慢性閉塞性肺疾患改善剤
【課題】新規なCSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質の提供。
【解決手段】コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬等、を有効成分として含む組成物であり、肺の気腫性病変抑制又は、COPDの治療・予防に好適である。
【解決手段】コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬等、を有効成分として含む組成物であり、肺の気腫性病変抑制又は、COPDの治療・予防に好適である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質有効成分とした、CSPGの肺組織への沈着抑制剤、肺の気腫性病変の抑制剤、CSPGの沈着抑制方法、気腫化の抑制方法、及び該方法に基づく肺気腫もしくは慢性閉塞性肺疾患（COPD）に対する治療または予防に関するものである。
【０００２】
本発明はコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬等を代表例とする、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質を有効成分として含む肺の気腫性病変抑制又は、COPDの治療・予防に好適である気腫性病変抑制剤、COPDの治療・予防薬に関するもの、気腫性病変の抑制方法、COPDの治療・予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（COPD）は中高年の喫煙者に多く発症し、慢性かつ持続性の閉塞性換気障害を呈する疾患群であり、WHO（世界保健機関）の統計では死亡原因の第４位にランクされている。本邦においては2000年に死亡原因の第１０位にランクされている（非特許文献１）。本邦においては日本呼吸器学会ガイドライン（非特許文献１）により、肺気腫（PE）、慢性気管支炎（CB）または両者の併発により惹起される閉塞性換気障害を特徴とする疾患と定義されている。この内、本発明の主たる標的であるPEは軽症な病態を抱えている人を含めると、約３００万人が肺気腫の予備群であると予測されている。
【０００４】
PEの病態は終末細気管支以下の気道と肺胞壁の破壊、及び非可逆的な気腔の拡張を特徴とし、明らかな線維化や気道系の閉塞を伴わない病態と病理学的に定義されている。PEの発症の機序については「エラスターゼ・アンチエラスターゼ不均衡説」や肺胞壁のアポトーシス（非特許文献２及び３）などが考えられているが、いまだ明らかにされていないことも多い。最も確かな内因性危険因子は遺伝性疾患であるα1-アンチトリプシリン欠損症であるが、本邦においては非常にまれである（非特許文献１）。
【０００５】
最近のCOPDに関する報告では呼気濃縮液、気管支肺胞洗浄液bronchoalveolar lavage fluid（BAL液）、気道組織中において肺胞マクロファージや好中球に関連する炎症性生体内物質であるTumor Necrosis factor（TNF-α）、macrophage chemotatic protein（MCP）-1、macrophage inflamentry protein（MIP）-1β、Transforming grothfactor（TGF）-β、interleukin（IL）-1、IL-6、IL-8、などのサイトカインが増加しているとの報告がある（非特許文献４〜７）。これらのサイトカインは煙草の煙やその他の因子により刺激された気道上皮細胞や、肺局所に誘導された肺胞マクロファージ、好中球により産生されたものであると考えられる。気道中や肺胞域への免疫細胞への遊走の抑制がCOPDの治療への鍵であるとも考えられる。
【０００６】
これら種々の要因が原因で引き起こされた肺の気腫化は、不可逆的で現在の治療法では肺移植以外での治癒は困難であり、気腫化の進行を阻止し、患部の再生・修復を促す新規治療薬の開発が世界的に望まれている。最近ではマトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤などにより肺気腫の抑制や治療を目的とする研究も行われているが未だ臨床応用には至っていない（非特許文献８、９）。さらに、血管新生増殖因子（VEGF）を用いて新生血管を増成させ、組織修復を促進させるという手法でVEGFを肺気腫治療に応用することも試みられているが未だ研究段階である。
【０００７】
一方、本発明の標的物質であるプロテオグリカンは、コア蛋白質に呼ばれる蛋白質に、1本以上のグリコサミノグリカン（GAG）鎖が共有結合した構造をもつ分子の総称であり細胞表面や細胞外マトリックスの構成成分である（非特許文献１０、１１）。プロテオグリカンに結合しているGAG鎖の特異的な糖鎖構造がプロテオグリカンの多彩な機能を担うと考えられており、プロテオグリカンはGAGの骨格構造に基づいて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケタラン硫酸プロテオグリカンと4つに大別される（非特許文献１２〜１８）。この中で、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに関しては、多彩なサイトカイン、接着分子、ケモカインと結合し、その機能を大きく修飾するため幅広く研究されてきている。このヘパラン硫酸プロテオグリカンの減少とPEの発症との関連を示唆する報告もある（非特許文献１９、２０）。
【０００８】
一方、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに関しては、胎生時期には必須分子で、各臓器に豊富に存在するが、出生、成長、老化に伴い減少することが知られているが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生体内機能は未だ明らかとなっていない。近年では、CSPGを遺伝的に欠損させたマウスが胎生致死や器官形成不全に陥ることが判明したことから、CSPGは生体に必須の分子であるとの認識が強まっている。
【０００９】
また、PEとCSPGに関する報告では加齢に伴う肺組織中のCSPGの減少とPEの発症の関連を示唆する報告があった（非特許文献２１）。またRao らはヒト白血球由来エラスターゼ用いたPEハムスターモデルにおいて、CSPGを含む硫酸化多糖体の投与がPEを抑制したとの報告をしている（非特許文献２２）。しかしながら、PE発症とCSPGとの関連は明確にはなっていない。
【００１０】
【非特許文献１】日本呼吸器学会COPDガイドライン作製委員会：COPD診断と治療のためのガイドライン1999
【非特許文献２】Hoshino.Y, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.(2001) 281(2):L509-16
【非特許文献３】Aoshiba K, Am J Respir Cell Mol Biol. (2003) 28(5):555-62
【非特許文献４】Am J Respir Crit Care Med. 1996 Feb;153(2):530-4
【非特許文献５】Am Rev Respir Dis. 1987 Sep;136(3):779-82
【非特許文献６】Eur Respir J. 1999 Jul;14(1):160-5
【非特許文献７】J Pathol. 2000 Apr;190(5):619-26
【非特許文献８】Selman M: Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003 Nov;285(5):L1026-36
【非特許文献９】Funada Y: Kobe J.Med.Sci 2004 vol.50(3) P59-67
【非特許文献１０】Berfield M: Annu Rev Biochem 1999 68:729-777
【非特許文献１１】Iozzo RV: Annu Rev Biochem 1998 67:609-652
【非特許文献１２】Lindahl, U et al. (1972) In Glycoproteins (Gottschalk, A. ed)pp. 491-517, Elsevier, New York.
【非特許文献１３】Oegema, T et al. J. Biol. (1984) Chem. 259, 1720-1726 15
【非特許文献１４】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1988) 263, 10168-10174
【非特許文献１５】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6027-6035
【非特許文献１６】De Waard et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6036-6043
【非特許文献１７】Moses, J, Oldberg et al. Eur. J.Biol. (1992) 248, 521-526, 19
【非特許文献１８】Yamada, S et al. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, .(1998) 10, 95-123
【非特許文献１９】van Straaten JF Mod Pathol 1999 Jul;12(7):697-705
【非特許文献２０】van Kuppevelt TH: Am J Respir Cell Mol Biol. 1997 Jan;16(1):75-84
【非特許文献２１】Konno K Am Rev Respir Dis 1982 Nov;126(5):797-801
【非特許文献２２】Rao NV Am Rev Respir Dis 1990 Aug; 142(2):407
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、閉塞性換気障害抑制剤、および該薬剤を有効成分とする慢性閉塞性肺疾患の治療剤、並びに、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、そのような薬剤を開発する鋭意研究を重ねるうち、従来考えられていた肺気腫病変の病因とはされていなかったCSPGの過剰な蓄積が肺の組織破壊を亢進もしくは組織修復を阻害し、肺気腫病変の発症増悪に寄与しているのではないかと考えた。本発明者らは、この考えに基づいて研究を重ねた結果、コンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）ABCが肺気腫病変に蓄積したCSPGを効率よく分解し、コンドロイチナーゼABCを被検体に投与することにより肺組織の気腫化を顕著に抑制できることを見出した。さらにCSPGの生体内での合成に必須のC6硫酸化酵素の遺伝子発現を抑える遺伝子治療薬（C6STアンチセンス薬）、CSPGの構成成分であるN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）のC4硫酸化酵素及びC6硫酸化酵素の遺伝子発現を抑える遺伝子治療薬（GalNAcアンチセンス薬）がコンドロイチナーゼABCとともに、in vivoで肺の気腫病変に伴う呼吸機能等の臨床症状を改善することを見いだし、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、閉塞性換気障害抑制剤、および該薬剤を有効成分とする慢性閉塞性肺疾患の治療剤、並びに、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
〔１〕 コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、閉塞性換気障害抑制剤、
〔２〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔４〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔５〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔６〕 肺においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕 慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用の、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕 前記慢性閉塞性肺疾患が、肺気腫である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕 前記慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎である、〔７〕に記載の薬剤、
〔１０〕 被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法、
〔１１〕 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、〔１０〕に記載のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
〔１２〕 前記閉塞性換気障害抑制剤が、慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用である、〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔１３〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤の、閉塞性換気障害抑制剤の製造における使用、
〔１４〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤を、個体（患者等）へ投与する工程を含む、慢性閉塞性肺疾患の治療方法、
〔１５〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、CSPGの肺組織への沈着抑制を目的とし、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの脱硫酸化作用、CSPGの硫酸化阻害作用を機序とする肺の気腫性病変抑制又は、COPDの治療・予防に好適である気腫性病変抑制剤、COPDの治療・予防薬に関するもの、気腫性病変の抑制方法、COPDの治療・予防方法を提供することを１つの目的とする。
本発明によって、閉塞性換気障害の発症にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積が関係していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積を阻害することにより閉塞性換気障害の発症が抑制されることが示された。これまでにない新しいコンセプトの慢性閉塞性肺疾患治療薬が提供できることになる。特に慢性閉塞性肺疾患の一つである肺気腫は本邦において患者予備軍が約３００万人にものぼり、新しいコンセプトの治療薬剤は医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
代表的な慢性閉塞性肺疾患の一つである肺気腫に伴う病態として、肺における終末細気管支以下の気道と肺胞壁の破壊及び非可逆的な気腔の拡張などの病変がある。本発明者らは、これら肺における病変の改善を肺気腫治療の有効な方法の一つとするため、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの機能に着目した。そして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑制する状態をモデルマウスにおいて作出し、詳細に解析したところ、肺胞隔壁の消失や気腫性病変の低減など、病態の改善がみられるとともに、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積が低減している組織が観察された。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害すると、肺気腫に深く関与している肺組織におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの異常蓄積状態の改善が促進され、病態の改善につながることを見出した。
【００１６】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、閉塞性換気障害抑制剤に関する。
【００１７】
本発明の「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、プロテオグリカンの一つであり、代表的な硫酸化ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸とタンパク質（コアタンパク質）との共有結合化合物の総称である。本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質（ホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」に含まれる。例えば、ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。また本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンには、炎症などで一時的にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合しプロテオグリカンになるもの、いわゆるパートタイムプロテオグリカンも含まれる。
【００１８】
以下の記載において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbを例示する。本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはこれらに限られず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を持つ物質であればよい。ここでコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性とは、例えば細胞接着能、または細胞増殖促進などが挙げられる。当業者は次のような方法でコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を評価することができる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部の領域を含むタンパク質、または一部の領域と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有するタンパク質の存在下で腫瘍細胞（例えばCaco-2、HT-29細胞など）の分裂増殖を測定する。分裂増殖を促進する効果を持つタンパク質をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン活性を有するタンパク質として判定できる（Int J Exp Pathol. 2005 Aug;86(4):219-29およびHistochem Cell Biol. 2005 Aug;124(2):139-49）。ここで高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、 97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。
【００１９】
本発明における「閉塞性換気障害」とは、肺、気管支など呼吸器系が行う一連の換気のプロセスにおいて異常が見られる状態を指す。例えば、気道、肺胞壁の破壊、気腔の拡張などが挙げられるが、これらには限られない。
【００２０】
本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する」とは、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」、「合成阻害」、「脱硫酸化」、「硫酸化阻害」などが挙げられるが、これらには限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する物質」とは、特に制限されないが、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「脱硫酸化作用を有する物質」、または「硫酸化阻害作用を有する物質」である。
【００２１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」とは、たとえばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現の阻害・存在の減少が挙げられる。ここで「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質が挙げられる。また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばβglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質が挙げられる。これらはいずれも例示であり、これらに限らず広くコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質であればよい。
【００２２】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の機能」とは、例えば、該タンパク質がコンドロイチン硫酸と結合する機能や、その他の細胞中の構成要素との結合等を挙げることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
【００２３】
さらにまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。これらの酵素の例としては、メタロプロテイナーゼ（例えばADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5など）やコンドロイチナーゼ、Calpain Iなどが挙げられるが、これらには限られない。また「分解促進」は、これらの酵素または酵素の一部の投与により生ずる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量の減少であってもよい。
【００２４】
また「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。これらの物質には例えばn-butylate、Diethylcarbamazepine、Tunicamycin、non-steroidal estrogen、Cyclofenil deiphenolなどが挙げられるが、これらには限られない。
【００２５】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００２６】
また「分解促進作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物
【００２７】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「合成阻害」とは、たとえばグリコサミノグリカンの生合成の阻害、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成に関わる酵素の阻害などが挙げられるが、必ずしもこれらに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程のいずれかを阻害することを指す。
【００２８】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害する物質として、グリコサミノグリカンの生合成を阻害する物質としては、たとえば、β-D-xyloside、2-deoxy-D-glucose（2-DG）、ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate（ETDP）、5-hexyl-2-deoxyuridine（HUdR）などが挙げられる。これらをはじめとした物質によりグリコサミノグリカンの生合成が阻害され、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
一方、コンドロイチン合成に関わる酵素としては、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどが挙げられる。これらをはじめとした酵素を阻害、発現の抑制等を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００２９】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３０】
また「合成阻害作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物
【００３１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「脱硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン中の硫酸基が除かれることを指し、例えば内在性あるいは外部から投与される脱硫酸化酵素による脱硫酸化、または硫酸化を抑制する化合物による硫酸化の抑制などが挙げられるが、これらに限られず、硫酸基が除去される過程を指す。
【００３２】
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseが挙げられる。また、硫酸化を抑制する化合物としては、たとえばChlorate、EGF receptor antagonistなどが挙げられる。
【００３３】
「脱硫酸化作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３４】
また「脱硫酸化作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対して、ドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物
【００３５】
ここで「脱硫酸化抑制化合物」は、タンパク質には限られず、例えば補酵素など非タンパク質化合物を含む。
【００３６】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「硫酸化阻害作用」とは、例えば、硫酸基転移酵素の阻害が挙げられるが、これに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程に生じる硫酸化が阻害されることを指す。
【００３７】
硫酸基転移酵素としては、例えば、C4ST-1（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1）、C4ST-2（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2）、C4ST-3（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3）、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などが挙げられる。
【００３８】
「硫酸化阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３９】
また「硫酸化阻害作用を有する物質」としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物
【００４０】
上記例示した酵素は、一遺伝子に対応する一酵素を示すのみならず、ある特徴を共有する酵素群をも含む。例えばコンドロイチナーゼは、ムコ多糖分解酵素という特徴は共有するが基質特異性などの異なるABC、AC、Bなどの酵素の総称である。例えば、コンドロイチナーゼAC Iは、コンドロイチン硫酸類（A、CまたはE）、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸-デルマタン硫酸ハイブリッド型およびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-グルクロン酸残基を持つオリゴ糖を生成する。本酵素はデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B，ヘキスロン酸としてL-イズロン酸を持つもの）、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンには作用しない。また、コンドロイチナーゼAC II は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸CのN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、Δ4-不飽和二糖（ΔDi-0S、ΔDi-4SおよびΔDi-6S）を生成する。本酵素はヒアルロン酸にもよく作用する。デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）には作用せず、本酵素の競合的阻害剤となる。コンドロイチナーゼB（デルマタナーゼ）は、デルマタン硫酸のL-イズロン酸に結合したN-アセチルガラクトサミニド結合を脱離反応的に切断し、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つオリゴ糖（2糖および4糖）を生成する。本酵素はL-イズロン酸を含まないコンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸Cには作用しない。デルマタン硫酸の硫酸基を除去した誘導体であるデルマタンは、この酵素の基質とはならない。デルマタン硫酸のL-イズロン酸単位の第2位が硫酸化されている箇所はこの酵素によってよりよく切断される。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つ二糖を主に生成する。本酵素はケタラン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸には作用しない。コンドロイチナーゼはこのような、異なる性質を持っていながらもムコ多糖分解酵素という共通の性質を持つ酵素の総称であり、必ずしもここで例示したChondroitinase ACI、Chondroitinase AC II、Chondrotinase B、Chondroitinase ABCには限られない。
【００４１】
また、このような特徴を共有する酵素群は、必ずしもゲノムDNA上の一遺伝子に対応するものではない。例えば、chondroitin-4-sulfatase、chondroitin-6-sulfataseは、ともにゲノムデータベース上の複数のアクセッション番号で参照される配列（例えばGenbankアクセッション番号NT_039500（その一部はアクセッション番号CAAA01098429（配列番号：８６）としてあらわされる）、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349）として公共遺伝子データベースGenbank上で検索される。
【００４２】
上記に例示したもののうち個別の遺伝子に対応しているものは下記のように示される。すなわち、上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして例示した、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素として例示した、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I、コンドロイチン合成に関わる酵素として例示した、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylT、硫酸基転移酵素として例示した、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2をそれぞれヒトにおいてコードする遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号、塩基配列、アミノ酸配列は、次の通りである。
aggrican（アクセッション番号NM_007424、塩基配列の配列番号：１、アミノ酸配列の配列番号：２）
versican（アクセッション番号BC096495、塩基配列の配列番号：３、アミノ酸配列の配列番号：４）
neurocan（アクセッション番号NM_010875、塩基配列の配列番号：５、アミノ酸配列の配列番号：６）
brevican（アクセッション番号NM_007529、塩基配列の配列番号：７、アミノ酸配列の配列番号：８）
βglycan（アクセッション番号AF039601、塩基配列の配列番号：９、アミノ酸配列の配列番号：１０）
Decorin（アクセッション番号NM_007833、塩基配列の配列番号：１１、アミノ酸配列の配列番号：１２）
Biglycan（アクセッション番号BC057185、塩基配列の配列番号：１３、アミノ酸配列の配列番号：１４）
Fibromodulin（アクセッション番号NM_021355、塩基配列の配列番号：１５、アミノ酸配列の配列番号：１６）
PG-Lb（アクセッション番号NM_007884、塩基配列の配列番号：１７、アミノ酸配列の配列番号：１８）
ADAMTS-1（アクセッション番号NM_009621、塩基配列の配列番号：１９、アミノ酸配列の配列番号：２０）
ADAMTS-4（アクセッション番号NM_172845、塩基配列の配列番号：２１、アミノ酸配列の配列番号：２２）
ADAMTS-5（アクセッション番号AF140673、塩基配列の配列番号：２３、アミノ酸配列の配列番号：２４）
Calpain I（アクセッション番号NM_007600、塩基配列の配列番号：２５、アミノ酸配列の配列番号：２６）
GalNAc4ST-1（アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号：２７、アミノ酸配列の配列番号：２８）
GalNAc4ST-2（アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号：２９、アミノ酸配列の配列番号：３０）
GALNAC4S-6ST（アクセッション番号NM_029935、塩基配列の配列番号：３１、アミノ酸配列の配列番号：３２）
UA2OST（アクセッション番号NM_177387、塩基配列の配列番号：３３、アミノ酸配列の配列番号：３４）
GalT-I（アクセッション番号NM_016769、塩基配列の配列番号：３５、アミノ酸配列の配列番号：３６）
GalT-II（アクセッション番号BC064767、塩基配列の配列番号：３７、アミノ酸配列の配列番号：３８）
GlcAT-I（アクセッション番号BC058082、塩基配列の配列番号：３９、アミノ酸配列の配列番号：４０、またはアクセッション番号NM_024256、塩基配列の配列番号：４１、アミノ酸配列の配列番号：４２）
XylosylT（アクセッション番号NM_145828、塩基配列の配列番号：４３、アミノ酸配列の配列番号：４４）
C4ST-1（アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号：４５、アミノ酸配列の配列番号：４６）
C4ST-2（アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号：４７、アミノ酸配列の配列番号：４８）
C4ST-3（アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号：４９、アミノ酸配列の配列番号：５０）
D4ST（アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号：５１、アミノ酸配列の配列番号：５２）
C6ST-1（アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号：５３、アミノ酸配列の配列番号：５４）
C6ST-2（アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号：５５、アミノ酸配列の配列番号：５６）
【００４３】
上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば細胞内の構成成分と結合する機能等）を持つタンパク質は、本発明の上記タンパク質に含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。
【００４４】
本発明における上記遺伝子には、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトの上記遺伝子のホモログ等）が含まれる。
【００４５】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。
【００４６】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用、合成阻害作用、脱硫酸化作用または硫酸化阻害作用の活性測定方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、後出の本発明におけるスクリーニング方法の項にて記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【００４７】
本発明の上記タンパク質は、天然のタンパク質としてのほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質としては、例えば上記タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、上記タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、上記タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより、調製することが可能である。本発明の上記タンパク質は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
【００４８】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA（peptide nucleic acid）等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。
【００４９】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。
【００５０】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または 500塩基以上であってもよい。
【００５１】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばVersican遺伝子の塩基配列（GenBankのアクセッション番号BC096495、配列番号：３）、C4ST-1（GenBankのアクセッション番号NM_021439、配列番号：４５）、C4ST-2（GenBankのアクセッション番号NM_021528、配列番号：４７）、C4ST-3（GenBankのアクセッション番号XM_355798、配列番号：４９）等をもとに作成することができる。
