抗ＣＥＡ抗体を用いた標的化遺伝子治療
【課題】 本発明は、癌の遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターによる非特異的な遺伝子送達を改善すること、ならびに抗体を用いて癌治療を行う際の交差反応性の問題および免疫反応の問題を改善することを目的とする。
【解決手段】 本発明は、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する癌治療薬、特に、完全ヒト型抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する癌治療薬を提供し、典型的には、上記抗体と抗体を結合するように遺伝的に改変したファイバー変異型アデノウイルスとの複合体を含有する癌治療剤を提供する。
【解決手段】 本発明は、抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する癌治療薬、特に、完全ヒト型抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する癌治療薬を提供し、典型的には、上記抗体と抗体を結合するように遺伝的に改変したファイバー変異型アデノウイルスとの複合体を含有する癌治療剤を提供する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＥＡ抗体を用いた標的化遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、世界で最も一般的な、癌に関連する死の原因である。胃癌の発生率はアジアで高く、日本において、特に胃癌は、癌による死の最も一般的な原因である。現在の処置ストラテジーには、外科手術、化学療法、および放射線療法などがあるが、これらはその治療効果が限られている。したがって、これらの疾患の治療のための新たな治療態様が必要とされていることが明らかである。遺伝子治療は、この点において、進行した胃癌の治療のための合理的なアプローチを代表する。
【０００３】
しかしながら、癌遺伝子治療に対する主要な障壁の１つは、癌細胞への不十分かつ非特異的な遺伝子送達であり、これは、自殺遺伝子療法、免疫学的遺伝子療法のようないくつかの効果的ストラテジーが、遺伝子導入していない癌細胞をある程度治療し得、そして部分的にこの問題を避けることができるにもかかわらず、遺伝子導入していない腫瘍細胞からの再発のために、臨床試験において不満足な結果を導くに至っている。したがって、遺伝子治療における課題は、より良い腫瘍選択性に基づいて現在の治療態様を改善することである。
【０００４】
現在までに、アデノウイルスベクターは高力価で産生され得、そして多くの異なる細胞型に感染し得るため、遺伝子を腫瘍細胞に導入するために広範に適用されている。５型アデノウイルス（Ａｄ５）の感染は、コクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）へのアデノウイルスファイバーノブの高親和性結合、およびそれに続く細胞表面上のインテグリンαｖβ３およびαｖβ５へのペントンベース中のＲＧＤモチーフの結合によって仲介される内部移行によって仲介される。
【０００５】
しかしながら、癌遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの広範な適用は、ＣＡＲが正常細胞および悪性細胞の両方に発現することによる悪性細胞の特異性の欠如のために阻まれている（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３，１９９７：非特許文献１）。すなわち、ＣＡＲ受容体は肝細胞をはじめとする多くの正常細胞でも十分に発現している。また、癌細胞ではＣＡＲの発現はさまざまであり、扁平上皮癌、悪性黒色腫、前立腺がん、一部の消化器癌などでは極めて発現が低く、通常のアデノウイルスでは十分な遺伝子導入効率が得られない。このような状況で全身にアデノウイルスを投与されると、肝毒性等の副作用が出現してしまうのが実情である。全身性疾患（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）である癌を治療するためには、原発巣のみならず、全身に転移しうる癌細胞に対し全身的な特異的な治療が必要であり、アデノウイルスによる癌遺伝子治療を飛躍させるためには、効率の良い標的化（腫瘍の標的化）が求められている。
【０００６】
近年、アデノウイルスの指向性は、Ａｄ５を代替のレセプターに再標的化するように改変されることができ、それによってウイルス感染をＣＡＲ非依存性にすることができることがわかっている。Ａｄ５カプシド改変のための最も一般的に利用される部位は、ファイバータンパク質ノブドメインである（Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ． Ｔ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８８６：１５８−１７１，１９９９：非特許文献２）。ＣＡＲ非依存性遺伝子送達のためのいくつかのストラテジーが、報告されている。例えば、抗ファイバーノブ抗体および標的化レセプターリガンドの融合タンパク質（Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１００４−１０１２，１９９７：非特許文献３）、ファイバーノブおよび腫瘍関連抗原に対する二重特異的抗体（Ｈａｉｓｍａ， Ｈ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ６： １４６９−１４７４， １９９９：非特許文献４；Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ， Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３： ８８２−８９１， ２００１：非特許文献５）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメイン（Ｚ３３）のノブタンパク質および標的化レセプターへの挿入（Ｖｏｌｐｅｒｓ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７７： ２０９３−２１０４， ２００３：非特許文献６）である。本発明者らは、３番目のストラテジー、つまり、ブドウ球菌プロテインＡに由来する合成３３アミノ酸ＩｇＧ結合ドメイン（Ｚ３３）が、アデノウイルスファイバータンパク質に挿入されることに注目する。ファイバーは、３量体になる能力を維持しており、ＩｇＧに高親和性で結合し、ベクター粒子に組み込まれた。Ｖｏｌｐｅｒｓらは、Ｚ３３改変アデノウイルスベクターのＥＧＦＲ発現細胞への遺伝子導入効率は、ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体との組み合わせによって強力にかつ用量依存的に増強されたことを報告した（非特許文献６）。
【０００７】
ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、高度にグリコシル化された同型／異型の細胞表面細胞内接着分子のグループに属し、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一部であるヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーの原型メンバーである（Ｐａｘｔｏｎ， Ｒ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８４： ９２０−９２４， １９８７：非特許文献７）。ＣＥＡは、種々のヒト組織の癌細胞の９５％までにおいて、および正常胃腸組織および胎児の小腸の上皮細胞の表面に広範に発現されている。
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３，１９９７
【非特許文献２】Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ． Ｔ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８８６：１５８−１７１，１９９９
【非特許文献３】Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１００４−１０１２，１９９７
【非特許文献４】Ｈａｉｓｍａ， Ｈ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ６： １４６９−１４７４， １９９９
【非特許文献５】Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ， Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３： ８８２−８９１， ２００１
【非特許文献６】Ｖｏｌｐｅｒｓ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７７： ２０９３−２１０４， ２００３
【非特許文献７】Ｐａｘｔｏｎ， Ｒ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８４： ９２０−９２４， １９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、癌の遺伝子治療は、５型アデノウイルスベクターを使用することによって限定されている。このアプローチの主要な問題は、癌細胞中でのアデノウイルスレセプターであるコクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現が弱いことによる遺伝子導入効率が低いこと、および／または正常細胞中でのＣＡＲの発現による副作用に関係していると考えられている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述のような状況に鑑み、本発明者らは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を癌細胞中での特異的分子として選択し、ＣＥＡ発現ヒト腫瘍細胞に対し、ファイバー変異型アデノウイルスベクター（Ａｄｖ−ＦＺ３３）と結合させたヒト型抗ＣＡＥモノクローナル抗体を用いて、インビトロおよびインビボの両方において標的化治療の検討を行なった。
【００１０】
その結果、本発明者らは、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３による癌細胞に対する標的化効果を実証し、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明は、以下の抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（１）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得し、
上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価し、そして
上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択すること、
によって調製される、抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（２）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（２ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも５０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（３）上記ファイバー変異型アデノウイルスが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（４）Ｃ２−４５である、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
【００１２】
本発明はまた、以下に記載する複合体を提供する。
（５）抗ＣＥＡモノクローナル抗体とＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターとの複合体。
（６）上記アデノウイルスベクターが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、上記（５）に記載の複合体。
（７）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（５）または（６）に記載の複合体。
【００１３】
本発明はまた、以下に記載する癌の治療薬を提供する。
（８）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の治療薬。
（９）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（８）に記載の癌の治療薬。
（１０）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、上記（８）または（９）に記載の癌の治療薬。
（１１）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合されている、上記（１０）に記載の癌の治療薬。
（１２）上記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、上記（１０）に記載の癌の治療薬。
（１３）上記リポソームベクターが、飽和リン脂質、不飽和リン脂質、フォスファチジルコリン（ＰＣ）、フォスファチジルセリン（ＰＳ）、フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群から選択されるリポソーム、または該リポソームの２種以上のいずれかの組み合わせからなるリポソームである、上記（１２）に記載の癌の治療薬
（１４）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現癌細胞を溶解またはその成長を阻害する、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１５）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１６）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（８）〜（１５）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１７）上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（１６）に記載の癌の治療薬。
