抗血管形成タンパク質およびその使用方法
【課題】インビボでの腫瘍成長を停止し、また、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロモデルにおいて毛細血管の形成を阻害するＩＶ型コラーゲンのα１鎖、α２鎖およびα３鎖のＮＣ１ドメインのＣ末端フラグメントを提供する。
【解決手段】抗血管形成特性を有するＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣ１ドメインを含むタンパク質である、アレステン（Arresten）、カンスタチン（Canstatin・）およびタムスタチン（Tumstatin・）は、インビボでの腫瘍成長を停止し、また、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロモデルにおいて毛細血管の形成を阻害する。
【解決手段】抗血管形成特性を有するＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣ１ドメインを含むタンパク質である、アレステン（Arresten）、カンスタチン（Canstatin・）およびタムスタチン（Tumstatin・）は、インビボでの腫瘍成長を停止し、また、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロモデルにおいて毛細血管の形成を阻害する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管形成タンパク質およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本願は、１９９８年６月１７日に出願された米国仮出願第６０／０８９，６８９号、および、また１９９９年３月２５日に出願された米国仮出願第６０／１２６，１７５号の利益を主張するものであり、その全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
発明の背景
血管基底膜は、コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、フィブロネクチンおよびエンタクチン（entactin）等の巨大分子からなる（Timpl,R.,1996,Curr Opin Cell Biol 8:618-24）。機能的に、コラーゲンは細胞接着、細胞移動、細胞分化および細胞成長を促進し（Paulsson,M.,1992,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol. 27:93-127・）、また、これらの機能を介して、予め存在している血管からの新たな血管の形成プロセスである血管形成の際に、内皮細胞の増殖および挙動において重要な役割を果たすと推定される（Madri,J.A. et al.,1986,J.Histochem.Cytochem. 34:85-91;Folkman,J.,1972,Ann.Surg. 175:409-16）。血管形成は複雑なプロセスであり、内皮細胞の発芽および移動、それらの細胞の増殖、および管様構造へのそれらの分化ならびに発達途上の血管周囲の基底膜マトリックスの生成を必要とする。さらに、血管形成は、創傷治癒および子宮内膜再構築等の通常の生理学的事象に重要なプロセスである（Folkman,J. et al.,1995,J.Biol.Chem. 267:10931-34）。現在では、血管形成は数ｍｍ2 の大きさを超える充実性腫瘍の転移および増殖に必要であるということが充分に報告されている（Folkman,J.,1972,Ann.Surg. 175:409-16;Folkman,J.,1995,Nat.Med. 1:27-31・）。いくつかの研究によればコラーゲン代謝のインヒビターは抗血管形成特性を有することが示されており、これは、基底膜コラーゲン合成および沈着が血管形成および生存に重要であることを支持する（Maragoudakis,M.E. et al.,1994,Kidney Int. 43:147-50;Haralabopoulos,G.C. et al.,1994,Lab.Invest. 71:575-82・）。しかしながら、基底膜組織および血管形成におけるコラーゲンの正確な役割は未だ充分には理解されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の概要
本発明は、抗血管形成特性を有するＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣ１ドメインを含むタンパク質に関する。特に、本発明は、新規タンパク質である、アレステン（Arresten）、カンスタチン（Canstatin・）およびタムスタチン（Tumstatin・）および生物学的に活性な（たとえば、抗血管形成）フラグメント、変異体、アナログ、ホモログおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの多量体（たとえば、二量体）および融合タンパク質（本明細書においてはキメラタンパク質ともいう）に関する。これらのタンパク質は全て、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１〔non-collagenous 1・（非コラーゲン性１）〕のＣ末端フラグメントを含む。より詳細には、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは、各々ＩＶ型コラーゲンのα１鎖、α２鎖およびα３鎖のＮＣ１ドメインのＣ末端フラグメントである。特に、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは単量体タンパク質である。３つ全て、インビボでの腫瘍成長を停止し、また、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロモデルにおいて毛細血管の形成を阻害する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨は、
〔１〕 配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離された組換えタンパク質、
〔２〕 配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される単離された組換えタンパク質フラグメントであって、該タンパク質フラグメントは、１０ｋＤａのフラグメントであり、内皮管形成を阻害する、フラグメント、
〔３〕 〔１〕記載のタンパク質、または〔２〕記載の１０ｋＤａのタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質、
〔４〕 〔１〕記載のタンパク質および／または〔２〕記載のフラグメントを含む組成物、
〔５〕 薬学的に適合可能な担体をさらに含む〔４〕記載の組成物、
〔６〕 〔１〕記載のタンパク質、〔２〕記載のフラグメント、および〔３〕記載のタンパク質からなる群より選択される１つ以上を含み、ならびにエンドスタチン、アンジオスタチン、レスチン、およびアポミグレンからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含む組成物、
〔７〕 配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される１０ｋＤａのフラグメントを含む医薬であって、組織と接触することによって、哺乳動物の組織における血管形成活性を阻害するための医薬、
〔８〕 該組織が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬、眼血管形成疾患、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維腫、創傷肉芽形成、腸管癒着、動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、ネコひっかき病、ヘリコバクターピロリ潰瘍、透析移植片血管アクセス狭窄、および肥満からなる群より選ばれる疾患を有する個体の組織である、〔７〕記載の医薬、
〔９〕 疾患が癌である〔８〕記載の医薬、
〔１０〕 血管形成活性を特徴とする疾患を有する個体に、放射線療法、化学療法、または免疫療法を組み合わせて投与される、〔９〕記載の医薬、
〔１１〕 医薬が産児制限剤である〔７〕記載の医薬、
〔１２〕 〔１〕記載のタンパク質または〔２〕記載のいずれかのタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチド
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、単離されたアレステンおよび組換え的に生産されたアレステンを包含する。アレステンは、本明細書においてはアレスチン（Arrestin）ともいい、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインを含んでおり、抗血管形成活性を有する。また、本発明は、単離されたアレステンの抗血管形成フラグメント、単離されたアレステンおよび抗血管形成フラグメントの多量体、およびそれらの抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。また、生物学的に活性な成分として、単離されたアレステン、その抗血管形成フラグメント、または両方を含む組成物を包含する。他の態様では、本発明は、増殖性疾患が血管形成活性を特徴とする哺乳動物における癌等の増殖性疾患の治療方法を特色とする。かかる方法は、抗血管形成アレステンまたはそのフラグメントを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。また、抗血管形成アレステンおよびそのフラグメントを用いて、細胞移動または内皮細胞増殖を防ぐことができる。単離された抗血管形成アレステンおよびそのフラグメントに対する抗体も特色とする。
【０００７】
本発明はまた、単離されたカンスタチンおよび組換え的に生産されたカンスタチンを包含する。カンスタチンは、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインを含んでおり、抗血管形成活性を有する。また、本発明は、単離されたカンスタチンの抗血管形成フラグメント、単離されたカンスタチンおよび抗血管形成フラグメントの多量体、およびそれらの抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。また、生物学的に活性な成分として、単離されたカンスタチン、その抗血管形成フラグメント、または両方を含む組成物を包含する。他の態様では、本発明は、増殖性疾患が血管形成活性を特徴とする哺乳動物における癌等の増殖性疾患の治療方法を特色とする。かかる方法は、抗血管形成カンスタチンまたはそのフラグメントを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。また、抗血管形成カンスタチンおよびそのフラグメントを用いて、細胞移動または内皮細胞増殖を防ぐことができる。単離された抗血管形成カンスタチンおよびそのフラグメントに対する抗体も特色とする。
【０００８】
本発明は同様に、単離されたタムスタチンおよび組換え的に生産されたタムスタチンを包含する。タムスタチンは、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインを含んでおり、抗血管形成活性を有する。また、本発明は、単離されたタムスタチンの抗血管形成フラグメント、単離されたタムスタチンおよび抗血管形成フラグメントの多量体、およびそれらの抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。また、生物学的に活性な成分として、単離されたタムスタチン、その抗血管形成フラグメント、または両方を含む組成物を包含する。他の態様では、本発明は、増殖性疾患が血管形成活性を特徴とする哺乳動物における癌等の増殖性疾患の治療方法を特色とする。かかる方法は、抗血管形成タムスタチンまたはそのフラグメントを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。また、抗血管形成タムスタチンおよびそのフラグメントを用いて、細胞移動または内皮細胞増殖を防ぐことができる。単離された抗血管形成タムスタチンおよびそのフラグメントに対する抗体も特色とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
好ましくない血管形成に伴い、多様な疾患が生ずる。一方、ある時点において、または特定の組織中で、何らかの条件下で、毛細血管の成長と肥大を停止させることが可能であれば、多くの疾患や好ましくない病態を予防または改善することができる。基底膜構造は、ＩＶ型コラーゲンのＣ末端球状非コラーゲン性（ＮＣｌ）ドメインを介して発生すると推定されるＩＶ型コラーゲンネットワークの集合に依存している（Timple, R., 1996, Curr Opin Cell Biol 8:618-24；Timple, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-211 ）。ＩＶ型コラーゲンは、６つの異なる遺伝子産物、すなわちα１からα６でできている（Prockop, D.J. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:403-34 ）。α１およびα２アイソフォームはヒト基底膜中に普遍的に存在するが（Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127）、他の４つのアイソフォームは限定的分布を示す（Kalluri,R.etal.,1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8）。
【００１０】
腫瘍成長および転移の過程には、既存の血管からの新たな毛細血管の形成、すなわち血管形成が不可欠である（Folkman, J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-4；Folkman,J.,1995, Nat. Med. 1:27-31；Hanahan, D. et al., 1996, Cell 86:353-64）。ヒトおよび動物の腫瘍は、当初は血管化されないが、腫瘍が数ｍｍ3 以上に成長するために、血管化することがある（Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1:27-31；Hanahan,D.etal.,1996, Cell 86:353-64）。血管形成表現型へのスイッチには、血管形成刺激剤のアップレギュレーションと血管形成インヒビターのダウンレギュレーションの両者が必要である（Folkman,J.,1995, Nat. Med. 1:27-31）。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、腫瘍中で最も普通に発現される血管形成因子である。血管化した腫瘍は、腫瘍成長を相乗的に促進しうるこれらの血管形成因子の１つ以上のものを過剰発現することがある。ＶＥＧＦなどの単一の血管形成因子を受容体アンタゴニストで阻害しても、腫瘍成長を停止させることはできない。いくつかの血管形成インヒビターが最近同定されているが、ＩＦＮ−α、血小板因子４（Maione,T.E.etal.,1990, Science 247:77-9 ）およびＰＥＸ（Brooks, P.C. et al., 1998, Cell 92:391-400）などある種の因子は腫瘍細胞と内因的には関連していないが、アンジオスタチン（O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28 ）とエンドスタチン（O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85 ）は、腫瘍組織そのものによって生成される腫瘍関連血管形成インヒビターである。これらの内因性血管形成インヒビターによる腫瘍成長および転移の治療は非常に効果的であって、魅力的な発想であるが、抗血管形成療法に関連して起こり得るいくつかの問題を考慮に入れなければならない。長期的抗血管形成療法によって惹起される遅延型毒性ならびに治療時の創傷治癒および生殖系血管形成の障害の可能性も十分考慮しなければならない。
【００１１】
本発明においては、抗血管形成の性質を有するタンパク質、およびそれらのフラグメント、アナログ、誘導体、ホモログおよび変異体、ならびにこれらのタンパク質、アナログ、誘導体、ホモログおよび変異体を用いて血管形成関与増生疾患を阻害する方法について説明する。該タンパク質は、ＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣｌドメイン、または該ドメインの一部から成るものであり、具体的には、ＩＶ型コラーゲンのα１、α２およびα３鎖のＮＣｌドメインの単量体から成る。これらのタンパク質は、とくに単量体状である場合、癌のインビボのモデルにおける腫瘍成長を停止させるとともに、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロのモデルにおける毛細血管の形成も阻害する。
【００１２】
これらのタンパク質は、ＮＣｌドメインの接合部領域を含んでいることもある。α４、α５、およびα６鎖は抗血管形成活性が低下しているか検出できなくなっていることを示唆する証拠があることから、α１、α２、またはα３鎖が好ましい。一般に、六量体型も活性がほとんどないか低下していることを示唆する証拠があることから、該タンパク質の単量体型が好ましい。
【００１３】
さらに具体的には、本発明は、ヒトＩＶ型コラーゲンのＮＣｌドメインのα１鎖のＮ末端にあるアミノ酸に対応する約２３０個分のアミノ酸の長さを有するタンパク質である「アレステン（Arresten）」と呼ばれるタンパク質について説明する（Hostikka, S.L. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:19488-93）。
【００１４】
本明細書で開示されるように、ヒトアレステンは、ペリプラズム輸送を行いうるがゆえに可溶性タンパク質を生成するｐＥＴ２２ｂなどの細菌発現プラスミドを用いて、大腸菌中で製造することができる。該タンパク質は、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグを有する２９ｋＤａの融合タンパク質として発現される。追加の３ｋＤａ（２６ｋＤａに加わる）は、ポリリンカーおよびヒスチジンのタグ配列に由来する。アレステンは、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞ベクターを用いて、２９３腎細胞中で分泌可溶性タンパク質としても製造された。この２９３産生タンパク質は、精製タグや検出タグを保持していない。
【００１５】
大腸菌産生アレステンは、０．２５μｇ／ｍｌのＥＤ50をもって、用量依存的にｂＦＧＦ刺激内皮細胞の増殖を阻害する。腎癌細胞（７８６−０）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）、またはヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）の増殖に及ぼす有意な影響は認められなかった。エンドスタチンは、アレステンより３倍高い０．７５μｇ／ｍｌのＥＤ50で、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖を阻害したが、Ａ−４９８癌細胞を阻害しなかった。
【００１６】
本明細書で説明するように、内皮細胞の増殖および移動が特異的に阻害されることは、アレステンが、細胞表面タンパク質または受容体を介して機能する可能性があることを示している。マトリックスメタロプロテイナーゼすなわちＭＭＰが阻害されることは、アレステンが、バチマスタット（batimastat）（ＢＢ−９４）やマリマスタット（marimastat）（ＢＢ−２５１６）と同様に、腫瘍の成長および転移において直接的役目を果たしていることを示唆している。
【００１７】
本発明においては、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣｌドメインであるカンスタチン（Canstatin・）を用いて、血管形成を阻害させたが、この阻害は、内皮細胞の増殖と移動の阻害および内皮管形成の阻害によってアッセイした。カンスタチンにより、内皮細胞の増殖と移動が特異的に阻害されたことは、この物質が抗血管形成活性を有すること、および細胞表面タンパク質／受容体を介して機能する可能性があることも証明している。インテグリンは、細胞外マトリックス結合能力および移動や増殖などの細胞挙動を調節する能力を有することからみて、候補分子となりうる。とくに、ａｖｂ３インテグリンは、血管形成時に誘導されること、および相手を選ばず結合しうることから、カンスタチン受容体であり得る。
【００１８】
本発明においては、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣｌドメインであるタムスタチン（Tumstatin ）（Timple, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-11；Turner, N. et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:592-601）を用いて、インビトロおよびインビボの血管形成および腫瘍成長モデルにおける血管内皮細胞の増殖および血管形成を調節した。α３（ＩＶ）鎖の分布は、ＧＢＭなどある種の基底膜、数種類の蝸牛基底膜、前房水晶体嚢などの眼基底膜、デスメ膜、卵巣および精巣基底膜（Frojdman, K. et al., 1998, Differentiation 83:125-30）、および肺胞毛細血管基底膜（Kashtan,C.E., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9:1736-50 ）に限定されている。しかしながら、この鎖は、腎臓メサンギウム、皮膚の血管基底膜および表皮基底膜、および肝臓の血管基底膜（Kashtan, C.E., 上掲）には見当たらない。創傷治癒の過程では、ＩＶ型コラーゲンのα３およびα４鎖は「既存の」すなわち皮膚血管系の基底膜の成分ではないがゆえに、これら２つの鎖以外のα鎖が集合して、新たな毛細血管を形成する。α３（ＩＶ）鎖は正常なヒトの皮膚における本来の成分ではないので、創傷治癒の病変におけるコラーゲン集合および血管形成の過程が、タムスタチンを用いた治療によって変化することはない。
【００１９】
α３（ＩＶ）鎖は、ヒト腎臓血管基底膜ならびにＧＢＭ中で発現される（Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8）。これらの「既存の」血管は、腎細胞癌などの原発性腎腫瘍の進行に関与していると推定される。タムスタチンは、α３（ＩＶ）鎖とその他のα鎖の集合を介する新生血管形成を破壊することによって、原発性腎腫瘍の治療に有効であり得る。腎細胞癌の診断を受ける患者数は、１９９６年の米国において約３万人であり（Mulders,P.etal.,1997, Cancer Res. 57:5189-95）、転移症例の予後は非常に悪い。放射線療法と化学療法の進歩にもかかわらず、治療を受けた患者の長期生存率はあまり改善されていない（Mulders,P., 上掲）。腎細胞癌の有意治療選択肢がないことから、新規治療方式を確立することが非常に重要である。この事実に鑑み、最近、充実性腫瘍の新生血管形成のターゲティングが、いくつかの動物モデルにおいて有望な成績を挙げている（Baillie, C.T. et al., 1995, Br. J. Cancer 72:257-67 ；Burrows, F.J. et al., 1994, Pharmacol. Ther. 64:155-74；Thorpe, P.E. et al., 1995, Breast Cancer Res. Treat. 36:237-51）。インビボにおける腎細胞癌成長の阻害にタムスタチンが有効であることは、この分子が、この腫瘍タイプに対して有効な抗血管形成療法になり得ることを示している。
【００２０】
本発明においては、タムスタチンは内皮細胞増殖を特異的に阻害し、インビトロにおいて腫瘍細胞株ＰＣ−３および７８６−Ｏの増殖に対しては影響を及ぼさなかった。タムスタチンは内皮細胞移動を阻害しなかったが、インビトロにおける内皮管形成を有意に抑制した。これらの成績を総合すると、タムスタチンは、血管形成過程における様々な段階を阻害することにより、新たな血管の形成を抑制することがわかる。
【００２１】
インビボ試験で、タムスタチンは、マトリゲルプラグ（matrigelplug・）アッセイにおける血管形成を阻害し、マウス異種移植片モデルにおけるＰＣ−３腫瘍および７８６−Ｏ腫瘍の成長を抑制した。タムスタチンが大型腫瘍の成長を阻害したことは、臨床現場における腫瘍の治療に鑑みてとくに有意義である。
【００２２】
タムスタチンは、肺出血と急速進行性糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患であるグッドパスチャー症候群の病原エピトープを保持しているため（Butkowski, R.J. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:7874-77；Saus, J. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13374-80；Kalluri, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:24018-24 ）、タムスタチンの短期的または長期的投与がこの自己免疫疾患を誘導する可能性がある。いくつかのグループが、α３（ＩＶ）ＮＣｌ上のグッドパスチャー症候群自己エピトープの位置をマッピングまたは予測しようと試みており、Ｎ末端部分、中間部分、およびＣ末端部分が該エピトープを保持することが報告された（Kalluri, R. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6:1178-85；Kalluri,R.etal.,1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8 ；Levy, J.B. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:1698-1705 ；Quinones, S. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:19780-4 ；Kefalides, N.A. et al., 1993, Kidney Int. 43:94-100 ；Netzer, K.O. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11267-74）。最近、組換えキメラ構築物を用いて、α３（ＩＶ）ＮＣｌのＮ末端のみに対する自己抗体の反応性が腎臓生存率と相関していることが報告された（Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:936-44）。Ｎ末端部分の最初の４０個のアミノ酸に対する疾患関連エピトープも同定された。グッドパスチャー症候群のエピトープを除去するために、Ｎ末端の５３個のアミノ酸残基を欠損する切形型タムスタチンが合成されたが、この分子は、マウス異種移植片モデルにおいて７８６−Ｏ腫瘍成長に対して阻害作用を示す。また、この分子は、グッドパスチャー症候群の重症患者の自己抗体には結合しなかった。これらの結果から、タムスタチンの抗血管形成領域は、Ｎ末端の５３個のアミノ酸が除去されても保存されることがわかる。
【００２３】
タムスタチンにより内皮細胞増殖が特異的に阻害されることから、タムスタチンは細胞表面タンパク質／受容体を介して機能する可能性があることが強く示唆される。血管形成は、インテグリンａｖｂ３が介在する特異的内皮細胞付着事象にも依存している（Brooks, P.C. et al., 1994, Cell 79:1157-64）。タムスタチンは、増殖中の内皮細胞とマトリックス成分の相互作用を破壊する可能性があるため、内皮細胞をアポトーシスに導く可能性がある（Re, F. et al., 1994, J. Cell. Biol. 127:537-46）。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍中の新たな血管の形成を調節する重要酵素であると推定されている（Ray, J.M. et al., 1994; Eur. Respir. J. 7:2062-72 ）。最近、ＭＭＰ−２のインヒビター（ＰＥＸ）が、血管形成を阻害することにより、腫瘍成長を抑制し得ることが証明された（Brooks, P.C. et al., Cell 92:391-400）。タムスタチンは、ＭＭＰの活性を阻害することにより機能する可能性がある。
【００２４】
タムスタチンは、インビトロおよびインビボにおける血管形成を阻害して、腫瘍進行の抑制をもたらす。この方式を患者に適用するためには、全身投与による潜在的毒性または副作用も考慮しなければならない。タムスタチンの分布が限定されていて、皮膚基底膜中にはほとんど存在しないことから、タムスタチン治療による副作用の可能性は低いことが示唆される。また、腎臓などの一部臓器の血管基底膜中にタムスタチンが存在することから、一部臓器で発生する腫瘍のターゲティングにおいて、独自の利点を示し得ることが示唆される。究極的には、遺伝子導入法を用いて、腫瘍血管系においてインビボでタムスタチン遺伝子を発現させる代替方式を開発することが望ましい（Kashihara, N. et al., 1997, Exp. Nephrol. 5:126-31；Maeshima, Y. et al., 1996, J. Am. Soc. Nephrol. 7:2219-29 ；Maeshima, T. et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:2589-97 ）。
【００２５】
α３（ＩＶ）鎖の分布は一部臓器の基底膜に限定されているため、α鎖の集合を阻害することにタムスタチン分子が示し得る機構を考慮すれば、タムスタチンの有害性は低い可能性が高い。さらに、α３（ＩＶ）鎖は、腎臓の血管基底膜中にも認められ（Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8）、これらの血管は腎細胞癌などの原発性腎腫瘍の進行に関与していると考えられる。したがって、タムスタチンは、α３（ＩＶ）鎖と他のα鎖の集合を破壊することにより、上記腫瘍の治療に有効である可能性がある。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「血管形成」という用語は、１つの組織または臓器中に新たな血管が生成することを意味し、内皮細胞増殖を包含する。通常の生理条件下では、ヒトや動物は、非常に特異的な限定された状況においてのみ血管形成を受ける。たとえば、血管形成は通常、創傷治癒、胎児および胚の発育、および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において認められる。「内皮」という用語は、漿液腔、リンパ管、および血管の内側を構成する平坦上皮細胞の薄層を意味する。したがって、「抗血管形成活性」とは、ある組成物が血管の成長を阻害する能力をいう。血管の成長は複雑な一連の事象であり、それぞれの内皮細胞の下にある基底膜の局所的分解、これらの細胞の増殖、将来血管となる場所への該細胞の移動、新たな血管膜を形成するための該細胞の再構成、内皮細胞増殖の停止、および血管周囲細胞およびその他の新たな血管壁を支持する細胞の取り込みを包含する。したがって、本明細書で使用する場合、「抗血管形成活性」とは、これらの段階の一部または全体が阻害されることで、最終的に新たな血管の形成が阻害されることを包含する。
【００２７】
抗血管形成活性には、一般的には、ある組成物が血管形成を阻害する能力、たとえば、線維芽細胞成長因子、血管形成関連因子、またはその他の公知の成長因子の存在下で、培養ウシ毛細血管内皮細胞の成長または移動を阻害する能力をいう内皮阻害活性を包含する。「成長因子」は、細胞の成長、再生、または合成活性を刺激する組成物である。「血管形成関連因子」は、血管形成を阻害するか促進する因子である。血管形成関連因子の具体例としては、血管形成促進剤である塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの血管形成成長因子が挙げられる。血管形成関連因子のもう１つの具体例としては、たとえばアンジオスタチン（たとえば米国特許第５，８０１，０１２号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７７６，７０４号、米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７９２，８４５号、ＷＯ９６／３５７７４、ＷＯ９５／２９２４２、ＷＯ９６／４１１９４、ＷＯ９７／２３５００参照）またはエンドスタチン（たとえばＷＯ９７／１５６６６参照) などの血管形成阻害因子が挙げられる。
【００２８】
「実質的に同一の生理活性」または「実質的に同一またはそれ以上の生理活性」とは、常法のアッセイで測定した場合に、ある組成物が抗血管形成活性を有し、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンと同様の挙動を示すことを意味する。「常法のアッセイ」としては、分子生物学分野において、抗血管形成活性、細胞周期停止、およびアポトーシスを評価する目的に使用されるプロトコルが挙げられるが、これらに限定されない。かかるアッセイとしては、内皮細胞増殖、内皮細胞移動、細胞周期解析、および内皮細胞管形成のアッセイ、たとえばアポトーシス細胞形態またはアネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイによるアポトーシスの検出、漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、およびヌードマウスにおける腎癌腫瘍成長の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。かかるアッセイを、下記実施例に示す。
【００２９】
「アレステン」は、本明細書において「アレスチン」ともいうが、アレステン配列ならびに他の哺乳類に由来するアレステンのアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにアレステンアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「カンスタチン」は、カンスタチン配列ならびに他の哺乳類に由来するカンスタチンのアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにカンスタチンアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「タムスタチン」は、タムスタチン配列ならびに他の哺乳類に由来するタムスタチンのアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにタムスタチンアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【００３２】
本発明は、内皮阻害活性（たとえばある組成物が一般的に血管形成を阻害する能力、たとえば線維芽細胞成長因子、血管形成関連因子、またはその他の公知の成長因子の存在下で、培養ウシ毛細血管内皮細胞の成長または移動を阻害する能力）を有するアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのあらゆる誘導体を包含するものと解する。本発明は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質全体、これらのタンパク質の誘導体およびこれらのタンパク質の生理活性フラグメントを包含する。これらのものには、アミノ酸置換を有するか、糖またはその他の分子がアミノ酸官能基に付着したものを有するアレステン、カンスタチンまたはタムスタチン活性のあるタンパク質が含まれる。
【００３３】
本発明は、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンのフラグメント、変異体、ホモログおよびアナログについても説明する。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「フラグメント」は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドの少なくとも２５個の連続アミノ酸から成るアレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子より短いアミノ酸配列である。かかる分子は、たとえば全長または部分リンカー配列に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列など、クローン化の過程から得られた追加アミノ酸をさらに含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本発明の範囲に含まれるためには、かかる変異体は、上記追加アミノ酸残基の有無に関わらず、参照ポリペプチドの天然型または全長型と実質的に同一の生理活性を有するものでなければならない。
【００３４】
かかるフラグメントの１つである「タムスタチンＮ−５３」と呼ばれるフラグメントは、常法のアッセイによって測定した場合、全長タムスタチンと同等の抗血管形成活性を有することが判明した。タムスタチンＮ−５３は、Ｎ末端の５３個のアミノ酸が欠失しているタムスタチン分子から成る。本明細書で説明するその他の変異体フラグメントは、本明細書で説明するアッセイによって示されるように、非常に高いレベルの抗血管形成活性を有することが判明している。これらのフラグメント、すなわち「タムスタチン３３３」、「タムスタチン３３４」、「１２ｋＤａアレステンフラグメント」、「８ｋＤａアレステンフラグメント」、および「１０ｋＤａカンスタチンフラグメント」は、それぞれ７５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および８０ｎｇ／ｍｌのＥＤ50値を有する。一方、全長アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは、それぞれ４００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、および５５０ｎｇ／ｍｌのＥＤ50値を有することが判明した。タムスタチン３３３は配列番号：１０のアミノ酸２位〜１２５位より成り、タムスタチン３３４は配列番号：１０のアミノ酸１２６位〜２４５位より成る。
【００３５】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「変異体」とは、同等の参照アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドのアミノ酸配列に近縁のアミノ酸配列の変化を有するポリペプチドを意味する。かかる変化は、自然的に、または人為的操作によるか、化学エネルギー（たとえばＸ線）によるか、その他の形の化学的突然変異誘発によるか、遺伝子工学によるか、交配またはその他の形の遺伝情報の交換の結果として起こり得る。突然変異としては、たとえば塩基変化、欠失、挿入、逆位、転位、または重複が挙げられる。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの変異体型は、同等の参照アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドに対して抗血管形成活性が増大または減少している場合があり、かかる変異体は、たとえば全体または部分リンカー配列に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列など、クローン化の過程から得られる追加アミノ酸を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００３６】
本発明の抗血管形成タンパク質の変異体／フラグメントは、ＰＣＲクローン化によって生成させることができる。下記実施例１８で説明され、Ｆｉｇ．２３および２４に示されるように、「タムスタチン３３３」および「タムスタチン３３４」と呼ばれるフラグメントをこのようにして生成させたところ、全長タムスタチンより優れた抗血管形成活性を有することがわかった。かかるフラグメントを作製するためには、ＰＣＲプライマーを、各セットのプライマーがタンパク質全体から公知サブ配列を増幅させるようなやり方で、公知配列から設計される。次いで、これらのサブ配列を、ｐＥＴ２２ｂベクターなどの適当な発現ベクターにクローン化し、発現タンパク質の抗血管形成活性を、下記アッセイで説明されているように試験する。
【００３７】
本発明の抗血管形成タンパク質の変異体／フラグメントは、Mariyama, M.ら、(1992, J. Biol. Chem. 267:1253-8）によって記載され、下記実施例２４で説明されているようにして、シュードモナス（Pseudomonas・）エラスターゼ消化によって生成させることもできる。この方法を用いて、１２ｋＤａおよび８ｋＤａアレスチン変異体、および１０ｋＤａカンスタチン変異体を製造したが、これら３つのものはいずれも、元の全長タンパク質よりも高いレベルの抗血管形成活性を有する。
【００３８】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「アナログ」とは、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子全体またはそのフラグメントもしくは対立遺伝子変異体のいずれかと実質的に同様の天然に存在しない分子であって、実質的に同一またはそれ以上の生理活性を有する分子を意味する。かかるアナログは、生理活性アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン、ならびにそのフラグメント、変異体、ホモログ、および対立遺伝子変異体の誘導体（たとえば上記に定義される化学誘導体）であって、未修飾のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチド、フラグメント、変異体、ホモログ、または対立遺伝子変異体と定性的に同様のアゴニストまたはアンタゴニスト効果を示す誘導体を包含するものとする。
【００３９】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「対立遺伝子」とは、参照アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドのポリペプチド配列に対する天然配列変異を含有するポリペプチド配列を意味する。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの「対立遺伝子」とは、参照アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列に対する配列変異を含有するポリヌクレオチド配列であって、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体が対立遺伝子型のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４０】
特定のポリペプチドが、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのフラグメント、変異体、アナログ、または対立遺伝子変異体のいずれか１つのものであってもよいし、これらのものの２つ以上であってもよく、たとえば１つのポリペプチドはアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドのアナログかつ変異体であってもよい。たとえば、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子の短縮型（たとえばアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのフラグメント）を、実験室内で作製することができる。次いで、そのフラグメントを、当該分野において公知の手段により突然変異誘発させると、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのフラグメントかつ変異体である分子が作製される。別の具体例では、後で一部の哺乳類個体中で対立遺伝子型のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンとして存在することが明らかになる変異体を作製することができる。したがって、かかる変異体アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子は、変異体かつ対立遺伝子変異体である。フラグメント、変異体、対立遺伝子変異体、およびアナログのかかる組み合わせは、本発明の範囲に包含されるものとする。
【００４１】
たとえば、下記実施例１８で説明する大腸菌発現クローン化法によって作製されたタムスタチンは単量体である。大腸菌発現クローン化法は、天然のタンパク質中には存在しないポリリンカー配列とヒスチジンタグを発現タンパク質に付加するため、このものは融合またはキメラタンパク質でもある。やはり実施例１８で説明するタムスタチンフラグメント「タムスタチンＮ−５３」は、全長タムスタチンタンパク質のフラグメントかつ欠失変異体であり、同じ大腸菌発現クローン化法によって作製すると、やはり追加配列が付加されるので、このものも全長タムスタチンタンパク質の融合またはキメラ変異体フラグメントである。このタムスタチンＮ−５３のサブユニットを、たとえば二量体や三量体などへと一体化させると、タムスタチンタンパク質のキメラ変異体フラグメントの多量体状融合体が生じる。
【００４２】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードするポリヌクレオチドと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。「実質的に同一の配列」とは、たとえば別の核酸またはポリペプチドなどの参照配列と少なくとも約７０％の配列相同性、通常は参照配列と少なくとも約８０％の配列相同性、好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性、最も好ましくは参照配列と少なくとも約９７％の配列相同性を示す核酸またはポリペプチドを意味する。配列の比較長は、通常、少なくともヌクレオチド塩基７５個またはアミノ酸２５個分、より好ましくは少なくともヌクレオチド塩基１５０個またはアミノ酸５０個分、最も好ましくはヌクレオチド塩基２４３〜２６４個またはアミノ酸８１〜８８個分である。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは、アミノ酸の分子鎖を表し、特定の長さの産物をいうのではない。すなわち、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、たとえば糖化、アセチル化、リン酸化などの発現後修飾をすでに受けているポリペプチドも包含するものとする。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「配列相同性」とは、たとえば２個のポリヌクレオチドまたは２個のポリペプチドなど２個のポリマー状分子どうしのサブユニット配列類似性をいう。たとえば２個のペプチドのそれぞれにおける位置がセリンによって占拠されている場合、２個の分子の両者におけるサブユニット位置が同一の単量体状サブユニットによって占拠されると、これらのものはその位置において相同になる。２個の配列どうしの相同性は、マッチングする位置すなわち相同の位置の数に正比例し、たとえば２個のペプチドまたは化合物配列中の位置の半数（たとえばサブユニット１０個分の長さのポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、２個の配列は５０％相同であり、たとえば１０個のうちの９個など位置数の９０％がマッチすると、２個の配列は９０％の配列相同性があることになる。例示すると、アミノ酸配列Ｒ2 Ｒ5 Ｒ7Ｒ10Ｒ6 Ｒ3 とＲ9Ｒ8 Ｒ1 Ｒ10Ｒ6Ｒ3 は６つの位置のうちの３つを共有しているので、５０％の配列相同性があり、配列Ｒ2 Ｒ5 Ｒ7Ｒ10Ｒ6 Ｒ3 とＲ8Ｒ1 Ｒ10Ｒ6 Ｒ3は５つの位置のうちの３つを共有しているので、６０％の配列相同性がある。２個の配列どうしの相同性は、マッチングする位置すなわち相同の位置の数に正比例する。したがって、参照配列の一部が特定のペプチドを欠失すると、その欠失箇所は配列相同性の計算を行う目的のためには算定されず、たとえば、Ｒ2 Ｒ5 Ｒ7Ｒ10Ｒ6 Ｒ3 とＲ2Ｒ5 Ｒ7 Ｒ10Ｒ3は６つの位置のうちの５つを共有しているので、８３．３％の配列相同性がある。
【００４４】
相同性は、たとえばＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＰ（http: ／／www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ から入手可能）などの配列解析ソフトウエアを用いて測定されることが多い。ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）によって２個の配列を比較（たとえば２個の配列を互いに対して「ブラスト（Blasting）」処理する、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html)するためのデフォールトパラメーターは、マッチリウォード＝１、ミスマッチペナルティー＝−２、オープンギャップ＝５、伸長ギャップ＝２である。タンパク質配列用のＢＬＡＳＴＰを用いる場合のデフォールトパラメーターは、マッチリウォード＝０、ミスマッチペナルティー＝０、オープンギャップ＝１１、および伸長ギャップ＝１である。
【００４５】
２個の配列に「配列相補性」がある場合、該２個の配列は、保存的置換のみによって互いに異なることを意味する。ポリペプチド配列の場合、かかる保存的置換は、配列中の特定位置における１個のアミノ酸が同じクラスの別のアミノ酸（たとえばバリンがロイシンに、アルギニンがリジンに置換するなど、疎水性、電荷、ｐＫまたはその他の立体配置的または化学的性質の特性を共有するアミノ酸）に置換しているものから成る。または、ポリペプチドの生理活性が破壊される程度に該ポリペプチドの立体配置または折りたたみを変化させることはない配列の位置における１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によって異なるものである。「保存的置換」の具体例としては、ポリペプチドが必須の生理活性を示すという条件の下に、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基が別のものに置換しているもの；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、トレオニンとセリンの間などの１つの極性（親水性）残基が別のものに置換しているもの；リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの１つの塩基性残基が別のものに置換しているもの；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基が別のものに置換しているもの；または非誘導体化残基の代わりに化学誘導体化残基を使用するものが挙げられる。配列相補性を有する２個の配列は、「配列ホモログ」と呼ばれることがある。
【００４６】
ポリペプチドの相補性は、通常、配列解析ソフトウエア（たとえばGenetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705の配列解析ソフトウエアパッケージ）を用いて測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に対する相補性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。保存的置換は通常、下記グループ内の置換を含む。すなわち、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンである。
【００４７】
アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンの化学誘導体も本発明の範囲に含まれる。「化学誘導体」とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドをいう。かかる誘導体化残基としては、たとえば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化させて、塩、メチルおよびエチルエステルまたはその他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成させてもよい。遊離水酸基を誘導体化させて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成させてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化させて、Ｎ−イムベンジルヒスチジンを形成させてもよい。化学誘導体には、２０種類の標準アミノ酸のうちの１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。たとえば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換させてもよいし；５−ヒドロキシリジンをリジンに置換させてもよいし；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに置換させてもよいし；ホモセリンをセリンに置換させてもよいし；オルニチンをリジンに置換させてもよい。
【００４８】
本発明はまた、抗血管形成タンパク質、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体から成る融合タンパク質およびキメラタンパク質も包含する。融合またはキメラタンパク質は、組換え発現とクローニング過程によって製造することができ、たとえば全長または部分リンカー配列に対応する追加のアミノ酸またはアミノ酸配列から成るタンパク質を製造することができ、たとえば本発明のアレステンを大腸菌中で製造したもの（下記実施例２参照）は、ヒスチジンタグを含む追加ベクター配列がタンパク質に付加されている。本明細書で使用する場合、「融合またはキメラタンパク質」とは、元のタンパク質配列に対するこのタイプの変化を包含するものとする。同様の変化が、カンスタチンおよびタムスタチンタンパク質に対しても作製された（それぞれ実施例１１および１８）。融合またはキメラタンパク質は、単一のタンパク質の多量体から成ることができ、たとえば抗血管形成タンパク質または融合およびキメラタンパク質の反復単位は、数個のタンパク質、たとえば該抗血管形成タンパク質の数個のものでできていてもよい。該融合またはキメラタンパク質は、２つ以上の公知の抗血管形成タンパク質（たとえばアンジオスタチンとエンドスタチン、またはアンジオスタチンとエンドスタチンの生理活性フラグメント）を組み合わせたもの、または１つの抗血管形成タンパク質とターゲティング剤を組み合わせたもの（たとえばエンドスタチンと上皮成長因子（ＥＧＦ) またはＲＧＤペプチド）、または１つの抗血管形成タンパク質と免疫グロブリン分子を組み合わせたもの（たとえばエンドスタチンとＩｇＧ、とくにＦｃ部分を除去したＩｇＧ）から成ることができる。融合およびキメラタンパク質は、抗血管形成タンパク質、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにその他の抗血管形成タンパク質、たとえばエンドスタチンまたはアンジオスタチンを含むこともできる。その他の抗血管形成タンパク質には、レスチン（restin）およびアポミグレン（apomigren・）（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２６０５８、この文献の教示は参照により本明細書に含まれる）およびエンドスタチンのフラグメント（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２６０５７、この文献の教示は参照により本明細書に含まれる）も含まれ得る。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、たとえば化学療法剤をコードするポリヌクレオチドが抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結されている化学療法剤を送達するための追加成分を包含する場合もあり得る。融合またはキメラタンパク質は、たとえば二量体や三量体など抗血管形成タンパク質の多量体を包含する場合もあり得る。かかる融合またはキメラタンパク質は、翻訳後修飾を介して連結（たとえば化学連結）させることができるが、融合タンパク質全体を組換え法により製造してもよい。
【００４９】
アレステン、カンスタチン、タムスタチン、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体から成る多量体状タンパク質も本発明の範囲に含まれるものとする。「多量体」とは、サブユニットタンパク質の２つ以上のコピーから成るタンパク質を意味する。該サブユニットタンパク質は、本発明のタンパク質の１つであってよく、たとえばアレステンが２回以上反復されているもの、またはたとえばタムスタチン３３３などのタムスタチン変異体またはフラグメントなどのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体が２回以上反復されているものであってよい。かかる多量体は、融合またはキメラタンパク質であってもよく、たとえば反復タムスタチン変異体を、単一コピー中に存在していてもよいポリリンカー配列、および／または１つ以上の抗血管形成ペプチドと組み合わせてもよく、あるいはタンデム反復されていてもよく、たとえば１つのタンパク質がタンパク質全体内の２つ以上の多量体から成るものであってもよい。
【００５０】
