心筋毒性検査装置、心筋毒性検査チップおよび心筋毒性検査方法。
【課題】心筋毒性を従来in vivoで行っているものを、等価的にin vitroで行うことを可能とする心筋毒性検査装置および方法を提供する。
【解決手段】透明基板１上に拍動ペースメーカー細胞集団１０Ｇを配置し、続いて心筋拍動細胞を適当に離して配置する。これらの間に適当な数の線維芽細胞を配置・結合させて細胞ネットワークを構成する。この細胞ネットワークは光学的に観察可能とされる。ネットワークを構成する細胞には薬物が作用するように薬物を含む液体の流れに曝す。ネットワークの心筋拍動細胞の一つから終段の心筋拍動細胞への拍動の伝播の通常の遅れと薬物の作用時の拍動の伝播の遅れの差異を電極から得られる電気信号で捕らえてＮａ+イオン阻害を評価する。ネットワークの心筋拍動細胞の一つの拍動を光学的に捕らえて体積変化を検出することから薬物の作用時の収縮速度を検出して心拍出量を評価する。
【解決手段】透明基板１上に拍動ペースメーカー細胞集団１０Ｇを配置し、続いて心筋拍動細胞を適当に離して配置する。これらの間に適当な数の線維芽細胞を配置・結合させて細胞ネットワークを構成する。この細胞ネットワークは光学的に観察可能とされる。ネットワークを構成する細胞には薬物が作用するように薬物を含む液体の流れに曝す。ネットワークの心筋拍動細胞の一つから終段の心筋拍動細胞への拍動の伝播の通常の遅れと薬物の作用時の拍動の伝播の遅れの差異を電極から得られる電気信号で捕らえてＮａ+イオン阻害を評価する。ネットワークの心筋拍動細胞の一つの拍動を光学的に捕らえて体積変化を検出することから薬物の作用時の収縮速度を検出して心拍出量を評価する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞に対する薬物の心筋毒性検査装置、心筋毒性検査チップおよび心筋毒性検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも１細胞の特性であるかの様に観察してきた。
【０００３】
しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。
【０００４】
すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。
【０００５】
また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。
【０００６】
細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかし、この場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。
【０００７】
細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために、本願の発明者らは特開２００６‐９４７０３（特許文献１）に示すように、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結するとともに、必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を提案した。
【特許文献１】特開２００６‐９４７０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。
【０００９】
心筋細胞および線維芽細胞について見ると隣接する心筋細胞あるいは線維芽細胞からの拍動の伝播が、１細胞単位で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、心筋細胞に対する薬物の毒性検査が１細胞の細胞電位、細胞形態として正確に計測できるデバイスやシステムを開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑み、本発明は、以下の心筋毒性検査装置、心筋毒性検査チップ、および心筋毒性検査方法を提供する。
（１）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２）前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている上記（１）記載の心筋毒性検査装置。
（３）前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた上記（１）記載の心筋毒性検査装置。
（４）前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された上記（１）記載の心筋毒性検査装置。
（５）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、および
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（６）前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている上記（５）記載の心筋毒性検査装置。
（７）前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた上記（５）記載の心筋毒性検査装置。
（８）前記細胞培養液を供給する培養液供給手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された上記（５）記載の心筋毒性検査装置。
（９）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする心筋毒性検査チップ。
（１０）前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている上記（９）記載の心筋毒性検査チップ。
（１１）前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する上記（９）記載の心筋毒性検査チップ。
（１２）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有する心筋毒性検査装置を使用して、
前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（１３）透明基板、
該透明基板上に配置された、安定した拍動を行う心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
前記細胞保持部の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、ならびに
前記透明基板上に配置した細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
（１４）前記細胞保持部（ＣＨG，ＣＨn）の各々が、前記透明基板上に設けられた細胞非接着性の壁で囲まれた空間として規定され、該壁が前記細胞が通り抜けることの出来ない１以上の間隙を有する、上記（１３）記載の心筋毒性検査装置。
（１５）前記心筋細胞集団保持領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記心筋細胞集団保持領域の複数の細胞保持部（ＣＨG）のうち一つに収容された細胞と前記細胞連絡チャネルの端部の細胞保持部（ＣＨn）の細胞とが連携するための開口部を有する障壁が設けられた、上記（１３）記載の心筋毒性検査装置。
（１６）透明基板、
該透明基板上に配置された複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、ならびに
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
（１７）透明基板、
該透明基板上に配置された、心筋細胞を保持するための複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該細胞集団の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数個の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を備える、心筋毒性検査チップ。
（１８）上記（１３）〜（１６）のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（１９）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞に対して拍動を励起する電気刺激を与える手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２０）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２１）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記可動式微小電極を用いて環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団の細胞電位を計測し記録する手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２２）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の環状の形状と同じリング状の形状を持った微小電極、
前記微小電極を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２３）
カメラ受光素子の光電変換面を除去して直接電気信号を計測できるように構成された受光素子アレイ基板、
該受光素子アレイ基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記受光素子アレイ基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記受光素子アレイ基板を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記受光素子アレイ基板上の各受光素子上に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記受光素子に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２４）
上記（１９）〜（２３）のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（２５）
上記（１２）、（１８）および（２４）のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、特定の細胞の拍動データの隣接する拍動間の差異を定量的に比較して、その差異のゆらぎが一定以上の値となるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（２６）
上記（１２）、（１８）および（２４）のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、環状の細胞ネットワークにおいて、複数の伝達経路を選択できる細胞配置の構成がなされているもので、その伝達経路が各周回で異なるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【００１１】
本発明は、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておく構成を利用して、適切なサイズの管理された心筋細胞集団を構成して安定した拍動を行わせ、ペースメーカーとして機能させる。さらに、この細胞集団とインタラクションする心筋細胞および線維芽細胞の複数個の直列配列された拍動細胞連絡チャネルを構成する。通常の培養液の下で心筋細胞集団の発生する拍動を拍動細胞連絡チャネルに伝播させ、この伝播を直列配列された心筋細胞および線維芽細胞で次々に伝播させる。この伝播状態を、心筋細胞集団の一つの心筋細胞に対して設けた電極と直列配列された心筋細胞および線維芽細胞のいくつかに対してそれぞれ設けた電極により細胞電位を計測する。さらに、直列配列された拍動細胞の内の心筋細胞については拍動の状態を光学的に検出する。
【００１２】
次に、心筋細胞に作用する薬剤を添加した培養液の下で、上記と同じ計測、検出を行い、それぞれの計測、検出結果の比較により、心筋細胞に対する薬物の毒性を評価する。
【発明の効果】
【００１３】
心筋細胞および線維芽細胞の１細胞ごとの拍動の伝播を細胞電位、光学的データとして正確に計測、評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１は本発明の実施例に係る心筋毒性検査装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。図２は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。図３は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨに保持された細胞を光学的に検出する光学系を説明する図である。
【００１５】
１００は心筋毒性検査装置であり、透明基板１の上に構築されている部品を主体として構成される。透明基板１は光学的に透明な材料、たとえば、ガラス基板あるいはシリコン基板である。２は微小電極であり、たとえば、ＩＴＯによる透明電極とされ、透明基板１上に配置される。２’は微小電極２の引き出し線である。３1，３2，３3及び３4はアガロースゲルによる壁であり、微小電極２の周辺に間隙４1，４2，４3及び４4を介して配置される。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4は中心部が切り欠かれて細胞収納部となる空間を形成している。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上には、必要により、微小電極２が配置される。微小電極２の有無に係らず、細胞収納部に一つの細胞１０が収納できる。図２では、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上に、微小電極２が配置され、その上に心筋細胞１０0が収納されている。微小電極２には引き出し線２’が接続されて引き出されている様子を示す。微小電極２の細胞載置面および微小電極２を設けないで透明基板１に、直接、細胞を載置する場合の細胞載置面にはコラーゲン等の細胞が電極表面および透明基板に接着するのを助ける素材を塗っておくのがよい。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部内の細胞は、アガロースゲルは細胞にとっては非接着性であるため、この壁３1，３2，３3及び３4の高さを細胞と同程度としても、壁を乗り越えて細胞１０が移動することはない。また、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部の周辺の間隙４1，４2，４3及び４4は細胞の大きさより小さいものとされるから、この間隙４1，４2，４3及び４4をすり抜けて細胞１０が移動することはない。
【００１６】
