抗筋萎縮剤
【課題】筋萎縮の予防又は治療に有用な抗筋萎縮剤の提供。また、抗筋萎縮剤のスクリーニング方法の提供。また、筋萎縮の予防および治療方法の提供。
【解決手段】ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤を含む抗筋萎縮剤。
【解決手段】ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤を含む抗筋萎縮剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤およびそれを含む抗筋萎縮剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人の骨格筋は、少なくとも部分的には、タンパク質合成と分解との動的平衡による驚異的な柔軟性を有する。タンパク質合成の増加は、筋肥大をもたらし、一方、タンパク質分解の増加は、筋萎縮をもたらす。身体活動、特に筋力トレーニングの増加は、現存する筋線維の成長を特徴とする筋肥大を誘導し、多くの場合健康上の利益をもたらす。一方、種々の慢性疾患は、疾患状態を悪化させ生活の質を損なう、骨格筋萎縮をもたらす。このように、骨格筋萎縮の予防や減弱は、重要な臨床問題の一つである。
【０００３】
筋萎縮は、絶食、慢性疾患（たとえば、癌、糖尿病、ＡＩＤＳ、敗血症及び筋肉減少症）及び不活動（廃用性萎縮）に応答して生じる。これらの多様な条件下で、萎縮性の筋肉は、ユビキチン−プロテアソーム経路の活性化によって最初にタンパク質分解の促進を受け（非特許文献１）、そして一緒に「萎縮プログラム」を構成する共通する一連の転写適応が生じる（非特許文献２）。複数の骨格筋萎縮のモデルにおいて、筋特異的Ｆ−ｂｏｘタンパク質であるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１は、上方制御されており、筋タンパク質欠損の促進に不可欠と思われる（非特許文献３）。骨格筋管におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の過剰発現は、萎縮をもたらし、そして、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１欠損マウスは、種々のモデルの骨格筋萎縮に耐性である（非特許文献４，５）。
【０００４】
Sandri et al.は、クラスＯのフォークヘッドボックストランスクリプションファクター（ＦｏｘＯ）のメンバーがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の翻訳を制御することを報告している（非特許文献６）。萎縮ファクターは、ＦｏｘＯ発現を誘導し、そしてその核輸送を開始し、筋萎縮をもたらすＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１発現を高める。一方、筋肥大の主要な経路であるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路は、ＦｏｘＯをリン酸化し、その核輸送を阻害することによって筋萎縮を予防することができる（非特許文献７）。
【０００５】
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１はリングフィンガー型のユビキチンリガーゼとして委縮筋から発見された。Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１は筋萎縮時に発現量が亢進する一方、この遺伝子を欠損したマウスでは筋萎縮に耐性を示すことが報告されており、Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１は筋タンパク質分解系において主要な役割を担っていると考えられている（非特許文献５）。
【０００６】
最近の研究では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として知られる小さな非コードＲＮＡが、骨格筋の分化及び形態形成を含む、多様な生物学的及び病理学的プロセスにおいて基本的な役割を奏するという、筋遺伝子制御の新たな面を明らかにした（非特許文献８）。ｍｉＲＮＡは、長さが約２２個のヌクレオチドであり、標的の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と相互作用することによって特定のｍＲＮＡ標的の翻訳を阻害する（非特許文献９）。ｍｉＲＮＡは、最初に、特徴的なヘアピン二次構造を有する数百から数千の長さにわたる、プライマリ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、そしてＲＮａｓｅIII酵素であるＤｒｏｓｈａによってｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として切断される。次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５によって核から搬出され、ＲＮａｓｅIII酵素であるＤｉｃｅｒによって〜２２ヌクレオチドの２本鎖の成熟ｍｉＲＮＡにプロセスされる。最後に、１本鎖の成熟ｍｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを結合するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に組み込まれる。よって、特に記載がない場合は、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを結合する１本鎖の成熟ｍｉＲＮＡを意味する。
【０００７】
いくつかのｍｉＲＮＡは、組織特異的な様式で発現されることが報告されており、発生の間の組織の特異化におけるｍｉＲＮＡの役割が示唆される。骨格筋において、いくつかの筋特異的ｍｉＲＮＡが、筋肉の成長及び分化の調節において複数の役割を奏することが報告されている。Chen et al.は、筋特異的ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１３３が、それぞれ、血清応答因子（ＳＲＦ）及びヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）を下方制御し、筋分化を調節することを示した（非特許文献１０）。筋原性制御因子であるＭｙｏＤが、ｍｉＲ−２０６を誘導し、筋形成を促進することも示されてきている（非特許文献１１、１２）。これらの過去の研究は、骨格筋の発生における筋特異的ｍｉＲＮＡの重要性を明らかにする。しかし、成体における骨格筋の柔軟性に関与するｍｉＲＮＡについては、全く報告されていない。
【０００８】
本発明者らは、成体骨格筋柔軟性、特に筋萎縮におけるｍｉＲＮＡの関与を調べるために、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１と相互作用するｍｉＲＮＡを探索し、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１：5'-AUC ACA UUG CCA GGG AUU UCC -3'、ヒトにおける配列）がＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１と相互作用することを見出した。ｍｉＲ−２３ａは、活性化カルシニュリンＡをトランスジェニックに発現するマウスの肥大化心臓において上方制御されているｍｉＲＮＡとして既に報告されている（非特許文献１３）が、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１と相互作用すること、および筋萎縮に関与することはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jagoe R.T. and Goldberg A.L. What do we really know about the ubiquitln-proteasome pathway in muscle atrophy? Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 4, 183-190 (2001)
【非特許文献２】Lecker S.H. et al. Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression. FASEB J. 18, 39-51 (2004)
【非特許文献３】Sacheck J.M. et al. Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during systemic diseases. FASEB J. 21, 140-155 (2007)
【非特許文献４】Gomes M.D, et al. Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 14440-14445 (2001)
【非特許文献５】Bodine S.C. et al. Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy Science. 294, 1704-1708 (2001)
【非特許文献６】Sandri M. et al. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy. Cell. 117, 399-412 (2004)
【非特許文献７】Stitt T.N. et al. The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy-induced ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors. Mol. Cell. 14, 395-403 (2004)
【非特許文献８】Van Rooij E. and Olson E.N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. J. Clin. Invest. 117, 2369-2376 (2007)
【非特許文献９】Chen K. and Rajewsky N. The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs. Nature Rev. Genet. 8, 93-103 (2007)
【非特許文献１０】Chen J.F. et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation. Nature Genet. 38, 228-233 (2006)
【非特許文献１１】Rosenberg M.I. et al. MyoD inhibits Fstl1 and Utrn expression by inducing transcription of miR-206. J. Cell Biol. 175, 77-85 (2006)
【非特許文献１２】Kim H.K. et al. Muscle-specific microRNA miR-206 promotes muscle differentiation. J. Cell Biol. 174, 677-87 (2006)
【非特許文献１３】Schakman O. et al. Mechanisms of glucocorticoid-induced myopathy. J. Endocrinol. 197, 1-10 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新たな抗筋萎縮剤を提供する。また、本発明は、新たな抗筋萎縮剤のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、新たな筋萎縮の予防および治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ｍｉＲＮＡによるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子の制御をここで初めて報告し、筋可塑性におけるｍｉＲＮＡの関与を明らかにする。本発明者らは、ｍｉＲ−２３ａがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１及びＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲに結合し、その翻訳を阻害することをここで示す。さらに、筋管及び筋線維におけるｍｉＲ−２３ａの強制発現が、筋萎縮に対する耐性をもたらすことをここで示す。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる上記知見に基づくものであり、上記課題を解決するための手段は、下記のとおりである：
（１）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤を含む抗筋萎縮剤；
（２）阻害剤が、ＲＮＡ又はその類似体である上記（１）記載の抗筋萎縮剤；
（３）ＲＮＡが、ｍiＲＮＡまたはｓiＲＮＡである上記（２）の抗筋萎縮剤；
（４）ＲＮＡ又はその類似体の配列が、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列である上記（２）または（３）記載の抗筋萎縮剤；
（５）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に候補物質を接触させること、
− 前記細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの発現量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの発現量と比較して、増加した前記ｍiＲＮＡの発現量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法；
（６）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に筋萎縮誘導物質を生体外で接触させること、
− 筋萎縮誘導物質と接触させた前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量と比較して、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法；
（７）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、あるいは３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、
− 前記発現ベクターを動物細胞に生体外で導入すること、
− 前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量と比較して、減少したレポーターたんぱく質の量、あるいは減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法；
（８）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮を有する患者を３８〜１１０℃で処置することを含む、前記筋萎縮に対する予防及び／又は治療方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、筋萎縮を予防又は治療するための医薬品を提供することができる。また、本発明によれば、筋萎縮を予防又は治療するための抗筋萎縮剤をスクリーニングするための方法を提供することができる。また、本発明によれば、筋萎縮を予防又は治療するための方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ又はＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲをにおけるｍｉＲ−２３ａの推定結合部位の配列アライメントは、ｍｉＲ−２３ａの配列と相補性が高く、Human、Monkey、Mouse、Ratにおいて配列が高度に保存されていることを示す。Human、Monkey、Mouse、Ratは、それぞれのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ又はＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの配列を表す。
【図１ｂ】レポーターベクター：ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ又はｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲの構造を示す。ｍｉＲ−２３ａの機能を分析するために、ｍｉＲ−２３ａの推定結合部位を含むＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ（約３００ｂｐ）又はＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲ（約３００ｂｐ）がルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングされた。
【図１ｃ】ＨｅＬａ細胞を、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ（ＷＴ）、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔ（ミュータント）、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲΔ（ミュータント）又はｐＬｕｃ２ＥＸＮ（コントロール）のいずれかと、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ-ｍｉＲ−２３ａ又はｐＣＸｂＧ（モックベクター）のいずれかとを一緒に、コトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定した（ｎ＝６）。値（相対変化）は、モックベクターをコトランスフェクションした場合のルシフェラーゼ活性に対する相対値で示される。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧ（モック）によるコトランスフェクションを示す。「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１」における「ＷＴ」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲによるコトランスフェクションを示す。「ミュータント」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔによるコトランスフェクションを示す。「ＭｕＲＦ１」における「ＷＴ」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲによるコトランスフェクションを示す。「ミュータント」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１−１ ３’ＵＴＲΔによるコトランスフェクションを示す。「コントロール」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮによるコトランスフェクションを示す。
【図１ｄ】ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＭｕＲＦ１発現ベクターの構築。ａｔｒｏｇｉｎ−１のＯＲＦとａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲをＦＬＡＧの下流にサブクローニングした。同様に、ＭｕＲＦ１のＯＲＦとＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲをＦＬＡＧの下流にサブクローニングした。
【図１ｅ】ＨｅＬａ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＭｕＲＦ１、又はｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｐ３８βのいずれかと、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ-ｍｉＲ−２３ａ又はｐＣＸｂＧのいずれかとを一緒に、コトランスフェクションした。ＨｅＬａ細胞は回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに溶解し、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、たんぱく質をニトロセルロース膜に移し抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。１次抗体には、抗ＦＬＡＧ抗体（F7425, SIGMA）または抗γーチューブリン抗体（AK-15, SIGMA）を用い、２次抗体にはHRP標識抗ウサギIgG抗体（Amasham）を用い、検出にはECL発光試薬（Amasham）を用いた。ウエスタンブロットを用いて、ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＭｕＲＦ１発現を抗ＦＬＡＧ抗体によって測定した結果、ｍｉＲ−２３ａの発現によってこれらのタンパク発現が阻害された。「ａｔｒｏｇｉｎ−１」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１でコトランスフェクションしたことを示す。「ＭｕＲＦ１」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＭｕＲＦ１でコトランスフェクションしたことを示す。「ａｔｒｏｇｉｎ−１」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１でコトランスフェクションしたことを示す。「ｐ３８β」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｐ３８βでコトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧ（モック）によるコトランスフェクションを示す。「α−ＦＬＡＧ」は、抗ＦＬＡＧ抗体と反応させたことを示す。「α−γーチューブリン」は、抗γーチューブリン抗体と反応させたことを示す。
【図２ａ】ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧをＣ２Ｃ１２細胞内にトランスフェクションし、筋管形成を誘導した。１０μＭのデキサメタゾン処理有りまたは無しにおける、筋管直径を測定した（ｎ＞５０）。「コントロール」は、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）処理がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）処理があることを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧでトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。値（相対変化）は、ｐＣＸｂＧをトランスフェクションし、デキサメタゾン処理しなかった場合の筋管直径を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図２ｂ】ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧをＣ２Ｃ１２細胞内にトランスフェクションし、筋管形成を誘導した。１０μＭのデキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）有りまたは無しにおける、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＭｕＲＦ１のｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いることによって定量した（ｎ＝６）。「−」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「＋」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧでトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。値（相対変化）は、ｐＣＸｂＧをトランスフェクションし、デキサメタゾン処理しなかった場合のＰＣＲ産物のバンドの強度を１．０としたときの相対値で表わされる。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図３】ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターの有無による速筋線維（ＭＨＣ２ｂ）の断面積を測定した。ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ又はｐＣＸｂＧを電気パルス介在遺伝子導入によってＴＡ筋内にトランスフェクションした。「ＣＳＡ」は、マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂモノクローナル抗体で染色された面積（μｍ２）を表す。「−」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「＋」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧでトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図４ａ】Ｃ２Ｃ１２における、熱ストレス誘導性ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量を、デキサメタゾン処理有りまたは無しにおいてＲＴーＰＣＲよって定量した（ｎ＝６）。「−」は、熱ストレス処理がないことを示す。「＋」は、熱ストレス処理があることを示す。「コントロール」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。値（相対変化）は、熱ストレス処理がなく、デキサメタゾン処理がなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。ＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量は、熱ストレスの有無によって大きく変化しないことが認められる。