本発明は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードする１つ以上の単離ポリヌクレオチドから成る組成物、ならびにかかるポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにアレステン、カンスタチンおよびタムスタチン、およびそれらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を製造するための方法も包含する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸の断片（pieces）が挿入またはクローン化されていてもよい担体であって、該核酸の断片を宿主細胞中に導入する機能を示す担体を意味する。かかるベクターは、導入される核酸断片の複製および／または発現をもたらしてもよい。ベクターの具体例としては、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、または哺乳類、植物または昆虫ウイルス、またはリガンド−核酸コンジュゲート、リポソーム、または脂質−核酸複合体などの非ウイルスベクターに由来する核酸分子が挙げられる。導入される核分子は、発現制御配列に作動可能に連結されて、該導入核酸を発現し得る発現ベクターを形成させることが望ましい。核酸のかかる導入は一般に「形質転換」と呼ばれ、挿入に用いられる方法の如何に関わらず、宿主細胞に外来ポリヌクレオチドが挿入されることをいう。たとえば、直接取り込み、トランスダクションまたはｆ交配が含まれる。外来ポリヌクレオチドは、たとえばプラスミドなどの非統合ベクターとして維持することができるが、あるいは、宿主ゲノム中に統合させてもよい。「作動可能に連結される」とは、上記成分が、意図的なやり方で機能させられる関係にある状況をいい、たとえばコード配列に対して「作動可能に連結された」制御配列を、該コード配列の発現が制御配列にふさわしい条件化で行われるようなやり方でライゲーションさせる。「コード配列」は、適当な調節配列の制御化に置かれると（たとえば作動可能に連結されると）、ｍＲＮＡに転写されてポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳終止コドンによって決定されている。かかる境界は天然に生じることができるが、当該分野において公知の方法によりポリヌクレオチド配列に導入または付加させることもできる。コード配列としては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５１】
クローン化ポリヌクレオチドがクローン化されるベクターは、原核生物中で機能するという理由で選ぶことができるが、真核生物中で機能するという理由で選んでもよい。アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローン化と、該ポリヌクレオチドからのこれらのタンパク質の発現の両者が可能なベクターの２つの具体例として、それぞれ細菌および酵母におけるタンパク質の発現が可能なｐＥＴ２２ｂおよびｐＥＴ２８（ａ）ベクター（Novagen, Madison, Wisconsin, USA）および修飾ｐＰＩＣＺαＡベクター（In Vitrogen, San Diego, California, USA ）が挙げられる。（たとえばＰＣＴ／ＵＳ９８／２５８９２参照、この文献の教示は参照により本明細書に含まれる）。
【００５２】
ポリヌクレオチドが適当なベクターにクローン化されたならば、適当な宿主細胞に形質転換させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターを介して導入核酸のレシピエントとしてすでに使用されているか、使用することができる細胞を意味する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞、哺乳類、植物、または昆虫であることができ、単細胞として、またはたとえば培養物としてのコレクションとして、または組織培養状態で、または組織もしくは生物体中に存在することができる。宿主細胞は、たとえば哺乳類などの多細胞生物の正常または疾患組織から得ることもできる。本明細書で使用する場合、宿主細胞とは、核酸で形質転換された元の細胞のみならず、該核酸を依然として含有しているかかる細胞の子孫をも含むものとする。
【００５３】
１つの態様においては、抗血管形成タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドは、ペプチドをコードするポリヌクレオチドリンカーをさらに含む。かかるリンカーは当業者にとって公知であり、たとえば該リンカーは、少なくとも１つの追加アミノ酸をコードする少なくとも１つの追加コドンを含むことができる。通常、該リンカーは、１個から２０個または３０個のアミノ酸から成る。ポリヌクレオチドリンカーは、抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドと同様に翻訳され、その結果、少なくとも１つの追加アミノ酸残基を抗血管形成タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に有する抗血管形成タンパク質の発現が起きる。該単数または複数の追加アミノ酸は、該抗血管形成タンパク質の活性を低下させないことが重要である。
【００５４】
ポリヌクレオチドを選んでベクターに挿入した後、ベクターを、適切な原核生物系に形質転換させ、その系を、該生理活性抗血管形成タンパク質の製造に適した培養条件下で培養する（たとえば継代する) ことにより、生理活性抗血管形成タンパク質、またはその変異体、誘導体、フラグメントまたは融合タンパク質を製造する。１つの態様においては、本発明は、抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ１７ｂまたはｐＥＴ２８ａにクローン化させ、次いでこれらのベクターを細菌に形質転換させる工程を含む。細菌宿主系は、その後、該抗血管形成タンパク質を発現する。通常、抗血管形成タンパク質は、培養液１リットルあたり約１０〜２０ミリグラム以上の量で産生される。
【００５５】
本発明の別の態様においては、真核細胞ベクターは修飾酵母ベクターから成る。１つの方法は、マルチプルクローン化部位を含有するｐＰＩＣｚαプラスミドを使用するものである。該マルチプルクローン化部位は、Ｈｉｓ．タグモチーフをマルチプルクローン化部位に挿入している。さらに、ベクターは、ＮｄｅＩ部位またはその他の適切な制限部位を付加するように修飾することができる。かかる部位は、当業者にとって公知である。本態様によって製造される抗血管形成タンパク質は、１個以上のヒスチジン、通常は約５〜２０個のヒスチジンから成るヒスチジンタグモチーフ（Ｈｉｓ．タグ）を含む。該タグは、該タンパク質の抗血管形成性を阻害するものであってはならない。
【００５６】
たとえばアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンを製造する１つの方法は、それぞれ配列番号：１、配列番号：５、または配列番号：９のポリヌクレオチドを増幅させ、それを、たとえばｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ２８（ａ）、ｐＰＩＣＺαＡ、またはその他の発現ベクターにクローン化させ、該ポリヌクレオチドを含有する該ベクターを、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現し得る宿主細胞に形質転換させ、該形質転換宿主細胞を、該タンパク質の発現に適した培養条件下で培養し、次いで、該タンパク質を培養物から抽出および精製するものである。一般的には抗血管形成タンパク質、具体的にはアレステン、カンスタチンおよびタムスタチンを製造する代表的方法を、下記実施例に示す。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質は、たとえばトランスジェニックの雌性ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタの乳汁の成分としてなどトランスジェニック動物の産物として、またはたとえばトウモロコシ中のデンプン分子と化合または連結させたトランスジェニック植物の産物として、発現させてもよい。
【００５７】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンは、従来の公知の化学合成法によって製造してもよい。合成手段により本発明のタンパク質を構築する方法は、当業者にとって公知である。合成的に構築されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質配列は、たとえば組換え的に製造されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと、一次、二次または三次構造特性および／または立体配置特性を共有させるために、生理活性を含む生物学的性質をそれらのものと共通的に保持してもよい。すなわち、合成的に構築されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質配列は、たとえば治療用化合物のスクリーニングにおいて、および抗体生成のための免疫学的プロセスにおいて、組換え的に製造され精製されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質に対する生理活性または免疫学的置換物として用いてもよい。
【００５８】
アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンタンパク質は、常法のアッセイにおいて下記実施例に示されるようにして測定される抗血管形成を阻害する上で有用である。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンは、たとえば内皮細胞以外の細胞など、他の細胞型の成長を阻害しない。
【００５９】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードするポリヌクレオチドは、単離ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。本明細書で「単離」と称される核酸ポリペプチドは、それらが得られた生物学的供給源の物質（たとえば核酸の混合物中または細胞中に存在するもの）を実質的に含まない（すなわち完全に分離されている）核酸またはポリペプチドであり、さらにプロセシングを受けていてもよい。「単離」核酸またはポリペプチドとしては、本明細書で説明する方法、類似の方法、またはその他の適切な方法によって得られる核酸またはポリペプチドが挙げられ、実質的に純粋な核酸またはポリペプチド、化学合成によって製造された核酸またはポリペプチド、化学的または生物学的方法を組み合わせたものによって製造された核酸またはポリペプチド、および組換え法によって製造された核酸またはポリペプチドが単離されたものが含まれる。したがって、単離されたポリペプチドとは、通常は関連している他のタンパク質、炭水化物、脂質、およびその他の細胞成分を比較的含んでいないものを意味する。単離された核酸は、該核酸の由来元である生物の天然ゲノム中で直接連続している核酸の両者と直接連続（すなわち共有結合）していない。したがって、該用語は、たとえばベクター（たとえば自己複製ウイルスまたはプラスミド）に組み込まれている核酸、または化学的手段または制限エンドヌクレアーゼ処理によって製造された核酸フラグメントなど、他の核酸とは独立している別の分子として存在する核酸を包含する。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、他の抗血管形成タンパク質を単離するためのプローブを設計する目的に用いることもできる。特殊な方法が、ジェイコブスら（Jacobs et al. ）の米国特許第５，８３７, ４９０号に示されているが、この文献の教示全体は参照によりすべて本明細書に含まれる。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、以下の項目に従うことが好ましい。すなわち、（ａ）プローブは、塩基が存在する場合は、最少数のアンビギュアス（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）塩基（「Ｎ」）を有する配列のエリアに対して設計されなければならない。また、（ｂ）プローブは、約８０℃（各ＡまたはＴについては２℃、各ＧまたはＣについては４度を想定）のＴｍを有するように設計されなければならない。
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、通常のオリゴヌクレオチド標識技術を用いて、ｇ−32Ｐ−ＡＴＰ（比活性６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識されることが好ましい。他の標識技術を用いることもできる。取り込まれなかった標識体は、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはその他の確立された方法によって除去されることが好ましい。プローブに取り込まれた放射活性の量は、シンチレーションカウンターにおける測定によって定量されなければならない。生じたプローブの比活性は、約４ｘ１０6 ｄｐｍ／ｐｍｏｌｅであることが好ましい。全長クローンのプールを含有する細菌培養物を融解させ、１００μｌの原液を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５ｍｌの滅菌Ｌブロスを入れた滅菌培養フラスコに接種することが好ましい。培養物は、３７℃で飽和になるまで培養することが好ましく、飽和培養物は、新鮮Ｌブロスで希釈することが好ましい。これらの希釈物の一定量を平板培養に付して、３７℃で一夜培養したときに、１５０ｍｍペトリ皿中で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと１．５％の寒天を含有するＬブロスを含む固形細菌培地上で約５０００個の明瞭でよく分離されたコロニーを生じる希釈度と容量を求めることが好ましい。明瞭でよく分離されたコロニーを得る他の公知方法を用いることもできる。
【００６２】
次いで、コロニーハイブリダイゼーションの常法手順を用いて、コロニーをニトロセルロースフィルターに移し、溶菌、変性および加熱しなければならない。高度ストリンジェント条件とは、たとえば６５℃で１ｘＳＳＣ、または４２℃で１ｘＳＳＣと５０％ホルムアミドで処理するのと少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。中等度ストリンジェント条件とは、６５℃で４ｘＳＳＣ、または４２℃で４ｘＳＳＣと５０％ホルムアミドで処理するのと少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。低度ストリンジェント条件とは、５０℃で４ｘＳＳＣ、または４０℃で６ｘＳＳＣと５０％ホルムアミドで処理するのと少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。
【００６３】
次いで、フィルターを、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ、および１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する６倍ＳＳＣ（２０ｘ原液は、１リットルあたり１７５．３ｇのＮａＣｌ、１リットルあたり８８．２ｇのクエン酸ＮａをＮａＯＨでｐＨ７．０に調整したもの）（１５０ｍｍフィルター１枚あたり約１０ｍＬ）中でゆっくり撹拌しながら、６５℃で１時間保温することが好ましい。次いで、プローブを、１ｘ１０6 ｄｐｍ／ｍＬより大きいか同等な濃度で、ハイブリダイゼーション混合物に添加することが好ましい。次いで、フィルターを、ゆっくり撹拌しながら６５℃で一夜保温することが好ましい。次いで、フィルターを、撹拌しないで室温で、５００ｍＬの２ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で洗浄することが好ましく、さらに続いて、室温で振盪しながら、５００ｍＬの２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分間にわたり洗浄することが好ましい。６５℃で０．１ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳによる３回目の洗浄を３０分間から１時間にわたり行ってもよい。次いで、フィルターを乾燥させ、Ｘ線フィルム上で陽性物を可視化させるのに十分な時間にわたりオートラジオグラフィーに付すことが好ましい。他の公知のハイブリダイゼーション法を用いることもできる。次いで、陽性クローンを釣菌し、培養し、常法を用いてプラスミドＤＮＡを単離する。次いで、クローンを、制限酵素解析、ハイブリダイゼーション解析、またはＤＮＡ配列決定法によって確認することができる。
【００６４】
本発明は、アレステン、カンスタチン、タムスタチンまたはそれらの生理活性フラグメント、アナログ、ホモログ、誘導体または変異体を用いて、哺乳類組織における血管形成を阻害する方法を含む。さらに具体的には、本発明は、血管形成関与疾患を、１つ以上の抗血管形成タンパク質またはそれらの１つ以上の生理活性フラグメント、または抗血管形成活性を有するフラグメントを組み合わせたもの、またはアゴニストおよびアンタゴニストの有効量で治療する方法を含む。抗血管形成タンパク質の有効量とは、疾患または病態を生ぜしめる血管形成を阻害することで、該疾患または病態を完全にまたは部分的に改善させるのに十分な量である。血管形成関与疾患の改善は、たとえば腫瘍のサイズの減少または腫瘍成長停止など、疾患の症状の改善を観察することによって、判定することができる。本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者にとって有意義な利益、すなわち関連する医学的状態の治療、治癒、予防または軽減、またはかかる状態の治療、治癒、予防または軽減の速度の増大を示すのに十分な組成物または方法の各有効成分の合計量を意味することもある。１つの組み合わせに対して適用される場合、該用語は、併用的、連続的、または同時的に投与されるかに関わらず、該治療効果をもたらす有効成分の合計量をいう。血管形成関与疾患としては、癌、充実性腫瘍、血液性腫瘍（たとえば白血病）、腫瘍転移、良性腫瘍（たとえば血管腫、聴覚神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼血管形成疾患（たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管形成緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス）、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維種、および創傷肉芽形成が挙げられるが、これらに限定されない。抗血管形成タンパク質は、内皮細胞の過剰または異常刺激による疾患の治療に有用である。これらの疾患としては、腸管癒着、クローン病、動脈硬化、強皮症、および過形成性瘢痕（すなわちケロイド）が挙げられるが、これらに限定されない。抗血管形成タンパク質は、胚着床に必要な血管形成を予防することにより、産児制限剤として用いることができる。抗血管形成タンパク質は、ネコひっかき病〔ロケレ ミナリア クイントサ（Rochele minalia quintosa）〕や潰瘍（ヘリコバクター ピロリ）など病理的に血管形成を伴う疾患の治療に有用である。抗血管形成タンパク質は、たとえば脂肪組織における毛細血管形成を阻害することによりその肥大を予防することで、透析移植片血管アクセス狭窄（dialysis graft vascular access stenosis ）および肥満を予防する目的に用いることもできる。抗血管形成タンパク質は、局在化（たとえば転移していない）疾患を治療する目的に用いることもできる。「癌」とは、新生物成長、過形成性または増殖性成長または異常細胞発育の病理的状態を意味し、充実性腫瘍、非充実性腫瘍、および白血病で見られるものなどの異常細胞増殖を含む。本明細書で使用する場合、「癌」とは、血管形成依存性の癌および腫瘍、すなわち血液を供給する血管の数と密度の増大を、その成長（容積および／または質量の増大) に必要とする腫瘍も意味する。「後退」とは、当業者にとって公知の方法を用いて測定される腫瘍質量とサイズの減少をいう。
【００６５】
あるいは、たとえば創傷治癒において、または梗塞後心臓組織において、血管形成の増大が望まれる場合には、抗血管形成タンパク質に対する抗体または抗血清を用いて、局在化された天然の抗血管形成タンパク質およびプロセスをブロックすることで、新たな血管の形成を増大させ、組織の萎縮を阻害することができる。
【００６６】
抗血管形成タンパク質は、疾患治療のための他の組成物および手順と組み合わせて用いてもよい。たとえば、腫瘍は、従来通り、外科手術、放射線照射、化学療法、または免疫療法を抗血管形成タンパク質と組み合わせたもので治療してもよく、次いで、抗血管形成タンパク質を患者に投与して、微小転移の潜伏期間を延長させ、残留する原発性腫瘍の成長を安定化および阻害させてもよい。抗血管形成タンパク質、またはそれらのフラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、または受容体アンタゴニスト、またはそれらを組み合わせたものを、他の抗血管形成化合物、または他の抗血管形成タンパク質（たとえばアンジオスタチン、エンドスタチン）のタンパク質、フラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニストと組み合わせて用いることもできる。さらに、抗血管形成タンパク質、またはそれらのフラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、またはそれらを組み合わせたものを、薬学的に許容される賦形剤、および任意には生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成させる。本発明の組成物は、エンドスタチンまたはアンジオスタチン、およびそれらの変異体、フラグメント、およびアナログなど、他の抗血管形成タンパク質または化学化合物をさらに含んでいてもよい。該組成物は、化学療法剤や放射性剤など、該タンパク質の活性を強化するか、治療に際してその活性または用途を引き立たせる他剤をさらに含有していてもよい。かかる追加的因子および／または剤を該組成物に含有させて、本発明のタンパク質と相乗的効果を生じさせたり、副作用を極力抑えることができる。また、本発明の組成物の投与は、たとえば化学療法または放射線療法レジメンと組み合わせて投与するなど、他の療法と併用投与することができる。
【００６７】
本発明は、哺乳類組織における血管形成を、組織を本発明のタンパク質から成る組成物と接触させることにより、阻害する方法を含む。「接触させる」とは、局所施用のみならず、該組成物を該組織に、または該組織の細胞に導入する送達方式をも意味する。
【００６８】
遅放性送達系または徐放性送達系の使用も本発明に含まれる。かかる系は、たとえば年齢または疾患経過そのものにより衰弱している患者など外科手術が困難または不可能であったり、リスク・効果解析で治癒よりコントロールが求められる状況において、とくに望ましい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、徐放性マトリックスは、酵素的または酸／塩基加水分解によるか、溶解によって分解可能な、通常はポリマーである物質でできているマトリックスである。体内に挿入されたマトリックスは、酵素と体液によって作用させられる。徐放性マトリックスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド・コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコンなどの生体適合性物質から選ばれることが望ましい。好ましい生分解性マトリックスとしては、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド・コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のいずれか１つのもののマトリックスが挙げられる。
【００７０】
本発明の血管形成調節組成物は、固体、液体またはエアゾルであってよく、公知の投与経路によって投与することができる。固体組成物の具体例としては、錠剤、クリーム剤、およびインプラント剤型が挙げられる。錠剤は経口的に投与することができ、治療用クリーム剤は局所的に投与することができる。インプラント剤型は、たとえば腫瘍部位において局所的に投与することができるが、血管形成調節組成物の全身放出を目的として、たとえば皮下的に留置してもよい。液体組成物の具体例としては、皮下、静脈内、動脈内注射用の処方、および局所投与および眼内投与用処方が挙げられる。エアゾル処方の具体例としては、肺への投与用の吸入処方が挙げられる。
【００７１】
上記抗血管形成活性を有するタンパク質およびタンパク質フラグメントは、当業者にとって公知の処方方法を用いて、薬学的に許容される処方として、単離され実質的に精製済みのタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供することができる。これらの処方は通常の経路によって投与することができる。一般に、該組成物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳脊髄液内、脳内、腟内、子宮内、経口、直腸内または非経口的（たとえば静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）経路によって投与してよい。また、抗血管形成タンパク質は、該化合物を徐放させる生分解性ポリマーに取り込ませて、該ポリマーを、たとえば腫瘍の部位など、薬物送達が望まれる場所の付近にインプラントさせるか、抗血管形成タンパク質が全身的に徐々に放出されるようにインプラントしてもよい。浸透圧ミニポンプを用いて、カニューレを介して、高濃度の抗血管形成タンパク質を、転移体または腫瘍への血管系に直接送達させるなど、関心部位に制御送達させてもよい。生分解性ポリマーおよびそれらの用途については、たとえばBremら、（1991) (J. Neurosurg. 74:441-446 ）において詳細に説明されているが、この文献は参照により全て本明細書に含まれる。
【００７２】
本発明のポリペプチドを含有する組成物は、たとえば、単位用量の注射によるなどして、静脈内投与することができる。本発明の治療用組成物について使用する場合、「単位用量」という用語は、対象に対する単位投与量として適切である物理的に明確な単位をいい、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと関連して所望の治療効果を発揮するように計算された所定量の有効成分を含有している。
【００７３】
本発明の組成物の投与方式としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射ならびに輸液が挙げられる。非経口的注射用医薬組成物は、薬学的に許容される無菌の水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳液、ならびに使用直前に無菌の注射溶液または分散液に再構成される無菌粉末から成る。適切な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの具体例としては、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびその適当な混合物、植物油（たとえばオリーブ油) およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性を、たとえばレシチンなどの被覆物質の使用により、分散液の場合は、必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持してもよい。これらの組成物は、保存料、湿潤化剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントをさらに含有していてもよい。パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など様々な抗細菌剤および抗真菌剤を含有させることで、微生物活動の予防を確実にしてもよい。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含ませることも望ましい。吸収を遅らせるモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの剤を含有させることにより、注射用医薬剤型の長期的吸収を起こさせてもよい。蓄積注射剤型は、薬物のマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）などの生分解性ポリマー中で形成させることによって、作製される。ポリマーに対する薬物の比率および使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。蓄積注射用処方は、薬物を、生体組織適合性のリポソームまたはマイクロエマルジョンに封入することによって調製される場合もある。該注射用処方は、たとえば細菌捕捉フィルターを通す濾過によるか、使用直前に滅菌水またはその他の滅菌注射媒体に溶解または分散させることができる滅菌固形組成物の形で滅菌剤を添加することによって、滅菌してもよい。
【００７４】
本発明の治療用組成物は、たとえば無機または有機酸から得てもよい、当該成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」とは、正当な医学的判断の範囲内で、好ましくない毒性、刺激性、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよびヒトより下等な動物の組織と接触する用途に適した塩であって、妥当な利益／リスク比に相当する塩を意味する。薬学的に許容される塩は、当該分野において公知である。たとえば、S.M. Bergeらは、J. Pharmaceutical Sciences (1977)66:1 et seq. において、薬学的に許容される塩を詳細に記載しているが、この文献は参照により本明細書に含まれる。薬学的に許容される塩としては、たとえば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることもできる。該塩は、本発明の化合物を最終的に単離および精製する際にインサイチュウで調製してもよく、遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることにより別に調製してもよい。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、二硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシメタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、蓚酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物およびヨウ化物などの低級アルキルハロゲン化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミル硫酸塩のようなジアルキル硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル塩化物、臭化物およびヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物；ベンジルおよびフェネチル臭化物などのようなアリルアルキルハロゲン化物などの剤で四級化（quaternized・）することができる。このようにして、水または脂溶性または分散性の生成物が得られる。薬学的に許容される酸付加塩を形成するために使用することができる酸の具体例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸などの無機酸および蓚酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸などの有機酸が挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」、「生理的に忍容される」という用語およびそれらの文法変化形が組成物、担体、希釈剤および試薬についていわれるときは、互換的に用いられ、当該物質が、吐き気、めまい、胃もたれなどの好ましくない生理的影響をほとんど引き起こさないで、哺乳類に対して投与し得ることを表す。溶解または分散された有効成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当該分野において自明であり、処方に応じて限定される必要はない。通常、かかる組成物は、液状の溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製されるが、使用前の液状の溶液または懸濁液に適した固形剤型を調製することもできる。該製剤は、乳化させることもできる。
【００７６】
有効成分は、薬学的に許容され、かつその有効成分と適合する賦形剤と、本明細書で説明する治療方法における用途に適した量で、混合することができる。適当な賦形剤としては、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、およびそれらを組み合わせたものが挙げられる。また、所望により、該組成物は、有効成分の効果を強化する湿潤化または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの助剤を少量含有することができる。
【００７７】
本発明の抗血管形成タンパク質は、プロドラッグから成る組成物に含有させることもできる。本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、たとえば血液中の酵素加水分解によって、インビボで急速に変換されて、親化合物を生成する化合物をいう。詳細な議論が、（T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series およびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and PermagonPress, 1987 ）でなされ、これらの文献はいずれも参照により本明細書に含まれる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、（１）正当な医学的判断の範囲内で、好ましくない毒性、刺激性、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび動物の組織と接触する用途に適した本発明の化合物のプロドラッグであって、適当な対リスク利益比に相当し、かつそれらの目的用途に有効であるプロドラッグ、および（２）可能である場合は、親化合物の双極性イオン型をいう。
【００７８】
本発明の抗血管形成タンパク質の投与量は、治療されている疾患状態または病態およびヒトまたは動物の体重や状態および化合物の投与経路など、その他の臨床的因子によって決まる。ヒトまたは動物を治療する場合、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから体重１ｋｇあたり約２０ｍｇのタンパク質を投与することができる。たとえば本発明のタンパク質を放射線療法、化学療法、または免疫療法と併用するなどの併用療法においては、たとえば体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから体重１ｋｇあたり約０．２ｍｇまで投与量を減らすことができる。特定の動物またはヒトにおける抗血管形成タンパク質の半減期に応じて、抗血管形成タンパク質を、１日あたり数回から１週間に１回の間で投与することができる。本発明は、ヒト用途と獣医科用途の両方の用途があるものと解される。本発明の方法は、単回投与、ならびに同時的であるか長期にわたるかに関わらず複数回投与が可能である。また、抗血管形成タンパク質は、たとえば化学療法、放射線療法、または免疫療法など、他の形の療法と併用投与することができる。
【００７９】
抗血管形成タンパク質処方としては、経口、直腸内、眼内（硝子体内または眼房内を含む）、鼻腔内、局所（頬内および舌下を含む）、子宮内、腟内または非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適したものが挙げられる。抗血管形成タンパク質処方は、単位剤型として簡便に投与することができ、従来の製薬技術によって調製することができる。かかる技術としては、有効成分と単数または複数の医薬担体または単数または複数の賦形剤を会合させる工程を含む。一般に、該処方は、有効成分を液状担体または粉砕した固形担体または両者と均一かつ緊密に会合させた後、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００８０】
非経口投与に適した処方としては、処方を想定レシピエントの血液と等張化する抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含有していてもよい水性および非水性の無菌注射溶液；および懸濁剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。該処方は、たとえば封入アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量容器に入れて投与することができ、たとえば注射用水などの無菌液状担体を使用直前に添加するだけで、凍結乾燥（リオフィライズ）状態で保存することができる。処方用注射溶液および懸濁液は、上記種類の無菌粉末、粒剤および錠剤から調製することができる。
【００８１】
本発明のタンパク質の有効量が経口的に投与される場合、本発明の抗血管形成タンパク質は、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液またはエリキシル剤の形を取ることになる。錠剤型で投与される場合、本発明の医薬組成物は、ゼラチンやアジュバントなどの固形担体をさらに含有してよい。該錠剤、カプセル剤、および散剤は、本発明のタンパク質を約５から９５％含有しているが、本発明のタンパク質を約２５から９５％含有していることが好ましい。液剤型で投与される場合、水、石油、ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油、またはゴマ油などの動植物起源の油、または合成油などの液状担体を添加することができる。液剤型の該医薬組成物は、生理食塩水、デキストロースまたはその他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含有することができる。液剤型で投与される場合、該医薬組成物は、本発明のタンパク質を約０．５から９０重量％含んでいるが、本発明のタンパク質を約１から５０％含んでいることが好ましい。
【００８２】
本発明のタンパク質の有効量が静脈内、皮内または皮下注射によって投与される場合、本発明のタンパク質は、発熱性物質不含の非経口的に許容される水溶液の形を取ることになる。かかる非経口的に許容されるタンパク質溶液は、ｐＨ、等張性、安定性などに関して配慮されており、その調製は、当該分野における技術の範囲内である。好ましい静脈内、皮内、または皮下注射用医薬組成物は、本発明のタンパク質以外に、当該分野において公知であるように、「塩化ナトリウム注射液」、「リンゲル注射液」、「デキストロース注射液」、「デキストロース・塩化ナトリウム注射液」、「乳酸加リンゲル注射液」、またはその他のビヒクルなどの等張ビヒクルを含有していなければならない。本発明の医薬組成物は、安定剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤、またはその他の当業者にとって公知の添加剤をさらに含有することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物における本発明のタンパク質の量は、治療されている病態の性質と程度により、また患者がそれまで受けていた先行的治療の性質によって決まる。究極的には、主治医が、各患者を治療するのに用いる本発明のタンパク質の量を決定する。まず、主治医は、本発明のタンパク質を低用量で投与し、患者の反応を観察する。患者にとって最適の治療効果が得られるまで、より高用量で本発明のタンパク質を投与し、その時点で、投与量をそれ以上増やさない。
【００８４】
本発明の医薬組成物を用いた静脈内投与療法の期間は、治療されている疾患の程度と各患者の状態および潜在的特異体質反応によって決まる。本発明のタンパク質の各投与の期間は、連続的静脈内投与で１２から２４時間の範囲に入る。究極的には、主治医が、本発明の医薬組成物を用いた静脈内投与療法の適切な期間を決定する。
【００８５】
好ましい単位投与処方は、投与成分の１日あたり用量または単位、１日あたりサブ用量（sub-dose）、またはその適当な分数を含有する処方である。とくに上記の成分以外にも、本発明の処方は、対象処方タイプにふさわしい当該分野において従来公知の他剤を含むことができるものとする。任意に、細胞傷害剤を添加するか、他の形で、抗血管形成タンパク質またはそれらの生理機能性タンパク質フラグメントと併用することで、複合療法を患者に提供してもよい。
【００８６】
該治療用組成物は、現時点で、獣医科用途にも有用である。ヒト以外にも、とくに家畜動物およびサラブレッド馬は、本発明のタンパク質によるかかる治療の対象として望ましい。
【００８７】
リシンなどの細胞傷害剤を、抗血管形成タンパク質およびそれらのフラグメントに連結させることで、該抗血管形成タンパク質に結合する細胞を破壊する手段を提供することができる。これらの細胞は、微小転移や原発性腫瘍を含む多くの場所で見られるが、これらに限定されない。細胞傷害剤に連結させたタンパク質を、所望の場所への送達を最大化するように設計されたやり方で輸液投与する。たとえば、リシン連結高度親和性フラグメントを、ターゲット部位に血液を供給する血管にカニューレを介して、またはターゲットに直接、送達させる。かかる剤は、輸液カニューレに接続した浸透圧ポンプを介して、制御されたやり方で送達させることもある。抗血管形成タンパク質に対するアンタゴニストを組み合わせたものを、血管形成シミュレーターとともに併用投与して、組織の血管形成を増大させてもよい。この治療レジメンは、効果的な転移癌破壊手段を提供する。
【００８８】
上記以外の治療方法としては、抗血管形成タンパク質、それらのフラグメント、アナログ、抗血清、または受容体アゴニストおよびアンタゴニストを細胞傷害剤に連結させたものの投与が挙げられる。抗血管形成タンパク質は、起源がヒトまたは動物であってよいものと解する。抗血管形成タンパク質は、化学反応によって、または組換え技術を発現系と組み合わせたものによって、合成的に製造することもできる。抗血管形成タンパク質は、単離ＩＶ型コラーゲンを酵素的に分解することで、抗血管形成活性を有するタンパク質を生成させることによって、製造することもできる。抗血管形成タンパク質は、ＩＶ型コラーゲンを分解して該抗血管形成タンパク質を生成させる内因性酵素の作用を模倣する化合物によって製造してもよい。抗血管形成タンパク質の製造は、分解酵素の活性に影響を及ぼす化合物によって調節してもよい。
【００８９】
本発明は、抗血管形成タンパク質またはそれらの変異体、フラグメント、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが患者の体内に導入され調節される遺伝子治療をも包含する。遺伝子産物タンパク質を発現させるためにＤＮＡを細胞に転位または送達させる、遺伝子治療とも呼ばれる様々な方法が、Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang (1992) Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 に開示されているが、この文献は参照により本明細書に含まれる。遺伝子治療は、エクスビボまたはインビボ治療のいずれかにおける用途のための体細胞または生殖細胞へのＤＮＡ配列の組み込みを包含する。遺伝子治療は、遺伝子を置換し、正常または異常な遺伝子機能を強化させ、感染症およびその他の病理に対抗する機能を発揮する。
【００９０】
これらの医学的問題を遺伝子治療で治療する方式としては、欠陥遺伝子を同定した後で機能遺伝子を添加することで、該欠陥遺伝子の機能に置換するか、やや機能する遺伝子を強化するなどの治療法式；または病態を治療するか、組織または臓器を治療レジメンに対してより感受性にする産物タンパク質の遺伝子を添加するなどの予防方式が挙げられる。予防方式の具体例としては、１つ以上の抗血管形成タンパク質をコードするものなどの遺伝子を患者の体内に導入することで、血管形成の発生を予防してもよく；腫瘍細胞を放射線に対してより感受性にする遺伝子を挿入した後、その腫瘍に放射線を照射して、腫瘍細胞の死滅性を高めることもできる。
【００９１】
抗血管形成タンパク質のＤＮＡまたは調節配列の導入のための多くのプロトコルも本発明に含まれる。抗血管形成タンパク質と特異的に関連しているのが普通であるもの以外のプロモーター配列、または抗血管形成タンパク質の産生を増大させる他の配列のトランスダクションも、遺伝子治療の方法とみなされる。本技術の具体例として、細胞中でエリスロポエチン遺伝子に変化する「遺伝子スイッチ」を挿入する相同組換え法を用いたものが、Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Mass., に示されている。Genetic Engineering News, Apr. 15, 1994 参照。かかる「遺伝子スイッチ」を用いて、抗血管形成タンパク質（または受容体）を発現しないのが普通である細胞中で該タンパク質（または受容体）を活性化させることができる。
【００９２】
遺伝子治療のための遺伝子導入方法は、３つの範疇に大別される。すなわち、物理的方法（たとえばエレクトロポレーション、直接遺伝子導入および粒子ボンバードメント）、化学的方法（たとえば脂質利用担体、またはその他の非ウイルスベクター）および生物学的方法（たとえばウイルス由来ベクターおよび受容体取り込み）である。たとえば、ＤＮＡで被覆されたリポソームを含む非ウイルスベクターを使用することができる。かかるリポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接的に患者に静脈内注射することができる。リポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓で濃縮され、ＤＮＡをマクロファージとクッパー細胞に送達させると考えられる。これらの細胞は生存期間が長いため、送達ＤＮＡの長期的発現をもたらす。また、ベクターすなわち遺伝子の「はだかの」ＤＮＡを、所望の臓器、組織または腫瘍に直接注射することで、治療用ＤＮＡのターゲット化送達を行ってもよい。
【００９３】
遺伝子治療方法は、送達部位別に説明することもできる。基本的な遺伝子送達手段としては、エクスビボ遺伝子導入、インビボ遺伝子導入、およびインビトロ遺伝子導入が挙げられる。エクスビボ遺伝子導入では、細胞を患者から採取し、細胞培養で成長させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクトさせ、トランスフェクト細胞を数的に増殖させた後、患者に戻す。インビトロ遺伝子導入では、組織培養細胞など培養状態で成長する細胞が形質転換細胞となり、特定の患者の特定の細胞はこれに該当しない。これらの「実験室細胞」をトランスフェクトさせ、トランスフェクト細胞を選抜し、増殖させて、患者への移植またはその他の用途に使用する。
【００９４】
インビボ遺伝子導入は、患者の細胞が患者の体内にあるときに、ＤＮＡを細胞に導入するものである。方法としては、非感染性ウイルスを用いたウイルス介在遺伝子導入を用いて、遺伝子を患者に送達するか、はだかのＤＮＡを患者の体内の部位に注射して、ＤＮＡを、遺伝子産物タンパク質が発現される細胞の一定の比率のものに取り込ませるものが挙げられる。また、本明細書で説明する「遺伝子銃」の使用など、他の方法を、抗血管形成タンパク質の産生を制御するＤＮＡまたは調節配列のインビトロ挿入に用いることができる。
【００９５】
遺伝子治療の化学的方法としては、必ずしもリポソームでなくてもよい脂質ベース化合物を用いて、ＤＮＡを細胞膜通過させるものがある。負電荷ＤＮＡに結合する脂質ベース陽イオンであるリポフェクチンまたはサイトフェクチンは、細胞膜を通過して、ＤＮＡを細胞内部に送ることができる複合体を形成する。別の化学的方法では、特定のリガンドを細胞表面受容体に結合させ、それを封入し、細胞膜を通して輸送させる受容体ベースのエンドサイトーシスを利用する。リガンドは、ＤＮＡに結合し、複合体全体が細胞内に輸送される。リガンド遺伝子複合体が血流内に注射された後、受容体を有するターゲット細胞がリガンドと特異的に結合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細胞内へ輸送する。
【００９６】
多くの遺伝子治療方法は、ウイルスベクターを用いて遺伝子を細胞に挿入する。たとえば、変化させたレトロウイルスベクターをエクスビボの方法で用いて、遺伝子を末梢および腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋肉細胞、またはその他の体細胞に導入する。次いで、これらの変化細胞を患者に導入することで、挿入ＤＮＡ由来の遺伝子産物を提供する。
【００９７】
ウイルスベクターは、インビボのプロトコルによる遺伝子の細胞への挿入にも用いられている。外来遺伝子の組織特異的発現を起こさせるために、組織特異的であることが知られているシス作用性調節エレメントまたはプロモーターを用いることができる。あるいは、この発現は、インビボにおいてＤＮＡまたはウイルスベクターを特定の解剖部位にインサイチュウ送達することで行うことができる。たとえば、インビボにおける血管への遺伝子導入が、動脈壁上の選ばれた部位において、インビトロでトランスデュース内皮細胞を移植することによって、行われている。ウイルスは周囲の細胞に感染し、これらの細胞も遺伝子産物を発現した。ウイルスベクターは、たとえばカテーテルにより、インビボ部位に直接送達させることで、特定のエリアのみをウイルスに感染させ、長期的な部位特異的遺伝子発現をもたらすことができる。レトロウイルスベクターを用いるインビボ遺伝子導入は、変化ウイルスを、臓器につながる血管に注射することによっても、哺乳類組織および肝臓組織中で起きることが示されている。
【００９８】
遺伝子治療プロトコルに用いられてきたウイルスベクターとしては、レトロウイルス、ポリオウイルスまたはシンドビスウイルスなどのその他のＲＮＡウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアおよびその他のＤＮＡウイルスが挙げられる。複製欠損ネズミレトロウイルスベクターは、最も広く利用されている遺伝子導入ベクターである。ネズミ白血病レトロウイルスは、１本鎖ＲＮＡが核コアタンパク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合体化したものが、タンパク質コア（ｇａｇ）に封入され、宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）に取り囲まれているものから成る。レトロウイルスのゲノム構造には、５’および３’の長鎖末端反復単位（ＬＴＲ）において閉鎖されたｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子が含まれている。レトロウイルスベクター系は、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞株においてトランスの位置で提供されるという条件の下に、５’および３’ＬＴＲを含有するミニマルベクターおよびパッケージングシグナルさえあれば、ベクターのパッケージング、感染およびターゲット細胞への取り込みを起こさせるのに十分であるという事実を利用している。遺伝子導入におけるレトロウイルスベクターの基本的長所としては、ほとんどの細胞タイプにおいて効率的な感染と遺伝子発現が行えること、ターゲット細胞染色体ＤＮＡへの単一コピーベクターの取り込みが正確に行えること、およびレトロウイルスゲノムの操作が容易であることが挙げられる。
【００９９】
アデノウイルスは、線状２本鎖ＤＮＡがコアタンパク質と複合体を形成し、カプシドタンパク質で囲まれたものから成る。分子ウイルス学の進歩により、これらの生物の生物学的性質を利用して、新規遺伝子配列をインビボでターゲット細胞にトランスデュースし得るベクターを作製することが可能になった。アデノウイルスベースのベクターは、高レベルの遺伝子産物タンパク質を発現する。アデノウイルスベクターは、低タイターのウイルスとでさえ、高い効力の感染性を有する。また、該ウイルスは、細胞不含ビリオンとして完全感染性を示すので、プロデューサー細胞株の注射は不要である。アデノウイルスベクターのもう１つの長所となり得るのは、異種遺伝子の長期的発現をインビボで行うことができる点である。
【０１００】
ＤＮＡ送達の機械的方法としては、リポソームまたはその他の膜融合用ベシクルなどの融合誘発性脂質ベシクル、リポフェクチンなどのカチオン脂質を含んでいるＤＮＡの脂質粒子、ＤＮＡのポリリジン介在導入、生殖または体細胞へのＤＮＡのマイクロ注射などのＤＮＡの直接注射、「遺伝子銃」に使用される金粒子などの空圧送達ＤＮＡ被覆粒子、およびリン酸カルシウムトランスフェクションなどの無機化学的アプローチが挙げられる。粒子介在遺伝子導入法は、当初、植物組織の形質転換に用いられた。粒子ボンバードメント装置すなわち「遺伝子銃」により、動力を発生させ、ＤＮＡ被覆高密度粒子（金やタングステンなど）を、ターゲット臓器、組織または細胞への進入が可能になる高い速度まで加速させる。粒子ボンバードメントは、インビトロ系において、またはエクスビボまたはインビボ技術とともに用いて、ＤＮＡを細胞、組織または臓器に導入することができる。別の方法であるリガンド介在遺伝子治療は、ＤＮＡを特異的リガンドと複合体化させて、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを形成させることで、ＤＮＡを特定の細胞または組織に送達させる。
【０１０１】
プラスミドＤＮＡを筋細胞に注射すると、高い比率の細胞がトランスフェクトされ、マーカー遺伝子を持続的に発現するようになることがわかっている。プラスミドのＤＮＡは、細胞のゲノム中に取り込ませてもよいし、取り込ませなくてもよい。トランスフェクトＤＮＡを取り込ませない場合、最終分化した非増殖性組織中で、細胞またはミトコンドリアゲノムの突然変異挿入、欠失、または置換の恐れなく、長期的に、遺伝子産物タンパク質のトランスフェクションと発現が可能になる。長期的ではあるが必ずしも永続的である必要はない治療用遺伝子の特定細胞への導入は、遺伝疾患の治療法または予防用途を提供する。ＤＮＡを定期的に再注射して、レシピエント細胞のゲノムに突然変異を起こさせないで、遺伝子産物レベルを維持することができる。外来ＤＮＡを取り込ませない場合、全ての構築物が様々な遺伝子産物を発現しつつ、１つの細胞内でいくつかの異なる外来ＤＮＡ構築物を存在させることができる。
【０１０２】
遺伝子導入のためのエレクトロポレーションは、電流を利用して、細胞または組織をエレクトロポレーション介在の介在遺伝子導入に対して感受性にする。ＤＮＡ分子が細胞に進入できるようなやり方で、一定の電場強度を有する短時間の電気インパルスを用いて、膜の透過性を増大させる。本技術を、インビトロ系において、またはエクスビボまたはインビボ技術とともに用いて、ＤＮＡを細胞、組織または臓器に導入することができる。
【０１０３】
インビボにおける担体介在遺伝子導入を利用して、外来ＤＮＡを細胞にトランスフェクトさせることができる。担体−ＤＮＡ複合体を、簡便に体液または血流に導入した後で、部位特異的に体内のターゲット臓器または組織に送達させることができる。リポソームと、ポリリジン、リポフェクチンまたはサイトフェクチンなどのポリカチオンのいずれも用いることができる。細胞特異的または臓器特異的であるリポソームを作製することができるので、リポソームが保持する外来ＤＮＡがターゲット細胞に取り込まれる。ある種の細胞上の特異的受容体にターゲット化されている免疫リポソームの注射は、ＤＮＡを受容体担持細胞に挿入する簡便な方法として用いることができる。これまで用いられてきた別の担体系として、インビボ遺伝子導入のためにＤＮＡを肝細胞に運ぶためのアシアロ糖タンパク質／ポリリジンコンジュゲート系がある。
【０１０４】
トランスフェクトＤＮＡは、そのＤＮＡがレシピエント細胞に運ばれた後で、細胞質中または核質中にとどまるように、他種の担体と複合体化させてもよい。ＤＮＡは、特異的に作製されたベシクル複合体中の担体核タンパク質と結合させて、核に直接送達させることができる。
【０１０５】
抗血管形成タンパク質の遺伝子調節は、抗血管形成タンパク質の１つをコードする遺伝子、またはその遺伝子と関連する制御領域、またはその対応するＲＮＡ転写物に結合する化合物を投与することで、転写または翻訳の速度を変化させることによって、行うことができる。また、抗血管形成タンパク質をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を、患者に投与して、それらのタンパク質のインビボの供給源を提供することができる。たとえば、細胞は、抗血管形成タンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターでトランスフェクトすることができる。トランスフェクト細胞は、患者の正常組織や患者の疾患組織に由来する細胞であってもよいし、患者以外の細胞であってもよい。
【０１０６】
たとえば、患者から採取した腫瘍細胞を、本発明のタンパク質を発現し得るベクターでトランスフェクトし、患者に戻すことができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、腫瘍の成長を阻害するレベルのタンパク質を患者体内で産生する。患者は、ヒトまたはヒト以外の動物であってよい。細胞は、非ベクター、またはエレクトロポレーション、イオノポレーション（ionoporation）など当該分野において公知の物理的または化学的方法によるか、「遺伝子銃」を介して、トランスフェクトさせてもよい。また、ＤＮＡは、担体の補助なしに、患者体内に直接注射してもよい。とくに、ＤＮＡは、皮膚、筋肉または血液中に注射することができる。
【０１０７】
抗血管形成タンパク質を患者体内にトランスフェクトするための遺伝子治療プロトコルは、抗血管形成タンパク質ＤＮＡを細胞のゲノムに、またはミニ染色体に取り込ませることによるか、細胞の細胞質または核質中で別個の複製または非複製ＤＮＡ構築物として、行うことができる。抗血管形成タンパク質の発現は、長期的に持続してもよいし、定期的に再注射を行って、所望の細胞、組織または臓器中タンパク質レベルまたは所定の血中レベルを維持してもよい。
【０１０８】
また、本発明は抗体および抗血清を包含する。かかる抗体および抗血清は、新規な抗血管形成タンパク質の試験に用いることができ、また、血管形成活性またはその欠如を特徴とする、またはそれに関連する疾患および症状の診断、予後、または治療において使用することができる。かかる抗体および抗血清はまた、所望の、たとえば、梗塞後の心臓組織において、本発明のタンパク質に対する抗体または抗血清を使用して、天然の抗血管形成タンパク質の局在およびプロセスをブロックし、新たな血管形成を増加し、ならびに心臓組織の萎縮を阻害するという、血管形成の上流調節に使用することができる。
【０１０９】
かかる抗体および抗血清は、診断用組成物、予後用組成物または治療用組成物を作製するために薬学的に許容され得る組成物および担体と組み合わせることができる。用語「抗体」または「抗体分子」とは、免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子の集団をいう。
【０１１０】
抗血管形成タンパク質を特異的に結合する抗体を用いる受動的な抗体療法を実施して、生殖、発達、および創傷治癒および組織修復等の血管形成依存性プロセスを調節することができる。また、抗血管形成タンパク質の抗体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与し、該タンパク質に対する内因性の抗血清の該タンパク質に結合する能力をブロックすることができる。