【００５２】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
【００５３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
【００５４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５５】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
【００５６】
近年のゲノムプロジェクトの完了によってヒトの全塩基配列が解読され数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA（siRNA）の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは、2本鎖RNA（dsRNA）が直接細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA（siRNA）を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。
【００５７】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００５８】
siRNAの設計にあたっては、ターゲットとしては上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、Versican遺伝子の塩基配列（配列番号：３）、C4ST-1遺伝子の塩基配列（配列番号：４５）、C4ST-2遺伝子の塩基配列（配列番号：４７）、C4ST-3遺伝子の塩基配列（配列番号：４９）等をもとに作成することができる。より具体的には、その配列の一部の領域をターゲット候補とすることが可能であり、例えば、Versican遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５７）、C4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５８）、C4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５９）、C4ST-3遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６０）、C6ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６１）、C6ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６２）、GalNAc4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６３）、GalNAc4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６４）、GALNAC4S-6STの塩基配列の一部領域（配列番号：６５）等をもとに作成することができる。さらに具体的には、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜８５）を標的とするsiRNAが例示できる。
【００５９】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００６０】
また上記２本のRNA分子は、ここで一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA（shRNA）であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA（short hairpin RNA）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。
【００６１】
また本発明の好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜８５）を標的とするsiRNAにおいて、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
【００６２】
RNAi（siRNA）のために使用されるRNAは、上記タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。
【００６３】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
【００６４】
例えば、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子（siRNA）が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
【００６５】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００６６】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖RNAである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖RNAの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのsiRNAは、当業者においては市販の核酸合成機およびDICER酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。
【００６７】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（RNA）でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【００６８】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００６９】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域。具体的な例としては、PG-Lbのプロモーター領域である配列番号：６６で表される塩基配列が挙げられる。）と結合することにより、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また当業者においては、所望の化合物について、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。
【００７０】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７１】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）を発現するベクターを挙げることができる。
【００７２】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００７３】
本発明の抗体は、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。
【００７４】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。
【００７５】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。
【００７６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００７７】
本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。
【００７８】
さらに本発明は、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素の機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
【００７９】
さらに本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸との結合を野生型Versicanコアタンパク質と競合阻害するようなVersicanコアタンパク質変異体を挙げることができる。
【００８０】
また本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する臓器、組織または細胞は特に限定はされないが、好ましくは閉塞性換気障害に関与する呼吸器系の臓器、組織または細胞であり、より好ましくは、肺または気管支である。
【００８１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する化合物は、慢性閉塞性肺疾患の治療または予防のための薬剤となることが期待される。ここで「治療または予防」は、慢性閉塞性肺疾患を呈する臓器、組織、または細胞に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。
【００８２】
本発明において慢性閉塞性肺疾患は、閉塞性換気障害を伴う疾患であれば特に限定はされないが、好ましくは肺気腫、慢性気管支炎等を挙げることができる。
【００８３】
本発明の閉塞性換気障害抑制剤は、閉塞性換気障害の原因であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害することにより閉塞性換気障害を抑制する作用を有する。従って、本発明の好ましい態様としては、例えば、本発明の閉塞性換気障害抑制剤を有効成分とする、肺気腫治療剤または慢性気管支炎治療剤を提供する。
【００８４】
また本発明の「閉塞性換気障害抑制剤」は、「閉塞性換気障害治療剤」、または「閉塞性換気障害改善剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
【００８５】
なお、本発明における「治療」には、閉塞性換気障害の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、閉塞性換気障害発現細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００８６】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤（ネブライザー）あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤、頭蓋内投与注射剤、あるいは鼻腔内投与注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００８７】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００８８】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００８９】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００９０】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００９１】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００９２】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。閉塞性換気障害組織等に局所的に投与することもできる。siRNAはin vitroにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ochiya, TらのNature Med.,5:707-710,1999、Curr.Gene Ther.,1 :31-52, 2001より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありsiRNAのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されているが、本発明の薬剤の導入の方法はこれには限られない。
【００９３】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
【００９４】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【００９５】
本発明の薬剤を使用する場合は、閉塞性換気障害を発現する疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば肺気腫、慢性気管支炎等を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。
【００９６】
また本発明は、被検試料からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって、閉塞性換気障害抑制剤もしくは閉塞性換気障害抑制剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
これらに共通したスクリーニングの基本的な原理として、代表的な例として、下記の工程を含むものが挙げられる。
（１）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）そのもの／もしくはグリコサミノグリカン（GAG）鎖／もしくはCSPGやGAG鎖を合成（生成）する細胞
（２）被検化合物（例えば、製薬企業の有する莫大な化合物ライブラリー）
（３）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の切断断面／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）量／遊離グリコサミノグリカン（GAG）量を検出する方法
上記3種のツールを用いる。（１）と（２）を試験管内、もしくは培養皿上で混合させ、その効果を（３）により簡便に検出するという手順が望ましい。
【００９８】
以下、本発明のスクリーニング方法の態様を例示する。なお、以下に記載の態様においては、用いられるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、脱硫酸化酵素の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来するものが挙げられるが、これらに由来するものに特に制限されない。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一部とは、グリコサミノグリカン鎖、コアタンパク質などの構成要素またはその一部であり、特に限定されない。
【００９９】
また以下に記載の態様に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【０１００】
また以下に記載の態様における被検化合物への「接触」は、通常、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、その一部、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素を被検化合物と混合することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、これらのタンパク質またはその一部を発現する細胞を被検化合物と接触させることにより、上記「接触」を行うことができる。
【０１０１】
また以下に記載の態様における「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、それぞれの態様において用いられるタンパク質を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。例えば、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現する細胞」としては、内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子を発現している細胞、または外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が発現した細胞は、通常コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【０１０２】
また以下の記載において、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質、また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばDecorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質である。また「合成酵素」は、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどである。また「硫酸基転移酵素」は、例えば、C4ST-1（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1）、C4ST-2（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2）、C4ST-3（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3）、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などである。また、「分解促進酵素」とは、例えば、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Chondroitinase ABC（ChABC）、Chondroitinase AC、Chondroitinase B、Calpain Iなどである。また「脱硫酸化酵素」は、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseなどである。
【０１０３】
本発明のスクリーニング方法の態様として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用を有する化合物を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程
【０１０４】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１０５】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に結合する標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１０６】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１０７】
被検化合物が上記(a)分解促進作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１０８】
上記(a) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用に関するスクリーニング方法態様：
CS-GAGとして、コンドロイチン硫酸A（CS-A）、CS-B、CS-C（生化学工業社、ICN社、Sigma社など）、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１０９】
検出方法としては、例えばWFAレクチン（ノダフジレクチン）結合法が簡便な手法として挙げられる。WFAレクチンはCS-GAG鎖のGalNAc残基に結合するため、CS-GAGを簡便に検出できる。被検化合物の陽性コントロールとしてはコンドロイチナーゼABCを使用する。コンドロイチナーゼABC添加により、CS-GAG鎖が分解されるとWFAレクチンが結合できなくなるため、その原理を利用する。より具体的には、FITC標識WFAレクチン（EY社など）を、被検化合物混合前後でCSコーティング・ウェルに添加し、CS-GAGが分解される事により、ウェル中のFITC蛍光強度の変化を蛍光プレートリーダーあるいは蛍光顕微鏡などの検出機器により極めて簡便に定量・数値化できる。混合前後で最も蛍光数値を減少させた化合物が、本コンセプトを満たす新規の治療候補化合物として判定できる。
【０１１０】
また、他の検出方法として、CS-GAGそのものを直接的に標識する抗CS抗体（クローン：CS56、生化学工業社製）を使用する事ができる。WFAレクチンと同様に、FITC標識抗CS抗体をCSコーティング・ウェルに添加する事で、蛍光数値の変化を見れば、極めて短時間かつ簡便に大量スクリーニングができる。
【０１１１】
より詳細な検出方法として、被検化合物混合前後のプレートをそのまま使用し、sGAG Assay Kit（WIESLAB社製）、Sulphanated Glycosaminoglycans, ELISA Kit（FUNAKOSHI社製）などを適用するにより、GAG含有量を正確に定量・数値化する方法がある。
【０１１２】
さらに詳細には、被検化合物混合前後のプレートに2-AB（2-aminobenzamide）や2-AP（2-aminopyridine；いずれもLUD社製など）を添加することにより、遊離GAG鎖の還元末端を簡便に蛍光標識し、糖鎖の各タイプや、各タイプの含有率までを、HPLC、MALDI-MS、LC-MSなどで解析する事により、より詳細な解析が可能である。候補化合物の特性を詳細に調べるという、スクリーニングの次の段階の方法である。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記合成量を低下させる化合物を選択する工程
【０１１４】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる。
【０１１５】
次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する。測定は当業者においては公知の手法、例えば、標識した抗体による方法、質量分析法、クロマトグラフィー法等によって適宜実施することができる。
【０１１６】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、合成量を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１１７】
被検化合物が上記(b)合成阻害作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１１８】
上記(b) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸を合成する細胞、細胞株は当該研究者には既知である。ヒトでは例えば、健常人の末梢血を採取後、単核球を分離・培養するという標準的な方法により、16時間の細胞培養でコンドロイチン硫酸を産生してくる（Uhlin-Hansen L et al., Blood 82:2880, 1993.など）。また、より簡便には、既知の細胞株、例えば、線維芽細胞株NIH3T3（Phillip HA, et al. J. Biol. Chem. 279:48640, 2004など）、腎尿細管由来癌細胞株ACHN（Kawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921, 2002）、腎遠位尿細管由来細胞株MDCK（Borges FT et al., Kidney Int. 68:1630, 2005.など）、血管内皮細胞株HUVEC（Schick BP et al., Blood 97:449, 2001など）など、多数挙げられる。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後のCS-GAG量の変化を上記（a）の方法で簡便に数値化できる。細胞培養後のCS-GAG量の増加（すなわち、CS-GAG合成量を反映する）を抑制する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１１９】
さらに、より選択的には、例えばGalNAc4ST-1やXylosylTなどのCS-GAG合成酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的にCS-GAGを合成する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、硫酸化を受けていた量を低下させる物質を選択する工程
【０１２１】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１２２】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に残存する脱硫酸化の構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１２３】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１２４】
被検化合物が上記(c)脱硫酸化作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１２５】
上記(c) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用に関するスクリーニング方法態様：
基本的に上記（a）の方法と同様、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１２６】
検出方法は、脱硫酸化する事により、プロテオグリカンのコア蛋白側に残存した脱硫酸化断片の２糖構造を、抗プロテオグリカンΔdi４S抗体（クローン；2-B-6、4位に硫酸化を受けていた部分を認識する）あるいは抗プロテオグリカンΔdi6S（クローン；3-B-3、6位に硫酸化を受けていた部分を認識する。ともに生化学工業社製）と反応させることで、脱硫酸化を受けた部分の検出が容易にできる。したがって、混合培養前後のプレートにおいて、FITC標識した2-B-6や3-B-3抗体を反応させ、その蛍光数値の変化を簡便に検出できる。反応前後の蛍光強度を増加させた化合物が、より脱硫酸化を促進する物質であると判定でき、本コンセプトを満たす新規治療候補化合物として簡便に同定できる。
【０１２７】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。 本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞もしくは細胞抽出液あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化過程を構成する酵素、基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
【０１２８】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検物質を接触させる。
【０１２９】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１３０】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１３１】
被検化合物が上記(d)硫酸化阻害の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３２】
上記(d) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸の硫酸化を促進する細胞、細胞株は上記（c）に記載の細胞、細胞株と一致する。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後の硫酸化の程度を、例えば、4位硫酸化を検出する抗体（クローン；LY111）や6位硫酸化を検出する抗体（クローン；MC21C、いずれも生化学工業社製）で簡便に確認できる。蛍光標識抗体を用いて、培養前後の蛍光数値を比較しても良いし、上記（c）同様に、培養前後で2-B-6や3-B-3抗体を使用した検出法を行っても良い。細胞培養後の硫酸化の増加（LY111やMC21Cの蛍光数値増加）を抑制する化合物、もしくは細胞培養後の脱硫酸化の進行（2-B-6や3-B-3の蛍光数値増加）を促進する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１３３】
さらに、より選択的には、例えばC4ST-1やC6ST-1などの硫酸基転移酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的に硫酸基を付加する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１３４】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）該発現量を被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下している化合物、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１３５】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。
【０１３６】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【０１３７】
例えば、上記いずれかのタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT- PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、上記いずれかのタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、上記いずれかのタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【０１３８】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と該遺伝子の発現量を比較する。
【０１３９】
本方法においては、次いで、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１４０】
また、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１４１】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様としては、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下している化合物、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素に機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４２】
本方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。
【０１４３】
ここで「機能的に結合した」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【０１４４】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【０１４５】
「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。
【０１４６】
ここで「接触」は、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【０１４７】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１４８】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する。
【０１４９】
本方法においては、次いで、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１５０】
また、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素にと機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１５１】
本発明のスクリーニング方法において見出される閉塞性換気障害抑制剤は、好ましくは、慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用のものである。
【０１５２】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
【０１５３】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
【０１５４】
本発明の好ましい態様においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの検出の際に利用可能な、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体（抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体）も、本発明の閉塞性換気障害抑制剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。
【０１５５】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【０１５６】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1 ×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、 42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer（Amersham Life Science）を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution（CLONTECH）中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
【０１５７】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、上記本発明中の遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１５８】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、慢性閉塞性肺疾患の治療もしくは予防方法を提供する。
【０１５９】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、慢性閉塞性肺疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【０１６０】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【０１６１】
さらに本発明は、本発明の薬剤の、閉塞性換気障害抑制剤の製造における使用に関する。
【０１６２】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６３】
CSPGを含むプロテオグリカンの生体内動態とその制御の伴う制御し病態変化を観察した実際の臨床治療報告は過去には存在しないが、今回、その一例としてCSPGの分解酵素の一つであるコンドロイチナーゼABCに着目した。
【０１６４】
RNAiは1998年にFireらによって発見された現象（Fire A, Nature (1998) 391, :806-811）で、二本鎖RNA（double strand RNA）が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。しかしながら、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続が難しいとされてきた。最近の報告では（Takeshita F. PNAS.(2003) 102(34) 12177-82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109）、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、siRNAのキャリアーとして非常に適しているとされている。先に述べたコンドロイチナーゼABCと同様に、RNAiを用いてC6STやGalNAcの発現を抑制し、CSPGの動態を生体内で制御した報告はこれまでにはない。
【０１６５】
コンドロイチナーゼABCは、酵素番号EC4.2.2.4に分類されるリアーゼであり、（コンドロイチンABCリアーゼ）であり、コンドロイチナーゼABCは、1,4-β-D-ヘキソサミニド結合、及び1,3-β-D-グルクロノシル結合もしくは1,3-α-L-イズロノシル結合を含有する多糖を、4-デオキシ-β-D-グルク-4-エヌロノシル基を含有する分解する活性を有する。また、このコンドロイチナーゼABCを肺気腫やCOPDの治療に応用した報告はない。
【０１６６】
また本発明は、先に述べたCSPGの分解酵素であるコンドロイチナーゼABCとは異なるアプローチについても着目している。これはCSPGの生合成に関与する酵素であるChondroitin D-N-acetylgalactosamine-6-O-sulfotransferase 1（C6ST-1）、Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-6-O-sulfotransferase 2（C6ST-2）、Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-6-O-sulfotransferase 3（C6ST-3）、同様にCSPGの生合成に関与する酵素であるN-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1（GalNAc 4ST-1）、N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2（GalNAc 4ST-2）、N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase（GALNAC 4S-6ST）、に着目したものである。本実施例においては、これら２つの酵素を発現する遺伝子に対して、それらを特異的に阻害する遺伝子（ small interfering RNA :siRNA）の導入（RNA interference :RNAi）を行い、コンドロイチナーゼABCとは異なり作用機序でのCSPGの生体内における制御をも試みている。
【０１６７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１６８】
実施例１：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABCの気腫性病変の抑制効果
この実施例では、基本的な肺気腫マウスモデルであるブタ膵臓由来エラスターゼ（PPE）気管内投与モデルを使用した。このマウスモデルは古典的ではあるが再現性にすぐれ、簡便であることより肺気腫モデルとして広く使用されている。
（非特許文献：Karlinsky JB et al Am Rev Respir Dis 1978;117:1109-1133.