【００１４】
本発明はまた、以下に記載する薬剤の標的化送達方法を提供する。
（１８）抗ＣＥＡ抗体を用いて、薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法。
（１９）上記抗ＣＥＡ抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（１８）に記載の方法。
（２０）上記薬剤が、上記抗ＣＥＡ抗体と化学的または遺伝子工学的に結合している、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）上記薬剤が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を含む、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２２）上記治療遺伝子が、ウイルスベクターに担持されている、上記（２１）に記載の方法。
（２３）上記ウイルスベクターが、上記抗ＣＥＡ抗体が結合し得るファイバー変異型アデノウイルスである、上記（２２）に記載の方法。
（２４）上記標的部位が、ＣＥＡを特異的に発現している細胞、組織、または臓器である、上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
本発明はまた、以下に記載する抗ＣＥＡ抗体を使用する方法を提供する。
（２５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体を用いてＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する方法。
（２６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体を用いて、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を溶解またはその成長を阻害する方法。
【００１６】
本発明はまた、以下に記載する抗ＣＥＡモノクローナル抗体の調製方法を提供する。
（２７）腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法であって、
ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
（２８）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞への感染が、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記腫瘍細胞に接触させること、
によって行われる上記（２７）に記載の方法。
（２８ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の代わりに、予め調製された抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いる、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（２９）上記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する上記感染効率を評価することを含み、ここで上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（３０）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３１）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３１ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも５０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３２）上記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたはＥＧＦＰである、上記（２９）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）上記ＣＥＡ陽性腫瘍細胞が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌細胞である、上記（２７）〜（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）上記（２７）〜（３３）のいずれかに記載の方法によって得られる、抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
【００１７】
本発明はまた、以下に記載する癌の診断薬を提供する。
（３５）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の診断薬。
（３６）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（３５）に記載の癌の診断薬。
（３７）上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（３５）または（３６）に記載の癌の診断薬。
（３８）上記抗ＣＥＡ抗体が、標識されている、上記（３５）〜（３７）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（３９）上記抗ＣＥＡ抗体が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素によって標識されている、上記（３８）に記載の癌の診断薬。
（４０）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（３５）〜（３９）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（４１）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（４０）に記載の診断薬。
【００１８】
本発明はまた、以下に記載する癌の診断方法を提供する。
（４２）被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。
（４３）被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する、上記（４２）に記載の方法。
（４４）上記生体試料と抗ＣＥＡ抗体とを接触させる工程、および
該生体試料中のＣＥＡと該抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量する工程
を包含する、上記（４２）または（４３）に記載の方法。
（４５）上記検出および／または定量する工程が、標識された抗ＣＥＡ抗体を用いて、ＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量することを包含する、上記（４２）〜（４４）のいずれかに記載の方法。
（４６）上記生体試料が、被験者由来の組織、細胞、血液、尿、リンパ液、精液、唾液、または汗である、上記（４２）〜（４５）のいずれかに記載の方法。
（４７）ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、上記（４３）〜（４６）のいずれかに記載の方法。
（４８）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（４２）〜（４７）に記載の方法。
（４９）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（４８）に記載の方法。
【００１９】
本発明はまた、以下のような自己抗体を用いた癌の診断方法を提供する。
（５０）ＣＥＡに対する自己抗体を癌の診断マーカーとして使用する方法。
（５１）被験者由来の生体試料中の抗ＣＥＡ自己抗体を検出および／または定量する工程を包含する、上記（５０）に記載の方法。
（５２）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（５０）または（５１）に記載の方法。
（５３）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（５２）に記載の方法。
【００２０】
本発明はさらに、以下の抗ＣＥＡ抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、抗ＣＥＡ抗体の製造方法、およびそれにより製造される抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（５４）抗ＣＥＡ抗体をコードするＤＮＡ。
（５５）抗ＣＥＡ抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）をコードするＤＮＡ。
（５６）上記（５４）または（５５）に記載のＤＮＡを含有するベクター。
（５７）上記（５６）に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（５８）上記（５７）に記載の形質転換体を適切な培地で培養する工程、および
該培養物から抗ＣＥＡ抗体を収集する工程
を包含する、抗ＣＥＡ抗体の製造方法。
（５９）上記（５８）に記載の方法により製造される、抗ＣＥＡ抗体。
（６０）Ｈ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）を含有する、上記（５９）の抗ＣＥＡ抗体。
【００２１】
本発明はまた、以下のような特徴を有する抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（６１）特定の細胞に対するウイルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる、抗ＣＥＡ抗体。
（６２）抗ＣＥＡ抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含むヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６３）ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である、上記（６２）に記載のヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６４）完全にヒト型である、上記（６２）または（６３）に記載のヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６５）モノクローナル抗体である、上記（６１）〜（６４）に記載の抗ＣＥＡ抗体。
（６６）上記（６１）〜（６５）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体と放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤とを化学的または遺伝子工学的に結合させた誘導体。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、抗ＣＥＡ抗体と、ＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変したアデノウイルスベクターとの組み合わせを使用することによって、癌（特にＣＥＡ産生癌）の遺伝子治療を、遺伝子導入効率および特異性の両面において顕著に改善し得る。
【００２３】
本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、ＣＥＡ産生癌（特に転移癌）の標的化療法、診断等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスの感染効率を特異的に高めることから、ＣＥＡ産生癌特異的な遺伝子療法に有用である。
【００２４】
また、マウス抗ＣＥＡ抗体が、臨床試験で癌に対して抗癌剤として使用される場合、モノクローナル抗体の正常組織との交差反応性およびマウスモノクローナル抗体に対するヒトの免疫反応は、主要な問題である。ＣＥＡファミリーは、７つの発現された遺伝子からなる。それらのうち、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、およびＣＥＡＣＡＭ８はしばしば種々のタイプの正常組織に存在するため、非常に障害となる。本発明の完全ヒト型の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いることにより、上記免疫反応の問題は解決される。また、本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、実施例に示すように、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、またはＣＥＡＣＡＭ８のいずれとも交差反応しないため、上記の交差反応性の問題も解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明者らは、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いた癌への遺伝子導入療法において、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞への特異的な遺伝子導入効率を高めるモノクローナル抗体を同定した。
【００２６】
本発明者らは、上記モノクローナル抗体を併用して、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いたＣＥＡ陽性もしくは陰性の胃癌細胞または正常細胞への遺伝子導入を評価し、ＣＥＡ陽性胃癌細胞において特異的に遺伝子導入効率が顕著に高まることを見出した。本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、上記Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスとの組み合わせのみならず、他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子など）と組み合わせて、ＣＥＡ産生癌の標的化療法に用いることができる。
【００２７】
ＣＥＡは、正常成人組織において、円柱上皮細胞の腔側に局在し、そのため、正常ＣＥＡは、血流または組織液に直接接していない。それゆえ、腫瘍ＣＥＡは、抗ＣＥＡ抗体を用いた遺伝子治療のための魅力的な標的分子であり得る。
【００２８】
