抗−５Ｔ４抗体およびその使用
抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲート、ならびにその製法および使用法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２００７年２月２３日に出願された米国仮出願第６０／８９１，２４８号および２００６年３月１０日に出願された米国仮出願第６０／７８１，３４６号（各々、出典明示より、全体として本明細書の一部とされる）に対して優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、新生物または悪性障害の診断および／または治療のための抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲート（すなわち、免疫コンジュゲート）に関する。本発明は、また、抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートを調製するための単離した可変領域核酸およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
高アフィニティーモノクローナル抗体の利用性は、標的とされる免疫療法の開発を可能にした。このアプローチによれば、所定の標的細胞集団に対して結合特異性を有する抗体と治療剤を結合させる。モノクローナル抗体に結合させた治療剤は、細胞毒、生物学的応答修飾剤、酵素（例えば、リボヌクレアーゼ）、アポトーシス誘導性タンパク質およびペプチド、および放射性同位元素を包含する。抗体／細胞毒コンジュゲートは、一般に、免疫細胞毒素と称される。低分子量の薬物、例えば、メトトレキサート（methothrexate）に結合させた抗体は、典型的に、化学抗体／薬物コンジュゲートと呼ばれる。免疫調節剤として記載されるコンジュゲートは、リンホカイン、成長因子、および補体活性化コブラ毒因子（ＣＶＦ）などの生物学的応答修飾剤を含有する。放射性標識抗体は、放射能治療ならびに画像化に用いられ得る放射活性同位元素を包含する。
【０００４】
腫瘍細胞に対する抗体媒介性薬物送達は、正常組織中におけるその取り込み量を最小限にすることによって、薬物の効力を増大させる。例えば、Reff et al. (2002) Cancer Control 9:152-66; Sievers (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46 Suppl:S18-22; Goldenberg (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201を参照のこと。ＭＹＬＯＴＡＲＧＲ（登録商標）（ゲムツズマブ・オゾガマイシン（gemtuzumab ozogamicin））は、該原理にしたがって作用する市販の標的化免疫療法剤であり、老齢の患者における急性骨髄性白血病の治療に承認されている。Sievers et al. (1999) Blood 93: 3678-84参照のこと。この場合、標的分子は、カリケアマイシンに結合した抗−ＣＤ３３モノクローナル抗体である。
【０００５】
しかしながら、ヒトにおける標的化免疫療法は、一部、非ヒトモノクローナル抗体に対して有害な反応を示すために制限されている。齧歯類抗体を用いた初期の臨床試験は、迅速な抗体クリアランスをもたらすヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）およびヒト抗−ラット抗体（ＨＡＲＡ）応答を示した。それ以来、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤＲ抗体、およびトランスジェニックマウスまたはファージディスプレーライブラリーを用いて調製されるヒト抗体を含め、免疫原性の低い抗体が開発されてきた。Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-5; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33; Newman et al. (1992) Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97を参照のこと。ＨＡＭＡ応答の回避は、高投与量および反復投与により治療応答を達成することを可能にする。
【０００６】
薬物標的化のための候補抗体は、腫瘍胎児抗原、すなわち、胎児細胞および新生物細胞に存在し、正常な成人細胞にほとんど存在しない抗原を認識する抗体を包含する。例えば、Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150: 133-43を参照のこと。５Ｔ４腫瘍胎児抗原は、４２ｋＤａの非グリコシル化コアを含む７２ｋＤａの高グリコシル化膜貫通型糖蛋白である（Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-84; ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／０７９４７号、米国特許第５，８６９，０５３号）。５Ｔ４は、標的化療法の接触可能な部位である、２つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）および介在する親水性領域によって特徴付けられる細胞外ドメインを含む（Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9319-24）。
【０００７】
ヒト５Ｔ４は、膀胱、胸、子宮頸、子宮内膜、肺、食道、卵巣、膵臓、胃および精巣の癌腫を包含する多くのタイプの癌において発現され、胎盤の合胞体栄養細胞を除き、正常組織には実質的に存在しない（例えば、Southall et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 89-95 （正常および悪性組織における５Ｔ４抗原の免疫組織学的分布（immunohistological distribution of 5T4 antigen in normal and malignant tissues））；Mieke et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-1930 （腫瘍細胞における低い細胞内付着分子１および高い５Ｔ４発現は、結腸直腸癌患者における無病生存率の減少と相関する（low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients））；Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902 （結腸直腸癌における５Ｔ４腫瘍胎児抗原発現の予後的意義（prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma））；Starzynska et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 867-869 （結腸直腸および胃癌における５Ｔ４抗原の発現（expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma））；Jones et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 96-100 （子宮頚癌における５Ｔ４抗原の発現（（expression of 5T4 antigen in cervical cancer））；Connor and Stern (199) Int. J. Cancer 46: 1029-1034 （子宮頚癌におけるＭＨＣクラスＩ発現の喪失（（loss of MHC class-I expression in cervical carcinomas））；Ali et al. (2001) Oral Oncology 37: 57-64 （正常、形成異常および悪性口腔粘膜における５Ｔ４腫瘍胎児抗原の発現パターン（pattern of expression of the 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa））;ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／０７９４７号；米国特許第５，８６９，０５３号参照）。例えば、５Ｔ４の発現がないと報告された組織には、肝臓、皮膚、脾臓、胸腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、副腎、および卵巣がある。５Ｔ４の限局性または低い発現があると報告された組織には、肝臓、皮膚、脾臓、リンパ節、扁桃、甲状腺、前立腺、および精嚢がある。５Ｔ４の弱〜中程度の拡散性発現が腎臓、肺、膵臓、咽頭および胃腸管において報告された。５Ｔ４の高い発現があることが報告された唯一の組織は合胞体栄養細胞であり、５Ｔ４は、正常な血清または妊婦の血清にも存在しない（すなわち、＜１０ｎｇ／ｍｌレベル）。腫瘍における５Ｔ４の過剰発現は疾患の進行度と相関し、５Ｔ４発現の評価は、短期予後患者を同定するための有用なアプローチとして提案された（Mulder et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-30, Naganuma et al. (2002) Anticancer Res. 22: 1033-1038, Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902, Starzynska et al. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10: 479-484, Wrigley et al. (1995) Int. J. Gynecol. Cancer 5: 269-274）。
【０００８】
５Ｔ４抗原の立体構造エピトープを認識するｍＡｂ５Ｔ４（Ｈ８抗体ともいう）（(Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363: 137-45, ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５５６０７号）、ラットモノクローナル抗体（Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65）および５Ｔ４と呼ばれるマウルモノクローナル抗体（米国特許第５，８６９，０５３号）を包含するいくつかの抗−５Ｔ４抗体が記載されている。一本鎖抗−５Ｔ４抗体もまた、治療分子に融合した抗−５Ｔ４抗体配列を包含する融合タンパク質と同様に、記載されている。例えば、ヒトＩｇＧ１定常ドメインまたはネズミＢ７．１の細胞外ドメインに融合した抗−５Ｔ４抗体配列は、５Ｔ４発現性腫瘍細胞系統の細胞溶解を誘導する（Myers et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-896, Shaw et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-246；米国特許出願公開第２００３／００１８００４号）。同様に、スーパー抗原に融合した一本鎖抗−５Ｔ４抗体は、非小細胞肺癌細胞のイン・ビトロでのＴ細胞依存性細胞溶解を刺激しうる（Forsberg et al. (2001) Br. J. Cancer 85: 129-136）。ＰＮＵ−２１４９３６、変異型スーパー抗原ブドウ球菌腸細胞毒Ａ（ＳＥＡ）に融合したモノクローナル抗体５Ｔ４のネズミＦａｂフラグメントを用いる第Ｉ相臨床試験は、限られた毒性およびある程度の抗腫瘍応答を示した（Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-9）。別の治療アプローチとして、組み換え５Ｔ４ワクチンもまた、癌の治療に提案されている（Mulryan et al. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37；ＵＫ特許出願公開第２，３７０，５７１号および第２，３７８，７０４号；ＥＰ特許出願公開第ＥＰ１，１６０，３２３号および第１，１５２，０６０号）。
【０００９】
本発明は、新規な抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート、開示された抗体および抗体／薬物コンジュゲートの製造法、およびそれらの診断および治療的使用方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、新規な抗−５Ｔ４抗体、そのコンジュゲートおよびその使用方法を提供する。また、単離された抗−５Ｔ４ポリペプチドおよびそれをコードしている単離された核酸も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、ヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合する抗体を包含し、ここに、該抗体は、（ａ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の抗原結合性ドメインを含み、（ｂ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と、５Ｔ４結合に関して競合し、（ｃ）Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合される５Ｔ４エピトープに結合し、または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の抗体の５Ｔ４−結合フラグメントを含む。本発明の抗−５Ｔ４抗体は、キメラ、ヒト化、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、四量体、四価、多特異的、ドメイン特異的、単一ドメイン抗体、融合タンパク質、またはネズミモノクローナルであってもよい。例えば、本発明のヒト化抗−５Ｔ４抗体は、少なくとも１つの重鎖可変領域または少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む抗体を包含し、ここに、該ヒト化抗体または抗体フラグメントは、（ａ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の抗原結合性ドメインを含み、（ｂ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と、５Ｔ４結合に関して競合し、（ｃ）Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合される５Ｔ４エピトープに結合し、または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の抗体の５Ｔ４−結合フラグメントを含む。
【００１２】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、ヒト５Ｔ４抗原に対する結合アフィニティーが少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍである。開示される抗−５Ｔ４抗体およびそのコンジュゲートは、また、５Ｔ４発現性細胞のイン・ビボでの標的化によって特異的結合を示す。
【００１３】
本発明の代表的な抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号４９、５１、５２、５４、５６、７７、７８、８１または８２のいずれか１つのアミノ酸配列、（ｈ）配列番号５１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、（ｉ）配列番号５４と少なくとも７８％同一のアミノ酸配列、（ｊ）配列番号７７と少なくとも８９％同一のアミノ酸配列、（ｋ）配列番号７８と少なくとも７９％同一のアミノ酸配列、（ｌ）配列番号８１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列、（ｍ）配列番号８２と少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００１４】
本発明の代表的な抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号８の残基２３−１３０のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１２の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８３または８４のいずれか１つのアミノ酸配列、（ｈ）配列番号６０と少なくとも８３％同一のアミノ酸配列、（ｉ）配列番号７０と少なくとも９３％同一のアミノ酸配列、（ｊ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｋ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｌ）配列番号７９と少なくとも８８％同一のアミノ酸配列、（ｍ）配列番号８０と少なくとも８４％同一のアミノ酸配列、（ｎ）配列番号８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｏ）配列番号８４と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００１５】
例えば、抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号６の残基１９−１３５由来のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８の残基２３−１３０由来のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または（ｃ）配列番号１０の残基２０−１４１由来のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２の残基２１−１２７由来のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００１６】
本発明のキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、ヒト定常領域由来の定常領域、例えば、ヒトカッパ軽鎖定常領域由来のヒト軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域由来のヒト重鎖定常領域を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）ヒト抗体フレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域、および（ｂ）配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲ、または配列番号２、６または１０の重鎖可変領域の１以上のＣＤＲを含む抗体を包含する。例えば、ヒト抗体フレームワーク領域の残基は、（ａ）ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系統クローン、ＶκＩＩＩサブグループ（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系統クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ７）のヒト抗体軽鎖フレームワーク領域、（ｂ）ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）からなる群から選択されるヒト抗体重鎖フレームワーク領域、（ｃ）（ｂ）の重鎖フレームワーク領域のコンセンサス配列、または（ｄ）（ａ）−（ｃ）のフレームワーク領域と少なくとも６３％同一のフレームワーク領域を含むことができる。
【００１８】
本発明の代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、また、配列番号２、４、６、８、１０または１２の２以上のＣＤＲ、例えば、配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の２つまたは３つ全てのＣＤＲ、または配列番号２、６または１０の重鎖可変領域の２つまたは３つ全てのＣＤＲ、または配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲおよび配列番号２、６または１２の重鎖可変領域の１以上のＣＤＲ、または配列番号２、４、６、８、１０または１２の全てのＣＤＲを包含することができる。
【００１９】
代表的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号４９の残基１−１１９のアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４９の残基１−１１９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｉ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００２０】
本発明の付加的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５−４０５のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号４８のヌクレオチド１−３５８のヌクレオチド配列、（ｅ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３可変領域をコードしているヌクレオチド配列、（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列、または（ｇ）ストリンジェントな条件下、（ａ）−（ｅ）のいずれか１つの相補物と特異的にハイブリダイズする核酸を含む核酸によってコードされる重鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００２１】
代表的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号８の残基２３−１３０のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１２の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、または（ｇ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む抗体を包含する。
【００２２】
また、（ａ）本発明のキメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメント、および（ｂ）該抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む薬物送達のための抗体／薬物コンジュゲートも提供される。代表的な薬物は、細胞毒、放射性同位元素、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、プロ−アポトーシス剤、化学療法剤、および治療的核酸などの治療剤を包含する。細胞毒は、例えば、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または酵素であってもよい。抗生物質細胞毒、例えば、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシン、またはその誘導体、例えば、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジドは、抗癌治療に特に有用である。
【００２３】
開示される抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートは、抗体と薬物との結合のためのリンカーを含んでいてもよい。代表的リンカーは、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、および４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）を包含する。抗体／薬物コンジュゲートは、また、ポリエチレングリコールまたは薬物取り込みを増大させるための他の薬剤を含んでいてもよい。
【００２４】
５Ｔ４発現性細胞への薬物の送達のために、本発明は、細胞を、（ｉ）キメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）ヒト化抗−５Ｔ４抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む抗体／薬物コンジュゲートと接触させる方法を提供する。開示される方法によると、薬物は標的細胞内に内在化される。治療法もまた本明細書中に開示され、それは、５Ｔ４−陽性癌を有する対象に、治療上有効量の、（ｉ）キメラまたはヒト化抗―５Ｔ４抗体または抗体フラグメントおよび（ｉｉ）ヒト化抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメントに直接または間接的に結合する治療剤を含む抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを投与することを特徴とする。本発明の抗−５Ｔ４療法は、改善された効果のために、いずれか他の既知の療法と組み合わせてもよい。第２の治療剤は、抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートと共に、同時またはいずれかの順序で連続的に投与すればよい。
【００２５】
また、ヒト化抗−５Ｔ４可変領域をコードしている単離核酸が提供され、それは、開示されるヒト化抗−５Ｔ４抗体の生産に有用である。ヒト化抗−５Ｔ４重鎖可変領域をコードしている代表的な核酸は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５−４０５のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号４８、５０、５３または５５のいずれか１つをコードしているヌクレオチド配列、（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５０と８９％同一のヌクレオチド配列、（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５３と８２％同一のヌクレオチド配列、または（ｇ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）−（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸を包含する。ヒト化抗−５Ｔ４軽鎖可変領域をコードしている代表的な核酸は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド６７−３９０のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３または７５のいずれか１つのヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列、（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５９と８４％同一のヌクレオチド配列、（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号６９と８６％同一のヌクレオチド配列、（ｇ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号７５と８５％同一のヌクレオチド配列、または（ｈ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）−（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な記載
Ｉ．抗−５Ｔ４抗体
本発明は、ヒト５Ｔ４抗原に結合し、標的免疫療法の開発に有用な新規なネズミ抗体を提供する。ヒト５Ｔ４抗原は、トロホブラスト細胞および多くの型の癌細胞の表面に見出される７２ｋＤａ非グリコシル化リンタンパク質である。Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-184;、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／０７９４７号、米国特許第５，８６９，０５３号参照。
【００２７】
本発明のネズミ抗−５Ｔ４抗体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３と称し、実施例１に記載されるように調製された。また、Ａ１、Ａ２およびＡ３から誘導される抗−５Ｔ４抗体も提供され、それはヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合する。例えば、本発明の抗−５Ｔ４抗体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体由来の抗原結合残基を含む抗体、５Ｔ４抗原への結合について、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体と競合する抗体、およびＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と同じ５Ｔ４エピトープに結合する抗体を包含する。
【００２８】
特に、開示されるＡ１、Ａ２およびＡ３抗体は、各々、ヒト５Ｔ４抗原上の独特なエピトープを認識する抗原結合部位を含む。これらの抗体の各々は、また、Ｈ８によって結合されるものとは別個のエピトープに結合し、Ａ１、Ａ２およびＡ３の各々は、ヒト５Ｔ４への結合について、Ｈ８抗体と競合することができない。実施例４〜５および図６〜７を参照のこと。したがって、本発明は、ヒト５Ｔ４の残基３０−１６３に特異的に結合する抗体（例えば、Ａ３）、ヒト５Ｔ４の残基２２４−２７６に特異的に結合する抗体（例えば、Ａ１）、およびヒト５Ｔ４の残基２２４−３５５に特異的に結合する抗体（例えば、Ａ２）を提供する。また、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合されるエピトープを含むヒト５Ｔ４抗原も提供される。例えば、本発明は、天然または全長５Ｔ４抗原の残基３０−１６３、２２４−２７６および２２４−３５５を含む５Ｔ４抗原フラグメントを提供する。
【００２９】
開示される抗−５Ｔ４抗体の特異的結合とは、複数の異なる抗原を含む異種試料中における、ヒト５Ｔ４抗原への抗体の優先的結合をいう。典型的に、特異的結合は、結合アフィニティーが少なくとも約１０−７Ｍ以上、例えば、約１０−８Ｍ以上（少なくとも約１０−９Ｍ以上、少なくとも約１０−１１Ｍ以上または少なくとも約１０−１２Ｍ以上を包含する）の場合に起こる。例えば、本発明の抗体のヒト５Ｔ４抗原への特異的結合は、少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの範囲、例えば、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの範囲、または約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１１Ｍの範囲、または約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲、または約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲における結合を包含する。特異的結合とは、また、対象への抗体の投与後、抗−５Ｔ４抗体が５Ｔ４発現性細胞を選択的に標的とすることをいう。
【００３０】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、四量体構造（例えば、天然抗体に類似する）を有していてもよく、または、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域または少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖領域、またはその５Ｔ４結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメント）を有するいずれか他の構造を含んでいてもよい。また、６個全てよりは少ないが１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合領域を構成している単一ドメイン抗体も包含される。本発明は、また、キメラ抗体、ヒト化抗体、超ヒト化抗体、二重特異性抗体（diabody）、一本鎖抗体、四価抗体、および／または多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）を包含する。これらの抗体記述は、相互排除的ではない。
【００３１】
天然抗体は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる約１５０，０００ダルトンの四量体（Ｈ２Ｌ２）糖タンパク質である。２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖および重鎖の各々は、さらに、アミノ末端可変領域および定常領域によって特徴付けられる。可変領域は、抗体間で広範囲に異なる配列を有し、実質的に、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合アフィニティーおよび特異性を決定する。軽鎖および重鎖の各々の可変領域は、抗原結合性ドメインを形成するように整列する。
【００３２】
キメラ抗体は、少なくとも２つの異なる種由来の配列を含む。一例として、組み換えクローニング技術を用いて、抗原結合部位を含有する非ヒト抗体（すなわち、抗原で免疫された非ヒト種において調製された抗体）由来の可変領域、およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を含ませてもよい。
【００３３】
本発明のキメラ抗−５Ｔ４抗体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域、すなわち、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号６の残基１９−１３５の重鎖アミノ酸配列および配列番号８の残基２３−１３０の軽鎖アミノ酸配列、および（ｃ）配列番号１０の残基２０−１４１の重鎖アミノ酸配列および配列番号１２の残基２１−１２７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を包含する。代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号４９のアミノ酸１−１１９として示される重鎖可変領域、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化重鎖可変領域のいずれか１つ、および図９Ａ−９Ｃにも示されるヒト化軽鎖可変領域を含んでいてもよい。本発明の代表的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体の調製は、実施例７に記載される。
【００３４】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、また、Ａ１、Ａ２またはＡ３可変領域から由来するか、またはこれらに実質的に類似する、あるいはヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域に実質的に類似するアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含んでいてもよい。実質的に同一の重鎖および軽鎖可変領域に関し、実質的に同一の配列は、配列番号１−１２のいずれか１つの可変領域配列または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域に、少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％同一、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。
【００３５】
本発明の代表的なキメラ抗−５Ｔ４抗体、すなわち、５Ｔ４抗原に特異的に結合する抗体は、また、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、配列番号１０の残基２０−１４１、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３重鎖可変領域のいずれか１つとして示される重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５に少なくとも８６％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｄ）配列番号１０の残基２０−１４１に少なくとも９１％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｅ）配列番号４９の残基１−１１９に少なくとも９０％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、または（ｆ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３のいずれか１つ由来の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００３６】
５Ｔ４抗原に特異的に結合するキメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、配列番号９のヌクレオチド５８−４２３、配列番号４８のヌクレオチド１−３５８のヌクレオチド配列を含む核酸、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３重鎖可変領域をコードしている核酸、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド配５５−４０５、または配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。例えば、キメラ抗−５Ｔ４抗体の重鎖可変領域は、配列番号１のヌクレオチド５８−４１４と少なくとも９８％同一の核酸、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号４８のヌクレオチド１−３５８と少なくとも８９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。キメラ抗−５Ｔ４抗体の重鎖可変領域は、また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えば、６５℃にて０．１ Ｘ ＳＳＣの最終洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、配列番号９のヌクレオチド５８−４２３、または配列番号４８のヌクレオチド１−３５８のヌクレオチド配列を含む核酸の相補物に特異的にハイブリダイズする核酸によってコードされうる。
【００３７】
本発明の代表的なキメラ抗−５Ｔ４抗体は、さらに、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、配列番号１２の残基２１−１２７、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域の残基として示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、または（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、または配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体を包含する。例えば、軽鎖可変領域アミノ酸配列は、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｂ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｃ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または（ｄ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域のいずれか１つ由来の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００３８】
５Ｔ４抗原に特異的に結合するキメラ抗−５Ｔ４抗体の軽鎖可変領域は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域のいずれか１つをコードしているヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸、または（ｂ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、または配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。例えば、キメラ抗−５Ｔ４抗体の軽鎖可変領域は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド６７−３９０と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、または（ｃ）配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。５Ｔ４抗原に特異的に結合するキメラ抗−５Ｔ４抗体の軽鎖可変領域は、また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えば、６５℃にて０．１ Ｘ ＳＳＣの最終洗浄条件下で、配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、または配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列を含む核酸の相補物に特異的にハイブリダイズする核酸によってコードされうる。
【００３９】
ヒト化抗体は、抗原結合に関与する可変領域残基（すなわち、相補性決定領域、簡略された（abbreviated）相補性決定領域の残基、または抗原結合に関係するいずれか他の残基）が非ヒト種由来である一方で、残りの可変領域残基（すなわち、フレームワーク領域の残基）および定常領域が、少なくとも一部、ヒト抗体配列に由来する種類のキメラ抗体である。ヒト化抗体のフレームワーク領域残基および定常領域残基のサブセットは、非ヒト源に由来していてもよい。ヒト化抗体の可変領域は、また、ヒト化として記載される（すなわち、ヒト化軽鎖または重鎖可変領域）。非ヒト種は、典型的に、抗原での免疫化に用いられる種であり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、または他の非ヒト哺乳動物種である。ヒト化抗体は、典型的には、伝統的なキメラ抗体よりも免疫原性が低く、ヒトへの投与後に、改善された安定性を示す。例えば、Benincosa et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos et al. (1994) Eur. J. Cancer 30A: 1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr. Infect. Dis. J. 17:110-5を参照のこと。
【００４０】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、抗原結合に関係する抗体可変領域の残基である。ＣＤＲｓを同定するためのいくつかのナンバリングシステムが一般に使用されている。Ｋａｂａｔ定義は、配列変化性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づく。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａアプローチの間の折衷である。軽鎖可変領域のＣＤＲｓは、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｂＭアルゴリズムにしたがって、位置２４および３４（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０および５６（ＣＤＲ２−Ｌ）、および８９および９７（ＣＤＲ３−Ｌ）の残基によって境界を示される。Ｋａｂａｔ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲｓは、位置３１および３５Ｂ（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０および５６（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５および１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基によって境界が示される（Ｋａｂａｔにしたがうナンバリング）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲｓは、位置２６および３２（ＣＤＲ１−Ｈ）、５２および５６（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５および１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基によって境界が示される（Ｃｈｏｔｈｉａにしたがうナンバリング）。ＡｂＭ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲｓは、位置２６および３５Ｂ（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０および５８（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５および１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）によって境界が示される（Ｋａｂａｔにしたがうナンバリング）。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ９２６８９２７２； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３： １２１１５３； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １： １２６； および Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ． （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ． １４１１７２を参照のこと。
【００４１】
特異性決定領域（ＳＤＲｓ）は、抗原と直接的に相互作用するＣＤＲｓ内の残基である。ＳＤＲｓは超可変残基に相当する。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139を参照のこと。
【００４２】
フレームワーク残基は、超可変またはＣＤＲ残基以外の抗体可変領域の残基である。フレームワーク残基は、天然ヒト抗体から由来していてもよく、例えば、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体のフレームワーク領域と実質的に類似するヒトフレームワークから由来していてもよい。個々の配列のなかでも、コンセンサスを示す人工フレームワーク配列もまた、使用されうる。ヒト化のためにフレームワーク領域を選択する場合、ヒトにおいて幅広く示される配列は、少ない配列よりも好ましい場合がある。ヒトフレームワークアクセプター配列の付加的な変異は、抗原接触に関与すると考えられるネズミ残基および／または抗原結合部位の構造的完全性に関与する残基を復帰させるように、または抗体発現を改善するように作成されうる。ペプチド構造予測は、ヒト化設計によって導入される翻訳後タンパク質修飾部位を同定し、回避するために、ヒト化可変重鎖および軽鎖領域配列を分析するために使用されうる。
【００４３】
ヒト化抗体は、下記するような相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のベニアリング（veneering）、グラフティング（grafting）、簡略化したＣＤＲｓのグラフティング、特異性決定領域（ＳＤＲｓ）のグラフティング、およびＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリーを包含する種々の方法のいずれか１つを用いて調製されうる。ヒト化抗体は、また、１以上の変更がＣＤＲｓ中に導入されている超ヒト化抗体を包含する。例えば、ヒト残基は、ＣＤＲｓにおいて、非ヒト残基の代わりに用いられうる。これらの一般的なアプローチは、いずれかの所望の配列の抗−５Ｔ４抗体を製造するために、標準的な変異誘発および合成技術と組み合わせてもよい。
【００４４】
ベニアリングは、抗体の溶媒接触可能外面をヒトアミノ酸配列で再舗装（resurfacing）することによって、齧歯類または他の非ヒト抗体において潜在的に免疫原性のアミノ酸配列を減少させるという概念に基づく。かくして、ベニア化された抗体は、修飾されていない非ヒト抗体よりも、ヒト細胞にとって異質ではないようである。Padlan (1991) Mol. Immunol. 28: 489-98を参照のこと。非ヒト抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域における同じ位置の残基とは異なる、非ヒト抗体において露出した外部フレームワーク領域残基を同定し、該同定された残基を、ヒト抗体におけるこれらの同じ位置を典型的に占めているアミノ酸で置換することによってベニア化される。
【００４５】
ＣＤＲｓのグラフティングは、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体または所望のフレームワーク残基を含む他の抗体）の１以上のＣＤＲｓをドナー抗体（例えば、非ヒト抗体）のＣＤＲｓで置き換えることによって実施される。アクセプター抗体は、候補アクセプター抗体およびドナー抗体間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択されうる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアプローチによると、ヒトフレームワーク領域は、関連する非ヒト抗体の各フレームワーク領域に対して実質的な配列相同性を有すると同定され、非ヒト抗体のＣＤＲｓを種々のヒトフレームワーク領域の複合物上に接合する。本発明の抗体の調製にも有用な関連する方法は、また、米国特許出願公報第２００３／００４０６０６号にも記載されている。
【００４６】
簡略化されたＣＤＲｓのグラフティングは、関連するアプローチである。簡略化されたＣＤＲｓは、軽鎖の位置２７ｄ−３４、５０−５５および８９−９６および重鎖の位置３１−３５ｂ、５０−５８および９５−１０１のアミノ酸を包含する、特異性決定残基および隣接するアミノ酸を包含する（Kabat et al. (1987)のナンバリングの慣例にしたがう）。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9を参照のこと。特異性決定残基（ＳＤＲｓ）のグラフティングは、抗体結合部位の結合特異性およびアフィニティーが各相補性決定領域（ＣＤＲｓ）内で最も高い可変残基によって決定されるという理解を前提とする。入手可能なアミノ酸配列データの分析と組み合わせた、抗体−抗原複合体の三次元構造の分析は、ＣＤＲ内の各位置で起きるアミノ酸残基の構造的不同性に基づく配列変化性をモデル化するために使用されうる。ＳＤＲｓは、接触残基からなる最小限の免疫原性のポリペプチド配列として同定される。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139を参照のこと。
【００４７】
一般に、ヒトアクセプターフレームワークは、それらが実質的にドナー抗体のフレームワーク領域に類似するということに基づくか、またはそれらが可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に非常に類似するということに基づいて選択される。グラフティング後、抗体結合、機能性、コドン使用、発現レベルなどを最適化するために、ドナーおよび／またはアクセプター配列において、非ヒト残基のフレームワーク領域中への導入を包含する付加的な変更が施されてもよい。例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号を参照のこと。
【００４８】
重鎖可変フレームワーク領域上へのＣＤＲｓのグラフティングの場合、有用なフレームワーク配列は、ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）に由来していてもよい。ヒト化のためのフレームワーク残基を含有する代表的な重鎖可変領域は、配列番号１３−２４および８８−９３として示される。ＶＨ１フレームワーク残基のコンセンサスを示す代表的なフレームワークは、配列番号２５−２７として示される。図１０Ａ−１０Ｂも参照のこと。
【００４９】
軽鎖可変フレームワーク領域上へのＣＤＲｓのグラフティングの場合、有用なフレームワーク配列は、ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系クローン、ＶκＩＩＩサブグループ（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ７）から由来していてもよい。ヒト化のためのフレームワーク残基を含有する代表的な軽鎖可変領域は、配列番号２８−３４、３５−４４および９４−９９として示される。図１１−１４を参照のこと。
【００５０】
本発明の代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号２、６または１０のいずれか１つの重鎖可変領域または配列番号４、８または１２のいずれか１つの軽鎖可変領域のＣＤＲｓから選択される非ヒト抗−５Ｔ４抗体の１以上のＣＤＲｓを有する抗体を包含する。例えば、ヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号２、６または１０のいずれか１つの重鎖可変領域または配列番号４、８または１２のいずれか１つの軽鎖可変領域のＣＤＲｓから選択される２以上のＣＤＲｓを含んでいてもよい。ヒト化抗−５Ｔ４抗体は、また、配列番号２、６または１０のいずれか１つの２または３個のＣＤＲｓを有する可変領域を含む重鎖、および配列番号４、８または１２のいずれか１つの２または３個のＣＤＲｓを有する可変領域を含む軽鎖を含んでいてもよい。
【００５１】
第１鎖の可変領域（すなわち、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）がヒト化されており、また、第２鎖の可変領域（すなわち、非ヒト種において産生される抗体の可変領域）がヒト化されていない本発明のヒト化抗−５Ｔ４抗体が構築されうる。これらの抗体は、半ヒト化抗体と呼ばれるタイプのヒト化抗体である。半ヒト化抗体を調製するために使用されうる非ヒト抗−５Ｔ４抗体は、本明細書中に開示されるようなＡ１、Ａ２およびＡ３抗体、ならびにＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５５６０７号およびForsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):124430-12436に記載されるＨ８抗体、またはWoods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65に記載されるラットモノクローナル抗体を包含する。例えば、半ヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号４９のアミノ酸１−１１９として示される重鎖可変領域、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２もしくはＡ３重鎖可変領域のアミノ酸、および配列番号４、８または１２のいずれか１つの軽鎖可変領域を含むことができる。
【００５２】
キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、そのいずれかのイソ型（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソ型）、ならびにその変異バージョンのいずれか１つの定常領域から由来していてもよい。ヒトイソ型の選択および該イソ型における特定のアミノ酸の修飾は、宿主防御メカニズムの活性化を増幅または除去し、抗体生体分布を改変しうる。Reff et al. (2002) Cancer Control 9: 152-66を参照のこと。本発明のキメラおよびヒト化抗体を調製するのに有用な代表的な定常領域は、配列番号４５−４７として示される。変種または変異バージョンに含まれるヒトラムダ軽鎖定常領域もまた使用されうる。免疫グロブリン定常領域をコードしている配列のクローニングのために、イントロン配列を欠失させてもよい。
【００５３】
キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、当該分野で知られる標準的な技術を用いて構築されうる。例えば、可変領域は、可変領域をコードしている重複するオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングし、ヒト抗体定常領域を含有している発現ベクター中にそれらをライゲートすることによって調製されうる。例えば、Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York および米国特許第４，１９６，２６５号、第４，９４６，７７８号、第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号、第５，２６０，２０３号、第５，６７７，４２７号、第５，８９２，０１９号、第５，９８５，２７９号、第６，０５４，５６１号を参照のこと。ホモ二量体およびヘテロ二量体を包含する２つの無傷四量体抗体を含む四価抗体（Ｈ４Ｌ４）は、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０２／０９６９４８号に記載のように調製されうる。抗体二量体は、また、ヘテロ二官能性架橋剤の使用によって（Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53: 2560-5）、または二重定常領域を含むための組み換え体産生によって（Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30）、鎖間ジスルフィド結合形成を促進する抗体定常領域中へのシステイン残基の導入によって調製されうる。本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、末端切断された抗体配列の発現によって、または全長抗体の翻訳後消化によって調製されうる。
【００５４】
本発明の抗−５Ｔ４抗体の変種、すなわち、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体ならびにそのキメラおよびヒト化バージョンは、容易に、種々の変化、置換、挿入および欠失を含むように調製されうる。例えば、抗体配列は、抗体発現に使用される細胞型においてコドン使用に最適化されうる。抗体の血清半減期を増加させるために、すでに存在しないならば、サルベージレセプター結合性エピトープを抗体重鎖配列中に組み込んでもよい。米国特許第５，７３９，２７７号を参照のこと。抗体安定性を増加させるための付加的な修飾は、残基２４１のセリンをプロリンに置き換えるためのＩｇＧ４の修飾を包含する。Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108を参照のこと。他の有用な変化は、抗体と薬物のコンジュゲートにおける効力を最適化するために必要とされるような置換を包含する。例えば、抗体は、薬物付着のためのアミノ酸を含むように、そのカルボキシル末端で修飾されていてもよい。例えば、１以上のシステイン残基が付加されていてもよい。定常領域は、炭水化物または他の基の結合のための部位を導入するように修飾されていてもよい。
【００５５】
本発明の抗−５Ｔ４抗体の変種は、部位特異的変異誘発を包含する標準的な組み換え技術、または組み換えクローニングを用いて生産されうる。抗−５Ｔ４抗体の多様化されたレパートリーは、トランスジェニック非ヒト動物における遺伝子配置および遺伝子変換法（米国特許公開第２００３／００１７５３４号）によって調製されてもよく、次いで、それらは、機能的アッセイを用いて関連する活性について試験される。本発明の特定の具体例において、抗−５Ｔ４変種は、ＣＤＲｓを変異させるためのアフィニティー成熟プロトコール（Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403）、鎖シャッフリング（Marks et al. (1992) Biotechnology (NY) 10: 779-783）、Ｅ．ｃｏｌｉの変異誘発株の使用（Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724-733）、ファージディスプレー（Thompson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 77-88）、およびセクシャルＰＣＲ（Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291）を用いて得られる。免疫療法適用のために、関連する機能的アッセイは、下記するように、ヒト５Ｔ４抗原に対する特異的結合、抗体内在化、および腫瘍を有する動物への投与時における腫瘍部位への標的化を包含する。
【００５６】
