抗血栓化合物
本発明は、式Ｉの化合物：オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストＩに関する
（式中、オリゴ糖は、構造Ｉの負に帯電した五糖類の残基であり、電荷は正に帯電した対イオンによって補償され；スペーサーは、１５−５０個の原子長を有する本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバンまたはその類似体から誘導された残基である。）または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグもしくはその溶媒和物に関する。本発明の化合物は、抗血栓活性を有し、血栓症の治療または予防に使用することができる。
（式中、オリゴ糖は、構造Ｉの負に帯電した五糖類の残基であり、電荷は正に帯電した対イオンによって補償され；スペーサーは、１５−５０個の原子長を有する本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバンまたはその類似体から誘導された残基である。）または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグもしくはその溶媒和物に関する。本発明の化合物は、抗血栓活性を有し、血栓症の治療または予防に使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗血栓化合物、活性成分として本化合物を含む医薬組成物、および薬物製造のための前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞、虚血および脳卒中は、アテローム性動脈硬化の冠動脈において閉塞性血栓の形成により引き起こされる。動脈血栓は、フィブリノゲン（の濃度の上昇）により凝集する血小板（栓球）によって形成される。このプロセスは、フィブリノゲンが分解されてフィブリンクロットになる凝固系の励起状態および不均衡に関連している。これら主要および二次的止血経路の１つにおける介入は、（動脈）血栓症の治療に不可欠である。
【０００３】
セリンプロテアーゼは、血液凝固カスケードで重要な役割を果たす酵素である。このプロテアーゼグループのファミリーは、例えば、トロンビン、トリプシン、ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、ＸＩＩａ因子およびプロテインＣである。トロンビンは、凝固カスケードにおける最終のセリンプロテアーゼ酵素である。トロンビンの主な機能は、フィブリノゲンを分解して、架橋して不溶性ゲルを形成するフィブリンモノマーを生成させることである。さらに、トロンビンは、カスケードの初期にＶおよびＶＩＩＩ因子の活性化によって、それ自体の産生を制御する。また、特定の受容体に作用して、血小板凝集、内皮細胞活性化および線維芽細胞増殖を引き起こすという細胞レベルでの重要な作用を有する。したがって、トロンビンは止血および血栓形成において中心的な調節的役割を有する。Ｘａ因子は、プロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する。Ｘａ因子の阻害により、効果的に血液凝固が抑制される。血小板凝集は、トロンビンだけでなく、ＡＤＰ、コラーゲンおよびエピネフリンなど、いくつかの活性化因子によって引き起こされる。すべての場合において、血小板凝集に至る最終の共通経路は、フィブリノゲンの受容体である主要な糖タンパク質複合体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのフィブリノゲンの結合である。したがって、このタンパク質へのフィブリノゲンの結合の阻害は、（動脈）血栓形成の予防および血栓障害の治療のために、血小板凝集を抑制する非常に有効な方法と考えられる。
【０００４】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３）は、インテグリンファミリーに属する表面受容体である。インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットの２つの鎖から成り、これらはカルシウム依存的様式で非共有結合によって一緒に保持されている。ＧＰＩＩｂは、二価陽イオン結合ドメインとサブユニット（αＩＩｂ）を構成し、一方、ＧＰＩＩＩａは、プロティピカル（ｐｒｏｔｙｐｉｃａｌ）なβサブユニット（β３）である。インテグリンは、体全体を通して細胞から単離されており、細胞−細胞および細胞−基質の接着およびシグナル伝達のメディエータである。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａには３つの結合部位があり、このうち１つはアミノ配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ結合部位）を認識し、他の１つはＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＱＡＧＤ結合部位）を認識し、さらに１つはＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＧＤ結合部位）を認識する。
【０００５】
循環する血小板ごとに、３５，０００から１００，０００のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体があり；大部分が血小板表面に分布し、内部に予備のより少量の蓄えを有する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体は、血小板がＡＤＰまたはトロンビンなどの外因性アゴニストによって活性化されるまで、この血漿リガンドと相互作用を起こさない。これが起こると、複合体の細胞外部分における立体配座の変化を生じさせる内から外へのシグナル（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ ｓｉｇｎａｌ）が発生し、立体配座の変化により分子がフィブリノゲンおよび他のリガンドへ結合することが可能になる。
【０００６】
フィブリノゲンのα鎖（ＲＧＤ）およびγ鎖（ＫＱＡＧＤＶ）断片を模倣している化合物がアンタゴニストとして作用する可能性がある。ペプチド模倣構造に基づく多数の強力なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが以前に報告されている。
【０００７】
いくつかの（非常に）強力な例には、Ｒｏ４３５０５４、ゼミロフィバン、ＲＷＪ５００４２、チロフィバンおよびラミフィバンがある。しかし、（１つには）化合物の半減期が短いことによって引き起こされる、血小板凝集の一貫した制御の欠如およびあいまいな薬理学的挙動により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて優れた効力および薬理学的特性を示す他のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのかなりの数が、さらに開発されていないか、または後期臨床試験に達したあと、保留されている。短い半減期は、遊離型薬物の血漿濃度における大きな変動につながり、用量反応における個人間変動の原因となる可能性がある（治療の監視が必要とされる。）。
【０００８】
さらにＨ．Ｄａｒｉｕｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２００１，１０３，Ｓ１１７−Ｓ１２４では、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに関するすべての大規模臨床試験において、治療効果は、ごくわずかなもので、さらに糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストで治療した患者群では、死亡率の増加すら観察されていたことを報告した。血小板フィブリノゲン受容体の制御についての知識が依然として非常に限られていることに加えて、本薬物の狭い治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）および限られた生物学的利用率は、この治療不成功の原因であると考えられた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
結論として、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが予測可能な抗血栓作用、好ましくは、より長い半減期を（血小板凝集の一貫したレベルの抑制を達成するために）有する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
欧州特許出願０４００５３４３．１において、現在、新規な化合物が報告されており、本化合物は、凝固カスケード（Ｘａ因子）および血小板凝集経路（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）の両方における２つの主要な標的を阻害することによる複合の薬理学的特性を有する二重阻害剤（ｄｕａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である。本発明は、特に興味深い薬理学的特性を有するそのような二重阻害剤に関する。
【００１１】
本発明の化合物は、式Ｉ
オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト Ｉ
（式中、オリゴ糖は、以下の構造の負に帯電した五糖類の残基であり、
【００１２】
【化３】
電荷は正に帯電した対イオンによって補償され；
スペーサーは、１５−５０個の原子長の本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバンまたはその類似体から誘導された残基である。）
を有し、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグもしくはその溶媒和物である。
【００１３】
本発明の化合物は、Ｘａ凝固因子のＡＴＩＩＩ介在による阻害およびフィブリノゲンのこの受容体への結合に拮抗することによる血小板凝集の抑制の両方により有効な抗血栓症薬である。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤を抗凝固療法と組み合わせる当技術分野で公知の併用療法（例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ（２００３）１２（９），１５６７、ＵＳ２００３／０１９９４５７Ａ１およびＵＳ６５４１４８８に記載のもの）と比較して、本発明の化合物の薬物動態学的および薬力学的プロフィールは、より一貫した血小板凝集の制御および用量反応におけるより少ない個人間変動をもたらす。