したがって、本発明は、ＣＥＡをマーカーとして利用するＣＥＡ産生癌の診断、および／またはＣＥＡを標的としたＣＥＡ産生癌の標的化療法を提供する。本発明はまた、癌特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。癌特異的ＣＥＡ抗原に特異的に結合し得る抗体を同定することにより、癌のイメージングおよび／または処置のために有用なシステムが提供される。
【００２９】
１．抗ＣＥＡ抗体
本発明は、ＣＥＡに対する抗体を提供する。
【００３０】
本明細書中、「ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）」、「ＣＥＡタンパク質」、または「ＣＥＡ抗原」とは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号Ｐ０６７３１で登録されているアミノ酸配列（配列番号１）で特定される７０２アミノ酸残基のタンパク質、ならびに上記タンパク質の断片、またはこれらの誘導体を意味する。ここで、「誘導体」とは、ＣＥＡタンパク質またはその断片のアミノ酸配列において１または複数個（例えば、数個（例、６個））のアミノ酸残基の変異、置換、欠失および／または付加を含み、実質的にＣＥＡタンパク質と同じ抗原性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味するものとする。ここで、「実質的に」とは、ＣＥＡの発現によって特徴付けられる疾患の診断および／または治療に使用され得る程度に、抗ＣＥＡ抗体によって特異的に認識されるような特異性の程度を意味する。誘導体の典型的な例には、ＣＥＡ多型、スプライシングなどによる配列変化がある。ここで、「断片」の長さとしては、抗ＣＥＡ抗体に特異的な抗原として認識され得る長さであれば制限はないが、好ましくは６アミノ酸以上、より好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは１０アミノ酸以上である。また、これらの断片は、ＣＥＡタンパク質の任意の部分であり得るが、ＣＥＡタンパク質のエピトープに対応するか、エピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。
【００３１】
本明細書中、「抗ＣＥＡ抗体」または「ＣＥＡに対する抗体」は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をいい、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）または誘導体をも含むものとする。抗体の機能的断片または誘導体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドのような抗体の機能的断片、またはヒト化抗体（例えば、ＣＤＲ移植完全ヒト型抗体）のような誘導体などが含まれる。本発明に使用する抗体は、以下に詳述するように、動物を免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収すること（適切な細胞との融合によるハイブリドーマの作製のため）を含む、従来の方法により作製することができる。
【００３２】
本明細書中、抗体があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００３３】
本発明の抗ＣＥＡ抗体は、マウス抗ＣＥＡ抗体などのヒト以外の哺乳動物の抗体であってもよいが、ヒト化抗体であることがヒトへの適用には抗原性が低く副作用が少ないため好ましく、完全ヒト型抗体であることが最も好ましい。また、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得るが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３４】
以下、本発明の抗ＣＥＡ抗体の作製において利用し得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片等の一般的な作製方法について説明する。
【００３５】
（モノクロナール抗体の作製方法）
モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＣＥＡに対するモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。ＣＥＡを、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【００３６】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５）に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用し得るが、例えば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に、放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３８】
モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
【００３９】
（ポリクローナル抗体の作製方法）
ＣＥＡに対するポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質の抗原）と担体タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原と担体タンパク質との複合体に関して、担体タンパク質の種類および担体とハプテンとの混合比は、担体に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、任意のものを任意の比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンと担体のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタールアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００４０】
（抗体断片または誘導体の製造方法）
Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
【００４１】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。
【００４２】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
【００４３】
上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’はまた、全長抗ＣＥＡ抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物もしくは真核生物に導入して発現することによっても製造することができる（例えば、Ｃｏ Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６； Ｂｅｔｔｅｒ Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ Ａ．Ｈ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６； Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ Ａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５； Ｌａｍｏｙｉ Ｅ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３； Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９； Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７等を参照）。
【００４４】
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと略すこともある）は、一本の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＨと略す）と一本の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＬと略す）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと略す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３を参照）。本発明の一本鎖抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。
【００４５】
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも略すこともある）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７，６９７ （１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるジスルフィド安定化Ｖ領域断片に含まれるＶＨおよびＶＬは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００４６】
本発明のジスルフィド安定化Ｖ領域断片は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることにより製造することができる。相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略す）を含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００４７】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
（ヒト化抗体）
【００４８】
ヒト以外の動物の抗体を、遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、または完全ヒト型抗体などとしたヒト化抗体もまた、本発明において有利に使用することができる。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（２１），６８５１−６８５５，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｊｏｎｅｓ Ｐ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３２１（６０６９），５２２−５２５，１９８６）。また、完全ヒト型抗体とは、マウスのようなヒト以外の動物で作成した抗体を遺伝子組換え技術によりヒト化部分を１００％含むようにした抗体である。ヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖）Ｃ領域としてγ１サブクラスを使用すれば、血中で安定で、かつ抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（Ｃｏ Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５），１１１８−１１２５，１９９６）。エフェクター活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合に有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、エフェクター活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域としてγ４サブクラスを使用すれば、γ４サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６６（５），１３５１−１３６１，１９８７； Ｂｉｎｄｏｎ Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６８（１），１２７−１４２，１９８８）、副作用を回避でき、しかもマウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８５（４），６６８−６７４，１９９５）。さらに、蛋白質工学、遺伝子工学的手法を用いてヒト化抗体を含めた抗体から作製したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ （Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２（４８７７），４２３−４２６，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｗｅｂｂｅｒ Ｋ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２（４），２４９−２５８，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（６），２９６６−２９７１，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片を使用することもできる。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さいために、標的組織への移行性に優れており、有利である（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２−３４０８，１９９２）。
【００４９】
本発明のＣＥＡに特異的に結合する抗体（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片）に、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体は、ＣＥＡに特異的に反応する抗体および抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには該抗体および抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、治療タンパク質あるいは低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる（例えば、抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４を参照）。
【００５０】
２．診断薬および治療薬
本発明はまた、別の態様において、抗ＣＥＡ抗体を含有する癌の診断薬および治療薬を提供する。なお、本願明細書中、用語「癌」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。
【００５１】