【図４ｂ】ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンス（配列番号１６）ＬＮＡをＣ２Ｃ１２にトランスフェクション後、筋管形成を誘導した。筋管を３０分間水浴（４２℃）に置くことで熱ストレスに曝した。熱ストレス処理後インビトロで筋萎縮を誘導するために培地を１０μＭのＤｅｘを含むＤＭに交換し１２時間培養した。筋管の核をヘキスト３３３４２及び細胞質をtracker green fluorescentで染色し、筋管の直径（μｍ）を測定した。「熱ストレス（−）」は、熱ストレス処理がないことを示す。「熱ストレス（＋）」は、熱ストレス処理があることを示す。「Ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ」は、ｍｉＲ−２３ａのアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがあることを示す。「モック」は、アンチセンスＬＮＡの代わりにｐＣＸｂＧをトランスフェクションしたことを示す。「コントロール」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。熱ストレス処理による萎縮に対する耐性（デキサメタゾン処理有り、熱ストレス処理有りおよびＡｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ無し）が、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡの存在により弱められていることがわかる（デキサメタゾン処理有り、熱ストレス処理有りおよびＡｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ有り）。
【図４ｃ】熱ストレス処理の有無におけるＣ２Ｃ１２のｍｉＲ−２３ａの発現を、リアルタイムＰＣＲを用いることによって定量した（ｎ＝６）。「−」は、熱ストレス処理がないことを示す。「＋」は、熱ストレス処理があることを示す。値（相対変化）は、熱ストレス処理しなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。熱ストレスによるＣ２Ｃ１２におけるｍｉＲ−２３ａの増加が認められる。
【図４ｄ】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖し足底筋肉重量を測定した。「ＢＷ（ｇ）」は、マウスの体重を表す。「ＭＷ（ｍｇ）」は、足底筋重量を表す。「コントロール」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理の両方がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「Ｈ／Ｄｅｘ」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理があることを示す。＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図４ｅ】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖後足底筋のＯＣＴ包埋切片を作製し、速筋線維（ＭＨＣ２ｂ）の断面積を測定した。「ＣＳＡ」は、マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂモノクローナル抗体で染色された面積（μｍ２）を表す。「コントロール」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理の両方がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「Ｈ／Ｄｅｘ」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理があることを示す。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図４ｆ】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖後足底筋におけるｍｉＲ−２３ａの発現をリアルタイムＰＣＲによって定量した（ｎ＝６）。値（相対変化）は、熱ストレス処理をせず、デキサメタゾン処理もしなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。「コントロール」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理の両方がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「Ｈ／Ｄｅｘ」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理があることを示す。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図５】ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａとｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡをＣ２Ｃ１２にコトランスフェクションし、ｍｉＲ−２３ａの発現を、リアルタイムＰＣＲを用いることによって定量した（ｎ＝６）。「ｍｉＲ−２３ａベクター」の「−」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａのトランスフェクションがないことを示す。「＋」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａのトランスフェクションがあることを示す。「Ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ」の「−」は、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがないことを示す。「＋」は、ｍｉＲ−２３ａのアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがあることを示す。値（相対変化）は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａのトランスフェクションがなく、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。アンチセンスＬＮＡによるｍｉＲ−２３ａの産生の阻害が認められる。
【図６】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖後足底筋におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲによって定量した（ｎ＝６）。「Ｄｅｘ」の「−」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「＋」は、デキサメタゾン処理があることを示す。は、デキサメタゾン処理があることを示す。「熱ストレス」の「−」は、熱ストレス処理がないことを示す。「＋」は、熱ストレス処理があることを示す。値（相対変化）は、熱ストレス処理がなく、デキサメタゾン処理がなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量は、熱ストレスによって減少しないことが認められる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子」とは、Ｆ−ｂｏｘたんぱく質ファミリーのメンバーであるＦＢＸＯ３２たんぱく質をコードする遺伝子を意味し、そのゲノム遺伝子、ｍＲＮＡの塩基配列およびたんぱく質のアミノ酸配列は、例えば、マウスについてはgenbankのNM_026346に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_058229に開示されている。しかし、生物種は、これらに限定されず、マウスおよびヒトのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子に相当する他の生物のＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子も含まれる。また、マウスまたはヒトのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子の塩基配列またはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質のアミノ酸配列に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入、置換を有する変異体も含まれる。また、マウスまたはヒトのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子またはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質に相当する他の生物のＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子またはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有する変異体も含まれる。
【００１６】
本発明における「Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」とは、ＲＩＮＧジンガーフィンガーたんぱく質ファミリーのメンバーであるＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質をコードする遺伝子を意味し、そのゲノム遺伝子、ｍＲＮＡの塩基配列およびたんぱく質のアミノ酸配列は、例えば、マウスについてはgenbankにNM_001039048に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_032588に開示されている。しかし、生物種は、これらに限定されず、マウスおよびヒトのＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子に相当する他の生物のＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子も含まれる。また、マウスまたはヒトのＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の塩基配列またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質のアミノ酸配列に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有する変異体も含まれる。また、マウスまたはヒトのＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質に相当する他の生物のＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有する変異体も含まれる。
【００１７】
本発明における「発現」とは、ゲノム遺伝子からｍＲＮＡ（messenger RNA）への転写および／またはｍＲＮＡからたんぱく質への翻訳を意味する。そして、発現の阻害若しくは抑制とは、転写物（ｍＲＮＡ）および／または翻訳物（たんぱく質）の量が減少することを意味する。
【００１８】
本発明における「発現に対する阻害剤」は、 ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現を阻害若しくは抑制する物質であれば限定されないが、例えば、低分子化合物、核酸、たんぱく質などが挙げられる。好ましくは、ＲＮＡ又はその類似体である。類似体とは、天然のＲＮＡが有する機能を保持しながら人工的に修飾されたＲＮＡを意味し、例えば、ロックされた核酸（LNA, locked nucleic acid）などが挙げられる。ここで、ＬＮＡとは、糖の2'位と4'位を-O-CH2- で架橋しコンフォメーションを N型に固定した人工核酸を意味する。
【００１９】
ＲＮＡは、ｍiＲＮＡまたはｓiＲＮＡが好ましい。ｍiＲＮＡとは、細胞内に存在する長さ２０から２５塩基ほどの1本鎖ＲＮＡを意味し、前述のように他の遺伝子の発現の調節に関与している。また、ｓiＲＮＡ（small interfering RNA）とは、２１−２３塩基対から成る二本鎖ＲＮＡを意味し、配列特異的にｍＲＮＡを破壊することによって遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉（RNAi）に関与している。
【００２０】
本発明における「配列番号１で示される塩基配列」とは、ヒトのｍｉＲ−２３ａの塩基配列を意味する。「その類似配列」とは、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する機能を有する、配列番号１の配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列を意味する。さらに、ヒトのｍｉＲ−２３ａに相当する他の生物のｍｉＲ−２３ａの塩基配列およびその配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列も意味する。
【００２１】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤は、配列番号１で示される塩基配列若しくはその類似配列からなるｍｉＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列若しくはその類似配列を含むｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列若しくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、又は該ｍｉＲＮＡ若しくはその類似配列、該ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ若しくはその類似配列又は該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはその類似配列を含む発現ベクターであることが更に好ましい。なお、該ｍｉＲＮＡ、該ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、又は該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する際には一本鎖であるが、それ以前は一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
【００２２】
該ｍｉＲＮＡ、該ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又は該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、従来公知の手法を用いて、天然物から単離するか、化学的に合成するか、又は組換え的に産生させることにより得ることができる。
【００２３】
配列番号１で示される塩基配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ヒトのｐｒｅ−ｍｉＲ−２３ａ）としては、たとえば、5'-GGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAUUGCCAGGGAUUUCCAACCGACC-3'（配列番号２：ヒトｍｉＲ−２３ａステムループ）を挙げることができる。その類似配列には、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する機能を有する、配列番号２の配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列が含まれる。さらに、ヒトのｐｒｅ−ｍｉＲ−２３ａに相当する他の生物のｐｒｅ−ｍｉＲ−２３ａの塩基配列およびその配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列も含まれる。
【００２４】
配列番号１で示される塩基配列を含むｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ヒトのｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ）としては、たとえば、5'-CUUUCUCCCCUCCAGGUGCCAGCCUCUGGCCCCGCCCGGUGCCCCCCUCACCCCUGUGCCACGGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAUUGCCAGGGAUUUCCAACCGACCCUGAGCUCUGCCACCGAGGAUGCUGCCCGGGGACGGGGUGGCAGAGAGGCCCCGAAGCCUGU-3'
（配列番号３）を挙げることができる。その類似配列には、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する機能を有する、配列番号３の配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列が含まれる。さらに、ヒトのｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａに相当する他の生物のｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａの塩基配列およびその配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列も含まれる。
【００２５】
本発明における「動物細胞」は、動物由来であれば限定されないが、好ましくは、哺乳動物由来であり、より好ましくは、動物由来の筋細胞または筋芽細胞、特に好ましくは、哺乳動物由来の筋細胞または筋芽細胞である。
【００２６】
本発明における「筋萎縮誘導剤」は、筋萎縮を誘導する物質であれば限定されないが、例えば、低分子化合物（例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン）、たんぱく質（例えば、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質）、核酸（例えば、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子）などが挙げられる。
【００２７】
本発明における「細胞に筋萎縮誘導物質を生体外で接触させる」は、生体外で細胞と筋萎縮誘導物質を一緒に存在させて接触させることと供に、筋萎縮誘導物質が、遺伝子の場合、目的遺伝子を発現ベクターに組み込み、細胞に導入し、発現させて、遺伝子産物を産生させて接触させることも含まれる。
【００２８】
本発明における「候補物質」には、限定されないが、天然物からの抽出物、低分子化合物、たんぱく質、核酸、糖質などが挙げられる。
【００２９】
本発明における「細胞に候補物質を生体外で接触させる」には、生体外で細胞と候補物質を一緒に存在させて接触させることと供に、候補物質が、遺伝子の場合、目的遺伝子を発現ベクターに組み込み、細胞に導入し、発現させて、遺伝子産物を産生させて接触させることも含まれる。
【００３０】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量を測定すること」には、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の転写物（たとえば、メッセンジャーＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。測定方法は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。
【００３１】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量」とは、候補物質と接触させたときの細胞におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量（転写物の量及び／又は翻訳物の量）が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して減少していることを意味する。減少量は、限定されないが、好ましくは０．９倍以下、より好ましく０．５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
【００３２】
本発明における「レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を有する発現ベクターを構築すること」とは、導入された細胞においてレポーター遺伝子を発現するために、発現ベクター中のプローモーターの制御下に、レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を、レポーター遺伝子の３’末端側と３’ＵＴＲ遺伝子の５’末端側が繋がるように発現ベクターに組み込むこと、すなわち、５’「プローモーター」３’−５’「 レポーター遺伝子」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子」３’の構成を有する組み換え遺伝子を有するベクターを構築することを意味する。
【００３３】
「３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を有する発現ベクターを構築すること」とは、導入された細胞においてＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を発現するために、発現ベクター中のプローモーターの制御下に、３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を組み込むこと、すなわち、５’「プローモーター」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子」３’の構成を有する組み換え遺伝子を有するベクターを構築することを意味する。場合により、３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子は、そのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の検出を容易にするために、タグたんぱく質をコードする核酸配列と連結されていても良い。例えば、５’「プローモーター」３’−５’「タグたんぱく質をコードする核酸配列」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子」３’の構成を有する組み換え遺伝子を有するベクターを構築してもよい。
【００３４】
「３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」は、天然に見出されるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）とその３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を有する遺伝子、あるいはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）とその３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を有する遺伝子、たとえば、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｃＤＮＡまたはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｃＤＮＡであってもよいし、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のＯＲＦとその３’ＵＴＲを人工的に遺伝子組み換え技術を用いて連結した遺伝子であっても良い。。
【００３５】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）の遺伝子の配列は、例えば、マウスについてはgenbankのNM_026346に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_058229に開示されている。また、他の生物のＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲであってもよい。マウスの場合、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲは、配列番号２７：5'ggaaa tttacaaatg tgaa3' を含む配列、好ましくは、配列番号２８：5'ccgatggaaa tttacaaatg tgaattccac3' を含む配列、より好ましくは、配列番号２９：5'aat cccagcacac gacaacactt cagaaggctt ctaattggat ggctgggagt cgggacactt catttgtaaa tagtgtacat tttaagcatt ggcttgaaac tgcgggggat acgtcattga ggagacgttg gcggggaaga gatgcagttg ccgatggaaa tttacaaatg tgaattccac atgagaactg gtacagaaaa gcagaaatac tgtaaataga ctttttattt tccctaacga tttgcaagca agactataaa ggcaagaact ctatgtcagc catggaaacg gagtcctc3'を含む配列を用いることができる。
