抗体ライブラリーを作製およびスクリーニングするための新規な方法
本発明は、抗体を産生することができる細胞のＲＮＡから少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための方法に関する。より詳しくは、本発明は、モノクローナル抗体ライブラリーの作製に関する。本発明はまた、癌を処置するためのモノクローナル抗体、好ましくはヒト抗体をスクリーニングするための抗体ライブラリーの使用に関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、他のヒト抗体の中でもモノクローナル抗体の分野に関する。より詳しくは、本発明は、好ましくは、抗体を発現し得る細胞由来の全ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡから、少なくとも１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための新規な方法に向けられている。本発明はまた、先の方法の工程を適用し、抗体、好ましくはヒト抗体のバンクまたはライブラリーを作製するための方法も含んでなる。
【０００２】
「バンク」または「ライブラリー」という表現は、本明細書において違いなく用いられ、これらの表現は双方とも同じ意味を有する。
【０００３】
従来、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、Kohler and Milstein (Kohler and Milstein, 1975, Nature 256, 495)により記載されているハイブリドーマの標準的技術を用いることによって作製され、それにより得られた抗体を次にヒト化されてきた。
【０００４】
もっと最近では、ヒトモノクローナル抗体を作製および発現させるために、天然機構の理解とＤＮＡ組換え技術の開発に基づいた新規な方法が開発された。特に、抗体のコンビナトリアルライブラリーまたはバンクを得ることを目的とする技術は多くの開発の課題となっている。このような技術は、より迅速であり、ヒト化工程なしで行えるということに加え、抗体そのものおよび抗体リストの変異性のより有効な使用を提供する。
【０００５】
抗体は、分子の柔軟性を提供する多様な数のジスルフィド橋により互いに連結された２本の重鎖（重鎖としてのＨ）と２本の軽鎖（軽鎖としてのＬ）の４本のポリペプチド鎖で形成された免疫グロブリンのスーパーファミリーの糖タンパク質である。これらの鎖はＹ型の構造を形成し、アミノ酸約１１０個の免疫グロブリンドメインからなる。各軽鎖は定常領域と可変領域からなり、重鎖は可変領域とイソ型によって３つまたは４つの定常領域からなる。
【０００６】
ある抗体に関して、２本の重鎖は同一であり、同じことが２本の軽鎖についても当てはまる。
【０００７】
定常領域は、ある抗体から他の抗体まで極めて密接に関連するアミノ酸配列を特徴とし、その種およびイソ型に特徴的である。各軽鎖はＣＬとして示されるその典型例を有する。重鎖はイソ型によって３つまたは４つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。
【０００８】
抗体は２本の「腕」の末端に位置する４つの可変領域を有する。重鎖（ＶＨ）が持つ可変領域と軽鎖（ＶＬ）が持つ隣接可変領域の間の会合は、その抗原の認識部位（またはパラトープ）を形成する。従って、免疫グロブリン分子は各末端に１つずつ、抗原と結合するための２つの部位を有する。これらの両部位は同一であるので、１つの抗体につき２つの抗原分子が結合する可能性がある。
【０００９】
重鎖では、可変領域ＶＨは、３種類のセグメント、すなわち、変動性セグメント（ｖセグメントまたは遺伝子）、多様性セグメント（ｄセグメントまたは遺伝子）および接合セグメント（ｊセグメントまたは遺伝子）を含む遺伝子によりコードされる。軽鎖ＶＬの可変領域をコードする遺伝子も遺伝子ｖと遺伝子ｊを有するが、遺伝子ｄは有さない。
【００１０】
まず、ナイーブな免疫レパートリーは、可変領域をコードする種々の遺伝子のコンビナトリアルな再編成に由来する。より詳しくは、重鎖の遺伝子ｖ、ｄ、ｊと軽鎖の遺伝子ｖ、ｊは互いに独立に会合可能であり、このことは生成され得る可変領域の大きな多様性を説明する。構造の異なる極めて多数の機能的単位が生じ得るこの第一の機構はコンビナトリアルダイバーシティー(combinatorial diversity)と呼ばれる。
【００１１】
他の２つの機構がこの多様性を高め、１つはＢリンパ球の分化の最初の段階で起こり（ジャンクショナルダイバーシティー(junctional diversity)）、もう１つは抗原刺激により誘発される免疫応答中に起こる（体細胞超変異(somatic hypermutation)）。
【００１２】
ジャンクショナルダイバーシティーは、重鎖では遺伝子ｖ−ｄおよびｄ−ｊ、軽鎖ではｖ−ｊの間の接合部におけるコンビナトリアルな再編成の際の突然変異の出現に基づく。
【００１３】
抗体の親和性の成熟は、ＶＨおよびＶＬ領域をコードする領域においてもっぱら生じる点様突然変異からなり、パラトープの構造変化の起源となり得る体細胞超変異を選択するプロセスによって起こる。
【００１４】
従って、多様性は記載した３つの要素、すなわち、コンビナトリアルダイバーシティー、ジャンクショナルダイバーシティーおよび体細胞超変異に基づく。
【００１５】
これらの要素を用いて始め、ヒト抗体の大きな多様性を迅速に生じさせることができるように種々の技術が開発され、特に、技術的にハイブリドーマを得るのが困難なヒト抗体の場合に注目されることが分かった。
【００１６】
より詳しくは、いわゆる「ファージディスプレー」技術(Smith, 1985, Science, 228:1315; Scott & Smith, 1990 Science, 249:386; McCafferty, 1990, Nature, 348:552)の出現が、in vitroでライブラリーから、多様な標的、または抗原に対して向けられた抗体またはヒト抗体のフラグメントを選択できる可能性を与えた。これらのライブラリーは２つの群、すなわち、天然ライブラリーと合成ライブラリーに分けられる。
【００１７】
天然ライブラリーはヒトＢ細胞から直接回収された遺伝子から、従って、コンビナトリアルダイバーシティー、ジャンクショナルダイバーシティーおよび体細胞超変異を保証する種々の機構の後に構築される。よって、このようなライブラリーを用いれば、多様な抗体を天然に作製することができる。
【００１８】
さらに、これらの天然ライブラリーは、確立され、実証された技術を用いるという利点を有し、細菌、酵母、真核細胞または植物などの種々の発現系との適合が可能である。
【００１９】
しかしながら、これらのライブラリーの作製は扱いにくく、適用が困難であり、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）工程に頼る必要がある。このＰＣＲ工程の適用では、既知の生殖細胞系からこのＰＣＲに必要なプライマーを定義するために、５’および３’領域の個々の配列を知っておく必要がある。もしこの点が遺伝子ｃ（すなわち、抗体の定常領域をコードする）に位置する３’末端に関して特に厄介でなければ、それは、それに対して遺伝子ｖ、すなわち変動性遺伝子の末端に位置する５’末端に関して限定する。遺伝子ｖの５’領域に関して必要とされるこの知見は、本質的に、選択可能なプライマーをこれまでに知られている生殖細胞系由来のプライマーに限定し、従って、既知の遺伝子ｖ配列に限定する。これは、回収され得る抗体をそれらの可変領域の５’領域に既知の配列を有する抗体に限定し、従って、遺伝子ｖの５’末端の配列が知られていない他の総ての抗体を排除するという結果となる。さらに、クローニングおよび／または増幅を容易にするために可変領域のアミノ酸を改変する必要もあり得る。
【００２０】
遺伝子ｖの５’末端に関して必要な知見から来るもう１つの欠点が、この末端で体細胞超変異が生じた抗体を見過ごすというリスクである。
【００２１】
最後に、ＰＣＲ技術のために、遺伝子ｖの５’末端が、用いるプライマーと極めて強い親和性を有する抗体だけが、親和性の低いものが保持されずに、優先物として回収される。
【００２２】
それらに関する合成ライブラリーは、種々の非再編成遺伝子から構築される。それらの再編成はin vitroにおいてＰＣＲにより行われ、次に、特異性および親和性に関して最良の抗体を得るために種々のin vivo成熟機構が適用され得る。
【００２３】
合成ライブラリーに頼れば、得られる抗体の多様性を増し、かつ、これらの種々の発現系との適合を保持することができる。しかしながら、それでもやはり、それらを作製するのに必要な作業には時間と労力がかかり、多くの欠点が残るのはそのままである。実際、合成ライブラリーを作製するには、ＰＣＲ工程が常に必須である。ＰＣＲに使用に関連する上述の欠点に加え、この工程はサイズの大きな縮重プライマーの使用を必要とし、これはしばしば組み立てられたｖ、ｄ、ｊ遺伝子内の塩基対の欠失、付加および改変を導入し、これがまた、それらを適切に折りたたむことができない抗体の形成をもたらし、機能的でなくなく場合がある。さらに、これらのライブラリーから選択された抗体は一般に発現が弱く、多くの場合、抗体の免疫原性に影響を及ぼし得る突然変異を含む。
【００２４】
さらに、合成ライブラリーの作製では、体細胞超変異のジャンクショナルダイバーシティーを保証する接合領域における突然変異を考慮に入れることができない。従って、多様性の大きな損失がある。
【００２５】
本発明は、重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するため、最も詳しくは、広い多様性を有する抗体のライブラリーを作製するための簡単な方法を初めて記載することにより、上記に挙げた欠点をまとめて克服することをねらいとする。よって、本発明の目的は、その利点を有するだけでなく、合成ライブラリーの利点も有し、それとともにこれら２つの技術それぞれの個々の欠点を排除しつつ、抗体の重鎖および／または軽鎖の天然ライブラリーを作製する方法である。
【００２６】
より詳しくは、本発明は、ＰＣＲ増幅工程を用いずに行うことによりこれまでに知られているどの技術とも異なり、従って、このＰＣＲ工程に関連する上記のどの欠点とも異なる。最も詳しくは、本発明の目的である技術は、もはや、抗体の可変ドメインの遺伝子ｖの５’末端の配列が既知である必要はない。本発明は、増幅工程が一本鎖ＤＮＡ配列に対して行われるという点で先行技術と異なる。実際、標準的なＰＣＲ増幅工程、すなわち、二本鎖ＤＮＡ分子に対するものに限定される当業者の先入観および技術の現状の一体とは異なり、本発明は、単一の一次プライマーから、また、この一次プライマーから得られた一本鎖ｃＤＮＡ配列から抗体バンクを作製する方法を初めて記載する。
【００２７】
第一の態様によれば、本特許出願の目的は、抗体、または少なくとも抗体の重鎖および／もしくは軽鎖をコードするＲＮＡを発現し得る細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製する方法に向けられ、該方法は少なくとも以下の工程：
ａ）一次プライマー（Ｉ）を、抗体の重鎖または軽鎖をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（ここでは「センス」ＲＮＡと表す）を含むべき該ＲＮＡ抽出物または混合物と接触させる工程（この一次プライマーは該「センス」ＲＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、該抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域Ｃをコードする配列に含まれる）；
ｂ）該一次プライマー（Ｉ）から、「アンチセンス」ｃＤＮＡと表される一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
ｃ）必要に応じて、工程ａ）でハイブリダイズされなかった一次プライマー（Ｉ）を除去する工程；
ｄ）該「アンチセンス」ｃＤＮＡを、その５’末端とその３’末端の間に共有結合を導入することによってアニーリングする工程；
ｅ）「センス」二次プライマーと表される二次プライマー（ＩＩ）を、工程ｄ）で得られた「アンチセンス」環状ｃＤＮＡと接触させる工程（この「センス」二次プライマー（ＩＩ）は該「アンチセンス」環状ｃＤＮＡとハイブリダイズすることができる）；
ｆ）該二次プライマー（ＩＩ）から該「アンチセンス」ｃＤＮＡを増幅させる工程；および
ｇ）それにより増幅された「センス」相補的ＤＮＡ直鎖を回収する工程
を含む。
【００２８】
ＰＣＲ工程に頼るのであれば、そこに相補的プライマーをハイブリダイズさせ、それにより二本鎖分子の従来技術による増幅を開始させることができるには、増幅されるべき遺伝子の５’末端および３’末端それぞれの配列を知っておく必要がある。
【００２９】
本発明の実際の原理は、アニーリングされた一本鎖ＤＮＡ配列を適切な酵素で増幅させることができることに基づく。従って、当業者には、増幅されるべき配列の３’末端の１つの相補的プライマーだけが必要とされることが明らかであろう。そして、より詳しくは、抗体をコードする配列を作製するという範囲内で、本発明に従う増幅には、定常領域に相当する配列の全部または一部の相補的プライマーだけが必要となる。この場合、そのプライマーを一本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、「センス」ＲＮＡ分子に結合させれば、一本鎖配列を増幅させることができる好適な酵素を用いてこれを増幅するに十分である。
【００３０】
当業者ならば、前記が可変領域に相当する「センス」ＲＮＡ配列の全体的増幅を可能とし、その５’末端である限り、すなわち、必要であれば、シグナルペプチドならびに５’−ＵＴＲ領域に相当する配列を含むという点で、本発明の目的である本発明によりもたらされる利点を容易に理解するであろう。
【００３１】
この技術によって単離された抗体は、次に、真核生物発現系においてこのような抗体を発現させるのに最適な、その元のシグナルペプチドとともに直接クローニングすることができるという点で、この態様は特に有利である。実際、元のシグナルペプチドが存在しなければ、発現ベクターにおける抗体のクローニングは、非天然シグナルペプチドの付加が必要となり、常に抗体の遺伝子の５’末端の配列を知っておく必要があり、このような抗体の核酸配列および／またはタンパク質配列の改変の導入の可能性がある。さらに、このような方法を用いれば、上記の欠点を総て排除すること可能性である。
【００３２】
上記の各工程は、この工程に求められる必須の結果が、やはり本発明の目的から、また、この方法の保護の所望の範囲から逸脱することなく得ることができる等価の工程で置き換えてよいことは明らかである。明瞭にするために、ここで、本特許出願の全体において、「センス」および「アンチセンス」という表現は、当業者にとって標準的な方法での参照体系として、最初のＲＮＡ分子、すなわち、抗体の重鎖または軽鎖をコードするＲＮＡ分子の５’３’方向を持つことを明記する。
【００３３】
よって、論理的に、一次プライマー（Ｉ）とこのプライマーから作製されたｃＤＮＡ分子は、両者とも該ＲＮＡに相補的であり、これにより「アンチセンス」という表現により特徴付けられる。同様に、二次プライマー（ＩＩ）ならびにこのプライマーから作製された直鎖ＤＮＡ分子は、両者とも作製されたｃＤＮＡに相補的であり、従って、最初のＲＮＡ配列のような配向を持ち、「センス」という表現により特徴付けられる。最後に、同様に、三次プライマー（ＩＩＩ）およびこの三次プライマーから作製された相補的ＤＮＡ配列は、それらに関して、「アンチセンス」という表現により特徴付けられる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡの抽出物または混合物が由来する細胞は哺乳類細胞、好ましくは、マウス、ラットまたは霊長類のものであり、ヒト起源が最も好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ抽出物または混合物は、全ＲＮＡの抽出物または混合物、メッセンジャーおよび／またはプレメッセンジャーＲＮＡが富化されたＲＮＡの抽出物または混合物である。
【００３６】
第二の実施形態によれば、本発明の目的である該方法は、天然細胞、健常細胞、または病的組織もしくは器官、とりわけ腫瘍由来の細胞に直接適用可能であり、これらの細胞は抗体の重鎖または軽鎖をコードするＲＮＡを発現することができる。本発明の目的である該方法はまた、健常細胞または病的細胞由来の細胞系統の細胞にも適用可能である。
【００３７】
また、本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡの抽出物または混合物は脾細胞、結節またはＢリンパ球に起源する。
【００３８】
好ましくは、ＲＮＡ混合物の抽出物が由来する細胞はＢリンパ球またはその前駆体の１つまたは形質細胞である。好ましくは、これらの細胞はプロ−Ｂ前駆細胞（すでにＢ細胞系に約束された幹細胞）、プレ−Ｂ前駆細胞、未熟Ｂリンパ球、免疫適格成熟Ｂリンパ球または形質細胞から選択される（これらの細胞の特徴に関しては、とりわけ、ImmunoGeneticsサイト<<http://imgt.cines.fr/textes/IMGTeducatio n/Tutorials/IGandBcells/_FR/Differenciation B/>>でProfessors Marie-Paule LEFRANC and Gerard LEFRANC, Universite Montpellier II and Laboratoire d'ImmunoGenetique Moleculaire, LIGMによる刊行物「Differenciation des lymphocytes B」に示されている定義を参照）。
【００３９】
本発明の極めて好ましい実施形態によれば、ＲＮＡ抽出物または混合物はＢリンパ球に由来する。
【００４０】
特定の実施形態によれば、ＲＮＡが起源する細胞は細胞系統由来の細胞、健常な哺乳類または予め治療有効成分、とりわけ、免疫原またはワクチン（後者は抗感染性または抗腫瘍性ワクチンであり得る）としての抗原で処置された哺乳類からの単離細胞である。これらの細胞の中で、癌に罹患している、またはさらに病原性ウイルスに感染している患者からの細胞を挙げることもできる。
【００４１】
よって、本発明の利点は、多様な細胞材料で始めて実施できるという可能性が得られることである。
【００４２】
例えば、本発明の別の実施形態によれば、例えば、一方が脾臓由来のＢリンパ球ともう一方が骨髄腫細胞の間の融合から得られるハイブリドーマなどの形質転換細胞で始めて実施することが望ましい場合がある。
【００４３】
この適用では、本発明に従う方法の利益の１つは、ＰＣＲ増幅を用いずに、従って、抗体の５’末端の配列を知ることなく、該ハイブリドーマにより発現されたモノクローナル抗体の天然配列を得ることができるということである。得られた配列はまた、該抗体の天然シグナルペプチド、および５’ＵＴＲ領域をコードする配列も含んでなる。この基礎において、この抗体は当業者に公知の標準的な手段によってクローニングしてもよいし、あるいはまた、該抗体に相当する遺伝子を、ＰＣＲ工程の必要なく、完全に合成してもよい。
【００４４】
よって、本発明に従う方法の特定の実施形態では、抗体を発現し得る細胞はハイブリドーマにおいてである。
【００４５】
特定の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡおよび一次プライマー（Ｉ）からの工程ｂ）におけるｃＤＮＡの合成は、とりわけ、逆転写酵素とヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ）の存在下でプライマーからｃＤＮＡの合成を得るために当業者に周知のいずれかの技術で行われる。
【００４６】
前記ｃＤＮＡの合成に用いられる一次プライマー（Ｉ）は、その５’末端に、工程ｂ）で合成されたｃＤＮＡの３’末端に共有結合により結合できる基を含んでなり、それによりこのｃＤＮＡのアニーリングが起こり、この基は一次プライマー（Ｉ）の合成の際に導入することができる。これらの基の中でもＰＯ４基が好ましく、この基は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、前記の合成ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端とホスホジエステル型の共有結合を形成することができる。
【００４７】
特定の実施形態では、アニーリング工程ｄ）の前に、反応媒体中にハイブリダイズしていない一次プライマー（Ｉ）の残存物が確実に残っていないようにすることが好ましく、これは該プライマー（Ｉ）のアニーリングを避け、そして、抗体のアニーリングしたｃＤＮＡよりもアニーリングしたプライマー（Ｉ）の増幅が起こらないようにするためである。
【００４８】
これを行うため、限定されない例として、サイズフィルタリングによるか、またはｃＤＮＡの精製製品を用いるか（１００塩基対（ｂｐ）未満の材料を排除することが分かっている）、またはさらにアガロースゲルでの分離を用いた精製による、ｃＤＮＡ合成後の反応媒体の洗浄などのいくつかの解決法が意図される。もう１つの代替法によれば、用いる一次プライマー（Ｉ）の量は飽和量を下回るように至適化され、この構成では工程ｃ）は必要とされない。
【００４９】
本発明のもう１つの好ましい実施形態によれば、該一次プライマー（Ｉ）は、定常領域Ｃに相当する「センス」ＲＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である。
【００５０】
本発明のこの態様は、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域をコードする配列の少なくとも一部を特異的に認識するプライマーからの抗体のアニーリングしたｃＤＮＡの合成、その後の特異的増幅を可能とするという意味で有利である。
【００５１】
特定の好ましい実施形態では、該ｃＤＮＡの合成に用いる一次プライマー（Ｉ）は、その５’末端に、工程ｂ）で合成されたｃＤＮＡの３’末端に共有結合により結合することができる基を含んでなり、それによりこのｃＤＮＡのアニーリングが起こり、この基は一次プライマー（Ｉ）の合成の際に導入される。これらの基の中でもＰＯ４基が好ましく、この基はＤＮＡリガーゼの存在下で合成されたｃＤＮＡの３’ＯＨ末端とホスホジエステル型の共有結合を形成することができる。
【００５２】
ｃＤＮＡ配列がアニーリングされる場合、当業者ならば、二次プライマー（ＩＩ）が特異的であってもなくてもよく、これは「ローリングサークル」で増幅し、このｃＤＮＡ配列全体が増幅されることを理解することができる。本発明の実施形態によれば、ランダムプライマーが使用可能である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、該二次プライマー（ＩＩ）は該「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端と、定常領域Ｃに相当する該「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列の３’末端の間に含まれる配列に特異的である。
【００５４】
いっそうより好ましくは、該二次プライマー（ＩＩ）は、「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列と特異的である。
【００５５】
これは図面から明らかとなるが、「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端はまた、一次プライマー（Ｉ）の５’末端に相当し、該「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列は、当然のことながら、一次プライマー（Ｉ）により開始される。
【００５６】
本発明の可能性のある実施形態によれば、本発明の方法の工程ｅ）で適用される該二次プライマー（ＩＩ）は、一次プライマー（Ｉ）をコードする配列の全体とハイブリダイズすることができる「アンチセンス」プライマーからなる。別の可能性のある実施形態によれば、この二次プライマー（ＩＩ）は一次プライマー（Ｉ）の大きさよりも小さく、一次プライマー（Ｉ）をコードする配列内でハイブリダイズする。
【００５７】
より詳しくは、本発明は、該一次（Ｉ）プライマーおよび二次（ＩＩ）プライマーがそれぞれ１０〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡ配列からなることを特徴とする方法を目的とする。
【００５８】
いっそうより好ましくは、本発明による方法は、該一次（Ｉ）プライマーおよび二次（ＩＩ）プライマーがそれぞれ、一次プライマー（Ｉ）については２０〜６０ヌクレオチドの間、そして二次プライマー（ＩＩ）については１０〜３０ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡ配列からなることを特徴とする。
【００５９】
従来、「アンチセンス」ｃＤＮＡ鎖の合成は、遊離ヌクレオチドと、限定されない例として、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ、またはさらには鳥類骨髄芽球症ウイルスまたはモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素などの逆転写酵素型の酵素を加えることにより行われる。
【００６０】
好ましくは、本発明による方法は、一次プライマー（Ｉ）のハイブリダイゼーション工程ａ）の前にＲＮＡ変性のための工程を含んでなる。
【００６１】