図１において、細胞保持部ＣＨ1、ＣＨ2、ＣＨ3およびＣＨnはそれぞれ細胞収納部に一つの心筋細胞あるいは線維芽細胞１０1、１０2、１０3および１０nを保持するとともに、図では明確でないが、それぞれ、微小電極２を備えていて、引き出し線２’1、２’2、２’3および２’nが引き出されている。これらの心筋細胞または線維芽細胞は直列配列された細胞連絡チャネルＣＣＣを構成する。ここで、ｎは例えば２０である。また、これら２０個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞の配分は、ランダムでよいが、細胞保持部ＣＨ1の細胞およびＣＨ20の細胞は心筋細胞であったほうがよい。この細胞連絡チャネルＣＣＣの左端には３×３の細胞保持部ＣＨGが形成されていて、それぞれの細胞保持部ＣＨに心筋細胞１０が保持されてなる細胞集団１０Gを含む心筋細胞集団保持領域が存在する。この細胞集団１０Gは安定した拍動を行うペースメーカーとして機能するものである。細胞集団１０Gでは、細胞集団１０Gの一つの細胞保持部ＣＨのみに微小電極２が備えられ、引き出し線２’Gが引き出されている。また、細胞集団１０Gの右側の中央の細胞保持部ＣＨが細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞保持部ＣＨ1に対向するように構成されている。細胞集団１０Gの右側と細胞連絡チャネルＣＣＣの左端部との間に障壁１１aが設けられる。この障壁１１aの中央部の下部には小さい開口１１bが形成される。この開口１１bの両側には対向する細胞集団１０Gの右側の中央の細胞保持部ＣＨと細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞保持部ＣＨ1があり、それぞれの細胞収納部の周辺の間隙４を介してそれぞれに保持されている細胞の物理的接触・細胞間インタラクションが可能なように構成されている。細胞集団１０Gの下部に比較電極２Cが設けられ、引き出し線２’Cが引き出されている。
【００１７】
７は周辺を取り巻く壁であり、細胞集団１０G、細胞連絡チャネルＣＣＣおよび比較電極２Cを取り巻いている。８1および８2は壁７の内部の領域に、細胞の培養液を供給し、および、壁７の内部の領域から、細胞の培養液を排出するためのパイプであり、図の例では、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８1から培養液が供給され、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８2から培養液が排出される。培養液を供給するパイプ８1の培養液の出口の近くにパイプ８3が結合され、このパイプ８3を介して細胞に作用させたい薬剤が供給される。したがって、細胞１０はパイプ８1により壁７の内部の領域に供給される細胞の培養液に曝されながら、微小電極２の上に安定して保持される。細胞を培養液に曝す必要がなくなったときは、パイプ８2により壁７の内部の領域から培養液を排出すればよい。また、培養液を新しいものと交換するときは、培養液を排出した後、あるいは、排出しながら、培養液を供給すればよい。一方、細胞に薬剤を作用させたいときは、パイプ８2により培養液を排出しながら、パイプ８3を介して細胞に作用させたい薬剤を培養液に加えて、パイプ８1により培養液とともに供給すればよい。このとき、細胞集団１０Gと細胞連絡チャネルＣＣＣとの間に障壁１１aを設けたことにより、薬剤を含む培養液がパイプ８1により壁７の内部の領域に供給されるとき、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞が薬剤の影響を受ける程度に比し、細胞集団１０Gの細胞が薬剤の影響を受ける程度は低いものとなる。すなわち、パイプ８1により薬剤を含む培養液が供給されるとき、この培養液は障壁１１aの両側の壁７との隙間および障壁１１aの上面を乗り越えて細胞集団１０Gにも供給されるから細胞集団１０Gの細胞も薬剤の影響を受ける。しかし、その影響は細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞に対するものと比較すれば間接的であるので、ペースメーカーとしての機能に影響を及ぼすほどのものではない。なお、パイプ８1、パイプ８2およびパイプ８3の構成、配置は計測の仕方により任意に変更してよい。例えば、パイプ８1およびパイプ８3は分離されたものとしてもよいし、パイプ８2は省略して、パイプ８1を供給、排出の両方に使用するものとしてもよい。
【００１８】
ＰＣはパソコンであり、細胞保持部ＣＨの微小電極２の引き出し線２’と比較電極２Cの引き出し線２’との間で細胞電位を計測し記録する。また、パソコン９には操作者の操作信号Ｍｓが加えられる。
【００１９】
心筋毒性検査装置１００は光学観察装置２００のＸＹステージ１５に載せて細胞連絡チャネルＣＣＣの任意の細胞１０の拍動を、光学系により観察することが出来る。ＸＹステージ１５は、光学的に透明であるとともに、操作者の操作信号Ｍｓに応じてパソコンＰＣが与える信号に応じてＸ−Ｙ駆動装置１６により、任意の位置に移動される。図３では、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nの拍動の状態を観察する例を示している。１２は培養液を示す。
【００２０】
２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞１０nの観察の場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０nの損傷を防ぐことができる。２４はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。ＸＹステージ１５上には基板１上に形成されている細胞応答計測装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置１６によって前記ＸＹステージ１５を移動させることで前記細胞応答計測装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記細胞応答計測装置１００内の細胞１０nの拍動の状態は、対物レンズ１７で観察される。対物レンズ１７の焦点位置はパソコンＰＣによる信号に応じて駆動装置１８によってＺ軸方向に移動させることができる。対物レンズ１７の倍率は４０倍以上のものが使用できる。対物レンズ１７で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０nの位相差像あるいは微分干渉像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１９およびバンドパスフィルタ２０によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ２１によって観察される。カメラ２１によって観察された画像信号はパソコンＰＣに導入される。
【００２１】
図１に示す心筋毒性検査装置１００の構造の主要なサイズの例を示すと以下のようである。これは、細胞の大きさを１０μｍφとした例である。透明基板１の大きさは１００ｍｍ×１５０ｍｍ、微小電極２は８μｍ×８μｍの大きさ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の個々の大きさは２０μｍ×２０μｍ×１０μｍ（高さ）、間隙４1，４2，４3及び４4の幅２μｍ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間は１２μｍφの円柱状、壁７の外形は５ｍｍ×５ｍｍとし高さは５ｍｍである。障壁１１ａの高さは１ｍｍである。尚、ここでは、微小電極２は８μｍ×８μｍの正方形としたが、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と間隙４1，４2，４3及び４4の幅とで構成する細胞の収納部となる１０μｍφの円状の電極としてもよい。
【００２２】
以下、本発明の細胞応答計測装置１００の構成例とこれを用いた具体的な計測例を説明する。
【００２３】
図４（ａ）、図４（ｂ）および図４（ｃ）は、細胞電位の計測に関する信号を示す図である。それぞれ、横軸に時間を、縦軸に微小電極２と比較電極２Cとの間に得られる細胞電位を示す。図４（ａ）は細胞集団１０Gの拍動による細胞電位である。ここでは、図１に示す細胞集団１０Gの一つから引き出された引き出し線２’Gと比較電極２Cから引き出された引き出し線２’Cとの間の電位である。図に示すように、安定した拍動を示し、ペースメーカーとして機能しうることがわかる。図４（ｂ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞の拍動による細胞電位である。ここでは、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nとし、細胞１０nから引き出された引き出し線２’nと比較電極２Cから引き出された引き出し線２’Cとの間の電位が計測されている。図４（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけ遅れていることが観察される。これに対して、図４（ｃ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞の拍動による細胞電位である。ここでも、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nとし、図４（ｂ）との比較が明確になるようにしている。図４（ａ）、図４（ｂ）、の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけの遅れではなく、時間Δｔ＋αの遅れとなっていることが観察される。これは、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞に対する薬物の作用によるＮａイオン阻害の大きさが＋αの遅れの増大として表れていることを意味する。すなわち、心筋細胞に対する薬物の毒性をＮａイオン阻害として評価することが出来る。
【００２４】
図５（ａ）、図５（ｂ）および図５（ｃ）は、細胞の拍動に伴う体積変化を光学系によって計測した結果に関する信号を示す図である。図５（ａ）は細胞集団１０Gの細胞の拍動に伴う体積変化である。細胞集団１０Gの細胞の一つの拍動を図３に示す形で光学的に検出したものである。細胞の拍動に伴う収縮および拡張がパルス状に現れる変化として認められる。この波形の周期は、図４（ａ）に示す拍動に伴う細胞電位の変化の周期と同じである。図５（ｂ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞の拍動に伴う体積変化を上段に示し、下段にこれを電気信号として評価するために時間微分値として処理したときの波形を示す。ここでも、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nとし、細胞１０nの拍動を図３に示す形で光学的に検出したものである。図５（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけ遅れていることが観察される。これに対して、図５（ｃ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞の拍動に伴う体積変化を評価するための説明図であり、図５（ａ）、図５（ｂ）に比し時間軸を拡大した形で示す。上段は図５（ｂ）の上段の波形に対応する波形であり、図５（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔよりもさらにβだけ遅れが増大していることが観察される。標的細胞の拍動に伴う体積変化が薬物により受ける影響は、この遅延の増大以上に体積変化の傾きが小さくなることが特徴的である。図５（ｃ）の下段に参考波形として示した薬物を含まない培養液での体積変化と比較してみるとこのことがよく分かる。図５（ｃ）の中段には、上段の波形を評価するために時間微分値として処理したときの波形を示す。この時間微分値を図５（ｂ）の下段のそれと比較すると分かるように、ピーク値が小さくなるとともに、傾きが緩やかになっている。これは、薬物により心筋の収縮速度が低下して、心拍出量が低下したことを意味する。すなわち、心筋細胞に対する薬物の毒性を収縮速度の低下として評価することが出来る。
【００２５】
図６（ａ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す。図６（ｂ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す。図６（ａ）、図６（ｂ）を対比してすぐ分かるように、ＱＴ遅延が表われて波形が時間軸方向に伸びている。さらにＫ+イオンの流入出に伴い、波形が大きく変形している。これを電気信号として評価するために、図に破線で示した“０”と“１００”の間の値に対して、３０％、６０％および９０％の値の継続時間をＡＰＤ３０，ＡＰＤ６０およびＡＰＤ９０として検出する。ここで、ＡＰＤとはAction Potential Durationの頭文字からとった表現である。これらの値の大きさおよび比率を評価すれば、その薬物のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に及ぼす影響を評価できる。
【００２６】
図７は、心筋毒性検査装置の細胞を光学的に検出する光学系および可動電極の配置の一例を説明する図であり、たとえば計測する細胞１０nの拍動の状態を観察する例を示している。１２は培養液を示す。２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２２１は細胞の蛍光計測をするための蛍光光源であり、一般に水銀ランプ、単色光レーザー、ＬＥＤ光源などが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタであり、２３１は蛍光光源２２１から特定の蛍光を励起する励起波長の光のみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞１０nの拍動堆積変化情報のような形状変化の観察の場合には、細胞形状を計測するための波長の光だけを透過させるバンドパスフィルター２０を通過した像をカメラ２１でリアルタイム計測するが、計測に波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０nの損傷を防ぐことができる。２４および２４１はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。蛍光計測の場合は、たとえば細胞内カルシウム放出の計測を行う場合は、励起波長５００ｎｍ程度、蛍光計測波長６００ｎｍ程度での光を選択的に透過するバンドパスフィルターの組み合わせを用い、蛍光波長の光だけを選択的に透過するバンドパスフィルター２０１を通過した蛍光像をカメラ２０１で計測する。このとき、細胞ネットワーク中での1細胞単位でのカルシウム放出の時間的前後関係を計測して細胞ネットワーク中での信号伝達の経路を計測する場合には、カメラの計測時間分解能は０．１ｍｓ以上の高速連続画像が取得できるものとなっている。ＸＹステージ１５上には基板１上に形成されている細胞応答計測装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置１６によって前記ＸＹステージ１５を移動させることで前記細胞応答計測装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記細胞応答計測装置１００内の細胞１０nの拍動の状態は、対物レンズ１７で観察される。対物レンズ１７の焦点位置はパソコンＰＣによる信号に応じて駆動装置１８によってＺ軸方向に移動させることができる。