【０１１１】
本発明の抗血管形成タンパク質はまた、１つまたは複数のインヒビターおよび１つまたは複数のレセプターに対し特異的な抗体を作製するのに使用することができる。かかる抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗血管形成タンパク質またはそれらのレセプターに特異的に結合するこれらの抗体は、体液または体組織において抗血管形成タンパク質またはそれらのレセプターを検出または定量するための、当業者に既知の診断方法および診断用キットにおいて使用され得る。これらの試験からの結果を用いて、癌および他の血管形成媒介疾患の発生または再生の診断または予測を行うことができる。
【０１１２】
本発明はまた、血管形成活性を特徴とする疾患の診断または予後における、抗血管形成タンパク質、それらのタンパク質に対する抗体、およびそれらのタンパク質および／またはそれらの抗体を含む組成物の使用を含む。本明細書で使用する用語「予後方法」とは、疾患、特に血管形成依存性疾患と診断されたヒトまたは動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。本明細書で使用する用語「診断方法」とは、ヒトまたは動物内でのあるいはヒトまたは動物上での血管形成依存性疾患の存在または型の決定を可能にする方法を意味する。
【０１１３】
抗血管形成タンパク質を診断方法および診断用キットに用いて、該タンパク質を結合することができる抗体を検出および定量することができる。これらのキットは、インサイチュウでの原発性腫瘍により分泌される抗血管形成タンパク質の存在下に微小転移の広がりを示す抗血管形成タンパク質に対する循環する抗体の検出を可能にするであろう。かかる循環する抗タンパク質抗体を有する患者は、多様な腫瘍および癌が発生している可能性がより高いかもしれず、また、治療または緩解の期間の後の癌の再生を有している可能性がより高いかもしれない。これらの抗タンパク質抗体のＦａｂフラグメントを抗原として用い、抗タンパク質抗体を中和するために用い得る抗タンパク質Ｆａｂフラグメント抗血清を生成してもよい。かかる方法は、抗タンパク質抗体による循環するタンパク質の除去を減少させ、それにより、効果的に抗血管形成タンパク質の循環レベルを向上するであろう。
【０１１４】
本発明はまた、抗血管形成タンパク質に特異的なレセプターの単離を含む。組織への高新和性結合を有するタンパク質フラグメントを用いて、アフィニティーカラム上で抗血管形成タンパク質のレセプターを単離することができる。１つまたは複数のレセプターの単離と精製は、抗血管形成タンパク質の作用機構の解明への基本工程である。レセプターの単離およびアゴニストおよびアンタゴニストの同定は、生物学的活性への最終経路であるレセプターの活性を調節するための薬物の開発を容易にするであろう。レセプターの単離は、インサイチュウおよび溶液ハイブリダイゼーション技術に使用してレセプターの位置および合成を追跡するためのヌクレオチドプローブの構築を可能にする。さらに、レセプターの遺伝子を単離し得、発現ベクターに組み込み得、また、細胞型、組織または腫瘍の抗血管形成タンパク質を結合する能力および局部的な血管形成を阻害する能力を増加するために、患者の腫瘍細胞等の細胞にトランスフェクトし得る。
【０１１５】
抗血管形成タンパク質を用いて、培養腫瘍細胞から抗血管形成タンパク質の１つまたは複数のレセプターの単離のためのアフィニティーカラムを開発する。レセプターの単離および精製の後にアミノ酸配列解析を行う。この情報を用いて、レセプターをコードする１つまたは複数の遺伝子を同定し得、単離し得る。次いで、クローニングされた核酸配列をレセプターを発現することができるベクターへの挿入のために開発する。これらの技術は当業者に充分に知られている。腫瘍細胞へのレセプターをコードする核酸配列のトランスフェクション、およびトランスフェクトされた腫瘍細胞によるレセプターの発現は、内因性または外因性の抗血管形成タンパク質への細胞の応答性を高め、それにより、転移増殖の速度が減少する。
【０１１６】
本発明の血管形成阻害性タンパク質は標準の微量化学装置において合成し得、ＨＰＬＣおよび質量分光光学法で純度を調べることができる。タンパク質合成、ＨＰＬＣ精製および質量分光光学法の方法は一般に当業者に公知である。また、高血管形成タンパク質およびそれらのレセプタータンパク質を組換え大腸菌または酵母発現系で生産し、カラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１１７】
無傷の抗血管形成タンパク質の異なるタンパク質フラグメントを、特に限定するものではないが、以下のようないくつかの適用における使用のために合成することができる；特異的抗血清の開発のための抗原として、抗血管形成タンパク質の結合部位において活性なアゴニストおよびアンタゴニストとして、抗血管形成タンパク質を結合する細胞の標的殺傷のための細胞傷害性薬剤に連結するための、または該薬剤と組み合わせるタンパク質として。
【０１１８】
抗血管形成タンパク質の合成タンパク質フラグメントは種々の用途を有する。高い特異性および親和力で抗血管形成タンパク質のレセプターに結合するタンパク質を放射性標識し、オートラジオグラフィーおよび膜結合技術を用いて結合部位の視覚化および定量に使用する。この適用は、重要な診断用および研究用ツールを提供する。１つまたは複数のレセプターの結合特性の認識は、１つまたは複数のレセプターに関連するトランスダクションメカニズムの調査を容易にする。
【０１１９】
抗血管形成タンパク質およびそれらに由来するタンパク質は、標準法を用いて他の分子に結合し得る。抗血管形成タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端は両方ともチロシンおよびリジン残基を含んでおり、多くの技術、たとえば、慣用の技術（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲン、ラクトペルオキシダーゼ；リジン残基−ボルトン−ハンター試薬）を用いる放射性標識により同位体および非同位体で標識される。これらの結合技術は当業者によく知られている。他方、チロシンまたはリジンは、タンパク質上の反応性のアミノ基およびヒドロキシル基の標識を容易にするためにこれらの残基を有しないフラグメントに付加される。結合技術は、特に限定されるものではないが、アミノ、スルフヒドラル、カルボキシル、アミド、フェノール、およびイミダゾールを含むアミノ酸に対し利用可能な官能基に基づいて選択される。これらの結合に作用するのに用いられる種々の試薬としては、中でも、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド、およびｐ−ベンゾキノンが挙げられる。
【０１２０】
抗血管形成タンパク質は、種々の適用のために、同位体、酵素、担体タンパク質、細胞傷害性試薬、蛍光分子、化学発光物質、生物発光物質および他の化合物に化学的に結合される。結合反応の効率は、特異的反応に適する異なる技術を用いて決定される。たとえば、125 Ｉによる本発明のタンパク質の放射性標識は高い特異性活性のクロラミンＴおよびＮａ125 Ｉを用いて行われる。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムで終了し、処分可能なカラムで脱塩する。標識タンパク質をカラムから溶出し、フラクションを回収する。アリコート（aliquots）を各フラクションから採り除き、放射活性をガンマカウンターで測定する。この方式では、未反応Ｎａ125 Ｉは標識タンパク質から分離される。最も高い特異的放射活性を有するタンパク質フラクションを抗血管形成タンパク質に結合する能力の解析等の続く使用のために保存する。
【０１２１】
また、短命な同位体による抗血管形成タンパク質の標識では、ポジトロンエミッショントモグラフィーまたは他の近代Ｘ線撮影技術を用いるインビボでのレセプター結合部位の視覚化によりタンパク質の結合部位を有する腫瘍を位置づけることを可能にする。
【０１２２】
これらの合成タンパク質内でのアミノ酸の組織的な置換は、１つまたは複数のレセプターへの結合を増強または消去する抗血管形成タンパク質の１つまたは複数のレセプターに対する高親和性のタンパク質アゴニストおよびアンタゴニストを生ずる。かかるアゴニストを用いて微小転移の成長を抑制し、それにより、癌の広がりを制限する。抗血管形成タンパク質に対するアンタゴニストは、抗血管形成タンパク質の阻害作用をブロックし、かつ血管形成を促進するために、不充分な血管新生の場合に適用される。たとえば、この処理は、糖尿病における創傷治癒を促進する治療効果を有するかもしれない。
【０１２３】
本発明をさらに以下の実施例により説明する。かかる実施例は、本発明の範囲において如何様な限定にも解釈されることを意図していない。一方、種々の他の態様、修飾、およびそれらの均等物に対し、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の精神および／または添付する特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく当業者にそれら自身を示唆する余地を有するかもしれないことを明確に理解されるべきである。
【実施例】
【０１２４】
実施例
実施例１：天然アレステンの単離。
アレステンはヒトの胎盤および羊膜組織からミリグラム量で得ることができる。アレステンおよび類似タンパク質を単離するためのプロトコールは他の研究者によって記述されている（例えばＬａｎｇｅｖｅｌｄ，Ｊ．Ｐ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１０４８１−１０４８８；Ｓａｕｓ，Ｊ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１３３７４−１３３８０；Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５４６６−５４６９；Ｇｕｎｗａｒ Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−１５３２４；Ｋａｈｓａｉ，Ｔ．Ｚ．ら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：１７０２３−１７０３２）。組換え型アレステンの生産は、Ｎｅｉｌｓｏｎら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−８４０６）に記載されている。このタンパク質は２９３腎細胞でも発現させることができる（例えばＨｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．ら，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ． １７：１６５６−１６６４に記載の方法による）。アレステンはＰｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ，Ｔ．ら（１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６０：７６８１−７６８７）の方法でも単離できる。
【０１２５】
ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１）とアミノ酸配列（配列番号：２）をＦｉｇ．１に示す。アレステンのおよその始まりと終わりに印をつけてある。アレステンは一般にＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインを含み、またＮＣ１ドメインの直前の１２アミノ酸である接合領域もおそらく含んでいる。
【０１２６】
天然アレステンを、細菌性コラゲナーゼ、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィーを使って、ヒト胎盤から単離した（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４；Ｗｅｂｅｒ，Ｓ．ら，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｈｅｍ． １３９：４０１−１０）。ヒト胎盤から単離されたＩＶ型コラーゲン単量体をＣ−１８疎水性カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使ってＨＰＬＣ精製した。構成タンパク質をアセトニトリル勾配（３２％−３９％）で分離した。主要ピークが認められ、それは小さな二重ピークだった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、第１ピーク内に２つのバンドが認められ、第２ピークにはタンパク質は検出されなかった。免疫ブロッティングでも、第２ピークに免疫検出可能なタンパク質は見つからず、主要ピークはアレステンであると同定された。
【０１２７】
実施例２：大腸菌におけるアレステンの組換え生産。
アレステンをコードする配列を、α１ＮＣ１（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）からＰＣＲにより、フォワードプライマー５' −ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＧＧＣ ＴＴＣ−３' （配列番号：３）およびリバースプライマー５' −ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＣＡ ＧＡＣ−３' （配列番号：４）を用いて増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、予め消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）にライゲートした。この構造をＦｉｇ．２に示す。これにより、アレステンはｐｅｌＢリーダー配列の下流にｐｅｌＢリーダー配列とインフレームで配置され、ペリプラズム局在と可溶性タンパク質の発現が可能になった。タンパク質にはアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクター配列が付加された。配列の３' 末端をポリヒスチジンタグ配列とインフレームでライゲートした。ｃＤＮＡの３' 末端とｈｉｓ−タグの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードした。陽性クローンの両鎖を配列決定した。
【０１２８】
アレステンをコードするプラスミド構築物をまず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、次に、発現用のＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。終夜細菌培養物を使ってＬＢ培地の５００ｍｌ培養に接種した。この培養を細胞が０．６のＯＤ600 に達するまで約４時間生育させた。次に、最終濃度が１〜２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、タンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後に、５０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁することによって、細胞を溶解した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ヒルデン）に毎分２ｍｌの流速で４〜６回通した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭイミダゾールと２５ｍＭイミダゾールの両方を使って洗浄することにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のイミダゾール濃度を順次増加して（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）、上記のカラムからアレステンタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析中に総タンパク質のごく一部が沈殿した。透析したタンパク質を集め、約３５００×ｇで遠心分離して、ペレット画分と上清画分に分離した。各画分中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で決定した。総タンパク質のうち約２２％がペレット中にあり、残りの７８％が可溶性タンパク質として回収された。タンパク質の全収量は約１０ｍｇ／リットルだった。
【０１２９】
大腸菌発現タンパク質は主に可溶性タンパク質として単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは２９ｋＤａに単量体バンドが認められた。付加的な３ｋＤａはポリリンカー配列およびヒスチジンタグ配列に起因し、アレステン抗体および６−ヒスチジンタグ抗体の両方によって免疫検出された。
【０１３０】
実施例３：２９３胎児腎細胞におけるアレステンの発現。
α１（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミドを使って、リーダーシグナル配列がｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）中にインフレームで付加されるような方法で、アレステンを増幅した。全長α１（ＩＶ）鎖の５' 末端に由来するリーダー配列をＮＣ１ドメインの５' 側にクローニングして、培養培地へのタンパク質分泌を可能にした。そのアレステン含有組換えベクターを、フランキングプライマーを使って配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンをさらに精製し、それをインビトロ翻訳実験に使用して、タンパク質発現を確認した。そのアレステン含有プラスミドおよび対照プラスミドを使用して、２９３細胞を塩化カルシウム法でトランスフェクトした。トランスフェクトされたクローンをジェネティシン抗生物質処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）によって選択した。その細胞を、細胞死が明らかでなくなるまで、上記抗生物質の存在下に３週間放置した。次にクローンをＴ−２２５フラスコに拡大し、コンフルエントになるまで生育させた。次に上清を集め、アミコン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使って濃縮した。濃縮した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡによってアレステン発現について解析した。ＥＬＩＳＡにより上清に強い結合が検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、約３０ｋＤａに単一の主要バンドが認められた。アレステン含有上清を、アレステン特異的抗体（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４）を使ったアフィニティークロマトグラフィーにかけた。アレステン抗体との免疫反応性を示す約３０ｋＤａの単量体を含む主要ピークが同定された。培養液１リットルにつき約１〜２ｍｇの組換えアレステンが生産された。
【０１３１】
実施例４：アレステンは内皮細胞増殖を阻害する。
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中でＣ−ＰＡＥ細胞をコンフルエントまで生育させ、接触阻害状態を４８時間保った。対照細胞は７８６−０（腎癌）細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞、およびＡ−４９８（腎癌）細胞とした。細胞を３７℃で５分間のトリプシン処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）によって収集した。１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに懸濁した１２，５００個の細胞を、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆した２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。その細胞を５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を取り除き、０．５％ＦＣＳと３ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国ミネソタ州ミネアポリス）を含むＤＭＥＭで置き換えた。非刺激対照にはｂＦＧＦを与えなかった。細胞を０．０１〜５０μｇ／ｍｌの濃度のアレステンまたはエンドスタチンで処理した。処理時に、全てのウェルに１マイクロキュリーの3 Ｈ−チミジンを添加した。２４時間後に、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）溶液が入っているシンチレーションバイアルに加えた。シンチレーションカウンターを使ってチミジン取り込みを測定した。その結果をＦｉｇ．３ＡおよびＦｉｇ．３Ｂに示す。Ｆｉｇ．３ＡおよびＦｉｇ．３Ｂは、様々な量のアレステン（Ｆｉｇ．３Ａ）またはエンドスタチン（Ｆｉｇ．３Ｂ）で処理したＣ−ＰＡＥ細胞への3 Ｈ−チミジンの取り込みを示す一組のグラフである。アレステンはエンドスタチンと同様にＣ−ＰＡＥにおけるチミジン取り込みを阻害するようであった。アレステンおよびエンドスタチンで処理した対照細胞の挙動もＦｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに示すが、アレステンは７８６−０細胞（Ｆｉｇ．４Ａ）、ＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．４Ｂ）またはＨＰＥＣ細胞（Ｆｉｇ．４Ｃ）に対してほとんど影響をもたなかった。エンドスタチンはＡ−４９８細胞に対してほとんど影響をもたなかった（Ｆｉｇ．４Ｄ）。Ｆｉｇ．３およびＦｉｇ．４に示す各群はすべて三連の試料を表す。
【０１３２】
実施例５：アレステンは内皮細胞移動を阻害する。
ＦＢＳによって誘発される走化性に対するアレステンとエンドスタチンの阻害効果を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＥＣＶ−３０４細胞，ＡＴＣＣ １９９８−ＣＲＬ，ＡＴＣＣ（アメリカン タイプ カルチャー コレクション，米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス、ユニバーシティーブールバード１０８０１））で、ボイエンチャンバー測定法（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，米国メリーランド州キャビンジョン）を使って調べた。１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ ＤｉｌＣ１８（３）生細胞蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，米国オレゴン州ユージーン）を含むＭ１９９培地で、ＥＣＶ−３０４細胞を一晩生育させた。トリプシン処理し、０．５％ＦＢＳを含むＭ１９９で細胞を洗浄、希釈した後、６０，０００個の細胞を、アレステンまたはエンドスタチン（２〜４０μｇ／ｍｌ）と共に、もしくはアレステンまたはエンドスタチンを伴なわずに、上チャンバーウェルに播種した。２％ＦＢＳを含むＭ１９９培地を化学誘引物質として下チャンバーに入れた。細胞含有コンパートメントを孔径８μｍのポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，米国カリフォルニア州リバーモア）で化学誘引物質から隔離した。そのチャンバーを５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で４．５時間インキュベートした。非移動細胞を捨て、上ウェルをＰＢＳで洗浄した後、フィルターをプラスチック製の刃で削り、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、ガラススライド上に置いた。蛍光強拡大視野を用いて、数個の独立した均質な像を、画像処理ソフトウェアＰＭＩＳ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，米国アリゾナ州トゥーソン）で操作したデジタルＳｅｎＳｙｓTMカメラで記録した。代表的画像をＦｉｇ．５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。これらの図は２μｇ／ｍｌのアレステンが２０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと同程度に有効であることを示している。ＯＰＴＩＭＡＳ ６．０ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ニューヨーク州ロチェスター）を使って細胞数を数えた。その結果をＦｉｇ．６に示す。この図は顕微鏡写真に見られる結果をグラフで表したものである。
【０１３３】
実施例６：アレステンは内皮管形成を阻害する。
内皮管形成の阻害を測定するために、３２０μｌのマトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を２４ウェルプレートの各ウェルに加えて、重合させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ． １９０：８５４−６３）。抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）に懸濁した２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）を、マトリゲルで被覆した各ウェルに移した。その細胞を、濃度を順次増加させたアレステン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳまたは７Ｓドメインで処理した。全てのアッセイは三連で行なった。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（接眼レンズ３．３×、対物レンズ１０×）を使って観察した。次に、４００ＤＫ被覆ＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）を使って細胞を写真撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，米国ミズーリ州セントルイス）で染色し、再び写真撮影した。１０視野を観察し、管の数を数えて平均した。その結果をＦｉｇ．７に示す。この図はアレステンが対照と比較して管形成を阻害することを示している。十分に形成された管の代表例は、７Ｓドメインで処理した細胞を示すＦｉｇ．８Ａに見ることができる（倍率１００×）。これに対してＦｉｇ．８Ｂは、０．８μｇ／ｍｌアレステンで処理したＭＡＥ細胞では管がうまく形成されないか、全く形成されないことを示している（倍率１００×）。
【０１３４】
マトリゲルアッセイをＣ５７／ＢＬ６マウスでインビボでも行なった。マトリゲルを４℃で一晩融解した。次に、それを２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国ミネソタ州ミネアポリス）および１μｇ／ｍｌのアレステンまたは１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと混合した。そのマトリゲル混合物を、２１ゲージ注射針を使って皮下に注射した。対照群には血管形成インヒビターを含まない点以外は同じ混合物を投与した。１４日後に、マウスを屠殺し、マトリゲルのプラグを取り出した。そのマトリゲルプラグを４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中で室温にて４時間固定した後、ＰＢＳに２４時間切り換えた。そのプラグをパラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。切片を光学顕微鏡で調べ、強拡大の１０視野から血管数を数えて平均した。
【０１３５】
マトリゲルを順次濃度を増加させたアレステンと共に、またはアレステンを伴なわずに、ｂＦＧＦの存在下においた場合、１μｇ／ｍｌのアレステンと１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンでは血管数に５０％の減少が観察された。これらの結果は、アレステンが血管形成過程の様々な段階を阻害することによって新血管の形成に影響を及ぼすことを示している。また、これらの結果は、１μｇ／ｍｌのアレステンが、インビボでの新血管形成の阻害に関して、１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと同程度に有効であることも示している。
【０１３６】
実施例７：アレステンはインビボで腫瘍転移を阻害する。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに１００万個のＭＣ３８／ＭＵＣ１（Ｇｏｎｇ，Ｊ．ら，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ３：５５８−６１）を静脈内注射した。２６日間にわたって一日おきに、５匹の対照マウスに１０ｍＭの滅菌ＰＢＳを注射し、６匹の実験マウスに４ｍｇ／ｍｌアレステンを投与した。処理の２６日後に、各マウスについて肺腫瘍結節数を数え、上記の２群について平均した。各群で２例の死亡が記録された。アレステンは一次小節の平均数を対照マウスでの３００から２００まで有意に減少させた。
【０１３７】
実施例８：アレステンはインビボで腫瘍成長を阻害する。
２００万個の７８６−０細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。６匹のマウスからなる第１群では、腫瘍を約７００ｍｍ3 まで増殖させた。６匹のマウスからなる第２群では、腫瘍を１００ｍｍ3 まで増殖させた。滅菌ＰＢＳ中のアレステンを、７００ｍｍ3 の腫瘍を持つマウスについては２０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｍ3 の腫瘍を持つマウスについては１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、１０日間にわたって毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照マウスにはＢＳＡまたはＰＢＳビヒクルを投与した。その結果をＦｉｇ．９ＡおよびＦｉｇ．９Ｂに示す。Ｆｉｇ．９Ａは、１０ｍｇ／ｋｇアレステン処理マウス（白四角）、ＢＳＡ処理マウス（＋）、および対照マウス（黒丸）に関して、腫瘍容積の７００ｍｍ3 からの増加を示すプロットである。アレステン処理マウスの腫瘍は７００ｍｍ3 から５００ｍｍ3 に収縮したが、ＢＳＡ処理マウスおよび対照マウスの腫瘍は１０日間で約１２００ｍｍ3 に増殖した。Ｆｉｇ．９Ｂは、１００ｍｍ3 の腫瘍を持つマウスでも、アレステン（白四角）は腫瘍を約８０ｍｍ3 に収縮させたが、ＢＳＡ処理腫瘍（＋）は１０日間でほぼ５００ｍｍ3 までサイズが増大したことを示している。
【０１３８】
約５００万個のＰＣ−３細胞（ヒト前立腺腺癌細胞）を収集し、７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍を１０日間増殖させた後、ノギスで測定した。腫瘍容積は標準的な公式（幅2 ×長さ×０．５２）を使って計算した（Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ ８８：２７７−８５；Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ／Ｓら，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８）。マウスを５〜６匹ずつの群に分割した。実験群には、アレステン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはエンドスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群には毎日ＰＢＳを投与した。その結果をＦｉｇ．９Ｃに示す。これはアレステン（白四角）がエンドスタチン（黒三角）と同程度か、またはエンドスタチンよりわずかに強く、腫瘍の増殖を阻害したことを示している。アレステン用量を４ｍｇ／ｋｇ／日に変更して、この実験を繰返した。その結果をＦｉｇ．９Ｄに示す。８日後（矢印）に処理を停止したが、追加のアレステン処理を行なわなくても、有意な阻害はさらに１２日間にわたって継続した。１２日間の無処理後に、腫瘍はアレステンの阻害的影響を免れ始めた。
【０１３９】
実施例９：アレステンの循環半減期。
ヒト胎盤から単離された天然アレステンを２００ｇのサイズのレート（ｒａｔｅ）に静脈内注射した。各ラットに５ｍｇのヒトアレステンを投与した。抗アレステン抗体を使用して、様々な時点で、循環アレステンの存在について、直接ＥＬＩＳＡによって血清を解析した。同量の血清が解析に使用されることを保証するために、対照として血清アルブミンも各時点で評価した。アレステンは約３６時間の半減期で血清中を循環することがわかった。
【０１４０】
もう一つのラット群には２００μｇのヒトアレステンをＩ．Ｐ．および／または皮下注射し、肺、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、脳、精巣、卵巣などにおける発病の徴候について評価した。直接ＥＬＩＳＡを行なったところ、これらのラットの血清中にアレステン抗体が検出され、以前にも観察されているように（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６２０１−５）、多少の内因性ＩｇＧ沈着が腎糸球体基底膜に認められた。この腎臓における抗体沈着は、炎症または腎機能低下の徴候を何も伴なわなかった。これらの実験からアレステンは非病原性であることが示唆される。
【０１４１】
実施例１０：アレステンによるＭＭＰ−２酵素の結合と阻害。
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびそれらの酵素に対する抗体をＯｎｃｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から購入した。既に記述されているように（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６２０１−５）、ヒト胎盤から単離された天然アレステンを用いて、直接ＥＬＩＳＡを行なった。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はどちらも特異的にアレステンを結合した。これらの酵素は７Ｓドメインを結合しなかった。この結合はＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１結合とはそれぞれ無関係だった。
【０１４２】
アレステンの基底膜分解能を評価するために、マトリゲルをＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と共に穏やかに振盪しながら３７℃で６時間インキュベートした。上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＶ型コラーゲンのα２鎖に対する抗体による免疫ブロットによって解析した。分解アッセイの開始時に、アレステンを順次濃度を増加させて添加し、ＭＭＰ−２活性の阻害を観察した。ＮＣ１ドメインはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で２６ｋＤａの単量体および５６ｋＤａの二量体として分離し、ＩＶ型コラーゲン抗体を用いたウェスタンブロットによって可視化することができた。順次濃度を増加させたアレステンが、ＭＭＰ−２による基底膜の分解を阻害したことから、アレステンはＭＭＰ−２を結合して、それが基底膜コラーゲンを分解するのを防ぎうることが示された。同様の結果がＭＭＰ−９についても得られた。
【０１４３】
実施例１１：大腸菌におけるカンスタチンの組換え生産。
ＩＶ型コラーゲンのα２ＮＣ１ドメインのヌクレオチド配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）をＦｉｇ．１０に示す。カンスタチンをコードする配列を、ＰＣＲによって、α２ＮＣＩ（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）から、フォワードプライマー５'・−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＣ−３' （配列番号：７）およびリバースプライマー５' −ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＣ−３' （配列番号：８）を使って増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前もって消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）にライゲートした。その構造をＦｉｇ．１１に示す。かかるライゲーションにより、カンスタチンはｐｅｌＢリーダー配列の下流にｐｅｌＢリーダー配列とインフレームで配置され、ペリプラズム局在と可溶性タンパク質の発現が可能になった。タンパク質にはアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクター配列が付加された。配列の３' 末端はポリヒスチジンタグ配列とインフレームでライゲートされた。ｃＤＮＡの３' 末端とｈｉｓ−タグの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードした。陽性クローンの両鎖を配列決定した。
【０１４４】
カンスタチンをコードするプラスミド構築物をまず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、次に発現用のＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。終夜細菌培養物を使ってＬＢ培地の５００ｍｌ培養に接種した。この培養を細胞が０．６のＯＤ600 に達するまで約４時間生育させた。次に、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、タンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後に、５，０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁することによって、細胞を溶解した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ヒルデン）に２ｍｌ／分の流速で４〜６回通した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭイミダゾールを１５ｍｌずつ使って洗浄することにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２種類の濃度のイミダゾール（１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）を使って、上記のカラムからカンスタチンタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析中に総タンパク質の一部が沈殿した。透析したタンパク質を集め、約３，５００×ｇで遠心分離して、ペレット画分と上清画分に分離した。各画分中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では２９ｋＤａに単量体バンドが認められ、余分な３ｋＤａはポリリンカー配列およびヒスチジンタグ配列に起因した。カンスタチンを含む溶出液を合わせ、以降のアッセイに使用するためにＰＢＳに対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで解析したカンスタチンタンパク質は、ポリヒスチジンタグ抗体によって検出された。ＩＶ型コラーゲンＮＣ１抗体も、細菌によって発現された組換えコンスタチン（ｃｏｎｓｔａｔｉｎ）タンパク質を検出した。
【０１４５】
大腸菌発現タンパク質は主に可溶性タンパク質として単離された。総タンパク質のうち約４０％がペレット中にあり、残りの６０％が可溶性タンパク質として回収された。タンパク質の全収量は約１５ｍｇ／リットルだった。
【０１４６】
実施例１２：２９３胎児腎細胞におけるカンスタチンの発現。
α２（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミド（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）を使って、リーダーシグナル配列がｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）中にインフレームで付加されるような方法で、カンスタチンをＰＣＲ増幅した。全長α２（ＩＶ）鎖の５' 末端に由来するリーダー配列をＮＣ１ドメインの５' 側にクローニングして、培養培地へのタンパク質分泌を可能にした。そのカンスタチン含有組換えベクターを、フランキングプライマーを使って配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンをさらに精製し、それをインビトロ翻訳実験に使用して、タンパク質発現を確認した。そのカンスタチン含有プラスミドおよび対照プラスミドを使用して、２９３細胞を塩化カルシウム法（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，１９９６，「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（リン酸カルシウムトランスフェクション）」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，米国ニューヨーク州ニューヨーク）の９．１．４〜９．１．７頁）でトランスフェクトした。トランスフェクトされたクローンをジェネティシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）抗生物質処理によって選択した。その細胞を、細胞死が明らかでなくなるまで、上記抗生物質の存在下に３週間放置した。クローンをＴ−２２５フラスコに拡大し、コンフルエントになるまで生育させた。次に上清を集め、アミコン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を使って濃縮した。濃縮した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡによってカンスタチン発現について解析した。ＥＬＩＳＡにより上清に強い結合が検出された。カンスタチン含有上清をカンスタチン特異的抗体（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４）を使ったアフィニティークロマトグラフィーにかけた。カンスタチン抗体（抗α２ ＮＣ１抗体，１：２００希釈）との免疫反応性を示す約２４ｋＤａの純粋な単量体を含む主要ピークが同定された。
【０１４７】
実施例１３：カンスタチンは内皮細胞増殖を阻害する。
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中で子ウシ大動脈内皮（ＣＰＡＥ）細胞をコンフルエントまで生育させ、接触阻害状態を４８時間保った。細胞を３７℃で５分間のトリプシン処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）によって収集した。０．５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに懸濁した１２，５００個の細胞を、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆した２４穴プレートの各ウェルに加えた。その細胞を５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を取り除き、０．５％ＦＣＳ（非刺激細胞）または１０％ＦＣＳ（刺激および処理細胞）を含むＤＭＥＭで置き換えた。７８６−０、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３細胞を対照とし、同じ方法でコンフルエントに生育させ、トリプシン処理し、プレートに播種した。細胞を０．０２５〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度のカンスタチンまたはエンドスタチンで３回処理した。チミジン取り込み実験では、全てのウェルに１ミリキュリーの3 Ｈ−チミジンを処理時に添加した。２４時間後に、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。放射活性を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）溶液が入っているシンチレーションバイアルに加えた。シンチレーションカウンターを使ってチミジン取り込みを測定した。
【０１４８】
その結果をＦｉｇ．１２ＡとＦｉｇ．１２Ｂに示す。Ｆｉｇ．１２Ａは、ＣＰＡＥ細胞の増殖に対する様々な量のカンスタチンの影響を示すヒストグラムである。チミジン取り込み量をカウント毎分の単位でｙ軸上に示す。ｘ軸上の「０．５％」は、０．５％ＦＣＳ（非刺激）対照であり、「１０％」は１０％ＦＣＳ（刺激）対照である。カンスタチンの濃度を順次増加させて処理することにより、チミジン取り込みは着実に減少した。Ｆｉｇ．１２Ｂは、非内皮細胞７８６−０、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３でのチミジン取り込みに対する順次量を増加させたカンスタチンの影響を示すヒストグラムである。チミジン取り込み量をカウント毎分の単位でｙ軸に示し、ｘ軸は上記３つの細胞株のそれぞれについて０．５％ＦＣＳ（非刺激）対照および１０％ＦＣＳ（刺激）対照を示し、その後ろに、順次増加させたカンスタチンの濃度が示してある。全ての群は三連の試料を表し、バーは平均カウント毎分±平均の標準誤差を表す。
【０１４９】
メチレンブルー染色試験も行なった。３，１００個の細胞を各ウェルに加え、上述のように処理した後、Ｏｌｉｖｅｒらの方法（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：５１３−８）を使って細胞数を数えた。全てのウェルを１００ｍｌの１×ＰＢＳで１回洗浄し、１００ｍｌの１０％ホルマリン／中性緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）を室温で３０分間添加することにより、細胞を固定した。ホルマリンを除去した後、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の１％メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）溶液を使って、室温で３０分間、細胞を染色した。染色溶液を除去した後、ウェルを１００ｍｌの０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で５回洗浄した。１００ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ／エタノール（１：１混合液）を使って、室温で１時間にわたって、メチレンブルーを細胞から抽出した。メチレンブルー染色の量を、波長６５５ｎｍでの吸光度を使って、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）で測定した。
【０１５０】
その結果をＦｉｇ．１２ＣおよびＦｉｇ．１２Ｄに示す。Ｆｉｇ．１２Ｃは、ＣＰＡＥ細胞による色素の取り込みに対する順次量を増加させたカンスタチンの影響を示すヒストグラムである。ＯＤ655 の吸光度をｙ軸上に示す。「０．１％」は０．１％ＦＣＳ処理（非刺激）対照を表し、「１０％」は１０％ＦＣＳ処理（刺激）対照である。残りのバーは、順次濃度を増加させたカンスタチンによる処理を表す。ＣＰＡＥ細胞では、約０．６２５〜１．２５μｇ／ｍｌのカンスタチン処理レベルで、色素取り込み量が非刺激細胞に見られるレベルにまで低下した。Ｆｉｇ．１２Ｄは、非内皮細胞ＨＥＫ２９３（白抜きのバー）およびＰＣ−３（斜線付きのバー）に対する様々なカンスタチン濃度の影響を示すヒストグラムである。ＯＤ655 の吸光度をｙ軸に示す。「０．１％」は０．１％ＦＣＳ処理（非刺激）対照を表し、「１０％」は１０％ＦＣＳ処理（刺激）対照を表す。バーは１処理濃度につき８ウェルに関する６５５ｎｍでの相対吸光度単位の平均±標準誤差を表す。
【０１５１】
１０％血清刺激内皮細胞の用量依存的阻害が約０．５μｇ／ｍｌのＥＤ50値で検出された（Ｆｉｇ．１２ＡおよびＦｉｇ．１２Ｃ）。４０ｍｇ／ｍｌまでのカンスタチン用量では、腎癌細胞（７８６−０）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）またはヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）の増殖に対する有意な影響は観察されなかった（Ｆｉｇ．１２ＢおよびＦｉｇ．１２Ｄ）。この内皮細胞特異性は、カンスタチンがおそらくとりわけ効果的な抗血管形成剤であることを示している。
【０１５２】
実施例１４：カンスタチンは内皮細胞移動を阻害する。
血管形成の過程で、内皮細胞は、増殖するだけでなく移動もする。そこで内皮細胞移動に対するカンスタチンの影響を評価した。ＦＢＳによって誘発される走化性に対するカンスタチンとエンドスタチンの阻害効果を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で、ボイエンチャンバーアッセイ（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，米国メリーランド州キャビンジョン）を使って調べた。１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ ＤｉＩＣ１８（３）生細胞蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，米国オレゴン州ユージーン）を含むＭ１９９培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）で、ＨＵＶＥＣ細胞を一晩生育させた。トリプシン処理し、０．５％ＦＢＳを含むＭ１９９で細胞を洗浄、希釈した後、６０，０００個の細胞を、カンスタチン（０．０１または１．００ｍｇ／ｍｌ）と共に、またはカンスタチンを伴なわずに、上チャンバーウェルに播種した。２％ＦＢＳを含むＭ１９９培地を化学誘引物質として下チャンバーに入れた。細胞含有コンパートメントを孔径８μｍのポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，米国カリフォルニア州リバーモア）で化学誘引物質から隔離した。そのチャンバーを５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で４．５時間インキュベートした。非移動細胞を捨て、上ウェルをＰＢＳで洗浄した後、フィルターをプラスチック製の刃で削り、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、ガラススライド上に置いた。蛍光強拡大視野を用いて、数個の独立した均質な像を、画像処理ソフトウェアＰＭＩＳ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，米国アリゾナ州トゥーソン）で操作したデジタルＳｅｎＳｙｓTMカメラで記録した。ＯＰＴＩＭＩＺＥ ６．０ソフトウェアプログラム（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ニューヨーク州ロチェスター）を使って細胞数を数えた（Ｋｌｅｍｋｅ，Ｒ．Ｌ．ら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：８５９−６６）。
【０１５３】
その結果をＦｉｇ．１３に示す。この図は、ＶＥＧＦなし（ＶＥＧＦなしまたは血清）およびＶＥＧＦ（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）による細胞の処理、および０．０１μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌカンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌカンスタチン）による処理について、１視野あたりの移動した内皮細胞数（ｙ軸）を示す棒グラフである。
【０１５４】
カンスタチンはＨＵＶＥＣの移動を阻害し、有意な効果が１０ｎｇ／ｍｌで観察された。内皮細胞の増殖と移動の両方を阻害できるカンスタチンの能力から、カンスタチンは血管形成の過程の１つを超える段階で作用することが示唆される。あるいはカンスタチンは、刺激された内皮細胞にとって、増殖と移動の両方に影響を及ぼしうるアポトーシスシグナルとして作用するのかもしれない。アポトーシス誘導は、別の抗血管形成分子であるアンジオスタチン（Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８；Ｌｕｃａｓ，Ｒ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：４７３０−４１）について報告されている。
【０１５５】
実施例１５：カンスタチンは内皮管形成を阻害する。
カンスタチンの抗血管形成能に関する最初の試験として、マウス基底膜タンパク質の固体ゲルであるマトリゲルでの内皮細胞による管形成を妨害するその能力について評価した。マウス大動脈内皮細胞をマトリゲル上で培養すると、それらは素早く整列し、中空管様の構造を形成する。
【０１５６】
マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を２４ウェルプレートの各ウェルに加えて（３２０ｍｌ）、重合させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ． １９０：８５４−６３）。抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）に懸濁した２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）を、マトリゲルで被覆した各ウェルに移した。その細胞を、順次濃度を増加させたカンスタチン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳまたはα５−ＮＣ１ドメインで処理した。全てのアッセイを三連で行なった。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（接眼レンズ３．３×、対物レンズ１０×）を使って観察した。次に、４００ＤＫ被覆ＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）を使って細胞を写真撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）で染色し、再び写真撮影した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。１０視野を観察し、管の数を数えて平均した。
【０１５７】
その結果をＦｉｇ．１４に示す。この図は、ＢＳＡ（白四角）、カンスタチン（黒四角）およびα５ＮＣ１（白丸）で様々な処理を施した場合の管形成の量を対照（ＰＢＳ処理ウェル）管形成の百分率（ｙ軸）として表すグラフである。垂直方向の線分は平均の標準誤差を表す。この結果は、カンスタチンが対照と比較して内皮管形成を著しく減少させることを示している。
【０１５８】
カンスタチンは用量依存的に内皮管形成を選択的に阻害し、１ｍｇのカンスタチンタンパク質の添加により、ほぼ完全な管形成の阻害が観察された（Ｆｉｇ．１４）。対照タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もＩＶ型コラーゲンα５鎖のＮＣ１ドメインも、内皮管形成に影響しなかったことから、このアッセイにおけるカンスタチンの阻害効果はカンスタチンに特異的であって、添加タンパク質の含有量によるものではないことが証明された。これらの結果はカンスタチンが抗血管形成剤であることを示している。
【０１５９】
実施例１６：カンスタチンはインビボで腫瘍成長を阻害する。
ヒト前立腺腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）を培養から収集し、滅菌ＰＢＳ中の２００万個の細胞を７〜９週齢の雄性ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍を約４週間増殖させた後、動物を４匹ずつの群に分割した。実験群には、総体積０．１ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｋｇの用量のカンスタチンを毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群には等体積のＰＢＳを毎日投与した。処理の開始時点（第０日）で、腫瘍の容積は、対照マウスの場合は８８ｍｍ3 〜１３５ｍｍ3 、カンスタチン処理マウスの場合は１０８ｍｍ3 〜１４９ｍｍ3 の範囲にあった。各群には５匹のマウスを含めた。所定の日の腫瘍容積計算値を処理第０日の容積で割ることによって腫瘍容積率（Ｖ／Ｖ0 ）を求めた。その結果をＦｉｇ．１５Ａに示す。この図は、処理日（ｘ軸）に対してプロットした腫瘍容積率（ｙ軸）±標準誤差を示すグラフである。カンスタチン処理（黒四角）腫瘍は、対照（白四角）と比較してサイズがわずかしか増加しなかった。
【０１６０】
第二のＰＣ−３実験では、ＰＣ−３細胞を培養から収集し、３００万個の細胞を６〜７週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに注射し、腫瘍を約２週間にわたって皮下で増殖させた後、マウスを４匹ずつの群に分割した。実験群（４匹）には総体積０．２ｍｌのＰＢＳ中に３ｍｇ／ｋｇの用量のカンスタチンまたは同じ体積のＰＢＳ中に８ｍｇ／ｋｇの用量のエンドスタチンを毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群（４匹）には、等体積のＰＢＳを毎日投与した。腫瘍の長さと幅をノギスを使って測定し、標準的な公式：長さ×幅2 ×０．５２を用いて腫瘍容積を計算した。腫瘍容積は２６ｍｍ3 〜７３ｍｍ3 の範囲にあり、上述のように所定の日の腫瘍容積計算値を処理第０日の容積で割ることによって腫瘍容積率（Ｖ／Ｖ0 ）を求めた。その結果をＦｉｇ．１５Ｂに示す。この図は、処理日（ｘ軸）に対してプロットした腫瘍容積率（ｙ軸）±標準誤差を示すグラフである。対照（白四角）と比較して、カンスタチン処理（黒四角）腫瘍はサイズがわずかしか増加せず、その結果は、エンドスタチン（白丸）で達成された結果と比べてひけをとらなかった。
