心臓血管疾患を診断する方法
個体の心臓血管疾患を診断するための方法であって、個体の試料を用意する工程；該試料中のサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；及び該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が参考対照中のＣＫ−１８若しくはその断片の量と比較して増加している場合、及び／又は該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が参考対照中のＩＬ−１β前駆体の量と比較して減少している場合には心臓血管疾患と診断する工程を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓血管疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ；ジュネーブ）によれば、心臓血管疾患は、毎年、世界中で１，５００万人を超える死者の原因である。いくつかの先進国の全死亡数の５０％を超え、アフリカ及び西・東南アジアにおいて５０％を超える。また、成人における死亡の主要な原因でもある。さらに、多くの心臓血管事象は必ずしも致命的ではないが、正常な日常生活を生きるための能力を損なう場合があり、結果として、社会に莫大に医療費を負担させてしまう。
【０００３】
改善された急性及び慢性的な投薬及び外科的処置、並びに生活スタイル及び食事の変化により、過去２、３０年と比較して全体の心臓血管疾患の致死率の有意な減少がある。なお、これらの高い事象及び致死率のために、心臓血管疾患は、バイオテクノロジーおよび製薬業界の両方によって莫大な投資の対象となる。
【０００４】
しかしながら、心臓血管疾患の効果的な治療及び予防は、適切な薬剤の投与を伴うだけでなく、確実な診断ツールを必要とする。したがって、初期の診断及び予防のための心臓血管疾患の分子マーカーの同定及び使用は、非常に重要である。例えば、心臓トロポニンは、損傷を受けた心筋細胞によって選択的に放出される。この事象の特異性は、急性心臓虚血性障害の診断における改善にとって十分に高い。さらに、医師は、より確実に患者に対するリスク及び予後のシナリオを予測することができる。
【０００５】
さらに、アテローム性動脈硬化形成、その進行及び不安定化を指標とする生物学的マーカーについてのサーチは、急性冠不全症候群の臨床設定、及び虚血性事象、例えば脳梗塞に関連した他の臨床的実体において非常に関連性がある。
【０００６】
今日、複数の証拠が、アテローム性動脈硬化症は慢性炎症疾患であり、粥腫発生における免疫系の成分と関係していることを示唆している。最近、研究によって、炎症に関与している強力な免疫メディエーターであるＣＤ４０及びその対応物であるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ１５４）の関与が特定された。以前に、一般的な炎症マーカー、例えば高感度Ｃ−反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）及びインターロイキン−６、並びに血清アミロイドは、冠状動脈性心臓病を有する患者において不利な結果と関連付けられることが示唆された。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、個体において心臓血管疾患を診断するための手段及び方法を提供することである。更なる目的は、安定狭心症と不安定狭心症とを区別するための方法である。本発明の別の更なる目的は、心臓血管疾患、特に血栓症に関連した疾患を治療するための手段を提供することである。
【０００８】
したがって、本発明は、個体の心臓血管疾患を診断するための方法であって、該方法は、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料中のサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；及び
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が参考対照中のＣＫ−１８若しくはその断片の量と比較して増加している場合、及び／又はＩＬ−１β前駆体の量が参考対照中のＩＬ−１β前駆体の量と比較して減少している場合には心臓血管疾患と診断する工程
を含む。
【０００９】
さらに、健常な個体の試料と比較して、心臓血管疾患を患っているか又は患っていると疑われる個体の試料中のＣＫ−１８又はその断片及びＩＬ−１β前駆体の量は、心臓血管疾患を指示することが見出された。心臓血管疾患を患っている個体の試料中のＣＫ−１８又はその断片及びＩＬ−１β前駆体の量は、心臓血管疾患を患っていない健常な個体から得られた試料中の該マーカーの量と比較して、それぞれ、増加し、減少する。
【００１０】
局所性及び全身性炎症は、心臓血管疾患、特に急性冠症候群（ＡＣＳ）、例えば不安定狭心症（ＵＡ）及び急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に主要な役割を演じる。種々のデータにより、アポトーシスがアテローム斑の発生及び進行中に主要な事象となることを示している。ＡＭＩは、虚血によって誘導される筋細胞壊死の直接的な結果として起こることを明確に示されてはいるが、アポトーシスは、冠状動脈の閉塞後に重要な寄与実体として説明されている。メカニズム的には、粥腫崩壊後の血栓形成は、ＡＭＩにおける血管閉塞の主な原因となり、ＵＡにおける流量障害に寄与する。急性経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）は、ＡＣＳを有する患者の治療に対する最先端オプションであり、血栓溶解療法よりも高い再潅流率及び良好な結果と関連する。それにも関わらず、ＰＣＩは、血栓症及び血栓形成材料を動員するリスクを持ち、末梢の塞栓及び小循環の機能障害を引き起し、心筋救済を制限する場合がある。
【００１１】
いくつかの血栓切除デバイスは、臨床領域に導入され、ＡＭＩの設定における冠動脈血栓材料の断片化及び除去を可能にする。見込まれる無作為試験において、例えば、Ｘ−サイザー血栓切除デバイスは、心外膜流量及びＳＴセグメント分解を改善することを示している。しかしながら、生存または増加した心筋救済の改善は、これらの試験では示されなかった。生存的な心室機能及び生活の改善における急性血栓切除の効果は、今日まで多施設臨床試験において証明されてはいないが、この技術は、冠状動脈における急性動脈血栓症の部位から血液試料を回収する可能性を提供し、炎症及びアポトーシスに関連することが知られているタンパク質を調査することができる。
【００１２】
アポトーシスとは、細胞収縮、膜気泡（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、染色体凝縮、及びＤＮＡ断片化を含む「積極的なに」死んでいく細胞によって示される形態学的変更を意味する。アポトーシス細胞死は、内因性の実行プログラムの発生的に調節された活性化、又は広範囲な外因性の刺激によって開始される死のシグナルの形質導入に起因する。主要な経路は、インターロイキン−１β−変換酵素（ＩＣＥ）、システインプロテアーゼタンパク質−３２様ファミリー（シノラブディス・エレガンス細胞死遺伝子ｃｅｄ−３の遺伝子産物に相同である）に対する受容体の誘因を必要とする。炎症及びアポトーシスと関連することが知られている他のタンパク質には、ＩＬ−１β及びＩＬ−１β前駆体（ＩＬ−１β）、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−Ｒ１／ＣＤ１２０ａ、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌ／ＣＤ１７８、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４が含まれる。さらに、ＵＡを有するタンパク質は、活性化したＣＤ３＋細胞、マクロファージ及び内皮細胞由来の可溶性の脱落（ｓｈｅｄ）膜成分の濃度増加を示し、増加した血管内の末梢アポトーシス代謝回転を示す。これらの脱落膜粒子は、凝血活性が増加することが報告されている。さらに、虚血性心疾患を有する患者は、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）又はその断片を生じること見出され、細胞骨格産物は、アポトーシスを受けている内皮細胞及び心臓微小血管に存在する。
【００１３】
これらのマーカーの全ては、刊行物において、冠状動脈性心臓病の正の徴候対象物であることが説明され、ｐ値は、０．０４〜０．０５の範囲にあることが記載されている。
【００１４】
用語「参考対照」とは、本明細書中で使用するとき、好ましくは、分析されるべき固体の試料に匹敵する少なくとも１つの健常な個体から得られる同供給源（例えば、血液、血清など）の試料を意味する。同程度の結果を得るために、参考対照及び個体の試料が同じように得られ、操作され、取り扱われるべきである。参考対照値を得るために健常な個体の数は、少なくとも１つであり、好ましくは少なくとも１０、とりわけ少なくとも２０であってもよい。しかしながら、この値はまた、少なくとも１００、１０００又は１００００個体から得ることもできる。
【００１５】
「量」及びそれと同義に使用される用語「レベル」とは、本発明の文脈において使用されるとき、試料中に存在するマーカーの濃度を意味する。
【００１６】
用語「この量が〜と比較して増加する」及び「この量が〜と比較して減少する」とは、本明細書中で使用するとき、分析されるべき試料において測定される量を意味し、対照又は「正常」（＝健常）値とは統計的有意性を有して分散し、参考対照の量の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも２００％である。本明細書中で使用するとき、用語「ＣＫ−１８又はその断片」とは、ＣＫ−１８及びその特定の断片を指し、それは、例えば、アポトーシス細胞においてサイトケラチン−１８のカスパーゼ媒介による下位列によって得られ、該細胞から放出される（例えば、Ｋｒａｍｅｒ Ｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）６４：１７５１−１７５６を参照されたい）。特定の断片は、ヒトの体内で生理学的又は病理学的プロセスによって産生されるＣＫ−１８分解産物として特異的に認識され得るものである。ＣＫ−１８の特定の断片はまた、インビトロにおいて、例えば、ＣＫ−１８のプロテアーゼもしくは化学的処理によって、又は（生理学的／病理学的に生じた断片（のさらなる断片化によって）のプロテアーゼもしくは化学的処理によって産生され得る。このようなＣＫ−１８断片は、いずれかの場合において、ＣＫ−１８断片でなければならなず（即ち、ＣＫ−１８断片として明確に同定され得るように）、少なくとも８アミノ酸残基の長さ、好ましくは少なくとも１０アミノ酸の長さ、とりわけ少なくとも１５アミノ酸残基の長さでなければならない。これらの断片は、特異的に認識されるべき特徴的（独特な）アミノ酸配列を有しなければならない（又は有するように選択されなければならない）。好ましいＣＫ−１８断片は、５０〜４００アミノ酸残基、好ましくは１００〜３５０アミノ酸残基、とりわけ１５０〜３００アミノ酸残基の長さを有する。ＣＫ−１８又はその断片は、特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体（他のサイトケラチンなどの他のタンパク質を認識及び交差反応しない）によって検出可能である。ＣＫ−１８又はその断片を特異的に認識する、かなりの数のこのような抗ＣＫ−１８抗体は市販されている。このような抗体の例は、ＤＡＬＤ後の開裂部位を有するカスパーゼによって開裂されたＣＫ−１８断片の配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤを認識する抗体ＭＢ３０である（ＥＰ１０１９４３８Ａ）。この抗体は、この断片に特異的でもあるが、開裂していないＣＫ−１８を認識しない。したがって、ＣＫ−１８に特異的であるだけでなく、ある種のＣＫ−１８断片にも特異的である検出手段（例えば、抗体）が、本発明のＣＫ−１８断片を検出するためには好ましい手段である。ＣＫ−１８のカスパーゼによって開裂した断片は、本発明の特に好ましいＣＫ−１８断片である。
【００１７】
本発明によれば、「心臓血管疾患を患っていない個体」とは、ＣＫ−１８（若しくはその断片）、ＩＬ−１β前駆体及び／又はカスパーゼ−１（ＩＣＥ）レベルが健常な個体のものと似ている個体を意味する。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄である。
【００１９】
用語「心臓血管疾患」とは、本明細書中で使用するとき、心臓及び血管を含む脈管系に影響を及ぼす任意の疾患又は障害を指す。血管疾患又は血管障害には、例えば、アテローム斑の発生に起因した血管内狭窄（狭くする）又は血栓（ブロックする）を含む血管機能不全によって特徴付けられる任意の疾患又は障害、並びにそれからもたらされる疾患及び障害が含まれる。特に好ましい心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄から選択される。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様によれば、試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）量は、追加的に測定され、参考対照に存在するＩＣＥの量と比較され、該試料中のＩＣＥ量が参考対照のＩＣＥ量と比較して増加している場合には心臓血管疾患であると診断される。
【００２１】
ＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の測定を併用した試料中のＩＣＥ量の測定は、さらにより正確な診断を可能にする。
【００２２】
本発明の別の局面は、安定狭心症と不安定狭心症との間を区別する方法又は安定狭心症及び不安定狭心症を診断する方法、あるいは経皮冠動脈インターベンション後の再狭窄のリスクを評価する方法に関し、該方法は、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料中のサイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８若しくはその断片）及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体と、安定狭心症又は不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の少なくとも１つの参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；
−不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と比較して、該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が減少し、該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が増加している場合には、安定狭心症と診断する工程（また、所定のマーカー量が安定狭心症を患っている個体におけるレベルと比較される場合には安定狭心症であると診断することもできる）
を含む。
【００２３】
狭心症は、心筋酸素の供給と需要の不均衡によって引き起こされる心筋虚血の結果である。具体的には、需要は、不十分な血液供給により供給を上回る。心臓は、全体重の少ない割合を占めるが、生体の酸素消費の７％を占める。心臓組織代謝は、非常に好気性であり、不十分な血液供給を補うために貯留は非常に僅かである。血液供給は、心筋需要に不十分であるレベルまで減少すると、組織は、急激に低酸素状態となり、毒性細胞代謝物は除去することができない。心筋細胞は、急速に、局所的な微小血管系に残存する酸素供給源を使用し、好気性代謝が続く期間は、動脈閉塞の程度に間接的に比例する。酸素供給が一度枯渇すると、酸素が電子受容体としてもはや利用できないので酸化的リン酸化が持続できず、ピルビン酸塩は、アセチル補酵素Ａに変換されず、クエン酸サイクルに入る。心筋代謝は、グリコーゲン及びグルコース貯蔵を用いて嫌気性代謝にスイッチし、ピルビン酸塩は乳酸塩に発酵される。乳酸塩の蓄積は、ＡＣＳを有する個体における胸痛の根本原因である。虚血が持続するにつれて、心臓組織は、乳酸塩よりも酸性になり、他の酸性中間体が蓄積し、ＡＴＰレベルが減少し、利用可能なエネルギー源が消耗する。心臓組織は、虚血事象の１５〜２０分後に再潅流されると回復可能である。細胞内グリコーゲン貯蔵の消耗後、細胞は、壊死の特徴を少しずつ示すようになり、それには、ミトコンドリアの膨張及び細胞膜の完全性の喪失が含まれる。再潅流により、これらの損傷した細胞は、恐らくは、イオン平衡を細胞が維持できない結果として死滅する。膜の完全性の喪失は、細胞の細胞質内容物が循環系に放出されてしまう。
【００２４】
安定狭心症、不安定狭心症、及び心筋梗塞は、心筋虚血と関連した収縮性胸痛という１つの共通した特徴を共有する。胸痛は、診断のＥＣＧ変化の有無を問わず、医師による臨床症状の解釈を経て、安定又は不安定として分類される。「安定」又は「不安定」として狭心症の分類は、プラークそれ自体の安定性を指すものではなく、むしろ、胸痛を発揮するのに要求される激しさ（ｅｘｅｒｔｉｏｎ）の程度を指す。最も顕著には、限定的な心筋梗塞以外の場合において、安定又は不安定狭心症（あるいは軽度の心筋梗塞も）としての胸痛の分類は、動脈閉塞の程度を定量可能な血管造影法によってなされないが、むしろ、医師による臨床症状の解釈によってなされる。
【００２５】
安定狭心症は、激しさ又はストレスに応じて発生する収縮性胸痛によって特徴付けられ、休息又は舌下のニトログリセリンによって軽減される。安定狭心症を有する患者の冠状血管造影は、通常、少なくとも１つの冠状動脈の５０〜７０％の閉塞を示す。安定狭心症は、通常、臨床症状及びＥＣＧ変化の評価によって診断される。安定狭心症の患者は、一時的なＳＴセグメント異常性を有する場合があるが、安定狭心症と関連したこれらの変化の感度及び特異性は低い。
【００２６】
不安定狭心症は、舌下のニトログリセリンによって軽減される安静中の収縮性胸痛によって特徴付けられる。狭心症の胸痛は、通常、舌下のニトログリセリンによって軽減され、この痛みは、通常、３０分以内に鎮静化する。不安定狭心症は、安定狭心症とＡＭＩとの間の臨床状態を示し、主に、アテローム性動脈硬化症、冠動脈攣縮又はその後の血栓性閉塞を有する非閉塞性プラークへの出血の重傷度と程度における進行によるものと考えられている。不安定狭心症の患者の冠状血管造影は、通常、少なくとも１つの冠状動脈の９０％以上の閉塞を示し、結果として、基底の心筋酸素需要でさえ酸素供給ができなくなる。安定なアテローム斑のゆっくりとした成長又はその後の血栓形成を伴う不安定アテローム斑の破裂は、不安定狭心症を引き起し得る。これらの両方の原因は、結果として、冠状動脈を臨床的に狭くする。不安定狭心症は、通常、アテローム斑破裂、血小板活性化、及び血栓形成と関連する。不安定狭心症は、通常、臨床症状、ＥＣＧ変化、及び心臓マーカーの変化によって診断される。不安定狭心症の患者に対する治療は、硝酸塩、アスピリンＧＰＩ１ｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ヘパリン、及びベータ−ブロッカーを含む。患者はまた、血管形成術及びステントを受ける場合がある。最後に、不安定狭心症の患者は、急性心筋梗塞を発症する危険性がある。
【００２７】
したがって、安定狭心症と不安定狭心症との間、場合により、安定狭心症、不安定狭心症及び急性心筋梗塞の間の確実な識別診断を提供するために、該状態の１つを患っていることが疑われる個体から得た試料中のＣＫ−１８若しくは及び／又はＩＬ−１β前駆体及び場合によりＩＣＥのレベルを測定し、それらの状態の１つを患っている個体のそれぞれのレベルと比較する。
【００２８】
安定狭心症を患っている個体におけるＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＣＥのレベルは、不安定狭心症及び急性心筋梗塞を患っている個体において見出されるレベルと比較すると減少している。
【００２９】
これとは対照的に、ＩＬ−１β前駆体のレベルは、不安定狭心症を患っている個体において見出されるレベルと比較すると増加している。
【００３０】
この方法は、個体における安定狭心症と不安定狭心症との間を明確に区別することを可能にするので、得られるデータは、安定狭心症又は不安定狭心症及び急性心筋梗塞を患っている個体の最適かつ適切な治療を設計するのに有用であり得る。
【００３１】
安定狭心症と不安定狭心症とを区別するか又は個体において安定狭心症及び不安定狭心症を診断する方法に関連する本発明の好ましい態様によれば、試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）の量は、さらに測定され、参考対照に存在するＩＣＥ量と比較され、試料中のＩＣＥ量が不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の参考対照におけるＩＣＥ量と比較して減少している場合には安定狭心症と診断される。
【００３２】
さらに、安定狭心症と不安定狭心症とを区別するか又は個体における安定狭心症と不安定狭心症を診断する方法に関する本発明に係る方法は、ＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量、及びＩＣＥ量の測定を伴ってもよい。また、単一マーカー：ＣＫ−１８又はその断片及びＩＬ−１β前駆体；ＣＫ−１８又はその断片、ＩＬ−１β前駆体及びＩＣＥ；ＣＫ−１８又はその断片及びＩＣＥ；ＩＬ−１β前駆体前駆体及びＩＣＥを組み合わせることも可能である。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、サイトケラチン−１８又はその断片、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及びインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量は、免疫学的に、好ましくは、酵素免疫吸着測定法、放射免疫アッセイ又はウェスタンブロットアッセイによって測定される。
【００３４】
試料中のＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体のタンパク質レベルは、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いてアッセイ可能である。例えば、酵素ＩＣＥは、その触媒活性に基づくアッセイ（例えば、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，７６８−７４；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６，３７−４３；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，８０１−９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３，７４６４−９；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４，６１５−３１）、試料に含まれるタンパク質量の定量に基づくアッセイによって定量化され得る。ＣＫ−１８又はその断片の量の測定に関しては、例えば、いくつかの免疫学的アッセイは当該技術分野において知られている（例えば、Ｋｒａｍｅｒ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）６４：１７５１−１７５６）。例えば、抗体に基づく技術は、好ましくは本発明の方法における全てのマーカーに用いられ得る。例えば、特異的な認識は、一次抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）によって与えられ、二次検出システムは、一次抗体の存在（又は結合）を検出するために用いられる。検出可能な標識は、二次抗体に結合可能であり、例えば、蛍光ラベル、放射性標識又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ）があり、定量可能な、例えば着色された産物を生成する。別の適切な方法では、一次抗体それ自体は、検出可能に標識化され得る。結果として、組織切片の免疫組織学的標識が提供される。一態様では、分析のために生物試料（例えば、血液、組織、細胞）から抽出物が与えられる。このような抽出物（例えば、界面活性剤抽出物）は、日常的な免疫ブロット法（Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて、対象とするタンパク質のレベルについてウェスタンブロット又はドット／スロットアッセイに供することができる。
【００３５】
他の有用な抗体に基づく方法には、免疫アッセイ、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫測定（ＲＩＡ）が含まれる。例えば、タンパク質特異的なモノクローナル抗体は、免疫吸着剤及び酵素標識プローブとして用いて、対象とするタンパク質を検出及び定量することができる。試料に存在するこのようなタンパク質の量は、直線回帰コンピュータアルゴリズム（Ｉａｃｏ−ｂｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１１：１９−３０（１９８８））を用いて、標準調製物に存在する量と比較して計算可能である。別の態様では、対象とするタンパク質に対する２種のモノクローナル抗体を用いることができ、１つは、免疫吸着剤として、他方は、酵素標識プローブとして用いられる。
【００３６】
分析されるべき試料は、好ましくは体液、好ましくは血液、より好ましくは血漿又は血清である。
【００３７】
本発明に係る全てのマーカーポリペプチドは、（全）血液及び血漿又は血清、好ましくは可溶形態又は可溶化形態で検出され、定量化されてもよい。
【００３８】
本発明の好ましい態様によれば、試料は、大腿動脈から得られる。対照血漿試料は、安定狭心症及び不安定狭心症患者の肘から得られる（両方のサンプリング法は末梢血流に相当する）。
【００３９】
本発明の別の局面は、心臓血管疾患を診断するか、安定と不安定狭心症とを区別するか若しくは個体における安定及び不安定狭心症を診断するか、又は心臓血管系の血栓を得る個体のリスクを評価するためのキットに関し、該キットは、
−サイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８）、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）を検出するための手段；及び
−参考対照
を含む。
【００４０】
