抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤
【課題】 抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤及び抗炎症剤を提供する。
【解決手段】 抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用に優れた成分を見出すために、天然由来の種々の成分について検討を行なった結果、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物抽出物を有効成分として配合することにより、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤及び抗炎症剤を提供することができた。
【解決手段】 抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用に優れた成分を見出すために、天然由来の種々の成分について検討を行なった結果、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物抽出物を有効成分として配合することにより、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤及び抗炎症剤を提供することができた。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤に関する。さらに詳しくは、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物またはその抽出物を含有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索及び配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活あるいは増殖促進作用を有する成分としてポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、ツリガネニンジン属植物の抽出物（特許文献２参照）、クロレラ抽出物（特許文献３参照）、ビワ抽出物（特許文献４参照）が開示されている。美白剤としては、白鶴霊芝の抽出物（特許文献５参照）、抗酸化剤としてはサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献６参照）が開示されている。痩身剤としては哺乳動物の乳由来リン脂質（特許文献７参照）、褐藻の酵素分解物（特許文献８参照）、抗炎症剤としてはラン科シンビジューム属植物抽出物（特許文献９参照）、ボチョウジ属植物抽出物（特許文献１０）が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献３】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献４】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献５】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献６】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献７】特開２００１−２７５６１４号公報
【特許文献８】特開平７−２７８００５号公報
【特許文献９】特開２００５−２８９８７０号公報
【特許文献１０】特開２００６−３６７１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来はその効果が知られていなかったユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物またはその抽出物に優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物としては、大型の白花をつける多年草で、西南日本に分布するウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｃｏｒｄａｔｕｍ）、東北日本に分布するオオウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｇｌｅｈｎｉｉ）、ヒマラヤから中国に分布するヒマラヤウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）が知られている。
【００１０】
本発明は、ユリ科ウバユリ属植物であれば特に限定されないが、入手が比較的容易などの理由から、適当なものとして、オオウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｇｌｅｈｎｉｉ）が挙げられる。
【００１１】
これらの植物は、単独で用いられるほか、２種以上を組み合わせて使用することもできる。これらユリ科ウバユリ属植物を使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、葉、根、茎、花などの任意の部分を使用することができる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。
【００１２】
それらはそのまま粉砕して使用することもできるが、それらの部位からの抽出物を用いることが好ましい。
【００１３】
抽出には、ユリ科ウバユリ属植物のいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、全草、葉、花、球根を用いるとよい。その際、複数の部位を用いて抽出物を得るようにしてもよい。また、異なる溶媒を用いて抽出された抽出物を２種以上混合して用いてもよい。
【００１４】
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１５】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１６】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。
【００１７】
ユリ科ウバユリ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。或いは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ユリ科ウバユリ属植物の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１８】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物は、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用を有し、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤として利用することができる。
【００１９】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞の細胞賦活効果、ヒト真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進効果、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進効果、ヒト表皮角化細胞ＩＶ型コラーゲン産生促進効果を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００２０】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたヒト表皮メラニン細胞のチロシナーゼ活性阻害効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。