【０１６１】
腎細胞癌細胞モデルとして、２００万個の７８６−０細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍を約１００ｍｍ3 または約７００ｍｍ3 まで増殖させた。各群には６匹のマウスを含めた。滅菌ＰＢＳ中のカンスタチンを１０ｍｇ／ｋｇの濃度で１０日間にわたって毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群には同体積のＰＢＳを投与した。その結果をＦｉｇ．１５Ｃ（１００ｍｍ3 腫瘍）およびＦｉｇ．３１Ｄ（７００ｍｍ3 腫瘍）に示す。どちらの群でも、カンスタチン処理（黒四角）腫瘍は、対照（白四角）と比較して実際に収縮した。
【０１６２】
大腸菌で生産されたカンスタチンは、小さい腎細胞癌（７８６−０）腫瘍（１００ｍｍ3 ，Ｆｉｇ．１５Ｃ）および大きい腎細胞癌（７８６−０）腫瘍（７００ｍｍ3 ，Ｆｉｇ．１５Ｄ）の増殖を抑制した。重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中のヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍の場合、１０ｍｇ／ｋｇのカンスタチンにより、腫瘍容積率がビヒクルのみを注射したマウスの５５％に保たれた。胸腺欠損（ｎｕ／ｎｕ）マウスで、さらに低用量のカンスタチンおよびエンドスタチンを使用したところ、３ｍｇ／ｋｇのカンスタチンは８ｍｇ／ｋｇのエンドスタチンと同程度の抑制効果を示した。どのインビボ試験でも、マウスは消耗の徴候を示すことなく健康そうな外観を呈し、処理中に死亡したマウスはいなかった。
【０１６３】
実施例１７：カンスタチン処理マウスでのＣＤ３１免疫組織化学。
インビボでの腫瘍サイズの減少から、これらの腫瘍における血管の形成に対する抑制効果が示唆された。腫瘍血管を検出するために、抗ＣＤ３１抗体アルカリホスファターゼコンジュゲートによる免疫組織化学をパラフィン包埋腫瘍切片で行なった。摘出した腫瘍をスカペル（ｓｃａｐｅｌ）で厚さ約３〜４ｍｍの数片に切断した後、４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定した。次に組織をＰＢＳに２４時間切り換えた後、脱水し、パラフィン包埋した。パラフィンに包埋した後、３ｍｍ組織切片を切断し、マウントした。切片を脱パラフィンし、再水和し、３００ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）で３７℃にて５分間前処理した。１００％エタノール中で消化を停止した。切片を風乾し、再水和し、１０％ウサギ血清でブロックした。次にスライドをラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）の１：５０希釈液と共に４℃で一晩インキュベートした後、ウサギ抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）およびラットＡＰＡＡＰ（ＤＡＫＯ）の１：５０希釈と共に３７℃でそれぞれ３０分間、順次インキュベートした。新しいフクシンで発色反応を行なった。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１６４】
カンスタチン処理腫瘍には、対照腫瘍と比較して、血管数の減少が認められた。
【０１６５】
実施例１８：大腸菌におけるタムスタチンおよびタムスタチン変異体の組換え生産。
ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα３鎖のヌクレオチド配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）をＦｉｇ．１６に示す。タムスタチンをコードする配列を、ＰＣＲによって、α３ＮＣＩ（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）から、フォワードプライマー５' −ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＣＧＴ−３' （配列番号：１１）およびリバースプライマー５' −ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＡＴ−３' （配列番号：１２）を使って増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前もって消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）にライゲートした。その構造をＦｉｇ．１７に示す。かかるライゲーションにより、タムスタチンはｐｅｌＢリーダー配列の下流にｐｅｌＢリーダー配列とインフレームで配置され、ペリプラズム局在と可溶性タンパク質の発現が可能になった。タンパク質にはアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクター配列が付加された。配列の３' 末端はポリヒスチジンタグ配列とインフレームでライゲートされた。ｃＤＮＡの３' 末端とｈｉｓ−タグの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードした。陽性クローンの両鎖を配列決定した。タムスタチンをコードするプラスミド構築物をまず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、次に発現用のＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。終夜細菌培養物を使ってＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）の５００ｍｌ培養に接種した。この培養を細胞が０．６のＯＤ600 に達するまで約４時間生育させた。次に、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、タンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後に、５，０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁することによって、細胞を溶解した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ヒルデン）に毎分２ｍｌの流速で４〜６回通した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭイミダゾールと２５ｍＭイミダゾールの両方を使って洗浄することにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のイミダゾール濃度を順次増加して（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）、上記のカラムからタムスタチンタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を４℃のＰＢＳに対して２回透析した。透析中に総タンパク質の一部が沈殿した。透析したタンパク質を集め、約３，５００×ｇで遠心分離して、不溶性（ペレット）画分と可溶性（上清）画分に分離した。
【０１６６】
大腸菌発現タムスタチンは主に可溶性タンパク質として単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では３１ｋＤａに単量体バンドが認められた。余分な３ｋＤａはポリリンカー配列およびヒスチジンタグ配列に起因する。このバンドを含む溶出画分を、以降の実験に使用した。各画分中のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）および走査デンシトメトリーを用いた定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決定した。還元条件下では、非還元条件でタムスタチンの二量体に相当する６０ｋＤ付近に観察されたバンドが、３１ｋＤａの単一バンドとして分離した。タンパク質の全収量は１リットルにつき約５ｍｇだった。
【０１６７】
５３個のＮ末端アミノ酸を欠く組換え切形型タムスタチン（タムスタチン−Ｎ５３）を大腸菌中で生産し、他の変異体について以前記載されているようにして精製した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。この変異体は、α３（ＩＶ）ＮＣ１単量体内の切形アミノ酸の位置を示す構成図であるＦｉｇ．１８に記載されている。黒丸は、「タムスタチン−Ｎ５３」を生成するためにタムスタチンから欠失させたＮ末端の５３個のアミノ酸残基に相当する（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。短いバーでマークしたジスルフィド結合はα１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１において存在しているように配置されている（Siebold,B. et al.,1988,Eur.J.Biochem. 176:617-24）。明瞭にするため、可能な２つのジスルフィド立体配置の内の１つのみを示す。
【０１６８】
ヒトα（ＩＶ）ＮＣ１に対するウサギ抗体を以前に記載されるようにして調製した（Kalluri,R. et al.,1997,J.Clin.Invest. 99:2470-8・）。モノクローナルラット抗マウスＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子、ＰＥＣＡＭ−１）抗体を（PharMingen,San Diego,California,USA・）から購入した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体をSigma Chemical Co.（St.Louis,Missouri,USA・）から購入した。
【０１６９】
前記得られた濃縮上清を、以前に記載されたようにしてタムスタチンの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングで解析した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。一次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを１２％分離ゲルおよび不連続の緩衝液系を用いて行った。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、２％ＢＳＡで室温にて３０分間ブロックした。残りの結合部位をブロックした後、膜を完全に洗浄用緩衝液で洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：１０００に希釈された一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションはシェーカー上で一夜室温にて行った。次いで、ブロットを洗浄用緩衝液で完全に洗浄し、シェーカー上で室温にて３時間ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した二次抗体と共にインキュベートした。ブロットを再度完全に洗浄し、基質（０．０１％塩化コバルトおよびニッケルアンモニウム含有０．０５Ｍリン酸緩衝液中のジアミノベンジジン）を加えて、室温にて１０分間インキュベートした。次いで、基質溶液を流し出し、過酸化水素含有基質緩衝液を加えた。バンドを発色させた後、反応を蒸留水で止め、ブロットを乾燥した。３１ｋＤａの単一バンドが観察された。
【０１７０】
実施例１９：２９３胎児肝細胞におけるタムスタチンの発現。
ヒトタムスタチンをまた、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞ベクターを用い２９３胎児肝細胞において分泌性の可溶性タンパク質として生産した。この組換えタンパク質（いずれの精製用または検出用タグをも有しない）をアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離し、純粋な単量体型をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析により主要ピークにおいて検出した。
【０１７１】
α３（ＩＶ）ＮＣ１含有ｐＤＳプラスミド（Neilson,E.G. et al.,1993,J.Biol.Chem. 268:8402-5）を用い、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（InVitrogen,San Diego,California,USA・）にインフレームでリーダーシグナル配列を付加するようにＰＣＲでタムスタチンを増幅した。全長α３（ＩＶ）鎖の５’末端由来のリーダー配列を、タンパク質分泌が培養培地に生ずるようにＮＣ１ドメインの５’にクローニングした。タムスタチン含有組換えベクターを、フランキングプライマーを用いて両鎖について配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンをさらに精製し、タンパク質発現を確認するためにインビトロでの翻訳研究に使用した。タムスタチン含有プラスミドおよび対照プラスミドを用いて、塩化カルシウム法を用いて２９３細胞をトランスフェクトした（Sambrook,J. et al.,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,USA,pps.16.32-16.40・）。トランスフェクトされたクローンをジェネティシン（Life Technologies/Gibco BRL,Gaithersburg,Maryland,USA・）抗生物質処理により選抜した。細胞は、明確な細胞死がなくなるまで抗生物質の存在下で３週間放置した。クローンをＴ−２２５フラスコへ拡張し、コンフルエントまで増殖させた。次いで、上清を回収し、アミコン濃縮器を用いて濃縮した（Amicon,Inc.,Beverly,Massachusetts,USA・）。濃縮上清をタムスタチンの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよびＥＬＩＳＡで解析した。上清における強い結合がＥＬＩＳＡで検出された。
【０１７２】
タムスタチン含有上清をアフィニティークロマトグラフィーに供し、抗タムスタチンおよび抗６−ヒスチジンタグ抗体（Gunwar,S. et al.,1991,J.Biol.Chem. 266:15318-24・）の両方を用いて免疫検出した。タムスタチン抗体と免疫反応する約３１ｋＤａの単量体を含む主要ピークを同定した。
【０１７３】
実施例２０：タムスタチンは内皮細胞増殖を阻害する。
Ｃ−ＰＡＥ細胞に対するタムスタチンの抗増殖性作用を、大腸菌産生可溶性タンパク質を用いて3 Ｈ−チミジン取り込みアッセイにより調べた。
細胞株および培養。７８６−０（腎明細胞癌株）、ＰＣ−３（ヒト前立腺腺癌細胞株）、Ｃ−ＰＡＥ（ウシ肺動脈内皮細胞株）、ＭＡＥ（マウス大動脈内皮細胞株）を全てアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。７８６−０細胞株およびＣ−ＰＡＥ細胞株をＤＭＥＭ（Life Technologies/Gibco BRL,Gaithersburg,Maryland,USA・）中に維持し、ＥＣＶ−３０４細胞をＭ１９９中に維持し、また、ＭＡＥ細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＥＧＭ−２（Clonetics Corporation,San Diego,California,USA）中に維持した。
増殖アッセイ。Ｃ−ＰＡＥ細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中でコンフルエンスまで増殖させ、４８時間接触阻害を続けた。Ｃ−ＰＡＥ細胞を第２パッセージおよび第４パッセージの間で用いた。７８６−０細胞とＰＣ−３細胞を本実験において非内皮性対照として用いた。細胞を３７℃で５分間のトリプシン処理（Life Technologies/Gibco BRL,Gaithersberg,Maryland,USA・）により回収した。０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中の１２，５００個の細胞のサスペンジョンを１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆した２４穴プレートの各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ2 および湿度９５％で３７度にて２４時間インキュベートした。培地を除去して、２０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで置き換えた。非刺激対照細胞を０．１％ＦＣＳと共にインキュベートした。細胞を０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度のタムスタチンで処理した。全てのウェルに処理開始から１２時間後に１ｍＣｕｒｉｅの3 Ｈ−チミジンを添加した。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅＩＩ（Fisher Scientific,Pittsburgh,Pennsylvania,USA・）溶液を含むシンチレーションバイアルに添加した。チミジン取り込みをシンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０１７４】
結果を、種々の濃度のタムスタチン（ｘ軸）で処理した場合のＣ−ＰＡＥ細胞（Ｆｉｇ．１９Ａ）、ＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．１９Ｂ）および７８６−０細胞（Ｆｉｇ．１９Ｃ）についての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示すヒストグラムであるＦｉｇ．１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃに示す。全ての群は３連の試料を示す。タムスタチンは用量依存的様式で２０％ＦＣＳ刺激3 Ｈ−チミジン取り込みを有意に阻害した。ＥＤ50は約０．０１ｍｇ／ｍｌであった（Ｆｉｇ．１９Ａ）。また、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）または腎癌細胞（７８６−０）で、タムスタチン２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度でさえ、有意な抗増殖性作用は観察されなかった（Ｆｉｇ．１９Ｂおよび１９Ｃ）。タムスタチン処理（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）における3 Ｈ−チミジン取り込みの平均値と対照の平均値との間の差は有意であった（Ｐ＜０．０５）。ＰＣ−３細胞または７８６−０細胞をタムスタチンで処理した場合、阻害作用は観察されなかった（Ｆｉｇ．１９Ｂ、１９Ｃ）。各カラムは３連のウェルの平均±ＳＥを表す。この実験は３回繰り返した。星印でマークした棒は、片側スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０５で有意である。
【０１７５】
実施例２１：タムスタチンは内皮管形成を阻害する。
マトリゲル（matrigel）（Collaborative Biomedical Products,Bedford,Massachusetts,USA ）を２４穴プレートの各ウェルに添加し（３２０ｍｌ）、重合させた（Grant,D.S. et al.,1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63）。抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Clonetics Corporation,San Diego,California,USA）中の２５，０００個のＭＡＥ細胞のサスペンジョンをマトリゲルで被覆した各ウェルに移した（Grant,D.S. et al.,1994,Pathol.Res.Pract. 190:854-63・）。細胞を順に濃度を増加させたタムスタチン、ＢＳＡまたは７Ｓドメインで処理した。対照細胞は滅菌したＢＳＡと共にインキュベートした。全てのアッセイは３連で行った。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（３．３×接眼レンズ、１０×対物レンズの拡大）を用いて観察した。次いで、細胞を４００ＤＫで被覆したＴＭＡＸフィルム（Kodak・）を用いて写真撮影した。細胞をジフ−クイック（diff-quik・）固定液（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri,USA）で染色し、再度写真撮影した（Grant,D.S. et al.,1994,Pathol.Res.Pract. 190:854-63・）。１０個の視野を観察し、管の数を実験プロトコルを知らない２人の研究者に計数させ、平均をとった。
【０１７６】
結果をＦｉｇ．２０に示す。マウス大動脈内皮細胞を、マウス基底膜タンパク質の固体ゲルであるマトリゲル上で培養すると、それらは急速に整列し、中空管様構造を形成する（Haralabopoulos,G.C. et al.,1994,Lab.Invest. 71:575-82・）。２９３細胞で生産されたタムスタチンは、ＢＳＡ対照と比較して用量依存的様式でＭＡＥ細胞における内皮管形成を有意に阻害した（Ｆｉｇ．２０）。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質による処理後の管形成の割合はＢＳＡ９８．０±４．０、タムスタチン１４．０±４．０であった。同様な結果がまた、大腸菌で生産したタムスタチンを用いて得られた。ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（Ｎ末端非コラーゲン性ドメイン）は内皮管形成に作用しなかった。タムスタチンによる最大の阻害に８００〜１０００ｎｇ／ｍｌの間で達した。タムスタチン処理（黒丸、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）の平均割合の値と対照〔ＢＳＡ（白四角）、７Ｓドメイン（白丸）〕の平均割合の値との間の差は有意（ｐ＜０．０５）であった。各点は３連のウェルの平均±ＳＥを表す。この実験は３回繰り返した。星印でマークしたデータ点は、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。充分に形成された管が７Ｓドメイン処理で観察された。０．８ｍｇ／ｍｌのタムスタチンで処理したＭＡＥ細胞は管形成の減少を示した。
【０１７７】
新たな毛細血管の形成に対するタムスタチンのインビボでの作用を評価するために、マトリゲルプラグアッセイ（matrigel plug assay・）を行った（Passaniti,A. et al.,1992,Lab Invest. 67:519-29）。５〜６週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine,USA・）を得た。マトリゲル（Collaborative Biochemical Products,Bedford,Massachusetts,USA）を一夜４℃で溶解した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに注射する前に、２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Pierce Chemical Co.,Rockford,Illinois,USA・）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（R&D Systems,Minneapolis,Minnesota,USA・）、および１ｍｇ／ｍｌのタムスタチンと混合した。対照群には血管形成インヒビターを与えなかった。マトリゲル混合物を２１ゲージ針を用いて皮下注射した。１４日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを除去した。マトリゲルプラグを室温にて４時間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）にて固定し、次いで２４時間、ＰＢＳに切り換えた。プラグをパラフィンで包埋し、切片にし、Ｈ＆Ｅ染色した。切片を光学顕微鏡で調べ、１０個の強拡大（high power）視野から血管の数を計数し、平均をとった。全切片は、研究プロトコルを知らない病理学者によりコードされ、観察された。
【０１７８】
マトリゲルを大腸菌に生産させたタムスタチンの有りまたはなしで、ｂＦＧＦおよびヘパリンの存在下に置いた場合、血管数の６７％の減少が、１ｍｇ／ｍｌのタムスタチン処理で観察された。強拡大視野当たりの血管数は、タムスタチン、２．２５±１．３２および対照、７．５０±２．１７であった。各カラムは１群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを表わす。タムスタチン（１ｍｇ／ｍｌ）はＰＢＳで処理した対照と比較してインビボでの血管新生を有意に阻害した。タムスタチン処理動物の平均割合の値と対照動物の平均割合の値との間の差は有意（ｐ＜０．０５）であった。タムスタチン処理は、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。
【０１７９】
実施例２２：タムスタチンおよびタムスタチンの変異体はインビボでの腫瘍成長を阻害する。
５００万個のＰＣ−３細胞を回収し、７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスの背に皮下注射した。ノギスを用いて測定し、容積を標準式 幅2 ×長さ×０．５２を用いて計算した。腫瘍を約１００ｍｍ3 まで増殖させ、次いで、動物を５匹または６匹のマウスの群に分けた。滅菌したＰＢＳ中のタムスタチンまたはマウスエンドスタチンを、各々の実験群に対し、１０日間、毎日腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ）した。対照群にはビヒクル注射を行った（ＢＳＡまたはＰＢＳ）。腫瘍容積を１０日間に渡り２または３日ごとに計算した。結果を、ＰＢＳ対照（白四角）、２０ｍｇ／ｋｇのタムスタチン（黒丸）および２０ｍｇ／ｋｇのエンドスタチン（白丸）についての処理日数（ｘ軸）に対するｍｍ3 での腫瘍容積（ｙ軸）を示すグラフであるＦｉｇ．２１Ａに示す。大腸菌で生産したタムスタチンは、ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖を有意に阻害した（Ｆｉｇ．２１Ａ）。タムスタチンは２０ｍｇ／Ｋｇで、エンドスタチン２０ｍｇ／ｋｇにおけるのと同様に腫瘍成長を阻害した（Ｆｉｇ．２１Ａ）。腫瘍成長に対する有意な阻害作用が１０日目に観察された（対照２０２．８±５０．０ｍｍ3 、タムスタチン８２．９±２５．２ｍｍ3 、エンドスタチン６８．９±１６．７ｍｍ3 ）。タムスタチンまたはエンドスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較して、ヒト前立腺腺癌細胞（ＰＣ−３）腫瘍の増殖を阻害した。この実験は、腫瘍容積が１００ｍｍ3 未満の時に開始した。
【０１８０】
マウスで確立した他の原発性腫瘍に対するタムスタチンの作用も研究した。２００万個の７８６−０腎細胞癌細胞を７〜９週齢雄性胸腺欠損ヌードマウスの背に皮下注射した。腫瘍を約６００〜約７００ｍｍ3 まで増殖させ、次いで、動物を６匹ずつの群に分けた。滅菌したＰＢＳ中のタムスタチンを１０日間、毎日、腹腔内注射（６ｍｇ／ｋｇ）した。対照群にはＢＳＡ注射を行った。結果を、ＰＢＳ対照（白四角）および６ｍｇ／ｋｇのタムスタチン（黒丸）についての処理日数（ｘ軸）に対するｍｍ3 での腫瘍容積（ｙ軸）を示すグラフであるＦｉｇ．２１Ｂに示す。大腸菌で生産したタムスタチンは６ｍｇ／ｋｇで、ＢＳＡ対照と比較して、７８６−０ヒト腎細胞癌の腫瘍成長を阻害した（Ｆｉｇ．２１Ｂ）。腫瘍成長に対する有意な阻害作用が１０日目に観察された（対照１０９６±１７９．７ｍｍ3 、タムスタチン６１９±１２０．７ｍｍ3 ）。タムスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較して、ヒト腎細胞癌（７８６−０）の腫瘍成長を阻害した。この実験は、腫瘍容積が６００〜７００ｍｍ3 の時に開始した。各点は、１群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを表わす。星印のデータ点マーカーは、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。
【０１８１】
ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン〔α３（ＩＶ）ＮＣ１〕の部分はグッドパスチャー（Goodpasture・）症候群の病原性エピトープである（Butkowski,R.J. et al.,1987,J.Biol.Chem. 262:7874-7;Saus,J. et al.,1988,J.Biol.Chem. 263:13374-80;Kalluri,R. et al.,1991,J.Biol.Chem. 266:24018-24・）。グッドパスチャー症候群は、肺出血および／または急速に進行する糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患である（Wilson,C.&F.Dixon,1986,The Kidney,W.B. Sanders Co.,Philadelphia,Pennsylvania,USA,pps.80-89;Hudson,B.G. et al.,1993,J.Biol.Chem. 268:16033-6・）。これらの症状は、α３（ＩＶ）ＮＣ１に対する自己抗体の結合を介する腎糸球体および歯槽基底膜の崩壊により生ずる（Wilson,1986,前記；Hudson,1993,前記）。幾つかのグループがα３（ＩＶ）上のグッドパスチャー自己抗原の位置を位置づけまたは予測することを試みており（Kalluri,R. et al.,1995,J.Am.Soc.Nephrol. 6:1178-85;(Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8;Levy,J.B. et al.,1997,J.Am.Soc.Nephrol. 8:1698-1705;Kefalides,N.A. et al.,1993,Kidney Int. 43:94-100;Quinones,S. et al.,1992,J.Biol.Chem. 267:19780-4(J.Biol.Chem. 269:17358・における誤植）;Netzer,K.O. et al.,1999,J.Biol.Chem. 274:11267-74）、Ｎ末端、Ｃ末端、および中央部分の残基がエピトープの位置であると報告している。最近、最も可能性の高い疾患関連病原性エピトープがＮ末端位置において同定され（Hellmark,T. et al.,1999,Kidney Int. 55:936-44・）、さらに、Ｎ末端の４０個のアミノ酸に限定された。切形型タムスタチンは、病原性グッドパスチャー自己エピトープに相当するＮ末端の５３個のアミノ酸を欠くように設計された（タムスタチン−Ｎ５３）。この変異体タンパク質を以下の実験で用いた。
【０１８２】
２００万個の７８６−０腎細胞癌細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスの背に皮下注射した。腫瘍を約１００〜１５０ｍｍ3 のサイズまで増殖させた。次いで、マウスを５匹の群に分け、１０日間、２０ｍｇ／ｋｇの５３個のＮ末端アミノ酸を欠く大腸菌で発現させた切形型タムスタチンを毎日、腹腔内注射した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。対照マウスにはＰＢＳ注射を行った。結果を、対照マウス（白四角）およびタムスタチン変異体Ｎ２６で処理したマウス（黒丸）についての処理日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｙ軸）の増加を示すグラフであるＦｉｇ．２２に示す。大腸菌で生産したタムスタチン−Ｎ５３は２０ｍｇ／ｋｇで、対照と比較して４日〜１０日で７８６−０ヒト腎腫瘍の増殖を有意に阻害した（１０日目：タムスタチン−Ｎ５３ １１０．０±２９．０ｍｍ３、対照３４５．０±２４．０ｍｍ３）（Ｆｉｇ．２２）。各点は、５〜６匹マウス／群の平均±ＳＥを表わす。星印のデータ点マーカーは、片側スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。
【０１８３】
実施例２３：α３（ＩＶ）ＮＣ１およびＣＤ３１の免疫組織化学的染色。
７週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス由来の腎臓および皮膚組織を免疫蛍光顕微鏡により評価するために加工した。組織試料を液体窒素中で凍結し、４ｍｍ厚の切片を用いた。組織は以前に記載されているようにして間接的な免疫蛍光技術により加工した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。凍結切片を、一次抗体、ポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：１００希釈）またはポリクローナル抗α３（ＩＶ）ＮＣ１抗体（１：５０希釈）で染色した後、二次抗体、ＦＩＴＣ結合抗ラットＩｇＧ抗体またはＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。免疫蛍光をオリンパス蛍光顕微鏡（東京、日本国）の下で調べた。陰性対照は、一次抗体を無関係な免疫前血清で置き換えることにより行った。
【０１８４】
マウス腎臓では、ａ３（ＩＶ）ＮＣ１の発現がＧＢＭおよび血管基底膜において観察された。ＣＤ３１、ＰＥＣＡＭ−１の発現は糸球体内皮および血管内皮において観察された。マウス皮膚では、α３（ＩＶ）ＮＣ１は表皮基底膜および血管基底膜に存在しなかった。ＣＤ３１の発現は皮膚の血管内皮において観察された。ＣＤ３１発現は、マウス腎臓における糸球体および小管の内皮において観察され、α３（ＩＶ）ＮＣ１発現は糸球体基底膜および糸球体外血管基底膜において観察された。ＣＤ３１の発現は、マウス皮膚の真皮小管の内皮において観察された。α３（ＩＶ）ＮＣ１発現は内皮基底膜に存在せず、真皮小管の基底膜においてほとんど観察されなかった。これらの結果は、タムスタチンの分布が制限される例を示す。
【０１８５】
実施例２４：抗血管形成タンパク質の変異体およびフラグメント
アレステンおよびカンスタチンのフラグメントおよび変異体も、マリヤマら（1992,J.Biol.Chem. 267:1253-8）のシュードモナス（Pseudomonas・）エラスターゼ消化により作製した。消化物をゲルろ過ＨＰＬＣで分離し、得られたフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、前記内皮管アッセイで評価した。これらのフラグメントは、アレステンの１２ｋＤａフラグメント、アレステンの８ｋＤａフラグメント、カンスタチンの１０ｋＤａフラグメントを含む。また、タムスタチンの２つのフラグメント（「３３３」および「３３４」）をＰＣＲクローニングにより生成した。
【０１８６】
Ｆｉｇ．２３に示すように、前記のようにして行った内皮管アッセイで、２つのアレステンフラグメント〔１２ｋＤａ（黒四角）および８ｋＤａ（白四角）〕およびカンスタチンフラグメント〔１９ｋＤａ（黒三角）〕は、アレステン（黒丸）またはカンスタチン（白丸）が行ったよりもさらにより大きな程度で内皮管の形成を阻害した。Ｆｉｇ．２４は、同様にタムスタチンフラグメント、「３３３」（黒丸）および「３３４」（白丸）がタムスタチン（黒三角）より性能が優れることを示す。ＢＳＡ（黒四角）およびα６鎖（白四角）を対照として用いた。
【０１８７】
全ての参照文献、特許、および特許出願は、それらの全体において参照により本明細書に取り込まれる。本発明をその好ましい態様を参照して詳細に示し、また記載したが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明において成されてよいということを当業者は理解するであろう。
【０１８８】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］ ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメイン、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメイン、もしくはＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインからなる群より選ばれる単離されたタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体であって、該タンパク質、そのフラグメント、アナログ、誘導体または変異体が抗血管形成特性を有するものである、単離されたタンパク質。
［２］ タンパク質が単量体である［１］記載の単離されたタンパク質。
［３］ タンパク質がアレステンである［２］記載の単離されたタンパク質。
［４］ タンパク質がカンスタチンである［２］記載の単離されたタンパク質。
［５］ タンパク質がタムスタチンである［２］記載の単離されたタンパク質。
［６］ 抗血管形成活性を有する、［１］記載のタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体の多量体。
［７］ 抗血管形成活性を有する、１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体を含んでなるキメラタンパク質。
［８］ エンドスタチンもしくはそのフラグメント、アンジオスタチンもしくはそのフラグメント、レスチンもしくはそのフラグメント、アポミグレンもしくはそのフラグメント、または他の抗血管形成タンパク質、もしくはそのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含んでなる［７］記載のキメラタンパク質。
［９］ 生物学的に活性な成分として１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質を含んでなる組成物。
［１０］ ［９］記載の組成物と薬学的に適合可能な担体。
［１１］ 生物学的に活性な成分として１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質を含んでなり、かつエンドスタチンもしくはそのフラグメント、アンジオスタチンもしくはそのフラグメント、レスチンもしくはそのフラグメント、アポミグレンもしくはそのフラグメント、または他の抗血管形成タンパク質、もしくはそのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含んでなる組成物。
［１２］ 生物学的に活性な成分として［６］記載の多量体を含んでなる組成物。
［１３］ 生物学的に活性な成分として［７］記載のキメラタンパク質を含んでなる組成物。
［１４］ ［１］記載のタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体または変異体をコードするものであって、該タンパク質またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体が抗血管形成活性を有するものである、単離されたポリヌクレオチド。
［１５］ 発現制御配列に作動可能に連結されているものである［１４］記載の単離されたポリヌクレオチド。
［１６］ ［１５］記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。
［１７］ 細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選ばれるものである［１６］記載の宿主細胞。
［１８］ ［３］記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
［１９］ ［４］記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
［２０］ ［５］記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
［２１］ （ａ）［１４］記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞の培養物を増殖させる工程、ここで、該宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選ばれるものである；ならびに
（ｂ）培養物からタンパク質を精製する工程；
を含み、かかる工程により、［１４］記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を生産する、［１４］記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の生産方法。
［２２］ （ａ）中等度ストリンジェンシーな条件下で［１４］記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドプローブを製造する工程；
（ｂ）該１つまたは複数のプローブを哺乳動物ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程；ならびに
（ｃ）１つまたは複数のプローブで検出されたＤＮＡポリヌクレオチドを単離する工程；
により生産される単離されたポリヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が［１４］記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相当するものである単離されたポリヌクレオチド。
［２３］ インビトロで処理され、［１４］記載のポリヌクレオチドを挿入された哺乳動物細胞を哺乳動物に導入する工程および該哺乳動物において血管形成活性を阻害するのに充分な量の抗血管形成タンパク質の治療上有効量を前記哺乳動物においてインビボで発現させる工程を含む、哺乳動物への抗血管形成タンパク質の提供方法。
［２４］ 抗血管形成タンパク質の発現が一過的発現である［２３］記載の方法。
［２５］ 細胞が、血球、ＴＩＬ細胞、骨髄細胞、血管細胞、腫瘍細胞、肝細胞、筋細胞、線維芽細胞からなる群より選ばれる［２３］記載の方法。
［２６］ ポリヌクレオチドがウイルスベクターにより細胞に挿入される［２５］記載の方法。
［２７］ ［１］記載の単離されたタンパク質、そのアナログ、誘導体ホモログまたは変異体に対する特異的に結合する抗体。
［２８］ １つまたはそれ以上の以下のもの：１つまたはそれ以上の［１］記載の単離されたタンパク質、［１］記載の単離されたタンパク質のフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体、［１］記載のタンパク質の多量体、［１］記載のフラグメントの多量体、１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質を含んでなるキメラタンパク質、または［１］記載のタンパク質のフラグメントを含んでなるキメラタンパク質、を含んでなる組成物と組織を接触させる工程を含む、哺乳動物組織における抗血管形成活性の阻害方法。
［２９］ 疾患が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬、眼血管形成疾患、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管腺維腫、創傷肉芽形成、腸管癒着、動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、ネコひっかき病、ヘリコバクターピロリ潰瘍、透析移植片血管アクセス狭窄、不妊症、肥満からなる群より選ばれる、［２８］記載の方法。
［３０］ 疾患が癌である［２９］記載の方法。
［３１］ 疾患を有する患者に、放射線療法、化学療法、または免疫療法を組み合わせて組成物を投与する工程を含む、血管形成活性を特徴とする疾患を阻害するための［２８］記載の組成物の使用方法。
［３２］ 抗血管形成活性を有する、配列番号：１０のアミノ酸２位〜アミノ酸１２５位を含んでなるポリペプチド。
［３３］ ［３２］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［３４］ 抗血管形成活性を有する、配列番号：１０のアミノ酸１２５位〜アミノ酸２４５位を含んでなるポリペプチド。
［３５］ ［３４］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［３６］ ＰＣＲクローニングの方法により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［３７］ ＰＣＲクローニングの方法により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［３８］ ＰＣＲクローニングの方法により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［３９］ シュードモナスエラスターゼ消化により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［４０］ １２ｋＤａのサイズである［３９］記載の抗血管形成フラグメント。
［４１］ ８ｋＤａのサイズである［３９］記載の抗血管形成フラグメント。
［４２］ シュードモナスエラスターゼ消化により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［４３］ １０ｋＤａのサイズである［４２］記載の抗血管形成フラグメント。
［４４］ シュードモナスエラスターゼ消化により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１Ａ】Ｆｉｇ．１Ａおよび１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα１鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１Ａ、配列番号：１）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１Ｂ、配列番号：２）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配列番号：４）の位置を示す。
【図１Ｂ】Ｆｉｇ．１Ａおよび１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα１鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１Ａ、配列番号：１）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１Ｂ、配列番号：２）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配列番号：４）の位置を示す。
【図２】Ｆｉｇ．２は、アレステンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す概略図である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配列番号：４）ならびにアレステンがクローニングされる部位を示す。
【図３】Ｆｉｇ．３Ａおよび３Ｂは、内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ）増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステン（Ｆｉｇ．３Ａ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ｘ軸）およびエンドスタチン（Ｆｉｇ．３Ｂ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ｘ軸）の影響を示す、１組の線グラフである。
【図４Ａ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図４Ｂ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図４Ｃ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図４Ｄ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図５】Ｆｉｇ．５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ヒト臍静脈内皮（ＥＣＶ−３０４）細胞におけるＦＢＳ−誘発走化性を介する内皮細胞移動に対するアレステン（２μｇ／ｍｌ、Ｆｉｇ．５Ｂ）およびエンドスタチン（２０μｇ／ｍｌ、Ｆｉｇ．５Ｃ）の影響を示す１組の４つの顕微鏡写真である。Ｆｉｇ．５Ａは、未処理の対照細胞を示す。
【図６】Ｆｉｇ．６は、Ｆｉｇ．５の結果をグラフ形式で示す棒グラフである。Ｆｉｇ．６は、ＥＣＶ−３０４内皮細胞の移動に対するアレステン（２μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）およびエンドスタチン（２．５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）の影響を示す。
【図７】Ｆｉｇ．７は、内皮管形成に対するアレステンの影響を示す線グラフである。管形成の割合をｙ軸に、インヒビターの濃度をｘ軸に示す。処理は：なし（対照、黒菱形）、ＢＳＡ（対照、白三角）、７Ｓドメイン（対照、Ｘ）およびアレステン（黒四角）であった。
【図８】Ｆｉｇ．８Ａおよび８Ｂは、対照（Ｆｉｇ．８Ａ）と比較した内皮管形成に対するアレステン（０．８μｇ／ｍｌ、Ｆｉｇ．８Ｂ）の影響を示す１組の顕微鏡写真である。
【図９】Ｆｉｇ．９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、インビボでの腫瘍成長に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す１組の４つの線グラフである。Ｆｉｇ．９Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステン処理（白四角）、ＢＳＡ処理（＋）、および対照マウス（黒丸）についての７００ｍｍ3 からの腫瘍容積の増加を示すプロットである。Ｆｉｇ．９Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステン処理（白四角）およびＢＳＡ処理（＋）腫瘍についての１００ｍｍ3 からの腫瘍容積の増加を示す。Ｆｉｇ．９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステン処理（白四角）、エンドスタチン処理（黒三角）、および対照マウス（黒丸）についての約１００ｍｍ3 からの腫瘍容積の増加を示す。Ｆｉｇ．９Ｄは、アレステン（白四角）対対照（黒丸）で処理した場合の２００ｍｍ3 の腫瘍についての増加を示す。
【図１０Ａ】Ｆｉｇ．１０Ａおよび１０Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα２鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１０Ａ、配列番号：５）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１０Ｂ、配列番号：６）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー（配列番号：８）の位置を示す。
【図１０Ｂ】Ｆｉｇ．１０Ａおよび１０Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα２鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１０Ａ、配列番号：５）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１０Ｂ、配列番号：６）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー（配列番号：８）の位置を示す。
【図１１】Ｆｉｇ．１１は、カンスタチンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す概略図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー（配列番号：８）ならびにカンスタチンがクローニングされる部位を示す。
【図１２】Ｆｉｇ．１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、内皮（Ｃ−ＰＡＥ）細胞（Ｆｉｇ．１２Ａおよび１２Ｃ）および非内皮（７８６−０、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３）細胞（Ｆｉｇ．１２Ｂおよび１２Ｄ）の増殖に対する種々の濃度のカンスタチン（ｘ軸）の影響を示すヒストグラムである。増殖は、3 Ｈ−チミジン取り込み（Ｆｉｇ．１２Ａおよび１２Ｂ）およびメチレンブルー染色（Ｆｉｇ．１２Ｂおよび１２Ｄ）の関数として測定した。
【図１３】Ｆｉｇ．１３は、ＶＥＧＦなし（ＶＥＧＦなしまたは血清）、およびＶＥＧＦ（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）細胞の処理についての、および０．０１μｇ／ｍｌ カンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌ カンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌ カンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌ カンスタチン）の処理についての、視野当たりの移動した内皮細胞の数（ｙ軸）を示す棒グラフである。
【図１４】Ｆｉｇ．１４は、ＢＳＡ（白四角）、カンスタチン（黒四角）、およびα５ＮＣ１（白丸）の種々の処理の下での対照（ＰＢＳ処理ウェル）管形成の割合（ｙ軸）としての内皮管形成の量を示す線グラフである。垂直方向の線分は平均の標準誤差を示す。
【図１５】Ｆｉｇ．１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは、処理日数（ｘ軸）に対してプロットした、腫瘍容積率（ｙ軸、Ｆｉｇ．１５Ａおよび１５Ｂ）またはｍｍ3 での腫瘍容積（ｙ軸、Ｆｉｇ．１５Ｃおよび１５Ｄ）に関するカンスタチン（黒四角）、エンドスタチン（白丸）および対照（白四角）のＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．１５Ａおよび１５Ｂ）および７８６−０細胞（Ｆｉｇ．１５Ｃおよび１５Ｄ）に対する影響を示す線グラフである。
【図１６Ａ】Ｆｉｇ．１６Ａおよび１６Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα３鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１６Ａ、配列番号：９）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１６Ｂ、配列番号：１０）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）の位置を示す。「タムスタチン３３３」フラグメントおよび「タムスタチン３３４」フラグメントの始まりと終わりも示す。
【図１６Ｂ】Ｆｉｇ．１６Ａおよび１６Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα３鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１６Ａ、配列番号：９）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１６Ｂ、配列番号：１０）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）の位置を示す。「タムスタチン３３３」フラグメントおよび「タムスタチン３３４」フラグメントの始まりと終わりも示す。
【図１７】Ｆｉｇ．１７は、タムスタチンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す概略図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）ならびにタムスタチンがクローニングされる部位を示す。
【図１８】Ｆｉｇ．１８は、タムスタチン変異体タムスタチンＮ−５３におけるα３（ＩＶ）ＮＣ１単量体内の切形アミノ酸の位置を示す概略図である。黒丸は、この変異体を作製するためにタムスタチンから欠失させたＮ末端の５３個のアミノ酸残基に相当する。短いバーでマークしたジスルフィド結合は、それらがα１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１において生ずるように配置されている。
【図１９】Ｆｉｇ．１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、種々の濃度のタムスタチン（ｘ軸）で処理した場合のＣ−ＰＡＥ細胞（Ｆｉｇ．１９Ａ）、ＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．１９Ｂ）および７８６−０細胞（Ｆｉｇ．１９Ｃ）についての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示す１組の３つのヒストグラムである。全ての群は３連の試料を示す。
【図２０】Ｆｉｇ．２０は、種々の量のタムスタチン（黒丸）、ＢＳＡ（対照、白四角）および７Ｓドメイン（対照、白丸）（ｘ軸）の内皮管形成（ｙ軸）に対する影響を示す線グラフである。
【図２１】Ｆｉｇ．２１Ａおよび２１Ｂは、タムスタチン（黒丸）およびエンドスタチン（白丸）対対照（白四角）での処理日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｍｍ3 、ｙ軸）への影響を示す１組の線グラフである。星印をつけたデータ点は、片側スチューデントの検定によるＰ＜０．０５で有意である。
【図２２】Ｆｉｇ．２２は、処理日数（ｘ軸）に対してプロットした、腫瘍容積（ｙ軸）に関する対照マウス（白四角）、タムスタチン変異体Ｎ−５３で処理されたマウス（黒丸）に対する増加を示す線グラフである。星印をつけたデータポイントは、片側スチューデントの検定によるＰ＜０．０５で有意である。
【図２３】Ｆｉｇ．２３は、アレステン（黒丸）、カンスタチン（白丸）、アレステンの１２ｋＤａフラグメント（黒四角）、アレステンの８ｋＤａフラグメント（白四角）、およびカンスタチンの１０ｋＤａフラグメント（黒三角）の濃度変化（ｘ軸）による内皮管形成（ｙ軸）の阻害を示す線グラフである。