対物レンズ１７の倍率は４０倍以上のものが使用できる。対物レンズ１７で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０nの位相差像あるいは微分干渉像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１９２およびバンドパスフィルタ２０によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ２１によって観察される。カメラ２１によって観察された画像信号はパソコンＰＣに導入される。また、この実施例では細胞への刺激を行うための可動電極２７が配置されており、可動電極の座標がＸＹステージと同じ平面上の任意の位置のみならず、高さを任意に調節することができる位置制御機構が備わっている。この位置制御機構を用いて細胞ネットワーク中の特定の1細胞あるいは数細胞の位置に可動電極の先端を移動させることで、任意の特定の細胞あるいは数細胞に刺激を与えることができる。可動電極の素材としては、先端部以外の部分は絶縁被覆されている金属電極、先端の開口サイズが５ミクロン程度以下のガラス電極等の、可動電極先端近傍にある特定の細胞あるいは数細胞のみに電気刺激を与えることができる構成の電極を用いることができる。金属電極を用いる場合は、先端部表面に白金黒などを付加することによって効果的に電気刺激を細胞に伝達することができる。可動電極の先端の位置は、電気刺激に対する細胞の応答の程度によって調整するものとし、細胞に接しても良いし、あるいは、細胞のごく近傍に配置しても良い。また、刺激電極の刺激を適切に標的とする特定の細胞に与えるために電気刺激を与える瞬間にスイッチングによって細胞電位計測のための電極２を接地電極として用いても良いし、あるいは、別途、別の接地電極２８を配置しても良い。さらに、特定の細胞を刺激するために、既存の微小電極２を刺激電極として用いても良い。その場合には、微小電極が接続されているスイッチング回路２９のスイッチングによって、通常は電気信号計測回路３０に接続されているものを、刺激を与える瞬間に、スイッチング切り替えによって、電気刺激回路３１に接続をして矩形波の刺激信号を微小電極２に与えることができる。また、上記可動電極２７を用いて刺激を与える瞬間には、スイッチング回路２９を接地にスイッチングすることができる。他方、可動電極も、刺激電極としてだけでなく、細胞の電気信号を計測する電極としてもちいたり、接地電極として用いることもできる。その場合は、可動電極はスイッチング回路２９１に接続されており、細胞電位計測、細胞刺激、接地電極としての利用に応じて、それぞれスイッチングによって、電気信号計測回路３０１に接続されて細胞電位を計測したり、電気刺激回路３１１に接続をして矩形波の刺激信号を細胞に与えたり、また、接地させることで、接地電極として用いることができる。電気刺激回路３１、３１１が細胞に与える電気刺激のタイミングは、おもに次の２つの用途で用いることができる。ひとつは自律拍動機能を持った細胞ネットワークにおいて、その正常な心筋細胞ネットワークの拍動インターバルの間に、イレギュラーな刺激を与えるものであり、他方は、自律拍動能を有さない心筋細胞ネットワークに対して拍動インターバルを与えるものである。ともに、計測するのは、拍動インターバルの周期（２つの拍動間の時間差）を５ｍｓ単位で徐々に短くしていったときの、細胞ネットワークの応答の変化を追跡できるものである。そのために、電気刺激回路３１、３１１は、電気信号計測回路３０、３０１などによって得られた拍動周期情報を解析して、その結果に基づいて刺激のタイミングを決定するフィードバック制御を行うことができる。さらに、可動電極２７を電気信号計測のために用いる場合、本システムにおいて微小電極２が無くても同様な計測ができることとなる。これは、システムに構成されている光学計測によって細胞ネットワーク中の各細胞の拍動周期の計測は可能であることから、この拍動周期が安定状態から不整脈などの不安定状態になることはシステムに配置されている光学計測装置のみで計測し、その結果から必要に応じて、可動電極を用いて特定の細胞の電気的特性のデータを取得するものであり、この場合には、システム上に事前に配置している微小電極数の制約を受けず、光学計測できる範囲で、より自由に大きな細胞ネットワークを構築することができる。
【００２７】
図８に、細胞の電気信号の発生の一例について模式図で示した。最初に、細胞膜にあるナトリウムイオンチャンネルからのナトリウムイオンの細胞内への流入が発生し細胞電位が急激に下がり、次に、少しの遅延を経て、カルシウムイオンの流入による細胞電位の低下が起き、そして、次のステップとして、カリウムイオンの細胞外への排出が起きることで細胞電位の上昇が起きる。細胞電位の変化は、心筋細胞膜に存在する応答特性の異なるさまざまなイオンチャンネルの特性の違いによって引き起こされる。それぞれのイオンチャンネルに起因して引き起こされる電位変化のピークの位置を、各イオンチャンネルの特性時間として解析すると、薬剤の影響によって各イオンチャンネルがブロックされることで、その薬剤の特性に応じてブロックされたイオンチャンネルの種類に応じた電気信号の波形の変化を計測することができ、それによって薬剤のイオンチャンネルへの阻害効果を見積もることができる。薬剤の評価に特に重要なイオンチャンネルは、ＦａｓｔＮａ、ＳｌｏｗＮａ、Ｃａ、ＩＫｒ、ＩＫｓの４つのイオンチャンネルであり、これら4種類のイオンチャンネルのブロックの状態を計測することができる。
【００２８】
図９（ａ）は、図８で示した細胞の電気信号について、実際にカリウムイオンチャンネルを選択的に阻害する試薬Ｅ−４０３１を様々な濃度で添加したときの変化を示したものである。細胞の電位を上げるＫイオンの細胞外への排出機能を担うＩＫｒイオンチャンネルを阻害することから、薬剤濃度が高まるにつれて正方向の細胞電位の変化が徐々に遅延することが分かる。本図９（ａ）に示したのは、細胞の応答の特定の1拍動データであるが、実際には隣接する各拍動での応答のゆらぎ幅の大きさが、薬剤の影響を見積もる重油様な指標となる。図９（ｂ）がその一例であり、ポアンカレプロットと呼ばれる隣接する拍動データの相関を比較する解析手法である。ここでは、Ｘ軸にｎ回目の拍動時の特定のイオンチャンネルの応答時間の位置を、Ｙ軸に（ｎ＋１）回目の拍動時の同じイオンチャンネルの応答時間の位置を置いたプロットを行う。すると、隣接する拍動同士での特性が同じ場合は、グラフ内の点線で描かれたＹ＝Ｘ上にプロットが並ぶこととなるが、隣接する拍動同士での応答に大きな揺らぎがある場合は、Ｙ＝Ｘから離れた位置までの大きなプロットの分布が観測されることとなる。実際に、この例では、薬剤を添加しないControlに対して、４０ｎＭの添加では応答時間の遅延があるが、隣接した拍動間での相同性は維持されている。他方、４００ｎＭまで薬剤の添加をすると応答時間の更なる遅延に加えて、隣接した拍動間での相同性も崩れ、不安定な拍動周期が発生することとなることが本プロットによって明らかにできる。この結果は、心毒性を示すＱＴ延長計測の結果とも一致しており、ポアンカレプロットによって1細胞レベルでの隣接した各拍動のゆらぎの増大の計測を指標にすることでＱＴ延長の発生を見積もることができる。この現象は、特定のイオンチャンネルが薬剤によってブロックされたときに、そのブロックの程度が軽微な場合は、イオンの排出能力の低下という現象が見えるだけで細胞応答の不安定性はまだ発生しないのに対して、さらに、ブロックの程度が重度になると、機能しているイオンチャンネルの数が極端に減少して、そのために細胞のイオン排出能力について同じ細胞でありながら再現性の低い大きな揺らぎを持った結果が出てくることとなる。そして、このゆらぎの大きさがＱＴ延長の発生し易さの指標として用いることができるものである。
【００２９】
図１０（ａ）は１細胞レベルでの細胞配置技術を用いた心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路薬剤の一例を示す模式図である。心筋細胞のみで細胞の環状ネットワークを作成したものは、正常ネットワークモデルとなり、心肥大などの病理モデルの場合には、細胞ネットワークの中に線維芽細胞を組み込むことで実現される。そして、ネットワーク中に混在する線維芽細胞が心筋細胞ネットワークの伝達速度の遅延や減衰をもたらし、その結果、期外収縮の発生を予測することができる。図１０（ｂ）は、実際に微小電極上に心筋細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真である。実際に、この写真に示したように、１細胞単位で微小電極上に配置された場合は、隣接した心筋細胞同士の信号伝達の遅延を計測することができる。そして、この伝達速度は拍動のときに発生する最初の電気信号の大きさに依存することから、Ｎａイオンチャンネルへの阻害効果として、この信号伝達の遅延データを用いることができる。
【００３０】
図１１（ａ）は一定の幅の細胞集団を用いて心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路の一例を示す模式図である。図１０に示した１細胞単位での環状細胞ネットワークでは、心筋細胞の拍動信号はその通過について一意的であり、図９に示したような細胞自体の拍動のゆらぎが無い限り、同一の特性を維持して細胞は拍動信号を隣接細胞間で伝達する。他方、この図１１で示したように、一定の幅で細胞を配置して環状ネットワークを形成した場合、細胞集団はその伝達について実線３５、破線３６、点線３７のように拍動ごとに異なる経路を取る自由度を持つこととなる。特に、図９で説明したように、薬剤の添加によって各心筋細胞の応答特性に大きなゆらぎが発生すると、容易に応答する細胞が環状ネットワークを刺激信号が周回するたびに、その都度異なることから、経路の違いがより顕著となる。これはスパイラル・リエントリーと呼ばれる心臓の致死に至る期外収縮の機構と同じメカニズムとなることから、このような幅を持った細胞集団ベースでの環状ネットワークを特に用いることでスパイラル・リエントリーの計測が可能となる。図１１（ｂ）は実際に微小電極上に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真であり、心筋細胞６０％程度に線維芽細胞４０％程度を混ぜた細胞集団を配置している。実際に、このような配置を行うと、隣接電極間での伝達速度の隣接拍動間でのゆらぎは大きくなり、特に薬剤の添加によって、そのゆらぎの増大が顕著となることから、隣接拍動間での伝達速度のゆらぎ幅の変化からスパイラル・リエントリーの発生を見積もることができる。図１１（ｃ）は、さらに実際に微小電極アレイ上に環状に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真である。実際のスパイラル・リエントリーの計測には、図７に示した高速蛍光計測カメラを用いることで、細胞集団ネットワーク中での各細胞のカルシウム発火を１細胞レベルで見積もることができ、その結果として細胞の信号伝達がどのような経路で進んでいるのか、各周回での経路の変化を実際に解析することができる。
【００３１】
図１２（ａ）は環状電極を用いたリエントリー回路計測装置の一例を示す模式図である。この例では、１〜３ｍｍの直径のリング状に形成した電極幅５０〜１００ミクロンの環状電極３８を各９６穴ウエルプレート４２の底面に１つ配置し、電極表面にのみ４１のように細胞集団が環状に配置されるように、電極上の除く周囲の底面については、表面にアガロース等の細胞接着性の無い素材をコートしている。この細胞が接着しないようにコートされた領域に、同心円状に参照電極リング３９が配置されており、また、試薬の出入りが行える流路４０が配置されている。このような電極を用いることで簡易に心筋細胞の異常拍動を簡便に計測することができる。図１２（ｂ）は実際に電極で計測した、正常拍動データと異常拍動データを示したグラフである。本実施例では、環状電極を用いたが、図７で示した光学計測システムを用いることで、本環状電極による効果と同じ、異常拍動を光学的に計測することができるシステムを構築することができる。その場合、電気的信号を計測する場合には、図７で示した移動電極を環状細胞ネットワークに接触させることで、電気信号も取得することができる。
【００３２】
図１３（ａ）は１細胞の電位計測を行う微小電極２と細胞の配置の一例を示す模式図であり、直径１０ミクロンから５０ミクロンの微小電極２上に、計測の対象となる細胞を１細胞だけ配置して計測する手法を示したものである。本実施例でも、他の実施例と同様、電極上の細胞がその場所に保持されるように電極周囲には、細胞接着性を阻害するアガロースなどの素材がコートされている。図１３（ｂ）は実際に微小電極２で計測した孤立１細胞の電極上の写真とその拍動電気データを示したものであるが、孤立した一細胞の信号は不安定でありグラフに示したように大きなゆらぎを持って拍動している。他方、図１３（ｃ）で示したように、微小電極２上には、図１３（ｂ）と同様に１細胞が配置されているが、他の細胞と連結された細胞集団となることで、拍動信号グラフを見てもわかるように、拍動周期の安定性が実現される。実際の１細胞レベルでの拍動計測では、図９でも示したように、隣接した各拍動間のゆらぎの大きさが指標となることから、本実施例で示したような、細胞集団化による安定化を実現しながら、１細胞の拍動デーたが取得できるように、特定の計測したい１細胞のみ微小電極上に配置され、この特定細胞の安定性を維持するために他の心筋細胞を電極上には載らない形で配置されている構成を用いた計測システムが有用である。
【００３３】
図１４は、本発明でカメラ受光素子を１細胞の電位計測に用いた実施例を説明する模式図である。通常、カメラ受光素子は、光電変換面で光信号を電気信号に変換して、この電気信号を計測に用いるものであることから、この光電面を除去して、電気信号アレイ部分をもちいることで、２次元での電気信号を取得することが可能となる。これによって、１細胞レベルでのサイズの電極アレイを用いることができるため、たとえば細胞集団の中の各細胞の電気信号を同時に計測することが必要な、図１１で示した一定の幅を持つ細胞集団ネットワーク中での信号伝達経路の変化というスパイラル・リエントリーの発生を計測することが可能となる。実際の計測では、画素の計測インターバルは１万分の１秒程度必要であり、１万分の１秒のシャッタースピードの高速カメラのカメラ受光素子を利用する必要がある。この場合、取得された細胞の信号データは、既存のカメラで用いられている画像処理技術をそのまま適用することができ、画像処理用のFPGAを用いた実時間処理が可能となる。また、その実時間処理によって得られたデータに基づいて刺激電極へのフィードバック刺激を行うことも可能となる。
【００３４】
図１５は、本発明の細胞計測システムで複数試料を計測できる機構の一例を説明する模式図である。この実施例のシステムは、分析モジュール、多段インキュベーター、電気解析モジュールとオンラインネットワークで接続されたオンライン解析モジュールとからなる。ここで、分析モジュールには、細胞形状の変化を計測する位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡、そして蛍光顕微鏡とカメラ撮影解析による光学的計測、アガロースを顕微鏡システムを利用してミクロンのスケールで局所溶解できるアガロース加工技術からなっている。多段インキュベーターには、複数の細胞培養槽が配置されており、また、細胞培養槽の中には微小電極チップが配置されており、各細胞の電気信号の計測、電気的刺激がインキュベーター中で並列で連続処理できるようになっている。得られた電気信号については、電気解析モジュールで実時間計測を行い、そのデータはオンラインアクセスが可能なストレージに、光学計測のデータと電気計測データの結果が同じ時間スタンプを持った形で記録されており、この記録データにオンラインで解析モジュールが適宜アクセスすることで解析することができる。