【００２１】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたラジカル消去効果、スーパーオキサイドアニオン消去効果を有し、優れた抗酸化作用を発揮する。
【００２２】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤は、優れたヒト前駆脂肪細胞の中性脂肪蓄積抑制効果を有し、優れた痩身作用を発揮する。
【００２３】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害効果を有し、優れた抗炎症作用を発揮する。
【実施例】
【００２４】
以下にユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物抽出物の調製例、各作用を評価するための試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２５】
［調製方法１］
オオウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｇｌｅｈｎｉｉ）の葉の乾燥粉砕物１００ｇに、５０質量％エタノール水溶液を２．０Ｋｇ加え、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出液をろ過して回収し、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を得た。
【００２６】
［調製方法２］
オオウバユリの葉の乾燥粉砕物５ｇに精製水を１００ｇ加え、オートクレーブ（１２０℃、２０分間）を使って抽出した。抽出液をろ過して回収し、凍結乾燥を行い、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を得た。
【００２７】
［調製方法３］
超臨界抽出装置にオオウバユリの葉の乾燥粉砕物１００ｇを投入し、液化二酸化炭素をポンプで連続的に流し込み、２５Ｍｐａ、５ｍＬ／分、４０℃で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を得た。
【００２８】
上記抽出物を用いて、抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊及び＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【００２９】
＜抗老化作用（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用）の評価１＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物の細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００３０】
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表１に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価では、試料を含む培地の他に、コントロールとして１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価結果を、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした場合の相対値として表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた細胞賦活作用を有することが明らかとなった。
【００３３】
＜抗老化作用（ヒト真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用）の評価２＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のＩ型コラーゲン産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００３４】
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表２に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩ型コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２´−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５０μＭのＬ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（ＶＣＰＭｇ）を含有する０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにてタンパク量を測定し単位タンパク量当たりのコラーゲン産生量を求めた。評価結果を、ネガティブコントロールの単位当りコラーゲン産生量を１００とした場合の相対値として表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
表２より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意なＩ型コラーゲン産生促進効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００３７】
＜抗老化作用（ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用）の評価３＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のＡＴＰ産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００３８】
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり４．０×１０４ 個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を捨て洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素も溶出してしまうため、超音波処理する際に使用するバッファーにＡＴＰ分解酵素阻害剤（和光純薬のＣｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。作製した細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。発光強度はヤマト社のコンパクトルミＶＳ５０１を使用して測定した。評価結果を、試料（抽出物）無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生促進作用を１００とした場合の相対値として表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意なＡＴＰ産生促進効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたＡＴＰ産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００４１】
＜抗老化作用（ヒト表皮角化細胞ＩＶ型コラーゲン産生促進作用）の評価４＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のＩＶ型コラーゲン産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００４２】