回収されたＲＮＡの変性は従来、当業者に公知のいずれの方法によって達成してもよい。限定されない例として、反応混合物を６５℃以上に加熱することが挙げられ、これはＲＮＡの二次構造を変性させる。変性冷却の際に反応混合物中に一次プライマー（Ｉ）が存在すると、一次プライマーと、高い特異性を有する該ＲＮＡ中のその相補的配列とのハイブリダイゼーションが可能となる。さらに、例えばＴ４遺伝子３２補因子などのタンパク質補因子を添加してもよい。これにより、ｃＤＮＡの非特異的合成の軽減が可能となる(This allows i.a. reduction of non-specific synthesis of cDNA.)。
【００６２】
本発明に従う方法の鍵となる工程の１つは、「アンチセンス」ｃＤＮＡのアニーリングにある。この工程は当業者に公知のいずれの技術によって行ってもよい。実際、増幅のために従来のＰＣＲ工程を排除できるということは、一本鎖形態で増幅されるｃＤＮＡ分子がアニーリングされるという事実に大部分基づいている。このＤＮＡのアニーリング原理はそれ自体が新規なものでなければ、本発明の範囲内でのその適用、すなわち、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする配列の作製は新規であり、これまでに記載されていない。
【００６３】
このアニーリング工程は、それが同じモノカテナリー（一本鎖）ＤＮＡの５’末端と３’末端の共有結合による結合を可能とする限り、当業者に公知のいずれの技術を用いて行ってもよい。
【００６４】
好ましくは、該アニーリング工程は、「ｓｓＤＮＡリガーゼ」型のリガーゼ（「ｓｓＤＮＡ」は「一本鎖ＤＮＡ」をさす）との接触により行われる。
【００６５】
一実施形態によれば、リガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre, Madison, WI, USA)またはｓｓＤＮＡサーモファージまたはいずれかの等価の酵素から選択される。
【００６６】
しかしながら、本発明に従う好ましい実施形態によれば、このリガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）または等価の酵素からなる。
【００６７】
さらに詳しくは、当業者ならば、以下の刊行物(Polidoros, A.N. et al., Biotechniques 41(1), 35 (2006))を参照することができる。
【００６８】
好ましくは、用いるリガーゼは、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入する。これを行うために、該ｃＤＮＡの合成に用いる一次プライマー（Ｉ）の合成の際にその５’末端に予めＰＯ４基が導入された。当然のことながら、同じ機能をもたらし得る、すなわち、ｃＤＮＡ分子の５’末端と３’末端の間の共有結合を可能とする他のいずれの基も使用可能である。
【００６９】
このアプローチによって単離された抗体のクローニングを容易にするため、この一次プライマー（Ｉ）は定常部分の配列内に天然の制限部位を含んでもよく、あるいはこの工程を容易にするためにそれに特異的に付加された非天然配列を含んでもよい。アダプターとしてのこの付加配列は発現ベクターにおいてクローニングを容易にすることができる。このアダプターは好ましくは、発現ベクター内に存在する制限部位に適合した１以上の制限部位を含んでもよい。第二の例は、部位特異的レコンビナーゼ型の酵素により認識される２つのＤＮＡ配列を、単量体を作出するためにそれらの間の制限部位とともに含んでなるアダプターからなり得る。限定されない例としての該部位特異的レコンビナーゼは、λファージ部位特異的レコンビナーゼまたはＰ１バクテリオファージＣｒｅレコンビナーゼであり得る。このアダプターはまた、「リガーゼ依存的クローニング」に適合した各部位の配列を有する単量体を作製するための制限部位を含んでなるＤＮＡ配列を含んでなってもよい。
【００７０】
本発明の目的である方法のもう１つの重要な工程は、厳密に言えば、環状「アンチセンス」ｃＤＮＡ分子の増幅工程にある。上述のように、この工程は、二次プライマー（ＩＩ）の最初の段階における、該「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列の５’末端と同じ「アンチセンス」ｃＤＮＡの定常領域Ｃに相当する配列の３’末端の間のハイブリダイゼーションにより開始される。
【００７１】
この二次プライマーは当業者に公知の方法に従って選択され、１以上の免疫グロブリンイソ型の定常部分をコードするｃＤＮＡ配列との相補性、および定常部分の５’末端と一次プライマー（Ｉ）がハイブリダイズした末端の間に含まれるのが望ましいことが分かっている。
【００７２】
このｃＤＮＡ分子を増幅させるために、増幅工程ｆ）が、一本鎖環状ＤＮＡ配列を増幅させることができる酵素とともに適用される。
【００７３】
より詳しくは、該酵素は好ましくは、ＢＳＥ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、バクテリオファージφ２９の「ローリングサイクルポリメラーゼ」または一本鎖環状ＤＮＡ配列を増幅させることができるいずれかの等価の酵素からなる。
【００７４】
第一の適用では、当業者に公知の従来のアプローチを用い、数コピーの抗体からなる増幅された一本鎖ＤＮＡの直接配列決定が意図される。このアプローチによって得られる配列は５’−ＵＴＲ領域、シグナルペプチド、および該抗体の可変部分をコードする配列を含んでなり、その抗体をコードする配列の５’末端について予め知っておく必要はない。
【００７５】
一実施形態によれば、本発明による方法は、工程ｇ）で回収された「センス」直鎖ＤＮＡを配列決定する工程をさらに含んでなる。
【００７６】
この態様は、例えばとりわけ「アンチセンス」ｃＤＮＡがハイブリドーマから回収されたＲＮＡから得られた場合に注目される。
【００７７】
第二の適用では、本発明の目的である方法は、好ましくは、マウス、ラットまたは霊長類（ヒト起源が好ましい）などの哺乳類の抗体の重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法において適用可能である。
【００７８】
より詳しくは、この場合、本発明の目的は、重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法であって、該方法は上記のような方法を適用することからなり、さらに以下の工程：
ｈ）「アンチセンス」三次プライマーと呼ばれる三次プライマー（ＩＩＩ）を、工程ｇ）で得られた「センス」直鎖ＤＮＡと接触させる工程（この「アンチセンス」三次プライマー（ＩＩＩ）は該ＤＮＡ直鎖の３’末端と５’末端の間に含まれる直鎖ＤＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、定常領域Ｃをコードするこの直鎖ＤＮＡの配列に相当する）
ｉ）該三次プライマー（ＩＩＩ）から、相補的「アンチセンス」ＤＮＡ鎖の合成によりコンカテマーを作製する工程、および
ｊ）それにより得られた二本鎖ＤＮＡコンカテマーを予め作製したベクター内にクローニングする工程
を含んでなる。
【００７９】
このような方法を用いれば、例えば、それにより得られ、クローニングされたコンカテマーライブラリーから、これらのコンカテマーの単量体で表される重鎖または軽鎖を配列決定することができる。
【００８０】
本発明の目的に含まれるこのような方法では、コンカテマーまたは該コンカテマーの少なくとも１つの単量体を配列決定するための工程は工程ｊ）の終了時に適用される。
【００８１】
「コンカテマー」とは、直鎖多量体を形成する同じ繰り返しの単量体からなるＤＮＡ分子と理解することができる。
【００８２】
より詳しくは、好ましい実施形態によれば、該三次プライマー（ＩＩＩ）は、定常領域Ｃに相当する「センス」直鎖ＤＮＡの配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である。
【００８３】
この態様は、一本鎖コンカテマーと相補的な二本鎖を合成することができ、そして、樹状増幅を開始させるという利点を有する。
【００８４】
一次および二次プライマーについては、該三次プライマー（ＩＩＩ）は、１０〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡ配列からなる。三次プライマー（ＩＩＩ）については、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３５、そして１５〜３０ヌクレオチドの間の長さがいっそうより好ましい。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の目的は、本発明による重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法であり、該方法は、クローニング工程ｊ）の前に、用いるプライマーに相当する配列において、得られたコンカテマーをセグメント化する工程を含んでなり、この工程の後に、それにより得られた二本鎖ＤＮＡセグメントを予め作製されたベクター内にクローニングするための工程ｊ）を行うことを特徴とする。
【００８６】
重鎖または軽鎖抗体鎖の単量体をコードするＤＮＡのバンクを作製するためのこの方法では、一次プライマー（Ｉ）が制限部位を含んでなること、そして、それにより得られたコンカテマーがこの一次プライマーの配列においてセグメント化されるのが好ましい。
【００８７】
この制限部位の存在は、工程ｊ）の前にコンカテマーをセグメント化するために用いる手段の１つである。二本鎖コンカテマーを形成する相補鎖の作製の実際の特性のために、この制限部位は該コンカテマーを形成する２本の鎖上に見られる。第一の実施形態によれば、一次プライマー（Ｉ）は、少なくとも１つの制限部位を天然に含んでなるように選択することができる。一例として、軽鎖κの定常部分に存在するＨｐａ １および／またはＨｉｎｃ ＩＩまたはさらにはλ鎖ではＢｇｌ ＩＩが挙げられる。
【００８８】
第二の実施形態によれば、一次プライマー（Ｉ）は、制限部位を含むように若干改変することができる。例えば、制限部位を人工的に作出し、しかしながら所望のセンスＲＮＡドメインと特異的にハイブリダイズするその能力を失わないように、１つまたは２つの残基を変異させることができる。
【００８９】
最後に、第三の実施形態によれば、制限部位をコードする配列を一次プライマー（Ｉ）内に挿入することができ、これは所望のセンスＲＮＡドメインと特異的にハイブリダイズするその能力をプライマーに保持させることによる。
【００９０】
従って、本発明による重鎖または軽鎖抗体鎖の単量体セグメントをコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法はまた、コンカテマーをセグメント化するための工程が、一次プライマー（Ｉ）に含まれるか、または導入された制限部位の、特異的制限エンドヌクレアーゼによる酵素的消化により適用されることを特徴とする。
【００９１】
該単量体は、次に、重鎖または軽鎖の一次プライマー（Ｉ）の３’に定常部分の連続を含んでなる真核生物発現ベクターにクローニングすることができる。クローニングは、一次プライマー（Ｉ）内に存在するものに相補的な制限部位を介して、または部位特異的組換えにより行うことができる。該発現ベクターは、宿主細胞株において組換えタンパク質を発現するために必要なエレメントを含むことができる。限定されない例として、ベクターｐＣＥＰ(Invitrogen)は好適な発現プロモーターを含んでなる。
【００９２】
より詳しくは、本発明による方法は、工程ｊ）に用いられるベクターが、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインをコードする配列をさらに含んでなることを特徴とする。
【００９３】
好ましくは、重鎖の定常ドメインをコードする配列は好ましくは、膜アンカーを含む免疫グロブリン由来の配列、またはトランスメンブランＣ末端領域を含んでなる配列からなる。
【００９４】
本発明に従って作製された抗体バンクのスクリーニングを容易にするために、重鎖または軽鎖抗体鎖の配列を、例えば、ヒト解離促進因子（崩壊促進因子(decay-accelerating factor)、「ＤＡＦ」またはＣＤ５５）から生じたトランスメンブラン領域のグリコシジルホスホチジルイノシトール結合シグナル配列の５’末端にクローニングすることができる。それにより構築されたベクターは次に、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などの真核宿主株にトランスフェクトすることができる。
【００９５】
よって、本発明は、重鎖または軽鎖抗体鎖の単量体をコードするＤＮＡのライブラリーを発現することができる細胞のバンクをスクリーニングするための方法を記載し、該ライブラリーは本発明による方法によって作製されたものであり、本発明によるＤＮＡバンクを作製するための方法の工程ｊ）で得られたベクターで、該ベクター内に挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされている抗体を発現することができる宿主細胞をトランスフェクトすることからなる工程ｋ）、および重鎖または軽鎖抗体鎖の配列をコードするこのようなＤＮＡを発現する細胞が選択される工程ｌ）をさらに含んでなることを特徴とする。
【００９６】
より詳しくは、工程ｌ）の宿主細胞は、その表面で、挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされている抗体の重鎖および／または軽鎖を発現することができる細胞からなり、いっそうより好ましくは、該宿主細胞は、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などの真核細胞からなる。
【００９７】
真核生物の宿主細胞における発現は、天然型の抗体を発現するという利点を有する。いくつかの細胞をクローニング抗体の混合物でトランスフェクトすると、宿主細胞の表面において結合または発現された抗体（または重鎖および／または軽鎖を含んでなるフラグメント）のバンクを作製することができる。抗体（またはフラグメント）の該バンクは、次に、例えば、陽性クローンをＦＡＣＳにより分離することによるか、または固定された、もしくは懸濁された標識を用いてポリクローナル集団を単離することによるなど、当業者に公知のいずれかのアプローチのよってスクリーニングすることができる。
【００９８】
別の態様によれば、抗体または重鎖および／または軽鎖を含んでなるそのフラグメントのライブラリーを作製するために本発明による方法の使用が意図される。
【００９９】
同様に、本発明はまた、上記の方法を適用することによって得られるいずれの抗体ライブラリーも包含する。
【０１００】
限定されるものではないが、好ましくは、本発明による抗体ライブラリーは、ヒト抗体またはそのフラグメントのライブラリーである。
【０１０１】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明により得られたライブラリーをスクリーニングすることにより得られる抗体、機能的フラグメントまたは誘導化合物が記載され、特許請求され、該抗体またはフラグメントは好ましくはヒト抗体を含んでなる。
【０１０２】
最後に、本発明の最後の態様によれば、それが由来する抗体により認識される特異的エピトープを認識することができる抗体またはそれらの機能的フラグメントをスクリーニングするためのin vitro法が意図され、これらの抗体は所定の疾病に対して活性があり、この方法は、該所定の疾病に罹患している患者から血液サンプルを採取する工程を含んでなり、該血液サンプルに対して本発明による方法が適用される。限定されるものではないが、いっそうより好ましくは、該所定の疾病は癌である。
【０１０３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の記載において、実施例および図面（その説明を以下に示す）を見れば明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明の目的である方法の実施形態の工程ａ）およびｂ）を示す図である。
【図２】本発明の目的である方法の実施形態の工程ｃ）を示す図である。
【図３】本発明の目的である方法の実施形態の工程ｄ）、ｅ）およびｆ）を示す図である。
【図４】実施例２において重鎖の配列を作製するために用いた種々の一次（Ｉ）、二次（ＩＩ）および三次（ＩＩＩ）プライマーを示す。一次プライマー（Ｉ）において制限部位を下線で示す。
【図５】実施例２において軽鎖の配列を作製するために用いた種々の一次（Ｉ）、二次（ＩＩ）および三次（ＩＩＩ）プライマーを示す。一次プライマー（Ｉ）において制限部位を下線で示す。
【図６】配列決定後の全重鎖に関して得られた配列（配列番号１１に相当）を示し、ここでも、クローニングベクターの部分（斜体の核酸配列）、制限部位（下線の核酸配列）、一次プライマーＩに相当するフラグメント（太字の核酸配列）、５’−ＵＴＲ領域（四角で囲まれた核酸配列）、シグナルペプチド（二重下線の核酸配列）、重鎖可変部分（太字のアミノ酸配列）および定常部の部分（斜体のアミノ酸配列）が見られる。
【図７】重鎖に関して、図面においてそれぞれ、ｉ）ＩＭＧＴベースの、生殖細胞系ＩＧＨＶ１−１８＊０１の配列、ｉｉ）標準的なアプローチにより得られた可変ドメインの配列、およびｉｉｉ）本発明の方法（図において本発明のアプローチと呼ぶ）によって得られた可変ドメインの配列のアライメントを示す。
【図８】さらに重鎖に関して、図面においてそれぞれ、ｉ）ＩＭＧＴベースの、生殖細胞系ＩＧＨＶ１−１８＊０１に関連している（図面ではゲノム配列と呼ばれる）シグナルペプチドの配列、ｉｉ）標準的なアプローチにより得られたシグナルペプチドの配列、およびｉｉｉ）本発明の方法（本発明のアプローチと呼ぶ）によって得られたシグナルペプチドの配列のアライメントを示す。
【図９】全軽鎖に関して配列決定後に得られた核酸配列およびタンパク質配列（配列番号１２に相当する）を示し、二重下線の核酸配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１０】全重鎖に関して間接的配列決定後に得られた配列（配列番号１８に相当する）を示し、太字の核酸配列はプライマーに相当し、下線の核酸配列は制限部位Ｍｌｕ Ｉに相当し、二重下線の核酸配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１１】全重鎖に関して複合配列決定後に得られた配列（配列番号２０に相当する）を示し、二重下線の核酸配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１２】全重鎖に関して間接的配列決定（配列番号１８）および複合配列決定（配列番号２０）後に得られた配列のアライメントを示し、太字の核酸配列は一次プライマーに相当し、下線の核酸配列は制限部位Ｍｌｕ Ｉに相当し、二重下線の配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１３】真核細胞の表面にそれらを提示させるための抗体の可変部分をクローニングするための様式を示す。プロモーター：発現プロモーター、すなわち、ＣＭＶ；Ｍｌｕ Ｉ：本発明によるＲＣＡにより得られた可変部分のクローニングのための特異的制限部位；ＣＨ１’−ＣＨ２−ＣＨ３：ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の部分的ＣＨ１ドメインおよび全ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン；ＤＴＭ：トランスメンブランドメイン；Ｃκ’：部分的ヒトＣκ２ドメイン。
【図１４】ＣＨＯ細胞の表面における抗体の存在に関するＦＡＣＳ分析を示す。上の図：抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８を用いた表面における抗体の検出。下の図：抗ネズミＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８を用いた表面における抗体の検出。非発現細胞は黒いピークで表され、マーキングされた細胞は黒い線で表される。
【図１５】プライマーの例を示す。図１５Ａ：ヒト抗体をクローニングおよび配列決定するためのプライマーの部位。Ｍｆｅ Ｉ（１個のアミノ酸の改変）の制限部位Ｍｌｕ Ｉ（全部合成）が付加されたヒトＩｇＧ１−４定常部分のコンセンサス配列。図１５Ｂ：ヒト抗体をクローニングおよび配列決定するためのプライマーの部位。制限部位Ｍｌｕ Ｉが付加されたＩｇκ定常部分のコンセンサス配列。図１５Ｃ：ヒト抗体クローニングおよび配列決定するためのプライマーの部位。制限部位Ｍｌｕ Ｉが付加されたヒトＩｇλ定常部分のコンセンサス配列。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
図１は、抗体の重鎖をコードする「センス」ＲＮＡ鎖を示し（点線）、該ＲＮＡはこの例ではハイブリドーマから回収されたものである。最初に記載したように、このＲＮＡ鎖は精製されたものである。このＲＮＡ鎖は５’３’方向に、可変領域をコードする配列ならびに定常領域Ｃをコードする配列を含んでなる。より詳しくは、可変領域Ｖは、５’−ＵＴＲ単位、シグナルペプチド（Ｐｓ）ならびにｖ、ｄおよびｊ遺伝子からなる。遺伝子ｖは可変遺伝子に相当し、遺伝子ｄは多様性遺伝子に相当し、遺伝子ｊは接合遺伝子に相当する。
【０１０６】
軽鎖の場合、「センス」ＲＮＡ鎖は遺伝子ｄは含まない。本特許出願では、重鎖の例のみを詳しく記載し、軽鎖の場合はその方法の種々の工程のレベルで同一である。
【０１０７】
「アンチセンス」一次プライマー（Ｉ）は、定常領域Ｃにおいてハイブリダイズされる。より詳しくは、本明細書に示されている好ましい実施形態によれば、一次プライマー（Ｉ）は定常領域Ｃをコードする配列の５’末端の近傍でハイブリダイズする。
【０１０８】
最初に記載したように、この点は、ｃＤＮＡ鎖の合成の際にｖ、ｄおよびｊ遺伝子の完全性が事実上保存されることを確実とすることができるという意味で、本発明の特に興味深い利点を有する。
【０１０９】
該一次プライマー（Ｉ）から「アンチセンス」ｃＤＮＡ鎖が合成され（実線で示される）、これはそれに対して５’３’方向に遺伝子ｊ、ｄおよびｖの相補的配列を含んでなる。
【０１１０】
このｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを次にＲＮアーゼで処理してＲＮＡ鎖を分解し、その後アニーリングさせることができるｃＤＮＡの一本鎖を得る。
【０１１１】
アニーリング工程は図２に示す。
【０１１２】
より詳しくは、５’３’方向に、プライマー（Ｉ）を含んでなる定常領域Ｃの部分をコードする配列と可変領域の相当する配列をなお含んでなり、後者が遺伝子ｊ、ｄおよびｖを含んでなり、全体が５’末端と３’末端の間の共有結合によりアニーリングされているｃＤＮＡ鎖が示される。これを行うため、以下の例から明らかとなるように、５’末端は通常リン酸基（ＰＯ４−）を含んでなるが、それに対して３’末端はヒドロキシル基（ＯＨ）を含んでなる。
【０１１３】
図３は、「ローテーティングサークル」または「ローリングサークル」としての最初の４回の増幅ラウンドを示す。
【０１１４】
図３ａ）は、最初の増幅ラウンドを表す。この「センス」二次プライマー（ＩＩ）は、一次プライマー（Ｉ）の５’末端と定常領域Ｃの３’末端の間に含まれる配列において、環状ｃＤＮＡとハイブリダイズする。本明細書で示される実施形態では、二次プライマー（ＩＩ）は一次プライマー（Ｉ）の５’末端においてハイブリダイズする。このハイブリダイゼーション位置に限定されるものではなく、ここでは単に一例として示されることは明らかである。次に、「センス」ＤＮＡの相補鎖の合成（点線で示される）が、該二次プライマー（ＩＩ）から反応媒体中に存在する遊離のヌクレオチドを５’３’方向に付加することによって行われる。この最初の増幅ラウンドの終了により、環状ｃＤＮＡとハイブリダイズされた「センス」ＤＮＡの第一単位（１）が得られる。
【０１１５】
図３ｂ）は、次の増幅ラウンドを模式的に示す。最初の増幅ラウンドの継続において、２回目の増幅ラウンドが適用され、その際に、反応媒体中に存在する遊離のヌクレオチドが「センス」ＤＮＡの第一単位（１）の３’末端に付加され、それにより「センス」ＤＮＡの第二単位（２）が形成され、それはその合成に際に、それを移動させることにより環状ｃＤＮＡに沿った第一単位１の場所をとる。この結果、ｃＤＮＡとハイブリダイズされ、取って代わられた「センス」ＤＮＡの第一単位（１）とその５’末端でしっかり結合された「センス」ＤＮＡの第二単位（２）からなるＤＮＡ分子が得られ、結果として一本鎖となる。同時に、最初に合成された直鎖ＤＮＡ単位（１）が第二単位（２）のポリメラーゼに取って代わられた際に、三次プライマー（ＩＩＩ）のハイブリダイゼーション部位に相当する配列が遊離する（すなわち、それは一本鎖となる）。その後、この三次プライマー（ＩＩＩ）がハイブリダイズし、第一「センス」ＤＮＡ単位（１）と相補的な「アンチセンス」ＤＮＡ ＩＩの第一鎖の合成を開始する（実線で示される）。
【０１１６】
図３ｃ）は、本増幅法の以降のラウンドを示す。
【０１１７】
同じ機構が生じ、環状ｃＤＮＡに沿って「センス」ＤＮＡの第三単位（３）の合成が起こり、それにより第一単位および第二単位（１、２）からなる「センス」ＤＮＡセグメントに取って代わり、この第一単位（１）は先行する増幅ラウンドのために二本鎖ＤＮＡとなり、一方、第二単位（２）は「センス」ＤＮＡの一本鎖となる。上記の工程と同様にして、「センス」ＤＮＡの第二単位（２）の移動は、それに結合して「センス」ＤＮＡの第二単位（２）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡ（１２）の第二鎖の合成を開始する三次プライマー（ＩＩＩ）のハイブリダイゼーション部位を遊離させる。この「アンチセンス」ＤＮＡの新たに合成された第２鎖（１２）が第一単位（１）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第一鎖（１１）の５’末端に隣接すると、それは「センス」ＤＮＡの配列に沿ったその場所を想定し、それにより第一単位（１）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第一鎖（１１）を遊離させる。次に、二次プライマー（ＩＩ）がそのハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズし、それによりその３’末端を遊離させ、５’３’方向に沿って「センス」ＤＮＡの相補鎖の合成を開始する。