【００３６】
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）の遺伝子の配列は、例えば、マウスについてはgenbankにNM_001039048に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_032588に開示されている。また、他の生物のＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲであってもよい。マウスの場合、Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲは、配列番号３０：5'gtat gtttttaaaa tgtgat3' を含む配列、好ましくは、配列番号３１：5'attttgtat gtttttaaaa tgtgattttt gt3' を含む配列、より好ましくは、配列番号３２：5'ggaagtgtg tcttctctct gctcagagag cagggactag catagggctc cccaccactg tgtccagcag ctgctgaaac acaattggaa atgtatccaa aacgtcacag gacacttttc tacgttggtg cgaaatgaaa tattttgtat gtttttaaaa tgtgattttt gtatatactt gtatatgtat gccaatttgg tgctttttgt acgagaactt ttgtatgatc acgcctggtc attgtgtgac tggcgattgt cacaaagtgg gaaggaagcc aagacaatag agatgcctac ttcctttcct tg3'を含む配列を用いることができる。
【００３７】
タグたんぱく質には、例えば、当業者に周知のＦＬＡＧなどが挙げられる。
【００３８】
発現ベクターとは、目的遺伝子を発現させるために使用するベクターで、宿主細胞で機能するプロモーター、ターミネーターなどを含むベクターを意味し、市場より入手できる。例えば、ｐGL3コントロール（Promega）、pCX-EGFP（Clontech）、pcDNA3.1（Invitrogen）などが挙げられる。プロモーターには、CMVプロモーター、SV40プロモーター、βアクチンプロモーターなどが挙げられ、ターミネーターには、SV40 lateのβポリAシグナル、アクチンのポリAシグナル、βグロビンのポリAシグナルなどが挙げられる。レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光たんぱく質（GFP）遺伝子、EGFP遺伝子などが挙げられる。
【００３９】
「発現ベクターを動物細胞に生体外で導入すること」は、当業者に周知であるプラスミドベクターやウイルスベクターを動物細胞にトランスフェクションする方法を用いて実施することができる。
【００４０】
本発明における「レポーターたんぱく質の量を測定すること」は、レポーターたんぱく質を、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどで測定してもよいし、レポーターたんぱく質の活性を測定しても良い。例えば、レポーターたんぱく質が、ルシフェラーゼである場合、ルシフェラーゼと基質（ルシフェリン）との反応で生じる蛍光を、市販の蛍光測定装置を用いて測定してもよい。レポーターたんぱく質が、緑色蛍光たんぱく質（GFP、EGFP）である場合、GFP、EGFPの蛍光を、市販の蛍光測定装置を用いて測定してもよい。
【００４１】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を測定すること」は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質を、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどで測定してもよいし、タグたんぱく質とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質が融合されている場合は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の代わりに、タグたんぱく質をマイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどで測定してもよい。
【００４２】
本発明における「減少したレポーターたんぱく質の量」とは、候補物質と接触させたときの細胞におけるレポーターたんぱく質の量が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して減少していることを意味する。減少量は、限定されないが、好ましくは０．９倍以下、より好ましく０．５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
【００４３】
「減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量」とは、候補物質と接触させたときの細胞におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して減少していることを意味する。減少量は、限定されないが、好ましくは０．９倍以下、より好ましく０．５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
【００４４】
本発明における「配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの発現量を測定すること」には、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡを測定するだけでなく、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍiＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍiＲＮＡを測定してもよい。測定は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。
【００４５】
本発明における「増加した前記ｍiＲＮＡの発現量」とは、候補物質と接触させたときの細胞における配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍiＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍiＲＮＡの量が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して増加していることを意味する。増加量は、限定されないが、好ましくは１．１倍以上、より好ましく２．０倍以上、さらに好ましくは５．０倍以上である。
【００４６】
本発明における「筋萎縮に対するに対する阻害剤として決定すること」とは、（ｉ）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量を示した細胞に使用された候補物質を筋萎縮に対する阻害剤として選択すること、（ii）減少したレポーターたんぱく質の量、あるいは減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を示した細胞に使用された候補物質を筋萎縮に対する阻害剤として選択すること、あるいは（iii）配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍiＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍiＲＮＡの量の増加を示した細胞に使用された候補物質を、筋萎縮に対する阻害剤として選択することを意味する。
【００４７】
本発明における「抗筋萎縮剤」とは、筋萎縮、好ましくはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子若しくはたんぱく質が関与する筋萎縮を予防又は治療する薬剤を意味する。
【００４８】
本発明の抗筋萎縮剤は、さらに、必要に応じ、その他の成分を含有することができる。
【００４９】
該その他の成分としては、特に制限されることなく、目的に応じて適宜選択することができる。たとえば、医薬的に許容され得る担体を挙げることができる。
【００５０】
本発明の抗筋萎縮剤の剤型としては、特に制限はなく、たとえば、固形、液状の経口剤、注射剤などを挙げることができる。
【００５１】
本発明の抗筋萎縮剤は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１が関与する筋萎縮の予防又は治療に好適である。また、本発明の抗筋萎縮剤は、糖尿病、ガン、心筋梗塞、敗血症、不活動、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性進行性筋萎縮症に伴う骨格筋の筋萎縮からなる群より選択される筋萎縮の予防又は治療に好適である。
【００５２】
本発明の抗筋萎縮剤の投与量、投与回数及び投与時期は、特に制限されることなく、適用例に対応し、適宜選択することができる。
【００５３】
また、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮を有する患者を３８〜１１０℃、好ましくは３９〜９０℃、より好ましくは４０〜４５℃で処置して、前記筋萎縮に対する予防及び／又は治療を行うことも可能である。処置は、サウナや温浴のような全身処理であっても、局所処理であってもよく。処理時間は、火傷にならない時間であれば限定さない。
【実施例】
【００５４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
１．筋萎縮のインビトロモデル
Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）マウス骨格筋芽細胞を、２０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum、GIBCO）を含むＤＭＥＭ中でサブコンフルエントな密度に維持した。８０〜１００％のコンフルエント密度で、培地を、２％ウマ血清（ＨＳ、GIBCO）を含むＤＭＥＭ（以後、２％ＨＳを含むＤＭＥＭをＤＭと呼ぶ）に交換し、筋形成を誘導するために４日間ＤＭでインキュベーションした。８０％を越える細胞が、多核性の筋管を形成した。インビトロで筋萎縮を誘導するために、細胞を、１０μＭデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含むＤＭ中で１２時間又は２４時間インキュベーションした。この処理の後、細胞をＰＢＳ（−）を用いて回収するか又は形態分析に用いた。
【００５５】
２．筋管形態学的分析
Ｄｅｘ処理の後、筋管の核をヘキスト３３３４２（Invitorogen Co., Carlsbad, CA）で、及び細胞質をtracker green fluorescent（Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland）で染色した。培養プレート中の筋管を、ＥＭ−ＣＣＤデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics K.K., Shizuoka, Japan）付きのＩＸ７１蛍光顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）を用いて直接撮影した。５０を超える筋管の最も太い箇所の直径をAquaCosmosソフトウェアー（Hamamatsu Photonics K.K.）を用いて測定した。
ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉーｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧをトランスフェクションした細胞の場合、トランスジーンマーカーとしてのＥＧＦＰの蛍光によって、培養プレート中の筋管を直接撮影し、筋管の直径をAquaCosmosソフトウェアー（Hamamatsu Photonics K.K.）を用いて測定した。
【００５６】
３．ベクターの構築
３−１．プライマリーｍｉＲ−２３ａ発現用ベクター（ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ-ｍｉＲ−２３ａ）の構築
プライマリーｍｉＲ−２３ａ領域のプライマー：
5'-AAA GTC GAC CTT TCT CCC CTC CAG GTG C-3'（配列番号４、下線はＳａｌＩ部位を示す）及び
5'-AAG ATA TCT CGA GAC AGG CTT CGG GGC CTC TC-3'（配列番号５、下線はＥｃｏＲＶ部位を示す）
を用いてヒトゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって、配列番号３に示すプライマリーｍｉＲ−２３ａ（ｐｒｉーｍｉＲ−２３ａ）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶ部位でプラスミドｐＣＸｂＧ内に導入した。このｐＣＸｂＧは、加藤義雄（独立行政法人 産業技術総合研究所 ジーンファンクション研究センター 機能性RNA研究チーム）によりプラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰ（Okabe M. et al. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407, 313-319 (1997)）から作製され供与された。
【００５７】
３−２．レポーターベクター：ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲおよびｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△の構築
推定のｍｉＲ−２３ａ結合部位を含む、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲの約３００ｂｐのヌクレオチドフラグメントを、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（TaKaRa, Osaka, Japan）を用いるＰＣＲによってマウスのｃＤＮＡ（骨格筋由来）から増幅した。プライマー配列は、下記のとおりである。
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲのためには、
forward primer 5'-TCT CTA GAA TCC CAG CAC ACG ACA ACA CTT C-3'（配列番号６、下線はＸｂａＩ部位を示す）および
reverse primer 5'-CTC TCG AGG ACT CCG TTT CCA TGG CTG AC-3'（配列番号７、下線はＸｈｏＩ部位を示す）、または
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲのためには、
forward primer 5'-AAG AAT TCG GAA GTG TGT CTT CTC TCT GCT C-3'（配列番号８、下線はＥｃｏＲＩ部位を示す）および
reverse primer 5'-AAG AAT TCA AGG AAA GGA AGT AGG CAT CTC-3'（配列番号９、下線はＥｃｏＲＩ部位を示す）
【００５８】
増幅したフラグメントをｐＬｕｃ２ＥＸＮプラスミドのＸｂａＩ及びＸｈｏＩ部位内、またはＥｃｏＲＩ部位内にクローニングした。このｐＬｕｃ２ＥＸＮは、加藤義雄（独立行政法人 産業技術総合研究所 ジーンファンクション研究センター 機能性RNA研究チーム）によりプラスミドｐＧＬ３−コントロール（Promega Co., Madison, WI）から作製され供与された。ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△またはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△を、Akimoto T. et al. （Akimoto T. et al. Real-time imaging of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha promoter activity in skeletal muscles of living mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C790-796 (2004)）に記載したとおり、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲから部位特異的突然変異誘発によって作成した。
【００５９】
概略すると、ＰＣＲベース部位特異的突然変異誘発のために、
ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△のためには
forward primer：5'- GCC GAT GGA AAT TTA CAC ACT ATA ATT CCA CAT G-3'（配列番号１０、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）及び
reverse primer：5'- CAT GTG GAA TTA TAG TGT GTA AAT TTC CAT CGG C-3（配列番号１１、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）を用いて、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲをテンプレートに増幅をおこなった。また、
ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△のためには
forward primer：5'-GTA TGT TTT TAA AAT ACC CGT TTT GTA TAT ACT TGT ATA TG-3'（配列番号１２、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）及び
reverse primer：5'-CAT ATA CAA GTA TAT ACA AAA CGG GTA TTT TAA AAA CAT AC-3'（配列番号１３、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）を用いて、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲをテンプレートに１回目の増幅を行った後、さらに、
forward primer： 5'-GTA TGC TTT TAA CCC ACC CGT TTT GTA TAT ACT TG-3'（配列番号１４ 、突然変異したヌクレオチドに下線を付した） 及び
reverse primer：5'-CAA GTA TAT ACA AAA CGG TTG GGT TAA AAG CAT AC-3'（配列番号１５、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）
を用いて、１回目のテンプレートを鋳型に２回目の増幅を行った。
【００６０】
これらの増幅産物から、QuickExchange lightning site-directed mutagenesis kit（Stratagene）を用いて部位特異的突然変異を有するプラスミドを得た。簡単には、テンプレートのｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲを含む増幅産物またはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲにおける２回目の増幅産物をDpn Iで消化後ＤＨ−５αにトランスフォーメーションし、アンピシリン含有培地において増殖してきたＤＨ−５αから、プラスミドMidi kit（Qiagen）を用いてｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△またはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△を得た。
【００６１】
３−３．ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１発現ベクターの構築
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の翻訳のｍｉＲ−２３ａによる阻害を確認するために、ＦＬＡＧタグ化した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１発現ベクターを構築した。３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のＯＲＦをマウス骨格筋由来のｃＤＮＡからExTaq HS polymerase (TaKaRa)を用いて増幅し、TA vectors (Invitrogen)にクローニングした。クローニングのための特異的プライマーは、Ａｔｒｏｇｉｎ−１ ＯＲＦ＋３’ ＵＴＲについては、
Forward： 5'-AGG ATC CAT GCC GTT CCT TGG GCA GGA C-3'（配列番号１６、下線はＢａｍＨＩ部位を示す) および
Reverse： 5'-ACT CGA GGC TTG TTT GCC AAG AGC ATG CAT AG-3'（配列番号１７、下線はＸｈｏＩ部位を示す)、
ＭｕＲＦ１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲについては、
forward： 5'-AAG GAT CCA TGG ATT ATA AAT CTA GCC TGA TTC CTG-3'（配列番号１８、下線はＢａｍＨＩ部位を示す) および
reverse： 5'-AAG AAT TCT TTA TTT TTG AGG CAG AGT CTC TCT ATG-3'（配列番号１９、下線はＥｃｏＲＩ部位を示す)である。
【００６２】
Ａｔｒｏｇｉｎ−１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片は、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位で、そしてＭｕＲＦ１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片は、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位で、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にサブクローニングした。サブクローニング後、ｆ：ＰＧＣ−１（Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Wu Z, Puigserver P, Andersson U, Zhang C, Adelmant G, Mootha V, Troy A, Cinti S, Lowell B, Scarpulla RC, Spiegelman BM. Cell. 1999 Jul 9;98(1):115-24. Harvard Medical School, USAのBruce Spiegelmanから贈与された）からＢａｍＨＩ部位で切り出したＦＬＡＧ−ｔａｇを含むＤＮＡ断片を、Ａｔｒｏｇｉｎ−１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片またはＭｕＲＦ１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片の上流にＢａｍＨＩ部位で挿入した。
【００６３】
４．トランスフェクション
Ｃ２Ｃ１２をトランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。細胞を、１μｇの各ベクター（ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧ）および／又は５０ｎｇのｍｉＲ−２３ａのアンチセンスであるロックされた核酸（locked nucleic acid, ＬＮＡ）：5'-GGA AAU CCC UGG CAA UGU GAU-3'（配列番号２６、下線はロックされた位置を示す）と、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を含む無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。６時間インキュベーション後に、培地をＦＢＳを含む培地と交換した。
【００６４】
５．レポーターアッセイ
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。細胞を０．１μｇのベクター（ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲΔ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＭｕＲＦ１またはｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｐ３８β）、及び、１．８μｇのｐＣＸｂＧ−ｍｉＲ−２３ａもしくはｐＣＸｂＧ、およびリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega Co.）を用いて測定した。
【００６５】
６．ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡ分析