Otto-Verberne CJ et al Protective effect of pulmonary surfactant on elastase-induced emphysema in mice. Eur Respir J 1992;5:1223-1230.
Janoff A et al Prevention of elastase-induced experimental emphysema by oral administration of a synthetic elastase inhibitor. Am Rev Respir Dis 1980;121:1025-1029.
Christensen TG, et al. Irreversible bronchial goblet cell metaplasia in hamsters with elastase-induced panacinar emphysema. J Clin Invest 1977;59:397-404.
Lucey EC, et al. Remodeling of alveolar walls after elastase treatment of hamsters: results of elastin and collagen mRNA in situ hybridization. Am J Respir Crit Care Med 1998;158:555-564.
Snider GL, Lucey EC, Stone PJ. Animal models of emphysema. Am Rev Respir Dis 1986;133:149-169.）
【０１６９】
この実施例では肺気腫モデルマウスの肺組織サンプルを使用してヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）を行い、コンドロイチナーゼABC気腫性病変抑制効果について比較検討を行った。
【０１７０】
最初にマウスモデルの作製についてであるが、C57BL6/J マウス（メス、５〜６週齢、日本クレア社製）に、PPE（４単位；Calbiochem-Novabiochem社製）を気管内投与する。投与後３週間飼育し肺組織を採取した。対照群は同様のマウスでPPE未投与のものを用いた。
【０１７１】
PPEに先立ち、マウスには予めコンドロイチナーゼABC（20単位/ml；Sigma-Aldrich社製）を４単位/mouseで腹腔内投与し、PPE処理後にも追加投与を行った。
【０１７２】
採取した右肺組織を凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、液体窒素を用いて凍結ブロックを作製した。その凍結ブロックからクライオスタット（Microm社製）を用いて厚さ６μmの切片を作製した。
【０１７３】
得られた切片を１％グルタールアルデヒド（ナカライテスク社製）で10分間固定後、さらにホルモールカルシウム液で10分間固定。リン酸緩衝液で洗浄後、リリマイヤーヘマトキシリン液（シグマアルドリッチジャパン社製）で室温、５分間染色し脱色液（0.5%HCL含有70％エタノール、いずれもナカライテスク社製試薬を用いて作製）にて軽く洗浄。その後10分間水洗いを行う。エオジンアルコール室温、５分間染色し10分間水洗いを行う。100％エタノールで軽く洗浄後、３分間静置。さらにキシレン（ナカライテスク社製）軽く洗浄後、10分間静置した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察し組織の様子を確認した。
【０１７４】
得られた組織図を図１上段に示した。対照群（PPE未投与マウス）の所見では蜂の巣様の肺胞隔壁が特徴的な正常な肺実質の組織所見が確認出来る。しかしながら、中央の写真が示す未治療群（PPE投与、コンドロイチナーゼABC未投与）では、肺気腫に特徴的な所見である肺胞隔壁の破壊消失と気腔の拡大に伴う気腫性病変が観察出来る。これに対して酵素治療群（PPE投与、コンドロイチナーゼABC投与）では若干の肺胞隔壁の消失と気腫性病変が見られるものの、その程度は大幅に改善されていることが観察出来る所見であった。
【０１７５】
また、肺気腫における特徴的な所見の一つとして肺胞腔の拡大が知られているが、図１の上段に示した肺気腫マウスモデルのHE染色所見においても、これが散見される。肺気腫モデルマウスの病変の程度を数値化して示す方法として、肺胞間の平均距離を測定する方法が知られている（Thurlbeck W.M, Thorax (1967) 22, 483-96 Murakami S. (2005).Am J Respir Crit Care Med 172, 581-9）、HE染色のサンプルの写真を先程使用した光学顕微鏡（ライカ社製）を用いて倍率400倍で撮影した。この写真上の肺胞間の平均距離を対照群、未治療群、治療群の間で比較することによりコンドロイチナーゼABC治療効果について検討した。
【０１７６】
肺胞間平均距離の測定結果について図１の下段に示した。対照群における肺胞間の平均距離は47.125±0.65μmであったが、未治療群では77.85±11.42μm（vs対照群P=0.002 t検定））と顕著な肺胞間平均距離の拡大を認めた。これに対して酵素治療群における肺胞間平均距離は64.925±0.31μm（vs未治療群P=0.0013 t検定）と対照群に比べ肺胞間平均距離は拡大しているものの、未治療群に比べて有意な肺胞間平均距離の縮小を認めた。
【０１７７】
以上、本実施例の結果を考察すると、PPE気管内投与マウス肺気腫モデルにおいて、コンドロイチナーゼABC生体内投与により気腫性病変の進行が抑制、もしくは改善されることが明らかになった。
【０１７８】
実施例２：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABCのプロテオグリカンの沈着抑制効果
この実施例では肺気腫モデルマウスの肺組織サンプルを使用してコンドロイチナーゼABCのプロテオグリカン抑制効果について比較検討を行った。実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を（ニチレイ社製）添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７９】
得られた組織像を図２に示した。対照群の所見では肺胞隔壁や写真中央の細気管支周囲にわずかに陽性の茶色のシグナルが見られるものの、特に強いCSPGの沈着は確認出来ない。しかしながら、未治療群では実施例１で見られたような破壊された肺胞隔壁部位に強い陽性のシグナルすなわち、強いCSPGの沈着が確認できた。これに対して酵素治療群では肺胞隔壁の破壊も弱く、対照群とほぼ同程度の陽性所見しか確認出来ない。
【０１８０】
以上の抗CSPG抗体を用いた肺組織の免疫染色所見を考察すると、PPE気管内投与マウス肺気腫モデルにおいて誘導される肺組織におけるCSPGの沈着は、コンドロイチナーゼABC生体内投与により分解され抑制されることが明らかになった。
【０１８１】
実施例３：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABCのプロテオグリカンの集積抑制効果
実施例２で示したCSPGの沈着はマクロファージなどの炎症細胞を誘導する生体内物質であるケモカインを吸着することが知られている。CSPGの沈着が結果的に炎症細胞を引き寄せ肺組織を破壊することにつながると推測し、この実施例では肺気腫モデルマウスの肺組織サンプルを使用して、肺胞マクロファージの集積動態に対するコンドロイチナーゼABCの効果について免疫染色組織化学染色法を用いて検討した。
【０１８２】
実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗マウスマクロファージ抗体（クローンF4/80；１：200希釈；BMA社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG（1:200希釈；バイオソース社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１８３】
得られた組織像を図３に示した。対照群の所見では肺胞域に少数の陽性のシグナルが見られる。しかしながら、未治療群では写真中央の細気管支周囲に非常に多数の陽性シグナルの集積、つまり肺胞マクロファージの集積が認められた。これに対して酵素治療群では、対照群とほぼ同程度の陽性シグナルしか確認出来なかった。
【０１８４】
以上の抗マクロファージ抗体を用いた肺組織の免疫染色所見を考察すると、PPE気管内投与マウス肺気腫モデルにおいて誘導される肺組織におけるマクロファージの集積は、コンドロイチナーゼABC生体内投与により顕著に抑制されることが明らかになった。この実施例の結果と実施例２に示した結果を併せて考察すると、PPE気管内投与に伴うCSPGの沈着をコンドロイチナーゼABCが抑制することにより肺胞マクロファージの集積が抑制されると考えられる。このマクロファージの集積抑制が結果的に気腫性病変の抑制につながるものであると結論づけられる。
【０１８５】
実施例４：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の硫酸化グリコサミノグリカン沈着の抑制効果
この実施例では肺気腫モデルマウスの左肺組織中に沈着した硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）沈着の抑制効果について比較検討を行った。本発明の標的分子であるCSPGは他のプロテオグリカンと同様にsGAGの共有結合により構成されている。よって本実施例は、sGAGの定量化によりコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬のCSPGの肺組織への沈着の抑制効果を間接的に数値化することを目的としてアルシアンブルー結合反応sGAGアッセイ法を用いて検討を行った。肺気腫モデルマウスの作製についてであるが実施例１〜３と同様の方法で作成している。投与後は同じく３週間飼育し、肺組織を採取した。
【０１８６】
C6STアンチセンス薬とGalNAcアンチセンス薬の投与については、PPE投与後より１週間ごとにsiRNA GalNAcまたはsiRNA C6STを１μg（GeneWorld社製）とsiRNAの媒体である１％アテノコラーゲン（高研社製）を混合したもの腹腔内投与した。投与量は200μL/ mouseで行った。
*[GalNAc4ST-1 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_175140）
5’-accccacaactcggaacgatgcggct-3’（配列番号：６７）
5’-tgcatgttctcgtccatcctgctg-3’（配列番号：６８）
5’-cgccaccgtgtactgtactgtgaagt-3’（配列番号：６９）
5’-aggctgctccaactggaagagggtg-3’（配列番号：７０）
*[GalNAc4ST-2 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_199055）
5’-atatagtatctaggatatatgtag-3’（配列番号：７１）
5’-gaagtaccaaaagctggctgctcta-3’（配列番号：７２）
5’-ttctatcacttggactatttgatgtt-3’（配列番号：７３）
5’-tacacaactccacatttgtaatttg-3’（配列番号：７４）
*[GALNAC4S-6ST siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_029935）
5’-ccagaagccaagctcattgttatg-3’（配列番号：７５）
5’-ctgtggagaggttgtactcagacta-3’（配列番号：７６）
5’-atttgcctggaagacaacgtgagagc-3’（配列番号：７７）
5’-gtcccttctgcagaagctgggcccact-3’（配列番号：７８）
*[C6ST-1 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_016803）
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’（配列番号：７９）
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*[C6ST-2 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_021715）
5’-tggggagagtgaggattcggtgaa-3’（配列番号：８３）
5’-cggacgtgggactcgtcgaggacaaag-3’（配列番号：８４）
5’-cgaaagtacctgcccgcccgtttcgc-3’（配列番号：８５）
【０１８７】
また、コンドロイチナーゼABCによる治療方法であるが、PPEに先立ちマウスには予めコンドロイチナーゼABC（20単位/ml；Sigma-Aldrich社製）を４単位/mouseで腹腔内投与し、PPE処理後にも追加投与を行った。
【０１８８】
検体の処理方法についてであるが、実施例１、実施例２で用いた肺組織と同時に採取した左肺をリン酸緩衝液で洗浄後、２mLの0.2% Triton X（シグマアルドリッチジャパン社製）に浸して氷上に静置。ホモジナイザーにてホモジナイズを行い４℃で一晩攪拌を行った。この組織懸濁液をサンプルとしてsGAG定量キット（ヴィエリサ社製）を用いて左肺中のsGAGの含有量を測定した。アルシアンブルー結合反応sGAGアッセイ法についてはsGAG定量キットの添付文書に準じた。
【０１８９】
本実施例の結果について図４に示した。左肺におけるsGAGの沈着量は対照群（PPE未投与）では2.31±0.28μg/Lt lungであったが、未治療群（PPE投与、治療薬未投与）で4.71±0.49μg/Lt lung（vs対照群P=0.00033 t検定））と顕著な増加を認めた。この結果は実施例２で示した肺組織での抗CSPG染色の結果と相関するものであった。これに対して酵素治療群（PPE投与、コンドロイチナーゼABC投与）、C6ST治療群（PPE投与、C6STアンチセンス薬投与）、GalNAc治療群（PPE投与、GalNAcアンチセンス薬投与）ではsGAGの沈着量はそれぞれ1.93±0.31μg/Lt lung（vs未治療群P=0.0000036 t検定）、2.06±0.28μg/Lt lung（vs未治療群P=0.0004 t検定）、2.81±1.24μg/Lt lung（vs未治療群P=0.018 t検定）とsGAGの沈着量はそれぞれ未治療群に対して有意に低下していた。
【０１９０】
これらの結果をまとめると、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬はPPEの気管内投与に伴う肺内のsGAGの沈着の増加を抑制することが明らかになった。
【０１９１】
また、先にも述べたように、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬がいずれもCSPGの分解を促進または発現を抑制する薬剤であることより、本実施例で示されたPPEの気管内投与に伴う肺内のsGAGの沈着量増加の抑制機序はCSPGの分解促進または発現抑制であることが判る。
【０１９２】
実施例５：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の呼吸機能の保存効果
ここまでの実施例では肺気腫モデルマウスにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬CSPG沈着抑制による気腫性病変抑制効果について示してきたが、本実施例では、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の肺気腫モデルマウスにおける臨床効果を検討するために静肺コンプライアンス（statistic compliance: Cst）を指標として呼吸機能に与える影響について評価した。Cstは肺組織の伸びやすさを表しているが、肺胞域の組織破壊を伴う疾患である肺気腫はCstが上昇する。
【０１９３】
これまでの実施例１〜４で示してきた方法と同様の手順で肺気腫モデルマウスを作製し、実施例４と同様にコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬で治療を行った。それらのマウスの自発呼吸を麻酔薬にて停止させたのちFlexiVent（SCIREQ社製）呼吸機能解析装置のP-V roop modeを用いてCstを測定した。マウスとFlexiVentとの接続はマウスの自発呼吸停止後に正中切開を行い、気管内に専用カニューレを挿管し気管支周囲を結紮する方法にて行った。
【０１９４】
本実施例の結果について図５に示した。対照群では42.62±2.25μL/cmH2Oであったが、未治療群で51.22±5.2μL/cmH2O（vs対照群P=0.03 t検定）と統計学的に有意な増加を認めた。また、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群におけるCstは、それぞれ43.41±3.39μL/cmH2O（vs未治療群P=0.047 t検定）、42.92±1.82 μL/cmH2O（vs未治療群P=0.03 t検定）、44.15±2.29μL/cmH2O（vs未治療群P=0.018 t検定）とCstはそれぞれ未治療群に対して有意に低下していた。
【０１９５】
これらの結果をまとめると、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬は、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴うCstの増加を有意に抑制することが明らかになった。また、本実施例に示された結果は、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の投与は肺組織の破壊を抑制するだけでなく実際の臨床症状（呼吸状態）を改善する効果を有することを示唆するものであった。
【０１９６】
実施例６：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の組織保存効果
肺胞の気腔拡大を特徴的な病理像として示す肺気腫では、気腫性病変の進行に従い肺容量が増加する。本実施例ではコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の治療効果が、細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく臓器の形態維持・保存の効果にまで及ぶものであることを立証することを目的として行われた。
【０１９７】
本実施例で使用した肺組織は、実施例５で使用した肺組織の右肺を使用して行っている。マウスより摘出した肺組織をりん酸緩衝液で軽く洗浄後、同じくガラス容器に満たしたりん酸緩衝液につけた。りん酸緩衝液を満たしたガラス容器の重量を予め測定しておき、肺組織を容器に加えた後に増加した重量を液量に換算し肺容量とした。
【０１９８】
本実施例の結果について図６に示した。対照群における肺容量は277.5±61.85μLであったが、未治療群で413.33±77.67μL（vs対照群P=0.024 t検定）と統計学的に有意な肺容量の増加を認めた。また、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群における肺容量は、それぞれ303.33±25.17μL（vs未治療群P=0.04 t検定）、292.5±51.23 μL（vs未治療群P=0.027 t検定）、315±51.96μL（vs未治療群P=0.049 t検定）とそれぞれ未治療群に対して有意に肺容量の低下を認めた。
【０１９９】
これらの結果をまとめると、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬は、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴う肺葉量の増加を効果的に抑制することが明らかになった。また、本実施例に示された結果は、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の投与は細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく、臓器の形態維持・保存の効果、もしくは破壊された組織の修復効果を持ち合わせていることを示すものであった。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
本発明に係わるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬等を代表とする、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質を有効成分として含有する肺の気腫性病変の抑制剤は肺胞壁の破壊、肺胞腔の拡大を伴う肺気腫含むCOPDの治療・予防に効果を有する。本発明に係る肺の気腫性病変の抑制剤は、肺気腫モデルマウスにおいて肺胞壁の破壊、肺胞腔の拡大を抑制する効果、CSPGの沈着抑制効果、肺胞マクロファージも集積抑制効果、呼吸機能の保存効果などのCOPDに付随する所見を様々な角度から抑制出来る効能を有していることより、COPDの治療・予防において非常に有用な薬剤である。本発明の肺の気腫性病変の抑制剤、またはこれを用いた治療法・予防法はCOPD患者の予後改善に非常に有効な手段である。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】上段は豚膵臓由来エラスターゼ（PPE）気管内投与により誘発された肺気腫モデルマウスにおけるヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）所見の光学顕微鏡写真である。倍率は５０倍。下段のグラフは気腫病変の程度を数値化するために上段の写真における肺胞間の平均距離を測定したものである。対照群（PPE(-) Chase ABC(-)）、未治療群（PPE(+) Chase ABC(-)）、酵素治療群（PPE(+) Chase ABC(+)）とする。*P＜0.01（t-検定）
【図２】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスにおける酵素治療群のCSPG（茶色シグナル）沈着の減少効果を示す写真である。倍率５０倍。
【図３】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスにおける酵素治療群のF4/80陽性肺胞マクロファージ（茶色シグナル）集積の減少効果を示す写真である。倍率５０倍。
【図４】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスの左肺におけるグリコサミノグリカン（GAG）の沈着量（μg/ Lt lung）について比較した図である。対照群、未治療群、酵素治療群、C6ST治療群（PPE(+) C6STアンチセンス薬）、GalNAc治療群（PPE(+) GalNAcアンチセンス薬）の５群間で検討した。*P＜0.01,**P＜0.05（t-検定）。
【図５】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスの静肺コンプライアンス（Cst）について示した図である。Cstは肺の弾性の目安である。対照群、未治療群、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群の５群間で検討した。*P＜0.01（t-検定）。
【図６】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスの右肺の容積（μl）を比較した図である。対照群、未治療群、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群の５群間で検討した。*P＜0.01（t-検定）。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質有効成分とした、CSPGの肺組織への沈着抑制剤、肺の気腫性病変の抑制剤、CSPGの沈着抑制方法、気腫化の抑制方法、及び該方法に基づく肺気腫もしくは慢性閉塞性肺疾患（COPD）に対する治療または予防に関するものである。
【０００２】
本発明はコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬等を代表例とする、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質を有効成分として含む肺の気腫性病変抑制又は、COPDの治療・予防に好適である気腫性病変抑制剤、COPDの治療・予防薬に関するもの、気腫性病変の抑制方法、COPDの治療・予防方法に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（COPD）は中高年の喫煙者に多く発症し、慢性かつ持続性の閉塞性換気障害を呈する疾患群であり、WHO（世界保健機関）の統計では死亡原因の第４位にランクされている。本邦においては2000年に死亡原因の第１０位にランクされている（非特許文献１）。本邦においては日本呼吸器学会ガイドライン（非特許文献１）により、肺気腫（PE）、慢性気管支炎（CB）または両者の併発により惹起される閉塞性換気障害を特徴とする疾患と定義されている。この内、本発明の主たる標的であるPEは軽症な病態を抱えている人を含めると、約３００万人が肺気腫の予備群であると予測されている。
【０００４】
PEの病態は終末細気管支以下の気道と肺胞壁の破壊、及び非可逆的な気腔の拡張を特徴とし、明らかな線維化や気道系の閉塞を伴わない病態と病理学的に定義されている。PEの発症の機序については「エラスターゼ・アンチエラスターゼ不均衡説」や肺胞壁のアポトーシス（非特許文献２及び３）などが考えられているが、いまだ明らかにされていないことも多い。最も確かな内因性危険因子は遺伝性疾患であるα1-アンチトリプシリン欠損症であるが、本邦においては非常にまれである（非特許文献１）。
【０００５】
最近のCOPDに関する報告では呼気濃縮液、気管支肺胞洗浄液bronchoalveolar lavage fluid（BAL液）、気道組織中において肺胞マクロファージや好中球に関連する炎症性生体内物質であるTumor Necrosis factor（TNF-α）、macrophage chemotatic protein（MCP）-1、macrophage inflamentry protein（MIP）-1β、Transforming grothfactor（TGF）-β、interleukin（IL）-1、IL-6、IL-8、などのサイトカインが増加しているとの報告がある（非特許文献４〜７）。これらのサイトカインは煙草の煙やその他の因子により刺激された気道上皮細胞や、肺局所に誘導された肺胞マクロファージ、好中球により産生されたものであると考えられる。気道中や肺胞域への免疫細胞への遊走の抑制がCOPDの治療への鍵であるとも考えられる。
【０００６】
これら種々の要因が原因で引き起こされた肺の気腫化は、不可逆的で現在の治療法では肺移植以外での治癒は困難であり、気腫化の進行を阻止し、患部の再生・修復を促す新規治療薬の開発が世界的に望まれている。最近ではマトリクスメタロプロテアーゼ阻害剤などにより肺気腫の抑制や治療を目的とする研究も行われているが未だ臨床応用には至っていない（非特許文献８、９）。さらに、血管新生増殖因子（VEGF）を用いて新生血管を増成させ、組織修復を促進させるという手法でVEGFを肺気腫治療に応用することも試みられているが未だ研究段階である。
【０００７】
一方、本発明の標的物質であるプロテオグリカンは、コア蛋白質に呼ばれる蛋白質に、1本以上のグリコサミノグリカン（GAG）鎖が共有結合した構造をもつ分子の総称であり細胞表面や細胞外マトリックスの構成成分である（非特許文献１０、１１）。プロテオグリカンに結合しているGAG鎖の特異的な糖鎖構造がプロテオグリカンの多彩な機能を担うと考えられており、プロテオグリカンはGAGの骨格構造に基づいて、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケタラン硫酸プロテオグリカンと4つに大別される（非特許文献１２〜１８）。この中で、ヘパラン硫酸プロテオグリカンに関しては、多彩なサイトカイン、接着分子、ケモカインと結合し、その機能を大きく修飾するため幅広く研究されてきている。このヘパラン硫酸プロテオグリカンの減少とPEの発症との関連を示唆する報告もある（非特許文献１９、２０）。
【０００８】
一方、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンに関しては、胎生時期には必須分子で、各臓器に豊富に存在するが、出生、成長、老化に伴い減少することが知られているが、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生体内機能は未だ明らかとなっていない。近年では、CSPGを遺伝的に欠損させたマウスが胎生致死や器官形成不全に陥ることが判明したことから、CSPGは生体に必須の分子であるとの認識が強まっている。
【０００９】
また、PEとCSPGに関する報告では加齢に伴う肺組織中のCSPGの減少とPEの発症の関連を示唆する報告があった（非特許文献２１）。またRao らはヒト白血球由来エラスターゼ用いたPEハムスターモデルにおいて、CSPGを含む硫酸化多糖体の投与がPEを抑制したとの報告をしている（非特許文献２２）。しかしながら、PE発症とCSPGとの関連は明確にはなっていない。
【００１０】
【非特許文献１】日本呼吸器学会COPDガイドライン作製委員会：COPD診断と治療のためのガイドライン1999
【非特許文献２】Hoshino.Y, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.(2001) 281(2):L509-16
【非特許文献３】Aoshiba K, Am J Respir Cell Mol Biol. (2003) 28(5):555-62
【非特許文献４】Am J Respir Crit Care Med. 1996 Feb;153(2):530-4
【非特許文献５】Am Rev Respir Dis. 1987 Sep;136(3):779-82
【非特許文献６】Eur Respir J. 1999 Jul;14(1):160-5
【非特許文献７】J Pathol. 2000 Apr;190(5):619-26
【非特許文献８】Selman M: Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2003 Nov;285(5):L1026-36
【非特許文献９】Funada Y: Kobe J.Med.Sci 2004 vol.50(3) P59-67
【非特許文献１０】Berfield M: Annu Rev Biochem 1999 68:729-777
【非特許文献１１】Iozzo RV: Annu Rev Biochem 1998 67:609-652
【非特許文献１２】Lindahl, U et al. (1972) In Glycoproteins (Gottschalk, A. ed)pp. 491-517, Elsevier, New York.