【００３５】
図１６は、本発明の細胞計測システムで計測できる心臓情報を説明する模式図である。微小電極上での１細胞の電気信号計測によって、Na、Ca,IKｒ、IKｓなどのイオンチャンネルの信号データを計測することができ、隣接する心筋細胞間での信号伝達の速度変化の計測からNaイオンチャンネルの阻害を計測することができる。また、１細胞の形状変化の光学計測によって不整脈の発生の計測および心臓の拍出量の見積もりができる。さらに、環状に細胞ネットワークを配置することによってリエントリーの発生を計測することができ、さらに線維芽細胞を細胞配置に加えることで心肥大などの病理心臓モデルとしての計測がすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、細胞集団のペースメーカーとしての拍動を基礎として心筋細胞あるいは線維芽細胞が直列配列された細胞連絡チャネルＣＣＣによる細胞の拍動の伝達応答およびこれに対する薬物の影響、すなわち、薬物の心筋毒性を等価的にin vitroで評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の実施例に係る心筋毒性検査装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。
【図２】図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。
【図３】図３は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨに保持された細胞を光学的に検出する光学系を説明する図である。
【図４】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、細胞電位の計測に関する信号を示す図である。それぞれ、横軸に時間を、縦軸に微小電極２と比較電極２Cとの間に得られる細胞電位を示す。
【図５】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、細胞の拍動に伴う体積変化を光学系によって計測した結果に関する信号を示す図である。
【図６】（ａ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す図であり、（ｂ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す図である。
【図７】心筋毒性検査装置の細胞を光学的に検出する光学系および可動電極の配置の一例を説明する図である。
【図８】細胞の電気信号の発生を説明する模式図である。
【図９】（ａ）は薬剤の添加による細胞電位変化の一例を示す図であり、（ｂ）は各拍動時の細胞電位変化について、隣接した２つの拍動の相同性を評価するポアンカレプロットの一例を示す図である。
【図１０】（ａ）は１細胞レベルでの細胞配置技術を用いた心筋細胞の環状ネットワークによって作成したリエントリー回路の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に微小電極上に細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真である。
【図１１】（ａ）は一定の幅の細胞集団を用いて心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に微小電極上に細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真であり、（ｃ）は実際に微小電極アレイ上に環状に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真である。
【図１２】（ａ）は環状電極を用いたリエントリー回路計測装置の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に電極で計測した、正常拍動データと異常拍動データを示したグラフである。
【図１３】（ａ）は１細胞の電位計測を行う電極と細胞の配置の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に電極で計測した孤立１細胞の電極上の写真とその拍動電気データ、（ｃ）は計測した細胞集団の電極上での写真と細胞集団の中の１細胞の拍動電気データを示したグラフである。
【図１４】本発明でカメラ受光素子を１細胞の電位計測に用いた実施例を説明する模式図である。
【図１５】本発明の細胞計測システムで複数試料を計測できる機構の一例を説明する模式図である。
【図１６】本発明の細胞計測システムで計測できる心臓情報を説明する模式図である。
【符号の説明】
【００３８】
１…透明基板、２…微小電極、２ｃ…比較電極、２’…微小電極２の引き出し線、３1，３2，３3及び３4…アガロースゲルによる壁、４1，４2，４3及び４4…間隙、７…周辺を取り巻く壁、８1，８2，８3…パイプ、ＰＣ…パソコン、Ｍｓ…パソコンの操作信号、１０0，１０1，１０2，１０3，−−−，１０n…心筋細胞あるいは線維芽細胞、１５…光学観察装置の透明ステージ、１６…Ｘ−Ｙ駆動装置、１８…Ｚ駆動装置、ＣＨ1、ＣＨ2、ＣＨ3およびＣＨn…細胞保持部、ＣＣＣ…細胞連絡チャネル、１０G…細胞集団、１１a…障壁、１１b…開口、１９、１９１、１９２、１９３…ダイクロイックミラー、２０、２０１…バンドパスフィルタ、２１、２１１…カメラ、２２…光源、２２１…蛍光光源、２３、２３１…バンドパスフィルタ、２４、２４１…シャッター、２５…コンデンサレンズ、２６…対物レンズ、２７…可動電極、２８…接地電極、２９、２９１…スイッチング回路、３０、３０１…電気信号計測回路、３１、３１１…電気刺激回路、３２…心筋細胞、３３…線維芽細胞、３４…細胞配置用ピペット、３５…N周回目の伝達経路、３６…（N＋１）周回目の伝達経路、３７…（N＋２）周回目の伝達経路、３８…測定電極、３９…参照電極、４０…送液系、４１…環状に配置した細胞集団、４２…９６穴ウエルプレート、４３…カメラ受光素子、４４…細胞、４５…細胞刺激電極、１００…心筋毒性検査装置。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心筋細胞に対する薬物の心筋毒性検査装置、心筋毒性検査チップおよび心筋毒性検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態の変化や、細胞の薬物等に対する応答を観察するのに多用されているのはバイオアッセイである。従来のバイオアッセイでは、一般的に培養細胞を用いることが多い。この系では複数の細胞を用いてアッセイを行うので、細胞集団の値の平均値をあたかも１細胞の特性であるかの様に観察してきた。
【０００３】
しかし、実際には細胞は集団の中で細胞周期が同調しているものはまれであり、各々の細胞が異なった周期でタンパク質を発現している。このため、刺激に対する応答の結果を解析するときにゆらぎの問題が常に付きまとう。
【０００４】
すなわち、細胞の反応機構自体が普遍的に持つ応答のゆらぎが存在するために、常に、平均的なレスポンスしか得ることができない。これらの問題を解決するために、同調培養等の手法が開発されているが、常に同じステージにある細胞群を使用することは、常にそのような細胞を供給し続けなければならないということで、バイオアッセイを広く一般に広める障害となっている。
【０００５】
また、細胞に対する刺激（シグナル）は、細胞周辺の溶液に含まれるシグナル物質、栄養、溶存気体の量によって与えられるものと、他の細胞との物理的接触・細胞間インタラクションによるものの２種類があることからも、ゆらぎについての判断が難しいのが実情であった。
【０００６】
細胞の物理的接触・細胞間インタラクションの問題は、バイオアッセイを組織断片のような細胞塊で行うことである程度解決できる。しかし、この場合、培養細胞と異なり、常に均一な素性の細胞塊を得ることができない。そのため、得られるデータがばらついたり、集団の中に情報が埋もれてしまったりする問題がある。
【０００７】
細胞群の細胞の１つ１つを最小構成単位とする情報処理モデルの計測のために、本願の発明者らは特開２００６‐９４７０３（特許文献１）に示すように、細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておくための複数の細胞培養区画を構成し、隣接する区画間は細胞の通り抜けることができない溝またはトンネルでお互いを連結するとともに、必要に応じて、溝またはトンネルあるいは細胞培養区画に、細胞の電位変化を計測するための複数の電極パターンを持つ構造の集合細胞マイクロアレー（バイオアッセイチップ）を提案した。
【特許文献１】特開２００６‐９４７０３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従来のバイオアッセイでは、細胞を組織断片として扱うか、培養細胞のように１細胞として扱うかのいずれかであった。細胞の数が多すぎると上記従来技術の項で述べたように、得られる情報が平均的なものになってしまい、薬剤などに対するレスポンスが正確に得られない問題がある。細胞を１細胞ずつ用いる場合は、本来、多細胞組織の細胞として機能している細胞を、引き離された独立した状態の細胞として使用するために、細胞同士のインタラクションの影響が現れなくなることとなり、やはり正確な薬剤レスポンスすなわちバイオアッセイデータを得る上で問題がある。
【０００９】
心筋細胞および線維芽細胞について見ると隣接する心筋細胞あるいは線維芽細胞からの拍動の伝播が、１細胞単位で細胞電位、細胞形態が正確に計測できるとともに、心筋細胞に対する薬物の毒性検査が１細胞の細胞電位、細胞形態として正確に計測できるデバイスやシステムを開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
上記課題に鑑み、本発明は、以下の心筋毒性検査装置、心筋毒性検査チップ、および心筋毒性検査方法を提供する。
（１）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２）前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている上記（１）記載の心筋毒性検査装置。
（３）前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた上記（１）記載の心筋毒性検査装置。
（４）前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された上記（１）記載の心筋毒性検査装置。
（５）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、および
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（６）前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている上記（５）記載の心筋毒性検査装置。
（７）前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた上記（５）記載の心筋毒性検査装置。
（８）前記細胞培養液を供給する培養液供給手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された上記（５）記載の心筋毒性検査装置。
（９）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする心筋毒性検査チップ。
（１０）前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている上記（９）記載の心筋毒性検査チップ。
（１１）前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する上記（９）記載の心筋毒性検査チップ。
（１２）透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有する心筋毒性検査装置を使用して、
前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（１３）透明基板、
該透明基板上に配置された、安定した拍動を行う心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
前記細胞保持部の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、ならびに
前記透明基板上に配置した細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
（１４）前記細胞保持部（ＣＨG，ＣＨn）の各々が、前記透明基板上に設けられた細胞非接着性の壁で囲まれた空間として規定され、該壁が前記細胞が通り抜けることの出来ない１以上の間隙を有する、上記（１３）記載の心筋毒性検査装置。
（１５）前記心筋細胞集団保持領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記心筋細胞集団保持領域の複数の細胞保持部（ＣＨG）のうち一つに収容された細胞と前記細胞連絡チャネルの端部の細胞保持部（ＣＨn）の細胞とが連携するための開口部を有する障壁が設けられた、上記（１３）記載の心筋毒性検査装置。
（１６）透明基板、
該透明基板上に配置された複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、ならびに
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
（１７）透明基板、
該透明基板上に配置された、心筋細胞を保持するための複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該細胞集団の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数個の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を備える、心筋毒性検査チップ。
（１８）上記（１３）〜（１６）のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（１９）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞に対して拍動を励起する電気刺激を与える手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２０）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２１）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記可動式微小電極を用いて環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団の細胞電位を計測し記録する手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２２）
