抗原を含有する経皮免疫製剤およびその製造方法
【課題】
皮膚表層及び／又は皮膚角質層に折れることなく容易且つ均一に刺入でき、かつ皮膚表層及び／又は皮膚角質層において容易に溶解するワクチン用マイクロニードルアレイを提供する。
【解決手段】本発明のワクチン用マイクロニードルアレイは、ヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％により構成され、抗原を含有する。ここに前記ヒアルロン酸の分子量は５０万〜４００万であることが望ましい。抗原としては、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド又は組み替えＨＢｓタンパクのいずれかを好適に用いることができる。
皮膚表層及び／又は皮膚角質層に折れることなく容易且つ均一に刺入でき、かつ皮膚表層及び／又は皮膚角質層において容易に溶解するワクチン用マイクロニードルアレイを提供する。
【解決手段】本発明のワクチン用マイクロニードルアレイは、ヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％により構成され、抗原を含有する。ここに前記ヒアルロン酸の分子量は５０万〜４００万であることが望ましい。抗原としては、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド又は組み替えＨＢｓタンパクのいずれかを好適に用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン用マイクロニードルアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚表層及び／又は皮膚角質層に修飾効果及び／又は機能効果を与えるためには、従来、薬効成分を含む液状物質、軟膏剤、クリーム製剤、テープ製剤、バッチ製剤、パップ製剤等を局部に塗布又は貼付し、薬物を皮膚や粘膜を透過させて投与していた。しかし、これらの製剤は使用中に発汗、洗浄、外的圧力等により薬物が消失したり脱落したりする欠点があった。また、皮膚表層及び／又は皮膚角質層は体内へ異物の侵入を抑止するバリアー機能を有しているので、塗布または貼付により充分な量の薬物を皮膚下に吸収させるのは困難であった。皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所に薬物を確実に供給することはさらに困難であった。特に薬物が高分子物質あるいは粒子状物質である場合は、皮膚を通じての投与は著しく困難であった。
【０００３】
これらの問題を解決し、皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所に薬効成分を確実に供給する方法として、マイクロニードルが提案された（特許文献１）。マイクロニードルは非常に細いので皮膚表層及び／又は皮膚角質層に刺入した際痛みも出血もなく且つ穿刺創は速やかに閉鎖されるので、皮膚下に薬物を確実に供給する方法として好適である。なお、基板上に複数のマイクロニードルを備えたものをマイクロニードルアレイという。さらにマイクロニードルアレイを皮膚上に固定するための粘着テープ等を備えたものをマイクロニードルパッチという。
【０００４】
マイクロニードルの材質として、生体内で溶解消失する物質が提案されている（特許文献２）。このようなマイクロニードルに薬物を含有させて皮膚に刺入すると、マイクロニードルは皮膚表層及び／又は皮膚角質層において溶解消失するので、皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所に薬物を確実に供給することができる。
【０００５】
しかしながらマイクロニードルの機械的強度が小さい場合は皮膚に刺入する際に折れて刺入できず、機械的強度が大きい場合はマイクロニードルが皮膚内で容易に折れず残留させることが困難な欠点があった。例えばポリ乳酸やマルトースを素材とするマイクロニードルは、機械的強度や硬度が適切ではない。
【０００６】
マイクロニードルの生体内で溶解消失する材質として、これまでマルトース（特許文献２）、ヒアルロン酸（特許文献４、５、６）、デキストラン（特許文献４）、ポリビニルピロリドン（特許文献７）、ゼラチン（特許文献３、５、６）、コラーゲン（特許文献５、６）、キトサン（特許文献５）、蛋白質（特許文献３、４）、生分解性樹脂（特許文献１）を用いたものが公表されている。しかし、コラーゲン、ゼラチン、キトサンなどの物質は免疫原性があり、これらをマイクロニードル材質として用いると、体内にこれらの物質に対する抗体が産生する恐れがある。そのためこれらの物質を含むマイクロニードルを長期にわたり投与することは望ましくない。
【０００７】
医療用の薬物を含むマイクロニードルは医療用マイクロニードルと呼ばれ、特に抗原を含むものはワクチン用マイクロニードルと呼ばれる。ワクチン用マイクロニードルに含ませる抗原としては、細菌、ウイルス、真菌や寄生体など生物を感染することができる病原体由来の抗原を用いることができる。アレルギー抗原をマイクロニードルに担持させてアレルギー検査を行うことができる（特許文献８）。
【０００８】
インフルエンザは毎年数百万人以上が罹患し、体力や免疫力の低い高齢者や乳幼児には危険な急性呼吸器疾患である。特に人類が未だ免疫を有していない鳥インフルエンザ由来の新型インフルエンザには強い警戒が必要である。インフルエンザの抑制にはインフルエンザワクチンの接種が有効と考えられている。
破傷風やジフテリアは感染法上の指定感染症であり、世界的には毎年多数の死者が出ており、その予防にはワクチンが欠かせない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５１７３００号公報
【特許文献２】特開２００３−２３８３４７号公報
【特許文献３】特開２００６−３４６１２６号公報
【特許文献４】ＷＯ２００６／０８０５０８号公報
【特許文献５】特開２００８−２８４３１８号公報
【特許文献６】特開２０１０−０２９６３４号公報
【特許文献７】特開２０１０−０８２４０１号公報
【特許文献８】ＷＯ２００８／０９６７３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
各種伝染性疾患に対しては痛みや苦しみを伴う予防注射に代わるより安全なワクチン投与法が求められている。特に予防注射は一部の人には深刻な副作用があり、副作用の軽減のためには、投与する抗原量を減らし少量の抗原で有効な免疫力を付与する投与法が求められている。
また、抗原は高分子物質であり、皮膚表面に塗布あるいは貼付することにより投与することはきわめて困難である。
本発明の解決しようとする課題は、注射法や表面塗布法といった従来法の欠点に鑑み、皮膚表層及び／又は皮膚角質層に折れることなく容易且つ均一に刺入でき、皮膚表層及び／又は皮膚角質層において速やかに溶解し、その素材が長期にわたり多数回投与しても安全な物質からなる医療用マイクロニードルとマイクロニードルアレイを開発し、抗原を含有させ、予防医学に有用なワクチン用マイクロニードルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のワクチン用マイクロニードルは、以下の３種類の生体内溶解性高分子、即ち、ヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％により構成され、抗原を含有することを特徴とする。
【００１２】
このような抗原は大量に得ることが困難で高価である。従って、抗原はマイクロニードルアレイのマイクロニードル部分にのみ存在させ、基板部分には含ませないようにマイクロニードルアレイを製造することが好ましい。
【００１３】
ヒアルロン酸の組成が５０重量％より少ないとマイクロニードルは脆くなり、刺入の際折れやすくなり、８０重量％を超えるとマイクロニードルは硬さ不足のため刺入し難くなる。デキストランはヒアルロン酸と逆の傾向を示し、１０重量％より少ないとマイクロニードルは硬さ不足となり、４０重量％を超えると脆くなる。それゆえ適度の強度と剛性を有するマイクロニードルを作製する材料としてヒアルロン酸とデキストランの混合物が極めて有効である。ポリビニルピロリドンはマイクロニードルの皮膚内溶解性を高めるもので、５重量％より少ないと溶解速度が遅く、２０重量％を超えるともろくなる。
【００１４】
マイクロニードルの主成分を構成するヒアルロン酸の分子量は５０万以上４００万以下であることが望ましい。ヒアルロン酸の分子量が５０万未満であると機械的強度の観点から不都合である。また４００万を超えると水溶液とした際の溶液粘度が高すぎて取扱に不便である。