臨床診療において、心臓血管疾患の診断、安定狭心症と不安定狭心症との区別、並びに狭心症の診断は、特に関心があり、これは、医師が、急性心筋梗塞、心室性頻拍症及び線維化のような重篤な心不整脈、又は突然死に至る心停止に感受性である患者のリスクを評価することができるためである。本発明に係る方法及びキットによって得られる結果に基づいて、適切な治療及び／又は外科的介入が適用可能である。また、本発明のキットは、心臓血管系における血栓を得る個体のリスクを評価するために用いてもよい。健常な個体と比較してＣＫ−１８又はそれらの断片のレベル上昇は、血栓を得るリスクを指示する。従って、本発明はまた、該リスクを評価する方法に関する。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、該手段は、ＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体に指向される抗体を含む。
【００４２】
該抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、ＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体に特異的な抗体の結合の検出を可能にする適切な標識に結合されてもよい。また、ＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１βに結合する抗体に指向する二次抗体を用いることができる。ＩＣＥの活性が測定される場合において、ペプチド又はポリペプチド基質は、さらに増加する（例えば、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，７６８−７４；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６，３７−４３；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，８０１−９；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４，６１５−３１）。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様によれば、参考対照は、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体、又は安定狭心症若しくは不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体から得られる。
【００４４】
本発明のキットによって検出されるべき心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄であってもよい。
【００４５】
本発明の別の局面は、血栓症（例えば、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、表在性静脈血栓症、門脈の血栓症）及び血栓症関連疾患の治療のための薬剤を製造するためのサイトケラチン−１８又はその断片を分解する化合物の使用に関する。驚くべきことに、ＣＫ−１８又はその断片は、心臓血管疾患を患っている個体の血管で形成される血栓において見出された。適切な低分子カスパーゼにより開裂されたＣＫ−１８断片は、血栓において見出される。血栓症及び血栓依存性血管疾患は、全てのヒトの臓器で発生され得て、例えば、慢性血栓肺高血圧症（ＣＴ−ＰＨ）又は後天性末梢静脈疾患に対する感受性がある。
【００４６】
血栓は、血管内の異常な血液凝固体である。血栓は、結果として、血流を閉塞する。西洋における死因の第１位は、血管内の異常な血液凝固の形成であるため、血栓を防止する工程を取ることは健康な人々によって重要である。血栓を発症する危険因子をもつ者にとって、突発的な行動が、脳梗塞、心臓発作、腎不全、肺動脈塞栓などに対して予防するために取らなければならない。
【００４７】
血栓は、動脈、静脈又は心房内で形成され得る。血栓は、高圧条件及び高流量条件下で動脈内に形成され、内因性のフィブリンタンパク質鎖によって互いに結合した血小板凝集体から構成されている。静脈内の凝固体は、低流量条件下で形成され、大部分は血小板がほとんどない赤血球から構成され、及び大量の分散したフィブリン鎖を含む。
【００４８】
これらの血栓は、血管内で静止したままである場合があるが、凝固体は移動又は閉塞し得る。凝固体が下肢の静脈から肺へ移動すると、結果として、肺動脈血栓及び／又は肺梗塞（肺細胞死）となる。同様に、凝固体が新蔵王又は頸動脈から脳へ移動すると、脳梗塞を引き起し得る。凝固体が冠状動脈を閉塞又はブロックする位置に移動すると、心臓発作（心筋梗塞）が発症し得る。不規則な心臓鼓動（例えば、心房性細動）及び心臓弁膜症（例えば、僧帽弁狭窄症）などのある種の状態は、心房心室拡大及び非効率な心房心室収縮を引き起こす。したがって、脳に移動し、脳梗塞を引き起こす可能性のある心房内で形成されるという凝固体のリスクが増す。
【００４９】
血栓症の予防は、心臓血管疾患を有意に減少させるために本質的である。心臓血管疾患は、年に約１００万人が死亡するという死因の第１位のままである。これは、年の癌死者の発生率の約２倍である。これらの心臓血管系死亡のうち、冠動脈疾患は、約５１％を示し、脳梗塞は、１６％を示す。これらの疾患は、全ての心臓血管系死亡において血栓症を伴う。さらに、血栓症は、癌患者の共通の死因である。したがって、心臓血管及び他の疾患に基づく死亡の高発生率を減少させるために、血栓症の予防及び治療を最適化することは最重要となっている。
【００５０】
血栓症の症状は、形成した凝固体の局在性に依存している。心臓発作中に、ある場合には冠状動脈に流れる凝固体により、関連した症状の開始は、通常、突然に起こる。関与している冠状動脈が小さい血管であり、その血管が末端でこの凝固体によって閉塞（ブロック）されると、心臓発作は、いずれの症状を全く示さないこともある。しかしながら、凝固体が大きく、左の主要な冠状動脈で突然閉塞すると、左心室への全血液の供給が突然切断され、心臓発作は大規模となり、突然死に至る。左又は右の主要な冠状動脈の分岐が塞栓症によって、又はより共通には、冠状動脈の壁から形成し、酸化されたＬＤＬ及びフィブリノーゲンと混合され血管を閉塞する小さな凝固体によって閉塞され得て、これは、粉瘤と呼ばれるものを形成し、関連する冠状動脈の内径を狭める。
【００５１】
この閉塞は、多くの場合、突然の心臓発作の古典的な症状：狭心症に関連した胸痛、息切れ、冷たくて湿った汗、冷えた手足、ひどい不安、吐き気、高度の脱力、目眩、集中力の欠如、胸の粗動、及び動悸又は他の不規則な鼓動を引き起こす。心臓発作中に感じる古典的な胸痛は、重く、強烈な、収縮感覚に似ている。この痛みは、胸部、左腕若しくは右腕、両肩、又は顎にも由来する。痛みは、多くの場合、胸部から左下にかけて広がる。しかしながら、痛みの広がりは、胸部から右腕又は顎にも移動する場合がある。持続的な心臓発作と関連した場合、痛みは、心臓発作の１〜３分前というよりはむしろ１０〜１５分続く傾向がある。
【００５２】
閉塞があまり重症ではないか又は傷害された神経分布の場合（例えば、糖尿病性神経障害であるなど）である場合、心臓発作はいずれの症状もなしに発生し得て、正常なＥＣＧを有する緊急治療室にも与えられる。この状況では、心臓発作は、血中の正の心筋酵素を特定することによって診断される。古典的な心臓発作症状が現れる場合、例えば、アセチルサリチル酸は、応急処置段階として投与されてもよい。
【００５３】
血栓性脳梗塞と関連した症状は、脳梗塞が突然の塞栓症又は漸進的凝固体形成から起こるかどうかに依存して変化する。脳塞栓性脳梗塞では、症状は開始時に急速であり、多くの場合、数秒以内にピークを迎える。犠牲者は発作と、症状の突然の開始により影響を受けた側に頭痛を経験する。脳血栓性脳梗塞では、開始は、数分又は数時間で起こり、場合によっては、脳梗塞は数日又は数週間のステージで進行する。
【００５４】
脳梗塞中に発生する症状は、損傷を受けた脳の領域に依存する。例えば、目を補う領域（網膜領域）が関係する場合、患者は、一時的な眼前暗闇及び影が目を被せるという感覚を経験する。大脳が関係する場合、反対側の単不全麻痺、片側不全麻痺、局所的な刺痛、無感覚、片側視野欠損、失語症及び意識消失が起こる場合がある。椎骨脳底領域が関係する場合、患者は、両側の視覚障害（薄暗い、灰色がかった、ぼけ視、又は複視と呼ばれる一時的な全盲）を経験する。椎骨脳底エピソードは、突然の位置変化によって誘導される症状を引き起こすが、頸動脈エピソードは起こらない。内耳又は中耳が関係する場合、目眩、不安定、吐き気、及び嘔吐が起こる。脳幹が関係する場合、患者は、ろれつが回らない、構音障害、不完全失語症、無感覚、衰弱、及び四肢の知覚異常を経験する。姿勢緊張の突然の喪失からの「倒れ」発作は、起源が脳底である脳梗塞の症状である。
【００５５】
肺塞栓症又は梗塞と関連した症状は、非特異的であり、多くの場合、頻度及び強度において変化し得る。これは、肺血管閉塞の程度、塞栓が起こる前の心臓の機能強度、及び塞栓の大きさに依存する。小さな塞栓又はミクロ塞栓は無症候性である場合がある。しかしながら、症状が現れる場合には、数分で突然発症する傾向にあり、咳若しくは喘鳴を伴うか又は伴わない突然の息切れ（ｓｈｏｒｔｎｅｓｓ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ）又は息切れ（ｂｒｅａｔｈｌｅｓｓｎｅｓｓ）、呼吸促迫、不安、及び不穏が含まれる。多くの場合、肺塞栓症の際、高血圧が肺動脈管構造内にある。これがそのケースである場合、塞栓症が起こると、鈍い胸痛が発生する場合がある。酷い肺塞栓症では、右心不全が腹部及び下肢において体液とともに発症する場合がある。心不全による心拍出量の減少により、頭のふらつき、意識不明、及び発作がある場合がある。
【００５６】
血栓症を治療及び／又は予防するために、いくつかの物質を投与することができる。例えば、クマディン（ワルファリン）は、第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ及びＸ因子などのビタミンＫ依存性血液凝固因子、並びに抗凝固タンパク質の合成を阻害する。血栓症を予防及び治療に用いられる別の薬物は、トロンボキサン合成と干渉することによって血小板凝集を阻害するアセチルサリチル酸である。チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ）は、血小板膜へのフィブリノーゲン結合と干渉することによって血小板凝集を阻害する。チクロピジンは、多くの場合、血栓性脳梗塞の危険性が高く、アスピリンに寛容でない患者において考慮される。ヘパリン（静脈内投与される）は、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を妨げるアンチトロンビンＩＩＩの活性を増加させる。ヘパリンは、胃腸管によって吸収されず、静脈内に投与されなければならない。通常、（例えば、脳梗塞後の）緊急事態においてのみ用いられる。組織プラスミノーゲン因子（ｔ−ＰＡ）は、フィブリンを分裂させるプラスミンを活性する。ｔ−ＰＡは血液凝固体を溶解させるために、緊急状態で用いられる。ストレプトキナーゼは、他の組織プラスミノーゲン因子薬物である。これら両方の薬物は、緊急性の血栓状態（例えば、虚血性脳梗塞）において静脈内に投与される。
【００５７】
驚くべきことに、血栓はフィブリンを含むだけでなく、サイトケラチン、特にサイトケラチン−１８又はその断片を含むことが見出された。サイトケラチンは血栓の形成に関与するので、サイトケラチンを分解する化合物の使用により、単独で又は一定の間隔で血栓溶解治療に関与する他の化合物と併用して血栓を溶解することができる。
【００５８】
本発明の好ましい態様によれば、ＣＫ−１８を分解する（又はＣＫ−１８断片をさらに分解する）化合物は、好ましくは下記のリストから選択されるプロテアーゼである。
【００５９】
特に好ましい化合物は、プロテアーゼ（ＥＣ３．４）、特にアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）、ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３）、ジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５）、セリン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１８）、オメガペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９）、セリン・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システイン・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アルパラギン酸エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４）及びスレオニン・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２５）である。
【００６０】
本発明に従って用いられる好ましいアミノペプチダーゼは、ロイシル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１）、膜アラニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２）、シスチニルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．３）、トリペプチドアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．４）、プロリル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．５）、アルギニルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．６）、グルタミル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．７）、Ｘａａ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．９）、細菌性ロイシル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１０）、クロストリジアル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１３）、細胞質アラニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１４）、リジル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１５）、Ｘａａ−Ｔｒｐアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１６）、トリプロファニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１７）、メチオニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１８）、Ｄ−立体特異的アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１９）、アミノペプチダーゼＥｙ（ＥＣ３．４．１１．２０）、アスパルチル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２１）、アミノペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１１．２２）及びＰｅｐＢアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２３）からなる群から選択される。
【００６１】
本発明に従って用いられる好ましいジペプチダーゼは、Ｘａａ−Ｈｉｓジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．３）、Ｘａａ−Ａｒｇジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．４）、Ｘａａ−メチル−Ｈｉｓジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．５）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．７）、Ｘａａ−Ｐｒｏジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．９）、Ｍｅｔ−Ｘａａジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１２）、非立体特異的ジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１７）、細胞質非特異的ジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１８）、膜ジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１９）、ｂ−Ａｌａ−Ｈｉｓジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．２０）及びジペプチダーゼＥ（ＥＣ３．４．１３．２１）からなる群から選択される。
【００６２】
本発明に従って用いられる好ましいジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジル−ペプチダーゼは、ジペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．１）、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＩＩ（ＥＣ３．４．１４．４）、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＥＣ３．４．１４．５）、ジペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．６）、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．９）、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１４．１０）及びＸａａ−Ｐｒｏジペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．１１）からなる群から選択される。
【００６３】
本発明に従って用いられる好ましいペプチジル−ジペプチダーゼは、ペプチジル−ジペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１５．１）、ペプチジル−ジペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．１５．４）及びペプチジル−ジペプチダーゼＤｃｐ（ＥＣ３．４．１５．５）からなる群から選択される。
【００６４】
本発明に従って用いられるセリン型カルボキシペプチダーゼは、リソソームＰｒｏ−Ｘａａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．２）、セリン型Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．４）、カルボキシペプチダーゼＣ（ＥＣ３．４．１６．５）及びカルボキシペプチダーゼＤ（ＥＣ３．４．１６．６）からなる群から選択される。
【００６５】
本発明に従って用いられる好ましいメタロカルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１７．１）、カルボキシペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．１７．２）、リジン・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．３）、Ｇｌｙ−Ｘａａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．４）、アラニン・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．６）、ムラモイルペンタペプチダーゼ・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．８）、カルボキシペプチダーゼＥ（ＥＣ３．４．１７．１０）、グルタミン酸塩カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１１）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＥＣ３．４．１７．１２）、ムラモイルテトラペプチド・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１３）、亜鉛Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１４）、カルボキシペプチダーゼＡ２（ＥＣ３．４．１７．１５）、膜Ｐｒｏ−Ｘａａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１６）、チューブリニル−Ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１７）、カルボキシペプチダーゼＴ（ＥＣ３．４．１７．１８）、カルボキシペプチダーゼＴａｑ（ＥＣ３．４．１７．１９）、カルボキシペプチダーゼＵ（ＥＣ３．４．１７．２０）、グルタミン酸塩カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１７．２１）及びメタロカルボキシペプチダーゼＤ（ＥＣ３．４．１７．２２）からなる群から選択される。
【００６６】
本発明に従って用いられる好ましいシステイン型カルボキシペプチダーゼは、カテプシンＸ（ＥＣ３．４．１８．１）である。
【００６７】
本発明に従って用いられる好ましいオメガペプチダーゼは、アシルアミノアシル−ペプチド（ＥＣ３．４．１９．１）、ペプチジル−グリシンアミダーゼ（ＥＣ３．４．１９．２）、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１９．３）、ｂ−アスパルチル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９．５）、ピログルタミル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１９．６）、Ｎ−ホルミルメチオニル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９．７）、ｇ−グルタミルヒドラーゼ（ＥＣ３．４．１９．９）、ｇ−Ｄ−グルタミル−メソ−ジアミノピメレート・ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１９．１１）及びユビキチニルヒドロラーゼ１（ＥＣ３．４．１９．１２）からなる群から選択される。
【００６８】
本発明に従って用いられる好ましいセリン・エンドペプチダーゼは、キモトリプシン（ＥＣ３．４．２１．１）、キモトリプシンＣ（ＥＣ３．４．２１．２）、メトリジン（ＥＣ３．４．２１．３）、トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）、トロンビン（ＥＣ３．４．２１．５）、血液凝固因子Ｘａ（ＥＣ３．４．２１．６）、プラスミン（ＥＣ３．４．２１．７）、エンテロペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．９）、アクロシン（ＥＣ３．４．２１．１０）、ａ−溶解エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１２）、グルタミル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１９）、カテプシンＧ（ＥＣ３．４．２１．２０）、血液凝固因子ＶＩｌａ（ＥＣ３．４．２１．２１）、血液凝固因子ＩＸａ（ＥＣ３．４．２１．２２）、ククミシン（ＥＣ３．４．２１．２５）、プロリル・オリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）、血液凝固因子ＸＩａ（ＥＣ３．４．２１．２７）、ブラキウリン（ＥＣ３．４．２１．３２）、血漿カリクレイン（ＥＣ３．４．２１．３４）、組織カリクレイン（ＥＣ３．４．２１．３５）、膵エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３６）、白血球エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３７）、血液凝固因子ＸＩＩａ（ＥＣ３．４．２１．３８）、キマーゼ（ＥＣ３．４．２１．３９）、補体サブコンポーネントＣ（ＥＣ３．４．２１．４１）、補体サブコンポーネントＣ（ＥＣ３．４．２１．４２）、古典的−補体−経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素（ＥＣ３．４．２１．４３）、補体因子Ｉ（ＥＣ３．４．２１．４５）、補体因子Ｄ（ＥＣ３．４．２１．４６）、代替−補体−経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素（ＥＣ３．４．２１．４７）、セレビジン（ＥＣ３．４．２１．４８）、ヒポデルミンＣ（ＥＣ３．４．２１．４９）、リジル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．５０）、エンドペプチダーゼＬａ（ＥＣ３．４．２１．５３）、ｇ−レニン（ＥＣ３．４．２１．５４）、ベノンビンＡＢ（ＥＣ３．４．２１．５５）、ロイシル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．５７）、トリプターゼ（ＥＣ３．４．２１．５９）、スクテラリン（ＥＣ３．４．２１．６０）、ケキシン（ＥＣ３．４．２１．６１）、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、オリジン（ＥＣ３．４．２１．６３）、エンドペプチダーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）、サーモミコリン（ＥＣ３．４．２１．６５）、テルミターゼ（ＥＣ３．４．２１．６６）、エンドペプチダーゼＳｏ（ＥＣ３．４．２１．６７）、ｔ−プラスミノーゲンアクチベータ（ＥＣ３．４．２１．６８）、プロテインＣ（活性化）（ＥＣ３．４．２１．６９）、膵エンドペプチダーゼＥ（ＥＣ３．４．２１．７０）、膵エラスターゼＩＩ（ＥＣ３．４．２１．７１）、ＩｇＡ−特異的セリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．７２）、ｕ−プラスミノーゲンアクチベータ（ＥＣ３．４．２１．７３）、ベノンビンＡ（ＥＣ３．４．２１．７４）、フリン（ＥＣ３．４．２１．７５）、ミエロブラスチン（ＥＣ３．４．２１．７６）、セメノゲラーゼ（ＥＣ３．４．２１．７７）、グランザイムＡ（ＥＣ３．４．２１．７８）、グランザイムＢ（ＥＣ３．４．２１．７９）、ストレプトグリシンＡ（ＥＣ３．４．２１．８０）、ストレプトグリシンＢ（ＥＣ３．４．２１．８１）、グルタミル・エンドペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．２１．８２）、オリゴペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．２１．８３）、リムルス凝固因子（ＥＣ３．４．２１．８４）、リムルス凝固因子（ＥＣ３．４．２１．８５）、リムルス凝固酵素（ＥＣ３．４．２１．８６）、オムプチン（ＥＣ３．４．２１．８７）、リプレッサーＬｅｘＡ（ＥＣ３．４．２１．８８）、シグナル・ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．２１．８９）、トガビリン（ＥＣ３．４．２１．９０）、フラビビリン（ＥＣ３．４．２１．９１）、エンドペプチダーゼＣＩｐ（ＥＣ３．４．２１．９２）、タンパク質変換酵素１（ＥＣ３．４．２１．９３）、プロタンパク質変換酵素２（ＥＣ３．４．２１．９４）、ヘビ毒因子Ｖアクチベータ（ＥＣ３．４．２１．９５）、ラクトセピン（ＥＣ３．４．２１．９６）、アセンブリン（ＥＣ３．４．２１．９７）、ヘパシビリン（ＥＣ３．４．２１．９８）、スペルモシン（ＥＣ３．４．２１．９９）、シュードモナリシン（ＥＣ３．４．２１．１００）、キサントモナリシン（ＥＣ３．４．２１．１０１）、Ｃ−末端プロセッシングペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１０２）、フィサロリシン（ＥＣ３．４．２１．１０３）、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ−２（ＥＣ３．４．２１．１０４）及びロンボイドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．１０５）からなる群から選択される。