【００１４】
本発明の化合物は、血栓症を治療および（場合によって）予防することに有用である。これは凝固カスケードが活性化される多くの血栓および血栓形成前（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）の状態を含み、これらには深部静脈血栓、肺塞栓症、血栓静脈炎、血栓症または塞栓症による動脈閉塞、血管形成中または後の動脈再閉塞、動脈損傷または侵襲的心臓病学的手技後の再狭窄、術後の静脈血栓症または塞栓症、脳卒中および心筋梗塞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
好ましい実施形態では、スペーサーは、オリゴ糖残基の酸素を含まないスペーサーの「バックボーン」に沿って数えられる２５−３５個の原子を有する本質的に薬理学的不活性な結合残基である。スペーサーの化学的性質は、本発明の化合物の抗血栓活性に対して重要性が低い。スペーサーは、環式構造および不飽和結合などの（いくぶん）固定された要素を含む可能性がある。しかし、本発明の化合物のスペーサーは、好ましくは柔軟である。適切なスペーサーは、当業者により容易にデザインされることができる。しかし、合成上の理由のために、スペーサーは長い程適さないと考えられるがより長いスペーサーが、依然として本発明の化合物にうまく適用することができる。好ましいスペーサーは、少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。より好ましいスペーサーは、より多くの、好ましくは６つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。もっとも好ましいスペーサーは、＊−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、＊印で示された末端は、オリゴ糖残基の酸素に結合していることを示す。
【００１６】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基へのスペーサー付着部位は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト活性が消失しないとすれば、基本的に任意に選択することができる。したがって、（場合によってエステル化された）カルボン酸部分およびチロフィバン（またはその類似体）の塩基部分は、無変化のままでなければならない。
【００１７】
好ましくは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバン類似体から誘導された残基である。
【００１８】
本発明の一実施形態は、構造ＩＩを有する化合物である。
【００１９】
【化４】
【００２０】
正に帯電した対イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋などを意味する。好ましくは、本発明の化合物は、これらのナトリウム塩の形態である。
チロフィバンは、以下の構造を有する。
【００２１】
【化５】
【００２２】
「プロドラッグ」という用語は、例えば、式Ｉの化合物（式中、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基中のカルボキシレート基は、エステル化されている。）などの活性化合物へ体内で代謝される化合物を意味する。
【００２３】
本発明による溶媒和物は、水和物を含む。
【００２４】
本発明の化合物は、当技術分野で一般に公知の方法を使用して、アミノ酸、ペプチド模倣物または付加官能基（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）（例えば、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨなど）でチロフィバンを場合によって修飾することによって調製することができる。そのような修飾化合物の合成の例は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９，３５７−３７９（２００１）に記載されており、ここでは本化合物は、標的薬物送達のための潜在的ベクターとして示唆されている。本発明によれば、場合によって修飾されたチロフィバンは、（ａ）五糖類−スペーサー残基に結合するか、または（ｂ）引き続いて五糖類−スペーサー−残基に結合するスペーサーに結合する（例えば、ＷＯ９９／６５９３４；ＷＯ０１／４２２６２によって公知の方法により）。五糖類へのスペーサーの結合は、例えば、ＥＰ０６４９８５４に記載の方法を用いて実施することができる。
【００２５】
本発明の化合物を調製するための上記の方法における手順のステップであるペプチド結合は、ペプチド断片の結合（または縮合）のための当技術分野で一般に公知の方法、例えば、アジド法、混合無水物法、活性化エステル法、カルボジイミド法（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）によるか、または好ましくはＴＢＴＵなどのアンモニウム／ウロニウム塩の影響下、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの触媒およびラセミ化抑制化合物の添加によって実施することができる。概要は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００２）に示されている。
【００２６】
本化合物に存在するアミン官能基は、Ｎ−保護基（ｔｅｒｔ−ブチル臭化オキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基もしくはフタロイル（Ｐｈｔｈ）基などのαアミノ基の保護にペプチド化学において一般に使用される基を意味する。）による、合成手順の間に保護できるか、またはアジド部分のデマスキングによって導入できる。アミノ保護基およびそれらの除去に関する概要は、上記のＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて示されている。アミジン官能基が存在する場合、結合のステップで非保護のままにしておくか、またはアリルオキシカルボニルもしくはベンジルオキシカルボニルなどのカルバミン酸塩を用いて保護することができる。アミジン官能基は、前駆体として１，２，４−オキサジアゾリン−５−オン部分を用いて温和な条件下で導入するのが好ましい。
【００２７】
カルボン酸基を、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどのα−カルボン酸基の保護のために、ペプチド化学において一般に使用される基によって保護することができる。修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのカルボン酸基を、ベンジルエステルとして好ましくは保護する。保護基の除去は、これら保護基の性質によって異なる方法で行うことができる。通常、脱保護は、酸性条件下およびスカベンジャーの存在下、または接触水素化などの還元条件下で行う。
【００２８】
オリゴ糖へのチロフィバン（またはその類似体）の抱合の必要条件は、カルボキシレート基などの直交性反応型（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ）のアンカー基が存在することで、これらはオリゴ糖−スペーサー誘導体に結合するか、またはスペーサーを通してオリゴ糖−スペーサー誘導体に結合することができる。大部分の場合、そのような抱合を可能にするために、チロフィバンの（追加的な）修飾が必要である。
【００２９】
式Ｉの化合物への途中のスペーサー誘導構成要素の構築は、アミノ酸、これらの誘導体もしくはペプチド模倣物の段階的導入による直鎖状様式、または中間構築物のブロック結合による収束的様式でのいずれかの当技術分野で公知の方法を用いる様々な方法において達成することができる。
【００３０】
遊離塩基の形態で生じる可能性のある本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で反応混合物から単離することができる。また、薬学的に許容される塩は、式Ｉの遊離塩基を、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸などの有機または無機酸で処理することによって得ることができる。
【００３１】
本発明の化合物またはその中間体は、キラル炭素原子を有することができ、したがって、純粋なエナンチオマー、またはエナンチオマーの混合物、またはジアステレオマーを含む混合物として得ることができる。純粋なエナンチオマーを得るための方法は、例えば、光学活性な酸およびラミセ混合物から得られる塩の結晶化、またはキラルカラムを用いたクロマトグラフィーなどの当技術分野において公知である。ジアステレオマーのために、順相または逆相カラムを使用することができる。
【００３２】
本発明の化合物は、経腸的または非経口的に投与することができる。正確な用量ならびにこれら化合物およびその組成のレジメンは、薬物を投与される個々の被験者の必要性、苦痛または必要性の程度および医療従事者の判断に必然的に依存する。通常、非経口投与は、吸収に多く依存する他の投与方法より用量が少ない。しかし、ヒトにおける１日投与量は、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００３３】
また、本発明の化合物を用いて製造された薬物を、（短期）抗凝固療法における補助剤として使用することができる。そのような場合において、本薬物を、アスピリン、クロピドグレルまたはスタチンなどのそのような疾患状態を治療することにおいて有用な他の化合物と共に投与する。例えば、標準的参考文献のＧｅｎｎａｒｏら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、特にＰａｒｔ ８：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照）に記載のように、薬学的に適切な助剤と混合して、本化合物を、丸剤、錠剤などの固体用量単位に圧縮するか、またはカプセルもしくは坐剤に加工することができる。また、薬学的に適切な液体を用いて、本化合物を、例えば、注射製剤として、または例えば、鼻腔噴霧剤としての使用のためなど噴霧剤として、溶液、懸濁液、乳濁液の形態に適用することができる。