【００１５】
その他の生体内溶解性物質、例えばコラーゲン、ゼラチン、マルトース、などを計１０重量％以下であれば添加しても差し支えない。
しかし、コラーゲン、ゼラチン、などの物質は免疫原性があり、これらをマイクロニードル材質として用いると、体内にこれらの物質に対する抗体が産生する恐れがある。そのためこれらの物質を主成分とするマイクロニードルを長期にわたり投与することは望ましくない。しかしワクチン用マイクロニードルは、通常１回ないし２回の投与で終了するので、これらの化合物を添加することを不可とはしない。
【００１６】
本発明のマイクロニードルアレイは、複数の微細なマイクロニードルが基板の表面に形成されてなるマイクロニードルアレイであって、該マイクロニードルの形状は皮膚に刺入しやすく且つ刺入に際し苦痛を伴わないように円錐型、円錐台型又はコニーデ型とした。なお、コニーデ型とは、いわゆる火山型と呼ばれる形状であり、円錐台型の側面が内側方向に湾曲した形状である。
【００１７】
マイクロニードルの根元直径は細くなると皮膚内に刺入する素材の量が減少すると共に皮膚に刺入する際に折れやすくなり、太くなると皮膚に刺入する際に苦痛を伴うので０．１５〜１．０ｍｍが適当である。先端直径は、細くなると（尖っていると）皮膚に刺入する際に折れやすくなり、太くなると皮膚に刺入しにくくなり苦痛を伴うので０．０１〜０．０８ｍｍが適当である。
【００１８】
マイクロニードルの高さは、低くなると皮膚表層及び／又は皮膚角質層の所定位置に薬剤を供給しにくくなり、高くなると皮膚に刺入する際に折れやすくなるので０．１〜１．２ｍｍが適当である。又、マイクロニードルとマイクロニードルの間のピッチは、短くなると皮膚に刺入しにくくなり、長くなると面積あたりのマイクロニードルの数が少なくなり、所定の狭い部位に多量の薬剤を供給できなくなるので、０．４〜１．０ｍｍが適当である。
【００１９】
上記マイクロニードルに薬効成分を添加すると医療用マイクロニードルとなるが、特に抗原を添加するとワクチン用マイクロニードルとなる。抗原としては、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される生物を感染することができる病原体由来の抗原、及び細胞（例えば、腫瘍細胞又は正常細胞）を感染することができる病原体由来の抗原があげられる。
【００２０】
上記細菌としては、例えば、炭疽菌、キャンピロバクター、コレラ、クロストリディウム（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む）、ジフテリア、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、ジアルジア（ｇｉａｒｄｉａ）、淋菌、ヘリコバクターピロリ又はヘリコバクターピロリが産生するウレアーゼ、インフルエンザ菌Ｂ、型別不能インフルエンザ菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌、マイコバクテリウム（結核に関与する生物を含む）、百日咳菌、肺炎双球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌及びその腸毒素、Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌、連鎖球菌Ｂ、破傷風菌、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ボレリア・ブルグドルフィ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｉ）及びエルシニア、及びこれらの生成物等があげられる。
【００２１】
上記ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、デングウイルス血清型１〜４、エボラ、腸内ウイルス、ハンタウイルス、肝炎血清型Ａ〜Ｅ（ＨＢｓなど）、単純ヘルペスウイルス１又は２、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、麻疹、ノーウォーク、ウマ日本脳炎、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオ、狂犬病、ＲＳウイルス、ロタウイルス、風疹、麻疹、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、ワクシニア、他の抗原（例えば、マラリア抗原、水痘、および黄熱）をコードする遺伝子を含むウイルス発現ベクター、及びこれらの生成物等があげられる。
【００２２】
上記真菌としては、躯幹白癬、爪白癬、スポロトリクム症、アスペルギルス症、カンジダ症を引き起こす起こす真菌、及び他の病原性真菌が等があげられ、上記寄生体としては、例えば、赤痢アメーバ、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、蠕虫、住血吸虫及びこれらの生成物等があげられる。
【００２３】
抗原としては、腫瘍抗原又は自己抗原があげられる。抗原としては、例えば、花粉、動物のふけ、カビ、ほこりのダニ、ノミ抗原、唾液アレルゲン、草、食物（例えば、ピーナツと他のナッツ類）、Ｂｅｔｖ１等のアレルゲンがあげられる。
【００２４】
化学的には、抗原は、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド又はこれらの化学的または組換え型結合体でもよい。抗原は、組換え手段、化学合成又は天然起源からの精製により得られる、タンパク質性抗原、または多糖との結合体が好適である。抗原は少なくとも部分的に精製された、無細胞型である。あるいは抗原は、生きたウイルス、弱毒化した生きたウイルス、または不活性化ウイルスの型で提供される。抗原は、適宜抗原をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）でもよい。
【００２５】
本発明のワクチン用マイククロニードルはアジュバンドを含有していてもよい。アジュバントとは、抗原に対する免疫応答の誘導を助ける物質であり、ある物質が、免疫刺激及び特異的抗体応答またはＴ細胞応答を誘導することにより、アジュバント及び抗原の両方として作用することがある。
【００２６】
上記アジュバントとしては、例えば、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、ケモカイン（例えば、デフェンシンズ（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）１又は２、ＲＥＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８又はサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０又は−１２；インターフェロンガンマ；腫瘍壊死因子−α又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子））、ムラミルジペプチド誘導体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰまたはムラミルトリペプチド）、熱ショックタンパク質もしくは誘導体、リーシュマニアメージャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＬｅＩＦの誘導体、コレラ毒素又はコレラ毒素Ｂ、細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素及びそのサブユニット、又は細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素若しくはそのサブユニットを使用する組み換え体、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導体（例えば、脂質Ａ又はモノホスホリル脂質Ａ又は脂質Ａ類似体）、スーパー抗原、トリプシン切断部位の突然変異体を含むＡＤＰ−リボシル化に影響を与える突然変異細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素、ＱＳ２１、キル（Ｑｕｉｌｌ）Ａ、みょうばん等があげられる。
【００２７】
本発明のマイクロニードルアレイの製造方法は、特に限定されず、従来公知の任意の方法で製造されればよい。以下に具体的方法を３例挙げる。