【非特許文献１３】Oegema, T et al. J. Biol. (1984) Chem. 259, 1720-1726 15
【非特許文献１４】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1988) 263, 10168-10174
【非特許文献１５】Sugahara, K et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6027-6035
【非特許文献１６】De Waard et al. J. Biol. Chem. (1992) 267, 6036-6043
【非特許文献１７】Moses, J, Oldberg et al. Eur. J.Biol. (1992) 248, 521-526, 19
【非特許文献１８】Yamada, S et al. Trends in Glycoscience and Glycotechnology, .(1998) 10, 95-123
【非特許文献１９】van Straaten JF Mod Pathol 1999 Jul;12(7):697-705
【非特許文献２０】van Kuppevelt TH: Am J Respir Cell Mol Biol. 1997 Jan;16(1):75-84
【非特許文献２１】Konno K Am Rev Respir Dis 1982 Nov;126(5):797-801
【非特許文献２２】Rao NV Am Rev Respir Dis 1990 Aug; 142(2):407
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、閉塞性換気障害抑制剤、および該薬剤を有効成分とする慢性閉塞性肺疾患の治療剤、並びに、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、そのような薬剤を開発する鋭意研究を重ねるうち、従来考えられていた肺気腫病変の病因とはされていなかったCSPGの過剰な蓄積が肺の組織破壊を亢進もしくは組織修復を阻害し、肺気腫病変の発症増悪に寄与しているのではないかと考えた。本発明者らは、この考えに基づいて研究を重ねた結果、コンドロイチナーゼ（コンドロイチネース）ABCが肺気腫病変に蓄積したCSPGを効率よく分解し、コンドロイチナーゼABCを被検体に投与することにより肺組織の気腫化を顕著に抑制できることを見出した。さらにCSPGの生体内での合成に必須のC6硫酸化酵素の遺伝子発現を抑える遺伝子治療薬（C6STアンチセンス薬）、CSPGの構成成分であるN-アセチルガラクトサミン（GalNAc）のC4硫酸化酵素及びC6硫酸化酵素の遺伝子発現を抑える遺伝子治療薬（GalNAcアンチセンス薬）がコンドロイチナーゼABCとともに、in vivoで肺の気腫病変に伴う呼吸機能等の臨床症状を改善することを見いだし、本発明を完成させた。
【００１３】
本発明は、閉塞性換気障害抑制剤、および該薬剤を有効成分とする慢性閉塞性肺疾患の治療剤、並びに、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法等に関し、より具体的には、
〔１〕 コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、閉塞性換気障害抑制剤、
〔２〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔３〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔４〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔５〕 前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、〔１〕に記載の薬剤、
〔６〕 肺においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の薬剤、
〔７〕 慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用の、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の薬剤、
〔８〕 前記慢性閉塞性肺疾患が、肺気腫である、〔７〕に記載の薬剤、
〔９〕 前記慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎である、〔７〕に記載の薬剤、
〔１０〕 被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法、
〔１１〕 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、〔１０〕に記載のスクリーニング方法、
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
〔１２〕 前記閉塞性換気障害抑制剤が、慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用である、〔１０〕または〔１１〕に記載のスクリーニング方法、
を、提供するものである。
さらに本発明は、以下に関する。
〔１３〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤の、閉塞性換気障害抑制剤の製造における使用、
〔１４〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤を、個体（患者等）へ投与する工程を含む、慢性閉塞性肺疾患の治療方法、
〔１５〕 〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の薬剤および薬学的に許容された担体を含んでなる組成物。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、CSPGの肺組織への沈着抑制を目的とし、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの脱硫酸化作用、CSPGの硫酸化阻害作用を機序とする肺の気腫性病変抑制又は、COPDの治療・予防に好適である気腫性病変抑制剤、COPDの治療・予防薬に関するもの、気腫性病変の抑制方法、COPDの治療・予防方法を提供することを１つの目的とする。
本発明によって、閉塞性換気障害の発症にコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積が関係していることが明らかになった。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成や蓄積を阻害することにより閉塞性換気障害の発症が抑制されることが示された。これまでにない新しいコンセプトの慢性閉塞性肺疾患治療薬が提供できることになる。特に慢性閉塞性肺疾患の一つである肺気腫は本邦において患者予備軍が約３００万人にものぼり、新しいコンセプトの治療薬剤は医療上また産業上も重要な意義を持つ。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
代表的な慢性閉塞性肺疾患の一つである肺気腫に伴う病態として、肺における終末細気管支以下の気道と肺胞壁の破壊及び非可逆的な気腔の拡張などの病変がある。本発明者らは、これら肺における病変の改善を肺気腫治療の有効な方法の一つとするため、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの機能に着目した。そして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積を抑制する状態をモデルマウスにおいて作出し、詳細に解析したところ、肺胞隔壁の消失や気腫性病変の低減など、病態の改善がみられるとともに、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの蓄積が低減している組織が観察された。即ち、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害すると、肺気腫に深く関与している肺組織におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの異常蓄積状態の改善が促進され、病態の改善につながることを見出した。
【００１６】
本発明は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、閉塞性換気障害抑制剤に関する。
【００１７】
本発明の「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、プロテオグリカンの一つであり、代表的な硫酸化ムコ多糖であるコンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸とタンパク質（コアタンパク質）との共有結合化合物の総称である。本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」は、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであることが好ましいが、その由来する生物種は特に制限されず、ヒト以外の生物におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質（ホモログ・オルソログ等）も本発明における「コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」に含まれる。例えば、ヒトコンドロイチン硫酸プロテオグリカンに相当するタンパク質を有し、かつ、ヒトのコンドロイチン硫酸プロテオグリカンと同等なタンパク質を有する生物であれば、本発明を実施することは可能である。また本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンには、炎症などで一時的にグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合しプロテオグリカンになるもの、いわゆるパートタイムプロテオグリカンも含まれる。
【００１８】
以下の記載において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbを例示する。本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンはこれらに限られず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を持つ物質であればよい。ここでコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの活性とは、例えば細胞接着能、または細胞増殖促進などが挙げられる。当業者は次のような方法でコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとしての活性を評価することができる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのアミノ酸配列の一部の領域を含むタンパク質、または一部の領域と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有するタンパク質の存在下で腫瘍細胞（例えばCaco-2、HT-29細胞など）の分裂増殖を測定する。分裂増殖を促進する効果を持つタンパク質をコンドロイチン硫酸プロテオグリカン活性を有するタンパク質として判定できる（Int J Exp Pathol. 2005 Aug;86(4):219-29およびHistochem Cell Biol. 2005 Aug;124(2):139-49）。ここで高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、 97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。
【００１９】
本発明における「閉塞性換気障害」とは、肺、気管支など呼吸器系が行う一連の換気のプロセスにおいて異常が見られる状態を指す。例えば、気道、肺胞壁の破壊、気腔の拡張などが挙げられるが、これらには限られない。
【００２０】
本発明におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する」とは、例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」、「合成阻害」、「脱硫酸化」、「硫酸化阻害」などが挙げられるが、これらには限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量、機能または活性が比較対象よりも低下または消失させることをいう。本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「生成もしくは蓄積を阻害する物質」とは、特に制限されないが、好ましくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進作用を有する物質」、「合成阻害作用を有する物質」、「脱硫酸化作用を有する物質」、または「硫酸化阻害作用を有する物質」である。
【００２１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」とは、たとえばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現の阻害・存在の減少が挙げられる。ここで「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質が挙げられる。また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばβglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質が挙げられる。これらはいずれも例示であり、これらに限らず広くコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質であればよい。
【００２２】
「発現」とは遺伝子からの「転写」あるいはポリペプチドへの「翻訳」及びタンパク質の「分解抑制」によるものが含まれる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の発現」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質をコードする遺伝子の転写および翻訳が生じること、またはこれらの転写・翻訳によりコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質が生成されることを意味する。また、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアとなるタンパク質の機能」とは、例えば、該タンパク質がコンドロイチン硫酸と結合する機能や、その他の細胞中の構成要素との結合等を挙げることができる。上述の各種機能は、当業者においては、一般的な技術を用いて、適宜、評価（測定）することが可能である。具体的には、後述の実施例に記載の方法、あるいは該方法を適宜改変して実施することができる。
【００２３】
さらにまた、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素の発現の上昇であってもよい。これらの酵素の例としては、メタロプロテイナーゼ（例えばADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5など）やコンドロイチナーゼ、Calpain Iなどが挙げられるが、これらには限られない。また「分解促進」は、これらの酵素または酵素の一部の投与により生ずる、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの存在量の減少であってもよい。
【００２４】
また「分解促進」は、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの発現の抑制を促す物質の投与により生じるものであってもよい。これらの物質には例えばn-butylate、Diethylcarbamazepine、Tunicamycin、non-steroidal estrogen、Cyclofenil deiphenolなどが挙げられるが、これらには限られない。
【００２５】
「分解促進作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００２６】
また「分解促進作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質と結合する低分子化合物
【００２７】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「合成阻害」とは、たとえばグリコサミノグリカンの生合成の阻害、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成に関わる酵素の阻害などが挙げられるが、必ずしもこれらに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程のいずれかを阻害することを指す。
【００２８】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成を阻害する物質として、グリコサミノグリカンの生合成を阻害する物質としては、たとえば、β-D-xyloside、2-deoxy-D-glucose（2-DG）、ethane-1-hydroxy-1,1-diphosphonate（ETDP）、5-hexyl-2-deoxyuridine（HUdR）などが挙げられる。これらをはじめとした物質によりグリコサミノグリカンの生合成が阻害され、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
一方、コンドロイチン合成に関わる酵素としては、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどが挙げられる。これらをはじめとした酵素を阻害、発現の抑制等を行うことにより、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成が阻害される。
【００２９】
「合成阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３０】
また「合成阻害作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素に対してドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成酵素と結合する低分子化合物
【００３１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「脱硫酸化」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン中の硫酸基が除かれることを指し、例えば内在性あるいは外部から投与される脱硫酸化酵素による脱硫酸化、または硫酸化を抑制する化合物による硫酸化の抑制などが挙げられるが、これらに限られず、硫酸基が除去される過程を指す。
【００３２】
脱硫酸化酵素としては、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseが挙げられる。また、硫酸化を抑制する化合物としては、たとえばChlorate、EGF receptor antagonistなどが挙げられる。
【００３３】
「脱硫酸化作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３４】
また「脱硫酸化作用を有する物質」としては例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制タンパク質に対して、ドミナントネガティブの性質を有するコンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化抑制タンパク質変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化酵素抑制化合物と結合する低分子化合物
【００３５】
ここで「脱硫酸化抑制化合物」は、タンパク質には限られず、例えば補酵素など非タンパク質化合物を含む。
【００３６】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの「硫酸化阻害作用」とは、例えば、硫酸基転移酵素の阻害が挙げられるが、これに限らず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンが合成される過程に生じる硫酸化が阻害されることを指す。
【００３７】
硫酸基転移酵素としては、例えば、C4ST-1（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1）、C4ST-2（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2）、C4ST-3（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3）、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などが挙げられる。
【００３８】
「硫酸化阻害作用を有する物質」の好ましい態様としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物（核酸）を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物またはその一部に対するアンチセンス核酸
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有する核酸
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現をRNAi効果により阻害する作用を有する核酸
【００３９】
また「硫酸化阻害作用を有する物質」としては、例えば以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される化合物を挙げることができる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する抗体
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素変異体
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸基転移酵素と結合する低分子化合物
【００４０】
上記例示した酵素は、一遺伝子に対応する一酵素を示すのみならず、ある特徴を共有する酵素群をも含む。例えばコンドロイチナーゼは、ムコ多糖分解酵素という特徴は共有するが基質特異性などの異なるABC、AC、Bなどの酵素の総称である。例えば、コンドロイチナーゼAC Iは、コンドロイチン硫酸類（A、CまたはE）、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸-デルマタン硫酸ハイブリッド型およびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-グルクロン酸残基を持つオリゴ糖を生成する。本酵素はデルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B，ヘキスロン酸としてL-イズロン酸を持つもの）、ケタラン硫酸、ヘパラン硫酸およびヘパリンには作用しない。また、コンドロイチナーゼAC II は、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸CのN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、Δ4-不飽和二糖（ΔDi-0S、ΔDi-4SおよびΔDi-6S）を生成する。本酵素はヒアルロン酸にもよく作用する。デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸B）には作用せず、本酵素の競合的阻害剤となる。コンドロイチナーゼB（デルマタナーゼ）は、デルマタン硫酸のL-イズロン酸に結合したN-アセチルガラクトサミニド結合を脱離反応的に切断し、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つオリゴ糖（2糖および4糖）を生成する。本酵素はL-イズロン酸を含まないコンドロイチン硫酸Aおよびコンドロイチン硫酸Cには作用しない。デルマタン硫酸の硫酸基を除去した誘導体であるデルマタンは、この酵素の基質とはならない。デルマタン硫酸のL-イズロン酸単位の第2位が硫酸化されている箇所はこの酵素によってよりよく切断される。コンドロイチナーゼABCは、コンドロイチン硫酸A、コンドロイチン硫酸C、デルマタン硫酸、コンドロイチンおよびヒアルロン酸のN-アセチルヘキソサミニド結合を脱離反応的に切断して、非還元末端にΔ4-ヘキスロン酸残基を持つ二糖を主に生成する。本酵素はケタラン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸には作用しない。コンドロイチナーゼはこのような、異なる性質を持っていながらもムコ多糖分解酵素という共通の性質を持つ酵素の総称であり、必ずしもここで例示したChondroitinase ACI、Chondroitinase AC II、Chondrotinase B、Chondroitinase ABCには限られない。
【００４１】
また、このような特徴を共有する酵素群は、必ずしもゲノムDNA上の一遺伝子に対応するものではない。例えば、chondroitin-4-sulfatase、chondroitin-6-sulfataseは、ともにゲノムデータベース上の複数のアクセッション番号で参照される配列（例えばGenbankアクセッション番号NT_039500（その一部はアクセッション番号CAAA01098429（配列番号：８６）としてあらわされる）、NT_078575、NT_039353、NW_001030904、NW_001030811、NW_001030796、NW_000349）として公共遺伝子データベースGenbank上で検索される。
【００４２】
上記に例示したもののうち個別の遺伝子に対応しているものは下記のように示される。すなわち、上記のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンとして例示した、aggrican、versican、neurocan、brevican、βglycan、Decorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lb、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを切断あるいは分解する酵素またはこれらに関連する酵素として例示した、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Calpain I、コンドロイチン合成に関わる酵素として例示した、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylT、硫酸基転移酵素として例示した、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3、D4ST、C6ST-1、C6ST-2をそれぞれヒトにおいてコードする遺伝子の公共遺伝子データベースGenbankにおけるアクセッション番号、塩基配列、アミノ酸配列は、次の通りである。