ヒト表皮角化細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表４に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、培養上清を採取し、ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）及びビオチン化ホームラディッシュペルオキシダーゼを添加し、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダーで６５０ｎｍの吸光度を測定し、上清中に産生されたＩＶ型コラーゲンを定量した。また、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのＩＶ型コラーゲン産生量を求めた。評価結果を、試料（抽出物）無添加のコントロールにおけるＩＶ型コラーゲン産生量を１００とした場合の相対値として表４に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】
表４より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では有意なＩＶ型コラーゲン産生促進効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００４５】
以上の抗老化作用の評価１〜４から、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００４６】
＜美白作用（チロシナーゼ活性阻害作用）の評価＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のチロシナーゼ活性阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００４７】
クラボウ社製正常ヒト表皮メラニン細胞を、１ウェル当たり３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、クラボウ社製Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓによって表５に示す各濃度に調製した試料添加培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に、１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有リン酸緩衝液７５μＬに交換して細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液５０μＬを加え、３７℃で２時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量を、式（１）に各測定値を導入して求めた。
式（１）：生成されたドーパメラニン量＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）｝−２．１６６／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにより各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当たりのドーパメラニン生成量を求めた。試料（抽出物）無添加のコントロールの値を１００とした時の相対値より、チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
【００４９】
表５より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地を用いた場合には、メラニン産生量の低下が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、有意なチロシナーゼ活性阻害作用を有することがわかった。
【００５０】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた美白作用を有することが明らかとなった。
【００５１】
＜抗酸化作用（ラジカル消去作用）の評価１＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のラジカル消去作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００５２】
各試料を、５０質量％エタノールを用いて濃度調製して試料溶液とし、表６に示す濃度となるように９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ添加した。そこへ、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジカル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、良く混合後、室温、暗所にて２４時間静置した。その後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料を添加しなかった場合のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ＤＰＰＨラジカルの消去率を式（２）に導入して求めた。測定結果を表６に示す。
式（２）：ラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００５３】
【表６】
【００５４】
表６より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物には優れたＤＰＰＨラジカルの消去効果が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたラジカルの消去作用を有することがわかった。
【００５５】
＜抗酸化作用（スーパーオキサイドアニオン消去作用）の評価２＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００５６】
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨａｎｋｓ（＋）溶液７５μＬに、表７に示す濃度となるようにＨａｎｋｓ（＋）溶液で希釈した試料２５μＬを添加し、Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ２５μＬ（０．００７５Ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料が無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（３）の値をスーパーオキサイドアニオン消去率とした。評価結果を表７に示した。
式（３）：消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００５７】
【表７】
【００５８】
表７より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物には有意なスーパーオキサイドアニオンの消去効果が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたスーパーオキサイドアニオンの消去作用を有することがわかった。
【００５９】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００６０】