（１）マイクロニードルの形状が穿設された型に、マイクロニードル素材に医薬成分を添加した水溶液を流延し、室温下又は加熱して水分を蒸発して乾燥する。その上にマイクロニードル素材のみの水溶液を流延して基板を積層した後剥離し、基板上にマイクロニードルを転写する。この方法によればマイクロニードルにのみ医薬成分が含有されたマイクロニードルアレイが得られ、医薬成分の利用効率がよい。
（２）上記型表面上に上記水溶液を流延し、室温下又は加熱して水分を蒸発して乾燥した後剥離してもよい。この方法によればマイクロニードルに加えて基板にも医薬成分が添加されたマイクロニードルアレイが得られる。医薬成分が安価で大量に得られるとき便利な方法である。
（３）また、薬物が貴重・高価である場合には溶着法と呼ばれる方法が適当である。
ａ）上記方法（２）により生体内溶解性高分子を素材として医薬成分を含まないマイクロニードルアレイを作成し、
ｂ）薬物と該生体内溶解性高分子の溶液を作成し、
ｃ）該マイクロニードルアレイの先端を該溶液に浸漬させ、
ｄ）該マイクロニードルアレイを該溶液から引き上げ、
ｅ）該マイクロニードルアレイを乾燥させて、マイクロニードル先端にのみ薬物を付着させたマイクロニードルアレイを製造する。
【００２８】
溶着法によりマイクロニードルアレイ先端に薬物を効率よく付着させるためには、マイクロニードルアレイ素材と薬物溶液は相溶性があることが好ましい。
従って、水溶性の薬物を用い、薬物水溶液に該生分解性高分子を予め十分に含有させておくならば、マイクロニードル先端部を薬物溶液に浸したとき、先端部が部分的に溶解し薬物は生体内溶解性高分子と一体的にマイクロニードル先端に取り込まれる。このように一体化すれば、マイクロニードルに薬物を単に塗布・付着させる場合と異なり、マイクロニードル刺入の際薬物が剥がれ落ちることなく、薬物が体内に完全に取り込まれることとなる。
【００２９】
以上のような方法で作製したマイクロニードルアレイは硬く、皮膚に数時間適用するためにはマイクロニードルアレイの裏面に粘着性フィルムで裏打ちする必要がある。そのためにはポリエステルフィルム、ポリエチレンフィルムなどの片面にアクリルエステルからなる粘着剤を付着させたものを好適に使用出来る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のマイクロニードルアレイの構成によれば、マイクロニードルは適度の硬さと折れにくさを有し、しかも皮膚表層及び／又は皮膚角質層において容易に溶解する。このため刺入に際し失敗が少なく、初心者にも使用しやすい。
この結果、皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所にマイクロニードル素材やそれに含有される抗原を確実に供給することができる。
【００３１】
本発明のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原のワクチン用マイクロニードルアレイ投与によれば、注射投与法や経鼻投与法より少ない抗原投与量で、各種抗体の内ＩｇＧ産生に関しては注射法と同等の産生能を示し、注射法では全く産生しないＩｇＡ抗体をも産生するとの大きな特徴を有する。
また、破傷風やジフテリアのワクチン用マイクロニードルはそれらの予防注射と同等以上の効果を有している。
本発明が実用化すれば予防注射が不要となり、投与量がより少ないため副作用を低減でき、乳幼児に注射恐怖症を発生させることがない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】円錐台状マイクロニードルを有するマイクロニードルアレイの断面図
【図２】血清中及び糞便中の抗体比較の測定タイミング図
【図３】血清中のＩｇＧ抗体測定により判定した、インフルエンザワクチンのマイクロニードル投与法（◎）、注射投与法（○）及び経鼻投与法（●）による免疫応答比較の図
【図４】糞便中のＩｇＡ抗体測定により判定した、インフルエンザワクチンのマイクロニードル投与法（◎）、注射投与法（○）及び経鼻投与法（●）による免疫応答比較の図
【図５】破傷風・ジフテリアトキソイドの抗体価測定手順の図
【図６】マイクロニードル投与法（●）と注射投与法（○）の、破傷風トキソイドのＩｇＧ抗体価の比較の図
【図７】マイクロニードル投与法（●）と注射投与法（○）の、ジフテリアトキソイドのＩｇＧ抗体価の比較の図
【発明を実施するための形態】
【００３３】
次に、本発明を図面を参照して詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（マイクロニードルの最適組成の決定）
図１に本実施例のマイクロニードルの断面図を示す。本実施例で用いたマイクロニードルの材質とマイクロニードルに含めた薬物をまとめて表１に示す。マイクロニードルの材質は、マイクロニードルを構成する３成分の重量比で示す。抗原の濃度は、マイクロニードル重量に対する重量％で示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
本実施例で用いられているヒアルロン酸は（株）紀文フードケミファ製でその分子量は８０万（商品名：ＦＣＨ−８０ＬＥ）、デキストランは日本バルク薬品（株）製（商品名：デキストラン７０）、ポリビニルピロリドンはＢＡＳＦジャパン製（商品名：コリドン１２ＰＦ）である。また、本発明において分子量とは重量平均分子量であり、ゲルパーミェーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定された量をいう。
【００３７】
各マイクロニードルアレイは前記の方法（１）で製造した。マイクロニードルは、根元直径０．２ｍｍ、先端直径０．０４ｍｍ、長さ０．８ｍｍの円錐台状であり、０．８ｍｍ間隔に格子状に配列されており、１ｃｍ２の円形パッチ型アレイでありマイクロニードルは１４４個形成されている。
各組成の混合物を水に溶解させて１０％固形分水溶液とした。この水溶液に破傷風トキソイド（財団法人阪大微生物病研究会、香川県観音寺市）を添加し、室温下マイクロニードル形成用凹部に充填し水分を蒸発して乾燥した後剥離してマイクロニードルアレイを作製した。
【００３８】
作製したマイクロニードルアレイのベース部の硬度をＪＩＳ鉛筆硬度測定法により測定した。
雄性ラット（１２週齢）をネンブタール（３０ｍｂ／ｋｇ）で麻酔後腹部皮膚を剃毛し、上記の各組成のマイクロニードルを１枚の保護絆創膏で裏打ちして投与した。投与時間は２時間であった。取出したマイクロニードルを顕微鏡観察し、先端部の溶解状況を観察した。各マイクロニードルの鉛筆硬度と投与後の観察結果を表２にまとめた。
この表より、マイクロニードルの組成はヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％が適当と結論できる。
【００３９】
【表２】
【実施例２】
【００４０】
（インフルエンザワクチンに対する免疫応答の誘導）
使用抗原及びその起源
本発明の方法によるワクチンの有用性を検討するために、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、週齢は６週）を用いて免疫応答を調べた。用いたインフルエンザウイルスはＡ／ブリスベン／５９／００７株、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７株、及びＢ／フロリダ／４／２００６株であり、それらのインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）を抗原として用いた。上記３種の抗原は財団法人大阪大学微生物病研究所（香川県観音寺市）から提供を受けた。
【００４１】
抗原含有ヒアルロン酸マイクロニードルの調製
上記本組成１の基剤の１０％水溶液に、上記の３種の抗原を混合した抗原懸濁液０．５ｍｌを均一に混合して抗原−基剤水溶液を得た。この水溶液適量を鋳型に流延し、その後抗原を含まない１０％基剤水溶液を追加流延し、３５℃で水分を蒸発させた後、鋳型から剥離して本発明のマイクロニードルアレイを得た。抗原はマイクロニードル部分にのみ含有され、基板部分には存在せず、貴重な抗原の有効利用を図った。本マイクロニードルは高さが０．８ｍｍ、根元の直径が０．１６ｍｍ、先端直径が０．０４ｍｍである円錐台状である。１ｃｍ２の円板上に間隔０．６ｍｍで格子状に配列されたマイクロニードルは計２５０本形成されている。各マイクロニードルアレイ１個あたりの抗原含有量は３種の抗原ともそれぞれ０．２μｇであった。
【００４２】
マイクロニードルアレイのマウスへの投与及び免疫誘導の確認
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して３種ＨＡ抗原封入マイクロニードルアレイ（各ＨＡ抗原０．２μｇ）を６時間貼付することで経皮免疫を実施した。