【０１１８】
図３ｄ）は、以降の増幅ラウンドを示す。
【０１１９】
同様に、「センス」ＤＮＡの第四単位（４）が環状ｃＤＮＡに沿って合成され、それにより、先行する増幅ラウンドから生じた「センス」ＤＮＡの３つの第一単位（１、２、３）からなるＤＮＡセグメントに取って代わる。
【０１２０】
本方法のこのレベルにおいて、第一単位と第二単位（１、２）は、先行する増幅ラウンドのために二本鎖ＤＮＡからなり、一方、第三単位（３）は「センス」ＤＮＡの一本鎖からなる。先行する工程と同様に、この「センス」ＤＮＡの第三単位（３）の移動は、それに結合して「センス」ＤＮＡの第三単位（３）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡ（１３）の第三鎖の合成を開始する三次プライマー（ＩＩＩ）のハイブリダイゼーション部位を遊離させる。この「アンチセンス」ＤＮＡの新たに合成された第三鎖が第一単位および第二単位（１、２）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第二鎖（１２）の５’末端に隣接すると、それは次に「センス」ＤＮＡの配列に沿ったその場所を想定し、それにより第一単位と第二単位（１、２）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第二鎖（１２）を遊離させる。次に、二次プライマー（ＩＩ）がそのハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズし、それにより、第一単位（１）の、または第二単位（２）の３’末端を遊離させ、その５’３’方向に沿って第一単位と第二単位（１、２）の相補的「センス」ＤＮＡの鎖の合成を開始する。この場合、二次プライマーが第二単位（２）の３’末端でハイブリダイズしたところで初めて、第二単位（２）に対する相補的「センス」ＤＮＡの鎖の合成が行われた。結果として、二次プライマー（ＩＩ）は、次に、第一単位（１）の３’末端にハイブリダイズし、そして、第一単位と第二単位（１、２）の相補的「センス」ＤＮＡの鎖の合成を開始する。この段階で、この第二単位（２）において、「センス」ＤＮＡの相補鎖の合成は、先に合成された「センス」ＤＮＡの鎖を移動させ、遊離させる。その後、この二次プライマー（ＩＩ）はこの遊離した「センス」ＤＮＡ鎖にハイブリダイズすることができ、相補的「アンチセンス」ＤＮＡの鎖の合成を開始する（示されていない）。
【０１２１】
実施例２：「間接的」アプローチによるハイブリドーマからの抗体遺伝子のクローニングおよび配列決定
Ｉ．ＲＮＡの精製
遠心分離により予め濃縮した５×１０６細胞のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、細胞ペレットとして−８０℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、ＲＮＡを単離するために変性させる。全ＲＮＡの単離にはＭｉｎｉ Ｋｉｔ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(Qiagen)を用いる。全ＲＮＡの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー６００μＬを加えることにより溶解した後、太さ２０ゲージのニードルに６回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に６００μＬの容量の７０％エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各６００μｌの２アリコートでＲＮｅａｓｙミニカラムに適用する。各適用の後に１０，０００ｇで１５秒間の遠心分離を行う。このＲＮｅａｓｙミニカラムを５００μＬのＲＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離する。次に、このＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい遠沈管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファーを追加して洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離する。次に、このミニカラムＲＮｅａｓｙを新しい遠沈管に入れ、このカラムにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水(Ambion)５０μＬを加える。このＲＮｅａｓｙミニカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次に、精製された全ＲＮＡを２６０／２８０ｎｍでの分光光度測定により定量した後すぐにｃＤＮＡの合成に用いる。
【０１２２】
ＩＩ．ｃＤＮＡの合成および精製
ｃＤＮＡの合成は、鋳型としての全ＲＮＡと重鎖ＣＨｓｓＤＮＡの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＧ３’、配列番号１）または軽鎖ＶＬｓｓＤＮＡの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＧＴ ＴＡＡ ＣＴＧ ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧ ３’、配列番号２）を用いることにより、逆転写スーパースクリプトＩＩＩ(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、制限部位を天然に含むように、または親配列の若干の改変により制限部位の包含を可能とするように選択される。重鎖のプライマーの配列は、制限部位Ｘｍａ Ｉを含むように改変される。軽鎖のプライマーの配列はそれに対して天然制限部位Ｈｐａ Ｉを含んでなる。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、２．５μｇの全ＲＮＡ、１μＬのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ、Ozyme）、遺伝子の特異的プライマー２μＬ（１μＭ、５’リン酸化、Eurogentec）を用いて行い、総て、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水(Ambion)で総量１４μＬとする。それにより得られた混合物を５分間６５℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に４μＬの５×「第一鎖バッファー」(Invitrogen)、１μＬのＤＴＴ（１Ｍ）および１μＬのスーパースクリプトＩＩＩ（２００Ｕ／μＬ）を加える。この反応混合物を次に５５℃で１時間インキュベートし、これらの酵素を１５分間７０℃に加熱することにより不活性化する。
【０１２３】
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをＰＣＲ精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。ｃＤＮＡの合成は、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水５０μＬを加え、それに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、これを１．５ｍＬの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、その後、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１２４】
ＲＮアーゼで処理するなど、ｃＤＮＡ合成に他の一連の工程を行ってもよいが、それらは必須ではない。
【０１２５】
ＩＩＩ．ｃＤＮＡのアニーリング
一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入するリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre)を用いてアニーリングする。ＰＯ４基は、ｃＤＮＡの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に５’末端に予め導入された。アニーリング反応は１６μＬの精製ｃＤＮＡ、２μＬの反応バッファー１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ(Epicentre)、１μＬのＡＴＰ（１ｍＭ）、１μＬのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（１００Ｕ／μＬ）を用いて行う。次に、反応物を６０℃で１時間インキュベートした後、８０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で５０μＬとし、これに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムをもう一度１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次にこれを新しい１．５ｍＬのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１２６】
ＩＶ．「ローテーティングサークル」による増幅
アニーリングした一本鎖ｃＤＮＡを、増幅キットｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ（商標）(Amersham Biosciences)とｃＤＮＡの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は５μＬのバッファーＴｅｍｐｌｉＰＨｉ、０．５μＬのアニーリングｃＤＮＡおよび０．２５μＬのセンスおよびアンチセンスプライマー（１００μＭ、Sigma ProOligo）を用いて行う。これらのプライマーを表１に示す。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
センスおよびアンチセンスプライマーは、ポリメラーゼφ２９のエキソヌクレアーゼ活性から保護するためにホスホロチオエート結合を用いて合成する。反応媒体を３分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却する。第二の混合物は、５μＬの反応バッファーＴｅｍｐｌｉＰｈｉおよび０．２μＬの酵素ＴｅｍｐｌｉＰｈｉを用いて作製する。次に、この混合物５μＬを予め作製した第一の反応媒体に加える。最終混合物を３０℃で１８時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を不活性化する。増幅された二本鎖ＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１２９】
Ｖ．増幅された抗体の遺伝子のクローニング
増幅の後、二本鎖ＤＮＡコンカテマーを、そのｃＤＮＡの合成に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに適合する制限酵素で消化する。増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する：７．５μＬの増幅ＤＮＡ、０．５μＬのＢＳＡ ２０×、１μＬのバッファー４ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＸｍａ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する：７．５μの増幅ＤＮＡ、０．５μＬの水、１μＬのバッファー４ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＨｐａ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートする。消化された重鎖および軽鎖を次に、それぞれ配列決定ベクターｐＵＣ１８およびＰＧＥＭ−Ｔにクローニングする。次に、クローニングされたＤＮＡインサートを「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」(Applied Biosystems)とこれらの配列決定ベクターに相当するプライマーを用いて配列決定する。
【０１３０】
全重鎖に関する配列決定後に得られた配列を図６に示す（配列番号１１）。図６の太字のアミノ酸配列である可変ドメインに相当する部分を配列番号７に示し、図６の二重下線の、シグナルペプチドに相当する配列を配列番号９の配列で示す。
【０１３１】
全軽鎖に関する配列決定後に得られた配列を図９に示す（配列番号１２）。図９の太字のアミノ酸配列である可変ドメインに相当する核酸の部分を配列番号１３の配列に示す。
【０１３２】
ＶＩ．標準的な方法により、また、本発明の目的であるアプローチにより得られた抗体の重鎖の可変ドメインおよびシグナルペプチドの配列の比較分析
ハイブリドーマから抗体の可変ドメインの配列を得るための標準的なアプローチは、該可変ドメインをＰＣＲにより、センスプライマーとしてはシグナルペプチドに、そしてアンチセンスプライマーとしては、重鎖では定常ドメインＣＨ１、軽鎖ではＣκの５’に存在するプライマーを用いて増幅させることからなる。その抗体が由来する生物によって天然に用いられているシグナルペプチドの可能性のある既知の推定配列の総てとハイブリダイズすることができるように、通常用いられるセンスプライマーは縮重配列に相当することを述べておくべきであろう。
【０１３３】
重鎖の可変ドメインに関して標準的な方法で得られた配列を配列番号８の配列で示す。
【０１３４】
次に、例示された抗体の重鎖の可変ドメインに関して得られた配列を、機能を生じた種々の遺伝子の再配列の同定およびその例示抗体の可変ドメインの作製の際に用いられた遺伝子Ｖに関連するシグナルペプチドのゲノム配列のデータベース検索をさらに可能とするＩＭＧＴ命名法に従った免疫原分析を行うことにより特徴づける。
【０１３５】
表２は重鎖に関して得られた結果を示す。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
図７に示される配列のアライメントならびに免疫原分析により、本発明によるアプローチにより得られた重鎖の可変ドメインの配列（配列番号７）と標準的なアプローチにより得られた重鎖の可変ドメインの配列（配列番号８）の間に存在する同一性を確認する。
【０１３８】
シグナルペプチドに相当する配列、すなわち、本発明による方法によって得られた配列（配列番号９）および標準的なアプローチに従って得られた配列（配列番号１０）に関して同じアプローチを行った。
【０１３９】
ＩＭＧＴベースで配列を検索することにより、遺伝子Ｖ ＩＧＨＶ１−１８＊０１（ＩＭＧＴ Ｆｌａｔ Ｆｉｌｅ）の同定に関する情報を得ること、およびそれからその遺伝子に関するシグナルペプチドの核酸配列およびタンパク質配列を抽出することが可能である。この場合、ネズミ株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊから、例示された抗体の重鎖の可変ドメインの配列に最も近いことが確認された対立遺伝子ＩＧＨＶ１−１８＊０１が同定された。この例では、抗体の作製に用いられたネズミ株はＢＡＬＢ／ｃであり、その生殖細胞系は対立遺伝子ＩＧＨＶ１ １８＊０２下に存在する。例示された抗体の鎖の可変ドメインに関して得られた配列のアライメントは９８．０２％（２４８／２５３ｎｔ）の相同性を示す。この相同性は対立遺伝子ＩＧＨＶ１−１８＊０１に関して同定されたものよりも顕著であるが、それは遺伝子Ｖの短縮配列、すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの対立遺伝子＊０１の２８８ｎｔに対してＢＡＬＢ／ｃの対立遺伝子＊０２の２５３ｎｔのみを考慮する。これは最初の分析が対立遺伝子＊０１に有利であった場合を説明する。従って、シグナルペプチドの同定に関しては、この場合も用いるネズミ株に見られ、対立遺伝子ＩＧＨＶ１−１８＊０２に相当する配列に着目する必要がある。
【０１４０】
図８に示されるシグナルペプチドに相当する配列のアライメントは明らかに、この例のこの場合、タンパク質配列に４つの突然変異を誘導する４つのヌクレオチド改変に、相当する配列（配列番号１０）においてバイアスを導入する標準的なアプローチとは異なり、本発明の方法はゲノム配列（配列番号９）の取得を可能とすることを示す。
【０１４１】
結論として、この例は、得られた配列が実際に抗体の生殖細胞系に相当するだけでなく、特に標準的な方法により得られる配列にも相当するという確信をもたらす。さらに、この例はまた、本発明による方法が標準的なアプローチで改変される天然シグナルペプチドの保存を可能とすることも示す。
【０１４２】
ＶＩＩ．標準的な方法により、また、本発明の目的であるアプローチにより得られた抗体の軽鎖の可変ドメインおよびシグナルペプチドの配列の比較分析
同様のアプローチを行い、同じ結果（示されていない）が得られた。
【０１４３】
実施例３：「間接的」アプローチによるハイブリドーマからの抗体の遺伝子のクローニングおよび配列決定
Ｉ．ＲＮＡの精製
遠心分離により予め濃縮した５×１０６細胞のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、細胞ペレットとして−８０℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、ＲＮＡを単離するために変性させる。全ＲＮＡの単離にはＭｉｎｉ Ｋｉｔ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(Qiagen)を用いる。全ＲＮＡの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー６００μＬを加えることにより溶解した後、太さ２０ゲージのニードルに６回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に６００μＬの容量の７０％エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各６００μｌの２アリコートでＲＮｅａｓｙミニカラムに適用する。各適用の後に１０，０００ｇで１５秒間の遠心分離を行う。このＲＮｅａｓｙミニカラムを５００μＬのＲＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離する。次に、このＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい遠沈管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファーを追加して洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離する。次に、このミニカラムＲＮｅａｓｙを新しい遠沈管に入れ、このカラムにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水(Ambion)５０μＬを加える。このＲＮｅａｓｙミニカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次に、精製された全ＲＮＡを２６０／２８０ｎｍでの分光光度測定により定量した後すぐにｃＤＮＡの合成に用いる。
【０１４４】
ＩＩ．ｃＤＮＡの合成および精製
ｃＤＮＡの合成は、鋳型としての全ＲＮＡと重鎖ＩＧＨＣｌｐＯの特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＴＣ Ｃ３’、配列番号１４）または軽鎖ＩＧＫｐＯの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＡＧ３’、配列番号１５）を用いることにより、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、天然配列の５’末端に付加された制限部位Ｍｌｕ Ｉを含んでなる。第一鎖ｃＤＮＡの合成は、２．５μｇの全ＲＮＡ、１μＬのＤＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ、Ozyme）、遺伝子の特異的プライマー１μＬ（５０μＭ、５’リン酸化、Eurogentec）を用いて行い、総て、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水(Ambion)で総量１０μＬとする。それにより得られた混合物を５分間６５℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に４μＬの５×「Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔバッファー」(Takara)、０．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／ｕＬ）、１μＬのＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ（２００Ｕ／μＬ）を加えた後、２０μｌのＨ２Ｏで容量を整える。この反応混合物を次に５０℃で１時間インキュベートし、これらの酵素を１５分間７０℃に加熱することにより不活性化する。
【０１４５】
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをＰＣＲ精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。ｃＤＮＡの合成は、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水５０μＬを加え、それに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、これを１．５ｍＬの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、その後、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１４６】
ＲＮアーゼ処理など、ｃＤＮＡ合成に他の一連の工程を行ってもよいが、それらは必須ではない。
【０１４７】
ＩＩＩ．ｃＤＮＡのアニーリング
一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入するリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre)を用いてアニーリングする。ＰＯ４基は、ｃＤＮＡの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に５’末端に予め導入された。アニーリング反応は１μＬの精製ｃＤＮＡ、１μＬの反応バッファー１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ(Epicentre)、１μＬのＡＴＰ（１ｍＭ）、１μＬのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（１００Ｕ／μＬ）および６μｌのＨ２Ｏを用いて行う。次に、反応物を６０℃で１時間インキュベートした後、８０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で５０μＬとし、これに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムをもう一度１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次にこれを新しい１．５ｍＬのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１４８】
ＩＶ．「ローテーティングサークル」による増幅
アニーリングした一本鎖ｃＤＮＡを、増幅キットｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ（商標）(Amersham Biosciences)とｃＤＮＡの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は４μＬのＨ２Ｏ、０．５μＬのアニーリングｃＤＮＡおよび０．５μＬのセンスおよびアンチセンスプライマー（１００μＭ、Sigma ProOligo）を用いて行う。これらのプライマーを表３に示す。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
センスおよびアンチセンスプライマーは、ポリメラーゼφ２９のエキソヌクレアーゼ活性から保護するためにホスホロチオエート結合を用いて合成する。反応媒体を３分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却する。第二の混合物は、５μＬの反応バッファーＴｅｍｐｌｉＰｈｉおよび０．２μＬの酵素ＴｅｍｐｌｉＰｈｉを用いて作製する。次に、この混合物５μＬを予め作製した第一の反応媒体に加える。最終混合物を３０℃で１８時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を不活性化する。増幅された二本鎖ＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５１】