＜痩身作用（中性脂肪蓄積抑制作用）の評価＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物の脂肪細胞における中性脂肪蓄積抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００６１】
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ・ＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社）を、１ウェル当り１．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ＰＧＭ培地（１０質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞が飽和状態になる直前に表８に示す濃度の試料を添加したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬ インシュリン，１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，２００μＭ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０日〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳにて洗浄の後、０．５ｗ／ｖ％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳにて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。抽出後、マイクロプレートリーダーより、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積量を測定した。
測定結果を、試料無添加の培地を用いたコントロールにおける、中性脂肪蓄積量を１００とした相対値により、表８に示す。
【００６２】
【表８】
【００６３】
表８より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意な中性脂肪蓄積抑制効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。
【００６４】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた痩身作用を有することが明らかとなった。
【００６５】
＜抗炎症作用（ヒアルロニダーゼ活性阻害作用）の評価＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のヒアルロニダーゼ活性阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法３により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００６６】
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し基質溶液とした。ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し酵素溶液とした。酵素溶液は用時調製とした。緩衝液で任意の濃度に調製した試料溶液０．１ｍＬ及び酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４Ｎ水酸化ナトリウム０．０６ｍＬを加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液２．０ｍＬを添加し、３７℃で２０分間反応させた後、反応溶液を９６ウェルマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、試料無添加の緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼ活性が阻害されると、分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなることから、ヒアルロニダーゼ阻害作用を求めた。試料が無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（４）の値をヒアルロニダーゼ活性阻害率とした。評価結果を表９に示した。
式（４）：阻害率＝｛（Ａ）−（Ｂ）｝／（Ａ）×１００（％）
【００６７】
【表９】
【００６８】
表９より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物には有意なヒアルロニダーゼ活性阻害効果が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有することがわかった。
【００６９】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、天然由来成分を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤に関する。さらに詳しくは、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物またはその抽出物を含有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
加齢、疾患、ストレス、紫外線などによるシワ、シミ、皮膚の弾力低下といった皮膚症状の要因として、乾燥、細胞機能低下、紫外線によるメラニン産生や色素沈着、真皮マトリックス成分の減少や変性、紫外線等による細胞の酸化障害などが挙げられる。このような皮膚症状を防止・改善するために、様々な有効成分の検索及び配合検討がなされてきた。特に天然由来成分は、様々な薬理作用や美容効果を有することが知られ、これまでにも数多くの植物や菌類などの抽出物の皮膚外用剤、経口組成物への応用が検討されてきた。
【０００３】
例えば、皮膚の老化防止、改善作用を有する皮膚外用剤を得るために、真皮線維芽細胞の賦活あるいは増殖促進作用を有する成分としてポンカンのエッセンス（特許文献１参照）、ツリガネニンジン属植物の抽出物（特許文献２参照）、クロレラ抽出物（特許文献３参照）、ビワ抽出物（特許文献４参照）が開示されている。美白剤としては、白鶴霊芝の抽出物（特許文献５参照）、抗酸化剤としてはサルオガセ科サルオガセ属植物の抽出物（特許文献６参照）が開示されている。痩身剤としては哺乳動物の乳由来リン脂質（特許文献７参照）、褐藻の酵素分解物（特許文献８参照）、抗炎症剤としてはラン科シンビジューム属植物抽出物（特許文献９参照）、ボチョウジ属植物抽出物（特許文献１０）が知られている。
【０００４】
【特許文献１】特開２００１−１３１０４５号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８１９８号公報
【特許文献３】特開平１１−３３５２９３号公報
【特許文献４】特公平５−１７２０６号公報
【特許文献５】特開２００３−８９６３０号公報
【特許文献６】特開平１０−１８２４１３号公報
【特許文献７】特開２００１−２７５６１４号公報
【特許文献８】特開平７−２７８００５号公報
【特許文献９】特開２００５−２８９８７０号公報