対照群として注射投与群は、２７Ｇ針および１ｍｌ注射器を用いて、各０．９μｇの３種ＨＡ抗原を１００μｇの水酸化アルミニウムゲルとともに１００μｌの容量でマウス背部皮下に注射投与した。
対象群としての経鼻投与群は、マイクロピペッターを用いて各０．９μｇの３種ＨＡ抗原を１０μｇのコレラトキシンとともに５μｌの容量で投与した。
【００４３】
これらの操作を４週間隔で２回（第０、４週目）行い、第０、４、６週目に回収した血清中のＨＡ特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。また１３週目に各マウスから糞便を回収し、その中に含まれるＨＡ特異的ＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。操作法を図２にまとめた。
ＥＬＩＳＡ法は次のようにして行った。マイクロタイタープレートに０．５μｇのＨＡ抗原を５０μｌ播種し、４℃で一晩放置することで固相化した。２％スキムミルクを含むＴＢＳを２５０μｌ添加し、室温で２時間ブロッキング操作を行った。その後血清あるいは糞便抽出液の連続希釈検体を５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。次いで各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を５０μｌ添加した。室温で２時間放置した後に、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質を添加した。１５分後に２Ｎ硫酸溶液を加えることによって反応を停止させ、吸光波長４５０ｎｍ、副波長６５５ｎｍにおける吸光度を測定した。各検体の抗体価は０週に回収した検体よりも吸光度が０．１以上高い最大希釈倍率の逆数の対数をＲｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｌｏｇ２ ｔｉｔｅｒとして表わした。尚、検体ならびに抗体の希釈は全て０．２％スキムミルクを含むＴＢＳＴで行った。
【００４４】
図３の結果は本マイクロニードルを用いた経皮免疫は３種類のＨＡ抗原に対して、投与抗原量がより少ないにもかかわらず、注射免疫あるいは経鼻免疫に匹敵する抗原特異的ＩｇＧ抗体産生を誘導できることを示している。この検討では、皮下注射免疫ならびに経鼻免疫ともにアジュバントを併用したが、本マイクロニードルアレイを用いた経皮免疫はアジュバントを用いずに行った。したがって本マイクロニードルアレイを用いた経皮免疫はアジュバントを用いずに、強力な免疫応答を誘導できることが示された。マイクロニードル投与法では注射投与法に比べて少ない投与量で同等あるいはそれ以上の抗体生成がある。
【００４５】
また粘膜免疫誘導能を評価するために糞便抽出液中のＨＡ特異的ＩｇＡ抗体価を測定した（図４）。本マイクロニードルによる経皮免疫は、投与抗原量がより少ないにもかかわらず、経鼻免疫に匹敵する抗原特異的ＩｇＡ抗体の産生を誘導した。一方皮下注射免疫したマウスでは抗原特異的ＩｇＡ抗体は検出されなかった。したがって、本マイクロニードルによる経皮免疫は全身性免疫のみならず粘膜免疫をも誘導できることが示された。
【実施例３】
【００４６】
（破傷風及びジフテリアトキソイドに対する免疫応答の誘導）
使用抗原及びその起源
本発明の方法によるワクチンの有用性を検討するために、ヘアレスラット（週齢は６週）を用いて、破傷風及びジフテリアトキソイドを抗原として免疫応答を観察した。上記２種抗原は財団法人大阪大学微生物病研究所から提供を受けた。
【００４７】
抗原含有マイクロニードルの調製
実施例１の本組成１の１０％基剤水溶液に、上記２種混合抗原懸濁液０．５ｍｌを均一に混合して抗原−基剤水溶液を得、鋳型に適量を流延し、その後抗原を含まない１０％基剤水溶液を追加流延し３５℃で水分を蒸発させた後、鋳型から剥離して本発明のマイクロニードルアレイを得た。本マイクロニードルは高さが０．８ｍｍ、根元の直径が０．１６ｍｍ、先端直径が０．０４ｍｍである円錐台状である。１ｃｍ２の円板上に間隔０．６ｍｍで格子状に配列されたマイクロニードルは、計２５０個形成されている。各マイクロニードルアレイ１個あたりの抗原含有量は、破傷風及びジフテリアトキソイドの抗原それぞれ１０μｇであった。
【００４８】
マイクロニードルアレイのヘアレスラットへの投与及び免疫誘導の確認
ヘアレスラットに対して上記マイクロニードルアレイ（破傷風及びジフテリアトキソイドの抗原それぞれ１０μｇ含有）を６時間貼付することで経皮免疫を実施した。また対照群として２７Ｇ針および１ｃｃ注射器を用いて、各１０μｇの破傷風及びジフテリアトキソイドを１００μｌの容量でヘアレスラット背部皮下に注射投与した。これらの操作を２週間隔で５回（０、２，４，６，６週目）行い、０、２、４、６、８，１０週目に回収した血清中のＨＡ特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。これらの操作過程を図５に示す。ＥＬＩＳＡ法は抗原に破傷風及びジフテリアトキソイドを用いたほかは実施例２と同様であった。
【００４９】
図６及び図７の結果は本マイクロニードルを用いた経皮免疫は破傷風及びジフテリアトキソイド２種類の抗原に対して、注射免疫に匹敵する抗原特異的ＩｇＧ抗体産生を誘導できることを示している。
【実施例４】
【００５０】
（ＨＢｓタンパクに対する免疫応答の誘導）
前記本組成１の素材の薬物を含まないマイクロニードルを作成した。また、本組成１のマイクロニードル素材と組み替えＨＢｓタンパク（シグマ社）５００μｇを５００μｌの水に溶解した溶液を作成した。
溶着法により、すなわち上記マイクロニードルの針の先端部１００μｍをを上記水溶液に５秒間浸漬して引き上げ乾燥させ、先端ＨＢｓ溶着マイクロニードルアレイを得た。マイクロニードルアレイの裏面には皮膚への数時間の適用を安定化させるために絆創膏（マイクロポア、３Ｍ社）を直径２．５ｃｍの円形に切り出した粘着フィルムを裏打ちしマイクロニードルパッチを得た。
【００５１】
ＨＢｓに特異的な抗体に対して陰性である日本白色種雄性ウサギ（体重２〜２．５ｋｇ）３羽の背中を除毛した後、上記マイクロニードルパッチを６時間皮膚適用して免疫感作操作を行った。
免疫感作操作３週間後、ウサギの静脈血液試料を採取し、ＨＢｓ抗原に特異的な抗体力価を測定したところ三羽とも陽性であった。尚、抗体力価の測定はバイオクリット−抗ＨＢｓ（三光純薬製）を用いた。
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン用マイクロニードルアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚表層及び／又は皮膚角質層に修飾効果及び／又は機能効果を与えるためには、従来、薬効成分を含む液状物質、軟膏剤、クリーム製剤、テープ製剤、バッチ製剤、パップ製剤等を局部に塗布又は貼付し、薬物を皮膚や粘膜を透過させて投与していた。しかし、これらの製剤は使用中に発汗、洗浄、外的圧力等により薬物が消失したり脱落したりする欠点があった。また、皮膚表層及び／又は皮膚角質層は体内へ異物の侵入を抑止するバリアー機能を有しているので、塗布または貼付により充分な量の薬物を皮膚下に吸収させるのは困難であった。皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所に薬物を確実に供給することはさらに困難であった。特に薬物が高分子物質あるいは粒子状物質である場合は、皮膚を通じての投与は著しく困難であった。
【０００３】
これらの問題を解決し、皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所に薬効成分を確実に供給する方法として、マイクロニードルが提案された（特許文献１）。マイクロニードルは非常に細いので皮膚表層及び／又は皮膚角質層に刺入した際痛みも出血もなく且つ穿刺創は速やかに閉鎖されるので、皮膚下に薬物を確実に供給する方法として好適である。なお、基板上に複数のマイクロニードルを備えたものをマイクロニードルアレイという。さらにマイクロニードルアレイを皮膚上に固定するための粘着テープ等を備えたものをマイクロニードルパッチという。
【０００４】
マイクロニードルの材質として、生体内で溶解消失する物質が提案されている（特許文献２）。このようなマイクロニードルに薬物を含有させて皮膚に刺入すると、マイクロニードルは皮膚表層及び／又は皮膚角質層において溶解消失するので、皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所に薬物を確実に供給することができる。