aggrican（アクセッション番号NM_007424、塩基配列の配列番号：１、アミノ酸配列の配列番号：２）
versican（アクセッション番号BC096495、塩基配列の配列番号：３、アミノ酸配列の配列番号：４）
neurocan（アクセッション番号NM_010875、塩基配列の配列番号：５、アミノ酸配列の配列番号：６）
brevican（アクセッション番号NM_007529、塩基配列の配列番号：７、アミノ酸配列の配列番号：８）
βglycan（アクセッション番号AF039601、塩基配列の配列番号：９、アミノ酸配列の配列番号：１０）
Decorin（アクセッション番号NM_007833、塩基配列の配列番号：１１、アミノ酸配列の配列番号：１２）
Biglycan（アクセッション番号BC057185、塩基配列の配列番号：１３、アミノ酸配列の配列番号：１４）
Fibromodulin（アクセッション番号NM_021355、塩基配列の配列番号：１５、アミノ酸配列の配列番号：１６）
PG-Lb（アクセッション番号NM_007884、塩基配列の配列番号：１７、アミノ酸配列の配列番号：１８）
ADAMTS-1（アクセッション番号NM_009621、塩基配列の配列番号：１９、アミノ酸配列の配列番号：２０）
ADAMTS-4（アクセッション番号NM_172845、塩基配列の配列番号：２１、アミノ酸配列の配列番号：２２）
ADAMTS-5（アクセッション番号AF140673、塩基配列の配列番号：２３、アミノ酸配列の配列番号：２４）
Calpain I（アクセッション番号NM_007600、塩基配列の配列番号：２５、アミノ酸配列の配列番号：２６）
GalNAc4ST-1（アクセッション番号NM_175140、塩基配列の配列番号：２７、アミノ酸配列の配列番号：２８）
GalNAc4ST-2（アクセッション番号NM_199055、塩基配列の配列番号：２９、アミノ酸配列の配列番号：３０）
GALNAC4S-6ST（アクセッション番号NM_029935、塩基配列の配列番号：３１、アミノ酸配列の配列番号：３２）
UA2OST（アクセッション番号NM_177387、塩基配列の配列番号：３３、アミノ酸配列の配列番号：３４）
GalT-I（アクセッション番号NM_016769、塩基配列の配列番号：３５、アミノ酸配列の配列番号：３６）
GalT-II（アクセッション番号BC064767、塩基配列の配列番号：３７、アミノ酸配列の配列番号：３８）
GlcAT-I（アクセッション番号BC058082、塩基配列の配列番号：３９、アミノ酸配列の配列番号：４０、またはアクセッション番号NM_024256、塩基配列の配列番号：４１、アミノ酸配列の配列番号：４２）
XylosylT（アクセッション番号NM_145828、塩基配列の配列番号：４３、アミノ酸配列の配列番号：４４）
C4ST-1（アクセッション番号NM_021439、塩基配列の配列番号：４５、アミノ酸配列の配列番号：４６）
C4ST-2（アクセッション番号NM_021528、塩基配列の配列番号：４７、アミノ酸配列の配列番号：４８）
C4ST-3（アクセッション番号XM_355798、塩基配列の配列番号：４９、アミノ酸配列の配列番号：５０）
D4ST（アクセッション番号NM_028117、塩基配列の配列番号：５１、アミノ酸配列の配列番号：５２）
C6ST-1（アクセッション番号NM_016803、塩基配列の配列番号：５３、アミノ酸配列の配列番号：５４）
C6ST-2（アクセッション番号AB046929、塩基配列の配列番号：５５、アミノ酸配列の配列番号：５６）
【００４３】
上記以外のタンパク質であっても、例えば配列表に記載された配列と高い相同性（通常70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上）を有し、かつ、上記タンパク質が有する機能（例えば細胞内の構成成分と結合する機能等）を持つタンパク質は、本発明の上記タンパク質に含まれる。上記タンパク質とは、例えば、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６のいずれかに記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が付加、欠失、置換、挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、通常変化するアミノ酸数が30アミノ酸以内、好ましくは10アミノ酸以内、より好ましくは5アミノ酸以内、最も好ましくは3アミノ酸以内である。
【００４４】
本発明における上記遺伝子には、例えば、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物における内在性の遺伝子（ヒトの上記遺伝子のホモログ等）が含まれる。
【００４５】
また、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載の塩基配列からなるDNAに対応する他の生物の内在性のDNAは、一般的に、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５のいずれかに記載のDNAと高い相同性を有する。高い相同性とは、50％以上、好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上（例えば、95％以上、さらには96％、97％、98％または99％以上）の相同性を意味する。この相同性は、mBLASTアルゴリズム（Altschul et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-7）によって決定することができる。また、該DNAは、生体内から単離した場合、それぞれ配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５に記載のDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすると考えられる。ここで「ストリンジェントな条件」としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」の条件を挙げることができる。
【００４６】
当業者は、上記の高い相同性を持つタンパク質から、上記のタンパク質に機能的に同等なタンパク質を、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用、合成阻害作用、脱硫酸化作用または硫酸化阻害作用の活性測定方法を用いることにより適宜取得することができる。具体的な活性測定方法は、後出の本発明におけるスクリーニング方法の項にて記載される。また当業者においては、他の生物における上記遺伝子に相当する内在性の遺伝子を、上記遺伝子の塩基配列を基に適宜取得することが可能である。なお、本明細書においては、ヒト以外の生物における上記タンパク質および遺伝子に相当する上記タンパク質および遺伝子、あるいは、上述のタンパク質および遺伝子と機能的に同等な上記タンパク質および遺伝子も、単に上記の名称で記載する場合がある。
【００４７】
本発明の上記タンパク質は、天然のタンパク質としてのほか、遺伝子組み換え技術を利用した組換えタンパク質として調製することができる。天然のタンパク質としては、例えば上記タンパク質が発現していると考えられる細胞（組織）の抽出液に対し、上記タンパク質に対する抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを用いる方法により調製することが可能である。一方、組換えタンパク質は、例えば、上記タンパク質をコードするDNAで形質転換した細胞を培養することにより、調製することが可能である。本発明の上記タンパク質は、例えば、後述のスクリーニング方法において好適に用いられる。
【００４８】
本発明における「核酸」とはRNAまたはDNAを意味する。また所謂PNA（peptide nucleic acid）等の化学合成核酸アナログも、本発明の核酸に含まれる。PNAは、核酸の基本骨格構造である五単糖・リン酸骨格を、グリシンを単位とするポリアミド骨格に置換したもので、核酸によく似た３次元構造を有する。
【００４９】
特定の内在性遺伝子の発現を阻害する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者によく知られている。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発現を阻害する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。即ち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が作られた部位とのハイブリッド形成による転写阻害、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点におけるハイブリッド形成によるスプライシング阻害、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行阻害、キャッピング部位やポリ(A)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング阻害、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始阻害、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳阻害、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻害、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現阻害などである。このようにアンチセンス核酸は、転写、スプライシングまたは翻訳など様々な過程を阻害することで、標的遺伝子の発現を阻害する（平島および井上, 新生化学実験講座2 核酸IV遺伝子の複製と発現, 日本生化学会編, 東京化学同人, 1993, 319-347.）。
【００５０】
本発明で用いられるアンチセンス核酸は、上記のいずれの作用により、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素のいずれかをコードする遺伝子の発現および／または機能を阻害してもよい。一つの態様としては、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的と考えられる。また、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用することができる。このように、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の翻訳領域だけでなく、非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明で利用されるアンチセンス核酸に含まれる。使用されるアンチセンス核酸は、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは 3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製された核酸は、公知の方法を用いることで所望の動物（細胞）に形質転換することができる。アンチセンス核酸の配列は、形質転換される動物（細胞）が有する内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90%以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に阻害するには、アンチセンス核酸の長さは少なくとも15塩基以上25塩基未満であることが好ましいが、本発明のアンチセンス核酸は必ずしもこの長さに限定されず、例えば100塩基以上、または 500塩基以上であってもよい。
【００５１】
本発明のアンチセンス核酸は特に制限されないが、例えばVersican遺伝子の塩基配列（GenBankのアクセッション番号BC096495、配列番号：３）、C4ST-1（GenBankのアクセッション番号NM_021439、配列番号：４５）、C4ST-2（GenBankのアクセッション番号NM_021528、配列番号：４７）、C4ST-3（GenBankのアクセッション番号XM_355798、配列番号：４９）等をもとに作成することができる。
【００５２】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現の阻害は、リボザイム、またはリボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子を指す。リボザイムには種々の活性を有するものが存在するが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムに焦点を当てた研究により、RNAを部位特異的に切断するリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型やRNase Pに含まれるM1 RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある（小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.）。
【００５３】
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15という配列のC15の3'側を切断するが、その活性にはU14とA9との塩基対形成が重要とされ、C15の代わりにA15またはU15でも切断され得ることが示されている（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.）。基質結合部位が標的部位近傍のRNA配列と相補的なリボザイムを設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することができる（Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285.、小泉誠および大塚栄子, タンパク質核酸酵素, 1990, 35, 2191.、Koizumi, M. et al., Nucl Acids Res, 1989, 17, 7059.）。
【００５４】
また、ヘアピン型リボザイムも本発明の目的に有用である。このリボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される（Buzayan, JM., Nature, 1986, 323, 349.）。ヘアピン型リボザイムからも、標的特異的なRNA切断リボザイムを作出できることが示されている（Kikuchi, Y.& Sasaki, N., Nucl Acids Res, 1991, 19, 6751.、菊池洋, 化学と生物, 1992, 30, 112.）。このように、リボザイムを用いて上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写産物を特異的に切断することで、該遺伝子の発現を阻害することができる。
【００５５】
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二本鎖RNAを用いたRNA干渉（RNA interference、以下「RNAi」と略称する）によっても行うことができる。
【００５６】
近年のゲノムプロジェクトの完了によってヒトの全塩基配列が解読され数多くの疾患関連遺伝子が盛んに同定されている現在、特定の遺伝子を標的とした治療法、創薬開発が盛んに実施されている。中でも特異的転写後抑制効果を発揮するsmall interfering RNA（siRNA）の遺伝子治療への応用が注目されている。RNAiは、2本鎖RNA（dsRNA）が直接細胞内に取り込まれると、このdsRNAと相同な配列を持つ遺伝子の発現が抑えられ現在注目を浴びている手法である。哺乳類細胞においては、短鎖dsRNA（siRNA）を用いることにより、RNAiを誘導する事が可能で、RNAiは、ノックアウトマウスと比較して、効果が安定、実験が容易、費用が安価であるなど、多くの利点を有している。
【００５７】
RNAi効果による阻害作用を有する核酸は、一般的にsiRNAもしくはshRNAとも呼ばれる。RNAiは、標的遺伝子のmRNAと相同な配列からなるセンスRNAとこれと相補的な配列からなるアンチセンスRNAとからなる短鎖二本鎖RNA（以下、「dsRNA」と略称する）を細胞等に導入することにより、標的遺伝子mRNAに特異的かつ選択的に結合して破壊を誘導し、当該標的遺伝子を切断することにより標的遺伝子の発現を効率よく阻害する（抑制する）現象である。例えば、dsRNAを細胞内に導入すると、そのRNAと相同配列の遺伝子の発現が抑制（ノックダウン）される。このようにRNAiは、標的遺伝子の発現を抑制し得ることから、従来の煩雑で効率の低い相同組換えによる遺伝子破壊方法に代わる簡易な遺伝子ノックアウト方法として、または、遺伝子治療への応用可能な方法として注目されている。RNAiに用いるRNAは、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と必ずしも完全に同一である必要はないが、完全な相同性を有することが好ましい。
【００５８】
siRNAの設計にあたっては、ターゲットとしては上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子であれば特に限定されるものではなく、任意の領域を全てターゲット候補とすることが可能である。例えば、Versican遺伝子の塩基配列（配列番号：３）、C4ST-1遺伝子の塩基配列（配列番号：４５）、C4ST-2遺伝子の塩基配列（配列番号：４７）、C4ST-3遺伝子の塩基配列（配列番号：４９）等をもとに作成することができる。より具体的には、その配列の一部の領域をターゲット候補とすることが可能であり、例えば、Versican遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５７）、C4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５８）、C4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：５９）、C4ST-3遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６０）、C6ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６１）、C6ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６２）、GalNAc4ST-1遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６３）、GalNAc4ST-2遺伝子の塩基配列の一部領域（配列番号：６４）、GALNAC4S-6STの塩基配列の一部領域（配列番号：６５）等をもとに作成することができる。さらに具体的には、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜８５）を標的とするsiRNAが例示できる。
【００５９】
siRNAを細胞に導入するには、in vitroで合成したsiRNAをプラスミドDNAに連結してこれを細胞に導入する方法、２本のRNAをアニールする方法などを採用することができる。
【００６０】
また上記２本のRNA分子は、ここで一方の端が閉じた構造の分子、例えば、ヘアピン構造を有するsiRNA（shRNA）であってもよい。shRNAとは、ショートヘアピンRNA（short hairpin RNA）と呼ばれ、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するRNA分子である。即ち、分子内において二本鎖RNA構造を形成し得る分子もまた本発明のsiRNAに含まれる。
【００６１】
また本発明の好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）であって、本明細書によって具体的に示されたDNA配列（配列番号：６７〜８５）を標的とするsiRNAにおいて、例えば、１もしくは少数のRNAが付加もしくは欠失された構造の二本鎖RNAであっても、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を抑制する機能を有するものであれば、本発明のsiRNAに含まれる。
【００６２】
RNAi（siRNA）のために使用されるRNAは、上記タンパク質をコードする遺伝子もしくは該遺伝子の部分領域と完全に同一（相同）である必要はないが、完全な同一（相同）性を有することが好ましい。
【００６３】
RNAi機構の詳細については未だに不明な部分もあるが、DICERといわれる酵素（RNase III核酸分解酵素ファミリーの一種）が二本鎖RNAと接触し、二本鎖RNAがsmall interfering RNAまたはsiRNAと呼ばれる小さな断片に分解されるものと考えられている。本発明におけるRNAi効果を有する二本鎖RNAには、このようにDICERによって分解される前の二本鎖RNAも含まれる。即ち、そのままの長さではRNAi効果を有さないような長鎖のRNAであっても、細胞においてRNAi効果を有するsiRNAへ分解されることが期待されるため、本発明における二本鎖RNAの長さは、特に制限されない。
【００６４】
例えば、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のmRNAの全長もしくはほぼ全長の領域に対応する長鎖二本鎖RNAを、例えば、予めDICERで分解させ、その分解産物を本発明の薬剤として利用することが可能である。この分解産物には、RNAi効果を有する二本鎖RNA分子（siRNA）が含まれることが期待される。この方法によれば、RNAi効果を有することが期待されるmRNA上の領域を、特に選択しなくともよい。即ち、RNAi効果を有する本発明の上述の遺伝子のmRNA上の領域は、必ずしも正確に規定される必要はない。
【００６５】
本発明の上記「RNAi効果により抑制し得る二本鎖RNA」は、当業者においては、該二本鎖RNAの標的となる上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の塩基配列を基に、適宜作製することができる。一例を示せば、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、本発明の二本鎖RNAを作製することができる。即ち、配列番号：６７に記載の塩基配列をもとに、該配列の転写産物であるmRNAの任意の連続するRNA領域を選択し、この領域に対応する二本鎖RNAを作製することは、当業者においては、通常の試行の範囲内において適宜行い得ることである。また、該配列の転写産物であるmRNA配列から、より強いRNAi効果を有するsiRNA配列を選択することも、当業者においては、公知の方法によって適宜実施することが可能である。また、一方の鎖が判明していれば、当業者においては容易に他方の鎖（相補鎖）の塩基配列を知ることができる。siRNAは、当業者においては市販の核酸合成機を用いて適宜作製することが可能である。また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。
【００６６】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも標的配列に対する一組の２本鎖RNAである必要はなく、標的配列を含んだ領域に対する複数組の２本鎖RNAの混合物であってもよい。ここで標的配列に対応した核酸混合物としてのsiRNAは、当業者においては市販の核酸合成機およびDICER酵素を用いて適宜作成することが可能であり、また、所望のRNAの合成については、一般の合成受託サービスを利用することができる。なお、本発明のsiRNAには、所謂「カクテルsiRNA」が含まれる。
【００６７】
また、本発明におけるsiRNAは、必ずしも全てのヌクレオチドがリボヌクレオチド（RNA）でなくともよい。即ち、本発明において、siRNAを構成する１もしくは複数のリボヌクレオチドは、対応するデオキシリボヌクレオチドであってもよい。この「対応する」とは、糖部分の構造は異なるものの、同一の塩基種（アデニン、グアニン、シトシン、チミン（ウラシル））であることを指す。例えば、アデニンを有するリボヌクレオチドに対応するデオキシリボヌクレオチドとは、アデニンを有するデオキシリボヌクレオチドのことを言う。また、前記「複数」とは特に制限されないが、好ましくは２〜５個程度の少数を指す。
【００６８】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のタンパク質をコードする遺伝子の発現を抑制し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば、本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００６９】
また、本発明の発現阻害物質には、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現調節領域（例えば、プロモーター領域。具体的な例としては、PG-Lbのプロモーター領域である配列番号：６６で表される塩基配列が挙げられる。）と結合することにより、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害する化合物が含まれる。該化合物は、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子のプロモーターDNA断片を用いて、該DNA断片との結合活性を指標とするスクリーニング方法により、取得することが可能である。また当業者においては、所望の化合物について、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害するか否かの判定を公知の方法、例えばレポーターアッセイ法等により適宜実施することができる。
【００７０】
さらに、本発明の上記RNAを発現し得るDNA（ベクター）もまた、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の発現を阻害し得る化合物の好ましい態様に含まれる。例えば本発明の上記二本鎖RNAを発現し得るDNA（ベクター）は、該二本鎖RNAの一方の鎖をコードするDNA、および該二本鎖RNAの他方の鎖をコードするDNAが、それぞれ発現し得るようにプロモーターと連結した構造を有するDNAである。本発明の上記DNAは、当業者においては、一般的な遺伝子工学技術により、適宜作製することができる。より具体的には、本発明のRNAをコードするDNAを公知の種々の発現ベクターへ適宜挿入することによって、本発明の発現ベクターを作製することが可能である。