Ｖ．増幅された抗体の遺伝子のクローニング
増幅の後、二本鎖ＤＮＡコンカテマーを、そのｃＤＮＡの合成に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに適合する制限酵素で消化する。増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する：８μＬの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する：８μの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。消化された重鎖および軽鎖を次に、それぞれ配列決定ベクターｐＧＥＭ−Ｔにクローニングする。次に、クローニングされたＤＮＡインサートを「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」(Applied Biosystems)とこれらの配列決定ベクターに相当するプライマーを用いて配列決定する。
【０１５２】
全重鎖に関する配列決定後に得られた配列を図１０に示す（配列番号１８）。図１０の太字のアミノ酸配列である可変ドメインの相当する核酸部分を配列番号１９の配列で示す。
【０１５３】
実施例４：「複合」アプローチによるハイブリドーマからの抗体の遺伝子のクローニングおよび配列決定
１．ＲＮＡの精製
遠心分離により予め濃縮した５×１０６細胞のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、細胞ペレットとして−８０℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、ＲＮＡを単離するために変性させる。全ＲＮＡの単離にはＭｉｎｉ Ｋｉｔ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(Qiagen)を用いる。全ＲＮＡの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー６００μＬを加えることにより溶解した後、太さ２０ゲージのニードルに６回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に６００μＬの容量の７０％エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各６００μｌの２アリコートでＲＮｅａｓｙミニカラムに適用する。各適用の後に１０，０００ｇで１５秒間の遠心分離を行う。このＲＮｅａｓｙミニカラムを５００μＬのＲＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離する。次に、このＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい遠沈管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファーを追加して洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離する。次に、このミニカラムＲＮｅａｓｙを新しい遠沈管に入れ、このカラムにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水(Ambion)５０μＬを加える。このＲＮｅａｓｙミニカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次に、精製された全ＲＮＡを２６０／２８０ｎｍでの分光光度測定により定量した後すぐにｃＤＮＡの合成に用いる。
【０１５４】
ＩＩ．ｃＤＮＡの合成および精製
ｃＤＮＡの合成は、鋳型としての全ＲＮＡと重鎖ＩＧＨＣｌｐＯの特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＴＣ Ｃ３’、配列番号１４）または軽鎖ＩＧＫｐＯの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＡＧ３’、配列番号１５）を用いることにより、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、制限部位を天然に含むように、または親配列の若干の改変により制限部位の包含を可能とするように選択される。重鎖および軽鎖のプライマーの配列は、５’末端に制限部位Ｍｌｕ Ｉを含むように改変される。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、２．５μｇの全ＲＮＡ、１μＬのＤＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ、Ozyme）、遺伝子の特異的プライマー２μＬ（５０μＭ、５’リン酸化、Eurogentec）を用いて行い、総て、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水(Ambion)で総量１４μＬとする。それにより得られた混合物を５分間６５℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に４μＬの５×「第一鎖バッファー」(Invitrogen)、１μＬのＤＴＴおよびスーパースクリプトＩＩＩ（２００Ｕ／μＬ）を加える。この反応混合物を次に５０℃で１時間インキュベートし、これらの酵素を１５分間７０℃に加熱することにより不活性化する。
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをＰＣＲ精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。ｃＤＮＡの合成は、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水５０μＬを加え、それに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、これを１．５ｍＬの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、その後、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５５】
ＲＮアーゼ処理など、ｃＤＮＡ合成に他の一連の工程を行ってもよいが、それらは必須ではない。
【０１５６】
ＩＩＩ．ｃＤＮＡのアニーリング
一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入するリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre)を用いてアニーリングする。ＰＯ４基は、ｃＤＮＡの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に５’末端に予め導入された。アニーリング反応は１６μＬの精製ｃＤＮＡ、２μＬの反応バッファー１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ(Epicentre)、１μＬのＡＴＰ（１ｍＭ）、１μＬのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（１００Ｕ／μＬ）を用いて行う。次に、反応物を６０℃で１時間インキュベートした後、８０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で５０μＬとし、これに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムをもう一度１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次にこれを新しい１．５ｍＬのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５７】
ＩＶ．「ローテーティングサークル」による増幅
アニーリングした一本鎖ｃＤＮＡを、増幅キットｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ（商標）(Amersham Biosciences)とｃＤＮＡの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は５μＬの水、０．５μＬのアニーリングｃＤＮＡおよび０．５μＬのセンスおよびアンチセンスプライマー（１００μＭ、Sigma ProOligo）を用いて行う。これらのプライマーは上記の実施例３のものと同じであるので、表３に示されている。
【０１５８】
センスおよびアンチセンスプライマーは、ポリメラーゼφ２９のエキソヌクレアーゼ活性から保護するためにホスホロチオエート結合を用いて合成する。反応媒体を３分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却する。第二の混合物は、５μＬの反応バッファーＴｅｍｐｌｉＰｈｉおよび０．２μＬの酵素ＴｅｍｐｌｉＰｈｉを用いて作製する。次に、この混合物５μＬを予め作製した第一の反応媒体に加える。最終混合物を３０℃で１８時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を不活性化する。増幅された二本鎖ＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５９】
増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する：８μＬの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する：８μの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。重鎖の単量体はアガロースゲル（１％ｗ／ｖ）での電気泳動により１０Ｖ／ｃｍで分離する。次に、単量体に相当するＤＮＡを抽出し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット(Machery Nagel)を製造業者の手順に従って用い、１５μＬの「溶出バッファー」での溶出により単離する。次に、このＤＮＡを、「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」(Applied Biosystems)にて、ｃＤＮＡ合成に従った一次または三次プライマーを用い、以下の条件：５μＬの単量体ＤＮＡ、２μＬの５×バッファー(Applied Biosystems)、２μＬのＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１、１μＬのプライマー（１０μＭ）下での「ローテーティングサイクル」増幅により配列決定する。反応条件はＦａｓｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ９８００(Applied Biosystems)装置、プログラム「ＢｉｇＤｙｅ ｓｔｄ」のプログラミングに従う。
【０１６０】
全重鎖の配列決定後に得られた配列を図１１（配列番号２０）に示す。図１１の太字のアミノ酸配列である可変ドメインに相当する核酸部分を配列番号２１の配列で示す。
【０１６１】
実施例５：「間接的」アプローチにより得られた配列と「複合アプローチ」により得られた配列の比較
本発明の種々の選択肢、すなわち、間接的アプローチおよび複合アプローチ（直接的アプローチとも呼ばれる）を実証するために、全重鎖に関して得られた配列のアライメントを、それぞれ両アプローチを用いて行った。
【０１６２】
図１２はこのアライメントを示す。
【０１６３】
この図から明らかなように、得られた配列は同一であり、これにより本発明の両アプローチが実証される。
【０１６４】
実施例６：真核細胞の表面での発現の検出
本発明に従ってクローニングされた抗体のスクリーニングを行うために、真核生物発現ベクターを、ヒト抗体の重鎖の定常部分のＣ末端にトランスメンブランドメイン（ＤＴＭ）を含むように改変した。宿主細胞で発現された抗体が培養上清中ではもはや発現されずに細胞の表面で保持されるように、このＤＴＭをＩｆＧ１型のヒト重鎖の定常ドメインとともにシスでクローニングした（図１３）。Ｍｌｕ Ｉによる制限およびＤＴＭを含有するベクター中での連結により、それらの５’ＵＴＲ部分とシグナルペプチドを含んでなる可変部分を定常ドメインとともにシスで挿入することができ、軽鎖は同様にＤＴＭを含まないベクターにクローニングする（図１３）。ネズミ抗体の重鎖および軽鎖の可変部分は発現ベクター中にヒト定常ドメイン：ＩｇＧ１（重鎖）またはＩｇｋ（軽鎖）とともに、重鎖の場合にはＤＴＭを伴ってシスでクローニングする。次に、宿主ＣＨＯ細胞の、重鎖および軽鎖の発現ベクターでの同時トランスフェクションを、リポフェクタミンによるトランスフェクションにより行った。血清を含む増殖培地中での４８時間の増殖時間の後、細胞をＰＢＳで洗浄した。
【０１６５】
予め洗浄した細胞の表面の抗体の存在を、それらの細胞をＩｇＧ抗ヒトまたはＩｇＧ抗マウス抗体とともにインキュベーションすることにより検出した。蛍光体ＡＬＥＸＡ ４８８(Molecular Probes, A11013)で予めマーキングしたＩｇＧ抗ヒトまたは抗マウス抗体が、宿主細胞の膜表面に抗体を担持する細胞の同定を可能とする。その後、フローサイトメトリー分析により、発現ベクターを含まない宿主細胞に比べて表面に抗体を担持する細胞を検出することができる（図１４）。これらの抗体のキメラ性、ネズミ可変部分およびヒト定常部分は、ＩｇＧ抗ヒトまたはＩｇＧ抗マウス抗体を用いた検出を可能とする。
【０１６６】
実施例７：本発明の適用の範囲内で使用可能な種々のネズミおよびヒトプライマーのリスト
本実施例では、限定されるものではないが、本発明の適用に好ましいプライマーの配列を一覧化する。
【０１６７】
Ｉ．ネズミプライマー
表４：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける定常ドメインの各イソ型に対する特異的ネズミｃＤＮＡの合成のための一次プライマー（Ｉ）。制限部位Ｍｌｕ Ｉを下線および斜体で示す。
【表４】
【０１６８】
表５：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための二次プライマー（ＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表５】
【０１６９】
表６：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための三次プライマー（ＩＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表６】
【０１７０】
ＩＩ．ヒトプライマー
表７：いずれかのイソ型ＩｇＧに対する特異的ヒトｃＤＮＡの合成のための一次プライマー（Ｉ）。制限部位Ｍｌｕ Ｉを下線および斜体で示す。
【表７】
【０１７１】
表８：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための二次プライマー（ＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表８】
【０１７２】
表９：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための三次プライマー（ＩＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表９】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃもまた、種々のプライマーおよび相当する部位を示す。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、他のヒト抗体の中でもモノクローナル抗体の分野に関する。より詳しくは、本発明は、好ましくは、抗体を発現し得る細胞由来の全ＲＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡから、少なくとも１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための新規な方法に向けられている。本発明はまた、先の方法の工程を適用し、抗体、好ましくはヒト抗体のバンクまたはライブラリーを作製するための方法も含んでなる。
【０００２】
「バンク」または「ライブラリー」という表現は、本明細書において違いなく用いられ、これらの表現は双方とも同じ意味を有する。
【０００３】
従来、モノクローナル抗体またはそのフラグメントは、Kohler and Milstein (Kohler and Milstein, 1975, Nature 256, 495)により記載されているハイブリドーマの標準的技術を用いることによって作製され、それにより得られた抗体を次にヒト化されてきた。
【０００４】
もっと最近では、ヒトモノクローナル抗体を作製および発現させるために、天然機構の理解とＤＮＡ組換え技術の開発に基づいた新規な方法が開発された。特に、抗体のコンビナトリアルライブラリーまたはバンクを得ることを目的とする技術は多くの開発の課題となっている。このような技術は、より迅速であり、ヒト化工程なしで行えるということに加え、抗体そのものおよび抗体リストの変異性のより有効な使用を提供する。
【０００５】
抗体は、分子の柔軟性を提供する多様な数のジスルフィド橋により互いに連結された２本の重鎖（重鎖としてのＨ）と２本の軽鎖（軽鎖としてのＬ）の４本のポリペプチド鎖で形成された免疫グロブリンのスーパーファミリーの糖タンパク質である。これらの鎖はＹ型の構造を形成し、アミノ酸約１１０個の免疫グロブリンドメインからなる。各軽鎖は定常領域と可変領域からなり、重鎖は可変領域とイソ型によって３つまたは４つの定常領域からなる。
【０００６】
ある抗体に関して、２本の重鎖は同一であり、同じことが２本の軽鎖についても当てはまる。
【０００７】
定常領域は、ある抗体から他の抗体まで極めて密接に関連するアミノ酸配列を特徴とし、その種およびイソ型に特徴的である。各軽鎖はＣＬとして示されるその典型例を有する。重鎖はイソ型によって３つまたは４つの定常領域ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４を含む。
【０００８】
抗体は２本の「腕」の末端に位置する４つの可変領域を有する。重鎖（ＶＨ）が持つ可変領域と軽鎖（ＶＬ）が持つ隣接可変領域の間の会合は、その抗原の認識部位（またはパラトープ）を形成する。従って、免疫グロブリン分子は各末端に１つずつ、抗原と結合するための２つの部位を有する。これらの両部位は同一であるので、１つの抗体につき２つの抗原分子が結合する可能性がある。
【０００９】
重鎖では、可変領域ＶＨは、３種類のセグメント、すなわち、変動性セグメント（ｖセグメントまたは遺伝子）、多様性セグメント（ｄセグメントまたは遺伝子）および接合セグメント（ｊセグメントまたは遺伝子）を含む遺伝子によりコードされる。軽鎖ＶＬの可変領域をコードする遺伝子も遺伝子ｖと遺伝子ｊを有するが、遺伝子ｄは有さない。
【００１０】
まず、ナイーブな免疫レパートリーは、可変領域をコードする種々の遺伝子のコンビナトリアルな再編成に由来する。より詳しくは、重鎖の遺伝子ｖ、ｄ、ｊと軽鎖の遺伝子ｖ、ｊは互いに独立に会合可能であり、このことは生成され得る可変領域の大きな多様性を説明する。構造の異なる極めて多数の機能的単位が生じ得るこの第一の機構はコンビナトリアルダイバーシティー(combinatorial diversity)と呼ばれる。
【００１１】
他の２つの機構がこの多様性を高め、１つはＢリンパ球の分化の最初の段階で起こり（ジャンクショナルダイバーシティー(junctional diversity)）、もう１つは抗原刺激により誘発される免疫応答中に起こる（体細胞超変異(somatic hypermutation)）。
【００１２】
ジャンクショナルダイバーシティーは、重鎖では遺伝子ｖ−ｄおよびｄ−ｊ、軽鎖ではｖ−ｊの間の接合部におけるコンビナトリアルな再編成の際の突然変異の出現に基づく。
【００１３】
抗体の親和性の成熟は、ＶＨおよびＶＬ領域をコードする領域においてもっぱら生じる点様突然変異からなり、パラトープの構造変化の起源となり得る体細胞超変異を選択するプロセスによって起こる。
【００１４】
従って、多様性は記載した３つの要素、すなわち、コンビナトリアルダイバーシティー、ジャンクショナルダイバーシティーおよび体細胞超変異に基づく。
【００１５】
これらの要素を用いて始め、ヒト抗体の大きな多様性を迅速に生じさせることができるように種々の技術が開発され、特に、技術的にハイブリドーマを得るのが困難なヒト抗体の場合に注目されることが分かった。
【００１６】
より詳しくは、いわゆる「ファージディスプレー」技術(Smith, 1985, Science, 228:1315; Scott & Smith, 1990 Science, 249:386; McCafferty, 1990, Nature, 348:552)の出現が、in vitroでライブラリーから、多様な標的、または抗原に対して向けられた抗体またはヒト抗体のフラグメントを選択できる可能性を与えた。これらのライブラリーは２つの群、すなわち、天然ライブラリーと合成ライブラリーに分けられる。
【００１７】
天然ライブラリーはヒトＢ細胞から直接回収された遺伝子から、従って、コンビナトリアルダイバーシティー、ジャンクショナルダイバーシティーおよび体細胞超変異を保証する種々の機構の後に構築される。よって、このようなライブラリーを用いれば、多様な抗体を天然に作製することができる。
【００１８】
さらに、これらの天然ライブラリーは、確立され、実証された技術を用いるという利点を有し、細菌、酵母、真核細胞または植物などの種々の発現系との適合が可能である。
【００１９】
しかしながら、これらのライブラリーの作製は扱いにくく、適用が困難であり、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）工程に頼る必要がある。このＰＣＲ工程の適用では、既知の生殖細胞系からこのＰＣＲに必要なプライマーを定義するために、５’および３’領域の個々の配列を知っておく必要がある。もしこの点が遺伝子ｃ（すなわち、抗体の定常領域をコードする）に位置する３’末端に関して特に厄介でなければ、それは、それに対して遺伝子ｖ、すなわち変動性遺伝子の末端に位置する５’末端に関して限定する。遺伝子ｖの５’領域に関して必要とされるこの知見は、本質的に、選択可能なプライマーをこれまでに知られている生殖細胞系由来のプライマーに限定し、従って、既知の遺伝子ｖ配列に限定する。これは、回収され得る抗体をそれらの可変領域の５’領域に既知の配列を有する抗体に限定し、従って、遺伝子ｖの５’末端の配列が知られていない他の総ての抗体を排除するという結果となる。さらに、クローニングおよび／または増幅を容易にするために可変領域のアミノ酸を改変する必要もあり得る。
【００２０】
遺伝子ｖの５’末端に関して必要な知見から来るもう１つの欠点が、この末端で体細胞超変異が生じた抗体を見過ごすというリスクである。
【００２１】
最後に、ＰＣＲ技術のために、遺伝子ｖの５’末端が、用いるプライマーと極めて強い親和性を有する抗体だけが、親和性の低いものが保持されずに、優先物として回収される。
【００２２】
それらに関する合成ライブラリーは、種々の非再編成遺伝子から構築される。それらの再編成はin vitroにおいてＰＣＲにより行われ、次に、特異性および親和性に関して最良の抗体を得るために種々のin vivo成熟機構が適用され得る。
【００２３】
合成ライブラリーに頼れば、得られる抗体の多様性を増し、かつ、これらの種々の発現系との適合を保持することができる。しかしながら、それでもやはり、それらを作製するのに必要な作業には時間と労力がかかり、多くの欠点が残るのはそのままである。実際、合成ライブラリーを作製するには、ＰＣＲ工程が常に必須である。ＰＣＲに使用に関連する上述の欠点に加え、この工程はサイズの大きな縮重プライマーの使用を必要とし、これはしばしば組み立てられたｖ、ｄ、ｊ遺伝子内の塩基対の欠失、付加および改変を導入し、これがまた、それらを適切に折りたたむことができない抗体の形成をもたらし、機能的でなくなく場合がある。さらに、これらのライブラリーから選択された抗体は一般に発現が弱く、多くの場合、抗体の免疫原性に影響を及ぼし得る突然変異を含む。
【００２４】
さらに、合成ライブラリーの作製では、体細胞超変異のジャンクショナルダイバーシティーを保証する接合領域における突然変異を考慮に入れることができない。従って、多様性の大きな損失がある。
【００２５】
本発明は、重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するため、最も詳しくは、広い多様性を有する抗体のライブラリーを作製するための簡単な方法を初めて記載することにより、上記に挙げた欠点をまとめて克服することをねらいとする。よって、本発明の目的は、その利点を有するだけでなく、合成ライブラリーの利点も有し、それとともにこれら２つの技術それぞれの個々の欠点を排除しつつ、抗体の重鎖および／または軽鎖の天然ライブラリーを作製する方法である。
【００２６】
より詳しくは、本発明は、ＰＣＲ増幅工程を用いずに行うことによりこれまでに知られているどの技術とも異なり、従って、このＰＣＲ工程に関連する上記のどの欠点とも異なる。最も詳しくは、本発明の目的である技術は、もはや、抗体の可変ドメインの遺伝子ｖの５’末端の配列が既知である必要はない。本発明は、増幅工程が一本鎖ＤＮＡ配列に対して行われるという点で先行技術と異なる。実際、標準的なＰＣＲ増幅工程、すなわち、二本鎖ＤＮＡ分子に対するものに限定される当業者の先入観および技術の現状の一体とは異なり、本発明は、単一の一次プライマーから、また、この一次プライマーから得られた一本鎖ｃＤＮＡ配列から抗体バンクを作製する方法を初めて記載する。
