Ｆ．ＳＥＲＣＡ２の発現をＩＮ ＶＩＶＯでモニターする方法
ＳＥＲＣＡ２の発現をモニターするために、本発明に従って宿主に導入されるＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを、既知のレポーター遺伝子を含むように改変してよい。例えば、Ｎｏｒｔｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：２８１、１９８５年に記載のｐＲＳＶ ｌａｃ−Ｚ ＤＮＡベクターは、蛋白質発現とともにβ−ガラクシターゼを産生する。ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（「ＣＡＴ」；ｐＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドの構築については、例えば前述のＧｏｒｍａｎ他を参照のこと）も使用できる。別の有用なレポーター分子は、免疫測定法で容易に検出することができるフラッグ抗原性ペプチドである。フラッグ抗原性ペプチドの８個のアミノ酸配列及びそれをコードする領域は、当技術分野で既知である。この点に関して参照するためには、当業者なら、Ｃｈｉａｎｇ他、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．、６：６２〜６４、１９９３年を参照できよう。（例えば、開始コドンから約１５塩基対の位置に遺伝子を挿入することにより）コード用のレポーター遺伝子をＳＥＲＣＡ２蛋白質のＣ末端に挿入しても、ＳＥＲＣＡ２触媒活性は妨害されない。このようなレポーター遺伝子の発現を検出する手段は当技術分野で公知であり、詳細には記載しないが、以下に要約する。
【００７４】
例えば、本発明に従ってＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを導入した後にｉｎ ｖｉｖｏで発現されたＳＥＲＣＡ２を、免疫測定法によって検出することができる。この免疫測定法では、ＳＥＲＣＡ２蛋白質を液相中で利用し又は固相担体に結合させることができる。さらに、これらのアッセイで利用するＳＥＲＣＡ２蛋白質は、様々な方法で検出可能に標識することができる。さらに、ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に対する抗体を、血液や血清などのアッセイ試料中でのＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチド発現を検出するために利用することもできる。
【００７５】
簡単に言うと、このような抗体は、当技術分野で公知の手段によって調製することができる。例えば、ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に特異的な抗体は、抗原性のＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子ペプチドで非ヒト生物を免疫することによって調製することができる。このようなペプチドは天然の供給源から単離することができ（例えば、総説としてその開示内容を本明細書に組み込んだＰｏｐｏｖｉｃｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６１：Ｅ３７７〜Ｅ３８１、１９９１年に報告されているラットＳＥＲＣＡ２を単離するのに使用された方法を参照のこと）、或いは、α−アミノ基のｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣ保護などの通常使用される方法により、過度に実験をすることなく合成することもできる。
【００７６】
後者の方法は、ペプチドのＣ末端から出発して、各段階で１つのアミノ酸が加えられる段階的合成である（Ｃｏｌｉｇａｎ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、９９１、ユニット９を参照のこと）。この場合に使用するペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９、１９６２年、並びにＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ、固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、２７〜６２、１９６９年）に記載されているものなど様々な公知の固相ペプチド合成方法により、ポリマー１ｇ当たり０．１〜１．０ｍＭｏｌのアミンを含む共重合体（スチレン−ジビニルベンゼン）を使用して、合成することができる。
【００７７】
化学合成が完了するとすぐに、０℃で約１／４〜１時間、フッ化水素酸１０％アニソール液で処理することにより、ペプチドを脱保護しポリマーから切断することができる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを１％酢酸溶液でポリマーから抽出し、次いで凍結乾燥させて未精製物質を得る。通常、溶媒として５％酢酸を使用するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５を用いたゲル濾過などの技術によってこれを精製することができる。カラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチド又はペプチド誘導体が得られ、これらは、次いで、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度などの標準の技術により特徴を明らかにし、固相エドマン分解法によって定量することができる。目的のペプチドの抗原性は、そのペプチドで免疫された動物の抗体反応の大きさを判定する従来技術によって決定することができる。
【００７８】
抗原性のＳＥＲＣＡ２ペプチドを調製した後で、（ウサギ、マウス、又はラットなどの）哺乳動物にペプチドを導入することにより、免疫ペプチドに対する抗体を作製する。複数回注入による免疫化プロトコールが、抗原性ペプチドで動物を免疫する際に使用するのに好ましい（例えば、Ｌａｎｇｏｎｅ他編、「小用量の免疫原生物による抗血清の調製：皮内複数回注入（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｗｉｔｈ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、１９８１年を参照のこと）。例えば、フロイント完全アジュバントに乳濁させた１ｍｇの抗原性ペプチドを皮内注射し、その数週間後にフロイント不完全アジュバント中の同じ抗原を１回又は複数回追加することにより、通常、ウサギで良い抗体反応が得られる。
【００７９】
望むなら、免疫ペプチドは、当技術分野で公知の技術を使用して結合することにより、キャリア蛋白質に結合させてよい。ペプチドに化学的に結合されるこれらの普通に使用されるキャリアには、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び破傷風トキソイドが含まれる。次に、結合されたペプチドを使用して動物（例えばマウス又はウサギ）を免疫する。ＳＥＲＣＡ２は、現在、哺乳動物種間でかなり良く保存されていると考えられているので、ＳＥＲＣＡ２蛋白質の免疫原性を増大させるためにキャリア蛋白質を使用することが好ましい。
【００８０】
動物に産生されたポリクローナル抗体を、例えば、抗体が産生された対象のペプチドが結合されているマトリクスに結合させ、マトリクスから溶出させることによって、さらに精製することができる。当業者なら、ポリクローナル抗体、並びにモノクローナル抗体の精製及び／又は濃縮に関する免疫学分野では普通の様々な技術について知っていよう（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他、ユニット９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１年を参照のこと）。
【００８１】
モノクローナル抗体は、特異性があり調製が容易であるため、ＳＥＲＣＡ２発現の検出に使用するのに好ましい。モノクローナル抗体を調製するためには、マウス又はラットの免疫が好ましい。本発明で使用する「抗体」という用語は、無傷の分子、並びに、例えば、エピトープ決定基を結合することができるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２’などのその断片も含むものとする。また、この文脈では、「本発明のｍＡｂ’ｓ」という用語は、ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に特異的なモノクローナル抗体を意味する。
【００８２】
モノクローナル抗体（「ｍＡｂ’ｓ」）を分泌するハイブリドーマの調製に使用する通常の方法は、公知である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５年）。簡単に言うと、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎに記載のように、この技術は、外科的検体から得、プールし、次いでＳＨＦＰ−１に融合させた、黒色腫、奇形癌、子宮頸癌、神経膠腫、又は肺癌である５名の別々の癌患者の排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）所属リンパ節から単離したリンパ球を含む。ハイブリドーマは、癌細胞系に結合する抗体を産生するかどうかでスクリーニングした。
【００８３】
ｍＡｂ’ｓの抗原特異性の確認は、（酵素結合免疫測定法、即ち「ＥＬＩＳＡ」などの）比較的よく使うスクリーニング技術を使用して目的のｍＡｂの基本的な反応パターンを判定することによって、実現できる。あるｍＡｂを評価して、本発明のｍＡｂと同じ特異性を有するかどうか判定することも、前述のように単離した目的の抗原に本発明のｍＡｂが結合するのを試験対象のｍＡｂが妨げるかどうか判定することによって、過度に実験をすることなく、可能である。本発明のｍＡｂによる結合の低減により試験対象のｍＡｂが本発明のｍＡｂに競合することが示される場合は、それら２種のモノクローナル抗体が同じ或いは密接に関係するエピトープに結合する可能性が高い。
【００８４】
あるｍＡｂが本発明のｍＡｂの特異性を有するかどうか判定するさらに別の方法では、本発明のｍＡｂを通常反応性の抗原と一緒にプレインキュベートし、試験対象のｍＡｂがその抗原に結合する能力を阻害されるかどうか判定する。そのとき試験対象のｍＡｂが阻害される場合は、高い確率で、本発明のｍＡｂと同じ或いは密接に関係するエピトープ特異性がある。
【００８５】
ＭＨＣα及びＭＨＣβに共通するエピトープを認識するＳＥＲＣＡ２モノクローナル抗体は、検出するＳＥＲＣＡ２の構造が本質的に改変されていないかどうか判定するのに特に有用である。このようなｍＡｂ’ｓは、その開示内容を総説及び参考文献として使用するために本明細書に組み込んだ、Ｄｏｒｎ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６７：Ｈ４００〜Ｈ４０５、１９９４年に、再現するのに十分な詳しさで記載されている。
【００８６】
ＳＥＲＣＡ２発現を検出するために使用できる免疫測定法の例は、直接式又は間接式の競合及び非競合免疫測定法である。このような免疫測定法の例は、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、サンドイッチ法（イムノメトリックアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ））、及びウェスタンブロット法がある。ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に結合する抗体の検出は、生理試料の免疫組織化学的分析を含めて、順方向、逆方向、又は同時に両方向に作動する免疫測定法を利用して実施することができる。ｌａｃ−Ｚ又はβ−ｇａｌ（例えば、β−ガラクトシダーゼ）などのレポーター遺伝子産物を検出するための市販の分析キットが、この点で、使用するのに特に好ましい。
【００８７】
使用する抗原又は抗体の濃度は、免疫測定法のタイプ及び使用する検出可能な標識の性質に応じて変わる。しかし、使用する免疫測定法のタイプにかかわらず、利用する抗原又は抗体の濃度は、当業者が常法の実験を実施して容易に決定することができる。
【００８８】
このような抗原又は抗体は、多数の様々なキャリアに結合し、それに特異的に反応する抗原又は抗体の存在を検出するのに使用することができる。公知のキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びに磁鉄鉱が含まれる。本発明では、キャリアの性質は可溶性でも不溶性でもよい。当業者なら、これに関して、使用するのに適した他のキャリアについて知っているか、常法の実験を実施してそれらを確認することができよう。
【００８９】
当業者には既知の多くの様々な標識及び標識方法がある。本発明で使用できる標識のタイプの例には、酵素、ラジオアイソトープ、コロイド金属、蛍光性化合物、化学発光化合物、及び生物発光化合物が含まれる。
【００９０】
或いは、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドは、その一般的技術を以下に要約する、当技術分野で既知の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコールを使用して（好ましくは従来の心臓組織の生検技術を使用して得た標的細胞試料中で）検出することができる。
【００９１】
精製又は未精製の任意の組織標本に由来する核酸を、それが標的核酸を含む特定の核酸配列を含む又は含むと推測されることを条件として、１種又は複数の出発核酸として利用することができる。従って、このプロセスは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含めて、ＤＮＡ又はＲＮＡを使用してよく、ＤＮＡ又はＲＮＡは１本鎖でも２本鎖でもよい。ＲＮＡを鋳型として使用する場合は、その鋳型をＤＮＡに逆転写するのに最適な酵素及び／又は条件を利用することになる。さらに、それぞれ１本の鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドも利用してよい。また、核酸の混合物を使用しても、以前の増幅反応で同じ又は別のプライマーを使用してここで作製した核酸をそのように使用してもよい。増幅するヌクレオチド配列は、大分子の一部分でもよく、或いは、別々の分子として最初に存在することもでき、従って、この特定の配列が核酸全体を構成する。増幅する配列は、最初に精製した形で存在する必要はなく、ヒトＤＮＡ全体に含まれるような複雑な混合物のごく一部分でよい。
【００９２】
試料の標的ヌクレオチド配列が２本の鎖を含む場合、鋳型として使用できるように核酸の鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、別々のステップとして又はプライマー伸張生成物の合成と同時に実施することができる。この鎖の分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含めて、様々な適切な変性条件を使用して実現することができる。「変性させる」という語は、これら全ての手段を含む。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は、核酸を変性するまで加熱するものである。通常の加熱変性は、約１〜１０分間、約８０〜１０５℃の温度を必要とする。鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られている酵素群のうちの１つの酵素又はヘリカーゼ活性のある酵素ＲｅｃＡにより、ＤＮＡを変性することが知られているリボＡＴＰの存在下で誘導してもよい。ヘリカーゼを用いた核酸鎖の分離に適した反応条件は、Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ（ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３：６３、１９７８年）に記載されており、ＲｅｃＡを使用する技術はＣ．Ｒａｄｄｉｎｇ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：４０５〜４３７、１９８２年）に総説がある。
【００９３】
増幅する標的核酸を含む核酸が一本鎖の場合、１種又は２種のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることにより、その相補鎖が合成される。単一のプライマーを利用する場合は、プライマー、重合用作用物質、及び後述する４種のヌクレオシド３リン酸の存在下で、プライマー伸長生成物を合成する。この生成物は、一本鎖核酸に相補的なものとなり、一本鎖核酸にハイブリダイズして、長さが不揃いな鎖の二重鎖を形成する。次にこの二重鎖を一本鎖に分離させて、一本に分離された相補鎖２本を生成することができる。或いは、２種のプライマーを一本鎖核酸に加え、記載したように反応を実施してもよい。
【００９４】
核酸の相補鎖を分離すると、その核酸がもともと二本鎖であったか一本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は、追加の核酸鎖を合成するための鋳型としていつでも使用できる。この合成は、プライマーが鋳型にハイブリダイズできる条件の下で実施する。通常、合成は好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくはｐＨ８の緩衝水溶液中で実施する。過剰モル（ゲノム核酸の場合、通常、プライマーと鋳型の比が約１０８対１）の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離された鋳型鎖を含む緩衝液に加えることが好ましい。しかし、本発明のプロセスを診断で適用するのに使用する場合は、相補鎖の量が分からない可能性があり、従って、相補鎖に対するプライマーの量を確実に決定することはできない。しかし、増幅しようとする配列が複雑で長い核酸鎖の混合物に含まれるとき、実用的には、加えるプライマーの量は通常、相補鎖（鋳型）の量に対して過剰モルである。プロセスの効率を高めるためには、大過剰モルが好ましい。
【００９５】
いくつかの増幅実施形態では、基質、例えばデオキシリボヌクレオチド３リン酸のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰを適量、プライマーと別に又は一緒に、合成混合物に加え、得られる溶液を約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間、約９０〜１００℃に加熱する。この加熱期間の後、溶液をプライマーのハイブリダイズにとって好ましい室温まで自然冷却させる。冷却した混合物に、プライマー伸長反応を実施するのに適した作用物質（本明細書では「重合用作用物質」と呼ぶ）を加え、当技術分野で既知の条件下で反応を起こさせる。重合用作用物質は、熱安定性である場合は、他の試薬とともに加えてもよい。この合成（即ち増幅）反応は、室温から、最高ではそれを超えると重合用作用物質が機能しなくなる温度までで行うことができる。従って、例えばＤＮＡポリメラーゼが作用物質として使用される場合は、通常、温度は約４０℃以下である。
【００９６】
重合用作用物質は、酵素を含めて、プライマー伸長生成物の合成を実現するように機能するどんな化合物又は系でもよい。この目的に適した酵素には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異蛋白質、逆転写酵素、リガーゼ、及び、熱安定性酵素（即ち、変性を引き起こすのに十分な高い温度下に置かれた後でも、プライマー伸長を行う酵素）を含めて、他の酵素が含まれる。適切な酵素を使用すると、ヌクレオチドの正しい組み合わせがうまく進み、各変異ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長生成物が形成される。通常、合成は各プライマーの３’末端で開始され、合成が終わるまで鋳型鎖に沿って５’方向に進行し、様々な長さの分子を生成する。しかし、前述したのと同じプロセスを使用して、５’末端で合成を開始し、別の方向に進行する重合用作用物質があるかもしれない。
【００９７】
新しく合成された変異ヌクレオチド及びその相補的な核酸鎖は、前述のハイブリダイズする条件下で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドをプロセスの後続のステップで使用する。次のステップでは、新しく合成された二本鎖分子を前述した手順のいずれかを使用して変性条件において、一本鎖分子を生成させる。
【００９８】
上記のプロセスを一本鎖分子に対して繰り返す。反応が先に規定した条件下で進行するように、必要なら、追加の重合用作用物質、ヌクレオシド、及びプライマーを加えてよい。やはり、合成各オリゴヌクレオチドプライマーの一端で開始され、鋳型の一本鎖に沿って進行し、追加の核酸を生成する。このステップの後、伸長生成物の半分は、２種のプライマーが結合した特定の核酸配列からなるはずである。
【００９９】
変性及び伸長生成物合成のステップは、標的の変異ヌクレオチド配列を検出に必要な量まで増幅するのに必要なだけ繰り返すことができる。生成される変異ヌクレオチド配列の量は、指数関数的に増加する。
【０１００】