【００３４】
錠剤のような用量単位を製造するために、増量剤、着色剤、ポリマー結合剤などの従来の添加物の使用が考えられる。一般に、活性化合物の機能を妨げない薬学的に許容される添加剤を使用することができる。組成を投与することができる適切な担体は、適切な量において使用したラクトース、デンプン、セルロース誘導体など、またはその混合物を含む。
【００３５】
本発明は、以下の実施例により、さらに例証される。
【００３６】
（実施例）
使用される略語
ＡＤＰ＝アデノシン二リン酸
ＡＴＩＩＩ＝抗トロンビンＩＩＩ
Ｂｎ＝ベンジル
ＤｉＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド
Ｅｔ＝エチル
Ｍｅ＝メチル
ＲＴ＝室温
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＲＡＰ＝トロンビン受容体アゴニストペプチド
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
【実施例１】
【００３７】
メチル Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜１２−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサ−ドデシル＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシドノナキスナトリウム塩（３）
【００３８】
（スキーム１）
化合物３を、化合物１（１０２ｍｇ、５４μｍｏｌ）［ＷＯ０１／４２２６２に記載の誘導体化された単糖類５とＵＳ２００４／００２４１９７に記載の四糖類４８とを、脱保護および硫酸化を含むこれら特許出願に記載の方法と同様な方法を用いて結合させることにより得ることができる。］とＥＰ０４００５３４３．１に記載のように調製した化合物２（６０ｍｇ、５７μｍｏｌ）の結合により得た。
【００３９】
こうして、カルボン酸誘導体（５７μｍｏｌ）２を、乾燥ＤＭＦ（２×３ｍＬ）中で繰り返し濃縮することにより乾燥させ、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、Ｎ２雰囲気下のＴＢＴＵ（１９ｍｇ、５７μｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（９．８μＬ、５７μｍｏｌ）の存在下で撹拌した。１時間後に、五糖類１（５３μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ＲＴで終夜撹拌し、イオン交換（Ｍｏｎｏ−Ｑ）および逆相（Ｌｕｎａ Ｃ１８）クロマトグラフィーによって分析した。反応混合物を濃縮した（＜５０℃、１５ｍｍＨｇ）。（粗）生成物（Ｈ２Ｏ／ｔ−ＢｕＯＨ中に１０ｍｇ／ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）を、１０％Ｐｄ／Ｃ（等量（重量）を粗成生物に対して加えた。）による水素添加（Ｈ２）により脱保護した。１６時間後に、溶液を脱気し、０．４５μＭ ＨＰＬＣフィルターによってろ過し、減圧下（＜５０℃、１５ｍｍＨｇ）で濃縮した。抱合体を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、緩衝液：Ｈ２Ｏ→２Ｍ ＮａＣｌ）により精製した後、セファデックスＧ２５カラム（Ｈ２Ｏ）により脱塩し、凍結乾燥させた。収量７２ｍｇ（５２％）。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ７．８４（ｍ，１Ｈ）、７．７５（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．４２（ｔ，１Ｈ）、６．８３（ｄ，２Ｈ）、６．４８（ｄ，２Ｈ）、５．３８（ｄ，１Ｈ）、５．３３（ｍ，１Ｈ）、５．０８（ｄ，１Ｈ）、５．０２（ｂｓ，１Ｈ）、４．５８（ｄ，１Ｈ）、４．４６（ｂｓ，２Ｈ）、４．２８（ｍ，２Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｍ，２Ｈ）、４．１１（ｍ，２Ｈ）、４．０４（ｄ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．８４（ｍ，２Ｈ）、３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｍ，１Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ）、３．６６（ｍ，２Ｈ）、３．６２〜３．３３（ｍ，５４Ｈ）、３．２０（ｄｄ，１Ｈ）、３．１８（ｍ，１Ｈ）、２．９２（ｍ，２Ｈ）、１．９２（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．５８（ｍ，１Ｈ）、１．４４（ｍ，２Ｈ）、１．３３（ｍ，４Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ １２２５．２［Ｍ＋５Ｈ＋２Ｎａ］２−、８２３．８［Ｍ＋３Ｎａ＋３Ｈ］３−、８１６．５［Ｍ＋２Ｎａ＋４Ｈ］３−、８０９．１［Ｍ＋Ｎａ＋５Ｈ］３−。
【００４０】
【化６】
【実施例２】
【００４１】
薬理学
１．１ ＡＤＰにより誘発されたモルモットの血小板凝集の抑制に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトまたはモルモットの多血小板血漿（ＰＲＰ）に対するアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の添加は、血小板凝集を誘発する。この凝集は、ＰＲＰの光学濃度（ＯＤ）における変化を測定することにより評価することができる。以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、モルモットのＡＤＰ誘発凝集への干渉について試験化合物を評価するために使用した。
【００４２】
材料
多血小板血漿（ＰＲＰ）：自由流（Ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）の血液を、健常ボランティアまたはモルモットから採取し、蒸留水中の０．１容量のクエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ、３．８％（ｗ／ｖ）に収集する。最終濃度は、０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血を、室温でＨｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ、すなわち９００ｒｐｍ）で遠心する。１５分後、遠心を、遠心機のブレーキを切って中止し、上清（＝ＰＲＰ）を収集する。０．９％ＮａＣｌ中５０μＭのＡＤＰ（分析グレード）の新鮮なＭＱ水溶液を直ちに使用する。このアッセイにおいて、チロフィバン（静注用０．２５ｍｇ／ｍＬ濃縮液として購入したＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））は、３０〜６０ｎＭの濃度で５μＭ ＡＤＰにより誘発されたヒトの血小板凝集を５０％抑制する（ＩＣ５０）。
【００４３】
器具
１．シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血球計数器モデルＫＸ−２１。
２．６２０ｎｍフィルター付きのラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）ｉＥＭＳリーダーＭＦ、１，０００ｒｐｍおよび一定温度３７℃に設定されたオービタルシェイカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）。吸収を、ラボシステムズｉＥＭＳプログラムで測定する。
３．針付き血液採取システム６００ｍＬ、ａｒｔＰ４２０３（ＮＰＢＩ）。
４．９６ウェル平底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）。
【００４４】
手順
上清内の血小板（ＰＲＰ）を、シスメックス血球計数器を用いて計数し、上清をＰＰＰ（乏血小板血漿）で希釈し、約４００，０００±５０，０００ｐｌｔ／ｍＬを含むＰＲＰを得る。ＰＲＰは、室温で２０分以上、３時間未満で安定化するはずである。
【００４５】
１５０μＬのＰＲＰを、ピペットでマイクロプレートのウェルに移す。様々な濃度（化合物当たり７つの濃度）の３０μＬの試験化合物またはビヒクルを加え、マイクロプレートを、３７℃でラボシステムズｉＥＭＳリーダーＭＦにかける。次に光学濃度（ＯＤ６２０）を、６２０ｎｍで測定する。リーダーで２分間振盪（１，０００ｒｐｍ）後、ＯＤを再度測定する。これは血小板の安定性（自然発生の血小板凝集のないこと）について検証するためである。次に、５０μＭ ＡＤＰ溶液２０μＬを加え、ＯＤを、６２０で毎分動力学的に１４分間測定する。２つの測定間に、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振盪させる。試験化合物ごとに、異なるボランティア由来のＰＲＰを用いて少なくとも２回の実験で調査する。
【００４６】
反応の評価
化合物の各濃度（ビヒクルを含む）での平均ＯＤを、ｔ＝０分およびｔ＝１０分で算出する。各濃度における抑制率を、以下の式を用いて算出する。
【００４７】
【数１】
【００４８】
試験化合物のＩＣ５０は、ＡＤＰ誘発の血小板凝集が５０％減少する濃度である。このために、抑制率の値を、化合物の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０を用いて（様々な傾きで）算出する。
【００４９】
１．２ ＴＲＡＰにより誘発されたヒトの血小板凝集の抑制に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける洗浄されたヒトまたはモルモットの血小板（ＷＰＬ）へのトロンビン受容体アゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）の添加により、血小板凝集を誘発する。この凝集は、ＷＰＬの光学濃度を測定することにより判定することができる。ここに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、ＴＲＡＰ誘発のヒト血小板凝集を抑制する試験化合物の活性を分析するために用いられる。マイクロプレートリーダーは、同時にいくつかの化合物の活性を測定するために用いられる。