【００６９】
本発明に従って用いられる好ましいシステインエンドペプチダーゼは、カテプシンＢ （ＥＣ３．４．２２．１）、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、フィカイン（ＥＣ３．４．２２．３）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、アスクレパイン（ＥＣ３．４．２２．７）、クロストリパイン（ＥＣ３．４．２２．８）、ストレプトパイン（ＥＣ３．４．２２．１０）、アクチン−イダイン（ＥＣ３．４．２２．１４）、カテプシンＬ（ＥＣ３．４．２２．１５）、カテプシンＨ（ＥＣ３．４．２２．１６）、カテプシンＴ（ＥＣ３．４．２２．２４）、グリシル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．２５）、癌凝固促進剤（ＥＣ３．４．２２．２６）、カテプシンＳ（ＥＣ３．４．２２．２７）、ピコルナイン３Ｃ（ＥＣ３．４．２２．２８）、ピコルナイン２Ａ（ＥＣ３．４．２２．２９）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、アナナイン（ＥＣ３．４．２２．３１）、ステム・ブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３２）、フルーツ・ブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３３）、レグマイン（ＥＣ３．４．２２．３４）、ヒストリサイン（ＥＣ ３．４．２２．３５）、カスパーゼ−１（ＥＣ３．４．２２．３６）、ギンギパインＲ（ＥＣ３．４．２２．３７）、カテプシンＫ（ＥＣ３．４．２２．３８）、アデナイン（ＥＣ３．４．２２．３９）、ブレオマイシン・ヒドラーゼ（ＥＣ３．４．２２．４０）、カテプシンＦ（ＥＣ３．４．２２．４１）、カテプシンＯ（ＥＣ３．４．２２．４２）、カテプシンＶ（ＥＣ３．４．２２．４３）、核封入−ａエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．４４）、ヘルパー成分プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．４５）、Ｌ−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．４６）、ギンギパインＫ（ＥＣ３．４．２２．４７）、スタホパイン（ＥＣ３．４．２２．４８）、セパラーゼ（ＥＣ３．４．２２．４９）、Ｖ−ｃａｔｈエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．５０）、クルジパイン（ＥＣ３．４．２２．５１）、カルパイン−１（ＥＣ３．４．２２．５２）及びカルパイン−２（ＥＣ３．４．２２．５３）からなる群から選択される。
【００７０】
本発明に従って用いられる好ましいアルパラギン酸エンドペプチダーゼは、ペプシンＡ（ＥＣ３．４．２３．１）、ペプシンＢ（ＥＣ３．４．２３．２）、ガストリクシン（ＥＣ３．４．２３．３）、キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）、カテプシンＤ（ＥＣ３．４．２３．５）、ネペンテシン（ＥＣ３．４．２３．１２）、レニン（ＥＣ３．４．２３．１５）、ＨＩＶ−Ｉレトロペプシン（ＥＣ３．４．２３．１６）、Ｐｒｏ−オピオメラノコルチン変更酵素（ＥＣ３．４．２３．１７）、アスペルギロペプシンＩ（ＥＣ３．４．２３．１８）、アスペルギロペプシンＩＩ（ＥＣ３．４．２３．１９）、ペニシロペプシン（ＥＣ３．４．２３．２０）、リゾプスペプシン（ＥＣ３．４．２３．２１）、エンドチアペプシン（ＥＣ３．４．２３．２２）、ムコルペプシン（ＥＣ３．４．２３．２３）、カンジダペプシン（ＥＣ３．４．２３．２４）、サッカロペプシン（ＥＣ３．４．２３．２５）、ロドトルラペプシン（ＥＣ３．４．２３．２６）、アクロシリンドペプシン（ＥＣ３．４．２３．２８）、ポリポロペプシン（ＥＣ３．４．２３．２９）、ピクノポロペプシン（ＥＣ３．４．２３．３０）、スキタリドペプシンＡ（ＥＣ３．４．２３．３１）、スキタリドペプシンＢ（ＥＣ３．４．２３．３２）、カテプシンＥ（ＥＣ３．４．２３．３４）、バリエルペプシン（ＥＣ３．４．２３．３５）、シグナル・ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．２３．３６）、プラスメプシンＩ（ＥＣ３．４．２３．３８）、プラスメプシンＩＩ（ＥＣ３．４．２３．３９）、フィテプシン（ＥＣ３．４．２３．４０）、ヤプシン１（ＥＣ３．４．２３．４１）、テェロモプシン（ＥＣ３．４．２３．４２）、プレピリンペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３．４３）、ノダウイルス・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３．４４）、メマプシン１（ＥＣ３．４．２３．４５）、メマプシン２（ＥＣ３．４．２３．４６）、ＨＩＶ−２レトロペプシン（ＥＣ３．４．２３．４７）及びプラスミノーゲンアクチベータＰＩａ（ＥＣ３．４．２３．４８）からなる群から選択される。
【００７１】
本発明に従って用いられる好ましいメタロエンドペプチダーゼは、アトロリシンＡ（ＥＣ３．４．２４．１）、微生物コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３）、ロイコリジン（ＥＣ３．４．２４．６）、間質コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．７）、ネプリリジン（ＥＣ３．４．２４．１１）、エンベリジン（ＥＣ３．４．２４．１２）、ＩｇＡ特異的メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１３）、プロコラーゲンＮ−エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１４）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１５）、ニューロリジン（ＥＣ３．４．２４．１６）、ストロメリジン１（ＥＣ３．４．２４．１７）、メプリンＡ（ＥＣ３．４．２４．１８）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１９）、ペプチジル−Ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．２０）、アスタシン（ＥＣ３．４．２４．２１）、ストロメリジン２（ＥＣ３．４．２４．２２）、マトリリジン（ＥＣ３．４．２４．２３）、ゼラチナーゼＡ（ＥＣ３．４．２４．２４）、ビブリオリジン（ＥＣ３．４．２４．２５）、シュードリジン（ＥＣ３．４．２４．２６）、テルモリジン（ＥＣ３．４．２４．２７）、バチロリジン（ＥＣ３．４．２４．２８）、アウレオリジン（ＥＣ３．４．２４．２９）、コッコロリジン（ＥＣ３．４．２４．３０）、ミコリジン（ＥＣ３．４．２４．３１）、ｂ−溶解メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．３２）、ペプチジル−Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．３３）、好中球コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３４）、ゲラチナーゼＢ（ＥＣ３．４．２４．３５）、レイシュマノリジン（ＥＣ３．４．２４．３６）、サッカロリジン（ＥＣ３．４．２４．３７）、ガメトリジン（ＥＣ３．４．２４．３８）、デューテロリジン（ＥＣ３．４．２４．３９）、セルラリジン（ＥＣ３．４．２４．４０）、アトロリジンＢ（ＥＣ３．４．２４．４１）、アトロリジンＣ（ＥＣ３．４．２４．４２）、アトロキサーゼ（ＥＣ３．４．２４．４３）、アトロリジンＥ（ＥＣ３．４．２４．４４）、アトロリジンＦ（ＥＣ３．４．２４．４５）、アダマリジン（ＥＣ３．４．２４．４６）、ホルリリジン（ＥＣ３．４．２４．４７）、ルベルリジン（ＥＣ３．４．２４．４８）、ボトロパシン（ＥＣ３．４．２４．４９）、ボトロパシン（ＥＣ３．４．２４．５０）、オフィオリジン（ＥＣ３．４．２４．５１）、トリメレリジンＩ（ＥＣ３．４．２４．５２）、トリメレリジンＩＩ（ＥＣ３．４．２４．５３）、ムクロリジン（ＥＣ３．４．２４．５４）、ピトリリジン（ＥＣ３．４．２４．５５）、インスリジン（ＥＣ３．４．２４．５６）、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．５７）、ルッセルリジン（ＥＣ３．４．２４．５８）、ミトコンドリア中間ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．５９）、ダクチリジン（ＥＣ３．４．２４．６０）、ナルジリジン（ＥＣ３．４．２４．６１）、マグノリジン（ＥＣ３．４．２４．６２）、メプリンＢ（ＥＣ３．４．２４．６３）、ミトコンドリアプロセッシングペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．６４）、マクロファージエラスターゼ（ＥＣ３．４．２４．６５）、コリオリジンＬ（ＥＣ３．４．２４．６６）、コリオリジンＨ（ＥＣ３．４．２４．６７）、テントキシリジン（ＥＣ３．４．２４．６８）、ボントキシリジン（ＥＣ３．４．２４．６９）、オリゴペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．２４．７０）、エンドセリン変換酵素（ＥＣ３．４．２４．７１）、フィブロラーゼ（ＥＣ３．４．２４．７２）、ジャラハギン（ＥＣ３．４．２４．７３）、フラギリジン（ＥＣ３．４．２４．７４）、リソスタフィン（ＥＣ３．４．２４．７５）、フラバスタシン（ＥＣ３．４．２４．７６）、スナパリジン（ＥＣ３．４．２４．７７）、ｇｐｒエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．７８）、パッパラリジン−１（ＥＣ３．４．２４．７９）、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＥＣ３．４．２４．８０），ＡＤＡＭｌＯエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８１）、ＡＤＡＭＴＳ−４エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８２）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８３）、Ｓｔｅ２４エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８４）、Ｓ２Ｐエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８５）及びＡＤＡＭ１７エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８６）からなる群から選択される。
【００７２】
本発明に従って用いられる好ましいスレオニンエンドペプチダーゼは、プロテアソーム・エンドペプチダーゼ複合体（ＥＣ３．５．２５．１）である。
【００７３】
ＣＫ−１８又はその断片の分解に対する特に好ましいプロテアソームは、カリクレイン８である（Ｓａｎｔｉｎ Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ（２００４），Ｇａｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９４：２８３−２８８を参照されたい）。より具体的には、カリクレイン７及び８並びに肥満細胞キマーゼは、本発明に従って用いられるべき好ましいプロテアーゼである。
【００７４】
本発明の好ましい態様に従って、薬剤は、さらに、ワルファリン、アセチルサリチル酸、チクロピジン、ヘパリン、組織プラスミノーゲン因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、及び／又はウロキナーゼを含む。
【００７５】
本発明は、下記の図面及び実施例に例証されるが、それらに限定されない。
【実施例】
【００７６】
本実施例では、ＡＭＩにおける炎症及びアポトーシス特異的な活性経路と関連することが知られているタンパク質の発現を調査した。ＡＭＩを患っている患者における冠状動脈系で得られた血漿中の該タンパク質の濃度を測定し、全身の血液レベルと比較した。ＵＡ及び安定狭心症（ＳＡ）と診断された患者は、非無作為的比較試験において対照として使用した。さらに、インビボで得られた急性冠状動脈血栓を免疫組織化学によって分析した。結果は、ＳＡ及びＵＡと比べると、ＡＭＩにおけるアポトーシス特異的なＩＣＥ及びカスパーゼ依存性開裂産物ＣＫ−１８の濃度増加を証明している。
【００７７】
全身性炎症及びアポトーシス特異的活性化は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を含む急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）において主要な役割を果たす。血栓切除デバイスは、臨床領域に最近導入され、ＡＭＩ開始の冠状動脈内の血栓性物質の除去を可能にした。この技術は、独特の可能性を提供し、炎症及びアポトーシス特異的タンパク質を比較するために、閉塞した冠状動脈及び大腿動脈で血液及び血栓を回収する。安定狭心症（ＳＡ）及び不安定狭心症（ＵＡ）を有する患者は、対照群として採用された。
【００７８】
患者及び臨床的特徴
緊急性冠状動脈血管造影を受けている４０人の一貫した患者が試験に含まれ、下記の基準を満たす場合：１）冠状動脈の血管造影時における胸痛、２）２以上の胸部誘導における≧２ｍｍの新規ＳＴ部分の上昇、又は冠状動脈血管造影の２０分以内に観察される１を超える水平面誘導における≧１ｍｍの新規ＳＴ部分の上昇、３）Ｘ−サイザー血栓切除に適した冠状動脈構造（ａｎａｔｏｍｙ）、４）血栓治療なし、５）血栓切除の成功を指示するＸ−サイザーフィルター及びボトル単位における視認できる血栓材料、及び６）同意書。Ｘ−サイザー使用のための基準は、脈管径≧３ｍｍ、各小孔の５０ｍｍ以内の血栓と思わせる大きな内径コントラスト欠陥であり、血管造影ガイドワイヤーの通過後のＴＩＭＩ０−１フローを有し、重大な血管のねじれ、硬化又は困難な血管アクセスはなかった。
【００７９】
さらに、狭心症胸痛の評価のための施設に収容された８０人の一貫した患者は、冠状動脈血管造影を受け、対照として採用された。ＳＡ（ｎ＝４０）は、休息、ニトログリセリン投与又はそれらの両方によって軽減した典型的な労作時胸痛狭心症によって定義され、運動ＥＣＧストレス試験に対するポジティブな応答、カテーテル化での≧１の冠状動脈内の≧５０％の直径の狭窄があった。ＵＡを有する患者（ｎ＝４０）は、Ｂｒａｕｎｗａｌｄの基準に従って定義された。ＵＡのＩＩＩＢ類を有する２４人全ての患者は、診断的ＳＴ部分変化、Ｔ波倒置又はそれらの両方を有していた。この試験に含まれる患者は、臨床履歴によって定義されるように、進行中の全身又は心臓の炎症プロセスの証拠を有していなかった。表１は、人口学的及び基準臨床的特性を概説する。
【００８０】
【表１】
【００８１】
試料の回収及び処理
患者は、活性化した凝集時間≧３００秒と２５０ｍｇのアスピリンでヘパリン化された。全血液試料は、大腿動脈からクエン酸塩−バキュテイイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に回収され、即座に遠心分離（１３００×ｇ、４℃、１０分）、内部対照として、閉塞した冠状動脈から直接得た血液試料を用いた。血小板が少ない血漿をアッセイまで−８０℃で凍結した。Ｘ−サイザー血栓切除カテーテルシステム（ＥｎｄｉＣＯＲ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ）は、手持ちコントロールモジュールに連結した二重内腔カテーテルシャフトからなる。内側の内腔は、外側の内腔を介した吸引に加えて、血栓上で吸引増加を有する約２，１００ｒｐｍで回転するらせんカッターを含む（図１を参照されたい）。
【００８２】
真空ガラスボトルの数センチ前で、血栓物質及びプラーク粒子が捕捉される小さなフィルターユニットに吸引物を通過させ、血液は、ヘパリン化したガラスボトルに吸引される。血液をクエン酸塩−バキュテイナーに即座に移し、上述したように遠心分離した。フィルターユニットに捕捉された血栓材料は、７．５％の緩衝化したホルマリン中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、連続的な３μｍのマイクロトーム切片を行った。上述したように、真空内腔によって吸収された血液をクエン酸バキュテイナー及び血液凝固剤に即座に移した。試料を−８０℃で即座に凍結した。
【００８３】
可溶性ＩＬ−１βｐ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌの定量化
ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ａｕｓｔｒｉａ）及びＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＵＳＡ）から購入したＥＬＩＳＡによってタンパク質濃度を測定した。ＴＮＦ−αレベルは、高感度ＥＬＩＳＡ（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって検出した。製造業者の指示書に従ってアッセイを行った。簡潔に言うと、プレートは、供給された被覆用抗体で前被覆又は被覆され、シールされ、一晩４℃でインキュベートされた。プレートを洗浄（０．５ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ２０及び１Ｌ ＰＢＳ）し、アッセイバッファー（５ｇ；ＢＳＡ；０．５ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０及び１Ｌ ＰＢＳ）で２時間室温でブロックした。次に、再度洗浄し、ビオチン結合体を各ウェルに添加した。さらに、プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／結合体とともにインキュベートした。１時間の処理及び追加の洗浄工程後、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）を添加した。発色が見られたとき、１Ｎ硫酸で反応を停止させた。プレートをＷａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター１４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）上で４５０ｎｍで読み込んだ。
【００８４】
可溶性ＩＣＥの定量化
ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ａｕｓｔｒｉａ）から提供される市販のＥＬＩＳＡを用いて、ＩＣＥを測定した。ＩＣＥ ＥＬＩＳＡは、ｐ４５前駆体及び酵素的に活性なｐ１０：ｐ２０複合体の両方を検出する。ＩＣＥとその前駆体基質との間の相互作用は、細胞内で専ら起こる。試料及び標準を提供されたアッセイ希釈剤で希釈した。プレートを２時間インキュベートし、３回洗浄した。二次抗体を有する別のインキュベーション及び洗浄工程後、ＨＲＰ結合した検出抗体を添加した。回転セット上でプレートお３０分間インキュベートした。次に、それらを空にし、洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。着色反応を１Ｎ硫酸で停止させ、波長４５０ｎｍでＷａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター１４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で測定した。
【００８５】
サイトケラチン−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープの定量化
循環ＣＫ−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープは、ＰＥＶＩＶＡ ＡＢ（Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入したＥＬＩＳＡによって測定した。このＥＬＩＳＡは、捕捉体としてＣＫ−１８の２３８−３９６断片上のエピトープを認識するモノクローナル抗体、及び検出体としてＨＲＰ結合Ｍ３０を使用する。Ｍ３０抗原レベルは、ユニット／Ｌで表される。１ユニットは、製造業者に従って、Ｍ３０認識モチーフを含む合成されたペプチドの１．２４ｐｍｏｌに対応する。ＥＬＩＳＡの感度は３０Ｕ／Ｌである。アッセイ内及びアッセイ間のＣＫ−１８ ＥＬＩＳＡの変動係数は、それぞれ０．７〜５．８％及び２．８〜４．８％であった。各試料のタンパク質量は、ＣＫ−１８ネオエピトープＭ３０の既知レベルに対して構築した光学密度の標準曲線に従って計算した。（Ｌｅｅｒｓ ＭＰ， Ｋｏｌｇｅｎ Ｗ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９９；１８７（５）：５６７−７２）
【００８６】
免疫組織化学
アポトーシスの検出に関して、Ｍ３０−ネオ−エピトープ２５に対するモノクローナルマウス抗体を用いた。ＡＭＩを有する患者からの新鮮な血栓を７．５％の緩衝化したホルマリン中で固定し、腹ファインに包埋した。連続的な３μｍ切片をヘマトキシリン及び酸性フクシンオレンジＧ（トリクローム染色）で染色した。免疫染色に関して、クエン酸塩緩衝液中でのマイクロ波（２×５分、６００Ｗ）の前処理を適用した。非特異的な染色を避けるために、試料を５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ／トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ））で３０分間処理した。その後、スライドを一次抗体（１：５０、抗Ｍ３０抗体、Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で一晩室温でインキュベートした。これは、ビオチン標識したマウス抗体（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｌｉｎｇａｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）で１時間インキュベートし、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン−ＡＰ／１０％ヒト血清（１：１００、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって検出した。視覚化は、ファーストレッド（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で達成した。ネガティブ対照については、一次抗体は、無関係なマウスＩｇＧによって置き換えた。
【００８７】
統計分析
結果は、他に言及がなければ、平均±ＳＥＭとして提示される。相対的に小さな試料サイズにより、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験は、有意差を計算するために用いた。ｐ値０．０５は、有意であると考えられた。
【００８８】
結果
患者の人口学的特徴及びいくつかの基準の特徴を表１に示す。SA及びUS試験群では、同様の数の患者が心筋梗塞または従来の冠状動脈インターベンション（冠動脈バイパス移植術及び経皮経管冠動脈形成術）の病歴を有する。冠状動脈疾患のための確立した危険因子及び血管造影所見は、両グループともに同じであった。
【００８９】
ＡＭＩ群は４０人の患者を含み、男性が２８人（７０％）、女性が１２人（３０％）であった。平均年齢は、５９．３歳であった。３０％の患者は、ＰＣＩ又はバイパス外科処置によって以前に血管再開通術治療を受けた。糖尿病である本試験の９人（２２．５％）の患者、２５人（６２．５％）の高血圧患者、及び２１人（５２．５％）が現在喫煙者であった。コレステロールの平均レベルは、２０６．３ｍｇ／ｄＬ（ＵＬＮ＝１９９ｍｇ／ｍＬ）であり、トリグリセリドは、２０４．６ｍｇ／ｄＬ（ＵＬＮ＝１７２ｍｇ／ｄＬ）であった。Ｃ反応性タンパク質の平均レベルは、全身性炎症プロセスを指示する３．６ｍｇ／ｄＬ（ＵＬＮ＝１ｍｇ／ｄＬ）であった。１９人（４７．５％）が２つ又は３つの血管疾患を受けた。唯一１人の患者では、左主幹動脈が関係した。半分を超える患者（５２．５％）は、心エコー検査によって特定された左心室機能の減少を示した。
【００９０】
炎症及びアポトーシス特異的タンパク質
全身性炎症応答症候群がＳＡ及びＵＡと比較してＡＭＩ部位で模倣されるかどうかを調査するために、血漿試料をＸ−サイザーによって得て、評価した。血漿試料は、内部対象として使用されるＡＭＩを患っている患者における大腿動脈から得た。炎症性サイトカインの誘導体（ＩＬ−１βｐ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−Ｒ１、ｓＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ）及びそれらの有意性を表２に示した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