増幅した生成物は、放射性プローブを使用せずに、サザンブロット分析により検出することができる。このようなプロセスでは、例えば、標的ヌクレオチド配列を極めて低いレベルで含むＤＮＡの少量のサンプルを増幅し、サザンブロット法により分析する。シグナルが高レベルで増幅されると、非放射性プローブ又は標識の使用が容易になる。
【０１０１】
定量的ＰＣＲを実施するための好ましい方法は、１種又は複数の塩基対に誘導された突然変異を含み、その結果、配列及び大きさが標的の鋳型遺伝子と異なる競合物になった競合鋳型を使用して実施する競合的ＰＣＲ法である。プライマーのうちの１種をビオチン標識し、或いは、好ましくは、結果として得られるＰＣＲ生成物の一方の鎖（通常アンチセンス鎖）を、アミノ−カルボキシル、アミノ−アミノ、ビオチン−ストレプトアビジン、又は他の適度に緊密な結合によって、適切な反応物に緊密に結合された固相の支持体に固定化できるように、アミノ化する。ＰＣＲ生成物、固相の支持体、及び反応物の間の結合が共有結合であり、従って、変性条件下で結合を解けにくいものにすることが最も好ましい。
【０１０２】
ＰＣＲ生成物のアミノ化又はビオチン標識した鎖を固定化した後、結合していない相補鎖をアルカリ性の変性洗浄液中で分離し、反応環境から除去する。標的に対応する配列特異的なオリゴヌクレオチド（「ＳＳＯ’ｓ」）及び競合核酸を検出タグで標識する。次に、ＳＳＯを、除去された結合していないセンス鎖との競合が無い状況でアンチセンス鎖にハイブリダイズさせる。適切な分析試薬を加え、使用した検出タグ及び固相支持体の手段に適したＥＬＩＳＡ測定法、好ましくはＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーによって、ハイブリダイゼーションの程度を測定する。標的鋳型及び競合鋳型を含む鋳型を増幅するＰＣＲ反応から別々に得られた標準曲線を用いて測定値を比較して、標的の核酸含有量を導出する。
【０１０３】
この方法は、定量的で、ＰＣＲサイクルの数によって変わらず、ＳＳＯプローブとＰＣＲ生成物の相補鎖との競合に影響を及ぼされないという点で有利である。
【０１０４】
或いは、重合ステップ及びハイブリダイゼーションの全ステップを固相の支持体上で実施することもできる。この方法では、固相支持体上に捕捉されるのは、ＰＣＲ生成物の鎖ではなく、ヌクレオチド重合プライマー（好ましくはオリゴヌクレオチド）である。次に、標的及び競合核酸ＰＣＲ生成物を、溶液の状態で固相支持体に加え、重合ステップを実施する。重合生成物の結合されていないセンス鎖を、前述の変性条件下で除去する。
【０１０５】
標的核酸と競合核酸の比を、適切な測定手段（好ましくはＥＬＩＳＡリーダー）を使用して標識されたオリゴヌクレオチドＳＳＯプローブを検出することによって決定することができる。この方法の効率は非常に高くできるため、重合ステップの連鎖反応が不必要になり、従って、この方法を実施するために必要な時間が短縮できる可能性がある。重合の最終生成物をハイブリダイゼーションのために反応管から固相支持体に移動させる必要がなく、従って、それらが損失又は損傷する潜在的可能性が限られてくるため、この方法の正確性も高くなっている。しかし、特定の試料にとって必要なら、ＰＣＲを使用して標的及び競合核酸を別々の反応管で増幅させ、続いて固相支持体上で最終の重合反応を実施してよい。
【０１０６】
結合したＰＣＲ生成物の形成を示す、当業者に既知の様々な検出可能のシグナルを提供することができる分子（標的及び競合ＰＣＲ生成物の形成を示す別の色を呈する、標識したヌクレオチド発色団など）を、反応の最後の数サイクルの進行中に反応溶液に加えることができる。標的核酸と競合核酸の比は、ＥＬＩＳＡによって又は他の適切な測定手段及び固定化したハイブリダイゼーションプライマーの３’末端に結合させた検出タグに反応する試薬によって、求めることができる。この方法は、従来の非競合的ＰＣＲプロトコールを実施することによって、（定量せずに）特定の遺伝子が試料中に存在するかどうか検出できるように適合させることもできる。
【０１０７】
当業者なら、前述の方法で使用するのに適したプライマーを選択する方法を知っているか、容易に確認できよう。前述の技術に関するさらに詳細な内容については、Ｋｏｈｓａｋａ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：３４６９〜３４７２、１９９３年；Ｂｕｎｎ他、米国特許第５，２１３，９６１号の開示内容、並びにＩｎｎｉｓ他、ＰＣＲプロトコール：方法と適用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、１９９０年を参照できよう。これらの開示内容は、定量的ＰＣＲプロトコールに関する当技術分野の状況を例示するためだけに、本明細書に組み込む。
【０１０８】
ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：１００８〜１０１２、１９８５年）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２７８、１９８３年）、オリゴヌクレオチドライゲーション分析（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７、１９８８年）などの、特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用されるどんな方法によっても、前述したように検出したＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをさらに、溶液の状態で又は固体支持体に結合させた後で、評価、検出、クローン化、配列決定などすることができる。ＤＮＡ分析に関する分子技術の総説があり、当技術分野で公知である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：２２９〜２３７、１９８８年）。
【０１０９】
本発明を十分に説明してきたが、その実施を例示する実施例を以下に記載する。しかし、これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【０１１０】
実施例において、略語「ｍｉｎ」は分を、「ｈｒｓ」及び「ｈ」は時間を意味し、（ｍｌなどの）測定単位は標準の略語によって示す。
【実施例１】
【０１１１】
ＡＡＶベクターによるＳＥＲＣＡ２のクローニング及び発現並びにマウス心筋の心筋細胞機能の評価
ＳＥＲＣＡ２ ｃＤＮＡを従来のクローニング技術を使用してアデノ随伴ウイルスベクター中にクローニングした。ＳＥＲＣＡ２を発現するアデノ随伴ウイルス又はＧＦＰレポーター配列の構築は、基本的に以下のように実施した。
【０１１２】
アデノ随伴シャトルベクターをＳａｍｕｌｓｋｉ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３：３８２２〜３８２８、１９８９年に記載されているプラスミドｐＳｕｂ２０１から誘導した。このプラスミドのＸｂａ Ｉ断片を、マルチクローニングサイト及びポリアデニル化シグナルの前にある５７２塩基対のヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター断片に連結した。このプラスミドをＡＡＶ−シャトルと呼び、サイズは約５０００塩基対である。
【０１１３】
３’末端でフラッグシグナルペプチドに融着させたラットＳＥＲＣＡ２ａ、及びＫｐｎ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ酵素又はＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ酵素を使用してＡＡＶ−シャトル中にクローニングした緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のコード配列が、それぞれ報告されている（Ｈｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １００：９７４〜９８０、１９９９年）。組換えクローンをＤＮＡ配列決定により確認し、大量のプラスミドをＣｓＣｌ大量調製（ｍａｘｉｐｒｅｐ）プロトコールによって精製した。プラスミドｐＤＧはＧｒｉｍｍ他によって記載されており（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２７４５〜２７６０、１９９８年）、同様にＣｓＣｌ精製した。
【０１１４】
純粋な感染性ウイルス粒子を生成するために、挿入されたｃＤＮＡを含むＡＡＶ−シャトルプラスミド及びｐＤＧプラスミドを共に、ＣａＰＯ４共沈法を使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。各ウイルス調製物のために、サブコンフルエントな２９３Ｔ細胞を蒔いた直径１５ｃｍの５０セル培養プレートを使用した。各１５ｃｍプレートに、１８マイクログラムのシャトルプラスミド及び７０マイクログラムのｐＤＧプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日に１０％ウシ胎児血清を含む新鮮なＤＭＥＭに培地を変更し、細胞を、５％ＣＯ２、摂氏３７度でさらに２日間インキュベートした。
【０１１５】
ウイルス粒子の回収は、２．５ｍｌのＤＭＥＭ中で各プレートから２９３Ｔ細胞をかきとることによって行った。次に、この細胞を遠心し、２５ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁させ、摂氏−８０度で凍結させた。さらに２回の凍結融解サイクルの後、１００マイクログラムのＤＮアーゼ Ｉ及びＲＮアーゼ Ｈを加え、懸濁液を摂氏３７度で３０分間インキュベートした。もう一度３０００ｇで遠心した後、上清を０．５％デオキシコレートに加え、摂氏３７度で３０分間インキュベートした。次に、この溶液を、５マイクロメーター及び０．８マイクロメーターのシリンジフィルターに順番に通して濾過し、３ｍｌのヘパリン−アガロース懸濁液とともに室温で１時間回転台の上で回転させた。次に、この懸濁液をガラスカラムの上に載せ、ヘパリン−アガロース樹脂を０．２５４Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ２５ｍｌで洗浄した。洗浄後、ウイルス粒子を０．５５４Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで溶出し、タイター評価のために少量の画分で保存した。最高のタイターの画分をプールし、ＰＢＳで透析し、摂氏４度で保存した。クローニングスキーム及び適切な制限部位の略図を図４に示す。
【０１１６】
次に、甲状腺機能低下マウスの左心室壁にウイルスベクターを投与した。甲状腺の状態が減退したマウス又は甲状腺機能低下マウスは、心臓の収縮性が低減しカルシウムトランジェントが遅くなっている。アデノウイルスベクターを、５〜１０μｌのアリコートで送り込み、左心室壁の異なる５つの部分に注入した。
【０１１７】
標的の導入遺伝子を含むＡＡＶの発現効率は一定で、当技術分野で公知である。これにより、心筋細胞の約５０％で導入遺伝子が発現する。核コードβＧａｌを発現するＡＡＶ又はアデノ随伴ウイルスをマウスの心臓の左心室自由壁に注入することによっても、同様の結果が得られた（図５）。ここでは、アデノウイルス又はＡＡＶ注入の２、４、６、又は８週間後に動物を屠殺した。マウスの心臓からのデータにより、ＡＡＶの強い発現は注入後６又は８週間持続するが、アデノウイルスの発現は有意に低減したことが示されている。
【０１１８】
ＳＥＲＣＡ２発現ＡＡＶベクターの注入４週間後に、いわゆるランゲルドルフ単離灌流装置で心臓の収縮性能を判定した。肺静脈を通して左心室に風船を挿入し、収縮機能、特に収縮期の圧力上昇又はｄＰ／ｄｔの最高値、拡張期の圧力低下又はｄＰ／ｄｔの最小値、及び収縮期全体の圧力を、対照としてＧＦＰ ＣＲＥを発現するＡＡＶを注入した心臓で判定した。甲状腺機能低下性マウスの心臓において、全ての収縮性周辺部で非常に有意な上昇が得られ、収縮機能が正常範囲に回復した。図６は、フラッグ標識したＳＥＲＣＡ２を発現するＡＡＶを注入した甲状腺機能低下性マウスから単離したマウス心臓の収縮性能についてのデータを示す。収縮期の収縮速度ｄＰ／ｄｔの最大値は、ＧＦＰ発現ＡＡＶを注入したマウスと比べて、有意に上昇した。同様に、拡張期の弛緩速度即ち−ｄＰ／ｄｔは、ＡＡＶ ＳＥＲＣＡを注入された甲状腺機能低下性マウスで有意に上昇し、収縮期圧力も、ＳＥＲＣＡ２ａを発現するＡＡＶを注入したマウス心臓で有意に上昇した。
【実施例２】
【０１１９】
ＳＥＲＣＡ２発現トランスジェニック動物及び対照動物における圧力過負荷モデル及び心臓肥大モデル
ＣＨＦ心臓の条件を模倣した条件下で導入遺伝子を含む動物におけるＳＥＲＣＡ２の追加発現の効果を試験するために、性別、年齢、体重が同程度の動物群を処理して、心臓狭窄を誘発させ、腹大動脈狭窄を発症させ、食塩負荷させた。ＣＨＦ心臓で顕著なこのような条件下で、これらの動物は心肥大（ＣＨ）を発症し、心臓への圧力過負荷（ＰＯ）に伴う心臓異常を起こす。導入遺伝子発現を心臓組織に対して特異的にするために、ＳＥＲＣＡ２ ＣＭＶ／β−アクチントランスジェニック動物を使用した。
【０１２０】
簡単に言うと、このような動物を開発するために、実施例１で記載したＳＥＲＣＡ２／ＡＡＶベクター構築体を使用して開発したトランスジェニック動物（体重約２００〜２５０ｇのラット）及び対照の動物を腹腔動脈のレベルで腹大動脈を分離するために麻酔し、トランスジェニック動物では、ステンレススチール製のヘモクリップ（Ｅｄｗａｒｄ Ｗｅｃｋ＆Ｃｏ．、ノースカロライナ州）を使用して腎動脈の上で大動脈を外科的に狭窄した。後者の手順により、大動脈管腔の大きさが約５０％小さくなった。
【０１２１】
手術の約２日後から、大動脈を狭窄したトランスジェニック動物に、ゴマ油に懸濁させたデオキシコルチコステロンを１週２回筋肉内注射し（２５ｍｇ／ｇ体重）、飲料水中１％塩化ナトリウムを与えた。通常は手術後１〜２週間内に生じるＣＨを発症するかどうか、全ての動物を心臓超音波（心エコー検査）を用いてモニターする。さらに、これらの動物は、圧力過負荷をかけることにより急性の損傷期を経験させる。
【実施例３】
【０１２２】
トランスジェニック動物におけるＣＨＦ状態に対する適応反応
ＡＡＶ／ＳＥＲＣＡ２構築体を使用して開発したトランスジェニック動物は、手術の６週間後に試験すると（ＳＥＲＣＡ２のｍＲＮＡレベルを検出して判定された）ＳＥＲＣＡ２遺伝子転写が有意に減少し、通常、１０〜１２週で心不全を発症し始める。ＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡレベル及び蛋白質レベルを、前述のノーザンブロット法及びウェスタンブロット法又は他の分析技術（例えば、やはり前述したＰＣＲ）によって決定した。トランスジェニック動物及び対照動物の（ＳＲカルシウムトランジェントに関係している）酵素活性レベル及び左心室機能を下記に記載するように測定した。他のＣＨＦ動物モデル及び本発明の方法による治療を受けているヒトにおいて、以下に記載するプロトコールに従って、心臓性能に関する同じパラメータを測定することができる。
【０１２３】
心臓収縮機能の評価
Ａ．心室の機能性を判定するための心エコー検査のプロトコール（ｉｎ ｖｉｖｏ）
心エコー図の撮像は、７Ｍｈｚで作動する２周波フェーズドアレイトランスデューサー、及び積算ドプラー出力機能を備えた「ＡＣＣＵＳＯＮ（登録商標）」１２８超音波コンソールを用いて、適切な動物モデルで実施する。心エコー事象のタイミングは、皮下電極から得られる同時の心電図記録と相関がある。撮像の深さは２ｃｍ、セクタ角度はフレームレートが５０／秒になる６０にセットする。パワー設定は７５ｄＢとする。２次元イメージを使用して、Ｍモード記録（１０００ライン／秒で得られる）に適したカーソル位置を選択することができる。
【０１２４】
軽く麻酔した動物をうつ伏せに置き、胸骨近くの左の肋間隙を通して撮像を実施する。傍胸骨長軸図及び短軸図を得、ビデオテープに録画し、上述したように、２次元図を使用して心室の中央レベルで実施するＭモード記録のためのカーソル位置を導く。全ての関連した測定値は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ推奨の臨床的慣行に関する判断基準を使用して、２次元化したＭモード記録から得ることができる。隔壁の厚さは、拡張末期における立ち上がりから立ち下がりまでを測定する。
【０１２５】
後壁心内膜は、収縮期の傾きの最も大きい線で特定され、拡張末期における後壁の立ち上がりから心外膜境界の立ち上がりまでを測定する。左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）は、心室径が最大の時点で、心室中隔の立ち下がりから後壁の立ち上がりまでを測定する。左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）は、同じ判断基準を用いて、心室径が最小の時点で測定する。収縮機能の指標としての心室内径短縮率（ＦＳ）は、［（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／（ＬＶＥＤＤ ０）］×１００で算出する。
【０１２６】
Ｂ．試料液を抜き取り、心臓内の血行動態パラメータを決定するためのマイクロマノメータ付きカテーテルによる処置のためのプロトコール（ｉｎ ｖｉｖｏ）
マウスを例にすると、体重２０〜３０ｇの成体マウス（ＰＯ有り又は無しの対象及びトランスジェニック）をケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与（ＩＰ））及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与（ＩＰ））の混合物で麻酔する。解剖顕微鏡下で、動物をうつ伏せにし、正中線頚部切開を行って気管及び頚動脈を露出させる。次に、２０ゲージの鈍針を、総（ｔｉｔａｌ）容量０．２ｍｌ、呼吸数１００／分のボリュームサイクル方式げっ歯類用人工呼吸器（ハーバードアパレイタス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）社製）に連結されている気管カニューレを補助するように気管に通す。換気の妥当性を、胸部の膨張を目視検査して判定する。挿管後、大動脈圧を測定するために、１本の頚動脈に、液体入りカテーテル（管状になるよう火炎で延伸したポリエチレン（ＰＥ））付きカニューレを挿入する。次に、胸部を開き、２Ｆ高忠実度のマイクロマノメータ（ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）社）を僧帽弁から挿入して、ＬＶ中に取り付ける。
【０１２７】
（例えば、オンライン検出装置を使用して）ＬＶ収縮期圧力及び拡張期圧力、ｄＰ／ｄｔの最大値及び最小値、並びに大動脈圧を継続的に測定して、血行動態パラメータをモニターする。データは、１５００試料／秒の速度で得られ、高忠実度のカテーテルの周波数応答は１０，０００Ｈｚ超まではフラットである。マウスの心拍速度が速い（３００〜５００／分）ため、そのｄＰ／ｄｔを正確に測定するためにこれらの高いサンプルレートが必要である。
【０１２８】
血行動態パラメータのオフライン分析は、ＬＶ圧力低下の時定数（タウ（τ））の計算に加えて最小及び最大ＬＶ圧力並びに大動脈血圧の測定を含むことができる。特に拡張期弛緩の最初の等容性期を反映するタウ（τ）の値の決定は、ＳＥＲＣＡ２機能に密接に関連づけられている。
【０１２９】
Ｃ．単離した筋肉生検組織において筋細胞の短縮を判定するためのプロトコール（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
このプロトコールをラットで例示すると、切除による損傷を最小限にし拘縮を防ぐために２５ｍＭ ＢＤＭを含む酸素化タイロード液中で左心室乳頭筋を切除し、受動的伸張を避ける。その端を短い５−０シルク縫合糸で結びつけて調製物の心室壁及び弁の端に付着させ、過剰伸張を防ぐ。筋肉の一方の端はＣａｍｂｒｉｄｇｅ４００ Ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｆｏｒｃｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（等尺性力トランスデューサー）（フルスケール５ｇ、分解能１００μｇ）のガラスロッドに付着し、もう一方の端はトランスデューサー台（Ｎｅｗｐｏｒｔ４２３、±１μｍ）上の小型のステンレススチールフックに付着するようにする。都合よく見られるように、１ｍｌの試験浴をＯｌｙｍｐｕｓ ＳＺ４５ステレオ顕微鏡の視野内におく。浴の温度を３３℃に維持する。
【０１３０】
次に、静止時の力が最初にトランスデューサーチャネルに記録されるゆるんだ長さに筋肉を調整し、ＢＤＭを洗い流し、（例えば、Ｇｒａｓ刺激装置を使用して）双極性の刺激用電極を浴中に沈める。筋肉を、０．２Ｈｚ（閾値より２０％高い）で刺激し、３０分後、灌流液を［Ｃａ２＋］０．５ｍＭ溶液から［Ｃａ２＋］２．０ｍＭ溶液に切り換える。全ての灌流液を１００％Ｏ２でバブリングする。
【０１３１】
定常状態での等尺性張力の発生は、筋肉長の増加で測定し、発生した張力が最大になるＬｍａｘに対する割合として表す。（結果をｉｎ ｖｉｖｏの筋肉組織性能に外挿する際に）使用する筋肉の長さが短いことを補正するために、張力のピーク時に短くなる歪みを、筋肉上に置いた対の表面細粒を使用して測定し、ビデオカメラで録画する。
【０１３２】
ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７を使用してＤａｔａ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎビデオフレームグラッバーボード付きＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｃｅｎｔｒｉｓ ６５０上でマーカー位置を検出しデジタル化することが好ましい。任意の固定した基準長に関する歪みを使用して長さの縮尺を補正すると、長さ−張力曲線の下降を打ち消すことが示された。
【０１３３】
収縮性は、等尺性の応力−歪み曲線の傾きで表され、このときの応力は発生した張力（静止期全体）を筋肉の断面積で割った値から計算する。この断面積は、機械的試験後に（その重量から決定した）標本の体積を、両端の間の無負荷の筋肉の長さで割ることにより推定する。細胞外Ｃａ２＋濃度０．５〜２．５ｍＭの関数としてこれらのプロトコールを繰り返すことにより、これらの調製物の潜在的なＣａ２＋感度を特徴付けることが可能になる。
【０１３４】
これらの実験のＳＥＲＣＡ２機能及びＥＣ結合をさらに特徴づけるために、Ｎａ／Ｃａ交換がＮａを含まないタイロード液で遮断されたとき、及び筋小胞体のカルシウム蓄積が１０ｍＭカフェインで遮断されたときの弛緩時間を測定することによって、ＳＥＣＲＡ２のポンプ機能を試験する。Ｎａ／Ｃａ交換を測定すると、弛緩時間は約３０％遅くなる。試験筋肉の弛緩特性は、チャートレコーダ（例えば、Ｇｏｕｌｄ ２２００レコーダ）及び高速（４０ｍｍ／秒）のマイクロコンピュータ取得システム（例えば、市販のＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｔｒｅｅ）に記録された等尺性張力の追跡から、筋肉長とカルシウムの関数として決定される。測定されるパラメータには、ピーク張力から９０％回復までの時間及び等尺性の力の低減の指数時定数が含まれる。筋節の長さが損傷されていない中央の筋肉を一定に保つように筋肉長が制御されると、等尺性弛緩が有意に延長されることが研究により示されているので、これらの測定値は前述のアーチファクトにも当てはまり、補正可能である。
【０１３５】
前述したのと同じ手法を用いて、解剖顕微鏡下でラットの左心室から単離した長くて薄い均質な梁柱を使用して、収縮の研究を実施することもできる。梁柱を使用して研究すると、従来の乳頭筋調製物からは得られない筋肉の一連の弾性があるため、拡張期収縮機序における絶対的変化に関する、アーチファクトとは無関係なより具体的な情報が得られる。左心室壁の他の部分領域を、辺縁検出及び細胞内Ｃａ２＋トランジェントの研究をするために心筋細胞を単離するのに使用できる。
【０１３６】
Ｄ．心筋細胞の単離及びカルシウムトランジェントレベルの評価のためのプロトコール（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
心筋細胞は、コラゲナーゼ灌流法を使用して成体ラットの心臓から調製することができる。この筋細胞は、４％ウシ胎児血清の不在下又は存在下で少なくとも４日間維持し、成体の心筋細胞の形態及び代謝的特徴を維持することができる。１匹の成体ラットの心臓から、９〜１０ｘ１０６個の生存可能な筋細胞を得ることができる。
【０１３７】
心筋細胞は、心室壁の小片から調製することもできる。これにより、筋細胞機能、乳頭筋機能、並びに同じ心臓から得られるＳＥＲＣＡ２遺伝子発現及びＳＥＲＣＡ２機能に関係するパラメータについて判断することが可能になる。このために、心室組織を細かく刻み、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭタウリン、及び２ｍＭカルニチンを追加したＣａ２＋を含まない改変Ｊｏｋｌｉｋ最少必須培養液（ＭＥＭ）中で洗浄する。次に、この組織を０．１％ コラゲナーゼ タイプＩＩ（ワーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）社）、０．１％ＢＳＡフラクションＶ、及び２５μＭＣａＣｌ２を含むＭＥＭで消化する。連続的な酸素添加のもと、３２℃で組織を穏やかに攪拌しながら、酵素消化を３０〜４０分間継続する。口径の大きな血清ピペットで穏やかに粉砕することによって、最終的に細胞を完全に分散させる。
【０１３８】
次に、細胞を３００μＭナイロンメッシュに通して濾過し、洗浄する。次に、カルシウムレベルを徐々にその場の濃度が１μＭになるまで上昇させる。この手順により、最大２ｘ１０６細胞／心臓を得ることができ、その６０〜７０％が以下に記載する研究で使用可能な生存可能な棒形の筋細胞である。
【０１３９】
単離した成体ラットの心筋細胞（非培養）を１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣＬ、１．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１１ｍＭグルコース、及び２５ｍＭ Ｎａ−Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸を含む１０ｍｌの溶液中に懸濁させ、５００μｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌの普通のタイロード液に加え、Ｉｎｄｏ Ｉのアセトキシメチルエステル誘導体のＤＭＳＯ中１ｍＭ溶液５μｌを加える。細胞を室温で１５〜２０分間インキュベートする。次に、Ｉｎｄｏ Ｉ添加の均一性、及びきれいな横紋を伴う棒形細胞の形態に基づき細胞を選別する。石英光学素子を装備したＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡の台上に取り付けた小型灌流チャンバーに細胞を移す。細胞を灌流チャンバーの底に自然沈降させ、９０％Ｏ２−５％ＣＯ２でガス補給し３７℃で維持したタイロード液を用いて５ｍｌ／分で連続的に灌流する。細胞を外部の白金電極を用いて０．２、０．３３、１．０、２．０、及び５．０Ｈｚで駆動し、Ｃａ２＋トランジェントを蛍光定量によって測定する。同様の研究を、新生児期のラット又はマウスの筋細胞を使用して実施することもできる。Ａｄｖ ＳＥＲＣＡ２を新生児筋細胞に感染させると、カルシウムトランジェントが顕著に低減する。
【０１４０】
カルシウムトランジェントレベルに関しては、カルシウム２＋＋トランジェントが最も低減するための時間は、ＳＥＲＣＡ２導入遺伝子を含む陽性の筋細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されるのと同様の程度まで有意に短縮された（実施例４、図３、ｐ＜０．０５）。心室圧に関しては、左心室で得られた最大圧力（ＬＶｄＰ／ｄｔ最大値）は、トランスジェニック動物において有意に大きかったが、最小レベルの場合、心室の筋肉は、トランスジェニック動物において拡張期弛緩がより速くなる傾向を示した（ｎ＝３、コントロール（ｎ＝５）と比べて）。動物で検出したＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルを図１及び図２に示す。これらのデータは、心筋のカルシウム輸送及び拡張期弛緩が、予測用動物モデルで本発明の方法を適用することにより、有利な影響を受けるという原理を証明している。
【実施例４】
【０１４１】
ＳＥＲＣＡ２発現アデノウイルスベクターでトランスフェクションした後の心筋細胞機能のＩＮ ＶＩＴＲＯでの評価
簡単に言うと、新生児の心筋細胞をＳＥＲＣＡ２アデノウイルスベクターでトランスフェクトし、実施例３で記載したようにカルシウムトランジェントを測定し、対照（トランスフェクトされていない）細胞と比べる。図３において、細胞＃４２は対照の新生児心筋細胞の挙動の平均を表し、細胞＃２７は、トランスフェクトした新生児心筋細胞の挙動の平均を表す（ＡＤＶ）。図３で示されるように、カルシウムトランジェントの最大減少の半分までの時間は、対照細胞と比べてトランスフェクトした細胞で３３±１９％短縮された（ｎ＝４、ｐ≦０．０１）。これらのデータは、カルシウムトランジェントがＳＥＲＣＡ２ ＡＤＶでトランスフェクトした筋細胞で増大され、その結果、ｉｎ ｖｉｖｏで測定すれば、心筋でより速い拡張期弛緩が促進されるはずであるという原理の証拠を提供する。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態を記載してきた。しかし、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々に改変を加えることができることが理解されよう。従って、本発明は例示した特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】（例として、アデノウイルスのＳＥＲＣＡ２構築体を使用して開発した）マウスにおけるＳＥＲＣＡ２導入遺伝子の発現を示したウェスタンブロットを示す図である。レーン１〜２はα−筋節アクチンの発現を示し、レーン３は、分子量マーカーを示し、レーン４〜５はＳＥＲＣＡ２発現を示す。
【図２】ＳＥＲＣＡ２をコードする数種のアデノウイルス、すなわち、例えばＣＭＶプロモーター（ＨＨ−１、ＨＨ−２、及びＳＡＩ−３）又はＴＫプロモーター（ＴＫ）の制御下にあるベクターなどのうちの１種でトランスフェクトしたマウス由来の心筋細胞におけるラットＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡの存在を示したノーザンブロットを示す図である。対照の構築体は、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを含まなかった（ｃｔｒｌ）。（ ）内の数字は、各構築体のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を示し、Ｌ６細胞をアデノウイルス構築体で４８時間感染させ、抽出し、細胞性ＲＮＡ全体をゲル上で分離し、次いでＳＥＲＣＡ２のｃＤＮＡをＲＮＡにハイブリダイズさせるノーザン分析法によって決定した。
【図３】例として、アデノウイルスベクターでトランスフェクトした新生児の筋細胞において検出されたカルシウムトランジェント（平均値は細胞＃２７で表されている）及びトランスフェクトされていない新生児の筋細胞において検出したカルシウムトランジェント（平均値は細胞＃４２で表されている）を示す図である。カルシウムトランジェントは蛍光定量法で測定し、時間（ｘ軸）の関数として表される。
【図４】例として、ベクターにＳＥＲＣＡ２ａ配列を挿入するためのクローニングスキーム及び適切な制限部位を示す図である。具体的には、ラットＳＥＲＣＡ２ａを３’末端でフラッグシグナルペプチドに融着させたＳＥＲＣＡ２ａ−フラッグが、ヒトＣＭＶプロモーターのもと、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ及びＢｇＩ ＩＩ／ＫｐｎＩ制限部位に挿入される。
【図５】マウスの心臓の左心室自由壁にＡＡＶ又はアデノ随伴ウイルスを注入し、注入の２、４、６、及び８週間後に発現している核コードβｇａｌを示す図である。
【図６】ｒＡＡＶ遺伝子送達４週間後に、単離して灌流させた心臓の機能測定値に対するＳＥＲＣＡ２ａ−フラッグ発現の効果を甲状腺低下症マウスのＧＦＰ対照と比較して示す図である。＊は、ＡＡＶ−ＧＦＰ処理したマウスと有意に（ｐ＜０．０５）異なることを示す。ｒＡＡＶ−ＳＥＲＣＡ−フラッグ処理をしたマウスの機能が、ＡＡＶ−ＧＦＰ処理をしたマウスの機能より改善していることに留意されたい。
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願へのクロスリファレンス
本発明は、１９９５年１１月４日出願の現在も係属中の米国特許出願第０８／４２０，３０６号の一部継続出願である。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、心筋収縮性を調節するための方法に関する。より詳細には、本発明は、ＳＥＲＣＡ２蛋白質を作動的にコードする遺伝子をｉｎ ｖｉｖｏで送達することによって、心臓の筋小胞体（ＳＲ）カルシウム２＋＋ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２）のｉｎ ｖｉｖｏのレベルを上昇させる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．先行技術の変遷
うっ血性心不全は、米国において成人の主な死亡原因のうちの１つである。心虚血（心臓への血液供給が妨害され又は失われることにより生じる急性の事象）と比べて、うっ血性心不全は、心筋の収縮性及びストレスに対する心臓の適応性の漸進的な消失を伴う比較的潜行性の事象である。結局、有効な治療法はなく、ＣＨＦ心臓は、身体の代謝要求を満たすのに十分な速度で血液をポンプ輸送する能力を失う。
【０００４】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）に付随する心機能の異常は様々であるが、収縮性蛋白質の活性化に必要とされるＣａ２＋＋イオンのＳＲからの放出の低減は、ＣＨＦ症候群の共通の特徴である。この消失の意味は、カルシウム輸送が心臓の正常な機能活動において果たしている役割という文脈で最も良く理解することができる。
【０００５】
簡単に言うと、ＳＲは心筋の各筋原線維を取り囲む膜性構造物である。ＳＥＲＣＡ２は、ＳＲの膜内部に含まれており、心筋の拡張期弛緩の間にＳＲ内部空間に遊離カルシウムイオンの７０〜８０％を能動輸送する働きをする。輸送に利用可能な残存カルシウムイオンの多くは、ＳＲのナトリウム／カルシウム交換輸送系、並びに程度ははるかに低いが、筋細胞膜カルシウムイオンＡＴＰアーゼが触媒するＡＴＰ加水分解によって駆動される輸送、及びミトコンドリアのカルシウム取り込みによって、細胞質から取り除かれる（Ｂａｓｓａｎｉ他、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、４５３：５９１〜６０８、１９９２年、及びＣａｒａｆｏｌｉ，Ｅ．、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６：３９５〜４３３、１９８７年）。
【０００６】
ＳＥＲＣＡ２のＡＴＰ加水分解活性とＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡの絶対レベルの双方がＣＨＦ心臓において低下することから（Ｈａｓｅｎｆｕｓｓ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７５：４３４〜４４２、１９９４年、及びＳｔｕｄｅｒ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７５：４４３〜４５３、１９９４年）、ＣＨＦ心臓の低圧力で血液を受け取る能力の損傷は、ＳＥＲＣＡ２媒介による、収縮を活性化するカルシウムイオンのＳＲへの輸送の遅れに直接関連づけられ、その結果心臓の拡張期弛緩が遅れると広く想定されている（例えば、Ｇｒｏｓｓｍａｎ，Ｗ．、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２５：１５５７〜１５６４、１９９１年；Ｌｏｒｅｌｌ，ＢＨ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．、４２：４１１〜４３６、１９９１年；及びＡｒａｉ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７４：５５５〜５６４、１９９４年を参照のこと）。これらの知見は、特にｍＲＮＡのＳＥＲＣＡ２コードレベルの低下に関して、ヒト並びに他の哺乳動物種において確かめられている。（ヒトＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡレベルについては、Ａｒａｉ他の上記論文、及びＭｅｒｃａｄｉｅｒ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８５：３０５〜３０９、１９９０年を参照のこと。また、他の哺乳動物種の肥大心臓組織におけるＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡレベルの低減については、Ｗａｎｇ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６７：Ｈ９１８〜Ｈ９２４、１９９４年（フェレット）；Ａｆｚａｌ及びＤｈｅｌｌａ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６２：Ｈ８６８〜Ｈ８７４、１９９２年（げっ歯類）；及びＦｅｌｄｍａｎ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７３：１８４〜１９２、１９９３年（げっ歯類）を参照のこと）。
【０００７】
ＣＨＦにおけるカルシウム輸送の役割に関して近年関心が持たれているにもかかわらず、ＳＥＲＣＡ２カルシウム輸送活性の損傷の分子的原理は少ししか理解されておらず、ＣＨＦの治療レジメンにまだ利用されていない。そうではなくて、ＣＨＦ症候群のための現在の治療様式は、ＣＨＦ心臓の不全につながる機能異常を引き起こさないとしてもそれに付随すると考えられている生化学的事象及び分子的事象を直接標的としていないという意味で、ほとんど非特異的である。例えば、アドレナリン様薬物を投与することによるＣＨＦの薬剤治療は、心筋収縮を刺激するが、筋肉の収縮性の減退を引き起こした根底にある状態を是正しない。
【０００８】
従って、ｉｎ ｖｉｖｏの心臓蛋白質レベルを補充及び／又は上昇させることは、ヒトのＣＨＦの進行を治療及び制御するための魅力的な代替方法である。しかし、心臓組織に心臓蛋白質又は心臓ペプチドを導入することによってこの目標を実現することは、成功する可能性が低い。特に蛋白質に対する生体反応を起こすのに十分な用量で、潜在的な毒性を生じる危険性が主要な懸念である。実用的な観点からは、これらの蛋白質を単離し精製すること、又は合成することに伴うコストの問題もある。さらに、標的組織中に存在するプロテアーゼによって分解されるため、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が比較的短いことにより、これらの蛋白質の臨床上の効果も限られるはずである。
【０００９】
これらの理由により、この蛋白質を発現する遺伝子の送達により、患者に蛋白質を導入することは、蛋白質それ自体の投与に代わる魅力的な代替方法である。この目的で、標的細胞に外来遺伝子を導入するための様々な戦略が開発されている。ヒトで使用するために今日までに提案されている遺伝子治療プロトコールの大半は、ｅｘ ｖｉｖｏの遺伝子移入に焦点を合わせている。例えば、標的組織に移植するための細胞のレトロウイルスによるトランスフェクションなどがある（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ＷＦ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：８０８〜８１３、１９９２年、及びＭｉｌｌｅｒ，ＡＤ、Ｎａｔｕｒｅ、３５７：４５５〜４６０、１９９２年（アデノシン脱アミノ酵素欠損の治療）を参照のこと）。しかし、これらのプロトコールの有用性は、蛋白質発現が比較的非効率的であること並びに標的器官及び組織への到達性が限られていることにより、限定的であることが判明した。
【００１０】
従って、ｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達方法は、当技術分野で関心の高いテーマである。この目的で、「裸の（ｎａｋｅｄ）」ポリヌクレオチド（プラスミド）、ウイルスに連結したプラスミド、ウイルスに取り込ませた（ｃｏｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）プラスミドの導入、並びにリポソームによる遺伝子構築体のカプセル化及び送達を含めて、この目標を達成するためにいくつかの系が開発されている。
【００１１】
例えば、リス肝炎の裸のクローン化プラスミドＤＮＡをリスに肝臓内注入したところ、ウイルス感染及び抗ウイルス性抗体の形成が共にリスで生じたというＮＩＨ（米国国立衛生研究所）の研究が１９８４年に報告された（Ｓｅｅｇｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８１：５８４９〜５８５２、１９８４年）。数年後、Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、骨格筋組織に注入した「裸の」ポリヌクレオチド（すなわち、リポソーム又はウイルス発現ベクターを伴わないＤＮＡ又はＲＮＡ）から蛋白質発現を得たことを報告した（Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１４６５、１９９０年。また、ＰＣＴ国際特許出願公開第９０／１１０９２号も参照のこと）。Ｆｅｌｇｎｅｒ他は、筋組織が、多核細胞、筋小胞体、及び筋細胞の深部まで伸びる横行の管状系からなる独特な構造を有するため、筋細胞がポリヌクレオチドを効率的に取込み発現すると推測した。
【００１２】
標的組織に直接遺伝子を送達するための同様の系が、Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：１１２７７〜１１２８１、１９９２年（リポゾームにカプセル化した遺伝子のエアロゾル送達後に検出された蛋白質発現）及びＴａｎｇ他、Ｎａｔｕｒｅ、３５６：１５２〜１５４、１９９２年（ワクチン「銃」を用いてコロイド性の金粒に結合させたｈＧＨプラスミドをマウスの皮膚に注入した結果、注入された遺伝子に対する免疫応答を誘発せずにｈＧＨ蛋白質を発現した）によって報告されている。筋細胞内で高レベルの蛋白質発現を起こすのに一般に有効ではあるが、長期治療のための筋組織へのＤＮＡ又はＲＮＡの直接注入では、遺伝子の分解による発現の損失を補うために注入を繰り返し利用する必要がある。この手法は、時間がかかり高価であるだけでなく、注入部位及びその周辺で炎症が引き起こされるため、長期治療には非実用的であるかもしれない。従って、短期治療又は救急治療では有用であるが、標的組織に発現可能な遺伝子を導入するための侵襲性のより低い手段が、標的組織への直接注入よりも一般に好ましい。