本発明は、さらに、本発明の抗−５Ｔ４抗体を発現している細胞および細胞系統を提供する。代表的な宿主細胞は、哺乳動物およびヒト細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＣＯＳ細胞を包含する。宿主細胞中への異種構築物のトランスフォーメーション後に安定な細胞系統を生成するための方法は、当該分野で知られている。代表的な非哺乳動物宿主細胞は、昆虫細胞（Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112）を包含する。抗体は、また、トランスジェニック動物（Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629）およびトランスジェニック植物（Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45）において産生されうる。
【００５７】
ＩＩ．抗−５Ｔ４核酸およびポリペプチド
本発明は、さらに、抗−５Ｔ４重鎖および軽鎖可変領域をコードしている単離核酸、および開示される核酸によってコードされる単離ポリペプチドを提供する。本発明の核酸およびポリペプチドは、Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域、ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域、およびその変種のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を包含する。単離核酸およびポリペプチドは、キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体を調製するために使用されうる。
【００５８】
ＩＩ．Ａ．抗−５Ｔ４核酸
核酸は、一本鎖、二本鎖または三本鎖形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーである。特に限定しないかぎり、核酸は、参照天然核酸と類似の特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似物を含有しうる。核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを包含する。核酸は、合成されてもよく、またはいずれかの生物を包含するいずれかの生物学的供給源から得られてもよい。抗−５Ｔ４抗体をコードする核酸をクローニングするための代表的な方法は、実施例１および７に記載される。
【００５９】
本発明の代表的な核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１および４８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。特に、Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖可変領域をコードしている核酸は、各々、配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、および配列番号１０の残基２０−１４１として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードする、配列番号１のヌクレオチド５８−４１、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、および配列番号９のヌクレオチド５８−４２３を含む。ヒト化Ａ１重鎖可変領域をコードしている核酸は、配列番号４８のヌクレオチド１−３５８を含む。Ａ１、Ａ２およびＡ３軽鎖可変領域をコードしている核酸は、各々、配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、および配列番号１２の残基２１−１２７として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードする、配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、および配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１を含む。本発明の付加的なアミノ酸は、図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域をコードしているヌクレオチドを含む。
【００６０】
本発明の核酸は、また、配列番号１、３、５、７、９、１１および４８のいずれか１つに実質的に同一のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれか１つの可変領域コード配列に少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも約９１％同一または少なくとも９２％同一、例えば、少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を包含する。例えば、本発明の核酸は、（ａ）配列番号１の可変領域コード配列と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３の可変領域コード配列と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号５の可変領域コード配列と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号７の可変領域コード配列と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、（ｅ）配列番号１１の可変領域コード配列と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列、または（ｆ）配列番号４８の可変領域コード配列と少なくとも８９％同一のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。配列は、下記するように、配列番号１、３、５、７、９、１１、４８のいずれかの全長可変領域コード配列、または図９Ａ−９Ｈに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列をクエリ配列として用いる配列比較アルゴリズムを用いて、または外観検査によって、最大の一致について比較する。実施例１および表１、および実施例７および表１１も参照のこと。
【００６１】
実質的に同一の配列は、多形配列、すなわち、集団における別の配列または対立遺伝子であってもよい。対立遺伝子の相違は、１塩基対ほどの小ささであってもよい。実質的に同一の配列は、また、サイレント変異を含む配列を包含する変異を起こさせた配列を含んでいてもよい。変異は、１以上の残基の変化、１以上の残基の欠失、または１以上の付加的な残基の挿入を含んでいてもよい。
【００６２】
実質的に同一の核酸は、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの全長に対し、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの可変領域コード配列の全長に対し、または図９Ａ−９Ｈに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列に対し、ストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズするか、または実質的にハイブリダイズする核酸として同定される。核酸ハイブリダイゼーションとの関連で、比較している２つの核酸配列は、プローブおよび標的と称してもよい。プローブは、参照核酸分子であり、標的は、試験核酸分子であり、しばしば、核酸分子の異種集団内で見出される。標的配列は、試験配列と同義である。
【００６３】
ハイブリダイゼーション研究の場合、有用なプローブは、本発明の核酸分子の少なくとも約１４〜４０ヌクレオチド配列に相補的であるか、またはそれらを模倣する。好ましくは、プローブは、１４〜２０個のヌクレオチドからなり、または長いプローブが望ましい場合でも、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００または５００ヌクレオチドまたは全長まで、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの可変領域コード配列の全長、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードするヌクレオチド配列からなる。かかるフラグメントは、例えば、フラグメントの化学的合成によって、核酸増幅技術の適用によって、または組み換え体産生のための組み換えベクター中への選択配列の導入によって、容易に調製されうる。
【００６４】
特異的ハイブリダイゼーションとは、配列が複合核酸混合物（例えば、全細胞性ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、分子が特定のヌクレオチド配列にだけ結合、二本鎖化（duplex）またはハイブリダイズすることをいう。特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件の厳しさにもよるが、プローブと標的配列との間のミスマッチを調整しうる。
【００６５】
サザンおよびノーザンブロット分析などの核酸ハイブリダイゼーション実験との関連で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件は、配列と環境のどちらにも依存する。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I chapter 2, Elsevier, New York, New Yorkに見出される。一般に、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨにて、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。典型的には、ストリンジェントな条件下、プローブは、その標的サブ配列に特異的にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。
【００６６】
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に合致するプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。約１００個を越える相補的残基を有する相補的核酸のサザンまたはノーザンブロット分析のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃にて、１ｍｇのヘパリンを含有する５０％ホルムアミド中、一晩のハイブリダイゼーションである。非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて、０．１ Ｘ ＳＳＣバッファー中１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて、０．２ Ｘ ＳＳＣバッファー中１５分である。ＳＳＣバッファーの記載については、Sambrook et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低いストリンジェンシー洗浄を行う。約１００個を越えるヌクレオチドの二本鎖のための中程度のストリンジェンシー洗浄条件の例は、４５℃にて、１ Ｘ ＳＳＣ中１５分である。約１００個を越えるヌクレオチドの二本鎖のための低ストリンジェンシー洗浄条件の例は、４０℃にて、４Ｘ〜６Ｘ ＳＳＣ中１５分である。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的に、ｐＨ７．０−８．３にて、約１Ｍ Ｎａ＋イオン未満の塩濃度、典型的には約０．０１〜１Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）を含み、温度は、典型的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されうる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、関係のないプローブに対して観察されるよりも２倍の（またはそれ以上）シグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００６７】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するために使用されうるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例である。プローブヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃にて標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、次いで、２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃にて洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。
【００６８】
２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらなる兆候は、該核酸によってコードされるタンパク質が実質的に同一であり、全体的な三次元構造を共有し、または生物学的に機能的等価であることである。これらの用語は、さらに下記で定義される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一であれば、まだ実質的に同一である。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列が遺伝子コードによって許可されるような保存的に置換された変種を含む場合に起こりうる。
【００６９】
保存的に置換された変種は、１以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている縮重コドン置換を有する核酸配列である。Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608;およびRossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98を参照のこと。
【００７０】
本発明の核酸は、また、配列番号１、３、５、７、９、１１、４８または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列、および配列番号１、３、５、７、９、１１、４８または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列のサブ配列および伸長配列、およびその相補配列のいずれか１つに相補的な核酸を含む。相補配列は、塩基対間の水素結合の形成において互いに対になることのできる逆平行なヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列である。本明細書中で使用される場合、相補配列なる語は、下記に示す同じヌクレオチド比較方法によって評価されうるような、実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味するか、または本明細書中に記載されるような比較的ストリンジェントな条件下で目的の核酸セグメントにハイブリダイズすることができるものとして定義される。相補的核酸セグメントの特定の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
サブ配列は、より長い核酸配列の一部からなる核酸の配列である。例示的サブ配列は、上記のようなプローブ、またはプライマーである。プライマーなる語は、本明細書中で使用される場合、選択された核酸分子の約８個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは、１０−２０個のヌクレオチド、より好ましくは２０−３０個のヌクレオチドからなる連続した配列をいう。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子上で重合の開始を提供するのに十分な長さの適当な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。
【００７２】
伸長配列は、核酸中に組み込まれた付加的なヌクレオチド（または他の類似分子）を含む。例えば、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加しうる。さらに、ヌクレオチド配列は、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、付加的な制限酵素部位、マルチプルクローニング部位、および他のコーディングセグメントと組み合わせてもよい。かくして、本発明は、また、組み換え発現ベクターを包含する、本発明の核酸が機能的プロモーターに作動可能に連結された開示された核酸を含むベクターを提供する。核酸に作動可能に連結される場合、プロモーターは、核酸の転写がプロモーター領域によって制御および調節されるように核酸と機能的に組み合わされている。ベクターとは、プラスミド、コスミドおよびウイルス性ベクターのなどの宿主細胞中で複製可能な核酸をいう。
【００７３】
本発明の核酸は、クローン化、合成、改変、変異誘発されていてもよく、またはそれらの組み合わせが施されていてもよい。核酸の単離に使用される標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該分野で既知である。塩基対の変化、欠失または小さな挿入を施すための部位特異的変異誘発もまた、当該分野で既知である。例えば、Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New Yorkを参照のこと。
【００７４】
ＩＩ．Ｂ．抗−５Ｔ４ポリペプチド
本発明は、また、単離した抗−５Ｔ４ポリペプチドを提供する。ポリペプチドおよびタンパク質とは各々、ペプチド結合によって結合された一本鎖アミノ酸からなる化合物をいう。代表的な重鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、配列番号１０の残基２０−１４１、および配列番号４９の残基１−１１９として示される。代表的な軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、および配列番号１２の残基２１−１２７として示される。本発明の付加的なポリペプチドは、図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域のアミノ酸を含む。
【００７５】
本発明の付加的なポリペプチドは、開示された抗−５Ｔ４ポリペプチドに実質的に類似する、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２および４９の可変領域と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一の重鎖および軽鎖可変領域ポリペプチドを包含する。配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、４９のいずれか１つまたは図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３可変領域のいずれか１つの全長配列、またはその可変領域配列を用いる配列比較アルゴリズムを用いて、または外観検査によって、最大の一致について比較される。本発明は、さらに、本明細書中に開示される核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドを包含する。
【００７６】
例えば、本発明の代表的なポリペプチドは、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｇ）配列番号４９の残基１−１１９と少なくとも９０％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。実施例１および表２、および実施例７および表１１を参照のこと。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸、遺伝的にコードされたアミノ酸、非遺伝的にコードされたアミノ酸、およびその組み合わせを含みうる。ポリペプチドは、Ｌ型およびＤ型アミノ酸の両方を包含する。
【００７８】
代表的な非遺伝的にコードされたアミノ酸は、限定するものではないが、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ナルロイシン、およびオルニチンを包含する。
【００７９】
代表的な誘導体化アミノ酸は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を包含する。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成していてもよい。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成していてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成していてもよい。
【００８０】
本発明は、また、本発明の抗−５Ｔ４ポリペプチドのフラグメント、例えば、５Ｔ４抗原結合部位を構成するフラグメントを提供する。開示される配列よりも長いポリペプチド配列もまた提供される。例えば、１以上のアミノ酸が抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されていてもよい。かかる付加的アミノ酸は、限定するものではないが、精製を包含する種々の適用に用いてもよい。伸長したタンパク質を調製する方法は、当該分野で知られている。
【００８１】
本発明の抗−５Ｔ４ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または４９のいずれか１つの保存的に置換された変種であるアミノ酸を含むタンパク質を包含する。保存的に置換された変種とは、１以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されているアミノ酸を含むポリペプチドをいう。
【００８２】
保存的置換の例は、１の非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの別の基での置換、１の極性（親水性）残基の別の基での置換、例えば、アルギニンとリジンとの間の置換、グルタミンとアスパラギンとの間の置換、グリシンとセリンとの間の置換、１の塩基性残基、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンの別の基での置換、または１の酸性残基、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸の別の基での置換を包含する。
【００８３】
本発明の単離ポリペプチドは、当業者に知られた種々の標準的技術を用いて、精製し、特徴付けられうる。例えば、Schroeder & Luebke (1965) The Peptides. Academic Press, New York; Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis, 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlin/ New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New Yorkを参照のこと。
【００８４】
ＩＩ．Ｃ．ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較
２以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列との関連で、「同一」または「パーセント同一性」なる語は、最大の一致について比較および整列させた場合、本明細書中に開示された配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または外観検査によって測定したとき、同一または特定のパーセンテージの同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２以上の配列またはサブ配列をいう。
【００８５】
ヌクレオチドまたはタンパク質配列に関して、「実質的に同一」なる語は、特定の配列が１以上の欠失、置換または付加によって天然の配列から変化しているが、その正味の影響は抗−５Ｔ４核酸またはポリペプチドの生物学的機能を保持することを意味する。
【００８６】
２以上の配列を比較する場合、典型的に１つの配列は、１以上の試験配列を比較している参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータープログラム中に入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを選択する。次いで、配列比較アルゴリズムが、選択されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対して指定された試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００８７】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith ＆ Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman ＆ Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson ＆ Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された手段（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WisconsinのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または外観観察によって実施されうる。一般に、Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New Yorkを参照のこと。
【００８８】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するための好ましいアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターは、アラインメントの感受性および速度を決定する。２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ＢＬＡＳＴｎデフォルトパラメーターは、Ｗ＝１１（ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ）およびＥ＝１０（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）で設定され、また、低い組成複雑性を有するクエリ配列の残基をマスクするための低複雑性フィルターの使用を包含する。２つのアミノ酸配列を比較する場合、ＢＬＡＳＴｐプログラムデフォルトパラメーターは、Ｗ＝３（ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ）、Ｅ＝１０（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）で設定され、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１のギャップコスト、および低い組成複雑性を有するクエリ配列の残基をマスクするための低複雑性フィルターの使用を包含する。実施例１を参照のこと。
【００８９】
ＩＩＩ．抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲート
本発明は、さらに、本発明の抗−５Ｔ４抗体を含む抗体／薬物コンジュゲートを提供する。また、薬物が抗体に直接または間接的に結合しているような抗体／薬物コンジュゲートの調製方法も提供される。本発明の抗体／薬物コンジュゲートは、一般式：
５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
［式中、
５Ｔ４Ａｂは、本明細書中に記載されるような抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメントであり、
Ｘは、抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメントと反応しうるいずれかの反応基の生成物を含むリンカーであり、
Ｗは、薬物であり、
ｍは、精製されたコンジュゲート生成物に関する平均負荷（例えば、薬物がコンジュゲートの約３−１０重量％を構成するようなｍ）あり、
（−Ｘ−Ｗ）ｍは、薬物誘導体である］
で示される。
【００９０】
また、本発明の抗体／薬物コンジュゲートの調製方法も提供される。一例として、式５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）ｍの抗体／薬物コンジュゲートは、（ａ）薬物誘導体を抗−５Ｔ４抗体に添加し、ここに、薬物は抗−５Ｔ４抗体の３−１０重量％であり、（ｂ）薬物誘導体および抗−５Ｔ４抗体を非求核性でタンパク質適合性の約ｐＨ７〜９のバッファー溶液中でインキュベートして、抗体／薬物コンジュゲートを製造し、ここに、該溶液はさらに、（ｉ）適当な有機共溶媒および（ｉｉ）少なくとも１つの胆汁酸またはその塩を含む１以上の添加物を含み、該インキュベーションは、約３０℃〜約３５℃にて、約１５分〜約２４時間実施され、次いで、（ｃ）工程（ｂ）で製造されたコンジュゲートをクロマトグラフィー分離過程に付して、３−１０重量％の薬物を負荷し、低コンジュゲートフラクション（ＬＣＦ）を有する抗体／薬物コンジュゲートを、コンジュゲートしていない抗−５Ｔ４抗体、薬物誘導体および凝集したコンジュゲートから分離することによって調製されうる。
【００９１】
ＩＩＩ．Ａ．薬物
薬物は、生物学的または検出可能な活性を有するいずれかの物質、例えば、治療剤、検出ラベル、結合剤等、およびイン・ビボで活性剤に代謝されるプロドラッグである。薬物は、また、薬物が本発明の抗体とコンジュゲート可能なように官能化されている薬物誘導体であってもよい。一般に、これらの型のコンジュゲートは、免疫コンジュゲートと呼ばれる。
【００９２】
治療剤は、必要とする対象において病態を治療または予防するのに使用されうる組成物である。本発明において有用な治療剤は、抗癌剤、すなわち、５Ｔ４発現性細胞、例えば、扁平上皮／腺腫性肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頚癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛癌由来の癌細胞において、抗癌活性を有する剤を包含する。
【００９３】
代表的な治療薬物は、細胞毒、放射性同位元素、化学療法剤、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、プロ−アポトーシス剤、ならびに細胞増殖抑制および細胞溶解性酵素（例えば、ＲＮＡｓｅｓ）を包含する。薬物は、また、治療的核酸、例えば、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、またはプロ−アポトーシス剤をコードしている遺伝子を包含しうる。これらの薬物の記述は、相互排他的ではなく、かくして、治療剤は、１以上の上記の用語を用いて記述されうる。例えば、選択された放射性同位元素は、細胞毒でもある。治療剤は、上記のいずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体として調製されうる。一般に、放射性同位元素を薬物として有するコンジュゲートは、放射性免疫コンジュゲートと呼ばれ、化学療法剤を薬物として有するコンジュゲートは、化学免疫コンジュゲートと呼ばれる。
【００９４】
免疫コンジュゲートにおいて使用するための適当な薬物の例は、タキサン類、マイタンシン類（maytansines）、ＣＣ−１０６５およびドゥオカルマイシン類（duocarmycins）、カリケアマイシン類および他のエンジイン類、およびアウリスタチン類（auristatins）を包含する。他の例には、抗−葉酸塩、ビンカアルカロイド、およびアントラサイクリンを包含する。植物毒、他の生物活性タンパク質、酵素（すなわち、ＡＤＥＰＴ）、放射性同位元素、光増感剤（すなわち、光線力学療法の場合）もまた、免疫コンジュゲートに用いることができる。さらに、例えば、リポソームまたはポリマーなどの第２の担体を細胞毒剤として用いて、コンジュゲートを作成することができる。
【００９５】
「細胞毒」なる語は、一般に、細胞の機能を阻害または妨害し、および／または細胞の破壊をもたらす剤をいう。代表的な細胞毒は、抗生物質、チューブリン重合阻害剤、ＤＮＡに結合して破壊するアルキル化剤、およびタンパク質合成または必須細胞性タンパク質、例えば、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素およびサイクリンの機能を破壊する剤を包含する。代表的な細胞毒は、限定するものではないが、ドクソルビシン（doxorubicin,）、ダウノルビシン（daunorubicin）、イダルビシン（idarubicin）、アクラルビシン（aclarubicin）、ゾルビシン（zorubicin）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、エピルビシン（epirubicin）、カルビシン（carubicin）、ノガラマイシン（nogalamycin）、メノガリル（menogaril）、ピタルビシン（pitarubicin）、バルルビシン（valrubicin）、シタラビン（cytarabine）、ゲムシタビン（gemcitabine）、トリフルリジン（trifluridine）、アンシタビン（ancitabine）、エノシタビン（enocitabine）、アザシチジン（azacitidine）、ドキシフルリジン（doxifluridine）、ペントスタチン（pentostatin）、ブロクリジン（broxuridine）、カペシタビン（capecitabine）、クラドリビン（cladribine）、デシタビン（decitabine）、フロクリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、ゴウゲロチン（gougerotin）、ピューロマイシン（puromycin）、テガフル（tegafur）、チアゾフリン（tiazofurin）、アドリアマイシン（adriamycin）、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、ダカルバジン（dacarbazine）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）、ミトキサトロン（mitoxantrone）、ブレオマイシン（bleomycin）、メクロルエタミン（mechlorethamine）、プレドニソン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、メトトレキサート（methotrexate）、フルロウラシル類（flurouracils）、エトポシド（etoposide）、タキソール（taxol）、タキソール類似物、プラチン類（platins）、例えば、シス−プラチンおよびカルボ−プラチン、マイトマイシン（mitomycin）、チオテパ（thiotepa）、タキサン類、ビンクリスチン（vincristine）、ダウノルビシン（daunorubicin）、エピルビシン（epirubicin）、アクチノマイシン（actinomycin）、オウトラマイシン（authramycin）、アザセリン類（azaserines）、ブレオマイシン類（bleomycins）、タモキシフェン（tamoxifen）、イダルビシン（idarubicin）、ドラスタチン類（dolastatins）／オーリスタチン類（auristatins）、ヘミアステリン類（hemiasterlins）、エスペラマイシン類（esperamicins）およびマイタンシノイド類（maytansinoids）を包含する。
【００９６】
本発明の特定の具体例において、細胞毒は、抗生物質、例えば、カリケアマイシン（ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体とも呼ばれる）、例えば、ガンマ−カリケアマイシン（γ１）またはＮ−アセチルガンマ−カリケアマイシンである。米国特許第４，９７０，１９８号を参照のこと。本発明の抗体／薬物コンジュゲートの調製において使用するのに適当なカリケアマイシンの付加的な例は、米国特許第４，６７１，９５８号、第５，０５３，３９４号、第５，０３７，６５１号、第５，０７９，２３３号および第５，１０８，９１２号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。これらの化合物は、適当なチオールと反応してジスルフィドを形成し、同時に、ヒドラジドまたは抗−５Ｔ４抗体にカリケアマイシンをコンジュゲートさせるのに有用な他の官能基などの官能基を導入しうるメチルトリスルフィドを含有する。カリケアマイシンのジスルフィド類似体もまた使用でき、例えば、米国特許第５，６０６，０４０号および第５，７７０，７１０号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載されている。
【００９７】
放射線療法での適用の場合、本発明の抗−５Ｔ４抗体は、高エネルギー放射性同位元素を含みうる。同位元素は、例えば、抗体に存在するシステイン残基にて、抗体に直接結合させてもよく、またはキレーターを用いて抗体と放射性同位元素との結合を媒介させてもよい。放射線療法に適当な放射性同位元素は、限定するものではないが、α−エミッター、β−エミッター、およびオージェ電子を包含する。診断的適用の場合、有用な放射性同位元素は、陽電子エミッターおよびγ−エミッターを包含する。本発明の抗−５Ｔ４抗体は、抗体の検出または治療効果を促進にするために、さらに、例えば、抗体のチロシン残基上で、ヨウ素化されていてもよい。
【００９８】
抗−５Ｔ４抗体にコンジュゲートされうる代表的な放射性同位元素は、１８フッ素、６４銅、６５銅、６７ガリウム、６８ガリウム、７７臭素、８０ｍ臭素、９５ルテニウム、９７ルテニウム、１０３ルテニウム、１０５ルテニウム、９９ｍテクネチウム、１０７水銀、２０３水銀、１２３ヨウ素、１２４ヨウ素、１２５ヨウ素、１２６ヨウ素、１３１ヨウ素、１３３ヨウ素、１１１インジウム、１１３インジウム、９９ｍルテニウム、１０５ルテニウム、１０１ルテニウム、１８６ルテニウム、１８８ルテニウム、１２１ｍテルル、９９テクネチウム、１２２ｍテルル、１２５ｍテルル、１６５ツリウム、１６７ツリウム、１６８ツリウム、９０イットリウム、およびそれらから誘導される窒化物または酸化物を包含する。他の適当な放射性同位元素は、アルファエミッター、例えば、２１３ビスマス、２１３鉛、および２２５アクチニウムを包含する。
【００９９】
本発明の抗体／薬物コンジュゲートは、免疫調節剤、すなわち、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）および細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）を包含する免疫応答を誘導する剤を包含しうる。代表的な免疫調節剤は、サイトカイン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロンおよび成長因子（例えば、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）、およびエストロゲン類（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン類（テストステロン、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮＲ（登録商標）（フルオキシメステロン））、プロゲスチン類（ＭＥＧＡＣＥＲ（酢酸メゲストロール）、ＰＲＯＶＥＲＡＲ（酢酸メドロキシプロゲステロン））およびコルチコストロイド類（プレドニソン、デキサメタソン、ヒドロコルチソン）などのホルモンを包含する。
【０１００】
本発明において有用な免疫調節剤は、また、腫瘍に対するホルモン作用を遮断する抗ホルモンおよびサイトカイン産生を抑制する、自己抗原発現をダウンレギュレートする、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤を包含する。代表的抗ホルモン剤は、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン（raloxifene）、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ１１７０１８、オナプンストン（onapstone）、およびトレミフェン（toremifene）を包含する抗エストロゲン類、および抗アンドロゲン類、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン、および抗副腎剤を包含する。代表的な免疫抑制剤は、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣフラグメントの抗遺伝子型抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド、例えば、グルココルチコステロイド、サイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト（例えば、抗インターフェロン抗体、抗−ＩＬ１０抗体、抗−ＴＮＦα抗体、抗−ＩＬ２抗体）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体フラグメント、およびＴ細胞受容体抗体を包含する。
【０１０１】
本発明において有用な付加的な薬剤は、血管形成を阻害する抗脈管形成剤、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤（例えば、２−メトキシエストラジオールビス−スルファマート（２−ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ））、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジンタンパク質、クラスＩインターフェロン、インターロイキン１２、プロタミン、アンジオスタチン、ラミニン、エンドスタチン、およびプロラクチンフラグメントを包含する。
【０１０２】
抗増殖剤およびプロ−アポトーシス剤は、ＰＰＡＲ−ガンマのアクチベーター（例えば、シクロペンテノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧｓ））、レチノイド、トリテルピノイド（例えば、シクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリエデラン、ダンマラン、ククルビタシン、およびリモノイド・トリテルペノイド）、ＥＧＦ受容体の阻害剤（例えば、ＨＥＲ４）、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬＲ（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡＲ（レトロゾン））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレーター（例えば、３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ））、アポプチン（ニワトリ貧血ウイルス由来のウイルス性タンパク質３−ＶＰ３）、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナリングのアクチベーター、およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナリングの阻害剤（例えば、ＵＣＮ−０１およびゲルダナマイシン）を包含する。
【０１０３】
代表的な化学治療剤は、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド、スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン（busulfan）、インプロスルファン（improsulfan）およびピポスルファン（piposulfan）、アジイジン類（aziidines）、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボクオン（carboquone）、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）、アルトレタミン（altretamine）、トリエチレンメラミン（triethylenemelamine）、トリエチレンホスホラミド（triethylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミド（triethylenethiophosphoramide）およびトリメチルオロメラミン（trimethylolomelamine）を包含するエチレンイミン類（ethylenimines）およびメチルアメラミン類（methylamelamines）；ニトロゲンマスタード、例えば、クロラムブシル（chlorambucil）、クロルナファジン（chlornaphazine）、クロロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン（estramustine）、イフォスファミド（ifosfamide）、メキオレタミン（mechiorethamine）、酸化メキオレタミン塩酸塩、メルファラン（melphalan）、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン（prednimustine）、トロホスファルニド（trofosfarnide）、ウラシルマスタード（uracil mustard）；ニトロソウレア類（nitrosureas）、例えば、カルムスチン（carmustine）、クロロゾトシン（chlorozotocin）、フォテムスチン（fotemustine）、ロムスチン（lomustine）、ニムスチン（nimustine）、ラニムスチン（ranimustine）；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン類（aclacinomysins）、アクチノマイシン（actinomycin）、オウトラマイシン（authramycin）、アザセリン（azaserine）、ブレオマイシン類（bleomycins）、カクチノマイシン（cactinomycin）、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン類（chromomycins）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドクソルビシン（doxorubicin）、エピルビシン（epirubicin）、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン（idarubicin）、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン類（mitomycins）、ミコフェノール酸（mycophenolic acid）、ノガラマイシン（nogalamycin）、オリボマイシン類（olivomycins）、ペプロマイシン（peplomycin）、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン（puromycin）、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン（streptonigrin）、ストレプトゾシン（streptozocin）、ツベルシジン（tubercidin）、ウベニメクス（ubenimex）、ジノスタチン（zinostatin）、ゾルビシン（zorubicin）；抗−代謝産物、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似物、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキサート（trimetrexate）；プリン類似物、例えば、フルダラビン（fludarabine）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン；ピリミジン類似物、例えば、アンシタビン（ancitabine）、アザシチジン（azacitidine）、６−アザウリジン、カモフル（carmofur）、シタラビン（cytarabine）、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（doxifluridine）、エノシタビン（enocitabine）、フロクスウリジン（floxuridine）、５−ＥＵ；アンドロゲン類、例えば、カルステロン（calusterone）、プロピオン酸ドロモスタノロン（dromostanolone propionate）、エピチオスタノール（epitiostanol）、メピチオスタン（mepitiostane）、テストラクトン（testolactone）；抗−副腎物質（anti-adrenal）、例えば、アルニノグルテチミド（arninoglutethimide）、ミトタン（mitotane）、トリロスタン（trilostane）；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン（aceglatone）；アルドホスファルニド（aldophospharnide）グリコシド；アルニノレブリン酸（arninolevulinic acid）；アムサクリン（amsacrine）；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン（demecolcine）；ジアジクオン（diaziquone）；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）;エトグルシド（etoglucid）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン（lentinan）；ロニダミン（Ionidamine）；ミトグアゾン（mitoguazone）；ミトキサントロン（mitoxantrone）；モピダモール（mopidamol）；ニトラクリン（nitracrine）；ペントスタチン（pentostatin）；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン（pirarubicin）；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン（procarbazine）；ラゾキサン（razoxane）；シゾフィラン（sizofiran）；スピロゲルマニウム（spirogermanium）；テヌアゾン酸（tenuazonic acid）；トリアジクオン（triaziquone）；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン（vindesine）；ダカルバジン（dacarbazine）；マンノムスチン（mannomustine）；ミトブロニトール（mitobronitol）；ミトラクトール（mitolactol）；ピポブロマン（pipobroman）；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（arabinoside）（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド（cyclophosphamide）；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（paclitaxel）（ＴＡＸＯＬＲ、Bristol-Myers Squibb Oncology of Princeton, New Jersey）およびドキセタキセル（doxetaxel）（ＴＡＸＯＴＥＲＥＲ、Rhone-Poulenc Rorer of Antony, France）；チオラムブシル（chiorambucil）；ゲムシタビン（gemcitabine）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似物、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（etoposide）（ＶＰ−１６）；イフォスファミド（ifosfamide）；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（navelbine）；ノバントロン（novantrone）；テニポシド（teniposide）；ダウノマイシン（daunomycin）；アイニノプテリン（aininopterin）；キセロダ（xeloda）；イバンドロナート（ibandronate）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類（esperamicins）；およびカペシタビン（capecitabine）を包含する。
【０１０４】
抗−５Ｔ４抗体にコンジュゲートされ、本発明の治療法にしたがって使用されうる付加的な治療剤は、光線力学療法のための感光剤（米国特許公開第２００２／０１９７２６２号および米国特許第５，９５２，３２９号）、温熱療法（米国特許公開第２００３／００３２９９５号）のための磁性粒子、結合剤、例えば、ペプチド、リガンド、細胞接着リガンド等、およびプロドラッグ、例えば、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換したフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性のある細胞毒性遊離薬物に変換しうる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを包含する。
【０１０５】
抗−５Ｔ４抗体を用いる診断方法の場合、薬物は、イン・ビトロまたはイン・ビボで５Ｔ４発現細胞の存在を検出するために使用される検出可能な標識を含んでいてもよい。イン・ビボで検出可能な放射性同位元素、例えば、シンチグラフィー、磁気共鳴画像化または超音波を用いて検出可能な標識は、臨床的診断的適用において使用されうる。有用なシチグラフィー標識は、陽電子エミッターおよびγ−エミッターを包含する。磁気源画像化のための代表的な造影剤は、常磁性または超常磁性イオン（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウムおよびガドリニウム）、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤である。超音波検出の場合、気体または液体を、微小気泡造影剤として放出される多孔性無機粒子中に封入してもよい。イン・ビトロ検出の場合、有用な検出可能標識は、フルオロフォア、検出可能エピトープまたは結合剤、および放射能標識を包含する。
【０１０６】
ＩＩＩ．Ｂ．リンカー分子
薬物は、本発明のキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体に直接またはリンカー分子を介して間接的にコンジュゲートされる。リンカー分子は、安定であるか、または加水分解可能であってもよく、それにより、細胞侵入後に放出される。薬物が抗体から開裂される主要なメカニズムは、酸性ｐＨのリソソーム（ヒドラゾン、アセタール、およびシス−アコニタート様アミド）中における加水分解、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド開裂、およびジスルフィドの還元を包含する。これらの種々の開裂メカニズムの結果として、薬物を抗体に連結するメカニズムもまた、幅広く変化し、いずれかの適当なリンカーを用いることができる。好ましくは、コンジュゲーション方法は、最小限の低コンジュゲートフラクション（ＬＣＦ、ほとんどコンジュゲートされていない抗体のフラクション）、すなわち、約１０％未満のＬＣＦを有する試料を生じる。
【０１０７】
適当なコンジュゲーション法の一例は、天然で抗体に生じる炭水化物の酸化によって生成されるアルデヒドに対するヒドラジドおよび他の求核原子のコンジュゲーションに依存する。ヒドラゾン含有コンジュゲートは、所望の薬物放出性を提供する導入されたカルボニル基を用いて作成することができる。コンジュゲートは、また、一方の末端にジスルフィド、真ん中にアルキル鎖、および他方の末端にヒドラジン誘導体を有するリンカーを用いて作製することができる。アントラサイクリン類は、該技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる細胞毒の一例である。
【０１０８】
ヒドラゾン類以外の官能基を含有するリンカーは、リソソームの酸性環境において開裂される可能性を有する。例えば、コンジュゲートは、細胞内で開裂可能なヒドラゾン以外の部位を含有するチオール反応性リンカー、例えば、エステル、アミドおよびアセタール／ケタールから作成することができる。カンプトテシンは、これらのリンカーを用いてコンジュゲートすることができる１の細胞毒剤である。５〜７員環ケトンからなり、酸素の１つが細胞毒剤に結合しており、他方が抗体結合のためのリンカーに結合しているケタールを用いることもできる。アントラサイクリン類もまた、これらのリンカーと共に使用するのに適当な細胞毒の一例である。
【０１０９】
ｐＨ感受性リンカーのクラスの別の例は、アミド結合に並置されたカルボン酸を有するシス−アコニテート類である。該カルボン酸は、酸性リポソソーム中でアミド加水分解を加速する。いくつかの他の型の構造を有する同様の加水分解速度加速を達成するリンカーもまた、使用できる。マイタンシノイド類は、Ｃ−９に結合したリンカーを用いてコンジュゲートすることのできる細胞毒の一例である。
【０１１０】
薬物コンジュゲートのための別の可能性のある放出方法は、リソソーム酵素によるペプチドの酵素的加水分解である。一例において、ペプチドは、アミド結合を介してパラ−アミノベンジルアルコールに結合し、次いで、カルバメートまたはカルボネートが該ベンジルアルコールと細胞毒剤との間に形成される。ペプチドの開裂は、アミノベンジルカルバメートまたはカルボネートの崩壊または自己犠牲をもたらす。該方法で例示される細胞毒剤は、アントラサイクリン類、タキサン類、マイトマイシンＣおよびオーリスタチン類を包含する。一例において、フェノールもまた、カルバメートの代わりにリンカーの崩壊によって放出されることができる。別の例において、ジスルフィド還元を用いて、パラ−メルカプトベンジルカルバメートまたはカルボネートの崩壊を開始する。
【０１１１】
抗体にコンジュゲートした細胞毒剤の多くは、あったとしても、ほとんど水に対する溶解性がなく、そのことは、コンジュゲートの凝集のために、コンジュゲート上の薬物負荷を制限する可能性がある。これを克服するための１のアプローチは、リンカーに可溶化基を付加することである。ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて作製されたコンジュゲートを用いることができ、抗体に結合したＰＥＧ二酸、チオール−酸、またはマレイミド−酸、ジペプチドスペーサー、およびアントラサイクリンまたはドゥオカルマイシン類似物のアミンに結合したアミドを有するコンジュゲートを包含する。別の例は、細胞毒剤に結合したＰＥＧ−含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製されたコンジュゲートである。ＰＥＧ基を組み込むアプローチは、凝集の克服に、および薬物負荷の制限に有益でありうる。
【０１１２】
本発明の抗体／薬物コンジュゲートの調製に好ましい代表的なリンカーは、式：
（ＣＯ−Ａｌｋ１−Ｓｐ１−Ａｒ−Ｓｐ２−Ａｌｋ２−Ｃ（Ｚ１）＝Ｑ−Ｓｐ）
［式中、
Ａｌｋ１およびＡｌｋ２は、独立して、結合または分枝もしくは非分枝（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり、
Ｓｐ１は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’−、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ’−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚ
（ここに、Ｘ、ＹおよびＺは独立して、結合、−ＮＲ’−、−Ｓ−または−Ｏ−であり、但し、ｎ＝０のとき、ＹおよびＺの少なくとも１つは結合であり、
Ａｒ’は、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１、２または３個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−または１，４−フェニレンである）
であり、但し、Ａｌｋ１が結合であるとき、Ｓｐ１は結合であり、
ｎは、０〜５の整数であり、
Ｒ’は、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ３）ジアルキルアミノ、および（Ｃ１−Ｃ３）トリアルキルアンモニウム−Ａ−（ここに、Ａ−は、塩を形成している医薬上許容されるアニオンである）の１または２個の基で置換されていてもよい分枝または非分枝（Ｃ１−Ｃ５）鎖であり、
Ａｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記のとおりである）の１、２または３個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−または１，４−フェニレンであるか、または１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリデンまたは
【化１】
であり、各ナフチリデンまたはフェノチアジンは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記の通りである）の１、２、３または４個の基で置換されていてもよく、但し、Ａｒがフェノチアジンであるとき、Ｓｐ１は窒素にのみ連結した結合であり、
Ｓｐ２は、結合、−Ｓ−、または−Ｏ−であり、但し、Ａｌｋ２が結合であるとき、Ｓｐ２は結合であり；