本明細書の実施例において具体的に記載するように、本発明の抗ＣＥＡ抗体を含有する治療薬または診断薬は、ＣＥＡを発現または高発現することによって特徴づけられる任意の疾患（例えば、胃癌など）の診断または治療に適している。
【００５２】
癌の診断または治療に使用するための本発明の抗ＣＥＡ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、必要に応じて、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。
【００５３】
また、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、あるいは標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）と化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。
【００５４】
ｉｎ ｖｉｖｏでの診断に使用するための抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、インジウム−１１１で標識した抗体とキレート剤との結合体（抗体−キレート剤）が、癌胎児性抗原を発現している腫瘍のラジオイムノシンチグラフィーによるイメージングでの使用に関して記述されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １９９０ １７：２４７−２５４）。特にこれらの抗体−キレート剤は、再発性の結腸直腸癌を有する疑いのある患者において腫瘍を検出するのに用いられている（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． １９９１ ９：６３１−６４０）。磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体もまた記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ， Ｒ．Ｂ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２：３３９−３４２）。
【００５５】
ＣＥＡに対する抗体も同様に用いることができる。すなわち、ＣＥＡに特異的に結合する標識された抗体を、例えば、癌を有する疑いのある患者に、その患者の疾患の状態の診断または病期診断等の目的で注射することができる。用いる標識は、用いるイメージングの様式に応じて選択し得る。例えば、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素−１３１（１３１Ｉ）などの放射性標識は、平面スキャンまたはシングルフォトン断層撮影に用いることができる。フッ素−１８（１８Ｆ）などのポジトロン放出標識をポジトロン断層撮影に用いることができる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを磁気共鳴イメージングに用いることができる。標識の局在性を検査することにより、癌の播種の判定をすることができる。また、器官または組織内の標識の量により、その器官または組織における癌の存在または欠如を決定することができる。
【００５６】
したがって、好ましくは、本発明の診断薬または治療薬中の抗ＣＥＡ抗体は、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したウイルスベクター等と化学的にまたは遺伝子工学的に結合されている。
【００５７】
「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性診断薬あるいは放射性治療薬として広く利用し得る。例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。
【００５８】
さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（６７Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（９０Ｙ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）またはレニウム−１８８（１８８Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。
【００５９】
「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、癌細胞を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００６０】
「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編 １９９６年 癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法 昭和５７年 医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
【００６１】
「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＣＥＡ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクター（例えば、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルス）が使用し得る。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、癌）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＣＥＡ抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＣＥＡ抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＣＥＡ抗体が認識する抗原（すなわち、ＣＥＡ）が存在する部位に指向されることができる。
【００６２】
３．組換えアデノウイルス発現システムの作製方法
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルスベクターは、当該分野で周知の分子生物学的手法によって作製することができる。例えば、一般的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９； Ａｕｓｂｅｌ． Ｆ ｅｔ ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；田村隆明編、改訂第２版 遺伝子工学実験ノート 上・下 洋土社 ２００１などを参照することができる。また、組換えアデノウイルスの作製のためには、ウイルスゲノムの両端に共有結合した末端タンパク質を保持したままのゲノム−末端タンパク質複合体（以下ＤＮＡ−ＴＰＣと略す）を用いる方法、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａらの方法（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：２５０３−１５１５ （１９９８））を利用することができる。これらの手法はいずれも当業者に良く知られたものである。典型的な作製方法においては、まず、ｐＡｘＣｗ、ｐＡｘＣＡｗｔ等のコスミドカセットに目的とする遺伝子を組み込んだコスミドを作製する。一方、ウイルスからＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、適当な制限酵素で切断しておく。次に、前述のコスミドおよび制限酵素処理したＤＮＡ−ＴＰＣを適切な宿主細胞、例えば２９３細胞にコトランスフェクションする。その後適当な条件で一定期間培養し、培養液中にウイルス粒子として放出された組換えアデノウイルス粒子を回収することができる。
【００６３】
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス粒子は、前述のように組換えアデノウイルス発現用核酸分子を適切な培養細胞にトランスフェクションし、その細胞を更に培養し、培養上清を回収することによって多量に調製することができる。必要であれば、回収したアデノウイルスを更に適切な宿主細胞で必要な回数だけ継代することによって更に大量のアデノウイルベクター粒子を調製することができる。アデノウイルスの増殖および回収のために適した細胞、トランスフェクションの条件、トランスフェクトした細胞の培養条件および培地等は当業者に良く知られたものである。例えば、通常よく使用されるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域に欠損のあるアデノウイルスを増殖させる場合には、恒常的にＥ１Ａ、Ｅ１Ｂを発現している２９３細胞等を使用すればよい。更に、必要に応じて、塩化セシウムの濃度勾配遠心法を用いて濃縮精製することもできる。濃縮することにより、１０９〜１０１１粒子／ｍｌ程度の高力価のウイルス液を得ることができる。
【００６４】
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子は、外来遺伝子を組み込むことができ、組み込まれた外来遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。本発明において使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子に組み込む外来遺伝子としては、直接または間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）とガンシシクロビルの組み合わせ（ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシンの組み合わせ（ＣＤ／５ＦＣ）、ウラシルホスホリラーゼと５−フルオロウラシルの組み合わせ（ＵＰ／５ＦＵ）、ＨＳＶｔｋとＵＰを組み合わせた系（ＵＰＴＫ／５ＦＵ＋ＧＣＶ）が挙げられる。このような外来遺伝子は、一般にはアデノウイルスゲノムのＥ１領域および／またはＥ３領域と置換され、またはこの領域に挿入される。
【００６５】
ファイバー変異型組み換えアデノウイルスの作製方法については、報告されている例を参照し得る（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００２； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００３など）。
【００６６】
本発明において好適に用いられるベクターの非限定的な例としては、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたＺ３３ファイバー変異型アデノウイルス、アデノウイルスに抗体を任意の方法で結合（共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のアデノウイルスなどが挙げられる。Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスは、図３に模式的にその概要を示すように、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフ（ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１４））をノブ（Ｋｎｏｂ）のＨＩループ部位（ｎｇｔｑｅｔｇｌｉｋ−−−−−ｉｄａｓｄｔｔｐｓａ）に含むＦＺ３３ファイバー変異型Ａｄ５ウイルスをベースとして、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどのレポーター遺伝子が組み込まれたアデノウイルスである。なお、これは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など各種ウイルスの外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した各種変異型ウイルス、または前記各種ウイルスに抗体を任意の方法で結合（例えば、共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の抗ＣＥＡ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターもまた、抗体を任意の方法で結合（ＦＺ３３などの抗体結合分子を結合させる方法、化学的共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターとすることによって、本発明の抗ＣＥＡ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。
【００６７】
本発明の抗ＣＥＡ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターを使用する利点として、以下のような点が挙げられる。通常、ウイルスベクターを使用する場合、そのウイルスが本来認識する細胞表面のレセプター（例えば、アデノウイルスの場合のＣＡＲ、またはシンドビスウイルスの場合の高親和性ラミニンレセプター（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｍｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＬＡＭＲ）、ポリオウイルスの場合のＣＤ１５５、コクサッキーウイルスＡ２１の場合のＩＣＡＭ／ＤＡＦ、麻疹ウイルスの場合のＳＬＡＭ／ＣＤ４６など）を細胞表面に発現している細胞に対して標的化される。したがって、使用するウイルスに特異的な細胞表面レセプターを発現していないか、発現の程度が低い細胞に対しては、通常、ウイルスベクターを用いた遺伝子の効果的な標的指向化導入は困難である。しかしながら、本発明の抗ＣＥＡ抗体と結合し得るかまたは結合するように改変されたウイルスベクターを用いれば、そのウイルスの本来の細胞表面レセプターを発現していない細胞であっても、その細胞がＣＥＡを発現する細胞であれば、その細胞に対してウイルスベクターを用いた治療遺伝子の標的指向化導入および発現が容易に可能となる。図４に、ファイバーノブに結合させた抗ＣＥＡ抗体を結合させることによって、アデノウイルスをＣＥＡ発現細胞へ指向化し得ることを模式的に示す。
【００６８】
なお、本発明において使用される組換えアデノウイルスの作製については、さらに下記文献を参照することができる。
【００６９】
Yoshida Y., Sadata A., Zhang W., Shinoura N. and Hamada H. “Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma.”Human Gene Therapy, 9(17): 2503-2515, 1998.