【００１３】
さらに、組換え発現ベクターを使用しないｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達方法の大半は、標的細胞のトランスフェクションが非効率的で蛋白質発現が比較的弱いという欠点がある。従って、組換え発現ベクター（特に複製不能型のベクター）が現在もなおｉｎ ｖｉｖｏの遺伝子送達のための好ましい運搬体（ｖｅｈｉｃｌｅ）である。
【００１４】
心筋細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子送達に適した標的であることが示されている。例えば、ＣＨＦの治療に対する近年の１つの提案を用いれば、ＣＨＦ心臓の筋細胞の活性β２−アドレナリン受容体の数が補充及び／又は増加されるはずである。マウスでの研究により、直接移植技術を使用してこれらの受容体をコードする遺伝子を導入したところ、外因性のアドレナリン供給源の不在下でさえ心筋の収縮性をｉｎ ｖｉｖｏで増大させたことが示されている（Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６４：５８２〜５８６、１９９４年）。特に、アデノ随伴ウイルスベクターが、心筋細胞への遺伝子送達のための成功裡の運搬体として示されている（例えば、Ｇｕｚｍａｎ他、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、７３：１２０２〜１２０７、１９９３年、及びＭｕｈｌｈａｕｓｅｒ他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、８８（Ｐａｒｔ２）：１〜４７５、１９９３年を参照のこと）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の好ましい実施形態の詳細を、添付図及び以下の説明に示す。本発明の詳細が知られれば、非常に多くのさらなる革新及び変更が当業者には明らかになるであろう。
【００１６】
本発明は、ＳＥＲＣＡ２を作動的にコードするポリヌクレオチドを心筋などの組織に導入することにより触媒活性のあるＳＥＲＣＡ２の発現をｉｎ ｖｉｖｏで高めることによって、心筋のＳＲへのカルシウム輸送を増大させる方法である。標的細胞のトランスフェクション効率の点で好ましい実施形態では、ＳＥＲＣＡ２をコードしているポリヌクレオチドを、複製不能型のウイルス組換え発現ベクター、最も好ましくはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）構築体を用いて心臓組織に送達する。
【００１７】
或いは、ＳＥＲＣＡ２コード遺伝子を、リポソームによるカプセル化又は「裸の」ヌクレオチドの投与によって提供してもよい。ＳＥＲＣＡ２遺伝子の送達は、外科的に（即ち、ベクター又はトランスフェクトした細胞の標的組織への直接導入によって）又は冠動脈内輸注法によって行ってよい。
【００１８】
ＳＲ中のＳＥＲＣＡ２活性上昇によってもたらされるＳＲへのカルシウムイオン輸送の増大により、心臓の筋原線維収縮の活性化が緩和されることになる。従って、本発明の方法の特に有利な点は、特に心筋の拡張期弛緩の初期段階を短くすることにより、ＣＨＦに関連する異常に対して心臓が調整するのを助けることである。
【００１９】
本発明の方法の一使用は、インターベンション治療（例えば移植）を待機している、且つ／又は既にＣＨＦ治療を受けている患者のＣＨＦの短期改善を目的としている。本発明の方法の使用はまた、ＣＨＦに関連する心機能の異常を生じるリスクがある、或いは既に異常を生じ始めている患者に恩恵をもたらすと予想される。
【００２０】
本発明の他の態様では、本発明の方法で使用するためのベクターを開発する際及び本発明の方法の適用を試験する際に使用するためのトランスジェニック動物が提供される。ＣＨＦの治療に使用したときの本発明の方法の有効性をモニターする方法も説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
この説明を通じて、ここに示す好ましい実施形態及び実施例は例とみなすべきで、本発明を限定するものとみなすべきではない。
【００２２】
Ａ．定義
以下の定義は、本発明の考察を簡単にするために提供される。しかし、これらの定義が本発明の正当な範囲又は趣旨から逸脱しない等価物を含むように拡張できることを、当業者なら理解するであろう。この理由から、これらの定義は本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
１．「ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味し、本発明に従って行う治療の目的に適したセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むことができる。本明細書では、「ポリヌクレオチド」とは、分離した断片の形又は大きな構築体の成分としての、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドの重合体を意味する。ポリヌクレオチドの配列は、遺伝コードから推測できるが、コードの縮重を考慮しなければならない。本発明のポリヌクレオチドは、遺伝コードの結果として縮重した配列を含み、その配列は当業者によって容易に決定することができる。
２．「作動的にコードする」とは、所望の翻訳産物、例えばペプチド又は蛋白質の発現及び望むならその分泌に必要なプロモーター及び他の配列を含むように改変されたポリヌクレオチドを意味する。本発明の全ての実施形態は、公知の組換え発現ベクターを使用して実施することができる。これらのベクターは、所望の翻訳産物をコードするｃＤＮＡを含むことが好ましい。従って、文脈上別の意味で解釈する必要がない限り、「ポリヌクレオチド」とは、適切な組換え発現ベクター中に含まれ作動的にコードする配列を意味すると想定され、その例が本明細書で提供される。
３．「合成」とは、ポリヌクレオチド配列及びポリペプチド配列を合成する公知の手段を意味し、天然のポリヌクレオチド及び蛋白質の単離及び精製を含むことができる。
４．「ペプチド」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで所望の生体効果を有する小型ペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチド、及び蛋白質を意味する。
５．「送達」とは、作動的にコードするポリヌクレオチドを宿主に導入する既知の方法を意味する。当業者なら、これらの送達手段を熟知しており、或いは容易に特定することができる。しかし、特に有用な送達手段に関しては、「新規の薬物送達系（Ｎｏｖｅｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、１９９２年）を参照することができ、その関連する開示内容を、薬物送達技術に関する当技術分野の知識状態を例示するために参照により本明細書に組み込む。
６．「宿主」とは、本発明に従って行われる治療の受容者を意味する。宿主はどんな脊椎動物でもよいが、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物の場合は、宿主はヒトが好ましいが、飼育された家畜でもペット動物でもよい。
７．「標的組織」とは、作動的にコードするポリヌクレオチドの発現を得ようとする、宿主の組織を意味する。
８．「抗体」とは、任意のクラスの免疫グロブリン全体、キメラ抗体、２つ又は複数の抗原特異性を有するハイブリッド抗体、及びハイブリッド断片を含む断片を意味する。また、このような断片の結合体、例えば米国特許第４，７０４，６９２号に記載されているいわゆる抗原結合性蛋白質（単鎖抗体）、及び、例えば米国特許第４，６９９，８８０号に記載されている抗イディオタイプ抗体（他の抗体に結合する抗体）も、「抗体」の意味の範囲内に含まれる。
９．「組換え発現ベクター」は、真核生物又は原核生物で発現可能なポリペプチドを作動的にコードするポリヌクレオチドの系を意味する。真核生物又はウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物で発現する方法は当技術分野で公知である。宿主中で発現及び複製できる、生物的に機能的なウイルス及びプラスミドＤＮＡベクターも当技術分野で公知である。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、及び哺乳類生物を挙げることができる。
【００２３】
Ｂ．本発明の方法で使用するポリヌクレオチド構築体
ラットＳＥＲＣＡ２のゲノムクローンのヌクレオチド配列（Ｒｏｈｒｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：６９４１〜６９４４、１９８８年（ラットＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡ）も参照のこと。この論文で報告された配列を、参照のために本明細書に組み込む）。このクローンは、Ｒｏｈｒｅｒ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６：８６３８〜８６４６、１９９１年（その開示内容を参照のために本明細書に組み込む）に記載されているような従来のハイブリダイゼーション技術によって得られた（実施例１を参照のこと）。この論文は、クローンを転写するための開始コドン及び終止コドンも記載している。
【００２４】
カルシウムＡＴＰアーゼのＳＥＲＣＡ２アイソフォームのヌクレオチド配列（すなわち、横紋筋の「速筋型」アイソフォームに対する骨格筋の「遅筋型」アイソフォーム）は、哺乳動物種間で９０％以上保存されている。従って、ＳＥＲＣＡ２は、ヒト（ＧＥＮＢＡＮＫ ＃Ｊ４０２５、又、ＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ２３１１４〜２３１１６、Ｍ２３２７７〜２３２７９、及びＬｙｔｔｏｎとＭａｃＬｅｎｎａｎ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６３：１５０２４〜１５０３１、１９８８年も参照のこと）、及びウサギ（ＭａｃＬｅｎｎａｎ，ＤＨ、Ｎａｔｕｒｅ、３１６：６９７〜７００、１９８５年、及びＧＥＮＢＡＮＫ Ｍ３３８３４）を含めて、げっ歯類以外の哺乳動物の骨格筋組織からかなり容易に同定され、配列決定されている。当業者なら、ヒトＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの使用がヒトの治療では大いに好ましいことを理解するであろうが、ラットＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドが、実施例で記載した実験のためには使用しやすく好ましい。
【００２５】
ＳＥＲＣＡ２に関して詳細に本明細書に記載する本発明の方法は、ＣＨＦ心臓でその発現及び活性が損傷されている他の心臓蛋白質を送達するために使用するように適合させることができるので有利であることも、当業者なら理解するであろう。特に、哺乳動物のカルシウム／ナトリウム交換体をコードしている遺伝子は、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの送達に関して本明細書に記載したのと同じ方法で、本発明の方法に従って心臓に送達するための特に魅力的な対象である。
【００２６】
本開示に含まれるＳＥＲＣＡ２配列及び当技術分野で公知のものを入手し使用するために、ＤＮＡ及びＲＮＡを当技術分野で公知の自動核酸合成装置を使用して合成することができる。公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用が、ポリヌクレオチド混合物を生成するのに特に好ましい。Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２章及び４章、（Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８９年）に記載のプロトコールのような当技術分野で公知の手段によって、ゲノム核酸を調製することができる。ｃＤＮＡは、当技術分野で公知の手段によって合成することができる（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ、米国ニューヨーク州、１９８２年）を参照のこと）。目的のポリヌクレオチドを含むｃＤＮＡの発現ライブラリを、当技術分野で公知の手段によってスクリーニングすることもできる。
【００２７】
例えば、これらの手段には、それだけには限らないが、１）共通のヌクレオチド配列を検出するための、ゲノム又はｃＤＮＡライブラリへのプローブのハイブリダイゼーション、２）共通の構造的特徴を検出するための発現ライブラリの抗体スクリーニング、及び３）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による合成が含まれる。特定のＤＮＡコード配列又はその断片の開発は、１）ゲノムＤＮＡからの二重鎖ＤＮＡ配列の単離、２）目的のポリペプチドのために必要なコドンを提供するＤＮＡ配列の化学的作製、及び３）真核性ドナー細胞から単離したｍＲＮＡの逆転写による二重鎖ＤＮＡ配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ合成によって行うことができる。後者の場合、一般にｃＤＮＡと呼ばれるｍＲＮＡの二重鎖ＤＮＡ相補物が、最終的に形成される。
【００２８】
ハイブリダイゼーション手順は、混合した合成オリゴヌクレオチド標識プローブを使用して、組換えクローンをスクリーニングするのに有用であり、この場合、各プローブは変性させた二重鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含むハイブリダイゼーション試料中にある特定のＤＮＡ配列の完全な相補物である可能性がある。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡ又は変性した二重鎖ＤＮＡ上でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。ハイブリダイゼーションは、目的のポリペプチドに関係するｍＲＮＡ配列が極めて少量しか存在しない供給源に由来するｃＤＮＡクローンの検出に特に有用である。言い換えれば、非特異的な結合を避けるようにした厳密なハイブリダイゼーション条件を使用することにより、例えば、混合物中のただ一つのプローブに標的ＤＮＡをハイブリダイゼーションすることによって、特定のｃＤＮＡクローンをオートラジオグラフィーで可視化させることが可能である。
【００２９】
目的のポリヌクレオチドを含むと考えられるｃＤＮＡライブラリは、ｃＤＮＡから誘導した様々なｍＲＮＡを卵母細胞に注入し、十分な時間を与えてｃＤＮＡ遺伝子産物を発現させ、例えば目的のポリヌクレオチドにコードされたペプチドに特異的な抗体、又は目的のポリヌクレオチドにコードされたペプチドの特徴である繰り返しモチーフ及び組織の発現パターンを調べるためのプローブを使用して、所望のｃＤＮＡ発現産物が存在するかどうか試験することによって、スクリーニングすることができる。或いは、ｃＤＮＡライブラリは、少なくとも１種のエピトープを有する治療用及び／又は免疫原性ペプチドの発現について、それらのペプチドに特異的な抗体を使用して、間接的にスクリーニングすることもできる。これらの抗体は、ポリクローナル型又はモノクローナル型を作製し、目的のｃＤＮＡの存在を示す発現産物を検出するのに使用することができる。
【００３０】
適切なプローブが利用可能であるならば、核酸ハイブリダイゼーションを利用するスクリーニング手順によって、任意の生物から任意の遺伝子配列を単離することが可能になる。問題の蛋白質をコードする配列の一部分に相当するオリゴヌクレオチドプローブを、化学的に合成することができる。このためには、アミノ酸配列の短いオリゴペプチド区間がわかっていなければならない。蛋白質をコードしているＤＮＡの配列は、遺伝コードから推測できるが、コードの縮重を考慮しなければならない。配列が縮重しているときは、混合付加反応を行うことができる。これは、変性した二重鎖ＤＮＡの不均一な混合物を含む。このようなスクリーニングの場合、一本鎖ＤＮＡ又は変性した二重鎖ＤＮＡ上でハイブリダイゼーションを行うことが好ましい。
【００３１】
本発明で使用するＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡでよいが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列であることが好ましい。本発明で使用するポリヌクレオチドは、（ａ）発現可能で、且つ（ｂ）複製不能、又は宿主ゲノム内に入って複製しないように当技術分野で公知の手段によって改変されたものでなければならない。ＳＥＲＣＡ２蛋白質を作動的にコードするポリヌクレオチドを組換え発現ベクター、最も好ましくはアデノウイルス構築体の一部として使用することが好ましい。
【００３２】
以下は、本発明で使用するのに適するポリヌクレオチドの調製の例であり、どのように特定のポリヌクレオチド組成物が作成されたかを示す特定の実施例が以下に提供される。しかし、複製不能なポリヌクレオチドを調製する他の既知の手段も適し得ることは、当業者には明らかであろう。
【００３３】
本発明のポリヌクレオチドは、ＳＥＲＣＡ２蛋白質を作動的にコードする既知のポリヌクレオチドの機能的誘導体を含む。「機能的誘導体」とは、ＳＥＲＣＡ２の「断片」、「変異体」、「類似体」、又は「化学的誘導体」をコードするポリヌクレオチドを意味する。分子の「断片」は、分子の任意のペプチド部分を含む。このような分子の「変異体」とは、分子全体又はその断片にかなり類似した天然の分子を意味する。分子の「類似体」とは、分子全体又はその断片にかなり類似した非天然の分子を意味する。
【００３４】
本明細書では、ある分子が普通ならその一部分ではない追加の化学的部分を含むとき、別の分子の「化学誘導体」であると言う。これらの部分は、分子の溶解性、吸収性、生物的半減期などを改善することができる。或いは、これらの部分は、分子の毒性を弱め、分子の望ましくない副作用を無くし又は減らすこともできる。このような効果をもたらすことができる当技術分野で既知の部分は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１６版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルベニア州、イーストン（１９８０年）に開示されている。
【００３５】
ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドは、これらのポリペプチドの発現を制御する調節蛋白質を作動的にコードする他のポリヌクレオチドに結合させ又はそれらと一緒に使用し、或いは、認識配列、プロモーター配列、及び分泌配列を含むことができる。当業者なら、過度に実験をすることなく、調節ポリヌクレオチドを選別し、それらを本発明のＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドに組み込むことができるであろう。例えば、ネズミ又はヒトの系で使用するのに適したプロモーター及びその使用法が、前述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの１章に記載されている。
【００３６】
本発明で使用するためのＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの特に好ましい形態は、組換え発現ベクターに組み込まれたものとなる。組換え発現ベクターを使用すると、標的組織における遺伝子の発現が長くなる。
【００３７】
適切な組換え発現ベクターは当技術分野で公知であり、前述のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙの１章に記載されているベクターが含まれる。２種の特に好ましいプラスミドプロモーターベクターは、ｐＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ））及びｐＣＭＶ（サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ））であり、特に後者である。この選択は、ＣＭＶプロモーターを使用すると、より高レベルの発現がこの状況で得られるという観察結果に基づく。
【００３８】
ＲＳＶプロモーターを単離し、プラスミドベクターの構築にそれを使用するための適切なプロトコールは、Ｇｏｒｍａｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７９：６７７７、（１９８２年）に記載されている。他の好ましいプラスミドベクターは、カリフォルニア州サンディエゴのインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社から市販されているｐＲＥＰ７及びｐＲＥＶである。ポリヌクレオチドのクローニングにおいて、ｍＲＮＡの産生に特に適したプラスミドは、Ｋｒｅｉｇ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：７０５７〜７０７０（１９８４年）に記載のｐＳＰ６４Ｔクローニングベクターである。従来技術を使用して、開始コドンを含む任意のｃＤＮＡをこのプラスミドに導入し、発現されたＤＮＡ鋳型からｍＲＮＡを調製することができる。