【００７１】
本発明の上記ベクターの好ましい態様としては、Versican、C4ST-1、C4ST-2、C4ST-3等の発現をRNAi効果により抑制し得るRNA（siRNA）を発現するベクターを挙げることができる。
【００７２】
上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体は、当業者に公知の方法により調製することが可能である。ポリクローナル抗体であれば、例えば、次のようにして得ることができる。天然の上述のタンパク質、あるいはGSTとの融合タンパク質として微生物において発現させたリコンビナント（組み換え）タンパク質、またはその部分ペプチドをウサギ等の小動物に免疫し血清を得る。これを、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することにより調製する。また、モノクローナル抗体であれば、例えば上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素やその部分ペプチドをマウスなどの小動物に免疫を行い、同マウスより脾臓を摘出し、これをすりつぶして細胞を分離し、該細胞とマウスミエローマ細胞とをポリエチレングリコール等の試薬を用いて融合させ、これによりできた融合細胞（ハイブリドーマ）の中から、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する抗体を産生するクローンを選択する。次いで、得られたハイブリドーマをマウス腹腔内に移植し、同マウスより腹水を回収し、得られたモノクローナル抗体を、例えば、硫安沈殿、プロテインA、プロテインGカラム、DEAEイオン交換クロマトグラフィー、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素のタンパク質や合成ペプチドをカップリングしたアフィニティーカラム等により精製することで、調製することが可能である。
【００７３】
本発明の抗体は、本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合するものであれば特に制限はなく、上記ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のほかにヒト抗体、遺伝子組み換えによるヒト型化抗体、さらにその抗体断片や抗体修飾物であってもよい。
【００７４】
抗体取得の感作抗原として使用される本発明のタンパク質はその由来となる動物種について制限されないが、哺乳動物、例えばマウスやヒト由来のタンパク質が好ましく、特にヒト由来のタンパク質が好ましい。ヒト由来のタンパク質は、当業者においては本明細書に開示される遺伝子配列またはアミノ酸配列を用いて適宜取得することができる。
【００７５】
本発明において、感作抗原として使用されるタンパク質は、完全なタンパク質あるいはタンパク質の部分ペプチドであってもよい。タンパク質の部分ペプチドとしては、例えば、タンパク質のアミノ基（N）末端断片やカルボキシ（C）末端断片が挙げられる。本明細書における「抗体」とはタンパク質の全長または断片に反応する抗体を意味する。
【００７６】
また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球、例えばEBウィルスに感染したヒトリンパ球をin vitroでタンパク質、タンパク質発現細胞またはその溶解物で感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞、例えばU266と融合させ、タンパク質への結合活性を有する所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを得ることもできる。
【００７７】
本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に対する抗体は、該タンパク質と結合することにより、該タンパク質の発現もしくは機能を阻害する効果が期待される。得られた抗体を人体に投与する目的（抗体治療）で使用する場合には、免疫原性を低下させるため、ヒト抗体やヒト型化抗体が好ましい。
【００７８】
さらに本発明は、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素の機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、または硫酸基転移酵素に結合する低分子量物質（低分子化合物）も含有する。該低分子量物質は、天然または人工の化合物であってもよい。通常、当業者に公知の方法を用いることによって製造または取得可能な化合物である。また本発明の化合物は、後述のスクリーニング方法によって、取得することも可能である。
【００７９】
さらに本発明の上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の発現もしくは機能を阻害し得る物質として、上述のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する変異体（ドミナントネガティブタンパク質）を挙げることができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素に対してドミナントネガティブの性質を有する該タンパク質変異体」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子を発現させることによって、内在性の野生型タンパク質の活性を消失もしくは低下させる機能を有するタンパク質を指す。このようなドミナントネガティブタンパク質としては、例えば、コンドロイチン硫酸との結合を野生型Versicanコアタンパク質と競合阻害するようなVersicanコアタンパク質変異体を挙げることができる。
【００８０】
また本発明において、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する臓器、組織または細胞は特に限定はされないが、好ましくは閉塞性換気障害に関与する呼吸器系の臓器、組織または細胞であり、より好ましくは、肺または気管支である。
【００８１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する化合物は、慢性閉塞性肺疾患の治療または予防のための薬剤となることが期待される。ここで「治療または予防」は、慢性閉塞性肺疾患を呈する臓器、組織、または細胞に対して、必ずしも完全な治療効果または予防効果を有する必要はなく、部分的な効果を有する場合であってよい。
【００８２】
本発明において慢性閉塞性肺疾患は、閉塞性換気障害を伴う疾患であれば特に限定はされないが、好ましくは肺気腫、慢性気管支炎等を挙げることができる。
【００８３】
本発明の閉塞性換気障害抑制剤は、閉塞性換気障害の原因であるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害することにより閉塞性換気障害を抑制する作用を有する。従って、本発明の好ましい態様としては、例えば、本発明の閉塞性換気障害抑制剤を有効成分とする、肺気腫治療剤または慢性気管支炎治療剤を提供する。
【００８４】
また本発明の「閉塞性換気障害抑制剤」は、「閉塞性換気障害治療剤」、または「閉塞性換気障害改善剤」等と表現することも可能である。また、本発明において「抑制剤」は、「医薬品」、「医薬組成物」、「治療用医薬」等と表現することもできる。
【００８５】
なお、本発明における「治療」には、閉塞性換気障害の発生を予め抑制し得る予防的な効果も含まれる。また、閉塞性換気障害発現細胞（組織）に対して、必ずしも、完全な治療効果を有する場合に限定されず、部分的な効果を有する場合であってもよい。
【００８６】
本発明の薬剤は、生理学的に許容される担体、賦形剤、あるいは希釈剤等と混合し、医薬組成物として経口、あるいは非経口的に投与することができる。経口剤としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型とすることができる。非経口剤としては、注射剤、点滴剤、外用薬剤、吸入剤（ネブライザー）あるいは座剤等の剤型を選択することができる。注射剤には、皮下注射剤、筋肉注射剤、腹腔内注射剤、頭蓋内投与注射剤、あるいは鼻腔内投与注射剤等を示すことができる。外用薬剤には、経鼻投与剤、あるいは軟膏剤等を示すことができる。主成分である本発明の薬剤を含むように、上記の剤型とする製剤技術は公知である。
【００８７】
例えば、経口投与用の錠剤は、本発明の薬剤に賦形剤、崩壊剤、結合剤、および滑沢剤等を加えて混合し、圧縮整形することにより製造することができる。賦形剤には、乳糖、デンプン、あるいはマンニトール等が一般に用いられる。崩壊剤としては、炭酸カルシウムやカルボキシメチルセルロースカルシウム等が一般に用いられる。結合剤には、アラビアゴム、カルボキシメチルセルロース、あるいはポリビニルピロリドンが用いられる。滑沢剤としては、タルクやステアリン酸マグネシウム等が公知である。
【００８８】
本発明の薬剤を含む錠剤は、マスキングや、腸溶性製剤とするために、公知のコーティングを施すことができる。コーティング剤には、エチルセルロースやポリオキシエチレングリコール等を用いることができる。
【００８９】
また注射剤は、主成分である本発明の薬剤を適当な分散剤とともに溶解、分散媒に溶解、あるいは分散させることにより得ることができる。分散媒の選択により、水性溶剤と油性溶剤のいずれの剤型とすることもできる。水性溶剤とするには、蒸留水、生理食塩水、あるいはリンゲル液等を分散媒とする。油性溶剤では、各種植物油やプロピレングリコール等を分散媒に利用する。このとき、必要に応じてパラベン等の保存剤を添加することもできる。また注射剤中には、塩化ナトリウムやブドウ糖等の公知の等張化剤を加えることができる。更に、塩化ベンザルコニウムや塩酸プロカインのような無痛化剤を添加することができる。
【００９０】
また、本発明の薬剤を固形、液状、あるいは半固形状の組成物とすることにより外用剤とすることができる。固形、あるいは液状の組成物については、先に述べたものと同様の組成物とすることで外用剤とすることができる。半固形状の組成物は、適当な溶剤に必要に応じて増粘剤を加えて調製することができる。溶剤には、水、エチルアルコール、あるいはポリエチレングリコール等を用いることができる。増粘剤には、一般にベントナイト、ポリビニルアルコール、アクリル酸、メタクリル酸、あるいはポリビニルピロリドン等が用いられる。この組成物には、塩化ベンザルコニウム等の保存剤を加えることができる。また、担体としてカカオ脂のような油性基材、あるいはセルロース誘導体のような水性ゲル基材を組み合わせることにより、座剤とすることもできる。
【００９１】
本発明の薬剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の薬剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００９２】
また、本発明の薬剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。siRNAやshRNAを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。閉塞性換気障害組織等に局所的に投与することもできる。siRNAはin vitroにおいては非常に優れた特異的転写後抑制効果を示すが、in vivoにおいては血清中のヌクレアーゼ活性により速やかに分解されてしまうため持続時間が限られるためより最適で効果的なデリバリーシステム開発が求められてきた。一つの例としては、Ochiya, TらのNature Med.,5:707-710,1999、Curr.Gene Ther.,1 :31-52, 2001より生体親和性材料であるアテロコラーゲンが核酸と混合し複合体を形成させると、生体中の分解酵素から核酸を保護する作用がありsiRNAのキャリアーとして非常に適しているキャリアーであると報告されているが、本発明の薬剤の導入の方法はこれには限られない。
【００９３】
本発明の薬剤は、安全とされている投与量の範囲内において、ヒトを含む哺乳動物に対して、必要量（有効量）が投与される。本発明の薬剤の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。一例を示せば、年齢、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型によって異なるが、例えばアデノウイルスの場合の投与量は1日1回あたり106〜1013個程度であり、1週〜8週間隔で投与される。
【００９４】
また、siRNAまたはshRNAを目的の組織または器官に導入するために、市販の遺伝子導入キット（例えばアデノエクスプレス：クローンテック社）を用いることもできる。
【００９５】
本発明の薬剤を使用する場合は、閉塞性換気障害を発現する疾患であれば適用部位もしくは疾患の種類は特に限定されず、例えば肺気腫、慢性気管支炎等を対象として適用される。上記疾患は、他の疾患と併発したものであってもよい。
【００９６】
また本発明は、被検試料からコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法によって、閉塞性換気障害抑制剤もしくは閉塞性換気障害抑制剤のための候補化合物を効率的に取得することができる。
【００９７】
本発明のスクリーニング方法の好ましい態様は、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
これらに共通したスクリーニングの基本的な原理として、代表的な例として、下記の工程を含むものが挙げられる。
（１）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）そのもの／もしくはグリコサミノグリカン（GAG）鎖／もしくはCSPGやGAG鎖を合成（生成）する細胞
（２）被検化合物（例えば、製薬企業の有する莫大な化合物ライブラリー）
（３）コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の切断断面／コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）量／遊離グリコサミノグリカン（GAG）量を検出する方法
上記3種のツールを用いる。（１）と（２）を試験管内、もしくは培養皿上で混合させ、その効果を（３）により簡便に検出するという手順が望ましい。
【００９８】
以下、本発明のスクリーニング方法の態様を例示する。なお、以下に記載の態様においては、用いられるコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、脱硫酸化酵素の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来するものが挙げられるが、これらに由来するものに特に制限されない。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの一部とは、グリコサミノグリカン鎖、コアタンパク質などの構成要素またはその一部であり、特に限定されない。
【００９９】
また以下に記載の態様に用いる被検化合物としては、特に制限されないが、例えば、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチドなどの単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられる。
【０１００】
また以下に記載の態様における被検化合物への「接触」は、通常、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、その一部、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制化合物、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素を被検化合物と混合することによって行うが、この方法に限定されない。例えば、これらのタンパク質またはその一部を発現する細胞を被検化合物と接触させることにより、上記「接触」を行うことができる。
【０１０１】
また以下に記載の態様における「細胞」の由来としては、ヒト、マウス、ラット等に由来する細胞が挙げられるが、これらに由来する細胞に特に制限されず、それぞれの態様において用いられるタンパク質を発現するように形質転換された大腸菌、酵母等の微生物細胞を利用することも可能である。例えば、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを発現する細胞」としては、内在性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子を発現している細胞、または外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が導入され、該遺伝子が発現している細胞を利用することができる。外来性のコンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が発現した細胞は、通常コンドロイチン硫酸プロテオグリカン遺伝子が挿入された発現ベクターを宿主細胞へ導入することにより作製することができる。該発現ベクターは、一般的な遺伝子工学技術によって作製することができる。
【０１０２】
また以下の記載において、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質」とは、例えば、matrix typeコンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、aggrican、versican、neurocan、brevicanなどのコアタンパク質、また膜型コンドロイチン硫酸プロテオグリカンであれば、例えばDecorin、Biglycan、Fibromodulin、PG-Lbなどのコアタンパク質である。また「合成酵素」は、例えば、GalNAc4ST-1、GalNAc4ST-2、GALNAC4S-6ST、UA2OST、GalT-I、GalT-II、GlcAT-I、XylosylTなどである。また「硫酸基転移酵素」は、例えば、C4ST-1（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1）、C4ST-2（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2）、C4ST-3（Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 3）、D4ST、C6ST-1、C6ST-2などである。また、「分解促進酵素」とは、例えば、ADAMTS-1、ADAMTS-4、ADAMTS-5、Chondroitinase ABC（ChABC）、Chondroitinase AC、Chondroitinase B、Calpain Iなどである。また「脱硫酸化酵素」は、例えば、Chondroitin-4-sulfatase、Chondroitin-6-sulfataseなどである。
【０１０３】
本発明のスクリーニング方法の態様として、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用を有する化合物を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、存在量を低下させる物質を選択する工程
【０１０４】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１０５】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に結合する標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１０６】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１０７】
被検化合物が上記(a)分解促進作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１０８】
上記(a) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用に関するスクリーニング方法態様：
CS-GAGとして、コンドロイチン硫酸A（CS-A）、CS-B、CS-C（生化学工業社、ICN社、Sigma社など）、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１０９】
検出方法としては、例えばWFAレクチン（ノダフジレクチン）結合法が簡便な手法として挙げられる。WFAレクチンはCS-GAG鎖のGalNAc残基に結合するため、CS-GAGを簡便に検出できる。被検化合物の陽性コントロールとしてはコンドロイチナーゼABCを使用する。コンドロイチナーゼABC添加により、CS-GAG鎖が分解されるとWFAレクチンが結合できなくなるため、その原理を利用する。より具体的には、FITC標識WFAレクチン（EY社など）を、被検化合物混合前後でCSコーティング・ウェルに添加し、CS-GAGが分解される事により、ウェル中のFITC蛍光強度の変化を蛍光プレートリーダーあるいは蛍光顕微鏡などの検出機器により極めて簡便に定量・数値化できる。混合前後で最も蛍光数値を減少させた化合物が、本コンセプトを満たす新規の治療候補化合物として判定できる。
【０１１０】
また、他の検出方法として、CS-GAGそのものを直接的に標識する抗CS抗体（クローン：CS56、生化学工業社製）を使用する事ができる。WFAレクチンと同様に、FITC標識抗CS抗体をCSコーティング・ウェルに添加する事で、蛍光数値の変化を見れば、極めて短時間かつ簡便に大量スクリーニングができる。
【０１１１】
より詳細な検出方法として、被検化合物混合前後のプレートをそのまま使用し、sGAG Assay Kit（WIESLAB社製）、Sulphanated Glycosaminoglycans, ELISA Kit（FUNAKOSHI社製）などを適用するにより、GAG含有量を正確に定量・数値化する方法がある。
【０１１２】
さらに詳細には、被検化合物混合前後のプレートに2-AB（2-aminobenzamide）や2-AP（2-aminopyridine；いずれもLUD社製など）を添加することにより、遊離GAG鎖の還元末端を簡便に蛍光標識し、糖鎖の各タイプや、各タイプの含有率までを、HPLC、MALDI-MS、LC-MSなどで解析する事により、より詳細な解析が可能である。候補化合物の特性を詳細に調べるという、スクリーニングの次の段階の方法である。
【０１１３】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群における、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記合成量を低下させる化合物を選択する工程
【０１１４】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞、該細胞抽出液、もしくはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成過程を構成する酵素および基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる。
【０１１５】
次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその合成過程における中間体の合成量を測定する。測定は当業者においては公知の手法、例えば、標識した抗体による方法、質量分析法、クロマトグラフィー法等によって適宜実施することができる。
【０１１６】
さらに被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、合成量を低下（抑制）させる化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１１７】
被検化合物が上記(b)合成阻害作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１１８】
上記(b) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸を合成する細胞、細胞株は当該研究者には既知である。ヒトでは例えば、健常人の末梢血を採取後、単核球を分離・培養するという標準的な方法により、16時間の細胞培養でコンドロイチン硫酸を産生してくる（Uhlin-Hansen L et al., Blood 82:2880, 1993.など）。また、より簡便には、既知の細胞株、例えば、線維芽細胞株NIH3T3（Phillip HA, et al. J. Biol. Chem. 279:48640, 2004など）、腎尿細管由来癌細胞株ACHN（Kawashima H et al., J. Biol. Chem. 277:12921, 2002）、腎遠位尿細管由来細胞株MDCK（Borges FT et al., Kidney Int. 68:1630, 2005.など）、血管内皮細胞株HUVEC（Schick BP et al., Blood 97:449, 2001など）など、多数挙げられる。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後のCS-GAG量の変化を上記（a）の方法で簡便に数値化できる。細胞培養後のCS-GAG量の増加（すなわち、CS-GAG合成量を反映する）を抑制する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１１９】
さらに、より選択的には、例えばGalNAc4ST-1やXylosylTなどのCS-GAG合成酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的にCS-GAGを合成する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１２０】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。本発明の上記方法は例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する工程
（ｃ）被検化合物の非存在下において測定した場合と比較して、硫酸化を受けていた量を低下させる物質を選択する工程
【０１２１】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検化合物を接触させる。
【０１２２】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に残存する脱硫酸化の構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１２３】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１２４】
被検化合物が上記(c)脱硫酸化作用の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１２５】
上記(c) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用に関するスクリーニング方法態様：