【図２４】Ｆｉｇ．２４は、タムスタチンフラグメント３３３（黒丸）、タムスタチンフラグメント３３４（白丸）、ＢＳＡ（対照、黒四角）、α６（対照、白四角）、およびタムスタチン（黒三角）の濃度変化（ｘ軸）による内皮管形成（ｙ軸）の阻害を示す線グラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗血管形成タンパク質およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連出願
本願は、１９９８年６月１７日に出願された米国仮出願第６０／０８９，６８９号、および、また１９９９年３月２５日に出願された米国仮出願第６０／１２６，１７５号の利益を主張するものであり、その全教示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０００３】
発明の背景
血管基底膜は、コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、フィブロネクチンおよびエンタクチン（entactin）等の巨大分子からなる（Timpl,R.,1996,Curr Opin Cell Biol 8:618-24）。機能的に、コラーゲンは細胞接着、細胞移動、細胞分化および細胞成長を促進し（Paulsson,M.,1992,Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol. 27:93-127・）、また、これらの機能を介して、予め存在している血管からの新たな血管の形成プロセスである血管形成の際に、内皮細胞の増殖および挙動において重要な役割を果たすと推定される（Madri,J.A. et al.,1986,J.Histochem.Cytochem. 34:85-91;Folkman,J.,1972,Ann.Surg. 175:409-16）。血管形成は複雑なプロセスであり、内皮細胞の発芽および移動、それらの細胞の増殖、および管様構造へのそれらの分化ならびに発達途上の血管周囲の基底膜マトリックスの生成を必要とする。さらに、血管形成は、創傷治癒および子宮内膜再構築等の通常の生理学的事象に重要なプロセスである（Folkman,J. et al.,1995,J.Biol.Chem. 267:10931-34）。現在では、血管形成は数ｍｍ2 の大きさを超える充実性腫瘍の転移および増殖に必要であるということが充分に報告されている（Folkman,J.,1972,Ann.Surg. 175:409-16;Folkman,J.,1995,Nat.Med. 1:27-31・）。いくつかの研究によればコラーゲン代謝のインヒビターは抗血管形成特性を有することが示されており、これは、基底膜コラーゲン合成および沈着が血管形成および生存に重要であることを支持する（Maragoudakis,M.E. et al.,1994,Kidney Int. 43:147-50;Haralabopoulos,G.C. et al.,1994,Lab.Invest. 71:575-82・）。しかしながら、基底膜組織および血管形成におけるコラーゲンの正確な役割は未だ充分には理解されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の概要
本発明は、抗血管形成特性を有するＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣ１ドメインを含むタンパク質に関する。特に、本発明は、新規タンパク質である、アレステン（Arresten）、カンスタチン（Canstatin・）およびタムスタチン（Tumstatin・）および生物学的に活性な（たとえば、抗血管形成）フラグメント、変異体、アナログ、ホモログおよびそれらの誘導体、ならびにそれらの多量体（たとえば、二量体）および融合タンパク質（本明細書においてはキメラタンパク質ともいう）に関する。これらのタンパク質は全て、ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１〔non-collagenous 1・（非コラーゲン性１）〕のＣ末端フラグメントを含む。より詳細には、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは、各々ＩＶ型コラーゲンのα１鎖、α２鎖およびα３鎖のＮＣ１ドメインのＣ末端フラグメントである。特に、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは単量体タンパク質である。３つ全て、インビボでの腫瘍成長を停止し、また、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロモデルにおいて毛細血管の形成を阻害する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の要旨は、
〔１〕 配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離された組換えタンパク質、
〔２〕 配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される単離された組換えタンパク質フラグメントであって、該タンパク質フラグメントは、１０ｋＤａのフラグメントであり、内皮管形成を阻害する、フラグメント、
〔３〕 〔１〕記載のタンパク質、または〔２〕記載の１０ｋＤａのタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質、
〔４〕 〔１〕記載のタンパク質および／または〔２〕記載のフラグメントを含む組成物、
〔５〕 薬学的に適合可能な担体をさらに含む〔４〕記載の組成物、
〔６〕 〔１〕記載のタンパク質、〔２〕記載のフラグメント、および〔３〕記載のタンパク質からなる群より選択される１つ以上を含み、ならびにエンドスタチン、アンジオスタチン、レスチン、およびアポミグレンからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含む組成物、
〔７〕 配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される１０ｋＤａのフラグメントを含む医薬であって、組織と接触することによって、哺乳動物の組織における血管形成活性を阻害するための医薬、
〔８〕 該組織が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬、眼血管形成疾患、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維腫、創傷肉芽形成、腸管癒着、動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、ネコひっかき病、ヘリコバクターピロリ潰瘍、透析移植片血管アクセス狭窄、および肥満からなる群より選ばれる疾患を有する個体の組織である、〔７〕記載の医薬、
〔９〕 疾患が癌である〔８〕記載の医薬、
〔１０〕 血管形成活性を特徴とする疾患を有する個体に、放射線療法、化学療法、または免疫療法を組み合わせて投与される、〔９〕記載の医薬、
〔１１〕 医薬が産児制限剤である〔７〕記載の医薬、
〔１２〕 〔１〕記載のタンパク質または〔２〕記載のいずれかのタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチド
に関する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明は、単離されたアレステンおよび組換え的に生産されたアレステンを包含する。アレステンは、本明細書においてはアレスチン（Arrestin）ともいい、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインを含んでおり、抗血管形成活性を有する。また、本発明は、単離されたアレステンの抗血管形成フラグメント、単離されたアレステンおよび抗血管形成フラグメントの多量体、およびそれらの抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。また、生物学的に活性な成分として、単離されたアレステン、その抗血管形成フラグメント、または両方を含む組成物を包含する。他の態様では、本発明は、増殖性疾患が血管形成活性を特徴とする哺乳動物における癌等の増殖性疾患の治療方法を特色とする。かかる方法は、抗血管形成アレステンまたはそのフラグメントを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。また、抗血管形成アレステンおよびそのフラグメントを用いて、細胞移動または内皮細胞増殖を防ぐことができる。単離された抗血管形成アレステンおよびそのフラグメントに対する抗体も特色とする。
【０００７】
本発明はまた、単離されたカンスタチンおよび組換え的に生産されたカンスタチンを包含する。カンスタチンは、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインを含んでおり、抗血管形成活性を有する。また、本発明は、単離されたカンスタチンの抗血管形成フラグメント、単離されたカンスタチンおよび抗血管形成フラグメントの多量体、およびそれらの抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。また、生物学的に活性な成分として、単離されたカンスタチン、その抗血管形成フラグメント、または両方を含む組成物を包含する。他の態様では、本発明は、増殖性疾患が血管形成活性を特徴とする哺乳動物における癌等の増殖性疾患の治療方法を特色とする。かかる方法は、抗血管形成カンスタチンまたはそのフラグメントを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。また、抗血管形成カンスタチンおよびそのフラグメントを用いて、細胞移動または内皮細胞増殖を防ぐことができる。単離された抗血管形成カンスタチンおよびそのフラグメントに対する抗体も特色とする。
【０００８】
本発明は同様に、単離されたタムスタチンおよび組換え的に生産されたタムスタチンを包含する。タムスタチンは、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインを含んでおり、抗血管形成活性を有する。また、本発明は、単離されたタムスタチンの抗血管形成フラグメント、単離されたタムスタチンおよび抗血管形成フラグメントの多量体、およびそれらの抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドを包含する。また、生物学的に活性な成分として、単離されたタムスタチン、その抗血管形成フラグメント、または両方を含む組成物を包含する。他の態様では、本発明は、増殖性疾患が血管形成活性を特徴とする哺乳動物における癌等の増殖性疾患の治療方法を特色とする。かかる方法は、抗血管形成タムスタチンまたはそのフラグメントを含む組成物を哺乳動物に投与する工程を含む。また、抗血管形成タムスタチンおよびそのフラグメントを用いて、細胞移動または内皮細胞増殖を防ぐことができる。単離された抗血管形成タムスタチンおよびそのフラグメントに対する抗体も特色とする。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
好ましくない血管形成に伴い、多様な疾患が生ずる。一方、ある時点において、または特定の組織中で、何らかの条件下で、毛細血管の成長と肥大を停止させることが可能であれば、多くの疾患や好ましくない病態を予防または改善することができる。基底膜構造は、ＩＶ型コラーゲンのＣ末端球状非コラーゲン性（ＮＣｌ）ドメインを介して発生すると推定されるＩＶ型コラーゲンネットワークの集合に依存している（Timple, R., 1996, Curr Opin Cell Biol 8:618-24；Timple, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-211 ）。ＩＶ型コラーゲンは、６つの異なる遺伝子産物、すなわちα１からα６でできている（Prockop, D.J. et al., 1995, Annu. Rev. Biochem. 64:403-34 ）。α１およびα２アイソフォームはヒト基底膜中に普遍的に存在するが（Paulsson, M., 1992, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 27:93-127）、他の４つのアイソフォームは限定的分布を示す（Kalluri,R.etal.,1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8）。
【００１０】
腫瘍成長および転移の過程には、既存の血管からの新たな毛細血管の形成、すなわち血管形成が不可欠である（Folkman, J. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:10931-4；Folkman,J.,1995, Nat. Med. 1:27-31；Hanahan, D. et al., 1996, Cell 86:353-64）。ヒトおよび動物の腫瘍は、当初は血管化されないが、腫瘍が数ｍｍ3 以上に成長するために、血管化することがある（Folkman, J., 1995, Nat. Med. 1:27-31；Hanahan,D.etal.,1996, Cell 86:353-64）。血管形成表現型へのスイッチには、血管形成刺激剤のアップレギュレーションと血管形成インヒビターのダウンレギュレーションの両者が必要である（Folkman,J.,1995, Nat. Med. 1:27-31）。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）は、腫瘍中で最も普通に発現される血管形成因子である。血管化した腫瘍は、腫瘍成長を相乗的に促進しうるこれらの血管形成因子の１つ以上のものを過剰発現することがある。ＶＥＧＦなどの単一の血管形成因子を受容体アンタゴニストで阻害しても、腫瘍成長を停止させることはできない。いくつかの血管形成インヒビターが最近同定されているが、ＩＦＮ−α、血小板因子４（Maione,T.E.etal.,1990, Science 247:77-9 ）およびＰＥＸ（Brooks, P.C. et al., 1998, Cell 92:391-400）などある種の因子は腫瘍細胞と内因的には関連していないが、アンジオスタチン（O'Reilly, M.S. et al., 1994, Cell 79:315-28 ）とエンドスタチン（O'Reilly, M.S. et al., 1997, Cell 88:277-85 ）は、腫瘍組織そのものによって生成される腫瘍関連血管形成インヒビターである。これらの内因性血管形成インヒビターによる腫瘍成長および転移の治療は非常に効果的であって、魅力的な発想であるが、抗血管形成療法に関連して起こり得るいくつかの問題を考慮に入れなければならない。長期的抗血管形成療法によって惹起される遅延型毒性ならびに治療時の創傷治癒および生殖系血管形成の障害の可能性も十分考慮しなければならない。
【００１１】
本発明においては、抗血管形成の性質を有するタンパク質、およびそれらのフラグメント、アナログ、誘導体、ホモログおよび変異体、ならびにこれらのタンパク質、アナログ、誘導体、ホモログおよび変異体を用いて血管形成関与増生疾患を阻害する方法について説明する。該タンパク質は、ＩＶ型コラーゲンのα鎖のＮＣｌドメイン、または該ドメインの一部から成るものであり、具体的には、ＩＶ型コラーゲンのα１、α２およびα３鎖のＮＣｌドメインの単量体から成る。これらのタンパク質は、とくに単量体状である場合、癌のインビボのモデルにおける腫瘍成長を停止させるとともに、内皮管アッセイを含むいくつかのインビトロのモデルにおける毛細血管の形成も阻害する。
【００１２】
これらのタンパク質は、ＮＣｌドメインの接合部領域を含んでいることもある。α４、α５、およびα６鎖は抗血管形成活性が低下しているか検出できなくなっていることを示唆する証拠があることから、α１、α２、またはα３鎖が好ましい。一般に、六量体型も活性がほとんどないか低下していることを示唆する証拠があることから、該タンパク質の単量体型が好ましい。
【００１３】
さらに具体的には、本発明は、ヒトＩＶ型コラーゲンのＮＣｌドメインのα１鎖のＮ末端にあるアミノ酸に対応する約２３０個分のアミノ酸の長さを有するタンパク質である「アレステン（Arresten）」と呼ばれるタンパク質について説明する（Hostikka, S.L. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:19488-93）。
【００１４】
本明細書で開示されるように、ヒトアレステンは、ペリプラズム輸送を行いうるがゆえに可溶性タンパク質を生成するｐＥＴ２２ｂなどの細菌発現プラスミドを用いて、大腸菌中で製造することができる。該タンパク質は、Ｃ末端の６個のヒスチジンタグを有する２９ｋＤａの融合タンパク質として発現される。追加の３ｋＤａ（２６ｋＤａに加わる）は、ポリリンカーおよびヒスチジンのタグ配列に由来する。アレステンは、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞ベクターを用いて、２９３腎細胞中で分泌可溶性タンパク質としても製造された。この２９３産生タンパク質は、精製タグや検出タグを保持していない。
【００１５】
大腸菌産生アレステンは、０．２５μｇ／ｍｌのＥＤ50をもって、用量依存的にｂＦＧＦ刺激内皮細胞の増殖を阻害する。腎癌細胞（７８６−０）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）、またはヒト前立腺上皮細胞（ＨＰＥＣ）の増殖に及ぼす有意な影響は認められなかった。エンドスタチンは、アレステンより３倍高い０．７５μｇ／ｍｌのＥＤ50で、Ｃ−ＰＡＥ細胞の増殖を阻害したが、Ａ−４９８癌細胞を阻害しなかった。
【００１６】
本明細書で説明するように、内皮細胞の増殖および移動が特異的に阻害されることは、アレステンが、細胞表面タンパク質または受容体を介して機能する可能性があることを示している。マトリックスメタロプロテイナーゼすなわちＭＭＰが阻害されることは、アレステンが、バチマスタット（batimastat）（ＢＢ−９４）やマリマスタット（marimastat）（ＢＢ−２５１６）と同様に、腫瘍の成長および転移において直接的役目を果たしていることを示唆している。
【００１７】
本発明においては、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣｌドメインであるカンスタチン（Canstatin・）を用いて、血管形成を阻害させたが、この阻害は、内皮細胞の増殖と移動の阻害および内皮管形成の阻害によってアッセイした。カンスタチンにより、内皮細胞の増殖と移動が特異的に阻害されたことは、この物質が抗血管形成活性を有すること、および細胞表面タンパク質／受容体を介して機能する可能性があることも証明している。インテグリンは、細胞外マトリックス結合能力および移動や増殖などの細胞挙動を調節する能力を有することからみて、候補分子となりうる。とくに、ａｖｂ３インテグリンは、血管形成時に誘導されること、および相手を選ばず結合しうることから、カンスタチン受容体であり得る。
【００１８】
本発明においては、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣｌドメインであるタムスタチン（Tumstatin ）（Timple, R. et al., 1981, Eur. J. Biochem. 120:203-11；Turner, N. et al., 1992, J. Clin. Invest. 89:592-601）を用いて、インビトロおよびインビボの血管形成および腫瘍成長モデルにおける血管内皮細胞の増殖および血管形成を調節した。α３（ＩＶ）鎖の分布は、ＧＢＭなどある種の基底膜、数種類の蝸牛基底膜、前房水晶体嚢などの眼基底膜、デスメ膜、卵巣および精巣基底膜（Frojdman, K. et al., 1998, Differentiation 83:125-30）、および肺胞毛細血管基底膜（Kashtan,C.E., 1998, J. Am. Soc. Nephrol. 9:1736-50 ）に限定されている。しかしながら、この鎖は、腎臓メサンギウム、皮膚の血管基底膜および表皮基底膜、および肝臓の血管基底膜（Kashtan, C.E., 上掲）には見当たらない。創傷治癒の過程では、ＩＶ型コラーゲンのα３およびα４鎖は「既存の」すなわち皮膚血管系の基底膜の成分ではないがゆえに、これら２つの鎖以外のα鎖が集合して、新たな毛細血管を形成する。α３（ＩＶ）鎖は正常なヒトの皮膚における本来の成分ではないので、創傷治癒の病変におけるコラーゲン集合および血管形成の過程が、タムスタチンを用いた治療によって変化することはない。
【００１９】
α３（ＩＶ）鎖は、ヒト腎臓血管基底膜ならびにＧＢＭ中で発現される（Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8）。これらの「既存の」血管は、腎細胞癌などの原発性腎腫瘍の進行に関与していると推定される。タムスタチンは、α３（ＩＶ）鎖とその他のα鎖の集合を介する新生血管形成を破壊することによって、原発性腎腫瘍の治療に有効であり得る。腎細胞癌の診断を受ける患者数は、１９９６年の米国において約３万人であり（Mulders,P.etal.,1997, Cancer Res. 57:5189-95）、転移症例の予後は非常に悪い。放射線療法と化学療法の進歩にもかかわらず、治療を受けた患者の長期生存率はあまり改善されていない（Mulders,P., 上掲）。腎細胞癌の有意治療選択肢がないことから、新規治療方式を確立することが非常に重要である。この事実に鑑み、最近、充実性腫瘍の新生血管形成のターゲティングが、いくつかの動物モデルにおいて有望な成績を挙げている（Baillie, C.T. et al., 1995, Br. J. Cancer 72:257-67 ；Burrows, F.J. et al., 1994, Pharmacol. Ther. 64:155-74；Thorpe, P.E. et al., 1995, Breast Cancer Res. Treat. 36:237-51）。インビボにおける腎細胞癌成長の阻害にタムスタチンが有効であることは、この分子が、この腫瘍タイプに対して有効な抗血管形成療法になり得ることを示している。
【００２０】
本発明においては、タムスタチンは内皮細胞増殖を特異的に阻害し、インビトロにおいて腫瘍細胞株ＰＣ−３および７８６−Ｏの増殖に対しては影響を及ぼさなかった。タムスタチンは内皮細胞移動を阻害しなかったが、インビトロにおける内皮管形成を有意に抑制した。これらの成績を総合すると、タムスタチンは、血管形成過程における様々な段階を阻害することにより、新たな血管の形成を抑制することがわかる。
【００２１】
インビボ試験で、タムスタチンは、マトリゲルプラグ（matrigelplug・）アッセイにおける血管形成を阻害し、マウス異種移植片モデルにおけるＰＣ−３腫瘍および７８６−Ｏ腫瘍の成長を抑制した。タムスタチンが大型腫瘍の成長を阻害したことは、臨床現場における腫瘍の治療に鑑みてとくに有意義である。
【００２２】
タムスタチンは、肺出血と急速進行性糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患であるグッドパスチャー症候群の病原エピトープを保持しているため（Butkowski, R.J. et al., 1987, J. Biol. Chem. 262:7874-77；Saus, J. et al., 1988, J. Biol. Chem. 263:13374-80；Kalluri, R. et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:24018-24 ）、タムスタチンの短期的または長期的投与がこの自己免疫疾患を誘導する可能性がある。いくつかのグループが、α３（ＩＶ）ＮＣｌ上のグッドパスチャー症候群自己エピトープの位置をマッピングまたは予測しようと試みており、Ｎ末端部分、中間部分、およびＣ末端部分が該エピトープを保持することが報告された（Kalluri, R. et al., 1995, J. Am. Soc. Nephrol. 6:1178-85；Kalluri,R.etal.,1996, J. Biol. Chem. 271:9062-8 ；Levy, J.B. et al., 1997, J. Am. Soc. Nephrol. 8:1698-1705 ；Quinones, S. et al., 1992, J. Biol. Chem. 267:19780-4 ；Kefalides, N.A. et al., 1993, Kidney Int. 43:94-100 ；Netzer, K.O. et al., 1999, J. Biol. Chem. 274:11267-74）。最近、組換えキメラ構築物を用いて、α３（ＩＶ）ＮＣｌのＮ末端のみに対する自己抗体の反応性が腎臓生存率と相関していることが報告された（Hellmark, T. et al., 1999, Kidney Int. 55:936-44）。Ｎ末端部分の最初の４０個のアミノ酸に対する疾患関連エピトープも同定された。グッドパスチャー症候群のエピトープを除去するために、Ｎ末端の５３個のアミノ酸残基を欠損する切形型タムスタチンが合成されたが、この分子は、マウス異種移植片モデルにおいて７８６−Ｏ腫瘍成長に対して阻害作用を示す。また、この分子は、グッドパスチャー症候群の重症患者の自己抗体には結合しなかった。これらの結果から、タムスタチンの抗血管形成領域は、Ｎ末端の５３個のアミノ酸が除去されても保存されることがわかる。
【００２３】
タムスタチンにより内皮細胞増殖が特異的に阻害されることから、タムスタチンは細胞表面タンパク質／受容体を介して機能する可能性があることが強く示唆される。血管形成は、インテグリンａｖｂ３が介在する特異的内皮細胞付着事象にも依存している（Brooks, P.C. et al., 1994, Cell 79:1157-64）。タムスタチンは、増殖中の内皮細胞とマトリックス成分の相互作用を破壊する可能性があるため、内皮細胞をアポトーシスに導く可能性がある（Re, F. et al., 1994, J. Cell. Biol. 127:537-46）。マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）は、腫瘍中の新たな血管の形成を調節する重要酵素であると推定されている（Ray, J.M. et al., 1994; Eur. Respir. J. 7:2062-72 ）。最近、ＭＭＰ−２のインヒビター（ＰＥＸ）が、血管形成を阻害することにより、腫瘍成長を抑制し得ることが証明された（Brooks, P.C. et al., Cell 92:391-400）。タムスタチンは、ＭＭＰの活性を阻害することにより機能する可能性がある。
【００２４】
タムスタチンは、インビトロおよびインビボにおける血管形成を阻害して、腫瘍進行の抑制をもたらす。この方式を患者に適用するためには、全身投与による潜在的毒性または副作用も考慮しなければならない。タムスタチンの分布が限定されていて、皮膚基底膜中にはほとんど存在しないことから、タムスタチン治療による副作用の可能性は低いことが示唆される。また、腎臓などの一部臓器の血管基底膜中にタムスタチンが存在することから、一部臓器で発生する腫瘍のターゲティングにおいて、独自の利点を示し得ることが示唆される。究極的には、遺伝子導入法を用いて、腫瘍血管系においてインビボでタムスタチン遺伝子を発現させる代替方式を開発することが望ましい（Kashihara, N. et al., 1997, Exp. Nephrol. 5:126-31；Maeshima, Y. et al., 1996, J. Am. Soc. Nephrol. 7:2219-29 ；Maeshima, T. et al., 1998, J. Clin. Invest. 101:2589-97 ）。
【００２５】
α３（ＩＶ）鎖の分布は一部臓器の基底膜に限定されているため、α鎖の集合を阻害することにタムスタチン分子が示し得る機構を考慮すれば、タムスタチンの有害性は低い可能性が高い。さらに、α３（ＩＶ）鎖は、腎臓の血管基底膜中にも認められ（Kalluri, R. et al., 1997, J. Clin. Invest. 99:2470-8）、これらの血管は腎細胞癌などの原発性腎腫瘍の進行に関与していると考えられる。したがって、タムスタチンは、α３（ＩＶ）鎖と他のα鎖の集合を破壊することにより、上記腫瘍の治療に有効である可能性がある。
【００２６】
本明細書で使用する場合、「血管形成」という用語は、１つの組織または臓器中に新たな血管が生成することを意味し、内皮細胞増殖を包含する。通常の生理条件下では、ヒトや動物は、非常に特異的な限定された状況においてのみ血管形成を受ける。たとえば、血管形成は通常、創傷治癒、胎児および胚の発育、および黄体、子宮内膜および胎盤の形成において認められる。「内皮」という用語は、漿液腔、リンパ管、および血管の内側を構成する平坦上皮細胞の薄層を意味する。したがって、「抗血管形成活性」とは、ある組成物が血管の成長を阻害する能力をいう。血管の成長は複雑な一連の事象であり、それぞれの内皮細胞の下にある基底膜の局所的分解、これらの細胞の増殖、将来血管となる場所への該細胞の移動、新たな血管膜を形成するための該細胞の再構成、内皮細胞増殖の停止、および血管周囲細胞およびその他の新たな血管壁を支持する細胞の取り込みを包含する。したがって、本明細書で使用する場合、「抗血管形成活性」とは、これらの段階の一部または全体が阻害されることで、最終的に新たな血管の形成が阻害されることを包含する。
【００２７】
抗血管形成活性には、一般的には、ある組成物が血管形成を阻害する能力、たとえば、線維芽細胞成長因子、血管形成関連因子、またはその他の公知の成長因子の存在下で、培養ウシ毛細血管内皮細胞の成長または移動を阻害する能力をいう内皮阻害活性を包含する。「成長因子」は、細胞の成長、再生、または合成活性を刺激する組成物である。「血管形成関連因子」は、血管形成を阻害するか促進する因子である。血管形成関連因子の具体例としては、血管形成促進剤である塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの血管形成成長因子が挙げられる。血管形成関連因子のもう１つの具体例としては、たとえばアンジオスタチン（たとえば米国特許第５，８０１，０１２号、米国特許第５，８３７，６８２号、米国特許第５，７３３，８７６号、米国特許第５，７７６，７０４号、米国特許第５，６３９，７２５号、米国特許第５，７９２，８４５号、ＷＯ９６／３５７７４、ＷＯ９５／２９２４２、ＷＯ９６／４１１９４、ＷＯ９７／２３５００参照）またはエンドスタチン（たとえばＷＯ９７／１５６６６参照) などの血管形成阻害因子が挙げられる。
【００２８】
「実質的に同一の生理活性」または「実質的に同一またはそれ以上の生理活性」とは、常法のアッセイで測定した場合に、ある組成物が抗血管形成活性を有し、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンと同様の挙動を示すことを意味する。「常法のアッセイ」としては、分子生物学分野において、抗血管形成活性、細胞周期停止、およびアポトーシスを評価する目的に使用されるプロトコルが挙げられるが、これらに限定されない。かかるアッセイとしては、内皮細胞増殖、内皮細胞移動、細胞周期解析、および内皮細胞管形成のアッセイ、たとえばアポトーシス細胞形態またはアネキシンＶ−ＦＩＴＣアッセイによるアポトーシスの検出、漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイ、およびヌードマウスにおける腎癌腫瘍成長の阻害が挙げられるが、これらに限定されない。かかるアッセイを、下記実施例に示す。
【００２９】
「アレステン」は、本明細書において「アレスチン」ともいうが、アレステン配列ならびに他の哺乳類に由来するアレステンのアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにアレステンアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「カンスタチン」は、カンスタチン配列ならびに他の哺乳類に由来するカンスタチンのアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにカンスタチンアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「タムスタチン」は、タムスタチン配列ならびに他の哺乳類に由来するタムスタチンのアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにタムスタチンアミノ酸配列のフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を包含するものとする。
【００３２】
本発明は、内皮阻害活性（たとえばある組成物が一般的に血管形成を阻害する能力、たとえば線維芽細胞成長因子、血管形成関連因子、またはその他の公知の成長因子の存在下で、培養ウシ毛細血管内皮細胞の成長または移動を阻害する能力）を有するアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのあらゆる誘導体を包含するものと解する。本発明は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質全体、これらのタンパク質の誘導体およびこれらのタンパク質の生理活性フラグメントを包含する。これらのものには、アミノ酸置換を有するか、糖またはその他の分子がアミノ酸官能基に付着したものを有するアレステン、カンスタチンまたはタムスタチン活性のあるタンパク質が含まれる。
【００３３】
本発明は、アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンのフラグメント、変異体、ホモログおよびアナログについても説明する。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「フラグメント」は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドの少なくとも２５個の連続アミノ酸から成るアレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子より短いアミノ酸配列である。かかる分子は、たとえば全長または部分リンカー配列に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列など、クローン化の過程から得られた追加アミノ酸をさらに含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。本発明の範囲に含まれるためには、かかる変異体は、上記追加アミノ酸残基の有無に関わらず、参照ポリペプチドの天然型または全長型と実質的に同一の生理活性を有するものでなければならない。
【００３４】
かかるフラグメントの１つである「タムスタチンＮ−５３」と呼ばれるフラグメントは、常法のアッセイによって測定した場合、全長タムスタチンと同等の抗血管形成活性を有することが判明した。タムスタチンＮ−５３は、Ｎ末端の５３個のアミノ酸が欠失しているタムスタチン分子から成る。本明細書で説明するその他の変異体フラグメントは、本明細書で説明するアッセイによって示されるように、非常に高いレベルの抗血管形成活性を有することが判明している。これらのフラグメント、すなわち「タムスタチン３３３」、「タムスタチン３３４」、「１２ｋＤａアレステンフラグメント」、「８ｋＤａアレステンフラグメント」、および「１０ｋＤａカンスタチンフラグメント」は、それぞれ７５ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、および８０ｎｇ／ｍｌのＥＤ50値を有する。一方、全長アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンは、それぞれ４００ｎｇ／ｍｌ、４００ｎｇ／ｍｌ、および５５０ｎｇ／ｍｌのＥＤ50値を有することが判明した。タムスタチン３３３は配列番号：１０のアミノ酸２位〜１２５位より成り、タムスタチン３３４は配列番号：１０のアミノ酸１２６位〜２４５位より成る。
【００３５】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「変異体」とは、同等の参照アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドのアミノ酸配列に近縁のアミノ酸配列の変化を有するポリペプチドを意味する。かかる変化は、自然的に、または人為的操作によるか、化学エネルギー（たとえばＸ線）によるか、その他の形の化学的突然変異誘発によるか、遺伝子工学によるか、交配またはその他の形の遺伝情報の交換の結果として起こり得る。突然変異としては、たとえば塩基変化、欠失、挿入、逆位、転位、または重複が挙げられる。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの変異体型は、同等の参照アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドに対して抗血管形成活性が増大または減少している場合があり、かかる変異体は、たとえば全体または部分リンカー配列に対応するアミノ酸残基またはアミノ酸配列など、クローン化の過程から得られる追加アミノ酸を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。
【００３６】
本発明の抗血管形成タンパク質の変異体／フラグメントは、ＰＣＲクローン化によって生成させることができる。下記実施例１８で説明され、Ｆｉｇ．２３および２４に示されるように、「タムスタチン３３３」および「タムスタチン３３４」と呼ばれるフラグメントをこのようにして生成させたところ、全長タムスタチンより優れた抗血管形成活性を有することがわかった。かかるフラグメントを作製するためには、ＰＣＲプライマーを、各セットのプライマーがタンパク質全体から公知サブ配列を増幅させるようなやり方で、公知配列から設計される。次いで、これらのサブ配列を、ｐＥＴ２２ｂベクターなどの適当な発現ベクターにクローン化し、発現タンパク質の抗血管形成活性を、下記アッセイで説明されているように試験する。
【００３７】
本発明の抗血管形成タンパク質の変異体／フラグメントは、Mariyama, M.ら、(1992, J. Biol. Chem. 267:1253-8）によって記載され、下記実施例２４で説明されているようにして、シュードモナス（Pseudomonas・）エラスターゼ消化によって生成させることもできる。この方法を用いて、１２ｋＤａおよび８ｋＤａアレスチン変異体、および１０ｋＤａカンスタチン変異体を製造したが、これら３つのものはいずれも、元の全長タンパク質よりも高いレベルの抗血管形成活性を有する。
【００３８】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「アナログ」とは、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子全体またはそのフラグメントもしくは対立遺伝子変異体のいずれかと実質的に同様の天然に存在しない分子であって、実質的に同一またはそれ以上の生理活性を有する分子を意味する。かかるアナログは、生理活性アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン、ならびにそのフラグメント、変異体、ホモログ、および対立遺伝子変異体の誘導体（たとえば上記に定義される化学誘導体）であって、未修飾のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチド、フラグメント、変異体、ホモログ、または対立遺伝子変異体と定性的に同様のアゴニストまたはアンタゴニスト効果を示す誘導体を包含するものとする。
【００３９】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンの「対立遺伝子」とは、参照アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドのポリペプチド配列に対する天然配列変異を含有するポリペプチド配列を意味する。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの「対立遺伝子」とは、参照アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド配列に対する配列変異を含有するポリヌクレオチド配列であって、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの対立遺伝子変異体が対立遺伝子型のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を意味する。
【００４０】
特定のポリペプチドが、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのフラグメント、変異体、アナログ、または対立遺伝子変異体のいずれか１つのものであってもよいし、これらのものの２つ以上であってもよく、たとえば１つのポリペプチドはアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンポリペプチドのアナログかつ変異体であってもよい。たとえば、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子の短縮型（たとえばアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのフラグメント）を、実験室内で作製することができる。次いで、そのフラグメントを、当該分野において公知の手段により突然変異誘発させると、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンのフラグメントかつ変異体である分子が作製される。別の具体例では、後で一部の哺乳類個体中で対立遺伝子型のアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンとして存在することが明らかになる変異体を作製することができる。したがって、かかる変異体アレステン、カンスタチンまたはタムスタチン分子は、変異体かつ対立遺伝子変異体である。フラグメント、変異体、対立遺伝子変異体、およびアナログのかかる組み合わせは、本発明の範囲に包含されるものとする。
【００４１】
たとえば、下記実施例１８で説明する大腸菌発現クローン化法によって作製されたタムスタチンは単量体である。大腸菌発現クローン化法は、天然のタンパク質中には存在しないポリリンカー配列とヒスチジンタグを発現タンパク質に付加するため、このものは融合またはキメラタンパク質でもある。やはり実施例１８で説明するタムスタチンフラグメント「タムスタチンＮ−５３」は、全長タムスタチンタンパク質のフラグメントかつ欠失変異体であり、同じ大腸菌発現クローン化法によって作製すると、やはり追加配列が付加されるので、このものも全長タムスタチンタンパク質の融合またはキメラ変異体フラグメントである。このタムスタチンＮ−５３のサブユニットを、たとえば二量体や三量体などへと一体化させると、タムスタチンタンパク質のキメラ変異体フラグメントの多量体状融合体が生じる。
【００４２】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質、またはアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードするポリヌクレオチドと実質的に同一の核酸配列を有するポリヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。「実質的に同一の配列」とは、たとえば別の核酸またはポリペプチドなどの参照配列と少なくとも約７０％の配列相同性、通常は参照配列と少なくとも約８０％の配列相同性、好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性、最も好ましくは参照配列と少なくとも約９７％の配列相同性を示す核酸またはポリペプチドを意味する。配列の比較長は、通常、少なくともヌクレオチド塩基７５個またはアミノ酸２５個分、より好ましくは少なくともヌクレオチド塩基１５０個またはアミノ酸５０個分、最も好ましくはヌクレオチド塩基２４３〜２６４個またはアミノ酸８１〜８８個分である。本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」とは、アミノ酸の分子鎖を表し、特定の長さの産物をいうのではない。すなわち、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、たとえば糖化、アセチル化、リン酸化などの発現後修飾をすでに受けているポリペプチドも包含するものとする。
【００４３】
本明細書で使用する場合、「配列相同性」とは、たとえば２個のポリヌクレオチドまたは２個のポリペプチドなど２個のポリマー状分子どうしのサブユニット配列類似性をいう。たとえば２個のペプチドのそれぞれにおける位置がセリンによって占拠されている場合、２個の分子の両者におけるサブユニット位置が同一の単量体状サブユニットによって占拠されると、これらのものはその位置において相同になる。２個の配列どうしの相同性は、マッチングする位置すなわち相同の位置の数に正比例し、たとえば２個のペプチドまたは化合物配列中の位置の半数（たとえばサブユニット１０個分の長さのポリマーにおける５つの位置）が相同である場合、２個の配列は５０％相同であり、たとえば１０個のうちの９個など位置数の９０％がマッチすると、２個の配列は９０％の配列相同性があることになる。例示すると、アミノ酸配列Ｒ2 Ｒ5 Ｒ7Ｒ10Ｒ6 Ｒ3 とＲ9Ｒ8 Ｒ1 Ｒ10Ｒ6Ｒ3 は６つの位置のうちの３つを共有しているので、５０％の配列相同性があり、配列Ｒ2 Ｒ5 Ｒ7Ｒ10Ｒ6 Ｒ3 とＲ8Ｒ1 Ｒ10Ｒ6 Ｒ3は５つの位置のうちの３つを共有しているので、６０％の配列相同性がある。２個の配列どうしの相同性は、マッチングする位置すなわち相同の位置の数に正比例する。したがって、参照配列の一部が特定のペプチドを欠失すると、その欠失箇所は配列相同性の計算を行う目的のためには算定されず、たとえば、Ｒ2 Ｒ5 Ｒ7Ｒ10Ｒ6 Ｒ3 とＲ2Ｒ5 Ｒ7 Ｒ10Ｒ3は６つの位置のうちの５つを共有しているので、８３．３％の配列相同性がある。
【００４４】
相同性は、たとえばＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＰ（http: ／／www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ から入手可能）などの配列解析ソフトウエアを用いて測定されることが多い。ＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列用）によって２個の配列を比較（たとえば２個の配列を互いに対して「ブラスト（Blasting）」処理する、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html)するためのデフォールトパラメーターは、マッチリウォード＝１、ミスマッチペナルティー＝−２、オープンギャップ＝５、伸長ギャップ＝２である。タンパク質配列用のＢＬＡＳＴＰを用いる場合のデフォールトパラメーターは、マッチリウォード＝０、ミスマッチペナルティー＝０、オープンギャップ＝１１、および伸長ギャップ＝１である。
【００４５】
２個の配列に「配列相補性」がある場合、該２個の配列は、保存的置換のみによって互いに異なることを意味する。ポリペプチド配列の場合、かかる保存的置換は、配列中の特定位置における１個のアミノ酸が同じクラスの別のアミノ酸（たとえばバリンがロイシンに、アルギニンがリジンに置換するなど、疎水性、電荷、ｐＫまたはその他の立体配置的または化学的性質の特性を共有するアミノ酸）に置換しているものから成る。または、ポリペプチドの生理活性が破壊される程度に該ポリペプチドの立体配置または折りたたみを変化させることはない配列の位置における１つ以上の非保存的アミノ酸置換、欠失、または挿入によって異なるものである。「保存的置換」の具体例としては、ポリペプチドが必須の生理活性を示すという条件の下に、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの非極性（疎水性）残基が別のものに置換しているもの；アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、トレオニンとセリンの間などの１つの極性（親水性）残基が別のものに置換しているもの；リジン、アルギニンまたはヒスチジンなどの１つの塩基性残基が別のものに置換しているもの；またはアスパラギン酸またはグルタミン酸などの１つの酸性残基が別のものに置換しているもの；または非誘導体化残基の代わりに化学誘導体化残基を使用するものが挙げられる。配列相補性を有する２個の配列は、「配列ホモログ」と呼ばれることがある。
【００４６】
ポリペプチドの相補性は、通常、配列解析ソフトウエア（たとえばGenetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705の配列解析ソフトウエアパッケージ）を用いて測定される。タンパク質解析ソフトウエアは、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に対する相補性の程度を割り当てることにより、類似配列をマッチさせる。保存的置換は通常、下記グループ内の置換を含む。すなわち、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシンである。
【００４７】
アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンの化学誘導体も本発明の範囲に含まれる。「化学誘導体」とは、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する対象ポリペプチドをいう。かかる誘導体化残基としては、たとえば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子が挙げられる。遊離カルボキシル基を誘導体化させて、塩、メチルおよびエチルエステルまたはその他のタイプのエステルまたはヒドラジドを形成させてもよい。遊離水酸基を誘導体化させて、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成させてもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化させて、Ｎ−イムベンジルヒスチジンを形成させてもよい。化学誘導体には、２０種類の標準アミノ酸のうちの１つ以上の天然アミノ酸誘導体を含有するペプチドも含まれる。たとえば、４−ヒドロキシプロリンをプロリンに置換させてもよいし；５−ヒドロキシリジンをリジンに置換させてもよいし；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに置換させてもよいし；ホモセリンをセリンに置換させてもよいし；オルニチンをリジンに置換させてもよい。
【００４８】
本発明はまた、抗血管形成タンパク質、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体から成る融合タンパク質およびキメラタンパク質も包含する。融合またはキメラタンパク質は、組換え発現とクローニング過程によって製造することができ、たとえば全長または部分リンカー配列に対応する追加のアミノ酸またはアミノ酸配列から成るタンパク質を製造することができ、たとえば本発明のアレステンを大腸菌中で製造したもの（下記実施例２参照）は、ヒスチジンタグを含む追加ベクター配列がタンパク質に付加されている。本明細書で使用する場合、「融合またはキメラタンパク質」とは、元のタンパク質配列に対するこのタイプの変化を包含するものとする。同様の変化が、カンスタチンおよびタムスタチンタンパク質に対しても作製された（それぞれ実施例１１および１８）。融合またはキメラタンパク質は、単一のタンパク質の多量体から成ることができ、たとえば抗血管形成タンパク質または融合およびキメラタンパク質の反復単位は、数個のタンパク質、たとえば該抗血管形成タンパク質の数個のものでできていてもよい。該融合またはキメラタンパク質は、２つ以上の公知の抗血管形成タンパク質（たとえばアンジオスタチンとエンドスタチン、またはアンジオスタチンとエンドスタチンの生理活性フラグメント）を組み合わせたもの、または１つの抗血管形成タンパク質とターゲティング剤を組み合わせたもの（たとえばエンドスタチンと上皮成長因子（ＥＧＦ) またはＲＧＤペプチド）、または１つの抗血管形成タンパク質と免疫グロブリン分子を組み合わせたもの（たとえばエンドスタチンとＩｇＧ、とくにＦｃ部分を除去したＩｇＧ）から成ることができる。融合およびキメラタンパク質は、抗血管形成タンパク質、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログ、および対立遺伝子変異体、ならびにその他の抗血管形成タンパク質、たとえばエンドスタチンまたはアンジオスタチンを含むこともできる。その他の抗血管形成タンパク質には、レスチン（restin）およびアポミグレン（apomigren・）（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２６０５８、この文献の教示は参照により本明細書に含まれる）およびエンドスタチンのフラグメント（ＰＣＴ／ＵＳ９８／２６０５７、この文献の教示は参照により本明細書に含まれる）も含まれ得る。本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」または「キメラタンパク質」とは、たとえば化学療法剤をコードするポリヌクレオチドが抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドに連結されている化学療法剤を送達するための追加成分を包含する場合もあり得る。融合またはキメラタンパク質は、たとえば二量体や三量体など抗血管形成タンパク質の多量体を包含する場合もあり得る。かかる融合またはキメラタンパク質は、翻訳後修飾を介して連結（たとえば化学連結）させることができるが、融合タンパク質全体を組換え法により製造してもよい。
【００４９】
アレステン、カンスタチン、タムスタチン、それらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体から成る多量体状タンパク質も本発明の範囲に含まれるものとする。「多量体」とは、サブユニットタンパク質の２つ以上のコピーから成るタンパク質を意味する。該サブユニットタンパク質は、本発明のタンパク質の１つであってよく、たとえばアレステンが２回以上反復されているもの、またはたとえばタムスタチン３３３などのタムスタチン変異体またはフラグメントなどのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログまたは対立遺伝子変異体が２回以上反復されているものであってよい。かかる多量体は、融合またはキメラタンパク質であってもよく、たとえば反復タムスタチン変異体を、単一コピー中に存在していてもよいポリリンカー配列、および／または１つ以上の抗血管形成ペプチドと組み合わせてもよく、あるいはタンデム反復されていてもよく、たとえば１つのタンパク質がタンパク質全体内の２つ以上の多量体から成るものであってもよい。
【００５０】
本発明は、アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードする１つ以上の単離ポリヌクレオチドから成る組成物、ならびにかかるポリヌクレオチドを含有するベクターおよび宿主細胞、ならびにアレステン、カンスタチンおよびタムスタチン、およびそれらのフラグメント、変異体、ホモログ、アナログおよび対立遺伝子変異体を製造するための方法も包含する。本明細書で使用する場合、「ベクター」という用語は、核酸の断片（pieces）が挿入またはクローン化されていてもよい担体であって、該核酸の断片を宿主細胞中に導入する機能を示す担体を意味する。かかるベクターは、導入される核酸断片の複製および／または発現をもたらしてもよい。ベクターの具体例としては、たとえばプラスミド、バクテリオファージ、または哺乳類、植物または昆虫ウイルス、またはリガンド−核酸コンジュゲート、リポソーム、または脂質−核酸複合体などの非ウイルスベクターに由来する核酸分子が挙げられる。導入される核分子は、発現制御配列に作動可能に連結されて、該導入核酸を発現し得る発現ベクターを形成させることが望ましい。核酸のかかる導入は一般に「形質転換」と呼ばれ、挿入に用いられる方法の如何に関わらず、宿主細胞に外来ポリヌクレオチドが挿入されることをいう。たとえば、直接取り込み、トランスダクションまたはｆ交配が含まれる。外来ポリヌクレオチドは、たとえばプラスミドなどの非統合ベクターとして維持することができるが、あるいは、宿主ゲノム中に統合させてもよい。「作動可能に連結される」とは、上記成分が、意図的なやり方で機能させられる関係にある状況をいい、たとえばコード配列に対して「作動可能に連結された」制御配列を、該コード配列の発現が制御配列にふさわしい条件化で行われるようなやり方でライゲーションさせる。「コード配列」は、適当な調節配列の制御化に置かれると（たとえば作動可能に連結されると）、ｍＲＮＡに転写されてポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンと３’末端の翻訳終止コドンによって決定されている。かかる境界は天然に生じることができるが、当該分野において公知の方法によりポリヌクレオチド配列に導入または付加させることもできる。コード配列としては、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチド配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００５１】
クローン化ポリヌクレオチドがクローン化されるベクターは、原核生物中で機能するという理由で選ぶことができるが、真核生物中で機能するという理由で選んでもよい。アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンタンパク質をコードするポリヌクレオチドのクローン化と、該ポリヌクレオチドからのこれらのタンパク質の発現の両者が可能なベクターの２つの具体例として、それぞれ細菌および酵母におけるタンパク質の発現が可能なｐＥＴ２２ｂおよびｐＥＴ２８（ａ）ベクター（Novagen, Madison, Wisconsin, USA）および修飾ｐＰＩＣＺαＡベクター（In Vitrogen, San Diego, California, USA ）が挙げられる。（たとえばＰＣＴ／ＵＳ９８／２５８９２参照、この文献の教示は参照により本明細書に含まれる）。
【００５２】
ポリヌクレオチドが適当なベクターにクローン化されたならば、適当な宿主細胞に形質転換させることができる。「宿主細胞」とは、ベクターを介して導入核酸のレシピエントとしてすでに使用されているか、使用することができる細胞を意味する。宿主細胞は原核細胞または真核細胞、哺乳類、植物、または昆虫であることができ、単細胞として、またはたとえば培養物としてのコレクションとして、または組織培養状態で、または組織もしくは生物体中に存在することができる。宿主細胞は、たとえば哺乳類などの多細胞生物の正常または疾患組織から得ることもできる。本明細書で使用する場合、宿主細胞とは、核酸で形質転換された元の細胞のみならず、該核酸を依然として含有しているかかる細胞の子孫をも含むものとする。