【００７０】
Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Effective Gene Transfer to Human Melanomas via Integrin-Targeted Adenoviral Vectors.”Hum. Gene Ther., 13(5): 613-626, 2002.
【００７１】
Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Reduction of natural adenovirus tropism to the liver by both ablation of fiber-Coxsackievirus and adenovirus receptor interaction and use of replaceable short fiber.”J. Virol., 77(4): 2512-2521, 2003.
【００７２】
Uchida H, Tanaka T, Sasaki K, Kato K, Dehari H, Ito Y, Kobune M, Miyagishi M, Taira K, Tahara H, Hamada H. “Adenovirus-Mediated Transfer of siRNA against Survivin Induced Apoptosis and Attenuated Tumor Cell Growth in Vitro and in Vivo.” Mol Ther. 10(1):162-71, 2004.
【００７３】
Volpers C et al. “Antibody-mediated targeting of an adenovirus vector modified to contain a synthetic immunoglobulin G-binding domain in the capsid.” J. Virol. 77: 2093-2104, 2003.
【００７４】
Braisted AC and Wells JA “Minimizing a binding domain from protein A.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5688-5692, 1996.
【００７５】
４．薬剤の標的指向化
上記２．の説明からも明らかなように、本発明の抗ＣＥＡ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達することができる。したがって、本発明はまた、抗ＣＥＡ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達する方法を提供する。
【００７６】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」の例としては、既に説明した放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子などが挙げられる。
【００７７】
典型的な例として、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、抗ＣＥＡ抗体が結合し得る、治療遺伝子を組み込んだファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合される。これにより、アデノウイルス本来の受容体である（ＣＡＲ）に依存する感染のみの場合と比較して、標的細胞への感染効率を高めることができ、ファイバー変異型アデノウイルスを用いた標的部位への治療遺伝子の導入を効果的に行うことができる。
【００７８】
本発明において、「標的部位」は、ＣＥＡを発現または高発現している細胞、組織、臓器等であり、特に、ＣＥＡを高発現している腫瘍細胞である。そのような細胞の非限定的な例として、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌細胞等が本発明の目的にとって好適なものとして挙げられ得る。また、本発明において、「ＣＥＡ産生癌」とは、ＣＥＡを発現または高発現する癌（ＣＥＡ陽性の癌）のことをいうものとする。また、本明細書中、「腫瘍特異的ＣＥＡ抗原」とは、腫瘍細胞において発現しているＣＥＡをいうものとする。
【００７９】
５．本発明の抗ＣＥＡ抗体を用いるエフェクター細胞を介在する疾患の治療およびオプソニン化
本発明はまた、１つの態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＣＥＡ抗体が、被験者に投与された場合に、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を溶解または成長を阻害するように作用する、ＣＥＡの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。
【００８０】
用語「免疫学的エフェクター細胞」は、当該分野で通常用いられる意味で本明細書中でも用いられるが、特に、免疫応答の認識及び活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を言うものとする。免疫学的エフェクター細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ））、ＮＫ細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、多核白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞）などが含まれる。例えば、本発明者の抗ＣＥＡ抗体は、免疫学的エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合することができる。エフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体を発現して、抗体の結合によって特異的な免疫機能を奏することができ、例えば、好中球は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。このように、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を貪食するか、または溶解させることができる。
【００８１】
本発明者はまた、さらに別の態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＣＥＡ抗体が、被験者に投与された場合に、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化するように作用する、ＣＥＡの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬、およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。
【００８２】
例えば、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対する少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異的または多重特異的分子であり得る。例えば、上記第２の標的エピトープは、例えば、ヒトＦｃγＲＩ又はヒトＦｃα受容体などのＦｃ受容体であり得る。従って、本発明には、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＣＥＡを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。また上記第２の標的エピトープは抗ＣＥＡ抗体の補体結合部でもあり得る。抗ＣＥＡ抗体は補体を介して補体受容体を発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＣＥＡを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的または多重特異的分子は、ＣＥＡ発現細胞をエフェクター細胞に狙わせ、ＣＥＡ発現細胞のファゴサイトーシス、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオン産生などのＦｃ受容体媒介エフェクター細胞活性を惹起することができる。
【００８３】
６．ＣＥＡを診断マーカーとして検出および／または定量する方法
本発明は、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはそれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法を提供する。
【００８４】
本明細書中、「被験者」とは、ＣＥＡを高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、癌を罹患しているか、そのような疾患を罹患していると疑われるか、またはそのような疾患を罹患する危険性のある、ヒトの被験者を意味するものとする。本発明の目的に従う代表的な「癌」の例としては、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書中、「生体試料」とは、検査のために採取された被験者由来の細胞、組織、臓器、体液などを意味する。体液には、血液、リンパ液、精液、唾液、汗等が含まれ、血液には、全血の他、血清、血漿などの血液製剤も含まれるものとする。より具体的には、生体試料は、癌細胞（または癌組織）であり得、好ましくは、ＣＥＡ陽性癌細胞である。
【００８６】
本発明はまた、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、抗ＣＥＡ抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する方法を提供する。
【００８７】
好ましい態様に係る本発明の方法は、（１）生体試料と抗ＣＥＡ抗体とを接触させる工程、および（２）該生体試料中のＣＥＡと該抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量する工程を包含する。
【００８８】
このような方法は、ＣＥＡを例えば、正常細胞と比較して高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌等を含む癌の診断のために使用することができる。通常、ＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との結合体のレベル（または量）に基づいて、生体試料中のＣＥＡのレベル（または量）が評価される。生体試料中のＣＥＡのレベルと正常なヒトのコントロールで測定したレベルとを比較し、その変化（または差違）に基づいて、癌の存在が診断される。通常、正常ヒトコントロールと比較して高いＣＥＡレベルは、癌の存在を示す。この場合、通常少なくとも２倍、好ましくは、５倍程度高いＣＥＡレベルが、被験者が癌を有することを示す陽性結果である。あるいは、生体試料中のＣＥＡの存在そのものが、被験者における癌の存在を示し得る。
【００８９】
ヒト由来の生体試料において、ＣＥＡのようなタンパク質の発現レベルを決定するのに用いることができるアッセイ技術は、当業者によく知られている。このようなアッセイ方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡアッセイ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、結合タンパク質競合アッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、およびプロテオミクスアプローチ（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ）を含む。これらの中で、ＥＬＩＳＡが、生物学的液体における遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。
【００９０】
もし商業的に容易に入手できない場合、ＥＬＩＳＡ分析は、最初に、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さらに、一般的に、ＣＥＡに特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼなどの酵素試薬などの検出可能な試薬を付着している。
【００９１】