【特許文献１０】特開２００６−３６７１３号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このように、これまでに様々な天然由来成分が応用されている。しかし、天然由来成分の中には、未だその効果が知られていないものも数多く存在し、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用などを有する有効成分の開発が期待されていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、天然由来の種々の成分について検討を行った結果、従来はその効果が知られていなかったユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物またはその抽出物に優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用が存在することを見出し、さらに検討を重ねて本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明は、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤に関する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とすることにより、優れた効果を有する抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物としては、大型の白花をつける多年草で、西南日本に分布するウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｃｏｒｄａｔｕｍ）、東北日本に分布するオオウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｇｌｅｈｎｉｉ）、ヒマラヤから中国に分布するヒマラヤウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）が知られている。
【００１０】
本発明は、ユリ科ウバユリ属植物であれば特に限定されないが、入手が比較的容易などの理由から、適当なものとして、オオウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｇｌｅｈｎｉｉ）が挙げられる。
【００１１】
これらの植物は、単独で用いられるほか、２種以上を組み合わせて使用することもできる。これらユリ科ウバユリ属植物を使用する際は、その使用部位には特に制限はなく、葉、根、茎、花などの任意の部分を使用することができる。複数の部位を組み合わせて使用してもよい。
【００１２】
それらはそのまま粉砕して使用することもできるが、それらの部位からの抽出物を用いることが好ましい。
【００１３】
抽出には、ユリ科ウバユリ属植物のいずれの部位を用いても構わないが、簡便に利用するには、全草、葉、花、球根を用いるとよい。その際、複数の部位を用いて抽出物を得るようにしてもよい。また、異なる溶媒を用いて抽出された抽出物を２種以上混合して用いてもよい。
【００１４】
抽出の際は、植物を生のまま用いてもよいが、抽出効率を考えると、細切、乾燥、粉砕等の処理を行った後に抽出を行うことが好ましい。
【００１５】
抽出は、任意の抽出溶媒に所定時間浸漬して行うことができる。抽出溶媒は、必要に応じて加熱してもよい。あるいは、超臨界流体や亜臨界流体を用いた抽出方法でも行うことができる。抽出効率を上げるため、撹拌したり抽出溶媒中でホモジナイズしたりしてもよい。抽出温度としては、５℃程度から抽出溶媒の沸点以下の温度とするのが適切である。抽出時間は、抽出溶媒の種類や抽出温度によっても異なるが、１時間〜１４日間程度とするのが適切である。
【００１６】
抽出溶媒としては、水の他、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等の低級アルコール；１，３−ブチレングリコール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、グリセリン等の多価アルコール；エチルエーテル、プロピルエーテル等のエーテル類；酢酸ブチル、酢酸エチル等のエステル類；アセトン、エチルメチルケトン等のケトン類などの溶媒を用いることができる。これらは、単独で用いられるほか、任意の２種以上を組み合わせて用いてもよい。生理食塩水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水等を用いてもよい。さらに、水や二酸化炭素、エチレン、プロピレン、エタノール、メタノール、アンモニアなどの１種又は２種以上の超臨界液体や亜臨界液体を用いてもよい。
【００１７】
ユリ科ウバユリ属植物の上記溶媒による抽出物は、そのままでも使用することができるが、一定期間そのまま静置して熟成させて用いてもよいし、濃縮、乾固した物を水や極性溶媒に再度溶解して使用することもできる。或いは、これらの生理作用を損なわない範囲で、脱色、脱臭、脱塩等の精製処理や、カラムクロマトグラフィー等による分画処理を行った後に用いてもよい。ユリ科ウバユリ属植物の前記抽出物やその処理物及び分画物は、各処理及び分画後に凍結乾燥し、用時に溶媒に溶解して用いることもできる。また、リポソーム等のベシクルやマイクロカプセル等に内包させて用いることもできる。
【００１８】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物は、優れた抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用を有し、抗老化剤、美白剤、抗酸化剤、痩身剤、抗炎症剤として利用することができる。
【００１９】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤は、優れたヒト真皮線維芽細胞の細胞賦活効果、ヒト真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進効果、ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進効果、ヒト表皮角化細胞ＩＶ型コラーゲン産生促進効果を有し、老化症状の防止・改善に優れた効果を発揮する。
【００２０】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤は、優れたヒト表皮メラニン細胞のチロシナーゼ活性阻害効果を有し、色素沈着、シミ、そばかす等を予防および改善して、優れた美白作用を発揮する。
【００２１】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤は、優れたラジカル消去効果、スーパーオキサイドアニオン消去効果を有し、優れた抗酸化作用を発揮する。
【００２２】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤は、優れたヒト前駆脂肪細胞の中性脂肪蓄積抑制効果を有し、優れた痩身作用を発揮する。
【００２３】
ユリ科ウバユリ属植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害効果を有し、優れた抗炎症作用を発揮する。
【実施例】
【００２４】
以下にユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物抽出物の調製例、各作用を評価するための試験についてさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれによってなんら限定されるものではない。
【００２５】
［調製方法１］
オオウバユリ（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ ｃｏｒｄａｔｕｍ ｖａｒ．ｇｌｅｈｎｉｉ）の葉の乾燥粉砕物１００ｇに、５０質量％エタノール水溶液を２．０Ｋｇ加え、撹拌しながら室温にて２時間抽出した。抽出液をろ過して回収し、減圧濃縮後、凍結乾燥を行い、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を得た。
【００２６】
［調製方法２］