基本的に上記（a）の方法と同様、ヒト由来プロテオグリカン（BGN社、ISL社など）などを準備し、９６穴プレートに10μg/mLの濃度でコーティングする（Kawashima H et al.; J. Biol. Chem. 277:12921-12930, 2002.など、既知の方法による）。本プレートの各ウェルに各種の被検化合物を添加し、３７℃で２時間反応後にCS-GAGの変化を検出する。
【０１２６】
検出方法は、脱硫酸化する事により、プロテオグリカンのコア蛋白側に残存した脱硫酸化断片の２糖構造を、抗プロテオグリカンΔdi４S抗体（クローン；2-B-6、4位に硫酸化を受けていた部分を認識する）あるいは抗プロテオグリカンΔdi6S（クローン；3-B-3、6位に硫酸化を受けていた部分を認識する。ともに生化学工業社製）と反応させることで、脱硫酸化を受けた部分の検出が容易にできる。したがって、混合培養前後のプレートにおいて、FITC標識した2-B-6や3-B-3抗体を反応させ、その蛍光数値の変化を簡便に検出できる。反応前後の蛍光強度を増加させた化合物が、より脱硫酸化を促進する物質であると判定でき、本コンセプトを満たす新規治療候補化合物として簡便に同定できる。
【０１２７】
本発明のスクリーニング方法の他の態様としては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用を有する物質を選択する工程を含む方法を挙げることができる。 本発明の上記方法は、例えば以下の工程からなる。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部を発現する細胞もしくは細胞抽出液あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化過程を構成する酵素、基質などを含む物質群と被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞、細胞抽出液または物質群におけるコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化活性を測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合と比較して、前記活性を低下させる化合物を選択する工程
【０１２８】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部に被検物質を接触させる。
【０１２９】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化を受けていた量を測定する。測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。例えば、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の硫酸化構造に結合する、標識された化合物または抗体を用い、標識量を測定することにより検出することができる。また、クロマトグラフィー法や質量分析法などを用いて検出することもできる。
【０１３０】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と比較して、該コンドロイチン硫酸プロテオグリカンまたはその一部の存在量を低下させる化合物を選択する。低下させる化合物は閉塞性換気障害治療のための薬剤となる。
【０１３１】
被検化合物が上記(d)硫酸化阻害の活性を有しているか否かについて評価（測定）可能な方法、具体例の簡単な一例を以下に示す。
【０１３２】
上記(d) コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用に関するスクリーニング方法態様：
コンドロイチン硫酸の硫酸化を促進する細胞、細胞株は上記（c）に記載の細胞、細胞株と一致する。このような細胞株を一定時間培養する過程において各種被検化合物を混合し、培養前後の硫酸化の程度を、例えば、4位硫酸化を検出する抗体（クローン；LY111）や6位硫酸化を検出する抗体（クローン；MC21C、いずれも生化学工業社製）で簡便に確認できる。蛍光標識抗体を用いて、培養前後の蛍光数値を比較しても良いし、上記（c）同様に、培養前後で2-B-6や3-B-3抗体を使用した検出法を行っても良い。細胞培養後の硫酸化の増加（LY111やMC21Cの蛍光数値増加）を抑制する化合物、もしくは細胞培養後の脱硫酸化の進行（2-B-6や3-B-3の蛍光数値増加）を促進する化合物が、本コンセプトを満たす治療候補化合物として、容易に判定できる。
【０１３３】
さらに、より選択的には、例えばC4ST-1やC6ST-1などの硫酸基転移酵素の遺伝子をCHO細胞やL細胞などへ周知の方法で導入、恒常的に発現させた細胞株を作成する事ができる。このような恒常的に硫酸基を付加する細胞株を使用する事により、よりクリアーに治療候補化合物を判定する事ができる。
【０１３４】
本発明の他の好ましい態様は、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を選択する、以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法である。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記細胞における遺伝子の発現量を測定する工程
（ｃ）該発現量を被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下している化合物、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１３５】
上記方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子を発現する細胞に、被検化合物を接触させる。
【０１３６】
本方法においては次いで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の発現量を測定する。ここで「遺伝子の発現」には、転写および翻訳の双方が含まれる。遺伝子の発現量の測定は、当業者に公知の方法によって行うことができる。
【０１３７】
例えば、上記いずれかのタンパク質を発現する細胞からmRNAを定法に従って抽出し、このmRNAを鋳型としたノーザンハイブリダイゼーション法、RT- PCR法、DNAアレイ法等を実施することによって該遺伝子の転写量の測定を行うことができる。また、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現する細胞からタンパク質画分を回収し、上記いずれかのタンパク質の発現をSDS-PAGE等の電気泳動法で検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うこともできる。さらに、上記いずれかのタンパク質に対する抗体を用いて、ウェスタンブロッティング法を実施することにより該タンパク質の発現を検出することにより、遺伝子の翻訳量の測定を行うことも可能である。該タンパク質の検出に用いる抗体としては、検出可能な抗体であれば特に制限はないが、例えばモノクローナル抗体、またはポリクローナル抗体の両方を利用することができる。
【０１３８】
本方法においては、次いで、被検化合物を接触させない場合（対照）と該遺伝子の発現量を比較する。
【０１３９】
本方法においては、次いで、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１４０】
また、前記遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素である場合には、前記遺伝子の発現量が対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１４１】
また、本発明のスクリーニング方法の一態様としては、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素の遺伝子の発現レベルを低下させる化合物、あるいはコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素または脱硫酸化酵素の遺伝子の発現レベルを上昇させる化合物を、レポーター遺伝子の発現を指標として選択する方法である。本発明の上記方法は例えば以下の（ａ）〜（ｄ）の工程を含む。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するＤＮＡを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる工程
（ｂ）前記レポーター遺伝子の発現レベルを測定する工程
（ｃ）被検化合物を接触させない場合（対照）と比較する工程
（ｄ）前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下している化合物、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素に機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇している化合物を選択する工程
【０１４２】
本方法においてはまず、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞または細胞抽出液と、被検化合物を接触させる。
【０１４３】
ここで「機能的に結合した」とは、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することにより、レポーター遺伝子の発現が誘導されるように、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが結合していることをいう。従って、レポーター遺伝子が他の遺伝子と結合しており、他の遺伝子産物との融合タンパク質を形成する場合であっても、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域に転写因子が結合することによって、該融合タンパク質の発現が誘導されるものであれば、上記「機能的に結合した」の意に含まれる。コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子のcDNA塩基配列に基づいて、当業者においては、ゲノム中に存在するコンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域を周知の方法により取得することが可能である。
【０１４４】
本方法に用いるレポーター遺伝子としては、その発現が検出可能であれば特に制限はなく、例えば、CAT遺伝子、lacZ遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、およびGFP遺伝子等が挙げられる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」として、例えば、このような構造が挿入されたベクターを導入した細胞が挙げられる。このようなベクターは、当業者に周知の方法により作製することができる。ベクターの細胞への導入は、一般的な方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、電気パルス穿孔法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法等によって実施することができる。「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」には、染色体に該構造が挿入された細胞も含まれる。染色体へのDNA構造の挿入は、当業者に一般的に用いられる方法、例えば、相同組み換えを利用した遺伝子導入法により行うことができる。
【０１４５】
「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞抽出液」とは、例えば、市販の試験管内転写翻訳キットに含まれる細胞抽出液に、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを添加したものを挙げることができる。
【０１４６】
ここで「接触」は、「コンドロイチン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、硫酸基転移酵素、分解促進酵素、または脱硫酸化酵素をコードする遺伝子の転写調節領域とレポーター遺伝子とが機能的に結合した構造を有するDNAを含む細胞」の培養液に被検化合物を添加する、または該DNAを含む上記の市販された細胞抽出液に被検化合物を添加することにより行うことができる。被検化合物がタンパク質の場合には、例えば、該タンパク質を発現するDNAベクターを、該細胞へ導入することにより行うことも可能である。
【０１４７】
本方法においては、次いで、該レポーター遺伝子の発現レベルを測定する。レポーター遺伝子の発現レベルは、該レポーター遺伝子の種類に応じて、当業者に公知の方法により測定することができる。例えば、レポーター遺伝子がCAT遺伝子である場合には、該遺伝子産物によるクロラムフェニコールのアセチル化を検出することによって、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。レポーター遺伝子がlacZ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による色素化合物の発色を検出することにより、また、ルシフェラーゼ遺伝子である場合には、該遺伝子発現産物の触媒作用による蛍光化合物の蛍光を検出することにより、さらに、GFP遺伝子である場合には、GFPタンパク質による蛍光を検出することにより、レポーター遺伝子の発現量を測定することができる。
【０１４８】
本方法においては、次いで、測定したレポーター遺伝子の発現レベルを被検化合物の非存在下において測定した場合（対照）と比較する。
【０１４９】
本方法においては、次いで、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質、合成酵素、脱硫酸化酵素抑制タンパク質、または硫酸基転移酵素をコードする遺伝子と機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して低下（抑制）させている化合物を選択する。低下（抑制）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１５０】
また、前記レポーター遺伝子がコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進酵素、または脱硫酸化酵素にと機能的に結合している場合には、前記レポーター遺伝子の発現レベルが対照と比較して上昇（増強）させている化合物を選択する。上昇（増強）させる化合物は、閉塞性換気障害抑制のための薬剤もしくは閉塞性換気障害治療のための候補化合物となる。
【０１５１】
本発明のスクリーニング方法において見出される閉塞性換気障害抑制剤は、好ましくは、慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用のものである。
【０１５２】
また本発明は、本発明のスクリーニング方法を実施するために用いられる、各種薬剤・試薬等を含むキットを提供する。
【０１５３】
本発明のキットは、例えば本発明の上述の各種試薬の中から、実施するスクリーニング方法にあわせて適宜選択することができる。例えば本発明のキットは、本発明のコンドロイチン硫酸プロテオグリカンを構成要素とすることができる。本発明のキットには、さらに、本発明の方法において使用される各種試薬、容器等を含めることができる。例えば、抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体、プローブ、各種反応試薬、細胞、培養液、対照サンプル、緩衝液、使用方法を記載した指示書等を適宜含めることができる。
【０１５４】
本発明の好ましい態様においては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されているかどうかを検出する工程を含む、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法である。従って、該スクリーニング方法において、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの検出の際に利用可能な、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンのコアタンパク質をコードする遺伝子に対するプローブもしくは該遺伝子の任意の領域を増幅するためのプライマー等のオリゴヌクレオチド、または、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンを認識する抗体（抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン抗体）も、本発明の閉塞性換気障害抑制剤スクリーニング用キットの構成要素に含めることができる。
【０１５５】
上記オリゴヌクレオチドは、例えば、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子のDNAに特異的にハイブリダイズするものである。ここで「特異的にハイブリダイズする」とは、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下（例えば、サムブルックら, Molecular Cloning,Cold Spring Harbour Laboratory Press,New York,USA,第２版1989に記載の条件）において、他のタンパク質をコードするDNAとクロスハイブリダイゼーションを有意に生じないことを意味する。特異的なハイブリダイズが可能であれば、該オリゴヌクレオチドは、本発明のVersicanコアタンパク質遺伝子の塩基配列に対し、完全に相補的である必要はない。
【０１５６】
本発明においてハイブリダイゼーションの条件としては、例えば「2×SSC、0.1％SDS、50℃」、「2×SSC、0.1％SDS、42℃」、「1 ×SSC、0.1％SDS、37℃」、よりストリンジェントな条件として「2×SSC、0.1％SDS、65℃」、「0.5×SSC、0.1％SDS、 42℃」および「0.2×SSC、0.1％SDS、65℃」等の条件を挙げることができる。より詳細には、Rapid-hyb buffer（Amersham Life Science）を用いた方法として、68℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して1時間以上68℃に保ってハイブリッド形成させ、その後2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回行い、続いて1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を3回行い、最後に1×SSC、0.1％SDS中、50℃で20分間の洗浄を2回行うことができる。その他、例えばExpresshyb Hybridization Solution（CLONTECH）中、55℃で30分間以上プレハイブリダイゼーションを行った後、標識プローブを添加して37〜55℃で1時間以上インキュベートし、2×SSC、0.1％SDS中、室温で20分間の洗浄を3回、1×SSC、0.1％SDS中、37℃で20分間の洗浄を1回行うこともできる。ここで、例えば、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションや2度目の洗浄の際の温度をより高く設定することにより、よりストリンジェントな条件とすることができる。例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの温度を60℃、さらにストリンジェントな条件としては68℃とすることができる。当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度、温度等の条件に加えて、プローブ濃度、プローブの長さ、プローブの塩基配列構成、反応時間等のその他の条件を加味し、条件を設定することができる。
【０１５７】
該オリゴヌクレオチドは、上記本発明のスクリーニング用キットにおけるプローブやプライマーとして用いることができる。該オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いる場合、その長さは、通常15bp〜100bpであり、好ましくは17bp〜30bpである。プライマーは、上記本発明中の遺伝子のDNAの少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。
【０１５８】
また本発明は、本発明の薬剤を個体（例えば、患者等）へ投与する工程を含む、慢性閉塞性肺疾患の治療もしくは予防方法を提供する。
【０１５９】
本発明の予防もしくは治療方法の対象となる個体は、慢性閉塞性肺疾患を発症し得る生物であれば特に制限されないが、好ましくはヒトである。
【０１６０】
個体への投与は、一般的には、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射など当業者に公知の方法により行うことができる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者（医師、獣医師、薬剤師等）であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【０１６１】
さらに本発明は、本発明の薬剤の、閉塞性換気障害抑制剤の製造における使用に関する。
【０１６２】
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６３】
CSPGを含むプロテオグリカンの生体内動態とその制御の伴う制御し病態変化を観察した実際の臨床治療報告は過去には存在しないが、今回、その一例としてCSPGの分解酵素の一つであるコンドロイチナーゼABCに着目した。
【０１６４】
RNAiは1998年にFireらによって発見された現象（Fire A, Nature (1998) 391, :806-811）で、二本鎖RNA（double strand RNA）が相同な標的遺伝子の発現を強力に抑制するというものである。従来のベクター等を用いる遺伝子導入法に比べ簡便であり、標的に対する特異性が高く、遺伝子治療への応用が可能であるということで最近注目されている。しかしながら、生体内においては血清中の核酸分解酵素の働きにより、速やかに分解されてしまうため長時間の効果の継続が難しいとされてきた。最近の報告では（Takeshita F. PNAS.(2003) 102(34) 12177-82、Minakuchi Y Nucleic Acids Reserch(2004) 32(13) e109）、牛皮膚由来のアテロコラーゲンが核酸と複合体を形成し、生体内の分解酵素から核酸を保護する作用があり、siRNAのキャリアーとして非常に適しているとされている。先に述べたコンドロイチナーゼABCと同様に、RNAiを用いてC6STやGalNAcの発現を抑制し、CSPGの動態を生体内で制御した報告はこれまでにはない。
【０１６５】
コンドロイチナーゼABCは、酵素番号EC4.2.2.4に分類されるリアーゼであり、（コンドロイチンABCリアーゼ）であり、コンドロイチナーゼABCは、1,4-β-D-ヘキソサミニド結合、及び1,3-β-D-グルクロノシル結合もしくは1,3-α-L-イズロノシル結合を含有する多糖を、4-デオキシ-β-D-グルク-4-エヌロノシル基を含有する分解する活性を有する。また、このコンドロイチナーゼABCを肺気腫やCOPDの治療に応用した報告はない。
【０１６６】
また本発明は、先に述べたCSPGの分解酵素であるコンドロイチナーゼABCとは異なるアプローチについても着目している。これはCSPGの生合成に関与する酵素であるChondroitin D-N-acetylgalactosamine-6-O-sulfotransferase 1（C6ST-1）、Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-6-O-sulfotransferase 2（C6ST-2）、Chondroitin D-N-acetylgalactosamine-6-O-sulfotransferase 3（C6ST-3）、同様にCSPGの生合成に関与する酵素であるN-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 1（GalNAc 4ST-1）、N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase 2（GalNAc 4ST-2）、N-acetylgalactosamine-4-O-sulfotransferase（GALNAC 4S-6ST）、に着目したものである。本実施例においては、これら２つの酵素を発現する遺伝子に対して、それらを特異的に阻害する遺伝子（ small interfering RNA :siRNA）の導入（RNA interference :RNAi）を行い、コンドロイチナーゼABCとは異なり作用機序でのCSPGの生体内における制御をも試みている。
【０１６７】
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。
【０１６８】
実施例１：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABCの気腫性病変の抑制効果
この実施例では、基本的な肺気腫マウスモデルであるブタ膵臓由来エラスターゼ（PPE）気管内投与モデルを使用した。このマウスモデルは古典的ではあるが再現性にすぐれ、簡便であることより肺気腫モデルとして広く使用されている。
（非特許文献：Karlinsky JB et al Am Rev Respir Dis 1978;117:1109-1133.
Otto-Verberne CJ et al Protective effect of pulmonary surfactant on elastase-induced emphysema in mice. Eur Respir J 1992;5:1223-1230.
Janoff A et al Prevention of elastase-induced experimental emphysema by oral administration of a synthetic elastase inhibitor. Am Rev Respir Dis 1980;121:1025-1029.
Christensen TG, et al. Irreversible bronchial goblet cell metaplasia in hamsters with elastase-induced panacinar emphysema. J Clin Invest 1977;59:397-404.
Lucey EC, et al. Remodeling of alveolar walls after elastase treatment of hamsters: results of elastin and collagen mRNA in situ hybridization. Am J Respir Crit Care Med 1998;158:555-564.