製造者のプロトコールにしたがって、全ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ（WAKO, Osaka, Japan）を用いることによってＣ２Ｃ１２細胞または筋肉組織から抽出し、１０μｇのＲＮＡを、SuperScriptIII（Invitrogen）逆転写（ＲＴ）に付した。オリゴｄＴプライマー（Invitrogen）をｃＤＮＡを作成するために用いた。反応液を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間そして８５℃で５分間インキュベーションした。アリコートのＲＴ反応産物をＥｘ Ｔａｑ ＨＳ（TaKaRa, Osaka, Japan）及びＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子特異的プライマー（fasmacで合成）を用いてＰＣＲ（ABI, 9600）に直接用いた。ＰＣＲ反応（１０μｌ）を行った。各１０μｌ反応混合液は、２μｌの希釈したＲＴ産物を含んだ。反応液を９５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で３０秒及び６０℃で３０秒、７２℃で６０秒を２５サイクルさせた。ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子特異的プライマー配列は、下記のとおりである。増幅産物は、0.5 μg/mlのエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、ＤＮＡバンドの蛍光強度をルミノイメージアナライザー（LAS-3000，FUJI Film）を用いて測定した。
【００６６】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１：
5'-GGG AGG CAA TGT CTG TGT TT-3'（配列番号２０）及び
5'-TTG TGA AAA AGT CCC GGT TC-3'（配列番号２１）
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１：
5'-ACC GAG TGC AGA CGA TCA TCT C-3'（配列番号２２）及び
5'-AAA GTC AAT GGC CCT CAA GGC-3'（配列番号２３）
ＧＡＰＤＨ：
5'-GTG GCA AAG TGG AGA TTG TTG CC-3'（配列番号２４）及び
5'-GAT GAT GAC CCG TTT GGC TCC-3'（配列番号２５）
ＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
【００６７】
７．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２３ａ）分析
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, Foster City, CA）及びTaqMan MicroRNA assays has-miR-23a（#4373074,Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２３ａ）の発現を定量した。ｍｉＲＮＡ定量において、各逆転写（ＲＴ）反応液は、１０ｎｇの精製全ＲＮＡを含んだ。このＲＴ反応液を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間そして８５℃で５分間インキュベーションした。各ｍｉＲＮＡ（１０μｌ）のリアルタイムＰＣＲ反応液をトリプリケートで行った。各１０μｌ反応混合液は、２μｌの希釈したＲＴ産物を含んだ。反応液を９６ウェルプレート中でApplied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systemで、９５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクルさせた。内部標準は同様にキットに付属のβアクチンを使用した。
【００６８】
８．動物実験
成体（８週齢）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Clea Japan , Inc., Tokyo, Japan）を温度制御施設（２１℃）で１２時間明期／１２時間暗期サイクルで飼育し、水と餌は、自由に摂取させた。骨格筋萎縮を誘導するために、１ｍｇＤｅｘ／ｋｇ体重を７日間腹腔内投与した。Ｄｅｘ処理の後、動物を屠殺し、筋肉を適当なバッファー（例えば、ＰＢＳ（−））に回収するか又はＯＣＴ化合物に包埋した。この動物プロトコールは、東京大学及び早稲田大学の動物実験委員会によって承認されている。
【００６９】
９．マウス骨格筋の免疫組織化学
抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）２ｂ（ＢＦ−Ｆ３）モノクローナル抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA）をマウス骨格筋からのＯＣＴ包埋切片（10μメートル）の断面の免疫染色の一次抗体として用いた（Schiaffino S. et al., Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J. Muscle Res. Cell Motil. 10, 197-205 (1989)）。筋線維の形状は、マウス抗ジストロフィン抗体（D8043, Sigma. St. Louis. MO）とＦＩＴＣ結合二次抗体を用いて確認した。切片の断面を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）で透過処理し、そして一次抗体（マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂ（ＢＦ−Ｆ３）モノクローナル抗体）と一緒に一晩インキュベーション（4℃）した。二次抗体は、ＭＨＣ２ｂについてはＲ−ＰＥ結合抗マウスＩｇＭであった。最後に、カバースリップをＶＡＣＴＡ ＳＨＩＥＬＤ（Vector Laboratories, Ltd., Burlingame, CA）で封入した。マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂモノクローナル抗体で染色された面積をＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで測定した（Hamamatsu Photonics K.K.）。
【００７０】
１０．電気パルスによる遺伝子導入
電気パルスによる遺伝子導入を、Akimono T. et al（Akimono T. et al (2004)）に記載されたとおりに行った。簡略には、両前脛骨（ＴＡ）筋に麻酔下（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ペントバルビタールナトリウム）で２０μｇのプラスミドＤＮＡをインジェクションした。インジェクションの後１分以内に、モデル５３２ ２ニードルアレイ（BTX Instrument Divisoin Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA）によりＳＥＮ−３４０１電気刺激器（Nihon Kohden, Tokyo, Japan）を用いてインジェクションされたＴＡ筋に電場を与えた。持続期間１００ｍｓ、周波数１Ｈｚ、振幅１００Ｖ（２００Ｖ／ｃｍ）で、ＴＡ筋の内側側面及び外側側面にニードルアレイを設置することによって、８回のパルスを筋肉に適用し、電場を筋線維の長軸に対して垂直にした。このマウスをデキサメタゾン注射前に４日間回復させた。
【００７１】
１１．熱ストレス処理
インビトロ研究については、Ｃ２Ｃ１２筋管を３０分間水浴（４２℃）に置くことで熱ストレスを与えた。熱ストレス後インビトロで筋萎縮を誘導するために培地を１０μＭＤｅｘを含むＤＭに交換し１２時間培養した。インビボ研究については、マウスを１時間４２℃に置くことで熱ストレスに曝した。熱ストレス処理の２４時間後に１ｍｇＤｅｘ／ｋｇ体重を腹腔内に投与し骨格筋萎縮を誘導した。Ｄｅｘは１日１回で７日間投与した。
【００７２】
１２．統計解析
データを平均±平均の標準誤差で表した。統計的有意（ｐ＜０．０５）をスチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡ、さらに、それぞれ、二群又は多群間比較ダンネット検定によって決定した。
【００７３】
結果
ｍｉＲ−２３ａは、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用した。
バイオインフォマティックス分析（Human miRNA targets（http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/）及びMIRBASE Targets（http://microrna.sanger.ac.uk/targets/））では、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲにおける推定のｍｉＲ−２３ａ結合部位がヒト及びマウスを含む哺乳動物において高く保存されていることが明らかとなった（図１ａ）。
【００７４】
ｍｉＲ−２３ａ及びＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の機能的相互作用を調べるために、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲをルシフェラーゼレポーターベクターの下流にサブクローニングした（図１ｂ）。ｍｉＲ−２３ａ過剰発現ベクター（ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ）及びレポーターベクター（ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ）をＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの２４時間後に測定した。また、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲのｍｉＲ−２３ａの想定結合部位に突然変異を有するレポーターベクター（ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△）を構築し、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲと同様にコトランスフェクションした。
【００７５】
予測されたとおり、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ（図１ｃにおけるＷＴ）からのルシフェラーゼ活性は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターと一緒にコトランスフェクションしたときに明らかに減少した（図１ｃのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のＷＴにおけるｍｉＲ−２３ａ）が、突然変異ベクターからのルシフェラーゼ活性は、減少しなかった（図１ｃのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のミュータントにおけるｍｉＲ−２３ａ）。同様に、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ（図１ｃにおけるＷＴ）からのルシフェラーゼ活性は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターと一緒にコトランスフェクションしたときに明らかに減少した（図１ｃのＭｕＲＦ１のＷＴにおけるｍｉＲ−２３ａ）が、突然変異ベクターからのルシフェラーゼ活性は、減少しなかった（図１ｃのＭｕＲＦ１のミュータントにおけるｍｉＲ−２３ａ）。これは、ｍｉＲ−２３ａがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＭｕＲＦ１の ｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用し、その発現を下方制御したことを示す。また、ｍｉＲ−２３ａは、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１よりＭｕＲＦ１の方をより強く発現抑制することがわかった。以上のことから、ｍｉＲ−２３ａがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用し、その発現を下方制御したことがわかった。
【００７６】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕＲＦ１の発現の下方制御がｍｉＲ−２３ａによる翻訳の阻害であることを確認するために、３’ＵＴＲを含むＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のＯＲＦをＦＬＡＧの下流にサブクローニングした（図１ｄ）。
【００７７】
ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１発現ベクターとｍｉＲ−２３ａ発現ベクターを細胞にコトランスフェクションし、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウェスタンブロット法によって検出した。これらのタンパク発現が、ｍｉＲ−２３ａの発現によって阻害されたこと（図１e）から、ｍｉＲ−２３ａによるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の発現阻害が翻訳段階での阻害であることが示された。
【００７８】
ｍｉＲ−２３ａは、インビトロ及びインビボでのデキサメタゾン誘導筋萎縮に対する耐性をもたらす。
ｍｉＲ−２３ａを強制的に発現させたインビトロ筋萎縮モデルを用いることによってｍｉＲ−２３ａ機能を調べた。ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターであるｐＣＸｂＧ−ｍｉＲ−２３ａをマウスの筋芽細胞系（Ｃ２Ｃ１２）にトランスフェクションし、筋形成を誘導した。筋管を１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で２４時間処理し、その直径をトランスジーンマーカーとしてのＥＧＦＰの可視化によって測定した。モック（ｐＣＸｂＧ）のトランスフェクションをされた細胞において、筋管の直径は、デキサメタゾン処理に応じて明らかに減少した（図２ａのモックにおけるコントロールとＤｅｘの比較）。一方、ｍｉＲ−２３ａを強制発現させている筋管の直径は、デキサメタゾン処理に応じて減少することはなかった（図２ａのｍｉＲ−２３ａにおけるコントロールとＤｅｘの比較）。転写レベルでのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のデキサメタゾン誘導上方制御は、ｍｉＲ−２３ａ発現によって影響されることはないことから（図２ｂのモックにおけるＤｅｘ ＋とｍｉＲ−２３ａにおけるＤｅｘ ＋の比較）、ｍｉＲ−２３ａが転写以外のほかのメカニズムによってその機能を媒介していることがわかる。
【００７９】
さらに、電気パルス介在遺伝子導入を用い、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａをマウスの成体の両前脛骨（ＴＡ）筋内にトランスフェクションし、７日間デキサメタゾン処理（ｉ．ｐ．注射で毎日）に応じたモックトランスフェクション筋との筋横断面積を比較した。グルココルチコイドは速筋線維に選択的に筋萎縮を誘導することが知られている（van Rooij E. et al. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 l 8255-18260 (2006)）。モックトランスフェクション筋において、線維の横断面積はデキサメタゾン処理によって明らかに減少したが、ｍｉＲ−２３ａ陽性線維は、減少が見られず明らかに筋萎縮に耐性であった（図３）。これらの結果は、ｍｉＲ−２３ａ発現が、インビトロ及びインビボでの骨格筋萎縮を弱めるのに十分であることを示す。
【００８０】
ｍｉＲ−２３ａは、心筋におけるストレス応答性ｍｉＲＮＡの１つとして報告されている（Schakman O., Gilson H. & Thissen JP. Mechanisms of glucocorticoid-induced myopathy. J. Endocrinol. 197, 1-10 (2008)。よって、ｍｉＲ−２３ａは、骨格筋においてもストレスにより誘導される可能性がある。ｍｉＲ−２３ａを誘導する物理的ストレスをインビトロでスクリーニングしたところ、熱ストレスが筋芽細胞(Ｃ２Ｃ１２)においてｍｉＲ−２３ａをもっとも強く誘導することを見出した（図４c）。そして、熱ストレスが、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ｍＲＮＡの発現に影響を与えることなく（図４a）、デキサメタゾン誘導性萎縮への耐性を筋管に与えることを見出した（図４ｂ）。
【００８１】
熱ストレス誘導性ｍｉＲ−２３ａをノックダウンするために、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡをＣ２Ｃ１２にトランスフェクションした。アンチセンスＬＮＡは、選択的に相補的なｍｉＲＮＡと結合し強固な２本鎖を形成してその機能を下方制御することが報告されている（Elm J. et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic Acids Res. 36, 1153-1162 (2008)）。アンチセンスＬＮＡはｍｉＲ−２３ａ発現を下方制御した（図５）。そして、熱ストレス誘導性萎縮の耐性を弱めた（図４ｂ）。これらの結果は、ｍｉＲ−２３ａが熱ストレスにより誘導された筋萎縮に対する耐性と関係があることを示している。
【００８２】
インビトロにおける筋萎縮への熱ストレス誘導耐性の役割を確かめるために、マウスを熱ストレスに曝した後７日間デキサメタゾン処理を行った。足底筋において、筋重量の減少は熱ストレスに曝していない群と比較して熱ストレスに曝した群において顕著に少なかった（図４ｄ）。足底筋における速筋線維の断面積の測定は、繊維サイズの減少が熱ストレスに曝していない群と比較して熱ストレスに曝した群において顕著に少ないことを示していた（図４e）。デキサメタゾン誘導性ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ｍＲＮＡの発現は、熱ストレスによって影響されなかった（図４a）。培養における筋管での発見と一致して、骨格筋におけるｍｉＲ−２３ａの発現は熱ストレスに曝されたマウスにおいて顕著に上方制御されていた（図４ｆ）。これらの結果は、熱ストレス誘導性ｍｉＲ−２３ａが、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現をＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子の転写後において抑制し筋萎縮を弱めていることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、筋萎縮の予防又は治療のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
SEQUENCE LISTING
<110> The University of Tokyo
<120> Agent against muscle atrophy
<130> KP-12701
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<170> PatentIn version 3.3
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uuuccaaccg acc 73
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acggccggcu gggguuccug gggaugggau uugcuuccug ucacaaauca cauugccagg 120
gauuuccaac cgacccugag cucugccacc gaggaugcug cccggggacg ggguggcaga 180
gaggccccga agccugu 197
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cacatgagaa ctggtacaga aaagcagaaa tactgtaaat agacttttta ttttccctaa 240
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ttgtgtgact ggcgattgtc acaaagtggg aaggaagcca agacaataga gatgcctact 300
tcctttcctt g 311
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤およびそれを含む抗筋萎縮剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
成人の骨格筋は、少なくとも部分的には、タンパク質合成と分解との動的平衡による驚異的な柔軟性を有する。タンパク質合成の増加は、筋肥大をもたらし、一方、タンパク質分解の増加は、筋萎縮をもたらす。身体活動、特に筋力トレーニングの増加は、現存する筋線維の成長を特徴とする筋肥大を誘導し、多くの場合健康上の利益をもたらす。一方、種々の慢性疾患は、疾患状態を悪化させ生活の質を損なう、骨格筋萎縮をもたらす。このように、骨格筋萎縮の予防や減弱は、重要な臨床問題の一つである。
【０００３】
筋萎縮は、絶食、慢性疾患（たとえば、癌、糖尿病、ＡＩＤＳ、敗血症及び筋肉減少症）及び不活動（廃用性萎縮）に応答して生じる。これらの多様な条件下で、萎縮性の筋肉は、ユビキチン−プロテアソーム経路の活性化によって最初にタンパク質分解の促進を受け（非特許文献１）、そして一緒に「萎縮プログラム」を構成する共通する一連の転写適応が生じる（非特許文献２）。複数の骨格筋萎縮のモデルにおいて、筋特異的Ｆ−ｂｏｘタンパク質であるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１は、上方制御されており、筋タンパク質欠損の促進に不可欠と思われる（非特許文献３）。骨格筋管におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の過剰発現は、萎縮をもたらし、そして、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１欠損マウスは、種々のモデルの骨格筋萎縮に耐性である（非特許文献４，５）。
【０００４】
Sandri et al.は、クラスＯのフォークヘッドボックストランスクリプションファクター（ＦｏｘＯ）のメンバーがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の翻訳を制御することを報告している（非特許文献６）。萎縮ファクターは、ＦｏｘＯ発現を誘導し、そしてその核輸送を開始し、筋萎縮をもたらすＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１発現を高める。一方、筋肥大の主要な経路であるＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路は、ＦｏｘＯをリン酸化し、その核輸送を阻害することによって筋萎縮を予防することができる（非特許文献７）。
【０００５】
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１はリングフィンガー型のユビキチンリガーゼとして委縮筋から発見された。Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１は筋萎縮時に発現量が亢進する一方、この遺伝子を欠損したマウスでは筋萎縮に耐性を示すことが報告されており、Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１は筋タンパク質分解系において主要な役割を担っていると考えられている（非特許文献５）。
【０００６】
最近の研究では、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）として知られる小さな非コードＲＮＡが、骨格筋の分化及び形態形成を含む、多様な生物学的及び病理学的プロセスにおいて基本的な役割を奏するという、筋遺伝子制御の新たな面を明らかにした（非特許文献８）。ｍｉＲＮＡは、長さが約２２個のヌクレオチドであり、標的の３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）と相互作用することによって特定のｍＲＮＡ標的の翻訳を阻害する（非特許文献９）。ｍｉＲＮＡは、最初に、特徴的なヘアピン二次構造を有する数百から数千の長さにわたる、プライマリ−ｍｉＲＮＡ（ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ）として転写され、そしてＲＮａｓｅIII酵素であるＤｒｏｓｈａによってｍｉＲＮＡ前駆体（ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ）として切断される。次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、Ｅｘｐｏｒｔｉｎ−５によって核から搬出され、ＲＮａｓｅIII酵素であるＤｉｃｅｒによって〜２２ヌクレオチドの２本鎖の成熟ｍｉＲＮＡにプロセスされる。最後に、１本鎖の成熟ｍｉＲＮＡが、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを結合するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）内に組み込まれる。よって、特に記載がない場合は、ｍｉＲＮＡは標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲを結合する１本鎖の成熟ｍｉＲＮＡを意味する。