【００２７】
第一の態様によれば、本特許出願の目的は、抗体、または少なくとも抗体の重鎖および／もしくは軽鎖をコードするＲＮＡを発現し得る細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の重鎖および／または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製する方法に向けられ、該方法は少なくとも以下の工程：
ａ）一次プライマー（Ｉ）を、抗体の重鎖または軽鎖をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（ここでは「センス」ＲＮＡと表す）を含むべき該ＲＮＡ抽出物または混合物と接触させる工程（この一次プライマーは該「センス」ＲＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、該抗体の重鎖および／または軽鎖の定常領域Ｃをコードする配列に含まれる）；
ｂ）該一次プライマー（Ｉ）から、「アンチセンス」ｃＤＮＡと表される一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
ｃ）必要に応じて、工程ａ）でハイブリダイズされなかった一次プライマー（Ｉ）を除去する工程；
ｄ）該「アンチセンス」ｃＤＮＡを、その５’末端とその３’末端の間に共有結合を導入することによってアニーリングする工程；
ｅ）「センス」二次プライマーと表される二次プライマー（ＩＩ）を、工程ｄ）で得られた「アンチセンス」環状ｃＤＮＡと接触させる工程（この「センス」二次プライマー（ＩＩ）は該「アンチセンス」環状ｃＤＮＡとハイブリダイズすることができる）；
ｆ）該二次プライマー（ＩＩ）から該「アンチセンス」ｃＤＮＡを増幅させる工程；および
ｇ）それにより増幅された「センス」相補的ＤＮＡ直鎖を回収する工程
を含む。
【００２８】
ＰＣＲ工程に頼るのであれば、そこに相補的プライマーをハイブリダイズさせ、それにより二本鎖分子の従来技術による増幅を開始させることができるには、増幅されるべき遺伝子の５’末端および３’末端それぞれの配列を知っておく必要がある。
【００２９】
本発明の実際の原理は、アニーリングされた一本鎖ＤＮＡ配列を適切な酵素で増幅させることができることに基づく。従って、当業者には、増幅されるべき配列の３’末端の１つの相補的プライマーだけが必要とされることが明らかであろう。そして、より詳しくは、抗体をコードする配列を作製するという範囲内で、本発明に従う増幅には、定常領域に相当する配列の全部または一部の相補的プライマーだけが必要となる。この場合、そのプライマーを一本鎖ＤＮＡ分子、すなわち、「センス」ＲＮＡ分子に結合させれば、一本鎖配列を増幅させることができる好適な酵素を用いてこれを増幅するに十分である。
【００３０】
当業者ならば、前記が可変領域に相当する「センス」ＲＮＡ配列の全体的増幅を可能とし、その５’末端である限り、すなわち、必要であれば、シグナルペプチドならびに５’−ＵＴＲ領域に相当する配列を含むという点で、本発明の目的である本発明によりもたらされる利点を容易に理解するであろう。
【００３１】
この技術によって単離された抗体は、次に、真核生物発現系においてこのような抗体を発現させるのに最適な、その元のシグナルペプチドとともに直接クローニングすることができるという点で、この態様は特に有利である。実際、元のシグナルペプチドが存在しなければ、発現ベクターにおける抗体のクローニングは、非天然シグナルペプチドの付加が必要となり、常に抗体の遺伝子の５’末端の配列を知っておく必要があり、このような抗体の核酸配列および／またはタンパク質配列の改変の導入の可能性がある。さらに、このような方法を用いれば、上記の欠点を総て排除すること可能性である。
【００３２】
上記の各工程は、この工程に求められる必須の結果が、やはり本発明の目的から、また、この方法の保護の所望の範囲から逸脱することなく得ることができる等価の工程で置き換えてよいことは明らかである。明瞭にするために、ここで、本特許出願の全体において、「センス」および「アンチセンス」という表現は、当業者にとって標準的な方法での参照体系として、最初のＲＮＡ分子、すなわち、抗体の重鎖または軽鎖をコードするＲＮＡ分子の５’３’方向を持つことを明記する。
【００３３】
よって、論理的に、一次プライマー（Ｉ）とこのプライマーから作製されたｃＤＮＡ分子は、両者とも該ＲＮＡに相補的であり、これにより「アンチセンス」という表現により特徴付けられる。同様に、二次プライマー（ＩＩ）ならびにこのプライマーから作製された直鎖ＤＮＡ分子は、両者とも作製されたｃＤＮＡに相補的であり、従って、最初のＲＮＡ配列のような配向を持ち、「センス」という表現により特徴付けられる。最後に、同様に、三次プライマー（ＩＩＩ）およびこの三次プライマーから作製された相補的ＤＮＡ配列は、それらに関して、「アンチセンス」という表現により特徴付けられる。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡの抽出物または混合物が由来する細胞は哺乳類細胞、好ましくは、マウス、ラットまたは霊長類のものであり、ヒト起源が最も好ましい。
【００３５】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ抽出物または混合物は、全ＲＮＡの抽出物または混合物、メッセンジャーおよび／またはプレメッセンジャーＲＮＡが富化されたＲＮＡの抽出物または混合物である。
【００３６】
第二の実施形態によれば、本発明の目的である該方法は、天然細胞、健常細胞、または病的組織もしくは器官、とりわけ腫瘍由来の細胞に直接適用可能であり、これらの細胞は抗体の重鎖または軽鎖をコードするＲＮＡを発現することができる。本発明の目的である該方法はまた、健常細胞または病的細胞由来の細胞系統の細胞にも適用可能である。
【００３７】
また、本発明の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡの抽出物または混合物は脾細胞、結節またはＢリンパ球に起源する。
【００３８】
好ましくは、ＲＮＡ混合物の抽出物が由来する細胞はＢリンパ球またはその前駆体の１つまたは形質細胞である。好ましくは、これらの細胞はプロ−Ｂ前駆細胞（すでにＢ細胞系に約束された幹細胞）、プレ−Ｂ前駆細胞、未熟Ｂリンパ球、免疫適格成熟Ｂリンパ球または形質細胞から選択される（これらの細胞の特徴に関しては、とりわけ、ImmunoGeneticsサイト<<http://imgt.cines.fr/textes/IMGTeducatio n/Tutorials/IGandBcells/_FR/Differenciation B/>>でProfessors Marie-Paule LEFRANC and Gerard LEFRANC, Universite Montpellier II and Laboratoire d'ImmunoGenetique Moleculaire, LIGMによる刊行物「Differenciation des lymphocytes B」に示されている定義を参照）。
【００３９】
本発明の極めて好ましい実施形態によれば、ＲＮＡ抽出物または混合物はＢリンパ球に由来する。
【００４０】
特定の実施形態によれば、ＲＮＡが起源する細胞は細胞系統由来の細胞、健常な哺乳類または予め治療有効成分、とりわけ、免疫原またはワクチン（後者は抗感染性または抗腫瘍性ワクチンであり得る）としての抗原で処置された哺乳類からの単離細胞である。これらの細胞の中で、癌に罹患している、またはさらに病原性ウイルスに感染している患者からの細胞を挙げることもできる。
【００４１】
よって、本発明の利点は、多様な細胞材料で始めて実施できるという可能性が得られることである。
【００４２】
例えば、本発明の別の実施形態によれば、例えば、一方が脾臓由来のＢリンパ球ともう一方が骨髄腫細胞の間の融合から得られるハイブリドーマなどの形質転換細胞で始めて実施することが望ましい場合がある。
【００４３】
この適用では、本発明に従う方法の利益の１つは、ＰＣＲ増幅を用いずに、従って、抗体の５’末端の配列を知ることなく、該ハイブリドーマにより発現されたモノクローナル抗体の天然配列を得ることができるということである。得られた配列はまた、該抗体の天然シグナルペプチド、および５’ＵＴＲ領域をコードする配列も含んでなる。この基礎において、この抗体は当業者に公知の標準的な手段によってクローニングしてもよいし、あるいはまた、該抗体に相当する遺伝子を、ＰＣＲ工程の必要なく、完全に合成してもよい。
【００４４】
よって、本発明に従う方法の特定の実施形態では、抗体を発現し得る細胞はハイブリドーマにおいてである。
【００４５】
特定の好ましい実施形態によれば、ＲＮＡおよび一次プライマー（Ｉ）からの工程ｂ）におけるｃＤＮＡの合成は、とりわけ、逆転写酵素とヌクレオチド混合物（ｄＮＴＰ）の存在下でプライマーからｃＤＮＡの合成を得るために当業者に周知のいずれかの技術で行われる。
【００４６】
前記ｃＤＮＡの合成に用いられる一次プライマー（Ｉ）は、その５’末端に、工程ｂ）で合成されたｃＤＮＡの３’末端に共有結合により結合できる基を含んでなり、それによりこのｃＤＮＡのアニーリングが起こり、この基は一次プライマー（Ｉ）の合成の際に導入することができる。これらの基の中でもＰＯ４基が好ましく、この基は、ＤＮＡリガーゼの存在下で、前記の合成ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端とホスホジエステル型の共有結合を形成することができる。
【００４７】
特定の実施形態では、アニーリング工程ｄ）の前に、反応媒体中にハイブリダイズしていない一次プライマー（Ｉ）の残存物が確実に残っていないようにすることが好ましく、これは該プライマー（Ｉ）のアニーリングを避け、そして、抗体のアニーリングしたｃＤＮＡよりもアニーリングしたプライマー（Ｉ）の増幅が起こらないようにするためである。
【００４８】
これを行うため、限定されない例として、サイズフィルタリングによるか、またはｃＤＮＡの精製製品を用いるか（１００塩基対（ｂｐ）未満の材料を排除することが分かっている）、またはさらにアガロースゲルでの分離を用いた精製による、ｃＤＮＡ合成後の反応媒体の洗浄などのいくつかの解決法が意図される。もう１つの代替法によれば、用いる一次プライマー（Ｉ）の量は飽和量を下回るように至適化され、この構成では工程ｃ）は必要とされない。
【００４９】
本発明のもう１つの好ましい実施形態によれば、該一次プライマー（Ｉ）は、定常領域Ｃに相当する「センス」ＲＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である。
【００５０】
本発明のこの態様は、抗体の重鎖または軽鎖の定常領域をコードする配列の少なくとも一部を特異的に認識するプライマーからの抗体のアニーリングしたｃＤＮＡの合成、その後の特異的増幅を可能とするという意味で有利である。
【００５１】
特定の好ましい実施形態では、該ｃＤＮＡの合成に用いる一次プライマー（Ｉ）は、その５’末端に、工程ｂ）で合成されたｃＤＮＡの３’末端に共有結合により結合することができる基を含んでなり、それによりこのｃＤＮＡのアニーリングが起こり、この基は一次プライマー（Ｉ）の合成の際に導入される。これらの基の中でもＰＯ４基が好ましく、この基はＤＮＡリガーゼの存在下で合成されたｃＤＮＡの３’ＯＨ末端とホスホジエステル型の共有結合を形成することができる。
【００５２】
ｃＤＮＡ配列がアニーリングされる場合、当業者ならば、二次プライマー（ＩＩ）が特異的であってもなくてもよく、これは「ローリングサークル」で増幅し、このｃＤＮＡ配列全体が増幅されることを理解することができる。本発明の実施形態によれば、ランダムプライマーが使用可能である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態によれば、該二次プライマー（ＩＩ）は該「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端と、定常領域Ｃに相当する該「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列の３’末端の間に含まれる配列に特異的である。
【００５４】
いっそうより好ましくは、該二次プライマー（ＩＩ）は、「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列と特異的である。
【００５５】
これは図面から明らかとなるが、「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端はまた、一次プライマー（Ｉ）の５’末端に相当し、該「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列は、当然のことながら、一次プライマー（Ｉ）により開始される。
【００５６】
本発明の可能性のある実施形態によれば、本発明の方法の工程ｅ）で適用される該二次プライマー（ＩＩ）は、一次プライマー（Ｉ）をコードする配列の全体とハイブリダイズすることができる「アンチセンス」プライマーからなる。別の可能性のある実施形態によれば、この二次プライマー（ＩＩ）は一次プライマー（Ｉ）の大きさよりも小さく、一次プライマー（Ｉ）をコードする配列内でハイブリダイズする。
【００５７】
より詳しくは、本発明は、該一次（Ｉ）プライマーおよび二次（ＩＩ）プライマーがそれぞれ１０〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡ配列からなることを特徴とする方法を目的とする。
【００５８】
いっそうより好ましくは、本発明による方法は、該一次（Ｉ）プライマーおよび二次（ＩＩ）プライマーがそれぞれ、一次プライマー（Ｉ）については２０〜６０ヌクレオチドの間、そして二次プライマー（ＩＩ）については１０〜３０ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡ配列からなることを特徴とする。
【００５９】
従来、「アンチセンス」ｃＤＮＡ鎖の合成は、遊離ヌクレオチドと、限定されない例として、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ、またはさらには鳥類骨髄芽球症ウイルスまたはモロニーネズミ白血病ウイルス逆転写酵素などの逆転写酵素型の酵素を加えることにより行われる。
【００６０】
好ましくは、本発明による方法は、一次プライマー（Ｉ）のハイブリダイゼーション工程ａ）の前にＲＮＡ変性のための工程を含んでなる。
【００６１】
回収されたＲＮＡの変性は従来、当業者に公知のいずれの方法によって達成してもよい。限定されない例として、反応混合物を６５℃以上に加熱することが挙げられ、これはＲＮＡの二次構造を変性させる。変性冷却の際に反応混合物中に一次プライマー（Ｉ）が存在すると、一次プライマーと、高い特異性を有する該ＲＮＡ中のその相補的配列とのハイブリダイゼーションが可能となる。さらに、例えばＴ４遺伝子３２補因子などのタンパク質補因子を添加してもよい。これにより、ｃＤＮＡの非特異的合成の軽減が可能となる(This allows i.a. reduction of non-specific synthesis of cDNA.)。
【００６２】
本発明に従う方法の鍵となる工程の１つは、「アンチセンス」ｃＤＮＡのアニーリングにある。この工程は当業者に公知のいずれの技術によって行ってもよい。実際、増幅のために従来のＰＣＲ工程を排除できるということは、一本鎖形態で増幅されるｃＤＮＡ分子がアニーリングされるという事実に大部分基づいている。このＤＮＡのアニーリング原理はそれ自体が新規なものでなければ、本発明の範囲内でのその適用、すなわち、抗体の重鎖および／または軽鎖をコードする配列の作製は新規であり、これまでに記載されていない。
【００６３】
このアニーリング工程は、それが同じモノカテナリー（一本鎖）ＤＮＡの５’末端と３’末端の共有結合による結合を可能とする限り、当業者に公知のいずれの技術を用いて行ってもよい。
【００６４】
好ましくは、該アニーリング工程は、「ｓｓＤＮＡリガーゼ」型のリガーゼ（「ｓｓＤＮＡ」は「一本鎖ＤＮＡ」をさす）との接触により行われる。
【００６５】
一実施形態によれば、リガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre, Madison, WI, USA)またはｓｓＤＮＡサーモファージまたはいずれかの等価の酵素から選択される。
【００６６】
しかしながら、本発明に従う好ましい実施形態によれば、このリガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）または等価の酵素からなる。
【００６７】
さらに詳しくは、当業者ならば、以下の刊行物(Polidoros, A.N. et al., Biotechniques 41(1), 35 (2006))を参照することができる。
【００６８】
好ましくは、用いるリガーゼは、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入する。これを行うために、該ｃＤＮＡの合成に用いる一次プライマー（Ｉ）の合成の際にその５’末端に予めＰＯ４基が導入された。当然のことながら、同じ機能をもたらし得る、すなわち、ｃＤＮＡ分子の５’末端と３’末端の間の共有結合を可能とする他のいずれの基も使用可能である。
【００６９】
このアプローチによって単離された抗体のクローニングを容易にするため、この一次プライマー（Ｉ）は定常部分の配列内に天然の制限部位を含んでもよく、あるいはこの工程を容易にするためにそれに特異的に付加された非天然配列を含んでもよい。アダプターとしてのこの付加配列は発現ベクターにおいてクローニングを容易にすることができる。このアダプターは好ましくは、発現ベクター内に存在する制限部位に適合した１以上の制限部位を含んでもよい。第二の例は、部位特異的レコンビナーゼ型の酵素により認識される２つのＤＮＡ配列を、単量体を作出するためにそれらの間の制限部位とともに含んでなるアダプターからなり得る。限定されない例としての該部位特異的レコンビナーゼは、λファージ部位特異的レコンビナーゼまたはＰ１バクテリオファージＣｒｅレコンビナーゼであり得る。このアダプターはまた、「リガーゼ依存的クローニング」に適合した各部位の配列を有する単量体を作製するための制限部位を含んでなるＤＮＡ配列を含んでなってもよい。
【００７０】
本発明の目的である方法のもう１つの重要な工程は、厳密に言えば、環状「アンチセンス」ｃＤＮＡ分子の増幅工程にある。上述のように、この工程は、二次プライマー（ＩＩ）の最初の段階における、該「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列の５’末端と同じ「アンチセンス」ｃＤＮＡの定常領域Ｃに相当する配列の３’末端の間のハイブリダイゼーションにより開始される。
【００７１】
この二次プライマーは当業者に公知の方法に従って選択され、１以上の免疫グロブリンイソ型の定常部分をコードするｃＤＮＡ配列との相補性、および定常部分の５’末端と一次プライマー（Ｉ）がハイブリダイズした末端の間に含まれるのが望ましいことが分かっている。
【００７２】
このｃＤＮＡ分子を増幅させるために、増幅工程ｆ）が、一本鎖環状ＤＮＡ配列を増幅させることができる酵素とともに適用される。
【００７３】
より詳しくは、該酵素は好ましくは、ＢＳＥ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、バクテリオファージφ２９の「ローリングサイクルポリメラーゼ」または一本鎖環状ＤＮＡ配列を増幅させることができるいずれかの等価の酵素からなる。
【００７４】
第一の適用では、当業者に公知の従来のアプローチを用い、数コピーの抗体からなる増幅された一本鎖ＤＮＡの直接配列決定が意図される。このアプローチによって得られる配列は５’−ＵＴＲ領域、シグナルペプチド、および該抗体の可変部分をコードする配列を含んでなり、その抗体をコードする配列の５’末端について予め知っておく必要はない。
【００７５】
一実施形態によれば、本発明による方法は、工程ｇ）で回収された「センス」直鎖ＤＮＡを配列決定する工程をさらに含んでなる。
【００７６】
この態様は、例えばとりわけ「アンチセンス」ｃＤＮＡがハイブリドーマから回収されたＲＮＡから得られた場合に注目される。
【００７７】
第二の適用では、本発明の目的である方法は、好ましくは、マウス、ラットまたは霊長類（ヒト起源が好ましい）などの哺乳類の抗体の重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法において適用可能である。
【００７８】
より詳しくは、この場合、本発明の目的は、重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法であって、該方法は上記のような方法を適用することからなり、さらに以下の工程：
ｈ）「アンチセンス」三次プライマーと呼ばれる三次プライマー（ＩＩＩ）を、工程ｇ）で得られた「センス」直鎖ＤＮＡと接触させる工程（この「アンチセンス」三次プライマー（ＩＩＩ）は該ＤＮＡ直鎖の３’末端と５’末端の間に含まれる直鎖ＤＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、定常領域Ｃをコードするこの直鎖ＤＮＡの配列に相当する）
ｉ）該三次プライマー（ＩＩＩ）から、相補的「アンチセンス」ＤＮＡ鎖の合成によりコンカテマーを作製する工程、および
ｊ）それにより得られた二本鎖ＤＮＡコンカテマーを予め作製したベクター内にクローニングする工程
を含んでなる。
【００７９】
このような方法を用いれば、例えば、それにより得られ、クローニングされたコンカテマーライブラリーから、これらのコンカテマーの単量体で表される重鎖または軽鎖を配列決定することができる。
【００８０】
本発明の目的に含まれるこのような方法では、コンカテマーまたは該コンカテマーの少なくとも１つの単量体を配列決定するための工程は工程ｊ）の終了時に適用される。
【００８１】
「コンカテマー」とは、直鎖多量体を形成する同じ繰り返しの単量体からなるＤＮＡ分子と理解することができる。
【００８２】
より詳しくは、好ましい実施形態によれば、該三次プライマー（ＩＩＩ）は、定常領域Ｃに相当する「センス」直鎖ＤＮＡの配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である。
【００８３】
この態様は、一本鎖コンカテマーと相補的な二本鎖を合成することができ、そして、樹状増幅を開始させるという利点を有する。
【００８４】
一次および二次プライマーについては、該三次プライマー（ＩＩＩ）は、１０〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡ配列からなる。三次プライマー（ＩＩＩ）については、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、１５〜３５、そして１５〜３０ヌクレオチドの間の長さがいっそうより好ましい。
【００８５】
好ましい実施形態では、本発明の目的は、本発明による重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法であり、該方法は、クローニング工程ｊ）の前に、用いるプライマーに相当する配列において、得られたコンカテマーをセグメント化する工程を含んでなり、この工程の後に、それにより得られた二本鎖ＤＮＡセグメントを予め作製されたベクター内にクローニングするための工程ｊ）を行うことを特徴とする。
【００８６】
重鎖または軽鎖抗体鎖の単量体をコードするＤＮＡのバンクを作製するためのこの方法では、一次プライマー（Ｉ）が制限部位を含んでなること、そして、それにより得られたコンカテマーがこの一次プライマーの配列においてセグメント化されるのが好ましい。
【００８７】
この制限部位の存在は、工程ｊ）の前にコンカテマーをセグメント化するために用いる手段の１つである。二本鎖コンカテマーを形成する相補鎖の作製の実際の特性のために、この制限部位は該コンカテマーを形成する２本の鎖上に見られる。第一の実施形態によれば、一次プライマー（Ｉ）は、少なくとも１つの制限部位を天然に含んでなるように選択することができる。一例として、軽鎖κの定常部分に存在するＨｐａ １および／またはＨｉｎｃ ＩＩまたはさらにはλ鎖ではＢｇｌ ＩＩが挙げられる。
【００８８】
第二の実施形態によれば、一次プライマー（Ｉ）は、制限部位を含むように若干改変することができる。例えば、制限部位を人工的に作出し、しかしながら所望のセンスＲＮＡドメインと特異的にハイブリダイズするその能力を失わないように、１つまたは２つの残基を変異させることができる。
【００８９】
最後に、第三の実施形態によれば、制限部位をコードする配列を一次プライマー（Ｉ）内に挿入することができ、これは所望のセンスＲＮＡドメインと特異的にハイブリダイズするその能力をプライマーに保持させることによる。
【００９０】
従って、本発明による重鎖または軽鎖抗体鎖の単量体セグメントをコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法はまた、コンカテマーをセグメント化するための工程が、一次プライマー（Ｉ）に含まれるか、または導入された制限部位の、特異的制限エンドヌクレアーゼによる酵素的消化により適用されることを特徴とする。
【００９１】
該単量体は、次に、重鎖または軽鎖の一次プライマー（Ｉ）の３’に定常部分の連続を含んでなる真核生物発現ベクターにクローニングすることができる。クローニングは、一次プライマー（Ｉ）内に存在するものに相補的な制限部位を介して、または部位特異的組換えにより行うことができる。該発現ベクターは、宿主細胞株において組換えタンパク質を発現するために必要なエレメントを含むことができる。限定されない例として、ベクターｐＣＥＰ(Invitrogen)は好適な発現プロモーターを含んでなる。
【００９２】