【０００５】
しかしながらマイクロニードルの機械的強度が小さい場合は皮膚に刺入する際に折れて刺入できず、機械的強度が大きい場合はマイクロニードルが皮膚内で容易に折れず残留させることが困難な欠点があった。例えばポリ乳酸やマルトースを素材とするマイクロニードルは、機械的強度や硬度が適切ではない。
【０００６】
マイクロニードルの生体内で溶解消失する材質として、これまでマルトース（特許文献２）、ヒアルロン酸（特許文献４、５、６）、デキストラン（特許文献４）、ポリビニルピロリドン（特許文献７）、ゼラチン（特許文献３、５、６）、コラーゲン（特許文献５、６）、キトサン（特許文献５）、蛋白質（特許文献３、４）、生分解性樹脂（特許文献１）を用いたものが公表されている。しかし、コラーゲン、ゼラチン、キトサンなどの物質は免疫原性があり、これらをマイクロニードル材質として用いると、体内にこれらの物質に対する抗体が産生する恐れがある。そのためこれらの物質を含むマイクロニードルを長期にわたり投与することは望ましくない。
【０００７】
医療用の薬物を含むマイクロニードルは医療用マイクロニードルと呼ばれ、特に抗原を含むものはワクチン用マイクロニードルと呼ばれる。ワクチン用マイクロニードルに含ませる抗原としては、細菌、ウイルス、真菌や寄生体など生物を感染することができる病原体由来の抗原を用いることができる。アレルギー抗原をマイクロニードルに担持させてアレルギー検査を行うことができる（特許文献８）。
【０００８】
インフルエンザは毎年数百万人以上が罹患し、体力や免疫力の低い高齢者や乳幼児には危険な急性呼吸器疾患である。特に人類が未だ免疫を有していない鳥インフルエンザ由来の新型インフルエンザには強い警戒が必要である。インフルエンザの抑制にはインフルエンザワクチンの接種が有効と考えられている。
破傷風やジフテリアは感染法上の指定感染症であり、世界的には毎年多数の死者が出ており、その予防にはワクチンが欠かせない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００２−５１７３００号公報
【特許文献２】特開２００３−２３８３４７号公報
【特許文献３】特開２００６−３４６１２６号公報
【特許文献４】ＷＯ２００６／０８０５０８号公報
【特許文献５】特開２００８−２８４３１８号公報
【特許文献６】特開２０１０−０２９６３４号公報
【特許文献７】特開２０１０−０８２４０１号公報
【特許文献８】ＷＯ２００８／０９６７３２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
各種伝染性疾患に対しては痛みや苦しみを伴う予防注射に代わるより安全なワクチン投与法が求められている。特に予防注射は一部の人には深刻な副作用があり、副作用の軽減のためには、投与する抗原量を減らし少量の抗原で有効な免疫力を付与する投与法が求められている。
また、抗原は高分子物質であり、皮膚表面に塗布あるいは貼付することにより投与することはきわめて困難である。
本発明の解決しようとする課題は、注射法や表面塗布法といった従来法の欠点に鑑み、皮膚表層及び／又は皮膚角質層に折れることなく容易且つ均一に刺入でき、皮膚表層及び／又は皮膚角質層において速やかに溶解し、その素材が長期にわたり多数回投与しても安全な物質からなる医療用マイクロニードルとマイクロニードルアレイを開発し、抗原を含有させ、予防医学に有用なワクチン用マイクロニードルを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明のワクチン用マイクロニードルは、以下の３種類の生体内溶解性高分子、即ち、ヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％により構成され、抗原を含有することを特徴とする。
【００１２】
このような抗原は大量に得ることが困難で高価である。従って、抗原はマイクロニードルアレイのマイクロニードル部分にのみ存在させ、基板部分には含ませないようにマイクロニードルアレイを製造することが好ましい。
【００１３】
ヒアルロン酸の組成が５０重量％より少ないとマイクロニードルは脆くなり、刺入の際折れやすくなり、８０重量％を超えるとマイクロニードルは硬さ不足のため刺入し難くなる。デキストランはヒアルロン酸と逆の傾向を示し、１０重量％より少ないとマイクロニードルは硬さ不足となり、４０重量％を超えると脆くなる。それゆえ適度の強度と剛性を有するマイクロニードルを作製する材料としてヒアルロン酸とデキストランの混合物が極めて有効である。ポリビニルピロリドンはマイクロニードルの皮膚内溶解性を高めるもので、５重量％より少ないと溶解速度が遅く、２０重量％を超えるともろくなる。
【００１４】
マイクロニードルの主成分を構成するヒアルロン酸の分子量は５０万以上４００万以下であることが望ましい。ヒアルロン酸の分子量が５０万未満であると機械的強度の観点から不都合である。また４００万を超えると水溶液とした際の溶液粘度が高すぎて取扱に不便である。
【００１５】
その他の生体内溶解性物質、例えばコラーゲン、ゼラチン、マルトース、などを計１０重量％以下であれば添加しても差し支えない。
しかし、コラーゲン、ゼラチン、などの物質は免疫原性があり、これらをマイクロニードル材質として用いると、体内にこれらの物質に対する抗体が産生する恐れがある。そのためこれらの物質を主成分とするマイクロニードルを長期にわたり投与することは望ましくない。しかしワクチン用マイクロニードルは、通常１回ないし２回の投与で終了するので、これらの化合物を添加することを不可とはしない。
【００１６】
本発明のマイクロニードルアレイは、複数の微細なマイクロニードルが基板の表面に形成されてなるマイクロニードルアレイであって、該マイクロニードルの形状は皮膚に刺入しやすく且つ刺入に際し苦痛を伴わないように円錐型、円錐台型又はコニーデ型とした。なお、コニーデ型とは、いわゆる火山型と呼ばれる形状であり、円錐台型の側面が内側方向に湾曲した形状である。
【００１７】
マイクロニードルの根元直径は細くなると皮膚内に刺入する素材の量が減少すると共に皮膚に刺入する際に折れやすくなり、太くなると皮膚に刺入する際に苦痛を伴うので０．１５〜１．０ｍｍが適当である。先端直径は、細くなると（尖っていると）皮膚に刺入する際に折れやすくなり、太くなると皮膚に刺入しにくくなり苦痛を伴うので０．０１〜０．０８ｍｍが適当である。
【００１８】
マイクロニードルの高さは、低くなると皮膚表層及び／又は皮膚角質層の所定位置に薬剤を供給しにくくなり、高くなると皮膚に刺入する際に折れやすくなるので０．１〜１．２ｍｍが適当である。又、マイクロニードルとマイクロニードルの間のピッチは、短くなると皮膚に刺入しにくくなり、長くなると面積あたりのマイクロニードルの数が少なくなり、所定の狭い部位に多量の薬剤を供給できなくなるので、０．４〜１．０ｍｍが適当である。
【００１９】
上記マイクロニードルに薬効成分を添加すると医療用マイクロニードルとなるが、特に抗原を添加するとワクチン用マイクロニードルとなる。抗原としては、細菌、ウイルス、真菌及び寄生体よりなる群から選択される生物を感染することができる病原体由来の抗原、及び細胞（例えば、腫瘍細胞又は正常細胞）を感染することができる病原体由来の抗原があげられる。
【００２０】
上記細菌としては、例えば、炭疽菌、キャンピロバクター、コレラ、クロストリディウム（クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）を含む）、ジフテリア、腸管出血性大腸菌、毒素原性大腸菌、ジアルジア（ｇｉａｒｄｉａ）、淋菌、ヘリコバクターピロリ又はヘリコバクターピロリが産生するウレアーゼ、インフルエンザ菌Ｂ、型別不能インフルエンザ菌、レジオネラ菌、髄膜炎菌、マイコバクテリウム（結核に関与する生物を含む）、百日咳菌、肺炎双球菌、サルモネラ菌、赤痢菌、ブドウ球菌及びその腸毒素、Ａ群ベータ溶血性連鎖球菌、連鎖球菌Ｂ、破傷風菌、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、ボレリア・ブルグドルフィ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｉ）及びエルシニア、及びこれらの生成物等があげられる。
【００２１】