【００５３】
１つの態様においては、抗血管形成タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチドは、ペプチドをコードするポリヌクレオチドリンカーをさらに含む。かかるリンカーは当業者にとって公知であり、たとえば該リンカーは、少なくとも１つの追加アミノ酸をコードする少なくとも１つの追加コドンを含むことができる。通常、該リンカーは、１個から２０個または３０個のアミノ酸から成る。ポリヌクレオチドリンカーは、抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドと同様に翻訳され、その結果、少なくとも１つの追加アミノ酸残基を抗血管形成タンパク質のアミノまたはカルボキシル末端に有する抗血管形成タンパク質の発現が起きる。該単数または複数の追加アミノ酸は、該抗血管形成タンパク質の活性を低下させないことが重要である。
【００５４】
ポリヌクレオチドを選んでベクターに挿入した後、ベクターを、適切な原核生物系に形質転換させ、その系を、該生理活性抗血管形成タンパク質の製造に適した培養条件下で培養する（たとえば継代する) ことにより、生理活性抗血管形成タンパク質、またはその変異体、誘導体、フラグメントまたは融合タンパク質を製造する。１つの態様においては、本発明は、抗血管形成タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ１７ｂまたはｐＥＴ２８ａにクローン化させ、次いでこれらのベクターを細菌に形質転換させる工程を含む。細菌宿主系は、その後、該抗血管形成タンパク質を発現する。通常、抗血管形成タンパク質は、培養液１リットルあたり約１０〜２０ミリグラム以上の量で産生される。
【００５５】
本発明の別の態様においては、真核細胞ベクターは修飾酵母ベクターから成る。１つの方法は、マルチプルクローン化部位を含有するｐＰＩＣｚαプラスミドを使用するものである。該マルチプルクローン化部位は、Ｈｉｓ．タグモチーフをマルチプルクローン化部位に挿入している。さらに、ベクターは、ＮｄｅＩ部位またはその他の適切な制限部位を付加するように修飾することができる。かかる部位は、当業者にとって公知である。本態様によって製造される抗血管形成タンパク質は、１個以上のヒスチジン、通常は約５〜２０個のヒスチジンから成るヒスチジンタグモチーフ（Ｈｉｓ．タグ）を含む。該タグは、該タンパク質の抗血管形成性を阻害するものであってはならない。
【００５６】
たとえばアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンを製造する１つの方法は、それぞれ配列番号：１、配列番号：５、または配列番号：９のポリヌクレオチドを増幅させ、それを、たとえばｐＥＴ２２ｂ、ｐＥＴ２８（ａ）、ｐＰＩＣＺαＡ、またはその他の発現ベクターにクローン化させ、該ポリヌクレオチドを含有する該ベクターを、該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを発現し得る宿主細胞に形質転換させ、該形質転換宿主細胞を、該タンパク質の発現に適した培養条件下で培養し、次いで、該タンパク質を培養物から抽出および精製するものである。一般的には抗血管形成タンパク質、具体的にはアレステン、カンスタチンおよびタムスタチンを製造する代表的方法を、下記実施例に示す。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質は、たとえばトランスジェニックの雌性ウシ、ヤギ、ヒツジまたはブタの乳汁の成分としてなどトランスジェニック動物の産物として、またはたとえばトウモロコシ中のデンプン分子と化合または連結させたトランスジェニック植物の産物として、発現させてもよい。
【００５７】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンは、従来の公知の化学合成法によって製造してもよい。合成手段により本発明のタンパク質を構築する方法は、当業者にとって公知である。合成的に構築されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質配列は、たとえば組換え的に製造されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンと、一次、二次または三次構造特性および／または立体配置特性を共有させるために、生理活性を含む生物学的性質をそれらのものと共通的に保持してもよい。すなわち、合成的に構築されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質配列は、たとえば治療用化合物のスクリーニングにおいて、および抗体生成のための免疫学的プロセスにおいて、組換え的に製造され精製されたアレステン、カンスタチンまたはタムスタチンタンパク質に対する生理活性または免疫学的置換物として用いてもよい。
【００５８】
アレステン、カンスタチンおよびタムスタチンタンパク質は、常法のアッセイにおいて下記実施例に示されるようにして測定される抗血管形成を阻害する上で有用である。アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンは、たとえば内皮細胞以外の細胞など、他の細胞型の成長を阻害しない。
【００５９】
アレステン、カンスタチンまたはタムスタチンをコードするポリヌクレオチドは、単離ＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーからクローン化することができる。本明細書で「単離」と称される核酸ポリペプチドは、それらが得られた生物学的供給源の物質（たとえば核酸の混合物中または細胞中に存在するもの）を実質的に含まない（すなわち完全に分離されている）核酸またはポリペプチドであり、さらにプロセシングを受けていてもよい。「単離」核酸またはポリペプチドとしては、本明細書で説明する方法、類似の方法、またはその他の適切な方法によって得られる核酸またはポリペプチドが挙げられ、実質的に純粋な核酸またはポリペプチド、化学合成によって製造された核酸またはポリペプチド、化学的または生物学的方法を組み合わせたものによって製造された核酸またはポリペプチド、および組換え法によって製造された核酸またはポリペプチドが単離されたものが含まれる。したがって、単離されたポリペプチドとは、通常は関連している他のタンパク質、炭水化物、脂質、およびその他の細胞成分を比較的含んでいないものを意味する。単離された核酸は、該核酸の由来元である生物の天然ゲノム中で直接連続している核酸の両者と直接連続（すなわち共有結合）していない。したがって、該用語は、たとえばベクター（たとえば自己複製ウイルスまたはプラスミド）に組み込まれている核酸、または化学的手段または制限エンドヌクレアーゼ処理によって製造された核酸フラグメントなど、他の核酸とは独立している別の分子として存在する核酸を包含する。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質は、他の抗血管形成タンパク質を単離するためのプローブを設計する目的に用いることもできる。特殊な方法が、ジェイコブスら（Jacobs et al. ）の米国特許第５，８３７, ４９０号に示されているが、この文献の教示全体は参照によりすべて本明細書に含まれる。オリゴヌクレオチドプローブの設計は、以下の項目に従うことが好ましい。すなわち、（ａ）プローブは、塩基が存在する場合は、最少数のアンビギュアス（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）塩基（「Ｎ」）を有する配列のエリアに対して設計されなければならない。また、（ｂ）プローブは、約８０℃（各ＡまたはＴについては２℃、各ＧまたはＣについては４度を想定）のＴｍを有するように設計されなければならない。
【００６１】
オリゴヌクレオチドは、通常のオリゴヌクレオチド標識技術を用いて、ｇ−32Ｐ−ＡＴＰ（比活性６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）とＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識されることが好ましい。他の標識技術を用いることもできる。取り込まれなかった標識体は、ゲル濾過クロマトグラフィーまたはその他の確立された方法によって除去されることが好ましい。プローブに取り込まれた放射活性の量は、シンチレーションカウンターにおける測定によって定量されなければならない。生じたプローブの比活性は、約４ｘ１０6 ｄｐｍ／ｐｍｏｌｅであることが好ましい。全長クローンのプールを含有する細菌培養物を融解させ、１００μｌの原液を用いて、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２５ｍｌの滅菌Ｌブロスを入れた滅菌培養フラスコに接種することが好ましい。培養物は、３７℃で飽和になるまで培養することが好ましく、飽和培養物は、新鮮Ｌブロスで希釈することが好ましい。これらの希釈物の一定量を平板培養に付して、３７℃で一夜培養したときに、１５０ｍｍペトリ皿中で１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと１．５％の寒天を含有するＬブロスを含む固形細菌培地上で約５０００個の明瞭でよく分離されたコロニーを生じる希釈度と容量を求めることが好ましい。明瞭でよく分離されたコロニーを得る他の公知方法を用いることもできる。
【００６２】
次いで、コロニーハイブリダイゼーションの常法手順を用いて、コロニーをニトロセルロースフィルターに移し、溶菌、変性および加熱しなければならない。高度ストリンジェント条件とは、たとえば６５℃で１ｘＳＳＣ、または４２℃で１ｘＳＳＣと５０％ホルムアミドで処理するのと少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。中等度ストリンジェント条件とは、６５℃で４ｘＳＳＣ、または４２℃で４ｘＳＳＣと５０％ホルムアミドで処理するのと少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。低度ストリンジェント条件とは、５０℃で４ｘＳＳＣ、または４０℃で６ｘＳＳＣと５０％ホルムアミドで処理するのと少なくとも同程度にストリンジェントな条件をいう。
【００６３】
次いで、フィルターを、０．５％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌの酵母ＲＮＡ、および１０ｍＭのＥＤＴＡを含有する６倍ＳＳＣ（２０ｘ原液は、１リットルあたり１７５．３ｇのＮａＣｌ、１リットルあたり８８．２ｇのクエン酸ＮａをＮａＯＨでｐＨ７．０に調整したもの）（１５０ｍｍフィルター１枚あたり約１０ｍＬ）中でゆっくり撹拌しながら、６５℃で１時間保温することが好ましい。次いで、プローブを、１ｘ１０6 ｄｐｍ／ｍＬより大きいか同等な濃度で、ハイブリダイゼーション混合物に添加することが好ましい。次いで、フィルターを、ゆっくり撹拌しながら６５℃で一夜保温することが好ましい。次いで、フィルターを、撹拌しないで室温で、５００ｍＬの２ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳ中で洗浄することが好ましく、さらに続いて、室温で振盪しながら、５００ｍＬの２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で１５分間にわたり洗浄することが好ましい。６５℃で０．１ｘＳＳＣ／０．５％ＳＤＳによる３回目の洗浄を３０分間から１時間にわたり行ってもよい。次いで、フィルターを乾燥させ、Ｘ線フィルム上で陽性物を可視化させるのに十分な時間にわたりオートラジオグラフィーに付すことが好ましい。他の公知のハイブリダイゼーション法を用いることもできる。次いで、陽性クローンを釣菌し、培養し、常法を用いてプラスミドＤＮＡを単離する。次いで、クローンを、制限酵素解析、ハイブリダイゼーション解析、またはＤＮＡ配列決定法によって確認することができる。
【００６４】
本発明は、アレステン、カンスタチン、タムスタチンまたはそれらの生理活性フラグメント、アナログ、ホモログ、誘導体または変異体を用いて、哺乳類組織における血管形成を阻害する方法を含む。さらに具体的には、本発明は、血管形成関与疾患を、１つ以上の抗血管形成タンパク質またはそれらの１つ以上の生理活性フラグメント、または抗血管形成活性を有するフラグメントを組み合わせたもの、またはアゴニストおよびアンタゴニストの有効量で治療する方法を含む。抗血管形成タンパク質の有効量とは、疾患または病態を生ぜしめる血管形成を阻害することで、該疾患または病態を完全にまたは部分的に改善させるのに十分な量である。血管形成関与疾患の改善は、たとえば腫瘍のサイズの減少または腫瘍成長停止など、疾患の症状の改善を観察することによって、判定することができる。本明細書で使用する場合、「有効量」という用語は、患者にとって有意義な利益、すなわち関連する医学的状態の治療、治癒、予防または軽減、またはかかる状態の治療、治癒、予防または軽減の速度の増大を示すのに十分な組成物または方法の各有効成分の合計量を意味することもある。１つの組み合わせに対して適用される場合、該用語は、併用的、連続的、または同時的に投与されるかに関わらず、該治療効果をもたらす有効成分の合計量をいう。血管形成関与疾患としては、癌、充実性腫瘍、血液性腫瘍（たとえば白血病）、腫瘍転移、良性腫瘍（たとえば血管腫、聴覚神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫）、慢性関節リウマチ、乾癬、眼血管形成疾患（たとえば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植拒絶、血管形成緑内障、水晶体後線維増殖、ルベオーシス）、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維種、および創傷肉芽形成が挙げられるが、これらに限定されない。抗血管形成タンパク質は、内皮細胞の過剰または異常刺激による疾患の治療に有用である。これらの疾患としては、腸管癒着、クローン病、動脈硬化、強皮症、および過形成性瘢痕（すなわちケロイド）が挙げられるが、これらに限定されない。抗血管形成タンパク質は、胚着床に必要な血管形成を予防することにより、産児制限剤として用いることができる。抗血管形成タンパク質は、ネコひっかき病〔ロケレ ミナリア クイントサ（Rochele minalia quintosa）〕や潰瘍（ヘリコバクター ピロリ）など病理的に血管形成を伴う疾患の治療に有用である。抗血管形成タンパク質は、たとえば脂肪組織における毛細血管形成を阻害することによりその肥大を予防することで、透析移植片血管アクセス狭窄（dialysis graft vascular access stenosis ）および肥満を予防する目的に用いることもできる。抗血管形成タンパク質は、局在化（たとえば転移していない）疾患を治療する目的に用いることもできる。「癌」とは、新生物成長、過形成性または増殖性成長または異常細胞発育の病理的状態を意味し、充実性腫瘍、非充実性腫瘍、および白血病で見られるものなどの異常細胞増殖を含む。本明細書で使用する場合、「癌」とは、血管形成依存性の癌および腫瘍、すなわち血液を供給する血管の数と密度の増大を、その成長（容積および／または質量の増大) に必要とする腫瘍も意味する。「後退」とは、当業者にとって公知の方法を用いて測定される腫瘍質量とサイズの減少をいう。
【００６５】
あるいは、たとえば創傷治癒において、または梗塞後心臓組織において、血管形成の増大が望まれる場合には、抗血管形成タンパク質に対する抗体または抗血清を用いて、局在化された天然の抗血管形成タンパク質およびプロセスをブロックすることで、新たな血管の形成を増大させ、組織の萎縮を阻害することができる。
【００６６】
抗血管形成タンパク質は、疾患治療のための他の組成物および手順と組み合わせて用いてもよい。たとえば、腫瘍は、従来通り、外科手術、放射線照射、化学療法、または免疫療法を抗血管形成タンパク質と組み合わせたもので治療してもよく、次いで、抗血管形成タンパク質を患者に投与して、微小転移の潜伏期間を延長させ、残留する原発性腫瘍の成長を安定化および阻害させてもよい。抗血管形成タンパク質、またはそれらのフラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、または受容体アンタゴニスト、またはそれらを組み合わせたものを、他の抗血管形成化合物、または他の抗血管形成タンパク質（たとえばアンジオスタチン、エンドスタチン）のタンパク質、フラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニストと組み合わせて用いることもできる。さらに、抗血管形成タンパク質、またはそれらのフラグメント、抗血清、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、またはそれらを組み合わせたものを、薬学的に許容される賦形剤、および任意には生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組み合わせて、治療用組成物を形成させる。本発明の組成物は、エンドスタチンまたはアンジオスタチン、およびそれらの変異体、フラグメント、およびアナログなど、他の抗血管形成タンパク質または化学化合物をさらに含んでいてもよい。該組成物は、化学療法剤や放射性剤など、該タンパク質の活性を強化するか、治療に際してその活性または用途を引き立たせる他剤をさらに含有していてもよい。かかる追加的因子および／または剤を該組成物に含有させて、本発明のタンパク質と相乗的効果を生じさせたり、副作用を極力抑えることができる。また、本発明の組成物の投与は、たとえば化学療法または放射線療法レジメンと組み合わせて投与するなど、他の療法と併用投与することができる。
【００６７】
本発明は、哺乳類組織における血管形成を、組織を本発明のタンパク質から成る組成物と接触させることにより、阻害する方法を含む。「接触させる」とは、局所施用のみならず、該組成物を該組織に、または該組織の細胞に導入する送達方式をも意味する。
【００６８】
遅放性送達系または徐放性送達系の使用も本発明に含まれる。かかる系は、たとえば年齢または疾患経過そのものにより衰弱している患者など外科手術が困難または不可能であったり、リスク・効果解析で治癒よりコントロールが求められる状況において、とくに望ましい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、徐放性マトリックスは、酵素的または酸／塩基加水分解によるか、溶解によって分解可能な、通常はポリマーである物質でできているマトリックスである。体内に挿入されたマトリックスは、酵素と体液によって作用させられる。徐放性マトリックスは、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド・コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）ポリ無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリタンパク質、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコンなどの生体適合性物質から選ばれることが望ましい。好ましい生分解性マトリックスとしては、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド・コグリコリド（乳酸とグリコール酸の共重合体）のいずれか１つのもののマトリックスが挙げられる。
【００７０】
本発明の血管形成調節組成物は、固体、液体またはエアゾルであってよく、公知の投与経路によって投与することができる。固体組成物の具体例としては、錠剤、クリーム剤、およびインプラント剤型が挙げられる。錠剤は経口的に投与することができ、治療用クリーム剤は局所的に投与することができる。インプラント剤型は、たとえば腫瘍部位において局所的に投与することができるが、血管形成調節組成物の全身放出を目的として、たとえば皮下的に留置してもよい。液体組成物の具体例としては、皮下、静脈内、動脈内注射用の処方、および局所投与および眼内投与用処方が挙げられる。エアゾル処方の具体例としては、肺への投与用の吸入処方が挙げられる。
【００７１】
上記抗血管形成活性を有するタンパク質およびタンパク質フラグメントは、当業者にとって公知の処方方法を用いて、薬学的に許容される処方として、単離され実質的に精製済みのタンパク質およびタンパク質フラグメントとして提供することができる。これらの処方は通常の経路によって投与することができる。一般に、該組成物は、局所、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳脊髄液内、脳内、腟内、子宮内、経口、直腸内または非経口的（たとえば静脈内、脊髄内、皮下または筋肉内）経路によって投与してよい。また、抗血管形成タンパク質は、該化合物を徐放させる生分解性ポリマーに取り込ませて、該ポリマーを、たとえば腫瘍の部位など、薬物送達が望まれる場所の付近にインプラントさせるか、抗血管形成タンパク質が全身的に徐々に放出されるようにインプラントしてもよい。浸透圧ミニポンプを用いて、カニューレを介して、高濃度の抗血管形成タンパク質を、転移体または腫瘍への血管系に直接送達させるなど、関心部位に制御送達させてもよい。生分解性ポリマーおよびそれらの用途については、たとえばBremら、（1991) (J. Neurosurg. 74:441-446 ）において詳細に説明されているが、この文献は参照により全て本明細書に含まれる。
【００７２】
本発明のポリペプチドを含有する組成物は、たとえば、単位用量の注射によるなどして、静脈内投与することができる。本発明の治療用組成物について使用する場合、「単位用量」という用語は、対象に対する単位投与量として適切である物理的に明確な単位をいい、各単位は、必要とされる希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと関連して所望の治療効果を発揮するように計算された所定量の有効成分を含有している。
【００７３】
本発明の組成物の投与方式としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、皮下および関節内注射ならびに輸液が挙げられる。非経口的注射用医薬組成物は、薬学的に許容される無菌の水性または非水性の溶液、分散液、懸濁液または乳液、ならびに使用直前に無菌の注射溶液または分散液に再構成される無菌粉末から成る。適切な水性および非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの具体例としては、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセリン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロースおよびその適当な混合物、植物油（たとえばオリーブ油) およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性を、たとえばレシチンなどの被覆物質の使用により、分散液の場合は、必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、維持してもよい。これらの組成物は、保存料、湿潤化剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントをさらに含有していてもよい。パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸など様々な抗細菌剤および抗真菌剤を含有させることで、微生物活動の予防を確実にしてもよい。糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を含ませることも望ましい。吸収を遅らせるモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの剤を含有させることにより、注射用医薬剤型の長期的吸収を起こさせてもよい。蓄積注射剤型は、薬物のマイクロカプセルマトリックスを、ポリラクチド−ポリグリコリド、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）などの生分解性ポリマー中で形成させることによって、作製される。ポリマーに対する薬物の比率および使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。蓄積注射用処方は、薬物を、生体組織適合性のリポソームまたはマイクロエマルジョンに封入することによって調製される場合もある。該注射用処方は、たとえば細菌捕捉フィルターを通す濾過によるか、使用直前に滅菌水またはその他の滅菌注射媒体に溶解または分散させることができる滅菌固形組成物の形で滅菌剤を添加することによって、滅菌してもよい。
【００７４】
本発明の治療用組成物は、たとえば無機または有機酸から得てもよい、当該成分の薬学的に許容される塩を含むことができる。「薬学的に許容される塩」とは、正当な医学的判断の範囲内で、好ましくない毒性、刺激性、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよびヒトより下等な動物の組織と接触する用途に適した塩であって、妥当な利益／リスク比に相当する塩を意味する。薬学的に許容される塩は、当該分野において公知である。たとえば、S.M. Bergeらは、J. Pharmaceutical Sciences (1977)66:1 et seq. において、薬学的に許容される塩を詳細に記載しているが、この文献は参照により本明細書に含まれる。薬学的に許容される塩としては、たとえば塩酸またはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離アミノ基と形成される）が挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩は、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることもできる。該塩は、本発明の化合物を最終的に単離および精製する際にインサイチュウで調製してもよく、遊離塩基官能基を適切な有機酸と反応させることにより別に調製してもよい。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、二硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、ジグルコン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシメタンスルホン酸塩（イセチオン酸塩）、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、蓚酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩およびウンデカン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。また、塩基性窒素含有基は、メチル、エチル、プロピル、およびブチル塩化物、臭化物およびヨウ化物などの低級アルキルハロゲン化物；ジメチル、ジエチル、ジブチル、およびジアミル硫酸塩のようなジアルキル硫酸塩；デシル、ラウリル、ミリスチルおよびステアリル塩化物、臭化物およびヨウ化物などの長鎖ハロゲン化物；ベンジルおよびフェネチル臭化物などのようなアリルアルキルハロゲン化物などの剤で四級化（quaternized・）することができる。このようにして、水または脂溶性または分散性の生成物が得られる。薬学的に許容される酸付加塩を形成するために使用することができる酸の具体例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸およびリン酸などの無機酸および蓚酸、マレイン酸、コハク酸およびクエン酸などの有機酸が挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される」、「生理的に忍容される」という用語およびそれらの文法変化形が組成物、担体、希釈剤および試薬についていわれるときは、互換的に用いられ、当該物質が、吐き気、めまい、胃もたれなどの好ましくない生理的影響をほとんど引き起こさないで、哺乳類に対して投与し得ることを表す。溶解または分散された有効成分を含有する薬理学的組成物の調製は、当該分野において自明であり、処方に応じて限定される必要はない。通常、かかる組成物は、液状の溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製されるが、使用前の液状の溶液または懸濁液に適した固形剤型を調製することもできる。該製剤は、乳化させることもできる。
【００７６】
有効成分は、薬学的に許容され、かつその有効成分と適合する賦形剤と、本明細書で説明する治療方法における用途に適した量で、混合することができる。適当な賦形剤としては、たとえば水、食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、およびそれらを組み合わせたものが挙げられる。また、所望により、該組成物は、有効成分の効果を強化する湿潤化または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの助剤を少量含有することができる。
【００７７】
本発明の抗血管形成タンパク質は、プロドラッグから成る組成物に含有させることもできる。本明細書で使用する場合、「プロドラッグ」という用語は、たとえば血液中の酵素加水分解によって、インビボで急速に変換されて、親化合物を生成する化合物をいう。詳細な議論が、（T. Higuchi and V. Stella, Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 of the ACS Symposium Series およびEdward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and PermagonPress, 1987 ）でなされ、これらの文献はいずれも参照により本明細書に含まれる。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容されるプロドラッグ」という用語は、（１）正当な医学的判断の範囲内で、好ましくない毒性、刺激性、アレルギー反応などを伴わずにヒトおよび動物の組織と接触する用途に適した本発明の化合物のプロドラッグであって、適当な対リスク利益比に相当し、かつそれらの目的用途に有効であるプロドラッグ、および（２）可能である場合は、親化合物の双極性イオン型をいう。
【００７８】
本発明の抗血管形成タンパク質の投与量は、治療されている疾患状態または病態およびヒトまたは動物の体重や状態および化合物の投与経路など、その他の臨床的因子によって決まる。ヒトまたは動物を治療する場合、体重１ｋｇあたり約１０ｍｇから体重１ｋｇあたり約２０ｍｇのタンパク質を投与することができる。たとえば本発明のタンパク質を放射線療法、化学療法、または免疫療法と併用するなどの併用療法においては、たとえば体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇから体重１ｋｇあたり約０．２ｍｇまで投与量を減らすことができる。特定の動物またはヒトにおける抗血管形成タンパク質の半減期に応じて、抗血管形成タンパク質を、１日あたり数回から１週間に１回の間で投与することができる。本発明は、ヒト用途と獣医科用途の両方の用途があるものと解される。本発明の方法は、単回投与、ならびに同時的であるか長期にわたるかに関わらず複数回投与が可能である。また、抗血管形成タンパク質は、たとえば化学療法、放射線療法、または免疫療法など、他の形の療法と併用投与することができる。
【００７９】
抗血管形成タンパク質処方としては、経口、直腸内、眼内（硝子体内または眼房内を含む）、鼻腔内、局所（頬内および舌下を含む）、子宮内、腟内または非経口（皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外を含む）投与に適したものが挙げられる。抗血管形成タンパク質処方は、単位剤型として簡便に投与することができ、従来の製薬技術によって調製することができる。かかる技術としては、有効成分と単数または複数の医薬担体または単数または複数の賦形剤を会合させる工程を含む。一般に、該処方は、有効成分を液状担体または粉砕した固形担体または両者と均一かつ緊密に会合させた後、必要に応じて生成物を成形することによって調製される。
【００８０】
非経口投与に適した処方としては、処方を想定レシピエントの血液と等張化する抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および溶質を含有していてもよい水性および非水性の無菌注射溶液；および懸濁剤および増粘剤を含んでいてもよい水性および非水性の無菌懸濁液が挙げられる。該処方は、たとえば封入アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量容器に入れて投与することができ、たとえば注射用水などの無菌液状担体を使用直前に添加するだけで、凍結乾燥（リオフィライズ）状態で保存することができる。処方用注射溶液および懸濁液は、上記種類の無菌粉末、粒剤および錠剤から調製することができる。
【００８１】
本発明のタンパク質の有効量が経口的に投与される場合、本発明の抗血管形成タンパク質は、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液またはエリキシル剤の形を取ることになる。錠剤型で投与される場合、本発明の医薬組成物は、ゼラチンやアジュバントなどの固形担体をさらに含有してよい。該錠剤、カプセル剤、および散剤は、本発明のタンパク質を約５から９５％含有しているが、本発明のタンパク質を約２５から９５％含有していることが好ましい。液剤型で投与される場合、水、石油、ラッカセイ油、鉱油、ダイズ油、またはゴマ油などの動植物起源の油、または合成油などの液状担体を添加することができる。液剤型の該医薬組成物は、生理食塩水、デキストロースまたはその他の糖溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのグリコールをさらに含有することができる。液剤型で投与される場合、該医薬組成物は、本発明のタンパク質を約０．５から９０重量％含んでいるが、本発明のタンパク質を約１から５０％含んでいることが好ましい。
【００８２】
本発明のタンパク質の有効量が静脈内、皮内または皮下注射によって投与される場合、本発明のタンパク質は、発熱性物質不含の非経口的に許容される水溶液の形を取ることになる。かかる非経口的に許容されるタンパク質溶液は、ｐＨ、等張性、安定性などに関して配慮されており、その調製は、当該分野における技術の範囲内である。好ましい静脈内、皮内、または皮下注射用医薬組成物は、本発明のタンパク質以外に、当該分野において公知であるように、「塩化ナトリウム注射液」、「リンゲル注射液」、「デキストロース注射液」、「デキストロース・塩化ナトリウム注射液」、「乳酸加リンゲル注射液」、またはその他のビヒクルなどの等張ビヒクルを含有していなければならない。本発明の医薬組成物は、安定剤、保存料、緩衝剤、抗酸化剤、またはその他の当業者にとって公知の添加剤をさらに含有することができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物における本発明のタンパク質の量は、治療されている病態の性質と程度により、また患者がそれまで受けていた先行的治療の性質によって決まる。究極的には、主治医が、各患者を治療するのに用いる本発明のタンパク質の量を決定する。まず、主治医は、本発明のタンパク質を低用量で投与し、患者の反応を観察する。患者にとって最適の治療効果が得られるまで、より高用量で本発明のタンパク質を投与し、その時点で、投与量をそれ以上増やさない。
【００８４】
本発明の医薬組成物を用いた静脈内投与療法の期間は、治療されている疾患の程度と各患者の状態および潜在的特異体質反応によって決まる。本発明のタンパク質の各投与の期間は、連続的静脈内投与で１２から２４時間の範囲に入る。究極的には、主治医が、本発明の医薬組成物を用いた静脈内投与療法の適切な期間を決定する。
【００８５】
好ましい単位投与処方は、投与成分の１日あたり用量または単位、１日あたりサブ用量（sub-dose）、またはその適当な分数を含有する処方である。とくに上記の成分以外にも、本発明の処方は、対象処方タイプにふさわしい当該分野において従来公知の他剤を含むことができるものとする。任意に、細胞傷害剤を添加するか、他の形で、抗血管形成タンパク質またはそれらの生理機能性タンパク質フラグメントと併用することで、複合療法を患者に提供してもよい。
【００８６】
該治療用組成物は、現時点で、獣医科用途にも有用である。ヒト以外にも、とくに家畜動物およびサラブレッド馬は、本発明のタンパク質によるかかる治療の対象として望ましい。
【００８７】
リシンなどの細胞傷害剤を、抗血管形成タンパク質およびそれらのフラグメントに連結させることで、該抗血管形成タンパク質に結合する細胞を破壊する手段を提供することができる。これらの細胞は、微小転移や原発性腫瘍を含む多くの場所で見られるが、これらに限定されない。細胞傷害剤に連結させたタンパク質を、所望の場所への送達を最大化するように設計されたやり方で輸液投与する。たとえば、リシン連結高度親和性フラグメントを、ターゲット部位に血液を供給する血管にカニューレを介して、またはターゲットに直接、送達させる。かかる剤は、輸液カニューレに接続した浸透圧ポンプを介して、制御されたやり方で送達させることもある。抗血管形成タンパク質に対するアンタゴニストを組み合わせたものを、血管形成シミュレーターとともに併用投与して、組織の血管形成を増大させてもよい。この治療レジメンは、効果的な転移癌破壊手段を提供する。
【００８８】
上記以外の治療方法としては、抗血管形成タンパク質、それらのフラグメント、アナログ、抗血清、または受容体アゴニストおよびアンタゴニストを細胞傷害剤に連結させたものの投与が挙げられる。抗血管形成タンパク質は、起源がヒトまたは動物であってよいものと解する。抗血管形成タンパク質は、化学反応によって、または組換え技術を発現系と組み合わせたものによって、合成的に製造することもできる。抗血管形成タンパク質は、単離ＩＶ型コラーゲンを酵素的に分解することで、抗血管形成活性を有するタンパク質を生成させることによって、製造することもできる。抗血管形成タンパク質は、ＩＶ型コラーゲンを分解して該抗血管形成タンパク質を生成させる内因性酵素の作用を模倣する化合物によって製造してもよい。抗血管形成タンパク質の製造は、分解酵素の活性に影響を及ぼす化合物によって調節してもよい。
【００８９】
本発明は、抗血管形成タンパク質またはそれらの変異体、フラグメント、または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが患者の体内に導入され調節される遺伝子治療をも包含する。遺伝子産物タンパク質を発現させるためにＤＮＡを細胞に転位または送達させる、遺伝子治療とも呼ばれる様々な方法が、Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N. Yang (1992) Crit. Rev. Biotechn. 12(4):335-356 に開示されているが、この文献は参照により本明細書に含まれる。遺伝子治療は、エクスビボまたはインビボ治療のいずれかにおける用途のための体細胞または生殖細胞へのＤＮＡ配列の組み込みを包含する。遺伝子治療は、遺伝子を置換し、正常または異常な遺伝子機能を強化させ、感染症およびその他の病理に対抗する機能を発揮する。
【００９０】
これらの医学的問題を遺伝子治療で治療する方式としては、欠陥遺伝子を同定した後で機能遺伝子を添加することで、該欠陥遺伝子の機能に置換するか、やや機能する遺伝子を強化するなどの治療法式；または病態を治療するか、組織または臓器を治療レジメンに対してより感受性にする産物タンパク質の遺伝子を添加するなどの予防方式が挙げられる。予防方式の具体例としては、１つ以上の抗血管形成タンパク質をコードするものなどの遺伝子を患者の体内に導入することで、血管形成の発生を予防してもよく；腫瘍細胞を放射線に対してより感受性にする遺伝子を挿入した後、その腫瘍に放射線を照射して、腫瘍細胞の死滅性を高めることもできる。
【００９１】
抗血管形成タンパク質のＤＮＡまたは調節配列の導入のための多くのプロトコルも本発明に含まれる。抗血管形成タンパク質と特異的に関連しているのが普通であるもの以外のプロモーター配列、または抗血管形成タンパク質の産生を増大させる他の配列のトランスダクションも、遺伝子治療の方法とみなされる。本技術の具体例として、細胞中でエリスロポエチン遺伝子に変化する「遺伝子スイッチ」を挿入する相同組換え法を用いたものが、Transkaryotic Therapies, Inc., of Cambridge, Mass., に示されている。Genetic Engineering News, Apr. 15, 1994 参照。かかる「遺伝子スイッチ」を用いて、抗血管形成タンパク質（または受容体）を発現しないのが普通である細胞中で該タンパク質（または受容体）を活性化させることができる。
【００９２】
遺伝子治療のための遺伝子導入方法は、３つの範疇に大別される。すなわち、物理的方法（たとえばエレクトロポレーション、直接遺伝子導入および粒子ボンバードメント）、化学的方法（たとえば脂質利用担体、またはその他の非ウイルスベクター）および生物学的方法（たとえばウイルス由来ベクターおよび受容体取り込み）である。たとえば、ＤＮＡで被覆されたリポソームを含む非ウイルスベクターを使用することができる。かかるリポソーム／ＤＮＡ複合体は、直接的に患者に静脈内注射することができる。リポソーム／ＤＮＡ複合体は肝臓で濃縮され、ＤＮＡをマクロファージとクッパー細胞に送達させると考えられる。これらの細胞は生存期間が長いため、送達ＤＮＡの長期的発現をもたらす。また、ベクターすなわち遺伝子の「はだかの」ＤＮＡを、所望の臓器、組織または腫瘍に直接注射することで、治療用ＤＮＡのターゲット化送達を行ってもよい。
【００９３】
遺伝子治療方法は、送達部位別に説明することもできる。基本的な遺伝子送達手段としては、エクスビボ遺伝子導入、インビボ遺伝子導入、およびインビトロ遺伝子導入が挙げられる。エクスビボ遺伝子導入では、細胞を患者から採取し、細胞培養で成長させる。ＤＮＡを細胞にトランスフェクトさせ、トランスフェクト細胞を数的に増殖させた後、患者に戻す。インビトロ遺伝子導入では、組織培養細胞など培養状態で成長する細胞が形質転換細胞となり、特定の患者の特定の細胞はこれに該当しない。これらの「実験室細胞」をトランスフェクトさせ、トランスフェクト細胞を選抜し、増殖させて、患者への移植またはその他の用途に使用する。
【００９４】
インビボ遺伝子導入は、患者の細胞が患者の体内にあるときに、ＤＮＡを細胞に導入するものである。方法としては、非感染性ウイルスを用いたウイルス介在遺伝子導入を用いて、遺伝子を患者に送達するか、はだかのＤＮＡを患者の体内の部位に注射して、ＤＮＡを、遺伝子産物タンパク質が発現される細胞の一定の比率のものに取り込ませるものが挙げられる。また、本明細書で説明する「遺伝子銃」の使用など、他の方法を、抗血管形成タンパク質の産生を制御するＤＮＡまたは調節配列のインビトロ挿入に用いることができる。
【００９５】
遺伝子治療の化学的方法としては、必ずしもリポソームでなくてもよい脂質ベース化合物を用いて、ＤＮＡを細胞膜通過させるものがある。負電荷ＤＮＡに結合する脂質ベース陽イオンであるリポフェクチンまたはサイトフェクチンは、細胞膜を通過して、ＤＮＡを細胞内部に送ることができる複合体を形成する。別の化学的方法では、特定のリガンドを細胞表面受容体に結合させ、それを封入し、細胞膜を通して輸送させる受容体ベースのエンドサイトーシスを利用する。リガンドは、ＤＮＡに結合し、複合体全体が細胞内に輸送される。リガンド遺伝子複合体が血流内に注射された後、受容体を有するターゲット細胞がリガンドと特異的に結合し、リガンド−ＤＮＡ複合体を細胞内へ輸送する。
【００９６】
多くの遺伝子治療方法は、ウイルスベクターを用いて遺伝子を細胞に挿入する。たとえば、変化させたレトロウイルスベクターをエクスビボの方法で用いて、遺伝子を末梢および腫瘍浸潤リンパ球、肝細胞、上皮細胞、筋肉細胞、またはその他の体細胞に導入する。次いで、これらの変化細胞を患者に導入することで、挿入ＤＮＡ由来の遺伝子産物を提供する。
【００９７】
ウイルスベクターは、インビボのプロトコルによる遺伝子の細胞への挿入にも用いられている。外来遺伝子の組織特異的発現を起こさせるために、組織特異的であることが知られているシス作用性調節エレメントまたはプロモーターを用いることができる。あるいは、この発現は、インビボにおいてＤＮＡまたはウイルスベクターを特定の解剖部位にインサイチュウ送達することで行うことができる。たとえば、インビボにおける血管への遺伝子導入が、動脈壁上の選ばれた部位において、インビトロでトランスデュース内皮細胞を移植することによって、行われている。ウイルスは周囲の細胞に感染し、これらの細胞も遺伝子産物を発現した。ウイルスベクターは、たとえばカテーテルにより、インビボ部位に直接送達させることで、特定のエリアのみをウイルスに感染させ、長期的な部位特異的遺伝子発現をもたらすことができる。レトロウイルスベクターを用いるインビボ遺伝子導入は、変化ウイルスを、臓器につながる血管に注射することによっても、哺乳類組織および肝臓組織中で起きることが示されている。
【００９８】
遺伝子治療プロトコルに用いられてきたウイルスベクターとしては、レトロウイルス、ポリオウイルスまたはシンドビスウイルスなどのその他のＲＮＡウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ワクシニアおよびその他のＤＮＡウイルスが挙げられる。複製欠損ネズミレトロウイルスベクターは、最も広く利用されている遺伝子導入ベクターである。ネズミ白血病レトロウイルスは、１本鎖ＲＮＡが核コアタンパク質およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）酵素と複合体化したものが、タンパク質コア（ｇａｇ）に封入され、宿主範囲を決定する糖タンパク質エンベロープ（ｅｎｖ）に取り囲まれているものから成る。レトロウイルスのゲノム構造には、５’および３’の長鎖末端反復単位（ＬＴＲ）において閉鎖されたｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子が含まれている。レトロウイルスベクター系は、ウイルス構造タンパク質がパッケージング細胞株においてトランスの位置で提供されるという条件の下に、５’および３’ＬＴＲを含有するミニマルベクターおよびパッケージングシグナルさえあれば、ベクターのパッケージング、感染およびターゲット細胞への取り込みを起こさせるのに十分であるという事実を利用している。遺伝子導入におけるレトロウイルスベクターの基本的長所としては、ほとんどの細胞タイプにおいて効率的な感染と遺伝子発現が行えること、ターゲット細胞染色体ＤＮＡへの単一コピーベクターの取り込みが正確に行えること、およびレトロウイルスゲノムの操作が容易であることが挙げられる。
【００９９】
アデノウイルスは、線状２本鎖ＤＮＡがコアタンパク質と複合体を形成し、カプシドタンパク質で囲まれたものから成る。分子ウイルス学の進歩により、これらの生物の生物学的性質を利用して、新規遺伝子配列をインビボでターゲット細胞にトランスデュースし得るベクターを作製することが可能になった。アデノウイルスベースのベクターは、高レベルの遺伝子産物タンパク質を発現する。アデノウイルスベクターは、低タイターのウイルスとでさえ、高い効力の感染性を有する。また、該ウイルスは、細胞不含ビリオンとして完全感染性を示すので、プロデューサー細胞株の注射は不要である。アデノウイルスベクターのもう１つの長所となり得るのは、異種遺伝子の長期的発現をインビボで行うことができる点である。
【０１００】
ＤＮＡ送達の機械的方法としては、リポソームまたはその他の膜融合用ベシクルなどの融合誘発性脂質ベシクル、リポフェクチンなどのカチオン脂質を含んでいるＤＮＡの脂質粒子、ＤＮＡのポリリジン介在導入、生殖または体細胞へのＤＮＡのマイクロ注射などのＤＮＡの直接注射、「遺伝子銃」に使用される金粒子などの空圧送達ＤＮＡ被覆粒子、およびリン酸カルシウムトランスフェクションなどの無機化学的アプローチが挙げられる。粒子介在遺伝子導入法は、当初、植物組織の形質転換に用いられた。粒子ボンバードメント装置すなわち「遺伝子銃」により、動力を発生させ、ＤＮＡ被覆高密度粒子（金やタングステンなど）を、ターゲット臓器、組織または細胞への進入が可能になる高い速度まで加速させる。粒子ボンバードメントは、インビトロ系において、またはエクスビボまたはインビボ技術とともに用いて、ＤＮＡを細胞、組織または臓器に導入することができる。別の方法であるリガンド介在遺伝子治療は、ＤＮＡを特異的リガンドと複合体化させて、リガンド−ＤＮＡコンジュゲートを形成させることで、ＤＮＡを特定の細胞または組織に送達させる。
【０１０１】
プラスミドＤＮＡを筋細胞に注射すると、高い比率の細胞がトランスフェクトされ、マーカー遺伝子を持続的に発現するようになることがわかっている。プラスミドのＤＮＡは、細胞のゲノム中に取り込ませてもよいし、取り込ませなくてもよい。トランスフェクトＤＮＡを取り込ませない場合、最終分化した非増殖性組織中で、細胞またはミトコンドリアゲノムの突然変異挿入、欠失、または置換の恐れなく、長期的に、遺伝子産物タンパク質のトランスフェクションと発現が可能になる。長期的ではあるが必ずしも永続的である必要はない治療用遺伝子の特定細胞への導入は、遺伝疾患の治療法または予防用途を提供する。ＤＮＡを定期的に再注射して、レシピエント細胞のゲノムに突然変異を起こさせないで、遺伝子産物レベルを維持することができる。外来ＤＮＡを取り込ませない場合、全ての構築物が様々な遺伝子産物を発現しつつ、１つの細胞内でいくつかの異なる外来ＤＮＡ構築物を存在させることができる。
【０１０２】
遺伝子導入のためのエレクトロポレーションは、電流を利用して、細胞または組織をエレクトロポレーション介在の介在遺伝子導入に対して感受性にする。ＤＮＡ分子が細胞に進入できるようなやり方で、一定の電場強度を有する短時間の電気インパルスを用いて、膜の透過性を増大させる。本技術を、インビトロ系において、またはエクスビボまたはインビボ技術とともに用いて、ＤＮＡを細胞、組織または臓器に導入することができる。
【０１０３】
インビボにおける担体介在遺伝子導入を利用して、外来ＤＮＡを細胞にトランスフェクトさせることができる。担体−ＤＮＡ複合体を、簡便に体液または血流に導入した後で、部位特異的に体内のターゲット臓器または組織に送達させることができる。リポソームと、ポリリジン、リポフェクチンまたはサイトフェクチンなどのポリカチオンのいずれも用いることができる。細胞特異的または臓器特異的であるリポソームを作製することができるので、リポソームが保持する外来ＤＮＡがターゲット細胞に取り込まれる。ある種の細胞上の特異的受容体にターゲット化されている免疫リポソームの注射は、ＤＮＡを受容体担持細胞に挿入する簡便な方法として用いることができる。これまで用いられてきた別の担体系として、インビボ遺伝子導入のためにＤＮＡを肝細胞に運ぶためのアシアロ糖タンパク質／ポリリジンコンジュゲート系がある。
【０１０４】
トランスフェクトＤＮＡは、そのＤＮＡがレシピエント細胞に運ばれた後で、細胞質中または核質中にとどまるように、他種の担体と複合体化させてもよい。ＤＮＡは、特異的に作製されたベシクル複合体中の担体核タンパク質と結合させて、核に直接送達させることができる。
【０１０５】
抗血管形成タンパク質の遺伝子調節は、抗血管形成タンパク質の１つをコードする遺伝子、またはその遺伝子と関連する制御領域、またはその対応するＲＮＡ転写物に結合する化合物を投与することで、転写または翻訳の速度を変化させることによって、行うことができる。また、抗血管形成タンパク質をコードするＤＮＡ配列でトランスフェクトされた細胞を、患者に投与して、それらのタンパク質のインビボの供給源を提供することができる。たとえば、細胞は、抗血管形成タンパク質をコードする核酸配列を含有するベクターでトランスフェクトすることができる。トランスフェクト細胞は、患者の正常組織や患者の疾患組織に由来する細胞であってもよいし、患者以外の細胞であってもよい。
【０１０６】
たとえば、患者から採取した腫瘍細胞を、本発明のタンパク質を発現し得るベクターでトランスフェクトし、患者に戻すことができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞は、腫瘍の成長を阻害するレベルのタンパク質を患者体内で産生する。患者は、ヒトまたはヒト以外の動物であってよい。細胞は、非ベクター、またはエレクトロポレーション、イオノポレーション（ionoporation）など当該分野において公知の物理的または化学的方法によるか、「遺伝子銃」を介して、トランスフェクトさせてもよい。また、ＤＮＡは、担体の補助なしに、患者体内に直接注射してもよい。とくに、ＤＮＡは、皮膚、筋肉または血液中に注射することができる。
【０１０７】
抗血管形成タンパク質を患者体内にトランスフェクトするための遺伝子治療プロトコルは、抗血管形成タンパク質ＤＮＡを細胞のゲノムに、またはミニ染色体に取り込ませることによるか、細胞の細胞質または核質中で別個の複製または非複製ＤＮＡ構築物として、行うことができる。抗血管形成タンパク質の発現は、長期的に持続してもよいし、定期的に再注射を行って、所望の細胞、組織または臓器中タンパク質レベルまたは所定の血中レベルを維持してもよい。
【０１０８】
また、本発明は抗体および抗血清を包含する。かかる抗体および抗血清は、新規な抗血管形成タンパク質の試験に用いることができ、また、血管形成活性またはその欠如を特徴とする、またはそれに関連する疾患および症状の診断、予後、または治療において使用することができる。かかる抗体および抗血清はまた、所望の、たとえば、梗塞後の心臓組織において、本発明のタンパク質に対する抗体または抗血清を使用して、天然の抗血管形成タンパク質の局在およびプロセスをブロックし、新たな血管形成を増加し、ならびに心臓組織の萎縮を阻害するという、血管形成の上流調節に使用することができる。
【０１０９】
かかる抗体および抗血清は、診断用組成物、予後用組成物または治療用組成物を作製するために薬学的に許容され得る組成物および担体と組み合わせることができる。用語「抗体」または「抗体分子」とは、免疫グロブリン分子および／または免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗体結合部位またはパラトープを含む分子の集団をいう。
【０１１０】
抗血管形成タンパク質を特異的に結合する抗体を用いる受動的な抗体療法を実施して、生殖、発達、および創傷治癒および組織修復等の血管形成依存性プロセスを調節することができる。また、抗血管形成タンパク質の抗体のＦａｂ領域に対する抗血清を投与し、該タンパク質に対する内因性の抗血清の該タンパク質に結合する能力をブロックすることができる。
【０１１１】
本発明の抗血管形成タンパク質はまた、１つまたは複数のインヒビターおよび１つまたは複数のレセプターに対し特異的な抗体を作製するのに使用することができる。かかる抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗血管形成タンパク質またはそれらのレセプターに特異的に結合するこれらの抗体は、体液または体組織において抗血管形成タンパク質またはそれらのレセプターを検出または定量するための、当業者に既知の診断方法および診断用キットにおいて使用され得る。これらの試験からの結果を用いて、癌および他の血管形成媒介疾患の発生または再生の診断または予測を行うことができる。
【０１１２】
本発明はまた、血管形成活性を特徴とする疾患の診断または予後における、抗血管形成タンパク質、それらのタンパク質に対する抗体、およびそれらのタンパク質および／またはそれらの抗体を含む組成物の使用を含む。本明細書で使用する用語「予後方法」とは、疾患、特に血管形成依存性疾患と診断されたヒトまたは動物の疾患の進行に関する予測を可能にする方法を意味する。本明細書で使用する用語「診断方法」とは、ヒトまたは動物内でのあるいはヒトまたは動物上での血管形成依存性疾患の存在または型の決定を可能にする方法を意味する。
【０１１３】
抗血管形成タンパク質を診断方法および診断用キットに用いて、該タンパク質を結合することができる抗体を検出および定量することができる。これらのキットは、インサイチュウでの原発性腫瘍により分泌される抗血管形成タンパク質の存在下に微小転移の広がりを示す抗血管形成タンパク質に対する循環する抗体の検出を可能にするであろう。かかる循環する抗タンパク質抗体を有する患者は、多様な腫瘍および癌が発生している可能性がより高いかもしれず、また、治療または緩解の期間の後の癌の再生を有している可能性がより高いかもしれない。これらの抗タンパク質抗体のＦａｂフラグメントを抗原として用い、抗タンパク質抗体を中和するために用い得る抗タンパク質Ｆａｂフラグメント抗血清を生成してもよい。かかる方法は、抗タンパク質抗体による循環するタンパク質の除去を減少させ、それにより、効果的に抗血管形成タンパク質の循環レベルを向上するであろう。
【０１１４】
本発明はまた、抗血管形成タンパク質に特異的なレセプターの単離を含む。組織への高新和性結合を有するタンパク質フラグメントを用いて、アフィニティーカラム上で抗血管形成タンパク質のレセプターを単離することができる。１つまたは複数のレセプターの単離と精製は、抗血管形成タンパク質の作用機構の解明への基本工程である。レセプターの単離およびアゴニストおよびアンタゴニストの同定は、生物学的活性への最終経路であるレセプターの活性を調節するための薬物の開発を容易にするであろう。レセプターの単離は、インサイチュウおよび溶液ハイブリダイゼーション技術に使用してレセプターの位置および合成を追跡するためのヌクレオチドプローブの構築を可能にする。さらに、レセプターの遺伝子を単離し得、発現ベクターに組み込み得、また、細胞型、組織または腫瘍の抗血管形成タンパク質を結合する能力および局部的な血管形成を阻害する能力を増加するために、患者の腫瘍細胞等の細胞にトランスフェクトし得る。
【０１１５】
抗血管形成タンパク質を用いて、培養腫瘍細胞から抗血管形成タンパク質の１つまたは複数のレセプターの単離のためのアフィニティーカラムを開発する。レセプターの単離および精製の後にアミノ酸配列解析を行う。この情報を用いて、レセプターをコードする１つまたは複数の遺伝子を同定し得、単離し得る。次いで、クローニングされた核酸配列をレセプターを発現することができるベクターへの挿入のために開発する。これらの技術は当業者に充分に知られている。腫瘍細胞へのレセプターをコードする核酸配列のトランスフェクション、およびトランスフェクトされた腫瘍細胞によるレセプターの発現は、内因性または外因性の抗血管形成タンパク質への細胞の応答性を高め、それにより、転移増殖の速度が減少する。
【０１１６】
本発明の血管形成阻害性タンパク質は標準の微量化学装置において合成し得、ＨＰＬＣおよび質量分光光学法で純度を調べることができる。タンパク質合成、ＨＰＬＣ精製および質量分光光学法の方法は一般に当業者に公知である。また、高血管形成タンパク質およびそれらのレセプタータンパク質を組換え大腸菌または酵母発現系で生産し、カラムクロマトグラフィーで精製する。
【０１１７】