オオウバユリの葉の乾燥粉砕物５ｇに精製水を１００ｇ加え、オートクレーブ（１２０℃、２０分間）を使って抽出した。抽出液をろ過して回収し、凍結乾燥を行い、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を得た。
【００２７】
［調製方法３］
超臨界抽出装置にオオウバユリの葉の乾燥粉砕物１００ｇを投入し、液化二酸化炭素をポンプで連続的に流し込み、２５Ｍｐａ、５ｍＬ／分、４０℃で二酸化炭素の超臨界流体を用いて抽出した。抽出物を回収し、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を得た。
【００２８】
上記抽出物を用いて、抗老化作用、美白作用、抗酸化作用、痩身作用、抗炎症作用の評価を行った。なお各評価結果に記載した＊及び＊＊は、ｔ検定における有意確率Ｐ値に対し、有意確率５％未満（Ｐ＜０．０５）を＊で、有意確率１％未満（Ｐ＜０．０１）を＊＊でそれぞれ表したものである。
【００２９】
＜抗老化作用（ヒト真皮線維芽細胞賦活作用）の評価１＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物の細胞賦活作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００３０】
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表１に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに４８時間培養した。上清を除いた後、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を４００μｇ／ｍＬ含有する培地に交換して約２時間培養した。その後、テトラゾリウム環の開環により生じるフォルマザンを２−プロパノールにて抽出し、マイクロプレートリーダーにて５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍにおける吸光度を測定し、両測定値の差により細胞賦活作用を評価した。評価では、試料を含む培地の他に、コントロールとして１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。
評価結果を、コントロールにおける細胞賦活作用を１００とした場合の相対値として表１に示す。
【００３１】
【表１】
【００３２】
表１より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意なヒト真皮線維芽細胞賦活効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた細胞賦活作用を有することが明らかとなった。
【００３３】
＜抗老化作用（ヒト真皮線維芽細胞Ｉ型コラーゲン産生促進作用）の評価２＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のＩ型コラーゲン産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００３４】
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表２に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養上清中に分泌されたタイプＩ型コラーゲン量はＥＬＩＳＡ法を用い、最後は標識されたペルオキシダーゼに対し２，２´−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）及び過酸化水素を添加し反応させた後、マイクロプレートリーダーにて４０５ｎｍの吸光度を測定した。評価ではサンプル培養液の他にネガティブコントロールとして０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を、ポジティブコントロールとして５０μＭのＬ−アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（ＶＣＰＭｇ）を含有する０．５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地を用いた。ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにてタンパク量を測定し単位タンパク量当たりのコラーゲン産生量を求めた。評価結果を、ネガティブコントロールの単位当りコラーゲン産生量を１００とした場合の相対値として表２に示す。
【００３５】
【表２】
【００３６】
表２より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意なＩ型コラーゲン産生促進効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたＩ型コラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００３７】
＜抗老化作用（ヒト真皮線維芽細胞ＡＴＰ産生促進作用）の評価３＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のＡＴＰ産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００３８】
クラボウ社（倉敷紡績株式会社）製正常ヒト真皮線維芽細胞を、１ウェル当たり４．０×１０４ 個となるように４８ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に１質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表３に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した１質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに２４時間培養した。細胞上清を捨て洗浄し、細胞を超音波処理して細胞中のＡＴＰを溶出した。その際に細胞内にあるＡＴＰ分解酵素も溶出してしまうため、超音波処理する際に使用するバッファーにＡＴＰ分解酵素阻害剤（和光純薬のＣｅｌｌｓｔｅｉｎ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２）を添加した。作製した細胞溶解液を試験管に分注し、ルシフェラーゼおよびルシフェリン試薬を添加し、化学発光を測定した。発光強度はヤマト社のコンパクトルミＶＳ５０１を使用して測定した。評価結果を、試料（抽出物）無添加のコントロールにおけるＡＴＰ産生促進作用を１００とした場合の相対値として表３に示す。
【００３９】
【表３】
【００４０】
表３より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意なＡＴＰ産生促進効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたＡＴＰ産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００４１】
＜抗老化作用（ヒト表皮角化細胞ＩＶ型コラーゲン産生促進作用）の評価４＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のＩＶ型コラーゲン産生促進作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法１により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００４２】