上記ウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、デングウイルス血清型１〜４、エボラ、腸内ウイルス、ハンタウイルス、肝炎血清型Ａ〜Ｅ（ＨＢｓなど）、単純ヘルペスウイルス１又は２、ヒト免疫不全症ウイルス、ヒトパピローマウイルス、インフルエンザ、麻疹、ノーウォーク、ウマ日本脳炎、パピローマウイルス、パルボウイルスＢ１９、ポリオ、狂犬病、ＲＳウイルス、ロタウイルス、風疹、麻疹、セントルイス脳炎（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、ワクシニア、他の抗原（例えば、マラリア抗原、水痘、および黄熱）をコードする遺伝子を含むウイルス発現ベクター、及びこれらの生成物等があげられる。
【００２２】
上記真菌としては、躯幹白癬、爪白癬、スポロトリクム症、アスペルギルス症、カンジダ症を引き起こす起こす真菌、及び他の病原性真菌が等があげられ、上記寄生体としては、例えば、赤痢アメーバ、プラスモジウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、蠕虫、住血吸虫及びこれらの生成物等があげられる。
【００２３】
抗原としては、腫瘍抗原又は自己抗原があげられる。抗原としては、例えば、花粉、動物のふけ、カビ、ほこりのダニ、ノミ抗原、唾液アレルゲン、草、食物（例えば、ピーナツと他のナッツ類）、Ｂｅｔｖ１等のアレルゲンがあげられる。
【００２４】
化学的には、抗原は、炭水化物、糖脂質、糖タンパク質、脂質、リポタンパク質、リン脂質、ポリペプチド又はこれらの化学的または組換え型結合体でもよい。抗原は、組換え手段、化学合成又は天然起源からの精製により得られる、タンパク質性抗原、または多糖との結合体が好適である。抗原は少なくとも部分的に精製された、無細胞型である。あるいは抗原は、生きたウイルス、弱毒化した生きたウイルス、または不活性化ウイルスの型で提供される。抗原は、適宜抗原をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ）でもよい。
【００２５】
本発明のワクチン用マイククロニードルはアジュバンドを含有していてもよい。アジュバントとは、抗原に対する免疫応答の誘導を助ける物質であり、ある物質が、免疫刺激及び特異的抗体応答またはＴ細胞応答を誘導することにより、アジュバント及び抗原の両方として作用することがある。
【００２６】
上記アジュバントとしては、例えば、油エマルジョン（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）、ケモカイン（例えば、デフェンシンズ（ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ）１又は２、ＲＥＮＴＥＳ、ＭＩＰ１−α、ＭＩＰ−２、インターロイキン−８又はサイトカイン（例えば、インターロイキン−１β、−２、−６、−１０又は−１２；インターフェロンガンマ；腫瘍壊死因子−α又は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子））、ムラミルジペプチド誘導体（例えば、ムラブチド、トレオニル−ＭＤＰまたはムラミルトリペプチド）、熱ショックタンパク質もしくは誘導体、リーシュマニアメージャー（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｍａｊｏｒ）ＬｅＩＦの誘導体、コレラ毒素又はコレラ毒素Ｂ、細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素及びそのサブユニット、又は細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素若しくはそのサブユニットを使用する組み換え体、リポ多糖（ＬＰＳ）誘導体（例えば、脂質Ａ又はモノホスホリル脂質Ａ又は脂質Ａ類似体）、スーパー抗原、トリプシン切断部位の突然変異体を含むＡＤＰ−リボシル化に影響を与える突然変異細菌性ＡＤＰ−リボシル化外毒素、ＱＳ２１、キル（Ｑｕｉｌｌ）Ａ、みょうばん等があげられる。
【００２７】
本発明のマイクロニードルアレイの製造方法は、特に限定されず、従来公知の任意の方法で製造されればよい。以下に具体的方法を３例挙げる。
（１）マイクロニードルの形状が穿設された型に、マイクロニードル素材に医薬成分を添加した水溶液を流延し、室温下又は加熱して水分を蒸発して乾燥する。その上にマイクロニードル素材のみの水溶液を流延して基板を積層した後剥離し、基板上にマイクロニードルを転写する。この方法によればマイクロニードルにのみ医薬成分が含有されたマイクロニードルアレイが得られ、医薬成分の利用効率がよい。
（２）上記型表面上に上記水溶液を流延し、室温下又は加熱して水分を蒸発して乾燥した後剥離してもよい。この方法によればマイクロニードルに加えて基板にも医薬成分が添加されたマイクロニードルアレイが得られる。医薬成分が安価で大量に得られるとき便利な方法である。
（３）また、薬物が貴重・高価である場合には溶着法と呼ばれる方法が適当である。
ａ）上記方法（２）により生体内溶解性高分子を素材として医薬成分を含まないマイクロニードルアレイを作成し、
ｂ）薬物と該生体内溶解性高分子の溶液を作成し、
ｃ）該マイクロニードルアレイの先端を該溶液に浸漬させ、
ｄ）該マイクロニードルアレイを該溶液から引き上げ、
ｅ）該マイクロニードルアレイを乾燥させて、マイクロニードル先端にのみ薬物を付着させたマイクロニードルアレイを製造する。
【００２８】
溶着法によりマイクロニードルアレイ先端に薬物を効率よく付着させるためには、マイクロニードルアレイ素材と薬物溶液は相溶性があることが好ましい。
従って、水溶性の薬物を用い、薬物水溶液に該生分解性高分子を予め十分に含有させておくならば、マイクロニードル先端部を薬物溶液に浸したとき、先端部が部分的に溶解し薬物は生体内溶解性高分子と一体的にマイクロニードル先端に取り込まれる。このように一体化すれば、マイクロニードルに薬物を単に塗布・付着させる場合と異なり、マイクロニードル刺入の際薬物が剥がれ落ちることなく、薬物が体内に完全に取り込まれることとなる。
【００２９】
以上のような方法で作製したマイクロニードルアレイは硬く、皮膚に数時間適用するためにはマイクロニードルアレイの裏面に粘着性フィルムで裏打ちする必要がある。そのためにはポリエステルフィルム、ポリエチレンフィルムなどの片面にアクリルエステルからなる粘着剤を付着させたものを好適に使用出来る。
【発明の効果】
【００３０】
本発明のマイクロニードルアレイの構成によれば、マイクロニードルは適度の硬さと折れにくさを有し、しかも皮膚表層及び／又は皮膚角質層において容易に溶解する。このため刺入に際し失敗が少なく、初心者にも使用しやすい。
この結果、皮膚表層及び／又は皮膚角質層の特定の場所にマイクロニードル素材やそれに含有される抗原を確実に供給することができる。
【００３１】
本発明のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原のワクチン用マイクロニードルアレイ投与によれば、注射投与法や経鼻投与法より少ない抗原投与量で、各種抗体の内ＩｇＧ産生に関しては注射法と同等の産生能を示し、注射法では全く産生しないＩｇＡ抗体をも産生するとの大きな特徴を有する。
また、破傷風やジフテリアのワクチン用マイクロニードルはそれらの予防注射と同等以上の効果を有している。
本発明が実用化すれば予防注射が不要となり、投与量がより少ないため副作用を低減でき、乳幼児に注射恐怖症を発生させることがない。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】円錐台状マイクロニードルを有するマイクロニードルアレイの断面図
【図２】血清中及び糞便中の抗体比較の測定タイミング図
【図３】血清中のＩｇＧ抗体測定により判定した、インフルエンザワクチンのマイクロニードル投与法（◎）、注射投与法（○）及び経鼻投与法（●）による免疫応答比較の図
【図４】糞便中のＩｇＡ抗体測定により判定した、インフルエンザワクチンのマイクロニードル投与法（◎）、注射投与法（○）及び経鼻投与法（●）による免疫応答比較の図
【図５】破傷風・ジフテリアトキソイドの抗体価測定手順の図
【図６】マイクロニードル投与法（●）と注射投与法（○）の、破傷風トキソイドのＩｇＧ抗体価の比較の図
【図７】マイクロニードル投与法（●）と注射投与法（○）の、ジフテリアトキソイドのＩｇＧ抗体価の比較の図
【発明を実施するための形態】
【００３３】
次に、本発明を図面を参照して詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００３４】
（マイクロニードルの最適組成の決定）
図１に本実施例のマイクロニードルの断面図を示す。本実施例で用いたマイクロニードルの材質とマイクロニードルに含めた薬物をまとめて表１に示す。マイクロニードルの材質は、マイクロニードルを構成する３成分の重量比で示す。抗原の濃度は、マイクロニードル重量に対する重量％で示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