【００３９】
組換え発現ベクターで使用するための特徴が良く分かっている「ｏｎ／ｏｆｆ」スイッチは、抗生物質（テトラサイクリン）で調節されるプロモーター系である。このような系を構築する手段は、当技術分野で公知である。この点に関する総説について、当業者なら、Ｆｕｒｔｈ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：９３０２〜９３０６、１９９４年（トランスジェニックマウスにおける、テトラサイクリンに調節された遺伝子発現制御）、Ｆｉｓｈｍａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９３：１８６４〜１８６８、１９９３年（心臓の遺伝子発現のテトラサイクリンによる制御）、及びＮｉｗａ他、Ｇｅｎｅ、１０８：１９３〜２００、１９９１年（高発現のトランスフェクトタントのためのプロモーター系の使用）を参照できよう。テトラサイクリンプロモーター系の制御下でＳＥＲＣＡ２をコードするプラスミドを、実施例４に記載する。
【００４０】
本発明で利用できる様々なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、又はレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスが含まれる。単一の外来遺伝子を挿入できるレトロウイルスベクターの例には、それだけには限らないが、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ）（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（Ｈａｒｖｅｙ ｍｕｒｉｎｅ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ｍｕｒｉｎｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）（ＭｕＭＴＶ）及びラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）が含まれる。いくつかの他のレトロウイルスベクターは、複数の遺伝子を組み込むことができる。これらのベクターの全ては、形質導入された細胞を同定及び生成できるように、選択マーカーとして遺伝子を移入又は組み込むことができる。
【００４１】
組換えレトロウイルスは欠損があるため、感染性のベクター粒子を産生するためには助けを必要とする。例えば、ＬＴＲ内の調節配列の制御下にあるレトロウイルスの構造遺伝子の全てをコードしているプラスミドを含むヘルパー細胞系を使用して助けることができる。これらのプラスミドは、パッケージング機序でキャプシド形成のためのＲＮＡ転写物を認識するのを可能にするヌクレオチド配列を欠失している。パッケージングシグナルを欠失しているヘルパー細胞系には、それだけに限らないが、例えば、ψ２、ＰＡ３１７、及びＰＡ１２が含まれる。これらの細胞系は、ゲノムが全くパッケージされない（詰め込まれない）ため、空のウイルス粒子を産生する。パッケージングシグナルは損なわれていないが構造遺伝子が目的の他の遺伝子で置き換えられているこのようなヘルパー細胞系にレトロウイルスベクターが導入されると、ベクターはパッケージされることができ、ベクターウイルス粒子を産生することができる。
【００４２】
ＤＮＡ発現ベクターのうちでは、トランスフェクション効率（心筋細胞で最大７０％）の点からＡＡＶベクターが好ましい。このようなベクターは、外来ＤＮＡの比較的大きなセグメントを受け入れることができ、低い免疫原性で高タイターで生成することができるので好ましい。ＡＡＶベクターは、（例えばＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドのポリリジン結合体と比べて）冠動脈内輸注法に良く耐えるので有利である。
【００４３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、単純な非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスである。パッケージング配列を含むそのｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子は、ウイルスの先頭及び末尾を決めている逆方向反復配列の間に挟まれている。ｃａｐ遺伝子は、ウイルスのキャプシド（ｃａｐｓｉｌ）（莢膜）蛋白質をコードし、ｒｅｐ遺伝子産物は、ウイルスの複製及び組み込みに関与している。ＡＡＶは、複製のために、ヘルパーウイルス、例えばアデノウイルス又は単純ヘルペスウイルスによって提供される追加の遺伝子を必要とする。ＡＡＶは様々な細胞型に感染する。そのウイルスＤＮＡは、ヒト染色体１９に優先的に組み込まれることができる。
【００４４】
ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を導入遺伝子で置き換えることによって、ＡＡＶベクターを作製し、遺伝子治療用ベクターとして使用することができる。ヒト因子ＩＸのｃＤＮＡを含むＡＡＶベクターが構築され、免疫適格性マウスの肝臓細胞及び筋肉細胞に感染させるために使用されている。これらのマウスは、６ヶ月以上の間、治療効果のある量の因子ＩＸ蛋白質を血液中に産生することができた。ＡＡＶベクターを大量調製するための組成物及び方法は、米国特許第６，４１６，９９２号に開示されている。
【００４５】
本発明で使用するのに特に好ましいＡＡＶ構築体を、実施例１に示す。この構築体は、プロモーター、ポリリンカー、及びその他のものを含むシャトルベクター中にＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをクローニングすることによって、形成される。試料中で使用する特定のアデノ随伴シャトルベクターは、Ｓａｍｕｌｓｋｉ他によって記載の（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３（９）：３８２２〜３８２８、１９８９年）プラスミドｐＳｕｂ２０１から誘導した。このプラスミドのＸｂａ Ｉ断片を、マルチクローニングサイト及びポリアデニル化シグナルの前にある５７２塩基対のヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター断片に連結させた。このプラスミドをＡＡＶ−シャトルと呼び、サイズは約５０００塩基対である。
【００４６】
３’末端でフラッグシグナルペプチドに融着させたラットＳＥＲＣＡ２ａのコード配列が報告されている（Ｈｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １００：９７４〜９８０、１９９９年）。Ｋｐｎ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ又はＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ酵素を使用して、緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）をＡＡＶ−シャトル中に好都合にクローニングすることができる（Ｈｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １００：９７４〜９８０、１９９９年）。組換えクローンはＤＮＡ配列決定により確認され、大量のプラスミドｐＤＧが記載され、ＣｓＣｌ大量調製プロトコールによって精製されている（Ｇｒｉｍｍ他、Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２７４５〜２７６０、１９９８年）。
【００４７】
純粋な感染性ウイルス粒子を調製するために、挿入されたｃＤＮＡを含むＡＡＶ−シャトルプラスミド及びｐＤＧプラスミドは共に、ＣａＰＯ４共沈法を使用して細胞にトランスフェクトされる。トランスフェクションに続いて、細胞は新鮮な培地で培養され、次いでウイルス粒子が回収され精製される。クローニングスキーム及び適切な制限部位の略図を図４に示す。
【００４８】
（以下のセクションＣで記載の）リポソーム送達のためのＳＥＲＣＡ２のカプセル化も、複製可能なＡＡＶ構築体を使用する場合と同様に、ウイルスの免疫破壊を制限するはずである。しかし、ウイルスＤＮＡの宿主ゲノムへの組み込みに伴う可能性のある危険性を考えると、このようなベクターの使用は、ベクター産生物の長期間の発現が患者の生存に極めて重要である状況に限られることになる可能性が高い。
【００４９】
例えば、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードするもう１つの遺伝子といっしょに１種又は複数の目的の配列をウイルスベクターに挿入することによって、ベクターを標的特異性にすることができる。例えば、糖、糖脂質、又は蛋白質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって、レトロウイルスベクターを標的特異性にすることができる。
【００５０】
心臓に特異的なプロモーターを使用することにより、標的筋細胞以外の心筋細胞への本発明の組換え発現ベクターの非特異的トランスフェクションを回避することが好ましい。いくつかのこのようなプロモーターが現在知られており、トリβ−アクチンが挙げられる（実施例１を参照のこと）。当業者なら、ウイルスゲノムに挿入され、目的のＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にすることができる他の特定のポリヌクレオチド配列について知っているか、過度に実験をすることなく容易に確認することができよう。
【００５１】
心臓組織へのＳＥＲＣＡ２導入遺伝子の送達のためにＡＡＶベクターを使用することの利点は、このベクターに対して免疫応答が起こらず、導入遺伝子の発現が最大７ヶ月持続することである。ＳＥＲＣＡ２導入遺伝子の送達のためのＡＡＶベクターの使用に関する詳細な説明を、以下の実施例１に示す。
【００５２】
Ｃ．ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの薬剤調製物
ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの組成物及びＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの混合物は、製薬上許容される懸濁液、溶液、又は乳濁液中に入れてよい。適切な媒体は生理食塩水を含み、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを標的組織に送達するために抗原提示細胞を使用しない実施形態の場合は、リポソーム調製物を含んでよい。
【００５３】
より詳細には、製薬上許容される担体は、無菌の水性又は非水性溶液、懸濁液、及び乳濁液を含んでよい。非水溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、及びエチルオレエートなどの注射可能な有機エステルがある。水性の担体には、生理食塩水及び緩衝処理した媒体を含めて、水、アルコール性／水性溶液、乳濁液、又は懸濁液が含まれる。非経口用ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）には、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖入りリンガー液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム溶液、乳酸化リンガー液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内用ビヒクルには、（ブドウ糖入りリンガー液をベースとしたものなどの）流動性で栄養性の補充液及び電解質補充液などが含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガスなどの保存剤及び他の添加剤も存在してよい。さらに、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの組成物を、本発明に従って後で再構成し使用するために、当技術分野で公知の手段を使用して凍結乾燥してもよい。
【００５４】
上記に論じた標的化ベクター送達系に加えて、コロイド分散系も標的化送達に使用してよい。コロイド分散系には、水中油乳濁液、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含めて、高分子複合体、ナノカプセル、微粒子、ビーズ、及び脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系はリポソームである。
【００５５】
リポソームは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの送達運搬体として有用な人工膜小胞である。大きさ０．２〜４．０ｎｍの大きな一枚膜小胞（ＬＵＶ）が、大きな高分子を含む水性緩衝液のかなりの割合をカプセル化できることが示された。ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び無傷のウイルス粒子は、水性の内部にカプセル化され、生物活性のある形で細胞に送達されることができる（Ｆｒａｌｅｙ他、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．、６：７７、１９８１年）。リポソームは、哺乳動物細胞に加えて、作動的にコードするポリヌクレオチドを植物、酵母、細菌細胞中に送達するのに使用されている。リポソームが効率的な遺伝子移入運搬体となるためには、以下の特徴がなければならない。すなわち、（１）アンチセンスポリヌクレオチドをコードしている遺伝子を高効率でカプセル化するが、それらの生物活性は損なわないこと、（２）標的ではない細胞と比べて標的細胞に優先的且つ有意に結合すること、（３）運搬体中の水性内容物を、高効率で標的細胞の細胞質に送達すること、及び（４）遺伝情報を正確且つ有効に発現することである（Ｍａｎｎｉｎｏ他、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、６：６８２、１９８８年）。
【００５６】
リポソームの組成物は、通常ステロイド、特にコレステロールと組み合わせた、リン脂質、特に相転移温度の高いリン脂質の組み合わせである。他のリン脂質又は他の脂質も使用してよい。リポソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度、及び二価の陽イオンの有無によって決まる。
【００５７】
リポソーム調製に有用な脂質の例には、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、及びガングリオシドなどのホスファチジル化合物が含まれる。特に、脂質部分が１４〜１８個の炭素原子、特に１６〜１８個の炭素原子を含み、飽和されているジアシルホスファチジルグリセロールが有用である。リン脂質の例には、卵ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、及びジステアロイルホスファチジルコリンが含まれる。
【００５８】
リポソームの標的化は、解剖学的及び機械的要因に基づいて分類することができる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば、器官特異性、細胞特異性、及び細胞小器官特異性に基づく。機械的標的化は、それが受動的であるか能動的であるかに基づいて区別することができる。受動的標的化は、洞様毛細血管を含む器官において細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布するというリポソームの本来の傾向を利用する。一方、能動的標的化では、モノクローナル抗体、糖、糖脂質、蛋白質など特定のリガンドにリポソームを結合させること、又は本来の所在位置以外の器官及び細胞型を標的させるためにリポソームの組成又は大きさを変更することによってリポソームを改変する。
【００５９】
標的化送達系の表面は、様々な方法で改変してよい。リポソームによる標的化送達系の場合は、リポソームの二重層と安定に結合した状態で標的リガンドを維持するために、脂質類をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。標的リガンドに脂質鎖を結合させるために、様々な結合基を使用できる。
【００６０】
これらの技術（及び薬物送達を容易にするために通常使用される他の技術）は、当業者によって過度に実験をすることなく、本発明の方法で使用するためのＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドの調製に適合されることができると予想される。特に、上記のパラグラフで論じた手法は、発明者の知る限りでは、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをｉｎ ｖｉｖｏで筋細胞に送達するためにこれまで使用されていないが、この目的に使用するのに適していると考えられる。このため、上記に挙げた参照は、本発明の方法に必須ではないが、参照により本明細書に組み込む。それが適していることを示す特定の実施例を、以下に示す。
【００６１】
Ｄ．心臓のＳＥＲＣＡ２活性をＩＮ ＶＩＶＯで増大させるための方法
本発明では、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドが、それがコードする生物的に活性なペプチドを発現させるのに十分な用量で供給されれば十分である。実現される発現レベルが、「通常の」内在性ＳＥＲＣＡ２の活性を実質的に補充するのに十分であることが好ましい。ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドが、組換え発現ベクター、好ましくはＡＡＶベクターに含まれ、（セクションＣで前述したように）製薬上許容される組成物に配合されると有利である。
【００６２】
「通常の」ＳＥＲＣＡ２レベル及び活性は個体間で様々であり、従って、特定の種について絶対的に決定することはできない。しかし、ＳＥＲＣＡ２蛋白質の治療前後のレベル、並びにＣＨＦ心臓における増強された収縮性及び心臓性能の臨床的兆候をモニターすることによって、特定の治療目的を達成するために望ましいＳＥＲＣＡ２発現レベル（「治療上有益な量」）を確認し、それを許容される臨床制限内に維持することができる。ＳＥＲＣＡ２レベルをモニターする手段は、以下のセクションＦに説明する。
【００６３】
心臓性能、及びＣＨＦに伴うストレスに対する適応力の改善の臨床的兆候は、心臓病分野の当業者には公知であり、例えば、血流、心臓のポンプ容量、及び心室圧（例えば、血管造影及び心エコー検査による）、カルシウム輸送速度（心臓液試料のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価による）、耐性試験（例えば、心臓への圧力過負荷なストレスに対する心拍のモニタリングによる）、及びＣＨＦ症状の減退の一般的な臨床的兆候（例えば、宿主の持久力が増え、呼吸が容易になる）をモニターすることによって、判定することができる。投与用量は、個々の治療目的を達成するために変更してよい（例えば、急性のＣＨＦ病態の宿主においてカルシウム輸送を増大するためのＳＥＲＣＡ２の過剰発現）。最大及び最小範囲は、前述のモデル及び大型の哺乳動物種の使用などから得られるヒト以外の動物データの結果を外挿することによっても決定される。
【００６４】
ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチド送達は、静脈内又は冠動脈内輸注法により（好ましくは、ポリヌクレオチドの大動脈起始部への逆流を最小限にするためにカテーテル法を使用して）行うことが好ましい。或いは、より強くより即時的なＳＥＲＣＡ２発現を実現するために、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを（例えば、開胸技術を使って）心室壁に注入しても、（例えば、血管造影カテーテル法によって）直接心室に導入してもよい。その後、ＳＥＲＣＡ２発現をモニターし、必要なだけ送達を繰り返す。処理した宿主を、ポリヌクレオチド又はＳＥＲＣＡ２に対する免疫応答などの副作用、及び（例えば、拡張期の過度の延長によって示されるような）過度のＳＥＲＣＡ２発現がないかどうかについても注意深くモニターすべきである。
【００６５】
しかし、通常、以下の実施例で記載する結果に基づくと、ｉｎ ｖｉｖｏで筋細胞にＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをＡＡＶ送達することに関係した細胞変性又は他の有害な影響を生じる危険性は低いようであり、野生型のベクターの混入物を排除すること及び他の方法によって（リポソームによるベクターのカプセル化などによって）ベクターの免疫原性を低減させることによって最小限に抑えることができる。
【００６６】
Ｅ．本発明の方法を試験するための動物モデル