ヒト表皮角化細胞を、１ウェル当たり２．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に５質量％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したものを用いた。２４時間培養後、表４に示す各濃度となるように試料（抽出物）を添加した５質量％ＦＢＳ添加ＤＭＥＭ培地に交換し、さらに５日間培養した。培養終了後、培養上清を採取し、ＩＶ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体（認識部位：α２鎖）及びビオチン化ホームラディッシュペルオキシダーゼを添加し、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジンにより発色させ、マイクロプレートリーダーで６５０ｎｍの吸光度を測定し、上清中に産生されたＩＶ型コラーゲンを定量した。また、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにて各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当りのＩＶ型コラーゲン産生量を求めた。評価結果を、試料（抽出物）無添加のコントロールにおけるＩＶ型コラーゲン産生量を１００とした場合の相対値として表４に示す。
【００４３】
【表４】
【００４４】
表４より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では有意なＩＶ型コラーゲン産生促進効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたＩＶ型コラーゲン産生促進作用を有することが明らかとなった。
【００４５】
以上の抗老化作用の評価１〜４から、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた抗老化作用を有することが明らかとなった。
【００４６】
＜美白作用（チロシナーゼ活性阻害作用）の評価＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のチロシナーゼ活性阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００４７】
クラボウ社製正常ヒト表皮メラニン細胞を、１ウェル当たり３．０×１０４個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、クラボウ社製Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓを用いた。２４時間後、Ｍｅｄｉｕｍ１５４Ｓによって表５に示す各濃度に調製した試料添加培地に交換し、さらに４８時間培養した。次に、１質量％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ含有リン酸緩衝液７５μＬに交換して細胞を完全に溶解させ、内５０μＬを粗酵素液として使用した。粗酵素液に、基質となる０．０５質量％Ｌ−ドーパ含有リン酸緩衝液５０μＬを加え、３７℃で２時間静置した。マイクロプレートリーダーにより、基質添加直後と反応終了時の４０５ｎｍの吸光度を測定し、生成されたドーパメラニン量を、式（１）に各測定値を導入して求めた。
式（１）：生成されたドーパメラニン量＝｛（反応後４０５ｎｍ値−反応前４０５ｎｍ値）｝−２．１６６／５．２３８
また、ＰＩＥＲＣＥ社製ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔにより各ウェルのタンパク量を測定し、単位タンパク量当たりのドーパメラニン生成量を求めた。試料（抽出物）無添加のコントロールの値を１００とした時の相対値より、チロシナーゼ活性阻害作用を評価した。結果を表５に示す。
【００４８】
【表５】
【００４９】
表５より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地を用いた場合には、メラニン産生量の低下が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、有意なチロシナーゼ活性阻害作用を有することがわかった。
【００５０】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた美白作用を有することが明らかとなった。
【００５１】
＜抗酸化作用（ラジカル消去作用）の評価１＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のラジカル消去作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００５２】
各試料を、５０質量％エタノールを用いて濃度調製して試料溶液とし、表６に示す濃度となるように９６穴マイクロプレートに１００μＬずつ添加した。そこへ、０．２ｍＭの１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジカル（ＤＰＰＨ）エタノール溶液を１００μＬずつ添加し、良く混合後、室温、暗所にて２４時間静置した。その後、ＤＰＰＨラジカルに由来する５１６ｎｍの吸光度を測定した。試料を添加しなかった場合のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加した場合の吸光度を（Ｂ）としたとき、ＤＰＰＨラジカルの消去率を式（２）に導入して求めた。測定結果を表６に示す。
式（２）：ラジカル消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００５３】
【表６】
【００５４】
表６より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物には優れたＤＰＰＨラジカルの消去効果が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたラジカルの消去作用を有することがわかった。
【００５５】
＜抗酸化作用（スーパーオキサイドアニオン消去作用）の評価２＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のスーパーオキサイドアニオン消去作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００５６】
０．２５ｍＭ ＷＳＴ−１及び１ｍＭ Ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅを含むＨａｎｋｓ（＋）溶液７５μＬに、表７に示す濃度となるようにＨａｎｋｓ（＋）溶液で希釈した試料２５μＬを添加し、Ｘａｎｔｈｉｎｅ Ｏｘｉｄａｓｅ２５μＬ（０．００７５Ｕｎｉｔｓ）を加え、３７℃で１５分間反応後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試料が無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（３）の値をスーパーオキサイドアニオン消去率とした。評価結果を表７に示した。
式（３）：消去率＝｛１−（Ｂ）／（Ａ）｝×１００（％）
【００５７】
【表７】
【００５８】
表７より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物には有意なスーパーオキサイドアニオンの消去効果が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたスーパーオキサイドアニオンの消去作用を有することがわかった。
【００５９】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた抗酸化作用を有することが明らかとなった。
【００６０】