本実施例で用いられているヒアルロン酸は（株）紀文フードケミファ製でその分子量は８０万（商品名：ＦＣＨ−８０ＬＥ）、デキストランは日本バルク薬品（株）製（商品名：デキストラン７０）、ポリビニルピロリドンはＢＡＳＦジャパン製（商品名：コリドン１２ＰＦ）である。また、本発明において分子量とは重量平均分子量であり、ゲルパーミェーションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）により測定された量をいう。
【００３７】
各マイクロニードルアレイは前記の方法（１）で製造した。マイクロニードルは、根元直径０．２ｍｍ、先端直径０．０４ｍｍ、長さ０．８ｍｍの円錐台状であり、０．８ｍｍ間隔に格子状に配列されており、１ｃｍ２の円形パッチ型アレイでありマイクロニードルは１４４個形成されている。
各組成の混合物を水に溶解させて１０％固形分水溶液とした。この水溶液に破傷風トキソイド（財団法人阪大微生物病研究会、香川県観音寺市）を添加し、室温下マイクロニードル形成用凹部に充填し水分を蒸発して乾燥した後剥離してマイクロニードルアレイを作製した。
【００３８】
作製したマイクロニードルアレイのベース部の硬度をＪＩＳ鉛筆硬度測定法により測定した。
雄性ラット（１２週齢）をネンブタール（３０ｍｂ／ｋｇ）で麻酔後腹部皮膚を剃毛し、上記の各組成のマイクロニードルを１枚の保護絆創膏で裏打ちして投与した。投与時間は２時間であった。取出したマイクロニードルを顕微鏡観察し、先端部の溶解状況を観察した。各マイクロニードルの鉛筆硬度と投与後の観察結果を表２にまとめた。
この表より、マイクロニードルの組成はヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％が適当と結論できる。
【００３９】
【表２】
【実施例２】
【００４０】
（インフルエンザワクチンに対する免疫応答の誘導）
使用抗原及びその起源
本発明の方法によるワクチンの有用性を検討するために、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、週齢は６週）を用いて免疫応答を調べた。用いたインフルエンザウイルスはＡ／ブリスベン／５９／００７株、Ａ／ウルグアイ／７１６／２００７株、及びＢ／フロリダ／４／２００６株であり、それらのインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）を抗原として用いた。上記３種の抗原は財団法人大阪大学微生物病研究所（香川県観音寺市）から提供を受けた。
【００４１】
抗原含有ヒアルロン酸マイクロニードルの調製
上記本組成１の基剤の１０％水溶液に、上記の３種の抗原を混合した抗原懸濁液０．５ｍｌを均一に混合して抗原−基剤水溶液を得た。この水溶液適量を鋳型に流延し、その後抗原を含まない１０％基剤水溶液を追加流延し、３５℃で水分を蒸発させた後、鋳型から剥離して本発明のマイクロニードルアレイを得た。抗原はマイクロニードル部分にのみ含有され、基板部分には存在せず、貴重な抗原の有効利用を図った。本マイクロニードルは高さが０．８ｍｍ、根元の直径が０．１６ｍｍ、先端直径が０．０４ｍｍである円錐台状である。１ｃｍ２の円板上に間隔０．６ｍｍで格子状に配列されたマイクロニードルは計２５０本形成されている。各マイクロニードルアレイ１個あたりの抗原含有量は３種の抗原ともそれぞれ０．２μｇであった。
【００４２】
マイクロニードルアレイのマウスへの投与及び免疫誘導の確認
ＢＡＬＢ／ｃマウスに対して３種ＨＡ抗原封入マイクロニードルアレイ（各ＨＡ抗原０．２μｇ）を６時間貼付することで経皮免疫を実施した。
対照群として注射投与群は、２７Ｇ針および１ｍｌ注射器を用いて、各０．９μｇの３種ＨＡ抗原を１００μｇの水酸化アルミニウムゲルとともに１００μｌの容量でマウス背部皮下に注射投与した。
対象群としての経鼻投与群は、マイクロピペッターを用いて各０．９μｇの３種ＨＡ抗原を１０μｇのコレラトキシンとともに５μｌの容量で投与した。
【００４３】
これらの操作を４週間隔で２回（第０、４週目）行い、第０、４、６週目に回収した血清中のＨＡ特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。また１３週目に各マウスから糞便を回収し、その中に含まれるＨＡ特異的ＩｇＡ抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。操作法を図２にまとめた。
ＥＬＩＳＡ法は次のようにして行った。マイクロタイタープレートに０．５μｇのＨＡ抗原を５０μｌ播種し、４℃で一晩放置することで固相化した。２％スキムミルクを含むＴＢＳを２５０μｌ添加し、室温で２時間ブロッキング操作を行った。その後血清あるいは糞便抽出液の連続希釈検体を５０μｌ加え、室温で２時間反応させた。次いで各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で洗浄し、５０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧまたはＩｇＡ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を５０μｌ添加した。室温で２時間放置した後に、各ウェルを０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＴＢＳで３回洗浄し、ＴＭＢ基質を添加した。１５分後に２Ｎ硫酸溶液を加えることによって反応を停止させ、吸光波長４５０ｎｍ、副波長６５５ｎｍにおける吸光度を測定した。各検体の抗体価は０週に回収した検体よりも吸光度が０．１以上高い最大希釈倍率の逆数の対数をＲｅｃｉｐｒｏｃａｌ ｌｏｇ２ ｔｉｔｅｒとして表わした。尚、検体ならびに抗体の希釈は全て０．２％スキムミルクを含むＴＢＳＴで行った。
【００４４】
図３の結果は本マイクロニードルを用いた経皮免疫は３種類のＨＡ抗原に対して、投与抗原量がより少ないにもかかわらず、注射免疫あるいは経鼻免疫に匹敵する抗原特異的ＩｇＧ抗体産生を誘導できることを示している。この検討では、皮下注射免疫ならびに経鼻免疫ともにアジュバントを併用したが、本マイクロニードルアレイを用いた経皮免疫はアジュバントを用いずに行った。したがって本マイクロニードルアレイを用いた経皮免疫はアジュバントを用いずに、強力な免疫応答を誘導できることが示された。マイクロニードル投与法では注射投与法に比べて少ない投与量で同等あるいはそれ以上の抗体生成がある。
【００４５】
また粘膜免疫誘導能を評価するために糞便抽出液中のＨＡ特異的ＩｇＡ抗体価を測定した（図４）。本マイクロニードルによる経皮免疫は、投与抗原量がより少ないにもかかわらず、経鼻免疫に匹敵する抗原特異的ＩｇＡ抗体の産生を誘導した。一方皮下注射免疫したマウスでは抗原特異的ＩｇＡ抗体は検出されなかった。したがって、本マイクロニードルによる経皮免疫は全身性免疫のみならず粘膜免疫をも誘導できることが示された。
【実施例３】
【００４６】
（破傷風及びジフテリアトキソイドに対する免疫応答の誘導）
使用抗原及びその起源
本発明の方法によるワクチンの有用性を検討するために、ヘアレスラット（週齢は６週）を用いて、破傷風及びジフテリアトキソイドを抗原として免疫応答を観察した。上記２種抗原は財団法人大阪大学微生物病研究所から提供を受けた。
【００４７】
抗原含有マイクロニードルの調製
実施例１の本組成１の１０％基剤水溶液に、上記２種混合抗原懸濁液０．５ｍｌを均一に混合して抗原−基剤水溶液を得、鋳型に適量を流延し、その後抗原を含まない１０％基剤水溶液を追加流延し３５℃で水分を蒸発させた後、鋳型から剥離して本発明のマイクロニードルアレイを得た。本マイクロニードルは高さが０．８ｍｍ、根元の直径が０．１６ｍｍ、先端直径が０．０４ｍｍである円錐台状である。１ｃｍ２の円板上に間隔０．６ｍｍで格子状に配列されたマイクロニードルは、計２５０個形成されている。各マイクロニードルアレイ１個あたりの抗原含有量は、破傷風及びジフテリアトキソイドの抗原それぞれ１０μｇであった。
【００４８】
マイクロニードルアレイのヘアレスラットへの投与及び免疫誘導の確認
ヘアレスラットに対して上記マイクロニードルアレイ（破傷風及びジフテリアトキソイドの抗原それぞれ１０μｇ含有）を６時間貼付することで経皮免疫を実施した。また対照群として２７Ｇ針および１ｃｃ注射器を用いて、各１０μｇの破傷風及びジフテリアトキソイドを１００μｌの容量でヘアレスラット背部皮下に注射投与した。これらの操作を２週間隔で５回（０、２，４，６，６週目）行い、０、２、４、６、８，１０週目に回収した血清中のＨＡ特異的ＩｇＧ抗体をＥＬＩＳＡ法により測定した。これらの操作過程を図５に示す。ＥＬＩＳＡ法は抗原に破傷風及びジフテリアトキソイドを用いたほかは実施例２と同様であった。