ラットが、その心臓には側副循環がないが、ヒトＣＨＦの状態を満足できる程度に予測できる、うっ血性心不全の再現性のある実験モデルであることが明らかになった。特に、冠動脈の外科的結紮を受けたラットは、ヒトの心筋梗塞後のＣＨＦの特に良いモデルである。ＣＨＦ動物モデルとしてのラットを作製及び使用するための実験プロトコールは、当技術分野で十分に記載されており、参照文献については、当業者なら、Ｐｆｉｅｆｆｅｒ他、Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．、７６：９９〜１０３、１９８４年；Ｊｏｈｎｓ及びＯｌｓｅｎ、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ．、１４０：６７５〜６８２、１９５４年；並びに、Ｓｅｌｙｅ他、Ａｎｇｉｏｌｏｇｙ、１１：３９８〜４０７、１９６０年（その開示内容を、ＣＨＦ動物モデルの開発及び使用に関する当技術分野の知識を例示するために参照により本明細書に組み込む）を参照できよう。さらに、甲状腺の状態が減退したマウス、又は心臓の収縮性が低減しカルシウムトランジェントが遅くなっている甲状腺機能低下マウスも、再現性のある実験モデルとして使用することができる。
【００６７】
さらに、本発明の方法によってＳＥＲＣＡ２活性を増大させたＣＨＦ心臓における心臓性能への効果を特に予測するトランスジェニック動物モデルが開発された。これらの（ＳＥＲＣＡ２導入遺伝子を発現する）トランスジェニック動物を複製するのに有用なプロトコールを以下に記載し、実施例１で説明する。このプロトコールは、発現可能な導入遺伝子を哺乳動物に導入するための従来技術におおむね従う。当技術分野の当業者なら、これらの適用例を熟知しており、過度に実験をすることなく本発明の状況でそれらの技術を適用することができよう。
【００６８】
例えば、様々な発達段階の胚性の標的細胞を、導入遺伝子を導入するのに使用することができる。胚性の標的細胞の発達段階に応じて様々な方法が使用される。受精卵は、マイクロインジェクションの最も良い標的である。マウスでは、オスの前核の大きさは直径約２０マイクロメートルに達するので１〜２ｐｌのＤＮＡ溶液を複製可能に注入することができる。遺伝子移入の標的として受精卵を使用することは、多くの場合注入されたＤＮＡが第一卵割の前に宿主遺伝子に組み込まれることになるという点で、大きな利点がある（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：４４３８〜４４４２、１９８５年）。その結果、トランスジェニック非ヒト動物の全細胞が、組み込まれた導入遺伝子を持つことになる。これはまた、通常、生殖細胞の５０％がその導入遺伝子を含むことになるため、初代の子孫への導入遺伝子の効率的な伝達として反映されることにもなる。受精卵のマイクロインジェクションは、本発明を実施する際に導入遺伝子を組み込むための好ましい方法である。
【００６９】
レトロウイルス感染も、非ヒト動物に導入遺伝子を導入するのに使用することができる。発達途中の非ヒト胚は、胚盤胞段階までｉｎ ｖｉｔｒｏで培養することができる。この間、割球をレトロウイルス感染の標的とすることができる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、７３：１２６０〜１２６４、１９７６年）。酵素処理によって透明帯を除去することにより、割球の効率的な感染が得られる（Ｈｏｇａｎ他、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ 、米国ニューヨーク州、１９８６年）。導入遺伝子を導入するのに使用するウイルスベクター系は、通常、この導入遺伝子を含む複製欠損型レトロウイルスである（Ｊａｈｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：６９２７〜６９３１、１９８５年；Ｖａｎｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ 他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８２：６１４８〜６１５２）。ウイルス産生細胞の単層上で割球を培養することによって、容易に且つ効率的にトランスフェクションが得られる（前述のＶａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎ；Ｓｔｅｗａｒｄ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、６：３８３〜３８８、１９８７年）。
【００７０】
或いは、もっと後の段階で感染を実施してもよい。ウイルス又はウイルス産生細胞を分割腔に注入することができる（Ｊａｈｎｅｒ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９８：６２３〜６２８、１９８２年）。組込みはトランスジェニック非ヒト動物を形成する細胞の一部分でしか起こらないため、初代のほとんどは、導入遺伝子についてモザイク状となる。さらに、初代は、通常子孫に分かれていくゲノムの様々な位置に、導入遺伝子の様々なレトロウイルス挿入物を含むことができる。さらに、効率は低いが、妊娠中期の胚に子宮内でレトロウイルスを感染させて生殖細胞系に導入遺伝子を導入することも可能である（前述のＪａｈｎｅｒ他、１９８２年）。
【００７１】
導入遺伝子を導入するための第３の標的細胞は、胚性肝細胞（ＥＳ）である。ＥＳ細胞は、着床前の胚から得られ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し胚と融合される（Ｅｖａｎｓ他、Ｎａｔｕｒｅ、２９２：１５４〜１５６、１９８１年；Ｂｒａｄｌｅｙ他、Ｎａｔｕｒｅ、３０９：２５５〜２５８、１９８４年；Ｇｏｓｓｌｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ、８３：９０６５〜９０６９、１９８６年；及びＲｏｂｅｒｔｓｏｎ他、Ｎａｔｕｒｅ、３２２：４４５〜４４８、１９８６年）。導入遺伝子は、ＤＮＡトランスフェクション又はレトロウイルスの媒介による形質導入によって、ＥＳ細胞に効率的に導入することができる。その後に、これらの形質転換されたＥＳ細胞を非ヒト動物由来の胚盤胞に結合させることができる。ＥＳ細胞は、その後、胚に定着し、結果として得られるキメラ動物の生殖系の一部になる（総説については、Ｊａｅｎｉｓｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１４６８〜１４７４、１９８８年を参照のこと）。
【００７２】
本発明の状況で動物モデルとして使用するために、最適の導入遺伝子は、ＳＥＲＣＡ２の比較的高い発現レベルをもたらすことができるプロモーターを含むものが好ましい。この点で使用するのに好ましいプロモーターは、β−アクチンイントロンを含む、（例えば鳥類由来の）β−アクチンプロモーターに連結したヒトＣＭＶエンハンサーである。導入遺伝子の発現活性を検出するために、前述したフラッグ抗原エピトープのコード領域を、ＳＥＲＣＡ２のＣ末端領域をコードする導入遺伝子の領域に含ませた。実施例１で説明するように、導入遺伝子を発現した初代動物の子孫は成体になるまで生存し、導入遺伝子が初代系列の少なくとも約１５％の子孫に含まれていると予想できる。
【００７３】
Ｆ．ＳＥＲＣＡ２の発現をＩＮ ＶＩＶＯでモニターする方法
ＳＥＲＣＡ２の発現をモニターするために、本発明に従って宿主に導入されるＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを、既知のレポーター遺伝子を含むように改変してよい。例えば、Ｎｏｒｔｏｎ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：２８１、１９８５年に記載のｐＲＳＶ ｌａｃ−Ｚ ＤＮＡベクターは、蛋白質発現とともにβ−ガラクシターゼを産生する。ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチル基転移酵素（「ＣＡＴ」；ｐＲＳＶ−ＣＡＴプラスミドの構築については、例えば前述のＧｏｒｍａｎ他を参照のこと）も使用できる。別の有用なレポーター分子は、免疫測定法で容易に検出することができるフラッグ抗原性ペプチドである。フラッグ抗原性ペプチドの８個のアミノ酸配列及びそれをコードする領域は、当技術分野で既知である。この点に関して参照するためには、当業者なら、Ｃｈｉａｎｇ他、Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓ．、６：６２〜６４、１９９３年を参照できよう。（例えば、開始コドンから約１５塩基対の位置に遺伝子を挿入することにより）コード用のレポーター遺伝子をＳＥＲＣＡ２蛋白質のＣ末端に挿入しても、ＳＥＲＣＡ２触媒活性は妨害されない。このようなレポーター遺伝子の発現を検出する手段は当技術分野で公知であり、詳細には記載しないが、以下に要約する。
【００７４】
例えば、本発明に従ってＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを導入した後にｉｎ ｖｉｖｏで発現されたＳＥＲＣＡ２を、免疫測定法によって検出することができる。この免疫測定法では、ＳＥＲＣＡ２蛋白質を液相中で利用し又は固相担体に結合させることができる。さらに、これらのアッセイで利用するＳＥＲＣＡ２蛋白質は、様々な方法で検出可能に標識することができる。さらに、ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に対する抗体を、血液や血清などのアッセイ試料中でのＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチド発現を検出するために利用することもできる。
【００７５】
簡単に言うと、このような抗体は、当技術分野で公知の手段によって調製することができる。例えば、ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に特異的な抗体は、抗原性のＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子ペプチドで非ヒト生物を免疫することによって調製することができる。このようなペプチドは天然の供給源から単離することができ（例えば、総説としてその開示内容を本明細書に組み込んだＰｏｐｏｖｉｃｈ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、２６１：Ｅ３７７〜Ｅ３８１、１９９１年に報告されているラットＳＥＲＣＡ２を単離するのに使用された方法を参照のこと）、或いは、α−アミノ基のｔ−ＢＯＣ又はＦＭＯＣ保護などの通常使用される方法により、過度に実験をすることなく合成することもできる。
【００７６】
後者の方法は、ペプチドのＣ末端から出発して、各段階で１つのアミノ酸が加えられる段階的合成である（Ｃｏｌｉｇａｎ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、９９１、ユニット９を参照のこと）。この場合に使用するペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、８５：２１４９、１９６２年、並びにＳｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ、固相ペプチド合成法（Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）（Ｆｒｅｅｍａｎ、サンフランシスコ、２７〜６２、１９６９年）に記載されているものなど様々な公知の固相ペプチド合成方法により、ポリマー１ｇ当たり０．１〜１．０ｍＭｏｌのアミンを含む共重合体（スチレン−ジビニルベンゼン）を使用して、合成することができる。
【００７７】
化学合成が完了するとすぐに、０℃で約１／４〜１時間、フッ化水素酸１０％アニソール液で処理することにより、ペプチドを脱保護しポリマーから切断することができる。試薬を蒸発させた後、ペプチドを１％酢酸溶液でポリマーから抽出し、次いで凍結乾燥させて未精製物質を得る。通常、溶媒として５％酢酸を使用するＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−１５を用いたゲル濾過などの技術によってこれを精製することができる。カラムの適切な画分を凍結乾燥すると、均質なペプチド又はペプチド誘導体が得られ、これらは、次いで、アミノ酸分析、薄層クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、紫外吸収分光法、モル旋光度、溶解度などの標準の技術により特徴を明らかにし、固相エドマン分解法によって定量することができる。目的のペプチドの抗原性は、そのペプチドで免疫された動物の抗体反応の大きさを判定する従来技術によって決定することができる。
【００７８】
抗原性のＳＥＲＣＡ２ペプチドを調製した後で、（ウサギ、マウス、又はラットなどの）哺乳動物にペプチドを導入することにより、免疫ペプチドに対する抗体を作製する。複数回注入による免疫化プロトコールが、抗原性ペプチドで動物を免疫する際に使用するのに好ましい（例えば、Ｌａｎｇｏｎｅ他編、「小用量の免疫原生物による抗血清の調製：皮内複数回注入（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ ｗｉｔｈ Ｓｍａｌｌ Ｄｏｓｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ）」、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、１９８１年を参照のこと）。例えば、フロイント完全アジュバントに乳濁させた１ｍｇの抗原性ペプチドを皮内注射し、その数週間後にフロイント不完全アジュバント中の同じ抗原を１回又は複数回追加することにより、通常、ウサギで良い抗体反応が得られる。
【００７９】
望むなら、免疫ペプチドは、当技術分野で公知の技術を使用して結合することにより、キャリア蛋白質に結合させてよい。ペプチドに化学的に結合されるこれらの普通に使用されるキャリアには、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び破傷風トキソイドが含まれる。次に、結合されたペプチドを使用して動物（例えばマウス又はウサギ）を免疫する。ＳＥＲＣＡ２は、現在、哺乳動物種間でかなり良く保存されていると考えられているので、ＳＥＲＣＡ２蛋白質の免疫原性を増大させるためにキャリア蛋白質を使用することが好ましい。
【００８０】
動物に産生されたポリクローナル抗体を、例えば、抗体が産生された対象のペプチドが結合されているマトリクスに結合させ、マトリクスから溶出させることによって、さらに精製することができる。当業者なら、ポリクローナル抗体、並びにモノクローナル抗体の精製及び／又は濃縮に関する免疫学分野では普通の様々な技術について知っていよう（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ他、ユニット９，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１年を参照のこと）。
【００８１】
モノクローナル抗体は、特異性があり調製が容易であるため、ＳＥＲＣＡ２発現の検出に使用するのに好ましい。モノクローナル抗体を調製するためには、マウス又はラットの免疫が好ましい。本発明で使用する「抗体」という用語は、無傷の分子、並びに、例えば、エピトープ決定基を結合することができるＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２’などのその断片も含むものとする。また、この文脈では、「本発明のｍＡｂ’ｓ」という用語は、ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に特異的なモノクローナル抗体を意味する。
【００８２】
モノクローナル抗体（「ｍＡｂ’ｓ」）を分泌するハイブリドーマの調製に使用する通常の方法は、公知である（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５、１９７５年）。簡単に言うと、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎに記載のように、この技術は、外科的検体から得、プールし、次いでＳＨＦＰ−１に融合させた、黒色腫、奇形癌、子宮頸癌、神経膠腫、又は肺癌である５名の別々の癌患者の排出性（ｄｒａｉｎｉｎｇ）所属リンパ節から単離したリンパ球を含む。ハイブリドーマは、癌細胞系に結合する抗体を産生するかどうかでスクリーニングした。
【００８３】
ｍＡｂ’ｓの抗原特異性の確認は、（酵素結合免疫測定法、即ち「ＥＬＩＳＡ」などの）比較的よく使うスクリーニング技術を使用して目的のｍＡｂの基本的な反応パターンを判定することによって、実現できる。あるｍＡｂを評価して、本発明のｍＡｂと同じ特異性を有するかどうか判定することも、前述のように単離した目的の抗原に本発明のｍＡｂが結合するのを試験対象のｍＡｂが妨げるかどうか判定することによって、過度に実験をすることなく、可能である。本発明のｍＡｂによる結合の低減により試験対象のｍＡｂが本発明のｍＡｂに競合することが示される場合は、それら２種のモノクローナル抗体が同じ或いは密接に関係するエピトープに結合する可能性が高い。
【００８４】
あるｍＡｂが本発明のｍＡｂの特異性を有するかどうか判定するさらに別の方法では、本発明のｍＡｂを通常反応性の抗原と一緒にプレインキュベートし、試験対象のｍＡｂがその抗原に結合する能力を阻害されるかどうか判定する。そのとき試験対象のｍＡｂが阻害される場合は、高い確率で、本発明のｍＡｂと同じ或いは密接に関係するエピトープ特異性がある。
【００８５】
ＭＨＣα及びＭＨＣβに共通するエピトープを認識するＳＥＲＣＡ２モノクローナル抗体は、検出するＳＥＲＣＡ２の構造が本質的に改変されていないかどうか判定するのに特に有用である。このようなｍＡｂ’ｓは、その開示内容を総説及び参考文献として使用するために本明細書に組み込んだ、Ｄｏｒｎ他、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６７：Ｈ４００〜Ｈ４０５、１９９４年に、再現するのに十分な詳しさで記載されている。
【００８６】
ＳＥＲＣＡ２発現を検出するために使用できる免疫測定法の例は、直接式又は間接式の競合及び非競合免疫測定法である。このような免疫測定法の例は、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、サンドイッチ法（イムノメトリックアッセイ（ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ））、及びウェスタンブロット法がある。ＳＥＲＣＡ２又はレポーター遺伝子産物に結合する抗体の検出は、生理試料の免疫組織化学的分析を含めて、順方向、逆方向、又は同時に両方向に作動する免疫測定法を利用して実施することができる。ｌａｃ−Ｚ又はβ−ｇａｌ（例えば、β−ガラクトシダーゼ）などのレポーター遺伝子産物を検出するための市販の分析キットが、この点で、使用するのに特に好ましい。
【００８７】
使用する抗原又は抗体の濃度は、免疫測定法のタイプ及び使用する検出可能な標識の性質に応じて変わる。しかし、使用する免疫測定法のタイプにかかわらず、利用する抗原又は抗体の濃度は、当業者が常法の実験を実施して容易に決定することができる。
【００８８】
このような抗原又は抗体は、多数の様々なキャリアに結合し、それに特異的に反応する抗原又は抗体の存在を検出するのに使用することができる。公知のキャリアの例には、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、並びに磁鉄鉱が含まれる。本発明では、キャリアの性質は可溶性でも不溶性でもよい。当業者なら、これに関して、使用するのに適した他のキャリアについて知っているか、常法の実験を実施してそれらを確認することができよう。
【００８９】
当業者には既知の多くの様々な標識及び標識方法がある。本発明で使用できる標識のタイプの例には、酵素、ラジオアイソトープ、コロイド金属、蛍光性化合物、化学発光化合物、及び生物発光化合物が含まれる。
【００９０】
或いは、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドは、その一般的技術を以下に要約する、当技術分野で既知の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコールを使用して（好ましくは従来の心臓組織の生検技術を使用して得た標的細胞試料中で）検出することができる。
【００９１】
精製又は未精製の任意の組織標本に由来する核酸を、それが標的核酸を含む特定の核酸配列を含む又は含むと推測されることを条件として、１種又は複数の出発核酸として利用することができる。従って、このプロセスは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含めて、ＤＮＡ又はＲＮＡを使用してよく、ＤＮＡ又はＲＮＡは１本鎖でも２本鎖でもよい。ＲＮＡを鋳型として使用する場合は、その鋳型をＤＮＡに逆転写するのに最適な酵素及び／又は条件を利用することになる。さらに、それぞれ１本の鎖を含むＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドも利用してよい。また、核酸の混合物を使用しても、以前の増幅反応で同じ又は別のプライマーを使用してここで作製した核酸をそのように使用してもよい。増幅するヌクレオチド配列は、大分子の一部分でもよく、或いは、別々の分子として最初に存在することもでき、従って、この特定の配列が核酸全体を構成する。増幅する配列は、最初に精製した形で存在する必要はなく、ヒトＤＮＡ全体に含まれるような複雑な混合物のごく一部分でよい。