無傷の抗血管形成タンパク質の異なるタンパク質フラグメントを、特に限定するものではないが、以下のようないくつかの適用における使用のために合成することができる；特異的抗血清の開発のための抗原として、抗血管形成タンパク質の結合部位において活性なアゴニストおよびアンタゴニストとして、抗血管形成タンパク質を結合する細胞の標的殺傷のための細胞傷害性薬剤に連結するための、または該薬剤と組み合わせるタンパク質として。
【０１１８】
抗血管形成タンパク質の合成タンパク質フラグメントは種々の用途を有する。高い特異性および親和力で抗血管形成タンパク質のレセプターに結合するタンパク質を放射性標識し、オートラジオグラフィーおよび膜結合技術を用いて結合部位の視覚化および定量に使用する。この適用は、重要な診断用および研究用ツールを提供する。１つまたは複数のレセプターの結合特性の認識は、１つまたは複数のレセプターに関連するトランスダクションメカニズムの調査を容易にする。
【０１１９】
抗血管形成タンパク質およびそれらに由来するタンパク質は、標準法を用いて他の分子に結合し得る。抗血管形成タンパク質のアミノ末端およびカルボキシル末端は両方ともチロシンおよびリジン残基を含んでおり、多くの技術、たとえば、慣用の技術（チロシン残基−クロラミンＴ、ヨードゲン、ラクトペルオキシダーゼ；リジン残基−ボルトン−ハンター試薬）を用いる放射性標識により同位体および非同位体で標識される。これらの結合技術は当業者によく知られている。他方、チロシンまたはリジンは、タンパク質上の反応性のアミノ基およびヒドロキシル基の標識を容易にするためにこれらの残基を有しないフラグメントに付加される。結合技術は、特に限定されるものではないが、アミノ、スルフヒドラル、カルボキシル、アミド、フェノール、およびイミダゾールを含むアミノ酸に対し利用可能な官能基に基づいて選択される。これらの結合に作用するのに用いられる種々の試薬としては、中でも、グルタルアルデヒド、ジアゾ化ベンジジン、カルボジイミド、およびｐ−ベンゾキノンが挙げられる。
【０１２０】
抗血管形成タンパク質は、種々の適用のために、同位体、酵素、担体タンパク質、細胞傷害性試薬、蛍光分子、化学発光物質、生物発光物質および他の化合物に化学的に結合される。結合反応の効率は、特異的反応に適する異なる技術を用いて決定される。たとえば、125 Ｉによる本発明のタンパク質の放射性標識は高い特異性活性のクロラミンＴおよびＮａ125 Ｉを用いて行われる。反応はメタ重亜硫酸ナトリウムで終了し、処分可能なカラムで脱塩する。標識タンパク質をカラムから溶出し、フラクションを回収する。アリコート（aliquots）を各フラクションから採り除き、放射活性をガンマカウンターで測定する。この方式では、未反応Ｎａ125 Ｉは標識タンパク質から分離される。最も高い特異的放射活性を有するタンパク質フラクションを抗血管形成タンパク質に結合する能力の解析等の続く使用のために保存する。
【０１２１】
また、短命な同位体による抗血管形成タンパク質の標識では、ポジトロンエミッショントモグラフィーまたは他の近代Ｘ線撮影技術を用いるインビボでのレセプター結合部位の視覚化によりタンパク質の結合部位を有する腫瘍を位置づけることを可能にする。
【０１２２】
これらの合成タンパク質内でのアミノ酸の組織的な置換は、１つまたは複数のレセプターへの結合を増強または消去する抗血管形成タンパク質の１つまたは複数のレセプターに対する高親和性のタンパク質アゴニストおよびアンタゴニストを生ずる。かかるアゴニストを用いて微小転移の成長を抑制し、それにより、癌の広がりを制限する。抗血管形成タンパク質に対するアンタゴニストは、抗血管形成タンパク質の阻害作用をブロックし、かつ血管形成を促進するために、不充分な血管新生の場合に適用される。たとえば、この処理は、糖尿病における創傷治癒を促進する治療効果を有するかもしれない。
【０１２３】
本発明をさらに以下の実施例により説明する。かかる実施例は、本発明の範囲において如何様な限定にも解釈されることを意図していない。一方、種々の他の態様、修飾、およびそれらの均等物に対し、本明細書の記載を読んだ後に、本発明の精神および／または添付する特許請求の範囲の範囲を逸脱することなく当業者にそれら自身を示唆する余地を有するかもしれないことを明確に理解されるべきである。
【実施例】
【０１２４】
実施例
実施例１：天然アレステンの単離。
アレステンはヒトの胎盤および羊膜組織からミリグラム量で得ることができる。アレステンおよび類似タンパク質を単離するためのプロトコールは他の研究者によって記述されている（例えばＬａｎｇｅｖｅｌｄ，Ｊ．Ｐ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１０４８１−１０４８８；Ｓａｕｓ，Ｊ．ら，１９８８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６３：１３３７４−１３３８０；Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５：５４６６−５４６９；Ｇｕｎｗａｒ Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−１５３２４；Ｋａｈｓａｉ，Ｔ．Ｚ．ら，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７２：１７０２３−１７０３２）。組換え型アレステンの生産は、Ｎｅｉｌｓｏｎら（１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−８４０６）に記載されている。このタンパク質は２９３腎細胞でも発現させることができる（例えばＨｏｈｅｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．ら，１９９８，ＥＭＢＯ Ｊ． １７：１６５６−１６６４に記載の方法による）。アレステンはＰｉｈｌａｊａｎｉｅｍｉ，Ｔ．ら（１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６０：７６８１−７６８７）の方法でも単離できる。
【０１２５】
ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα１鎖のヌクレオチド配列（配列番号：１）とアミノ酸配列（配列番号：２）をＦｉｇ．１に示す。アレステンのおよその始まりと終わりに印をつけてある。アレステンは一般にＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインを含み、またＮＣ１ドメインの直前の１２アミノ酸である接合領域もおそらく含んでいる。
【０１２６】
天然アレステンを、細菌性コラゲナーゼ、陰イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、ＨＰＬＣおよびアフィニティークロマトグラフィーを使って、ヒト胎盤から単離した（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４；Ｗｅｂｅｒ，Ｓ．ら，１９８４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｈｅｍ． １３９：４０１−１０）。ヒト胎盤から単離されたＩＶ型コラーゲン単量体をＣ−１８疎水性カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使ってＨＰＬＣ精製した。構成タンパク質をアセトニトリル勾配（３２％−３９％）で分離した。主要ピークが認められ、それは小さな二重ピークだった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、第１ピーク内に２つのバンドが認められ、第２ピークにはタンパク質は検出されなかった。免疫ブロッティングでも、第２ピークに免疫検出可能なタンパク質は見つからず、主要ピークはアレステンであると同定された。
【０１２７】
実施例２：大腸菌におけるアレステンの組換え生産。
アレステンをコードする配列を、α１ＮＣ１（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）からＰＣＲにより、フォワードプライマー５' −ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＴＣＴ ＧＴＴ ＧＡＴ ＣＡＣ ＧＧＣ ＴＴＣ−３' （配列番号：３）およびリバースプライマー５' −ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＴ ＣＡＴ ＡＣＡ ＧＡＣ−３' （配列番号：４）を用いて増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、予め消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）にライゲートした。この構造をＦｉｇ．２に示す。これにより、アレステンはｐｅｌＢリーダー配列の下流にｐｅｌＢリーダー配列とインフレームで配置され、ペリプラズム局在と可溶性タンパク質の発現が可能になった。タンパク質にはアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクター配列が付加された。配列の３' 末端をポリヒスチジンタグ配列とインフレームでライゲートした。ｃＤＮＡの３' 末端とｈｉｓ−タグの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードした。陽性クローンの両鎖を配列決定した。
【０１２８】
アレステンをコードするプラスミド構築物をまず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、次に、発現用のＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。終夜細菌培養物を使ってＬＢ培地の５００ｍｌ培養に接種した。この培養を細胞が０．６のＯＤ600 に達するまで約４時間生育させた。次に、最終濃度が１〜２ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、タンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後に、５０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁することによって、細胞を溶解した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ヒルデン）に毎分２ｍｌの流速で４〜６回通した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭイミダゾールと２５ｍＭイミダゾールの両方を使って洗浄することにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のイミダゾール濃度を順次増加して（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）、上記のカラムからアレステンタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析中に総タンパク質のごく一部が沈殿した。透析したタンパク質を集め、約３５００×ｇで遠心分離して、ペレット画分と上清画分に分離した。各画分中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で決定した。総タンパク質のうち約２２％がペレット中にあり、残りの７８％が可溶性タンパク質として回収された。タンパク質の全収量は約１０ｍｇ／リットルだった。
【０１２９】
大腸菌発現タンパク質は主に可溶性タンパク質として単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは２９ｋＤａに単量体バンドが認められた。付加的な３ｋＤａはポリリンカー配列およびヒスチジンタグ配列に起因し、アレステン抗体および６−ヒスチジンタグ抗体の両方によって免疫検出された。
【０１３０】
実施例３：２９３胎児腎細胞におけるアレステンの発現。
α１（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミドを使って、リーダーシグナル配列がｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）中にインフレームで付加されるような方法で、アレステンを増幅した。全長α１（ＩＶ）鎖の５' 末端に由来するリーダー配列をＮＣ１ドメインの５' 側にクローニングして、培養培地へのタンパク質分泌を可能にした。そのアレステン含有組換えベクターを、フランキングプライマーを使って配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンをさらに精製し、それをインビトロ翻訳実験に使用して、タンパク質発現を確認した。そのアレステン含有プラスミドおよび対照プラスミドを使用して、２９３細胞を塩化カルシウム法でトランスフェクトした。トランスフェクトされたクローンをジェネティシン抗生物質処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）によって選択した。その細胞を、細胞死が明らかでなくなるまで、上記抗生物質の存在下に３週間放置した。次にクローンをＴ−２２５フラスコに拡大し、コンフルエントになるまで生育させた。次に上清を集め、アミコン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ）を使って濃縮した。濃縮した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡによってアレステン発現について解析した。ＥＬＩＳＡにより上清に強い結合が検出された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では、約３０ｋＤａに単一の主要バンドが認められた。アレステン含有上清を、アレステン特異的抗体（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４）を使ったアフィニティークロマトグラフィーにかけた。アレステン抗体との免疫反応性を示す約３０ｋＤａの単量体を含む主要ピークが同定された。培養液１リットルにつき約１〜２ｍｇの組換えアレステンが生産された。
【０１３１】
実施例４：アレステンは内皮細胞増殖を阻害する。
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中でＣ−ＰＡＥ細胞をコンフルエントまで生育させ、接触阻害状態を４８時間保った。対照細胞は７８６−０（腎癌）細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞、およびＡ−４９８（腎癌）細胞とした。細胞を３７℃で５分間のトリプシン処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）によって収集した。１％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに懸濁した１２，５００個の細胞を、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆した２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。その細胞を５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を取り除き、０．５％ＦＣＳと３ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国ミネソタ州ミネアポリス）を含むＤＭＥＭで置き換えた。非刺激対照にはｂＦＧＦを与えなかった。細胞を０．０１〜５０μｇ／ｍｌの濃度のアレステンまたはエンドスタチンで処理した。処理時に、全てのウェルに１マイクロキュリーの3 Ｈ−チミジンを添加した。２４時間後に、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで洗浄した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）溶液が入っているシンチレーションバイアルに加えた。シンチレーションカウンターを使ってチミジン取り込みを測定した。その結果をＦｉｇ．３ＡおよびＦｉｇ．３Ｂに示す。Ｆｉｇ．３ＡおよびＦｉｇ．３Ｂは、様々な量のアレステン（Ｆｉｇ．３Ａ）またはエンドスタチン（Ｆｉｇ．３Ｂ）で処理したＣ−ＰＡＥ細胞への3 Ｈ−チミジンの取り込みを示す一組のグラフである。アレステンはエンドスタチンと同様にＣ−ＰＡＥにおけるチミジン取り込みを阻害するようであった。アレステンおよびエンドスタチンで処理した対照細胞の挙動もＦｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄに示すが、アレステンは７８６−０細胞（Ｆｉｇ．４Ａ）、ＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．４Ｂ）またはＨＰＥＣ細胞（Ｆｉｇ．４Ｃ）に対してほとんど影響をもたなかった。エンドスタチンはＡ−４９８細胞に対してほとんど影響をもたなかった（Ｆｉｇ．４Ｄ）。Ｆｉｇ．３およびＦｉｇ．４に示す各群はすべて三連の試料を表す。
【０１３２】
実施例５：アレステンは内皮細胞移動を阻害する。
ＦＢＳによって誘発される走化性に対するアレステンとエンドスタチンの阻害効果を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＥＣＶ−３０４細胞，ＡＴＣＣ １９９８−ＣＲＬ，ＡＴＣＣ（アメリカン タイプ カルチャー コレクション，米国２０１１０−２２０９バージニア州マナッサス、ユニバーシティーブールバード１０８０１））で、ボイエンチャンバー測定法（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，米国メリーランド州キャビンジョン）を使って調べた。１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ ＤｉｌＣ１８（３）生細胞蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，米国オレゴン州ユージーン）を含むＭ１９９培地で、ＥＣＶ−３０４細胞を一晩生育させた。トリプシン処理し、０．５％ＦＢＳを含むＭ１９９で細胞を洗浄、希釈した後、６０，０００個の細胞を、アレステンまたはエンドスタチン（２〜４０μｇ／ｍｌ）と共に、もしくはアレステンまたはエンドスタチンを伴なわずに、上チャンバーウェルに播種した。２％ＦＢＳを含むＭ１９９培地を化学誘引物質として下チャンバーに入れた。細胞含有コンパートメントを孔径８μｍのポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，米国カリフォルニア州リバーモア）で化学誘引物質から隔離した。そのチャンバーを５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で４．５時間インキュベートした。非移動細胞を捨て、上ウェルをＰＢＳで洗浄した後、フィルターをプラスチック製の刃で削り、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、ガラススライド上に置いた。蛍光強拡大視野を用いて、数個の独立した均質な像を、画像処理ソフトウェアＰＭＩＳ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，米国アリゾナ州トゥーソン）で操作したデジタルＳｅｎＳｙｓTMカメラで記録した。代表的画像をＦｉｇ．５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。これらの図は２μｇ／ｍｌのアレステンが２０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと同程度に有効であることを示している。ＯＰＴＩＭＡＳ ６．０ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ニューヨーク州ロチェスター）を使って細胞数を数えた。その結果をＦｉｇ．６に示す。この図は顕微鏡写真に見られる結果をグラフで表したものである。
【０１３３】
実施例６：アレステンは内皮管形成を阻害する。
内皮管形成の阻害を測定するために、３２０μｌのマトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を２４ウェルプレートの各ウェルに加えて、重合させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ． １９０：８５４−６３）。抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）に懸濁した２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）を、マトリゲルで被覆した各ウェルに移した。その細胞を、濃度を順次増加させたアレステン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳまたは７Ｓドメインで処理した。全てのアッセイは三連で行なった。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（接眼レンズ３．３×、対物レンズ１０×）を使って観察した。次に、４００ＤＫ被覆ＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）を使って細胞を写真撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，米国ミズーリ州セントルイス）で染色し、再び写真撮影した。１０視野を観察し、管の数を数えて平均した。その結果をＦｉｇ．７に示す。この図はアレステンが対照と比較して管形成を阻害することを示している。十分に形成された管の代表例は、７Ｓドメインで処理した細胞を示すＦｉｇ．８Ａに見ることができる（倍率１００×）。これに対してＦｉｇ．８Ｂは、０．８μｇ／ｍｌアレステンで処理したＭＡＥ細胞では管がうまく形成されないか、全く形成されないことを示している（倍率１００×）。
【０１３４】
マトリゲルアッセイをＣ５７／ＢＬ６マウスでインビボでも行なった。マトリゲルを４℃で一晩融解した。次に、それを２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，米国ミネソタ州ミネアポリス）および１μｇ／ｍｌのアレステンまたは１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと混合した。そのマトリゲル混合物を、２１ゲージ注射針を使って皮下に注射した。対照群には血管形成インヒビターを含まない点以外は同じ混合物を投与した。１４日後に、マウスを屠殺し、マトリゲルのプラグを取り出した。そのマトリゲルプラグを４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ溶液中で室温にて４時間固定した後、ＰＢＳに２４時間切り換えた。そのプラグをパラフィンに包埋し、切片化し、Ｈ＆Ｅ染色した。切片を光学顕微鏡で調べ、強拡大の１０視野から血管数を数えて平均した。
【０１３５】
マトリゲルを順次濃度を増加させたアレステンと共に、またはアレステンを伴なわずに、ｂＦＧＦの存在下においた場合、１μｇ／ｍｌのアレステンと１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンでは血管数に５０％の減少が観察された。これらの結果は、アレステンが血管形成過程の様々な段階を阻害することによって新血管の形成に影響を及ぼすことを示している。また、これらの結果は、１μｇ／ｍｌのアレステンが、インビボでの新血管形成の阻害に関して、１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンと同程度に有効であることも示している。
【０１３６】
実施例７：アレステンはインビボで腫瘍転移を阻害する。
Ｃ５７／ＢＬ６マウスに１００万個のＭＣ３８／ＭＵＣ１（Ｇｏｎｇ，Ｊ．ら，１９９７，Ｎａｔ．Ｍｅｄ． ３：５５８−６１）を静脈内注射した。２６日間にわたって一日おきに、５匹の対照マウスに１０ｍＭの滅菌ＰＢＳを注射し、６匹の実験マウスに４ｍｇ／ｍｌアレステンを投与した。処理の２６日後に、各マウスについて肺腫瘍結節数を数え、上記の２群について平均した。各群で２例の死亡が記録された。アレステンは一次小節の平均数を対照マウスでの３００から２００まで有意に減少させた。
【０１３７】
実施例８：アレステンはインビボで腫瘍成長を阻害する。
２００万個の７８６−０細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。６匹のマウスからなる第１群では、腫瘍を約７００ｍｍ3 まで増殖させた。６匹のマウスからなる第２群では、腫瘍を１００ｍｍ3 まで増殖させた。滅菌ＰＢＳ中のアレステンを、７００ｍｍ3 の腫瘍を持つマウスについては２０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｍ3 の腫瘍を持つマウスについては１０ｍｇ／ｋｇの濃度で、１０日間にわたって毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照マウスにはＢＳＡまたはＰＢＳビヒクルを投与した。その結果をＦｉｇ．９ＡおよびＦｉｇ．９Ｂに示す。Ｆｉｇ．９Ａは、１０ｍｇ／ｋｇアレステン処理マウス（白四角）、ＢＳＡ処理マウス（＋）、および対照マウス（黒丸）に関して、腫瘍容積の７００ｍｍ3 からの増加を示すプロットである。アレステン処理マウスの腫瘍は７００ｍｍ3 から５００ｍｍ3 に収縮したが、ＢＳＡ処理マウスおよび対照マウスの腫瘍は１０日間で約１２００ｍｍ3 に増殖した。Ｆｉｇ．９Ｂは、１００ｍｍ3 の腫瘍を持つマウスでも、アレステン（白四角）は腫瘍を約８０ｍｍ3 に収縮させたが、ＢＳＡ処理腫瘍（＋）は１０日間でほぼ５００ｍｍ3 までサイズが増大したことを示している。
【０１３８】
約５００万個のＰＣ−３細胞（ヒト前立腺腺癌細胞）を収集し、７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍を１０日間増殖させた後、ノギスで測定した。腫瘍容積は標準的な公式（幅2 ×長さ×０．５２）を使って計算した（Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９７，Ｃｅｌｌ ８８：２７７−８５；Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ／Ｓら，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８）。マウスを５〜６匹ずつの群に分割した。実験群には、アレステン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）またはエンドスタチン（１０ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群には毎日ＰＢＳを投与した。その結果をＦｉｇ．９Ｃに示す。これはアレステン（白四角）がエンドスタチン（黒三角）と同程度か、またはエンドスタチンよりわずかに強く、腫瘍の増殖を阻害したことを示している。アレステン用量を４ｍｇ／ｋｇ／日に変更して、この実験を繰返した。その結果をＦｉｇ．９Ｄに示す。８日後（矢印）に処理を停止したが、追加のアレステン処理を行なわなくても、有意な阻害はさらに１２日間にわたって継続した。１２日間の無処理後に、腫瘍はアレステンの阻害的影響を免れ始めた。
【０１３９】
実施例９：アレステンの循環半減期。
ヒト胎盤から単離された天然アレステンを２００ｇのサイズのレート（ｒａｔｅ）に静脈内注射した。各ラットに５ｍｇのヒトアレステンを投与した。抗アレステン抗体を使用して、様々な時点で、循環アレステンの存在について、直接ＥＬＩＳＡによって血清を解析した。同量の血清が解析に使用されることを保証するために、対照として血清アルブミンも各時点で評価した。アレステンは約３６時間の半減期で血清中を循環することがわかった。
【０１４０】
もう一つのラット群には２００μｇのヒトアレステンをＩ．Ｐ．および／または皮下注射し、肺、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、脳、精巣、卵巣などにおける発病の徴候について評価した。直接ＥＬＩＳＡを行なったところ、これらのラットの血清中にアレステン抗体が検出され、以前にも観察されているように（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６２０１−５）、多少の内因性ＩｇＧ沈着が腎糸球体基底膜に認められた。この腎臓における抗体沈着は、炎症または腎機能低下の徴候を何も伴なわなかった。これらの実験からアレステンは非病原性であることが示唆される。
【０１４１】
実施例１０：アレステンによるＭＭＰ−２酵素の結合と阻害。
ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、およびそれらの酵素に対する抗体をＯｎｃｏｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．から購入した。既に記述されているように（Ｋａｌｌｕｒｉ，Ｒ．ら，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：６２０１−５）、ヒト胎盤から単離された天然アレステンを用いて、直接ＥＬＩＳＡを行なった。ＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９はどちらも特異的にアレステンを結合した。これらの酵素は７Ｓドメインを結合しなかった。この結合はＴＩＭＰ−２およびＴＩＭＰ−１結合とはそれぞれ無関係だった。
【０１４２】
アレステンの基底膜分解能を評価するために、マトリゲルをＭＭＰ−２およびＭＭＰ−９と共に穏やかに振盪しながら３７℃で６時間インキュベートした。上清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＩＶ型コラーゲンのα２鎖に対する抗体による免疫ブロットによって解析した。分解アッセイの開始時に、アレステンを順次濃度を増加させて添加し、ＭＭＰ−２活性の阻害を観察した。ＮＣ１ドメインはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で２６ｋＤａの単量体および５６ｋＤａの二量体として分離し、ＩＶ型コラーゲン抗体を用いたウェスタンブロットによって可視化することができた。順次濃度を増加させたアレステンが、ＭＭＰ−２による基底膜の分解を阻害したことから、アレステンはＭＭＰ−２を結合して、それが基底膜コラーゲンを分解するのを防ぎうることが示された。同様の結果がＭＭＰ−９についても得られた。
【０１４３】
実施例１１：大腸菌におけるカンスタチンの組換え生産。
ＩＶ型コラーゲンのα２ＮＣ１ドメインのヌクレオチド配列（配列番号：５）およびアミノ酸配列（配列番号：６）をＦｉｇ．１０に示す。カンスタチンをコードする配列を、ＰＣＲによって、α２ＮＣＩ（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）から、フォワードプライマー５'・−ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＴ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＧＧＣ ＴＡＣ ＣＴＣ−３' （配列番号：７）およびリバースプライマー５' −ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＣＡＧ ＧＴＴ ＣＴＴ ＣＡＴ ＧＣＡ ＣＡＣ−３' （配列番号：８）を使って増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前もって消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）にライゲートした。その構造をＦｉｇ．１１に示す。かかるライゲーションにより、カンスタチンはｐｅｌＢリーダー配列の下流にｐｅｌＢリーダー配列とインフレームで配置され、ペリプラズム局在と可溶性タンパク質の発現が可能になった。タンパク質にはアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクター配列が付加された。配列の３' 末端はポリヒスチジンタグ配列とインフレームでライゲートされた。ｃＤＮＡの３' 末端とｈｉｓ−タグの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードした。陽性クローンの両鎖を配列決定した。
【０１４４】
カンスタチンをコードするプラスミド構築物をまず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、次に発現用のＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。終夜細菌培養物を使ってＬＢ培地の５００ｍｌ培養に接種した。この培養を細胞が０．６のＯＤ600 に達するまで約４時間生育させた。次に、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、タンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後に、５，０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁することによって、細胞を溶解した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ヒルデン）に２ｍｌ／分の流速で４〜６回通した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の１０ｍＭ、２５ｍＭおよび５０ｍＭイミダゾールを１５ｍｌずつ使って洗浄することにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中の２種類の濃度のイミダゾール（１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）を使って、上記のカラムからカンスタチンタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を４℃でＰＢＳに対して２回透析した。透析中に総タンパク質の一部が沈殿した。透析したタンパク質を集め、約３，５００×ｇで遠心分離して、ペレット画分と上清画分に分離した。各画分中のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）および定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析で決定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では２９ｋＤａに単量体バンドが認められ、余分な３ｋＤａはポリリンカー配列およびヒスチジンタグ配列に起因した。カンスタチンを含む溶出液を合わせ、以降のアッセイに使用するためにＰＢＳに対して透析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで解析したカンスタチンタンパク質は、ポリヒスチジンタグ抗体によって検出された。ＩＶ型コラーゲンＮＣ１抗体も、細菌によって発現された組換えコンスタチン（ｃｏｎｓｔａｔｉｎ）タンパク質を検出した。
【０１４５】
大腸菌発現タンパク質は主に可溶性タンパク質として単離された。総タンパク質のうち約４０％がペレット中にあり、残りの６０％が可溶性タンパク質として回収された。タンパク質の全収量は約１５ｍｇ／リットルだった。
【０１４６】
実施例１２：２９３胎児腎細胞におけるカンスタチンの発現。
α２（ＩＶ）ＮＣ１を含有するｐＤＳプラスミド（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）を使って、リーダーシグナル配列がｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）中にインフレームで付加されるような方法で、カンスタチンをＰＣＲ増幅した。全長α２（ＩＶ）鎖の５' 末端に由来するリーダー配列をＮＣ１ドメインの５' 側にクローニングして、培養培地へのタンパク質分泌を可能にした。そのカンスタチン含有組換えベクターを、フランキングプライマーを使って配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンをさらに精製し、それをインビトロ翻訳実験に使用して、タンパク質発現を確認した。そのカンスタチン含有プラスミドおよび対照プラスミドを使用して、２９３細胞を塩化カルシウム法（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，１９９６，「Ｃａｌｃｉｕｍ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ（リン酸カルシウムトランスフェクション）」，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，米国ニューヨーク州ニューヨーク）の９．１．４〜９．１．７頁）でトランスフェクトした。トランスフェクトされたクローンをジェネティシン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）抗生物質処理によって選択した。その細胞を、細胞死が明らかでなくなるまで、上記抗生物質の存在下に３週間放置した。クローンをＴ−２２５フラスコに拡大し、コンフルエントになるまで生育させた。次に上清を集め、アミコン濃縮器（Ａｍｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．）を使って濃縮した。濃縮した上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫ブロッティングおよびＥＬＩＳＡによってカンスタチン発現について解析した。ＥＬＩＳＡにより上清に強い結合が検出された。カンスタチン含有上清をカンスタチン特異的抗体（Ｇｕｎｗａｒ，Ｓ．ら，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６６：１５３１８−２４）を使ったアフィニティークロマトグラフィーにかけた。カンスタチン抗体（抗α２ ＮＣ１抗体，１：２００希釈）との免疫反応性を示す約２４ｋＤａの純粋な単量体を含む主要ピークが同定された。
【０１４７】
実施例１３：カンスタチンは内皮細胞増殖を阻害する。
１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ中で子ウシ大動脈内皮（ＣＰＡＥ）細胞をコンフルエントまで生育させ、接触阻害状態を４８時間保った。細胞を３７℃で５分間のトリプシン処理（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）によって収集した。０．５％ＦＣＳを含むＤＭＥＭに懸濁した１２，５００個の細胞を、１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆した２４穴プレートの各ウェルに加えた。その細胞を５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を取り除き、０．５％ＦＣＳ（非刺激細胞）または１０％ＦＣＳ（刺激および処理細胞）を含むＤＭＥＭで置き換えた。７８６−０、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３細胞を対照とし、同じ方法でコンフルエントに生育させ、トリプシン処理し、プレートに播種した。細胞を０．０２５〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度のカンスタチンまたはエンドスタチンで３回処理した。チミジン取り込み実験では、全てのウェルに１ミリキュリーの3 Ｈ−チミジンを処理時に添加した。２４時間後に、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。放射活性を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅ ＩＩ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）溶液が入っているシンチレーションバイアルに加えた。シンチレーションカウンターを使ってチミジン取り込みを測定した。
【０１４８】
その結果をＦｉｇ．１２ＡとＦｉｇ．１２Ｂに示す。Ｆｉｇ．１２Ａは、ＣＰＡＥ細胞の増殖に対する様々な量のカンスタチンの影響を示すヒストグラムである。チミジン取り込み量をカウント毎分の単位でｙ軸上に示す。ｘ軸上の「０．５％」は、０．５％ＦＣＳ（非刺激）対照であり、「１０％」は１０％ＦＣＳ（刺激）対照である。カンスタチンの濃度を順次増加させて処理することにより、チミジン取り込みは着実に減少した。Ｆｉｇ．１２Ｂは、非内皮細胞７８６−０、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３でのチミジン取り込みに対する順次量を増加させたカンスタチンの影響を示すヒストグラムである。チミジン取り込み量をカウント毎分の単位でｙ軸に示し、ｘ軸は上記３つの細胞株のそれぞれについて０．５％ＦＣＳ（非刺激）対照および１０％ＦＣＳ（刺激）対照を示し、その後ろに、順次増加させたカンスタチンの濃度が示してある。全ての群は三連の試料を表し、バーは平均カウント毎分±平均の標準誤差を表す。
【０１４９】
メチレンブルー染色試験も行なった。３，１００個の細胞を各ウェルに加え、上述のように処理した後、Ｏｌｉｖｅｒらの方法（Ｏｌｉｖｅｒ，Ｍ．Ｈ．ら，１９８９，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ９２：５１３−８）を使って細胞数を数えた。全てのウェルを１００ｍｌの１×ＰＢＳで１回洗浄し、１００ｍｌの１０％ホルマリン／中性緩衝食塩水（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）を室温で３０分間添加することにより、細胞を固定した。ホルマリンを除去した後、０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）中の１％メチレンブルー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）溶液を使って、室温で３０分間、細胞を染色した。染色溶液を除去した後、ウェルを１００ｍｌの０．０１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）で５回洗浄した。１００ｍｌの０．１Ｎ ＨＣｌ／エタノール（１：１混合液）を使って、室温で１時間にわたって、メチレンブルーを細胞から抽出した。メチレンブルー染色の量を、波長６５５ｎｍでの吸光度を使って、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ，米国カリフォルニア州ハーキュリーズ）で測定した。
【０１５０】
その結果をＦｉｇ．１２ＣおよびＦｉｇ．１２Ｄに示す。Ｆｉｇ．１２Ｃは、ＣＰＡＥ細胞による色素の取り込みに対する順次量を増加させたカンスタチンの影響を示すヒストグラムである。ＯＤ655 の吸光度をｙ軸上に示す。「０．１％」は０．１％ＦＣＳ処理（非刺激）対照を表し、「１０％」は１０％ＦＣＳ処理（刺激）対照である。残りのバーは、順次濃度を増加させたカンスタチンによる処理を表す。ＣＰＡＥ細胞では、約０．６２５〜１．２５μｇ／ｍｌのカンスタチン処理レベルで、色素取り込み量が非刺激細胞に見られるレベルにまで低下した。Ｆｉｇ．１２Ｄは、非内皮細胞ＨＥＫ２９３（白抜きのバー）およびＰＣ−３（斜線付きのバー）に対する様々なカンスタチン濃度の影響を示すヒストグラムである。ＯＤ655 の吸光度をｙ軸に示す。「０．１％」は０．１％ＦＣＳ処理（非刺激）対照を表し、「１０％」は１０％ＦＣＳ処理（刺激）対照を表す。バーは１処理濃度につき８ウェルに関する６５５ｎｍでの相対吸光度単位の平均±標準誤差を表す。
【０１５１】
１０％血清刺激内皮細胞の用量依存的阻害が約０．５μｇ／ｍｌのＥＤ50値で検出された（Ｆｉｇ．１２ＡおよびＦｉｇ．１２Ｃ）。４０ｍｇ／ｍｌまでのカンスタチン用量では、腎癌細胞（７８６−０）、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）またはヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）の増殖に対する有意な影響は観察されなかった（Ｆｉｇ．１２ＢおよびＦｉｇ．１２Ｄ）。この内皮細胞特異性は、カンスタチンがおそらくとりわけ効果的な抗血管形成剤であることを示している。
【０１５２】
実施例１４：カンスタチンは内皮細胞移動を阻害する。
血管形成の過程で、内皮細胞は、増殖するだけでなく移動もする。そこで内皮細胞移動に対するカンスタチンの影響を評価した。ＦＢＳによって誘発される走化性に対するカンスタチンとエンドスタチンの阻害効果を、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）で、ボイエンチャンバーアッセイ（Ｎｅｕｒｏ−Ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．，米国メリーランド州キャビンジョン）を使って調べた。１０％ＦＢＳおよび５ｎｇ／ｍｌ ＤｉＩＣ１８（３）生細胞蛍光染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，米国オレゴン州ユージーン）を含むＭ１９９培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ）で、ＨＵＶＥＣ細胞を一晩生育させた。トリプシン処理し、０．５％ＦＢＳを含むＭ１９９で細胞を洗浄、希釈した後、６０，０００個の細胞を、カンスタチン（０．０１または１．００ｍｇ／ｍｌ）と共に、またはカンスタチンを伴なわずに、上チャンバーウェルに播種した。２％ＦＢＳを含むＭ１９９培地を化学誘引物質として下チャンバーに入れた。細胞含有コンパートメントを孔径８μｍのポリカーボネートフィルター（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．，米国カリフォルニア州リバーモア）で化学誘引物質から隔離した。そのチャンバーを５％ＣＯ2 および湿度９５％、３７℃で４．５時間インキュベートした。非移動細胞を捨て、上ウェルをＰＢＳで洗浄した後、フィルターをプラスチック製の刃で削り、４％ホルムアルデヒド／ＰＢＳ中で固定し、ガラススライド上に置いた。蛍光強拡大視野を用いて、数個の独立した均質な像を、画像処理ソフトウェアＰＭＩＳ（Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ，米国アリゾナ州トゥーソン）で操作したデジタルＳｅｎＳｙｓTMカメラで記録した。ＯＰＴＩＭＩＺＥ ６．０ソフトウェアプログラム（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ニューヨーク州ロチェスター）を使って細胞数を数えた（Ｋｌｅｍｋｅ，Ｒ．Ｌ．ら，１９９４，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２７：８５９−６６）。
【０１５３】
その結果をＦｉｇ．１３に示す。この図は、ＶＥＧＦなし（ＶＥＧＦなしまたは血清）およびＶＥＧＦ（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）による細胞の処理、および０．０１μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌカンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌカンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌカンスタチン）による処理について、１視野あたりの移動した内皮細胞数（ｙ軸）を示す棒グラフである。
【０１５４】
カンスタチンはＨＵＶＥＣの移動を阻害し、有意な効果が１０ｎｇ／ｍｌで観察された。内皮細胞の増殖と移動の両方を阻害できるカンスタチンの能力から、カンスタチンは血管形成の過程の１つを超える段階で作用することが示唆される。あるいはカンスタチンは、刺激された内皮細胞にとって、増殖と移動の両方に影響を及ぼしうるアポトーシスシグナルとして作用するのかもしれない。アポトーシス誘導は、別の抗血管形成分子であるアンジオスタチン（Ｏ' Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．Ｓ．ら，１９９４，Ｃｅｌｌ ７９：３１５−２８；Ｌｕｃａｓ，Ｒ．ら，１９９８，Ｂｌｏｏｄ ９２：４７３０−４１）について報告されている。
【０１５５】
実施例１５：カンスタチンは内皮管形成を阻害する。
カンスタチンの抗血管形成能に関する最初の試験として、マウス基底膜タンパク質の固体ゲルであるマトリゲルでの内皮細胞による管形成を妨害するその能力について評価した。マウス大動脈内皮細胞をマトリゲル上で培養すると、それらは素早く整列し、中空管様の構造を形成する。
【０１５６】
マトリゲル（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国マサチューセッツ州ベッドフォード）を２４ウェルプレートの各ウェルに加えて（３２０ｍｌ）、重合させた（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ． １９０：８５４−６３）。抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）に懸濁した２５，０００個のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥ）を、マトリゲルで被覆した各ウェルに移した。その細胞を、順次濃度を増加させたカンスタチン、ＢＳＡ、滅菌ＰＢＳまたはα５−ＮＣ１ドメインで処理した。全てのアッセイを三連で行なった。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（接眼レンズ３．３×、対物レンズ１０×）を使って観察した。次に、４００ＤＫ被覆ＴＭＡＸフィルム（Ｋｏｄａｋ）を使って細胞を写真撮影した。細胞をｄｉｆｆ−ｑｕｉｋ固定液（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）で染色し、再び写真撮影した（Ｇｒａｎｔ，Ｄ．Ｓ．ら，１９９４，Ｐａｔｈｏｌ．Ｒｅｓ．Ｐｒａｃｔ．１９０：８５４−６３）。１０視野を観察し、管の数を数えて平均した。
【０１５７】
その結果をＦｉｇ．１４に示す。この図は、ＢＳＡ（白四角）、カンスタチン（黒四角）およびα５ＮＣ１（白丸）で様々な処理を施した場合の管形成の量を対照（ＰＢＳ処理ウェル）管形成の百分率（ｙ軸）として表すグラフである。垂直方向の線分は平均の標準誤差を表す。この結果は、カンスタチンが対照と比較して内皮管形成を著しく減少させることを示している。
【０１５８】
カンスタチンは用量依存的に内皮管形成を選択的に阻害し、１ｍｇのカンスタチンタンパク質の添加により、ほぼ完全な管形成の阻害が観察された（Ｆｉｇ．１４）。対照タンパク質は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もＩＶ型コラーゲンα５鎖のＮＣ１ドメインも、内皮管形成に影響しなかったことから、このアッセイにおけるカンスタチンの阻害効果はカンスタチンに特異的であって、添加タンパク質の含有量によるものではないことが証明された。これらの結果はカンスタチンが抗血管形成剤であることを示している。
【０１５９】
実施例１６：カンスタチンはインビボで腫瘍成長を阻害する。
ヒト前立腺腺癌細胞（ＰＣ−３細胞）を培養から収集し、滅菌ＰＢＳ中の２００万個の細胞を７〜９週齢の雄性ＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍を約４週間増殖させた後、動物を４匹ずつの群に分割した。実験群には、総体積０．１ｍｌのＰＢＳ中に１０ｍｇ／ｋｇの用量のカンスタチンを毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群には等体積のＰＢＳを毎日投与した。処理の開始時点（第０日）で、腫瘍の容積は、対照マウスの場合は８８ｍｍ3 〜１３５ｍｍ3 、カンスタチン処理マウスの場合は１０８ｍｍ3 〜１４９ｍｍ3 の範囲にあった。各群には５匹のマウスを含めた。所定の日の腫瘍容積計算値を処理第０日の容積で割ることによって腫瘍容積率（Ｖ／Ｖ0 ）を求めた。その結果をＦｉｇ．１５Ａに示す。この図は、処理日（ｘ軸）に対してプロットした腫瘍容積率（ｙ軸）±標準誤差を示すグラフである。カンスタチン処理（黒四角）腫瘍は、対照（白四角）と比較してサイズがわずかしか増加しなかった。
【０１６０】
第二のＰＣ−３実験では、ＰＣ−３細胞を培養から収集し、３００万個の細胞を６〜７週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに注射し、腫瘍を約２週間にわたって皮下で増殖させた後、マウスを４匹ずつの群に分割した。実験群（４匹）には総体積０．２ｍｌのＰＢＳ中に３ｍｇ／ｋｇの用量のカンスタチンまたは同じ体積のＰＢＳ中に８ｍｇ／ｋｇの用量のエンドスタチンを毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群（４匹）には、等体積のＰＢＳを毎日投与した。腫瘍の長さと幅をノギスを使って測定し、標準的な公式：長さ×幅2 ×０．５２を用いて腫瘍容積を計算した。腫瘍容積は２６ｍｍ3 〜７３ｍｍ3 の範囲にあり、上述のように所定の日の腫瘍容積計算値を処理第０日の容積で割ることによって腫瘍容積率（Ｖ／Ｖ0 ）を求めた。その結果をＦｉｇ．１５Ｂに示す。この図は、処理日（ｘ軸）に対してプロットした腫瘍容積率（ｙ軸）±標準誤差を示すグラフである。対照（白四角）と比較して、カンスタチン処理（黒四角）腫瘍はサイズがわずかしか増加せず、その結果は、エンドスタチン（白丸）で達成された結果と比べてひけをとらなかった。
【０１６１】
腎細胞癌細胞モデルとして、２００万個の７８６−０細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射した。腫瘍を約１００ｍｍ3 または約７００ｍｍ3 まで増殖させた。各群には６匹のマウスを含めた。滅菌ＰＢＳ中のカンスタチンを１０ｍｇ／ｋｇの濃度で１０日間にわたって毎日Ｉ．Ｐ．注射した。対照群には同体積のＰＢＳを投与した。その結果をＦｉｇ．１５Ｃ（１００ｍｍ3 腫瘍）およびＦｉｇ．３１Ｄ（７００ｍｍ3 腫瘍）に示す。どちらの群でも、カンスタチン処理（黒四角）腫瘍は、対照（白四角）と比較して実際に収縮した。
【０１６２】
大腸菌で生産されたカンスタチンは、小さい腎細胞癌（７８６−０）腫瘍（１００ｍｍ3 ，Ｆｉｇ．１５Ｃ）および大きい腎細胞癌（７８６−０）腫瘍（７００ｍｍ3 ，Ｆｉｇ．１５Ｄ）の増殖を抑制した。重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス中のヒト前立腺（ＰＣ−３）腫瘍の場合、１０ｍｇ／ｋｇのカンスタチンにより、腫瘍容積率がビヒクルのみを注射したマウスの５５％に保たれた。胸腺欠損（ｎｕ／ｎｕ）マウスで、さらに低用量のカンスタチンおよびエンドスタチンを使用したところ、３ｍｇ／ｋｇのカンスタチンは８ｍｇ／ｋｇのエンドスタチンと同程度の抑制効果を示した。どのインビボ試験でも、マウスは消耗の徴候を示すことなく健康そうな外観を呈し、処理中に死亡したマウスはいなかった。
【０１６３】
実施例１７：カンスタチン処理マウスでのＣＤ３１免疫組織化学。
インビボでの腫瘍サイズの減少から、これらの腫瘍における血管の形成に対する抑制効果が示唆された。腫瘍血管を検出するために、抗ＣＤ３１抗体アルカリホスファターゼコンジュゲートによる免疫組織化学をパラフィン包埋腫瘍切片で行なった。摘出した腫瘍をスカペル（ｓｃａｐｅｌ）で厚さ約３〜４ｍｍの数片に切断した後、４％パラホルムアルデヒド中で２４時間固定した。次に組織をＰＢＳに２４時間切り換えた後、脱水し、パラフィン包埋した。パラフィンに包埋した後、３ｍｍ組織切片を切断し、マウントした。切片を脱パラフィンし、再水和し、３００ｍｇ／ｍｌプロテアーゼＸＸＩＶ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国ミズーリ州セントルイス）で３７℃にて５分間前処理した。１００％エタノール中で消化を停止した。切片を風乾し、再水和し、１０％ウサギ血清でブロックした。次にスライドをラット抗マウスＣＤ３１モノクローナル抗体（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，米国カリフォルニア州サンディエゴ）の１：５０希釈液と共に４℃で一晩インキュベートした後、ウサギ抗ラット免疫グロブリン（ＤＡＫＯ）およびラットＡＰＡＡＰ（ＤＡＫＯ）の１：５０希釈と共に３７℃でそれぞれ３０分間、順次インキュベートした。新しいフクシンで発色反応を行なった。切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１６４】
カンスタチン処理腫瘍には、対照腫瘍と比較して、血管数の減少が認められた。
【０１６５】
実施例１８：大腸菌におけるタムスタチンおよびタムスタチン変異体の組換え生産。