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の環状の形状と同じリング状の形状を持った微小電極、
前記微小電極を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２３）
カメラ受光素子の光電変換面を除去して直接電気信号を計測できるように構成された受光素子アレイ基板、
該受光素子アレイ基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記受光素子アレイ基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記受光素子アレイ基板を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記受光素子アレイ基板上の各受光素子上に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記受光素子に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
（２４）
上記（１９）〜（２３）のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（２５）
上記（１２）、（１８）および（２４）のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、特定の細胞の拍動データの隣接する拍動間の差異を定量的に比較して、その差異のゆらぎが一定以上の値となるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
（２６）
上記（１２）、（１８）および（２４）のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、環状の細胞ネットワークにおいて、複数の伝達経路を選択できる細胞配置の構成がなされているもので、その伝達経路が各周回で異なるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【００１１】
本発明は、１細胞を特定の空間配置の中に閉じ込めておく構成を利用して、適切なサイズの管理された心筋細胞集団を構成して安定した拍動を行わせ、ペースメーカーとして機能させる。さらに、この細胞集団とインタラクションする心筋細胞および線維芽細胞の複数個の直列配列された拍動細胞連絡チャネルを構成する。通常の培養液の下で心筋細胞集団の発生する拍動を拍動細胞連絡チャネルに伝播させ、この伝播を直列配列された心筋細胞および線維芽細胞で次々に伝播させる。この伝播状態を、心筋細胞集団の一つの心筋細胞に対して設けた電極と直列配列された心筋細胞および線維芽細胞のいくつかに対してそれぞれ設けた電極により細胞電位を計測する。さらに、直列配列された拍動細胞の内の心筋細胞については拍動の状態を光学的に検出する。
【００１２】
次に、心筋細胞に作用する薬剤を添加した培養液の下で、上記と同じ計測、検出を行い、それぞれの計測、検出結果の比較により、心筋細胞に対する薬物の毒性を評価する。
【発明の効果】
【００１３】
心筋細胞および線維芽細胞の１細胞ごとの拍動の伝播を細胞電位、光学的データとして正確に計測、評価することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
図１は本発明の実施例に係る心筋毒性検査装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。図２は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。図３は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨに保持された細胞を光学的に検出する光学系を説明する図である。
【００１５】
１００は心筋毒性検査装置であり、透明基板１の上に構築されている部品を主体として構成される。透明基板１は光学的に透明な材料、たとえば、ガラス基板あるいはシリコン基板である。２は微小電極であり、たとえば、ＩＴＯによる透明電極とされ、透明基板１上に配置される。２’は微小電極２の引き出し線である。３1，３2，３3及び３4はアガロースゲルによる壁であり、微小電極２の周辺に間隙４1，４2，４3及び４4を介して配置される。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4は中心部が切り欠かれて細胞収納部となる空間を形成している。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上には、必要により、微小電極２が配置される。微小電極２の有無に係らず、細胞収納部に一つの細胞１０が収納できる。図２では、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間の透明基板１上に、微小電極２が配置され、その上に心筋細胞１０0が収納されている。微小電極２には引き出し線２’が接続されて引き出されている様子を示す。微小電極２の細胞載置面および微小電極２を設けないで透明基板１に、直接、細胞を載置する場合の細胞載置面にはコラーゲン等の細胞が電極表面および透明基板に接着するのを助ける素材を塗っておくのがよい。アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部内の細胞は、アガロースゲルは細胞にとっては非接着性であるため、この壁３1，３2，３3及び３4の高さを細胞と同程度としても、壁を乗り越えて細胞１０が移動することはない。また、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4中心部が切り欠かれて形成される細胞収納部の周辺の間隙４1，４2，４3及び４4は細胞の大きさより小さいものとされるから、この間隙４1，４2，４3及び４4をすり抜けて細胞１０が移動することはない。
【００１６】
図１において、細胞保持部ＣＨ1、ＣＨ2、ＣＨ3およびＣＨnはそれぞれ細胞収納部に一つの心筋細胞あるいは線維芽細胞１０1、１０2、１０3および１０nを保持するとともに、図では明確でないが、それぞれ、微小電極２を備えていて、引き出し線２’1、２’2、２’3および２’nが引き出されている。これらの心筋細胞または線維芽細胞は直列配列された細胞連絡チャネルＣＣＣを構成する。ここで、ｎは例えば２０である。また、これら２０個の直列配列された心筋細胞および線維芽細胞の配分は、ランダムでよいが、細胞保持部ＣＨ1の細胞およびＣＨ20の細胞は心筋細胞であったほうがよい。この細胞連絡チャネルＣＣＣの左端には３×３の細胞保持部ＣＨGが形成されていて、それぞれの細胞保持部ＣＨに心筋細胞１０が保持されてなる細胞集団１０Gを含む心筋細胞集団保持領域が存在する。この細胞集団１０Gは安定した拍動を行うペースメーカーとして機能するものである。細胞集団１０Gでは、細胞集団１０Gの一つの細胞保持部ＣＨのみに微小電極２が備えられ、引き出し線２’Gが引き出されている。また、細胞集団１０Gの右側の中央の細胞保持部ＣＨが細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞保持部ＣＨ1に対向するように構成されている。細胞集団１０Gの右側と細胞連絡チャネルＣＣＣの左端部との間に障壁１１aが設けられる。この障壁１１aの中央部の下部には小さい開口１１bが形成される。この開口１１bの両側には対向する細胞集団１０Gの右側の中央の細胞保持部ＣＨと細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞保持部ＣＨ1があり、それぞれの細胞収納部の周辺の間隙４を介してそれぞれに保持されている細胞の物理的接触・細胞間インタラクションが可能なように構成されている。細胞集団１０Gの下部に比較電極２Cが設けられ、引き出し線２’Cが引き出されている。
【００１７】
７は周辺を取り巻く壁であり、細胞集団１０G、細胞連絡チャネルＣＣＣおよび比較電極２Cを取り巻いている。８1および８2は壁７の内部の領域に、細胞の培養液を供給し、および、壁７の内部の領域から、細胞の培養液を排出するためのパイプであり、図の例では、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８1から培養液が供給され、基板１の底面近くまで延伸されたパイプ８2から培養液が排出される。培養液を供給するパイプ８1の培養液の出口の近くにパイプ８3が結合され、このパイプ８3を介して細胞に作用させたい薬剤が供給される。したがって、細胞１０はパイプ８1により壁７の内部の領域に供給される細胞の培養液に曝されながら、微小電極２の上に安定して保持される。細胞を培養液に曝す必要がなくなったときは、パイプ８2により壁７の内部の領域から培養液を排出すればよい。また、培養液を新しいものと交換するときは、培養液を排出した後、あるいは、排出しながら、培養液を供給すればよい。一方、細胞に薬剤を作用させたいときは、パイプ８2により培養液を排出しながら、パイプ８3を介して細胞に作用させたい薬剤を培養液に加えて、パイプ８1により培養液とともに供給すればよい。このとき、細胞集団１０Gと細胞連絡チャネルＣＣＣとの間に障壁１１aを設けたことにより、薬剤を含む培養液がパイプ８1により壁７の内部の領域に供給されるとき、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞が薬剤の影響を受ける程度に比し、細胞集団１０Gの細胞が薬剤の影響を受ける程度は低いものとなる。すなわち、パイプ８1により薬剤を含む培養液が供給されるとき、この培養液は障壁１１aの両側の壁７との隙間および障壁１１aの上面を乗り越えて細胞集団１０Gにも供給されるから細胞集団１０Gの細胞も薬剤の影響を受ける。しかし、その影響は細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞に対するものと比較すれば間接的であるので、ペースメーカーとしての機能に影響を及ぼすほどのものではない。なお、パイプ８1、パイプ８2およびパイプ８3の構成、配置は計測の仕方により任意に変更してよい。例えば、パイプ８1およびパイプ８3は分離されたものとしてもよいし、パイプ８2は省略して、パイプ８1を供給、排出の両方に使用するものとしてもよい。
【００１８】
ＰＣはパソコンであり、細胞保持部ＣＨの微小電極２の引き出し線２’と比較電極２Cの引き出し線２’との間で細胞電位を計測し記録する。また、パソコン９には操作者の操作信号Ｍｓが加えられる。
【００１９】
心筋毒性検査装置１００は光学観察装置２００のＸＹステージ１５に載せて細胞連絡チャネルＣＣＣの任意の細胞１０の拍動を、光学系により観察することが出来る。ＸＹステージ１５は、光学的に透明であるとともに、操作者の操作信号Ｍｓに応じてパソコンＰＣが与える信号に応じてＸ−Ｙ駆動装置１６により、任意の位置に移動される。図３では、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nの拍動の状態を観察する例を示している。１２は培養液を示す。
【００２０】
２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞１０nの観察の場合には、波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０nの損傷を防ぐことができる。２４はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。ＸＹステージ１５上には基板１上に形成されている細胞応答計測装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置１６によって前記ＸＹステージ１５を移動させることで前記細胞応答計測装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記細胞応答計測装置１００内の細胞１０nの拍動の状態は、対物レンズ１７で観察される。対物レンズ１７の焦点位置はパソコンＰＣによる信号に応じて駆動装置１８によってＺ軸方向に移動させることができる。対物レンズ１７の倍率は４０倍以上のものが使用できる。対物レンズ１７で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０nの位相差像あるいは微分干渉像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１９およびバンドパスフィルタ２０によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ２１によって観察される。カメラ２１によって観察された画像信号はパソコンＰＣに導入される。
【００２１】
図１に示す心筋毒性検査装置１００の構造の主要なサイズの例を示すと以下のようである。これは、細胞の大きさを１０μｍφとした例である。透明基板１の大きさは１００ｍｍ×１５０ｍｍ、微小電極２は８μｍ×８μｍの大きさ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の個々の大きさは２０μｍ×２０μｍ×１０μｍ（高さ）、間隙４1，４2，４3及び４4の幅２μｍ、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4により形成される細胞収納部となる空間は１２μｍφの円柱状、壁７の外形は５ｍｍ×５ｍｍとし高さは５ｍｍである。障壁１１ａの高さは１ｍｍである。尚、ここでは、微小電極２は８μｍ×８μｍの正方形としたが、アガロースゲルによる壁３1，３2，３3及び３4の全体と間隙４1，４2，４3及び４4の幅とで構成する細胞の収納部となる１０μｍφの円状の電極としてもよい。
【００２２】
以下、本発明の細胞応答計測装置１００の構成例とこれを用いた具体的な計測例を説明する。
【００２３】
図４（ａ）、図４（ｂ）および図４（ｃ）は、細胞電位の計測に関する信号を示す図である。それぞれ、横軸に時間を、縦軸に微小電極２と比較電極２Cとの間に得られる細胞電位を示す。図４（ａ）は細胞集団１０Gの拍動による細胞電位である。ここでは、図１に示す細胞集団１０Gの一つから引き出された引き出し線２’Gと比較電極２Cから引き出された引き出し線２’Cとの間の電位である。図に示すように、安定した拍動を示し、ペースメーカーとして機能しうることがわかる。図４（ｂ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞の拍動による細胞電位である。ここでは、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nとし、細胞１０nから引き出された引き出し線２’nと比較電極２Cから引き出された引き出し線２’Cとの間の電位が計測されている。図４（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけ遅れていることが観察される。これに対して、図４（ｃ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞の拍動による細胞電位である。ここでも、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nとし、図４（ｂ）との比較が明確になるようにしている。図４（ａ）、図４（ｂ）、の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけの遅れではなく、時間Δｔ＋αの遅れとなっていることが観察される。これは、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞に対する薬物の作用によるＮａイオン阻害の大きさが＋αの遅れの増大として表れていることを意味する。すなわち、心筋細胞に対する薬物の毒性をＮａイオン阻害として評価することが出来る。