Ｚ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記のとおりである）の１、２または３個の基で置換されていてもよいフェニルであり、
Ｓｐは、直鎖または分枝鎖の二価または三価（Ｃ１−Ｃ１８）基、二価または三価のアリールまたはヘテロアリール基、二価または三価の（Ｃ３−Ｃ１８）シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、二価または三価のアリール−またはヘテロアリール−アリール（Ｃ１−Ｃ１８）基、二価または三価のシクロアルキル−またはヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ１−Ｃ１８）基、または二価または三価の（Ｃ２−Ｃ１８）不飽和アルキル基であり、ここに、ヘテロアリールは、好ましくは、フリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノクマリニル、またはフェナジニルであり、ここに、Ｓｐが三価の基である場合、Ｓｐは、低級（Ｃ１−Ｃ５）ジアルキルアミノ、低級（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、ヒドロキシまたは低級（Ｃ１−Ｃ５）アルキルチオ基によって付加的に置換されていてもよく、
Ｑは、＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である］
のリンカーを包含する。
【０１１３】
好ましくは、Ａｌｋ１は、分枝または非分枝（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり、Ｓｐ’は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲ’（ここに、Ｒ’は上記の通りである）であり、但し、Ａｌｋ１が結合であるとき、Ｓｐ１は結合であり、
Ａｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記の通りである）の１、２または３個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであるか、またはＡｒは、各々、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、３または４個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリデンであり、
Ｚ１は、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２または３個の基で置換されていてもよいフェニルであり、
Ａｌｋ２およびＳｐ２は、一緒になって結合を形成し、ＳｐおよびＱは、すぐ上で定義した通りである。
【０１１４】
米国特許第５，７７３，００１号は、全体として本明細書の一部とされるが、カリケアマイシン類から調製される求核性薬物、特にヒドラジドおよび関連する求核性分子と共に使用されうるリンカーを開示する。これらのリンカーは、特に、薬物とリンカーとの間に形成される結合が加水分解可能であるとき、より良好な活性が得られる場合に有用である。これらのリンカーは、（１）抗体と反応するための基（例えば、カルボン酸）、および（２）薬物と反応するためのカルボニル基（例えば、アルデヒドまたはケトン）を包含する２つの官能基を含有する。カルボニル基は、薬物上のヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成しうる。該結合は、加水分解可能であり、その結果、標的細胞に結合後に、コンジュゲートからの治療剤の放出を可能にする。
【０１１５】
一例として、抗−５Ｔ４抗体は、（１）細胞毒性薬物誘導体を抗−５Ｔ４抗体に加え、ここに、該細胞毒性薬物はタンパク質性担体の４．５％−１１重量％であり、（２）該細胞毒性薬物誘導体および抗−５Ｔ４抗体を、約ｐＨ７〜９の非求核性タンパク質適合性バッファー溶液中でインキュベートして、一量体細胞毒性薬物／抗体コンジュゲートを生産し、ここに、該溶液はさらに、（ａ）適当な有機共溶媒および（ｂ）少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩を含む添加剤を含み、ここに、該インキュベーションは約３０℃〜約３５℃にて約１５分〜２４時間実施され、（３）工程（２）で生産されたコンジュゲートをクロマトグラフィー分離過程に付して、３重量％〜１０重量％の負荷量の細胞毒性薬物を有し、かつ、１０％未満の低コンジュゲートフラクション（ＬＣＦ）を有するおよび一量体コンジュゲートを、コンジュゲートしていない抗体、細胞毒性薬物誘導体および凝集したコンジュゲートから分離することによって、細胞毒性薬物にコンジュゲートされうる。
【０１１６】
工程（３）のクロマトグラフィー分離工程は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外ろ過／ダイアフィルトレーション（diafiltration）、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣまたはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００クロマトグラフィーなどの過程を包含することができる。該クロマトグラフィー分離は、また、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐメチルＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチルＨＩＣ媒体を用いる、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって達成されうる。
【０１１７】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを調製するための代表的な方法は、同時継続中の米国特許出願公開第２００４−０８２７６４Ａ１号および米国特許出願第１０／６９９，８７４号（全体として本明細書の一部とされる）においてＣＭＣ−５４４の調製に関して記載された方法を包含する。コンジュゲーションは、下記の条件：１０ｍｇ／ｍｌ抗体、８．５％（ｗ／ｗ）カリケアマイシン誘導体、３７．５ｍＭデカン酸ナトリウム、９％（ｖ／ｖ）エタノール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、ｐＨ８．５、３２℃、１時間を用いて行ってもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ブチルセファロースＦＦ樹脂、０．６５Ｍリン酸カリウムローディングバッファー、０．４９Ｍリン酸カリウム洗浄バッファー、および４ｍＭリン酸カリウム溶出バッファーを用いて実施してもよい。バッファー交換は、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過／ダイフィルトレーション、または他の適当な手段によって達成されうる。抗体／薬物コンジュゲートは、１．５％Ｄｅｘｔｒａｎ−４０、０．９％シュークロース、０．０１％ＴＷＥＥＮＲ−８０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で処方されうる。５％シュークロース、０．０１％ＴＷＥＥＮＲ−８０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する別の処方溶液もまた用いてもよい。凍結乾燥サイクルは、処方に基づいて調整される。処方されたバルクの濃度は、０．５ｍｇコンジュゲート／ｍｌであってもよい。各バイアルは、１ｍｇのコンジュゲート、すなわち２ｍｌ充填量を含有しうる。所望により、他の充填容量、例えば５ｍｌ充填量で調製してもよい。
【０１１８】
他の代表的な方法は、米国特許出願公開第２００６０００２９４２号にも記載されるＣＭＤ−１９３に関して記載された方法を包含する。コンジュゲーションは、下記の条件：１０ｍｇ／ｍｌ抗体、７％（ｗ／ｗ）カリケアマイシン誘導体、１０ｍＭデオキシコレート、５０ｍＭ ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、９％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ８．２、３２℃、１時間を用いて実施されうる。該反応物は、０．６６Ｍリン酸カリウム、ｐＨ８．５６で１０倍希釈されてもよく、ＨＩＣは、ブチルセファロースＦＦ樹脂、０．６０Ｍリン酸カリウムローディングバッファーおよび洗浄バッファー、および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ溶出バッファーを用いて実施してもよい。バッファー交換は、再生セルロース膜を用いる限外ろ過／ダイフィルトレーションを用いて達成されうる。コンジュゲートは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０（１０ダイアボリューム）に対してダイアフィルトレーションされうる。抗体／薬物コンジュゲートは、５％シュークロース、０．０１％ＴＷＥＥＮＲ−８０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で処方されうる。処方後のバルクコンジュゲートの濃度は、１ｍｇ／ｍｌであってもよく、バイアル充填量は５ｍｇ／バイアル、すなわち５ｍｌ充填量であってもよく、または所望により、他の充填容量で調製されてもよい。
【０１１９】
本発明の特定の具体例において、用いられるリンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である。抗体／薬物コンジュゲートは、β−カリケアマイシン、γ−カリケアマイシンまたはＮ−アセチルγ−カリケアマイシン、またはその誘導体を３−メルカプト−３−メチルブタノイルヒドラジド、ＡｃＢｕｔリンカーおよび本発明の抗−５Ｔ４抗体と反応させることによって調製される。例えば、米国特許第５，７７３，００１号を参照のこと。該リンカーは、循環中において実質的に安定であり、その結果、１日につきおよそ２％のＮＡｃ−ガンマＤＭＨを放出し、酸性リソソーム中で容易にＮＡｃ−ガンマＤＭＨを放出するコンジュゲートを生産する。本発明の他の具体例において、抗体／薬物コンジュゲートは、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）または４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）をリンカー分子として用いて調製される。
【０１２０】
放射性同位元素のコンジュゲーションに有用な代表的なリンカーは、ジエチレントリアミンペンタセテート（ＤＴＰＡ）−イソチオシアネート、スクシンイミジル６−ヒドラジニウムニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）、およびヘキサメチルプロピレンアミドオキシム（ＨＭＰＡＯ）を包含する（Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270、米国特許第６，０２４，９３８号）。別法では、標的分子は、放射性同位元素が直接それに結合されうるように誘導体化されうる（Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300）。負荷方法もまた、当該分野で知られており、代表的なプロトコールは、例えば、Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 およびBakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-9において見出されうる。
【０１２１】
抗体／薬物コンジュゲートあたりの薬物分子の数をさらに増やすために、薬物は、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーを包含するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされてもよい。ＰＥＧモノマーは、式−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−で示される。薬物および／またはペプチド類似物は、ＰＥＧに直接または間接的に、すなわち、糖類などの適当なスペーサー基を介して結合されうる。ＰＥＧ／抗体／薬物組成物は、また、薬物安定性およびイン・ビボでの標的部位への送達を促進するために、付加的な脂肪親和性および／または親水性基を含んでいてもよい。ＰＥＧ−含有組成物の調製のための代表的な方法は、なかでも、米国特許第６，４６１，６０３号、第６，３０９，６３３号および第５，６４８，０９５号に見出されうる。
【０１２２】
例えば、抗体−カリケアマイシンコンジュゲートにおけるカリケアマイシンの量を増加するために、例えば、ＰＥＧ−ＳＰＡ、ＰＥＧ−ＳＢＡまたはＰＥＧ−ビス−マレイミドを用いて、抗体をＰＥＧにコンジュゲートした後に、カリケアマイシンとコンジュゲートする。ＰＥＧを用いて調製された抗体／薬物コンジュゲートは、標的抗原に対する結合アフィニティーの減少を示すが、薬物負荷量の増加の結果としてまだ効果的である。デオキシコレートおよびデカノエートなどの添加物を用いて、低レベルのコンジュゲートされていない抗体および低レベルの凝集物を伴う抗体／カリケアマイシンコンジュゲートを生産してもよい。
【０１２３】
カリケアマイシンを包含する多くの薬物の疎水性の性質は、抗体／薬物コンジュゲートの凝集をもたらしうる。より高い薬物負荷／収率を有し、かつ、凝集の少ない一量体抗体／薬物コンジュゲートを生産するために、コンジュゲーション反応は、（ｉ）共溶媒としてプロピレングリコールおよび（ｉｉ）少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸を含む添加物を含有する非求核性のタンパク質適合性バッファー溶液中で実施されうる。有用な酸は、Ｃ７〜Ｃ１２酸、例えば、オクタン酸またはカプリル酸またはその塩を包含する。プロピレングリコール以外の他のタンパク質適合性有機共溶媒、例えば、エチレングリコール、エタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳなどもまた、使用されうる。有機共溶媒のいくつか、または全てを用いて、薬物をコンジュゲーション混合物中に移動させる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステルまたは他の同等に活性化されたエステルを用いる抗体／薬物コンジュゲートの調製に有用なバッファーは、リン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳバッファー）を包含する。コンジュゲーション反応に用いられる緩衝溶液は、実質的に、遊離アミンおよび求核性分子を含有しない。別のアプローチとして、コンジュゲーション反応は、付加的な添加剤を含有せず、ｔ−ブタノールを含有する非求核性のタンパク質適合性緩衝溶液中で行ってもよい。例えば、米国特許第５，７１２，３７４号および第５，７１４，５８６号を参照のこと。コンジュゲーションのための付加的な方法およびカリケアマイシン含有コンジュゲートは、米国特許第５，７３９，１１６号および第５，８７７，２９６号に記載されている。
【０１２４】
一量体コンジュゲートの形成のための最適な反応条件は、温度、ｐＨ、カリケアマイシン誘導体投入量および添加物濃度などの反応変量の変動によって、経験的に決定されうる。プロピレングリコールの代表的な量は、全溶液容量の１０％〜６０％、例えば、１０％〜４０％、または約３０％の範囲である。少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩を含む添加剤の代表的な量は、２０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば、４０ｍＭ〜９０ｍＭ、または約６０ｍＭ〜９０ｍＭの範囲である。Ｃ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩の濃度は、１５０−３００ｍＭに増加してもよく、共溶媒は１％〜１０％に低下してもよい。本発明の代表的な具体例において、カルボン酸は、オクタン酸、デカン酸、またはその対応する塩である。例えば、２００ｍＭカプリル酸は、５％プロピレングリコールまたはエタノールと共に使用されうる。コンジュゲーション反応は、わずかに高温（３０−３５℃）にて、ｐＨ（８．２−８．７）で行ってもよい。抗体の濃度は、１〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲であってもよく、カリケアマイシン誘導体、例えば、Ｎ−アセチルガンマ−カリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔ ＯＳｕエステルの濃度は、抗体の約４．５重量％〜１１重量％の範囲であってもよい。他の薬物のコンジュゲーションのための適当な条件は、過度の実験を行うことなく、当業者によって決定されうる。
【０１２５】
ＩＩＩ．Ｃ．抗体／薬物コンジュゲートの精製
コンジュゲーション後、一量体コンジュゲートは、常法により、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）またはクロマトフォーカシング（ＣＦ）によって、コンジュゲートされていない反応物質および／または凝集形態のコンジュゲートから分離されうる。精製されたコンジュゲートは、一量体であり、通常、３重量％〜１０重量％の薬物を含有する。抗体／薬物コンジュゲートは、また、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製してもよく、該クロマトグラフィーは、（１）ＬＣＦ含量および凝集物を効率良く減らすための能力、（２）大量の反応容量に適応すること、および（３）生成物の最小限の希釈を包含する、ＳＥＣを越えるいくつかの利点を提供する。生産規模での使用に適当な大容量ＨＩＣ媒体は、フェニル・セファロース６ファースト・フロークロマトグラフィー媒体、ブチル・セファロース４ファースト・フロークロマトグラフィー媒体、オクチル・セファロース４ファースト・フロークロマトグラフィー媒体、トヨパール（Toyopearl）・エーテル−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、マクロ−プレプ（Macro-Prep）メチルＨＩＣ媒体またはマクロ−プレプｔ−ブチルＨＩＣ媒体を包含する。限外ろ過／ダイフィルトレーションもまた、バッファー交換に使用されうる。
【０１２６】
代表的な精製過程において、遠心分離細胞除去工程、プロテインＡアフィニティー捕捉工程および続く１または２回の直交クロマトグラフィーポリッシング（polishing）工程、ウイルスろ過工程、および濃縮および処方のためのタンジェンシャル・フロー（tangential flow）ろ過工程を包含する複数の工程が実施される。精製過程は、好ましくは、５％未満の凝集物、２０ｐｐｍ未満のプロテインＡ、５０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、および全回収率が５０％を越える生成物を生じる。
【０１２７】
典型的な抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシン調製物は、主に（〜９５％）、抗体１モルあたり５〜７モルのカリケアマイシンを含有するコンジュゲートされた抗体を含有する。該コンジュゲートは、研究室規模（１０−２００ｍｇ）で再生可能に調製された。モノクローナル抗体１ｍｇあたりのカリケアマイシンμｇとして表される薬物負荷量は、カリケアマイシン濃度（μｇ／ｍＬ）を抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）で割ることによって決定される。これらの値は、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍでのコンジュゲート溶液のＵＶ吸光度を測定することによって決定される。これは平均負荷量であって、実際の負荷量は、平均負荷値に中心のある疑似ガウス（quasi-gaussian）分布であり、すなわち、抗体のいくつかは平均より高く負荷され、抗体のいくつかは平均より低く負荷されることに注意することが重要である。コンジュゲートされていない抗体（低コンジュゲートフラクション）とは、分析的ＨＩＣ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー）を用いて測定することができるが、わずかにコンジュゲートされたか、またはコンジュゲートされていないカリケアマイシンを有する抗体の集団である。該値は、抗体におけるカリケアマイシン分布の測定値であり、一般に、投与されるカリケアマイシン量に影響を及ぼさない。コンジュゲートされていないカリケアマイシンとは、ＥＬＩＳＡを用いて測定することができるが、抗体にコンジュゲートされていないカリケアマイシンの量をいい、全カリケアマイシンに対するパーセントで表される。薬物負荷アッセイは、コンジュゲートされていないカリケアマイシンとコンジュゲートされたカリケアマイシンとを区別しない。コンジュゲートされていないカリケアマイシンの量は、薬物負荷アッセイを用いた場合、検出不可能であるか、または無視されるので、これらのアッセイは、コンジュゲートされたカリケアマイシンの量を効果的に測定する。
【０１２８】
分析方法は、ヒト化抗−５Ｔ４カリケアマイシンコンジュゲートの放出および安定性試験に関してアッセイするために使用することができる。該コンジュゲートは、同一性（ＩＥＦ）、強度（全タンパク質および全カリケアマイシン負荷）、純度（コンジュゲートされていないカリケアマイシン、低コンジュゲート抗体、凝集物含量および還元されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および免疫アフィニティー（抗原結合ＥＬＩＳＡ）について、評価することができる。当業者に既知の付加的なアッセイを使用することができる。これらのアッセイを用いて、バッチ−トゥ−バッチ（batch-to-batch）コンシステンシーを商業的製造において維持することができる。
【０１２９】
ＩＩＩ．Ｄ．抗体／薬物コンジュゲートの薬物動力学
５Ｔ４−標的化免疫コンジュゲートの薬物動力学を評価することができ、種々の動物におけるコンジュゲートされていないカリケアマイシンの薬物動力学と比較することができる。例えば、これは、雌ヌードマウス、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットおよび雌カニクイザル（cynomologus monkey）において、単回静脈内ボーラス投与後に行うことができる。抗−５Ｔ４抗体の薬物動力学は、一般に、低クリアランス、低容量の分布、および様々な種における見かけ上長期間の半減期によって特徴付けられる。コンジュゲートされていないカリケアマイシン誘導体の血清濃度は、定量限界よりも低いと予想される。単回投与量の毒性決定研究におけるこれらのコンジュゲートの毒性プロファイルは、比較可能な投与量にて、他の抗体／カリケアマイシンコンジュゲートに関して得られたプロファイルに類似すると予想される。
【０１３０】
ＩＶ．抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの特徴付けのための機能的アッセイ
本発明は、さらに、５Ｔ４結合活性、細胞表面上に存在する５Ｔ４抗原への結合後の細胞性内在化、および対象における５Ｔ４発現細胞の標的化を包含する、抗−５Ｔ４抗体の活性を特徴付けるためのイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイを開示する。細胞毒にコンジュゲートする場合、本発明の開示される抗体は、５Ｔ４発現性癌細胞の成長阻害および／または５Ｔ４発現性細胞における細胞死の誘導を包含する抗癌活性を誘導しうる。本発明の抗−５Ｔ４抗体は、１以上の外来性活性を含んでいてもよい。
【０１３１】
５Ｔ４抗原に対する抗−５Ｔ４抗体の結合を検出するための技術は、当該分野で知られており、例えば、実施例２に記載されるようなＢＩＡＣＯＲＥＲアッセイを包含する。付加的な代表的技術は、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーおよび他の免疫化学的方法を包含する。例えば、Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, United States of America; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, Amsterdam/New Yorkを参照のこと。抗原結合アッセイは、単離した５Ｔ４抗原または５Ｔ４発現性細胞を用いて行ってもよい。実施例２を参照のこと。
【０１３２】
抗−５Ｔ４抗体の結合特異性は、さらに、結合エピトープの限定、すなわち、抗原結合に関係する非隣接残基を包含する残基の同定、および／または抗原結合に影響を及ぼす残基の限定によって記載されうる。実施例４−５を参照のこと。
【０１３３】
抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの５Ｔ４発現性細胞による内在化は、５Ｔ４発現性細胞の表面に結合した抗体またはコンジュゲートの量を経時的に観察することによってアッセイされうる。抗体および抗体／薬物コンジュゲートの膜局在性を評価するための代表的な技術は、実施例３に記載される。
【０１３４】
機能的アッセイは、また、抗体／薬物コンジュゲートの抗癌活性、例えば、現存する癌細胞を破壊する能力、または癌細胞の成長を遅らせるか、もしくは妨げる能力を評価するための方法を包含する。本発明の抗体／薬物コンジュゲートによって標的化される癌は、原発性腫瘍および転移腫瘍の両方、ならびに白血病およびリンパ腫などの癌腫および造血系悪性腫瘍を包含する対象におけるいずれかの組織の癌腫を包含する。
【０１３５】
成長阻害活性を有する抗−５Ｔ４抗体は、５Ｔ４発現性細胞を排除することができるか、または５Ｔ４発現性細胞の増殖を妨げるか、もしくは減少させることができる。細胞成長阻害の迅速なイン・ビトロ評価のための代表的な方法は、Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98に記載されている。
【０１３６】
抗−５Ｔ４抗体は、また、細胞死、例えば、核ＤＮＡ分解、核退化および凝縮、膜完全性の喪失、および食作用によって特徴付けられるプログラム細胞死を誘導する能力を含んでいてもよい。細胞を評価するための代表的なアッセイは、Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885に記載されている。
【０１３７】
例えば、抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性をイン・ビトロで評価するために、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現しているヒト乳癌細胞）およびＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞（対照細胞）を、特にBoghaert et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10: 4538-4549に記載されているように、抗体−カリケアマイシンコンジュゲートの存在下または遊離カリケアマイシンの存在下で培養する。各剤の細胞毒性は、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として報告され、ＥＤ５０は、非処理対照と比べて細胞培養物の５０％減少を引き起こすコンジュゲートまたは遊離の薬剤として与えられたカリケアマイシンの量である。培養中の細胞数は、薬物曝露後に生体染色色素（ＭＴＳ）を用いて決定される。実施例６も参照のこと。
【０１３８】
抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性は、また、スフェロイド成長に適当な方法で培養されたＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４およびＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞を用いて評価されうる。細胞は、抗体／カリケアマイシンコンジュゲートまたは遊離カリケアマイシンの存在下で培養し、薬物曝露後、各スフェロイドの寸法を決定した。スフェロイド成長の阻害における各薬剤の効率は、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として、すなわち、非処理対照と比べてスフェロイド成長の５０％阻害を引き起こすコンジュゲートまたは遊離薬物として与えられたカリケアマイシンの量として報告される。実施例６を参照のこと。
【０１３９】
抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性をイン・ビボで評価するために、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現しているヒト乳癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ１５７細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）、ＰＣ１４ＰＥ６細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）またはＮ８７細胞（ヒト胃癌細胞）の皮下注射によって、ヌードマウス中で腫瘍を調製する。抗体／カリケアマイシンコンジュゲートおよび対照化合物を腫瘍を有するマウスに、例えば、腹膜内注射によって、４日間隔で全３回、例えば、１、５および９日目に投与する。測定可能な治療結果は、腫瘍細胞成長の阻害を包含する。
【０１４０】
さらに抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの標的化能力を評価するために、本質的にOnn et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9(15):5532-5539に記載のように、非小細胞および小細胞癌のための同所性モデルを用いてもよい。簡単に言うと、ヒト肺腺癌（ＰＣ１４ＰＥ６）細胞をヌードマウスの尾部静脈中に注射し、次いで、それが移動して肺に腫瘍を形成する。腫瘍は、肺実質における充実性結節として現れ、浮遊した腫瘍細胞を含有する血性胸水を引き起こしうる。対照化合物および抗体／カリケアマイシンコンジュゲートを腫瘍を有するマウスに、例えば、腫瘍細胞の注射後６日目に開始する４日間隔で全３回、例えば、６、１０および１４日目の腹膜内注射によって投与される。測定可能な治療結果は、胸水の減少および生存数の増加を包含する。
【０１４１】
Ｖ．抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの使用
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートは、５Ｔ４発現性性細胞に関連した適用について、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で有用である。５Ｔ４を発現している癌は、扁平上皮／腺腫様肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頚癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛癌を包含する。５Ｔ４は、気管支、胸、結腸、直腸、胃、子宮頚、子宮内膜、膵臓、卵巣、絨毛膜（chorium）および精嚢において高レベルで検出される。
【０１４２】
Ｖ．Ａ．イン・ビトロ適用
本発明は、イン・ビトロで抗−５Ｔ４抗体を用いる方法を提供する。例えば、開示される抗体は、５Ｔ４陽性癌細胞を特異的に結合してかかる細胞を細胞試料から枯渇させるために、単独または細胞毒性剤または他の薬物と組み合わせて使用してもよい。５Ｔ４発現性細胞と、細胞毒にコンジュゲートした抗−５Ｔ４抗体を含む抗体／薬物コンジュゲートとの接触を介して、アポトーシスおよび／または細胞増殖阻害を誘導するための方法もまた、提供される。代表的なイン・ビトロでの方法は、本明細書中、「抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの特徴付けのための機能的アッセイ」と見出しを付けて上記される。
【０１４３】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、また、５Ｔ４抗原に特異的に結合する能力に基づいて、イン・ビトロでの５Ｔ４陽性細胞の検出における有用性を有する。５Ｔ４発現性細胞を検出する方法は、（ａ）細胞を含む生物学的試料を調製し、（ｂ）抗−５Ｔ４抗体を生物学的試料とイン・ビトロで接触させ、次いで（ｃ）抗−５Ｔ４抗体の結合を検出することを含んでいてもよい。検出を容易化するために、抗体は標識にコンジュゲートされていてもよい。
【０１４４】
Ｖ．Ｂ．イン・ビボでの検出および診断
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、また、例えば、診断に役立つので、イン・ビボ検出方法に使用してもよく、術中の援助を提供するために、または用量決定のために使用してもよい。標識された抗−５Ｔ４抗体の対象への投与後、および結合に十分な時間の経過後、抗体によって結合された５Ｔ４発現性細胞の生体分布を視覚化してもよい。開示される診断方法は、治療方法と組み合わせて使用してもよい。さらに、本発明の抗−５Ｔ４抗体は、検出および治療という二重の目的で投与されてもよい。
【０１４５】
代表的な非浸襲性検出方法は、シンチグラフィー（例えば、ＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピューター断像撮影）、ＰＥＴ（ポジトロン放出断像撮影）、ガンマカメラ画像化、および直線走査）、磁気共鳴画像化（例えば、従来の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、プロトン磁気共鳴分光学（ＭＲＳ）、拡散強調画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像化（ｆＭＲＩ））、および超音波を包含する。
【０１４６】
Ｖ．Ｃ．治療的適用
本発明は、さらに、対象において５Ｔ４発現性癌細胞の細胞溶解を誘導するために有用な方法および組成物に関する。本発明の抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートは、癌細胞および非腫瘍性増殖障害、例えば、過形成、化生または最も特別には、異形成の細胞の成長を阻害するのに有用である（かかる異常な成長障害の概要については、DeVita, Jr. et a. (2001), Cancer: Principles and Practice, 6th edition, Lippincott Williams ＆ Wilkinsを参照のこと）。
【０１４７】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを用いる標的化に適当な癌は、胸、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、胆管、小腸、腎臓、膀胱および尿路上皮を包含する尿道、女性の生殖管、子宮頚、子宮、卵巣、男性の生殖管、前立腺、精嚢、精巣、内分泌腺、甲状腺、副腎、下垂体、皮膚、骨、軟組織、血管、脳、神経、眼、髄膜における５Ｔ４発現性原発性および転移性腫瘍を包含する。他の関連する癌は、無痛性、進行性、低悪性度、中程度の悪性度、または高悪性度の白血病またはリンパ腫を包含する５Ｔ４発現性白血病およびリンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）である。
【０１４８】
特に、５Ｔ４は、扁平上皮／腺腫様肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頚癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛癌の細胞において発現されることが知られている。５Ｔ４は、気管支、胸、結腸、直腸、胃、子宮頚、子宮内膜、膵臓、卵巣、絨毛膜（chorium）および精嚢において高レベルで検出される。５Ｔ４抗原の細胞表面分布は、均一または不均一であってもよい。結腸直腸癌、胃癌および卵巣癌において、５Ｔ４の発現は、疾患の進行に直接関係する。乳癌において、転移性節における増加した５Ｔ４染色強度が観察されるが、５Ｔ４発現は疾患段階と相関しない。癌は、また、胸、結腸、胃、食道、膵臓、十二指腸、肺、膀胱および腎臓癌ならびに胃および小島細胞神経内分泌腫瘍を包含するルイスＹ炭水化物抗原を発現しうる。米国特許第６，３１０，１８５号を参照のこと。
【０１４９】
かくして、本発明の抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートで処理すべき患者は、限定するものではないが、５Ｔ４抗原の発現増加を包含する生体マーカー発現に基づいて選択されてもよく、その結果、腫瘍の起源または組織学よりもむしろ豊富な標的発現について選択された患者集団をもたらす。標的発現は、細胞染色強度と組み合わせた細胞染色数の関数として測定されることができる。例えば、高発現の５Ｔ４の分類は、５Ｔ４について陽性の免疫組織化学的染色によって試験された細胞の３０％よりも多く（すなわち、４０％、５０％または６０％）が３＋（１〜４のスケール）のレベルである患者を包含し、一方、５Ｔ４の中程度の発現は、細胞の２０％よりも多くが１＋〜２＋で細胞染色された患者を包含することができる。
【０１５０】
例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）に基づく腫瘍の特徴付けを包含する５Ｔ４抗原の発現以外の生体マーカーもまた、患者選択のために使用することができる。ヒト癌のおよそ５０パーセントは、化学療法に対して完全に耐性であるか、または一時的にしか応答せず、その後、一般に使用される抗癌剤によってもはや影響を受けない。該現象は、ＭＤＲとも称し、いくつかの種類の腫瘍によって生得的に発現されるが、他の種類の腫瘍は、化学療法処理に曝露後にＭＤＲを獲得する。薬物流出ポンプＰ−糖タンパク質は、細胞毒性化学療法に関連するＭＤＲの大部分の媒介となる。癌患者腫瘍試料に存在するＭＤＲメカニズムの表現型的および機能的分析は、特定のＭＤＲメカニズムを特定の種類の腫瘍における化学療法耐性に関連づけるために行うことができる。
【０１５１】
癌成長または異常な増殖は、より進行した癌形態または病態への細胞内変化を示唆するいくつかの指標のうちのいずれか１つを示す。癌細胞または非腫瘍性増殖障害の細胞の成長の阻害は、当該分野で知られた方法によって、例えば、腫瘍成長の遅延および転移阻害によってアッセイされうる。癌成長の阻害を測定するための他の指標は、癌細胞生存における減少、腫瘍容量または形態の減少（例えば、コンピューター断像撮影（ＣＴ）、音波ホログラフィー、または他の画像化方法を用いて決定される）、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型皮膚過敏性試験における改善された動態、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性増加、および腫瘍特異的抗原レベルの減少を包含する。
【０１５２】
いずれか１つの様式の操作によって縛られることは望ましくないが、抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートの抗原−誘導性標的化ならびに受動的な標的化の両方が抗腫瘍効力に寄与しうる。抗原−誘導性標的化とは、対照組織（すなわち、実質的に５Ｔ４発現性細胞および投与された抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの結合および／または蓄積が欠くと推測される組織）と比べて、標的組織（すなわち、５Ｔ４発現性細胞、および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの蓄積が意図される部位を含む組織）におけるペプチドまたはペプチド類似物の優先的な移動および／または蓄積をいう。抗体／薬物コンジュゲートの優先的な局在化は、一般的に、標的組織における抗体／薬物コンジュゲートの量が対照組織における抗体／薬物コンジュゲートの量よりも約２倍多いような場合であり、例えば、約５倍以上、または約１０倍以上多いような場合である。
【０１５３】
受動的標的化とは、一般に、脈管構造における局所的変化に起因する腫瘍部位での抗体または抗体／薬物コンジュゲートの封鎖をいう。例えば、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、腫瘍部位で脈管構造（該構造はＶＥＧＦ産生増加のために有窓である）を離れ、５Ｔ４発現性細胞に結合して、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの内在化を引き起こしうる。腫瘍の乏しい静脈およびリンパドレナージもまた、結合していない５Ｔ４／薬物コンジュゲートの捕捉をもたらす。酸に不安定なリンカーを用いて薬物にコンジュゲートされた抗体は、薬物を放出することができ、次いで、腫瘍細胞中に拡散することができる。受動的標的化の抗腫瘍効果は、永続的ではなく、または抗原−誘導性標的化によって誘導される効果ほど強力ではないが、全体的な効力に寄与しうる。
【０１５４】
Ｖ．Ｄ．処方
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、容易に調製され、安全かつ効力のある臨床的使用のために処方される。対象に投与するための適当な処方は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール）、処方を意図されるレシピエントの体液と等張にするための溶質（例えば、糖類、塩類およびポリアルコール類）、懸濁化剤および増粘剤を含有しうる水性および非水性滅菌注射溶液を包含する。適当な溶媒は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびその混合物を包含する。該処方は、単位投与または多回投与用容器中、例えば、密閉したアンプルおよびバイアル中で提供してもよく、対象への投与のために使用する直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする冷凍または凍結乾燥された状態で、またはその後、意図される適用に適当な同位元素で放射能標識されるために、保管されてもよい。本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートは、好ましくは、下記のような有効投与量として処方される。
【０１５５】
一例として、代表的な抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート処方は、４０ｍｇ／ｍｌ抗体または抗体／薬物コンジュゲート、２５ｍＭアセテート、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．０の多回投与用処方を含み、それは、最小限の保管寿命が２−８℃保管で２年である。別の例として、抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート処方は、９．０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０および滅菌水、ｐＨ６．５中において、１０ｍｇ／ｍｌ抗体または抗体／薬物コンジュゲートを含んでいてもよい。実験的なマウスモデルに投与するための抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの代表的な処方は、２μｇまたは４μｇカリケアマイシンを含み（実施例３、４および７参照）、それに応じて、ヒトへの投与のために増減させればよい。
【０１５６】
抗−５Ｔ４抗体または抗体／薬物コンジュゲートの安定な凍結乾燥処方は、（ａ）抗体／薬物コンジュゲートを最終濃度０．５〜２ｍｇ／ｍｌまで、１．５重量％〜５重量％の凍結防止剤、０．５−１．５重量％のポリマー増量剤、０．０１Ｍ〜０．１Ｍの電解質、０．００５重量％〜０．０５重量％の溶解促進剤、溶液の最終ｐＨが７．８−８．２になるように５−５０ｍＭの緩衝化剤、および水を含む溶液中に溶解し、（ｂ）上記溶液を、＋５℃〜＋１０℃にてバイアル中に分注し、（ｃ）−３５℃〜−５０℃の冷凍温度で該溶液を冷凍し、（ｄ）該冷凍溶液を第１乾燥圧力２０〜８０ミクロンにて、棚温度−１０℃〜−４０℃で２４〜７８時間、最初の凍結乾燥工程に付し、次いで、（ｅ）工程（ｄ）の凍結乾燥産物を乾燥圧力２０〜８０ミクロンにて、棚温度＋１０℃〜＋３５℃で１５〜３０時間、第２の乾燥工程に付すことによって、調製されうる。
【０１５７】
凍結防止剤の凍結乾燥に有用な代表的な凍結防止剤は、アルジトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ポリエチレングリコール、アルドン酸、ウロン酸、糖酸（aldaric acid）、アルドース、ケトース、アミノ糖、アルジトール、イノシトール、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、グルコース、フラクトース、グルコン酸、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、メチルα−グルコピラノシド、マルトース、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトン、ソルボース、グルカル酸、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、シュークロース、トレハロース、ノイラミン酸、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプン、シュークロース、グルコース、ラクトース、トレハロース、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、およびペンタエリストリトールを包含する。
【０１５８】
例えば、凍結防止剤シュークロースは、１．５重量％の濃度で使用してもよく、ポリマー増量剤デキストラン４０またはヒドロキシエチルデンプン４０は、０．９重量％の濃度で使用してもよく、凍結乾燥溶液中に使用される電解質は、塩化ナトリウムであり、０．０５Ｍの濃度で存在し、緩衝化剤トロメタミンは、０．０２Ｍの濃度で使用してもよい。溶解促進剤（例えば、ポリソルベート８０などの界面活性剤）は、また、凍結乾燥工程の間に使用してもよい。通常、該溶解促進剤は、界面活性剤である。凍結乾燥処方の調製のための代表的な工程は、バイアルを−４５℃で冷凍し、冷凍された溶液を第１の乾燥圧力６０ミクロンおよび棚温度−３０℃で６０時間の最初の凍結乾燥工程に付し、次いで、凍結乾燥産物を乾燥圧力６０ミクロンで、棚温度＋２５℃で２４時間の第２の乾燥工程に付すことを包含する。
【０１５９】
抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートは、医薬上許容される担体、例えば、大きなゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子中で処方される。医薬上許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩、または有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩もまた使用してもよい。処方は、付加的に、液体、例えば、水、セーライン、グリセロール、およびエタノールを含有していてもよく、および／または補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化物質がかかる組成物中に配合されていてもよい。かかる担体は、該組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸薬、ドラジェー、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として処方することを可能にする。
【０１６０】
Ｖ．Ｅ．投与量および投与
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、非経口的に、例えば、血管内、皮下、腹膜内、または筋内投与によって投与されうる。肺経路への組成物の送達の場合、組成物は、エーロゾルまたは粗（coarse）スプレーとして、すなわち、経鼻投与によって投与されうる。髄腔内、骨髄内または心室内投与は、中枢神経系（ＣＮＳ）癌およびＣＮＳ関連癌の治療に用いてもよい。抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、また、経皮的（transdermally）、経皮的（transcutaneously）、局所的、経腸的、膣内、舌下または直腸投与されてもよい。静脈内投与は、臨床上、ルーチンに使用されうる。送達方法は、治療されるべき状態および部位、抗体処方の型および組成物の治療効力などの考慮に基づいて選択される。
【０１６１】
本発明は、有効量の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートを、すなわち、所望の生物学的応答を誘導するのに十分な抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの量を対象に投与することを提供する。例えば、癌を有する対象に投与する場合、有効量は、癌細胞溶解、癌細胞増殖の阻害、癌細胞アポトーシスの誘導、癌細胞抗原の減少、腫瘍成長の遅延、および／または転移の阻害を包含する抗癌活性を誘導するのに十分な量を含む。腫瘍の縮小は、効力についての臨床的代理マーカーとしてよく許容される。効力についての別のよく許容されるマーカーは、無増悪（progression-free）生存率である。抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、一般に、重要な効力パラメーターにおいて少なくとも２５％の改善、例えば、平均生存期間、腫瘍進行までの時間、および全体的な応答率における改善を明らかにする。
【０１６２】
一般に、有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２、例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２、または約１５ｍｇ／ｍ２の範囲であり、該投与量は、抗−５Ｔ４抗体の量に基づいて算出される。抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの有効量は、また、コンジュゲートされた薬物の量に基づいて算出されうる。例えば、実験的マウスモデルに投与するための抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの代表的な投与量は、２μｇまたは４μｇのカリケアマイシンを包含し、これに応じて、ヒトに対する投与のために増減させればよい。例えば、本発明の抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、ヒト患者に、３週間毎に１回、６サイクルまで投与されうる。放射能標識した抗−５Ｔ４抗体の場合、有効量は、放射性同位元素および抗体の結合アフィニティーにもよるが、典型的に、約１ｍＣｉ〜約３００ｍＣｉ、通常、約５ｍＣｉ〜１００ｍＣｉの範囲である。
【０１６３】
開示される抗−５Ｔ４抗体を用いる５Ｔ４陽性細胞の検出のために、検出可能な量の本発明の組成物を、すなわち、抗体の存在がイン・ビトロまたはイン・ビボで決定されうるような抗−５Ｔ４抗体の投与量を対象に投与する。放射性同位元素を用いるシンチグラフィー画像化の場合、放射性同位元素の典型的な投与量は、約１０μＣｉ〜５０ｍＣｉ、または約１００μＣｉ〜２５ｍＣｉ、または約５００μＣｉ〜２０ｍＣｉ、または約１ｍＣｉ〜１０ｍＣｉ、または約１０ｍＣｉの活性を包含しうる。
【０１６４】
本発明の組成物における活性剤の実際の投与量レベルは、所望の診断的または治療的結果を達成するのに有効な組成物量を投与するように変化させればよい。投与方針もまた、変化させればよい。単回注射または多回注射を用いてもよい。選択される投与量レベルおよび方針は、治療組成物、処方の活性および安定性（すなわち、半減期）、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、検出および／または治療されるべき疾患または障害、ならびに治療されている対象の物理的状態および以前の病歴を包含する種々の因子に依存する。
【０１６５】
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの場合、治療上有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、例えば、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、および／または霊長類のいずれかにおいて、最初に概算すればよい。動物モデルは、また、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用してもよい。次いで、かかる情報は、ヒトにおける有用な投与量および投与経路を決定するために使用してもよい。典型的には、最小投与量を投与し、該投与量を用量規定毒性の不在下で段階的に増加させる。有効量または投与量の決定および調整、ならびにかかる調整をいつどのように実施するかの評価は、医学分野における通常の知識を有する者にとって既知である。
【０１６６】
組み合わせ療法の場合、抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート、および／または付加的な治療剤または診断剤を、意図される治療または診断の実施に適当ないずれかの期間内に投与する。かくして、単一の薬剤を実質的に同時に（すなわち、単一処方として、または数分もしくは数時間以内に）投与してもよく、またはいずれかの順番で連続的に投与してもよい。例えば、単一薬剤治療は、互いに約１年以内に、例えば、約１０、８、６、４または２ヶ月以内に、または４、３、２または１週間以内に、または約５、４、３、２または１日以内に投与してもよい。
【０１６７】
処方、投与量、投与方針および測定可能な治療結果に関する付加的な手引きに関しては、Berkow et al. (2000) The Merck Manual of Medical Information, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology, CRC Press, Boca Raton, Florida; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania; Katzung (2001) Basic & Clinical Pharmacology, Lange Medical Books / McGraw-Hill Medical Pub. Div., New York; Hardman et al. (2001) Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, The McGraw-Hill Companies, Columbus, Ohio; Speight & Holford (1997) Avery's Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choices, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvaniaを参照のこと。
【０１６８】
Ｖ．Ｆ．組み合わせ療法
開示される抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、最初の治療として投与されてもよく、または、従来の治療に不反応性の病態の治療のために投与してもよい。さらに、抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートを他の治療（例えば、外科的切除、照射、付加的な抗癌剤など）と組み合わせて用いてもよく、それにより、付加的な、または強化された治療効果を誘導し、および／またはいくつかの抗癌剤の肝臓細胞毒性を減少させてもよい。本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、付加的な薬剤と共に投与または処方されてもよく、または付加的な薬剤といずれかの順番で連続的に投与するために処方されてもよい。
【０１６９】
組み合わせ療法に有用な代表的な薬剤は、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの調製に有用であるとして本明細書中に上記した薬剤のいずれをも包含する。本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、また、開示される抗−５Ｔ４抗体以外の抗−５Ｔ４抗体ならびに異なる抗原を標的とする抗体およびコンジュゲートを包含する他の治療的抗体および抗体／薬物コンジュゲートとの組み合わせにおいても使用してもよい。単独または抗体／薬物コンジュゲートとして使用されうる代表的な抗体は、抗−ＣＤ１９抗体、抗−ＣＤ２０抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮＲ、ＺＥＶＡＬＩＮＲ、ＢＥＸＸＡＲＲ）、抗−ＣＤ２２抗体、抗−ＣＤ３３抗体（例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧＲ）、抗−ＣＤ３３抗体／薬物コンジュゲート、抗−ルイスＹ抗体（例えば、Ｈｕ３Ｓ１９３、Ｍｔｈｕ３Ｓ１９３、ＡＧｍｔｈｕ３Ｓ１９３）、抗−ＨＥＲ−２抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ（トラスツズマブ（trastuzumab））、ＭＤＸ−２１０、ＯＭＮＩＴＡＲＧＲ（ペルツズマブ（pertuzumab）、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４））、抗−ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨＲ）、抗−ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸＲ（セツキシマブ（cetuximab））、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ（panitumumab））、抗−ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮＲ（ベバシツマブ（bevacizumab））、抗−ＤＮＡ／ヒストン複合抗体（例えば、ｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ）、抗−ＣＥＡ抗体（例えば、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、ＹＭＢ−１００３）ｈＬＭ６０９、抗−ＣＤ４７抗体（例えば、６Ｈ９）、抗−ＶＥＧＦＲ２（またはキナーゼ挿入ドメイン含有受容体、ＫＤＲ）抗体（例えば、ＩＭＣ−１Ｃ１１）、抗−Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（例えば、ＩＮＧ−１）、抗−ＦＡＰ抗体（例えば、シブロツマブ（sibrotuzumab））、抗−ＤＲ４抗体（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ）、抗−プロゲステロン受容体抗体（例えば、２Ｃ５）、抗−ＣＡ１９．９抗体（例えば、ＧＩＶＡＲＥＸＲ）および抗−フィブリン抗体（例えば、ＭＨ−１）を包含する。
【０１７０】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートは、また、治療方針の一部として、細胞毒性剤の１以上の組み合わせと一緒に投与されうる。該目的に有用な細胞毒性調製物は、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチンおよびプレドニソン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドクソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタソン、およびロイコボリン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニソン、メトトレキサート、ドクソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニソン、メトトレキサート、ドクソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシンおよびビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドクソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドクソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）とＡＢＶ（アドリアマイシン／ドクソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン）を交互；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）とＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドクソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）を交互；ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニソン）；ＩＭＶＰ−１６（イフォスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イフォスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタソン、高投与量シタラビンおよびシスプラスチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレジソロン、ＨＤシタラビンおよびシスプラスチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニソンおよびブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニソン）；およびＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニソン）；ＤＨＡＰ（シスプラスチン、高投与量シタラビンおよびデキサメタソン）；ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、シスプラスチン）；ＰＶ（シスプラスチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）；ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）；ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）；ＩＭ（イフォスファミド、マイトマイシン）；ＩＥ（イフォスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イフォスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イフォスファミド、シスプラチン）；ＩＣＥ（イフォスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン、イフォスファミド、エトポシド）；ビオレルビン（Ｖｉｏｒｅｌｂｉｎｅ）およびシスプラチン；カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）およびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン）；ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；およびＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン、ビンクリスチン）を包含する。