ＥＬＩＳＡを行う場合、ＣＥＡに特異的に結合する抗体は、例えば、ポリスチレンディッシュなどの、抗体を結合する固体支持体上でインキュベートされる。次に、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位（ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）は、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とインキュベートすることにより被覆される。次に、分析される試料は、ＣＥＡがポリスチレンディッシュに付着した特異抗体に結合する時間中、ディッシュ内でインキュベートされる。非結合試料はバッファーで洗い流される。ＣＥＡに対して特異的に指向し、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬を連結したレポーター抗体がディッシュ内に設置され、該レポーター抗体がＣＥＡに結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次に非結合レポーター抗体が洗い流される。比色基質を含むペルオキシダーゼ活性のための試薬が、次にディッシュに加えられる。抗ＣＥＡ抗体に連結した、固定化したペルオキシダーゼが着色反応産物を産生する。所定の時間内に発生した色素の量は、試料中のＣＥＡタンパク質の量に比例している。量的な結果は、通常標準曲線を参照して得られる。
【００９２】
競合アッセイもまた用いることができ、そこでは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体が固体支持体に付着しており、標識したＣＥＡおよび患者またはヒト対照に由来する試料が固体支持体上を通過する。固体支持体に付着した検出標識量を試料中のＣＥＡの量に相関させることができる。
【００９３】
上記に例示した個々の測定法以外にも、例えば、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、またはプロテインＡ免疫検定法などのいずれかの免疫学的な測定方法を本発明において用いることができる。
【００９４】
ＣＥＡを診断マーカーとして使用する意味において、ＣＥＡの核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いた核酸法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ）もまた、肺癌を含む癌のマーカーとしてのＣＥＡのｍＲＮＡを検出するのに用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列をもとにした増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）などのその他の核酸法を、様々な悪性腫瘍を診断およびモニタリングするための悪性細胞の検出に用いることができる。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、特定のｍＲＮＡ集団の存在を、何千ものその他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物の中で検出するために用いることができる強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、１種類のｍＲＮＡが、酵素である逆転写酵素を用いて最初に相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にそのｃＤＮＡが標準的なＰＣＲ反応と同様に増幅される。このように、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることができる。したがって、このｍＲＮＡがそれを産生する細胞に高度に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲは、特定の種類の細胞の存在を同定するのに用いることができる。また、リアルタイムＰＣＲ法も、ＣＥＡをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を定量し、被験者と健常者との比較において、ＣＥＡをマーカーとして被験者の癌の診断を行うために使用することができる。
【００９５】
また、ＣＥＡをマーカーとして、被験者の癌の進展の経過あるいは治療経過をモニタリングすることもできる。そのような癌としては、ＣＥＡ陽性の癌であれば特に種類を問わず、ＣＥＡ陽性の胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌などの診断に好適に使用することができる。例えば、抗体とマグネチックビーズとを用いた細胞の分別と濃縮（エンリッチメント）、ならびにＲＴ−ＰＣＲ法による高感度のｍＲＮＡの検出法を組み合わせることによって、例えば、５ｍｌの被験者の血液中に存在する数個の腫瘍細胞を検出することが可能である。血液中に存在する腫瘍細胞を検出すること、そのＣＥＡの発現量またはｍＲＮＡの量を検出または測定することによって、感度および特異性の高い腫瘍の診断が可能である。このような方法については、さらに以下の参考文献を参照することができる。
【００９６】
Zieglschmid V, Hollmann C, Bocher O. “Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood.” Crit Rev Clin Lab Sci. 2005;42(2):155-96.
【００９７】
Waguri N, Suda T, Nomoto M, Kawai H, Mita Y, Kuroiwa T, Igarashi M, Kobayashi M, Fukuhara Y, Aoyagi Y. “Sensitive and specific detection of circulating cancer cells in patients with hepatocellular carcinoma; detection of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA after immunomagnetic separation.” Clin Cancer Res. 2003 Aug 1;9(8):3004-11.
【００９８】
Zhang YL, Feng JG, Gou JM, Zhou LX, Wang P. “Detection of CK20mRNA in peripheral blood of pancreatic cancer and its clinical significance.” World J Gastroenterol. 2005 Feb 21;11(7):1023-7.
【００９９】
Demel U, Tilz GP, Foeldes-Papp Z, Gutierrez B, Albert WH, Bocher O. “Detection of tumour cells in the peripheral blood of patients with breast cancer. Development of a new sensitive and specific immunomolecular assay.” J Exp Clin Cancer Res. 2004 Sep;23(3):465-8.
【０１００】
固体支持体上に配列（すなわち、グリッド化（ｇｒｉｄｄｉｎｇ））されたクローンまたはオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションもまた、その遺伝子の発現の検出および発現レベルの定量の両方に用いることができる。この手法では、ＣＥＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡが基材に固定される。基材は、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むがこれらに限定されない任意の好適な種類であってもよい。ＣＥＡ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部を基材に付着させ、次に、当該組織から単離したＲＮＡまたはＲＮＡのコピーである相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい検体とインキュベートする。基材に結合したＤＮＡと検体とのハイブリダイゼーションは、検体またはハイブリッド検出用の二次分子を放射性標識または蛍光標識することを含むがこれらに限定されないいくつかの手段で検出し定量することができる。本発明において使用し得る標識の非限定的な例としては、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素等が挙げられる。遺伝子の発現レベルの定量は、検体からの信号の強度を、既知の標準から決定したレベルと比較することによってなされる。標準は、標的遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、収量の定量化、およびこの材料を用いて標準曲線を作成することにより得ることができる。
【０１０１】
プロテオミクスアプローチでは、２次元電気泳動が当業者によく知られた技術である。すなわち、血清などの試料からの個別のタンパク質は、通常ポリアクリルアミドゲル上で、タンパク質の異なる特性による分離を連続的に行うことによって単離することができる。最初に、タンパク質は電流を用いて大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均等に作用し、それにより、小さいタンパク質は大きいタンパク質よりもゲル上で早く移動する。第２次元では、第１次元に対して直角に電流をかけ、タンパク質を大きさに基づいてではなく、各タンパク質が有する特定の電荷に基づいて分離する。異なる配列の２つのタンパク質で大きさおよび電荷の両方に関して同一なものは存在しないため、２次元分離の結果は、各タンパク質が固有のスポットを占有する正方形のゲルとなる。該スポットの化学的プローブまたは抗体プローブによる分析、またはそれに引き続くタンパク質のマイクロシーケンスにより、所定のタンパク質の相対的な存在度を明らかにし、試料中のタンパク質の同定をすることができる。
【０１０２】
以上詳述した検出および／または定量方法は、組織生検材料および検死解剖材料を含む患者または被験者から得られた様々な細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジネートまたは可溶化した組織）に由来する試料について行うことができる。本発明に有用な体液は、血液、尿、唾液または任意のその他の体分泌物またはそれらの派生物を含む。血液は、全血、血漿、血清、または任意の血液の派生物を含む。
【０１０３】
７．抗ＣＥＡ自己抗体を検出および／または定量する方法
本発明はまた、別の態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡに対する自己抗体（抗ＣＥＡ自己抗体）を検出および／または定量する方法を提供する。
【０１０４】
被験者からの生体試料中の抗ＣＥＡ自己抗体の検出は、任意の多くの方法で行うことができるが、代表的な方法には、免疫アッセイがあり、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、プロテインＡ免疫検定法等が挙げられる。
【０１０５】
このような免疫アッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを実施するための１つの方法は、ＣＥＡタンパク質の固相支持体上への繋留、およびそれに対して特異的な抗ＣＥＡ抗体の検出を包含する。本発明のアッセイに用いられるＣＥＡタンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって調製し得る。例えば、ＣＥＡタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、ＣＥＡタンパク質を大規模に発現することができる。好ましくは、ＣＥＡの標識、固定化または検出を容易にすることができる融合タンパク質が遺伝子操作される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術を参照）。別法として、ＣＥＡタンパク質は天然の供給源から精製することができる。例えば、当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いて前立腺がん細胞から精製する。このような精製技術には、分子シーブクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーが包含されるが、これらに限定されない。実際にはＣＥＡタンパク質の固体支持体としては、マイクロタイタープレートが好都合に使用される。