【０００７】
いくつかのｍｉＲＮＡは、組織特異的な様式で発現されることが報告されており、発生の間の組織の特異化におけるｍｉＲＮＡの役割が示唆される。骨格筋において、いくつかの筋特異的ｍｉＲＮＡが、筋肉の成長及び分化の調節において複数の役割を奏することが報告されている。Chen et al.は、筋特異的ｍｉＲＮＡであるｍｉＲ−１及びｍｉＲ−１３３が、それぞれ、血清応答因子（ＳＲＦ）及びヒストンデアセチラーゼ４（ＨＤＡＣ４）を下方制御し、筋分化を調節することを示した（非特許文献１０）。筋原性制御因子であるＭｙｏＤが、ｍｉＲ−２０６を誘導し、筋形成を促進することも示されてきている（非特許文献１１、１２）。これらの過去の研究は、骨格筋の発生における筋特異的ｍｉＲＮＡの重要性を明らかにする。しかし、成体における骨格筋の柔軟性に関与するｍｉＲＮＡについては、全く報告されていない。
【０００８】
本発明者らは、成体骨格筋柔軟性、特に筋萎縮におけるｍｉＲＮＡの関与を調べるために、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１と相互作用するｍｉＲＮＡを探索し、ｍｉＲ−２３ａ（配列番号１：5'-AUC ACA UUG CCA GGG AUU UCC -3'、ヒトにおける配列）がＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１と相互作用することを見出した。ｍｉＲ−２３ａは、活性化カルシニュリンＡをトランスジェニックに発現するマウスの肥大化心臓において上方制御されているｍｉＲＮＡとして既に報告されている（非特許文献１３）が、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１と相互作用すること、および筋萎縮に関与することはこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Jagoe R.T. and Goldberg A.L. What do we really know about the ubiquitln-proteasome pathway in muscle atrophy? Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 4, 183-190 (2001)
【非特許文献２】Lecker S.H. et al. Multiple types of skeletal muscle atrophy involve a common program of changes in gene expression. FASEB J. 18, 39-51 (2004)
【非特許文献３】Sacheck J.M. et al. Rapid disuse and denervation atrophy involve transcriptional changes similar to those of muscle wasting during systemic diseases. FASEB J. 21, 140-155 (2007)
【非特許文献４】Gomes M.D, et al. Atrogin-1, a muscle-specific F-box protein highly expressed during muscle atrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 14440-14445 (2001)
【非特許文献５】Bodine S.C. et al. Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy Science. 294, 1704-1708 (2001)
【非特許文献６】Sandri M. et al. Foxo transcription factors induce the atrophy-related ubiquitin ligase atrogin-1 and cause skeletal muscle atrophy. Cell. 117, 399-412 (2004)
【非特許文献７】Stitt T.N. et al. The IGF-1/PI3K/Akt pathway prevents expression of muscle atrophy-induced ubiquitin ligases by inhibiting FOXO transcription factors. Mol. Cell. 14, 395-403 (2004)
【非特許文献８】Van Rooij E. and Olson E.N. MicroRNAs: powerful new regulators of heart disease and provocative therapeutic targets. J. Clin. Invest. 117, 2369-2376 (2007)
【非特許文献９】Chen K. and Rajewsky N. The evolution of gene regulation by transcription factors and microRNAs. Nature Rev. Genet. 8, 93-103 (2007)
【非特許文献１０】Chen J.F. et al. The role of microRNA-1 and microRNA-133 in skeletal muscle proliferation and differentiation. Nature Genet. 38, 228-233 (2006)
【非特許文献１１】Rosenberg M.I. et al. MyoD inhibits Fstl1 and Utrn expression by inducing transcription of miR-206. J. Cell Biol. 175, 77-85 (2006)
【非特許文献１２】Kim H.K. et al. Muscle-specific microRNA miR-206 promotes muscle differentiation. J. Cell Biol. 174, 677-87 (2006)
【非特許文献１３】Schakman O. et al. Mechanisms of glucocorticoid-induced myopathy. J. Endocrinol. 197, 1-10 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、新たな抗筋萎縮剤を提供する。また、本発明は、新たな抗筋萎縮剤のスクリーニング方法を提供する。また、本発明は、新たな筋萎縮の予防および治療方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、ｍｉＲＮＡによるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子の制御をここで初めて報告し、筋可塑性におけるｍｉＲＮＡの関与を明らかにする。本発明者らは、ｍｉＲ−２３ａがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１及びＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲに結合し、その翻訳を阻害することをここで示す。さらに、筋管及び筋線維におけるｍｉＲ−２３ａの強制発現が、筋萎縮に対する耐性をもたらすことをここで示す。
【００１２】
本発明は、本発明者らによる上記知見に基づくものであり、上記課題を解決するための手段は、下記のとおりである：
（１）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤を含む抗筋萎縮剤；
（２）阻害剤が、ＲＮＡ又はその類似体である上記（１）記載の抗筋萎縮剤；
（３）ＲＮＡが、ｍiＲＮＡまたはｓiＲＮＡである上記（２）の抗筋萎縮剤；
（４）ＲＮＡ又はその類似体の配列が、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列である上記（２）または（３）記載の抗筋萎縮剤；
（５）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に候補物質を接触させること、
− 前記細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの発現量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの発現量と比較して、増加した前記ｍiＲＮＡの発現量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法；
（６）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に筋萎縮誘導物質を生体外で接触させること、
− 筋萎縮誘導物質と接触させた前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量と比較して、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法；
（７）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、あるいは３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、
− 前記発現ベクターを動物細胞に生体外で導入すること、
− 前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量と比較して、減少したレポーターたんぱく質の量、あるいは減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法；
（８）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮を有する患者を３８〜１１０℃で処置することを含む、前記筋萎縮に対する予防及び／又は治療方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、筋萎縮を予防又は治療するための医薬品を提供することができる。また、本発明によれば、筋萎縮を予防又は治療するための抗筋萎縮剤をスクリーニングするための方法を提供することができる。また、本発明によれば、筋萎縮を予防又は治療するための方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１ａ】ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ又はＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲをにおけるｍｉＲ−２３ａの推定結合部位の配列アライメントは、ｍｉＲ−２３ａの配列と相補性が高く、Human、Monkey、Mouse、Ratにおいて配列が高度に保存されていることを示す。Human、Monkey、Mouse、Ratは、それぞれのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ又はＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの配列を表す。
【図１ｂ】レポーターベクター：ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ又はｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲの構造を示す。ｍｉＲ−２３ａの機能を分析するために、ｍｉＲ−２３ａの推定結合部位を含むＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ（約３００ｂｐ）又はＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲ（約３００ｂｐ）がルシフェラーゼ遺伝子の下流にクローニングされた。
【図１ｃ】ＨｅＬａ細胞を、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ（ＷＴ）、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔ（ミュータント）、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲΔ（ミュータント）又はｐＬｕｃ２ＥＸＮ（コントロール）のいずれかと、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ-ｍｉＲ−２３ａ又はｐＣＸｂＧ（モックベクター）のいずれかとを一緒に、コトランスフェクションした。ルシフェラーゼ活性を測定した（ｎ＝６）。値（相対変化）は、モックベクターをコトランスフェクションした場合のルシフェラーゼ活性に対する相対値で示される。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧ（モック）によるコトランスフェクションを示す。「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１」における「ＷＴ」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲによるコトランスフェクションを示す。「ミュータント」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔによるコトランスフェクションを示す。「ＭｕＲＦ１」における「ＷＴ」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲによるコトランスフェクションを示す。「ミュータント」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１−１ ３’ＵＴＲΔによるコトランスフェクションを示す。「コントロール」は、ｐＬｕｃ２ＥＸＮによるコトランスフェクションを示す。
【図１ｄ】ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＭｕＲＦ１発現ベクターの構築。ａｔｒｏｇｉｎ−１のＯＲＦとａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲをＦＬＡＧの下流にサブクローニングした。同様に、ＭｕＲＦ１のＯＲＦとＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲをＦＬＡＧの下流にサブクローニングした。
【図１ｅ】ＨｅＬａ細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＭｕＲＦ１、又はｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｐ３８βのいずれかと、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ-ｍｉＲ−２３ａ又はｐＣＸｂＧのいずれかとを一緒に、コトランスフェクションした。ＨｅＬａ細胞は回収後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに溶解し、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。泳動終了後、たんぱく質をニトロセルロース膜に移し抗ＦＬＡＧ抗体を用いてウエスタンブロットを行った。１次抗体には、抗ＦＬＡＧ抗体（F7425, SIGMA）または抗γーチューブリン抗体（AK-15, SIGMA）を用い、２次抗体にはHRP標識抗ウサギIgG抗体（Amasham）を用い、検出にはECL発光試薬（Amasham）を用いた。ウエスタンブロットを用いて、ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＭｕＲＦ１発現を抗ＦＬＡＧ抗体によって測定した結果、ｍｉＲ−２３ａの発現によってこれらのタンパク発現が阻害された。「ａｔｒｏｇｉｎ−１」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１でコトランスフェクションしたことを示す。「ＭｕＲＦ１」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＭｕＲＦ１でコトランスフェクションしたことを示す。「ａｔｒｏｇｉｎ−１」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１でコトランスフェクションしたことを示す。「ｐ３８β」は、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｐ３８βでコトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧ（モック）によるコトランスフェクションを示す。「α−ＦＬＡＧ」は、抗ＦＬＡＧ抗体と反応させたことを示す。「α−γーチューブリン」は、抗γーチューブリン抗体と反応させたことを示す。
【図２ａ】ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧをＣ２Ｃ１２細胞内にトランスフェクションし、筋管形成を誘導した。１０μＭのデキサメタゾン処理有りまたは無しにおける、筋管直径を測定した（ｎ＞５０）。「コントロール」は、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）処理がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）処理があることを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧでトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。値（相対変化）は、ｐＣＸｂＧをトランスフェクションし、デキサメタゾン処理しなかった場合の筋管直径を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図２ｂ】ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧをＣ２Ｃ１２細胞内にトランスフェクションし、筋管形成を誘導した。１０μＭのデキサメタゾン処理（Ｄｅｘ）有りまたは無しにおける、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＭｕＲＦ１のｍＲＮＡ発現を、ＲＴ−ＰＣＲを用いることによって定量した（ｎ＝６）。「−」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「＋」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧでトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。値（相対変化）は、ｐＣＸｂＧをトランスフェクションし、デキサメタゾン処理しなかった場合のＰＣＲ産物のバンドの強度を１．０としたときの相対値で表わされる。＊は、Ｐ＜０．０５であり、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図３】ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターの有無による速筋線維（ＭＨＣ２ｂ）の断面積を測定した。ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ又はｐＣＸｂＧを電気パルス介在遺伝子導入によってＴＡ筋内にトランスフェクションした。「ＣＳＡ」は、マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂモノクローナル抗体で染色された面積（μｍ２）を表す。「−」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「＋」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「モック」は、ｐＣＸｂＧでトランスフェクションしたことを示す。「ｍｉＲ−２３ａ」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａでトランスフェクションしたことを示す。＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図４ａ】Ｃ２Ｃ１２における、熱ストレス誘導性ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量を、デキサメタゾン処理有りまたは無しにおいてＲＴーＰＣＲよって定量した（ｎ＝６）。「−」は、熱ストレス処理がないことを示す。「＋」は、熱ストレス処理があることを示す。「コントロール」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。値（相対変化）は、熱ストレス処理がなく、デキサメタゾン処理がなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。ＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量は、熱ストレスの有無によって大きく変化しないことが認められる。
【図４ｂ】ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンス（配列番号１６）ＬＮＡをＣ２Ｃ１２にトランスフェクション後、筋管形成を誘導した。筋管を３０分間水浴（４２℃）に置くことで熱ストレスに曝した。熱ストレス処理後インビトロで筋萎縮を誘導するために培地を１０μＭのＤｅｘを含むＤＭに交換し１２時間培養した。筋管の核をヘキスト３３３４２及び細胞質をtracker green fluorescentで染色し、筋管の直径（μｍ）を測定した。「熱ストレス（−）」は、熱ストレス処理がないことを示す。「熱ストレス（＋）」は、熱ストレス処理があることを示す。「Ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ」は、ｍｉＲ−２３ａのアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがあることを示す。「モック」は、アンチセンスＬＮＡの代わりにｐＣＸｂＧをトランスフェクションしたことを示す。「コントロール」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。熱ストレス処理による萎縮に対する耐性（デキサメタゾン処理有り、熱ストレス処理有りおよびＡｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ無し）が、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡの存在により弱められていることがわかる（デキサメタゾン処理有り、熱ストレス処理有りおよびＡｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ有り）。
【図４ｃ】熱ストレス処理の有無におけるＣ２Ｃ１２のｍｉＲ−２３ａの発現を、リアルタイムＰＣＲを用いることによって定量した（ｎ＝６）。「−」は、熱ストレス処理がないことを示す。「＋」は、熱ストレス処理があることを示す。値（相対変化）は、熱ストレス処理しなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。熱ストレスによるＣ２Ｃ１２におけるｍｉＲ−２３ａの増加が認められる。
【図４ｄ】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖し足底筋肉重量を測定した。「ＢＷ（ｇ）」は、マウスの体重を表す。「ＭＷ（ｍｇ）」は、足底筋重量を表す。「コントロール」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理の両方がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「Ｈ／Ｄｅｘ」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理があることを示す。＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図４ｅ】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖後足底筋のＯＣＴ包埋切片を作製し、速筋線維（ＭＨＣ２ｂ）の断面積を測定した。「ＣＳＡ」は、マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂモノクローナル抗体で染色された面積（μｍ２）を表す。「コントロール」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理の両方がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「Ｈ／Ｄｅｘ」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理があることを示す。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図４ｆ】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖後足底筋におけるｍｉＲ−２３ａの発現をリアルタイムＰＣＲによって定量した（ｎ＝６）。値（相対変化）は、熱ストレス処理をせず、デキサメタゾン処理もしなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。「コントロール」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理の両方がないことを示す。「Ｄｅｘ」は、デキサメタゾン処理があることを示す。「Ｈ／Ｄｅｘ」は、熱ストレス処理とデキサメタゾン処理があることを示す。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。