【００２４】
図５（ａ）、図５（ｂ）および図５（ｃ）は、細胞の拍動に伴う体積変化を光学系によって計測した結果に関する信号を示す図である。図５（ａ）は細胞集団１０Gの細胞の拍動に伴う体積変化である。細胞集団１０Gの細胞の一つの拍動を図３に示す形で光学的に検出したものである。細胞の拍動に伴う収縮および拡張がパルス状に現れる変化として認められる。この波形の周期は、図４（ａ）に示す拍動に伴う細胞電位の変化の周期と同じである。図５（ｂ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞の拍動に伴う体積変化を上段に示し、下段にこれを電気信号として評価するために時間微分値として処理したときの波形を示す。ここでも、計測の標的細胞を細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０nとし、細胞１０nの拍動を図３に示す形で光学的に検出したものである。図５（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔだけ遅れていることが観察される。これに対して、図５（ｃ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞の拍動に伴う体積変化を評価するための説明図であり、図５（ａ）、図５（ｂ）に比し時間軸を拡大した形で示す。上段は図５（ｂ）の上段の波形に対応する波形であり、図５（ａ）の波形と比較して明らかなように、細胞連絡チャネルＣＣＣの細胞１０による拍動の伝達に要する時間Δｔよりもさらにβだけ遅れが増大していることが観察される。標的細胞の拍動に伴う体積変化が薬物により受ける影響は、この遅延の増大以上に体積変化の傾きが小さくなることが特徴的である。図５（ｃ）の下段に参考波形として示した薬物を含まない培養液での体積変化と比較してみるとこのことがよく分かる。図５（ｃ）の中段には、上段の波形を評価するために時間微分値として処理したときの波形を示す。この時間微分値を図５（ｂ）の下段のそれと比較すると分かるように、ピーク値が小さくなるとともに、傾きが緩やかになっている。これは、薬物により心筋の収縮速度が低下して、心拍出量が低下したことを意味する。すなわち、心筋細胞に対する薬物の毒性を収縮速度の低下として評価することが出来る。
【００２５】
図６（ａ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す。図６（ｂ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す。図６（ａ）、図６（ｂ）を対比してすぐ分かるように、ＱＴ遅延が表われて波形が時間軸方向に伸びている。さらにＫ+イオンの流入出に伴い、波形が大きく変形している。これを電気信号として評価するために、図に破線で示した“０”と“１００”の間の値に対して、３０％、６０％および９０％の値の継続時間をＡＰＤ３０，ＡＰＤ６０およびＡＰＤ９０として検出する。ここで、ＡＰＤとはAction Potential Durationの頭文字からとった表現である。これらの値の大きさおよび比率を評価すれば、その薬物のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に及ぼす影響を評価できる。
【００２６】
図７は、心筋毒性検査装置の細胞を光学的に検出する光学系および可動電極の配置の一例を説明する図であり、たとえば計測する細胞１０nの拍動の状態を観察する例を示している。１２は培養液を示す。２２は位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡の光源であり、一般にハロゲン系のランプが用いられる。２２１は細胞の蛍光計測をするための蛍光光源であり、一般に水銀ランプ、単色光レーザー、ＬＥＤ光源などが用いられる。２３は位相差等の実体顕微鏡観察の光源の光から特定の波長のもののみを透過させるバンドパスフィルタであり、２３１は蛍光光源２２１から特定の蛍光を励起する励起波長の光のみを透過させるバンドパスフィルタである。たとえば細胞１０nの拍動堆積変化情報のような形状変化の観察の場合には、細胞形状を計測するための波長の光だけを透過させるバンドパスフィルター２０を通過した像をカメラ２１でリアルタイム計測するが、計測に波長７００ｎｍ近傍の狭帯域の光を用いることで細胞１０nの損傷を防ぐことができる。２４および２４１はシャッターで、ＸＹステージ１５を移動させる場合など、画像計測をしていない間は光の照射を遮断する機能を有する。２５はコンデンサレンズであり、位相差観察をする場合は位相差リングを導入し、微分干渉観察をする場合は、偏光子を導入する。蛍光計測の場合は、たとえば細胞内カルシウム放出の計測を行う場合は、励起波長５００ｎｍ程度、蛍光計測波長６００ｎｍ程度での光を選択的に透過するバンドパスフィルターの組み合わせを用い、蛍光波長の光だけを選択的に透過するバンドパスフィルター２０１を通過した蛍光像をカメラ２０１で計測する。このとき、細胞ネットワーク中での1細胞単位でのカルシウム放出の時間的前後関係を計測して細胞ネットワーク中での信号伝達の経路を計測する場合には、カメラの計測時間分解能は０．１ｍｓ以上の高速連続画像が取得できるものとなっている。ＸＹステージ１５上には基板１上に形成されている細胞応答計測装置１００が載置されＸ−Ｙ駆動装置１６によって前記ＸＹステージ１５を移動させることで前記細胞応答計測装置１００の任意の位置を観察し、計測することができる。前記細胞応答計測装置１００内の細胞１０nの拍動の状態は、対物レンズ１７で観察される。対物レンズ１７の焦点位置はパソコンＰＣによる信号に応じて駆動装置１８によってＺ軸方向に移動させることができる。対物レンズ１７の倍率は４０倍以上のものが使用できる。対物レンズ１７で観察されるのは、光源２２から透過された光による細胞１０nの位相差像あるいは微分干渉像である。前記バンドパスフィルタ２３を透過するのと同波長の光を反射するダイクロイックミラー１９２およびバンドパスフィルタ２０によって、位相差顕微鏡像あるいは微分干渉顕微鏡像のみがカメラ２１によって観察される。カメラ２１によって観察された画像信号はパソコンＰＣに導入される。また、この実施例では細胞への刺激を行うための可動電極２７が配置されており、可動電極の座標がＸＹステージと同じ平面上の任意の位置のみならず、高さを任意に調節することができる位置制御機構が備わっている。この位置制御機構を用いて細胞ネットワーク中の特定の1細胞あるいは数細胞の位置に可動電極の先端を移動させることで、任意の特定の細胞あるいは数細胞に刺激を与えることができる。可動電極の素材としては、先端部以外の部分は絶縁被覆されている金属電極、先端の開口サイズが５ミクロン程度以下のガラス電極等の、可動電極先端近傍にある特定の細胞あるいは数細胞のみに電気刺激を与えることができる構成の電極を用いることができる。金属電極を用いる場合は、先端部表面に白金黒などを付加することによって効果的に電気刺激を細胞に伝達することができる。可動電極の先端の位置は、電気刺激に対する細胞の応答の程度によって調整するものとし、細胞に接しても良いし、あるいは、細胞のごく近傍に配置しても良い。また、刺激電極の刺激を適切に標的とする特定の細胞に与えるために電気刺激を与える瞬間にスイッチングによって細胞電位計測のための電極２を接地電極として用いても良いし、あるいは、別途、別の接地電極２８を配置しても良い。さらに、特定の細胞を刺激するために、既存の微小電極２を刺激電極として用いても良い。その場合には、微小電極が接続されているスイッチング回路２９のスイッチングによって、通常は電気信号計測回路３０に接続されているものを、刺激を与える瞬間に、スイッチング切り替えによって、電気刺激回路３１に接続をして矩形波の刺激信号を微小電極２に与えることができる。また、上記可動電極２７を用いて刺激を与える瞬間には、スイッチング回路２９を接地にスイッチングすることができる。他方、可動電極も、刺激電極としてだけでなく、細胞の電気信号を計測する電極としてもちいたり、接地電極として用いることもできる。その場合は、可動電極はスイッチング回路２９１に接続されており、細胞電位計測、細胞刺激、接地電極としての利用に応じて、それぞれスイッチングによって、電気信号計測回路３０１に接続されて細胞電位を計測したり、電気刺激回路３１１に接続をして矩形波の刺激信号を細胞に与えたり、また、接地させることで、接地電極として用いることができる。電気刺激回路３１、３１１が細胞に与える電気刺激のタイミングは、おもに次の２つの用途で用いることができる。ひとつは自律拍動機能を持った細胞ネットワークにおいて、その正常な心筋細胞ネットワークの拍動インターバルの間に、イレギュラーな刺激を与えるものであり、他方は、自律拍動能を有さない心筋細胞ネットワークに対して拍動インターバルを与えるものである。ともに、計測するのは、拍動インターバルの周期（２つの拍動間の時間差）を５ｍｓ単位で徐々に短くしていったときの、細胞ネットワークの応答の変化を追跡できるものである。そのために、電気刺激回路３１、３１１は、電気信号計測回路３０、３０１などによって得られた拍動周期情報を解析して、その結果に基づいて刺激のタイミングを決定するフィードバック制御を行うことができる。さらに、可動電極２７を電気信号計測のために用いる場合、本システムにおいて微小電極２が無くても同様な計測ができることとなる。これは、システムに構成されている光学計測によって細胞ネットワーク中の各細胞の拍動周期の計測は可能であることから、この拍動周期が安定状態から不整脈などの不安定状態になることはシステムに配置されている光学計測装置のみで計測し、その結果から必要に応じて、可動電極を用いて特定の細胞の電気的特性のデータを取得するものであり、この場合には、システム上に事前に配置している微小電極数の制約を受けず、光学計測できる範囲で、より自由に大きな細胞ネットワークを構築することができる。
【００２７】
図８に、細胞の電気信号の発生の一例について模式図で示した。最初に、細胞膜にあるナトリウムイオンチャンネルからのナトリウムイオンの細胞内への流入が発生し細胞電位が急激に下がり、次に、少しの遅延を経て、カルシウムイオンの流入による細胞電位の低下が起き、そして、次のステップとして、カリウムイオンの細胞外への排出が起きることで細胞電位の上昇が起きる。細胞電位の変化は、心筋細胞膜に存在する応答特性の異なるさまざまなイオンチャンネルの特性の違いによって引き起こされる。それぞれのイオンチャンネルに起因して引き起こされる電位変化のピークの位置を、各イオンチャンネルの特性時間として解析すると、薬剤の影響によって各イオンチャンネルがブロックされることで、その薬剤の特性に応じてブロックされたイオンチャンネルの種類に応じた電気信号の波形の変化を計測することができ、それによって薬剤のイオンチャンネルへの阻害効果を見積もることができる。薬剤の評価に特に重要なイオンチャンネルは、ＦａｓｔＮａ、ＳｌｏｗＮａ、Ｃａ、ＩＫｒ、ＩＫｓの４つのイオンチャンネルであり、これら4種類のイオンチャンネルのブロックの状態を計測することができる。
【００２８】
図９（ａ）は、図８で示した細胞の電気信号について、実際にカリウムイオンチャンネルを選択的に阻害する試薬Ｅ−４０３１を様々な濃度で添加したときの変化を示したものである。細胞の電位を上げるＫイオンの細胞外への排出機能を担うＩＫｒイオンチャンネルを阻害することから、薬剤濃度が高まるにつれて正方向の細胞電位の変化が徐々に遅延することが分かる。本図９（ａ）に示したのは、細胞の応答の特定の1拍動データであるが、実際には隣接する各拍動での応答のゆらぎ幅の大きさが、薬剤の影響を見積もる重油様な指標となる。図９（ｂ）がその一例であり、ポアンカレプロットと呼ばれる隣接する拍動データの相関を比較する解析手法である。ここでは、Ｘ軸にｎ回目の拍動時の特定のイオンチャンネルの応答時間の位置を、Ｙ軸に（ｎ＋１）回目の拍動時の同じイオンチャンネルの応答時間の位置を置いたプロットを行う。すると、隣接する拍動同士での特性が同じ場合は、グラフ内の点線で描かれたＹ＝Ｘ上にプロットが並ぶこととなるが、隣接する拍動同士での応答に大きな揺らぎがある場合は、Ｙ＝Ｘから離れた位置までの大きなプロットの分布が観測されることとなる。実際に、この例では、薬剤を添加しないControlに対して、４０ｎＭの添加では応答時間の遅延があるが、隣接した拍動間での相同性は維持されている。他方、４００ｎＭまで薬剤の添加をすると応答時間の更なる遅延に加えて、隣接した拍動間での相同性も崩れ、不安定な拍動周期が発生することとなることが本プロットによって明らかにできる。この結果は、心毒性を示すＱＴ延長計測の結果とも一致しており、ポアンカレプロットによって1細胞レベルでの隣接した各拍動のゆらぎの増大の計測を指標にすることでＱＴ延長の発生を見積もることができる。この現象は、特定のイオンチャンネルが薬剤によってブロックされたときに、そのブロックの程度が軽微な場合は、イオンの排出能力の低下という現象が見えるだけで細胞応答の不安定性はまだ発生しないのに対して、さらに、ブロックの程度が重度になると、機能しているイオンチャンネルの数が極端に減少して、そのために細胞のイオン排出能力について同じ細胞でありながら再現性の低い大きな揺らぎを持った結果が出てくることとなる。そして、このゆらぎの大きさがＱＴ延長の発生し易さの指標として用いることができるものである。
【００２９】
図１０（ａ）は１細胞レベルでの細胞配置技術を用いた心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路薬剤の一例を示す模式図である。心筋細胞のみで細胞の環状ネットワークを作成したものは、正常ネットワークモデルとなり、心肥大などの病理モデルの場合には、細胞ネットワークの中に線維芽細胞を組み込むことで実現される。そして、ネットワーク中に混在する線維芽細胞が心筋細胞ネットワークの伝達速度の遅延や減衰をもたらし、その結果、期外収縮の発生を予測することができる。図１０（ｂ）は、実際に微小電極上に心筋細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真である。実際に、この写真に示したように、１細胞単位で微小電極上に配置された場合は、隣接した心筋細胞同士の信号伝達の遅延を計測することができる。そして、この伝達速度は拍動のときに発生する最初の電気信号の大きさに依存することから、Ｎａイオンチャンネルへの阻害効果として、この信号伝達の遅延データを用いることができる。
【００３０】