より詳しくは、本発明による方法は、工程ｊ）に用いられるベクターが、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインをコードする配列をさらに含んでなることを特徴とする。
【００９３】
好ましくは、重鎖の定常ドメインをコードする配列は好ましくは、膜アンカーを含む免疫グロブリン由来の配列、またはトランスメンブランＣ末端領域を含んでなる配列からなる。
【００９４】
本発明に従って作製された抗体バンクのスクリーニングを容易にするために、重鎖または軽鎖抗体鎖の配列を、例えば、ヒト解離促進因子（崩壊促進因子(decay-accelerating factor)、「ＤＡＦ」またはＣＤ５５）から生じたトランスメンブラン領域のグリコシジルホスホチジルイノシトール結合シグナル配列の５’末端にクローニングすることができる。それにより構築されたベクターは次に、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などの真核宿主株にトランスフェクトすることができる。
【００９５】
よって、本発明は、重鎖または軽鎖抗体鎖の単量体をコードするＤＮＡのライブラリーを発現することができる細胞のバンクをスクリーニングするための方法を記載し、該ライブラリーは本発明による方法によって作製されたものであり、本発明によるＤＮＡバンクを作製するための方法の工程ｊ）で得られたベクターで、該ベクター内に挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされている抗体を発現することができる宿主細胞をトランスフェクトすることからなる工程ｋ）、および重鎖または軽鎖抗体鎖の配列をコードするこのようなＤＮＡを発現する細胞が選択される工程ｌ）をさらに含んでなることを特徴とする。
【００９６】
より詳しくは、工程ｌ）の宿主細胞は、その表面で、挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされている抗体の重鎖および／または軽鎖を発現することができる細胞からなり、いっそうより好ましくは、該宿主細胞は、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞などの真核細胞からなる。
【００９７】
真核生物の宿主細胞における発現は、天然型の抗体を発現するという利点を有する。いくつかの細胞をクローニング抗体の混合物でトランスフェクトすると、宿主細胞の表面において結合または発現された抗体（または重鎖および／または軽鎖を含んでなるフラグメント）のバンクを作製することができる。抗体（またはフラグメント）の該バンクは、次に、例えば、陽性クローンをＦＡＣＳにより分離することによるか、または固定された、もしくは懸濁された標識を用いてポリクローナル集団を単離することによるなど、当業者に公知のいずれかのアプローチのよってスクリーニングすることができる。
【００９８】
別の態様によれば、抗体または重鎖および／または軽鎖を含んでなるそのフラグメントのライブラリーを作製するために本発明による方法の使用が意図される。
【００９９】
同様に、本発明はまた、上記の方法を適用することによって得られるいずれの抗体ライブラリーも包含する。
【０１００】
限定されるものではないが、好ましくは、本発明による抗体ライブラリーは、ヒト抗体またはそのフラグメントのライブラリーである。
【０１０１】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明により得られたライブラリーをスクリーニングすることにより得られる抗体、機能的フラグメントまたは誘導化合物が記載され、特許請求され、該抗体またはフラグメントは好ましくはヒト抗体を含んでなる。
【０１０２】
最後に、本発明の最後の態様によれば、それが由来する抗体により認識される特異的エピトープを認識することができる抗体またはそれらの機能的フラグメントをスクリーニングするためのin vitro法が意図され、これらの抗体は所定の疾病に対して活性があり、この方法は、該所定の疾病に罹患している患者から血液サンプルを採取する工程を含んでなり、該血液サンプルに対して本発明による方法が適用される。限定されるものではないが、いっそうより好ましくは、該所定の疾病は癌である。
【０１０３】
本発明の他の特徴および利点は、以下の記載において、実施例および図面（その説明を以下に示す）を見れば明らかになろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】本発明の目的である方法の実施形態の工程ａ）およびｂ）を示す図である。
【図２】本発明の目的である方法の実施形態の工程ｃ）を示す図である。
【図３】本発明の目的である方法の実施形態の工程ｄ）、ｅ）およびｆ）を示す図である。
【図４】実施例２において重鎖の配列を作製するために用いた種々の一次（Ｉ）、二次（ＩＩ）および三次（ＩＩＩ）プライマーを示す。一次プライマー（Ｉ）において制限部位を下線で示す。
【図５】実施例２において軽鎖の配列を作製するために用いた種々の一次（Ｉ）、二次（ＩＩ）および三次（ＩＩＩ）プライマーを示す。一次プライマー（Ｉ）において制限部位を下線で示す。
【図６】配列決定後の全重鎖に関して得られた配列（配列番号１１に相当）を示し、ここでも、クローニングベクターの部分（斜体の核酸配列）、制限部位（下線の核酸配列）、一次プライマーＩに相当するフラグメント（太字の核酸配列）、５’−ＵＴＲ領域（四角で囲まれた核酸配列）、シグナルペプチド（二重下線の核酸配列）、重鎖可変部分（太字のアミノ酸配列）および定常部の部分（斜体のアミノ酸配列）が見られる。
【図７】重鎖に関して、図面においてそれぞれ、ｉ）ＩＭＧＴベースの、生殖細胞系ＩＧＨＶ１−１８＊０１の配列、ｉｉ）標準的なアプローチにより得られた可変ドメインの配列、およびｉｉｉ）本発明の方法（図において本発明のアプローチと呼ぶ）によって得られた可変ドメインの配列のアライメントを示す。
【図８】さらに重鎖に関して、図面においてそれぞれ、ｉ）ＩＭＧＴベースの、生殖細胞系ＩＧＨＶ１−１８＊０１に関連している（図面ではゲノム配列と呼ばれる）シグナルペプチドの配列、ｉｉ）標準的なアプローチにより得られたシグナルペプチドの配列、およびｉｉｉ）本発明の方法（本発明のアプローチと呼ぶ）によって得られたシグナルペプチドの配列のアライメントを示す。
【図９】全軽鎖に関して配列決定後に得られた核酸配列およびタンパク質配列（配列番号１２に相当する）を示し、二重下線の核酸配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１０】全重鎖に関して間接的配列決定後に得られた配列（配列番号１８に相当する）を示し、太字の核酸配列はプライマーに相当し、下線の核酸配列は制限部位Ｍｌｕ Ｉに相当し、二重下線の核酸配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１１】全重鎖に関して複合配列決定後に得られた配列（配列番号２０に相当する）を示し、二重下線の核酸配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１２】全重鎖に関して間接的配列決定（配列番号１８）および複合配列決定（配列番号２０）後に得られた配列のアライメントを示し、太字の核酸配列は一次プライマーに相当し、下線の核酸配列は制限部位Ｍｌｕ Ｉに相当し、二重下線の配列はシグナルペプチドに相当し、太字のタンパク質配列は可変ドメインに相当し、斜体のタンパク質配列は定常ドメインに相当する。
【図１３】真核細胞の表面にそれらを提示させるための抗体の可変部分をクローニングするための様式を示す。プロモーター：発現プロモーター、すなわち、ＣＭＶ；Ｍｌｕ Ｉ：本発明によるＲＣＡにより得られた可変部分のクローニングのための特異的制限部位；ＣＨ１’−ＣＨ２−ＣＨ３：ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分の部分的ＣＨ１ドメインおよび全ＣＨ２−ＣＨ３ドメイン；ＤＴＭ：トランスメンブランドメイン；Ｃκ’：部分的ヒトＣκ２ドメイン。
【図１４】ＣＨＯ細胞の表面における抗体の存在に関するＦＡＣＳ分析を示す。上の図：抗ヒトＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８を用いた表面における抗体の検出。下の図：抗ネズミＩｇＧ Ａｌｅｘａ ４８８を用いた表面における抗体の検出。非発現細胞は黒いピークで表され、マーキングされた細胞は黒い線で表される。
【図１５】プライマーの例を示す。図１５Ａ：ヒト抗体をクローニングおよび配列決定するためのプライマーの部位。Ｍｆｅ Ｉ（１個のアミノ酸の改変）の制限部位Ｍｌｕ Ｉ（全部合成）が付加されたヒトＩｇＧ１−４定常部分のコンセンサス配列。図１５Ｂ：ヒト抗体をクローニングおよび配列決定するためのプライマーの部位。制限部位Ｍｌｕ Ｉが付加されたＩｇκ定常部分のコンセンサス配列。図１５Ｃ：ヒト抗体クローニングおよび配列決定するためのプライマーの部位。制限部位Ｍｌｕ Ｉが付加されたヒトＩｇλ定常部分のコンセンサス配列。
【実施例】
【０１０５】
実施例１
図１は、抗体の重鎖をコードする「センス」ＲＮＡ鎖を示し（点線）、該ＲＮＡはこの例ではハイブリドーマから回収されたものである。最初に記載したように、このＲＮＡ鎖は精製されたものである。このＲＮＡ鎖は５’３’方向に、可変領域をコードする配列ならびに定常領域Ｃをコードする配列を含んでなる。より詳しくは、可変領域Ｖは、５’−ＵＴＲ単位、シグナルペプチド（Ｐｓ）ならびにｖ、ｄおよびｊ遺伝子からなる。遺伝子ｖは可変遺伝子に相当し、遺伝子ｄは多様性遺伝子に相当し、遺伝子ｊは接合遺伝子に相当する。
【０１０６】
軽鎖の場合、「センス」ＲＮＡ鎖は遺伝子ｄは含まない。本特許出願では、重鎖の例のみを詳しく記載し、軽鎖の場合はその方法の種々の工程のレベルで同一である。
【０１０７】
「アンチセンス」一次プライマー（Ｉ）は、定常領域Ｃにおいてハイブリダイズされる。より詳しくは、本明細書に示されている好ましい実施形態によれば、一次プライマー（Ｉ）は定常領域Ｃをコードする配列の５’末端の近傍でハイブリダイズする。
【０１０８】
最初に記載したように、この点は、ｃＤＮＡ鎖の合成の際にｖ、ｄおよびｊ遺伝子の完全性が事実上保存されることを確実とすることができるという意味で、本発明の特に興味深い利点を有する。
【０１０９】
該一次プライマー（Ｉ）から「アンチセンス」ｃＤＮＡ鎖が合成され（実線で示される）、これはそれに対して５’３’方向に遺伝子ｊ、ｄおよびｖの相補的配列を含んでなる。
【０１１０】
このｃＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドを次にＲＮアーゼで処理してＲＮＡ鎖を分解し、その後アニーリングさせることができるｃＤＮＡの一本鎖を得る。
【０１１１】
アニーリング工程は図２に示す。
【０１１２】
より詳しくは、５’３’方向に、プライマー（Ｉ）を含んでなる定常領域Ｃの部分をコードする配列と可変領域の相当する配列をなお含んでなり、後者が遺伝子ｊ、ｄおよびｖを含んでなり、全体が５’末端と３’末端の間の共有結合によりアニーリングされているｃＤＮＡ鎖が示される。これを行うため、以下の例から明らかとなるように、５’末端は通常リン酸基（ＰＯ４−）を含んでなるが、それに対して３’末端はヒドロキシル基（ＯＨ）を含んでなる。
【０１１３】
図３は、「ローテーティングサークル」または「ローリングサークル」としての最初の４回の増幅ラウンドを示す。
【０１１４】
図３ａ）は、最初の増幅ラウンドを表す。この「センス」二次プライマー（ＩＩ）は、一次プライマー（Ｉ）の５’末端と定常領域Ｃの３’末端の間に含まれる配列において、環状ｃＤＮＡとハイブリダイズする。本明細書で示される実施形態では、二次プライマー（ＩＩ）は一次プライマー（Ｉ）の５’末端においてハイブリダイズする。このハイブリダイゼーション位置に限定されるものではなく、ここでは単に一例として示されることは明らかである。次に、「センス」ＤＮＡの相補鎖の合成（点線で示される）が、該二次プライマー（ＩＩ）から反応媒体中に存在する遊離のヌクレオチドを５’３’方向に付加することによって行われる。この最初の増幅ラウンドの終了により、環状ｃＤＮＡとハイブリダイズされた「センス」ＤＮＡの第一単位（１）が得られる。
【０１１５】
図３ｂ）は、次の増幅ラウンドを模式的に示す。最初の増幅ラウンドの継続において、２回目の増幅ラウンドが適用され、その際に、反応媒体中に存在する遊離のヌクレオチドが「センス」ＤＮＡの第一単位（１）の３’末端に付加され、それにより「センス」ＤＮＡの第二単位（２）が形成され、それはその合成に際に、それを移動させることにより環状ｃＤＮＡに沿った第一単位１の場所をとる。この結果、ｃＤＮＡとハイブリダイズされ、取って代わられた「センス」ＤＮＡの第一単位（１）とその５’末端でしっかり結合された「センス」ＤＮＡの第二単位（２）からなるＤＮＡ分子が得られ、結果として一本鎖となる。同時に、最初に合成された直鎖ＤＮＡ単位（１）が第二単位（２）のポリメラーゼに取って代わられた際に、三次プライマー（ＩＩＩ）のハイブリダイゼーション部位に相当する配列が遊離する（すなわち、それは一本鎖となる）。その後、この三次プライマー（ＩＩＩ）がハイブリダイズし、第一「センス」ＤＮＡ単位（１）と相補的な「アンチセンス」ＤＮＡ ＩＩの第一鎖の合成を開始する（実線で示される）。
【０１１６】
図３ｃ）は、本増幅法の以降のラウンドを示す。
【０１１７】
同じ機構が生じ、環状ｃＤＮＡに沿って「センス」ＤＮＡの第三単位（３）の合成が起こり、それにより第一単位および第二単位（１、２）からなる「センス」ＤＮＡセグメントに取って代わり、この第一単位（１）は先行する増幅ラウンドのために二本鎖ＤＮＡとなり、一方、第二単位（２）は「センス」ＤＮＡの一本鎖となる。上記の工程と同様にして、「センス」ＤＮＡの第二単位（２）の移動は、それに結合して「センス」ＤＮＡの第二単位（２）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡ（１２）の第二鎖の合成を開始する三次プライマー（ＩＩＩ）のハイブリダイゼーション部位を遊離させる。この「アンチセンス」ＤＮＡの新たに合成された第２鎖（１２）が第一単位（１）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第一鎖（１１）の５’末端に隣接すると、それは「センス」ＤＮＡの配列に沿ったその場所を想定し、それにより第一単位（１）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第一鎖（１１）を遊離させる。次に、二次プライマー（ＩＩ）がそのハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズし、それによりその３’末端を遊離させ、５’３’方向に沿って「センス」ＤＮＡの相補鎖の合成を開始する。
【０１１８】
図３ｄ）は、以降の増幅ラウンドを示す。
【０１１９】
同様に、「センス」ＤＮＡの第四単位（４）が環状ｃＤＮＡに沿って合成され、それにより、先行する増幅ラウンドから生じた「センス」ＤＮＡの３つの第一単位（１、２、３）からなるＤＮＡセグメントに取って代わる。
【０１２０】
本方法のこのレベルにおいて、第一単位と第二単位（１、２）は、先行する増幅ラウンドのために二本鎖ＤＮＡからなり、一方、第三単位（３）は「センス」ＤＮＡの一本鎖からなる。先行する工程と同様に、この「センス」ＤＮＡの第三単位（３）の移動は、それに結合して「センス」ＤＮＡの第三単位（３）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡ（１３）の第三鎖の合成を開始する三次プライマー（ＩＩＩ）のハイブリダイゼーション部位を遊離させる。この「アンチセンス」ＤＮＡの新たに合成された第三鎖が第一単位および第二単位（１、２）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第二鎖（１２）の５’末端に隣接すると、それは次に「センス」ＤＮＡの配列に沿ったその場所を想定し、それにより第一単位と第二単位（１、２）の相補的「アンチセンス」ＤＮＡの第二鎖（１２）を遊離させる。次に、二次プライマー（ＩＩ）がそのハイブリダイゼーション部位にハイブリダイズし、それにより、第一単位（１）の、または第二単位（２）の３’末端を遊離させ、その５’３’方向に沿って第一単位と第二単位（１、２）の相補的「センス」ＤＮＡの鎖の合成を開始する。この場合、二次プライマーが第二単位（２）の３’末端でハイブリダイズしたところで初めて、第二単位（２）に対する相補的「センス」ＤＮＡの鎖の合成が行われた。結果として、二次プライマー（ＩＩ）は、次に、第一単位（１）の３’末端にハイブリダイズし、そして、第一単位と第二単位（１、２）の相補的「センス」ＤＮＡの鎖の合成を開始する。この段階で、この第二単位（２）において、「センス」ＤＮＡの相補鎖の合成は、先に合成された「センス」ＤＮＡの鎖を移動させ、遊離させる。その後、この二次プライマー（ＩＩ）はこの遊離した「センス」ＤＮＡ鎖にハイブリダイズすることができ、相補的「アンチセンス」ＤＮＡの鎖の合成を開始する（示されていない）。
【０１２１】
実施例２：「間接的」アプローチによるハイブリドーマからの抗体遺伝子のクローニングおよび配列決定
Ｉ．ＲＮＡの精製
遠心分離により予め濃縮した５×１０６細胞のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、細胞ペレットとして−８０℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、ＲＮＡを単離するために変性させる。全ＲＮＡの単離にはＭｉｎｉ Ｋｉｔ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(Qiagen)を用いる。全ＲＮＡの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー６００μＬを加えることにより溶解した後、太さ２０ゲージのニードルに６回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に６００μＬの容量の７０％エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各６００μｌの２アリコートでＲＮｅａｓｙミニカラムに適用する。各適用の後に１０，０００ｇで１５秒間の遠心分離を行う。このＲＮｅａｓｙミニカラムを５００μＬのＲＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離する。次に、このＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい遠沈管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファーを追加して洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離する。次に、このミニカラムＲＮｅａｓｙを新しい遠沈管に入れ、このカラムにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水(Ambion)５０μＬを加える。このＲＮｅａｓｙミニカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次に、精製された全ＲＮＡを２６０／２８０ｎｍでの分光光度測定により定量した後すぐにｃＤＮＡの合成に用いる。
【０１２２】
ＩＩ．ｃＤＮＡの合成および精製
ｃＤＮＡの合成は、鋳型としての全ＲＮＡと重鎖ＣＨｓｓＤＮＡの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＧＣ ＡＧＡ ＣＣＣ ＧＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＧ３’、配列番号１）または軽鎖ＶＬｓｓＤＮＡの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＴＣＣ ＡＧＡ ＴＧＴ ＴＡＡ ＣＴＧ ＣＴＣ ＡＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＴＧＧ ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＡＣ ＡＧ ３’、配列番号２）を用いることにより、逆転写スーパースクリプトＩＩＩ(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、制限部位を天然に含むように、または親配列の若干の改変により制限部位の包含を可能とするように選択される。重鎖のプライマーの配列は、制限部位Ｘｍａ Ｉを含むように改変される。軽鎖のプライマーの配列はそれに対して天然制限部位Ｈｐａ Ｉを含んでなる。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、２．５μｇの全ＲＮＡ、１μＬのｄＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ、Ozyme）、遺伝子の特異的プライマー２μＬ（１μＭ、５’リン酸化、Eurogentec）を用いて行い、総て、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水(Ambion)で総量１４μＬとする。それにより得られた混合物を５分間６５℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に４μＬの５×「第一鎖バッファー」(Invitrogen)、１μＬのＤＴＴ（１Ｍ）および１μＬのスーパースクリプトＩＩＩ（２００Ｕ／μＬ）を加える。この反応混合物を次に５５℃で１時間インキュベートし、これらの酵素を１５分間７０℃に加熱することにより不活性化する。
【０１２３】
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをＰＣＲ精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。ｃＤＮＡの合成は、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水５０μＬを加え、それに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、これを１．５ｍＬの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、その後、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１２４】
ＲＮアーゼで処理するなど、ｃＤＮＡ合成に他の一連の工程を行ってもよいが、それらは必須ではない。
【０１２５】
ＩＩＩ．ｃＤＮＡのアニーリング
一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入するリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre)を用いてアニーリングする。ＰＯ４基は、ｃＤＮＡの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に５’末端に予め導入された。アニーリング反応は１６μＬの精製ｃＤＮＡ、２μＬの反応バッファー１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ(Epicentre)、１μＬのＡＴＰ（１ｍＭ）、１μＬのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（１００Ｕ／μＬ）を用いて行う。次に、反応物を６０℃で１時間インキュベートした後、８０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で５０μＬとし、これに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムをもう一度１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次にこれを新しい１．５ｍＬのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１２６】
ＩＶ．「ローテーティングサークル」による増幅
アニーリングした一本鎖ｃＤＮＡを、増幅キットｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ（商標）(Amersham Biosciences)とｃＤＮＡの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は５μＬのバッファーＴｅｍｐｌｉＰＨｉ、０．５μＬのアニーリングｃＤＮＡおよび０．２５μＬのセンスおよびアンチセンスプライマー（１００μＭ、Sigma ProOligo）を用いて行う。これらのプライマーを表１に示す。
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
センスおよびアンチセンスプライマーは、ポリメラーゼφ２９のエキソヌクレアーゼ活性から保護するためにホスホロチオエート結合を用いて合成する。反応媒体を３分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却する。第二の混合物は、５μＬの反応バッファーＴｅｍｐｌｉＰｈｉおよび０．２μＬの酵素ＴｅｍｐｌｉＰｈｉを用いて作製する。次に、この混合物５μＬを予め作製した第一の反応媒体に加える。最終混合物を３０℃で１８時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を不活性化する。増幅された二本鎖ＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１２９】