【０１７１】
抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、全身的抗癌剤、例えば、エピチロン類（epithilones）（ＢＭＳ−２４７５５０，Ｅｐｏ−９０６）、タキサン類の再処方（Ａｂｒａｘａｎｅ，Ｘｙｏｔａｘ）、ミクロチューブリン阻害剤（ＭＳＴ−９９７，ＴＴＩ−２３７）、または標的化された細胞毒、例えば、ＣＭＤ−１９３およびＳＧＮ−１５と共に使用されうる。付加的な有効な抗癌剤は、ＴＡＸＯＴＥＲＥＲ、ＴＡＲＣＥＶＡＲ、ＧＥＭＺＡＲＲ（ゲムシタビン（gemcitabine））、５−ＦＵ、ＡＶＡＳＴＩＮＲ、ＥＲＢＩＴＵＸＲ、ＴＲＯＶＡＸＲ、アナツモマブ・マフェナトクス（anatumomab mafenatox）、レトラゾール（letrazole）、ドセタキセル（docetaxel）、およびアントラサイクリン類を包含する。
【０１７２】
組み合わせ治療の場合、抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート、および／または１以上の付加的な治療または診断剤を目的の治療または診断の実施に適当ないずれかの期間内に投与する。かくして、単一薬剤を実質的に同時に（すなわち、単一処方として、または数分もしくは数時間以内に）投与してもよく、あるいはいずれかの順番で連続的に投与してもよい。例えば、単一薬剤治療は、互いに約１年以内に、例えば、約１０、８、６、４または２ヶ月以内に、または４、３、２または１週間以内に、または約５、４、３、２または１日以内に投与すればよい。第２の治療剤と組み合わせた抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの投与は、好ましくは、いずれかの単独投与の効果よりも大きな効果をもたらす。
【実施例】
【０１７３】
下記の実施例は、本発明の様式を説明するために含まれる。下記の実施例のある種の態様は、本発明の共同発明者によって見出され、または意図された技術及び手法に関して、本発明を実施するために記載されている。これらの実施例は、共同発明者による標準的な研究室での実施を説明するものである。本開示および当該分野の一般的な水準に基づき、当業者には、下記の実施例が例示目的のみを意図し、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更、修飾および改変を用いてもよいことは明らかであろう。
【０１７４】
実施例１
ネズミ抗−５Ｔ４抗体
ヒト５Ｔ４抗原および免疫化のための標準的な方法を用いて、マウスにおいて抗−５Ｔ４抗体を調製した。Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統を、個々のＢ細胞とメラノーマ細胞との融合によって製造した。
【０１７５】
Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体重鎖および軽鎖可変領域をＳＭＡＲＴＲｃＤＮＡ合成システム（Clontech Laboratories Inc. of Mountain View, California）、続いてＰＣＲ増幅を用いてクローン化した。Ａ１、Ａ２およびＡ３ハイブリドーマ細胞から単離した１μｇの全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）およびＳＭＡＲＴＲＩＩＡオリゴ（Clontech Laboratories Inc.）をＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ（登録商標）逆転写酵素（Clontech Laboratories Inc.）と共に用いて、ｃＤＮＡを合成した。次いで、該ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴＲＩＩＡオリゴ配列にアニールするプライマーおよびマウス定常領域特異的プライマー（軽鎖に関するマウスカッパ、Ａ１重鎖に関するマウスＩｇＧ２ａ、Ａ２重鎖に関するマウスＩｇＧ２ｂ、およびＡ３重鎖に関するマウスＩｇＧ１）をＶＥＮＴＲポリメラーゼ（New England Biolabs Inc. of Ipswich, Massachusetts）と共に用いて、ＰＣＲによって増幅した。重鎖および軽鎖可変領域ＰＣＲ産物をｐＥＤ６発現ベクター中にサブクローン化し、核酸配列を決定した。該方法は、ＤＮＡ配列の予備知識を必要としない点で有益である。さらに、得られるＤＮＡ配列は、縮重ＰＣＲプライマーの使用によって改変されない。
【０１７６】
Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、各々、配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、および配列番号９のヌクレオチド５８−４２３として示される。Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖可変領域のアミノ酸配列は、各々、配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５および配列番号１０の残基２０−１４１として示される。Ａ１、Ａ２およびＡ３軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、各々、配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、および配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１として示される。Ａ１、Ａ２およびＡ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、および配列番号１２の残基２１−１２７として示される。図１Ａ〜１Ｃも参照のこと。
【０１７７】
Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４可変領域配列の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴｐ検索（タンパク質クエリ配列について）を、デフォルトパラメーターＥｘｐｅｃｔ＝１０、Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ＝３、低複雑性フィルター、およびＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１のギャップコストを許可して実施した。ＢＬＡＳＴｎ検索（ヌクレオチドクエリ配列について）は、デフォルトパラメーターＥｘｐｅｃｔ＝１０、Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ＝１１、および低複雑性フィルターを用いて実施した。ＢＬＡＳＴ検索結果は、クエリ配列に関連する配列のリストとして、Ｅ値（データベースにおいて同定された合致の統計学的有意性の指標である）の順でランク付けして報告する。ＢＬＡＳＴ分析に用いられた可変領域配列に最も密接に関連する配列を表１（ＢＬＡＳＴｎ）および表２（ＢＬＡＳＴｐ）において同定する。
【０１７８】
【表１】
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
実施例２
ネズミ抗−５Ｔ４抗体の結合特異性およびアフィニティー
Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の結合特異性およびアフィニティーを評価するために、ＣＭ５チップ上に固定化されたヒト５Ｔ４抗原を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥＲ分析を行った。ＢＩＡＣＯＲＥＲ技術は、表面層上に固定化された５Ｔ４抗原に対する抗体の結合における表面層での屈折率における変化を利用する。結合は、表面から屈折しているレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される。シグナル反応速度ｏｎ ｒａｔｅおよびｏｆｆ ｒａｔｅの分析は、非特異的および特異的相互作用間の区別を可能にする。Ｈ８抗−５Ｔ４抗体を対照として用いた。Ｈ８は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５５６０７号およびForsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):124430-12436において記載されたハイブリドーマから生じたモノクローナルマウスＩｇＧ１抗体である。
【０１８１】
表３
ＢＩＡＣＯＲＥＲアッセイの結果
【表３】
【０１８２】
ＢＩＡＣＯＲＥＲの結果は、Ａ２およびＡ３抗体と比べて、Ｈ８およびＡ１抗体が５Ｔ４に対する高いアフィニティーを有することを示す。Ａ２は、比較的低いアフィニティー抗体である。Ａ１重鎖可変領域の残基６７およびＡ３重鎖可変領域の残基９１には、異常なシステインが存在する。これらの残基をフェニルアラニン（Ａ１）またはチロシン（Ａ３）で置き換えても、抗体結合特性または発現レベルが変化しなかった。
【０１８３】
Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の結合アフィニティーは、また、ＣＴ２６／５Ｔ４細胞溶解物を用いるウェスタンブロッティングによっても評価され、Ｈ８、Ａ１およびＡ３による強い結合を同定した。図２参照のこと。
【０１８４】
Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の５Ｔ４抗原を発現している細胞に対する結合能は、ＰＣ１４ＰＥ６細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてアッセイされた。全ての抗体は、５Ｔ４発現性ＰＣ１４ＰＥ６細胞に対する特異的な結合を示したが、Ａ２結合レベルは、Ｈ８、Ａ１およびＡ３に関して観察されたレベルよりも有意に低かった。表４参照のこと。
【０１８５】
表４
ＦＡＣＳ分析の結果
【表４】
【０１８６】
抗体産生における潜在的な変化性を評価するために、Ａ１およびＨ８の２つの独立した調製物を試験した。各抗体の結合および反応速度特性は、各調製物を比較した場合、有意に相違しなかった。図３Ａ−３Ｂを参照のこと。
【０１８７】
実施例３
５Ｔ４発現性細胞によるネズミ抗−５Ｔ４抗体の内在化
５Ｔ４抗原への結合における抗体の内在化を評価するために、細胞表面 対 上清中で検出されたＨ８およびＡ１抗体の量を時間の関数として決定した。非酵素的に解離したＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト乳癌細胞）を抗−５Ｔ４抗体に４℃で１時間曝露した。細胞を洗浄し、培地中、３７℃で４時間または２４時間インキュベートした。細胞膜に結合した抗体 対 非結合抗体（すなわち、上清中の存在）の量をＦＡＣＳを用いて決定した。ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の表面からの５Ｔ４抗体の消失は、細胞表面での５Ｔ４抗原／抗体複合体の調節を立証し、このことは、内在化および／または解離を示しうる。図４Ａ−４Ｃ参照。
【０１８８】
実施例４
５Ｔ４キメラを用いるエピトープマッピング
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＨ８抗体が各々結合するエピトープを同定するために、（１）欠失または変異配列を有する５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ構築物および（２）ＣＯＳ−１細胞中で一時的に発現された５Ｔ４キメラ構築物を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。細胞外ドメインは、アミノ末端領域、２つのロイシンリッチリピート、および介在性親水性領域を含む。マウス５Ｔ４（アミノ酸１−３６１）、ラット５Ｔ４（アミノ酸１−３６１）、カニクイザル５Ｔ４（アミノ酸１−３５５）、チンパンジー５Ｔ４（アミノ酸１−３５５）、およびオグロマーモセット（アミノ酸１−３５５）を用いて、５Ｔ４細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１由来のＦｃ定常領域を含有する融合タンパク質を調製した。５Ｔ４キメラ構築物は、図５に示される。結合結果を表５にまとめ、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の各々による特異的結合、部分結合、または結合の欠失を示す。ヒト化Ｈ８およびキメラＡ１、Ａ２およびＡ３抗体は、各々、ネズミＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３に類似の結合特性を示した。
【０１８９】
これらの結果に基づいて、ヒト化Ｈ８抗体が残基１７３および２５２の間でヒト５Ｔ４に結合することが決定された。ヒト化Ｈ８は、残基３４４にてＮ−結合性グリコシル化を伴って、または伴わずに、５Ｔ４に結合し、これにより、ヒト化Ｈ８のヒト５Ｔ４への結合が膜に近接しないことが確認される。Ａ１抗体は、残基１７３および２５２の間でヒト５Ｔ４に１回目の接触をし、残基２８２および３６１の間でヒト５Ｔ４に２回目の接触をする。Ａ２抗体は、残基２８２および３６１の間でヒト５Ｔ４に結合する。Ａ３抗体は、残基８３〜１６３の間でヒト５Ｔ４の第１のロイシンリッチリピート領域に結合する。各抗体によって結合されるエピトープを図７に示す。
【０１９０】
表５
５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ融合およびヒト／マウス５Ｔ４キメラを用いるエピトープマッピングの結果
【表５】
（＋）結合；（−）結合しない；（＋／−）部分的結合
【０１９１】
ヒトおよびカニクイザル由来の５Ｔ４細胞外ドメインに対する観察された種々の結合に基づいて、抗体結合に関係する残基を識別するために、標的とされる変異を作成した。ヒト化Ｈ８抗体の結合は、下記表６に示される変異した５Ｔ４細胞外ドメイン、すなわち、示される位置にカニクイザル由来の残基を含むヒト５Ｔ４細胞外ドメインの各々に対してアッセイされた。これらの結果は、ヒト５Ｔ４抗原の残基２１３および２１４がヒト化Ｈ８によって結合されるエピトープに必要とされることを示した。
【０１９２】
表６
標的とされる変異を有するヒト５Ｔ４細胞外ドメイン／Ｆｃ融合を用いるエピトープマッピングの結果
【表６】
（＋）結合；（−）結合しない；（＋／−）部分的結合
【０１９３】
直接的な結合アッセイに加えて、ビオチン化ヒト化Ｈ８抗体およびＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の各々を用いて、競合的結合アッセイを行った。ヒト５Ｔ４に対する結合の阻害は観察されず、そのことは、Ａ１、Ａ２およびＡ３の各々が、Ｈ８抗体によって結合されるものとは別個の５Ｔ４エピトープに結合することを示唆する。図６Ａ−６を参照のこと。
【０１９４】
実施例５
ＢＩＡＣＯＲＥＲを用いるエピトープマッピング
Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体のエピトープマッピングは、また、ヒト５Ｔ４抗原を結合したＣＭ５チップを用いるＢＩＡＣＯＲＥＲを用いて行った。チップは、Ｈ８、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体で飽和させ、第１の応答を測定した。次いで、チップをＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体のなかから由来する二次抗体で飽和させ、第２の応答を測定した。複数回の実験のために、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５中で結合抗体を解離させ、次いでバッファー洗浄することによって、チップを再生した。結果を下記の表７にまとめる。示されるパーセンテージは、ＣＭ５チップに対する二次抗体の直接的結合において測定された応答単位を一次抗体で飽和されたＣＭ５チップに対する二次抗体の結合において測定された応答単位で割ったものである。これらの結果は、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３が各々、ヒト５Ｔ４上の別個のエピトープに結合することを示す。Ｈ８およびＡ３抗体によって結合されるエピトープは、立体的に互いに近接しており、その結果、抗原との結合速度は、Ｈ８の結合がＡ３の存在下でアッセイされる時、減少し、逆もまた同様である。同様の結果が、下記実施例７に記載するように調製されたキメラおよびヒト化Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体を用いて得られた。表８参照のこと。
【０１９５】
表７
ＢＩＡＣＯＲＥＲを用いる競合アッセイの結果
一次抗体での飽和後の二次抗体の応答パーセンテージ
【表７】
【０１９６】
表８
ＢＩＡＣＯＲＥＲを用いる競合アッセイの結果
一次抗体での飽和後に結合した二次抗体のパーセンテージ
【表８】
【０１９７】
キメラ構築物（実施例４参照）およびＢＩＡＣＯＲＥＲを用いて決定されたエピトープマッピング研究の合わせた結果は、図７に示される。
【０１９８】
実施例６
抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの効力
生体染色色素（ＭＴＳ）染色を用いて、種々の処理に曝露後に生存する数を決定した。ＭＴＳ（非放射性細胞増殖アッセイキット）は、Promega (Madison, Wisconsin)から購入し、製造者の説明書にしたがって使用した。各細胞系統のために、検量線（２時間後の細胞数 対 光学密度）を確立して、適当な開始播種密度を概算した。次いで、細胞を９６マルチウェル皿に７５０〜５０００細胞／ウェル密度で播種した。播種直後に、細胞を種々の濃度（０、０．０１、０．０５、０．１、１、１０、１００および５００ｎｇカリケアマイシン当量／ｍｌ）のカリケアマイシン、ＣＭＡ−６７６および抗−５Ｔ４抗体のカリケアマイシンコンジュゲートに曝露した。薬物曝露の９６時間後に生存している細胞数を決定後、用量応答曲線由来のロジスティック回帰パラメーターに基づいてＥＤ５０を計算した。ＥＤ５０は、薬物への曝露９６時間後に細胞数の５０％減少を引き起こした薬物の濃度（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）として定義された。カリケアマイシン当量（ｃａｌ．ｅｑ．）は、純粋な物質またはコンジュゲートとして与えられるカリケアマイシンの濃度である。抗体に結合したカリケアマイシンの量（抗体薬物負荷量）に依存して、異なるカリケアマイシン当量は、異なるタンパク質濃度を示しうる。
【０１９９】
ＭＴＳアッセイの結果を表９に示す。Ａ１およびＡ３抗−５Ｔ４アッセイを用いて調製された抗体／カリケアマイシンコンジュゲートは、実質的に、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の生存能力を減少させた。選択性値は、コンジュゲートの比活性を非特異的活性と比較することによって計算された。すなわち、５Ｔ４発現性細胞に関するｆｏｌｄ ＣａｌｉｃｈＤＭＨを５Ｔ４を発現していない細胞に関するｆｏｌｄ ＣａｌｉｃｈＤＭＨ値で割った。非特異的抗体、例えば、ｈｐ６７．６（ＣＭＡ−６７６）を使用する場合、ｆｏｌｄ ＣａｌｉｃｈＤＭＨ値は、選択性が１であるように、ほとんど同じである。
【０２００】
表９
ＭＴＳアッセイの結果
【表９−１】
【表９−２】
選択性：Ｈ８＝８；ｈＰ６７．６＝１；Ａ１＝９３；Ａ３＝１．６
ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，コンジュゲートしていないカリケアマイシン
ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたヒト化Ｈ８抗体
ＣＭＡ−６７６，抗−ＣＤ３３／カリケアマイシンコンジュゲート
Ａ１−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたＡ１抗体
Ａ２−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたＡ２抗体
Ａ３−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたＡ３抗体
【０２０１】
抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性もまた、イン・ビボ細胞環境をより密接に近似する三次元スフェロイド細胞培養を用いてアッセイされた。スフェロイドは、本質的に、Yuhas et al. (1977) Cancer Res. 37:3639-3643にしたがって作成された。簡単に言うと、５ｍｌ培養培地中１０５細胞を、予め５ｍｌの培養培地中における０．６５％組織培養等級寒天（Sigma of St. Louis, Missouri）でコートした６０ｍｍポリスチレン細胞培養皿に播種した。該皿を３７℃にて、５％ＣＯ２空気中５〜６日間インキュベートした。直径０．２ｍｍのスフェロイドを選択し、２４ウェルマルチウェル皿に置いた。各ウェルは、０．５ｍｌ寒天アンダーレイ、１スフェロイド、および１ｍｌ培養培地オーバーレイを含有した。次いで、スフェロイドを種々の濃度（０、０．０９１、０．３６５、１．４６、５．８６、２３．４４、９３．７５および３７５ｎｇカリケアマイシン当量／ｍｌ）のカリケアマイシン、ＣＭＡ−６７６、およびＡ１およびＡ３抗−５Ｔ４抗体およびＡｃＢｕｔリンカーを用いて調製された抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートに曝露した。両方の抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の成長を有意に阻害した。図８参照のこと。
【０２０２】
実施例７
キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体の調製および結合特性
ネズミＨ８重鎖および軽鎖可変領域配列およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を有するキメラＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体が構築された。Ａ１重鎖可変領域の６７位置に存在するシステインは、フェニルアラニンに変わっていてもよく、Ａ３重鎖可変領域の９１位置に存在するシステインは、チロシンに変わっていてもよい。これらの変種は、配列番号２（Ａ１ ＶＨ）および配列番号１０（Ａ３ ＶＨ）において示される。イントロン配列の存在または不存在およびシステイン残基の置換は、抗体発現に影響を及ぼさなかった。ＩｇＧ定常領域をコードしている配列のクローニングのために、所望により、イントロン配列を欠失させた。
【０２０３】
ヒト化Ｈ８は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０３１６５３号に記載されるように調製された。ヒト化Ａ１抗体は、さらに本明細書中に下記するようなＣＤＲグラフティングによって調製された。ネズミＡ１、Ａ２およびＡ３抗体のＣＤＲｓは、配列変化性ならびに構造的ループ領域の位置に基づくＡｂＭ限定（definition）を用いて同定された。一般に、ヒトアクセプターフレームワークは、それらが実質的にネズミ抗体のフレームワーク領域に類似するということに基づいて選択され、または、可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に最も類似していた。また、幅広く表示された配列が一般に、数の多くない配列よりも好ましいように、ヒトにおけるフレームワーク位置の表示も考慮した。ヒトフレームワークアクセプター配列の付加的な変異は、抗原接触に関与すると考えられるネズミ残基および／または抗原結合部位の構造無欠性に関与する残基を復旧させるために作成された。該アミノ酸配列は、また、ＣＨＯ細胞のコドン選択のために、および制限酵素部位の除去のために最適化させてもよい。ペプチド構造予測プログラムを用いて、ヒト化可変重鎖および軽鎖領域配列を分析して、ヒト化設計によって導入された翻訳後タンパク質修飾部位を同定し、回避してもよい。
【０２０４】
フレームワーク変異（Ｓ８２Ａ)および１つの復帰変異（Ｅ４６Ｋ）を含有するヒトＤＰ−２１フレームワーク領域（ＶＨ７サブグループ、受入番号第ＣＡＡ４３３４６号、配列番号８８）上にグラフトされたネズミＡ１のＣＤＲｓを含むように、ヒト化Ａ１重鎖可変領域（Ａ１ ＶＨバージョン１．０）を構築した。変種は、復帰変異を除去することによって調製された（Ａ１ ＶＨバージョン１．１および１．２）。第２のヒト化Ａ１重鎖可変領域は、Ａ１ ＣＤＲｓをヒトＤＰ−５４生殖細胞フレームワーク領域上にグラフティングすることによって調製された（Ａ１ ＶＨバージョン２．０）。６個の復帰変異を作成して、Ａ１ ＶＨバージョン２．１を製造した。さらに下記するように、両方のＡ１重鎖可変領域は、５Ｔ４結合特性を保持した。ＤＰ−２１およびＤＰ−５４フレームワーク領域は、その全長にわたり６３％アミノ酸配列同一性を示し、多くのアミノ酸変化が生じたことを示す一方で、特定のエピトープに結合する能力を包含する抗体の結合特異性を保存した。ヒト化Ａ１重鎖可変領域の類似性を表１０に示す。ヒト化Ａ１重鎖可変領域をコードしている代表的なヌクレオチド配列は、配列番号４８、５０、５３および５５として示される。ヒト化Ａ１重鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、配列番号４９、５１、５２、５４および４６として示される。図９Ａ−９Ｂも参照のこと。
【０２０５】
ヒト化Ａ１軽鎖可変領域は、ヒトＤＰＫ２４（ＶＫＩＶサブグループ）、ＤＰＫ９（ＶＫＩサブグループ）およびＤＰＫ２３（ＶＫＩＩＩサブグループ）生殖細胞フレームワーク領域上にグラフトされたネズミＡ１のＣＤＲｓを含むように構築された。これらの各フレームワークを用いて調製されたヒト化Ａ１軽鎖可変領域フレームワーク中へのＳ６７Ｙ復帰変異の組み込み後、５Ｔ４結合が明らかにされた。表１３を含め、下記参照のこと。ＤＰＫ２４フレームワーク領域は、その全長にわたり、ＤＰＫ９およびＤＰＫ２３に対して各々、７４％および７３％アミノ酸配列同一性を示す。ＤＰＫ９フレームワーク領域は、その全長にわたり、ＤＰＫ２３に対して７４％アミノ酸配列同一性を示す。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域の類似性は、表１０に示される。ヒト化軽鎖可変フレームワーク領域の複数のバージョンは、多数のアミノ酸変化が作成されうる一方で、特定のエピトープに対する結合能を含め、抗体の結合特異性が保存されることを明らかにする。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域をコードしている代表的なヌクレオチド配列は、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３および７５として示される。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４および７６として示される。図９Ｃ−９Ｆも参照のこと。
【０２０６】
表１０
ヒト化Ａ１抗体の関連性
【表１０】
【０２０７】
ヒト化Ａ２およびＡ３抗体は、類似の手法を用いて設計された。ヒト化Ａ２重鎖可変領域およびヒト化Ａ２軽鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、各々、配列番号７７−７８および配列番号７９−８０として示される。図９Ｇも参照のこと。ヒト化Ａ３重鎖可変領域およびヒト化Ａ３軽鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、各々、配列番号８１−８２および配列番号８３−８４として示される。図９Ｈも参照のこと。
【０２０８】
ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖および軽鎖可変領域の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ分析を実施例１に記載のように行った。結果を表１１に示す。
【０２０９】
表１１
ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ分析
【表１１−１】
【０２１０】
表１１つづき
表１１
ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ分析
【表１１−２】
＊クエリカバレッジ＝１００％のとき
【０２１１】
図１０Ａ−１０Ｂは、ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体の調製のためのフレームワークとして使用されうる付加的な重鎖可変領域配列を示す。図１１−１３は、ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体の調製のためのフレームワークとして使用されうる付加的な軽鎖可変領域配列を示す。図１４は、キメラおよびヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体の調製のために使用されうる代表的な定常領域を示す。
【０２１２】
キメラおよびヒト化Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の結合特異性およびアフィニティーを評価するために、ＣＭ５チップ上に固定したヒト５Ｔ４抗原を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥＲ分析を行った。実施例２参照のこと。キメラＡ１、Ａ２およびＡ３抗体の結果を下記表１２に示す。
【０２１３】
表１２
ＢＩＡＣＯＲＥＲアッセイの結果
【表１２】
【０２１４】
一般に、キメラ化／ヒト化は、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３のヒト５Ｔ４に対するアフィニティーを増加させた。表３と比較すること。結合アフィニティーにおける増加は、主に、より早い結合よりもむしろ、抗体および抗原のより遅い解離に起因するようである。キメラＡ２およびＡ３抗体は、キメラ化後に最も改善された結合特性を示した。
【０２１５】
全てのヒト化Ａ１重鎖可変領域は、５Ｔ４結合特異性を保持した。さらに、ヒト化Ａ１重鎖可変領域からのＫ４６復帰変異の除去は、５Ｔ４結合特性に影響を及ぼさなかった。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域は、損なわれた５Ｔ４結合特性を示した。ＤＰＫ９およびＤＰＫ２３フレームワークを用いて構築されたヒト化Ａ１軽鎖可変領域は、ＤＰＫ２４フレームワークを用いて構築されたヒト化Ａ１軽鎖可変領域よりも高いアフィニティーで５Ｔ４を結合した。復帰変異は、５Ｔ４結合を復旧する、および／または最適化するために組み込まれた。６７位置のセリン残基のチロシン残基での置換は、ネズミＡ１フレームワーク領域において見られるように、５Ｔ４抗原結合特性を完全に復旧した。表１３参照のこと。
【０２１６】
表１３
ＥＬＩＳＡによるヒト５Ｔ４へのビオチン化キメラＡ１抗体結合の阻害
【表１３】
ｈｕＡ１，ヒト化Ａ１
ｖ，バージョン
【０２１７】
実施例８
抗−５Ｔ４抗体の種間反応性
本明細書中に開示される抗−５Ｔ４抗体の種間反応性をアッセイして、イン・ビボでの効力研究および毒物学的分析について関連する種を決定した。また、種々の５Ｔ４細胞外ドメインの結合活性および関連性の相関関係を用いて、各抗体によって結合されるエピトープをさらに記載した。結合アッセイは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合した種々の種由来の５Ｔ４細胞外ドメインを用いて行われた。各細胞外ドメイン領域のヒト５Ｔ４に対するパーセンテージ同一性を表１４に示す。
【０２１８】
表１４
異なる種由来の５Ｔ４の関連性
【表１４】
ａ 親水性ドメイン内に６アミノ酸直接反復を含有する
【０２１９】
ヒト、マウス、ラット、イヌおよびウシ由来の５Ｔ４の全長または部分配列は、以前にＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ２９０８３（ヒト，配列番号８７）、ＡＪ０１２１６０（マウス）、ＢＣ０８７０１１（ラット）、ＸＭ５３９０２０（イヌ）およびＸＭ５９３５０２（ウシ）として開示されている。チンパンジー５Ｔ４の仮想部分配列は、ｍＲＮＡおよびゲノム配列のアラインメントを用いて作成された。５Ｔ４タンパク質をコードしている核酸は、カニクイザルおよびオグロマーモセットから単離された。これらの付加的な５Ｔ４抗原のアミノ酸配列を図１５に示し、また、配列番号８６（カニクイザル）および配列番号８５（オグロマーモセット）として示す。
【０２２０】
カニクイザルおよびオグロマーモセット配列の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴ分析を実施例２に記載のように行った。全長オグロマーモセット５Ｔ４アミノ酸配列をクエリ配列として用いた場合、最も近い対象配列は、ヒト５Ｔ４として同定され（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ ００６６６１．１）、９４％同一性（３０２／３２０アミノ酸）であった。該配列は、また、カルボキシル末端で異なり、配列番号８５のアミノ酸１−１９が最も近い対象配列と整列しなかった。全長カニクイザル５Ｔ４アミノ酸配列をクエリ配列として用いた場合、最も近い非仮想対象配列は、カニクイザルから由来するトロホブラスト糖蛋白前駆体として同定され（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＥ００４３２．１）、９９％同一性（３６４／３６６アミノ酸）であった。該配列もまた、カルボキシル末端で異なり、配列番号８６のアミノ酸１−２５が最も近い非仮想対象配列と整列しなかった。
【０２２１】
抗−５Ｔ４抗体の結合をアッセイするために、５Ｔ４細胞外ドメイン／Ｆｃ融合タンパク質をＣＯＳ−１細胞中に一時的にトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。非関連ヒトＩｇＧ４およびＩｇＧ１抗体を対照として用いた。抗−５Ｔ４抗体の種間反応性を表１５にまとめる。
【０２２２】
表１５
抗−５Ｔ４抗体の交差反応性（ｎＭにおけるＥＤ５０）
【表１５】
ｈｕＨ８γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するヒト化Ｈ８抗体
ｈｕＨ８γ１，ＩｇＧ１定常領域を有するヒト化Ｈ８抗体
ＣｈｉＡ１γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するキメラＡ１抗体
ＣｈｉＡ２γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するキメラＡ２抗体
ＣｈｉＡ３γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するキメラＡ３抗体
（＋／−），部分結合
（−），結合しない
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ネズミ抗−５Ｔ４抗体Ａ１、Ａ２またはＡ３の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。該アミノ酸配列は、下線を付すことによって相補性決定領域（ＣＤＲ）を示し、二重下線を付すことによってリーダー配列を示す。
【図２】図２は、ＣＴ２６／５Ｔ４細胞溶解物を用いて調製され、示される抗体でプローブされたウェスタンブロットである。
【図３】図３Ａ−３Ｂは、Ｈ８およびＡ１抗体という２つの独立した調製物に関する応答曲線および結合反応速度を示す線グラフである。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞によるＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の調節を示す線グラフである。細胞表面での抗体レベルは経時的に低下し（図４Ａ、４Ｃ（黒塗り））、一方、上清中の抗体レベルは一定に保たれる（図４Ｂ、４Ｃ（白塗り））。ＭＣＦは平均細胞蛍光、ｓｕｐｔは上清を示す。
【図５】図５は、ヒト細胞外ドメイン５Ｔ４Ｆｃ構築物、マウス細胞外ドメイン５Ｔ４Ｆｃ構築物、およびヒト／マウス５Ｔ４キメラ構築物の概略図である。これらの構築物は、実施例４に記載されるように、エピトープマッピングに用いられた。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、ヒト化Ｈ８および示される抗体の各々のヒト５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質への競合的結合の結果のグラフを示す。ＨｕＨ８はヒト化Ｈ８抗体を示し、ＣｈｉＡ１はキメラＡ１抗体を示し、ＣｈｉＡ１＋Ｃ６７Ｆは、Ｃ６７Ｆ変異を有するキメラＡ１抗体を示し、ＣｈｉＡ２はキメラＡ２抗体を示し、ｍｕＡ２はネズミＡ２抗体を示し、ＣｈｉＡ３は、キメラＡ３抗体を示し、ＣｈｉＡ３＋Ｃ９１Ｙは、Ｃ９１Ｙ変異を有するキメラＡ３抗体を示し、ｍｕＡ３はネズミＡ３抗体を示し、Ｎｏ Ａｂは、抗体無し（対照）を示す。
【図７】図７は、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３によって結合されるヒト５Ｔ４エピトープを示す線図である。示される残基は、Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(12):9319-9324によって記載される５Ｔ４抗原の残基であり、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ２９０８３としても入手可能である（配列番号８７）。ＬＲＲは、ロイシンリッチリピートを示す。
【図８】図８は、実施例６に記載のように実施されたスフェロイドアッセイの結果を示す。Ａ１およびＡ３抗体を用いて調製された抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、対照細胞（ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ）と比べて、５Ｔ４発現性細胞（ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４）の成長を有意に阻害した。ＣＭＡ−６７６は、抗−ＣＤ３３／カリケアマイシンコンジュゲートを示し、ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートされたヒト化Ｈ８抗体を示し、ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、コンジュゲートしていないカリケアマイシンを示し、Ａ１−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨｈａ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートされたＡ１抗体を示し、Ａ３−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートされたＡ３抗体を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｈは、ヒト化Ａ１重鎖可変領域バージョン１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号４８−４９）、ヒト化Ａ１重鎖可変領域（ｈｕＡ１ ＶＨ）バージョン１．２および２．０のアミノ酸配列、ヒト化Ａ１軽鎖可変領域（ｈｕＡ１ ＶＬ）バージョン１．０、２．０および３．０のアミノ酸配列、ヒト化Ａ２重鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ２ ＶＨ）のアミノ酸配列、ヒト化Ａ２軽鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ２ ＶＬ）のアミノ酸配列、ヒト化Ａ３重鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ３ ＶＨ）のアミノ酸配列、およびヒト化Ａ３軽鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ３２ ＶＬ）のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂは、ヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するのに使用されうる代表的なヒト重鎖可変領域フレームワーク配列を示す。図１０Ａは、サブグループＩのヒト重鎖可変領域配列（配列番号１４−２４）およびそこから誘導されたコンセンサスフレームワーク配列（配列番号２５−２７）のアラインメントである。図１０Ｂは、ＶＨ７およびＶＨ３サブグループのヒト生殖細胞遺伝子の配列（配列番号８８−９３）を示す。
【図１１】図１１は、サブグループＶκＩＩＩのヒト軽鎖可変領域配列（配列番号２９−３４）のアラインメントである。ボックスで囲んだ配列はＣＤＲを示す。
【図１２】図１２は、サブグループＶκＩのヒト軽鎖可変領域配列（配列番号３５−４４）のアラインメントである。ボックスで囲んだ配列はＣＤＲを示す。
【図１３】図１３は、Ｖｋ１およびＶｋ ＩＶサブグループの付加的なヒト生殖細胞配列を示し、それは、ヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するのに用いられ得るフレームワーク領域を有する（配列番号９４−９９）。
【図１４】図１４は、キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するために使用されうる代表的なヒト定常領域のアミノ酸配列を示す（配列番号４５−４７）。
【図１５】図１５は、全長カニクイザル５Ｔ４抗原および部分オグロマーモセット５Ｔ４抗原のアミノ酸配列を示す。下線を付した配列はリーダー配列である。各配列について、５Ｔ４細胞外ドメインは、アミノ酸３０−３５６を包含する。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２００７年２月２３日に出願された米国仮出願第６０／８９１，２４８号および２００６年３月１０日に出願された米国仮出願第６０／７８１，３４６号（各々、出典明示より、全体として本明細書の一部とされる）に対して優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、新生物または悪性障害の診断および／または治療のための抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲート（すなわち、免疫コンジュゲート）に関する。本発明は、また、抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートを調製するための単離した可変領域核酸およびポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
高アフィニティーモノクローナル抗体の利用性は、標的とされる免疫療法の開発を可能にした。このアプローチによれば、所定の標的細胞集団に対して結合特異性を有する抗体と治療剤を結合させる。モノクローナル抗体に結合させた治療剤は、細胞毒、生物学的応答修飾剤、酵素（例えば、リボヌクレアーゼ）、アポトーシス誘導性タンパク質およびペプチド、および放射性同位元素を包含する。抗体／細胞毒コンジュゲートは、一般に、免疫細胞毒素と称される。低分子量の薬物、例えば、メトトレキサート（methothrexate）に結合させた抗体は、典型的に、化学抗体／薬物コンジュゲートと呼ばれる。免疫調節剤として記載されるコンジュゲートは、リンホカイン、成長因子、および補体活性化コブラ毒因子（ＣＶＦ）などの生物学的応答修飾剤を含有する。放射性標識抗体は、放射能治療ならびに画像化に用いられ得る放射活性同位元素を包含する。
【０００４】
腫瘍細胞に対する抗体媒介性薬物送達は、正常組織中におけるその取り込み量を最小限にすることによって、薬物の効力を増大させる。例えば、Reff et al. (2002) Cancer Control 9:152-66; Sievers (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46 Suppl:S18-22; Goldenberg (2001) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201を参照のこと。ＭＹＬＯＴＡＲＧＲ（登録商標）（ゲムツズマブ・オゾガマイシン（gemtuzumab ozogamicin））は、該原理にしたがって作用する市販の標的化免疫療法剤であり、老齢の患者における急性骨髄性白血病の治療に承認されている。Sievers et al. (1999) Blood 93: 3678-84参照のこと。この場合、標的分子は、カリケアマイシンに結合した抗−ＣＤ３３モノクローナル抗体である。
【０００５】
しかしながら、ヒトにおける標的化免疫療法は、一部、非ヒトモノクローナル抗体に対して有害な反応を示すために制限されている。齧歯類抗体を用いた初期の臨床試験は、迅速な抗体クリアランスをもたらすヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）およびヒト抗−ラット抗体（ＨＡＲＡ）応答を示した。それ以来、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＰＲＩＭＡＴＩＺＥＤＲ抗体、およびトランスジェニックマウスまたはファージディスプレーライブラリーを用いて調製されるヒト抗体を含め、免疫原性の低い抗体が開発されてきた。Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-5; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33; Newman et al. (1992) Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97を参照のこと。ＨＡＭＡ応答の回避は、高投与量および反復投与により治療応答を達成することを可能にする。
【０００６】
薬物標的化のための候補抗体は、腫瘍胎児抗原、すなわち、胎児細胞および新生物細胞に存在し、正常な成人細胞にほとんど存在しない抗原を認識する抗体を包含する。例えば、Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150: 133-43を参照のこと。５Ｔ４腫瘍胎児抗原は、４２ｋＤａの非グリコシル化コアを含む７２ｋＤａの高グリコシル化膜貫通型糖蛋白である（Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-84; ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／０７９４７号、米国特許第５，８６９，０５３号）。５Ｔ４は、標的化療法の接触可能な部位である、２つのロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）および介在する親水性領域によって特徴付けられる細胞外ドメインを含む（Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9319-24）。
【０００７】
ヒト５Ｔ４は、膀胱、胸、子宮頸、子宮内膜、肺、食道、卵巣、膵臓、胃および精巣の癌腫を包含する多くのタイプの癌において発現され、胎盤の合胞体栄養細胞を除き、正常組織には実質的に存在しない（例えば、Southall et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 89-95 （正常および悪性組織における５Ｔ４抗原の免疫組織学的分布（immunohistological distribution of 5T4 antigen in normal and malignant tissues））；Mieke et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-1930 （腫瘍細胞における低い細胞内付着分子１および高い５Ｔ４発現は、結腸直腸癌患者における無病生存率の減少と相関する（low intercellular adhesion molecule 1 and high 5T4 expression on tumor cells correlate with reduced disease-free survival in colorectal carcinoma patients））；Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902 （結腸直腸癌における５Ｔ４腫瘍胎児抗原発現の予後的意義（prognostic significance of 5T4 oncofetal antigen expression in colorectal carcinoma））；Starzynska et al. (1992) Br. J. Cancer 66: 867-869 （結腸直腸および胃癌における５Ｔ４抗原の発現（expression of 5T4 antigen in colorectal and gastric carcinoma））；Jones et al. (1990) Br. J. Cancer 61: 96-100 （子宮頚癌における５Ｔ４抗原の発現（（expression of 5T4 antigen in cervical cancer））；Connor and Stern (199) Int. J. Cancer 46: 1029-1034 （子宮頚癌におけるＭＨＣクラスＩ発現の喪失（（loss of MHC class-I expression in cervical carcinomas））；Ali et al. (2001) Oral Oncology 37: 57-64 （正常、形成異常および悪性口腔粘膜における５Ｔ４腫瘍胎児抗原の発現パターン（pattern of expression of the 5T4 oncofoetal antigen on normal, dysplastic and malignant oral mucosa））;ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／０７９４７号；米国特許第５，８６９，０５３号参照）。例えば、５Ｔ４の発現がないと報告された組織には、肝臓、皮膚、脾臓、胸腺、中枢神経系（ＣＮＳ）、副腎、および卵巣がある。５Ｔ４の限局性または低い発現があると報告された組織には、肝臓、皮膚、脾臓、リンパ節、扁桃、甲状腺、前立腺、および精嚢がある。５Ｔ４の弱〜中程度の拡散性発現が腎臓、肺、膵臓、咽頭および胃腸管において報告された。５Ｔ４の高い発現があることが報告された唯一の組織は合胞体栄養細胞であり、５Ｔ４は、正常な血清または妊婦の血清にも存在しない（すなわち、＜１０ｎｇ／ｍｌレベル）。腫瘍における５Ｔ４の過剰発現は疾患の進行度と相関し、５Ｔ４発現の評価は、短期予後患者を同定するための有用なアプローチとして提案された（Mulder et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3: 1923-30, Naganuma et al. (2002) Anticancer Res. 22: 1033-1038, Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902, Starzynska et al. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10: 479-484, Wrigley et al. (1995) Int. J. Gynecol. Cancer 5: 269-274）。
【０００８】
５Ｔ４抗原の立体構造エピトープを認識するｍＡｂ５Ｔ４（Ｈ８抗体ともいう）（(Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363: 137-45, ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５５６０７号）、ラットモノクローナル抗体（Woods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65）および５Ｔ４と呼ばれるマウルモノクローナル抗体（米国特許第５，８６９，０５３号）を包含するいくつかの抗−５Ｔ４抗体が記載されている。一本鎖抗−５Ｔ４抗体もまた、治療分子に融合した抗−５Ｔ４抗体配列を包含する融合タンパク質と同様に、記載されている。例えば、ヒトＩｇＧ１定常ドメインまたはネズミＢ７．１の細胞外ドメインに融合した抗−５Ｔ４抗体配列は、５Ｔ４発現性腫瘍細胞系統の細胞溶解を誘導する（Myers et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9: 884-896, Shaw et al. (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524: 238-246；米国特許出願公開第２００３／００１８００４号）。同様に、スーパー抗原に融合した一本鎖抗−５Ｔ４抗体は、非小細胞肺癌細胞のイン・ビトロでのＴ細胞依存性細胞溶解を刺激しうる（Forsberg et al. (2001) Br. J. Cancer 85: 129-136）。ＰＮＵ−２１４９３６、変異型スーパー抗原ブドウ球菌腸細胞毒Ａ（ＳＥＡ）に融合したモノクローナル抗体５Ｔ４のネズミＦａｂフラグメントを用いる第Ｉ相臨床試験は、限られた毒性およびある程度の抗腫瘍応答を示した（Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4):602-9）。別の治療アプローチとして、組み換え５Ｔ４ワクチンもまた、癌の治療に提案されている（Mulryan et al. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37；ＵＫ特許出願公開第２，３７０，５７１号および第２，３７８，７０４号；ＥＰ特許出願公開第ＥＰ１，１６０，３２３号および第１，１５２，０６０号）。
【０００９】
本発明は、新規な抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート、開示された抗体および抗体／薬物コンジュゲートの製造法、およびそれらの診断および治療的使用方法を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の概要
本発明は、新規な抗−５Ｔ４抗体、そのコンジュゲートおよびその使用方法を提供する。また、単離された抗−５Ｔ４ポリペプチドおよびそれをコードしている単離された核酸も提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、ヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合する抗体を包含し、ここに、該抗体は、（ａ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の抗原結合性ドメインを含み、（ｂ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と、５Ｔ４結合に関して競合し、（ｃ）Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合される５Ｔ４エピトープに結合し、または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の抗体の５Ｔ４−結合フラグメントを含む。本発明の抗−５Ｔ４抗体は、キメラ、ヒト化、一本鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、四量体、四価、多特異的、ドメイン特異的、単一ドメイン抗体、融合タンパク質、またはネズミモノクローナルであってもよい。例えば、本発明のヒト化抗−５Ｔ４抗体は、少なくとも１つの重鎖可変領域または少なくとも１つの軽鎖可変領域を含む抗体を包含し、ここに、該ヒト化抗体または抗体フラグメントは、（ａ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の抗原結合性ドメインを含み、（ｂ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と、５Ｔ４結合に関して競合し、（ｃ）Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合される５Ｔ４エピトープに結合し、または（ｄ）（ａ）−（ｃ）の抗体の５Ｔ４−結合フラグメントを含む。
【００１２】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、ヒト５Ｔ４抗原に対する結合アフィニティーが少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍである。開示される抗−５Ｔ４抗体およびそのコンジュゲートは、また、５Ｔ４発現性細胞のイン・ビボでの標的化によって特異的結合を示す。
【００１３】
本発明の代表的な抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号４９、５１、５２、５４、５６、７７、７８、８１または８２のいずれか１つのアミノ酸配列、（ｈ）配列番号５１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、（ｉ）配列番号５４と少なくとも７８％同一のアミノ酸配列、（ｊ）配列番号７７と少なくとも８９％同一のアミノ酸配列、（ｋ）配列番号７８と少なくとも７９％同一のアミノ酸配列、（ｌ）配列番号８１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列、（ｍ）配列番号８２と少なくとも７８％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００１４】
本発明の代表的な抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号８の残基２３−１３０のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１２の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８３または８４のいずれか１つのアミノ酸配列、（ｈ）配列番号６０と少なくとも８３％同一のアミノ酸配列、（ｉ）配列番号７０と少なくとも９３％同一のアミノ酸配列、（ｊ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｋ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｌ）配列番号７９と少なくとも８８％同一のアミノ酸配列、（ｍ）配列番号８０と少なくとも８４％同一のアミノ酸配列、（ｎ）配列番号８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｏ）配列番号８４と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００１５】
例えば、抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号６の残基１９−１３５由来のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号８の残基２３−１３０由来のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または（ｃ）配列番号１０の残基２０−１４１由来のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、および配列番号１２の残基２１−１２７由来のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。
【００１６】
本発明のキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、ヒト定常領域由来の定常領域、例えば、ヒトカッパ軽鎖定常領域由来のヒト軽鎖定常領域およびヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４重鎖定常領域由来のヒト重鎖定常領域を含んでいてもよい。