【０１０６】
８．薬剤の標的指向化療法において使用し得る抗体分子を探索する方法
本明細書の実施例に、抗ＣＥＡ抗体とＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターとを用いて具体的に例示したＣＥＡ陽性、陰性または正常細胞への遺伝子導入効率の評価の方法は、ＣＥＡを標的とした標的化療法に使用し得る抗体を同定するための方法として有用である。
【０１０７】
したがって、本発明は、薬剤の標的指向化療法において使用し得る腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、１つの態様において、腫瘍特異的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を提供し、この方法は、
（１）ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、および
（３）上記感染効率が上記ハイブリドーマ由来産物（抗体など）を上記腫瘍細胞と接触させない場合と比較して増大したハイブリドーマを選択し、クローニングする工程
を包含する。
【０１０９】
本発明はまた、腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。この調製方法は、
（１）ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する。
【０１１０】
ここで、好ましくは、上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞への感染は、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記腫瘍細胞に接触させること、によって行われる。
【０１１１】
上記調製方法では、感染効率を評価した結果、通常、感染効率がハイブリドーマ由来産物（抗体など）を腫瘍細胞と接触させない場合と比較して、またはコントロール抗体と腫瘍細胞とを接触させた場合と比較して、増大したハイブリドーマを選択し、クローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。なお、予め抗ＣＥＡモノクローナル抗体が入手可能な場合（例えば、市販の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を使用し得る場合）は、上記のハイブリドーマのライブラリーを作製する工程は省略し得ることは明らかである。好ましい態様では、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程は、レポーター遺伝子発現アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する上記感染効率を評価することを含む。ここで、上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現することができるように作製されている。また、上記レポーター遺伝子発現アッセイは、例えば、分光光度計あるいはフローサイトメトリーを利用してレポーター遺伝子ＥＧＦＰの発現測定を行うことができる。ここで、上記発現効率の増大したハイブリドーマの選択においては、レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体を使用した場合と比較して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍、より好ましくは、少なくとも４０倍、最も好ましくは、少なくとも５０倍であるモノクローナル抗体が選択される。なお、ここでいう「コントロール抗体」とは、ＩＢＬ社（ｌｏｔ Ｎｏ ９Ｇ−７１７）のようなマウス抗ＣＥＡ抗体のことをいう。
【０１１２】
また、レポーター遺伝子発現アッセイの代替的な実施方法としては、例えば、レポーター遺伝子としてｌａｃＺを使用する場合には、ｌａｃＺ遺伝子産物の発現は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーター測定キット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。また、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販のルシフェラーゼ定量システムとして、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ１５００）などを使用して測定し得る。
【０１１３】
上記方法において、抗体に結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスとしては、例えば、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフをノブのＨＩループ部位に含むＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスが挙げられる。上記方法においては、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスに限らず、抗体とある程度以上のアフィニティー（例えば、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１以上であるような結合親和性；以下同様）をもって結合できる性質を付与したベクターであれば、その種類を問わない。例えば、アデノウイルスにＦＺ３３などの抗体結合分子もしくはペプチドを任意の方法で結合（Ｚ３３などを共有結合、Ｚ３３などをビオチン−アビジンによって架橋、Ｚ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させたＺ３３などの修飾型のアデノウイルス、などが挙げられる。また、アデノウイルスのファイバーのＣＡＲ受容体（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合部位を欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｋｉｒｂｙ Ｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３： ９５０８−９５１４， １９９９．； Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ７６９−７７６， ２００２．； ＲｏｅｌｖｉｎｋＰＷ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６： １５６８−１５７１， １９９９．などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスのインテグリン分子群との反応性を欠いた、ペントンベースタンパク変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスの肝臓への取り込みを欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｓｍｉｔｈ ＴＡ ｅｔ ａｌ （Ｓｍｉｔｈ ＴＡ， Ｉｄａｍａｋａｎｔｉ Ｎ， Ｒｏｌｌｅｎｃｅ ＭＬ， Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｎｅｆｆ Ｊ， Ｋｉｍ Ｊ， Ｍｕｌｇｒｅｗ Ｋ， Ｎｅｍｅｒｏｗ ＧＲ， Ｋａｌｅｋｏ Ｍ， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＳＣ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｆｉｂｅｒ ｓｈａｆｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００３ Ｍａｙ ２０；１４（８）：７７７−８７．）などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。なお、これらは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など）の外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した変異型ウイルス、または上記各種ウイルスにＦＺ３３などの抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（ＦＺ３３などを共有結合、ＦＺ３３などをビオチンーアビジンによって架橋、ＦＺ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の方法に使用し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターに、抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（抗体結合分子を化学的に共有結合させる、ビオチンーアビジンによって架橋させる、抗体結合分子を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターも、本発明において有利に使用することができる。
【０１１４】
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。これらのレポーター遺伝子は、当業者に周知のレポーター遺伝子アッセイ系を用いて検出し得る。例えば、ｌａｃＺを発現するように調製されたＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスの感染効率は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーターキット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。ルシフェラーゼ定量システムとしては Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ ， Ｃａｔ ＮｏＥ１５００）などを使用して測定し得る。ＥＧＦＰなどの蛍光タンパクは、分光光度計あるいはフローサイトメトリーによって発現量を測定し得る。
【０１１５】
なお、上記した薬剤の標的指向化療法に使用するためのモノクローナル抗体の作製および精製については、さらに以下の文献を参照することができる。
【０１１６】
Hamada H. and Tsuruo T. “Functional role for the 170- to 180-kDa glycoprotein specific to drug-resistant tumor cells as revealed by monoclonal antibodies.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7785-7789, 1986.
【０１１７】
Hamada H. and Tsuruo T. “Determination of membrane antigens by a covalent crosslinking method with monoclonal antibodies.”Anal. Biochem., 160: 483-488, 1987.
【０１１８】
Hamada H., Hagiwara K., Nakajima T. and Tsuruo T. “Phosphorylation of the Mr 170,000 to 180,000 glycoprotein specific to multidrug-resistant tumor cells: Effects of verapamil, trifluoperazine, and phorbol esters.”Cancer Res., 47: 2860-2865, 1987.
【０１１９】
Hamada H. and Tsuruo T. “Purification of the 170- to 180 kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance: The 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase.”J. Biol. Chem., 263: 1454-1458, 1988.