【００５０】
材料
＊ワトソン緩衝液の組成：
Ｈ２Ｏ １Ｌ当たり
ＮａＣｌ ７．８３ｇ（１３４ｍｍｏｌ）
ＫＣｌ ０．２２ｇ（２．９ｍｍｏｌ）
ＮａＨＣＯ３ １．０１ｇ（１２ｍｍｏｌ）
Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ ０．０６ｇ（０．３４ｍｍｏｌ）
ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ０．２０ｇ（１ｍｍｏｌ）
グルコース０．９０ｇ（５ｍｍｏｌ）
ＨＥＰＥＳ １．１９ｇ（５ｍｍｏｌ）
ｐＨは、ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）ＴＮＰ緩衝液で７．４に調整する。
【００５１】
＊ＴＮＰ緩衝液の組成：
Ｈ２Ｏ １Ｌ当たり
トロメタミン（トリス）６．０５７ｇ（５０ｍｍｏｌ）
ＮａＣｌ ５．８４４ｇ（１００ｍｍｏｌ）
ＰＥＧ６０００ ３．０ｇ
溶液のｐＨは、ＨＣｌ（１０ｍｏｌ／Ｌ）により３７℃で７．４に調整する。
【００５２】
＊ＰＧＩ２溶液：
ＫＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）中の１ｍｇ／ｍＬのプロスタグランジンＩ２原液を−２０℃で保存する。使用直前に、氷冷ＮａＣｌ（９．０ｇ／Ｌ）中の５μｇ／ｍＬの溶液を調製する。
【００５３】
＊多血小板血漿（ＰＲＰ）：
自由流の血液を、健常ボランティアまたはモルモットから採取し、ＭＱ水中の０．１容量の３．８％クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）に収集する。最終濃度は、０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血を、室温でＨｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ）で遠心する。１５分後、遠心を、遠心機のブレーキを切って中止する。さらに上清（＝ＰＲＰ）を収集し、乏血小板血漿で希釈し、約４００，０００血小板／ｍＬを含む懸濁液を得る。
【００５４】
＊乏血小板血漿（ＰＰＰ）：
クエン酸塩添加血を、ＲＴで約２０，０００Ｎ／ｋｇで１０分間遠心し、ＰＰＰをサイホンで移す。
【００５５】
＊洗浄血小板（ＷＰＬ）：
一定分量の１μＬのＰＧＩ２溶液を、１ｍＬのＰＲＰに加え、その後、ＲＴで約２０，０００Ｎ／ｋｇで１０分間遠心する。血漿をサイホンで移し、５ｎｇ／ｍＬのＰＧＩ２を含むワトソン緩衝液を血小板ペレットに加え、血小板を、プラスチック棒で静かに撹拌しながら原容量に再懸濁する。血小板懸濁液を、２０，０００Ｎ／ｋｇで再度遠心する。血小板をワトソン緩衝液で再懸濁し、約４００，０００血小板／ｍＬを含む懸濁液を得る。
【００５６】
＊ＴＲＡＰ溶液：
ＴＲＡＰをＨ２Ｏに溶解し、５０μｍｏｌ／Ｌを含む溶液を得る。新鮮な溶液を毎日調製する必要がある。すべての水溶液に対して、超高純度のＨ２Ｏ（ミリＱの品質）を使用する。
【００５７】
＊ヒトフィブリノゲン（Ｋｏｒｄｉａ／ＥＲＬ、ａｒｔ ｎｒ：ＦＩＢ２粉末）：０．５ｇのフィブリノゲン粉末を、真空下で５０ｍＬのＭＱ水に溶解する。この原液を、−２０℃で１００μＬの一定分量で保存する。使用直前に、０．５ｍｇ／ｍＬの生理食塩水溶液を調製する。
【００５８】
このアッセイにおいて、チロフィバン（静注用０．２５ｍｇ／ｍＬ濃縮液として購入したＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））は、３０〜６０ｎＭ（ＩＣ５０）の最終濃度で５μＭ ＴＲＡＰにより誘発されたヒトの血小板凝集を５０％抑制する。
【００５９】
手順
ＷＰＬ濃度を、シスメックス血球計数器で計数し、懸濁液をワトソン緩衝剤で希釈し、約４００，０００ｐｌｔ／ｍＬの濃度を得る。使用前に、ＷＰＬを、室温で２０分以上、３〜４時間未満で安定化させる。
【００６０】
１５０μＬのＷＰＬを、ピペットでマイクロプレートのウェルに移す。試験化合物またはビヒクル１５μＬおよび１５μＬのフィブリノゲン溶液を加え、マイクロプレートを、３７℃でマイクロプレートリーダーにかける。次に、光学密度（ＯＤ）を、４０５ｎｍで測定し、リーダーにおいて２分間振盪後、血小板の安定性（自然発生の血小板凝集のないこと）を検証するために、ＯＤ４０５を再度測定する。５０μＭ ＴＲＡＰ溶液２０μＬを加え、ＯＤ４０５を４０５ｎｍで１４分間に毎分、動力学的に測定する。２つの測定間に、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振盪させる。試験化合物のＩＣ５０の判定のために、化合物ごとに、異なるボランティア由来のＷＰＬを用いて少なくとも２回の実験において調査する。
【００６１】
反応の評価：
各濃度（ビヒクルを含む）の平均ＯＤを、ｔ＝０分およびｔ＝１０分で算出する。各濃度における抑制率を、以下の式によりマイクロソフトエクセルを用いて算出する。
【００６２】
【数２】
【００６３】
化合物の濃度を、抑制率に対してプロットする。ＩＣ５０をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０を用いて（様々な傾きで）算出する。試験化合物のＩＣ５０は、ＴＲＡＰ誘発の血小板凝集が５０％減少する濃度である。
【００６４】
１．３ ヒト血漿における抗Ｘａ因子活性の判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ヒト血漿における試験化合物の抗Ｘａ因子活性を、ＴｅｉｅｎおよびＬｉｅにより報告された方法を用いてＳ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ Ｌｔｄ、スウェーデン、ムルンダール（Ｍｏｌｎｄａｌ））によりアミド分解的（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に測定した（Ｔｅｉｅｎ ＡＮ，Ｌｉｅ Ｍ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ｈｅｐａｒｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９７７，１０：３９９−４１０）。抗Ｘａ活性を、アミド分解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）と標準ヘパリンの検量線との比較後にＵ／μｍｏｌで表す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
２．１薬物動態
化合物３の薬物動態学的特性について３００〜４００ｇｒのオスのウィスター系ラットにおいて検査した。ラットを、Ｏ２／Ｎ２Ｏ／イソフルランの混合物の吸入により麻酔し、その後に右側の頚静脈にカニューレを挿入した。翌日、ラットに１００または５００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を皮下注射した。皮下注射後、血液をいくつかの時間間隔で検体採取した。次に血液を遠心し、その後、血漿をサイホンで移し、使用するまで−２０℃で保存した。試験化合物自体の原液から作成した検量線に対する得られた血漿試料中の試験化合物の濃度を、Ｓ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ Ｌｔｄ、スウェーデン、ムルンダール（Ｍｏｌｎｄａｌ））を用いてＴｅｉｅｎおよびＬｉｅの方法を基にした抗Ｘａ活性の測定によりアミド分解的に測定した（Ｔｅｉｅｎ ＡＮ，Ｌｉｅ Ｍ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ｈｅｐａｒｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９７７，１０：３９９−４１０）。試料中の濃度をｎｍｏｌ／ｍＬで表し、動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎのノンコンパートメントモデルで算出した。
【００６７】
【表２】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な抗血栓化合物、活性成分として本化合物を含む医薬組成物、および薬物製造のための前記化合物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
急性心筋梗塞、虚血および脳卒中は、アテローム性動脈硬化の冠動脈において閉塞性血栓の形成により引き起こされる。動脈血栓は、フィブリノゲン（の濃度の上昇）により凝集する血小板（栓球）によって形成される。このプロセスは、フィブリノゲンが分解されてフィブリンクロットになる凝固系の励起状態および不均衡に関連している。これら主要および二次的止血経路の１つにおける介入は、（動脈）血栓症の治療に不可欠である。
【０００３】
セリンプロテアーゼは、血液凝固カスケードで重要な役割を果たす酵素である。このプロテアーゼグループのファミリーは、例えば、トロンビン、トリプシン、ＶＩＩａ、ＩＸａ、Ｘａ、ＸＩａ、ＸＩＩａ因子およびプロテインＣである。トロンビンは、凝固カスケードにおける最終のセリンプロテアーゼ酵素である。トロンビンの主な機能は、フィブリノゲンを分解して、架橋して不溶性ゲルを形成するフィブリンモノマーを生成させることである。さらに、トロンビンは、カスケードの初期にＶおよびＶＩＩＩ因子の活性化によって、それ自体の産生を制御する。また、特定の受容体に作用して、血小板凝集、内皮細胞活性化および線維芽細胞増殖を引き起こすという細胞レベルでの重要な作用を有する。したがって、トロンビンは止血および血栓形成において中心的な調節的役割を有する。Ｘａ因子は、プロトロンビンのトロンビンへの変換を触媒する。Ｘａ因子の阻害により、効果的に血液凝固が抑制される。血小板凝集は、トロンビンだけでなく、ＡＤＰ、コラーゲンおよびエピネフリンなど、いくつかの活性化因子によって引き起こされる。すべての場合において、血小板凝集に至る最終の共通経路は、フィブリノゲンの受容体である主要な糖タンパク質複合体ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへのフィブリノゲンの結合である。したがって、このタンパク質へのフィブリノゲンの結合の阻害は、（動脈）血栓形成の予防および血栓障害の治療のために、血小板凝集を抑制する非常に有効な方法と考えられる。