Ｖ．増幅された抗体の遺伝子のクローニング
増幅の後、二本鎖ＤＮＡコンカテマーを、そのｃＤＮＡの合成に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに適合する制限酵素で消化する。増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する：７．５μＬの増幅ＤＮＡ、０．５μＬのＢＳＡ ２０×、１μＬのバッファー４ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＸｍａ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する：７．５μの増幅ＤＮＡ、０．５μＬの水、１μＬのバッファー４ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＨｐａ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートする。消化された重鎖および軽鎖を次に、それぞれ配列決定ベクターｐＵＣ１８およびＰＧＥＭ−Ｔにクローニングする。次に、クローニングされたＤＮＡインサートを「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」(Applied Biosystems)とこれらの配列決定ベクターに相当するプライマーを用いて配列決定する。
【０１３０】
全重鎖に関する配列決定後に得られた配列を図６に示す（配列番号１１）。図６の太字のアミノ酸配列である可変ドメインに相当する部分を配列番号７に示し、図６の二重下線の、シグナルペプチドに相当する配列を配列番号９の配列で示す。
【０１３１】
全軽鎖に関する配列決定後に得られた配列を図９に示す（配列番号１２）。図９の太字のアミノ酸配列である可変ドメインに相当する核酸の部分を配列番号１３の配列に示す。
【０１３２】
ＶＩ．標準的な方法により、また、本発明の目的であるアプローチにより得られた抗体の重鎖の可変ドメインおよびシグナルペプチドの配列の比較分析
ハイブリドーマから抗体の可変ドメインの配列を得るための標準的なアプローチは、該可変ドメインをＰＣＲにより、センスプライマーとしてはシグナルペプチドに、そしてアンチセンスプライマーとしては、重鎖では定常ドメインＣＨ１、軽鎖ではＣκの５’に存在するプライマーを用いて増幅させることからなる。その抗体が由来する生物によって天然に用いられているシグナルペプチドの可能性のある既知の推定配列の総てとハイブリダイズすることができるように、通常用いられるセンスプライマーは縮重配列に相当することを述べておくべきであろう。
【０１３３】
重鎖の可変ドメインに関して標準的な方法で得られた配列を配列番号８の配列で示す。
【０１３４】
次に、例示された抗体の重鎖の可変ドメインに関して得られた配列を、機能を生じた種々の遺伝子の再配列の同定およびその例示抗体の可変ドメインの作製の際に用いられた遺伝子Ｖに関連するシグナルペプチドのゲノム配列のデータベース検索をさらに可能とするＩＭＧＴ命名法に従った免疫原分析を行うことにより特徴づける。
【０１３５】
表２は重鎖に関して得られた結果を示す。
【０１３６】
【表２】
【０１３７】
図７に示される配列のアライメントならびに免疫原分析により、本発明によるアプローチにより得られた重鎖の可変ドメインの配列（配列番号７）と標準的なアプローチにより得られた重鎖の可変ドメインの配列（配列番号８）の間に存在する同一性を確認する。
【０１３８】
シグナルペプチドに相当する配列、すなわち、本発明による方法によって得られた配列（配列番号９）および標準的なアプローチに従って得られた配列（配列番号１０）に関して同じアプローチを行った。
【０１３９】
ＩＭＧＴベースで配列を検索することにより、遺伝子Ｖ ＩＧＨＶ１−１８＊０１（ＩＭＧＴ Ｆｌａｔ Ｆｉｌｅ）の同定に関する情報を得ること、およびそれからその遺伝子に関するシグナルペプチドの核酸配列およびタンパク質配列を抽出することが可能である。この場合、ネズミ株Ｃ５７ＢＬ／６Ｊから、例示された抗体の重鎖の可変ドメインの配列に最も近いことが確認された対立遺伝子ＩＧＨＶ１−１８＊０１が同定された。この例では、抗体の作製に用いられたネズミ株はＢＡＬＢ／ｃであり、その生殖細胞系は対立遺伝子ＩＧＨＶ１ １８＊０２下に存在する。例示された抗体の鎖の可変ドメインに関して得られた配列のアライメントは９８．０２％（２４８／２５３ｎｔ）の相同性を示す。この相同性は対立遺伝子ＩＧＨＶ１−１８＊０１に関して同定されたものよりも顕著であるが、それは遺伝子Ｖの短縮配列、すなわち、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの対立遺伝子＊０１の２８８ｎｔに対してＢＡＬＢ／ｃの対立遺伝子＊０２の２５３ｎｔのみを考慮する。これは最初の分析が対立遺伝子＊０１に有利であった場合を説明する。従って、シグナルペプチドの同定に関しては、この場合も用いるネズミ株に見られ、対立遺伝子ＩＧＨＶ１−１８＊０２に相当する配列に着目する必要がある。
【０１４０】
図８に示されるシグナルペプチドに相当する配列のアライメントは明らかに、この例のこの場合、タンパク質配列に４つの突然変異を誘導する４つのヌクレオチド改変に、相当する配列（配列番号１０）においてバイアスを導入する標準的なアプローチとは異なり、本発明の方法はゲノム配列（配列番号９）の取得を可能とすることを示す。
【０１４１】
結論として、この例は、得られた配列が実際に抗体の生殖細胞系に相当するだけでなく、特に標準的な方法により得られる配列にも相当するという確信をもたらす。さらに、この例はまた、本発明による方法が標準的なアプローチで改変される天然シグナルペプチドの保存を可能とすることも示す。
【０１４２】
ＶＩＩ．標準的な方法により、また、本発明の目的であるアプローチにより得られた抗体の軽鎖の可変ドメインおよびシグナルペプチドの配列の比較分析
同様のアプローチを行い、同じ結果（示されていない）が得られた。
【０１４３】
実施例３：「間接的」アプローチによるハイブリドーマからの抗体の遺伝子のクローニングおよび配列決定
Ｉ．ＲＮＡの精製
遠心分離により予め濃縮した５×１０６細胞のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、細胞ペレットとして−８０℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、ＲＮＡを単離するために変性させる。全ＲＮＡの単離にはＭｉｎｉ Ｋｉｔ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(Qiagen)を用いる。全ＲＮＡの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー６００μＬを加えることにより溶解した後、太さ２０ゲージのニードルに６回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に６００μＬの容量の７０％エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各６００μｌの２アリコートでＲＮｅａｓｙミニカラムに適用する。各適用の後に１０，０００ｇで１５秒間の遠心分離を行う。このＲＮｅａｓｙミニカラムを５００μＬのＲＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離する。次に、このＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい遠沈管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファーを追加して洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離する。次に、このミニカラムＲＮｅａｓｙを新しい遠沈管に入れ、このカラムにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水(Ambion)５０μＬを加える。このＲＮｅａｓｙミニカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次に、精製された全ＲＮＡを２６０／２８０ｎｍでの分光光度測定により定量した後すぐにｃＤＮＡの合成に用いる。
【０１４４】
ＩＩ．ｃＤＮＡの合成および精製
ｃＤＮＡの合成は、鋳型としての全ＲＮＡと重鎖ＩＧＨＣｌｐＯの特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＴＣ Ｃ３’、配列番号１４）または軽鎖ＩＧＫｐＯの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＡＧ３’、配列番号１５）を用いることにより、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、天然配列の５’末端に付加された制限部位Ｍｌｕ Ｉを含んでなる。第一鎖ｃＤＮＡの合成は、２．５μｇの全ＲＮＡ、１μＬのＤＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ、Ozyme）、遺伝子の特異的プライマー１μＬ（５０μＭ、５’リン酸化、Eurogentec）を用いて行い、総て、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水(Ambion)で総量１０μＬとする。それにより得られた混合物を５分間６５℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に４μＬの５×「Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔバッファー」(Takara)、０．５μＬのＲＮアーゼ阻害剤（４０Ｕ／ｕＬ）、１μＬのＰｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ（２００Ｕ／μＬ）を加えた後、２０μｌのＨ２Ｏで容量を整える。この反応混合物を次に５０℃で１時間インキュベートし、これらの酵素を１５分間７０℃に加熱することにより不活性化する。
【０１４５】
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをＰＣＲ精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。ｃＤＮＡの合成は、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水５０μＬを加え、それに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、これを１．５ｍＬの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、その後、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１４６】
ＲＮアーゼ処理など、ｃＤＮＡ合成に他の一連の工程を行ってもよいが、それらは必須ではない。
【０１４７】
ＩＩＩ．ｃＤＮＡのアニーリング
一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入するリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre)を用いてアニーリングする。ＰＯ４基は、ｃＤＮＡの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に５’末端に予め導入された。アニーリング反応は１μＬの精製ｃＤＮＡ、１μＬの反応バッファー１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ(Epicentre)、１μＬのＡＴＰ（１ｍＭ）、１μＬのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（１００Ｕ／μＬ）および６μｌのＨ２Ｏを用いて行う。次に、反応物を６０℃で１時間インキュベートした後、８０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で５０μＬとし、これに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムをもう一度１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次にこれを新しい１．５ｍＬのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１４８】
ＩＶ．「ローテーティングサークル」による増幅
アニーリングした一本鎖ｃＤＮＡを、増幅キットｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ（商標）(Amersham Biosciences)とｃＤＮＡの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は４μＬのＨ２Ｏ、０．５μＬのアニーリングｃＤＮＡおよび０．５μＬのセンスおよびアンチセンスプライマー（１００μＭ、Sigma ProOligo）を用いて行う。これらのプライマーを表３に示す。
【０１４９】
【表３】
【０１５０】
センスおよびアンチセンスプライマーは、ポリメラーゼφ２９のエキソヌクレアーゼ活性から保護するためにホスホロチオエート結合を用いて合成する。反応媒体を３分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却する。第二の混合物は、５μＬの反応バッファーＴｅｍｐｌｉＰｈｉおよび０．２μＬの酵素ＴｅｍｐｌｉＰｈｉを用いて作製する。次に、この混合物５μＬを予め作製した第一の反応媒体に加える。最終混合物を３０℃で１８時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を不活性化する。増幅された二本鎖ＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５１】
Ｖ．増幅された抗体の遺伝子のクローニング
増幅の後、二本鎖ＤＮＡコンカテマーを、そのｃＤＮＡの合成に用いたオリゴヌクレオチドプライマーに適合する制限酵素で消化する。増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する：８μＬの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する：８μの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。消化された重鎖および軽鎖を次に、それぞれ配列決定ベクターｐＧＥＭ−Ｔにクローニングする。次に、クローニングされたＤＮＡインサートを「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」(Applied Biosystems)とこれらの配列決定ベクターに相当するプライマーを用いて配列決定する。
【０１５２】
全重鎖に関する配列決定後に得られた配列を図１０に示す（配列番号１８）。図１０の太字のアミノ酸配列である可変ドメインの相当する核酸部分を配列番号１９の配列で示す。
【０１５３】
実施例４：「複合」アプローチによるハイブリドーマからの抗体の遺伝子のクローニングおよび配列決定
１．ＲＮＡの精製
遠心分離により予め濃縮した５×１０６細胞のハイブリドーマから全ＲＮＡを単離し、細胞ペレットとして−８０℃で冷凍する。この細胞ペレットを解凍した後に、ＲＮＡを単離するために変性させる。全ＲＮＡの単離にはＭｉｎｉ Ｋｉｔ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）(Qiagen)を用いる。全ＲＮＡの精製は供給者からの説明書に従って行う。この細胞ペレットを、β−メルカプトエタノールを含有するＲＬＴバッファー６００μＬを加えることにより溶解した後、太さ２０ゲージのニードルに６回通すことによりホモジナイズする。このホモジナイズ溶解液に６００μＬの容量の７０％エタノールを加えた後、全体をピペット操作により混合する。次に、この溶解液を、各６００μｌの２アリコートでＲＮｅａｓｙミニカラムに適用する。各適用の後に１０，０００ｇで１５秒間の遠心分離を行う。このＲＮｅａｓｙミニカラムを５００μＬのＲＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１５秒間遠心分離する。次に、このＲＮｅａｓｙミニカラムを新しい遠沈管に移し、５００μＬのＲＰＥバッファーを追加して洗浄した後、１０，０００ｇで２分間遠心分離する。次に、このミニカラムＲＮｅａｓｙを新しい遠沈管に入れ、このカラムにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ不含水(Ambion)５０μＬを加える。このＲＮｅａｓｙミニカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次に、精製された全ＲＮＡを２６０／２８０ｎｍでの分光光度測定により定量した後すぐにｃＤＮＡの合成に用いる。
【０１５４】
ＩＩ．ｃＤＮＡの合成および精製
ｃＤＮＡの合成は、鋳型としての全ＲＮＡと重鎖ＩＧＨＣｌｐＯの特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＡＴ ＡＧＣ ＣＣＴ ＴＧＡ ＣＣＡ ＧＧＣ ＡＴＣ Ｃ３’、配列番号１４）または軽鎖ＩＧＫｐＯの遺伝子の特異的プライマー（５’ＰＯ４−ＡＣＡ ＡＡＣ ＧＣＧ ＴＴＧ ＧＴＧ ＧＧＡ ＡＧＡ ＴＧＧ ＡＴＡ ＣＡＧ３’、配列番号１５）を用いることにより、逆転写酵素スーパースクリプトＩＩＩ(Invitrogen)を用いて行う。これらのプライマーの配列は、制限部位を天然に含むように、または親配列の若干の改変により制限部位の包含を可能とするように選択される。重鎖および軽鎖のプライマーの配列は、５’末端に制限部位Ｍｌｕ Ｉを含むように改変される。ｃＤＮＡの第一鎖の合成は、２．５μｇの全ＲＮＡ、１μＬのＤＮＴＰ混合物（各１０ｍＭ、Ozyme）、遺伝子の特異的プライマー２μＬ（５０μＭ、５’リン酸化、Eurogentec）を用いて行い、総て、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水(Ambion)で総量１４μＬとする。それにより得られた混合物を５分間６５℃に加熱した後、鋳型上でのプライマーのハイブリダイゼーションを可能とするために氷上で冷却する。その後、該混合物に４μＬの５×「第一鎖バッファー」(Invitrogen)、１μＬのＤＴＴおよびスーパースクリプトＩＩＩ（２００Ｕ／μＬ）を加える。この反応混合物を次に５０℃で１時間インキュベートし、これらの酵素を１５分間７０℃に加熱することにより不活性化する。
第一鎖の合成が完了したところで、次にこれをＰＣＲ精製キット(Qiagen)で処理して組み込まれなかったプライマーを除去する。ｃＤＮＡの合成は、ＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水５０μＬを加え、それに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合することにより完了させる。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、これを１．５ｍＬの新しいマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、その後、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５５】
ＲＮアーゼ処理など、ｃＤＮＡ合成に他の一連の工程を行ってもよいが、それらは必須ではない。
【０１５６】
ＩＩＩ．ｃＤＮＡのアニーリング
一本鎖ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡの３’ＯＨ末端と５’ＰＯ４末端の間に共有結合を導入するリガーゼＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）(Epicentre)を用いてアニーリングする。ＰＯ４基は、ｃＤＮＡの合成に用いられた遺伝子の特異的プライマーの合成の際に５’末端に予め導入された。アニーリング反応は１６μＬの精製ｃＤＮＡ、２μＬの反応バッファー１０×ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ(Epicentre)、１μＬのＡＴＰ（１ｍＭ）、１μＬのＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（１００Ｕ／μＬ）を用いて行う。次に、反応物を６０℃で１時間インキュベートした後、８０℃で１０分間インキュベートすることにより酵素を不活性化する。このアニーリング反応の後に、得られた混合物をＤＮアーゼ／ＲＮアーゼ不含水で５０μＬとし、これに２５０μＬのＰＢバッファー(Qiagen)を加え、この溶液をピペット操作により混合する。次に、この混合物をＰＣＲ精製キットマイクロ遠心カラムに移し、１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムを７５０μＬのＰＥバッファー(Qiagen)で洗浄した後、再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。このカラムをもう一度１０，０００ｇで１分間遠心分離する。次にこれを新しい１．５ｍＬのマイクロ遠沈管に移し、カラムの中央に３０μＬのＥＢ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、Qiagen）を加えてｃＤＮＡを溶出し、全体を再び１０，０００ｇで１分間遠心分離する。その後、回収されたアニーリングｃＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５７】
ＩＶ．「ローテーティングサークル」による増幅
アニーリングした一本鎖ｃＤＮＡを、増幅キットｉｌｌｕｓｔｒａ ＴｅｍｐｌｉＰＨｉ（商標）(Amersham Biosciences)とｃＤＮＡの合成に用いたプライマーの配列の相同遺伝子の特異的プライマーを用いることにより増幅する。増幅反応は５μＬの水、０．５μＬのアニーリングｃＤＮＡおよび０．５μＬのセンスおよびアンチセンスプライマー（１００μＭ、Sigma ProOligo）を用いて行う。これらのプライマーは上記の実施例３のものと同じであるので、表３に示されている。
【０１５８】
センスおよびアンチセンスプライマーは、ポリメラーゼφ２９のエキソヌクレアーゼ活性から保護するためにホスホロチオエート結合を用いて合成する。反応媒体を３分間９５℃に加熱した後、氷上で冷却する。第二の混合物は、５μＬの反応バッファーＴｅｍｐｌｉＰｈｉおよび０．２μＬの酵素ＴｅｍｐｌｉＰｈｉを用いて作製する。次に、この混合物５μＬを予め作製した第一の反応媒体に加える。最終混合物を３０℃で１８時間インキュベートした後、６５℃で１０分間酵素を不活性化する。増幅された二本鎖ＤＮＡを−２０℃で保存する。
【０１５９】
増幅された免疫グロブリンの重鎖を次のように消化する：８μＬの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。増幅された免疫グロブリンの軽鎖は次のように消化する：８μの増幅ＤＮＡ、１μＬのバッファー３ １０×（ＮＥＢ）、１μＬのＭｌｕ Ｉ（ＮＥＢ）。この混合物を３７℃で４時間インキュベートした後、６５℃で２０分間酵素を不活性化する。重鎖の単量体はアガロースゲル（１％ｗ／ｖ）での電気泳動により１０Ｖ／ｃｍで分離する。次に、単量体に相当するＤＮＡを抽出し、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔ ＩＩキット(Machery Nagel)を製造業者の手順に従って用い、１５μＬの「溶出バッファー」での溶出により単離する。次に、このＤＮＡを、「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」(Applied Biosystems)にて、ｃＤＮＡ合成に従った一次または三次プライマーを用い、以下の条件：５μＬの単量体ＤＮＡ、２μＬの５×バッファー(Applied Biosystems)、２μＬのＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ３．１、１μＬのプライマー（１０μＭ）下での「ローテーティングサイクル」増幅により配列決定する。反応条件はＦａｓｔ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ９８００(Applied Biosystems)装置、プログラム「ＢｉｇＤｙｅ ｓｔｄ」のプログラミングに従う。
【０１６０】
全重鎖の配列決定後に得られた配列を図１１（配列番号２０）に示す。図１１の太字のアミノ酸配列である可変ドメインに相当する核酸部分を配列番号２１の配列で示す。
【０１６１】
実施例５：「間接的」アプローチにより得られた配列と「複合アプローチ」により得られた配列の比較
本発明の種々の選択肢、すなわち、間接的アプローチおよび複合アプローチ（直接的アプローチとも呼ばれる）を実証するために、全重鎖に関して得られた配列のアライメントを、それぞれ両アプローチを用いて行った。
【０１６２】
図１２はこのアライメントを示す。
【０１６３】
この図から明らかなように、得られた配列は同一であり、これにより本発明の両アプローチが実証される。
【０１６４】
実施例６：真核細胞の表面での発現の検出