可溶性ＩＣＥ及びＣＫ−１８
図１に示されるように、可溶性ＩＣＥの平均血漿レベルは、ＳＡでは６８．６±２０．２、ＵＡでは８１．５±２４．３、ＡＭＩ大腿（周囲）では９６±２７．１、及びＡＭＩ冠状動脈試料では２８２．２±１８０であった。このデータは、全身の血液レベルならびにＳＡ及びＵＡと比較して、心筋梗塞の部位から誘導された試料におけるＩＣＥ濃度の有意な増加を証明する（ＳＡ対ＵＡ ｐ＝０．０２３、ＵＡ対ＡＭＩ周辺 ｐ＝０．０２２、及びＡＭＩ周囲対ＡＭＩ冠状動脈 ｐ＜０．００１）。
【００９３】
図２に示した結果は、周囲と比較して、心筋梗塞の部位から誘導した血漿のＣＫ−１８−Ｍ３０ネオエピトープの濃度における顕著な増加を示す（４１１±１５．３対３３６．８±９．９、ｐ＝０．００１）。さらに有意な差は、ＡＭＩ周囲及びＵＡ（３３６．８±９．９対２５５±５、ｐ＜０．００１）、並びにＵＡ及びＳＡ（２５５．５±８．９対２３２．４±４．９、ｐ＝０．０２７）の間で見られた。
【００９４】
心筋梗塞を引き起こす血栓におけるＣＫ−１８の検出
血栓切除デバイスによって回収した血栓を免疫組織化学並びに日常的なヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）及び酸性フクシンオレンジＧ染色に供した。図３（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）は、急性心筋虚血を引き起こす代表的な血栓（ｎ＝８）を示す。パネル（Ａ）は、ＨＥ染色を示し、更なる免疫組織化学において、フィブリンだけでなく有意な量のマイクロフィラメントＣＫ−１８からなることが特定された淡色領域を含む。さらに、分散した白血球及び赤血球を観察することができる。血栓の中心部分における免疫組織染色により、ＣＫ−１８陽性領域を検出することができ（パネルＣ）、フィブリン沈殿に富んだ領域と主に対応している（酸性フクシンオレンジＧ染色、パネルＢを参照されたい）。パネルＤは、Ｍ３０に対する非特異的な対照染色を示す。末梢血軟膜を内部対照として使用した。
【００９５】
検討
本実施例は、カスパーゼファミリーのメンバーであるＩＣＥが、ＳＡと比較して、ＡＭＩを患っている患者における急性冠状血栓症の部位で顕著に増加し、その周囲及びＵＡではほんの中程度であることを示す。興味深いことに、ＡＭＩの患者では、この所見は、特異的なカスパーゼ活性の産物である全身性マイクロフィラメントＣＫ−１８の含有量の増加と関連する。
【００９６】
触媒残基として使用されるＣｙｓ２８５を有するプロテアーゼであるＩＣＥ／カスパーゼ−１は、Ａｓｐ１１６−Ａｌａ１１７で３１ｋＤａの生物学的に不活性なＩＬ−１β前駆体を開裂し、ＩＬ−１βから１７．５ｋＤＡの成熟形態を生じさせる（ＢｏｍｂｅｌｉＴ，Ｋａｒｓａｎ Ａ，Ｔａｉｔ ＪＦ，Ｈａｒｌａｎ ＪＭ．，Ｂｌｏｏｄ １９９７；８９（７）：２４２９−４２）（Ｋｏｓｔｕｒａ ＭＪ，Ｔｏｃｃｉ ＭＪ，Ｌｉｍｊｕｃｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９；８６（１４）：５２２７−３１）。活性酵素は、２つの同一でないサブユニット（ｐ１０及びｐ２０）からなり、それらはともに酵素活性に本質的であり、したがって、心筋細胞を含む種々の細胞のアポトーシスにおいて極めて重要な役割を果たす。心臓肥大におけるＩＣＥの発現増加、心筋ミオパシーにおけるＴＮＦ−αの過剰産生（Ｋｕｂｏｔａ Ｔ，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉｍａ Ｍ，Ｆｒｙｅ ＣＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００１；３３（７）：１３３１−４４）、及び内毒素誘導の心筋機能障害（Ｆａｕｖｅｌ Ｈ，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ Ｐ，Ｃｈｏｐｉｎ Ｃ，Ｆｏｒｍｓｔｅｃｈｅｒ Ｐ，Ｎｅｖｉｅｒｅ Ｒ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００１；２８０（４）：Ｈ１６０８−１４）は、ＡＭＩ部位で可溶性ＩＣＥの存在の評価を促進した。ＡＭＩ部位で平均４．１倍のＩＣＥ増加は、ＵＡと比較して観察された。内毒素又は低酸素ストレスの条件下で、カスパーゼ１は、これらの生理的ストレスとともに相乗的に作用し、カスパーゼ−３を介してアポトーシスを誘導することができる。虚血及び再潅流損傷の実験的モデルでは、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト遺伝子トランスフェクションは、梗塞面積を減らすことが示された（Ｆｒａｎｔｚ Ｓ，Ｄｕｃｈａｒｍｅ Ａ，Ｓａｗｙｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００３；３５（６）：６８５−９４．）、ＩＣＥの心筋レベルの増加は、ストレス条件下でアポトーシス性心筋損傷にかかり易くする場合がある（Ｓｙｅｄ ＦＭ，Ｈａｈｎ ＨＳ，Ｏｄｌｅｙ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００５；９６（１０）：１１０３−９）。
【００９７】
中間径フィラメントの主要コンポーネントであるサイトケラチン１８は、内皮組織及び線維芽細胞と非内皮細胞で少量幅広く発現される（Ｓｃｈａａｆｓｍａ ＨＥ，Ｒａｍａｅｋｅｒｓ ＦＣ，Ｐａｔｈｏｌ Ａｎｎｕ １９９４；２９ Ｐｔ １：２１−６２）。アポトーシス性細胞では、サイトケラチン１８はリン酸化され、主要部位はセリン５３であり、マイクロフィラメントは急速に凝集する（Ｋｕ ＮＯ，Ｌｉａｏ Ｊ，Ｏｍａｒｙ ＭＢ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２（５２）：３３１９７−２０３）（Ｃａｕｌｉｎ Ｃ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ ＧＳ，Ｏｓｈｉｍａ ＲＧ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；１３８（６）：１３７９−９４）。熱ショックストレス及びウイルス感染などの種々のストレス条件は、マイクロフィラメント認識及び可溶性、並びに改変された重合を増加する場合がある（Ｋｕ ＮＯ，Ｌｉａｏ Ｊ，Ｏｍａｒｙ ＭＢ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２（５２）：３３１９７−２０３．）（Ｓｃｈｕｔｔｅ Ｂ，Ｈｅｎｆｌｉｎｇ Ｍ，Ｋｏｌｇｅｎ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００４；２９７（１）：１１−２６）。リン酸化ＣＫ−１８は、タンパク質分解に対する優先的な基質である。アポトーシス中のＣＫ−１８のカスパーゼ媒介開裂（Ｃａｕｌｉｎ Ｃ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ ＧＳ，Ｏｓｈｉｍａ ＲＧ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；１３８（６）：１３７９−９４）は、抗体Ｍ３０に認識される特異的ネオ−エピトープの形成をもたらす（Ｌｅｅｒｓ ＭＰ，Ｋｏｌｇｅｎ Ｗ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９９；１８７（５）：５６７−７２）（Ｋａｄｙｒｏｖ Ｍ，Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｐ，Ｈｕｐｐｅｒｔｚ Ｂ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ２００１；２２（１）：４４−８）。興味深いことに、ＣＫ−１８、ネオ−エピトープＭ３０濃度の顕著な増加は、心筋梗塞の部位から直接得られる血漿において測定される。さらに、ＣＫ−１８の含有量の増加は、血栓切除デバイスがＣＫ−１８について陽性に染色されたＡＭＩにおける血栓を得たという本発明者らの見解によって確認された。血栓のこの新規な特徴は、何故、フィブリン溶解を目的とする静脈内血栓溶解療法が、ＡＭＩを患っている≧５０％の患者において初期の完全な冠血量を不完全にのみ回復するのかという更なる説明として用いられてもよい（Ｖａｌｇｉｍｉｇｌｉ Ｍ，Ｍｅｒｌｉ Ｅ，Ｍａｌａｇｕｔｔｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２００３；４２０（２）：２５５−６１．）（Ｔｏｐｏｌ ＥＪ．Ｔｏｗａｒｄ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９８；９７（２）：２１１−８）（Ｒｅｎｔｒｏｐ ＫＰ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００；１０１（１３）：１６１９−２６）。
【００９８】
ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４は、血管内皮細胞、マクロファージ、Ｔリンパ球、平滑筋細胞、及び血小板などの崩壊したアテロームと関連した様々な活性化細胞によって発現した膜貫通血具タンパク質である（Ｍａｃｈ Ｆ，Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ Ｕ，Ｓｕｋｈｏｖａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４（５）：１９３１−６）。この炎症性仲介因子は、細胞膜から開裂し、ｓＣＤ４０Ｌを形成することができ、これは、その生物学的特性を維持し、ＣＤ４０と相互作用し、種々の炎症応答を開始する（Ｍａｃｈ Ｆ，Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ Ｕ，Ｓｕｋｈｏｖａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４（５）：１９３１−６）（Ａｕｋｒｕｓｔ Ｐ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｆ，Ｕｅｌａｎｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９／１００（６）：６１４−２０）。ｓＣＤ４０Ｌのレベル増加は、従来、ＵＡを有する患者（Ａｕｋｒｕｓｔ Ｐ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｆ，Ｕｅｌａｎｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９；１００（６）：６１４−２０）、及び心筋梗塞の患者において見られた。（Ｏｈａｓｈｉ Ｙ，Ｋａｗａｓｈｉｍａ Ｓ，Ｍｏｒｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００５）。これらの見解に沿って、本結果は、ＳＡと比較して、急性心筋梗塞の部位でｓＣＤ４０Ｌの有意な増加を証明した。
【００９９】
従来、内皮損傷がＡＭＩ及びＵＡにおける一体部分であり（Ｍｕｔｉｎ Ｍ，Ｃａｎａｖｙ Ｉ，Ｂｌａｎｎ Ａ，Ｂｏｒｙ Ｍ，Ｓａｍｐｏｌ Ｊ，Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ Ｆ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３（９）：２９５１−８）、ＵＡの患者由来の血清が、ＳＡの患者由来の血清と比較して、ヒト臍静脈内皮細胞上でプロアポトーシス的である（Ｖａｌｇｉｍｉｇｌｉ Ｍ，Ａｇｎｏｌｅｔｔｉ Ｌ，Ｃｕｒｅｌｌｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３；１０７（２）：２６４−７０）ことが示されている。さらに、後者の血清は、１年のフォローアップで再調査された場合、安定な病巣を有する患者とはもはや相違しないことが観察され、血清のアポトーシス活性の増加が一時的にＵＡの結びつくことを示唆した。
【０１００】
アテローム斑内の局所的、及び循環内の全身的な炎症プロセスは、冠状動脈性心臓病の病因における確立した特徴である（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９８９；８０（２）：４１０−４）。アテローム性動脈硬化症を覆う内皮のアポトーシスが粥腫崩壊をもたらす場合があり、アポトーシスを受けている細胞によって組織因子を積層した膜の微粒子の放出が血液凝固カスケードを直接的に開始することが示唆されている。心筋梗塞における急性血栓切除の技術は、急性事象の際に発端となっている冠状動脈の外へ直接的に血液試料を回収するという独自の可能性を提供し、全身血液と比較される。このデータは、特に局所的に増大したアポトーシスとの相互作用における免疫学的プロセスの全身活性がＡＭＩにおける主要なメカニズムであることを示唆する。
【０１０１】
本実施例は、ＡＭＩを患っている患者の末梢血と皮悪して、急性冠状血栓症の部位で増加した炎症性／アポトーシス特異的タンパク質に関して報告している最初のものである。従来の試験から、ＡＭＩが局所的に炎症したプラーク、続くプラーク崩壊及びその後の血栓性血管閉塞及び全身性炎症の結果であることが知られている（Ｍｕｔｉｎ Ｍ，Ｃａｎａｖｙ Ｉ，Ｂｌａｎｎ Ａ，Ｂｏｒｙ Ｍ，Ｓａｍｐｏｌ Ｊ，Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ Ｆ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３（９）：２９５１−８）。ＢＡＸ、ＣＡＳＰ１、ＦＡＳ、ｐ５３又はＰＣＮＡのようなプロアポトーシス遺伝子の発現は、方向性冠動脈粥腫切除術由来のＡＣＳプラークにおいて有意に高く、ＭＤＭ２などの抗アポトーシス抗体は、ＳＡを有すると診断された患者由来のプラークにおいてより発現された（Ｒｏｓｓｉ ＭＬ，Ｍａｒｚｉｌｉａｎｏ Ｎ，Ｍｅｒｌｉｎｉ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１１０（１３）：１７６７−７３）。全身性炎症性プロセスは、とりわけ、単球浸潤、好中球誘引及びＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞を不安定課するプラークの拡大を含む（Ｚａｌ Ｂ，Ｋａｓｋｉ ＪＣ，Ａｒｎｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１０９（１０）：１２３０−５）。これらの観察は、細胞ホメオスタシス及び修復を受けているメカニズムはＳＡにおいて活性であり、より均衡を保つことを指示し、不安定なプラークは、プロアポトーシス遺伝子の活性化に起因する不均衡なプログラム細胞死によって特徴付けることができる。さらに、抗６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、コレステロール、肺炎クラミジア、及びＣＫ−１８に指向される抗体（Ｗｉｌｌｓｅｒｏｎ ＪＴ．Ｐｒｏｇ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓ ２００２；４４（６）：５６９−７８は虚血性心疾患と関連することが報告されている。
【０１０２】
ＣＤ４０Ｌに加えて、ＩＣＥ及びＣＫ−１８又はその断片のレベル増加は、臨床的な不安程度と関連し、したがって、急性冠状動脈症候群の特徴として考えられ得る。このインビボで得られた情報は、心筋細胞アポトーシス及び心筋梗塞拡張の予防におけるカスパーゼ阻害剤の薬理学的な使用を含む試行に言い換えられる（Ｙａｏｉｔａ Ｈ，Ｏｇａｗａ Ｋ，Ｍａｅｈａｒａ Ｋ，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９８；９７（３）：２７６−８１）。ＡＭＩにおけるＣＫ−１８又はその断片を標的とする新規治療が必要とされる。
【０１０３】
要約すると、Ｘ−サイザー血栓切除デバイスは、ＡＭＩを患っている患者（ｎ＝４０）において利用された。ＵＡ（ｎ＝４０）及びＳＡ（ｎ＝４０）は、対照群として含められた。炎症性及びアポトーシス特異的なタンパク質であるＩＬ−１β（ＩＬ−１βｐ）、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、インターロイキン−１β変換酵素／ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、ＥＬＩＳＡによって測定された。免疫組織化学は、ＡＭＩを患っている患者から得られた冠状動脈血栓においてＣＫ−１８の存在を評価するために利用された。比較群は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって評価された。
【０１０４】
可溶性ＩＬ−１βｐ、ＩＣＥ及びＣＫ−１８（又はその断片）は、ＳＡとＵＡとの間の新規な識別因子であることが特定された（それぞれ、ｐ＝０．０３４、ｐ＝０．０２３、Ｐ＝０．０２７）。興味深いことに、可溶性ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、全身血液と比較して、心筋梗塞部位で有意に増加し（ともにｐ＝０．００１）、心筋梗塞の急性事象における新規な特徴的役割を指示する。
【０１０５】
この観察は、ＣＫ−１８を同定可能な抗体であるＭ３０が心筋梗塞を引き起こす冠状動脈血栓において陽性に染色したという知見によって確認された。
【０１０６】
急性心筋梗塞は、インビボでの全身性ＩＣＥ及びＣＫ−１８レベルの増加と関連している。
【０１０７】
血栓切除の利用は、炎症及びアポトーシス特異的タンパク質を比較するために、閉塞した冠状動脈、付随して大腿動脈で血液及び血栓及び血漿を回収するという独特の可能性を提供する冠状動脈内血栓材料の除去を可能にする。安定狭心症及び不安定狭心症の患者は、対照として使用した（全ての群、ｎ＝４０）。グループ比較は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって評価された。
【０１０８】
炎症及びアポトーシス特異的タンパク質であるＩＬ−１βｐ、ＩＬ−１β、ｈｓ−ＴＮＦα、ＴＮ−Ｒ１、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、インターロイキン−１β−変換酵素／ＩＣＥ及びＣＫ−１８をＥＬＩＳＡによって測定した。免疫組織化学は、急性心筋梗塞を患っている患者から得られた冠状動脈血栓においてＣＫ−１８の存在を評価するために利用された。
【０１０９】
新規な情報は、次に関連する：可溶性ＩＬ−１βｐ、ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、安定狭心症と不安定狭心症との間の新規な識別因子であると特定された（それぞれ、ｐ＝０．０３４、ｐ＝０．０２３、ｐ＝０．０２７）。
【０１１０】
興味深いことに、ＩＬ−１β、ｈｓ−ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌは、グループ不安定対安定狭心症集団においていかなる有意差もなかった。しかしながら、本実施例で測定されたＣＤ４０Ｌ濃度は、関連文献で測定された平均値に匹敵するということは述べておくべきである。
【０１１１】
興味深いことに、ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、急性心筋梗塞を湯酢売る患者において全身血液と比較して、心筋梗塞の部位で有意に増加した（ともに、ｐ＝０．０００１）。これは、心筋梗塞の急性事象における新規な特徴的役割を指示する。この観察は、ＣＫ−１８を同定することができる抗体であるＭ３０が心筋梗塞を引き起こす血栓において陽性を染色するという知見によって確認された。
【０１１２】
【化１】
【０１１３】
【化２】
【０１１４】
【化３】
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】可溶性インターロイキン−１変換酵素／ＩＣＥの血漿レベルを示す。安定狭心症（ＳＡ）、不安定狭心症（ＵＡ）を有する４０人の患者の血漿中のｓＩＣＥの濃度は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）における大腿動脈及び冠状動脈から得られた血漿と比較された。各ボックスは、５０％値を含む４分位内を示す。ボックスを横切る線は、平均値ラインを示す。ヒゲがボックスから最高値及び最低値まで伸びている。
【図２】急性心筋梗塞、ＳＡ及びＵＡにおけるサイトケラチン１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープの血漿レベルを示す。患者の冠状動脈から得られた血漿中のＣＫ−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープの濃度は、大腿動脈から得られた全身血流量と比較して顕著に増加した。４０人の患者から得られたデータは、５０％値を含む４分位内を示す。ボックスを横切る線は、平均値ラインを示す。ヒゲがボックスから最高値及び最低値まで伸びている。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、急性心筋梗塞を有する患者からの代表的な血栓を示す（ｎ＝８）。図３Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す；図３Ｂは、酸性フクシンオレンジＧ染色（フィブリン−赤、赤血球、血小板及び他の血漿タンパク質−折れんい、分散した白血球−青）を示す；図３Ｃは、血栓の中心のＣＫ−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープのポジティブな免疫反応性を示す；図３Ｄは、ネガティブ対照を示す（全て２００倍）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓血管疾患を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関（ＷＨＯ；ジュネーブ）によれば、心臓血管疾患は、毎年、世界中で１，５００万人を超える死者の原因である。いくつかの先進国の全死亡数の５０％を超え、アフリカ及び西・東南アジアにおいて５０％を超える。また、成人における死亡の主要な原因でもある。さらに、多くの心臓血管事象は必ずしも致命的ではないが、正常な日常生活を生きるための能力を損なう場合があり、結果として、社会に莫大に医療費を負担させてしまう。
【０００３】
改善された急性及び慢性的な投薬及び外科的処置、並びに生活スタイル及び食事の変化により、過去２、３０年と比較して全体の心臓血管疾患の致死率の有意な減少がある。なお、これらの高い事象及び致死率のために、心臓血管疾患は、バイオテクノロジーおよび製薬業界の両方によって莫大な投資の対象となる。
【０００４】
しかしながら、心臓血管疾患の効果的な治療及び予防は、適切な薬剤の投与を伴うだけでなく、確実な診断ツールを必要とする。したがって、初期の診断及び予防のための心臓血管疾患の分子マーカーの同定及び使用は、非常に重要である。例えば、心臓トロポニンは、損傷を受けた心筋細胞によって選択的に放出される。この事象の特異性は、急性心臓虚血性障害の診断における改善にとって十分に高い。さらに、医師は、より確実に患者に対するリスク及び予後のシナリオを予測することができる。
【０００５】
さらに、アテローム性動脈硬化形成、その進行及び不安定化を指標とする生物学的マーカーについてのサーチは、急性冠不全症候群の臨床設定、及び虚血性事象、例えば脳梗塞に関連した他の臨床的実体において非常に関連性がある。
【０００６】
今日、複数の証拠が、アテローム性動脈硬化症は慢性炎症疾患であり、粥腫発生における免疫系の成分と関係していることを示唆している。最近、研究によって、炎症に関与している強力な免疫メディエーターであるＣＤ４０及びその対応物であるＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ又はＣＤ１５４）の関与が特定された。以前に、一般的な炎症マーカー、例えば高感度Ｃ−反応性タンパク質（ｈｓＣＲＰ）及びインターロイキン−６、並びに血清アミロイドは、冠状動脈性心臓病を有する患者において不利な結果と関連付けられることが示唆された。
【発明の開示】
【０００７】
本発明の目的は、個体において心臓血管疾患を診断するための手段及び方法を提供することである。更なる目的は、安定狭心症と不安定狭心症とを区別するための方法である。本発明の別の更なる目的は、心臓血管疾患、特に血栓症に関連した疾患を治療するための手段を提供することである。
【０００８】
したがって、本発明は、個体の心臓血管疾患を診断するための方法であって、該方法は、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料中のサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；及び
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が参考対照中のＣＫ−１８若しくはその断片の量と比較して増加している場合、及び／又はＩＬ−１β前駆体の量が参考対照中のＩＬ−１β前駆体の量と比較して減少している場合には心臓血管疾患と診断する工程
を含む。
【０００９】
さらに、健常な個体の試料と比較して、心臓血管疾患を患っているか又は患っていると疑われる個体の試料中のＣＫ−１８又はその断片及びＩＬ−１β前駆体の量は、心臓血管疾患を指示することが見出された。心臓血管疾患を患っている個体の試料中のＣＫ−１８又はその断片及びＩＬ−１β前駆体の量は、心臓血管疾患を患っていない健常な個体から得られた試料中の該マーカーの量と比較して、それぞれ、増加し、減少する。
【００１０】
局所性及び全身性炎症は、心臓血管疾患、特に急性冠症候群（ＡＣＳ）、例えば不安定狭心症（ＵＡ）及び急性心筋梗塞（ＡＭＩ）に主要な役割を演じる。種々のデータにより、アポトーシスがアテローム斑の発生及び進行中に主要な事象となることを示している。ＡＭＩは、虚血によって誘導される筋細胞壊死の直接的な結果として起こることを明確に示されてはいるが、アポトーシスは、冠状動脈の閉塞後に重要な寄与実体として説明されている。メカニズム的には、粥腫崩壊後の血栓形成は、ＡＭＩにおける血管閉塞の主な原因となり、ＵＡにおける流量障害に寄与する。急性経皮冠動脈インターベンション（ＰＣＩ）は、ＡＣＳを有する患者の治療に対する最先端オプションであり、血栓溶解療法よりも高い再潅流率及び良好な結果と関連する。それにも関わらず、ＰＣＩは、血栓症及び血栓形成材料を動員するリスクを持ち、末梢の塞栓及び小循環の機能障害を引き起し、心筋救済を制限する場合がある。
【００１１】
いくつかの血栓切除デバイスは、臨床領域に導入され、ＡＭＩの設定における冠動脈血栓材料の断片化及び除去を可能にする。見込まれる無作為試験において、例えば、Ｘ−サイザー血栓切除デバイスは、心外膜流量及びＳＴセグメント分解を改善することを示している。しかしながら、生存または増加した心筋救済の改善は、これらの試験では示されなかった。生存的な心室機能及び生活の改善における急性血栓切除の効果は、今日まで多施設臨床試験において証明されてはいないが、この技術は、冠状動脈における急性動脈血栓症の部位から血液試料を回収する可能性を提供し、炎症及びアポトーシスに関連することが知られているタンパク質を調査することができる。