【０００４】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ（αＩＩｂβ３）は、インテグリンファミリーに属する表面受容体である。インテグリンは、αサブユニットおよびβサブユニットの２つの鎖から成り、これらはカルシウム依存的様式で非共有結合によって一緒に保持されている。ＧＰＩＩｂは、二価陽イオン結合ドメインとサブユニット（αＩＩｂ）を構成し、一方、ＧＰＩＩＩａは、プロティピカル（ｐｒｏｔｙｐｉｃａｌ）なβサブユニット（β３）である。インテグリンは、体全体を通して細胞から単離されており、細胞−細胞および細胞−基質の接着およびシグナル伝達のメディエータである。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａには３つの結合部位があり、このうち１つはアミノ配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ結合部位）を認識し、他の１つはＬｙｓ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＱＡＧＤ結合部位）を認識し、さらに１つはＬｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＫＧＤ結合部位）を認識する。
【０００５】
循環する血小板ごとに、３５，０００から１００，０００のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体があり；大部分が血小板表面に分布し、内部に予備のより少量の蓄えを有する。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体は、血小板がＡＤＰまたはトロンビンなどの外因性アゴニストによって活性化されるまで、この血漿リガンドと相互作用を起こさない。これが起こると、複合体の細胞外部分における立体配座の変化を生じさせる内から外へのシグナル（ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ ｓｉｇｎａｌ）が発生し、立体配座の変化により分子がフィブリノゲンおよび他のリガンドへ結合することが可能になる。
【０００６】
フィブリノゲンのα鎖（ＲＧＤ）およびγ鎖（ＫＱＡＧＤＶ）断片を模倣している化合物がアンタゴニストとして作用する可能性がある。ペプチド模倣構造に基づく多数の強力なＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが以前に報告されている。
【０００７】
いくつかの（非常に）強力な例には、Ｒｏ４３５０５４、ゼミロフィバン、ＲＷＪ５００４２、チロフィバンおよびラミフィバンがある。しかし、（１つには）化合物の半減期が短いことによって引き起こされる、血小板凝集の一貫した制御の欠如およびあいまいな薬理学的挙動により、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて優れた効力および薬理学的特性を示す他のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのかなりの数が、さらに開発されていないか、または後期臨床試験に達したあと、保留されている。短い半減期は、遊離型薬物の血漿濃度における大きな変動につながり、用量反応における個人間変動の原因となる可能性がある（治療の監視が必要とされる。）。
【０００８】
さらにＨ．Ｄａｒｉｕｓ ｉｎ Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ．２００１，１０３，Ｓ１１７−Ｓ１２４では、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストに関するすべての大規模臨床試験において、治療効果は、ごくわずかなもので、さらに糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体アンタゴニストで治療した患者群では、死亡率の増加すら観察されていたことを報告した。血小板フィブリノゲン受容体の制御についての知識が依然として非常に限られていることに加えて、本薬物の狭い治療域（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）および限られた生物学的利用率は、この治療不成功の原因であると考えられた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
結論として、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストが予測可能な抗血栓作用、好ましくは、より長い半減期を（血小板凝集の一貫したレベルの抑制を達成するために）有する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
欧州特許出願０４００５３４３．１において、現在、新規な化合物が報告されており、本化合物は、凝固カスケード（Ｘａ因子）および血小板凝集経路（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）の両方における２つの主要な標的を阻害することによる複合の薬理学的特性を有する二重阻害剤（ｄｕａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）である。本発明は、特に興味深い薬理学的特性を有するそのような二重阻害剤に関する。
【００１１】
本発明の化合物は、式Ｉ
オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト Ｉ
（式中、オリゴ糖は、以下の構造の負に帯電した五糖類の残基であり、
【００１２】
【化３】
電荷は正に帯電した対イオンによって補償され；
スペーサーは、１５−５０個の原子長の本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバンまたはその類似体から誘導された残基である。）
を有し、または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグもしくはその溶媒和物である。
【００１３】
本発明の化合物は、Ｘａ凝固因子のＡＴＩＩＩ介在による阻害およびフィブリノゲンのこの受容体への結合に拮抗することによる血小板凝集の抑制の両方により有効な抗血栓症薬である。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤を抗凝固療法と組み合わせる当技術分野で公知の併用療法（例えば、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ（２００３）１２（９），１５６７、ＵＳ２００３／０１９９４５７Ａ１およびＵＳ６５４１４８８に記載のもの）と比較して、本発明の化合物の薬物動態学的および薬力学的プロフィールは、より一貫した血小板凝集の制御および用量反応におけるより少ない個人間変動をもたらす。
【００１４】
本発明の化合物は、血栓症を治療および（場合によって）予防することに有用である。これは凝固カスケードが活性化される多くの血栓および血栓形成前（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）の状態を含み、これらには深部静脈血栓、肺塞栓症、血栓静脈炎、血栓症または塞栓症による動脈閉塞、血管形成中または後の動脈再閉塞、動脈損傷または侵襲的心臓病学的手技後の再狭窄、術後の静脈血栓症または塞栓症、脳卒中および心筋梗塞を含むが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
好ましい実施形態では、スペーサーは、オリゴ糖残基の酸素を含まないスペーサーの「バックボーン」に沿って数えられる２５−３５個の原子を有する本質的に薬理学的不活性な結合残基である。スペーサーの化学的性質は、本発明の化合物の抗血栓活性に対して重要性が低い。スペーサーは、環式構造および不飽和結合などの（いくぶん）固定された要素を含む可能性がある。しかし、本発明の化合物のスペーサーは、好ましくは柔軟である。適切なスペーサーは、当業者により容易にデザインされることができる。しかし、合成上の理由のために、スペーサーは長い程適さないと考えられるがより長いスペーサーが、依然として本発明の化合物にうまく適用することができる。好ましいスペーサーは、少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。より好ましいスペーサーは、より多くの、好ましくは６つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む。もっとも好ましいスペーサーは、＊−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−であり、＊印で示された末端は、オリゴ糖残基の酸素に結合していることを示す。
【００１６】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基へのスペーサー付着部位は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト活性が消失しないとすれば、基本的に任意に選択することができる。したがって、（場合によってエステル化された）カルボン酸部分およびチロフィバン（またはその類似体）の塩基部分は、無変化のままでなければならない。
【００１７】
好ましくは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバン類似体から誘導された残基である。
【００１８】
本発明の一実施形態は、構造ＩＩを有する化合物である。
【００１９】
【化４】
【００２０】
正に帯電した対イオンは、Ｈ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋などを意味する。好ましくは、本発明の化合物は、これらのナトリウム塩の形態である。
チロフィバンは、以下の構造を有する。
【００２１】
【化５】
【００２２】
「プロドラッグ」という用語は、例えば、式Ｉの化合物（式中、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト残基中のカルボキシレート基は、エステル化されている。）などの活性化合物へ体内で代謝される化合物を意味する。
【００２３】
本発明による溶媒和物は、水和物を含む。
【００２４】