図１１（ａ）は一定の幅の細胞集団を用いて心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路の一例を示す模式図である。図１０に示した１細胞単位での環状細胞ネットワークでは、心筋細胞の拍動信号はその通過について一意的であり、図９に示したような細胞自体の拍動のゆらぎが無い限り、同一の特性を維持して細胞は拍動信号を隣接細胞間で伝達する。他方、この図１１で示したように、一定の幅で細胞を配置して環状ネットワークを形成した場合、細胞集団はその伝達について実線３５、破線３６、点線３７のように拍動ごとに異なる経路を取る自由度を持つこととなる。特に、図９で説明したように、薬剤の添加によって各心筋細胞の応答特性に大きなゆらぎが発生すると、容易に応答する細胞が環状ネットワークを刺激信号が周回するたびに、その都度異なることから、経路の違いがより顕著となる。これはスパイラル・リエントリーと呼ばれる心臓の致死に至る期外収縮の機構と同じメカニズムとなることから、このような幅を持った細胞集団ベースでの環状ネットワークを特に用いることでスパイラル・リエントリーの計測が可能となる。図１１（ｂ）は実際に微小電極上に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真であり、心筋細胞６０％程度に線維芽細胞４０％程度を混ぜた細胞集団を配置している。実際に、このような配置を行うと、隣接電極間での伝達速度の隣接拍動間でのゆらぎは大きくなり、特に薬剤の添加によって、そのゆらぎの増大が顕著となることから、隣接拍動間での伝達速度のゆらぎ幅の変化からスパイラル・リエントリーの発生を見積もることができる。図１１（ｃ）は、さらに実際に微小電極アレイ上に環状に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真である。実際のスパイラル・リエントリーの計測には、図７に示した高速蛍光計測カメラを用いることで、細胞集団ネットワーク中での各細胞のカルシウム発火を１細胞レベルで見積もることができ、その結果として細胞の信号伝達がどのような経路で進んでいるのか、各周回での経路の変化を実際に解析することができる。
【００３１】
図１２（ａ）は環状電極を用いたリエントリー回路計測装置の一例を示す模式図である。この例では、１〜３ｍｍの直径のリング状に形成した電極幅５０〜１００ミクロンの環状電極３８を各９６穴ウエルプレート４２の底面に１つ配置し、電極表面にのみ４１のように細胞集団が環状に配置されるように、電極上の除く周囲の底面については、表面にアガロース等の細胞接着性の無い素材をコートしている。この細胞が接着しないようにコートされた領域に、同心円状に参照電極リング３９が配置されており、また、試薬の出入りが行える流路４０が配置されている。このような電極を用いることで簡易に心筋細胞の異常拍動を簡便に計測することができる。図１２（ｂ）は実際に電極で計測した、正常拍動データと異常拍動データを示したグラフである。本実施例では、環状電極を用いたが、図７で示した光学計測システムを用いることで、本環状電極による効果と同じ、異常拍動を光学的に計測することができるシステムを構築することができる。その場合、電気的信号を計測する場合には、図７で示した移動電極を環状細胞ネットワークに接触させることで、電気信号も取得することができる。
【００３２】
図１３（ａ）は１細胞の電位計測を行う微小電極２と細胞の配置の一例を示す模式図であり、直径１０ミクロンから５０ミクロンの微小電極２上に、計測の対象となる細胞を１細胞だけ配置して計測する手法を示したものである。本実施例でも、他の実施例と同様、電極上の細胞がその場所に保持されるように電極周囲には、細胞接着性を阻害するアガロースなどの素材がコートされている。図１３（ｂ）は実際に微小電極２で計測した孤立１細胞の電極上の写真とその拍動電気データを示したものであるが、孤立した一細胞の信号は不安定でありグラフに示したように大きなゆらぎを持って拍動している。他方、図１３（ｃ）で示したように、微小電極２上には、図１３（ｂ）と同様に１細胞が配置されているが、他の細胞と連結された細胞集団となることで、拍動信号グラフを見てもわかるように、拍動周期の安定性が実現される。実際の１細胞レベルでの拍動計測では、図９でも示したように、隣接した各拍動間のゆらぎの大きさが指標となることから、本実施例で示したような、細胞集団化による安定化を実現しながら、１細胞の拍動デーたが取得できるように、特定の計測したい１細胞のみ微小電極上に配置され、この特定細胞の安定性を維持するために他の心筋細胞を電極上には載らない形で配置されている構成を用いた計測システムが有用である。
【００３３】
図１４は、本発明でカメラ受光素子を１細胞の電位計測に用いた実施例を説明する模式図である。通常、カメラ受光素子は、光電変換面で光信号を電気信号に変換して、この電気信号を計測に用いるものであることから、この光電面を除去して、電気信号アレイ部分をもちいることで、２次元での電気信号を取得することが可能となる。これによって、１細胞レベルでのサイズの電極アレイを用いることができるため、たとえば細胞集団の中の各細胞の電気信号を同時に計測することが必要な、図１１で示した一定の幅を持つ細胞集団ネットワーク中での信号伝達経路の変化というスパイラル・リエントリーの発生を計測することが可能となる。実際の計測では、画素の計測インターバルは１万分の１秒程度必要であり、１万分の１秒のシャッタースピードの高速カメラのカメラ受光素子を利用する必要がある。この場合、取得された細胞の信号データは、既存のカメラで用いられている画像処理技術をそのまま適用することができ、画像処理用のFPGAを用いた実時間処理が可能となる。また、その実時間処理によって得られたデータに基づいて刺激電極へのフィードバック刺激を行うことも可能となる。
【００３４】
図１５は、本発明の細胞計測システムで複数試料を計測できる機構の一例を説明する模式図である。この実施例のシステムは、分析モジュール、多段インキュベーター、電気解析モジュールとオンラインネットワークで接続されたオンライン解析モジュールとからなる。ここで、分析モジュールには、細胞形状の変化を計測する位相差顕微鏡あるいは微分干渉顕微鏡、そして蛍光顕微鏡とカメラ撮影解析による光学的計測、アガロースを顕微鏡システムを利用してミクロンのスケールで局所溶解できるアガロース加工技術からなっている。多段インキュベーターには、複数の細胞培養槽が配置されており、また、細胞培養槽の中には微小電極チップが配置されており、各細胞の電気信号の計測、電気的刺激がインキュベーター中で並列で連続処理できるようになっている。得られた電気信号については、電気解析モジュールで実時間計測を行い、そのデータはオンラインアクセスが可能なストレージに、光学計測のデータと電気計測データの結果が同じ時間スタンプを持った形で記録されており、この記録データにオンラインで解析モジュールが適宜アクセスすることで解析することができる。
【００３５】
図１６は、本発明の細胞計測システムで計測できる心臓情報を説明する模式図である。微小電極上での１細胞の電気信号計測によって、Na、Ca,IKｒ、IKｓなどのイオンチャンネルの信号データを計測することができ、隣接する心筋細胞間での信号伝達の速度変化の計測からNaイオンチャンネルの阻害を計測することができる。また、１細胞の形状変化の光学計測によって不整脈の発生の計測および心臓の拍出量の見積もりができる。さらに、環状に細胞ネットワークを配置することによってリエントリーの発生を計測することができ、さらに線維芽細胞を細胞配置に加えることで心肥大などの病理心臓モデルとしての計測がすることができる。
【産業上の利用可能性】
【００３６】
本発明によれば、細胞集団のペースメーカーとしての拍動を基礎として心筋細胞あるいは線維芽細胞が直列配列された細胞連絡チャネルＣＣＣによる細胞の拍動の伝達応答およびこれに対する薬物の影響、すなわち、薬物の心筋毒性を等価的にin vitroで評価できる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の実施例に係る心筋毒性検査装置の構造の１例を模式的に示した斜視図である。
【図２】図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨの構成の１例を模式的に示す斜視図である。
【図３】図３は、図１に示す心筋毒性検査装置の細胞保持部ＣＨに保持された細胞を光学的に検出する光学系を説明する図である。
【図４】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、細胞電位の計測に関する信号を示す図である。それぞれ、横軸に時間を、縦軸に微小電極２と比較電極２Cとの間に得られる細胞電位を示す。
【図５】（ａ）、（ｂ）および（ｃ）は、細胞の拍動に伴う体積変化を光学系によって計測した結果に関する信号を示す図である。
【図６】（ａ）は培養液に薬物が含まれない通常状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す図であり、（ｂ）は培養液に薬物が含まれた状態における標的細胞のＮａ+イオン、Ｃａ2+イオン、Ｋ+イオン成分の流入出量に伴う細胞電位変化を示す図である。
【図７】心筋毒性検査装置の細胞を光学的に検出する光学系および可動電極の配置の一例を説明する図である。
【図８】細胞の電気信号の発生を説明する模式図である。
【図９】（ａ）は薬剤の添加による細胞電位変化の一例を示す図であり、（ｂ）は各拍動時の細胞電位変化について、隣接した２つの拍動の相同性を評価するポアンカレプロットの一例を示す図である。
【図１０】（ａ）は１細胞レベルでの細胞配置技術を用いた心筋細胞の環状ネットワークによって作成したリエントリー回路の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に微小電極上に細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真である。
【図１１】（ａ）は一定の幅の細胞集団を用いて心筋細胞の環状ネットワークによるリエントリー回路の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に微小電極上に細胞を配置した一例を示す顕微鏡写真であり、（ｃ）は実際に微小電極アレイ上に環状に細胞集団を配置した一例を示す顕微鏡写真である。
【図１２】（ａ）は環状電極を用いたリエントリー回路計測装置の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に電極で計測した、正常拍動データと異常拍動データを示したグラフである。
【図１３】（ａ）は１細胞の電位計測を行う電極と細胞の配置の一例を示す模式図であり、（ｂ）は実際に電極で計測した孤立１細胞の電極上の写真とその拍動電気データ、（ｃ）は計測した細胞集団の電極上での写真と細胞集団の中の１細胞の拍動電気データを示したグラフである。
【図１４】本発明でカメラ受光素子を１細胞の電位計測に用いた実施例を説明する模式図である。
【図１５】本発明の細胞計測システムで複数試料を計測できる機構の一例を説明する模式図である。
【図１６】本発明の細胞計測システムで計測できる心臓情報を説明する模式図である。
【符号の説明】
【００３８】
１…透明基板、２…微小電極、２ｃ…比較電極、２’…微小電極２の引き出し線、３1，３2，３3及び３4…アガロースゲルによる壁、４1，４2，４3及び４4…間隙、７…周辺を取り巻く壁、８1，８2，８3…パイプ、ＰＣ…パソコン、Ｍｓ…パソコンの操作信号、１０0，１０1，１０2，１０3，−−−，１０n…心筋細胞あるいは線維芽細胞、１５…光学観察装置の透明ステージ、１６…Ｘ−Ｙ駆動装置、１８…Ｚ駆動装置、ＣＨ1、ＣＨ2、ＣＨ3およびＣＨn…細胞保持部、ＣＣＣ…細胞連絡チャネル、１０G…細胞集団、１１a…障壁、１１b…開口、１９、１９１、１９２、１９３…ダイクロイックミラー、２０、２０１…バンドパスフィルタ、２１、２１１…カメラ、２２…光源、２２１…蛍光光源、２３、２３１…バンドパスフィルタ、２４、２４１…シャッター、２５…コンデンサレンズ、２６…対物レンズ、２７…可動電極、２８…接地電極、２９、２９１…スイッチング回路、３０、３０１…電気信号計測回路、３１、３１１…電気刺激回路、３２…心筋細胞、３３…線維芽細胞、３４…細胞配置用ピペット、３５…N周回目の伝達経路、３６…（N＋１）周回目の伝達経路、３７…（N＋２）周回目の伝達経路、３８…測定電極、３９…参照電極、４０…送液系、４１…環状に配置した細胞集団、４２…９６穴ウエルプレート、４３…カメラ受光素子、４４…細胞、４５…細胞刺激電極、１００…心筋毒性検査装置。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２】
前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている請求項１記載の心筋毒性検査装置。
【請求項３】
前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた請求項１記載の心筋毒性検査装置。
【請求項４】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項１記載の心筋毒性検査装置。
【請求項５】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、および
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項６】
前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている請求項５記載の心筋毒性検査装置。
【請求項７】
前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた請求項５記載の心筋毒性検査装置。
【請求項８】
前記細胞培養液を供給する培養液供給手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項５記載の心筋毒性検査装置。
【請求項９】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする心筋毒性検査チップ。
【請求項１０】
前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている請求項９記載の心筋毒性検査チップ。
【請求項１１】
前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する請求項９記載の心筋毒性検査チップ。
【請求項１２】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有する心筋毒性検査装置を使用して、
前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項１３】
透明基板、
該透明基板上に配置された、安定した拍動を行う心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
前記細胞保持部の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、ならびに
前記透明基板上に配置した細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
【請求項１４】
前記細胞保持部（ＣＨG，ＣＨn）の各々が、前記透明基板上に設けられた細胞非接着性の壁で囲まれた空間として規定され、該壁が前記細胞が通り抜けることの出来ない１以上の間隙を有する、請求項１３記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１５】
前記心筋細胞集団保持領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記心筋細胞集団保持領域の複数の細胞保持部（ＣＨG）のうち一つに収容された細胞と前記細胞連絡チャネルの端部の細胞保持部（ＣＨn）の細胞とが連携するための開口部を有する障壁が設けられた、請求項１３記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１６】
透明基板、