【００１２】
アポトーシスとは、細胞収縮、膜気泡（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、染色体凝縮、及びＤＮＡ断片化を含む「積極的なに」死んでいく細胞によって示される形態学的変更を意味する。アポトーシス細胞死は、内因性の実行プログラムの発生的に調節された活性化、又は広範囲な外因性の刺激によって開始される死のシグナルの形質導入に起因する。主要な経路は、インターロイキン−１β−変換酵素（ＩＣＥ）、システインプロテアーゼタンパク質−３２様ファミリー（シノラブディス・エレガンス細胞死遺伝子ｃｅｄ−３の遺伝子産物に相同である）に対する受容体の誘因を必要とする。炎症及びアポトーシスと関連することが知られている他のタンパク質には、ＩＬ−１β及びＩＬ−１β前駆体（ＩＬ−１β）、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−Ｒ１／ＣＤ１２０ａ、ＣＤ９５及びＣＤ９５Ｌ／ＣＤ１７８、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４が含まれる。さらに、ＵＡを有するタンパク質は、活性化したＣＤ３＋細胞、マクロファージ及び内皮細胞由来の可溶性の脱落（ｓｈｅｄ）膜成分の濃度増加を示し、増加した血管内の末梢アポトーシス代謝回転を示す。これらの脱落膜粒子は、凝血活性が増加することが報告されている。さらに、虚血性心疾患を有する患者は、サイトケラチン１８（ＣＫ−１８）又はその断片を生じること見出され、細胞骨格産物は、アポトーシスを受けている内皮細胞及び心臓微小血管に存在する。
【００１３】
これらのマーカーの全ては、刊行物において、冠状動脈性心臓病の正の徴候対象物であることが説明され、ｐ値は、０．０４〜０．０５の範囲にあることが記載されている。
【００１４】
用語「参考対照」とは、本明細書中で使用するとき、好ましくは、分析されるべき固体の試料に匹敵する少なくとも１つの健常な個体から得られる同供給源（例えば、血液、血清など）の試料を意味する。同程度の結果を得るために、参考対照及び個体の試料が同じように得られ、操作され、取り扱われるべきである。参考対照値を得るために健常な個体の数は、少なくとも１つであり、好ましくは少なくとも１０、とりわけ少なくとも２０であってもよい。しかしながら、この値はまた、少なくとも１００、１０００又は１００００個体から得ることもできる。
【００１５】
「量」及びそれと同義に使用される用語「レベル」とは、本発明の文脈において使用されるとき、試料中に存在するマーカーの濃度を意味する。
【００１６】
用語「この量が〜と比較して増加する」及び「この量が〜と比較して減少する」とは、本明細書中で使用するとき、分析されるべき試料において測定される量を意味し、対照又は「正常」（＝健常）値とは統計的有意性を有して分散し、参考対照の量の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも１００％、最も好ましくは少なくとも２００％である。本明細書中で使用するとき、用語「ＣＫ−１８又はその断片」とは、ＣＫ−１８及びその特定の断片を指し、それは、例えば、アポトーシス細胞においてサイトケラチン−１８のカスパーゼ媒介による下位列によって得られ、該細胞から放出される（例えば、Ｋｒａｍｅｒ Ｇら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）６４：１７５１−１７５６を参照されたい）。特定の断片は、ヒトの体内で生理学的又は病理学的プロセスによって産生されるＣＫ−１８分解産物として特異的に認識され得るものである。ＣＫ−１８の特定の断片はまた、インビトロにおいて、例えば、ＣＫ−１８のプロテアーゼもしくは化学的処理によって、又は（生理学的／病理学的に生じた断片（のさらなる断片化によって）のプロテアーゼもしくは化学的処理によって産生され得る。このようなＣＫ−１８断片は、いずれかの場合において、ＣＫ−１８断片でなければならなず（即ち、ＣＫ−１８断片として明確に同定され得るように）、少なくとも８アミノ酸残基の長さ、好ましくは少なくとも１０アミノ酸の長さ、とりわけ少なくとも１５アミノ酸残基の長さでなければならない。これらの断片は、特異的に認識されるべき特徴的（独特な）アミノ酸配列を有しなければならない（又は有するように選択されなければならない）。好ましいＣＫ−１８断片は、５０〜４００アミノ酸残基、好ましくは１００〜３５０アミノ酸残基、とりわけ１５０〜３００アミノ酸残基の長さを有する。ＣＫ−１８又はその断片は、特異的なポリクローナル又はモノクローナル抗体（他のサイトケラチンなどの他のタンパク質を認識及び交差反応しない）によって検出可能である。ＣＫ−１８又はその断片を特異的に認識する、かなりの数のこのような抗ＣＫ−１８抗体は市販されている。このような抗体の例は、ＤＡＬＤ後の開裂部位を有するカスパーゼによって開裂されたＣＫ−１８断片の配列ＥＤＦＮＬＧＤＡＬＤを認識する抗体ＭＢ３０である（ＥＰ１０１９４３８Ａ）。この抗体は、この断片に特異的でもあるが、開裂していないＣＫ−１８を認識しない。したがって、ＣＫ−１８に特異的であるだけでなく、ある種のＣＫ−１８断片にも特異的である検出手段（例えば、抗体）が、本発明のＣＫ−１８断片を検出するためには好ましい手段である。ＣＫ−１８のカスパーゼによって開裂した断片は、本発明の特に好ましいＣＫ−１８断片である。
【００１７】
本発明によれば、「心臓血管疾患を患っていない個体」とは、ＣＫ−１８（若しくはその断片）、ＩＬ−１β前駆体及び／又はカスパーゼ−１（ＩＣＥ）レベルが健常な個体のものと似ている個体を意味する。
【００１８】
本発明の好ましい態様によれば、心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄である。
【００１９】
用語「心臓血管疾患」とは、本明細書中で使用するとき、心臓及び血管を含む脈管系に影響を及ぼす任意の疾患又は障害を指す。血管疾患又は血管障害には、例えば、アテローム斑の発生に起因した血管内狭窄（狭くする）又は血栓（ブロックする）を含む血管機能不全によって特徴付けられる任意の疾患又は障害、並びにそれからもたらされる疾患及び障害が含まれる。特に好ましい心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄から選択される。
【００２０】
本発明の別の好ましい態様によれば、試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）量は、追加的に測定され、参考対照に存在するＩＣＥの量と比較され、該試料中のＩＣＥ量が参考対照のＩＣＥ量と比較して増加している場合には心臓血管疾患であると診断される。
【００２１】
ＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の測定を併用した試料中のＩＣＥ量の測定は、さらにより正確な診断を可能にする。
【００２２】
本発明の別の局面は、安定狭心症と不安定狭心症との間を区別する方法又は安定狭心症及び不安定狭心症を診断する方法、あるいは経皮冠動脈インターベンション後の再狭窄のリスクを評価する方法に関し、該方法は、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料中のサイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８若しくはその断片）及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体と、安定狭心症又は不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の少なくとも１つの参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；
−不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と比較して、該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が減少し、該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が増加している場合には、安定狭心症と診断する工程（また、所定のマーカー量が安定狭心症を患っている個体におけるレベルと比較される場合には安定狭心症であると診断することもできる）
を含む。
【００２３】
狭心症は、心筋酸素の供給と需要の不均衡によって引き起こされる心筋虚血の結果である。具体的には、需要は、不十分な血液供給により供給を上回る。心臓は、全体重の少ない割合を占めるが、生体の酸素消費の７％を占める。心臓組織代謝は、非常に好気性であり、不十分な血液供給を補うために貯留は非常に僅かである。血液供給は、心筋需要に不十分であるレベルまで減少すると、組織は、急激に低酸素状態となり、毒性細胞代謝物は除去することができない。心筋細胞は、急速に、局所的な微小血管系に残存する酸素供給源を使用し、好気性代謝が続く期間は、動脈閉塞の程度に間接的に比例する。酸素供給が一度枯渇すると、酸素が電子受容体としてもはや利用できないので酸化的リン酸化が持続できず、ピルビン酸塩は、アセチル補酵素Ａに変換されず、クエン酸サイクルに入る。心筋代謝は、グリコーゲン及びグルコース貯蔵を用いて嫌気性代謝にスイッチし、ピルビン酸塩は乳酸塩に発酵される。乳酸塩の蓄積は、ＡＣＳを有する個体における胸痛の根本原因である。虚血が持続するにつれて、心臓組織は、乳酸塩よりも酸性になり、他の酸性中間体が蓄積し、ＡＴＰレベルが減少し、利用可能なエネルギー源が消耗する。心臓組織は、虚血事象の１５〜２０分後に再潅流されると回復可能である。細胞内グリコーゲン貯蔵の消耗後、細胞は、壊死の特徴を少しずつ示すようになり、それには、ミトコンドリアの膨張及び細胞膜の完全性の喪失が含まれる。再潅流により、これらの損傷した細胞は、恐らくは、イオン平衡を細胞が維持できない結果として死滅する。膜の完全性の喪失は、細胞の細胞質内容物が循環系に放出されてしまう。
【００２４】
安定狭心症、不安定狭心症、及び心筋梗塞は、心筋虚血と関連した収縮性胸痛という１つの共通した特徴を共有する。胸痛は、診断のＥＣＧ変化の有無を問わず、医師による臨床症状の解釈を経て、安定又は不安定として分類される。「安定」又は「不安定」として狭心症の分類は、プラークそれ自体の安定性を指すものではなく、むしろ、胸痛を発揮するのに要求される激しさ（ｅｘｅｒｔｉｏｎ）の程度を指す。最も顕著には、限定的な心筋梗塞以外の場合において、安定又は不安定狭心症（あるいは軽度の心筋梗塞も）としての胸痛の分類は、動脈閉塞の程度を定量可能な血管造影法によってなされないが、むしろ、医師による臨床症状の解釈によってなされる。
【００２５】
安定狭心症は、激しさ又はストレスに応じて発生する収縮性胸痛によって特徴付けられ、休息又は舌下のニトログリセリンによって軽減される。安定狭心症を有する患者の冠状血管造影は、通常、少なくとも１つの冠状動脈の５０〜７０％の閉塞を示す。安定狭心症は、通常、臨床症状及びＥＣＧ変化の評価によって診断される。安定狭心症の患者は、一時的なＳＴセグメント異常性を有する場合があるが、安定狭心症と関連したこれらの変化の感度及び特異性は低い。
【００２６】
不安定狭心症は、舌下のニトログリセリンによって軽減される安静中の収縮性胸痛によって特徴付けられる。狭心症の胸痛は、通常、舌下のニトログリセリンによって軽減され、この痛みは、通常、３０分以内に鎮静化する。不安定狭心症は、安定狭心症とＡＭＩとの間の臨床状態を示し、主に、アテローム性動脈硬化症、冠動脈攣縮又はその後の血栓性閉塞を有する非閉塞性プラークへの出血の重傷度と程度における進行によるものと考えられている。不安定狭心症の患者の冠状血管造影は、通常、少なくとも１つの冠状動脈の９０％以上の閉塞を示し、結果として、基底の心筋酸素需要でさえ酸素供給ができなくなる。安定なアテローム斑のゆっくりとした成長又はその後の血栓形成を伴う不安定アテローム斑の破裂は、不安定狭心症を引き起し得る。これらの両方の原因は、結果として、冠状動脈を臨床的に狭くする。不安定狭心症は、通常、アテローム斑破裂、血小板活性化、及び血栓形成と関連する。不安定狭心症は、通常、臨床症状、ＥＣＧ変化、及び心臓マーカーの変化によって診断される。不安定狭心症の患者に対する治療は、硝酸塩、アスピリンＧＰＩ１ｂ／ＩＩＩａ阻害剤、ヘパリン、及びベータ−ブロッカーを含む。患者はまた、血管形成術及びステントを受ける場合がある。最後に、不安定狭心症の患者は、急性心筋梗塞を発症する危険性がある。
【００２７】
したがって、安定狭心症と不安定狭心症との間、場合により、安定狭心症、不安定狭心症及び急性心筋梗塞の間の確実な識別診断を提供するために、該状態の１つを患っていることが疑われる個体から得た試料中のＣＫ−１８若しくは及び／又はＩＬ−１β前駆体及び場合によりＩＣＥのレベルを測定し、それらの状態の１つを患っている個体のそれぞれのレベルと比較する。
【００２８】
安定狭心症を患っている個体におけるＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＣＥのレベルは、不安定狭心症及び急性心筋梗塞を患っている個体において見出されるレベルと比較すると減少している。
【００２９】
これとは対照的に、ＩＬ−１β前駆体のレベルは、不安定狭心症を患っている個体において見出されるレベルと比較すると増加している。
【００３０】
この方法は、個体における安定狭心症と不安定狭心症との間を明確に区別することを可能にするので、得られるデータは、安定狭心症又は不安定狭心症及び急性心筋梗塞を患っている個体の最適かつ適切な治療を設計するのに有用であり得る。
【００３１】
安定狭心症と不安定狭心症とを区別するか又は個体において安定狭心症及び不安定狭心症を診断する方法に関連する本発明の好ましい態様によれば、試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）の量は、さらに測定され、参考対照に存在するＩＣＥ量と比較され、試料中のＩＣＥ量が不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の参考対照におけるＩＣＥ量と比較して減少している場合には安定狭心症と診断される。
【００３２】
さらに、安定狭心症と不安定狭心症とを区別するか又は個体における安定狭心症と不安定狭心症を診断する方法に関する本発明に係る方法は、ＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量、及びＩＣＥ量の測定を伴ってもよい。また、単一マーカー：ＣＫ−１８又はその断片及びＩＬ−１β前駆体；ＣＫ−１８又はその断片、ＩＬ−１β前駆体及びＩＣＥ；ＣＫ−１８又はその断片及びＩＣＥ；ＩＬ−１β前駆体前駆体及びＩＣＥを組み合わせることも可能である。
【００３３】
本発明の好ましい態様によれば、サイトケラチン−１８又はその断片、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及びインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量は、免疫学的に、好ましくは、酵素免疫吸着測定法、放射免疫アッセイ又はウェスタンブロットアッセイによって測定される。
【００３４】
試料中のＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体のタンパク質レベルは、当該技術分野において知られている任意の適切な方法を用いてアッセイ可能である。例えば、酵素ＩＣＥは、その触媒活性に基づくアッセイ（例えば、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，７６８−７４；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６，３７−４３；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，８０１−９；Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９３，７４６４−９；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４，６１５−３１）、試料に含まれるタンパク質量の定量に基づくアッセイによって定量化され得る。ＣＫ−１８又はその断片の量の測定に関しては、例えば、いくつかの免疫学的アッセイは当該技術分野において知られている（例えば、Ｋｒａｍｅｒ Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２００４）６４：１７５１−１７５６）。例えば、抗体に基づく技術は、好ましくは本発明の方法における全てのマーカーに用いられ得る。例えば、特異的な認識は、一次抗体（ポリクローナル又はモノクローナル）によって与えられ、二次検出システムは、一次抗体の存在（又は結合）を検出するために用いられる。検出可能な標識は、二次抗体に結合可能であり、例えば、蛍光ラベル、放射性標識又は酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ）があり、定量可能な、例えば着色された産物を生成する。別の適切な方法では、一次抗体それ自体は、検出可能に標識化され得る。結果として、組織切片の免疫組織学的標識が提供される。一態様では、分析のために生物試料（例えば、血液、組織、細胞）から抽出物が与えられる。このような抽出物（例えば、界面活性剤抽出物）は、日常的な免疫ブロット法（Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，．Ｊ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０１：９７６−９８５（１９８５）；Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０５：３０８７−３０９６（１９８７））を用いて、対象とするタンパク質のレベルについてウェスタンブロット又はドット／スロットアッセイに供することができる。
【００３５】
他の有用な抗体に基づく方法には、免疫アッセイ、例えば酵素免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）及び放射免疫測定（ＲＩＡ）が含まれる。例えば、タンパク質特異的なモノクローナル抗体は、免疫吸着剤及び酵素標識プローブとして用いて、対象とするタンパク質を検出及び定量することができる。試料に存在するこのようなタンパク質の量は、直線回帰コンピュータアルゴリズム（Ｉａｃｏ−ｂｉｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，１１：１９−３０（１９８８））を用いて、標準調製物に存在する量と比較して計算可能である。別の態様では、対象とするタンパク質に対する２種のモノクローナル抗体を用いることができ、１つは、免疫吸着剤として、他方は、酵素標識プローブとして用いられる。
【００３６】
分析されるべき試料は、好ましくは体液、好ましくは血液、より好ましくは血漿又は血清である。
【００３７】
本発明に係る全てのマーカーポリペプチドは、（全）血液及び血漿又は血清、好ましくは可溶形態又は可溶化形態で検出され、定量化されてもよい。
【００３８】
本発明の好ましい態様によれば、試料は、大腿動脈から得られる。対照血漿試料は、安定狭心症及び不安定狭心症患者の肘から得られる（両方のサンプリング法は末梢血流に相当する）。
【００３９】
本発明の別の局面は、心臓血管疾患を診断するか、安定と不安定狭心症とを区別するか若しくは個体における安定及び不安定狭心症を診断するか、又は心臓血管系の血栓を得る個体のリスクを評価するためのキットに関し、該キットは、
−サイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８）、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）を検出するための手段；及び
−参考対照
を含む。
【００４０】
臨床診療において、心臓血管疾患の診断、安定狭心症と不安定狭心症との区別、並びに狭心症の診断は、特に関心があり、これは、医師が、急性心筋梗塞、心室性頻拍症及び線維化のような重篤な心不整脈、又は突然死に至る心停止に感受性である患者のリスクを評価することができるためである。本発明に係る方法及びキットによって得られる結果に基づいて、適切な治療及び／又は外科的介入が適用可能である。また、本発明のキットは、心臓血管系における血栓を得る個体のリスクを評価するために用いてもよい。健常な個体と比較してＣＫ−１８又はそれらの断片のレベル上昇は、血栓を得るリスクを指示する。従って、本発明はまた、該リスクを評価する方法に関する。
【００４１】
本発明の好ましい態様によれば、該手段は、ＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体に指向される抗体を含む。
【００４２】
該抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、ＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体に特異的な抗体の結合の検出を可能にする適切な標識に結合されてもよい。また、ＣＫ−１８又はその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１βに結合する抗体に指向する二次抗体を用いることができる。ＩＣＥの活性が測定される場合において、ペプチド又はポリペプチド基質は、さらに増加する（例えば、Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ ３５６，７６８−７４；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６，３７−４３；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，８０１−９；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．（１９９４）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２４４，６１５−３１）。
【００４３】
本発明の別の好ましい態様によれば、参考対照は、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体、又は安定狭心症若しくは不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体から得られる。
【００４４】
本発明のキットによって検出されるべき心臓血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄であってもよい。
【００４５】
本発明の別の局面は、血栓症（例えば、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、表在性静脈血栓症、門脈の血栓症）及び血栓症関連疾患の治療のための薬剤を製造するためのサイトケラチン−１８又はその断片を分解する化合物の使用に関する。驚くべきことに、ＣＫ−１８又はその断片は、心臓血管疾患を患っている個体の血管で形成される血栓において見出された。適切な低分子カスパーゼにより開裂されたＣＫ−１８断片は、血栓において見出される。血栓症及び血栓依存性血管疾患は、全てのヒトの臓器で発生され得て、例えば、慢性血栓肺高血圧症（ＣＴ−ＰＨ）又は後天性末梢静脈疾患に対する感受性がある。
【００４６】
血栓は、血管内の異常な血液凝固体である。血栓は、結果として、血流を閉塞する。西洋における死因の第１位は、血管内の異常な血液凝固の形成であるため、血栓を防止する工程を取ることは健康な人々によって重要である。血栓を発症する危険因子をもつ者にとって、突発的な行動が、脳梗塞、心臓発作、腎不全、肺動脈塞栓などに対して予防するために取らなければならない。
【００４７】
血栓は、動脈、静脈又は心房内で形成され得る。血栓は、高圧条件及び高流量条件下で動脈内に形成され、内因性のフィブリンタンパク質鎖によって互いに結合した血小板凝集体から構成されている。静脈内の凝固体は、低流量条件下で形成され、大部分は血小板がほとんどない赤血球から構成され、及び大量の分散したフィブリン鎖を含む。
【００４８】
これらの血栓は、血管内で静止したままである場合があるが、凝固体は移動又は閉塞し得る。凝固体が下肢の静脈から肺へ移動すると、結果として、肺動脈血栓及び／又は肺梗塞（肺細胞死）となる。同様に、凝固体が新蔵王又は頸動脈から脳へ移動すると、脳梗塞を引き起し得る。凝固体が冠状動脈を閉塞又はブロックする位置に移動すると、心臓発作（心筋梗塞）が発症し得る。不規則な心臓鼓動（例えば、心房性細動）及び心臓弁膜症（例えば、僧帽弁狭窄症）などのある種の状態は、心房心室拡大及び非効率な心房心室収縮を引き起こす。したがって、脳に移動し、脳梗塞を引き起こす可能性のある心房内で形成されるという凝固体のリスクが増す。
【００４９】
血栓症の予防は、心臓血管疾患を有意に減少させるために本質的である。心臓血管疾患は、年に約１００万人が死亡するという死因の第１位のままである。これは、年の癌死者の発生率の約２倍である。これらの心臓血管系死亡のうち、冠動脈疾患は、約５１％を示し、脳梗塞は、１６％を示す。これらの疾患は、全ての心臓血管系死亡において血栓症を伴う。さらに、血栓症は、癌患者の共通の死因である。したがって、心臓血管及び他の疾患に基づく死亡の高発生率を減少させるために、血栓症の予防及び治療を最適化することは最重要となっている。
【００５０】
血栓症の症状は、形成した凝固体の局在性に依存している。心臓発作中に、ある場合には冠状動脈に流れる凝固体により、関連した症状の開始は、通常、突然に起こる。関与している冠状動脈が小さい血管であり、その血管が末端でこの凝固体によって閉塞（ブロック）されると、心臓発作は、いずれの症状を全く示さないこともある。しかしながら、凝固体が大きく、左の主要な冠状動脈で突然閉塞すると、左心室への全血液の供給が突然切断され、心臓発作は大規模となり、突然死に至る。左又は右の主要な冠状動脈の分岐が塞栓症によって、又はより共通には、冠状動脈の壁から形成し、酸化されたＬＤＬ及びフィブリノーゲンと混合され血管を閉塞する小さな凝固体によって閉塞され得て、これは、粉瘤と呼ばれるものを形成し、関連する冠状動脈の内径を狭める。
【００５１】
この閉塞は、多くの場合、突然の心臓発作の古典的な症状：狭心症に関連した胸痛、息切れ、冷たくて湿った汗、冷えた手足、ひどい不安、吐き気、高度の脱力、目眩、集中力の欠如、胸の粗動、及び動悸又は他の不規則な鼓動を引き起こす。心臓発作中に感じる古典的な胸痛は、重く、強烈な、収縮感覚に似ている。この痛みは、胸部、左腕若しくは右腕、両肩、又は顎にも由来する。痛みは、多くの場合、胸部から左下にかけて広がる。しかしながら、痛みの広がりは、胸部から右腕又は顎にも移動する場合がある。持続的な心臓発作と関連した場合、痛みは、心臓発作の１〜３分前というよりはむしろ１０〜１５分続く傾向がある。