【図５】ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａとｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡをＣ２Ｃ１２にコトランスフェクションし、ｍｉＲ−２３ａの発現を、リアルタイムＰＣＲを用いることによって定量した（ｎ＝６）。「ｍｉＲ−２３ａベクター」の「−」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａのトランスフェクションがないことを示す。「＋」は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａのトランスフェクションがあることを示す。「Ａｎｔｉ−ｍｉＲ−２３ａ」の「−」は、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがないことを示す。「＋」は、ｍｉＲ−２３ａのアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがあることを示す。値（相対変化）は、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａのトランスフェクションがなく、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡのトランスフェクションがなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。アンチセンスＬＮＡによるｍｉＲ−２３ａの産生の阻害が認められる。
【図６】熱ストレスに曝した２４時間後マウスに７日間デキサメタゾンを投与した。そして、解剖後足底筋におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ｍＲＮＡの発現をリアルタイムＰＣＲによって定量した（ｎ＝６）。「Ｄｅｘ」の「−」は、デキサメタゾン処理がないことを示す。「＋」は、デキサメタゾン処理があることを示す。は、デキサメタゾン処理があることを示す。「熱ストレス」の「−」は、熱ストレス処理がないことを示す。「＋」は、熱ストレス処理があることを示す。値（相対変化）は、熱ストレス処理がなく、デキサメタゾン処理がなかった場合の蛍光値を１．０としたときの相対値で表わされる。＊＊は、Ｐ＜０．００１である。エラーバーは、±ＳＥＭを意味する。ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｍＲＮＡの発現量は、熱ストレスによって減少しないことが認められる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子」とは、Ｆ−ｂｏｘたんぱく質ファミリーのメンバーであるＦＢＸＯ３２たんぱく質をコードする遺伝子を意味し、そのゲノム遺伝子、ｍＲＮＡの塩基配列およびたんぱく質のアミノ酸配列は、例えば、マウスについてはgenbankのNM_026346に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_058229に開示されている。しかし、生物種は、これらに限定されず、マウスおよびヒトのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子に相当する他の生物のＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子も含まれる。また、マウスまたはヒトのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子の塩基配列またはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質のアミノ酸配列に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入、置換を有する変異体も含まれる。また、マウスまたはヒトのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子またはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質に相当する他の生物のＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子またはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有する変異体も含まれる。
【００１６】
本発明における「Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」とは、ＲＩＮＧジンガーフィンガーたんぱく質ファミリーのメンバーであるＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質をコードする遺伝子を意味し、そのゲノム遺伝子、ｍＲＮＡの塩基配列およびたんぱく質のアミノ酸配列は、例えば、マウスについてはgenbankにNM_001039048に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_032588に開示されている。しかし、生物種は、これらに限定されず、マウスおよびヒトのＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子に相当する他の生物のＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子も含まれる。また、マウスまたはヒトのＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の塩基配列またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質のアミノ酸配列に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有する変異体も含まれる。また、マウスまたはヒトのＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質に相当する他の生物のＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質に１個または数個の塩基またはアミノ酸の欠失、挿入および／または置換を有する変異体も含まれる。
【００１７】
本発明における「発現」とは、ゲノム遺伝子からｍＲＮＡ（messenger RNA）への転写および／またはｍＲＮＡからたんぱく質への翻訳を意味する。そして、発現の阻害若しくは抑制とは、転写物（ｍＲＮＡ）および／または翻訳物（たんぱく質）の量が減少することを意味する。
【００１８】
本発明における「発現に対する阻害剤」は、 ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現を阻害若しくは抑制する物質であれば限定されないが、例えば、低分子化合物、核酸、たんぱく質などが挙げられる。好ましくは、ＲＮＡ又はその類似体である。類似体とは、天然のＲＮＡが有する機能を保持しながら人工的に修飾されたＲＮＡを意味し、例えば、ロックされた核酸（LNA, locked nucleic acid）などが挙げられる。ここで、ＬＮＡとは、糖の2'位と4'位を-O-CH2- で架橋しコンフォメーションを N型に固定した人工核酸を意味する。
【００１９】
ＲＮＡは、ｍiＲＮＡまたはｓiＲＮＡが好ましい。ｍiＲＮＡとは、細胞内に存在する長さ２０から２５塩基ほどの1本鎖ＲＮＡを意味し、前述のように他の遺伝子の発現の調節に関与している。また、ｓiＲＮＡ（small interfering RNA）とは、２１−２３塩基対から成る二本鎖ＲＮＡを意味し、配列特異的にｍＲＮＡを破壊することによって遺伝子の発現を抑制するＲＮＡ干渉（RNAi）に関与している。
【００２０】
本発明における「配列番号１で示される塩基配列」とは、ヒトのｍｉＲ−２３ａの塩基配列を意味する。「その類似配列」とは、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する機能を有する、配列番号１の配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列を意味する。さらに、ヒトのｍｉＲ−２３ａに相当する他の生物のｍｉＲ−２３ａの塩基配列およびその配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列も意味する。
【００２１】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤は、配列番号１で示される塩基配列若しくはその類似配列からなるｍｉＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列若しくはその類似配列を含むｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列若しくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、又は該ｍｉＲＮＡ若しくはその類似配列、該ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ若しくはその類似配列又は該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ若しくはその類似配列を含む発現ベクターであることが更に好ましい。なお、該ｍｉＲＮＡ、該ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、又は該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合する際には一本鎖であるが、それ以前は一本鎖であってもよいし、二本鎖であってもよい。
【００２２】
該ｍｉＲＮＡ、該ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ又は該ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡは、従来公知の手法を用いて、天然物から単離するか、化学的に合成するか、又は組換え的に産生させることにより得ることができる。
【００２３】
配列番号１で示される塩基配列を含むｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ（ヒトのｐｒｅ−ｍｉＲ−２３ａ）としては、たとえば、5'-GGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAUUGCCAGGGAUUUCCAACCGACC-3'（配列番号２：ヒトｍｉＲ−２３ａステムループ）を挙げることができる。その類似配列には、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する機能を有する、配列番号２の配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列が含まれる。さらに、ヒトのｐｒｅ−ｍｉＲ−２３ａに相当する他の生物のｐｒｅ−ｍｉＲ−２３ａの塩基配列およびその配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列も含まれる。
【００２４】
配列番号１で示される塩基配列を含むｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ（ヒトのｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ）としては、たとえば、5'-CUUUCUCCCCUCCAGGUGCCAGCCUCUGGCCCCGCCCGGUGCCCCCCUCACCCCUGUGCCACGGCCGGCUGGGGUUCCUGGGGAUGGGAUUUGCUUCCUGUCACAAAUCACAUUGCCAGGGAUUUCCAACCGACCCUGAGCUCUGCCACCGAGGAUGCUGCCCGGGGACGGGGUGGCAGAGAGGCCCCGAAGCCUGU-3'
（配列番号３）を挙げることができる。その類似配列には、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲに結合して翻訳を阻害する機能を有する、配列番号３の配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列が含まれる。さらに、ヒトのｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａに相当する他の生物のｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａの塩基配列およびその配列に１個または数個の塩基の欠失、挿入および／または置換を有する配列も含まれる。
【００２５】
本発明における「動物細胞」は、動物由来であれば限定されないが、好ましくは、哺乳動物由来であり、より好ましくは、動物由来の筋細胞または筋芽細胞、特に好ましくは、哺乳動物由来の筋細胞または筋芽細胞である。
【００２６】
本発明における「筋萎縮誘導剤」は、筋萎縮を誘導する物質であれば限定されないが、例えば、低分子化合物（例えば、グルココルチコイド、デキサメタゾン）、たんぱく質（例えば、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質）、核酸（例えば、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子）などが挙げられる。
【００２７】
本発明における「細胞に筋萎縮誘導物質を生体外で接触させる」は、生体外で細胞と筋萎縮誘導物質を一緒に存在させて接触させることと供に、筋萎縮誘導物質が、遺伝子の場合、目的遺伝子を発現ベクターに組み込み、細胞に導入し、発現させて、遺伝子産物を産生させて接触させることも含まれる。
【００２８】
本発明における「候補物質」には、限定されないが、天然物からの抽出物、低分子化合物、たんぱく質、核酸、糖質などが挙げられる。
【００２９】
本発明における「細胞に候補物質を生体外で接触させる」には、生体外で細胞と候補物質を一緒に存在させて接触させることと供に、候補物質が、遺伝子の場合、目的遺伝子を発現ベクターに組み込み、細胞に導入し、発現させて、遺伝子産物を産生させて接触させることも含まれる。
【００３０】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量を測定すること」には、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の転写物（たとえば、メッセンジャーＲＮＡ）及び／又は翻訳物（例えば、たんぱく質）を測定すること意味する。測定方法は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。
【００３１】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量」とは、候補物質と接触させたときの細胞におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量（転写物の量及び／又は翻訳物の量）が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して減少していることを意味する。減少量は、限定されないが、好ましくは０．９倍以下、より好ましく０．５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
【００３２】
本発明における「レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を有する発現ベクターを構築すること」とは、導入された細胞においてレポーター遺伝子を発現するために、発現ベクター中のプローモーターの制御下に、レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を、レポーター遺伝子の３’末端側と３’ＵＴＲ遺伝子の５’末端側が繋がるように発現ベクターに組み込むこと、すなわち、５’「プローモーター」３’−５’「 レポーター遺伝子」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子」３’の構成を有する組み換え遺伝子を有するベクターを構築することを意味する。
【００３３】
「３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を有する発現ベクターを構築すること」とは、導入された細胞においてＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を発現するために、発現ベクター中のプローモーターの制御下に、３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を組み込むこと、すなわち、５’「プローモーター」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子」３’の構成を有する組み換え遺伝子を有するベクターを構築することを意味する。場合により、３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子は、そのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の検出を容易にするために、タグたんぱく質をコードする核酸配列と連結されていても良い。例えば、５’「プローモーター」３’−５’「タグたんぱく質をコードする核酸配列」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」３’−５’「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子」３’の構成を有する組み換え遺伝子を有するベクターを構築してもよい。
【００３４】
「３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子」は、天然に見出されるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）とその３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を有する遺伝子、あるいはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子のＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）とその３’ＵＴＲ（非翻訳領域）を有する遺伝子、たとえば、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のｃＤＮＡまたはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｃＤＮＡであってもよいし、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のＯＲＦとその３’ＵＴＲを人工的に遺伝子組み換え技術を用いて連結した遺伝子であっても良い。。
【００３５】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）の遺伝子の配列は、例えば、マウスについてはgenbankのNM_026346に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_058229に開示されている。また、他の生物のＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲであってもよい。マウスの場合、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲは、配列番号２７：5'ggaaa tttacaaatg tgaa3' を含む配列、好ましくは、配列番号２８：5'ccgatggaaa tttacaaatg tgaattccac3' を含む配列、より好ましくは、配列番号２９：5'aat cccagcacac gacaacactt cagaaggctt ctaattggat ggctgggagt cgggacactt catttgtaaa tagtgtacat tttaagcatt ggcttgaaac tgcgggggat acgtcattga ggagacgttg gcggggaaga gatgcagttg ccgatggaaa tttacaaatg tgaattccac atgagaactg gtacagaaaa gcagaaatac tgtaaataga ctttttattt tccctaacga tttgcaagca agactataaa ggcaagaact ctatgtcagc catggaaacg gagtcctc3'を含む配列を用いることができる。
【００３６】
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲ（非翻訳領域）の遺伝子の配列は、例えば、マウスについてはgenbankにNM_001039048に開示されており、ヒトについてはgenbankのNM_032588に開示されている。また、他の生物のＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲであってもよい。マウスの場合、Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲは、配列番号３０：5'gtat gtttttaaaa tgtgat3' を含む配列、好ましくは、配列番号３１：5'attttgtat gtttttaaaa tgtgattttt gt3' を含む配列、より好ましくは、配列番号３２：5'ggaagtgtg tcttctctct gctcagagag cagggactag catagggctc cccaccactg tgtccagcag ctgctgaaac acaattggaa atgtatccaa aacgtcacag gacacttttc tacgttggtg cgaaatgaaa tattttgtat gtttttaaaa tgtgattttt gtatatactt gtatatgtat gccaatttgg tgctttttgt acgagaactt ttgtatgatc acgcctggtc attgtgtgac tggcgattgt cacaaagtgg gaaggaagcc aagacaatag agatgcctac ttcctttcct tg3'を含む配列を用いることができる。
【００３７】
タグたんぱく質には、例えば、当業者に周知のＦＬＡＧなどが挙げられる。
【００３８】
発現ベクターとは、目的遺伝子を発現させるために使用するベクターで、宿主細胞で機能するプロモーター、ターミネーターなどを含むベクターを意味し、市場より入手できる。例えば、ｐGL3コントロール（Promega）、pCX-EGFP（Clontech）、pcDNA3.1（Invitrogen）などが挙げられる。プロモーターには、CMVプロモーター、SV40プロモーター、βアクチンプロモーターなどが挙げられ、ターミネーターには、SV40 lateのβポリAシグナル、アクチンのポリAシグナル、βグロビンのポリAシグナルなどが挙げられる。レポーター遺伝子には、ルシフェラーゼ遺伝子、緑色蛍光たんぱく質（GFP）遺伝子、EGFP遺伝子などが挙げられる。
【００３９】
「発現ベクターを動物細胞に生体外で導入すること」は、当業者に周知であるプラスミドベクターやウイルスベクターを動物細胞にトランスフェクションする方法を用いて実施することができる。
【００４０】
本発明における「レポーターたんぱく質の量を測定すること」は、レポーターたんぱく質を、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどで測定してもよいし、レポーターたんぱく質の活性を測定しても良い。例えば、レポーターたんぱく質が、ルシフェラーゼである場合、ルシフェラーゼと基質（ルシフェリン）との反応で生じる蛍光を、市販の蛍光測定装置を用いて測定してもよい。レポーターたんぱく質が、緑色蛍光たんぱく質（GFP、EGFP）である場合、GFP、EGFPの蛍光を、市販の蛍光測定装置を用いて測定してもよい。
【００４１】
本発明における「ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を測定すること」は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質を、マイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどで測定してもよいし、タグたんぱく質とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質が融合されている場合は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の代わりに、タグたんぱく質をマイクロアレイ、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどで測定してもよい。
【００４２】
本発明における「減少したレポーターたんぱく質の量」とは、候補物質と接触させたときの細胞におけるレポーターたんぱく質の量が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して減少していることを意味する。減少量は、限定されないが、好ましくは０．９倍以下、より好ましく０．５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