Snider GL, Lucey EC, Stone PJ. Animal models of emphysema. Am Rev Respir Dis 1986;133:149-169.）
【０１６９】
この実施例では肺気腫モデルマウスの肺組織サンプルを使用してヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）を行い、コンドロイチナーゼABC気腫性病変抑制効果について比較検討を行った。
【０１７０】
最初にマウスモデルの作製についてであるが、C57BL6/J マウス（メス、５〜６週齢、日本クレア社製）に、PPE（４単位；Calbiochem-Novabiochem社製）を気管内投与する。投与後３週間飼育し肺組織を採取した。対照群は同様のマウスでPPE未投与のものを用いた。
【０１７１】
PPEに先立ち、マウスには予めコンドロイチナーゼABC（20単位/ml；Sigma-Aldrich社製）を４単位/mouseで腹腔内投与し、PPE処理後にも追加投与を行った。
【０１７２】
採取した右肺組織を凍結用包埋剤OCTコンパウンド（Miles社製）に包埋し、液体窒素を用いて凍結ブロックを作製した。その凍結ブロックからクライオスタット（Microm社製）を用いて厚さ６μmの切片を作製した。
【０１７３】
得られた切片を１％グルタールアルデヒド（ナカライテスク社製）で10分間固定後、さらにホルモールカルシウム液で10分間固定。リン酸緩衝液で洗浄後、リリマイヤーヘマトキシリン液（シグマアルドリッチジャパン社製）で室温、５分間染色し脱色液（0.5%HCL含有70％エタノール、いずれもナカライテスク社製試薬を用いて作製）にて軽く洗浄。その後10分間水洗いを行う。エオジンアルコール室温、５分間染色し10分間水洗いを行う。100％エタノールで軽く洗浄後、３分間静置。さらにキシレン（ナカライテスク社製）軽く洗浄後、10分間静置した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察し組織の様子を確認した。
【０１７４】
得られた組織図を図１上段に示した。対照群（PPE未投与マウス）の所見では蜂の巣様の肺胞隔壁が特徴的な正常な肺実質の組織所見が確認出来る。しかしながら、中央の写真が示す未治療群（PPE投与、コンドロイチナーゼABC未投与）では、肺気腫に特徴的な所見である肺胞隔壁の破壊消失と気腔の拡大に伴う気腫性病変が観察出来る。これに対して酵素治療群（PPE投与、コンドロイチナーゼABC投与）では若干の肺胞隔壁の消失と気腫性病変が見られるものの、その程度は大幅に改善されていることが観察出来る所見であった。
【０１７５】
また、肺気腫における特徴的な所見の一つとして肺胞腔の拡大が知られているが、図１の上段に示した肺気腫マウスモデルのHE染色所見においても、これが散見される。肺気腫モデルマウスの病変の程度を数値化して示す方法として、肺胞間の平均距離を測定する方法が知られている（Thurlbeck W.M, Thorax (1967) 22, 483-96 Murakami S. (2005).Am J Respir Crit Care Med 172, 581-9）、HE染色のサンプルの写真を先程使用した光学顕微鏡（ライカ社製）を用いて倍率400倍で撮影した。この写真上の肺胞間の平均距離を対照群、未治療群、治療群の間で比較することによりコンドロイチナーゼABC治療効果について検討した。
【０１７６】
肺胞間平均距離の測定結果について図１の下段に示した。対照群における肺胞間の平均距離は47.125±0.65μmであったが、未治療群では77.85±11.42μm（vs対照群P=0.002 t検定））と顕著な肺胞間平均距離の拡大を認めた。これに対して酵素治療群における肺胞間平均距離は64.925±0.31μm（vs未治療群P=0.0013 t検定）と対照群に比べ肺胞間平均距離は拡大しているものの、未治療群に比べて有意な肺胞間平均距離の縮小を認めた。
【０１７７】
以上、本実施例の結果を考察すると、PPE気管内投与マウス肺気腫モデルにおいて、コンドロイチナーゼABC生体内投与により気腫性病変の進行が抑制、もしくは改善されることが明らかになった。
【０１７８】
実施例２：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABCのプロテオグリカンの沈着抑制効果
この実施例では肺気腫モデルマウスの肺組織サンプルを使用してコンドロイチナーゼABCのプロテオグリカン抑制効果について比較検討を行った。実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、さらに一次抗体として抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）抗体（クローンCS56、マウスモノクローナル抗体、10μg/mL；生化学工業社製）を添加し、室温で一時間反応させた。続いて、ヒストファインマウスステインキット（ニチレイ社製；マウスモノクローナル抗体に対して使用）を用いて二次抗体反応を行った後、DAB基質を（ニチレイ社製）添加し酵素色素反応を行った。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１７９】
得られた組織像を図２に示した。対照群の所見では肺胞隔壁や写真中央の細気管支周囲にわずかに陽性の茶色のシグナルが見られるものの、特に強いCSPGの沈着は確認出来ない。しかしながら、未治療群では実施例１で見られたような破壊された肺胞隔壁部位に強い陽性のシグナルすなわち、強いCSPGの沈着が確認できた。これに対して酵素治療群では肺胞隔壁の破壊も弱く、対照群とほぼ同程度の陽性所見しか確認出来ない。
【０１８０】
以上の抗CSPG抗体を用いた肺組織の免疫染色所見を考察すると、PPE気管内投与マウス肺気腫モデルにおいて誘導される肺組織におけるCSPGの沈着は、コンドロイチナーゼABC生体内投与により分解され抑制されることが明らかになった。
【０１８１】
実施例３：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABCのプロテオグリカンの集積抑制効果
実施例２で示したCSPGの沈着はマクロファージなどの炎症細胞を誘導する生体内物質であるケモカインを吸着することが知られている。CSPGの沈着が結果的に炎症細胞を引き寄せ肺組織を破壊することにつながると推測し、この実施例では肺気腫モデルマウスの肺組織サンプルを使用して、肺胞マクロファージの集積動態に対するコンドロイチナーゼABCの効果について免疫染色組織化学染色法を用いて検討した。
【０１８２】
実施例１と同様の方法で得られた切片をアセトン（シグマアルドリッチジャパン社製）で10分間固定後、リン酸緩衝液で洗浄し、一次抗体としてラット由来抗マウスマクロファージ抗体（クローンF4/80；１：200希釈；BMA社製）を添加し、室温で１時間反応させた。次に二次抗体であるペルオキシダーゼ標識ロバ由来抗ラットIgG（1:200希釈；バイオソース社製）を添加し、室温で30分反応させた。反応後のサンプルにDAB基質（ニチレイ社製）を添加した。この標本を光学顕微鏡（ライカ社製）用いて観察した。
【０１８３】
得られた組織像を図３に示した。対照群の所見では肺胞域に少数の陽性のシグナルが見られる。しかしながら、未治療群では写真中央の細気管支周囲に非常に多数の陽性シグナルの集積、つまり肺胞マクロファージの集積が認められた。これに対して酵素治療群では、対照群とほぼ同程度の陽性シグナルしか確認出来なかった。
【０１８４】
以上の抗マクロファージ抗体を用いた肺組織の免疫染色所見を考察すると、PPE気管内投与マウス肺気腫モデルにおいて誘導される肺組織におけるマクロファージの集積は、コンドロイチナーゼABC生体内投与により顕著に抑制されることが明らかになった。この実施例の結果と実施例２に示した結果を併せて考察すると、PPE気管内投与に伴うCSPGの沈着をコンドロイチナーゼABCが抑制することにより肺胞マクロファージの集積が抑制されると考えられる。このマクロファージの集積抑制が結果的に気腫性病変の抑制につながるものであると結論づけられる。
【０１８５】
実施例４：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の硫酸化グリコサミノグリカン沈着の抑制効果
この実施例では肺気腫モデルマウスの左肺組織中に沈着した硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）沈着の抑制効果について比較検討を行った。本発明の標的分子であるCSPGは他のプロテオグリカンと同様にsGAGの共有結合により構成されている。よって本実施例は、sGAGの定量化によりコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬のCSPGの肺組織への沈着の抑制効果を間接的に数値化することを目的としてアルシアンブルー結合反応sGAGアッセイ法を用いて検討を行った。肺気腫モデルマウスの作製についてであるが実施例１〜３と同様の方法で作成している。投与後は同じく３週間飼育し、肺組織を採取した。
【０１８６】
C6STアンチセンス薬とGalNAcアンチセンス薬の投与については、PPE投与後より１週間ごとにsiRNA GalNAcまたはsiRNA C6STを１μg（GeneWorld社製）とsiRNAの媒体である１％アテノコラーゲン（高研社製）を混合したもの腹腔内投与した。投与量は200μL/ mouseで行った。
*[GalNAc4ST-1 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_175140）
5’-accccacaactcggaacgatgcggct-3’（配列番号：６７）
5’-tgcatgttctcgtccatcctgctg-3’（配列番号：６８）
5’-cgccaccgtgtactgtactgtgaagt-3’（配列番号：６９）
5’-aggctgctccaactggaagagggtg-3’（配列番号：７０）
*[GalNAc4ST-2 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_199055）
5’-atatagtatctaggatatatgtag-3’（配列番号：７１）
5’-gaagtaccaaaagctggctgctcta-3’（配列番号：７２）
5’-ttctatcacttggactatttgatgtt-3’（配列番号：７３）
5’-tacacaactccacatttgtaatttg-3’（配列番号：７４）
*[GALNAC4S-6ST siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_029935）
5’-ccagaagccaagctcattgttatg-3’（配列番号：７５）
5’-ctgtggagaggttgtactcagacta-3’（配列番号：７６）
5’-atttgcctggaagacaacgtgagagc-3’（配列番号：７７）
5’-gtcccttctgcagaagctgggcccact-3’（配列番号：７８）
*[C6ST-1 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_016803）
5’-gcgccccctctccccatggagaaag-3’（配列番号：７９）
5’-gctttgcctcaggatttccgggacc-3’（配列番号：８０）
5’-ggttcagccttggtctaccgtgatgtc-3’（配列番号：８１）
5’-gcagttgttgctatgcgacctgtat-3’（配列番号：８２）
*[C6ST-2 siRNAカクテル配列]
（GenBank accession number NM_021715）
5’-tggggagagtgaggattcggtgaa-3’（配列番号：８３）
5’-cggacgtgggactcgtcgaggacaaag-3’（配列番号：８４）
5’-cgaaagtacctgcccgcccgtttcgc-3’（配列番号：８５）
【０１８７】
また、コンドロイチナーゼABCによる治療方法であるが、PPEに先立ちマウスには予めコンドロイチナーゼABC（20単位/ml；Sigma-Aldrich社製）を４単位/mouseで腹腔内投与し、PPE処理後にも追加投与を行った。
【０１８８】
検体の処理方法についてであるが、実施例１、実施例２で用いた肺組織と同時に採取した左肺をリン酸緩衝液で洗浄後、２mLの0.2% Triton X（シグマアルドリッチジャパン社製）に浸して氷上に静置。ホモジナイザーにてホモジナイズを行い４℃で一晩攪拌を行った。この組織懸濁液をサンプルとしてsGAG定量キット（ヴィエリサ社製）を用いて左肺中のsGAGの含有量を測定した。アルシアンブルー結合反応sGAGアッセイ法についてはsGAG定量キットの添付文書に準じた。
【０１８９】
本実施例の結果について図４に示した。左肺におけるsGAGの沈着量は対照群（PPE未投与）では2.31±0.28μg/Lt lungであったが、未治療群（PPE投与、治療薬未投与）で4.71±0.49μg/Lt lung（vs対照群P=0.00033 t検定））と顕著な増加を認めた。この結果は実施例２で示した肺組織での抗CSPG染色の結果と相関するものであった。これに対して酵素治療群（PPE投与、コンドロイチナーゼABC投与）、C6ST治療群（PPE投与、C6STアンチセンス薬投与）、GalNAc治療群（PPE投与、GalNAcアンチセンス薬投与）ではsGAGの沈着量はそれぞれ1.93±0.31μg/Lt lung（vs未治療群P=0.0000036 t検定）、2.06±0.28μg/Lt lung（vs未治療群P=0.0004 t検定）、2.81±1.24μg/Lt lung（vs未治療群P=0.018 t検定）とsGAGの沈着量はそれぞれ未治療群に対して有意に低下していた。
【０１９０】
これらの結果をまとめると、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬はPPEの気管内投与に伴う肺内のsGAGの沈着の増加を抑制することが明らかになった。
【０１９１】
また、先にも述べたように、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬がいずれもCSPGの分解を促進または発現を抑制する薬剤であることより、本実施例で示されたPPEの気管内投与に伴う肺内のsGAGの沈着量増加の抑制機序はCSPGの分解促進または発現抑制であることが判る。
【０１９２】
実施例５：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の呼吸機能の保存効果
ここまでの実施例では肺気腫モデルマウスにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬CSPG沈着抑制による気腫性病変抑制効果について示してきたが、本実施例では、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の肺気腫モデルマウスにおける臨床効果を検討するために静肺コンプライアンス（statistic compliance: Cst）を指標として呼吸機能に与える影響について評価した。Cstは肺組織の伸びやすさを表しているが、肺胞域の組織破壊を伴う疾患である肺気腫はCstが上昇する。
【０１９３】
これまでの実施例１〜４で示してきた方法と同様の手順で肺気腫モデルマウスを作製し、実施例４と同様にコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬で治療を行った。それらのマウスの自発呼吸を麻酔薬にて停止させたのちFlexiVent（SCIREQ社製）呼吸機能解析装置のP-V roop modeを用いてCstを測定した。マウスとFlexiVentとの接続はマウスの自発呼吸停止後に正中切開を行い、気管内に専用カニューレを挿管し気管支周囲を結紮する方法にて行った。
【０１９４】
本実施例の結果について図５に示した。対照群では42.62±2.25μL/cmH2Oであったが、未治療群で51.22±5.2μL/cmH2O（vs対照群P=0.03 t検定）と統計学的に有意な増加を認めた。また、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群におけるCstは、それぞれ43.41±3.39μL/cmH2O（vs未治療群P=0.047 t検定）、42.92±1.82 μL/cmH2O（vs未治療群P=0.03 t検定）、44.15±2.29μL/cmH2O（vs未治療群P=0.018 t検定）とCstはそれぞれ未治療群に対して有意に低下していた。
【０１９５】
これらの結果をまとめると、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬は、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴うCstの増加を有意に抑制することが明らかになった。また、本実施例に示された結果は、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の投与は肺組織の破壊を抑制するだけでなく実際の臨床症状（呼吸状態）を改善する効果を有することを示唆するものであった。
【０１９６】
実施例６：マウス肺気腫モデルにおけるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の組織保存効果
肺胞の気腔拡大を特徴的な病理像として示す肺気腫では、気腫性病変の進行に従い肺容量が増加する。本実施例ではコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の治療効果が、細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく臓器の形態維持・保存の効果にまで及ぶものであることを立証することを目的として行われた。
【０１９７】
本実施例で使用した肺組織は、実施例５で使用した肺組織の右肺を使用して行っている。マウスより摘出した肺組織をりん酸緩衝液で軽く洗浄後、同じくガラス容器に満たしたりん酸緩衝液につけた。りん酸緩衝液を満たしたガラス容器の重量を予め測定しておき、肺組織を容器に加えた後に増加した重量を液量に換算し肺容量とした。
【０１９８】
本実施例の結果について図６に示した。対照群における肺容量は277.5±61.85μLであったが、未治療群で413.33±77.67μL（vs対照群P=0.024 t検定）と統計学的に有意な肺容量の増加を認めた。また、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群における肺容量は、それぞれ303.33±25.17μL（vs未治療群P=0.04 t検定）、292.5±51.23 μL（vs未治療群P=0.027 t検定）、315±51.96μL（vs未治療群P=0.049 t検定）とそれぞれ未治療群に対して有意に肺容量の低下を認めた。
【０１９９】
これらの結果をまとめると、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬は、PPEの気管内投与により誘導される肺気腫に伴う肺葉量の増加を効果的に抑制することが明らかになった。また、本実施例に示された結果は、コンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬の投与は細胞レベルでの破壊を抑制するだけでなく、臓器の形態維持・保存の効果、もしくは破壊された組織の修復効果を持ち合わせていることを示すものであった。
【産業上の利用可能性】
【０２００】
本発明に係わるコンドロイチナーゼABC、C6STアンチセンス薬、GalNAcアンチセンス薬等を代表とする、CSPGの分解促進作用、CSPGの合成阻害作用、CSPGの硫酸化阻害作用を有する物質を有効成分として含有する肺の気腫性病変の抑制剤は肺胞壁の破壊、肺胞腔の拡大を伴う肺気腫含むCOPDの治療・予防に効果を有する。本発明に係る肺の気腫性病変の抑制剤は、肺気腫モデルマウスにおいて肺胞壁の破壊、肺胞腔の拡大を抑制する効果、CSPGの沈着抑制効果、肺胞マクロファージも集積抑制効果、呼吸機能の保存効果などのCOPDに付随する所見を様々な角度から抑制出来る効能を有していることより、COPDの治療・予防において非常に有用な薬剤である。本発明の肺の気腫性病変の抑制剤、またはこれを用いた治療法・予防法はCOPD患者の予後改善に非常に有効な手段である。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】上段は豚膵臓由来エラスターゼ（PPE）気管内投与により誘発された肺気腫モデルマウスにおけるヘマトキシリン・エオジン染色（HE染色）所見の光学顕微鏡写真である。倍率は５０倍。下段のグラフは気腫病変の程度を数値化するために上段の写真における肺胞間の平均距離を測定したものである。対照群（PPE(-) Chase ABC(-)）、未治療群（PPE(+) Chase ABC(-)）、酵素治療群（PPE(+) Chase ABC(+)）とする。*P＜0.01（t-検定）
【図２】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスにおける酵素治療群のCSPG（茶色シグナル）沈着の減少効果を示す写真である。倍率５０倍。
【図３】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスにおける酵素治療群のF4/80陽性肺胞マクロファージ（茶色シグナル）集積の減少効果を示す写真である。倍率５０倍。
【図４】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスの左肺におけるグリコサミノグリカン（GAG）の沈着量（μg/ Lt lung）について比較した図である。対照群、未治療群、酵素治療群、C6ST治療群（PPE(+) C6STアンチセンス薬）、GalNAc治療群（PPE(+) GalNAcアンチセンス薬）の５群間で検討した。*P＜0.01,**P＜0.05（t-検定）。
【図５】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスの静肺コンプライアンス（Cst）について示した図である。Cstは肺の弾性の目安である。対照群、未治療群、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群の５群間で検討した。*P＜0.01（t-検定）。
【図６】PPE気管内投与により誘導された肺気腫モデルマウスの右肺の容積（μl）を比較した図である。対照群、未治療群、酵素治療群、C6ST治療群、GalNAc治療群の５群間で検討した。*P＜0.01（t-検定）。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、閉塞性換気障害抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
肺においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用の、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記慢性閉塞性肺疾患が、肺気腫である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【請求項１２】
前記閉塞性換気障害抑制剤が、慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用である、請求項１０または１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１】
コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する物質を有効成分として含む、閉塞性換気障害抑制剤。
【請求項２】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン分解促進作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン合成阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項４】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン脱硫酸化作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項５】
前記物質が、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン硫酸化阻害作用を有する物質である、請求項１に記載の薬剤。
【請求項６】
肺においてコンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積が阻害されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の薬剤。
【請求項７】
慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用の、請求項１〜６のいずれかに記載の薬剤。
【請求項８】
前記慢性閉塞性肺疾患が、肺気腫である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項９】
前記慢性閉塞性肺疾患が、慢性気管支炎である、請求項７に記載の薬剤。
【請求項１０】
被検試料から、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの生成もしくは蓄積を阻害する作用を有する物質を選択することを特徴とする、閉塞性換気障害抑制剤のスクリーニング方法。
【請求項１１】
以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の作用を有する物質を選択する工程を含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
（ａ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの分解促進作用
（ｂ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの合成阻害作用
（ｃ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの脱硫酸化作用
（ｄ）コンドロイチン硫酸プロテオグリカンの硫酸化阻害作用
【請求項１２】
前記閉塞性換気障害抑制剤が、慢性閉塞性肺疾患の治療用または予防用である、請求項１０または１１に記載のスクリーニング方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００８−１８９６６７（Ｐ２００８−１８９６６７Ａ）
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３２７８（Ｐ２００８−１３２７８）
【出願日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【分割の表示】特願２００６−５５３００６（Ｐ２００６−５５３００６）の分割
【原出願日】平成１８年１１月２８日（２００６．１１．２８）
【出願人】（５０５１５６７０９）株式会社ステリック再生医科学研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年８月２１日（２００８．８．２１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１月２４日（２００８．１．２４）
【分割の表示】特願２００６−５５３００６（Ｐ２００６−５５３００６）の分割
【原出願日】平成１８年１１月２８日（２００６．１１．２８）
【出願人】（５０５１５６７０９）株式会社ステリック再生医科学研究所 (16)
【Ｆターム（参考）】
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