【００５２】
閉塞があまり重症ではないか又は傷害された神経分布の場合（例えば、糖尿病性神経障害であるなど）である場合、心臓発作はいずれの症状もなしに発生し得て、正常なＥＣＧを有する緊急治療室にも与えられる。この状況では、心臓発作は、血中の正の心筋酵素を特定することによって診断される。古典的な心臓発作症状が現れる場合、例えば、アセチルサリチル酸は、応急処置段階として投与されてもよい。
【００５３】
血栓性脳梗塞と関連した症状は、脳梗塞が突然の塞栓症又は漸進的凝固体形成から起こるかどうかに依存して変化する。脳塞栓性脳梗塞では、症状は開始時に急速であり、多くの場合、数秒以内にピークを迎える。犠牲者は発作と、症状の突然の開始により影響を受けた側に頭痛を経験する。脳血栓性脳梗塞では、開始は、数分又は数時間で起こり、場合によっては、脳梗塞は数日又は数週間のステージで進行する。
【００５４】
脳梗塞中に発生する症状は、損傷を受けた脳の領域に依存する。例えば、目を補う領域（網膜領域）が関係する場合、患者は、一時的な眼前暗闇及び影が目を被せるという感覚を経験する。大脳が関係する場合、反対側の単不全麻痺、片側不全麻痺、局所的な刺痛、無感覚、片側視野欠損、失語症及び意識消失が起こる場合がある。椎骨脳底領域が関係する場合、患者は、両側の視覚障害（薄暗い、灰色がかった、ぼけ視、又は複視と呼ばれる一時的な全盲）を経験する。椎骨脳底エピソードは、突然の位置変化によって誘導される症状を引き起こすが、頸動脈エピソードは起こらない。内耳又は中耳が関係する場合、目眩、不安定、吐き気、及び嘔吐が起こる。脳幹が関係する場合、患者は、ろれつが回らない、構音障害、不完全失語症、無感覚、衰弱、及び四肢の知覚異常を経験する。姿勢緊張の突然の喪失からの「倒れ」発作は、起源が脳底である脳梗塞の症状である。
【００５５】
肺塞栓症又は梗塞と関連した症状は、非特異的であり、多くの場合、頻度及び強度において変化し得る。これは、肺血管閉塞の程度、塞栓が起こる前の心臓の機能強度、及び塞栓の大きさに依存する。小さな塞栓又はミクロ塞栓は無症候性である場合がある。しかしながら、症状が現れる場合には、数分で突然発症する傾向にあり、咳若しくは喘鳴を伴うか又は伴わない突然の息切れ（ｓｈｏｒｔｎｅｓｓ ｏｆ ｂｒｅａｔｈ）又は息切れ（ｂｒｅａｔｈｌｅｓｓｎｅｓｓ）、呼吸促迫、不安、及び不穏が含まれる。多くの場合、肺塞栓症の際、高血圧が肺動脈管構造内にある。これがそのケースである場合、塞栓症が起こると、鈍い胸痛が発生する場合がある。酷い肺塞栓症では、右心不全が腹部及び下肢において体液とともに発症する場合がある。心不全による心拍出量の減少により、頭のふらつき、意識不明、及び発作がある場合がある。
【００５６】
血栓症を治療及び／又は予防するために、いくつかの物質を投与することができる。例えば、クマディン（ワルファリン）は、第ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ及びＸ因子などのビタミンＫ依存性血液凝固因子、並びに抗凝固タンパク質の合成を阻害する。血栓症を予防及び治療に用いられる別の薬物は、トロンボキサン合成と干渉することによって血小板凝集を阻害するアセチルサリチル酸である。チクロピジン（Ｔｉｃｌｉｄ）は、血小板膜へのフィブリノーゲン結合と干渉することによって血小板凝集を阻害する。チクロピジンは、多くの場合、血栓性脳梗塞の危険性が高く、アスピリンに寛容でない患者において考慮される。ヘパリン（静脈内投与される）は、フィブリノーゲンからフィブリンへの変換を妨げるアンチトロンビンＩＩＩの活性を増加させる。ヘパリンは、胃腸管によって吸収されず、静脈内に投与されなければならない。通常、（例えば、脳梗塞後の）緊急事態においてのみ用いられる。組織プラスミノーゲン因子（ｔ−ＰＡ）は、フィブリンを分裂させるプラスミンを活性する。ｔ−ＰＡは血液凝固体を溶解させるために、緊急状態で用いられる。ストレプトキナーゼは、他の組織プラスミノーゲン因子薬物である。これら両方の薬物は、緊急性の血栓状態（例えば、虚血性脳梗塞）において静脈内に投与される。
【００５７】
驚くべきことに、血栓はフィブリンを含むだけでなく、サイトケラチン、特にサイトケラチン−１８又はその断片を含むことが見出された。サイトケラチンは血栓の形成に関与するので、サイトケラチンを分解する化合物の使用により、単独で又は一定の間隔で血栓溶解治療に関与する他の化合物と併用して血栓を溶解することができる。
【００５８】
本発明の好ましい態様によれば、ＣＫ−１８を分解する（又はＣＫ−１８断片をさらに分解する）化合物は、好ましくは下記のリストから選択されるプロテアーゼである。
【００５９】
特に好ましい化合物は、プロテアーゼ（ＥＣ３．４）、特にアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１）、ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３）、ジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４）、ペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１５）、セリン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６）、メタロカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７）、システイン型カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１８）、オメガペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９）、セリン・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１）、システイン・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２）、アルパラギン酸エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３）、メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４）及びスレオニン・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２５）である。
【００６０】
本発明に従って用いられる好ましいアミノペプチダーゼは、ロイシル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１）、膜アラニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２）、シスチニルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．３）、トリペプチドアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．４）、プロリル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．５）、アルギニルアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．６）、グルタミル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．７）、Ｘａａ−Ｐｒｏアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．９）、細菌性ロイシル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１０）、クロストリジアル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１３）、細胞質アラニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１４）、リジル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１５）、Ｘａａ−Ｔｒｐアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１６）、トリプロファニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１７）、メチオニル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１８）、Ｄ−立体特異的アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．１９）、アミノペプチダーゼＥｙ（ＥＣ３．４．１１．２０）、アスパルチル・アミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２１）、アミノペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１１．２２）及びＰｅｐＢアミノペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１１．２３）からなる群から選択される。
【００６１】
本発明に従って用いられる好ましいジペプチダーゼは、Ｘａａ−Ｈｉｓジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．３）、Ｘａａ−Ａｒｇジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．４）、Ｘａａ−メチル−Ｈｉｓジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．５）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．７）、Ｘａａ−Ｐｒｏジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．９）、Ｍｅｔ−Ｘａａジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１２）、非立体特異的ジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１７）、細胞質非特異的ジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１８）、膜ジペプチジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．１９）、ｂ−Ａｌａ−Ｈｉｓジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１３．２０）及びジペプチダーゼＥ（ＥＣ３．４．１３．２１）からなる群から選択される。
【００６２】
本発明に従って用いられる好ましいジペプチジル−ペプチダーゼ及びトリペプチジル−ペプチダーゼは、ジペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．１）、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１４．２）、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＩＩ（ＥＣ３．４．１４．４）、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ（ＥＣ３．４．１４．５）、ジペプチジル−ジペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．６）、トリペプチジル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１４．９）、トリペプチジル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１４．１０）及びＸａａ−Ｐｒｏジペプチジル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１４．１１）からなる群から選択される。
【００６３】
本発明に従って用いられる好ましいペプチジル−ジペプチダーゼは、ペプチジル−ジペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１５．１）、ペプチジル−ジペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．１５．４）及びペプチジル−ジペプチダーゼＤｃｐ（ＥＣ３．４．１５．５）からなる群から選択される。
【００６４】
本発明に従って用いられるセリン型カルボキシペプチダーゼは、リソソームＰｒｏ−Ｘａａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．２）、セリン型Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１６．４）、カルボキシペプチダーゼＣ（ＥＣ３．４．１６．５）及びカルボキシペプチダーゼＤ（ＥＣ３．４．１６．６）からなる群から選択される。
【００６５】
本発明に従って用いられる好ましいメタロカルボキシペプチダーゼは、カルボキシペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．１７．１）、カルボキシペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．１７．２）、リジン・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．３）、Ｇｌｙ−Ｘａａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．４）、アラニン・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．６）、ムラモイルペンタペプチダーゼ・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．８）、カルボキシペプチダーゼＥ（ＥＣ３．４．１７．１０）、グルタミン酸塩カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１１）、カルボキシペプチダーゼＭ（ＥＣ３．４．１７．１２）、ムラモイルテトラペプチド・カルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１３）、亜鉛Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−Ａｌａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１４）、カルボキシペプチダーゼＡ２（ＥＣ３．４．１７．１５）、膜Ｐｒｏ−Ｘａａカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１６）、チューブリニル−Ｔｙｒカルボキシペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１７．１７）、カルボキシペプチダーゼＴ（ＥＣ３．４．１７．１８）、カルボキシペプチダーゼＴａｑ（ＥＣ３．４．１７．１９）、カルボキシペプチダーゼＵ（ＥＣ３．４．１７．２０）、グルタミン酸塩カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１７．２１）及びメタロカルボキシペプチダーゼＤ（ＥＣ３．４．１７．２２）からなる群から選択される。
【００６６】
本発明に従って用いられる好ましいシステイン型カルボキシペプチダーゼは、カテプシンＸ（ＥＣ３．４．１８．１）である。
【００６７】
本発明に従って用いられる好ましいオメガペプチダーゼは、アシルアミノアシル−ペプチド（ＥＣ３．４．１９．１）、ペプチジル−グリシンアミダーゼ（ＥＣ３．４．１９．２）、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１９．３）、ｂ−アスパルチル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９．５）、ピログルタミル−ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．１９．６）、Ｎ−ホルミルメチオニル−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．１９．７）、ｇ−グルタミルヒドラーゼ（ＥＣ３．４．１９．９）、ｇ−Ｄ−グルタミル−メソ−ジアミノピメレート・ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．１９．１１）及びユビキチニルヒドロラーゼ１（ＥＣ３．４．１９．１２）からなる群から選択される。
【００６８】
本発明に従って用いられる好ましいセリン・エンドペプチダーゼは、キモトリプシン（ＥＣ３．４．２１．１）、キモトリプシンＣ（ＥＣ３．４．２１．２）、メトリジン（ＥＣ３．４．２１．３）、トリプシン（ＥＣ３．４．２１．４）、トロンビン（ＥＣ３．４．２１．５）、血液凝固因子Ｘａ（ＥＣ３．４．２１．６）、プラスミン（ＥＣ３．４．２１．７）、エンテロペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．９）、アクロシン（ＥＣ３．４．２１．１０）、ａ−溶解エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１２）、グルタミル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１９）、カテプシンＧ（ＥＣ３．４．２１．２０）、血液凝固因子ＶＩｌａ（ＥＣ３．４．２１．２１）、血液凝固因子ＩＸａ（ＥＣ３．４．２１．２２）、ククミシン（ＥＣ３．４．２１．２５）、プロリル・オリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．２６）、血液凝固因子ＸＩａ（ＥＣ３．４．２１．２７）、ブラキウリン（ＥＣ３．４．２１．３２）、血漿カリクレイン（ＥＣ３．４．２１．３４）、組織カリクレイン（ＥＣ３．４．２１．３５）、膵エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３６）、白血球エラスターゼ（ＥＣ３．４．２１．３７）、血液凝固因子ＸＩＩａ（ＥＣ３．４．２１．３８）、キマーゼ（ＥＣ３．４．２１．３９）、補体サブコンポーネントＣ（ＥＣ３．４．２１．４１）、補体サブコンポーネントＣ（ＥＣ３．４．２１．４２）、古典的−補体−経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素（ＥＣ３．４．２１．４３）、補体因子Ｉ（ＥＣ３．４．２１．４５）、補体因子Ｄ（ＥＣ３．４．２１．４６）、代替−補体−経路Ｃ３／Ｃ５転換酵素（ＥＣ３．４．２１．４７）、セレビジン（ＥＣ３．４．２１．４８）、ヒポデルミンＣ（ＥＣ３．４．２１．４９）、リジル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．５０）、エンドペプチダーゼＬａ（ＥＣ３．４．２１．５３）、ｇ−レニン（ＥＣ３．４．２１．５４）、ベノンビンＡＢ（ＥＣ３．４．２１．５５）、ロイシル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．５７）、トリプターゼ（ＥＣ３．４．２１．５９）、スクテラリン（ＥＣ３．４．２１．６０）、ケキシン（ＥＣ３．４．２１．６１）、サブチリシン（ＥＣ３．４．２１．６２）、オリジン（ＥＣ３．４．２１．６３）、エンドペプチダーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）、サーモミコリン（ＥＣ３．４．２１．６５）、テルミターゼ（ＥＣ３．４．２１．６６）、エンドペプチダーゼＳｏ（ＥＣ３．４．２１．６７）、ｔ−プラスミノーゲンアクチベータ（ＥＣ３．４．２１．６８）、プロテインＣ（活性化）（ＥＣ３．４．２１．６９）、膵エンドペプチダーゼＥ（ＥＣ３．４．２１．７０）、膵エラスターゼＩＩ（ＥＣ３．４．２１．７１）、ＩｇＡ−特異的セリンエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．７２）、ｕ−プラスミノーゲンアクチベータ（ＥＣ３．４．２１．７３）、ベノンビンＡ（ＥＣ３．４．２１．７４）、フリン（ＥＣ３．４．２１．７５）、ミエロブラスチン（ＥＣ３．４．２１．７６）、セメノゲラーゼ（ＥＣ３．４．２１．７７）、グランザイムＡ（ＥＣ３．４．２１．７８）、グランザイムＢ（ＥＣ３．４．２１．７９）、ストレプトグリシンＡ（ＥＣ３．４．２１．８０）、ストレプトグリシンＢ（ＥＣ３．４．２１．８１）、グルタミル・エンドペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．２１．８２）、オリゴペプチダーゼＢ（ＥＣ３．４．２１．８３）、リムルス凝固因子（ＥＣ３．４．２１．８４）、リムルス凝固因子（ＥＣ３．４．２１．８５）、リムルス凝固酵素（ＥＣ３．４．２１．８６）、オムプチン（ＥＣ３．４．２１．８７）、リプレッサーＬｅｘＡ（ＥＣ３．４．２１．８８）、シグナル・ペプチダーゼＩ（ＥＣ３．４．２１．８９）、トガビリン（ＥＣ３．４．２１．９０）、フラビビリン（ＥＣ３．４．２１．９１）、エンドペプチダーゼＣＩｐ（ＥＣ３．４．２１．９２）、タンパク質変換酵素１（ＥＣ３．４．２１．９３）、プロタンパク質変換酵素２（ＥＣ３．４．２１．９４）、ヘビ毒因子Ｖアクチベータ（ＥＣ３．４．２１．９５）、ラクトセピン（ＥＣ３．４．２１．９６）、アセンブリン（ＥＣ３．４．２１．９７）、ヘパシビリン（ＥＣ３．４．２１．９８）、スペルモシン（ＥＣ３．４．２１．９９）、シュードモナリシン（ＥＣ３．４．２１．１００）、キサントモナリシン（ＥＣ３．４．２１．１０１）、Ｃ−末端プロセッシングペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２１．１０２）、フィサロリシン（ＥＣ３．４．２１．１０３）、マンナン結合レクチン関連セリンプロテアーゼ−２（ＥＣ３．４．２１．１０４）及びロンボイドプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２１．１０５）からなる群から選択される。
【００６９】
本発明に従って用いられる好ましいシステインエンドペプチダーゼは、カテプシンＢ （ＥＣ３．４．２２．１）、パパイン（ＥＣ３．４．２２．２）、フィカイン（ＥＣ３．４．２２．３）、キモパパイン（ＥＣ３．４．２２．６）、アスクレパイン（ＥＣ３．４．２２．７）、クロストリパイン（ＥＣ３．４．２２．８）、ストレプトパイン（ＥＣ３．４．２２．１０）、アクチン−イダイン（ＥＣ３．４．２２．１４）、カテプシンＬ（ＥＣ３．４．２２．１５）、カテプシンＨ（ＥＣ３．４．２２．１６）、カテプシンＴ（ＥＣ３．４．２２．２４）、グリシル・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．２５）、癌凝固促進剤（ＥＣ３．４．２２．２６）、カテプシンＳ（ＥＣ３．４．２２．２７）、ピコルナイン３Ｃ（ＥＣ３．４．２２．２８）、ピコルナイン２Ａ（ＥＣ３．４．２２．２９）、カリカイン（ＥＣ３．４．２２．３０）、アナナイン（ＥＣ３．４．２２．３１）、ステム・ブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３２）、フルーツ・ブロメライン（ＥＣ３．４．２２．３３）、レグマイン（ＥＣ３．４．２２．３４）、ヒストリサイン（ＥＣ ３．４．２２．３５）、カスパーゼ−１（ＥＣ３．４．２２．３６）、ギンギパインＲ（ＥＣ３．４．２２．３７）、カテプシンＫ（ＥＣ３．４．２２．３８）、アデナイン（ＥＣ３．４．２２．３９）、ブレオマイシン・ヒドラーゼ（ＥＣ３．４．２２．４０）、カテプシンＦ（ＥＣ３．４．２２．４１）、カテプシンＯ（ＥＣ３．４．２２．４２）、カテプシンＶ（ＥＣ３．４．２２．４３）、核封入−ａエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．４４）、ヘルパー成分プロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．４５）、Ｌ−ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．４６）、ギンギパインＫ（ＥＣ３．４．２２．４７）、スタホパイン（ＥＣ３．４．２２．４８）、セパラーゼ（ＥＣ３．４．２２．４９）、Ｖ−ｃａｔｈエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２２．５０）、クルジパイン（ＥＣ３．４．２２．５１）、カルパイン−１（ＥＣ３．４．２２．５２）及びカルパイン−２（ＥＣ３．４．２２．５３）からなる群から選択される。
【００７０】
本発明に従って用いられる好ましいアルパラギン酸エンドペプチダーゼは、ペプシンＡ（ＥＣ３．４．２３．１）、ペプシンＢ（ＥＣ３．４．２３．２）、ガストリクシン（ＥＣ３．４．２３．３）、キモシン（ＥＣ３．４．２３．４）、カテプシンＤ（ＥＣ３．４．２３．５）、ネペンテシン（ＥＣ３．４．２３．１２）、レニン（ＥＣ３．４．２３．１５）、ＨＩＶ−Ｉレトロペプシン（ＥＣ３．４．２３．１６）、Ｐｒｏ−オピオメラノコルチン変更酵素（ＥＣ３．４．２３．１７）、アスペルギロペプシンＩ（ＥＣ３．４．２３．１８）、アスペルギロペプシンＩＩ（ＥＣ３．４．２３．１９）、ペニシロペプシン（ＥＣ３．４．２３．２０）、リゾプスペプシン（ＥＣ３．４．２３．２１）、エンドチアペプシン（ＥＣ３．４．２３．２２）、ムコルペプシン（ＥＣ３．４．２３．２３）、カンジダペプシン（ＥＣ３．４．２３．２４）、サッカロペプシン（ＥＣ３．４．２３．２５）、ロドトルラペプシン（ＥＣ３．４．２３．２６）、アクロシリンドペプシン（ＥＣ３．４．２３．２８）、ポリポロペプシン（ＥＣ３．４．２３．２９）、ピクノポロペプシン（ＥＣ３．４．２３．３０）、スキタリドペプシンＡ（ＥＣ３．４．２３．３１）、スキタリドペプシンＢ（ＥＣ３．４．２３．３２）、カテプシンＥ（ＥＣ３．４．２３．３４）、バリエルペプシン（ＥＣ３．４．２３．３５）、シグナル・ペプチダーゼＩＩ（ＥＣ３．４．２３．３６）、プラスメプシンＩ（ＥＣ３．４．２３．３８）、プラスメプシンＩＩ（ＥＣ３．４．２３．３９）、フィテプシン（ＥＣ３．４．２３．４０）、ヤプシン１（ＥＣ３．４．２３．４１）、テェロモプシン（ＥＣ３．４．２３．４２）、プレピリンペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３．４３）、ノダウイルス・エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２３．４４）、メマプシン１（ＥＣ３．４．２３．４５）、メマプシン２（ＥＣ３．４．２３．４６）、ＨＩＶ−２レトロペプシン（ＥＣ３．４．２３．４７）及びプラスミノーゲンアクチベータＰＩａ（ＥＣ３．４．２３．４８）からなる群から選択される。
【００７１】