【００９２】
試料の標的ヌクレオチド配列が２本の鎖を含む場合、鋳型として使用できるように核酸の鎖を分離することが必要である。鎖の分離は、別々のステップとして又はプライマー伸張生成物の合成と同時に実施することができる。この鎖の分離は、物理的、化学的、又は酵素的手段を含めて、様々な適切な変性条件を使用して実現することができる。「変性させる」という語は、これら全ての手段を含む。核酸の鎖を分離する１つの物理的方法は、核酸を変性するまで加熱するものである。通常の加熱変性は、約１〜１０分間、約８０〜１０５℃の温度を必要とする。鎖の分離は、ヘリカーゼとして知られている酵素群のうちの１つの酵素又はヘリカーゼ活性のある酵素ＲｅｃＡにより、ＤＮＡを変性することが知られているリボＡＴＰの存在下で誘導してもよい。ヘリカーゼを用いた核酸鎖の分離に適した反応条件は、Ｋｕｈｎ Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｂｅｒｌｉｎｇ（ＣＳＨ−Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４３：６３、１９７８年）に記載されており、ＲｅｃＡを使用する技術はＣ．Ｒａｄｄｉｎｇ（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１６：４０５〜４３７、１９８２年）に総説がある。
【００９３】
増幅する標的核酸を含む核酸が一本鎖の場合、１種又は２種のオリゴヌクレオチドプライマーを加えることにより、その相補鎖が合成される。単一のプライマーを利用する場合は、プライマー、重合用作用物質、及び後述する４種のヌクレオシド３リン酸の存在下で、プライマー伸長生成物を合成する。この生成物は、一本鎖核酸に相補的なものとなり、一本鎖核酸にハイブリダイズして、長さが不揃いな鎖の二重鎖を形成する。次にこの二重鎖を一本鎖に分離させて、一本に分離された相補鎖２本を生成することができる。或いは、２種のプライマーを一本鎖核酸に加え、記載したように反応を実施してもよい。
【００９４】
核酸の相補鎖を分離すると、その核酸がもともと二本鎖であったか一本鎖であったかにかかわらず、分離された鎖は、追加の核酸鎖を合成するための鋳型としていつでも使用できる。この合成は、プライマーが鋳型にハイブリダイズできる条件の下で実施する。通常、合成は好ましくはｐＨ７〜９、最も好ましくはｐＨ８の緩衝水溶液中で実施する。過剰モル（ゲノム核酸の場合、通常、プライマーと鋳型の比が約１０８対１）の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを、分離された鋳型鎖を含む緩衝液に加えることが好ましい。しかし、本発明のプロセスを診断で適用するのに使用する場合は、相補鎖の量が分からない可能性があり、従って、相補鎖に対するプライマーの量を確実に決定することはできない。しかし、増幅しようとする配列が複雑で長い核酸鎖の混合物に含まれるとき、実用的には、加えるプライマーの量は通常、相補鎖（鋳型）の量に対して過剰モルである。プロセスの効率を高めるためには、大過剰モルが好ましい。
【００９５】
いくつかの増幅実施形態では、基質、例えばデオキシリボヌクレオチド３リン酸のｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰを適量、プライマーと別に又は一緒に、合成混合物に加え、得られる溶液を約１〜１０分間、好ましくは１〜４分間、約９０〜１００℃に加熱する。この加熱期間の後、溶液をプライマーのハイブリダイズにとって好ましい室温まで自然冷却させる。冷却した混合物に、プライマー伸長反応を実施するのに適した作用物質（本明細書では「重合用作用物質」と呼ぶ）を加え、当技術分野で既知の条件下で反応を起こさせる。重合用作用物質は、熱安定性である場合は、他の試薬とともに加えてもよい。この合成（即ち増幅）反応は、室温から、最高ではそれを超えると重合用作用物質が機能しなくなる温度までで行うことができる。従って、例えばＤＮＡポリメラーゼが作用物質として使用される場合は、通常、温度は約４０℃以下である。
【００９６】
重合用作用物質は、酵素を含めて、プライマー伸長生成物の合成を実現するように機能するどんな化合物又は系でもよい。この目的に適した酵素には、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼ、他の入手可能なＤＮＡポリメラーゼ、ポリメラーゼ突然変異蛋白質、逆転写酵素、リガーゼ、及び、熱安定性酵素（即ち、変性を引き起こすのに十分な高い温度下に置かれた後でも、プライマー伸長を行う酵素）を含めて、他の酵素が含まれる。適切な酵素を使用すると、ヌクレオチドの正しい組み合わせがうまく進み、各変異ヌクレオチド鎖に相補的なプライマー伸長生成物が形成される。通常、合成は各プライマーの３’末端で開始され、合成が終わるまで鋳型鎖に沿って５’方向に進行し、様々な長さの分子を生成する。しかし、前述したのと同じプロセスを使用して、５’末端で合成を開始し、別の方向に進行する重合用作用物質があるかもしれない。
【００９７】
新しく合成された変異ヌクレオチド及びその相補的な核酸鎖は、前述のハイブリダイズする条件下で二本鎖分子を形成し、このハイブリッドをプロセスの後続のステップで使用する。次のステップでは、新しく合成された二本鎖分子を前述した手順のいずれかを使用して変性条件において、一本鎖分子を生成させる。
【００９８】
上記のプロセスを一本鎖分子に対して繰り返す。反応が先に規定した条件下で進行するように、必要なら、追加の重合用作用物質、ヌクレオシド、及びプライマーを加えてよい。やはり、合成各オリゴヌクレオチドプライマーの一端で開始され、鋳型の一本鎖に沿って進行し、追加の核酸を生成する。このステップの後、伸長生成物の半分は、２種のプライマーが結合した特定の核酸配列からなるはずである。
【００９９】
変性及び伸長生成物合成のステップは、標的の変異ヌクレオチド配列を検出に必要な量まで増幅するのに必要なだけ繰り返すことができる。生成される変異ヌクレオチド配列の量は、指数関数的に増加する。
【０１００】
増幅した生成物は、放射性プローブを使用せずに、サザンブロット分析により検出することができる。このようなプロセスでは、例えば、標的ヌクレオチド配列を極めて低いレベルで含むＤＮＡの少量のサンプルを増幅し、サザンブロット法により分析する。シグナルが高レベルで増幅されると、非放射性プローブ又は標識の使用が容易になる。
【０１０１】
定量的ＰＣＲを実施するための好ましい方法は、１種又は複数の塩基対に誘導された突然変異を含み、その結果、配列及び大きさが標的の鋳型遺伝子と異なる競合物になった競合鋳型を使用して実施する競合的ＰＣＲ法である。プライマーのうちの１種をビオチン標識し、或いは、好ましくは、結果として得られるＰＣＲ生成物の一方の鎖（通常アンチセンス鎖）を、アミノ−カルボキシル、アミノ−アミノ、ビオチン−ストレプトアビジン、又は他の適度に緊密な結合によって、適切な反応物に緊密に結合された固相の支持体に固定化できるように、アミノ化する。ＰＣＲ生成物、固相の支持体、及び反応物の間の結合が共有結合であり、従って、変性条件下で結合を解けにくいものにすることが最も好ましい。
【０１０２】
ＰＣＲ生成物のアミノ化又はビオチン標識した鎖を固定化した後、結合していない相補鎖をアルカリ性の変性洗浄液中で分離し、反応環境から除去する。標的に対応する配列特異的なオリゴヌクレオチド（「ＳＳＯ’ｓ」）及び競合核酸を検出タグで標識する。次に、ＳＳＯを、除去された結合していないセンス鎖との競合が無い状況でアンチセンス鎖にハイブリダイズさせる。適切な分析試薬を加え、使用した検出タグ及び固相支持体の手段に適したＥＬＩＳＡ測定法、好ましくはＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダーによって、ハイブリダイゼーションの程度を測定する。標的鋳型及び競合鋳型を含む鋳型を増幅するＰＣＲ反応から別々に得られた標準曲線を用いて測定値を比較して、標的の核酸含有量を導出する。
【０１０３】
この方法は、定量的で、ＰＣＲサイクルの数によって変わらず、ＳＳＯプローブとＰＣＲ生成物の相補鎖との競合に影響を及ぼされないという点で有利である。
【０１０４】
或いは、重合ステップ及びハイブリダイゼーションの全ステップを固相の支持体上で実施することもできる。この方法では、固相支持体上に捕捉されるのは、ＰＣＲ生成物の鎖ではなく、ヌクレオチド重合プライマー（好ましくはオリゴヌクレオチド）である。次に、標的及び競合核酸ＰＣＲ生成物を、溶液の状態で固相支持体に加え、重合ステップを実施する。重合生成物の結合されていないセンス鎖を、前述の変性条件下で除去する。
【０１０５】
標的核酸と競合核酸の比を、適切な測定手段（好ましくはＥＬＩＳＡリーダー）を使用して標識されたオリゴヌクレオチドＳＳＯプローブを検出することによって決定することができる。この方法の効率は非常に高くできるため、重合ステップの連鎖反応が不必要になり、従って、この方法を実施するために必要な時間が短縮できる可能性がある。重合の最終生成物をハイブリダイゼーションのために反応管から固相支持体に移動させる必要がなく、従って、それらが損失又は損傷する潜在的可能性が限られてくるため、この方法の正確性も高くなっている。しかし、特定の試料にとって必要なら、ＰＣＲを使用して標的及び競合核酸を別々の反応管で増幅させ、続いて固相支持体上で最終の重合反応を実施してよい。
【０１０６】
結合したＰＣＲ生成物の形成を示す、当業者に既知の様々な検出可能のシグナルを提供することができる分子（標的及び競合ＰＣＲ生成物の形成を示す別の色を呈する、標識したヌクレオチド発色団など）を、反応の最後の数サイクルの進行中に反応溶液に加えることができる。標的核酸と競合核酸の比は、ＥＬＩＳＡによって又は他の適切な測定手段及び固定化したハイブリダイゼーションプライマーの３’末端に結合させた検出タグに反応する試薬によって、求めることができる。この方法は、従来の非競合的ＰＣＲプロトコールを実施することによって、（定量せずに）特定の遺伝子が試料中に存在するかどうか検出できるように適合させることもできる。
【０１０７】
当業者なら、前述の方法で使用するのに適したプライマーを選択する方法を知っているか、容易に確認できよう。前述の技術に関するさらに詳細な内容については、Ｋｏｈｓａｋａ他、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２１：３４６９〜３４７２、１９９３年；Ｂｕｎｎ他、米国特許第５，２１３，９６１号の開示内容、並びにＩｎｎｉｓ他、ＰＣＲプロトコール：方法と適用のガイド（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、１９９０年を参照できよう。これらの開示内容は、定量的ＰＣＲプロトコールに関する当技術分野の状況を例示するためだけに、本明細書に組み込む。
【０１０８】
ＰＣＲ、オリゴマー制限（Ｓａｉｋｉ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：１００８〜１０１２、１９８５年）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブ分析（Ｃｏｎｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０：２７８、１９８３年）、オリゴヌクレオチドライゲーション分析（ＯＬＡ）（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１０７７、１９８８年）などの、特定のＤＮＡ配列の検出に通常適用されるどんな方法によっても、前述したように検出したＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドをさらに、溶液の状態で又は固体支持体に結合させた後で、評価、検出、クローン化、配列決定などすることができる。ＤＮＡ分析に関する分子技術の総説があり、当技術分野で公知である（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：２２９〜２３７、１９８８年）。
【０１０９】
本発明を十分に説明してきたが、その実施を例示する実施例を以下に記載する。しかし、これらの実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【０１１０】
実施例において、略語「ｍｉｎ」は分を、「ｈｒｓ」及び「ｈ」は時間を意味し、（ｍｌなどの）測定単位は標準の略語によって示す。
【実施例１】
【０１１１】
ＡＡＶベクターによるＳＥＲＣＡ２のクローニング及び発現並びにマウス心筋の心筋細胞機能の評価
ＳＥＲＣＡ２ ｃＤＮＡを従来のクローニング技術を使用してアデノ随伴ウイルスベクター中にクローニングした。ＳＥＲＣＡ２を発現するアデノ随伴ウイルス又はＧＦＰレポーター配列の構築は、基本的に以下のように実施した。
【０１１２】
アデノ随伴シャトルベクターをＳａｍｕｌｓｋｉ他、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６３：３８２２〜３８２８、１９８９年に記載されているプラスミドｐＳｕｂ２０１から誘導した。このプラスミドのＸｂａ Ｉ断片を、マルチクローニングサイト及びポリアデニル化シグナルの前にある５７２塩基対のヒトＣＭＶエンハンサー／プロモーター断片に連結した。このプラスミドをＡＡＶ−シャトルと呼び、サイズは約５０００塩基対である。
【０１１３】
３’末端でフラッグシグナルペプチドに融着させたラットＳＥＲＣＡ２ａ、及びＫｐｎ Ｉ／Ｘｂａ Ｉ酵素又はＨｉｎｄ ＩＩＩ／Ｘｂａ酵素を使用してＡＡＶ−シャトル中にクローニングした緑蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のコード配列が、それぞれ報告されている（Ｈｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ １００：９７４〜９８０、１９９９年）。組換えクローンをＤＮＡ配列決定により確認し、大量のプラスミドをＣｓＣｌ大量調製（ｍａｘｉｐｒｅｐ）プロトコールによって精製した。プラスミドｐＤＧはＧｒｉｍｍ他によって記載されており（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９：２７４５〜２７６０、１９９８年）、同様にＣｓＣｌ精製した。
【０１１４】
純粋な感染性ウイルス粒子を生成するために、挿入されたｃＤＮＡを含むＡＡＶ−シャトルプラスミド及びｐＤＧプラスミドを共に、ＣａＰＯ４共沈法を使用して２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。各ウイルス調製物のために、サブコンフルエントな２９３Ｔ細胞を蒔いた直径１５ｃｍの５０セル培養プレートを使用した。各１５ｃｍプレートに、１８マイクログラムのシャトルプラスミド及び７０マイクログラムのｐＤＧプラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクションの翌日に１０％ウシ胎児血清を含む新鮮なＤＭＥＭに培地を変更し、細胞を、５％ＣＯ２、摂氏３７度でさらに２日間インキュベートした。
【０１１５】
ウイルス粒子の回収は、２．５ｍｌのＤＭＥＭ中で各プレートから２９３Ｔ細胞をかきとることによって行った。次に、この細胞を遠心し、２５ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁させ、摂氏−８０度で凍結させた。さらに２回の凍結融解サイクルの後、１００マイクログラムのＤＮアーゼ Ｉ及びＲＮアーゼ Ｈを加え、懸濁液を摂氏３７度で３０分間インキュベートした。もう一度３０００ｇで遠心した後、上清を０．５％デオキシコレートに加え、摂氏３７度で３０分間インキュベートした。次に、この溶液を、５マイクロメーター及び０．８マイクロメーターのシリンジフィルターに順番に通して濾過し、３ｍｌのヘパリン−アガロース懸濁液とともに室温で１時間回転台の上で回転させた。次に、この懸濁液をガラスカラムの上に載せ、ヘパリン−アガロース樹脂を０．２５４Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳ２５ｍｌで洗浄した。洗浄後、ウイルス粒子を０．５５４Ｍ ＮａＣｌを含むＰＢＳで溶出し、タイター評価のために少量の画分で保存した。最高のタイターの画分をプールし、ＰＢＳで透析し、摂氏４度で保存した。クローニングスキーム及び適切な制限部位の略図を図４に示す。
【０１１６】
次に、甲状腺機能低下マウスの左心室壁にウイルスベクターを投与した。甲状腺の状態が減退したマウス又は甲状腺機能低下マウスは、心臓の収縮性が低減しカルシウムトランジェントが遅くなっている。アデノウイルスベクターを、５〜１０μｌのアリコートで送り込み、左心室壁の異なる５つの部分に注入した。
【０１１７】
標的の導入遺伝子を含むＡＡＶの発現効率は一定で、当技術分野で公知である。これにより、心筋細胞の約５０％で導入遺伝子が発現する。核コードβＧａｌを発現するＡＡＶ又はアデノ随伴ウイルスをマウスの心臓の左心室自由壁に注入することによっても、同様の結果が得られた（図５）。ここでは、アデノウイルス又はＡＡＶ注入の２、４、６、又は８週間後に動物を屠殺した。マウスの心臓からのデータにより、ＡＡＶの強い発現は注入後６又は８週間持続するが、アデノウイルスの発現は有意に低減したことが示されている。
【０１１８】
ＳＥＲＣＡ２発現ＡＡＶベクターの注入４週間後に、いわゆるランゲルドルフ単離灌流装置で心臓の収縮性能を判定した。肺静脈を通して左心室に風船を挿入し、収縮機能、特に収縮期の圧力上昇又はｄＰ／ｄｔの最高値、拡張期の圧力低下又はｄＰ／ｄｔの最小値、及び収縮期全体の圧力を、対照としてＧＦＰ ＣＲＥを発現するＡＡＶを注入した心臓で判定した。甲状腺機能低下性マウスの心臓において、全ての収縮性周辺部で非常に有意な上昇が得られ、収縮機能が正常範囲に回復した。図６は、フラッグ標識したＳＥＲＣＡ２を発現するＡＡＶを注入した甲状腺機能低下性マウスから単離したマウス心臓の収縮性能についてのデータを示す。収縮期の収縮速度ｄＰ／ｄｔの最大値は、ＧＦＰ発現ＡＡＶを注入したマウスと比べて、有意に上昇した。同様に、拡張期の弛緩速度即ち−ｄＰ／ｄｔは、ＡＡＶ ＳＥＲＣＡを注入された甲状腺機能低下性マウスで有意に上昇し、収縮期圧力も、ＳＥＲＣＡ２ａを発現するＡＡＶを注入したマウス心臓で有意に上昇した。
【実施例２】
【０１１９】
ＳＥＲＣＡ２発現トランスジェニック動物及び対照動物における圧力過負荷モデル及び心臓肥大モデル
ＣＨＦ心臓の条件を模倣した条件下で導入遺伝子を含む動物におけるＳＥＲＣＡ２の追加発現の効果を試験するために、性別、年齢、体重が同程度の動物群を処理して、心臓狭窄を誘発させ、腹大動脈狭窄を発症させ、食塩負荷させた。ＣＨＦ心臓で顕著なこのような条件下で、これらの動物は心肥大（ＣＨ）を発症し、心臓への圧力過負荷（ＰＯ）に伴う心臓異常を起こす。導入遺伝子発現を心臓組織に対して特異的にするために、ＳＥＲＣＡ２ ＣＭＶ／β−アクチントランスジェニック動物を使用した。
【０１２０】
簡単に言うと、このような動物を開発するために、実施例１で記載したＳＥＲＣＡ２／ＡＡＶベクター構築体を使用して開発したトランスジェニック動物（体重約２００〜２５０ｇのラット）及び対照の動物を腹腔動脈のレベルで腹大動脈を分離するために麻酔し、トランスジェニック動物では、ステンレススチール製のヘモクリップ（Ｅｄｗａｒｄ Ｗｅｃｋ＆Ｃｏ．、ノースカロライナ州）を使用して腎動脈の上で大動脈を外科的に狭窄した。後者の手順により、大動脈管腔の大きさが約５０％小さくなった。
【０１２１】
手術の約２日後から、大動脈を狭窄したトランスジェニック動物に、ゴマ油に懸濁させたデオキシコルチコステロンを１週２回筋肉内注射し（２５ｍｇ／ｇ体重）、飲料水中１％塩化ナトリウムを与えた。通常は手術後１〜２週間内に生じるＣＨを発症するかどうか、全ての動物を心臓超音波（心エコー検査）を用いてモニターする。さらに、これらの動物は、圧力過負荷をかけることにより急性の損傷期を経験させる。
【実施例３】
【０１２２】
トランスジェニック動物におけるＣＨＦ状態に対する適応反応
ＡＡＶ／ＳＥＲＣＡ２構築体を使用して開発したトランスジェニック動物は、手術の６週間後に試験すると（ＳＥＲＣＡ２のｍＲＮＡレベルを検出して判定された）ＳＥＲＣＡ２遺伝子転写が有意に減少し、通常、１０〜１２週で心不全を発症し始める。ＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡレベル及び蛋白質レベルを、前述のノーザンブロット法及びウェスタンブロット法又は他の分析技術（例えば、やはり前述したＰＣＲ）によって決定した。トランスジェニック動物及び対照動物の（ＳＲカルシウムトランジェントに関係している）酵素活性レベル及び左心室機能を下記に記載するように測定した。他のＣＨＦ動物モデル及び本発明の方法による治療を受けているヒトにおいて、以下に記載するプロトコールに従って、心臓性能に関する同じパラメータを測定することができる。
【０１２３】
心臓収縮機能の評価
Ａ．心室の機能性を判定するための心エコー検査のプロトコール（ｉｎ ｖｉｖｏ）