本発明に従ってクローニングされた抗体のスクリーニングを行うために、真核生物発現ベクターを、ヒト抗体の重鎖の定常部分のＣ末端にトランスメンブランドメイン（ＤＴＭ）を含むように改変した。宿主細胞で発現された抗体が培養上清中ではもはや発現されずに細胞の表面で保持されるように、このＤＴＭをＩｆＧ１型のヒト重鎖の定常ドメインとともにシスでクローニングした（図１３）。Ｍｌｕ Ｉによる制限およびＤＴＭを含有するベクター中での連結により、それらの５’ＵＴＲ部分とシグナルペプチドを含んでなる可変部分を定常ドメインとともにシスで挿入することができ、軽鎖は同様にＤＴＭを含まないベクターにクローニングする（図１３）。ネズミ抗体の重鎖および軽鎖の可変部分は発現ベクター中にヒト定常ドメイン：ＩｇＧ１（重鎖）またはＩｇｋ（軽鎖）とともに、重鎖の場合にはＤＴＭを伴ってシスでクローニングする。次に、宿主ＣＨＯ細胞の、重鎖および軽鎖の発現ベクターでの同時トランスフェクションを、リポフェクタミンによるトランスフェクションにより行った。血清を含む増殖培地中での４８時間の増殖時間の後、細胞をＰＢＳで洗浄した。
【０１６５】
予め洗浄した細胞の表面の抗体の存在を、それらの細胞をＩｇＧ抗ヒトまたはＩｇＧ抗マウス抗体とともにインキュベーションすることにより検出した。蛍光体ＡＬＥＸＡ ４８８(Molecular Probes, A11013)で予めマーキングしたＩｇＧ抗ヒトまたは抗マウス抗体が、宿主細胞の膜表面に抗体を担持する細胞の同定を可能とする。その後、フローサイトメトリー分析により、発現ベクターを含まない宿主細胞に比べて表面に抗体を担持する細胞を検出することができる（図１４）。これらの抗体のキメラ性、ネズミ可変部分およびヒト定常部分は、ＩｇＧ抗ヒトまたはＩｇＧ抗マウス抗体を用いた検出を可能とする。
【０１６６】
実施例７：本発明の適用の範囲内で使用可能な種々のネズミおよびヒトプライマーのリスト
本実施例では、限定されるものではないが、本発明の適用に好ましいプライマーの配列を一覧化する。
【０１６７】
Ｉ．ネズミプライマー
表４：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける定常ドメインの各イソ型に対する特異的ネズミｃＤＮＡの合成のための一次プライマー（Ｉ）。制限部位Ｍｌｕ Ｉを下線および斜体で示す。
【表４】
【０１６８】
表５：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための二次プライマー（ＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表５】
【０１６９】
表６：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための三次プライマー（ＩＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表６】
【０１７０】
ＩＩ．ヒトプライマー
表７：いずれかのイソ型ＩｇＧに対する特異的ヒトｃＤＮＡの合成のための一次プライマー（Ｉ）。制限部位Ｍｌｕ Ｉを下線および斜体で示す。
【表７】
【０１７１】
表８：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための二次プライマー（ＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表８】
【０１７２】
表９：アニーリングしたｃＤＮＡの増幅のための三次プライマー（ＩＩＩ）。３’結合はホスホジエステルの代わりにホスホチオエート（＊）である。
【表９】
図１５Ａ、１５Ｂおよび１５Ｃもまた、種々のプライマーおよび相当する部位を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体、または抗体の重鎖および／もしくは軽鎖をコードするＲＮＡを発現することができる細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製する方法であって、少なくとも以下の工程：
ａ）一次プライマー（Ｉ）を、抗体の重鎖または軽鎖をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（ここでは「センス」ＲＮＡと表す）を含み得る該ＲＮＡ抽出物または混合物と接触させる工程（この一次プライマーは該「センス」ＲＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、このフラグメントは、該抗体の重鎖または軽鎖の定常領域Ｃをコードする配列に含まれる）；
ｂ）該一次プライマー（Ｉ）から、「アンチセンス」ｃＤＮＡと表される一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
ｃ）必要に応じて、工程ａ）で該ＲＮＡの配列のフラグメントとハイブリダイズされなかった一次プライマー（Ｉ）を除去する工程；
ｄ）該「アンチセンス」ｃＤＮＡを、その５’末端と３’末端の間に共有結合を形成することによってアニーリングする工程；
ｅ）「センス」二次プライマーと表される二次プライマー（ＩＩ）を、工程ｄ）で得られた「アンチセンス」環状ｃＤＮＡと接触させる工程（この「センス」二次プライマー（ＩＩ）は、該「アンチセンス」環状ｃＤＮＡとハイブリダイズすることができる）；
ｆ）該二次プライマー（ＩＩ）から該「アンチセンス」ｃＤＮＡを増幅させる工程；および
ｇ）それにより増幅された「センス」相補的ＤＮＡ直鎖を回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記一次プライマー（Ｉ）が、定常領域Ｃに相当するセンスＲＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二次プライマー（ＩＩ）が、前記「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端と、定常領域Ｃに相当する前記「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列の３’末端の間に含まれる配列に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二次プライマー（ＩＩ）が、「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列と特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一次（Ｉ）および二次（ＩＩ）プライマーが、それぞれ互いに独立に、１０〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡの配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記一次プライマー（Ｉ）が、２０〜６０ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡの配列からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一次プライマー（ＩＩ）が、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡの配列からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
一次プライマー（Ｉ）のハイブリダイゼーションのための工程ａ）の前に、ＲＮＡの変性のための工程を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗体を産生することができる前記細胞が、ハイブリドーマからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、脾細胞、結節またはＢリンパ球に起源するＲＮＡから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡが、好ましくはＢリンパ球に起源する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アニーリング工程が、「ｓｓＤＮＡリガーゼ」と表される一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を共有結合によって結合させることができるリガーゼと接触させることにより行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リガーゼが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）またはサーモファージｓｓＤＮＡから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
増幅工程ｆ）が、一本鎖環状ＤＮＡの配列を増幅させることができる酵素とともに適用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、好ましくは、ＢＳＥ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、バクテリオファージφ２９の「ローリングサークルポリメラーゼ」からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を配列決定するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための方法を適用すること、およびＤＮＡ配列を作製するための該方法の工程ｇ）において回収された「センス」直鎖ＤＮＡを配列決定するための工程をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の少なくとも１つの重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための方法を適用すること、および以下の工程：
ｈ）「アンチセンス」三次プライマーと表される三次プライマー（ＩＩＩ）を、工程ｇ）で得られた該「センス」直鎖ＤＮＡと接触させる工程（この「アンチセンス」三次プライマー（ＩＩＩ）は、該ＤＮＡ直鎖の３’末端と５’末端の間に含まれる直鎖ＤＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、定常領域Ｃをコードするこの直鎖ＤＮＡの配列に相当する）、
ｉ）該三次プライマー（ＩＩＩ）から、相補的「アンチセンス」ＤＮＡ鎖の合成によりコンカテマーを作製する工程、および
ｊ）それにより得られた二本鎖ＤＮＡコンカテマーを予め作製したベクター内にクローニングする工程
をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記三次プライマー（ＩＩＩ）が、定常領域Ｃに相当する「センス」直鎖ＤＮＡの配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｊ）の前に、用いられるプライマーに相当する配列においてコンカテマーをセグメント化することからなる工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法。
【請求項２０】
一次プライマー（Ｉ）が、制限部位を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コンカテマーをセグメント化するための前記工程ｊ）が、一次プライマー（Ｉ）に含まれる制限部位の、特異的制限エンドヌクレアーゼによる酵素的消化により適用される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｊ）に用いられるベクターが、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインをコードする配列をさらに含んでなる、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
重鎖の定常ドメインをコードする前記配列が、好ましくは、膜アンカーを含む免疫グロブリン由来の配列、またはトランスメンブランＣ末端領域を含んでなる配列からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ｊ）で得られたベクターで、該ベクター内に挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされた抗体の重鎖または軽鎖を発現することができる宿主細胞をトランスフェクトするための工程ｋ）をさらに含んでなる、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程ｋ）の前記宿主細胞が、その表面で、挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされた抗体を発現することができる細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記真核細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫおよびＮＩＨ−３Ｔ３細胞から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＮＡの抽出物または混合物が由来する細胞が、ヒト起源である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗体のライブラリーを作製するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項３０】
所定の疾病に対する活性抗体をイン・ビトロでスクリーニングするための方法であって、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法が該所定の疾患に罹患している患者の血液サンプルに適用される工程を適用する、方法。
【請求項３１】
前記所定の疾患が、癌である、請求項３０に記載の方法。
【請求項１】
抗体、または抗体の重鎖および／もしくは軽鎖をコードするＲＮＡを発現することができる細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製する方法であって、少なくとも以下の工程：
ａ）一次プライマー（Ｉ）を、抗体の重鎖または軽鎖をコードする少なくとも１つのＲＮＡ（ここでは「センス」ＲＮＡと表す）を含み得る該ＲＮＡ抽出物または混合物と接触させる工程（この一次プライマーは該「センス」ＲＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、このフラグメントは、該抗体の重鎖または軽鎖の定常領域Ｃをコードする配列に含まれる）；
ｂ）該一次プライマー（Ｉ）から、「アンチセンス」ｃＤＮＡと表される一本鎖ｃＤＮＡを合成する工程；
ｃ）必要に応じて、工程ａ）で該ＲＮＡの配列のフラグメントとハイブリダイズされなかった一次プライマー（Ｉ）を除去する工程；
ｄ）該「アンチセンス」ｃＤＮＡを、その５’末端と３’末端の間に共有結合を形成することによってアニーリングする工程；
ｅ）「センス」二次プライマーと表される二次プライマー（ＩＩ）を、工程ｄ）で得られた「アンチセンス」環状ｃＤＮＡと接触させる工程（この「センス」二次プライマー（ＩＩ）は、該「アンチセンス」環状ｃＤＮＡとハイブリダイズすることができる）；
ｆ）該二次プライマー（ＩＩ）から該「アンチセンス」ｃＤＮＡを増幅させる工程；および
ｇ）それにより増幅された「センス」相補的ＤＮＡ直鎖を回収する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記一次プライマー（Ｉ）が、定常領域Ｃに相当するセンスＲＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二次プライマー（ＩＩ）が、前記「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端と、定常領域Ｃに相当する前記「アンチセンス」ｃＤＮＡの配列の３’末端の間に含まれる配列に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二次プライマー（ＩＩ）が、「アンチセンス」ｃＤＮＡ配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列と特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一次（Ｉ）および二次（ＩＩ）プライマーが、それぞれ互いに独立に、１０〜１００ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡの配列からなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記一次プライマー（Ｉ）が、２０〜６０ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡの配列からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一次プライマー（ＩＩ）が、１０〜３０ヌクレオチドの間の長さを有する一本鎖ＤＮＡの配列からなる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
一次プライマー（Ｉ）のハイブリダイゼーションのための工程ａ）の前に、ＲＮＡの変性のための工程を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
抗体を産生することができる前記細胞が、ハイブリドーマからなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＲＮＡが、脾細胞、結節またはＢリンパ球に起源するＲＮＡから選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡが、好ましくはＢリンパ球に起源する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アニーリング工程が、「ｓｓＤＮＡリガーゼ」と表される一本鎖ＤＮＡの５’末端と３’末端を共有結合によって結合させることができるリガーゼと接触させることにより行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記リガーゼが、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）またはサーモファージｓｓＤＮＡから選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
増幅工程ｆ）が、一本鎖環状ＤＮＡの配列を増幅させることができる酵素とともに適用される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素が、好ましくは、ＢＳＥ ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント、バクテリオファージφ２９の「ローリングサークルポリメラーゼ」からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を配列決定するための方法であって、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための方法を適用すること、およびＤＮＡ配列を作製するための該方法の工程ｇ）において回収された「センス」直鎖ＤＮＡを配列決定するための工程をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
細胞由来のＲＮＡの抽出物または混合物から、少なくとも１つの抗体の少なくとも１つの重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の少なくとも１つの抗体の重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を作製するための方法を適用すること、および以下の工程：
ｈ）「アンチセンス」三次プライマーと表される三次プライマー（ＩＩＩ）を、工程ｇ）で得られた該「センス」直鎖ＤＮＡと接触させる工程（この「アンチセンス」三次プライマー（ＩＩＩ）は、該ＤＮＡ直鎖の３’末端と５’末端の間に含まれる直鎖ＤＮＡの配列のフラグメントと特異的にハイブリダイズすることができ、定常領域Ｃをコードするこの直鎖ＤＮＡの配列に相当する）、
ｉ）該三次プライマー（ＩＩＩ）から、相補的「アンチセンス」ＤＮＡ鎖の合成によりコンカテマーを作製する工程、および
ｊ）それにより得られた二本鎖ＤＮＡコンカテマーを予め作製したベクター内にクローニングする工程
をさらに含んでなることを特徴とする、方法。
【請求項１８】
前記三次プライマー（ＩＩＩ）が、定常領域Ｃに相当する「センス」直鎖ＤＮＡの配列の５’末端に位置するか、または隣接する配列に特異的である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程ｊ）の前に、用いられるプライマーに相当する配列においてコンカテマーをセグメント化することからなる工程をさらに含んでなる、請求項１７に記載の重鎖または軽鎖抗体鎖をコードするＤＮＡのバンクを作製するための方法。
【請求項２０】
一次プライマー（Ｉ）が、制限部位を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
コンカテマーをセグメント化するための前記工程ｊ）が、一次プライマー（Ｉ）に含まれる制限部位の、特異的制限エンドヌクレアーゼによる酵素的消化により適用される、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｊ）に用いられるベクターが、免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の定常ドメインをコードする配列をさらに含んでなる、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
重鎖の定常ドメインをコードする前記配列が、好ましくは、膜アンカーを含む免疫グロブリン由来の配列、またはトランスメンブランＣ末端領域を含んでなる配列からなる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
工程ｊ）で得られたベクターで、該ベクター内に挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされた抗体の重鎖または軽鎖を発現することができる宿主細胞をトランスフェクトするための工程ｋ）をさらに含んでなる、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程ｋ）の前記宿主細胞が、その表面で、挿入された二本鎖ＤＮＡフラグメントによりコードされた抗体を発現することができる細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記真核細胞が、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫおよびＮＩＨ−３Ｔ３細胞から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＲＮＡの抽出物または混合物が由来する細胞が、ヒト起源である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗体のライブラリーを作製するための、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項３０】
所定の疾病に対する活性抗体をイン・ビトロでスクリーニングするための方法であって、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載の方法が該所定の疾患に罹患している患者の血液サンプルに適用される工程を適用する、方法。
【請求項３１】
前記所定の疾患が、癌である、請求項３０に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３ａ）】
【図３ｂ）】
【図３ｃ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【図２】
【図３ａ）】
【図３ｂ）】
【図３ｃ）】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１５Ｃ】
【公表番号】特表２０１１−５０５１６１（Ｐ２０１１−５０５１６１Ａ）
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−５３６４５９（Ｐ２０１０−５３６４５９）
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６８０４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０４６１
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０００３３４８３）ピエール、ファーブル、メディカマン (73)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年２月２４日（２０１１．２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年１２月４日（２００８．１２．４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００８／０６６８０４
【国際公開番号】ＷＯ２００９／０８０４６１
【国際公開日】平成２１年７月２日（２００９．７．２）
【出願人】（５０００３３４８３）ピエール、ファーブル、メディカマン (73)
【Ｆターム（参考）】
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