本発明に従って用いられる好ましいメタロエンドペプチダーゼは、アトロリシンＡ（ＥＣ３．４．２４．１）、微生物コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３）、ロイコリジン（ＥＣ３．４．２４．６）、間質コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．７）、ネプリリジン（ＥＣ３．４．２４．１１）、エンベリジン（ＥＣ３．４．２４．１２）、ＩｇＡ特異的メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１３）、プロコラーゲンＮ−エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１４）、チメットオリゴペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１５）、ニューロリジン（ＥＣ３．４．２４．１６）、ストロメリジン１（ＥＣ３．４．２４．１７）、メプリンＡ（ＥＣ３．４．２４．１８）、プロコラーゲンＣ−エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．１９）、ペプチジル−Ｌｙｓメタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．２０）、アスタシン（ＥＣ３．４．２４．２１）、ストロメリジン２（ＥＣ３．４．２４．２２）、マトリリジン（ＥＣ３．４．２４．２３）、ゼラチナーゼＡ（ＥＣ３．４．２４．２４）、ビブリオリジン（ＥＣ３．４．２４．２５）、シュードリジン（ＥＣ３．４．２４．２６）、テルモリジン（ＥＣ３．４．２４．２７）、バチロリジン（ＥＣ３．４．２４．２８）、アウレオリジン（ＥＣ３．４．２４．２９）、コッコロリジン（ＥＣ３．４．２４．３０）、ミコリジン（ＥＣ３．４．２４．３１）、ｂ−溶解メタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．３２）、ペプチジル−Ａｓｐメタロエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．３３）、好中球コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．３４）、ゲラチナーゼＢ（ＥＣ３．４．２４．３５）、レイシュマノリジン（ＥＣ３．４．２４．３６）、サッカロリジン（ＥＣ３．４．２４．３７）、ガメトリジン（ＥＣ３．４．２４．３８）、デューテロリジン（ＥＣ３．４．２４．３９）、セルラリジン（ＥＣ３．４．２４．４０）、アトロリジンＢ（ＥＣ３．４．２４．４１）、アトロリジンＣ（ＥＣ３．４．２４．４２）、アトロキサーゼ（ＥＣ３．４．２４．４３）、アトロリジンＥ（ＥＣ３．４．２４．４４）、アトロリジンＦ（ＥＣ３．４．２４．４５）、アダマリジン（ＥＣ３．４．２４．４６）、ホルリリジン（ＥＣ３．４．２４．４７）、ルベルリジン（ＥＣ３．４．２４．４８）、ボトロパシン（ＥＣ３．４．２４．４９）、ボトロパシン（ＥＣ３．４．２４．５０）、オフィオリジン（ＥＣ３．４．２４．５１）、トリメレリジンＩ（ＥＣ３．４．２４．５２）、トリメレリジンＩＩ（ＥＣ３．４．２４．５３）、ムクロリジン（ＥＣ３．４．２４．５４）、ピトリリジン（ＥＣ３．４．２４．５５）、インスリジン（ＥＣ３．４．２４．５６）、Ｏ−シアロ糖タンパク質エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．５７）、ルッセルリジン（ＥＣ３．４．２４．５８）、ミトコンドリア中間ペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．５９）、ダクチリジン（ＥＣ３．４．２４．６０）、ナルジリジン（ＥＣ３．４．２４．６１）、マグノリジン（ＥＣ３．４．２４．６２）、メプリンＢ（ＥＣ３．４．２４．６３）、ミトコンドリアプロセッシングペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．６４）、マクロファージエラスターゼ（ＥＣ３．４．２４．６５）、コリオリジンＬ（ＥＣ３．４．２４．６６）、コリオリジンＨ（ＥＣ３．４．２４．６７）、テントキシリジン（ＥＣ３．４．２４．６８）、ボントキシリジン（ＥＣ３．４．２４．６９）、オリゴペプチダーゼＡ（ＥＣ３．４．２４．７０）、エンドセリン変換酵素（ＥＣ３．４．２４．７１）、フィブロラーゼ（ＥＣ３．４．２４．７２）、ジャラハギン（ＥＣ３．４．２４．７３）、フラギリジン（ＥＣ３．４．２４．７４）、リソスタフィン（ＥＣ３．４．２４．７５）、フラバスタシン（ＥＣ３．４．２４．７６）、スナパリジン（ＥＣ３．４．２４．７７）、ｇｐｒエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．７８）、パッパラリジン−１（ＥＣ３．４．２４．７９）、膜型マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＥＣ３．４．２４．８０），ＡＤＡＭｌＯエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８１）、ＡＤＡＭＴＳ−４エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８２）、炭疽菌致死因子エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８３）、Ｓｔｅ２４エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８４）、Ｓ２Ｐエンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８５）及びＡＤＡＭ１７エンドペプチダーゼ（ＥＣ３．４．２４．８６）からなる群から選択される。
【００７２】
本発明に従って用いられる好ましいスレオニンエンドペプチダーゼは、プロテアソーム・エンドペプチダーゼ複合体（ＥＣ３．５．２５．１）である。
【００７３】
ＣＫ−１８又はその断片の分解に対する特に好ましいプロテアソームは、カリクレイン８である（Ｓａｎｔｉｎ Ａ．Ｄ．ｅｔ ａｌ（２００４），Ｇａｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．９４：２８３−２８８を参照されたい）。より具体的には、カリクレイン７及び８並びに肥満細胞キマーゼは、本発明に従って用いられるべき好ましいプロテアーゼである。
【００７４】
本発明の好ましい態様に従って、薬剤は、さらに、ワルファリン、アセチルサリチル酸、チクロピジン、ヘパリン、組織プラスミノーゲン因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、及び／又はウロキナーゼを含む。
【００７５】
本発明は、下記の図面及び実施例に例証されるが、それらに限定されない。
【実施例】
【００７６】
本実施例では、ＡＭＩにおける炎症及びアポトーシス特異的な活性経路と関連することが知られているタンパク質の発現を調査した。ＡＭＩを患っている患者における冠状動脈系で得られた血漿中の該タンパク質の濃度を測定し、全身の血液レベルと比較した。ＵＡ及び安定狭心症（ＳＡ）と診断された患者は、非無作為的比較試験において対照として使用した。さらに、インビボで得られた急性冠状動脈血栓を免疫組織化学によって分析した。結果は、ＳＡ及びＵＡと比べると、ＡＭＩにおけるアポトーシス特異的なＩＣＥ及びカスパーゼ依存性開裂産物ＣＫ−１８の濃度増加を証明している。
【００７７】
全身性炎症及びアポトーシス特異的活性化は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）を含む急性冠状動脈症候群（ＡＣＳ）において主要な役割を果たす。血栓切除デバイスは、臨床領域に最近導入され、ＡＭＩ開始の冠状動脈内の血栓性物質の除去を可能にした。この技術は、独特の可能性を提供し、炎症及びアポトーシス特異的タンパク質を比較するために、閉塞した冠状動脈及び大腿動脈で血液及び血栓を回収する。安定狭心症（ＳＡ）及び不安定狭心症（ＵＡ）を有する患者は、対照群として採用された。
【００７８】
患者及び臨床的特徴
緊急性冠状動脈血管造影を受けている４０人の一貫した患者が試験に含まれ、下記の基準を満たす場合：１）冠状動脈の血管造影時における胸痛、２）２以上の胸部誘導における≧２ｍｍの新規ＳＴ部分の上昇、又は冠状動脈血管造影の２０分以内に観察される１を超える水平面誘導における≧１ｍｍの新規ＳＴ部分の上昇、３）Ｘ−サイザー血栓切除に適した冠状動脈構造（ａｎａｔｏｍｙ）、４）血栓治療なし、５）血栓切除の成功を指示するＸ−サイザーフィルター及びボトル単位における視認できる血栓材料、及び６）同意書。Ｘ−サイザー使用のための基準は、脈管径≧３ｍｍ、各小孔の５０ｍｍ以内の血栓と思わせる大きな内径コントラスト欠陥であり、血管造影ガイドワイヤーの通過後のＴＩＭＩ０−１フローを有し、重大な血管のねじれ、硬化又は困難な血管アクセスはなかった。
【００７９】
さらに、狭心症胸痛の評価のための施設に収容された８０人の一貫した患者は、冠状動脈血管造影を受け、対照として採用された。ＳＡ（ｎ＝４０）は、休息、ニトログリセリン投与又はそれらの両方によって軽減した典型的な労作時胸痛狭心症によって定義され、運動ＥＣＧストレス試験に対するポジティブな応答、カテーテル化での≧１の冠状動脈内の≧５０％の直径の狭窄があった。ＵＡを有する患者（ｎ＝４０）は、Ｂｒａｕｎｗａｌｄの基準に従って定義された。ＵＡのＩＩＩＢ類を有する２４人全ての患者は、診断的ＳＴ部分変化、Ｔ波倒置又はそれらの両方を有していた。この試験に含まれる患者は、臨床履歴によって定義されるように、進行中の全身又は心臓の炎症プロセスの証拠を有していなかった。表１は、人口学的及び基準臨床的特性を概説する。
【００８０】
【表１】
【００８１】
試料の回収及び処理
患者は、活性化した凝集時間≧３００秒と２５０ｍｇのアスピリンでヘパリン化された。全血液試料は、大腿動脈からクエン酸塩−バキュテイイナー（ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ）に回収され、即座に遠心分離（１３００×ｇ、４℃、１０分）、内部対照として、閉塞した冠状動脈から直接得た血液試料を用いた。血小板が少ない血漿をアッセイまで−８０℃で凍結した。Ｘ−サイザー血栓切除カテーテルシステム（ＥｎｄｉＣＯＲ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｃ）は、手持ちコントロールモジュールに連結した二重内腔カテーテルシャフトからなる。内側の内腔は、外側の内腔を介した吸引に加えて、血栓上で吸引増加を有する約２，１００ｒｐｍで回転するらせんカッターを含む（図１を参照されたい）。
【００８２】
真空ガラスボトルの数センチ前で、血栓物質及びプラーク粒子が捕捉される小さなフィルターユニットに吸引物を通過させ、血液は、ヘパリン化したガラスボトルに吸引される。血液をクエン酸塩−バキュテイナーに即座に移し、上述したように遠心分離した。フィルターユニットに捕捉された血栓材料は、７．５％の緩衝化したホルマリン中で一晩固定し、パラフィンに包埋し、連続的な３μｍのマイクロトーム切片を行った。上述したように、真空内腔によって吸収された血液をクエン酸バキュテイナー及び血液凝固剤に即座に移した。試料を−８０℃で即座に凍結した。
【００８３】
可溶性ＩＬ−１βｐ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ４０、及びＣＤ４０Ｌの定量化
ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ａｕｓｔｒｉａ）及びＭＢＬ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（ＵＳＡ）から購入したＥＬＩＳＡによってタンパク質濃度を測定した。ＴＮＦ−αレベルは、高感度ＥＬＩＳＡ（ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、Ａｕｓｔｒｉａ）によって検出した。製造業者の指示書に従ってアッセイを行った。簡潔に言うと、プレートは、供給された被覆用抗体で前被覆又は被覆され、シールされ、一晩４℃でインキュベートされた。プレートを洗浄（０．５ｍＬ Ｔｗｅｅｎ ２０及び１Ｌ ＰＢＳ）し、アッセイバッファー（５ｇ；ＢＳＡ；０．５ｍｌ Ｔｗｅｅｎ ２０及び１Ｌ ＰＢＳ）で２時間室温でブロックした。次に、再度洗浄し、ビオチン結合体を各ウェルに添加した。さらに、プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／結合体とともにインキュベートした。１時間の処理及び追加の洗浄工程後、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＩ，ＵＳＡ）を添加した。発色が見られたとき、１Ｎ硫酸で反応を停止させた。プレートをＷａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター１４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，ＵＳＡ）上で４５０ｎｍで読み込んだ。
【００８４】
可溶性ＩＣＥの定量化
ＢｅｎｄｅｒＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ（Ａｕｓｔｒｉａ）から提供される市販のＥＬＩＳＡを用いて、ＩＣＥを測定した。ＩＣＥ ＥＬＩＳＡは、ｐ４５前駆体及び酵素的に活性なｐ１０：ｐ２０複合体の両方を検出する。ＩＣＥとその前駆体基質との間の相互作用は、細胞内で専ら起こる。試料及び標準を提供されたアッセイ希釈剤で希釈した。プレートを２時間インキュベートし、３回洗浄した。二次抗体を有する別のインキュベーション及び洗浄工程後、ＨＲＰ結合した検出抗体を添加した。回転セット上でプレートお３０分間インキュベートした。次に、それらを空にし、洗浄後、ＴＭＢ基質溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。着色反応を１Ｎ硫酸で停止させ、波長４５０ｎｍでＷａｌｌａｃ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌカウンター１４２０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）上で測定した。
【００８５】
サイトケラチン−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープの定量化
循環ＣＫ−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープは、ＰＥＶＩＶＡ ＡＢ（Ｂｒｏｍｍａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入したＥＬＩＳＡによって測定した。このＥＬＩＳＡは、捕捉体としてＣＫ−１８の２３８−３９６断片上のエピトープを認識するモノクローナル抗体、及び検出体としてＨＲＰ結合Ｍ３０を使用する。Ｍ３０抗原レベルは、ユニット／Ｌで表される。１ユニットは、製造業者に従って、Ｍ３０認識モチーフを含む合成されたペプチドの１．２４ｐｍｏｌに対応する。ＥＬＩＳＡの感度は３０Ｕ／Ｌである。アッセイ内及びアッセイ間のＣＫ−１８ ＥＬＩＳＡの変動係数は、それぞれ０．７〜５．８％及び２．８〜４．８％であった。各試料のタンパク質量は、ＣＫ−１８ネオエピトープＭ３０の既知レベルに対して構築した光学密度の標準曲線に従って計算した。（Ｌｅｅｒｓ ＭＰ， Ｋｏｌｇｅｎ Ｗ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９９；１８７（５）：５６７−７２）
【００８６】
免疫組織化学
アポトーシスの検出に関して、Ｍ３０−ネオ−エピトープ２５に対するモノクローナルマウス抗体を用いた。ＡＭＩを有する患者からの新鮮な血栓を７．５％の緩衝化したホルマリン中で固定し、腹ファインに包埋した。連続的な３μｍ切片をヘマトキシリン及び酸性フクシンオレンジＧ（トリクローム染色）で染色した。免疫染色に関して、クエン酸塩緩衝液中でのマイクロ波（２×５分、６００Ｗ）の前処理を適用した。非特異的な染色を避けるために、試料を５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ／トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ））で３０分間処理した。その後、スライドを一次抗体（１：５０、抗Ｍ３０抗体、Ｒｏｃｈｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で一晩室温でインキュベートした。これは、ビオチン標識したマウス抗体（１：１００、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｌｉｎｇａｍ，ＣＡ，ＵＳＡ）で１時間インキュベートし、アルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン−ＡＰ／１０％ヒト血清（１：１００、Ｄａｋｏ、Ｄｅｎｍａｒｋ）によって検出した。視覚化は、ファーストレッド（Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）で達成した。ネガティブ対照については、一次抗体は、無関係なマウスＩｇＧによって置き換えた。
【００８７】
統計分析
結果は、他に言及がなければ、平均±ＳＥＭとして提示される。相対的に小さな試料サイズにより、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ試験は、有意差を計算するために用いた。ｐ値０．０５は、有意であると考えられた。
【００８８】
結果
患者の人口学的特徴及びいくつかの基準の特徴を表１に示す。SA及びUS試験群では、同様の数の患者が心筋梗塞または従来の冠状動脈インターベンション（冠動脈バイパス移植術及び経皮経管冠動脈形成術）の病歴を有する。冠状動脈疾患のための確立した危険因子及び血管造影所見は、両グループともに同じであった。
【００８９】
ＡＭＩ群は４０人の患者を含み、男性が２８人（７０％）、女性が１２人（３０％）であった。平均年齢は、５９．３歳であった。３０％の患者は、ＰＣＩ又はバイパス外科処置によって以前に血管再開通術治療を受けた。糖尿病である本試験の９人（２２．５％）の患者、２５人（６２．５％）の高血圧患者、及び２１人（５２．５％）が現在喫煙者であった。コレステロールの平均レベルは、２０６．３ｍｇ／ｄＬ（ＵＬＮ＝１９９ｍｇ／ｍＬ）であり、トリグリセリドは、２０４．６ｍｇ／ｄＬ（ＵＬＮ＝１７２ｍｇ／ｄＬ）であった。Ｃ反応性タンパク質の平均レベルは、全身性炎症プロセスを指示する３．６ｍｇ／ｄＬ（ＵＬＮ＝１ｍｇ／ｄＬ）であった。１９人（４７．５％）が２つ又は３つの血管疾患を受けた。唯一１人の患者では、左主幹動脈が関係した。半分を超える患者（５２．５％）は、心エコー検査によって特定された左心室機能の減少を示した。
【００９０】
炎症及びアポトーシス特異的タンパク質
全身性炎症応答症候群がＳＡ及びＵＡと比較してＡＭＩ部位で模倣されるかどうかを調査するために、血漿試料をＸ−サイザーによって得て、評価した。血漿試料は、内部対象として使用されるＡＭＩを患っている患者における大腿動脈から得た。炎症性サイトカインの誘導体（ＩＬ−１βｐ、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−Ｒ１、ｓＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌ）及びそれらの有意性を表２に示した。
【００９１】
【表２】
【００９２】
可溶性ＩＣＥ及びＣＫ−１８
図１に示されるように、可溶性ＩＣＥの平均血漿レベルは、ＳＡでは６８．６±２０．２、ＵＡでは８１．５±２４．３、ＡＭＩ大腿（周囲）では９６±２７．１、及びＡＭＩ冠状動脈試料では２８２．２±１８０であった。このデータは、全身の血液レベルならびにＳＡ及びＵＡと比較して、心筋梗塞の部位から誘導された試料におけるＩＣＥ濃度の有意な増加を証明する（ＳＡ対ＵＡ ｐ＝０．０２３、ＵＡ対ＡＭＩ周辺 ｐ＝０．０２２、及びＡＭＩ周囲対ＡＭＩ冠状動脈 ｐ＜０．００１）。
【００９３】
図２に示した結果は、周囲と比較して、心筋梗塞の部位から誘導した血漿のＣＫ−１８−Ｍ３０ネオエピトープの濃度における顕著な増加を示す（４１１±１５．３対３３６．８±９．９、ｐ＝０．００１）。さらに有意な差は、ＡＭＩ周囲及びＵＡ（３３６．８±９．９対２５５±５、ｐ＜０．００１）、並びにＵＡ及びＳＡ（２５５．５±８．９対２３２．４±４．９、ｐ＝０．０２７）の間で見られた。
【００９４】
心筋梗塞を引き起こす血栓におけるＣＫ−１８の検出
血栓切除デバイスによって回収した血栓を免疫組織化学並びに日常的なヘマトキシリン−エオシン（ＨＥ）及び酸性フクシンオレンジＧ染色に供した。図３（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）は、急性心筋虚血を引き起こす代表的な血栓（ｎ＝８）を示す。パネル（Ａ）は、ＨＥ染色を示し、更なる免疫組織化学において、フィブリンだけでなく有意な量のマイクロフィラメントＣＫ−１８からなることが特定された淡色領域を含む。さらに、分散した白血球及び赤血球を観察することができる。血栓の中心部分における免疫組織染色により、ＣＫ−１８陽性領域を検出することができ（パネルＣ）、フィブリン沈殿に富んだ領域と主に対応している（酸性フクシンオレンジＧ染色、パネルＢを参照されたい）。パネルＤは、Ｍ３０に対する非特異的な対照染色を示す。末梢血軟膜を内部対照として使用した。
【００９５】
検討
本実施例は、カスパーゼファミリーのメンバーであるＩＣＥが、ＳＡと比較して、ＡＭＩを患っている患者における急性冠状血栓症の部位で顕著に増加し、その周囲及びＵＡではほんの中程度であることを示す。興味深いことに、ＡＭＩの患者では、この所見は、特異的なカスパーゼ活性の産物である全身性マイクロフィラメントＣＫ−１８の含有量の増加と関連する。
【００９６】
触媒残基として使用されるＣｙｓ２８５を有するプロテアーゼであるＩＣＥ／カスパーゼ−１は、Ａｓｐ１１６−Ａｌａ１１７で３１ｋＤａの生物学的に不活性なＩＬ−１β前駆体を開裂し、ＩＬ−１βから１７．５ｋＤＡの成熟形態を生じさせる（ＢｏｍｂｅｌｉＴ，Ｋａｒｓａｎ Ａ，Ｔａｉｔ ＪＦ，Ｈａｒｌａｎ ＪＭ．，Ｂｌｏｏｄ １９９７；８９（７）：２４２９−４２）（Ｋｏｓｔｕｒａ ＭＪ，Ｔｏｃｃｉ ＭＪ，Ｌｉｍｊｕｃｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８９；８６（１４）：５２２７−３１）。活性酵素は、２つの同一でないサブユニット（ｐ１０及びｐ２０）からなり、それらはともに酵素活性に本質的であり、したがって、心筋細胞を含む種々の細胞のアポトーシスにおいて極めて重要な役割を果たす。心臓肥大におけるＩＣＥの発現増加、心筋ミオパシーにおけるＴＮＦ−αの過剰産生（Ｋｕｂｏｔａ Ｔ，Ｍｉｙａｇｉｓｈｉｍａ Ｍ，Ｆｒｙｅ ＣＳ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００１；３３（７）：１３３１−４４）、及び内毒素誘導の心筋機能障害（Ｆａｕｖｅｌ Ｈ，Ｍａｒｃｈｅｔｔｉ Ｐ，Ｃｈｏｐｉｎ Ｃ，Ｆｏｒｍｓｔｅｃｈｅｒ Ｐ，Ｎｅｖｉｅｒｅ Ｒ．，Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２００１；２８０（４）：Ｈ１６０８−１４）は、ＡＭＩ部位で可溶性ＩＣＥの存在の評価を促進した。ＡＭＩ部位で平均４．１倍のＩＣＥ増加は、ＵＡと比較して観察された。内毒素又は低酸素ストレスの条件下で、カスパーゼ１は、これらの生理的ストレスとともに相乗的に作用し、カスパーゼ−３を介してアポトーシスを誘導することができる。虚血及び再潅流損傷の実験的モデルでは、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト遺伝子トランスフェクションは、梗塞面積を減らすことが示された（Ｆｒａｎｔｚ Ｓ，Ｄｕｃｈａｒｍｅ Ａ，Ｓａｗｙｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００３；３５（６）：６８５−９４．）、ＩＣＥの心筋レベルの増加は、ストレス条件下でアポトーシス性心筋損傷にかかり易くする場合がある（Ｓｙｅｄ ＦＭ，Ｈａｈｎ ＨＳ，Ｏｄｌｅｙ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ ２００５；９６（１０）：１１０３−９）。
【００９７】
中間径フィラメントの主要コンポーネントであるサイトケラチン１８は、内皮組織及び線維芽細胞と非内皮細胞で少量幅広く発現される（Ｓｃｈａａｆｓｍａ ＨＥ，Ｒａｍａｅｋｅｒｓ ＦＣ，Ｐａｔｈｏｌ Ａｎｎｕ １９９４；２９ Ｐｔ １：２１−６２）。アポトーシス性細胞では、サイトケラチン１８はリン酸化され、主要部位はセリン５３であり、マイクロフィラメントは急速に凝集する（Ｋｕ ＮＯ，Ｌｉａｏ Ｊ，Ｏｍａｒｙ ＭＢ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２（５２）：３３１９７−２０３）（Ｃａｕｌｉｎ Ｃ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ ＧＳ，Ｏｓｈｉｍａ ＲＧ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；１３８（６）：１３７９−９４）。熱ショックストレス及びウイルス感染などの種々のストレス条件は、マイクロフィラメント認識及び可溶性、並びに改変された重合を増加する場合がある（Ｋｕ ＮＯ，Ｌｉａｏ Ｊ，Ｏｍａｒｙ ＭＢ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９７；２７２（５２）：３３１９７−２０３．）（Ｓｃｈｕｔｔｅ Ｂ，Ｈｅｎｆｌｉｎｇ Ｍ，Ｋｏｌｇｅｎ Ｗ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２００４；２９７（１）：１１−２６）。リン酸化ＣＫ−１８は、タンパク質分解に対する優先的な基質である。アポトーシス中のＣＫ−１８のカスパーゼ媒介開裂（Ｃａｕｌｉｎ Ｃ，Ｓａｌｖｅｓｅｎ ＧＳ，Ｏｓｈｉｍａ ＲＧ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９７；１３８（６）：１３７９−９４）は、抗体Ｍ３０に認識される特異的ネオ−エピトープの形成をもたらす（Ｌｅｅｒｓ ＭＰ，Ｋｏｌｇｅｎ Ｗ，Ｂｊｏｒｋｌｕｎｄ Ｖ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １９９９；１８７（５）：５６７−７２）（Ｋａｄｙｒｏｖ Ｍ，Ｋａｕｆｍａｎｎ Ｐ，Ｈｕｐｐｅｒｔｚ Ｂ．，Ｐｌａｃｅｎｔａ ２００１；２２（１）：４４−８）。興味深いことに、ＣＫ−１８、ネオ−エピトープＭ３０濃度の顕著な増加は、心筋梗塞の部位から直接得られる血漿において測定される。さらに、ＣＫ−１８の含有量の増加は、血栓切除デバイスがＣＫ−１８について陽性に染色されたＡＭＩにおける血栓を得たという本発明者らの見解によって確認された。血栓のこの新規な特徴は、何故、フィブリン溶解を目的とする静脈内血栓溶解療法が、ＡＭＩを患っている≧５０％の患者において初期の完全な冠血量を不完全にのみ回復するのかという更なる説明として用いられてもよい（Ｖａｌｇｉｍｉｇｌｉ Ｍ，Ｍｅｒｌｉ Ｅ，Ｍａｌａｇｕｔｔｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ２００３；４２０（２）：２５５−６１．）（Ｔｏｐｏｌ ＥＪ．Ｔｏｗａｒｄ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９８；９７（２）：２１１−８）（Ｒｅｎｔｒｏｐ ＫＰ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０００；１０１（１３）：１６１９−２６）。