本発明の化合物は、当技術分野で一般に公知の方法を使用して、アミノ酸、ペプチド模倣物または付加官能基（ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｒｏｕｐ）（例えば、−ＣＯＯＨ、−ＮＨ２、−ＳＨ、−ＯＨなど）でチロフィバンを場合によって修飾することによって調製することができる。そのような修飾化合物の合成の例は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２９，３５７−３７９（２００１）に記載されており、ここでは本化合物は、標的薬物送達のための潜在的ベクターとして示唆されている。本発明によれば、場合によって修飾されたチロフィバンは、（ａ）五糖類−スペーサー残基に結合するか、または（ｂ）引き続いて五糖類−スペーサー−残基に結合するスペーサーに結合する（例えば、ＷＯ９９／６５９３４；ＷＯ０１／４２２６２によって公知の方法により）。五糖類へのスペーサーの結合は、例えば、ＥＰ０６４９８５４に記載の方法を用いて実施することができる。
【００２５】
本発明の化合物を調製するための上記の方法における手順のステップであるペプチド結合は、ペプチド断片の結合（または縮合）のための当技術分野で一般に公知の方法、例えば、アジド法、混合無水物法、活性化エステル法、カルボジイミド法（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）によるか、または好ましくはＴＢＴＵなどのアンモニウム／ウロニウム塩の影響下、特にＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよびＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの触媒およびラセミ化抑制化合物の添加によって実施することができる。概要は、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１）およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎ．Ｓｅｗａｌｄ ａｎｄ Ｈ．−Ｄ．Ｊａｋｕｂｋｅ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，２００２）に示されている。
【００２６】
本化合物に存在するアミン官能基は、Ｎ−保護基（ｔｅｒｔ−ブチル臭化オキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基もしくはフタロイル（Ｐｈｔｈ）基などのαアミノ基の保護にペプチド化学において一般に使用される基を意味する。）による、合成手順の間に保護できるか、またはアジド部分のデマスキングによって導入できる。アミノ保護基およびそれらの除去に関する概要は、上記のＴｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ ３およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙにおいて示されている。アミジン官能基が存在する場合、結合のステップで非保護のままにしておくか、またはアリルオキシカルボニルもしくはベンジルオキシカルボニルなどのカルバミン酸塩を用いて保護することができる。アミジン官能基は、前駆体として１，２，４−オキサジアゾリン−５−オン部分を用いて温和な条件下で導入するのが好ましい。
【００２７】
カルボン酸基を、ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどのα−カルボン酸基の保護のために、ペプチド化学において一般に使用される基によって保護することができる。修飾されたＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストのカルボン酸基を、ベンジルエステルとして好ましくは保護する。保護基の除去は、これら保護基の性質によって異なる方法で行うことができる。通常、脱保護は、酸性条件下およびスカベンジャーの存在下、または接触水素化などの還元条件下で行う。
【００２８】
オリゴ糖へのチロフィバン（またはその類似体）の抱合の必要条件は、カルボキシレート基などの直交性反応型（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ ｒｅａｃｔｉｖｅ）のアンカー基が存在することで、これらはオリゴ糖−スペーサー誘導体に結合するか、またはスペーサーを通してオリゴ糖−スペーサー誘導体に結合することができる。大部分の場合、そのような抱合を可能にするために、チロフィバンの（追加的な）修飾が必要である。
【００２９】
式Ｉの化合物への途中のスペーサー誘導構成要素の構築は、アミノ酸、これらの誘導体もしくはペプチド模倣物の段階的導入による直鎖状様式、または中間構築物のブロック結合による収束的様式でのいずれかの当技術分野で公知の方法を用いる様々な方法において達成することができる。
【００３０】
遊離塩基の形態で生じる可能性のある本発明の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で反応混合物から単離することができる。また、薬学的に許容される塩は、式Ｉの遊離塩基を、塩化水素、臭化水素、ヨウ化水素、硫酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、マレイン酸、マロン酸、メタンスルホン酸、フマル酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、アスコルビン酸などの有機または無機酸で処理することによって得ることができる。
【００３１】
本発明の化合物またはその中間体は、キラル炭素原子を有することができ、したがって、純粋なエナンチオマー、またはエナンチオマーの混合物、またはジアステレオマーを含む混合物として得ることができる。純粋なエナンチオマーを得るための方法は、例えば、光学活性な酸およびラミセ混合物から得られる塩の結晶化、またはキラルカラムを用いたクロマトグラフィーなどの当技術分野において公知である。ジアステレオマーのために、順相または逆相カラムを使用することができる。
【００３２】
本発明の化合物は、経腸的または非経口的に投与することができる。正確な用量ならびにこれら化合物およびその組成のレジメンは、薬物を投与される個々の被験者の必要性、苦痛または必要性の程度および医療従事者の判断に必然的に依存する。通常、非経口投与は、吸収に多く依存する他の投与方法より用量が少ない。しかし、ヒトにおける１日投与量は、好ましくは０．０００１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．００１〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。
【００３３】
また、本発明の化合物を用いて製造された薬物を、（短期）抗凝固療法における補助剤として使用することができる。そのような場合において、本薬物を、アスピリン、クロピドグレルまたはスタチンなどのそのような疾患状態を治療することにおいて有用な他の化合物と共に投与する。例えば、標準的参考文献のＧｅｎｎａｒｏら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１８版，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０、特にＰａｒｔ ８：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅを参照）に記載のように、薬学的に適切な助剤と混合して、本化合物を、丸剤、錠剤などの固体用量単位に圧縮するか、またはカプセルもしくは坐剤に加工することができる。また、薬学的に適切な液体を用いて、本化合物を、例えば、注射製剤として、または例えば、鼻腔噴霧剤としての使用のためなど噴霧剤として、溶液、懸濁液、乳濁液の形態に適用することができる。
【００３４】
錠剤のような用量単位を製造するために、増量剤、着色剤、ポリマー結合剤などの従来の添加物の使用が考えられる。一般に、活性化合物の機能を妨げない薬学的に許容される添加剤を使用することができる。組成を投与することができる適切な担体は、適切な量において使用したラクトース、デンプン、セルロース誘導体など、またはその混合物を含む。
【００３５】
本発明は、以下の実施例により、さらに例証される。
【００３６】
（実施例）
使用される略語
ＡＤＰ＝アデノシン二リン酸
ＡＴＩＩＩ＝抗トロンビンＩＩＩ
Ｂｎ＝ベンジル
ＤｉＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ―ジメチルホルムアミド
Ｅｔ＝エチル
Ｍｅ＝メチル
ＲＴ＝室温
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩
ＴＲＡＰ＝トロンビン受容体アゴニストペプチド
Ｚ＝ベンジルオキシカルボニル
【実施例１】
【００３７】
メチル Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−４−Ｏ−＜＜１２−Ｎ−＜３−｛［１５−Ｎ−（１５−アザ−１−ケト−３，６，９，１２−テトラオキサ−ペンタデシル）］−カルボニル｝−ベンゼンスルホニル＞−４−Ｏ−｛４−（４−ピペリジニル）−ブチル｝−Ｌ−チロシル＞−１２−アザ−３，６，９−トリオキサ−ドデシル＞＞−６−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−β−Ｄ−グルコピラヌロノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシル−（１−＞４）−Ｏ−２，３−ジ−Ｏ−メチル−α−Ｌ−イドピラヌロノシル−（１−＞４）−２，３，６−トリ−Ｏ−スルホ−α−Ｄ−グルコピラノシドノナキスナトリウム塩（３）
【００３８】
（スキーム１）
化合物３を、化合物１（１０２ｍｇ、５４μｍｏｌ）［ＷＯ０１／４２２６２に記載の誘導体化された単糖類５とＵＳ２００４／００２４１９７に記載の四糖類４８とを、脱保護および硫酸化を含むこれら特許出願に記載の方法と同様な方法を用いて結合させることにより得ることができる。］とＥＰ０４００５３４３．１に記載のように調製した化合物２（６０ｍｇ、５７μｍｏｌ）の結合により得た。
【００３９】