【００４３】
「減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量」とは、候補物質と接触させたときの細胞におけるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して減少していることを意味する。減少量は、限定されないが、好ましくは０．９倍以下、より好ましく０．５倍以下、さらに好ましくは０．１倍以下である。
【００４４】
本発明における「配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの発現量を測定すること」には、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡを測定するだけでなく、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍiＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍiＲＮＡを測定してもよい。測定は、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイなどの当業者に周知な方法を用いて測定することができる。
【００４５】
本発明における「増加した前記ｍiＲＮＡの発現量」とは、候補物質と接触させたときの細胞における配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍiＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍiＲＮＡの量が、候補物質と接触させなかったときの細胞におけるそれと比較して増加していることを意味する。増加量は、限定されないが、好ましくは１．１倍以上、より好ましく２．０倍以上、さらに好ましくは５．０倍以上である。
【００４６】
本発明における「筋萎縮に対するに対する阻害剤として決定すること」とは、（ｉ）ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量を示した細胞に使用された候補物質を筋萎縮に対する阻害剤として選択すること、（ii）減少したレポーターたんぱく質の量、あるいは減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を示した細胞に使用された候補物質を筋萎縮に対する阻害剤として選択すること、あるいは（iii）配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡ、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列を含むｐｒｅ−ｍiＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍiＲＮＡの量の増加を示した細胞に使用された候補物質を、筋萎縮に対する阻害剤として選択することを意味する。
【００４７】
本発明における「抗筋萎縮剤」とは、筋萎縮、好ましくはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子若しくはたんぱく質が関与する筋萎縮を予防又は治療する薬剤を意味する。
【００４８】
本発明の抗筋萎縮剤は、さらに、必要に応じ、その他の成分を含有することができる。
【００４９】
該その他の成分としては、特に制限されることなく、目的に応じて適宜選択することができる。たとえば、医薬的に許容され得る担体を挙げることができる。
【００５０】
本発明の抗筋萎縮剤の剤型としては、特に制限はなく、たとえば、固形、液状の経口剤、注射剤などを挙げることができる。
【００５１】
本発明の抗筋萎縮剤は、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１が関与する筋萎縮の予防又は治療に好適である。また、本発明の抗筋萎縮剤は、糖尿病、ガン、心筋梗塞、敗血症、不活動、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性進行性筋萎縮症に伴う骨格筋の筋萎縮からなる群より選択される筋萎縮の予防又は治療に好適である。
【００５２】
本発明の抗筋萎縮剤の投与量、投与回数及び投与時期は、特に制限されることなく、適用例に対応し、適宜選択することができる。
【００５３】
また、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮を有する患者を３８〜１１０℃、好ましくは３９〜９０℃、より好ましくは４０〜４５℃で処置して、前記筋萎縮に対する予防及び／又は治療を行うことも可能である。処置は、サウナや温浴のような全身処理であっても、局所処理であってもよく。処理時間は、火傷にならない時間であれば限定さない。
【実施例】
【００５４】
以下に本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
１．筋萎縮のインビトロモデル
Ｃ２Ｃ１２（ＡＴＣＣ）マウス骨格筋芽細胞を、２０％ＦＢＳ（Fetal bovine serum、GIBCO）を含むＤＭＥＭ中でサブコンフルエントな密度に維持した。８０〜１００％のコンフルエント密度で、培地を、２％ウマ血清（ＨＳ、GIBCO）を含むＤＭＥＭ（以後、２％ＨＳを含むＤＭＥＭをＤＭと呼ぶ）に交換し、筋形成を誘導するために４日間ＤＭでインキュベーションした。８０％を越える細胞が、多核性の筋管を形成した。インビトロで筋萎縮を誘導するために、細胞を、１０μＭデキサメタゾン（Ｄｅｘ）を含むＤＭ中で１２時間又は２４時間インキュベーションした。この処理の後、細胞をＰＢＳ（−）を用いて回収するか又は形態分析に用いた。
【００５５】
２．筋管形態学的分析
Ｄｅｘ処理の後、筋管の核をヘキスト３３３４２（Invitorogen Co., Carlsbad, CA）で、及び細胞質をtracker green fluorescent（Lonza Group Ltd., Basel, Switzerland）で染色した。培養プレート中の筋管を、ＥＭ−ＣＣＤデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics K.K., Shizuoka, Japan）付きのＩＸ７１蛍光顕微鏡（Olympus, Tokyo, Japan）を用いて直接撮影した。５０を超える筋管の最も太い箇所の直径をAquaCosmosソフトウェアー（Hamamatsu Photonics K.K.）を用いて測定した。
ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉーｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧをトランスフェクションした細胞の場合、トランスジーンマーカーとしてのＥＧＦＰの蛍光によって、培養プレート中の筋管を直接撮影し、筋管の直径をAquaCosmosソフトウェアー（Hamamatsu Photonics K.K.）を用いて測定した。
【００５６】
３．ベクターの構築
３−１．プライマリーｍｉＲ−２３ａ発現用ベクター（ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ-ｍｉＲ−２３ａ）の構築
プライマリーｍｉＲ−２３ａ領域のプライマー：
5'-AAA GTC GAC CTT TCT CCC CTC CAG GTG C-3'（配列番号４、下線はＳａｌＩ部位を示す）及び
5'-AAG ATA TCT CGA GAC AGG CTT CGG GGC CTC TC-3'（配列番号５、下線はＥｃｏＲＶ部位を示す）
を用いてヒトゲノムＤＮＡを用いるＰＣＲによって、配列番号３に示すプライマリーｍｉＲ−２３ａ（ｐｒｉーｍｉＲ−２３ａ）を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶで消化し、ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＶ部位でプラスミドｐＣＸｂＧ内に導入した。このｐＣＸｂＧは、加藤義雄（独立行政法人 産業技術総合研究所 ジーンファンクション研究センター 機能性RNA研究チーム）によりプラスミドｐＣＸ−ＥＧＦＰ（Okabe M. et al. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407, 313-319 (1997)）から作製され供与された。
【００５７】
３−２．レポーターベクター：ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲおよびｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△の構築
推定のｍｉＲ−２３ａ結合部位を含む、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲの約３００ｂｐのヌクレオチドフラグメントを、Ｅｘ Ｔａｑ ＨＳ（TaKaRa, Osaka, Japan）を用いるＰＣＲによってマウスのｃＤＮＡ（骨格筋由来）から増幅した。プライマー配列は、下記のとおりである。
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲのためには、
forward primer 5'-TCT CTA GAA TCC CAG CAC ACG ACA ACA CTT C-3'（配列番号６、下線はＸｂａＩ部位を示す）および
reverse primer 5'-CTC TCG AGG ACT CCG TTT CCA TGG CTG AC-3'（配列番号７、下線はＸｈｏＩ部位を示す）、または
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲのためには、
forward primer 5'-AAG AAT TCG GAA GTG TGT CTT CTC TCT GCT C-3'（配列番号８、下線はＥｃｏＲＩ部位を示す）および
reverse primer 5'-AAG AAT TCA AGG AAA GGA AGT AGG CAT CTC-3'（配列番号９、下線はＥｃｏＲＩ部位を示す）
【００５８】
増幅したフラグメントをｐＬｕｃ２ＥＸＮプラスミドのＸｂａＩ及びＸｈｏＩ部位内、またはＥｃｏＲＩ部位内にクローニングした。このｐＬｕｃ２ＥＸＮは、加藤義雄（独立行政法人 産業技術総合研究所 ジーンファンクション研究センター 機能性RNA研究チーム）によりプラスミドｐＧＬ３−コントロール（Promega Co., Madison, WI）から作製され供与された。ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△またはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△を、Akimoto T. et al. （Akimoto T. et al. Real-time imaging of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma coactivator-1 alpha promoter activity in skeletal muscles of living mice. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 287, C790-796 (2004)）に記載したとおり、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲから部位特異的突然変異誘発によって作成した。
【００５９】
概略すると、ＰＣＲベース部位特異的突然変異誘発のために、
ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△のためには
forward primer：5'- GCC GAT GGA AAT TTA CAC ACT ATA ATT CCA CAT G-3'（配列番号１０、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）及び
reverse primer：5'- CAT GTG GAA TTA TAG TGT GTA AAT TTC CAT CGG C-3（配列番号１１、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）を用いて、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲをテンプレートに増幅をおこなった。また、
ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△のためには
forward primer：5'-GTA TGT TTT TAA AAT ACC CGT TTT GTA TAT ACT TGT ATA TG-3'（配列番号１２、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）及び
reverse primer：5'-CAT ATA CAA GTA TAT ACA AAA CGG GTA TTT TAA AAA CAT AC-3'（配列番号１３、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）を用いて、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲをテンプレートに１回目の増幅を行った後、さらに、
forward primer： 5'-GTA TGC TTT TAA CCC ACC CGT TTT GTA TAT ACT TG-3'（配列番号１４ 、突然変異したヌクレオチドに下線を付した） 及び
reverse primer：5'-CAA GTA TAT ACA AAA CGG TTG GGT TAA AAG CAT AC-3'（配列番号１５、突然変異したヌクレオチドに下線を付した）
を用いて、１回目のテンプレートを鋳型に２回目の増幅を行った。
【００６０】
これらの増幅産物から、QuickExchange lightning site-directed mutagenesis kit（Stratagene）を用いて部位特異的突然変異を有するプラスミドを得た。簡単には、テンプレートのｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲを含む増幅産物またはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲにおける２回目の増幅産物をDpn Iで消化後ＤＨ−５αにトランスフォーメーションし、アンピシリン含有培地において増殖してきたＤＨ−５αから、プラスミドMidi kit（Qiagen）を用いてｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｈｌ−１ ３’ＵＴＲ△またはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△を得た。
【００６１】
３−３．ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１発現ベクターの構築
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の翻訳のｍｉＲ−２３ａによる阻害を確認するために、ＦＬＡＧタグ化した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１発現ベクターを構築した。３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のＯＲＦをマウス骨格筋由来のｃＤＮＡからExTaq HS polymerase (TaKaRa)を用いて増幅し、TA vectors (Invitrogen)にクローニングした。クローニングのための特異的プライマーは、Ａｔｒｏｇｉｎ−１ ＯＲＦ＋３’ ＵＴＲについては、
Forward： 5'-AGG ATC CAT GCC GTT CCT TGG GCA GGA C-3'（配列番号１６、下線はＢａｍＨＩ部位を示す) および
Reverse： 5'-ACT CGA GGC TTG TTT GCC AAG AGC ATG CAT AG-3'（配列番号１７、下線はＸｈｏＩ部位を示す)、
ＭｕＲＦ１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲについては、
forward： 5'-AAG GAT CCA TGG ATT ATA AAT CTA GCC TGA TTC CTG-3'（配列番号１８、下線はＢａｍＨＩ部位を示す) および
reverse： 5'-AAG AAT TCT TTA TTT TTG AGG CAG AGT CTC TCT ATG-3'（配列番号１９、下線はＥｃｏＲＩ部位を示す)である。
【００６２】
Ａｔｒｏｇｉｎ−１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片は、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ部位で、そしてＭｕＲＦ１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片は、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位で、ｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen）にサブクローニングした。サブクローニング後、ｆ：ＰＧＣ−１（Mechanisms controlling mitochondrial biogenesis and respiration through the thermogenic coactivator PGC-1. Wu Z, Puigserver P, Andersson U, Zhang C, Adelmant G, Mootha V, Troy A, Cinti S, Lowell B, Scarpulla RC, Spiegelman BM. Cell. 1999 Jul 9;98(1):115-24. Harvard Medical School, USAのBruce Spiegelmanから贈与された）からＢａｍＨＩ部位で切り出したＦＬＡＧ−ｔａｇを含むＤＮＡ断片を、Ａｔｒｏｇｉｎ−１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片またはＭｕＲＦ１ ＯＲＦ＋３’ＵＴＲのＰＣＲ断片の上流にＢａｍＨＩ部位で挿入した。
【００６３】
４．トランスフェクション
Ｃ２Ｃ１２をトランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。細胞を、１μｇの各ベクター（ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａまたはｐＣＸｂＧ）および／又は５０ｎｇのｍｉＲ−２３ａのアンチセンスであるロックされた核酸（locked nucleic acid, ＬＮＡ）：5'-GGA AAU CCC UGG CAA UGU GAU-3'（配列番号２６、下線はロックされた位置を示す）と、リポフェクタミン２０００（Invitrogen）を含む無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Invitrogen）を用いてトランスフェクションした。６時間インキュベーション後に、培地をＦＢＳを含む培地と交換した。
【００６４】
５．レポーターアッセイ
ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ）をトランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートに播種した。細胞を０．１μｇのベクター（ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲΔ、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−Ａｔｒｏｇｉｎ−１、ｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ＭｕＲＦ１またはｐｃＤＮＡ３．１−ＦＬＡＧ−ｐ３８β）、及び、１．８μｇのｐＣＸｂＧ−ｍｉＲ−２３ａもしくはｐＣＸｂＧ、およびリポフェクタミン２０００を用いてトランスフェクションした。細胞をトランスフェクションの２４時間後に溶解し、ルシフェラーゼ活性をルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（Promega Co.）を用いて測定した。
【００６５】
６．ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１ ｍＲＮＡ分析
製造者のプロトコールにしたがって、全ＲＮＡを、ＩＳＯＧＥＮ（WAKO, Osaka, Japan）を用いることによってＣ２Ｃ１２細胞または筋肉組織から抽出し、１０μｇのＲＮＡを、SuperScriptIII（Invitrogen）逆転写（ＲＴ）に付した。オリゴｄＴプライマー（Invitrogen）をｃＤＮＡを作成するために用いた。反応液を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間そして８５℃で５分間インキュベーションした。アリコートのＲＴ反応産物をＥｘ Ｔａｑ ＨＳ（TaKaRa, Osaka, Japan）及びＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子特異的プライマー（fasmacで合成）を用いてＰＣＲ（ABI, 9600）に直接用いた。ＰＣＲ反応（１０μｌ）を行った。各１０μｌ反応混合液は、２μｌの希釈したＲＴ産物を含んだ。反応液を９５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で３０秒及び６０℃で３０秒、７２℃で６０秒を２５サイクルさせた。ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子特異的プライマー配列は、下記のとおりである。増幅産物は、0.5 μg/mlのエチジウムブロミドを含む２％アガロースゲルを用いた電気泳動により分離し、ＤＮＡバンドの蛍光強度をルミノイメージアナライザー（LAS-3000，FUJI Film）を用いて測定した。
【００６６】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１：
5'-GGG AGG CAA TGT CTG TGT TT-3'（配列番号２０）及び
5'-TTG TGA AAA AGT CCC GGT TC-3'（配列番号２１）
Ｔｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１：
5'-ACC GAG TGC AGA CGA TCA TCT C-3'（配列番号２２）及び
5'-AAA GTC AAT GGC CCT CAA GGC-3'（配列番号２３）
ＧＡＰＤＨ：
5'-GTG GCA AAG TGG AGA TTG TTG CC-3'（配列番号２４）及び
5'-GAT GAT GAC CCG TTT GGC TCC-3'（配列番号２５）
ＧＡＰＤＨを内部標準として用いた。
【００６７】
７．マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２３ａ）分析
TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit（Applied Biosystems, Foster City, CA）及びTaqMan MicroRNA assays has-miR-23a（#4373074,Applied Biosystems, Foster City, CA）を用いて、製造者のプロトコールにしたがい、成熟ｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２３ａ）の発現を定量した。ｍｉＲＮＡ定量において、各逆転写（ＲＴ）反応液は、１０ｎｇの精製全ＲＮＡを含んだ。このＲＴ反応液を１６℃で３０分間、４２℃で３０分間そして８５℃で５分間インキュベーションした。各ｍｉＲＮＡ（１０μｌ）のリアルタイムＰＣＲ反応液をトリプリケートで行った。各１０μｌ反応混合液は、２μｌの希釈したＲＴ産物を含んだ。反応液を９６ウェルプレート中でApplied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR systemで、９５℃で１０分間インキュベーションし、次いで、９５℃で１５秒及び６０℃で１分を４０サイクルさせた。内部標準は同様にキットに付属のβアクチンを使用した。
【００６８】
８．動物実験
成体（８週齢）Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Clea Japan , Inc., Tokyo, Japan）を温度制御施設（２１℃）で１２時間明期／１２時間暗期サイクルで飼育し、水と餌は、自由に摂取させた。骨格筋萎縮を誘導するために、１ｍｇＤｅｘ／ｋｇ体重を７日間腹腔内投与した。Ｄｅｘ処理の後、動物を屠殺し、筋肉を適当なバッファー（例えば、ＰＢＳ（−））に回収するか又はＯＣＴ化合物に包埋した。この動物プロトコールは、東京大学及び早稲田大学の動物実験委員会によって承認されている。
【００６９】
９．マウス骨格筋の免疫組織化学