【００１７】
本発明の代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）ヒト抗体フレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域、および（ｂ）配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲ、または配列番号２、６または１０の重鎖可変領域の１以上のＣＤＲを含む抗体を包含する。例えば、ヒト抗体フレームワーク領域の残基は、（ａ）ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系統クローン、ＶκＩＩＩサブグループ（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系統クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ７）のヒト抗体軽鎖フレームワーク領域、（ｂ）ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）からなる群から選択されるヒト抗体重鎖フレームワーク領域、（ｃ）（ｂ）の重鎖フレームワーク領域のコンセンサス配列、または（ｄ）（ａ）−（ｃ）のフレームワーク領域と少なくとも６３％同一のフレームワーク領域を含むことができる。
【００１８】
本発明の代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、また、配列番号２、４、６、８、１０または１２の２以上のＣＤＲ、例えば、配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の２つまたは３つ全てのＣＤＲ、または配列番号２、６または１０の重鎖可変領域の２つまたは３つ全てのＣＤＲ、または配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲおよび配列番号２、６または１２の重鎖可変領域の１以上のＣＤＲ、または配列番号２、４、６、８、１０または１２の全てのＣＤＲを包含することができる。
【００１９】
代表的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、（ｇ）配列番号４９の残基１−１１９のアミノ酸配列、（ｈ）配列番号４９の残基１−１１９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、または（ｉ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００２０】
本発明の付加的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５−４０５のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号４８のヌクレオチド１−３５８のヌクレオチド配列、（ｅ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３可変領域をコードしているヌクレオチド配列、（ｆ）（ａ）−（ｅ）のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列、または（ｇ）ストリンジェントな条件下、（ａ）−（ｅ）のいずれか１つの相補物と特異的にハイブリダイズする核酸を含む核酸によってコードされる重鎖可変領域を含む抗体を包含する。
【００２１】
代表的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列、（ｃ）配列番号８の残基２３−１３０のアミノ酸配列、（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一のアミノ酸配列、（ｅ）配列番号１２の残基２１−１２７のアミノ酸配列、（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、または（ｇ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域配列を含む抗体を包含する。
【００２２】
また、（ａ）本発明のキメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメント、および（ｂ）該抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む薬物送達のための抗体／薬物コンジュゲートも提供される。代表的な薬物は、細胞毒、放射性同位元素、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、プロ−アポトーシス剤、化学療法剤、および治療的核酸などの治療剤を包含する。細胞毒は、例えば、抗生物質、チューブリン重合の阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または酵素であってもよい。抗生物質細胞毒、例えば、カリケアマイシン、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシン、またはその誘導体、例えば、Ｎ−アセチル−γ−カリケアマイシンジメチルヒドラジドは、抗癌治療に特に有用である。
【００２３】
開示される抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートは、抗体と薬物との結合のためのリンカーを含んでいてもよい。代表的リンカーは、４−（４’アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、および４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）を包含する。抗体／薬物コンジュゲートは、また、ポリエチレングリコールまたは薬物取り込みを増大させるための他の薬剤を含んでいてもよい。
【００２４】
５Ｔ４発現性細胞への薬物の送達のために、本発明は、細胞を、（ｉ）キメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）ヒト化抗−５Ｔ４抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む抗体／薬物コンジュゲートと接触させる方法を提供する。開示される方法によると、薬物は標的細胞内に内在化される。治療法もまた本明細書中に開示され、それは、５Ｔ４−陽性癌を有する対象に、治療上有効量の、（ｉ）キメラまたはヒト化抗―５Ｔ４抗体または抗体フラグメントおよび（ｉｉ）ヒト化抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメントに直接または間接的に結合する治療剤を含む抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを投与することを特徴とする。本発明の抗−５Ｔ４療法は、改善された効果のために、いずれか他の既知の療法と組み合わせてもよい。第２の治療剤は、抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートと共に、同時またはいずれかの順序で連続的に投与すればよい。
【００２５】
また、ヒト化抗−５Ｔ４可変領域をコードしている単離核酸が提供され、それは、開示されるヒト化抗−５Ｔ４抗体の生産に有用である。ヒト化抗−５Ｔ４重鎖可変領域をコードしている代表的な核酸は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５−４０５のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号４８、５０、５３または５５のいずれか１つをコードしているヌクレオチド配列、（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５０と８９％同一のヌクレオチド配列、（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５３と８２％同一のヌクレオチド配列、または（ｇ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）−（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸を包含する。ヒト化抗−５Ｔ４軽鎖可変領域をコードしている代表的な核酸は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド６７−３９０のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３または７５のいずれか１つのヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列、（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５９と８４％同一のヌクレオチド配列、（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号６９と８６％同一のヌクレオチド配列、（ｇ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号７５と８５％同一のヌクレオチド配列、または（ｈ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）−（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
発明の詳細な記載
Ｉ．抗−５Ｔ４抗体
本発明は、ヒト５Ｔ４抗原に結合し、標的免疫療法の開発に有用な新規なネズミ抗体を提供する。ヒト５Ｔ４抗原は、トロホブラスト細胞および多くの型の癌細胞の表面に見出される７２ｋＤａ非グリコシル化リンタンパク質である。Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57: 239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-184;、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ８９／０７９４７号、米国特許第５，８６９，０５３号参照。
【００２７】
本発明のネズミ抗−５Ｔ４抗体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３と称し、実施例１に記載されるように調製された。また、Ａ１、Ａ２およびＡ３から誘導される抗−５Ｔ４抗体も提供され、それはヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合する。例えば、本発明の抗−５Ｔ４抗体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体由来の抗原結合残基を含む抗体、５Ｔ４抗原への結合について、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体と競合する抗体、およびＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と同じ５Ｔ４エピトープに結合する抗体を包含する。
【００２８】
特に、開示されるＡ１、Ａ２およびＡ３抗体は、各々、ヒト５Ｔ４抗原上の独特なエピトープを認識する抗原結合部位を含む。これらの抗体の各々は、また、Ｈ８によって結合されるものとは別個のエピトープに結合し、Ａ１、Ａ２およびＡ３の各々は、ヒト５Ｔ４への結合について、Ｈ８抗体と競合することができない。実施例４〜５および図６〜７を参照のこと。したがって、本発明は、ヒト５Ｔ４の残基３０−１６３に特異的に結合する抗体（例えば、Ａ３）、ヒト５Ｔ４の残基２２４−２７６に特異的に結合する抗体（例えば、Ａ１）、およびヒト５Ｔ４の残基２２４−３５５に特異的に結合する抗体（例えば、Ａ２）を提供する。また、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合されるエピトープを含むヒト５Ｔ４抗原も提供される。例えば、本発明は、天然または全長５Ｔ４抗原の残基３０−１６３、２２４−２７６および２２４−３５５を含む５Ｔ４抗原フラグメントを提供する。
【００２９】
開示される抗−５Ｔ４抗体の特異的結合とは、複数の異なる抗原を含む異種試料中における、ヒト５Ｔ４抗原への抗体の優先的結合をいう。典型的に、特異的結合は、結合アフィニティーが少なくとも約１０−７Ｍ以上、例えば、約１０−８Ｍ以上（少なくとも約１０−９Ｍ以上、少なくとも約１０−１１Ｍ以上または少なくとも約１０−１２Ｍ以上を包含する）の場合に起こる。例えば、本発明の抗体のヒト５Ｔ４抗原への特異的結合は、少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの範囲、例えば、約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの範囲、または約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１１Ｍの範囲、または約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲、または約１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１０Ｍの範囲における結合を包含する。特異的結合とは、また、対象への抗体の投与後、抗−５Ｔ４抗体が５Ｔ４発現性細胞を選択的に標的とすることをいう。
【００３０】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、四量体構造（例えば、天然抗体に類似する）を有していてもよく、または、少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖可変領域または少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖領域、またはその５Ｔ４結合性フラグメント（例えば、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖフラグメント）を有するいずれか他の構造を含んでいてもよい。また、６個全てよりは少ないが１以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合領域を構成している単一ドメイン抗体も包含される。本発明は、また、キメラ抗体、ヒト化抗体、超ヒト化抗体、二重特異性抗体（diabody）、一本鎖抗体、四価抗体、および／または多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）を包含する。これらの抗体記述は、相互排除的ではない。
【００３１】
天然抗体は、２つの同一の軽鎖（Ｌ）および２つの同一の重鎖（Ｈ）からなる約１５０，０００ダルトンの四量体（Ｈ２Ｌ２）糖タンパク質である。２つの重鎖は、ジスルフィド結合によって互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合によって軽鎖に連結されている。軽鎖および重鎖の各々は、さらに、アミノ末端可変領域および定常領域によって特徴付けられる。可変領域は、抗体間で広範囲に異なる配列を有し、実質的に、その特定の抗原に対する特定の抗体の結合アフィニティーおよび特異性を決定する。軽鎖および重鎖の各々の可変領域は、抗原結合性ドメインを形成するように整列する。
【００３２】
キメラ抗体は、少なくとも２つの異なる種由来の配列を含む。一例として、組み換えクローニング技術を用いて、抗原結合部位を含有する非ヒト抗体（すなわち、抗原で免疫された非ヒト種において調製された抗体）由来の可変領域、およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を含ませてもよい。
【００３３】
本発明のキメラ抗−５Ｔ４抗体は、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の重鎖および軽鎖可変領域、すなわち、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、（ｂ）配列番号６の残基１９−１３５の重鎖アミノ酸配列および配列番号８の残基２３−１３０の軽鎖アミノ酸配列、および（ｃ）配列番号１０の残基２０−１４１の重鎖アミノ酸配列および配列番号１２の残基２１−１２７の軽鎖アミノ酸配列を含む抗体を包含する。代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号４９のアミノ酸１−１１９として示される重鎖可変領域、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化重鎖可変領域のいずれか１つ、および図９Ａ−９Ｃにも示されるヒト化軽鎖可変領域を含んでいてもよい。本発明の代表的なキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体の調製は、実施例７に記載される。
【００３４】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、また、Ａ１、Ａ２またはＡ３可変領域から由来するか、またはこれらに実質的に類似する、あるいはヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域に実質的に類似するアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽鎖可変領域を含んでいてもよい。実質的に同一の重鎖および軽鎖可変領域に関し、実質的に同一の配列は、配列番号１−１２のいずれか１つの可変領域配列または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域に、少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも９１％同一、または少なくとも９２％同一、または少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一である。
【００３５】
本発明の代表的なキメラ抗−５Ｔ４抗体、すなわち、５Ｔ４抗原に特異的に結合する抗体は、また、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、配列番号１０の残基２０−１４１、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３重鎖可変領域のいずれか１つとして示される重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５に少なくとも８６％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｄ）配列番号１０の残基２０−１４１に少なくとも９１％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、（ｅ）配列番号４９の残基１−１１９に少なくとも９０％同一の重鎖可変領域アミノ酸配列、または（ｆ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３のいずれか１つ由来の重鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００３６】
５Ｔ４抗原に特異的に結合するキメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体の重鎖可変領域は、（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、配列番号９のヌクレオチド５８−４２３、配列番号４８のヌクレオチド１−３５８のヌクレオチド配列を含む核酸、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３重鎖可変領域をコードしている核酸、（ｂ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド配５５−４０５、または配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列を含む核酸と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。例えば、キメラ抗−５Ｔ４抗体の重鎖可変領域は、配列番号１のヌクレオチド５８−４１４と少なくとも９８％同一の核酸、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列を含む核酸、または配列番号４８のヌクレオチド１−３５８と少なくとも８９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。キメラ抗−５Ｔ４抗体の重鎖可変領域は、また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えば、６５℃にて０．１ Ｘ ＳＳＣの最終洗浄条件下で、配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、配列番号９のヌクレオチド５８−４２３、または配列番号４８のヌクレオチド１−３５８のヌクレオチド配列を含む核酸の相補物に特異的にハイブリダイズする核酸によってコードされうる。
【００３７】
本発明の代表的なキメラ抗−５Ｔ４抗体は、さらに、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、配列番号１２の残基２１−１２７、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域の残基として示される軽鎖可変領域アミノ酸配列、または（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、または配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９０％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列を有する抗体を包含する。例えば、軽鎖可変領域アミノ酸配列は、（ａ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｂ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列、（ｃ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一の軽鎖可変領域アミノ酸配列、または（ｄ）図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域のいずれか１つ由来の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含んでいてもよい。
【００３８】
５Ｔ４抗原に特異的に結合するキメラ抗−５Ｔ４抗体の軽鎖可変領域は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域のいずれか１つをコードしているヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む核酸、または（ｂ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、または配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。例えば、キメラ抗−５Ｔ４抗体の軽鎖可変領域は、（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号７のヌクレオチド６７−３９０と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、または（ｃ）配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む核酸によってコードされうる。５Ｔ４抗原に特異的に結合するキメラ抗−５Ｔ４抗体の軽鎖可変領域は、また、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えば、６５℃にて０．１ Ｘ ＳＳＣの最終洗浄条件下で、配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、または配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列を含む核酸の相補物に特異的にハイブリダイズする核酸によってコードされうる。
【００３９】
ヒト化抗体は、抗原結合に関与する可変領域残基（すなわち、相補性決定領域、簡略された（abbreviated）相補性決定領域の残基、または抗原結合に関係するいずれか他の残基）が非ヒト種由来である一方で、残りの可変領域残基（すなわち、フレームワーク領域の残基）および定常領域が、少なくとも一部、ヒト抗体配列に由来する種類のキメラ抗体である。ヒト化抗体のフレームワーク領域残基および定常領域残基のサブセットは、非ヒト源に由来していてもよい。ヒト化抗体の可変領域は、また、ヒト化として記載される（すなわち、ヒト化軽鎖または重鎖可変領域）。非ヒト種は、典型的に、抗原での免疫化に用いられる種であり、例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、または他の非ヒト哺乳動物種である。ヒト化抗体は、典型的には、伝統的なキメラ抗体よりも免疫原性が低く、ヒトへの投与後に、改善された安定性を示す。例えば、Benincosa et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofonos et al. (1994) Eur. J. Cancer 30A: 1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr. Infect. Dis. J. 17:110-5を参照のこと。
【００４０】
相補性決定領域（ＣＤＲｓ）は、抗原結合に関係する抗体可変領域の残基である。ＣＤＲｓを同定するためのいくつかのナンバリングシステムが一般に使用されている。Ｋａｂａｔ定義は、配列変化性に基づき、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づく。ＡｂＭ定義は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａアプローチの間の折衷である。軽鎖可変領域のＣＤＲｓは、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｂＭアルゴリズムにしたがって、位置２４および３４（ＣＤＲ１−Ｌ）、５０および５６（ＣＤＲ２−Ｌ）、および８９および９７（ＣＤＲ３−Ｌ）の残基によって境界を示される。Ｋａｂａｔ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲｓは、位置３１および３５Ｂ（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０および５６（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５および１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基によって境界が示される（Ｋａｂａｔにしたがうナンバリング）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲｓは、位置２６および３２（ＣＤＲ１−Ｈ）、５２および５６（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５および１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）の残基によって境界が示される（Ｃｈｏｔｈｉａにしたがうナンバリング）。ＡｂＭ定義によると、重鎖可変領域のＣＤＲｓは、位置２６および３５Ｂ（ＣＤＲ１−Ｈ）、５０および５８（ＣＤＲ２−Ｈ）、および９５および１０２（ＣＤＲ３−Ｈ）によって境界が示される（Ｋａｂａｔにしたがうナンバリング）。Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： ９２６８９２７２； Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２０３： １２１１５３； Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ １： １２６； および Ｒｅｅｓ ｅｔ ａｌ． （１９９６） Ｉｎ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ Ｍ．Ｊ．Ｅ． （ｅｄ．）， Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｏｘｆｏｒｄ， ｐｐ． １４１１７２を参照のこと。
【００４１】
特異性決定領域（ＳＤＲｓ）は、抗原と直接的に相互作用するＣＤＲｓ内の残基である。ＳＤＲｓは超可変残基に相当する。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139を参照のこと。
【００４２】
フレームワーク残基は、超可変またはＣＤＲ残基以外の抗体可変領域の残基である。フレームワーク残基は、天然ヒト抗体から由来していてもよく、例えば、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体のフレームワーク領域と実質的に類似するヒトフレームワークから由来していてもよい。個々の配列のなかでも、コンセンサスを示す人工フレームワーク配列もまた、使用されうる。ヒト化のためにフレームワーク領域を選択する場合、ヒトにおいて幅広く示される配列は、少ない配列よりも好ましい場合がある。ヒトフレームワークアクセプター配列の付加的な変異は、抗原接触に関与すると考えられるネズミ残基および／または抗原結合部位の構造的完全性に関与する残基を復帰させるように、または抗体発現を改善するように作成されうる。ペプチド構造予測は、ヒト化設計によって導入される翻訳後タンパク質修飾部位を同定し、回避するために、ヒト化可変重鎖および軽鎖領域配列を分析するために使用されうる。
【００４３】
ヒト化抗体は、下記するような相補性決定領域（ＣＤＲｓ）のベニアリング（veneering）、グラフティング（grafting）、簡略化したＣＤＲｓのグラフティング、特異性決定領域（ＳＤＲｓ）のグラフティング、およびＦｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアセンブリーを包含する種々の方法のいずれか１つを用いて調製されうる。ヒト化抗体は、また、１以上の変更がＣＤＲｓ中に導入されている超ヒト化抗体を包含する。例えば、ヒト残基は、ＣＤＲｓにおいて、非ヒト残基の代わりに用いられうる。これらの一般的なアプローチは、いずれかの所望の配列の抗−５Ｔ４抗体を製造するために、標準的な変異誘発および合成技術と組み合わせてもよい。
【００４４】
ベニアリングは、抗体の溶媒接触可能外面をヒトアミノ酸配列で再舗装（resurfacing）することによって、齧歯類または他の非ヒト抗体において潜在的に免疫原性のアミノ酸配列を減少させるという概念に基づく。かくして、ベニア化された抗体は、修飾されていない非ヒト抗体よりも、ヒト細胞にとって異質ではないようである。Padlan (1991) Mol. Immunol. 28: 489-98を参照のこと。非ヒト抗体は、ヒト抗体のフレームワーク領域における同じ位置の残基とは異なる、非ヒト抗体において露出した外部フレームワーク領域残基を同定し、該同定された残基を、ヒト抗体におけるこれらの同じ位置を典型的に占めているアミノ酸で置換することによってベニア化される。
【００４５】
ＣＤＲｓのグラフティングは、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体または所望のフレームワーク残基を含む他の抗体）の１以上のＣＤＲｓをドナー抗体（例えば、非ヒト抗体）のＣＤＲｓで置き換えることによって実施される。アクセプター抗体は、候補アクセプター抗体およびドナー抗体間のフレームワーク残基の類似性に基づいて選択されうる。例えば、Ｆｒａｎｋｅｎｓｔｅｉｎアプローチによると、ヒトフレームワーク領域は、関連する非ヒト抗体の各フレームワーク領域に対して実質的な配列相同性を有すると同定され、非ヒト抗体のＣＤＲｓを種々のヒトフレームワーク領域の複合物上に接合する。本発明の抗体の調製にも有用な関連する方法は、また、米国特許出願公報第２００３／００４０６０６号にも記載されている。
【００４６】
簡略化されたＣＤＲｓのグラフティングは、関連するアプローチである。簡略化されたＣＤＲｓは、軽鎖の位置２７ｄ−３４、５０−５５および８９−９６および重鎖の位置３１−３５ｂ、５０−５８および９５−１０１のアミノ酸を包含する、特異性決定残基および隣接するアミノ酸を包含する（Kabat et al. (1987)のナンバリングの慣例にしたがう）。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9を参照のこと。特異性決定残基（ＳＤＲｓ）のグラフティングは、抗体結合部位の結合特異性およびアフィニティーが各相補性決定領域（ＣＤＲｓ）内で最も高い可変残基によって決定されるという理解を前提とする。入手可能なアミノ酸配列データの分析と組み合わせた、抗体−抗原複合体の三次元構造の分析は、ＣＤＲ内の各位置で起きるアミノ酸残基の構造的不同性に基づく配列変化性をモデル化するために使用されうる。ＳＤＲｓは、接触残基からなる最小限の免疫原性のポリペプチド配列として同定される。Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-139を参照のこと。
【００４７】
一般に、ヒトアクセプターフレームワークは、それらが実質的にドナー抗体のフレームワーク領域に類似するということに基づくか、またはそれらが可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に非常に類似するということに基づいて選択される。グラフティング後、抗体結合、機能性、コドン使用、発現レベルなどを最適化するために、ドナーおよび／またはアクセプター配列において、非ヒト残基のフレームワーク領域中への導入を包含する付加的な変更が施されてもよい。例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号を参照のこと。
【００４８】
重鎖可変フレームワーク領域上へのＣＤＲｓのグラフティングの場合、有用なフレームワーク配列は、ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）に由来していてもよい。ヒト化のためのフレームワーク残基を含有する代表的な重鎖可変領域は、配列番号１３−２４および８８−９３として示される。ＶＨ１フレームワーク残基のコンセンサスを示す代表的なフレームワークは、配列番号２５−２７として示される。図１０Ａ−１０Ｂも参照のこと。
【００４９】
軽鎖可変フレームワーク領域上へのＣＤＲｓのグラフティングの場合、有用なフレームワーク配列は、ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系クローン、ＶκＩＩＩサブグループ（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ７）から由来していてもよい。ヒト化のためのフレームワーク残基を含有する代表的な軽鎖可変領域は、配列番号２８−３４、３５−４４および９４−９９として示される。図１１−１４を参照のこと。
【００５０】
本発明の代表的なヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号２、６または１０のいずれか１つの重鎖可変領域または配列番号４、８または１２のいずれか１つの軽鎖可変領域のＣＤＲｓから選択される非ヒト抗−５Ｔ４抗体の１以上のＣＤＲｓを有する抗体を包含する。例えば、ヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号２、６または１０のいずれか１つの重鎖可変領域または配列番号４、８または１２のいずれか１つの軽鎖可変領域のＣＤＲｓから選択される２以上のＣＤＲｓを含んでいてもよい。ヒト化抗−５Ｔ４抗体は、また、配列番号２、６または１０のいずれか１つの２または３個のＣＤＲｓを有する可変領域を含む重鎖、および配列番号４、８または１２のいずれか１つの２または３個のＣＤＲｓを有する可変領域を含む軽鎖を含んでいてもよい。
【００５１】
第１鎖の可変領域（すなわち、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）がヒト化されており、また、第２鎖の可変領域（すなわち、非ヒト種において産生される抗体の可変領域）がヒト化されていない本発明のヒト化抗−５Ｔ４抗体が構築されうる。これらの抗体は、半ヒト化抗体と呼ばれるタイプのヒト化抗体である。半ヒト化抗体を調製するために使用されうる非ヒト抗−５Ｔ４抗体は、本明細書中に開示されるようなＡ１、Ａ２およびＡ３抗体、ならびにＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５５６０７号およびForsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):124430-12436に記載されるＨ８抗体、またはWoods et al. (2002) Biochem. J. 366: 353-65に記載されるラットモノクローナル抗体を包含する。例えば、半ヒト化抗−５Ｔ４抗体は、配列番号４９のアミノ酸１−１１９として示される重鎖可変領域、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２もしくはＡ３重鎖可変領域のアミノ酸、および配列番号４、８または１２のいずれか１つの軽鎖可変領域を含むことができる。
【００５２】
キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体の定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、そのいずれかのイソ型（例えば、ＩｇＧのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４イソ型）、ならびにその変異バージョンのいずれか１つの定常領域から由来していてもよい。ヒトイソ型の選択および該イソ型における特定のアミノ酸の修飾は、宿主防御メカニズムの活性化を増幅または除去し、抗体生体分布を改変しうる。Reff et al. (2002) Cancer Control 9: 152-66を参照のこと。本発明のキメラおよびヒト化抗体を調製するのに有用な代表的な定常領域は、配列番号４５−４７として示される。変種または変異バージョンに含まれるヒトラムダ軽鎖定常領域もまた使用されうる。免疫グロブリン定常領域をコードしている配列のクローニングのために、イントロン配列を欠失させてもよい。
【００５３】
キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体は、当該分野で知られる標準的な技術を用いて構築されうる。例えば、可変領域は、可変領域をコードしている重複するオリゴヌクレオチドを互いにアニーリングし、ヒト抗体定常領域を含有している発現ベクター中にそれらをライゲートすることによって調製されうる。例えば、Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York および米国特許第４，１９６，２６５号、第４，９４６，７７８号、第５，０９１，５１３号、第５，１３２，４０５号、第５，２６０，２０３号、第５，６７７，４２７号、第５，８９２，０１９号、第５，９８５，２７９号、第６，０５４，５６１号を参照のこと。ホモ二量体およびヘテロ二量体を包含する２つの無傷四量体抗体を含む四価抗体（Ｈ４Ｌ４）は、例えば、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ０２／０９６９４８号に記載のように調製されうる。抗体二量体は、また、ヘテロ二官能性架橋剤の使用によって（Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53: 2560-5）、または二重定常領域を含むための組み換え体産生によって（Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3: 219-30）、鎖間ジスルフィド結合形成を促進する抗体定常領域中へのシステイン残基の導入によって調製されうる。本発明の抗体の抗原結合性フラグメントは、例えば、末端切断された抗体配列の発現によって、または全長抗体の翻訳後消化によって調製されうる。
【００５４】
本発明の抗−５Ｔ４抗体の変種、すなわち、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体ならびにそのキメラおよびヒト化バージョンは、容易に、種々の変化、置換、挿入および欠失を含むように調製されうる。例えば、抗体配列は、抗体発現に使用される細胞型においてコドン使用に最適化されうる。抗体の血清半減期を増加させるために、すでに存在しないならば、サルベージレセプター結合性エピトープを抗体重鎖配列中に組み込んでもよい。米国特許第５，７３９，２７７号を参照のこと。抗体安定性を増加させるための付加的な修飾は、残基２４１のセリンをプロリンに置き換えるためのＩｇＧ４の修飾を包含する。Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 105-108を参照のこと。他の有用な変化は、抗体と薬物のコンジュゲートにおける効力を最適化するために必要とされるような置換を包含する。例えば、抗体は、薬物付着のためのアミノ酸を含むように、そのカルボキシル末端で修飾されていてもよい。例えば、１以上のシステイン残基が付加されていてもよい。定常領域は、炭水化物または他の基の結合のための部位を導入するように修飾されていてもよい。
【００５５】
本発明の抗−５Ｔ４抗体の変種は、部位特異的変異誘発を包含する標準的な組み換え技術、または組み換えクローニングを用いて生産されうる。抗−５Ｔ４抗体の多様化されたレパートリーは、トランスジェニック非ヒト動物における遺伝子配置および遺伝子変換法（米国特許公開第２００３／００１７５３４号）によって調製されてもよく、次いで、それらは、機能的アッセイを用いて関連する活性について試験される。本発明の特定の具体例において、抗−５Ｔ４変種は、ＣＤＲｓを変異させるためのアフィニティー成熟プロトコール（Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254: 392-403）、鎖シャッフリング（Marks et al. (1992) Biotechnology (NY) 10: 779-783）、Ｅ．ｃｏｌｉの変異誘発株の使用（Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260: 359-368）、ＤＮＡシャッフリング（Patten et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8: 724-733）、ファージディスプレー（Thompson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 77-88）、およびセクシャルＰＣＲ（Crameri et al. (1998) Nature 391: 288-291）を用いて得られる。免疫療法適用のために、関連する機能的アッセイは、下記するように、ヒト５Ｔ４抗原に対する特異的結合、抗体内在化、および腫瘍を有する動物への投与時における腫瘍部位への標的化を包含する。
【００５６】
本発明は、さらに、本発明の抗−５Ｔ４抗体を発現している細胞および細胞系統を提供する。代表的な宿主細胞は、哺乳動物およびヒト細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＶ−１細胞、およびＣＯＳ細胞を包含する。宿主細胞中への異種構築物のトランスフォーメーション後に安定な細胞系統を生成するための方法は、当該分野で知られている。代表的な非哺乳動物宿主細胞は、昆虫細胞（Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112）を包含する。抗体は、また、トランスジェニック動物（Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629）およびトランスジェニック植物（Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45）において産生されうる。
【００５７】
ＩＩ．抗−５Ｔ４核酸およびポリペプチド
本発明は、さらに、抗−５Ｔ４重鎖および軽鎖可変領域をコードしている単離核酸、および開示される核酸によってコードされる単離ポリペプチドを提供する。本発明の核酸およびポリペプチドは、Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域、ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域、およびその変種のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を包含する。単離核酸およびポリペプチドは、キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体を調製するために使用されうる。
【００５８】
ＩＩ．Ａ．抗−５Ｔ４核酸
核酸は、一本鎖、二本鎖または三本鎖形態におけるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーである。特に限定しないかぎり、核酸は、参照天然核酸と類似の特性を有する天然ヌクレオチドの既知の類似物を含有しうる。核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびｃＲＮＡを包含する。核酸は、合成されてもよく、またはいずれかの生物を包含するいずれかの生物学的供給源から得られてもよい。抗−５Ｔ４抗体をコードする核酸をクローニングするための代表的な方法は、実施例１および７に記載される。
【００５９】
本発明の代表的な核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１および４８のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。特に、Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖可変領域をコードしている核酸は、各々、配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、および配列番号１０の残基２０−１４１として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードする、配列番号１のヌクレオチド５８−４１、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、および配列番号９のヌクレオチド５８−４２３を含む。ヒト化Ａ１重鎖可変領域をコードしている核酸は、配列番号４８のヌクレオチド１−３５８を含む。Ａ１、Ａ２およびＡ３軽鎖可変領域をコードしている核酸は、各々、配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、および配列番号１２の残基２１−１２７として示されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域をコードする、配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、および配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１を含む。本発明の付加的なアミノ酸は、図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域をコードしているヌクレオチドを含む。
【００６０】
本発明の核酸は、また、配列番号１、３、５、７、９、１１および４８のいずれか１つに実質的に同一のヌクレオチド配列を含んでいてもよく、配列番号１、３、５、７、９および１１のいずれか１つの可変領域コード配列に少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも約９１％同一または少なくとも９２％同一、例えば、少なくとも９３％同一、または少なくとも９４％同一、または少なくとも９５％同一、または少なくとも９６％同一、または少なくとも９７％同一、または少なくとも９８％同一、または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を包含する。例えば、本発明の核酸は、（ａ）配列番号１の可変領域コード配列と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、（ｂ）配列番号３の可変領域コード配列と少なくとも９７％同一のヌクレオチド配列、（ｃ）配列番号５の可変領域コード配列と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、（ｄ）配列番号７の可変領域コード配列と少なくとも９８％同一のヌクレオチド配列、（ｅ）配列番号１１の可変領域コード配列と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列、または（ｆ）配列番号４８の可変領域コード配列と少なくとも８９％同一のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。配列は、下記するように、配列番号１、３、５、７、９、１１、４８のいずれかの全長可変領域コード配列、または図９Ａ−９Ｈに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列をクエリ配列として用いる配列比較アルゴリズムを用いて、または外観検査によって、最大の一致について比較する。実施例１および表１、および実施例７および表１１も参照のこと。
【００６１】
実質的に同一の配列は、多形配列、すなわち、集団における別の配列または対立遺伝子であってもよい。対立遺伝子の相違は、１塩基対ほどの小ささであってもよい。実質的に同一の配列は、また、サイレント変異を含む配列を包含する変異を起こさせた配列を含んでいてもよい。変異は、１以上の残基の変化、１以上の残基の欠失、または１以上の付加的な残基の挿入を含んでいてもよい。
【００６２】
実質的に同一の核酸は、さらに、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの全長に対し、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの可変領域コード配列の全長に対し、または図９Ａ−９Ｈに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列に対し、ストリンジェントな条件下で、特異的にハイブリダイズするか、または実質的にハイブリダイズする核酸として同定される。核酸ハイブリダイゼーションとの関連で、比較している２つの核酸配列は、プローブおよび標的と称してもよい。プローブは、参照核酸分子であり、標的は、試験核酸分子であり、しばしば、核酸分子の異種集団内で見出される。標的配列は、試験配列と同義である。
【００６３】
ハイブリダイゼーション研究の場合、有用なプローブは、本発明の核酸分子の少なくとも約１４〜４０ヌクレオチド配列に相補的であるか、またはそれらを模倣する。好ましくは、プローブは、１４〜２０個のヌクレオチドからなり、または長いプローブが望ましい場合でも、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの３０、４０、５０、６０、１００、２００、３００または５００ヌクレオチドまたは全長まで、配列番号１、３、５、７、９、１１または４８のいずれか１つの可変領域コード配列の全長、または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードするヌクレオチド配列からなる。かかるフラグメントは、例えば、フラグメントの化学的合成によって、核酸増幅技術の適用によって、または組み換え体産生のための組み換えベクター中への選択配列の導入によって、容易に調製されうる。
【００６４】
特異的ハイブリダイゼーションとは、配列が複合核酸混合物（例えば、全細胞性ＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、ストリンジェントな条件下で、分子が特定のヌクレオチド配列にだけ結合、二本鎖化（duplex）またはハイブリダイズすることをいう。特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件の厳しさにもよるが、プローブと標的配列との間のミスマッチを調整しうる。
【００６５】
サザンおよびノーザンブロット分析などの核酸ハイブリダイゼーション実験との関連で、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件およびストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件は、配列と環境のどちらにも依存する。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I chapter 2, Elsevier, New York, New Yorkに見出される。一般に、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、所定のイオン強度およびｐＨにて、特定の配列の熱融解点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。典型的には、ストリンジェントな条件下、プローブは、その標的サブ配列に特異的にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない。
【００６６】
Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に合致するプローブにハイブリダイズする温度（所定のイオン強度およびｐＨ下で）である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのＴｍと等しくなるように選択される。約１００個を越える相補的残基を有する相補的核酸のサザンまたはノーザンブロット分析のためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃にて、１ｍｇのヘパリンを含有する５０％ホルムアミド中、一晩のハイブリダイゼーションである。非常にストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて、０．１ Ｘ ＳＳＣバッファー中１５分である。ストリンジェントな洗浄条件の例は、６５℃にて、０．２ Ｘ ＳＳＣバッファー中１５分である。ＳＳＣバッファーの記載については、Sambrook et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照のこと。しばしば、高ストリンジェンシー洗浄の前に、バックグラウンドプローブシグナルを除去するための低いストリンジェンシー洗浄を行う。約１００個を越えるヌクレオチドの二本鎖のための中程度のストリンジェンシー洗浄条件の例は、４５℃にて、１ Ｘ ＳＳＣ中１５分である。約１００個を越えるヌクレオチドの二本鎖のための低ストリンジェンシー洗浄条件の例は、４０℃にて、４Ｘ〜６Ｘ ＳＳＣ中１５分である。短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的に、ｐＨ７．０−８．３にて、約１Ｍ Ｎａ＋イオン未満の塩濃度、典型的には約０．０１〜１Ｍ Ｎａ＋イオン濃度（または他の塩）を含み、温度は、典型的に、少なくとも約３０℃である。ストリンジェントな条件は、また、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって達成されうる。一般に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて、関係のないプローブに対して観察されるよりも２倍の（またはそれ以上）シグナル対ノイズ比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示す。
【００６７】
以下は、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を同定するために使用されうるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件の例である。プローブヌクレオチド配列は、好ましくは、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中、５０℃にて標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、次いで、２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃にて洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、０．５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０℃で洗浄する。より好ましくは、プローブおよび標的配列は、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．５Ｍ ＮａＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ中５０℃でハイブリダイズし、次いで、０．１Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中６５℃で洗浄する。
【００６８】
２つの核酸配列が実質的に同一であることを示すさらなる兆候は、該核酸によってコードされるタンパク質が実質的に同一であり、全体的な三次元構造を共有し、または生物学的に機能的等価であることである。これらの用語は、さらに下記で定義される。ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸分子は、対応するタンパク質が実質的に同一であれば、まだ実質的に同一である。これは、例えば、２つのヌクレオチド配列が遺伝子コードによって許可されるような保存的に置換された変種を含む場合に起こりうる。
【００６９】
保存的に置換された変種は、１以上の選択された（または全ての）コドンの第３位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている縮重コドン置換を有する核酸配列である。Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608;およびRossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98を参照のこと。
【００７０】
本発明の核酸は、また、配列番号１、３、５、７、９、１１、４８または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列、および配列番号１、３、５、７、９、１１、４８または図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域配列をコードしているヌクレオチド配列のサブ配列および伸長配列、およびその相補配列のいずれか１つに相補的な核酸を含む。相補配列は、塩基対間の水素結合の形成において互いに対になることのできる逆平行なヌクレオチド配列を含む２つのヌクレオチド配列である。本明細書中で使用される場合、相補配列なる語は、下記に示す同じヌクレオチド比較方法によって評価されうるような、実質的に相補的なヌクレオチド配列を意味するか、または本明細書中に記載されるような比較的ストリンジェントな条件下で目的の核酸セグメントにハイブリダイズすることができるものとして定義される。相補的核酸セグメントの特定の例は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００７１】
サブ配列は、より長い核酸配列の一部からなる核酸の配列である。例示的サブ配列は、上記のようなプローブ、またはプライマーである。プライマーなる語は、本明細書中で使用される場合、選択された核酸分子の約８個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、好ましくは、１０−２０個のヌクレオチド、より好ましくは２０−３０個のヌクレオチドからなる連続した配列をいう。本発明のプライマーは、本発明の核酸分子上で重合の開始を提供するのに十分な長さの適当な配列のオリゴヌクレオチドを包含する。
【００７２】
伸長配列は、核酸中に組み込まれた付加的なヌクレオチド（または他の類似分子）を含む。例えば、ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）は、核酸分子の３’末端に配列を付加しうる。さらに、ヌクレオチド配列は、他のＤＮＡ配列、例えば、プロモーター、プロモーター領域、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、イントロン配列、付加的な制限酵素部位、マルチプルクローニング部位、および他のコーディングセグメントと組み合わせてもよい。かくして、本発明は、また、組み換え発現ベクターを包含する、本発明の核酸が機能的プロモーターに作動可能に連結された開示された核酸を含むベクターを提供する。核酸に作動可能に連結される場合、プロモーターは、核酸の転写がプロモーター領域によって制御および調節されるように核酸と機能的に組み合わされている。ベクターとは、プラスミド、コスミドおよびウイルス性ベクターのなどの宿主細胞中で複製可能な核酸をいう。
【００７３】
本発明の核酸は、クローン化、合成、改変、変異誘発されていてもよく、またはそれらの組み合わせが施されていてもよい。核酸の単離に使用される標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該分野で既知である。塩基対の変化、欠失または小さな挿入を施すための部位特異的変異誘発もまた、当該分野で既知である。例えば、Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach, 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New Yorkを参照のこと。