こうして、カルボン酸誘導体（５７μｍｏｌ）２を、乾燥ＤＭＦ（２×３ｍＬ）中で繰り返し濃縮することにより乾燥させ、ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解し、Ｎ２雰囲気下のＴＢＴＵ（１９ｍｇ、５７μｍｏｌ）およびＤｉＰＥＡ（９．８μＬ、５７μｍｏｌ）の存在下で撹拌した。１時間後に、五糖類１（５３μｍｏｌ）を加えた。反応混合物を、ＲＴで終夜撹拌し、イオン交換（Ｍｏｎｏ−Ｑ）および逆相（Ｌｕｎａ Ｃ１８）クロマトグラフィーによって分析した。反応混合物を濃縮した（＜５０℃、１５ｍｍＨｇ）。（粗）生成物（Ｈ２Ｏ／ｔ−ＢｕＯＨ中に１０ｍｇ／ｍＬ、１／１、ｖ／ｖ）を、１０％Ｐｄ／Ｃ（等量（重量）を粗成生物に対して加えた。）による水素添加（Ｈ２）により脱保護した。１６時間後に、溶液を脱気し、０．４５μＭ ＨＰＬＣフィルターによってろ過し、減圧下（＜５０℃、１５ｍｍＨｇ）で濃縮した。抱合体を、イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロース（Ｑ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、緩衝液：Ｈ２Ｏ→２Ｍ ＮａＣｌ）により精製した後、セファデックスＧ２５カラム（Ｈ２Ｏ）により脱塩し、凍結乾燥させた。収量７２ｍｇ（５２％）。
１Ｈ ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ，６００ＭＨｚ，ＨＨ−ＣＯＳＹ）：δ ７．８４（ｍ，１Ｈ）、７．７５（ｍ，１Ｈ）、７．６２（ｍ，１Ｈ）、７．４２（ｔ，１Ｈ）、６．８３（ｄ，２Ｈ）、６．４８（ｄ，２Ｈ）、５．３８（ｄ，１Ｈ）、５．３３（ｍ，１Ｈ）、５．０８（ｄ，１Ｈ）、５．０２（ｂｓ，１Ｈ）、４．５８（ｄ，１Ｈ）、４．４６（ｂｓ，２Ｈ）、４．２８（ｍ，２Ｈ）、４．１７（ｍ，１Ｈ）、４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｍ，２Ｈ）、４．１１（ｍ，２Ｈ）、４．０４（ｄ，１Ｈ）、４．０３（ｍ，１Ｈ）、４．０２（ｍ，１Ｈ）、３．８８（ｍ，２Ｈ）、３．８４（ｍ，２Ｈ）、３．８２（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｍ，１Ｈ）、３．７２（１Ｈ，ｍ）、３．６６（ｍ，２Ｈ）、３．６２〜３．３３（ｍ，５４Ｈ）、３．２０（ｄｄ，１Ｈ）、３．１８（ｍ，１Ｈ）、２．９２（ｍ，２Ｈ）、１．９２（ｍ，２Ｈ）、１．７０（ｍ，２Ｈ）、１．５８（ｍ，１Ｈ）、１．４４（ｍ，２Ｈ）、１．３３（ｍ，４Ｈ）。
ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ １２２５．２［Ｍ＋５Ｈ＋２Ｎａ］２−、８２３．８［Ｍ＋３Ｎａ＋３Ｈ］３−、８１６．５［Ｍ＋２Ｎａ＋４Ｈ］３−、８０９．１［Ｍ＋Ｎａ＋５Ｈ］３−。
【００４０】
【化６】
【実施例２】
【００４１】
薬理学
１．１ ＡＤＰにより誘発されたモルモットの血小板凝集の抑制に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるヒトまたはモルモットの多血小板血漿（ＰＲＰ）に対するアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）の添加は、血小板凝集を誘発する。この凝集は、ＰＲＰの光学濃度（ＯＤ）における変化を測定することにより評価することができる。以下のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、モルモットのＡＤＰ誘発凝集への干渉について試験化合物を評価するために使用した。
【００４２】
材料
多血小板血漿（ＰＲＰ）：自由流（Ｆｒｅｅ−ｆｌｏｗｉｎｇ）の血液を、健常ボランティアまたはモルモットから採取し、蒸留水中の０．１容量のクエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ、３．８％（ｗ／ｖ）に収集する。最終濃度は、０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血を、室温でＨｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ、すなわち９００ｒｐｍ）で遠心する。１５分後、遠心を、遠心機のブレーキを切って中止し、上清（＝ＰＲＰ）を収集する。０．９％ＮａＣｌ中５０μＭのＡＤＰ（分析グレード）の新鮮なＭＱ水溶液を直ちに使用する。このアッセイにおいて、チロフィバン（静注用０．２５ｍｇ／ｍＬ濃縮液として購入したＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））は、３０〜６０ｎＭの濃度で５μＭ ＡＤＰにより誘発されたヒトの血小板凝集を５０％抑制する（ＩＣ５０）。
【００４３】
器具
１．シスメックス（Ｓｙｓｍｅｘ）血球計数器モデルＫＸ−２１。
２．６２０ｎｍフィルター付きのラボシステムズ（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）ｉＥＭＳリーダーＭＦ、１，０００ｒｐｍおよび一定温度３７℃に設定されたオービタルシェイカー（ｏｒｂｉｔａｌ ｓｈａｋｅｒ）。吸収を、ラボシステムズｉＥＭＳプログラムで測定する。
３．針付き血液採取システム６００ｍＬ、ａｒｔＰ４２０３（ＮＰＢＩ）。
４．９６ウェル平底マイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ）。
【００４４】
手順
上清内の血小板（ＰＲＰ）を、シスメックス血球計数器を用いて計数し、上清をＰＰＰ（乏血小板血漿）で希釈し、約４００，０００±５０，０００ｐｌｔ／ｍＬを含むＰＲＰを得る。ＰＲＰは、室温で２０分以上、３時間未満で安定化するはずである。
【００４５】
１５０μＬのＰＲＰを、ピペットでマイクロプレートのウェルに移す。様々な濃度（化合物当たり７つの濃度）の３０μＬの試験化合物またはビヒクルを加え、マイクロプレートを、３７℃でラボシステムズｉＥＭＳリーダーＭＦにかける。次に光学濃度（ＯＤ６２０）を、６２０ｎｍで測定する。リーダーで２分間振盪（１，０００ｒｐｍ）後、ＯＤを再度測定する。これは血小板の安定性（自然発生の血小板凝集のないこと）について検証するためである。次に、５０μＭ ＡＤＰ溶液２０μＬを加え、ＯＤを、６２０で毎分動力学的に１４分間測定する。２つの測定間に、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振盪させる。試験化合物ごとに、異なるボランティア由来のＰＲＰを用いて少なくとも２回の実験で調査する。
【００４６】
反応の評価
化合物の各濃度（ビヒクルを含む）での平均ＯＤを、ｔ＝０分およびｔ＝１０分で算出する。各濃度における抑制率を、以下の式を用いて算出する。
【００４７】
【数１】
【００４８】
試験化合物のＩＣ５０は、ＡＤＰ誘発の血小板凝集が５０％減少する濃度である。このために、抑制率の値を、化合物の濃度に対してプロットし、ＩＣ５０をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０を用いて（様々な傾きで）算出する。
【００４９】
１．２ ＴＲＡＰにより誘発されたヒトの血小板凝集の抑制に関するｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける洗浄されたヒトまたはモルモットの血小板（ＷＰＬ）へのトロンビン受容体アゴニストペプチド（ＴＲＡＰ）の添加により、血小板凝集を誘発する。この凝集は、ＷＰＬの光学濃度を測定することにより判定することができる。ここに記載のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験は、ＴＲＡＰ誘発のヒト血小板凝集を抑制する試験化合物の活性を分析するために用いられる。マイクロプレートリーダーは、同時にいくつかの化合物の活性を測定するために用いられる。
【００５０】
材料
＊ワトソン緩衝液の組成：
Ｈ２Ｏ １Ｌ当たり
ＮａＣｌ ７．８３ｇ（１３４ｍｍｏｌ）
ＫＣｌ ０．２２ｇ（２．９ｍｍｏｌ）
ＮａＨＣＯ３ １．０１ｇ（１２ｍｍｏｌ）
Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ ０．０６ｇ（０．３４ｍｍｏｌ）
ＭｇＣｌ２．６Ｈ２Ｏ ０．２０ｇ（１ｍｍｏｌ）
グルコース０．９０ｇ（５ｍｍｏｌ）
ＨＥＰＥＳ １．１９ｇ（５ｍｍｏｌ）
ｐＨは、ＮａＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）ＴＮＰ緩衝液で７．４に調整する。
【００５１】
＊ＴＮＰ緩衝液の組成：
Ｈ２Ｏ １Ｌ当たり
トロメタミン（トリス）６．０５７ｇ（５０ｍｍｏｌ）
ＮａＣｌ ５．８４４ｇ（１００ｍｍｏｌ）
ＰＥＧ６０００ ３．０ｇ
溶液のｐＨは、ＨＣｌ（１０ｍｏｌ／Ｌ）により３７℃で７．４に調整する。
【００５２】
＊ＰＧＩ２溶液：
ＫＯＨ（１ｍｏｌ／Ｌ）中の１ｍｇ／ｍＬのプロスタグランジンＩ２原液を−２０℃で保存する。使用直前に、氷冷ＮａＣｌ（９．０ｇ／Ｌ）中の５μｇ／ｍＬの溶液を調製する。
【００５３】
＊多血小板血漿（ＰＲＰ）：
自由流の血液を、健常ボランティアまたはモルモットから採取し、ＭＱ水中の０．１容量の３．８％クエン酸ナトリウム．２Ｈ２Ｏ（ｗ／ｖ）に収集する。最終濃度は、０．３８％クエン酸ナトリウムである。クエン酸塩添加血を、室温でＨｅｔｔｉｃｈ Ｒｏｔａｎｔａ／ＡＰにおいて１，６００Ｎ／ｋｇ（１６０ｇ）で遠心する。１５分後、遠心を、遠心機のブレーキを切って中止する。さらに上清（＝ＰＲＰ）を収集し、乏血小板血漿で希釈し、約４００，０００血小板／ｍＬを含む懸濁液を得る。
【００５４】
＊乏血小板血漿（ＰＰＰ）：
クエン酸塩添加血を、ＲＴで約２０，０００Ｎ／ｋｇで１０分間遠心し、ＰＰＰをサイホンで移す。
【００５５】
＊洗浄血小板（ＷＰＬ）：
一定分量の１μＬのＰＧＩ２溶液を、１ｍＬのＰＲＰに加え、その後、ＲＴで約２０，０００Ｎ／ｋｇで１０分間遠心する。血漿をサイホンで移し、５ｎｇ／ｍＬのＰＧＩ２を含むワトソン緩衝液を血小板ペレットに加え、血小板を、プラスチック棒で静かに撹拌しながら原容量に再懸濁する。血小板懸濁液を、２０，０００Ｎ／ｋｇで再度遠心する。血小板をワトソン緩衝液で再懸濁し、約４００，０００血小板／ｍＬを含む懸濁液を得る。
【００５６】
＊ＴＲＡＰ溶液：
ＴＲＡＰをＨ２Ｏに溶解し、５０μｍｏｌ／Ｌを含む溶液を得る。新鮮な溶液を毎日調製する必要がある。すべての水溶液に対して、超高純度のＨ２Ｏ（ミリＱの品質）を使用する。
【００５７】