＜痩身作用（中性脂肪蓄積抑制作用）の評価＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物の脂肪細胞における中性脂肪蓄積抑制作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法２により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００６１】
皮下脂肪由来正常ヒト前駆脂肪細胞Ｃｒｙｏ・ＨＰＲＡＤ−ＳＱ（三光純薬株式会社）を、１ウェル当り１．０×１０４ 個となるように９６ウェルマイクロプレートに播種した。播種培地には、ＰＧＭ培地（１０質量％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），２ｍＭ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ，１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｅ，１００μｇ／ｍＬ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎｅ含有）を用いた。細胞が飽和状態になる直前に表８に示す濃度の試料を添加したＰＧＭ分化用培地（１０μｇ／ｍＬ インシュリン，１μＭ Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，２００μＭ Ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ，５００μＭ Ｉｓｏｂｕｔｙｌ−ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ含有）に交換し、脂肪細胞への分化誘導を行った。分化誘導開始後、コントロール群が成熟して細胞内に多数の脂肪滴が蓄積されるまで、１０日〜１４日間培養した。細胞を回収後、１０％中性緩衝ホルムアルデヒド液を用いて細胞を固定した。ＰＢＳにて洗浄の後、０．５ｗ／ｖ％オイルレッドＯ溶液を添加し、３７℃で２時間インキュベートした。ＰＢＳにて洗浄の後、メタノールを添加し、色素を抽出した。抽出後、マイクロプレートリーダーより、５５０ｎｍの吸光度を測定した。同時に、濁度として６５０ｎｍの吸光度を測定し、両測定値の差を用いて中性脂肪蓄積量を測定した。
測定結果を、試料無添加の培地を用いたコントロールにおける、中性脂肪蓄積量を１００とした相対値により、表８に示す。
【００６２】
【表８】
【００６３】
表８より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物を添加した培地では、有意な中性脂肪蓄積抑制効果が認められた。このことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた中性脂肪蓄積抑制作用を有することが明らかとなった。
【００６４】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた痩身作用を有することが明らかとなった。
【００６５】
＜抗炎症作用（ヒアルロニダーゼ活性阻害作用）の評価＞
ユリ科ウバユリ属植物抽出物のヒアルロニダーゼ活性阻害作用の評価を、以下に示す方法により行った。試料として、調製方法３により製造したユリ科ウバユリ属植物抽出物を用いた。
【００６６】
ヒアルロン酸カリウム塩（ヒト臍の緒由来）を０．９ｍｇ／ｍＬになるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し基質溶液とした。ヒアルロニダーゼ（ウシ精巣由来）を５，３００ｕｎｉｔ／ｍＬとなるように０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解し酵素溶液とした。酵素溶液は用時調製とした。緩衝液で任意の濃度に調製した試料溶液０．１ｍＬ及び酵素溶液０．０３ｍＬを試験管にとり、３７℃で２０分間反応させた。次に活性化剤を０．０６ｍＬ加え、３７℃で２０分間反応させた。さらに基質溶液を０．１５ｍＬ加え、３７℃で１時間反応させた。０．４Ｎ水酸化ナトリウム０．０６ｍＬを加え反応を停止させた後すぐに氷冷し、ホウ酸緩衝液（ｐＨ９．１）を０．０６ｍＬ添加し、３分間煮沸した後さらに氷冷した。ｐ−ＤＡＢＡ溶液２．０ｍＬを添加し、３７℃で２０分間反応させた後、反応溶液を９６ウェルマイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダーを用いて５８５ｎｍにおける吸光度を測定した。コントロールには、試料無添加の緩衝溶液を用いた。ヒアルロニダーゼ活性が阻害されると、分解産物であるＮ−アセチルグルコサミンが減少し、ｐ−ＤＡＢＡによる吸光度が低くなることから、ヒアルロニダーゼ阻害作用を求めた。試料が無添加のコントロールの吸光度を（Ａ）、試料を添加したときの吸光度を（Ｂ）としたとき、式（４）の値をヒアルロニダーゼ活性阻害率とした。評価結果を表９に示した。
式（４）：阻害率＝｛（Ａ）−（Ｂ）｝／（Ａ）×１００（％）
【００６７】
【表９】
【００６８】
表９より明らかなように、ユリ科ウバユリ属植物抽出物には有意なヒアルロニダーゼ活性阻害効果が認められた。このことより、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れたヒアルロニダーゼ活性阻害作用を有することがわかった。
【００６９】
以上のことから、ユリ科ウバユリ属植物抽出物は、優れた抗炎症作用を有することが明らかとなった。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項２】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項３】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤。
【請求項５】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【請求項１】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗老化剤。
【請求項２】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする美白剤。
【請求項３】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗酸化剤。
【請求項４】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする痩身剤。
【請求項５】
ユリ科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）ウバユリ属（Ｃａｒｄｉｏｃｒｉｎｕｍ）植物より選ばれる１種または２種以上の植物またはその抽出物を有効成分とする抗炎症剤。
【公開番号】特開２０１２−４１２８４（Ｐ２０１２−４１２８４Ａ）
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１８２２６３（Ｐ２０１０−１８２２６３）
【出願日】平成２２年８月１７日（２０１０．８．１７）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２４年３月１日（２０１２．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年８月１７日（２０１０．８．１７）
【出願人】（０００１３５３２４）株式会社ノエビア (258)
【Ｆターム（参考）】
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