【００７４】
ＩＩ．Ｂ．抗−５Ｔ４ポリペプチド
本発明は、また、単離した抗−５Ｔ４ポリペプチドを提供する。ポリペプチドおよびタンパク質とは各々、ペプチド結合によって結合された一本鎖アミノ酸からなる化合物をいう。代表的な重鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、配列番号１０の残基２０−１４１、および配列番号４９の残基１−１１９として示される。代表的な軽鎖可変領域ポリペプチドは、配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、および配列番号１２の残基２１−１２７として示される。本発明の付加的なポリペプチドは、図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３可変領域のアミノ酸を含む。
【００７５】
本発明の付加的なポリペプチドは、開示された抗−５Ｔ４ポリペプチドに実質的に類似する、例えば、配列番号２、４、６、８、１０、１２および４９の可変領域と少なくとも約９０％同一、例えば、少なくとも約９１％同一、少なくとも約９２％同一、少なくとも約９３％同一、少なくとも約９４％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、または少なくとも約９９％同一の重鎖および軽鎖可変領域ポリペプチドを包含する。配列は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、４９のいずれか１つまたは図９Ａ−９Ｃに示されるヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３可変領域のいずれか１つの全長配列、またはその可変領域配列を用いる配列比較アルゴリズムを用いて、または外観検査によって、最大の一致について比較される。本発明は、さらに、本明細書中に開示される核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドを包含する。
【００７６】
例えば、本発明の代表的なポリペプチドは、（ａ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチド、および（ｇ）配列番号４９の残基１−１１９と少なくとも９０％類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。実施例１および表２、および実施例７および表１１を参照のこと。
【００７７】
本発明のポリペプチドは、天然アミノ酸、合成アミノ酸、遺伝的にコードされたアミノ酸、非遺伝的にコードされたアミノ酸、およびその組み合わせを含みうる。ポリペプチドは、Ｌ型およびＤ型アミノ酸の両方を包含する。
【００７８】
代表的な非遺伝的にコードされたアミノ酸は、限定するものではないが、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、β−アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸（ピペリジン酸）、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、２，４−ジアミノ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、アロ−ヒドロキシリジン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、アロ−イソロイシン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルバリン、ノルバリン、ナルロイシン、およびオルニチンを包含する。
【００７９】
代表的な誘導体化アミノ酸は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を包含する。遊離カルボキシル基は、誘導体化されて、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他の型のエステルまたはヒドラジドを形成していてもよい。遊離ヒドロキシル基は、誘導体化されて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成していてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素は、誘導体化されて、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを形成していてもよい。
【００８０】
本発明は、また、本発明の抗−５Ｔ４ポリペプチドのフラグメント、例えば、５Ｔ４抗原結合部位を構成するフラグメントを提供する。開示される配列よりも長いポリペプチド配列もまた提供される。例えば、１以上のアミノ酸が抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加されていてもよい。かかる付加的アミノ酸は、限定するものではないが、精製を包含する種々の適用に用いてもよい。伸長したタンパク質を調製する方法は、当該分野で知られている。
【００８１】
本発明の抗−５Ｔ４ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２または４９のいずれか１つの保存的に置換された変種であるアミノ酸を含むタンパク質を包含する。保存的に置換された変種とは、１以上の残基が機能的に類似の残基で保存的に置換されているアミノ酸を含むポリペプチドをいう。
【００８２】
保存的置換の例は、１の非極性（疎水性）残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンの別の基での置換、１の極性（親水性）残基の別の基での置換、例えば、アルギニンとリジンとの間の置換、グルタミンとアスパラギンとの間の置換、グリシンとセリンとの間の置換、１の塩基性残基、例えば、リジン、アルギニンまたはヒスチジンの別の基での置換、または１の酸性残基、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸の別の基での置換を包含する。
【００８３】
本発明の単離ポリペプチドは、当業者に知られた種々の標準的技術を用いて、精製し、特徴付けられうる。例えば、Schroeder & Luebke (1965) The Peptides. Academic Press, New York; Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis, 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlin/ New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New Yorkを参照のこと。
【００８４】
ＩＩ．Ｃ．ヌクレオチドおよびアミノ酸配列比較
２以上のヌクレオチドまたはタンパク質配列との関連で、「同一」または「パーセント同一性」なる語は、最大の一致について比較および整列させた場合、本明細書中に開示された配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または外観検査によって測定したとき、同一または特定のパーセンテージの同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する２以上の配列またはサブ配列をいう。
【００８５】
ヌクレオチドまたはタンパク質配列に関して、「実質的に同一」なる語は、特定の配列が１以上の欠失、置換または付加によって天然の配列から変化しているが、その正味の影響は抗−５Ｔ４核酸またはポリペプチドの生物学的機能を保持することを意味する。
【００８６】
２以上の配列を比較する場合、典型的に１つの配列は、１以上の試験配列を比較している参照配列としての役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピュータープログラム中に入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを選択する。次いで、配列比較アルゴリズムが、選択されたプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対して指定された試験配列についてのパーセント配列同一性を計算する。
【００８７】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith ＆ Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489の局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman ＆ Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson ＆ Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター化された手段（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WisconsinのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）によって、または外観観察によって実施されうる。一般に、Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New Yorkを参照のこと。
【００８８】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するための好ましいアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)を介して公的に入手可能である。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターは、アラインメントの感受性および速度を決定する。２つのヌクレオチド配列を比較する場合、ＢＬＡＳＴｎデフォルトパラメーターは、Ｗ＝１１（ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ）およびＥ＝１０（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）で設定され、また、低い組成複雑性を有するクエリ配列の残基をマスクするための低複雑性フィルターの使用を包含する。２つのアミノ酸配列を比較する場合、ＢＬＡＳＴｐプログラムデフォルトパラメーターは、Ｗ＝３（ｗｏｒｄ ｌｅｎｇｔｈ）、Ｅ＝１０（ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ）で設定され、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスの使用、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１のギャップコスト、および低い組成複雑性を有するクエリ配列の残基をマスクするための低複雑性フィルターの使用を包含する。実施例１を参照のこと。
【００８９】
ＩＩＩ．抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲート
本発明は、さらに、本発明の抗−５Ｔ４抗体を含む抗体／薬物コンジュゲートを提供する。また、薬物が抗体に直接または間接的に結合しているような抗体／薬物コンジュゲートの調製方法も提供される。本発明の抗体／薬物コンジュゲートは、一般式：
５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）ｍ
［式中、
５Ｔ４Ａｂは、本明細書中に記載されるような抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメントであり、
Ｘは、抗−５Ｔ４抗体または抗体フラグメントと反応しうるいずれかの反応基の生成物を含むリンカーであり、
Ｗは、薬物であり、
ｍは、精製されたコンジュゲート生成物に関する平均負荷（例えば、薬物がコンジュゲートの約３−１０重量％を構成するようなｍ）あり、
（−Ｘ−Ｗ）ｍは、薬物誘導体である］
で示される。
【００９０】
また、本発明の抗体／薬物コンジュゲートの調製方法も提供される。一例として、式５Ｔ４Ａｂ（−Ｘ−Ｗ）ｍの抗体／薬物コンジュゲートは、（ａ）薬物誘導体を抗−５Ｔ４抗体に添加し、ここに、薬物は抗−５Ｔ４抗体の３−１０重量％であり、（ｂ）薬物誘導体および抗−５Ｔ４抗体を非求核性でタンパク質適合性の約ｐＨ７〜９のバッファー溶液中でインキュベートして、抗体／薬物コンジュゲートを製造し、ここに、該溶液はさらに、（ｉ）適当な有機共溶媒および（ｉｉ）少なくとも１つの胆汁酸またはその塩を含む１以上の添加物を含み、該インキュベーションは、約３０℃〜約３５℃にて、約１５分〜約２４時間実施され、次いで、（ｃ）工程（ｂ）で製造されたコンジュゲートをクロマトグラフィー分離過程に付して、３−１０重量％の薬物を負荷し、低コンジュゲートフラクション（ＬＣＦ）を有する抗体／薬物コンジュゲートを、コンジュゲートしていない抗−５Ｔ４抗体、薬物誘導体および凝集したコンジュゲートから分離することによって調製されうる。
【００９１】
ＩＩＩ．Ａ．薬物
薬物は、生物学的または検出可能な活性を有するいずれかの物質、例えば、治療剤、検出ラベル、結合剤等、およびイン・ビボで活性剤に代謝されるプロドラッグである。薬物は、また、薬物が本発明の抗体とコンジュゲート可能なように官能化されている薬物誘導体であってもよい。一般に、これらの型のコンジュゲートは、免疫コンジュゲートと呼ばれる。
【００９２】
治療剤は、必要とする対象において病態を治療または予防するのに使用されうる組成物である。本発明において有用な治療剤は、抗癌剤、すなわち、５Ｔ４発現性細胞、例えば、扁平上皮／腺腫性肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頚癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛癌由来の癌細胞において、抗癌活性を有する剤を包含する。
【００９３】
代表的な治療薬物は、細胞毒、放射性同位元素、化学療法剤、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、プロ−アポトーシス剤、ならびに細胞増殖抑制および細胞溶解性酵素（例えば、ＲＮＡｓｅｓ）を包含する。薬物は、また、治療的核酸、例えば、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、またはプロ−アポトーシス剤をコードしている遺伝子を包含しうる。これらの薬物の記述は、相互排他的ではなく、かくして、治療剤は、１以上の上記の用語を用いて記述されうる。例えば、選択された放射性同位元素は、細胞毒でもある。治療剤は、上記のいずれかの医薬上許容される塩、酸または誘導体として調製されうる。一般に、放射性同位元素を薬物として有するコンジュゲートは、放射性免疫コンジュゲートと呼ばれ、化学療法剤を薬物として有するコンジュゲートは、化学免疫コンジュゲートと呼ばれる。
【００９４】
免疫コンジュゲートにおいて使用するための適当な薬物の例は、タキサン類、マイタンシン類（maytansines）、ＣＣ−１０６５およびドゥオカルマイシン類（duocarmycins）、カリケアマイシン類および他のエンジイン類、およびアウリスタチン類（auristatins）を包含する。他の例には、抗−葉酸塩、ビンカアルカロイド、およびアントラサイクリンを包含する。植物毒、他の生物活性タンパク質、酵素（すなわち、ＡＤＥＰＴ）、放射性同位元素、光増感剤（すなわち、光線力学療法の場合）もまた、免疫コンジュゲートに用いることができる。さらに、例えば、リポソームまたはポリマーなどの第２の担体を細胞毒剤として用いて、コンジュゲートを作成することができる。
【００９５】
「細胞毒」なる語は、一般に、細胞の機能を阻害または妨害し、および／または細胞の破壊をもたらす剤をいう。代表的な細胞毒は、抗生物質、チューブリン重合阻害剤、ＤＮＡに結合して破壊するアルキル化剤、およびタンパク質合成または必須細胞性タンパク質、例えば、プロテインキナーゼ、ホスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素およびサイクリンの機能を破壊する剤を包含する。代表的な細胞毒は、限定するものではないが、ドクソルビシン（doxorubicin,）、ダウノルビシン（daunorubicin）、イダルビシン（idarubicin）、アクラルビシン（aclarubicin）、ゾルビシン（zorubicin）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、エピルビシン（epirubicin）、カルビシン（carubicin）、ノガラマイシン（nogalamycin）、メノガリル（menogaril）、ピタルビシン（pitarubicin）、バルルビシン（valrubicin）、シタラビン（cytarabine）、ゲムシタビン（gemcitabine）、トリフルリジン（trifluridine）、アンシタビン（ancitabine）、エノシタビン（enocitabine）、アザシチジン（azacitidine）、ドキシフルリジン（doxifluridine）、ペントスタチン（pentostatin）、ブロクリジン（broxuridine）、カペシタビン（capecitabine）、クラドリビン（cladribine）、デシタビン（decitabine）、フロクリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、ゴウゲロチン（gougerotin）、ピューロマイシン（puromycin）、テガフル（tegafur）、チアゾフリン（tiazofurin）、アドリアマイシン（adriamycin）、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、ダカルバジン（dacarbazine）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビンクリスチン（vincristine）、ミトキサトロン（mitoxantrone）、ブレオマイシン（bleomycin）、メクロルエタミン（mechlorethamine）、プレドニソン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、メトトレキサート（methotrexate）、フルロウラシル類（flurouracils）、エトポシド（etoposide）、タキソール（taxol）、タキソール類似物、プラチン類（platins）、例えば、シス−プラチンおよびカルボ−プラチン、マイトマイシン（mitomycin）、チオテパ（thiotepa）、タキサン類、ビンクリスチン（vincristine）、ダウノルビシン（daunorubicin）、エピルビシン（epirubicin）、アクチノマイシン（actinomycin）、オウトラマイシン（authramycin）、アザセリン類（azaserines）、ブレオマイシン類（bleomycins）、タモキシフェン（tamoxifen）、イダルビシン（idarubicin）、ドラスタチン類（dolastatins）／オーリスタチン類（auristatins）、ヘミアステリン類（hemiasterlins）、エスペラマイシン類（esperamicins）およびマイタンシノイド類（maytansinoids）を包含する。
【００９６】
本発明の特定の具体例において、細胞毒は、抗生物質、例えば、カリケアマイシン（ＬＬ−Ｅ３３２８８複合体とも呼ばれる）、例えば、ガンマ−カリケアマイシン（γ１）またはＮ−アセチルガンマ−カリケアマイシンである。米国特許第４，９７０，１９８号を参照のこと。本発明の抗体／薬物コンジュゲートの調製において使用するのに適当なカリケアマイシンの付加的な例は、米国特許第４，６７１，９５８号、第５，０５３，３９４号、第５，０３７，６５１号、第５，０７９，２３３号および第５，１０８，９１２号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。これらの化合物は、適当なチオールと反応してジスルフィドを形成し、同時に、ヒドラジドまたは抗−５Ｔ４抗体にカリケアマイシンをコンジュゲートさせるのに有用な他の官能基などの官能基を導入しうるメチルトリスルフィドを含有する。カリケアマイシンのジスルフィド類似体もまた使用でき、例えば、米国特許第５，６０６，０４０号および第５，７７０，７１０号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に記載されている。
【００９７】
放射線療法での適用の場合、本発明の抗−５Ｔ４抗体は、高エネルギー放射性同位元素を含みうる。同位元素は、例えば、抗体に存在するシステイン残基にて、抗体に直接結合させてもよく、またはキレーターを用いて抗体と放射性同位元素との結合を媒介させてもよい。放射線療法に適当な放射性同位元素は、限定するものではないが、α−エミッター、β−エミッター、およびオージェ電子を包含する。診断的適用の場合、有用な放射性同位元素は、陽電子エミッターおよびγ−エミッターを包含する。本発明の抗−５Ｔ４抗体は、抗体の検出または治療効果を促進にするために、さらに、例えば、抗体のチロシン残基上で、ヨウ素化されていてもよい。
【００９８】
抗−５Ｔ４抗体にコンジュゲートされうる代表的な放射性同位元素は、１８フッ素、６４銅、６５銅、６７ガリウム、６８ガリウム、７７臭素、８０ｍ臭素、９５ルテニウム、９７ルテニウム、１０３ルテニウム、１０５ルテニウム、９９ｍテクネチウム、１０７水銀、２０３水銀、１２３ヨウ素、１２４ヨウ素、１２５ヨウ素、１２６ヨウ素、１３１ヨウ素、１３３ヨウ素、１１１インジウム、１１３インジウム、９９ｍルテニウム、１０５ルテニウム、１０１ルテニウム、１８６ルテニウム、１８８ルテニウム、１２１ｍテルル、９９テクネチウム、１２２ｍテルル、１２５ｍテルル、１６５ツリウム、１６７ツリウム、１６８ツリウム、９０イットリウム、およびそれらから誘導される窒化物または酸化物を包含する。他の適当な放射性同位元素は、アルファエミッター、例えば、２１３ビスマス、２１３鉛、および２２５アクチニウムを包含する。
【００９９】
本発明の抗体／薬物コンジュゲートは、免疫調節剤、すなわち、体液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）および細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）を包含する免疫応答を誘導する剤を包含しうる。代表的な免疫調節剤は、サイトカイン、キサンチン、インターロイキン、インターフェロンおよび成長因子（例えば、ＴＮＦ、ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ）、およびエストロゲン類（ジエチルスチルベストロール、エストラジオール）、アンドロゲン類（テストステロン、ＨＡＬＯＴＥＳＴＩＮＲ（登録商標）（フルオキシメステロン））、プロゲスチン類（ＭＥＧＡＣＥＲ（酢酸メゲストロール）、ＰＲＯＶＥＲＡＲ（酢酸メドロキシプロゲステロン））およびコルチコストロイド類（プレドニソン、デキサメタソン、ヒドロコルチソン）などのホルモンを包含する。
【０１００】
本発明において有用な免疫調節剤は、また、腫瘍に対するホルモン作用を遮断する抗ホルモンおよびサイトカイン産生を抑制する、自己抗原発現をダウンレギュレートする、またはＭＨＣ抗原をマスクする免疫抑制剤を包含する。代表的抗ホルモン剤は、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン（raloxifene）、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、ＬＹ１１７０１８、オナプンストン（onapstone）、およびトレミフェン（toremifene）を包含する抗エストロゲン類、および抗アンドロゲン類、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン、および抗副腎剤を包含する。代表的な免疫抑制剤は、２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン類、アザチオプリン、シクロホスファミド、ブロモクリプチン、ダナゾール、ダプソン、グルタルアルデヒド、ＭＨＣ抗原およびＭＨＣフラグメントの抗遺伝子型抗体、シクロスポリンＡ、ステロイド、例えば、グルココルチコステロイド、サイトカインまたはサイトカイン受容体アンタゴニスト（例えば、抗インターフェロン抗体、抗−ＩＬ１０抗体、抗−ＴＮＦα抗体、抗−ＩＬ２抗体）、ストレプトキナーゼ、ＴＧＦβ、ラパマイシン、Ｔ細胞受容体、Ｔ細胞受容体フラグメント、およびＴ細胞受容体抗体を包含する。
【０１０１】
本発明において有用な付加的な薬剤は、血管形成を阻害する抗脈管形成剤、例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ｂＦＧＦ阻害剤、ステロイドスルファターゼ阻害剤（例えば、２−メトキシエストラジオールビス−スルファマート（２−ＭｅＯＥ２ｂｉｓＭＡＴＥ））、インターロイキン−２４、トロンボスポンジン、メタロスポンジンタンパク質、クラスＩインターフェロン、インターロイキン１２、プロタミン、アンジオスタチン、ラミニン、エンドスタチン、およびプロラクチンフラグメントを包含する。
【０１０２】
抗増殖剤およびプロ−アポトーシス剤は、ＰＰＡＲ−ガンマのアクチベーター（例えば、シクロペンテノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧｓ））、レチノイド、トリテルピノイド（例えば、シクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリエデラン、ダンマラン、ククルビタシン、およびリモノイド・トリテルペノイド）、ＥＧＦ受容体の阻害剤（例えば、ＨＥＲ４）、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬＲ（１，２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ阻害剤（ＦＥＭＡＲＡＲ（レトロゾン））、テロメラーゼ阻害剤、鉄キレーター（例えば、３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ））、アポプチン（ニワトリ貧血ウイルス由来のウイルス性タンパク質３−ＶＰ３）、Ｂｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の阻害剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ−関連アポトーシス誘導性リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）シグナリングのアクチベーター、およびＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路シグナリングの阻害剤（例えば、ＵＣＮ−０１およびゲルダナマイシン）を包含する。
【０１０３】
代表的な化学治療剤は、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド、スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン（busulfan）、インプロスルファン（improsulfan）およびピポスルファン（piposulfan）、アジイジン類（aziidines）、例えば、ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボクオン（carboquone）、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa）、アルトレタミン（altretamine）、トリエチレンメラミン（triethylenemelamine）、トリエチレンホスホラミド（triethylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホラミド（triethylenethiophosphoramide）およびトリメチルオロメラミン（trimethylolomelamine）を包含するエチレンイミン類（ethylenimines）およびメチルアメラミン類（methylamelamines）；ニトロゲンマスタード、例えば、クロラムブシル（chlorambucil）、クロルナファジン（chlornaphazine）、クロロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン（estramustine）、イフォスファミド（ifosfamide）、メキオレタミン（mechiorethamine）、酸化メキオレタミン塩酸塩、メルファラン（melphalan）、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニムスチン（prednimustine）、トロホスファルニド（trofosfarnide）、ウラシルマスタード（uracil mustard）；ニトロソウレア類（nitrosureas）、例えば、カルムスチン（carmustine）、クロロゾトシン（chlorozotocin）、フォテムスチン（fotemustine）、ロムスチン（lomustine）、ニムスチン（nimustine）、ラニムスチン（ranimustine）；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン類（aclacinomysins）、アクチノマイシン（actinomycin）、オウトラマイシン（authramycin）、アザセリン（azaserine）、ブレオマイシン類（bleomycins）、カクチノマイシン（cactinomycin）、カリケアマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（carminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン類（chromomycins）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドクソルビシン（doxorubicin）、エピルビシン（epirubicin）、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン（idarubicin）、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン類（mitomycins）、ミコフェノール酸（mycophenolic acid）、ノガラマイシン（nogalamycin）、オリボマイシン類（olivomycins）、ペプロマイシン（peplomycin）、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン（puromycin）、ケラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン（streptonigrin）、ストレプトゾシン（streptozocin）、ツベルシジン（tubercidin）、ウベニメクス（ubenimex）、ジノスタチン（zinostatin）、ゾルビシン（zorubicin）；抗−代謝産物、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸類似物、例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキサート（trimetrexate）；プリン類似物、例えば、フルダラビン（fludarabine）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニン；ピリミジン類似物、例えば、アンシタビン（ancitabine）、アザシチジン（azacitidine）、６−アザウリジン、カモフル（carmofur）、シタラビン（cytarabine）、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン（doxifluridine）、エノシタビン（enocitabine）、フロクスウリジン（floxuridine）、５−ＥＵ；アンドロゲン類、例えば、カルステロン（calusterone）、プロピオン酸ドロモスタノロン（dromostanolone propionate）、エピチオスタノール（epitiostanol）、メピチオスタン（mepitiostane）、テストラクトン（testolactone）；抗−副腎物質（anti-adrenal）、例えば、アルニノグルテチミド（arninoglutethimide）、ミトタン（mitotane）、トリロスタン（trilostane）；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（frolinic acid）；アセグラトン（aceglatone）；アルドホスファルニド（aldophospharnide）グリコシド；アルニノレブリン酸（arninolevulinic acid）；アムサクリン（amsacrine）；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン（defofamine）；デメコルシン（demecolcine）；ジアジクオン（diaziquone）；エルフォルニチン（elfornithine）；酢酸エリプチニウム（elliptinium acetate）;エトグルシド（etoglucid）；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン（lentinan）；ロニダミン（Ionidamine）；ミトグアゾン（mitoguazone）；ミトキサントロン（mitoxantrone）；モピダモール（mopidamol）；ニトラクリン（nitracrine）；ペントスタチン（pentostatin）；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン（pirarubicin）；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン（procarbazine）；ラゾキサン（razoxane）；シゾフィラン（sizofiran）；スピロゲルマニウム（spirogermanium）；テヌアゾン酸（tenuazonic acid）；トリアジクオン（triaziquone）；２，２’，２’−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン（vindesine）；ダカルバジン（dacarbazine）；マンノムスチン（mannomustine）；ミトブロニトール（mitobronitol）；ミトラクトール（mitolactol）；ピポブロマン（pipobroman）；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（arabinoside）（Ａｒａ−Ｃ）；シクロホスファミド（cyclophosphamide）；チオテパ；タキソイド類、例えば、パクリタキセル（paclitaxel）（ＴＡＸＯＬＲ、Bristol-Myers Squibb Oncology of Princeton, New Jersey）およびドキセタキセル（doxetaxel）（ＴＡＸＯＴＥＲＥＲ、Rhone-Poulenc Rorer of Antony, France）；チオラムブシル（chiorambucil）；ゲムシタビン（gemcitabine）；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似物、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（etoposide）（ＶＰ−１６）；イフォスファミド（ifosfamide）；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン（navelbine）；ノバントロン（novantrone）；テニポシド（teniposide）；ダウノマイシン（daunomycin）；アイニノプテリン（aininopterin）；キセロダ（xeloda）；イバンドロナート（ibandronate）；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン類（esperamicins）；およびカペシタビン（capecitabine）を包含する。
【０１０４】
抗−５Ｔ４抗体にコンジュゲートされ、本発明の治療法にしたがって使用されうる付加的な治療剤は、光線力学療法のための感光剤（米国特許公開第２００２／０１９７２６２号および米国特許第５，９５２，３２９号）、温熱療法（米国特許公開第２００３／００３２９９５号）のための磁性粒子、結合剤、例えば、ペプチド、リガンド、細胞接着リガンド等、およびプロドラッグ、例えば、リン酸塩含有プロドラッグ、チオリン酸塩含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換したフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換フェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよびより活性のある細胞毒性遊離薬物に変換しうる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを包含する。
【０１０５】
抗−５Ｔ４抗体を用いる診断方法の場合、薬物は、イン・ビトロまたはイン・ビボで５Ｔ４発現細胞の存在を検出するために使用される検出可能な標識を含んでいてもよい。イン・ビボで検出可能な放射性同位元素、例えば、シンチグラフィー、磁気共鳴画像化または超音波を用いて検出可能な標識は、臨床的診断的適用において使用されうる。有用なシチグラフィー標識は、陽電子エミッターおよびγ−エミッターを包含する。磁気源画像化のための代表的な造影剤は、常磁性または超常磁性イオン（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウムおよびガドリニウム）、酸化鉄粒子、および水溶性造影剤である。超音波検出の場合、気体または液体を、微小気泡造影剤として放出される多孔性無機粒子中に封入してもよい。イン・ビトロ検出の場合、有用な検出可能標識は、フルオロフォア、検出可能エピトープまたは結合剤、および放射能標識を包含する。
【０１０６】
ＩＩＩ．Ｂ．リンカー分子
薬物は、本発明のキメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体に直接またはリンカー分子を介して間接的にコンジュゲートされる。リンカー分子は、安定であるか、または加水分解可能であってもよく、それにより、細胞侵入後に放出される。薬物が抗体から開裂される主要なメカニズムは、酸性ｐＨのリソソーム（ヒドラゾン、アセタール、およびシス−アコニタート様アミド）中における加水分解、リソソーム酵素（カテプシンおよび他のリソソーム酵素）によるペプチド開裂、およびジスルフィドの還元を包含する。これらの種々の開裂メカニズムの結果として、薬物を抗体に連結するメカニズムもまた、幅広く変化し、いずれかの適当なリンカーを用いることができる。好ましくは、コンジュゲーション方法は、最小限の低コンジュゲートフラクション（ＬＣＦ、ほとんどコンジュゲートされていない抗体のフラクション）、すなわち、約１０％未満のＬＣＦを有する試料を生じる。
【０１０７】
適当なコンジュゲーション法の一例は、天然で抗体に生じる炭水化物の酸化によって生成されるアルデヒドに対するヒドラジドおよび他の求核原子のコンジュゲーションに依存する。ヒドラゾン含有コンジュゲートは、所望の薬物放出性を提供する導入されたカルボニル基を用いて作成することができる。コンジュゲートは、また、一方の末端にジスルフィド、真ん中にアルキル鎖、および他方の末端にヒドラジン誘導体を有するリンカーを用いて作製することができる。アントラサイクリン類は、該技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる細胞毒の一例である。
【０１０８】
ヒドラゾン類以外の官能基を含有するリンカーは、リソソームの酸性環境において開裂される可能性を有する。例えば、コンジュゲートは、細胞内で開裂可能なヒドラゾン以外の部位を含有するチオール反応性リンカー、例えば、エステル、アミドおよびアセタール／ケタールから作成することができる。カンプトテシンは、これらのリンカーを用いてコンジュゲートすることができる１の細胞毒剤である。５〜７員環ケトンからなり、酸素の１つが細胞毒剤に結合しており、他方が抗体結合のためのリンカーに結合しているケタールを用いることもできる。アントラサイクリン類もまた、これらのリンカーと共に使用するのに適当な細胞毒の一例である。
【０１０９】
ｐＨ感受性リンカーのクラスの別の例は、アミド結合に並置されたカルボン酸を有するシス−アコニテート類である。該カルボン酸は、酸性リポソソーム中でアミド加水分解を加速する。いくつかの他の型の構造を有する同様の加水分解速度加速を達成するリンカーもまた、使用できる。マイタンシノイド類は、Ｃ−９に結合したリンカーを用いてコンジュゲートすることのできる細胞毒の一例である。
【０１１０】
薬物コンジュゲートのための別の可能性のある放出方法は、リソソーム酵素によるペプチドの酵素的加水分解である。一例において、ペプチドは、アミド結合を介してパラ−アミノベンジルアルコールに結合し、次いで、カルバメートまたはカルボネートが該ベンジルアルコールと細胞毒剤との間に形成される。ペプチドの開裂は、アミノベンジルカルバメートまたはカルボネートの崩壊または自己犠牲をもたらす。該方法で例示される細胞毒剤は、アントラサイクリン類、タキサン類、マイトマイシンＣおよびオーリスタチン類を包含する。一例において、フェノールもまた、カルバメートの代わりにリンカーの崩壊によって放出されることができる。別の例において、ジスルフィド還元を用いて、パラ−メルカプトベンジルカルバメートまたはカルボネートの崩壊を開始する。
【０１１１】
抗体にコンジュゲートした細胞毒剤の多くは、あったとしても、ほとんど水に対する溶解性がなく、そのことは、コンジュゲートの凝集のために、コンジュゲート上の薬物負荷を制限する可能性がある。これを克服するための１のアプローチは、リンカーに可溶化基を付加することである。ＰＥＧおよびジペプチドからなるリンカーを用いて作製されたコンジュゲートを用いることができ、抗体に結合したＰＥＧ二酸、チオール−酸、またはマレイミド−酸、ジペプチドスペーサー、およびアントラサイクリンまたはドゥオカルマイシン類似物のアミンに結合したアミドを有するコンジュゲートを包含する。別の例は、細胞毒剤に結合したＰＥＧ−含有リンカージスルフィドおよび抗体に結合したアミドを用いて調製されたコンジュゲートである。ＰＥＧ基を組み込むアプローチは、凝集の克服に、および薬物負荷の制限に有益でありうる。
【０１１２】
本発明の抗体／薬物コンジュゲートの調製に好ましい代表的なリンカーは、式：
（ＣＯ−Ａｌｋ１−Ｓｐ１−Ａｒ−Ｓｐ２−Ａｌｋ２−Ｃ（Ｚ１）＝Ｑ−Ｓｐ）
［式中、
Ａｌｋ１およびＡｌｋ２は、独立して、結合または分枝もしくは非分枝（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり、
Ｓｐ１は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＮＲ’−、−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２Ｎ−、または−Ｘ−Ａｒ’−Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−Ｚ
（ここに、Ｘ、ＹおよびＺは独立して、結合、−ＮＲ’−、−Ｓ−または−Ｏ−であり、但し、ｎ＝０のとき、ＹおよびＺの少なくとも１つは結合であり、
Ａｒ’は、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’のうち１、２または３個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−または１，４−フェニレンである）
であり、但し、Ａｌｋ１が結合であるとき、Ｓｐ１は結合であり、
ｎは、０〜５の整数であり、
Ｒ’は、−ＯＨ、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、（Ｃ１−Ｃ３）ジアルキルアミノ、および（Ｃ１−Ｃ３）トリアルキルアンモニウム−Ａ−（ここに、Ａ−は、塩を形成している医薬上許容されるアニオンである）の１または２個の基で置換されていてもよい分枝または非分枝（Ｃ１−Ｃ５）鎖であり、
Ａｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記のとおりである）の１、２または３個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−または１，４−フェニレンであるか、または１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリデンまたは
【化１】
であり、各ナフチリデンまたはフェノチアジンは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記の通りである）の１、２、３または４個の基で置換されていてもよく、但し、Ａｒがフェノチアジンであるとき、Ｓｐ１は窒素にのみ連結した結合であり、
Ｓｐ２は、結合、−Ｓ−、または−Ｏ−であり、但し、Ａｌｋ２が結合であるとき、Ｓｐ２は結合であり；
Ｚ１は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記のとおりである）の１、２または３個の基で置換されていてもよいフェニルであり、
Ｓｐは、直鎖または分枝鎖の二価または三価（Ｃ１−Ｃ１８）基、二価または三価のアリールまたはヘテロアリール基、二価または三価の（Ｃ３−Ｃ１８）シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキル基、二価または三価のアリール−またはヘテロアリール−アリール（Ｃ１−Ｃ１８）基、二価または三価のシクロアルキル−またはヘテロシクロアルキル−アルキル（Ｃ１−Ｃ１８）基、または二価または三価の（Ｃ２−Ｃ１８）不飽和アルキル基であり、ここに、ヘテロアリールは、好ましくは、フリル、チエニル、Ｎ−メチルピロリル、ピリジニル、Ｎ−メチルイミダゾリル、オキサゾリル、ピリミジニル、キノリル、イソキノリル、Ｎ−メチルカルバゾイル、アミノクマリニル、またはフェナジニルであり、ここに、Ｓｐが三価の基である場合、Ｓｐは、低級（Ｃ１−Ｃ５）ジアルキルアミノ、低級（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、ヒドロキシまたは低級（Ｃ１−Ｃ５）アルキルチオ基によって付加的に置換されていてもよく、
Ｑは、＝ＮＨＮＣＯ−、＝ＮＨＮＣＳ−、＝ＮＨＮＣＯＮＨ−、＝ＮＨＮＣＳＮＨ−、または＝ＮＨＯ−である］
のリンカーを包含する。
【０１１３】
好ましくは、Ａｌｋ１は、分枝または非分枝（Ｃ１−Ｃ１０）アルキレン鎖であり、Ｓｐ’は、結合、−Ｓ−、−Ｏ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、または−ＮＲ’（ここに、Ｒ’は上記の通りである）であり、但し、Ａｌｋ１が結合であるとき、Ｓｐ１は結合であり、
Ａｒは、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’（ここに、ｎおよびＲ’は上記の通りである）の１、２または３個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−、または１，４−フェニレンであるか、またはＡｒは、各々、（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、（Ｃ１−Ｃ５）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２、３または４個の基で置換されていてもよい１，２−、１，３−、１，４−、１，５−、１，６−、１，７−、１，８−、２，３−、２，６−、または２，７−ナフチリデンであり、
Ｚ１は、（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、または（Ｃ１−Ｃ５）アルキル、（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ４）チオアルコキシ、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＲ’、−ＣＯＮＨＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＯＲ’、−Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’、および−Ｓ（ＣＨ２）ｎＣＯＮＨＲ’の１、２または３個の基で置換されていてもよいフェニルであり、
Ａｌｋ２およびＳｐ２は、一緒になって結合を形成し、ＳｐおよびＱは、すぐ上で定義した通りである。
【０１１４】
米国特許第５，７７３，００１号は、全体として本明細書の一部とされるが、カリケアマイシン類から調製される求核性薬物、特にヒドラジドおよび関連する求核性分子と共に使用されうるリンカーを開示する。これらのリンカーは、特に、薬物とリンカーとの間に形成される結合が加水分解可能であるとき、より良好な活性が得られる場合に有用である。これらのリンカーは、（１）抗体と反応するための基（例えば、カルボン酸）、および（２）薬物と反応するためのカルボニル基（例えば、アルデヒドまたはケトン）を包含する２つの官能基を含有する。カルボニル基は、薬物上のヒドラジド基と反応してヒドラゾン結合を形成しうる。該結合は、加水分解可能であり、その結果、標的細胞に結合後に、コンジュゲートからの治療剤の放出を可能にする。
【０１１５】
一例として、抗−５Ｔ４抗体は、（１）細胞毒性薬物誘導体を抗−５Ｔ４抗体に加え、ここに、該細胞毒性薬物はタンパク質性担体の４．５％−１１重量％であり、（２）該細胞毒性薬物誘導体および抗−５Ｔ４抗体を、約ｐＨ７〜９の非求核性タンパク質適合性バッファー溶液中でインキュベートして、一量体細胞毒性薬物／抗体コンジュゲートを生産し、ここに、該溶液はさらに、（ａ）適当な有機共溶媒および（ｂ）少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩を含む添加剤を含み、ここに、該インキュベーションは約３０℃〜約３５℃にて約１５分〜２４時間実施され、（３）工程（２）で生産されたコンジュゲートをクロマトグラフィー分離過程に付して、３重量％〜１０重量％の負荷量の細胞毒性薬物を有し、かつ、１０％未満の低コンジュゲートフラクション（ＬＣＦ）を有するおよび一量体コンジュゲートを、コンジュゲートしていない抗体、細胞毒性薬物誘導体および凝集したコンジュゲートから分離することによって、細胞毒性薬物にコンジュゲートされうる。
【０１１６】
工程（３）のクロマトグラフィー分離工程は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、限外ろ過／ダイアフィルトレーション（diafiltration）、ＨＰＬＣ、ＦＰＬＣまたはＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−２００クロマトグラフィーなどの過程を包含することができる。該クロマトグラフィー分離は、また、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｂｕｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｏｃｔｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー媒体、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、Ｍａｃｒｏ−ＰｒｅｐメチルＨＩＣ媒体またはＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｔ−ブチルＨＩＣ媒体を用いる、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって達成されうる。
【０１１７】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを調製するための代表的な方法は、同時継続中の米国特許出願公開第２００４−０８２７６４Ａ１号および米国特許出願第１０／６９９，８７４号（全体として本明細書の一部とされる）においてＣＭＣ−５４４の調製に関して記載された方法を包含する。コンジュゲーションは、下記の条件：１０ｍｇ／ｍｌ抗体、８．５％（ｗ／ｗ）カリケアマイシン誘導体、３７．５ｍＭデカン酸ナトリウム、９％（ｖ／ｖ）エタノール、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、ｐＨ８．５、３２℃、１時間を用いて行ってもよい。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）は、ブチルセファロースＦＦ樹脂、０．６５Ｍリン酸カリウムローディングバッファー、０．４９Ｍリン酸カリウム洗浄バッファー、および４ｍＭリン酸カリウム溶出バッファーを用いて実施してもよい。バッファー交換は、サイズ排除クロマトグラフィー、限外ろ過／ダイフィルトレーション、または他の適当な手段によって達成されうる。抗体／薬物コンジュゲートは、１．５％Ｄｅｘｔｒａｎ−４０、０．９％シュークロース、０．０１％ＴＷＥＥＮＲ−８０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で処方されうる。５％シュークロース、０．０１％ＴＷＥＥＮＲ−８０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含有する別の処方溶液もまた用いてもよい。凍結乾燥サイクルは、処方に基づいて調整される。処方されたバルクの濃度は、０．５ｍｇコンジュゲート／ｍｌであってもよい。各バイアルは、１ｍｇのコンジュゲート、すなわち２ｍｌ充填量を含有しうる。所望により、他の充填容量、例えば５ｍｌ充填量で調製してもよい。
【０１１８】
他の代表的な方法は、米国特許出願公開第２００６０００２９４２号にも記載されるＣＭＤ−１９３に関して記載された方法を包含する。コンジュゲーションは、下記の条件：１０ｍｇ／ｍｌ抗体、７％（ｗ／ｗ）カリケアマイシン誘導体、１０ｍＭデオキシコレート、５０ｍＭ ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸））、９％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ８．２、３２℃、１時間を用いて実施されうる。該反応物は、０．６６Ｍリン酸カリウム、ｐＨ８．５６で１０倍希釈されてもよく、ＨＩＣは、ブチルセファロースＦＦ樹脂、０．６０Ｍリン酸カリウムローディングバッファーおよび洗浄バッファー、および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／２５ｍＭ ＮａＣｌ溶出バッファーを用いて実施してもよい。バッファー交換は、再生セルロース膜を用いる限外ろ過／ダイフィルトレーションを用いて達成されうる。コンジュゲートは、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０（１０ダイアボリューム）に対してダイアフィルトレーションされうる。抗体／薬物コンジュゲートは、５％シュークロース、０．０１％ＴＷＥＥＮＲ−８０、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ／１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で処方されうる。処方後のバルクコンジュゲートの濃度は、１ｍｇ／ｍｌであってもよく、バイアル充填量は５ｍｇ／バイアル、すなわち５ｍｌ充填量であってもよく、または所望により、他の充填容量で調製されてもよい。
【０１１９】
本発明の特定の具体例において、用いられるリンカーは、４−（４−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）である。抗体／薬物コンジュゲートは、β−カリケアマイシン、γ−カリケアマイシンまたはＮ−アセチルγ−カリケアマイシン、またはその誘導体を３−メルカプト−３−メチルブタノイルヒドラジド、ＡｃＢｕｔリンカーおよび本発明の抗−５Ｔ４抗体と反応させることによって調製される。例えば、米国特許第５，７７３，００１号を参照のこと。該リンカーは、循環中において実質的に安定であり、その結果、１日につきおよそ２％のＮＡｃ−ガンマＤＭＨを放出し、酸性リソソーム中で容易にＮＡｃ−ガンマＤＭＨを放出するコンジュゲートを生産する。本発明の他の具体例において、抗体／薬物コンジュゲートは、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）または４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）をリンカー分子として用いて調製される。
【０１２０】
放射性同位元素のコンジュゲーションに有用な代表的なリンカーは、ジエチレントリアミンペンタセテート（ＤＴＰＡ）−イソチオシアネート、スクシンイミジル６−ヒドラジニウムニコチネート塩酸塩（ＳＨＮＨ）、およびヘキサメチルプロピレンアミドオキシム（ＨＭＰＡＯ）を包含する（Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28: 741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270、米国特許第６，０２４，９３８号）。別法では、標的分子は、放射性同位元素が直接それに結合されうるように誘導体化されうる（Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300）。負荷方法もまた、当該分野で知られており、代表的なプロトコールは、例えば、Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 およびBakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-9において見出されうる。
【０１２１】
抗体／薬物コンジュゲートあたりの薬物分子の数をさらに増やすために、薬物は、直鎖または分枝鎖ポリエチレングリコールポリマーおよびモノマーを包含するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）にコンジュゲートされてもよい。ＰＥＧモノマーは、式−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−で示される。薬物および／またはペプチド類似物は、ＰＥＧに直接または間接的に、すなわち、糖類などの適当なスペーサー基を介して結合されうる。ＰＥＧ／抗体／薬物組成物は、また、薬物安定性およびイン・ビボでの標的部位への送達を促進するために、付加的な脂肪親和性および／または親水性基を含んでいてもよい。ＰＥＧ−含有組成物の調製のための代表的な方法は、なかでも、米国特許第６，４６１，６０３号、第６，３０９，６３３号および第５，６４８，０９５号に見出されうる。
【０１２２】
例えば、抗体−カリケアマイシンコンジュゲートにおけるカリケアマイシンの量を増加するために、例えば、ＰＥＧ−ＳＰＡ、ＰＥＧ−ＳＢＡまたはＰＥＧ−ビス−マレイミドを用いて、抗体をＰＥＧにコンジュゲートした後に、カリケアマイシンとコンジュゲートする。ＰＥＧを用いて調製された抗体／薬物コンジュゲートは、標的抗原に対する結合アフィニティーの減少を示すが、薬物負荷量の増加の結果としてまだ効果的である。デオキシコレートおよびデカノエートなどの添加物を用いて、低レベルのコンジュゲートされていない抗体および低レベルの凝集物を伴う抗体／カリケアマイシンコンジュゲートを生産してもよい。
【０１２３】
カリケアマイシンを包含する多くの薬物の疎水性の性質は、抗体／薬物コンジュゲートの凝集をもたらしうる。より高い薬物負荷／収率を有し、かつ、凝集の少ない一量体抗体／薬物コンジュゲートを生産するために、コンジュゲーション反応は、（ｉ）共溶媒としてプロピレングリコールおよび（ｉｉ）少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸を含む添加物を含有する非求核性のタンパク質適合性バッファー溶液中で実施されうる。有用な酸は、Ｃ７〜Ｃ１２酸、例えば、オクタン酸またはカプリル酸またはその塩を包含する。プロピレングリコール以外の他のタンパク質適合性有機共溶媒、例えば、エチレングリコール、エタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳなどもまた、使用されうる。有機共溶媒のいくつか、または全てを用いて、薬物をコンジュゲーション混合物中に移動させる。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＯＳｕ）エステルまたは他の同等に活性化されたエステルを用いる抗体／薬物コンジュゲートの調製に有用なバッファーは、リン酸緩衝化セーライン（ＰＢＳ）およびＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳバッファー）を包含する。コンジュゲーション反応に用いられる緩衝溶液は、実質的に、遊離アミンおよび求核性分子を含有しない。別のアプローチとして、コンジュゲーション反応は、付加的な添加剤を含有せず、ｔ−ブタノールを含有する非求核性のタンパク質適合性緩衝溶液中で行ってもよい。例えば、米国特許第５，７１２，３７４号および第５，７１４，５８６号を参照のこと。コンジュゲーションのための付加的な方法およびカリケアマイシン含有コンジュゲートは、米国特許第５，７３９，１１６号および第５，８７７，２９６号に記載されている。
【０１２４】