＊ヒトフィブリノゲン（Ｋｏｒｄｉａ／ＥＲＬ、ａｒｔ ｎｒ：ＦＩＢ２粉末）：０．５ｇのフィブリノゲン粉末を、真空下で５０ｍＬのＭＱ水に溶解する。この原液を、−２０℃で１００μＬの一定分量で保存する。使用直前に、０．５ｍｇ／ｍＬの生理食塩水溶液を調製する。
【００５８】
このアッセイにおいて、チロフィバン（静注用０．２５ｍｇ／ｍＬ濃縮液として購入したＡＧＧＲＡＳＴＡＴ（登録商標）（ＭＳＤ））は、３０〜６０ｎＭ（ＩＣ５０）の最終濃度で５μＭ ＴＲＡＰにより誘発されたヒトの血小板凝集を５０％抑制する。
【００５９】
手順
ＷＰＬ濃度を、シスメックス血球計数器で計数し、懸濁液をワトソン緩衝剤で希釈し、約４００，０００ｐｌｔ／ｍＬの濃度を得る。使用前に、ＷＰＬを、室温で２０分以上、３〜４時間未満で安定化させる。
【００６０】
１５０μＬのＷＰＬを、ピペットでマイクロプレートのウェルに移す。試験化合物またはビヒクル１５μＬおよび１５μＬのフィブリノゲン溶液を加え、マイクロプレートを、３７℃でマイクロプレートリーダーにかける。次に、光学密度（ＯＤ）を、４０５ｎｍで測定し、リーダーにおいて２分間振盪後、血小板の安定性（自然発生の血小板凝集のないこと）を検証するために、ＯＤ４０５を再度測定する。５０μＭ ＴＲＡＰ溶液２０μＬを加え、ＯＤ４０５を４０５ｎｍで１４分間に毎分、動力学的に測定する。２つの測定間に、プレートを１，０００ｒｐｍで４０秒間振盪させる。試験化合物のＩＣ５０の判定のために、化合物ごとに、異なるボランティア由来のＷＰＬを用いて少なくとも２回の実験において調査する。
【００６１】
反応の評価：
各濃度（ビヒクルを含む）の平均ＯＤを、ｔ＝０分およびｔ＝１０分で算出する。各濃度における抑制率を、以下の式によりマイクロソフトエクセルを用いて算出する。
【００６２】
【数２】
【００６３】
化合物の濃度を、抑制率に対してプロットする。ＩＣ５０をＧｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ３．０を用いて（様々な傾きで）算出する。試験化合物のＩＣ５０は、ＴＲＡＰ誘発の血小板凝集が５０％減少する濃度である。
【００６４】
１．３ ヒト血漿における抗Ｘａ因子活性の判定のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ試験
ヒト血漿における試験化合物の抗Ｘａ因子活性を、ＴｅｉｅｎおよびＬｉｅにより報告された方法を用いてＳ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ Ｌｔｄ、スウェーデン、ムルンダール（Ｍｏｌｎｄａｌ））によりアミド分解的（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）に測定した（Ｔｅｉｅｎ ＡＮ，Ｌｉｅ Ｍ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ｈｅｐａｒｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９７７，１０：３９９−４１０）。抗Ｘａ活性を、アミド分解活性（ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ）と標準ヘパリンの検量線との比較後にＵ／μｍｏｌで表す。
【００６５】
【表１】
【００６６】
２．１薬物動態
化合物３の薬物動態学的特性について３００〜４００ｇｒのオスのウィスター系ラットにおいて検査した。ラットを、Ｏ２／Ｎ２Ｏ／イソフルランの混合物の吸入により麻酔し、その後に右側の頚静脈にカニューレを挿入した。翌日、ラットに１００または５００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量を皮下注射した。皮下注射後、血液をいくつかの時間間隔で検体採取した。次に血液を遠心し、その後、血漿をサイホンで移し、使用するまで−２０℃で保存した。試験化合物自体の原液から作成した検量線に対する得られた血漿試料中の試験化合物の濃度を、Ｓ２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ、Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｓ Ｌｔｄ、スウェーデン、ムルンダール（Ｍｏｌｎｄａｌ））を用いてＴｅｉｅｎおよびＬｉｅの方法を基にした抗Ｘａ活性の測定によりアミド分解的に測定した（Ｔｅｉｅｎ ＡＮ，Ｌｉｅ Ｍ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｍｉｄｏｌｙｔｉｃ ｈｅｐａｒｉｎ ａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｂｙ ａｄｄｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ ＩＩＩ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．１９７７，１０：３９９−４１０）。試料中の濃度をｎｍｏｌ／ｍＬで表し、動態パラメータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎのノンコンパートメントモデルで算出した。
【００６７】
【表２】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉの化合物
オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト Ｉ
（式中、オリゴ糖は、以下の構造の負に帯電した五糖類の残基であり、
【化１】
電荷は正に帯電した対イオンによって補償され；
スペーサーは、１５−５０個の原子長の本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバンまたはその類似体から誘導された残基である。）
または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグもしくはその溶媒和物。
【請求項２】
スペーサーが２５−３５個の原子長を有する、請求項１の化合物。
【請求項３】
スペーサーが少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む、請求項１または２の化合物。
【請求項４】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストがチロフィバン類似体から誘導された残基である、請求項１から３のいずれか一項の化合物。
【請求項５】
構造
【化２】
を有する、請求項１から４のいずれか一項の化合物。
【請求項６】
このナトリウム塩の形態である、請求項５の化合物。
【請求項７】
修飾されたチロフィバン類似体がスペーサーに結合され、引き続いて、オリゴ糖−スペーサー−残基に結合されるステップを含む、式Ｉの化合物の調製方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項の化合物および薬学的に適切な助剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
治療に使用するための請求項１から６のいずれか一項の化合物。
【請求項１０】
血栓症を治療または予防するための薬物製造のための請求項１から６のいずれか一項の化合物の使用。
【請求項１】
式Ｉの化合物
オリゴ糖−スペーサー−ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト Ｉ
（式中、オリゴ糖は、以下の構造の負に帯電した五糖類の残基であり、
【化１】
電荷は正に帯電した対イオンによって補償され；
スペーサーは、１５−５０個の原子長の本質的に薬理学的不活性な結合残基であり；
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、チロフィバンまたはその類似体から誘導された残基である。）
または薬学的に許容されるその塩もしくはプロドラッグもしくはその溶媒和物。
【請求項２】
スペーサーが２５−３５個の原子長を有する、請求項１の化合物。
【請求項３】
スペーサーが少なくとも１つの−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−要素を含む、請求項１または２の化合物。
【請求項４】
ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストがチロフィバン類似体から誘導された残基である、請求項１から３のいずれか一項の化合物。
【請求項５】
構造
【化２】
を有する、請求項１から４のいずれか一項の化合物。
【請求項６】
このナトリウム塩の形態である、請求項５の化合物。
【請求項７】
修飾されたチロフィバン類似体がスペーサーに結合され、引き続いて、オリゴ糖−スペーサー−残基に結合されるステップを含む、式Ｉの化合物の調製方法。
【請求項８】
請求項１から６のいずれか一項の化合物および薬学的に適切な助剤を含む医薬組成物。
【請求項９】
治療に使用するための請求項１から６のいずれか一項の化合物。
【請求項１０】
血栓症を治療または予防するための薬物製造のための請求項１から６のいずれか一項の化合物の使用。
【公表番号】特表２００９−５１１５４４（Ｐ２００９−５１１５４４Ａ）
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５３５００３（Ｐ２００８−５３５００３）
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７１２８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４２４７０
【国際公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年３月１９日（２００９．３．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月６日（２００６．１０．６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００６／０６７１２８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０４２４７０
【国際公開日】平成１９年４月１９日（２００７．４．１９）
【出願人】（３９８０５７２８２）ナームローゼ・フエンノートチヤツプ・オルガノン (93)
【Ｆターム（参考）】
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