【００４９】
図６及び図７の結果は本マイクロニードルを用いた経皮免疫は破傷風及びジフテリアトキソイド２種類の抗原に対して、注射免疫に匹敵する抗原特異的ＩｇＧ抗体産生を誘導できることを示している。
【実施例４】
【００５０】
（ＨＢｓタンパクに対する免疫応答の誘導）
前記本組成１の素材の薬物を含まないマイクロニードルを作成した。また、本組成１のマイクロニードル素材と組み替えＨＢｓタンパク（シグマ社）５００μｇを５００μｌの水に溶解した溶液を作成した。
溶着法により、すなわち上記マイクロニードルの針の先端部１００μｍをを上記水溶液に５秒間浸漬して引き上げ乾燥させ、先端ＨＢｓ溶着マイクロニードルアレイを得た。マイクロニードルアレイの裏面には皮膚への数時間の適用を安定化させるために絆創膏（マイクロポア、３Ｍ社）を直径２．５ｃｍの円形に切り出した粘着フィルムを裏打ちしマイクロニードルパッチを得た。
【００５１】
ＨＢｓに特異的な抗体に対して陰性である日本白色種雄性ウサギ（体重２〜２．５ｋｇ）３羽の背中を除毛した後、上記マイクロニードルパッチを６時間皮膚適用して免疫感作操作を行った。
免疫感作操作３週間後、ウサギの静脈血液試料を採取し、ＨＢｓ抗原に特異的な抗体力価を測定したところ三羽とも陽性であった。尚、抗体力価の測定はバイオクリット−抗ＨＢｓ（三光純薬製）を用いた。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロニードルがヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％により構成され、抗原を含有するワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項２】
抗原が、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及び組み替えＨＢｓタンパクからなる群より選ばれた１の抗原であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項３】
前記抗原はマイクロニードルアレイのマイクロニードル部分にのみ存在していることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項４】
前記抗原は溶着法によりマイクロニードルに溶着させていることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードル。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸の分子量が５０万以上、４００万以下であることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項６】
前記マイクロニードルの形状が円錐型、円錐台型又はコニーデ型であり、その根元直径は０．１５〜１．０ｍｍ、先端直径は０．０１〜０．０８ｍｍ、高さは０．１〜１．２ｍｍであり、マイクロニードルとマイクロニードルのピッチが０．４〜１．０ｍｍであることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項７】
アジュバンドを含有することを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれか１項記載のワクチン用マイクロニードルアレイを無傷の皮膚へ適用し、抗原に特異的な免疫応答を誘導することを特徴とする経皮免疫方法。
【請求項９】
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の効果判定に際し、ＩｇＧ抗体価測定とＩｇＡ抗体価測定を併用することを特徴とする請求項８に記載の経皮免疫方法。
【請求項１】
マイクロニードルがヒアルロン酸５０〜８０重量％、デキストラン１０〜４０重量％及びポリビニルピロリドン５〜２０重量％により構成され、抗原を含有するワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項２】
抗原が、インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド及び組み替えＨＢｓタンパクからなる群より選ばれた１の抗原であることを特徴とする請求項１に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項３】
前記抗原はマイクロニードルアレイのマイクロニードル部分にのみ存在していることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項４】
前記抗原は溶着法によりマイクロニードルに溶着させていることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードル。
【請求項５】
前記ヒアルロン酸の分子量が５０万以上、４００万以下であることを特徴とする請求項１ないし請求項４のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項６】
前記マイクロニードルの形状が円錐型、円錐台型又はコニーデ型であり、その根元直径は０．１５〜１．０ｍｍ、先端直径は０．０１〜０．０８ｍｍ、高さは０．１〜１．２ｍｍであり、マイクロニードルとマイクロニードルのピッチが０．４〜１．０ｍｍであることを特徴とする請求項１ないし請求項５のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項７】
アジュバンドを含有することを特徴とする請求項１ないし請求項６のいずれか１項に記載のワクチン用マイクロニードルアレイ。
【請求項８】
請求項１ないし請求項７のいずれか１項記載のワクチン用マイクロニードルアレイを無傷の皮膚へ適用し、抗原に特異的な免疫応答を誘導することを特徴とする経皮免疫方法。
【請求項９】
インフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原の効果判定に際し、ＩｇＧ抗体価測定とＩｇＡ抗体価測定を併用することを特徴とする請求項８に記載の経皮免疫方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【公開番号】特開２０１２−４１３２９（Ｐ２０１２−４１３２９Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−２７７４５０（Ｐ２０１０−２７７４５０）
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年５月２８日 日本ＤＤＳ学会発行の「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ＶＯＬ．２５ Ｎｏ．３ 第２６回日本ＤＤＳ学会 プログラム予稿集」に発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人医薬基盤研究所基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２９６３８０）コスメディ製薬株式会社 (42)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１１月２６日（２０１０．１１．２６）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２２年５月２８日 日本ＤＤＳ学会発行の「Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍ ＶＯＬ．２５ Ｎｏ．３ 第２６回日本ＤＤＳ学会 プログラム予稿集」に発表
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２１年度、独立行政法人医薬基盤研究所基礎研究推進事業、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願
【出願人】（５０１２９６３８０）コスメディ製薬株式会社 (42)
【出願人】（５０４１７６９１１）国立大学法人大阪大学 (1,536)
【Ｆターム（参考）】
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