【００９８】
ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４は、血管内皮細胞、マクロファージ、Ｔリンパ球、平滑筋細胞、及び血小板などの崩壊したアテロームと関連した様々な活性化細胞によって発現した膜貫通血具タンパク質である（Ｍａｃｈ Ｆ，Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ Ｕ，Ｓｕｋｈｏｖａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４（５）：１９３１−６）。この炎症性仲介因子は、細胞膜から開裂し、ｓＣＤ４０Ｌを形成することができ、これは、その生物学的特性を維持し、ＣＤ４０と相互作用し、種々の炎症応答を開始する（Ｍａｃｈ Ｆ，Ｓｃｈｏｎｂｅｃｋ Ｕ，Ｓｕｋｈｏｖａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４（５）：１９３１−６）（Ａｕｋｒｕｓｔ Ｐ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｆ，Ｕｅｌａｎｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９／１００（６）：６１４−２０）。ｓＣＤ４０Ｌのレベル増加は、従来、ＵＡを有する患者（Ａｕｋｒｕｓｔ Ｐ，Ｍｕｌｌｅｒ Ｆ，Ｕｅｌａｎｄ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９９；１００（６）：６１４−２０）、及び心筋梗塞の患者において見られた。（Ｏｈａｓｈｉ Ｙ，Ｋａｗａｓｈｉｍａ Ｓ，Ｍｏｒｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｒｄｉｏｌ ２００５）。これらの見解に沿って、本結果は、ＳＡと比較して、急性心筋梗塞の部位でｓＣＤ４０Ｌの有意な増加を証明した。
【００９９】
従来、内皮損傷がＡＭＩ及びＵＡにおける一体部分であり（Ｍｕｔｉｎ Ｍ，Ｃａｎａｖｙ Ｉ，Ｂｌａｎｎ Ａ，Ｂｏｒｙ Ｍ，Ｓａｍｐｏｌ Ｊ，Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ Ｆ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３（９）：２９５１−８）、ＵＡの患者由来の血清が、ＳＡの患者由来の血清と比較して、ヒト臍静脈内皮細胞上でプロアポトーシス的である（Ｖａｌｇｉｍｉｇｌｉ Ｍ，Ａｇｎｏｌｅｔｔｉ Ｌ，Ｃｕｒｅｌｌｏ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００３；１０７（２）：２６４−７０）ことが示されている。さらに、後者の血清は、１年のフォローアップで再調査された場合、安定な病巣を有する患者とはもはや相違しないことが観察され、血清のアポトーシス活性の増加が一時的にＵＡの結びつくことを示唆した。
【０１００】
アテローム斑内の局所的、及び循環内の全身的な炎症プロセスは、冠状動脈性心臓病の病因における確立した特徴である（Ｂｒａｕｎｗａｌｄ Ｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９８９；８０（２）：４１０−４）。アテローム性動脈硬化症を覆う内皮のアポトーシスが粥腫崩壊をもたらす場合があり、アポトーシスを受けている細胞によって組織因子を積層した膜の微粒子の放出が血液凝固カスケードを直接的に開始することが示唆されている。心筋梗塞における急性血栓切除の技術は、急性事象の際に発端となっている冠状動脈の外へ直接的に血液試料を回収するという独自の可能性を提供し、全身血液と比較される。このデータは、特に局所的に増大したアポトーシスとの相互作用における免疫学的プロセスの全身活性がＡＭＩにおける主要なメカニズムであることを示唆する。
【０１０１】
本実施例は、ＡＭＩを患っている患者の末梢血と皮悪して、急性冠状血栓症の部位で増加した炎症性／アポトーシス特異的タンパク質に関して報告している最初のものである。従来の試験から、ＡＭＩが局所的に炎症したプラーク、続くプラーク崩壊及びその後の血栓性血管閉塞及び全身性炎症の結果であることが知られている（Ｍｕｔｉｎ Ｍ，Ｃａｎａｖｙ Ｉ，Ｂｌａｎｎ Ａ，Ｂｏｒｙ Ｍ，Ｓａｍｐｏｌ Ｊ，Ｄｉｇｎａｔ−Ｇｅｏｒｇｅ Ｆ．，Ｂｌｏｏｄ １９９９；９３（９）：２９５１−８）。ＢＡＸ、ＣＡＳＰ１、ＦＡＳ、ｐ５３又はＰＣＮＡのようなプロアポトーシス遺伝子の発現は、方向性冠動脈粥腫切除術由来のＡＣＳプラークにおいて有意に高く、ＭＤＭ２などの抗アポトーシス抗体は、ＳＡを有すると診断された患者由来のプラークにおいてより発現された（Ｒｏｓｓｉ ＭＬ，Ｍａｒｚｉｌｉａｎｏ Ｎ，Ｍｅｒｌｉｎｉ ＰＡ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１１０（１３）：１７６７−７３）。全身性炎症性プロセスは、とりわけ、単球浸潤、好中球誘引及びＣＤ４＋ＣＤ２８−細胞を不安定課するプラークの拡大を含む（Ｚａｌ Ｂ，Ｋａｓｋｉ ＪＣ，Ａｒｎｏ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４；１０９（１０）：１２３０−５）。これらの観察は、細胞ホメオスタシス及び修復を受けているメカニズムはＳＡにおいて活性であり、より均衡を保つことを指示し、不安定なプラークは、プロアポトーシス遺伝子の活性化に起因する不均衡なプログラム細胞死によって特徴付けることができる。さらに、抗６０ｋＤａ熱ショックタンパク質、コレステロール、肺炎クラミジア、及びＣＫ−１８に指向される抗体（Ｗｉｌｌｓｅｒｏｎ ＪＴ．Ｐｒｏｇ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｄｉｓ ２００２；４４（６）：５６９−７８は虚血性心疾患と関連することが報告されている。
【０１０２】
ＣＤ４０Ｌに加えて、ＩＣＥ及びＣＫ−１８又はその断片のレベル増加は、臨床的な不安程度と関連し、したがって、急性冠状動脈症候群の特徴として考えられ得る。このインビボで得られた情報は、心筋細胞アポトーシス及び心筋梗塞拡張の予防におけるカスパーゼ阻害剤の薬理学的な使用を含む試行に言い換えられる（Ｙａｏｉｔａ Ｈ，Ｏｇａｗａ Ｋ，Ｍａｅｈａｒａ Ｋ，Ｍａｒｕｙａｍａ Ｙ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １９９８；９７（３）：２７６−８１）。ＡＭＩにおけるＣＫ−１８又はその断片を標的とする新規治療が必要とされる。
【０１０３】
要約すると、Ｘ−サイザー血栓切除デバイスは、ＡＭＩを患っている患者（ｎ＝４０）において利用された。ＵＡ（ｎ＝４０）及びＳＡ（ｎ＝４０）は、対照群として含められた。炎症性及びアポトーシス特異的なタンパク質であるＩＬ−１β（ＩＬ−１βｐ）、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、インターロイキン−１β変換酵素／ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、ＥＬＩＳＡによって測定された。免疫組織化学は、ＡＭＩを患っている患者から得られた冠状動脈血栓においてＣＫ−１８の存在を評価するために利用された。比較群は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって評価された。
【０１０４】
可溶性ＩＬ−１βｐ、ＩＣＥ及びＣＫ−１８（又はその断片）は、ＳＡとＵＡとの間の新規な識別因子であることが特定された（それぞれ、ｐ＝０．０３４、ｐ＝０．０２３、Ｐ＝０．０２７）。興味深いことに、可溶性ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、全身血液と比較して、心筋梗塞部位で有意に増加し（ともにｐ＝０．００１）、心筋梗塞の急性事象における新規な特徴的役割を指示する。
【０１０５】
この観察は、ＣＫ−１８を同定可能な抗体であるＭ３０が心筋梗塞を引き起こす冠状動脈血栓において陽性に染色したという知見によって確認された。
【０１０６】
急性心筋梗塞は、インビボでの全身性ＩＣＥ及びＣＫ−１８レベルの増加と関連している。
【０１０７】
血栓切除の利用は、炎症及びアポトーシス特異的タンパク質を比較するために、閉塞した冠状動脈、付随して大腿動脈で血液及び血栓及び血漿を回収するという独特の可能性を提供する冠状動脈内血栓材料の除去を可能にする。安定狭心症及び不安定狭心症の患者は、対照として使用した（全ての群、ｎ＝４０）。グループ比較は、Ｍａｎｎ Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定によって評価された。
【０１０８】
炎症及びアポトーシス特異的タンパク質であるＩＬ−１βｐ、ＩＬ−１β、ｈｓ−ＴＮＦα、ＴＮ−Ｒ１、ＣＤ４０、ＣＤ−４０Ｌ、インターロイキン−１β−変換酵素／ＩＣＥ及びＣＫ−１８をＥＬＩＳＡによって測定した。免疫組織化学は、急性心筋梗塞を患っている患者から得られた冠状動脈血栓においてＣＫ−１８の存在を評価するために利用された。
【０１０９】
新規な情報は、次に関連する：可溶性ＩＬ−１βｐ、ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、安定狭心症と不安定狭心症との間の新規な識別因子であると特定された（それぞれ、ｐ＝０．０３４、ｐ＝０．０２３、ｐ＝０．０２７）。
【０１１０】
興味深いことに、ＩＬ−１β、ｈｓ−ＴＮＦα、ＴＮＦ−Ｒ１、ＣＤ４０及びＣＤ４０Ｌは、グループ不安定対安定狭心症集団においていかなる有意差もなかった。しかしながら、本実施例で測定されたＣＤ４０Ｌ濃度は、関連文献で測定された平均値に匹敵するということは述べておくべきである。
【０１１１】
興味深いことに、ＩＣＥ及びＣＫ−１８は、急性心筋梗塞を湯酢売る患者において全身血液と比較して、心筋梗塞の部位で有意に増加した（ともに、ｐ＝０．０００１）。これは、心筋梗塞の急性事象における新規な特徴的役割を指示する。この観察は、ＣＫ−１８を同定することができる抗体であるＭ３０が心筋梗塞を引き起こす血栓において陽性を染色するという知見によって確認された。
【０１１２】
【化１】
【０１１３】
【化２】
【０１１４】
【化３】
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】可溶性インターロイキン−１変換酵素／ＩＣＥの血漿レベルを示す。安定狭心症（ＳＡ）、不安定狭心症（ＵＡ）を有する４０人の患者の血漿中のｓＩＣＥの濃度は、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）における大腿動脈及び冠状動脈から得られた血漿と比較された。各ボックスは、５０％値を含む４分位内を示す。ボックスを横切る線は、平均値ラインを示す。ヒゲがボックスから最高値及び最低値まで伸びている。
【図２】急性心筋梗塞、ＳＡ及びＵＡにおけるサイトケラチン１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープの血漿レベルを示す。患者の冠状動脈から得られた血漿中のＣＫ−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープの濃度は、大腿動脈から得られた全身血流量と比較して顕著に増加した。４０人の患者から得られたデータは、５０％値を含む４分位内を示す。ボックスを横切る線は、平均値ラインを示す。ヒゲがボックスから最高値及び最低値まで伸びている。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、急性心筋梗塞を有する患者からの代表的な血栓を示す（ｎ＝８）。図３Ａは、ヘマトキシリン−エオシン染色を示す；図３Ｂは、酸性フクシンオレンジＧ染色（フィブリン−赤、赤血球、血小板及び他の血漿タンパク質−折れんい、分散した白血球−青）を示す；図３Ｃは、血栓の中心のＣＫ−１８ Ｍ３０−ネオ−エピトープのポジティブな免疫反応性を示す；図３Ｄは、ネガティブ対照を示す（全て２００倍）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体の心臓血管疾患を診断するための方法であって、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料中のサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；及び
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が参考対照中のＣＫ−１８若しくはその断片の量と比較して増加している場合、及び／又は該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が参考対照中のＩＬ−１β前駆体の量と比較して減少している場合には心臓血管疾患と診断する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄であることによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）の量が参考対照に存在するＩＣＥの量と比較して減少し、試料中のＩＣＥの量と参考対照中のＩＣＥの量とを比較することによって心臓血管疾患であると診断することによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
個体において安定狭心症と不安定狭心症との間を区別するか又は安定狭心症と不安定狭心症を診断するか又は経皮冠動脈インターベンション後の再狭窄の危険性を評価する方法であって、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料におけるサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体と、安定狭心症若しくは不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の少なくとも１つの参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；
−不安定狭心症を患っている少なくと１つの個体の参考対照におけるＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と比較して、該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片が減少し、該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が増加している場合に安定狭心症と診断する工程（所定のマーカー量が安定狭心症を患っている個体におけるレベルと比較した場合に安定狭心症を診断することも可能である）；
を含む前記方法。
【請求項５】
前記試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）の量が、参考対照に存在するＩＣＥの量と比較して測定され、該試料中のＩＣＥの量が、不安定狭心症を患っている少なくと１つの個体の参考対照中のＩＣＥの量と比較した場合に減少しているときには安定狭心症と診断することによって特徴付けられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８）、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及びインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量が、免疫学的に、好ましくは酵素免疫吸着測定法、放射免疫アッセイ又はウェスタンブロットアッセイによって測定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、血液、好ましくは血漿又は血清であることによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、大腿動脈から得られることによって特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
心臓血管疾患を診断するためのキットであるか、又は安定狭心症と不安定狭心症との間を区別するためのキットであるか、又は個体における安定及び不安定狭心症を診断するキットであるか、又は心臓血管系の血栓を得る個体の危険性を評価するためのキットであって、
−サイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８）、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）を検出するための手段；及び
−参考対照
を含む前記キット。
【請求項１０】
前記手段が、ＣＫ−１８若しくはその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体に指向される抗体を含むことによって特徴付けられる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
参考対照が、心臓血管疾患を患っていない少なくと１つの個体から得られるか又は安定狭心症若しくは不安定狭心症を患っている少なくと１つの個体から得られることによって特徴付けられる、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄であることによって特徴付けられる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
血栓症（例えば、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、表在性静脈血栓症、門脈の血栓症）及び血栓症に関連した疾患を治療するための薬剤を製造するためのサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）又はその断片を分解する化合物の使用。
【請求項１４】
前記薬剤が、ワルファリン、アセチルサリチル酸、チクロピジン、ヘパリン、組織プラスミノーゲン因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、及び／又はウロキナーゼをさらに含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１】
個体の心臓血管疾患を診断するための方法であって、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料中のサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と、心臓血管疾患を患っていない少なくとも１つの個体の参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；及び
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片の量が参考対照中のＣＫ−１８若しくはその断片の量と比較して増加している場合、及び／又は該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が参考対照中のＩＬ−１β前駆体の量と比較して減少している場合には心臓血管疾患と診断する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄であることによって特徴付けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）の量が参考対照に存在するＩＣＥの量と比較して減少し、試料中のＩＣＥの量と参考対照中のＩＣＥの量とを比較することによって心臓血管疾患であると診断することによって特徴付けられる、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
個体において安定狭心症と不安定狭心症との間を区別するか又は安定狭心症と不安定狭心症を診断するか又は経皮冠動脈インターベンション後の再狭窄の危険性を評価する方法であって、
−個体の試料を用意する工程；
−該試料におけるサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）若しくはその断片及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量を測定する工程；
−該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体と、安定狭心症若しくは不安定狭心症を患っている少なくとも１つの個体の少なくとも１つの参考対照に存在するＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量とを比較する工程；
−不安定狭心症を患っている少なくと１つの個体の参考対照におけるＣＫ−１８若しくはその断片及び／又はＩＬ−１β前駆体の量と比較して、該試料中のＣＫ−１８若しくはその断片が減少し、該試料中のＩＬ−１β前駆体の量が増加している場合に安定狭心症と診断する工程（所定のマーカー量が安定狭心症を患っている個体におけるレベルと比較した場合に安定狭心症を診断することも可能である）；
を含む前記方法。
【請求項５】
前記試料中のカスパーゼ−１（ＩＣＥ）の量が、参考対照に存在するＩＣＥの量と比較して測定され、該試料中のＩＣＥの量が、不安定狭心症を患っている少なくと１つの個体の参考対照中のＩＣＥの量と比較した場合に減少しているときには安定狭心症と診断することによって特徴付けられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
サイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８）、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及びインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）の量が、免疫学的に、好ましくは酵素免疫吸着測定法、放射免疫アッセイ又はウェスタンブロットアッセイによって測定される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、血液、好ましくは血漿又は血清であることによって特徴付けられる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、大腿動脈から得られることによって特徴付けられる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
心臓血管疾患を診断するためのキットであるか、又は安定狭心症と不安定狭心症との間を区別するためのキットであるか、又は個体における安定及び不安定狭心症を診断するキットであるか、又は心臓血管系の血栓を得る個体の危険性を評価するためのキットであって、
−サイトケラチン−１８若しくはその断片（ＣＫ−１８）、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）及び／又はインターロイキン−１β前駆体（ＩＬ−１β前駆体）を検出するための手段；及び
−参考対照
を含む前記キット。
【請求項１０】
前記手段が、ＣＫ−１８若しくはその断片、ＩＣＥ及びＩＬ−１β前駆体に指向される抗体を含むことによって特徴付けられる、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
参考対照が、心臓血管疾患を患っていない少なくと１つの個体から得られるか又は安定狭心症若しくは不安定狭心症を患っている少なくと１つの個体から得られることによって特徴付けられる、請求項９又は１０に記載のキット。
【請求項１２】
心臓血管疾患が、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈性心臓病、急性冠症候群、好ましくは不安定狭心症若しくは急性心筋梗塞、安定狭心症、脳梗塞、好ましくは虚血性脳梗塞、炎症性疾患若しくは自己免疫疾患関連アテローム性動脈硬化症又は再狭窄であることによって特徴付けられる、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１３】
血栓症（例えば、冠状動脈血栓症、深部静脈血栓症、表在性静脈血栓症、門脈の血栓症）及び血栓症に関連した疾患を治療するための薬剤を製造するためのサイトケラチン−１８（ＣＫ−１８）又はその断片を分解する化合物の使用。
【請求項１４】
前記薬剤が、ワルファリン、アセチルサリチル酸、チクロピジン、ヘパリン、組織プラスミノーゲン因子（ｔ−ＰＡ）、ストレプトキナーゼ、及び／又はウロキナーゼをさらに含む、請求項１３に記載の使用。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公表番号】特表２００９−５３４６７２（Ｐ２００９−５３４６７２Ａ）
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０６８５６（Ｐ２００９−５０６８５６）
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００７／０００１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１４９５
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５０８３１７４２４）メディツィニシェ ウニベルジテート ウィーン (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年９月２４日（２００９．９．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年４月１６日（２００７．４．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＡＴ２００７／０００１７３
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１２１４９５
【国際公開日】平成１９年１１月１日（２００７．１１．１）
【出願人】（５０８３１７４２４）メディツィニシェ ウニベルジテート ウィーン (2)
【Ｆターム（参考）】
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