心エコー図の撮像は、７Ｍｈｚで作動する２周波フェーズドアレイトランスデューサー、及び積算ドプラー出力機能を備えた「ＡＣＣＵＳＯＮ（登録商標）」１２８超音波コンソールを用いて、適切な動物モデルで実施する。心エコー事象のタイミングは、皮下電極から得られる同時の心電図記録と相関がある。撮像の深さは２ｃｍ、セクタ角度はフレームレートが５０／秒になる６０にセットする。パワー設定は７５ｄＢとする。２次元イメージを使用して、Ｍモード記録（１０００ライン／秒で得られる）に適したカーソル位置を選択することができる。
【０１２４】
軽く麻酔した動物をうつ伏せに置き、胸骨近くの左の肋間隙を通して撮像を実施する。傍胸骨長軸図及び短軸図を得、ビデオテープに録画し、上述したように、２次元図を使用して心室の中央レベルで実施するＭモード記録のためのカーソル位置を導く。全ての関連した測定値は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｅｃｈｏｃａｒｄｉｏｇｒａｐｈｙ推奨の臨床的慣行に関する判断基準を使用して、２次元化したＭモード記録から得ることができる。隔壁の厚さは、拡張末期における立ち上がりから立ち下がりまでを測定する。
【０１２５】
後壁心内膜は、収縮期の傾きの最も大きい線で特定され、拡張末期における後壁の立ち上がりから心外膜境界の立ち上がりまでを測定する。左心室拡張末期径（ＬＶＥＤＤ）は、心室径が最大の時点で、心室中隔の立ち下がりから後壁の立ち上がりまでを測定する。左心室収縮末期径（ＬＶＥＳＤ）は、同じ判断基準を用いて、心室径が最小の時点で測定する。収縮機能の指標としての心室内径短縮率（ＦＳ）は、［（ＬＶＥＤＤ−ＬＶＥＳＤ）／（ＬＶＥＤＤ ０）］×１００で算出する。
【０１２６】
Ｂ．試料液を抜き取り、心臓内の血行動態パラメータを決定するためのマイクロマノメータ付きカテーテルによる処置のためのプロトコール（ｉｎ ｖｉｖｏ）
マウスを例にすると、体重２０〜３０ｇの成体マウス（ＰＯ有り又は無しの対象及びトランスジェニック）をケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与（ＩＰ））及びキシラジン（５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与（ＩＰ））の混合物で麻酔する。解剖顕微鏡下で、動物をうつ伏せにし、正中線頚部切開を行って気管及び頚動脈を露出させる。次に、２０ゲージの鈍針を、総（ｔｉｔａｌ）容量０．２ｍｌ、呼吸数１００／分のボリュームサイクル方式げっ歯類用人工呼吸器（ハーバードアパレイタス（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）社製）に連結されている気管カニューレを補助するように気管に通す。換気の妥当性を、胸部の膨張を目視検査して判定する。挿管後、大動脈圧を測定するために、１本の頚動脈に、液体入りカテーテル（管状になるよう火炎で延伸したポリエチレン（ＰＥ））付きカニューレを挿入する。次に、胸部を開き、２Ｆ高忠実度のマイクロマノメータ（ミラー（Ｍｉｌｌａｒ）社）を僧帽弁から挿入して、ＬＶ中に取り付ける。
【０１２７】
（例えば、オンライン検出装置を使用して）ＬＶ収縮期圧力及び拡張期圧力、ｄＰ／ｄｔの最大値及び最小値、並びに大動脈圧を継続的に測定して、血行動態パラメータをモニターする。データは、１５００試料／秒の速度で得られ、高忠実度のカテーテルの周波数応答は１０，０００Ｈｚ超まではフラットである。マウスの心拍速度が速い（３００〜５００／分）ため、そのｄＰ／ｄｔを正確に測定するためにこれらの高いサンプルレートが必要である。
【０１２８】
血行動態パラメータのオフライン分析は、ＬＶ圧力低下の時定数（タウ（τ））の計算に加えて最小及び最大ＬＶ圧力並びに大動脈血圧の測定を含むことができる。特に拡張期弛緩の最初の等容性期を反映するタウ（τ）の値の決定は、ＳＥＲＣＡ２機能に密接に関連づけられている。
【０１２９】
Ｃ．単離した筋肉生検組織において筋細胞の短縮を判定するためのプロトコール（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
このプロトコールをラットで例示すると、切除による損傷を最小限にし拘縮を防ぐために２５ｍＭ ＢＤＭを含む酸素化タイロード液中で左心室乳頭筋を切除し、受動的伸張を避ける。その端を短い５−０シルク縫合糸で結びつけて調製物の心室壁及び弁の端に付着させ、過剰伸張を防ぐ。筋肉の一方の端はＣａｍｂｒｉｄｇｅ４００ Ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ ｆｏｒｃｅ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ（等尺性力トランスデューサー）（フルスケール５ｇ、分解能１００μｇ）のガラスロッドに付着し、もう一方の端はトランスデューサー台（Ｎｅｗｐｏｒｔ４２３、±１μｍ）上の小型のステンレススチールフックに付着するようにする。都合よく見られるように、１ｍｌの試験浴をＯｌｙｍｐｕｓ ＳＺ４５ステレオ顕微鏡の視野内におく。浴の温度を３３℃に維持する。
【０１３０】
次に、静止時の力が最初にトランスデューサーチャネルに記録されるゆるんだ長さに筋肉を調整し、ＢＤＭを洗い流し、（例えば、Ｇｒａｓ刺激装置を使用して）双極性の刺激用電極を浴中に沈める。筋肉を、０．２Ｈｚ（閾値より２０％高い）で刺激し、３０分後、灌流液を［Ｃａ２＋］０．５ｍＭ溶液から［Ｃａ２＋］２．０ｍＭ溶液に切り換える。全ての灌流液を１００％Ｏ２でバブリングする。
【０１３１】
定常状態での等尺性張力の発生は、筋肉長の増加で測定し、発生した張力が最大になるＬｍａｘに対する割合として表す。（結果をｉｎ ｖｉｖｏの筋肉組織性能に外挿する際に）使用する筋肉の長さが短いことを補正するために、張力のピーク時に短くなる歪みを、筋肉上に置いた対の表面細粒を使用して測定し、ビデオカメラで録画する。
【０１３２】
ＮＩＨ Ｉｍａｇｅ １．４７を使用してＤａｔａ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎビデオフレームグラッバーボード付きＭａｃｉｎｔｏｓｈ Ｃｅｎｔｒｉｓ ６５０上でマーカー位置を検出しデジタル化することが好ましい。任意の固定した基準長に関する歪みを使用して長さの縮尺を補正すると、長さ−張力曲線の下降を打ち消すことが示された。
【０１３３】
収縮性は、等尺性の応力−歪み曲線の傾きで表され、このときの応力は発生した張力（静止期全体）を筋肉の断面積で割った値から計算する。この断面積は、機械的試験後に（その重量から決定した）標本の体積を、両端の間の無負荷の筋肉の長さで割ることにより推定する。細胞外Ｃａ２＋濃度０．５〜２．５ｍＭの関数としてこれらのプロトコールを繰り返すことにより、これらの調製物の潜在的なＣａ２＋感度を特徴付けることが可能になる。
【０１３４】
これらの実験のＳＥＲＣＡ２機能及びＥＣ結合をさらに特徴づけるために、Ｎａ／Ｃａ交換がＮａを含まないタイロード液で遮断されたとき、及び筋小胞体のカルシウム蓄積が１０ｍＭカフェインで遮断されたときの弛緩時間を測定することによって、ＳＥＣＲＡ２のポンプ機能を試験する。Ｎａ／Ｃａ交換を測定すると、弛緩時間は約３０％遅くなる。試験筋肉の弛緩特性は、チャートレコーダ（例えば、Ｇｏｕｌｄ ２２００レコーダ）及び高速（４０ｍｍ／秒）のマイクロコンピュータ取得システム（例えば、市販のＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ Ｔｒｅｅ）に記録された等尺性張力の追跡から、筋肉長とカルシウムの関数として決定される。測定されるパラメータには、ピーク張力から９０％回復までの時間及び等尺性の力の低減の指数時定数が含まれる。筋節の長さが損傷されていない中央の筋肉を一定に保つように筋肉長が制御されると、等尺性弛緩が有意に延長されることが研究により示されているので、これらの測定値は前述のアーチファクトにも当てはまり、補正可能である。
【０１３５】
前述したのと同じ手法を用いて、解剖顕微鏡下でラットの左心室から単離した長くて薄い均質な梁柱を使用して、収縮の研究を実施することもできる。梁柱を使用して研究すると、従来の乳頭筋調製物からは得られない筋肉の一連の弾性があるため、拡張期収縮機序における絶対的変化に関する、アーチファクトとは無関係なより具体的な情報が得られる。左心室壁の他の部分領域を、辺縁検出及び細胞内Ｃａ２＋トランジェントの研究をするために心筋細胞を単離するのに使用できる。
【０１３６】
Ｄ．心筋細胞の単離及びカルシウムトランジェントレベルの評価のためのプロトコール（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
心筋細胞は、コラゲナーゼ灌流法を使用して成体ラットの心臓から調製することができる。この筋細胞は、４％ウシ胎児血清の不在下又は存在下で少なくとも４日間維持し、成体の心筋細胞の形態及び代謝的特徴を維持することができる。１匹の成体ラットの心臓から、９〜１０ｘ１０６個の生存可能な筋細胞を得ることができる。
【０１３７】
心筋細胞は、心室壁の小片から調製することもできる。これにより、筋細胞機能、乳頭筋機能、並びに同じ心臓から得られるＳＥＲＣＡ２遺伝子発現及びＳＥＲＣＡ２機能に関係するパラメータについて判断することが可能になる。このために、心室組織を細かく刻み、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ３、３．４ｍＭ ＭｇＣｌ２、３０ｍＭタウリン、及び２ｍＭカルニチンを追加したＣａ２＋を含まない改変Ｊｏｋｌｉｋ最少必須培養液（ＭＥＭ）中で洗浄する。次に、この組織を０．１％ コラゲナーゼ タイプＩＩ（ワーシントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）社）、０．１％ＢＳＡフラクションＶ、及び２５μＭＣａＣｌ２を含むＭＥＭで消化する。連続的な酸素添加のもと、３２℃で組織を穏やかに攪拌しながら、酵素消化を３０〜４０分間継続する。口径の大きな血清ピペットで穏やかに粉砕することによって、最終的に細胞を完全に分散させる。
【０１３８】
次に、細胞を３００μＭナイロンメッシュに通して濾過し、洗浄する。次に、カルシウムレベルを徐々にその場の濃度が１μＭになるまで上昇させる。この手順により、最大２ｘ１０６細胞／心臓を得ることができ、その６０〜７０％が以下に記載する研究で使用可能な生存可能な棒形の筋細胞である。
【０１３９】
単離した成体ラットの心筋細胞（非培養）を１１８ｍＭ ＮａＣｌ、４．８ｍＭ ＫＣＬ、１．２ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１．２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１１ｍＭグルコース、及び２５ｍＭ Ｎａ−Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−エタンスルホン酸を含む１０ｍｌの溶液中に懸濁させ、５００μｌの細胞懸濁液を１．５ｍｌの普通のタイロード液に加え、Ｉｎｄｏ Ｉのアセトキシメチルエステル誘導体のＤＭＳＯ中１ｍＭ溶液５μｌを加える。細胞を室温で１５〜２０分間インキュベートする。次に、Ｉｎｄｏ Ｉ添加の均一性、及びきれいな横紋を伴う棒形細胞の形態に基づき細胞を選別する。石英光学素子を装備したＮｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ顕微鏡の台上に取り付けた小型灌流チャンバーに細胞を移す。細胞を灌流チャンバーの底に自然沈降させ、９０％Ｏ２−５％ＣＯ２でガス補給し３７℃で維持したタイロード液を用いて５ｍｌ／分で連続的に灌流する。細胞を外部の白金電極を用いて０．２、０．３３、１．０、２．０、及び５．０Ｈｚで駆動し、Ｃａ２＋トランジェントを蛍光定量によって測定する。同様の研究を、新生児期のラット又はマウスの筋細胞を使用して実施することもできる。Ａｄｖ ＳＥＲＣＡ２を新生児筋細胞に感染させると、カルシウムトランジェントが顕著に低減する。
【０１４０】
カルシウムトランジェントレベルに関しては、カルシウム２＋＋トランジェントが最も低減するための時間は、ＳＥＲＣＡ２導入遺伝子を含む陽性の筋細胞において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されるのと同様の程度まで有意に短縮された（実施例４、図３、ｐ＜０．０５）。心室圧に関しては、左心室で得られた最大圧力（ＬＶｄＰ／ｄｔ最大値）は、トランスジェニック動物において有意に大きかったが、最小レベルの場合、心室の筋肉は、トランスジェニック動物において拡張期弛緩がより速くなる傾向を示した（ｎ＝３、コントロール（ｎ＝５）と比べて）。動物で検出したＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡ及び蛋白質レベルを図１及び図２に示す。これらのデータは、心筋のカルシウム輸送及び拡張期弛緩が、予測用動物モデルで本発明の方法を適用することにより、有利な影響を受けるという原理を証明している。
【実施例４】
【０１４１】
ＳＥＲＣＡ２発現アデノウイルスベクターでトランスフェクションした後の心筋細胞機能のＩＮ ＶＩＴＲＯでの評価
簡単に言うと、新生児の心筋細胞をＳＥＲＣＡ２アデノウイルスベクターでトランスフェクトし、実施例３で記載したようにカルシウムトランジェントを測定し、対照（トランスフェクトされていない）細胞と比べる。図３において、細胞＃４２は対照の新生児心筋細胞の挙動の平均を表し、細胞＃２７は、トランスフェクトした新生児心筋細胞の挙動の平均を表す（ＡＤＶ）。図３で示されるように、カルシウムトランジェントの最大減少の半分までの時間は、対照細胞と比べてトランスフェクトした細胞で３３±１９％短縮された（ｎ＝４、ｐ≦０．０１）。これらのデータは、カルシウムトランジェントがＳＥＲＣＡ２ ＡＤＶでトランスフェクトした筋細胞で増大され、その結果、ｉｎ ｖｉｖｏで測定すれば、心筋でより速い拡張期弛緩が促進されるはずであるという原理の証拠を提供する。
【０１４２】
本発明のいくつかの実施形態を記載してきた。しかし、本発明の趣旨及び範囲を逸脱することなく様々に改変を加えることができることが理解されよう。従って、本発明は例示した特定の実施形態によってではなく、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることが理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】（例として、アデノウイルスのＳＥＲＣＡ２構築体を使用して開発した）マウスにおけるＳＥＲＣＡ２導入遺伝子の発現を示したウェスタンブロットを示す図である。レーン１〜２はα−筋節アクチンの発現を示し、レーン３は、分子量マーカーを示し、レーン４〜５はＳＥＲＣＡ２発現を示す。
【図２】ＳＥＲＣＡ２をコードする数種のアデノウイルス、すなわち、例えばＣＭＶプロモーター（ＨＨ−１、ＨＨ−２、及びＳＡＩ−３）又はＴＫプロモーター（ＴＫ）の制御下にあるベクターなどのうちの１種でトランスフェクトしたマウス由来の心筋細胞におけるラットＳＥＲＣＡ２ ｍＲＮＡの存在を示したノーザンブロットを示す図である。対照の構築体は、ＳＥＲＣＡ２ポリヌクレオチドを含まなかった（ｃｔｒｌ）。（ ）内の数字は、各構築体のプラーク形成単位（ｐｆｕ）の数を示し、Ｌ６細胞をアデノウイルス構築体で４８時間感染させ、抽出し、細胞性ＲＮＡ全体をゲル上で分離し、次いでＳＥＲＣＡ２のｃＤＮＡをＲＮＡにハイブリダイズさせるノーザン分析法によって決定した。
【図３】例として、アデノウイルスベクターでトランスフェクトした新生児の筋細胞において検出されたカルシウムトランジェント（平均値は細胞＃２７で表されている）及びトランスフェクトされていない新生児の筋細胞において検出したカルシウムトランジェント（平均値は細胞＃４２で表されている）を示す図である。カルシウムトランジェントは蛍光定量法で測定し、時間（ｘ軸）の関数として表される。
【図４】例として、ベクターにＳＥＲＣＡ２ａ配列を挿入するためのクローニングスキーム及び適切な制限部位を示す図である。具体的には、ラットＳＥＲＣＡ２ａを３’末端でフラッグシグナルペプチドに融着させたＳＥＲＣＡ２ａ−フラッグが、ヒトＣＭＶプロモーターのもと、ＸｂａＩ／ＢａｍＨＩ及びＢｇＩ ＩＩ／ＫｐｎＩ制限部位に挿入される。
【図５】マウスの心臓の左心室自由壁にＡＡＶ又はアデノ随伴ウイルスを注入し、注入の２、４、６、及び８週間後に発現している核コードβｇａｌを示す図である。
【図６】ｒＡＡＶ遺伝子送達４週間後に、単離して灌流させた心臓の機能測定値に対するＳＥＲＣＡ２ａ−フラッグ発現の効果を甲状腺低下症マウスのＧＦＰ対照と比較して示す図である。＊は、ＡＡＶ−ＧＦＰ処理したマウスと有意に（ｐ＜０．０５）異なることを示す。ｒＡＡＶ−ＳＥＲＣＡ−フラッグ処理をしたマウスの機能が、ＡＡＶ−ＧＦＰ処理をしたマウスの機能より改善していることに留意されたい。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＥＲＣＡ２をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを宿主の心筋に送達することを含む、宿主の心筋細胞の筋小胞体へのＳＥＲＣＡ２媒介カルシウムイオン輸送を増大させるための方法であって、前記導入遺伝子の発現が、処理されていない筋細胞と比べて処理された筋細胞で、ＳＥＲＣＡ２媒介カルシウムイオン輸送の増大を誘起する方法。
【請求項２】
前記ＡＡＶベクターがコロイド分散系に含まれている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記宿主がうっ血性心不全と診断されたことがある請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記宿主がヒトである請求項３記載の方法。
【請求項１】
ＳＥＲＣＡ２をコードする導入遺伝子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを宿主の心筋に送達することを含む、宿主の心筋細胞の筋小胞体へのＳＥＲＣＡ２媒介カルシウムイオン輸送を増大させるための方法であって、前記導入遺伝子の発現が、処理されていない筋細胞と比べて処理された筋細胞で、ＳＥＲＣＡ２媒介カルシウムイオン輸送の増大を誘起する方法。
【請求項２】
前記ＡＡＶベクターがコロイド分散系に含まれている請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記宿主がうっ血性心不全と診断されたことがある請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記宿主がヒトである請求項３記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２００６−５１８９９６（Ｐ２００６−５１８９９６Ａ）
【公表日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００９１１（Ｐ２００６−５００９１１）
【出願日】平成１６年１月１２日（２００４．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０００７１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６２６１８
【国際公開日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ
【出願人】（３０４０５６８９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (9)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【住所又は居所原語表記】１１１１ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｏａｋｌａｎｄ， ＣＡ ９４６０７−５２００， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年８月２４日（２００６．８．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１月１２日（２００４．１．１２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０００７１９
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０６２６１８
【国際公開日】平成１６年７月２９日（２００４．７．２９）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ
【出願人】（３０４０５６８９９）ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア (9)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＲＥＧＥＮＴＳ ＯＦ ＴＨＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＣＡＬＩＦＯＲＮＩＡ
【住所又は居所原語表記】１１１１ Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｓｔｒｅｅｔ， Ｏａｋｌａｎｄ， ＣＡ ９４６０７−５２００， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【Ｆターム（参考）】
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