該透明基板上に配置された複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、ならびに
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
【請求項１７】
透明基板、
該透明基板上に配置された、心筋細胞を保持するための複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該細胞集団の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数個の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を備える、心筋毒性検査チップ。
【請求項１８】
請求項１３〜１６のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項１９】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞に対して拍動を励起する電気刺激を与える手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２０】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２１】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記可動式微小電極を用いて環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団の細胞電位を計測し記録する手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２２】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の環状の形状と同じリング状の形状を持った微小電極、
前記微小電極を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２３】
カメラ受光素子の光電変換面を除去して直接電気信号を計測できるように構成された受光素子アレイ基板、
該受光素子アレイ基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記受光素子アレイ基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記受光素子アレイ基板を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記受光素子アレイ基板上の各受光素子上に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記受光素子に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項２５】
請求項１２、１８および２４のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、特定の細胞の拍動データの隣接する拍動間の差異を定量的に比較して、その差異のゆらぎが一定以上の値となるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項２６】
請求項１２、１８および２４のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、環状の細胞ネットワークにおいて、複数の伝達経路を選択できる細胞配置の構成がなされているもので、その伝達経路が各周回で異なるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項１】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２】
前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている請求項１記載の心筋毒性検査装置。
【請求項３】
前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた請求項１記載の心筋毒性検査装置。
【請求項４】
前記細胞培養液を還流する培養液還流手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項１記載の心筋毒性検査装置。
【請求項５】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、および
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項６】
前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている請求項５記載の心筋毒性検査装置。
【請求項７】
前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する障壁が設けられた請求項５記載の心筋毒性検査装置。
【請求項８】
前記細胞培養液を供給する培養液供給手段に前記細胞に作用する薬剤を添加する手段が付加された請求項５記載の心筋毒性検査装置。
【請求項９】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を有することを特徴とする心筋毒性検査チップ。
【請求項１０】
前記細胞が、前記細胞が通り抜けることの出来ない間隙を有する細胞非接着性の壁で囲われている請求項９記載の心筋毒性検査チップ。
【請求項１１】
前記細胞集団の形成された領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記細胞集団の細胞の一つと前記細胞連絡チャネルの端部の細胞が連携するための開口部を有する請求項９記載の心筋毒性検査チップ。
【請求項１２】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる細胞集団、
該細胞集団の１細胞と連携して前記細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された心筋細胞と線維芽細胞よりなる細胞連絡チャネル、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および
前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有する心筋毒性検査装置を使用して、
前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項１３】
透明基板、
該透明基板上に配置された、安定した拍動を行う心筋細胞を保持するための複数の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
前記細胞保持部の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、ならびに
前記透明基板上に配置した細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
【請求項１４】
前記細胞保持部（ＣＨG，ＣＨn）の各々が、前記透明基板上に設けられた細胞非接着性の壁で囲まれた空間として規定され、該壁が前記細胞が通り抜けることの出来ない１以上の間隙を有する、請求項１３記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１５】
前記心筋細胞集団保持領域と前記細胞連絡チャネルの形成された領域との間に、前記細胞培養液の流れを阻害するとともに前記心筋細胞集団保持領域の複数の細胞保持部（ＣＨG）のうち一つに収容された細胞と前記細胞連絡チャネルの端部の細胞保持部（ＣＨn）の細胞とが連携するための開口部を有する障壁が設けられた、請求項１３記載の心筋毒性検査装置。
【請求項１６】
透明基板、
該透明基板上に配置された複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝える複数個の直列配列された細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および排出するための培養液供給／排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加えるための薬剤供給手段、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、
Ｘ−Ｙ方向に駆動されるとともに前記透明基板を載置するステージ、ならびに
前記ステージ上に載置された前記透明基板上の細胞の状態を光学的に計測する手段、
を備える、心筋毒性検査装置。
【請求項１７】
透明基板、
該透明基板上に配置された、心筋細胞を保持するための複数個の細胞保持部（ＣＨG）を含む心筋細胞集団保持領域、
該細胞集団の１細胞と連携して前記心筋細胞集団の拍動を伝えるための、直列配列された複数個の細胞保持部（ＣＨn）を含む細胞連絡チャネルであって、該細胞保持部（ＣＨn）が心筋細胞または線維芽細胞を保持する、細胞連絡チャネル、
前記透明基板表面と、前記心筋細胞集団保持領域および前記細胞連絡チャネルの周囲に形成された壁とによって規定される、細胞培養液を満たすための領域、
前記透明基板上に設けられ、前記心筋細胞集団保持領域の細胞保持部（ＣＨG）の一つにおいて心筋細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの複数の細胞保持部（ＣＨn）において前記心筋細胞または線維芽細胞を載置している複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、および
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線、
を備える、心筋毒性検査チップ。
【請求項１８】
請求項１３〜１６のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項１９】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞に対して拍動を励起する電気刺激を与える手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２０】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の一つの細胞を載置している微小電極、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞連絡チャネルの細胞のいくつかをそれぞれ載置している分離された複数の微小電極、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２１】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記壁で囲われた領域内に設けられた比較電極、
前記環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記可動式微小電極を用いて環状に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団の細胞電位を計測し記録する手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２２】
透明基板、
該透明基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記透明基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記透明基板上に設けられ、前記細胞集団の環状の形状と同じリング状の形状を持った微小電極、
前記微小電極を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記微小電極のそれぞれに接続された引き出し線と前記比較電極に接続された引き出し線とを用いて前記微小電極に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記微小電極に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段、および前記透明基板上に配置した一つの細胞の状態を光学的に計測する手段、
を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２３】
カメラ受光素子の光電変換面を除去して直接電気信号を計測できるように構成された受光素子アレイ基板、
該受光素子アレイ基板上に配置した複数個の細胞よりなる安定した拍動を行う心筋細胞よりなる環状に配置された細胞集団、
前記受光素子アレイ基板上に形成され、前記細胞集団および前記細胞連絡チャネルの周辺に細胞培養液を満たすための壁、
前記細胞培養液を前記壁で囲われた領域内に供給し、および、排出する培養液供給、排出手段、
前記細胞に作用する薬剤を前記細胞培養液に加える手段、
前記受光素子アレイ基板を取り巻く形で配置されている比較電極、
前記受光素子アレイ基板上の各受光素子上に載置されている細胞電位を計測し記録する手段、および前記受光素子に載置されている細胞のうち特定の細胞あるいは細胞集団に対して拍動を励起する電気刺激を与えることができる可動式微小電極を用いた電気刺激手段を有することを特徴とする心筋毒性検査装置。
【請求項２４】
請求項１９〜２３のいずれか記載の心筋毒性検査装置を使用して、前記細胞に作用する薬剤が前記細胞培養液に加えられたときに、前記心筋細胞集団の発生する拍動が前記細胞連絡チャネルを伝播する速度を遅延させるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項２５】
請求項１２、１８および２４のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、特定の細胞の拍動データの隣接する拍動間の差異を定量的に比較して、その差異のゆらぎが一定以上の値となるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【請求項２６】
請求項１２、１８および２４のいずれか記載の心筋毒性検査方法において、環状の細胞ネットワークにおいて、複数の伝達経路を選択できる細胞配置の構成がなされているもので、その伝達経路が各周回で異なるか否かを評価して前記細胞に作用する薬剤の心筋に対する毒性を検査する心筋毒性検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【公開番号】特開２０１０−１３０９６６（Ｐ２０１０−１３０９６６Ａ）
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−３１１３４１（Ｐ２００８−３１１３４１）
【出願日】平成２０年１２月５日（２００８．１２．５）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年６月１７日（２０１０．６．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月５日（２００８．１２．５）
【出願人】（５０４１７９２５５）国立大学法人 東京医科歯科大学 (228)
【Ｆターム（参考）】
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