一量体コンジュゲートの形成のための最適な反応条件は、温度、ｐＨ、カリケアマイシン誘導体投入量および添加物濃度などの反応変量の変動によって、経験的に決定されうる。プロピレングリコールの代表的な量は、全溶液容量の１０％〜６０％、例えば、１０％〜４０％、または約３０％の範囲である。少なくとも１つのＣ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩を含む添加剤の代表的な量は、２０ｍＭ〜１００ｍＭ、例えば、４０ｍＭ〜９０ｍＭ、または約６０ｍＭ〜９０ｍＭの範囲である。Ｃ６−Ｃ１８カルボン酸またはその塩の濃度は、１５０−３００ｍＭに増加してもよく、共溶媒は１％〜１０％に低下してもよい。本発明の代表的な具体例において、カルボン酸は、オクタン酸、デカン酸、またはその対応する塩である。例えば、２００ｍＭカプリル酸は、５％プロピレングリコールまたはエタノールと共に使用されうる。コンジュゲーション反応は、わずかに高温（３０−３５℃）にて、ｐＨ（８．２−８．７）で行ってもよい。抗体の濃度は、１〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲であってもよく、カリケアマイシン誘導体、例えば、Ｎ−アセチルガンマ−カリケアマイシンＤＭＨ ＡｃＢｕｔ ＯＳｕエステルの濃度は、抗体の約４．５重量％〜１１重量％の範囲であってもよい。他の薬物のコンジュゲーションのための適当な条件は、過度の実験を行うことなく、当業者によって決定されうる。
【０１２５】
ＩＩＩ．Ｃ．抗体／薬物コンジュゲートの精製
コンジュゲーション後、一量体コンジュゲートは、常法により、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＣ）またはクロマトフォーカシング（ＣＦ）によって、コンジュゲートされていない反応物質および／または凝集形態のコンジュゲートから分離されうる。精製されたコンジュゲートは、一量体であり、通常、３重量％〜１０重量％の薬物を含有する。抗体／薬物コンジュゲートは、また、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて精製してもよく、該クロマトグラフィーは、（１）ＬＣＦ含量および凝集物を効率良く減らすための能力、（２）大量の反応容量に適応すること、および（３）生成物の最小限の希釈を包含する、ＳＥＣを越えるいくつかの利点を提供する。生産規模での使用に適当な大容量ＨＩＣ媒体は、フェニル・セファロース６ファースト・フロークロマトグラフィー媒体、ブチル・セファロース４ファースト・フロークロマトグラフィー媒体、オクチル・セファロース４ファースト・フロークロマトグラフィー媒体、トヨパール（Toyopearl）・エーテル−６５０Ｍクロマトグラフィー媒体、マクロ−プレプ（Macro-Prep）メチルＨＩＣ媒体またはマクロ−プレプｔ−ブチルＨＩＣ媒体を包含する。限外ろ過／ダイフィルトレーションもまた、バッファー交換に使用されうる。
【０１２６】
代表的な精製過程において、遠心分離細胞除去工程、プロテインＡアフィニティー捕捉工程および続く１または２回の直交クロマトグラフィーポリッシング（polishing）工程、ウイルスろ過工程、および濃縮および処方のためのタンジェンシャル・フロー（tangential flow）ろ過工程を包含する複数の工程が実施される。精製過程は、好ましくは、５％未満の凝集物、２０ｐｐｍ未満のプロテインＡ、５０ｐｐｍ未満の宿主細胞タンパク質、および全回収率が５０％を越える生成物を生じる。
【０１２７】
典型的な抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシン調製物は、主に（〜９５％）、抗体１モルあたり５〜７モルのカリケアマイシンを含有するコンジュゲートされた抗体を含有する。該コンジュゲートは、研究室規模（１０−２００ｍｇ）で再生可能に調製された。モノクローナル抗体１ｍｇあたりのカリケアマイシンμｇとして表される薬物負荷量は、カリケアマイシン濃度（μｇ／ｍＬ）を抗体濃度（ｍｇ／ｍＬ）で割ることによって決定される。これらの値は、２８０ｎｍおよび３１０ｎｍでのコンジュゲート溶液のＵＶ吸光度を測定することによって決定される。これは平均負荷量であって、実際の負荷量は、平均負荷値に中心のある疑似ガウス（quasi-gaussian）分布であり、すなわち、抗体のいくつかは平均より高く負荷され、抗体のいくつかは平均より低く負荷されることに注意することが重要である。コンジュゲートされていない抗体（低コンジュゲートフラクション）とは、分析的ＨＩＣ−ＨＰＬＣ（疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー）を用いて測定することができるが、わずかにコンジュゲートされたか、またはコンジュゲートされていないカリケアマイシンを有する抗体の集団である。該値は、抗体におけるカリケアマイシン分布の測定値であり、一般に、投与されるカリケアマイシン量に影響を及ぼさない。コンジュゲートされていないカリケアマイシンとは、ＥＬＩＳＡを用いて測定することができるが、抗体にコンジュゲートされていないカリケアマイシンの量をいい、全カリケアマイシンに対するパーセントで表される。薬物負荷アッセイは、コンジュゲートされていないカリケアマイシンとコンジュゲートされたカリケアマイシンとを区別しない。コンジュゲートされていないカリケアマイシンの量は、薬物負荷アッセイを用いた場合、検出不可能であるか、または無視されるので、これらのアッセイは、コンジュゲートされたカリケアマイシンの量を効果的に測定する。
【０１２８】
分析方法は、ヒト化抗−５Ｔ４カリケアマイシンコンジュゲートの放出および安定性試験に関してアッセイするために使用することができる。該コンジュゲートは、同一性（ＩＥＦ）、強度（全タンパク質および全カリケアマイシン負荷）、純度（コンジュゲートされていないカリケアマイシン、低コンジュゲート抗体、凝集物含量および還元されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および免疫アフィニティー（抗原結合ＥＬＩＳＡ）について、評価することができる。当業者に既知の付加的なアッセイを使用することができる。これらのアッセイを用いて、バッチ−トゥ−バッチ（batch-to-batch）コンシステンシーを商業的製造において維持することができる。
【０１２９】
ＩＩＩ．Ｄ．抗体／薬物コンジュゲートの薬物動力学
５Ｔ４−標的化免疫コンジュゲートの薬物動力学を評価することができ、種々の動物におけるコンジュゲートされていないカリケアマイシンの薬物動力学と比較することができる。例えば、これは、雌ヌードマウス、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットおよび雌カニクイザル（cynomologus monkey）において、単回静脈内ボーラス投与後に行うことができる。抗−５Ｔ４抗体の薬物動力学は、一般に、低クリアランス、低容量の分布、および様々な種における見かけ上長期間の半減期によって特徴付けられる。コンジュゲートされていないカリケアマイシン誘導体の血清濃度は、定量限界よりも低いと予想される。単回投与量の毒性決定研究におけるこれらのコンジュゲートの毒性プロファイルは、比較可能な投与量にて、他の抗体／カリケアマイシンコンジュゲートに関して得られたプロファイルに類似すると予想される。
【０１３０】
ＩＶ．抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの特徴付けのための機能的アッセイ
本発明は、さらに、５Ｔ４結合活性、細胞表面上に存在する５Ｔ４抗原への結合後の細胞性内在化、および対象における５Ｔ４発現細胞の標的化を包含する、抗−５Ｔ４抗体の活性を特徴付けるためのイン・ビトロおよびイン・ビボアッセイを開示する。細胞毒にコンジュゲートする場合、本発明の開示される抗体は、５Ｔ４発現性癌細胞の成長阻害および／または５Ｔ４発現性細胞における細胞死の誘導を包含する抗癌活性を誘導しうる。本発明の抗−５Ｔ４抗体は、１以上の外来性活性を含んでいてもよい。
【０１３１】
５Ｔ４抗原に対する抗−５Ｔ４抗体の結合を検出するための技術は、当該分野で知られており、例えば、実施例２に記載されるようなＢＩＡＣＯＲＥＲアッセイを包含する。付加的な代表的技術は、遠心分離、アフィニティークロマトグラフィーおよび他の免疫化学的方法を包含する。例えば、Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, United States of America; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, Amsterdam/New Yorkを参照のこと。抗原結合アッセイは、単離した５Ｔ４抗原または５Ｔ４発現性細胞を用いて行ってもよい。実施例２を参照のこと。
【０１３２】
抗−５Ｔ４抗体の結合特異性は、さらに、結合エピトープの限定、すなわち、抗原結合に関係する非隣接残基を包含する残基の同定、および／または抗原結合に影響を及ぼす残基の限定によって記載されうる。実施例４−５を参照のこと。
【０１３３】
抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの５Ｔ４発現性細胞による内在化は、５Ｔ４発現性細胞の表面に結合した抗体またはコンジュゲートの量を経時的に観察することによってアッセイされうる。抗体および抗体／薬物コンジュゲートの膜局在性を評価するための代表的な技術は、実施例３に記載される。
【０１３４】
機能的アッセイは、また、抗体／薬物コンジュゲートの抗癌活性、例えば、現存する癌細胞を破壊する能力、または癌細胞の成長を遅らせるか、もしくは妨げる能力を評価するための方法を包含する。本発明の抗体／薬物コンジュゲートによって標的化される癌は、原発性腫瘍および転移腫瘍の両方、ならびに白血病およびリンパ腫などの癌腫および造血系悪性腫瘍を包含する対象におけるいずれかの組織の癌腫を包含する。
【０１３５】
成長阻害活性を有する抗−５Ｔ４抗体は、５Ｔ４発現性細胞を排除することができるか、または５Ｔ４発現性細胞の増殖を妨げるか、もしくは減少させることができる。細胞成長阻害の迅速なイン・ビトロ評価のための代表的な方法は、Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98に記載されている。
【０１３６】
抗−５Ｔ４抗体は、また、細胞死、例えば、核ＤＮＡ分解、核退化および凝縮、膜完全性の喪失、および食作用によって特徴付けられるプログラム細胞死を誘導する能力を含んでいてもよい。細胞を評価するための代表的なアッセイは、Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885に記載されている。
【０１３７】
例えば、抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性をイン・ビトロで評価するために、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現しているヒト乳癌細胞）およびＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞（対照細胞）を、特にBoghaert et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10: 4538-4549に記載されているように、抗体−カリケアマイシンコンジュゲートの存在下または遊離カリケアマイシンの存在下で培養する。各剤の細胞毒性は、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として報告され、ＥＤ５０は、非処理対照と比べて細胞培養物の５０％減少を引き起こすコンジュゲートまたは遊離の薬剤として与えられたカリケアマイシンの量である。培養中の細胞数は、薬物曝露後に生体染色色素（ＭＴＳ）を用いて決定される。実施例６も参照のこと。
【０１３８】
抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性は、また、スフェロイド成長に適当な方法で培養されたＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４およびＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ細胞を用いて評価されうる。細胞は、抗体／カリケアマイシンコンジュゲートまたは遊離カリケアマイシンの存在下で培養し、薬物曝露後、各スフェロイドの寸法を決定した。スフェロイド成長の阻害における各薬剤の効率は、ＥＤ５０（ｎｇ／ｍｌ）として、すなわち、非処理対照と比べてスフェロイド成長の５０％阻害を引き起こすコンジュゲートまたは遊離薬物として与えられたカリケアマイシンの量として報告される。実施例６を参照のこと。
【０１３９】
抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性をイン・ビボで評価するために、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト５Ｔ４抗原を過剰発現しているヒト乳癌細胞）、ＮＣＩ−Ｈ１５７細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）、ＰＣ１４ＰＥ６細胞（ヒト非小細胞肺癌細胞）またはＮ８７細胞（ヒト胃癌細胞）の皮下注射によって、ヌードマウス中で腫瘍を調製する。抗体／カリケアマイシンコンジュゲートおよび対照化合物を腫瘍を有するマウスに、例えば、腹膜内注射によって、４日間隔で全３回、例えば、１、５および９日目に投与する。測定可能な治療結果は、腫瘍細胞成長の阻害を包含する。
【０１４０】
さらに抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートの標的化能力を評価するために、本質的にOnn et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9(15):5532-5539に記載のように、非小細胞および小細胞癌のための同所性モデルを用いてもよい。簡単に言うと、ヒト肺腺癌（ＰＣ１４ＰＥ６）細胞をヌードマウスの尾部静脈中に注射し、次いで、それが移動して肺に腫瘍を形成する。腫瘍は、肺実質における充実性結節として現れ、浮遊した腫瘍細胞を含有する血性胸水を引き起こしうる。対照化合物および抗体／カリケアマイシンコンジュゲートを腫瘍を有するマウスに、例えば、腫瘍細胞の注射後６日目に開始する４日間隔で全３回、例えば、６、１０および１４日目の腹膜内注射によって投与される。測定可能な治療結果は、胸水の減少および生存数の増加を包含する。
【０１４１】
Ｖ．抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの使用
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートは、５Ｔ４発現性性細胞に関連した適用について、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で有用である。５Ｔ４を発現している癌は、扁平上皮／腺腫様肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頚癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛癌を包含する。５Ｔ４は、気管支、胸、結腸、直腸、胃、子宮頚、子宮内膜、膵臓、卵巣、絨毛膜（chorium）および精嚢において高レベルで検出される。
【０１４２】
Ｖ．Ａ．イン・ビトロ適用
本発明は、イン・ビトロで抗−５Ｔ４抗体を用いる方法を提供する。例えば、開示される抗体は、５Ｔ４陽性癌細胞を特異的に結合してかかる細胞を細胞試料から枯渇させるために、単独または細胞毒性剤または他の薬物と組み合わせて使用してもよい。５Ｔ４発現性細胞と、細胞毒にコンジュゲートした抗−５Ｔ４抗体を含む抗体／薬物コンジュゲートとの接触を介して、アポトーシスおよび／または細胞増殖阻害を誘導するための方法もまた、提供される。代表的なイン・ビトロでの方法は、本明細書中、「抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートの特徴付けのための機能的アッセイ」と見出しを付けて上記される。
【０１４３】
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、また、５Ｔ４抗原に特異的に結合する能力に基づいて、イン・ビトロでの５Ｔ４陽性細胞の検出における有用性を有する。５Ｔ４発現性細胞を検出する方法は、（ａ）細胞を含む生物学的試料を調製し、（ｂ）抗−５Ｔ４抗体を生物学的試料とイン・ビトロで接触させ、次いで（ｃ）抗−５Ｔ４抗体の結合を検出することを含んでいてもよい。検出を容易化するために、抗体は標識にコンジュゲートされていてもよい。
【０１４４】
Ｖ．Ｂ．イン・ビボでの検出および診断
本発明の抗−５Ｔ４抗体は、また、例えば、診断に役立つので、イン・ビボ検出方法に使用してもよく、術中の援助を提供するために、または用量決定のために使用してもよい。標識された抗−５Ｔ４抗体の対象への投与後、および結合に十分な時間の経過後、抗体によって結合された５Ｔ４発現性細胞の生体分布を視覚化してもよい。開示される診断方法は、治療方法と組み合わせて使用してもよい。さらに、本発明の抗−５Ｔ４抗体は、検出および治療という二重の目的で投与されてもよい。
【０１４５】
代表的な非浸襲性検出方法は、シンチグラフィー（例えば、ＳＰＥＣＴ（単光子放出コンピューター断像撮影）、ＰＥＴ（ポジトロン放出断像撮影）、ガンマカメラ画像化、および直線走査）、磁気共鳴画像化（例えば、従来の磁気共鳴画像化、磁化移動画像化（ＭＴＩ）、プロトン磁気共鳴分光学（ＭＲＳ）、拡散強調画像化（ＤＷＩ）および機能的ＭＲ画像化（ｆＭＲＩ））、および超音波を包含する。
【０１４６】
Ｖ．Ｃ．治療的適用
本発明は、さらに、対象において５Ｔ４発現性癌細胞の細胞溶解を誘導するために有用な方法および組成物に関する。本発明の抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートは、癌細胞および非腫瘍性増殖障害、例えば、過形成、化生または最も特別には、異形成の細胞の成長を阻害するのに有用である（かかる異常な成長障害の概要については、DeVita, Jr. et a. (2001), Cancer: Principles and Practice, 6th edition, Lippincott Williams ＆ Wilkinsを参照のこと）。
【０１４７】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを用いる標的化に適当な癌は、胸、結腸、直腸、肺、中咽頭、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、胆管、小腸、腎臓、膀胱および尿路上皮を包含する尿道、女性の生殖管、子宮頚、子宮、卵巣、男性の生殖管、前立腺、精嚢、精巣、内分泌腺、甲状腺、副腎、下垂体、皮膚、骨、軟組織、血管、脳、神経、眼、髄膜における５Ｔ４発現性原発性および転移性腫瘍を包含する。他の関連する癌は、無痛性、進行性、低悪性度、中程度の悪性度、または高悪性度の白血病またはリンパ腫を包含する５Ｔ４発現性白血病およびリンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）である。
【０１４８】
特に、５Ｔ４は、扁平上皮／腺腫様肺癌（非小細胞肺癌）、浸潤性乳癌、結腸直腸癌、胃癌、扁平上皮子宮頚癌、浸潤性子宮内膜腺癌、浸潤性膵臓癌、卵巣癌、扁平上皮膀胱癌、および絨毛癌の細胞において発現されることが知られている。５Ｔ４は、気管支、胸、結腸、直腸、胃、子宮頚、子宮内膜、膵臓、卵巣、絨毛膜（chorium）および精嚢において高レベルで検出される。５Ｔ４抗原の細胞表面分布は、均一または不均一であってもよい。結腸直腸癌、胃癌および卵巣癌において、５Ｔ４の発現は、疾患の進行に直接関係する。乳癌において、転移性節における増加した５Ｔ４染色強度が観察されるが、５Ｔ４発現は疾患段階と相関しない。癌は、また、胸、結腸、胃、食道、膵臓、十二指腸、肺、膀胱および腎臓癌ならびに胃および小島細胞神経内分泌腫瘍を包含するルイスＹ炭水化物抗原を発現しうる。米国特許第６，３１０，１８５号を参照のこと。
【０１４９】
かくして、本発明の抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートで処理すべき患者は、限定するものではないが、５Ｔ４抗原の発現増加を包含する生体マーカー発現に基づいて選択されてもよく、その結果、腫瘍の起源または組織学よりもむしろ豊富な標的発現について選択された患者集団をもたらす。標的発現は、細胞染色強度と組み合わせた細胞染色数の関数として測定されることができる。例えば、高発現の５Ｔ４の分類は、５Ｔ４について陽性の免疫組織化学的染色によって試験された細胞の３０％よりも多く（すなわち、４０％、５０％または６０％）が３＋（１〜４のスケール）のレベルである患者を包含し、一方、５Ｔ４の中程度の発現は、細胞の２０％よりも多くが１＋〜２＋で細胞染色された患者を包含することができる。
【０１５０】
例えば、多剤耐性（ＭＤＲ）に基づく腫瘍の特徴付けを包含する５Ｔ４抗原の発現以外の生体マーカーもまた、患者選択のために使用することができる。ヒト癌のおよそ５０パーセントは、化学療法に対して完全に耐性であるか、または一時的にしか応答せず、その後、一般に使用される抗癌剤によってもはや影響を受けない。該現象は、ＭＤＲとも称し、いくつかの種類の腫瘍によって生得的に発現されるが、他の種類の腫瘍は、化学療法処理に曝露後にＭＤＲを獲得する。薬物流出ポンプＰ−糖タンパク質は、細胞毒性化学療法に関連するＭＤＲの大部分の媒介となる。癌患者腫瘍試料に存在するＭＤＲメカニズムの表現型的および機能的分析は、特定のＭＤＲメカニズムを特定の種類の腫瘍における化学療法耐性に関連づけるために行うことができる。
【０１５１】
癌成長または異常な増殖は、より進行した癌形態または病態への細胞内変化を示唆するいくつかの指標のうちのいずれか１つを示す。癌細胞または非腫瘍性増殖障害の細胞の成長の阻害は、当該分野で知られた方法によって、例えば、腫瘍成長の遅延および転移阻害によってアッセイされうる。癌成長の阻害を測定するための他の指標は、癌細胞生存における減少、腫瘍容量または形態の減少（例えば、コンピューター断像撮影（ＣＴ）、音波ホログラフィー、または他の画像化方法を用いて決定される）、腫瘍脈管構造の破壊、遅延型皮膚過敏性試験における改善された動態、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性増加、および腫瘍特異的抗原レベルの減少を包含する。
【０１５２】
いずれか１つの様式の操作によって縛られることは望ましくないが、抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートの抗原−誘導性標的化ならびに受動的な標的化の両方が抗腫瘍効力に寄与しうる。抗原−誘導性標的化とは、対照組織（すなわち、実質的に５Ｔ４発現性細胞および投与された抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの結合および／または蓄積が欠くと推測される組織）と比べて、標的組織（すなわち、５Ｔ４発現性細胞、および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの蓄積が意図される部位を含む組織）におけるペプチドまたはペプチド類似物の優先的な移動および／または蓄積をいう。抗体／薬物コンジュゲートの優先的な局在化は、一般的に、標的組織における抗体／薬物コンジュゲートの量が対照組織における抗体／薬物コンジュゲートの量よりも約２倍多いような場合であり、例えば、約５倍以上、または約１０倍以上多いような場合である。
【０１５３】
受動的標的化とは、一般に、脈管構造における局所的変化に起因する腫瘍部位での抗体または抗体／薬物コンジュゲートの封鎖をいう。例えば、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、腫瘍部位で脈管構造（該構造はＶＥＧＦ産生増加のために有窓である）を離れ、５Ｔ４発現性細胞に結合して、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの内在化を引き起こしうる。腫瘍の乏しい静脈およびリンパドレナージもまた、結合していない５Ｔ４／薬物コンジュゲートの捕捉をもたらす。酸に不安定なリンカーを用いて薬物にコンジュゲートされた抗体は、薬物を放出することができ、次いで、腫瘍細胞中に拡散することができる。受動的標的化の抗腫瘍効果は、永続的ではなく、または抗原−誘導性標的化によって誘導される効果ほど強力ではないが、全体的な効力に寄与しうる。
【０１５４】
Ｖ．Ｄ．処方
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、容易に調製され、安全かつ効力のある臨床的使用のために処方される。対象に投与するための適当な処方は、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサール）、処方を意図されるレシピエントの体液と等張にするための溶質（例えば、糖類、塩類およびポリアルコール類）、懸濁化剤および増粘剤を含有しうる水性および非水性滅菌注射溶液を包含する。適当な溶媒は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、およびその混合物を包含する。該処方は、単位投与または多回投与用容器中、例えば、密閉したアンプルおよびバイアル中で提供してもよく、対象への投与のために使用する直前に滅菌液体担体の添加のみを必要とする冷凍または凍結乾燥された状態で、またはその後、意図される適用に適当な同位元素で放射能標識されるために、保管されてもよい。本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートは、好ましくは、下記のような有効投与量として処方される。
【０１５５】
一例として、代表的な抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート処方は、４０ｍｇ／ｍｌ抗体または抗体／薬物コンジュゲート、２５ｍＭアセテート、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、０．０２％ポリソルベート２０、ｐＨ５．０の多回投与用処方を含み、それは、最小限の保管寿命が２−８℃保管で２年である。別の例として、抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート処方は、９．０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０および滅菌水、ｐＨ６．５中において、１０ｍｇ／ｍｌ抗体または抗体／薬物コンジュゲートを含んでいてもよい。実験的なマウスモデルに投与するための抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの代表的な処方は、２μｇまたは４μｇカリケアマイシンを含み（実施例３、４および７参照）、それに応じて、ヒトへの投与のために増減させればよい。
【０１５６】
抗−５Ｔ４抗体または抗体／薬物コンジュゲートの安定な凍結乾燥処方は、（ａ）抗体／薬物コンジュゲートを最終濃度０．５〜２ｍｇ／ｍｌまで、１．５重量％〜５重量％の凍結防止剤、０．５−１．５重量％のポリマー増量剤、０．０１Ｍ〜０．１Ｍの電解質、０．００５重量％〜０．０５重量％の溶解促進剤、溶液の最終ｐＨが７．８−８．２になるように５−５０ｍＭの緩衝化剤、および水を含む溶液中に溶解し、（ｂ）上記溶液を、＋５℃〜＋１０℃にてバイアル中に分注し、（ｃ）−３５℃〜−５０℃の冷凍温度で該溶液を冷凍し、（ｄ）該冷凍溶液を第１乾燥圧力２０〜８０ミクロンにて、棚温度−１０℃〜−４０℃で２４〜７８時間、最初の凍結乾燥工程に付し、次いで、（ｅ）工程（ｄ）の凍結乾燥産物を乾燥圧力２０〜８０ミクロンにて、棚温度＋１０℃〜＋３５℃で１５〜３０時間、第２の乾燥工程に付すことによって、調製されうる。
【０１５７】
凍結防止剤の凍結乾燥に有用な代表的な凍結防止剤は、アルジトール、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ポリエチレングリコール、アルドン酸、ウロン酸、糖酸（aldaric acid）、アルドース、ケトース、アミノ糖、アルジトール、イノシトール、グリセルアルデヒド、アラビノース、リキソース、ペントース、リボース、キシロース、ガラクトース、グルコース、ヘキソース、イドース、マンノース、タロース、ヘプトース、グルコース、フラクトース、グルコン酸、ソルビトール、ラクトース、マンニトール、メチルα−グルコピラノシド、マルトース、イソアスコルビン酸、アスコルビン酸、ラクトン、ソルボース、グルカル酸、エリトロース、トレオース、アラビノース、アロース、アルトロース、グロース、イドース、タロース、エリトルロース、リブロース、キシルロース、プシコース、タガトース、グルクロン酸、グルコン酸、グルカル酸、ガラクツロン酸、マンヌロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、シュークロース、トレハロース、ノイラミン酸、アラビナン、フルクタン、フカン、ガラクタン、ガラクツロン、グルカン、マンナン、キシラン、レバン、フコイダン、カラギーナン、ガラクトカロロース、ペクチン、ペクチン酸、アミロース、プルラン、グリコーゲン、アミロペクチン、セルロース、デキストラン、プスツラン、キチン、アガロース、ケラチン、コンドロイチン、デルマタン、ヒアルロン酸、アルギン酸、キサンタンガム、デンプン、シュークロース、グルコース、ラクトース、トレハロース、エチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセロール、およびペンタエリストリトールを包含する。
【０１５８】
例えば、凍結防止剤シュークロースは、１．５重量％の濃度で使用してもよく、ポリマー増量剤デキストラン４０またはヒドロキシエチルデンプン４０は、０．９重量％の濃度で使用してもよく、凍結乾燥溶液中に使用される電解質は、塩化ナトリウムであり、０．０５Ｍの濃度で存在し、緩衝化剤トロメタミンは、０．０２Ｍの濃度で使用してもよい。溶解促進剤（例えば、ポリソルベート８０などの界面活性剤）は、また、凍結乾燥工程の間に使用してもよい。通常、該溶解促進剤は、界面活性剤である。凍結乾燥処方の調製のための代表的な工程は、バイアルを−４５℃で冷凍し、冷凍された溶液を第１の乾燥圧力６０ミクロンおよび棚温度−３０℃で６０時間の最初の凍結乾燥工程に付し、次いで、凍結乾燥産物を乾燥圧力６０ミクロンで、棚温度＋２５℃で２４時間の第２の乾燥工程に付すことを包含する。
【０１５９】
抗−５Ｔ４抗体および抗体／薬物コンジュゲートは、医薬上許容される担体、例えば、大きなゆっくりと代謝される巨大分子、例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマーおよび不活性ウイルス粒子中で処方される。医薬上許容される塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、および硫酸塩、または有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩および安息香酸塩もまた使用してもよい。処方は、付加的に、液体、例えば、水、セーライン、グリセロール、およびエタノールを含有していてもよく、および／または補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝化物質がかかる組成物中に配合されていてもよい。かかる担体は、該組成物を患者に摂取させるための錠剤、丸薬、ドラジェー、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリーおよび懸濁液として処方することを可能にする。
【０１６０】
Ｖ．Ｅ．投与量および投与
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、非経口的に、例えば、血管内、皮下、腹膜内、または筋内投与によって投与されうる。肺経路への組成物の送達の場合、組成物は、エーロゾルまたは粗（coarse）スプレーとして、すなわち、経鼻投与によって投与されうる。髄腔内、骨髄内または心室内投与は、中枢神経系（ＣＮＳ）癌およびＣＮＳ関連癌の治療に用いてもよい。抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、また、経皮的（transdermally）、経皮的（transcutaneously）、局所的、経腸的、膣内、舌下または直腸投与されてもよい。静脈内投与は、臨床上、ルーチンに使用されうる。送達方法は、治療されるべき状態および部位、抗体処方の型および組成物の治療効力などの考慮に基づいて選択される。
【０１６１】
本発明は、有効量の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートを、すなわち、所望の生物学的応答を誘導するのに十分な抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの量を対象に投与することを提供する。例えば、癌を有する対象に投与する場合、有効量は、癌細胞溶解、癌細胞増殖の阻害、癌細胞アポトーシスの誘導、癌細胞抗原の減少、腫瘍成長の遅延、および／または転移の阻害を包含する抗癌活性を誘導するのに十分な量を含む。腫瘍の縮小は、効力についての臨床的代理マーカーとしてよく許容される。効力についての別のよく許容されるマーカーは、無増悪（progression-free）生存率である。抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、一般に、重要な効力パラメーターにおいて少なくとも２５％の改善、例えば、平均生存期間、腫瘍進行までの時間、および全体的な応答率における改善を明らかにする。
【０１６２】
一般に、有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｍ２〜約５０ｍｇ／ｍ２、例えば、約０．１ｍｇ／ｍ２〜約２０ｍｇ／ｍ２、または約１５ｍｇ／ｍ２の範囲であり、該投与量は、抗−５Ｔ４抗体の量に基づいて算出される。抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの有効量は、また、コンジュゲートされた薬物の量に基づいて算出されうる。例えば、実験的マウスモデルに投与するための抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの代表的な投与量は、２μｇまたは４μｇのカリケアマイシンを包含し、これに応じて、ヒトに対する投与のために増減させればよい。例えば、本発明の抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、ヒト患者に、３週間毎に１回、６サイクルまで投与されうる。放射能標識した抗−５Ｔ４抗体の場合、有効量は、放射性同位元素および抗体の結合アフィニティーにもよるが、典型的に、約１ｍＣｉ〜約３００ｍＣｉ、通常、約５ｍＣｉ〜１００ｍＣｉの範囲である。
【０１６３】
開示される抗−５Ｔ４抗体を用いる５Ｔ４陽性細胞の検出のために、検出可能な量の本発明の組成物を、すなわち、抗体の存在がイン・ビトロまたはイン・ビボで決定されうるような抗−５Ｔ４抗体の投与量を対象に投与する。放射性同位元素を用いるシンチグラフィー画像化の場合、放射性同位元素の典型的な投与量は、約１０μＣｉ〜５０ｍＣｉ、または約１００μＣｉ〜２５ｍＣｉ、または約５００μＣｉ〜２０ｍＣｉ、または約１ｍＣｉ〜１０ｍＣｉ、または約１０ｍＣｉの活性を包含しうる。
【０１６４】
本発明の組成物における活性剤の実際の投与量レベルは、所望の診断的または治療的結果を達成するのに有効な組成物量を投与するように変化させればよい。投与方針もまた、変化させればよい。単回注射または多回注射を用いてもよい。選択される投与量レベルおよび方針は、治療組成物、処方の活性および安定性（すなわち、半減期）、投与経路、他の薬物または治療との組み合わせ、検出および／または治療されるべき疾患または障害、ならびに治療されている対象の物理的状態および以前の病歴を包含する種々の因子に依存する。
【０１６５】
本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの場合、治療上有効量は、細胞培養アッセイまたは動物モデル、例えば、齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタ、および／または霊長類のいずれかにおいて、最初に概算すればよい。動物モデルは、また、適当な濃度範囲および投与経路を決定するために使用してもよい。次いで、かかる情報は、ヒトにおける有用な投与量および投与経路を決定するために使用してもよい。典型的には、最小投与量を投与し、該投与量を用量規定毒性の不在下で段階的に増加させる。有効量または投与量の決定および調整、ならびにかかる調整をいつどのように実施するかの評価は、医学分野における通常の知識を有する者にとって既知である。
【０１６６】
組み合わせ療法の場合、抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート、および／または付加的な治療剤または診断剤を、意図される治療または診断の実施に適当ないずれかの期間内に投与する。かくして、単一の薬剤を実質的に同時に（すなわち、単一処方として、または数分もしくは数時間以内に）投与してもよく、またはいずれかの順番で連続的に投与してもよい。例えば、単一薬剤治療は、互いに約１年以内に、例えば、約１０、８、６、４または２ヶ月以内に、または４、３、２または１週間以内に、または約５、４、３、２または１日以内に投与してもよい。
【０１６７】
処方、投与量、投与方針および測定可能な治療結果に関する付加的な手引きに関しては、Berkow et al. (2000) The Merck Manual of Medical Information, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology, CRC Press, Boca Raton, Florida; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania; Katzung (2001) Basic & Clinical Pharmacology, Lange Medical Books / McGraw-Hill Medical Pub. Div., New York; Hardman et al. (2001) Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, The McGraw-Hill Companies, Columbus, Ohio; Speight & Holford (1997) Avery's Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choices, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvaniaを参照のこと。
【０１６８】
Ｖ．Ｆ．組み合わせ療法
開示される抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、最初の治療として投与されてもよく、または、従来の治療に不反応性の病態の治療のために投与してもよい。さらに、抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートを他の治療（例えば、外科的切除、照射、付加的な抗癌剤など）と組み合わせて用いてもよく、それにより、付加的な、または強化された治療効果を誘導し、および／またはいくつかの抗癌剤の肝臓細胞毒性を減少させてもよい。本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、付加的な薬剤と共に投与または処方されてもよく、または付加的な薬剤といずれかの順番で連続的に投与するために処方されてもよい。
【０１６９】
組み合わせ療法に有用な代表的な薬剤は、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートの調製に有用であるとして本明細書中に上記した薬剤のいずれをも包含する。本発明の抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲートは、また、開示される抗−５Ｔ４抗体以外の抗−５Ｔ４抗体ならびに異なる抗原を標的とする抗体およびコンジュゲートを包含する他の治療的抗体および抗体／薬物コンジュゲートとの組み合わせにおいても使用してもよい。単独または抗体／薬物コンジュゲートとして使用されうる代表的な抗体は、抗−ＣＤ１９抗体、抗−ＣＤ２０抗体（例えば、ＲＩＴＵＸＡＮＲ、ＺＥＶＡＬＩＮＲ、ＢＥＸＸＡＲＲ）、抗−ＣＤ２２抗体、抗−ＣＤ３３抗体（例えば、ＭＹＬＯＴＡＲＧＲ）、抗−ＣＤ３３抗体／薬物コンジュゲート、抗−ルイスＹ抗体（例えば、Ｈｕ３Ｓ１９３、Ｍｔｈｕ３Ｓ１９３、ＡＧｍｔｈｕ３Ｓ１９３）、抗−ＨＥＲ−２抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＲ（トラスツズマブ（trastuzumab））、ＭＤＸ−２１０、ＯＭＮＩＴＡＲＧＲ（ペルツズマブ（pertuzumab）、ｒｈｕＭＡｂ ２Ｃ４））、抗−ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨＲ）、抗−ＥＧＦＲ抗体（例えば、ＥＲＢＩＴＵＸＲ（セツキシマブ（cetuximab））、ＡＢＸ−ＥＧＦ（パニツムマブ（panitumumab））、抗−ＶＥＧＦ抗体（例えば、ＡＶＡＳＴＩＮＲ（ベバシツマブ（bevacizumab））、抗−ＤＮＡ／ヒストン複合抗体（例えば、ｃｈ−ＴＮＴ−１／ｂ）、抗−ＣＥＡ抗体（例えば、ＣＥＡ−Ｃｉｄｅ、ＹＭＢ−１００３）ｈＬＭ６０９、抗−ＣＤ４７抗体（例えば、６Ｈ９）、抗−ＶＥＧＦＲ２（またはキナーゼ挿入ドメイン含有受容体、ＫＤＲ）抗体（例えば、ＩＭＣ−１Ｃ１１）、抗−Ｅｐ−ＣＡＭ抗体（例えば、ＩＮＧ−１）、抗−ＦＡＰ抗体（例えば、シブロツマブ（sibrotuzumab））、抗−ＤＲ４抗体（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ）、抗−プロゲステロン受容体抗体（例えば、２Ｃ５）、抗−ＣＡ１９．９抗体（例えば、ＧＩＶＡＲＥＸＲ）および抗−フィブリン抗体（例えば、ＭＨ−１）を包含する。
【０１７０】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートは、また、治療方針の一部として、細胞毒性剤の１以上の組み合わせと一緒に投与されうる。該目的に有用な細胞毒性調製物は、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニソン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチンおよびプレドニソン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドクソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタソン、およびロイコボリン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニソン、メトトレキサート、ドクソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニソン、メトトレキサート、ドクソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシンおよびビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドクソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニソン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドクソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）とＡＢＶ（アドリアマイシン／ドクソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン）を交互；ＭＯＰＰ（メクロエタミン、ビンクリスチン、プレドニソンおよびプロカルバジン）とＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドクソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチンおよびダカルバジン）を交互；ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、プレドニソン）；ＩＭＶＰ−１６（イフォスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イフォスファミド、メトトレキサート、エトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタソン、高投与量シタラビンおよびシスプラスチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレジソロン、ＨＤシタラビンおよびシスプラスチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニソンおよびブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビンおよびプレドニソン）；およびＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニソン）；ＤＨＡＰ（シスプラスチン、高投与量シタラビンおよびデキサメタソン）；ＣＡＰ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、シスプラスチン）；ＰＶ（シスプラスチン、ビンブラスチンまたはビンデシン）；ＣＥ（カルボプラチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；ＭＶＰ（マイトマイシン、ビンブラスチンまたはビンデシン、シスプラチン）；ＰＦＬ（シスプラチン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）；ＩＭ（イフォスファミド、マイトマイシン）；ＩＥ（イフォスファミド、エトポシド）；ＩＰ（イフォスファミド、シスプラチン）；ＭＩＰ（マイトマイシン、イフォスファミド、シスプラチン）；ＩＣＥ（イフォスファミド、カルボプラチン、エトポシド）；ＰＩＥ（シスプラチン、イフォスファミド、エトポシド）；ビオレルビン（Ｖｉｏｒｅｌｂｉｎｅ）およびシスプラチン；カルボプラチン（Ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）およびパクリタキセル；ＣＡＶ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン）；ＣＡＥ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、エトポシド）；ＣＡＶＥ（シクロホスファミド、ドクソルビシン、ビンクリスチン、エトポシド）；ＥＰ（エトポシド、シスプラチン）；およびＣＭＣｃＶ（シクロホスファミド、メトトレキサート、ロムスチン、ビンクリスチン）を包含する。
【０１７１】
抗−５Ｔ４抗体および抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、全身的抗癌剤、例えば、エピチロン類（epithilones）（ＢＭＳ−２４７５５０，Ｅｐｏ−９０６）、タキサン類の再処方（Ａｂｒａｘａｎｅ，Ｘｙｏｔａｘ）、ミクロチューブリン阻害剤（ＭＳＴ−９９７，ＴＴＩ−２３７）、または標的化された細胞毒、例えば、ＣＭＤ−１９３およびＳＧＮ−１５と共に使用されうる。付加的な有効な抗癌剤は、ＴＡＸＯＴＥＲＥＲ、ＴＡＲＣＥＶＡＲ、ＧＥＭＺＡＲＲ（ゲムシタビン（gemcitabine））、５−ＦＵ、ＡＶＡＳＴＩＮＲ、ＥＲＢＩＴＵＸＲ、ＴＲＯＶＡＸＲ、アナツモマブ・マフェナトクス（anatumomab mafenatox）、レトラゾール（letrazole）、ドセタキセル（docetaxel）、およびアントラサイクリン類を包含する。
【０１７２】
組み合わせ治療の場合、抗−５Ｔ４抗体、抗−５Ｔ４／薬物コンジュゲート、および／または１以上の付加的な治療または診断剤を目的の治療または診断の実施に適当ないずれかの期間内に投与する。かくして、単一薬剤を実質的に同時に（すなわち、単一処方として、または数分もしくは数時間以内に）投与してもよく、あるいはいずれかの順番で連続的に投与してもよい。例えば、単一薬剤治療は、互いに約１年以内に、例えば、約１０、８、６、４または２ヶ月以内に、または４、３、２または１週間以内に、または約５、４、３、２または１日以内に投与すればよい。第２の治療剤と組み合わせた抗−５Ｔ４抗体または抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの投与は、好ましくは、いずれかの単独投与の効果よりも大きな効果をもたらす。
【実施例】
【０１７３】
下記の実施例は、本発明の様式を説明するために含まれる。下記の実施例のある種の態様は、本発明の共同発明者によって見出され、または意図された技術及び手法に関して、本発明を実施するために記載されている。これらの実施例は、共同発明者による標準的な研究室での実施を説明するものである。本開示および当該分野の一般的な水準に基づき、当業者には、下記の実施例が例示目的のみを意図し、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの変更、修飾および改変を用いてもよいことは明らかであろう。
【０１７４】
実施例１
ネズミ抗−５Ｔ４抗体
ヒト５Ｔ４抗原および免疫化のための標準的な方法を用いて、マウスにおいて抗−５Ｔ４抗体を調製した。Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体を産生するハイブリドーマ細胞系統を、個々のＢ細胞とメラノーマ細胞との融合によって製造した。
【０１７５】
Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体重鎖および軽鎖可変領域をＳＭＡＲＴＲｃＤＮＡ合成システム（Clontech Laboratories Inc. of Mountain View, California）、続いてＰＣＲ増幅を用いてクローン化した。Ａ１、Ａ２およびＡ３ハイブリドーマ細胞から単離した１μｇの全ＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）およびＳＭＡＲＴＲＩＩＡオリゴ（Clontech Laboratories Inc.）をＰＯＷＥＲＳＣＲＩＰＴＴＭ（登録商標）逆転写酵素（Clontech Laboratories Inc.）と共に用いて、ｃＤＮＡを合成した。次いで、該ｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴＲＩＩＡオリゴ配列にアニールするプライマーおよびマウス定常領域特異的プライマー（軽鎖に関するマウスカッパ、Ａ１重鎖に関するマウスＩｇＧ２ａ、Ａ２重鎖に関するマウスＩｇＧ２ｂ、およびＡ３重鎖に関するマウスＩｇＧ１）をＶＥＮＴＲポリメラーゼ（New England Biolabs Inc. of Ipswich, Massachusetts）と共に用いて、ＰＣＲによって増幅した。重鎖および軽鎖可変領域ＰＣＲ産物をｐＥＤ６発現ベクター中にサブクローン化し、核酸配列を決定した。該方法は、ＤＮＡ配列の予備知識を必要としない点で有益である。さらに、得られるＤＮＡ配列は、縮重ＰＣＲプライマーの使用によって改変されない。
【０１７６】
Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖可変領域のヌクレオチド配列は、各々、配列番号１のヌクレオチド５８−４１４、配列番号５のヌクレオチド５５−４０５、および配列番号９のヌクレオチド５８−４２３として示される。Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖可変領域のアミノ酸配列は、各々、配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５および配列番号１０の残基２０−１４１として示される。Ａ１、Ａ２およびＡ３軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は、各々、配列番号３のヌクレオチド６１−３８１、配列番号７のヌクレオチド６７−３９０、および配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１として示される。Ａ１、Ａ２およびＡ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、および配列番号１２の残基２１−１２７として示される。図１Ａ〜１Ｃも参照のこと。
【０１７７】
Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４可変領域配列の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴｐ検索（タンパク質クエリ配列について）を、デフォルトパラメーターＥｘｐｅｃｔ＝１０、Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ＝３、低複雑性フィルター、およびＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスを用いて、ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１およびｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１のギャップコストを許可して実施した。ＢＬＡＳＴｎ検索（ヌクレオチドクエリ配列について）は、デフォルトパラメーターＥｘｐｅｃｔ＝１０、Ｗｏｒｄ Ｓｉｚｅ＝１１、および低複雑性フィルターを用いて実施した。ＢＬＡＳＴ検索結果は、クエリ配列に関連する配列のリストとして、Ｅ値（データベースにおいて同定された合致の統計学的有意性の指標である）の順でランク付けして報告する。ＢＬＡＳＴ分析に用いられた可変領域配列に最も密接に関連する配列を表１（ＢＬＡＳＴｎ）および表２（ＢＬＡＳＴｐ）において同定する。
【０１７８】
【表１】
【０１７９】
【表２】
【０１８０】
実施例２
ネズミ抗−５Ｔ４抗体の結合特異性およびアフィニティー
Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の結合特異性およびアフィニティーを評価するために、ＣＭ５チップ上に固定化されたヒト５Ｔ４抗原を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥＲ分析を行った。ＢＩＡＣＯＲＥＲ技術は、表面層上に固定化された５Ｔ４抗原に対する抗体の結合における表面層での屈折率における変化を利用する。結合は、表面から屈折しているレーザー光の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検出される。シグナル反応速度ｏｎ ｒａｔｅおよびｏｆｆ ｒａｔｅの分析は、非特異的および特異的相互作用間の区別を可能にする。Ｈ８抗−５Ｔ４抗体を対照として用いた。Ｈ８は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９８／５５６０７号およびForsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):124430-12436において記載されたハイブリドーマから生じたモノクローナルマウスＩｇＧ１抗体である。
【０１８１】
表３
ＢＩＡＣＯＲＥＲアッセイの結果
【表３】
【０１８２】
ＢＩＡＣＯＲＥＲの結果は、Ａ２およびＡ３抗体と比べて、Ｈ８およびＡ１抗体が５Ｔ４に対する高いアフィニティーを有することを示す。Ａ２は、比較的低いアフィニティー抗体である。Ａ１重鎖可変領域の残基６７およびＡ３重鎖可変領域の残基９１には、異常なシステインが存在する。これらの残基をフェニルアラニン（Ａ１）またはチロシン（Ａ３）で置き換えても、抗体結合特性または発現レベルが変化しなかった。
【０１８３】
Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の結合アフィニティーは、また、ＣＴ２６／５Ｔ４細胞溶解物を用いるウェスタンブロッティングによっても評価され、Ｈ８、Ａ１およびＡ３による強い結合を同定した。図２参照のこと。
【０１８４】
Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の５Ｔ４抗原を発現している細胞に対する結合能は、ＰＣ１４ＰＥ６細胞の蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いてアッセイされた。全ての抗体は、５Ｔ４発現性ＰＣ１４ＰＥ６細胞に対する特異的な結合を示したが、Ａ２結合レベルは、Ｈ８、Ａ１およびＡ３に関して観察されたレベルよりも有意に低かった。表４参照のこと。
【０１８５】
表４
ＦＡＣＳ分析の結果
【表４】
【０１８６】
抗体産生における潜在的な変化性を評価するために、Ａ１およびＨ８の２つの独立した調製物を試験した。各抗体の結合および反応速度特性は、各調製物を比較した場合、有意に相違しなかった。図３Ａ−３Ｂを参照のこと。
【０１８７】
実施例３
５Ｔ４発現性細胞によるネズミ抗−５Ｔ４抗体の内在化
５Ｔ４抗原への結合における抗体の内在化を評価するために、細胞表面 対 上清中で検出されたＨ８およびＡ１抗体の量を時間の関数として決定した。非酵素的に解離したＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞（ヒト乳癌細胞）を抗−５Ｔ４抗体に４℃で１時間曝露した。細胞を洗浄し、培地中、３７℃で４時間または２４時間インキュベートした。細胞膜に結合した抗体 対 非結合抗体（すなわち、上清中の存在）の量をＦＡＣＳを用いて決定した。ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の表面からの５Ｔ４抗体の消失は、細胞表面での５Ｔ４抗原／抗体複合体の調節を立証し、このことは、内在化および／または解離を示しうる。図４Ａ−４Ｃ参照。
【０１８８】
実施例４
５Ｔ４キメラを用いるエピトープマッピング
Ａ１、Ａ２、Ａ３およびＨ８抗体が各々結合するエピトープを同定するために、（１）欠失または変異配列を有する５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ構築物および（２）ＣＯＳ−１細胞中で一時的に発現された５Ｔ４キメラ構築物を用いて、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。細胞外ドメインは、アミノ末端領域、２つのロイシンリッチリピート、および介在性親水性領域を含む。マウス５Ｔ４（アミノ酸１−３６１）、ラット５Ｔ４（アミノ酸１−３６１）、カニクイザル５Ｔ４（アミノ酸１−３５５）、チンパンジー５Ｔ４（アミノ酸１−３５５）、およびオグロマーモセット（アミノ酸１−３５５）を用いて、５Ｔ４細胞外ドメインおよびヒトＩｇＧ１由来のＦｃ定常領域を含有する融合タンパク質を調製した。５Ｔ４キメラ構築物は、図５に示される。結合結果を表５にまとめ、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の各々による特異的結合、部分結合、または結合の欠失を示す。ヒト化Ｈ８およびキメラＡ１、Ａ２およびＡ３抗体は、各々、ネズミＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３に類似の結合特性を示した。
【０１８９】
これらの結果に基づいて、ヒト化Ｈ８抗体が残基１７３および２５２の間でヒト５Ｔ４に結合することが決定された。ヒト化Ｈ８は、残基３４４にてＮ−結合性グリコシル化を伴って、または伴わずに、５Ｔ４に結合し、これにより、ヒト化Ｈ８のヒト５Ｔ４への結合が膜に近接しないことが確認される。Ａ１抗体は、残基１７３および２５２の間でヒト５Ｔ４に１回目の接触をし、残基２８２および３６１の間でヒト５Ｔ４に２回目の接触をする。Ａ２抗体は、残基２８２および３６１の間でヒト５Ｔ４に結合する。Ａ３抗体は、残基８３〜１６３の間でヒト５Ｔ４の第１のロイシンリッチリピート領域に結合する。各抗体によって結合されるエピトープを図７に示す。
【０１９０】
表５
５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ融合およびヒト／マウス５Ｔ４キメラを用いるエピトープマッピングの結果
【表５】
（＋）結合；（−）結合しない；（＋／−）部分的結合
【０１９１】
ヒトおよびカニクイザル由来の５Ｔ４細胞外ドメインに対する観察された種々の結合に基づいて、抗体結合に関係する残基を識別するために、標的とされる変異を作成した。ヒト化Ｈ８抗体の結合は、下記表６に示される変異した５Ｔ４細胞外ドメイン、すなわち、示される位置にカニクイザル由来の残基を含むヒト５Ｔ４細胞外ドメインの各々に対してアッセイされた。これらの結果は、ヒト５Ｔ４抗原の残基２１３および２１４がヒト化Ｈ８によって結合されるエピトープに必要とされることを示した。
【０１９２】
表６
標的とされる変異を有するヒト５Ｔ４細胞外ドメイン／Ｆｃ融合を用いるエピトープマッピングの結果
【表６】
（＋）結合；（−）結合しない；（＋／−）部分的結合
【０１９３】
直接的な結合アッセイに加えて、ビオチン化ヒト化Ｈ８抗体およびＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の各々を用いて、競合的結合アッセイを行った。ヒト５Ｔ４に対する結合の阻害は観察されず、そのことは、Ａ１、Ａ２およびＡ３の各々が、Ｈ８抗体によって結合されるものとは別個の５Ｔ４エピトープに結合することを示唆する。図６Ａ−６を参照のこと。
【０１９４】
実施例５
ＢＩＡＣＯＲＥＲを用いるエピトープマッピング
Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体のエピトープマッピングは、また、ヒト５Ｔ４抗原を結合したＣＭ５チップを用いるＢＩＡＣＯＲＥＲを用いて行った。チップは、Ｈ８、Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体で飽和させ、第１の応答を測定した。次いで、チップをＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体のなかから由来する二次抗体で飽和させ、第２の応答を測定した。複数回の実験のために、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５中で結合抗体を解離させ、次いでバッファー洗浄することによって、チップを再生した。結果を下記の表７にまとめる。示されるパーセンテージは、ＣＭ５チップに対する二次抗体の直接的結合において測定された応答単位を一次抗体で飽和されたＣＭ５チップに対する二次抗体の結合において測定された応答単位で割ったものである。これらの結果は、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３が各々、ヒト５Ｔ４上の別個のエピトープに結合することを示す。Ｈ８およびＡ３抗体によって結合されるエピトープは、立体的に互いに近接しており、その結果、抗原との結合速度は、Ｈ８の結合がＡ３の存在下でアッセイされる時、減少し、逆もまた同様である。同様の結果が、下記実施例７に記載するように調製されたキメラおよびヒト化Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体を用いて得られた。表８参照のこと。
【０１９５】
表７
ＢＩＡＣＯＲＥＲを用いる競合アッセイの結果
一次抗体での飽和後の二次抗体の応答パーセンテージ
【表７】
【０１９６】
表８
ＢＩＡＣＯＲＥＲを用いる競合アッセイの結果
一次抗体での飽和後に結合した二次抗体のパーセンテージ
【表８】
【０１９７】
キメラ構築物（実施例４参照）およびＢＩＡＣＯＲＥＲを用いて決定されたエピトープマッピング研究の合わせた結果は、図７に示される。
【０１９８】
実施例６
抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの効力
生体染色色素（ＭＴＳ）染色を用いて、種々の処理に曝露後に生存する数を決定した。ＭＴＳ（非放射性細胞増殖アッセイキット）は、Promega (Madison, Wisconsin)から購入し、製造者の説明書にしたがって使用した。各細胞系統のために、検量線（２時間後の細胞数 対 光学密度）を確立して、適当な開始播種密度を概算した。次いで、細胞を９６マルチウェル皿に７５０〜５０００細胞／ウェル密度で播種した。播種直後に、細胞を種々の濃度（０、０．０１、０．０５、０．１、１、１０、１００および５００ｎｇカリケアマイシン当量／ｍｌ）のカリケアマイシン、ＣＭＡ−６７６および抗−５Ｔ４抗体のカリケアマイシンコンジュゲートに曝露した。薬物曝露の９６時間後に生存している細胞数を決定後、用量応答曲線由来のロジスティック回帰パラメーターに基づいてＥＤ５０を計算した。ＥＤ５０は、薬物への曝露９６時間後に細胞数の５０％減少を引き起こした薬物の濃度（ＣａｌｉｃｈＤＭＨ）として定義された。カリケアマイシン当量（ｃａｌ．ｅｑ．）は、純粋な物質またはコンジュゲートとして与えられるカリケアマイシンの濃度である。抗体に結合したカリケアマイシンの量（抗体薬物負荷量）に依存して、異なるカリケアマイシン当量は、異なるタンパク質濃度を示しうる。
【０１９９】
ＭＴＳアッセイの結果を表９に示す。Ａ１およびＡ３抗−５Ｔ４アッセイを用いて調製された抗体／カリケアマイシンコンジュゲートは、実質的に、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の生存能力を減少させた。選択性値は、コンジュゲートの比活性を非特異的活性と比較することによって計算された。すなわち、５Ｔ４発現性細胞に関するｆｏｌｄ ＣａｌｉｃｈＤＭＨを５Ｔ４を発現していない細胞に関するｆｏｌｄ ＣａｌｉｃｈＤＭＨ値で割った。非特異的抗体、例えば、ｈｐ６７．６（ＣＭＡ−６７６）を使用する場合、ｆｏｌｄ ＣａｌｉｃｈＤＭＨ値は、選択性が１であるように、ほとんど同じである。
【０２００】
表９
ＭＴＳアッセイの結果
【表９−１】
【表９−２】
選択性：Ｈ８＝８；ｈＰ６７．６＝１；Ａ１＝９３；Ａ３＝１．６
ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，コンジュゲートしていないカリケアマイシン
ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたヒト化Ｈ８抗体
ＣＭＡ−６７６，抗−ＣＤ３３／カリケアマイシンコンジュゲート
Ａ１−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたＡ１抗体
Ａ２−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたＡ２抗体
Ａ３−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートしたＡ３抗体
【０２０１】
抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートの細胞毒性もまた、イン・ビボ細胞環境をより密接に近似する三次元スフェロイド細胞培養を用いてアッセイされた。スフェロイドは、本質的に、Yuhas et al. (1977) Cancer Res. 37:3639-3643にしたがって作成された。簡単に言うと、５ｍｌ培養培地中１０５細胞を、予め５ｍｌの培養培地中における０．６５％組織培養等級寒天（Sigma of St. Louis, Missouri）でコートした６０ｍｍポリスチレン細胞培養皿に播種した。該皿を３７℃にて、５％ＣＯ２空気中５〜６日間インキュベートした。直径０．２ｍｍのスフェロイドを選択し、２４ウェルマルチウェル皿に置いた。各ウェルは、０．５ｍｌ寒天アンダーレイ、１スフェロイド、および１ｍｌ培養培地オーバーレイを含有した。次いで、スフェロイドを種々の濃度（０、０．０９１、０．３６５、１．４６、５．８６、２３．４４、９３．７５および３７５ｎｇカリケアマイシン当量／ｍｌ）のカリケアマイシン、ＣＭＡ−６７６、およびＡ１およびＡ３抗−５Ｔ４抗体およびＡｃＢｕｔリンカーを用いて調製された抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートに曝露した。両方の抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞の成長を有意に阻害した。図８参照のこと。
【０２０２】
実施例７
キメラおよびヒト化抗−５Ｔ４抗体の調製および結合特性
ネズミＨ８重鎖および軽鎖可変領域配列およびヒトＩｇＧ４重鎖定常領域およびヒトカッパ軽鎖定常領域を有するキメラＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体が構築された。Ａ１重鎖可変領域の６７位置に存在するシステインは、フェニルアラニンに変わっていてもよく、Ａ３重鎖可変領域の９１位置に存在するシステインは、チロシンに変わっていてもよい。これらの変種は、配列番号２（Ａ１ ＶＨ）および配列番号１０（Ａ３ ＶＨ）において示される。イントロン配列の存在または不存在およびシステイン残基の置換は、抗体発現に影響を及ぼさなかった。ＩｇＧ定常領域をコードしている配列のクローニングのために、所望により、イントロン配列を欠失させた。
【０２０３】
ヒト化Ｈ８は、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ２００６／０３１６５３号に記載されるように調製された。ヒト化Ａ１抗体は、さらに本明細書中に下記するようなＣＤＲグラフティングによって調製された。ネズミＡ１、Ａ２およびＡ３抗体のＣＤＲｓは、配列変化性ならびに構造的ループ領域の位置に基づくＡｂＭ限定（definition）を用いて同定された。一般に、ヒトアクセプターフレームワークは、それらが実質的にネズミ抗体のフレームワーク領域に類似するということに基づいて選択され、または、可変領域サブファミリーのコンセンサス配列に最も類似していた。また、幅広く表示された配列が一般に、数の多くない配列よりも好ましいように、ヒトにおけるフレームワーク位置の表示も考慮した。ヒトフレームワークアクセプター配列の付加的な変異は、抗原接触に関与すると考えられるネズミ残基および／または抗原結合部位の構造無欠性に関与する残基を復旧させるために作成された。該アミノ酸配列は、また、ＣＨＯ細胞のコドン選択のために、および制限酵素部位の除去のために最適化させてもよい。ペプチド構造予測プログラムを用いて、ヒト化可変重鎖および軽鎖領域配列を分析して、ヒト化設計によって導入された翻訳後タンパク質修飾部位を同定し、回避してもよい。
【０２０４】
フレームワーク変異（Ｓ８２Ａ)および１つの復帰変異（Ｅ４６Ｋ）を含有するヒトＤＰ−２１フレームワーク領域（ＶＨ７サブグループ、受入番号第ＣＡＡ４３３４６号、配列番号８８）上にグラフトされたネズミＡ１のＣＤＲｓを含むように、ヒト化Ａ１重鎖可変領域（Ａ１ ＶＨバージョン１．０）を構築した。変種は、復帰変異を除去することによって調製された（Ａ１ ＶＨバージョン１．１および１．２）。第２のヒト化Ａ１重鎖可変領域は、Ａ１ ＣＤＲｓをヒトＤＰ−５４生殖細胞フレームワーク領域上にグラフティングすることによって調製された（Ａ１ ＶＨバージョン２．０）。６個の復帰変異を作成して、Ａ１ ＶＨバージョン２．１を製造した。さらに下記するように、両方のＡ１重鎖可変領域は、５Ｔ４結合特性を保持した。ＤＰ−２１およびＤＰ−５４フレームワーク領域は、その全長にわたり６３％アミノ酸配列同一性を示し、多くのアミノ酸変化が生じたことを示す一方で、特定のエピトープに結合する能力を包含する抗体の結合特異性を保存した。ヒト化Ａ１重鎖可変領域の類似性を表１０に示す。ヒト化Ａ１重鎖可変領域をコードしている代表的なヌクレオチド配列は、配列番号４８、５０、５３および５５として示される。ヒト化Ａ１重鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、配列番号４９、５１、５２、５４および４６として示される。図９Ａ−９Ｂも参照のこと。
【０２０５】
ヒト化Ａ１軽鎖可変領域は、ヒトＤＰＫ２４（ＶＫＩＶサブグループ）、ＤＰＫ９（ＶＫＩサブグループ）およびＤＰＫ２３（ＶＫＩＩＩサブグループ）生殖細胞フレームワーク領域上にグラフトされたネズミＡ１のＣＤＲｓを含むように構築された。これらの各フレームワークを用いて調製されたヒト化Ａ１軽鎖可変領域フレームワーク中へのＳ６７Ｙ復帰変異の組み込み後、５Ｔ４結合が明らかにされた。表１３を含め、下記参照のこと。ＤＰＫ２４フレームワーク領域は、その全長にわたり、ＤＰＫ９およびＤＰＫ２３に対して各々、７４％および７３％アミノ酸配列同一性を示す。ＤＰＫ９フレームワーク領域は、その全長にわたり、ＤＰＫ２３に対して７４％アミノ酸配列同一性を示す。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域の類似性は、表１０に示される。ヒト化軽鎖可変フレームワーク領域の複数のバージョンは、多数のアミノ酸変化が作成されうる一方で、特定のエピトープに対する結合能を含め、抗体の結合特異性が保存されることを明らかにする。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域をコードしている代表的なヌクレオチド配列は、配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３および７５として示される。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４および７６として示される。図９Ｃ−９Ｆも参照のこと。
【０２０６】
表１０
ヒト化Ａ１抗体の関連性
【表１０】
【０２０７】
ヒト化Ａ２およびＡ３抗体は、類似の手法を用いて設計された。ヒト化Ａ２重鎖可変領域およびヒト化Ａ２軽鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、各々、配列番号７７−７８および配列番号７９−８０として示される。図９Ｇも参照のこと。ヒト化Ａ３重鎖可変領域およびヒト化Ａ３軽鎖可変領域の代表的なアミノ酸配列は、各々、配列番号８１−８２および配列番号８３−８４として示される。図９Ｈも参照のこと。
【０２０８】
ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３重鎖および軽鎖可変領域の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ分析を実施例１に記載のように行った。結果を表１１に示す。
【０２０９】
表１１
ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ分析
【表１１−１】
【０２１０】
表１１つづき
表１１
ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐ分析
【表１１−２】
＊クエリカバレッジ＝１００％のとき
【０２１１】
図１０Ａ−１０Ｂは、ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体の調製のためのフレームワークとして使用されうる付加的な重鎖可変領域配列を示す。図１１−１３は、ヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体の調製のためのフレームワークとして使用されうる付加的な軽鎖可変領域配列を示す。図１４は、キメラおよびヒト化Ａ１、Ａ２およびＡ３抗−５Ｔ４抗体の調製のために使用されうる代表的な定常領域を示す。
【０２１２】
キメラおよびヒト化Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の結合特異性およびアフィニティーを評価するために、ＣＭ５チップ上に固定したヒト５Ｔ４抗原を用いて、ＢＩＡＣＯＲＥＲ分析を行った。実施例２参照のこと。キメラＡ１、Ａ２およびＡ３抗体の結果を下記表１２に示す。
【０２１３】
表１２
ＢＩＡＣＯＲＥＲアッセイの結果
【表１２】
【０２１４】
一般に、キメラ化／ヒト化は、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３のヒト５Ｔ４に対するアフィニティーを増加させた。表３と比較すること。結合アフィニティーにおける増加は、主に、より早い結合よりもむしろ、抗体および抗原のより遅い解離に起因するようである。キメラＡ２およびＡ３抗体は、キメラ化後に最も改善された結合特性を示した。
【０２１５】
全てのヒト化Ａ１重鎖可変領域は、５Ｔ４結合特異性を保持した。さらに、ヒト化Ａ１重鎖可変領域からのＫ４６復帰変異の除去は、５Ｔ４結合特性に影響を及ぼさなかった。ヒト化Ａ１軽鎖可変領域は、損なわれた５Ｔ４結合特性を示した。ＤＰＫ９およびＤＰＫ２３フレームワークを用いて構築されたヒト化Ａ１軽鎖可変領域は、ＤＰＫ２４フレームワークを用いて構築されたヒト化Ａ１軽鎖可変領域よりも高いアフィニティーで５Ｔ４を結合した。復帰変異は、５Ｔ４結合を復旧する、および／または最適化するために組み込まれた。６７位置のセリン残基のチロシン残基での置換は、ネズミＡ１フレームワーク領域において見られるように、５Ｔ４抗原結合特性を完全に復旧した。表１３参照のこと。
【０２１６】
表１３
ＥＬＩＳＡによるヒト５Ｔ４へのビオチン化キメラＡ１抗体結合の阻害
【表１３】
ｈｕＡ１，ヒト化Ａ１
ｖ，バージョン
【０２１７】
実施例８
抗−５Ｔ４抗体の種間反応性
本明細書中に開示される抗−５Ｔ４抗体の種間反応性をアッセイして、イン・ビボでの効力研究および毒物学的分析について関連する種を決定した。また、種々の５Ｔ４細胞外ドメインの結合活性および関連性の相関関係を用いて、各抗体によって結合されるエピトープをさらに記載した。結合アッセイは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃに融合した種々の種由来の５Ｔ４細胞外ドメインを用いて行われた。各細胞外ドメイン領域のヒト５Ｔ４に対するパーセンテージ同一性を表１４に示す。
【０２１８】
表１４
異なる種由来の５Ｔ４の関連性
【表１４】
ａ 親水性ドメイン内に６アミノ酸直接反復を含有する
【０２１９】
ヒト、マウス、ラット、イヌおよびウシ由来の５Ｔ４の全長または部分配列は、以前にＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ２９０８３（ヒト，配列番号８７）、ＡＪ０１２１６０（マウス）、ＢＣ０８７０１１（ラット）、ＸＭ５３９０２０（イヌ）およびＸＭ５９３５０２（ウシ）として開示されている。チンパンジー５Ｔ４の仮想部分配列は、ｍＲＮＡおよびゲノム配列のアラインメントを用いて作成された。５Ｔ４タンパク質をコードしている核酸は、カニクイザルおよびオグロマーモセットから単離された。これらの付加的な５Ｔ４抗原のアミノ酸配列を図１５に示し、また、配列番号８６（カニクイザル）および配列番号８５（オグロマーモセット）として示す。
【０２２０】
カニクイザルおよびオグロマーモセット配列の新規性を評価するために、ＢＬＡＳＴ分析を実施例２に記載のように行った。全長オグロマーモセット５Ｔ４アミノ酸配列をクエリ配列として用いた場合、最も近い対象配列は、ヒト５Ｔ４として同定され（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＮＰ ００６６６１．１）、９４％同一性（３０２／３２０アミノ酸）であった。該配列は、また、カルボキシル末端で異なり、配列番号８５のアミノ酸１−１９が最も近い対象配列と整列しなかった。全長カニクイザル５Ｔ４アミノ酸配列をクエリ配列として用いた場合、最も近い非仮想対象配列は、カニクイザルから由来するトロホブラスト糖蛋白前駆体として同定され（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＢＡＥ００４３２．１）、９９％同一性（３６４／３６６アミノ酸）であった。該配列もまた、カルボキシル末端で異なり、配列番号８６のアミノ酸１−２５が最も近い非仮想対象配列と整列しなかった。
【０２２１】
抗−５Ｔ４抗体の結合をアッセイするために、５Ｔ４細胞外ドメイン／Ｆｃ融合タンパク質をＣＯＳ−１細胞中に一時的にトランスフェクトし、ＥＬＩＳＡアッセイを行った。非関連ヒトＩｇＧ４およびＩｇＧ１抗体を対照として用いた。抗−５Ｔ４抗体の種間反応性を表１５にまとめる。
【０２２２】
表１５
抗−５Ｔ４抗体の交差反応性（ｎＭにおけるＥＤ５０）
【表１５】
ｈｕＨ８γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するヒト化Ｈ８抗体
ｈｕＨ８γ１，ＩｇＧ１定常領域を有するヒト化Ｈ８抗体
ＣｈｉＡ１γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するキメラＡ１抗体
ＣｈｉＡ２γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するキメラＡ２抗体
ＣｈｉＡ３γ４，ＩｇＧ４定常領域を有するキメラＡ３抗体
（＋／−），部分結合
（−），結合しない
【図面の簡単な説明】
【０２２３】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ネズミ抗−５Ｔ４抗体Ａ１、Ａ２またはＡ３の重鎖および軽鎖可変領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。該アミノ酸配列は、下線を付すことによって相補性決定領域（ＣＤＲ）を示し、二重下線を付すことによってリーダー配列を示す。
【図２】図２は、ＣＴ２６／５Ｔ４細胞溶解物を用いて調製され、示される抗体でプローブされたウェスタンブロットである。
【図３】図３Ａ−３Ｂは、Ｈ８およびＡ１抗体という２つの独立した調製物に関する応答曲線および結合反応速度を示す線グラフである。
【図４】図４Ａ−４Ｃは、ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４細胞によるＨ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３抗体の調節を示す線グラフである。細胞表面での抗体レベルは経時的に低下し（図４Ａ、４Ｃ（黒塗り））、一方、上清中の抗体レベルは一定に保たれる（図４Ｂ、４Ｃ（白塗り））。ＭＣＦは平均細胞蛍光、ｓｕｐｔは上清を示す。
【図５】図５は、ヒト細胞外ドメイン５Ｔ４Ｆｃ構築物、マウス細胞外ドメイン５Ｔ４Ｆｃ構築物、およびヒト／マウス５Ｔ４キメラ構築物の概略図である。これらの構築物は、実施例４に記載されるように、エピトープマッピングに用いられた。
【図６】図６Ａ−６Ｂは、ヒト化Ｈ８および示される抗体の各々のヒト５Ｔ４細胞外ドメインＦｃ融合タンパク質への競合的結合の結果のグラフを示す。ＨｕＨ８はヒト化Ｈ８抗体を示し、ＣｈｉＡ１はキメラＡ１抗体を示し、ＣｈｉＡ１＋Ｃ６７Ｆは、Ｃ６７Ｆ変異を有するキメラＡ１抗体を示し、ＣｈｉＡ２はキメラＡ２抗体を示し、ｍｕＡ２はネズミＡ２抗体を示し、ＣｈｉＡ３は、キメラＡ３抗体を示し、ＣｈｉＡ３＋Ｃ９１Ｙは、Ｃ９１Ｙ変異を有するキメラＡ３抗体を示し、ｍｕＡ３はネズミＡ３抗体を示し、Ｎｏ Ａｂは、抗体無し（対照）を示す。
【図７】図７は、Ｈ８、Ａ１、Ａ２およびＡ３によって結合されるヒト５Ｔ４エピトープを示す線図である。示される残基は、Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(12):9319-9324によって記載される５Ｔ４抗原の残基であり、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｚ２９０８３としても入手可能である（配列番号８７）。ＬＲＲは、ロイシンリッチリピートを示す。
【図８】図８は、実施例６に記載のように実施されたスフェロイドアッセイの結果を示す。Ａ１およびＡ３抗体を用いて調製された抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートは、対照細胞（ＭＤＡＭＢ４３５／ｎｅｏ）と比べて、５Ｔ４発現性細胞（ＭＤＡＭＢ４３５／５Ｔ４）の成長を有意に阻害した。ＣＭＡ−６７６は、抗−ＣＤ３３／カリケアマイシンコンジュゲートを示し、ｈｕＨ８−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートされたヒト化Ｈ８抗体を示し、ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、コンジュゲートしていないカリケアマイシンを示し、Ａ１−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨｈａ，４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートされたＡ１抗体を示し、Ａ３−ＡｃＢｕｔ−ＣａｌｉｃｈＤＭＨは、４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）を用いてカリケアマイシンにコンジュゲートされたＡ３抗体を示す。
【図９】図９Ａ−９Ｈは、ヒト化Ａ１重鎖可変領域バージョン１のヌクレオチドおよびアミノ酸配列（配列番号４８−４９）、ヒト化Ａ１重鎖可変領域（ｈｕＡ１ ＶＨ）バージョン１．２および２．０のアミノ酸配列、ヒト化Ａ１軽鎖可変領域（ｈｕＡ１ ＶＬ）バージョン１．０、２．０および３．０のアミノ酸配列、ヒト化Ａ２重鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ２ ＶＨ）のアミノ酸配列、ヒト化Ａ２軽鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ２ ＶＬ）のアミノ酸配列、ヒト化Ａ３重鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ３ ＶＨ）のアミノ酸配列、およびヒト化Ａ３軽鎖可変領域バージョン１．０および２．０（ｈｕＡ３２ ＶＬ）のアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０Ａ−１０Ｂは、ヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するのに使用されうる代表的なヒト重鎖可変領域フレームワーク配列を示す。図１０Ａは、サブグループＩのヒト重鎖可変領域配列（配列番号１４−２４）およびそこから誘導されたコンセンサスフレームワーク配列（配列番号２５−２７）のアラインメントである。図１０Ｂは、ＶＨ７およびＶＨ３サブグループのヒト生殖細胞遺伝子の配列（配列番号８８−９３）を示す。
【図１１】図１１は、サブグループＶκＩＩＩのヒト軽鎖可変領域配列（配列番号２９−３４）のアラインメントである。ボックスで囲んだ配列はＣＤＲを示す。
【図１２】図１２は、サブグループＶκＩのヒト軽鎖可変領域配列（配列番号３５−４４）のアラインメントである。ボックスで囲んだ配列はＣＤＲを示す。
【図１３】図１３は、Ｖｋ１およびＶｋ ＩＶサブグループの付加的なヒト生殖細胞配列を示し、それは、ヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するのに用いられ得るフレームワーク領域を有する（配列番号９４−９９）。
【図１４】図１４は、キメラおよびヒト化抗５Ｔ４抗体を調製するために使用されうる代表的なヒト定常領域のアミノ酸配列を示す（配列番号４５−４７）。
【図１５】図１５は、全長カニクイザル５Ｔ４抗原および部分オグロマーモセット５Ｔ４抗原のアミノ酸配列を示す。下線を付した配列はリーダー配列である。各配列について、５Ｔ４細胞外ドメインは、アミノ酸３０−３５６を包含する。
【図１−Ａ】
【図１−Ｂ】
【図１−Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の抗原結合ドメインを含み、
（ｂ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と５Ｔ４結合について競合し、
（ｃ）Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合される５Ｔ４エピトープと結合し、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の抗体の５Ｔ４−結合フラグメントを含む
ヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、四量体抗体、四価抗体、多特異的抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体または融合タンパク質である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ネズミモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項４】
ヒト５Ｔ４抗原に対して、少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの結合アフィニティーを有する請求項１記載の抗体。
【請求項５】
イン・ビボで５Ｔ４発現性細胞を特異的に標的とする請求項１記載の抗体。
【請求項６】
重鎖可変領域が配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、配列番号１０の残基２０−１４１、配列番号４９の残基１−１１９、またはヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３重鎖可変領域の残基のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖可変領域が配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、配列番号１２の残基２１−１２７、またはヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域の残基のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域が配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項９】
重鎖可変領域が配列番号６の残基１９−１３５由来のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号８の残基２３−１３０由来のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項１０】
重鎖可変領域が配列番号１０の残基２０−１４１由来のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１２の残基２１−１２７由来のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項１１】
キメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体である請求項２記載の抗体。
【請求項１２】
ヒト定常領域由来の定常領域を含む請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１３】
ヒト軽鎖定常領域がヒトカッパ軽鎖定常領域から由来する請求項１２記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１４】
ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域から由来する請求項１２記載のキメラまたはヒト化抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が２４１位置にプロリンを含む請求項１４記載のキメラまたはヒト化抗体または抗体フラグメント。
【請求項１６】
少なくとも１つの軽鎖または少なくとも１つの重鎖の可変領域が
（ａ）ヒト抗体フレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域、および
（ｂ）配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲ、あるいは配列番号２、６または１０の重鎖可変領域の１以上のＣＤＲ
を含む請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１７】
ヒト残基が
（ａ）ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）からなる群から選択されるヒト抗体重鎖フレームワーク領域；
（ｂ）ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系クローン、ＶκＩＩＩサブグループ（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ−７）のヒト抗体軽鎖フレームワーク領域、
（ｃ）（ａ）の重鎖フレームワーク領域のコンセンサス配列、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のフレームワーク領域と少なくとも６３％同一のフレームワーク領域
からなる群から選択されるヒトフレームワーク残基である、請求項１６記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１８】
配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれか１つの少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１６記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１９】
軽鎖が配列番号４、８または１２のいずれか１つの少なくとも２または３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項１８記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
軽鎖が配列番号４、８または１２のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項１９記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
重鎖が配列番号２、６または１０のいずれか１つの少なくとも２または３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項１６記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
重鎖が配列番号２、６または１０のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項２１記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
配列番号２および４のＣＤＲ、配列番号６および８のＣＤＲ、または配列番号１０および１２のＣＤＲを含む請求項１６記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
重鎖可変領域配列が
（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％同一のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４９、５１、５２、５４、５６、７７、７８、８１または８２のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号５１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号５４と少なくとも７８％同一のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号７７と少なくとも８９％同一のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号７８と少なくとも７９％同一のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号８１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号８２と少なくとも７８％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項２５】
軽鎖可変領域配列が
（ａ）配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号８の残基２３−１３０のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１２の残基２１−１２７のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８３または８４のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６０と少なくとも８３％同一のアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号７０と少なくとも９３％同一のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号７９と少なくとも８８％同一のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号８０と少なくとも８４％同一のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号８４と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項２６】
（ａ）請求項１記載の抗体、および
（ｂ）抗体に直接または間接的に結合する薬物
を含む薬物送達のための抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
薬物が、細胞毒、放射性同位元素、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、プロ−アポトーシス剤、化学療法剤、および治療的核酸からなる群から選択される治療剤である請求項２６記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
治療剤が細胞毒である請求項２７記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
細胞毒が、抗生物質、チューブリン重合阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または酵素である請求項２６記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
細胞毒が抗生物質である請求項２７記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
抗生物質がカリケアマイシンである請求項３０記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３２】
カリケアマイシンがカリケアマイシンのＮ−アセチル誘導体またはジスルフィド類似物
である請求項３１記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
カリケアマイシンがＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンである請求項３２記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
薬物がリンカーを介して抗体に結合する請求項２６記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３５】
リンカーが４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）、およびその誘導体からなる群から選択される請求項３４記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３６】
（ｉ）請求項１記載の抗−５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）抗−５Ｔ４抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む抗体／薬物コンジュゲートと細胞を接触させることを特徴とする、薬物を５Ｔ４−発現性細胞に送達する方法。
【請求項３７】
薬物が標的細胞中に内在化される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）請求項１記載の抗−５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）抗−５Ｔ４抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む治療上有効量の抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを対象に投与することを特徴とする、５Ｔ４−陽性癌を有する対象の治療方法。
【請求項３９】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートが抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートであり、さらに、第２の治療剤を投与することを含み、ここに、抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートおよび第２の治療剤が同時に、またはいずれかの順序で連続的に投与される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
配列番号８７の残基２１３−２１４を除く残基１７３−２５２および２７６−３５５を含むヒト５Ｔ４エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４１】
配列番号８７のアミノ酸２７６−３５５を含むヒト５Ｔ４エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４２】
配列番号８７のアミノ酸８３−１６３を含むヒト５Ｔ４エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４３】
配列番号８６のアミノ酸を有するカニクイザル５Ｔ４に特異的に結合する抗体。
【請求項４４】
（ａ）配列番号８５または８６のアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号８５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
を含む単離５Ｔ４タンパク質。
【請求項４５】
請求項４４記載の単離５Ｔ４タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項４６】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５−４０５のヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号４８、５０、５３または５５のいずれか１つをコードしているヌクレオチド配列、
（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５０と８９％同一のヌクレオチド配列、
（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５３と８２％同一のヌクレオチド配列、または
（ｇ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸
を含む抗−５Ｔ４重鎖可変領域をコードしている単離核酸。
【請求項４７】
（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド６７−３９０のヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３または７５のいずれか１つのヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列、
（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５９と８４％同一のヌクレオチド配列、
（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号６９と８６％同一のヌクレオチド配列、
（ｇ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号７５と８５％同一のヌクレオチド配列、または
（ｈ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸
を含む抗−５Ｔ４軽鎖可変領域をコードしている単離核酸。
【請求項１】
（ａ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体の抗原結合ドメインを含み、
（ｂ）ネズミＡ１、Ａ２またはＡ３抗体と５Ｔ４結合について競合し、
（ｃ）Ａ１、Ａ２またはＡ３抗体によって結合される５Ｔ４エピトープと結合し、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の抗体の５Ｔ４−結合フラグメントを含む
ヒト５Ｔ４抗原に特異的に結合する抗体。
【請求項２】
抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、四量体抗体、四価抗体、多特異的抗体、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体または融合タンパク質である請求項１記載の抗体。
【請求項３】
ネズミモノクローナル抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項４】
ヒト５Ｔ４抗原に対して、少なくとも約１×１０−７Ｍ〜約１×１０−１２Ｍの結合アフィニティーを有する請求項１記載の抗体。
【請求項５】
イン・ビボで５Ｔ４発現性細胞を特異的に標的とする請求項１記載の抗体。
【請求項６】
重鎖可変領域が配列番号２の残基２０−１３８、配列番号６の残基１９−１３５、配列番号１０の残基２０−１４１、配列番号４９の残基１−１１９、またはヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３重鎖可変領域の残基のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項７】
軽鎖可変領域が配列番号４の残基２１−１２７、配列番号８の残基２３−１３０、配列番号１２の残基２１−１２７、またはヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域の残基のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項８】
重鎖可変領域が配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項９】
重鎖可変領域が配列番号６の残基１９−１３５由来のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号８の残基２３−１３０由来のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項１０】
重鎖可変領域が配列番号１０の残基２０−１４１由来のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号１２の残基２１−１２７由来のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗体。
【請求項１１】
キメラまたはヒト化抗−５Ｔ４抗体である請求項２記載の抗体。
【請求項１２】
ヒト定常領域由来の定常領域を含む請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１３】
ヒト軽鎖定常領域がヒトカッパ軽鎖定常領域から由来する請求項１２記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１４】
ヒト重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４重鎖定常領域から由来する請求項１２記載のキメラまたはヒト化抗体または抗体フラグメント。
【請求項１５】
ヒトＩｇＧ４重鎖定常領域が２４１位置にプロリンを含む請求項１４記載のキメラまたはヒト化抗体または抗体フラグメント。
【請求項１６】
少なくとも１つの軽鎖または少なくとも１つの重鎖の可変領域が
（ａ）ヒト抗体フレームワーク領域の残基を含むフレームワーク領域、および
（ｂ）配列番号４、８または１２の軽鎖可変領域の１以上のＣＤＲ、あるいは配列番号２、６または１０の重鎖可変領域の１以上のＣＤＲ
を含む請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１７】
ヒト残基が
（ａ）ＤＰ−２１（ＶＨ７）、ＤＰ−５４（ＶＨ３−０７）、ＤＰ−４７（ＶＨ３−２３）、ＤＰ−５３（ＶＨ−７４）、ＤＰ−４９（ＶＨ３−３０）、ＤＰ−４８（ＶＨ３−１３）、ＤＰ−７５、ＤＰ−８（ＶＨ１−２）、ＤＰ−２５、ＶＩ−２ｂおよびＶＩ−３（ＶＨ１−０３）、ＤＰ−１５およびＶ１−８（ＶＨ１−０８）、ＤＰ−１４およびＶ１−１８（ＶＨ１−１８）、ＤＰ−５およびＶ１−２４Ｐ（ＶＨ１−２４）、ＤＰ−４（ＶＨ１−４５）、ＤＰ−７（ＶＨ１−４６）、ＤＰ−１０、ＤＡ−６およびＹＡＣ−７（ＶＨ１−６９）、ＤＰ−８８（ＶＨ１−ｅ）、ＤＰ−３およびＤＡ−８（ＶＨ１−ｆ）からなる群から選択されるヒト抗体重鎖フレームワーク領域；
（ｂ）ＤＰＫ２４サブグループＩＶ生殖細胞系クローン、ＶκＩＩＩサブグループ（ＤＰＫ２３、ＤＰＫ２２、ＤＰＫ２０、ＤＰＫ２１）、またはＶκＩサブグループ生殖細胞系クローン（ＤＰＫ９、ＤＰＫ１、Ｏ２、ＤＰＫ−７）のヒト抗体軽鎖フレームワーク領域、
（ｃ）（ａ）の重鎖フレームワーク領域のコンセンサス配列、または
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のフレームワーク領域と少なくとも６３％同一のフレームワーク領域
からなる群から選択されるヒトフレームワーク残基である、請求項１６記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１８】
配列番号２、４、６、８、１０または１２のいずれか１つの少なくとも２つのＣＤＲを含む、請求項１６記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項１９】
軽鎖が配列番号４、８または１２のいずれか１つの少なくとも２または３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項１８記載のヒト化抗体。
【請求項２０】
軽鎖が配列番号４、８または１２のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項１９記載のヒト化抗体。
【請求項２１】
重鎖が配列番号２、６または１０のいずれか１つの少なくとも２または３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項１６記載のヒト化抗体。
【請求項２２】
重鎖が配列番号２、６または１０のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む可変領域を含む、請求項２１記載のヒト化抗体。
【請求項２３】
配列番号２および４のＣＤＲ、配列番号６および８のＣＤＲ、または配列番号１０および１２のＣＤＲを含む請求項１６記載のヒト化抗体。
【請求項２４】
重鎖可変領域配列が
（ａ）配列番号２の残基２０−１３８のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号２の残基２０−１３８と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号６の残基１９−１３５のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号６の残基１９−１３５と少なくとも８６％同一のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１０の残基２０−１４１のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１０の残基２０−１４１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号４９、５１、５２、５４、５６、７７、７８、８１または８２のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号５１と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号５４と少なくとも７８％同一のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号７７と少なくとも８９％同一のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号７８と少なくとも７９％同一のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号８１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号８２と少なくとも７８％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項２５】
軽鎖可変領域配列が
（ａ）配列番号４の残基２１−１２７のアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号４の残基２１−１２７と少なくとも９４％同一のアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号８の残基２３−１３０のアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号８の残基２３−１３０と少なくとも９６％同一のアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号１２の残基２１−１２７のアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号１２の残基２１−１２７と少なくとも９８％同一のアミノ酸配列、
（ｇ）配列番号５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７９、８０、８３または８４のいずれか１つのアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号６０と少なくとも８３％同一のアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号７０と少なくとも９３％同一のアミノ酸配列、
（ｊ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
（ｋ）配列番号７６と少なくとも８５％同一のアミノ酸配列、
（ｌ）配列番号７９と少なくとも８８％同一のアミノ酸配列、
（ｍ）配列番号８０と少なくとも８４％同一のアミノ酸配列、
（ｎ）配列番号８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列、
（ｏ）配列番号８４と少なくとも９１％同一のアミノ酸配列
を含む、請求項１１記載のキメラまたはヒト化抗体。
【請求項２６】
（ａ）請求項１記載の抗体、および
（ｂ）抗体に直接または間接的に結合する薬物
を含む薬物送達のための抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項２７】
薬物が、細胞毒、放射性同位元素、免疫調節剤、抗脈管形成剤、抗増殖剤、プロ−アポトーシス剤、化学療法剤、および治療的核酸からなる群から選択される治療剤である請求項２６記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項２８】
治療剤が細胞毒である請求項２７記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
細胞毒が、抗生物質、チューブリン重合阻害剤、アルキル化剤、タンパク質合成阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または酵素である請求項２６記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
細胞毒が抗生物質である請求項２７記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３１】
抗生物質がカリケアマイシンである請求項３０記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３２】
カリケアマイシンがカリケアマイシンのＮ−アセチル誘導体またはジスルフィド類似物
である請求項３１記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３３】
カリケアマイシンがＮ−アセチル−γ−カリケアマイシンである請求項３２記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３４】
薬物がリンカーを介して抗体に結合する請求項２６記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３５】
リンカーが４−（４’−アセチルフェノキシ）ブタン酸（ＡｃＢｕｔ）、３−アセチルフェニル酸性酸（ＡｃＰａｃ）、４−メルカプト−４−メチル−ペンタン酸（Ａｍｉｄｅ）、およびその誘導体からなる群から選択される請求項３４記載の抗体／薬物コンジュゲート。
【請求項３６】
（ｉ）請求項１記載の抗−５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）抗−５Ｔ４抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む抗体／薬物コンジュゲートと細胞を接触させることを特徴とする、薬物を５Ｔ４−発現性細胞に送達する方法。
【請求項３７】
薬物が標的細胞中に内在化される請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
（ｉ）請求項１記載の抗−５Ｔ４抗体、および（ｉｉ）抗−５Ｔ４抗体に直接または間接的に結合する薬物を含む治療上有効量の抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートを対象に投与することを特徴とする、５Ｔ４−陽性癌を有する対象の治療方法。
【請求項３９】
抗−５Ｔ４抗体／薬物コンジュゲートが抗−５Ｔ４抗体／カリケアマイシンコンジュゲートであり、さらに、第２の治療剤を投与することを含み、ここに、抗−５Ｔ４／カリケアマイシンコンジュゲートおよび第２の治療剤が同時に、またはいずれかの順序で連続的に投与される、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
配列番号８７の残基２１３−２１４を除く残基１７３−２５２および２７６−３５５を含むヒト５Ｔ４エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４１】
配列番号８７のアミノ酸２７６−３５５を含むヒト５Ｔ４エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４２】
配列番号８７のアミノ酸８３−１６３を含むヒト５Ｔ４エピトープに特異的に結合する抗体。
【請求項４３】
配列番号８６のアミノ酸を有するカニクイザル５Ｔ４に特異的に結合する抗体。
【請求項４４】
（ａ）配列番号８５または８６のアミノ酸配列、または
（ｂ）配列番号８５と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列
を含む単離５Ｔ４タンパク質。
【請求項４５】
請求項４４記載の単離５Ｔ４タンパク質に特異的に結合する抗体。
【請求項４６】
（ａ）配列番号１のヌクレオチド５８−４１４のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号５のヌクレオチド５５−４０５のヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号９のヌクレオチド５８−４２３のヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号４８、５０、５３または５５のいずれか１つをコードしているヌクレオチド配列、
（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５０と８９％同一のヌクレオチド配列、
（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５３と８２％同一のヌクレオチド配列、または
（ｇ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸
を含む抗−５Ｔ４重鎖可変領域をコードしている単離核酸。
【請求項４７】
（ａ）配列番号３のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、
（ｂ）配列番号７のヌクレオチド６７−３９０のヌクレオチド配列、
（ｃ）配列番号１１のヌクレオチド６１−３８１のヌクレオチド配列、
（ｄ）配列番号５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３または７５のいずれか１つのヒト化Ａ１、Ａ２またはＡ３軽鎖可変領域をコードしているヌクレオチド配列、
（ｅ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号５９と８４％同一のヌクレオチド配列、
（ｆ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号６９と８６％同一のヌクレオチド配列、
（ｇ）クエリカバレッジが１００％のときに、配列番号７５と８５％同一のヌクレオチド配列、または
（ｈ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つの相補物に特異的にハイブリダイズする核酸
を含む抗−５Ｔ４軽鎖可変領域をコードしている単離核酸。
【図２】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図５】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９−Ａ】
【図９−Ｂ】
【図９−Ｃ】
【図９−Ｄ】
【図９−Ｅ】
【図９−Ｆ】
【図９−Ｇ】
【図９−Ｈ】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図３−Ａ】
【図３−Ｂ】
【図４−Ａ】
【図４−Ｂ】
【図４−Ｃ】
【図５】
【図６−Ａ】
【図６−Ｂ】
【図７】
【図８】
【図９−Ａ】
【図９−Ｂ】
【図９−Ｃ】
【図９−Ｄ】
【図９−Ｅ】
【図９−Ｆ】
【図９−Ｇ】
【図９−Ｈ】
【図１０−１】
【図１０−２】
【図１０−３】
【図１１】
【図１２−１】
【図１２−２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【公表番号】特表２００９−５２９５７８（Ｐ２００９−５２９５７８Ａ）
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５００５６５（Ｐ２００９−５００５６５）
【出願日】平成１９年３月９日（２００７．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６７４４
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年８月２０日（２００９．８．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年３月９日（２００７．３．９）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０６３６８５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１０６７４４
【国際公開日】平成１９年９月２０日（２００７．９．２０）
【出願人】（５９１０１１５０２）ワイス (573)
【氏名又は名称原語表記】Ｗｙｅｔｈ
【Ｆターム（参考）】
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