ＩＶ型コラーゲンのＮＣ１ドメインのα３鎖のヌクレオチド配列（配列番号：９）およびアミノ酸配列（配列番号：１０）をＦｉｇ．１６に示す。タムスタチンをコードする配列を、ＰＣＲによって、α３ＮＣＩ（ＩＶ）／ｐＤＳベクター（Ｎｅｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｇ．ら，１９９３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６８：８４０２−５）から、フォワードプライマー５' −ＣＧＧ ＧＡＴ ＣＣＧ ＧＧＴ ＴＴＧ ＡＡＡ ＧＧＡ ＡＡＡ ＣＧＴ−３' （配列番号：１１）およびリバースプライマー５' −ＣＣＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＴＣＡ ＧＴＧ ＴＣＴ ＴＴＴ ＣＴＴ ＣＡＴ−３' （配列番号：１２）を使って増幅した。得られたｃＤＮＡフラグメントをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、前もって消化しておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）にライゲートした。その構造をＦｉｇ．１７に示す。かかるライゲーションにより、タムスタチンはｐｅｌＢリーダー配列の下流にｐｅｌＢリーダー配列とインフレームで配置され、ペリプラズム局在と可溶性タンパク質の発現が可能になった。タンパク質にはアミノ酸ＭＤＩＧＩＮＳＤ（配列番号：１３）をコードする追加のベクター配列が付加された。配列の３' 末端はポリヒスチジンタグ配列とインフレームでライゲートされた。ｃＤＮＡの３' 末端とｈｉｓ−タグの間の追加のベクター配列はアミノ酸ＫＬＡＡＡＬＥ（配列番号：１４）をコードした。陽性クローンの両鎖を配列決定した。タムスタチンをコードするプラスミド構築物をまず大腸菌ＨＭＳ１７４（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換し、次に発現用のＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ，米国ウィスコンシン州マディソン）に形質転換した。終夜細菌培養物を使ってＬＢ培地（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，米国ペンシルバニア州ピッツバーグ）の５００ｍｌ培養に接種した。この培養を細胞が０．６のＯＤ600 に達するまで約４時間生育させた。次に、最終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加することによって、タンパク質発現を誘導した。２時間の誘導後に、５，０００×ｇでの遠心分離によって細胞を収集し、６Ｍグアニジン、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁することによって、細胞を溶解した。再懸濁した細胞を短時間超音波処理し、１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。上清画分を５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ・ヒルデン）に毎分２ｍｌの流速で４〜６回通した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１０ｍＭイミダゾールと２５ｍＭイミダゾールの両方を使って洗浄することにより、非特異的に結合したタンパク質を除去した。８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 、０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中のイミダゾール濃度を順次増加して（５０ｍＭ、１２５ｍＭおよび２５０ｍＭ）、上記のカラムからタムスタチンタンパク質を溶出させた。溶出したタンパク質を４℃のＰＢＳに対して２回透析した。透析中に総タンパク質の一部が沈殿した。透析したタンパク質を集め、約３，５００×ｇで遠心分離して、不溶性（ペレット）画分と可溶性（上清）画分に分離した。
【０１６６】
大腸菌発現タムスタチンは主に可溶性タンパク質として単離され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析では３１ｋＤａに単量体バンドが認められた。余分な３ｋＤａはポリリンカー配列およびヒスチジンタグ配列に起因する。このバンドを含む溶出画分を、以降の実験に使用した。各画分中のタンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，米国イリノイ州ロックフォード）および走査デンシトメトリーを用いた定量的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析によって決定した。還元条件下では、非還元条件でタムスタチンの二量体に相当する６０ｋＤ付近に観察されたバンドが、３１ｋＤａの単一バンドとして分離した。タンパク質の全収量は１リットルにつき約５ｍｇだった。
【０１６７】
５３個のＮ末端アミノ酸を欠く組換え切形型タムスタチン（タムスタチン−Ｎ５３）を大腸菌中で生産し、他の変異体について以前記載されているようにして精製した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。この変異体は、α３（ＩＶ）ＮＣ１単量体内の切形アミノ酸の位置を示す構成図であるＦｉｇ．１８に記載されている。黒丸は、「タムスタチン−Ｎ５３」を生成するためにタムスタチンから欠失させたＮ末端の５３個のアミノ酸残基に相当する（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。短いバーでマークしたジスルフィド結合はα１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１において存在しているように配置されている（Siebold,B. et al.,1988,Eur.J.Biochem. 176:617-24）。明瞭にするため、可能な２つのジスルフィド立体配置の内の１つのみを示す。
【０１６８】
ヒトα（ＩＶ）ＮＣ１に対するウサギ抗体を以前に記載されるようにして調製した（Kalluri,R. et al.,1997,J.Clin.Invest. 99:2470-8・）。モノクローナルラット抗マウスＣＤ３１（血小板内皮細胞接着分子、ＰＥＣＡＭ−１）抗体を（PharMingen,San Diego,California,USA・）から購入した。ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体、ＦＩＴＣ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体、およびホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体をSigma Chemical Co.（St.Louis,Missouri,USA・）から購入した。
【０１６９】
前記得られた濃縮上清を、以前に記載されたようにしてタムスタチンの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティングで解析した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。一次元のＳＤＳ−ＰＡＧＥを１２％分離ゲルおよび不連続の緩衝液系を用いて行った。分離したタンパク質をニトロセルロース膜に転写し、２％ＢＳＡで室温にて３０分間ブロックした。残りの結合部位をブロックした後、膜を完全に洗浄用緩衝液で洗浄し、１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで１：１０００に希釈された一次抗体と共にインキュベートした。インキュベーションはシェーカー上で一夜室温にて行った。次いで、ブロットを洗浄用緩衝液で完全に洗浄し、シェーカー上で室温にて３時間ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合した二次抗体と共にインキュベートした。ブロットを再度完全に洗浄し、基質（０．０１％塩化コバルトおよびニッケルアンモニウム含有０．０５Ｍリン酸緩衝液中のジアミノベンジジン）を加えて、室温にて１０分間インキュベートした。次いで、基質溶液を流し出し、過酸化水素含有基質緩衝液を加えた。バンドを発色させた後、反応を蒸留水で止め、ブロットを乾燥した。３１ｋＤａの単一バンドが観察された。
【０１７０】
実施例１９：２９３胎児肝細胞におけるタムスタチンの発現。
ヒトタムスタチンをまた、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞ベクターを用い２９３胎児肝細胞において分泌性の可溶性タンパク質として生産した。この組換えタンパク質（いずれの精製用または検出用タグをも有しない）をアフィニティークロマトグラフィーを用いて単離し、純粋な単量体型をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロット解析により主要ピークにおいて検出した。
【０１７１】
α３（ＩＶ）ＮＣ１含有ｐＤＳプラスミド（Neilson,E.G. et al.,1993,J.Biol.Chem. 268:8402-5）を用い、ｐｃＤＮＡ３．１真核細胞発現ベクター（InVitrogen,San Diego,California,USA・）にインフレームでリーダーシグナル配列を付加するようにＰＣＲでタムスタチンを増幅した。全長α３（ＩＶ）鎖の５’末端由来のリーダー配列を、タンパク質分泌が培養培地に生ずるようにＮＣ１ドメインの５’にクローニングした。タムスタチン含有組換えベクターを、フランキングプライマーを用いて両鎖について配列決定した。エラーを含まないｃＤＮＡクローンをさらに精製し、タンパク質発現を確認するためにインビトロでの翻訳研究に使用した。タムスタチン含有プラスミドおよび対照プラスミドを用いて、塩化カルシウム法を用いて２９３細胞をトランスフェクトした（Sambrook,J. et al.,1989,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,New York,USA,pps.16.32-16.40・）。トランスフェクトされたクローンをジェネティシン（Life Technologies/Gibco BRL,Gaithersburg,Maryland,USA・）抗生物質処理により選抜した。細胞は、明確な細胞死がなくなるまで抗生物質の存在下で３週間放置した。クローンをＴ−２２５フラスコへ拡張し、コンフルエントまで増殖させた。次いで、上清を回収し、アミコン濃縮器を用いて濃縮した（Amicon,Inc.,Beverly,Massachusetts,USA・）。濃縮上清をタムスタチンの発現についてＳＤＳ−ＰＡＧＥ、イムノブロッティングおよびＥＬＩＳＡで解析した。上清における強い結合がＥＬＩＳＡで検出された。
【０１７２】
タムスタチン含有上清をアフィニティークロマトグラフィーに供し、抗タムスタチンおよび抗６−ヒスチジンタグ抗体（Gunwar,S. et al.,1991,J.Biol.Chem. 266:15318-24・）の両方を用いて免疫検出した。タムスタチン抗体と免疫反応する約３１ｋＤａの単量体を含む主要ピークを同定した。
【０１７３】
実施例２０：タムスタチンは内皮細胞増殖を阻害する。
Ｃ−ＰＡＥ細胞に対するタムスタチンの抗増殖性作用を、大腸菌産生可溶性タンパク質を用いて3 Ｈ−チミジン取り込みアッセイにより調べた。
細胞株および培養。７８６−０（腎明細胞癌株）、ＰＣ−３（ヒト前立腺腺癌細胞株）、Ｃ−ＰＡＥ（ウシ肺動脈内皮細胞株）、ＭＡＥ（マウス大動脈内皮細胞株）を全てアメリカンタイプカルチャーコレクションから得た。７８６−０細胞株およびＣ−ＰＡＥ細胞株をＤＭＥＭ（Life Technologies/Gibco BRL,Gaithersburg,Maryland,USA・）中に維持し、ＥＣＶ−３０４細胞をＭ１９９中に維持し、また、ＭＡＥ細胞を１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、および１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加したＥＧＭ−２（Clonetics Corporation,San Diego,California,USA）中に維持した。
増殖アッセイ。Ｃ−ＰＡＥ細胞を１０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中でコンフルエンスまで増殖させ、４８時間接触阻害を続けた。Ｃ−ＰＡＥ細胞を第２パッセージおよび第４パッセージの間で用いた。７８６−０細胞とＰＣ−３細胞を本実験において非内皮性対照として用いた。細胞を３７℃で５分間のトリプシン処理（Life Technologies/Gibco BRL,Gaithersberg,Maryland,USA・）により回収した。０．１％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭ中の１２，５００個の細胞のサスペンジョンを１０μｇ／ｍｌフィブロネクチンで被覆した２４穴プレートの各ウェルに添加した。細胞を５％ＣＯ2 および湿度９５％で３７度にて２４時間インキュベートした。培地を除去して、２０％ＦＣＳ含有ＤＭＥＭで置き換えた。非刺激対照細胞を０．１％ＦＣＳと共にインキュベートした。細胞を０．０１〜１０ｍｇ／ｍｌの範囲の種々の濃度のタムスタチンで処理した。全てのウェルに処理開始から１２時間後に１ｍＣｕｒｉｅの3 Ｈ−チミジンを添加した。２４時間後、培地を除去し、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。細胞を１Ｎ ＮａＯＨで抽出し、４ｍｌのＳｃｉｎｔｉＶｅｒｓｅＩＩ（Fisher Scientific,Pittsburgh,Pennsylvania,USA・）溶液を含むシンチレーションバイアルに添加した。チミジン取り込みをシンチレーションカウンターを用いて測定した。
【０１７４】
結果を、種々の濃度のタムスタチン（ｘ軸）で処理した場合のＣ−ＰＡＥ細胞（Ｆｉｇ．１９Ａ）、ＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．１９Ｂ）および７８６−０細胞（Ｆｉｇ．１９Ｃ）についての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示すヒストグラムであるＦｉｇ．１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃに示す。全ての群は３連の試料を示す。タムスタチンは用量依存的様式で２０％ＦＣＳ刺激3 Ｈ−チミジン取り込みを有意に阻害した。ＥＤ50は約０．０１ｍｇ／ｍｌであった（Ｆｉｇ．１９Ａ）。また、前立腺癌細胞（ＰＣ−３）または腎癌細胞（７８６−０）で、タムスタチン２０ｍｇ／ｍｌまでの濃度でさえ、有意な抗増殖性作用は観察されなかった（Ｆｉｇ．１９Ｂおよび１９Ｃ）。タムスタチン処理（０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）における3 Ｈ−チミジン取り込みの平均値と対照の平均値との間の差は有意であった（Ｐ＜０．０５）。ＰＣ−３細胞または７８６−０細胞をタムスタチンで処理した場合、阻害作用は観察されなかった（Ｆｉｇ．１９Ｂ、１９Ｃ）。各カラムは３連のウェルの平均±ＳＥを表す。この実験は３回繰り返した。星印でマークした棒は、片側スチューデントのｔ検定でＰ＜０．０５で有意である。
【０１７５】
実施例２１：タムスタチンは内皮管形成を阻害する。
マトリゲル（matrigel）（Collaborative Biomedical Products,Bedford,Massachusetts,USA ）を２４穴プレートの各ウェルに添加し（３２０ｍｌ）、重合させた（Grant,D.S. et al.,1994,Pathol.Res.Pract.190:854-63）。抗生物質を含まないＥＧＭ−２培地（Clonetics Corporation,San Diego,California,USA）中の２５，０００個のＭＡＥ細胞のサスペンジョンをマトリゲルで被覆した各ウェルに移した（Grant,D.S. et al.,1994,Pathol.Res.Pract. 190:854-63・）。細胞を順に濃度を増加させたタムスタチン、ＢＳＡまたは７Ｓドメインで処理した。対照細胞は滅菌したＢＳＡと共にインキュベートした。全てのアッセイは３連で行った。細胞を３７℃で２４〜４８時間インキュベートし、ＣＫ２オリンパス顕微鏡（３．３×接眼レンズ、１０×対物レンズの拡大）を用いて観察した。次いで、細胞を４００ＤＫで被覆したＴＭＡＸフィルム（Kodak・）を用いて写真撮影した。細胞をジフ−クイック（diff-quik・）固定液（Sigma Chemical Co.,St.Louis,Missouri,USA）で染色し、再度写真撮影した（Grant,D.S. et al.,1994,Pathol.Res.Pract. 190:854-63・）。１０個の視野を観察し、管の数を実験プロトコルを知らない２人の研究者に計数させ、平均をとった。
【０１７６】
結果をＦｉｇ．２０に示す。マウス大動脈内皮細胞を、マウス基底膜タンパク質の固体ゲルであるマトリゲル上で培養すると、それらは急速に整列し、中空管様構造を形成する（Haralabopoulos,G.C. et al.,1994,Lab.Invest. 71:575-82・）。２９３細胞で生産されたタムスタチンは、ＢＳＡ対照と比較して用量依存的様式でＭＡＥ細胞における内皮管形成を有意に阻害した（Ｆｉｇ．２０）。１ｍｇ／ｍｌのタンパク質による処理後の管形成の割合はＢＳＡ９８．０±４．０、タムスタチン１４．０±４．０であった。同様な結果がまた、大腸菌で生産したタムスタチンを用いて得られた。ＩＶ型コラーゲンの７Ｓドメイン（Ｎ末端非コラーゲン性ドメイン）は内皮管形成に作用しなかった。タムスタチンによる最大の阻害に８００〜１０００ｎｇ／ｍｌの間で達した。タムスタチン処理（黒丸、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌ）の平均割合の値と対照〔ＢＳＡ（白四角）、７Ｓドメイン（白丸）〕の平均割合の値との間の差は有意（ｐ＜０．０５）であった。各点は３連のウェルの平均±ＳＥを表す。この実験は３回繰り返した。星印でマークしたデータ点は、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。充分に形成された管が７Ｓドメイン処理で観察された。０．８ｍｇ／ｍｌのタムスタチンで処理したＭＡＥ細胞は管形成の減少を示した。
【０１７７】
新たな毛細血管の形成に対するタムスタチンのインビボでの作用を評価するために、マトリゲルプラグアッセイ（matrigel plug assay・）を行った（Passaniti,A. et al.,1992,Lab Invest. 67:519-29）。５〜６週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,Maine,USA・）を得た。マトリゲル（Collaborative Biochemical Products,Bedford,Massachusetts,USA）を一夜４℃で溶解した。Ｃ５７／ＢＬ６マウスに注射する前に、２０Ｕ／ｍｌのヘパリン（Pierce Chemical Co.,Rockford,Illinois,USA・）、１５０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（R&D Systems,Minneapolis,Minnesota,USA・）、および１ｍｇ／ｍｌのタムスタチンと混合した。対照群には血管形成インヒビターを与えなかった。マトリゲル混合物を２１ゲージ針を用いて皮下注射した。１４日後、マウスを屠殺し、マトリゲルプラグを除去した。マトリゲルプラグを室温にて４時間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）にて固定し、次いで２４時間、ＰＢＳに切り換えた。プラグをパラフィンで包埋し、切片にし、Ｈ＆Ｅ染色した。切片を光学顕微鏡で調べ、１０個の強拡大（high power）視野から血管の数を計数し、平均をとった。全切片は、研究プロトコルを知らない病理学者によりコードされ、観察された。
【０１７８】
マトリゲルを大腸菌に生産させたタムスタチンの有りまたはなしで、ｂＦＧＦおよびヘパリンの存在下に置いた場合、血管数の６７％の減少が、１ｍｇ／ｍｌのタムスタチン処理で観察された。強拡大視野当たりの血管数は、タムスタチン、２．２５±１．３２および対照、７．５０±２．１７であった。各カラムは１群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを表わす。タムスタチン（１ｍｇ／ｍｌ）はＰＢＳで処理した対照と比較してインビボでの血管新生を有意に阻害した。タムスタチン処理動物の平均割合の値と対照動物の平均割合の値との間の差は有意（ｐ＜０．０５）であった。タムスタチン処理は、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。
【０１７９】
実施例２２：タムスタチンおよびタムスタチンの変異体はインビボでの腫瘍成長を阻害する。
５００万個のＰＣ−３細胞を回収し、７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスの背に皮下注射した。ノギスを用いて測定し、容積を標準式 幅2 ×長さ×０．５２を用いて計算した。腫瘍を約１００ｍｍ3 まで増殖させ、次いで、動物を５匹または６匹のマウスの群に分けた。滅菌したＰＢＳ中のタムスタチンまたはマウスエンドスタチンを、各々の実験群に対し、１０日間、毎日腹腔内注射（２０ｍｇ／ｋｇ）した。対照群にはビヒクル注射を行った（ＢＳＡまたはＰＢＳ）。腫瘍容積を１０日間に渡り２または３日ごとに計算した。結果を、ＰＢＳ対照（白四角）、２０ｍｇ／ｋｇのタムスタチン（黒丸）および２０ｍｇ／ｋｇのエンドスタチン（白丸）についての処理日数（ｘ軸）に対するｍｍ3 での腫瘍容積（ｙ軸）を示すグラフであるＦｉｇ．２１Ａに示す。大腸菌で生産したタムスタチンは、ＰＣ−３ヒト前立腺腫瘍の増殖を有意に阻害した（Ｆｉｇ．２１Ａ）。タムスタチンは２０ｍｇ／Ｋｇで、エンドスタチン２０ｍｇ／ｋｇにおけるのと同様に腫瘍成長を阻害した（Ｆｉｇ．２１Ａ）。腫瘍成長に対する有意な阻害作用が１０日目に観察された（対照２０２．８±５０．０ｍｍ3 、タムスタチン８２．９±２５．２ｍｍ3 、エンドスタチン６８．９±１６．７ｍｍ3 ）。タムスタチンまたはエンドスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較して、ヒト前立腺腺癌細胞（ＰＣ−３）腫瘍の増殖を阻害した。この実験は、腫瘍容積が１００ｍｍ3 未満の時に開始した。
【０１８０】
マウスで確立した他の原発性腫瘍に対するタムスタチンの作用も研究した。２００万個の７８６−０腎細胞癌細胞を７〜９週齢雄性胸腺欠損ヌードマウスの背に皮下注射した。腫瘍を約６００〜約７００ｍｍ3 まで増殖させ、次いで、動物を６匹ずつの群に分けた。滅菌したＰＢＳ中のタムスタチンを１０日間、毎日、腹腔内注射（６ｍｇ／ｋｇ）した。対照群にはＢＳＡ注射を行った。結果を、ＰＢＳ対照（白四角）および６ｍｇ／ｋｇのタムスタチン（黒丸）についての処理日数（ｘ軸）に対するｍｍ3 での腫瘍容積（ｙ軸）を示すグラフであるＦｉｇ．２１Ｂに示す。大腸菌で生産したタムスタチンは６ｍｇ／ｋｇで、ＢＳＡ対照と比較して、７８６−０ヒト腎細胞癌の腫瘍成長を阻害した（Ｆｉｇ．２１Ｂ）。腫瘍成長に対する有意な阻害作用が１０日目に観察された（対照１０９６±１７９．７ｍｍ3 、タムスタチン６１９±１２０．７ｍｍ3 ）。タムスタチンの毎日の腹腔内注射は、対照と比較して、ヒト腎細胞癌（７８６−０）の腫瘍成長を阻害した。この実験は、腫瘍容積が６００〜７００ｍｍ3 の時に開始した。各点は、１群当たり５〜６匹のマウスの平均±ＳＥを表わす。星印のデータ点マーカーは、片側スチューデントのｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。
【０１８１】
ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメイン〔α３（ＩＶ）ＮＣ１〕の部分はグッドパスチャー（Goodpasture・）症候群の病原性エピトープである（Butkowski,R.J. et al.,1987,J.Biol.Chem. 262:7874-7;Saus,J. et al.,1988,J.Biol.Chem. 263:13374-80;Kalluri,R. et al.,1991,J.Biol.Chem. 266:24018-24・）。グッドパスチャー症候群は、肺出血および／または急速に進行する糸球体腎炎を特徴とする自己免疫疾患である（Wilson,C.&F.Dixon,1986,The Kidney,W.B. Sanders Co.,Philadelphia,Pennsylvania,USA,pps.80-89;Hudson,B.G. et al.,1993,J.Biol.Chem. 268:16033-6・）。これらの症状は、α３（ＩＶ）ＮＣ１に対する自己抗体の結合を介する腎糸球体および歯槽基底膜の崩壊により生ずる（Wilson,1986,前記；Hudson,1993,前記）。幾つかのグループがα３（ＩＶ）上のグッドパスチャー自己抗原の位置を位置づけまたは予測することを試みており（Kalluri,R. et al.,1995,J.Am.Soc.Nephrol. 6:1178-85;(Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8;Levy,J.B. et al.,1997,J.Am.Soc.Nephrol. 8:1698-1705;Kefalides,N.A. et al.,1993,Kidney Int. 43:94-100;Quinones,S. et al.,1992,J.Biol.Chem. 267:19780-4(J.Biol.Chem. 269:17358・における誤植）;Netzer,K.O. et al.,1999,J.Biol.Chem. 274:11267-74）、Ｎ末端、Ｃ末端、および中央部分の残基がエピトープの位置であると報告している。最近、最も可能性の高い疾患関連病原性エピトープがＮ末端位置において同定され（Hellmark,T. et al.,1999,Kidney Int. 55:936-44・）、さらに、Ｎ末端の４０個のアミノ酸に限定された。切形型タムスタチンは、病原性グッドパスチャー自己エピトープに相当するＮ末端の５３個のアミノ酸を欠くように設計された（タムスタチン−Ｎ５３）。この変異体タンパク質を以下の実験で用いた。
【０１８２】
２００万個の７８６−０腎細胞癌細胞を７〜９週齢の雄性胸腺欠損ヌードマウスの背に皮下注射した。腫瘍を約１００〜１５０ｍｍ3 のサイズまで増殖させた。次いで、マウスを５匹の群に分け、１０日間、２０ｍｇ／ｋｇの５３個のＮ末端アミノ酸を欠く大腸菌で発現させた切形型タムスタチンを毎日、腹腔内注射した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。対照マウスにはＰＢＳ注射を行った。結果を、対照マウス（白四角）およびタムスタチン変異体Ｎ２６で処理したマウス（黒丸）についての処理日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｙ軸）の増加を示すグラフであるＦｉｇ．２２に示す。大腸菌で生産したタムスタチン−Ｎ５３は２０ｍｇ／ｋｇで、対照と比較して４日〜１０日で７８６−０ヒト腎腫瘍の増殖を有意に阻害した（１０日目：タムスタチン−Ｎ５３ １１０．０±２９．０ｍｍ３、対照３４５．０±２４．０ｍｍ３）（Ｆｉｇ．２２）。各点は、５〜６匹マウス／群の平均±ＳＥを表わす。星印のデータ点マーカーは、片側スチューデントｔ検定でｐ＜０．０５で有意であった。
【０１８３】
実施例２３：α３（ＩＶ）ＮＣ１およびＣＤ３１の免疫組織化学的染色。
７週齢の雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス由来の腎臓および皮膚組織を免疫蛍光顕微鏡により評価するために加工した。組織試料を液体窒素中で凍結し、４ｍｍ厚の切片を用いた。組織は以前に記載されているようにして間接的な免疫蛍光技術により加工した（Kalluri,R. et al.,1996,J.Biol.Chem. 271:9062-8）。凍結切片を、一次抗体、ポリクローナル抗ＣＤ３１抗体（１：１００希釈）またはポリクローナル抗α３（ＩＶ）ＮＣ１抗体（１：５０希釈）で染色した後、二次抗体、ＦＩＴＣ結合抗ラットＩｇＧ抗体またはＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧ抗体で染色した。免疫蛍光をオリンパス蛍光顕微鏡（東京、日本国）の下で調べた。陰性対照は、一次抗体を無関係な免疫前血清で置き換えることにより行った。
【０１８４】
マウス腎臓では、ａ３（ＩＶ）ＮＣ１の発現がＧＢＭおよび血管基底膜において観察された。ＣＤ３１、ＰＥＣＡＭ−１の発現は糸球体内皮および血管内皮において観察された。マウス皮膚では、α３（ＩＶ）ＮＣ１は表皮基底膜および血管基底膜に存在しなかった。ＣＤ３１の発現は皮膚の血管内皮において観察された。ＣＤ３１発現は、マウス腎臓における糸球体および小管の内皮において観察され、α３（ＩＶ）ＮＣ１発現は糸球体基底膜および糸球体外血管基底膜において観察された。ＣＤ３１の発現は、マウス皮膚の真皮小管の内皮において観察された。α３（ＩＶ）ＮＣ１発現は内皮基底膜に存在せず、真皮小管の基底膜においてほとんど観察されなかった。これらの結果は、タムスタチンの分布が制限される例を示す。
【０１８５】
実施例２４：抗血管形成タンパク質の変異体およびフラグメント
アレステンおよびカンスタチンのフラグメントおよび変異体も、マリヤマら（1992,J.Biol.Chem. 267:1253-8）のシュードモナス（Pseudomonas・）エラスターゼ消化により作製した。消化物をゲルろ過ＨＰＬＣで分離し、得られたフラグメントをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、前記内皮管アッセイで評価した。これらのフラグメントは、アレステンの１２ｋＤａフラグメント、アレステンの８ｋＤａフラグメント、カンスタチンの１０ｋＤａフラグメントを含む。また、タムスタチンの２つのフラグメント（「３３３」および「３３４」）をＰＣＲクローニングにより生成した。
【０１８６】
Ｆｉｇ．２３に示すように、前記のようにして行った内皮管アッセイで、２つのアレステンフラグメント〔１２ｋＤａ（黒四角）および８ｋＤａ（白四角）〕およびカンスタチンフラグメント〔１９ｋＤａ（黒三角）〕は、アレステン（黒丸）またはカンスタチン（白丸）が行ったよりもさらにより大きな程度で内皮管の形成を阻害した。Ｆｉｇ．２４は、同様にタムスタチンフラグメント、「３３３」（黒丸）および「３３４」（白丸）がタムスタチン（黒三角）より性能が優れることを示す。ＢＳＡ（黒四角）およびα６鎖（白四角）を対照として用いた。
【０１８７】
全ての参照文献、特許、および特許出願は、それらの全体において参照により本明細書に取り込まれる。本発明をその好ましい態様を参照して詳細に示し、また記載したが、添付の特許請求の範囲により規定される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明において成されてよいということを当業者は理解するであろう。
【０１８８】
本発明の態様として、以下のものが挙げられる。
［１］ ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメイン、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメイン、もしくはＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインからなる群より選ばれる単離されたタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体であって、該タンパク質、そのフラグメント、アナログ、誘導体または変異体が抗血管形成特性を有するものである、単離されたタンパク質。
［２］ タンパク質が単量体である［１］記載の単離されたタンパク質。
［３］ タンパク質がアレステンである［２］記載の単離されたタンパク質。
［４］ タンパク質がカンスタチンである［２］記載の単離されたタンパク質。
［５］ タンパク質がタムスタチンである［２］記載の単離されたタンパク質。
［６］ 抗血管形成活性を有する、［１］記載のタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体の多量体。
［７］ 抗血管形成活性を有する、１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体を含んでなるキメラタンパク質。
［８］ エンドスタチンもしくはそのフラグメント、アンジオスタチンもしくはそのフラグメント、レスチンもしくはそのフラグメント、アポミグレンもしくはそのフラグメント、または他の抗血管形成タンパク質、もしくはそのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含んでなる［７］記載のキメラタンパク質。
［９］ 生物学的に活性な成分として１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質を含んでなる組成物。
［１０］ ［９］記載の組成物と薬学的に適合可能な担体。
［１１］ 生物学的に活性な成分として１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質を含んでなり、かつエンドスタチンもしくはそのフラグメント、アンジオスタチンもしくはそのフラグメント、レスチンもしくはそのフラグメント、アポミグレンもしくはそのフラグメント、または他の抗血管形成タンパク質、もしくはそのフラグメントからなる群より選ばれる少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含んでなる組成物。
［１２］ 生物学的に活性な成分として［６］記載の多量体を含んでなる組成物。
［１３］ 生物学的に活性な成分として［７］記載のキメラタンパク質を含んでなる組成物。
［１４］ ［１］記載のタンパク質、またはそのフラグメント、アナログ、誘導体または変異体をコードするものであって、該タンパク質またはそのフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体が抗血管形成活性を有するものである、単離されたポリヌクレオチド。
［１５］ 発現制御配列に作動可能に連結されているものである［１４］記載の単離されたポリヌクレオチド。
［１６］ ［１５］記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞。
［１７］ 細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選ばれるものである［１６］記載の宿主細胞。
［１８］ ［３］記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
［１９］ ［４］記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
［２０］ ［５］記載のタンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド。
［２１］ （ａ）［１４］記載のポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞の培養物を増殖させる工程、ここで、該宿主細胞は細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞からなる群より選ばれるものである；ならびに
（ｂ）培養物からタンパク質を精製する工程；
を含み、かかる工程により、［１４］記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を生産する、［１４］記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の生産方法。
［２２］ （ａ）中等度ストリンジェンシーな条件下で［１４］記載のポリヌクレオチドにハイブリダイズする１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドプローブを製造する工程；
（ｂ）該１つまたは複数のプローブを哺乳動物ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程；ならびに
（ｃ）１つまたは複数のプローブで検出されたＤＮＡポリヌクレオチドを単離する工程；
により生産される単離されたポリヌクレオチドであって、そのヌクレオチド配列が［１４］記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に相当するものである単離されたポリヌクレオチド。
［２３］ インビトロで処理され、［１４］記載のポリヌクレオチドを挿入された哺乳動物細胞を哺乳動物に導入する工程および該哺乳動物において血管形成活性を阻害するのに充分な量の抗血管形成タンパク質の治療上有効量を前記哺乳動物においてインビボで発現させる工程を含む、哺乳動物への抗血管形成タンパク質の提供方法。
［２４］ 抗血管形成タンパク質の発現が一過的発現である［２３］記載の方法。
［２５］ 細胞が、血球、ＴＩＬ細胞、骨髄細胞、血管細胞、腫瘍細胞、肝細胞、筋細胞、線維芽細胞からなる群より選ばれる［２３］記載の方法。
［２６］ ポリヌクレオチドがウイルスベクターにより細胞に挿入される［２５］記載の方法。
［２７］ ［１］記載の単離されたタンパク質、そのアナログ、誘導体ホモログまたは変異体に対する特異的に結合する抗体。
［２８］ １つまたはそれ以上の以下のもの：１つまたはそれ以上の［１］記載の単離されたタンパク質、［１］記載の単離されたタンパク質のフラグメント、アナログ、誘導体もしくは変異体、［１］記載のタンパク質の多量体、［１］記載のフラグメントの多量体、１つまたはそれ以上の［１］記載のタンパク質を含んでなるキメラタンパク質、または［１］記載のタンパク質のフラグメントを含んでなるキメラタンパク質、を含んでなる組成物と組織を接触させる工程を含む、哺乳動物組織における抗血管形成活性の阻害方法。
［２９］ 疾患が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬、眼血管形成疾患、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管腺維腫、創傷肉芽形成、腸管癒着、動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、ネコひっかき病、ヘリコバクターピロリ潰瘍、透析移植片血管アクセス狭窄、不妊症、肥満からなる群より選ばれる、［２８］記載の方法。
［３０］ 疾患が癌である［２９］記載の方法。
［３１］ 疾患を有する患者に、放射線療法、化学療法、または免疫療法を組み合わせて組成物を投与する工程を含む、血管形成活性を特徴とする疾患を阻害するための［２８］記載の組成物の使用方法。
［３２］ 抗血管形成活性を有する、配列番号：１０のアミノ酸２位〜アミノ酸１２５位を含んでなるポリペプチド。
［３３］ ［３２］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［３４］ 抗血管形成活性を有する、配列番号：１０のアミノ酸１２５位〜アミノ酸２４５位を含んでなるポリペプチド。
［３５］ ［３４］記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
［３６］ ＰＣＲクローニングの方法により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［３７］ ＰＣＲクローニングの方法により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［３８］ ＰＣＲクローニングの方法により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［３９］ シュードモナスエラスターゼ消化により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα１鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［４０］ １２ｋＤａのサイズである［３９］記載の抗血管形成フラグメント。
［４１］ ８ｋＤａのサイズである［３９］記載の抗血管形成フラグメント。
［４２］ シュードモナスエラスターゼ消化により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα２鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
［４３］ １０ｋＤａのサイズである［４２］記載の抗血管形成フラグメント。
［４４］ シュードモナスエラスターゼ消化により作製される、ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のＮＣ１ドメインの抗血管形成フラグメント。
【図面の簡単な説明】
【０１８９】
【図１Ａ】Ｆｉｇ．１Ａおよび１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα１鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１Ａ、配列番号：１）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１Ｂ、配列番号：２）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配列番号：４）の位置を示す。
【図１Ｂ】Ｆｉｇ．１Ａおよび１Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα１鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１Ａ、配列番号：１）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１Ｂ、配列番号：２）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配列番号：４）の位置を示す。
【図２】Ｆｉｇ．２は、アレステンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す概略図である。フォワードプライマー（配列番号：３）およびリバースプライマー（配列番号：４）ならびにアレステンがクローニングされる部位を示す。
【図３】Ｆｉｇ．３Ａおよび３Ｂは、内皮細胞（Ｃ−ＰＡＥ）増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステン（Ｆｉｇ．３Ａ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ｘ軸）およびエンドスタチン（Ｆｉｇ．３Ｂ、０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ、ｘ軸）の影響を示す、１組の線グラフである。
【図４Ａ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図４Ｂ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図４Ｃ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図４Ｄ】Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、内皮細胞増殖の指標としての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す、１組の４つの棒グラフである。Ｆｉｇ．４Ａ、４Ｂおよび４Ｃは、７８６−０細胞、ＰＣ−３細胞、ＨＰＥＣ細胞各々に対するアレステン〔０μｇ／ｍｌ〜５０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ａおよび４Ｂ）および０μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ（Ｆｉｇ．４Ｃ）〕の影響を示す。Ｆｉｇ．４Ｄは、Ａ−４９８細胞に対する０．１〜１０μｇ／ｍｌエンドスタチンの影響を示す。
【図５】Ｆｉｇ．５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、ヒト臍静脈内皮（ＥＣＶ−３０４）細胞におけるＦＢＳ−誘発走化性を介する内皮細胞移動に対するアレステン（２μｇ／ｍｌ、Ｆｉｇ．５Ｂ）およびエンドスタチン（２０μｇ／ｍｌ、Ｆｉｇ．５Ｃ）の影響を示す１組の４つの顕微鏡写真である。Ｆｉｇ．５Ａは、未処理の対照細胞を示す。
【図６】Ｆｉｇ．６は、Ｆｉｇ．５の結果をグラフ形式で示す棒グラフである。Ｆｉｇ．６は、ＥＣＶ−３０４内皮細胞の移動に対するアレステン（２μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）およびエンドスタチン（２．５μｇ／ｍｌまたは２０μｇ／ｍｌ）の影響を示す。
【図７】Ｆｉｇ．７は、内皮管形成に対するアレステンの影響を示す線グラフである。管形成の割合をｙ軸に、インヒビターの濃度をｘ軸に示す。処理は：なし（対照、黒菱形）、ＢＳＡ（対照、白三角）、７Ｓドメイン（対照、Ｘ）およびアレステン（黒四角）であった。
【図８】Ｆｉｇ．８Ａおよび８Ｂは、対照（Ｆｉｇ．８Ａ）と比較した内皮管形成に対するアレステン（０．８μｇ／ｍｌ、Ｆｉｇ．８Ｂ）の影響を示す１組の顕微鏡写真である。
【図９】Ｆｉｇ．９Ａ、９Ｂ、９Ｃおよび９Ｄは、インビボでの腫瘍成長に対するアレステンおよびエンドスタチンの影響を示す１組の４つの線グラフである。Ｆｉｇ．９Ａは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステン処理（白四角）、ＢＳＡ処理（＋）、および対照マウス（黒丸）についての７００ｍｍ3 からの腫瘍容積の増加を示すプロットである。Ｆｉｇ．９Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステン処理（白四角）およびＢＳＡ処理（＋）腫瘍についての１００ｍｍ3 からの腫瘍容積の増加を示す。Ｆｉｇ．９Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇのアレステン処理（白四角）、エンドスタチン処理（黒三角）、および対照マウス（黒丸）についての約１００ｍｍ3 からの腫瘍容積の増加を示す。Ｆｉｇ．９Ｄは、アレステン（白四角）対対照（黒丸）で処理した場合の２００ｍｍ3 の腫瘍についての増加を示す。
【図１０Ａ】Ｆｉｇ．１０Ａおよび１０Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα２鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１０Ａ、配列番号：５）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１０Ｂ、配列番号：６）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー（配列番号：８）の位置を示す。
【図１０Ｂ】Ｆｉｇ．１０Ａおよび１０Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα２鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１０Ａ、配列番号：５）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１０Ｂ、配列番号：６）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー（配列番号：８）の位置を示す。
【図１１】Ｆｉｇ．１１は、カンスタチンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す概略図である。フォワードプライマー（配列番号：７）およびリバースプライマー（配列番号：８）ならびにカンスタチンがクローニングされる部位を示す。
【図１２】Ｆｉｇ．１２Ａ、１２Ｂ、１２Ｃおよび１２Ｄは、内皮（Ｃ−ＰＡＥ）細胞（Ｆｉｇ．１２Ａおよび１２Ｃ）および非内皮（７８６−０、ＰＣ−３およびＨＥＫ２９３）細胞（Ｆｉｇ．１２Ｂおよび１２Ｄ）の増殖に対する種々の濃度のカンスタチン（ｘ軸）の影響を示すヒストグラムである。増殖は、3 Ｈ−チミジン取り込み（Ｆｉｇ．１２Ａおよび１２Ｂ）およびメチレンブルー染色（Ｆｉｇ．１２Ｂおよび１２Ｄ）の関数として測定した。
【図１３】Ｆｉｇ．１３は、ＶＥＧＦなし（ＶＥＧＦなしまたは血清）、およびＶＥＧＦ（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）細胞の処理についての、および０．０１μｇ／ｍｌ カンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび０．０１μｇ／ｍｌ カンスタチン）および１．０μｇ／ｍｌ カンスタチン（１％ＦＣＳおよび１０ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦおよび１μｇ／ｍｌ カンスタチン）の処理についての、視野当たりの移動した内皮細胞の数（ｙ軸）を示す棒グラフである。
【図１４】Ｆｉｇ．１４は、ＢＳＡ（白四角）、カンスタチン（黒四角）、およびα５ＮＣ１（白丸）の種々の処理の下での対照（ＰＢＳ処理ウェル）管形成の割合（ｙ軸）としての内皮管形成の量を示す線グラフである。垂直方向の線分は平均の標準誤差を示す。
【図１５】Ｆｉｇ．１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは、処理日数（ｘ軸）に対してプロットした、腫瘍容積率（ｙ軸、Ｆｉｇ．１５Ａおよび１５Ｂ）またはｍｍ3 での腫瘍容積（ｙ軸、Ｆｉｇ．１５Ｃおよび１５Ｄ）に関するカンスタチン（黒四角）、エンドスタチン（白丸）および対照（白四角）のＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．１５Ａおよび１５Ｂ）および７８６−０細胞（Ｆｉｇ．１５Ｃおよび１５Ｄ）に対する影響を示す線グラフである。
【図１６Ａ】Ｆｉｇ．１６Ａおよび１６Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα３鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１６Ａ、配列番号：９）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１６Ｂ、配列番号：１０）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）の位置を示す。「タムスタチン３３３」フラグメントおよび「タムスタチン３３４」フラグメントの始まりと終わりも示す。
【図１６Ｂ】Ｆｉｇ．１６Ａおよび１６Ｂは、ヒトＩＶ型コラーゲンのα３鎖のヌクレオチド配列（Ｆｉｇ．１６Ａ、配列番号：９）およびアミノ酸配列（Ｆｉｇ．１６Ｂ、配列番号：１０）を示す図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）の位置を示す。「タムスタチン３３３」フラグメントおよび「タムスタチン３３４」フラグメントの始まりと終わりも示す。
【図１７】Ｆｉｇ．１７は、タムスタチンクローニングベクターｐＥＴ２２ｂ（＋）を示す概略図である。フォワードプライマー（配列番号：１１）およびリバースプライマー（配列番号：１２）ならびにタムスタチンがクローニングされる部位を示す。
【図１８】Ｆｉｇ．１８は、タムスタチン変異体タムスタチンＮ−５３におけるα３（ＩＶ）ＮＣ１単量体内の切形アミノ酸の位置を示す概略図である。黒丸は、この変異体を作製するためにタムスタチンから欠失させたＮ末端の５３個のアミノ酸残基に相当する。短いバーでマークしたジスルフィド結合は、それらがα１（ＩＶ）ＮＣ１およびα２（ＩＶ）ＮＣ１において生ずるように配置されている。
【図１９】Ｆｉｇ．１９Ａ、１９Ｂおよび１９Ｃは、種々の濃度のタムスタチン（ｘ軸）で処理した場合のＣ−ＰＡＥ細胞（Ｆｉｇ．１９Ａ）、ＰＣ−３細胞（Ｆｉｇ．１９Ｂ）および７８６−０細胞（Ｆｉｇ．１９Ｃ）についての3 Ｈ−チミジン取り込み（ｙ軸）を示す１組の３つのヒストグラムである。全ての群は３連の試料を示す。
【図２０】Ｆｉｇ．２０は、種々の量のタムスタチン（黒丸）、ＢＳＡ（対照、白四角）および７Ｓドメイン（対照、白丸）（ｘ軸）の内皮管形成（ｙ軸）に対する影響を示す線グラフである。
【図２１】Ｆｉｇ．２１Ａおよび２１Ｂは、タムスタチン（黒丸）およびエンドスタチン（白丸）対対照（白四角）での処理日数（ｘ軸）に対する腫瘍容積（ｍｍ3 、ｙ軸）への影響を示す１組の線グラフである。星印をつけたデータ点は、片側スチューデントの検定によるＰ＜０．０５で有意である。
【図２２】Ｆｉｇ．２２は、処理日数（ｘ軸）に対してプロットした、腫瘍容積（ｙ軸）に関する対照マウス（白四角）、タムスタチン変異体Ｎ−５３で処理されたマウス（黒丸）に対する増加を示す線グラフである。星印をつけたデータポイントは、片側スチューデントの検定によるＰ＜０．０５で有意である。
【図２３】Ｆｉｇ．２３は、アレステン（黒丸）、カンスタチン（白丸）、アレステンの１２ｋＤａフラグメント（黒四角）、アレステンの８ｋＤａフラグメント（白四角）、およびカンスタチンの１０ｋＤａフラグメント（黒三角）の濃度変化（ｘ軸）による内皮管形成（ｙ軸）の阻害を示す線グラフである。
【図２４】Ｆｉｇ．２４は、タムスタチンフラグメント３３３（黒丸）、タムスタチンフラグメント３３４（白丸）、ＢＳＡ（対照、黒四角）、α６（対照、白四角）、およびタムスタチン（黒三角）の濃度変化（ｘ軸）による内皮管形成（ｙ軸）の阻害を示す線グラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離された組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される単離された組換えタンパク質フラグメントであって、該タンパク質フラグメントは、１０ｋＤａのフラグメントであり、内皮管形成を阻害する、フラグメント。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質、または請求項２記載の１０ｋＤａのタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質および／または請求項２記載のフラグメントを含む組成物。
【請求項５】
薬学的に適合可能な担体をさらに含む請求項４記載の組成物。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質、請求項２記載のフラグメント、および請求項３記載のタンパク質からなる群より選択される１つ以上を含み、ならびにエンドスタチン、アンジオスタチン、レスチン、およびアポミグレンからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含む組成物。
【請求項７】
配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される１０ｋＤａのフラグメントを含む医薬であって、組織と接触することによって、哺乳動物の組織における血管形成活性を阻害するための医薬。
【請求項８】
該組織が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬、眼血管形成疾患、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維腫、創傷肉芽形成、腸管癒着、動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、ネコひっかき病、ヘリコバクターピロリ潰瘍、透析移植片血管アクセス狭窄、および肥満からなる群より選ばれる疾患を有する個体の組織である、請求項７記載の医薬。
【請求項９】
疾患が癌である請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
血管形成活性を特徴とする疾患を有する個体に、放射線療法、化学療法、または免疫療法を組み合わせて投与される、請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
医薬が産児制限剤である請求項７記載の医薬。
【請求項１２】
請求項１記載のタンパク質または請求項２記載のいずれかのタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【請求項１】
配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離された組換えタンパク質。
【請求項２】
配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される単離された組換えタンパク質フラグメントであって、該タンパク質フラグメントは、１０ｋＤａのフラグメントであり、内皮管形成を阻害する、フラグメント。
【請求項３】
請求項１記載のタンパク質、または請求項２記載の１０ｋＤａのタンパク質フラグメントを含むキメラタンパク質。
【請求項４】
請求項１記載のタンパク質および／または請求項２記載のフラグメントを含む組成物。
【請求項５】
薬学的に適合可能な担体をさらに含む請求項４記載の組成物。
【請求項６】
請求項１記載のタンパク質、請求項２記載のフラグメント、および請求項３記載のタンパク質からなる群より選択される１つ以上を含み、ならびにエンドスタチン、アンジオスタチン、レスチン、およびアポミグレンからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質分子をさらに含む組成物。
【請求項７】
配列番号：６のアミノ酸配列からなる単離されたタンパク質または配列番号：６のアミノ酸配列からなるタンパク質のシュードモナス（Pseudomonas）エラスターゼ消化によって調製される１０ｋＤａのフラグメントを含む医薬であって、組織と接触することによって、哺乳動物の組織における血管形成活性を阻害するための医薬。
【請求項８】
該組織が、血管形成依存性癌、良性腫瘍、慢性関節リウマチ、糖尿病性網膜症、乾癬、眼血管形成疾患、オースラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管形成、毛細管拡張症、血友病関節、血管線維腫、創傷肉芽形成、腸管癒着、動脈硬化、強皮症、過形成性瘢痕、ネコひっかき病、ヘリコバクターピロリ潰瘍、透析移植片血管アクセス狭窄、および肥満からなる群より選ばれる疾患を有する個体の組織である、請求項７記載の医薬。
【請求項９】
疾患が癌である請求項８記載の医薬。
【請求項１０】
血管形成活性を特徴とする疾患を有する個体に、放射線療法、化学療法、または免疫療法を組み合わせて投与される、請求項９記載の医薬。
【請求項１１】
医薬が産児制限剤である請求項７記載の医薬。
【請求項１２】
請求項１記載のタンパク質または請求項２記載のいずれかのタンパク質フラグメントをコードするポリヌクレオチド。
【図１１】
【図１３】
【図１７】
【図１８】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図１３】
【図１７】
【図１８】
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図４Ｃ】
【図４Ｄ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０Ａ】
【図１０Ｂ】
【図１２】
【図１４】
【図１５】
【図１６Ａ】
【図１６Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【公開番号】特開２００８−３０１８２３（Ｐ２００８−３０１８２３Ａ）
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１６４９２６（Ｐ２００８−１６４９２６）
【出願日】平成２０年６月２４日（２００８．６．２４）
【分割の表示】特願２００７−２４４６１８（Ｐ２００７−２４４６１８）の分割
【原出願日】平成１１年６月１７日（１９９９．６．１７）
【出願人】（５９９０３６０５９）ベス イスラエル ディーコネス メディカル センター (4)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１２月１８日（２００８．１２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月２４日（２００８．６．２４）
【分割の表示】特願２００７−２４４６１８（Ｐ２００７−２４４６１８）の分割
【原出願日】平成１１年６月１７日（１９９９．６．１７）
【出願人】（５９９０３６０５９）ベス イスラエル ディーコネス メディカル センター (4)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]