抗ミオシン重鎖（ＭＨＣ）２ｂ（ＢＦ−Ｆ３）モノクローナル抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA）をマウス骨格筋からのＯＣＴ包埋切片（10μメートル）の断面の免疫染色の一次抗体として用いた（Schiaffino S. et al., Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J. Muscle Res. Cell Motil. 10, 197-205 (1989)）。筋線維の形状は、マウス抗ジストロフィン抗体（D8043, Sigma. St. Louis. MO）とＦＩＴＣ結合二次抗体を用いて確認した。切片の断面を４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳ（−）で固定し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳ（−）で透過処理し、そして一次抗体（マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂ（ＢＦ−Ｆ３）モノクローナル抗体）と一緒に一晩インキュベーション（4℃）した。二次抗体は、ＭＨＣ２ｂについてはＲ−ＰＥ結合抗マウスＩｇＭであった。最後に、カバースリップをＶＡＣＴＡ ＳＨＩＥＬＤ（Vector Laboratories, Ltd., Burlingame, CA）で封入した。マウス抗ジストロフィン抗体およびＭＨＣ２ｂモノクローナル抗体で染色された面積をＡｑｕａＣｏｓｍｏｓソフトウェアーで測定した（Hamamatsu Photonics K.K.）。
【００７０】
１０．電気パルスによる遺伝子導入
電気パルスによる遺伝子導入を、Akimono T. et al（Akimono T. et al (2004)）に記載されたとおりに行った。簡略には、両前脛骨（ＴＡ）筋に麻酔下（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ペントバルビタールナトリウム）で２０μｇのプラスミドＤＮＡをインジェクションした。インジェクションの後１分以内に、モデル５３２ ２ニードルアレイ（BTX Instrument Divisoin Harvard Apparatus, Inc., Holliston, MA）によりＳＥＮ−３４０１電気刺激器（Nihon Kohden, Tokyo, Japan）を用いてインジェクションされたＴＡ筋に電場を与えた。持続期間１００ｍｓ、周波数１Ｈｚ、振幅１００Ｖ（２００Ｖ／ｃｍ）で、ＴＡ筋の内側側面及び外側側面にニードルアレイを設置することによって、８回のパルスを筋肉に適用し、電場を筋線維の長軸に対して垂直にした。このマウスをデキサメタゾン注射前に４日間回復させた。
【００７１】
１１．熱ストレス処理
インビトロ研究については、Ｃ２Ｃ１２筋管を３０分間水浴（４２℃）に置くことで熱ストレスを与えた。熱ストレス後インビトロで筋萎縮を誘導するために培地を１０μＭＤｅｘを含むＤＭに交換し１２時間培養した。インビボ研究については、マウスを１時間４２℃に置くことで熱ストレスに曝した。熱ストレス処理の２４時間後に１ｍｇＤｅｘ／ｋｇ体重を腹腔内に投与し骨格筋萎縮を誘導した。Ｄｅｘは１日１回で７日間投与した。
【００７２】
１２．統計解析
データを平均±平均の標準誤差で表した。統計的有意（ｐ＜０．０５）をスチューデントのｔ検定又はＡＮＯＶＡ、さらに、それぞれ、二群又は多群間比較ダンネット検定によって決定した。
【００７３】
結果
ｍｉＲ−２３ａは、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用した。
バイオインフォマティックス分析（Human miRNA targets（http://cbio.mskcc.org/mirnaviewer/）及びMIRBASE Targets（http://microrna.sanger.ac.uk/targets/））では、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲにおける推定のｍｉＲ−２３ａ結合部位がヒト及びマウスを含む哺乳動物において高く保存されていることが明らかとなった（図１ａ）。
【００７４】
ｍｉＲ−２３ａ及びＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の機能的相互作用を調べるために、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲをルシフェラーゼレポーターベクターの下流にサブクローニングした（図１ｂ）。ｍｉＲ−２３ａ過剰発現ベクター（ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ）及びレポーターベクター（ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｎｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ）をＨｅＬａ細胞にコトランスフェクションし、ルシフェラーゼ活性をトランスフェクションの２４時間後に測定した。また、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲのｍｉＲ−２３ａの想定結合部位に突然変異を有するレポーターベクター（ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲΔまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ△）を構築し、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲまたはｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲと同様にコトランスフェクションした。
【００７５】
予測されたとおり、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ａｔｒｏｇｉｎ−１ ３’ＵＴＲ（図１ｃにおけるＷＴ）からのルシフェラーゼ活性は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターと一緒にコトランスフェクションしたときに明らかに減少した（図１ｃのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のＷＴにおけるｍｉＲ−２３ａ）が、突然変異ベクターからのルシフェラーゼ活性は、減少しなかった（図１ｃのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１のミュータントにおけるｍｉＲ−２３ａ）。同様に、ｐＬｕｃ２ＥＸＮ−ＭｕＲＦ１ ３’ＵＴＲ（図１ｃにおけるＷＴ）からのルシフェラーゼ活性は、ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターと一緒にコトランスフェクションしたときに明らかに減少した（図１ｃのＭｕＲＦ１のＷＴにおけるｍｉＲ−２３ａ）が、突然変異ベクターからのルシフェラーゼ活性は、減少しなかった（図１ｃのＭｕＲＦ１のミュータントにおけるｍｉＲ−２３ａ）。これは、ｍｉＲ−２３ａがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＭｕＲＦ１の ｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用し、その発現を下方制御したことを示す。また、ｍｉＲ−２３ａは、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１よりＭｕＲＦ１の方をより強く発現抑制することがわかった。以上のことから、ｍｉＲ−２３ａがＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のｍＲＮＡの３’ＵＴＲと相互作用し、その発現を下方制御したことがわかった。
【００７６】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１およびＭｕＲＦ１の発現の下方制御がｍｉＲ−２３ａによる翻訳の阻害であることを確認するために、３’ＵＴＲを含むＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のＯＲＦをＦＬＡＧの下流にサブクローニングした（図１ｄ）。
【００７７】
ＦＬＡＧタグを付加した３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１発現ベクターとｍｉＲ−２３ａ発現ベクターを細胞にコトランスフェクションし、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の発現を、抗ＦＬＡＧ抗体を用いるウェスタンブロット法によって検出した。これらのタンパク発現が、ｍｉＲ−２３ａの発現によって阻害されたこと（図１e）から、ｍｉＲ−２３ａによるＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１またはＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の発現阻害が翻訳段階での阻害であることが示された。
【００７８】
ｍｉＲ−２３ａは、インビトロ及びインビボでのデキサメタゾン誘導筋萎縮に対する耐性をもたらす。
ｍｉＲ−２３ａを強制的に発現させたインビトロ筋萎縮モデルを用いることによってｍｉＲ−２３ａ機能を調べた。ｍｉＲ−２３ａ発現ベクターであるｐＣＸｂＧ−ｍｉＲ−２３ａをマウスの筋芽細胞系（Ｃ２Ｃ１２）にトランスフェクションし、筋形成を誘導した。筋管を１０μＭのデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で２４時間処理し、その直径をトランスジーンマーカーとしてのＥＧＦＰの可視化によって測定した。モック（ｐＣＸｂＧ）のトランスフェクションをされた細胞において、筋管の直径は、デキサメタゾン処理に応じて明らかに減少した（図２ａのモックにおけるコントロールとＤｅｘの比較）。一方、ｍｉＲ−２３ａを強制発現させている筋管の直径は、デキサメタゾン処理に応じて減少することはなかった（図２ａのｍｉＲ−２３ａにおけるコントロールとＤｅｘの比較）。転写レベルでのＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１のデキサメタゾン誘導上方制御は、ｍｉＲ−２３ａ発現によって影響されることはないことから（図２ｂのモックにおけるＤｅｘ ＋とｍｉＲ−２３ａにおけるＤｅｘ ＋の比較）、ｍｉＲ−２３ａが転写以外のほかのメカニズムによってその機能を媒介していることがわかる。
【００７９】
さらに、電気パルス介在遺伝子導入を用い、ｐＣＸｂＧ−ｐｒｉ−ｍｉＲ−２３ａをマウスの成体の両前脛骨（ＴＡ）筋内にトランスフェクションし、７日間デキサメタゾン処理（ｉ．ｐ．注射で毎日）に応じたモックトランスフェクション筋との筋横断面積を比較した。グルココルチコイドは速筋線維に選択的に筋萎縮を誘導することが知られている（van Rooij E. et al. A signature pattern of stress-responsive microRNAs that can evoke cardiac hypertrophy and heart failure. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 l 8255-18260 (2006)）。モックトランスフェクション筋において、線維の横断面積はデキサメタゾン処理によって明らかに減少したが、ｍｉＲ−２３ａ陽性線維は、減少が見られず明らかに筋萎縮に耐性であった（図３）。これらの結果は、ｍｉＲ−２３ａ発現が、インビトロ及びインビボでの骨格筋萎縮を弱めるのに十分であることを示す。
【００８０】
ｍｉＲ−２３ａは、心筋におけるストレス応答性ｍｉＲＮＡの１つとして報告されている（Schakman O., Gilson H. & Thissen JP. Mechanisms of glucocorticoid-induced myopathy. J. Endocrinol. 197, 1-10 (2008)。よって、ｍｉＲ−２３ａは、骨格筋においてもストレスにより誘導される可能性がある。ｍｉＲ−２３ａを誘導する物理的ストレスをインビトロでスクリーニングしたところ、熱ストレスが筋芽細胞(Ｃ２Ｃ１２)においてｍｉＲ−２３ａをもっとも強く誘導することを見出した（図４c）。そして、熱ストレスが、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ｍＲＮＡの発現に影響を与えることなく（図４a）、デキサメタゾン誘導性萎縮への耐性を筋管に与えることを見出した（図４ｂ）。
【００８１】
熱ストレス誘導性ｍｉＲ−２３ａをノックダウンするために、ｍｉＲ−２３ａに対するアンチセンスＬＮＡをＣ２Ｃ１２にトランスフェクションした。アンチセンスＬＮＡは、選択的に相補的なｍｉＲＮＡと結合し強固な２本鎖を形成してその機能を下方制御することが報告されている（Elm J. et al. Antagonism of microRNA-122 in mice by systemically administered LNA-antimiR leads to up-regulation of a large set of predicted target mRNAs in the liver. Nucleic Acids Res. 36, 1153-1162 (2008)）。アンチセンスＬＮＡはｍｉＲ−２３ａ発現を下方制御した（図５）。そして、熱ストレス誘導性萎縮の耐性を弱めた（図４ｂ）。これらの結果は、ｍｉＲ−２３ａが熱ストレスにより誘導された筋萎縮に対する耐性と関係があることを示している。
【００８２】
インビトロにおける筋萎縮への熱ストレス誘導耐性の役割を確かめるために、マウスを熱ストレスに曝した後７日間デキサメタゾン処理を行った。足底筋において、筋重量の減少は熱ストレスに曝していない群と比較して熱ストレスに曝した群において顕著に少なかった（図４ｄ）。足底筋における速筋線維の断面積の測定は、繊維サイズの減少が熱ストレスに曝していない群と比較して熱ストレスに曝した群において顕著に少ないことを示していた（図４e）。デキサメタゾン誘導性ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１ ｍＲＮＡの発現は、熱ストレスによって影響されなかった（図４a）。培養における筋管での発見と一致して、骨格筋におけるｍｉＲ−２３ａの発現は熱ストレスに曝されたマウスにおいて顕著に上方制御されていた（図４ｆ）。これらの結果は、熱ストレス誘導性ｍｉＲ−２３ａが、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の発現をＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子の転写後において抑制し筋萎縮を弱めていることを示唆している。
【産業上の利用可能性】
【００８３】
本発明は、筋萎縮の予防又は治療のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００８４】
SEQUENCE LISTING
<110> The University of Tokyo
<120> Agent against muscle atrophy
<130> KP-12701
<160> 32
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
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aucacauugc cagggauuuc c 21
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uuuccaaccg acc 73
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cuuucucccc uccaggugcc agccucuggc cccgcccggu gccccccuca ccccugugcc 60
acggccggcu gggguuccug gggaugggau uugcuuccug ucacaaauca cauugccagg 120
gauuuccaac cgacccugag cucugccacc gaggaugcug cccggggacg ggguggcaga 180
gaggccccga agccugu 197
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ttgtgaaaaa gtcccggttc 20
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<223> designed primer
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<212> DNA
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<220>
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ttgtgtgact ggcgattgtc acaaagtggg aaggaagcca agacaataga gatgcctact 300
tcctttcctt g 311
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤を含む抗筋萎縮剤。
【請求項２】
阻害剤が、ＲＮＡ又はその類似体である請求項１記載の抗筋萎縮剤。
【請求項３】
ＲＮＡが、ｍiＲＮＡまたはｓiＲＮＡである請求項２記載の抗筋萎縮剤。
【請求項４】
ＲＮＡ又はその類似体の配列が、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列である請求項２まはた３記載の抗筋萎縮剤。
【請求項５】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの量と比較して、増加した前記ｍiＲＮＡの量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法。
【請求項６】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に筋萎縮誘導物質を生体外で接触させること、
− 筋萎縮誘導物質と接触させた前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量と比較して、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法。
【請求項７】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、あるいは３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、
− 前記発現ベクターを動物細胞に生体外で導入すること、
− 前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量と比較して、減少したレポーターたんぱく質の量、あるいは減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法。
【請求項８】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮を有する患者を３８〜１１０℃で処置することを含む、前記筋萎縮に対する予防及び／又は治療方法。
【請求項１】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現に対する阻害剤を含む抗筋萎縮剤。
【請求項２】
阻害剤が、ＲＮＡ又はその類似体である請求項１記載の抗筋萎縮剤。
【請求項３】
ＲＮＡが、ｍiＲＮＡまたはｓiＲＮＡである請求項２記載の抗筋萎縮剤。
【請求項４】
ＲＮＡ又はその類似体の配列が、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列である請求項２まはた３記載の抗筋萎縮剤。
【請求項５】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、配列番号１で示される塩基配列もしくはその類似配列からなるｍiＲＮＡの量と比較して、増加した前記ｍiＲＮＡの量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法。
【請求項６】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− 動物細胞を提供すること、
− 前記細胞に筋萎縮誘導物質を生体外で接触させること、
− 筋萎縮誘導物質と接触させた前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の発現量と比較して、ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子の減少した発現量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法。
【請求項７】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮に対する阻害剤をスクリーニング方法であって、
− レポーター遺伝子とＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１の３’ＵＴＲの遺伝子又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１の３’ＵＴＲの遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、あるいは３’ＵＴＲを有するＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子又は３’ＵＴＲを有するＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子を有する発現ベクターを構築すること、
− 前記発現ベクターを動物細胞に生体外で導入すること、
− 前記細胞に候補物質を生体外で接触させること、
− 前記細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を測定すること、
− 候補物質と接触させなかった細胞における、レポーターたんぱく質の量、あるいはＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量と比較して、減少したレポーターたんぱく質の量、あるいは減少したＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１たんぱく質の量又は減少したＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１たんぱく質の量を有する細胞を選択すること、および
− 選択された細胞に使用された候補物質を、前記筋萎縮に対する阻害剤として決定すること、
を含む方法。
【請求項８】
ＭＡＦｂｘ／ａｔｒｏｇｉｎ−１遺伝子及び／又はＴｒｉｍ６３／ＭｕＲＦ１遺伝子が関与する筋萎縮を有する患者を３８〜１１０℃で処置することを含む、前記筋萎縮に対する予防及び／又は治療方法。
【図１ａ】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図５】
【図６】
【図１ｂ】
【図１ｃ】
【図１ｄ】
【図１ｅ】
【図２ａ】
【図２ｂ】
【図３】
【図４ａ】
【図４ｂ】
【図４ｃ】
【図４ｄ】
【図４ｅ】
【図４ｆ】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２０１０−１８４８７９（Ｐ２０１０−１８４８７９Ａ）
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−２８８３６（Ｐ２００９−２８８３６）
【出願日】平成２１年２月１０日（２００９．２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年８月１３日 ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｓｅａｒｃｈ？ｑｕｅｒｙ＝ｍｉＲ−２３ａ ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／２１７５／ｖｅｒｓｉｏｎ／１及びｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／２１７５／ｖｅｒｓｉｏｎ／１／ｆｉｌｅｓ／ｎｐｒｅ２００８２１７５−１．ｐｄｆを通じて発表
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２２年８月２６日（２０１０．８．２６）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年２月１０日（２００９．２．１０）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り 平成２０年８月１３日 ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／、ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｓｅａｒｃｈ？ｑｕｅｒｙ＝ｍｉＲ−２３ａ ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／２１７５／ｖｅｒｓｉｏｎ／１及びｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｃｅｄｉｎｇｓ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／２１７５／ｖｅｒｓｉｏｎ／１／ｆｉｌｅｓ／ｎｐｒｅ２００８２１７５−１．ｐｄｆを通じて発表
【出願人】（５０４１３７９１２）国立大学法人 東京大学 (1,942)
【出願人】（８９９００００６８）学校法人早稲田大学 (602)
【Ｆターム（参考）】
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