【０１２０】
Mishell BB, Shiigi SM eds. “Selected Methods in Cellular Immunology” WH Freeman and Co., San Francisco, 1980. (邦訳 細胞免疫実験操作法、今井ら訳、理工学社、1982)
【０１２１】
Birch JR and Lennox ES eds. “Monoclonal antibodies: Principles and Applications.” Wiley-Liss, New York, 1995.
【０１２２】
Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Academic Press, London, 1983.
【０１２３】
Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Third ed. Academic Press, London, 1996.
【０１２４】
上記の腫瘍特異的抗原に対する抗ＣＥＡモノクローナル抗体を同定する方法により、ＣＥＡ産生癌細胞の標的化治療に実用化可能な抗体を系統的に探索することができる。
【０１２５】
９．標的化療法における標的分子および抗体の配列決定およびクローニング
本発明の上記方法により、同定された抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当業者に周知の配列決定法により決定することができる。
【０１２６】
アミノ酸配列決定法としては、気相シークエンサー（例えば、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９０ｃＬＣ ＡＢＩ社、ＨＰ２４１ ＨＰ社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたペプチドのＨＰＬＣによる分離、ゲル電気泳動によるペプチドマップ法、質量分析装置によるＨＰＬＣで分離されたペプチドのアミノ酸配列分析等が使用され得る。核酸配列の決定方法としては、ＰＣＲを用いたサイクルシークエンス法などのような当業者に周知の核酸配列の決定法が使用され得る。
【０１２７】
得られた標的分子またはそれに対する抗体のＤＮＡの塩基配列が決定されれば、それに基づいて遺伝子工学的手法により、本発明の抗体を作製したり、他の分子との融合体を作製したりすることができる。目的とするＤＮＡは、プラスミドベクターによるクローニング法等の当業者に周知の分子生物学的手法を用いて大量に得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９等を参照）。
【０１２８】
１０．製剤化および製剤の投与方法
本発明の抗体を含有する治療薬、本発明の抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療薬は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。
【０１２９】
本発明の治療薬の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【０１３０】
本発明の治療薬の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
【０１３１】
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【０１３２】
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１３３】
本発明の治療剤は、対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されないが、ＣＥＡ産生癌（例えば、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および前立腺癌）の治療に用いることができる。
【０１３４】
また、本発明において典型的に使用されるウイルスベクター粒子は、医薬組成物の成分の一つとして、抗ＣＥＡ抗体と組み合わせて、治療、特に腫瘍の治療のために使用することができる。組換えアデノウイルス粒子と抗ＣＥＡ抗体との組み合わせを治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＣＥＡ抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０３〜１０１５個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＣＥＡ抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＣＥＡ抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。
【０１３５】
以下、実施例によって本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されない。
【実施例】
【０１３６】
１．材料および方法
1.1. 細胞培養
高レベルのＣＥＡを産生するヒト胃腺癌から樹立したＭＫＮ４５細胞株を、日本癌研究リサーチリソースバンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。ＭＫＮ−７４（ＣＥＡを発現しないヒト胃癌細胞）は、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉから提供された。ヒト正常肝細胞株であるＣｈａｎ−ｌｉｖｅｒは、Ｄｒ．Ｎｉｉｔｕ（Ｆｏｒｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓａｐｐｏｒｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、５％ ＣＯ２で増殖させた。
【０１３７】
1.2. ｐＡｘ３プラスミド構築
Ｓａｉｔｏらによって最初に開発されたコスミドＤＮＡ ｐＡｄｅｘ１ｃｗは、アデノウイルスゲノムの最左端の３３塩基対（ｂｐ）および最右端の約２００塩基対（ｂｐ）の両方を欠失するため、本発明者らは、アデノウイルスゲノムの左端および右端の両方の全長配列を提供する組換えアデノウイルス産生のためにコスミドＤＮＡを作製することを試みた。コスミドｐＡｘ３５７−ＦＲＧＤ（単にｐＡｘ３と略記されることもある）は、以下のようにこのプロジェクトのために構築された。Ａｄ５ゲノムの左端の３５７ｂｐを、Ａｄ５ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、そしてＭｕｎＩ（ｃａａｔｔｇ）、ＰａｃＩ（ｔｔａａｔｔａａ）、およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｄ）部位を含む５’プライマー：５’ＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡ−３’（配列番号２）、およびＣｌａＩ（ａｔｃｇａｔ）、ＳｗａＩ（ａｔｔｔａａａｔ）、およびＢｇｌＩＩ（ａｇａｔｃｔ）部位を含む３’プライマー：５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧＣＧＣ−３’（配列番号３）を用いてＰＣＲによって得た。得られた４０１ｂｐのＰＣＲ産物を、ＭｕｎＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｊａｐａｎ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入したｐＷＥ１５コスミドのＥｃｏＲＩ（ＭｕｎＩ接着末端と互換性）およびＣｌａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＷＥ３５７ＰａｃＩを得た。Ａｄ５ゲノムの３５７ｂｐ左側末端を含有するｐＷＥ３５７ＰａｃＩ由来のＣｌａＩ／ＲｓｒＩＩフラグメント（フラグメントＡ）を、ｐＡｘ−ＦＲＧＤ由来のＡｄ５ゲノムＤＮＡの約２４ｋｂｐの中央部分を含有するＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（フラグメントＢ）（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３（５）：６１３−２６，２００２）、およびｐＡｘＦＲＧＤ由来のＦＲＧＤファイバー変異体Ａｄ５ゲノムの右側６．７ｋｂｐを含有するＥｃｏＲＩ／ＲｅｒＩＩフラグメント（フラグメントＣ）へ、フラグメントＡ、ＢおよびＣの３部分ライゲーションによってライゲーションした。得られたコスミドＤＮＡを、ｐＡｘ３５７−ＦＲＧＤと命名した（これはまた、単にｐＡｘ３とも略記される）。
【０１３８】
図１は、本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのアデノウイルスベクターｐＡｘ３の模式図である。図１に示されるように、ｐＡｘ３プラスミドＤＮＡは、ＰａｃＩ部位を、Ａｄ５ゲノム（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）１〜３５７）の左側末端および右側末端の両方に含有し、続いてＢｇｌＩＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、およびＳａｌＩ制限酵素部位を含有する。ｐＡｘ３は、ｎｔ３５８〜３３２８のＥ１ＡおよびＥ１８コード領域を欠失する。これはまた、Ｅ３をコードする１．８ｋｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩフラグメントを欠失する。それは、ＲＧＤファイバー変異をコードするＣＤＣＲＧＤＣＦＣをファイバーノブのＨＩループに含有し、Ａｄ５ゲノムの全長右側末端を含有する。ＲＧＤ変異を有するファイバーノブＨＩループのＤＮＡ配列は、以下の通りであり：ＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴ（配列番号４）、ＳａｃＩＩ部位をＲＧＤリガンド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）コード領域に有し、続いてＡｓｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｌＩ制限酵素部位を有する。
【０１３９】
1.3. ＦＺ３３アデノウイルスベクター構築のためのプラスミド
ａ．プラスミドｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮ構築
ＡｄｖファイバーノブＨＩループの遺伝子工学を簡略化するために、本発明者らはまず、Ａｇｅｌ（ＡＣＣＧＧＴ）部位およびＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）部位を含有するＨＩループをコードするＤＮＡフラグメントを作製し、このフラグメントをｈｉＡＮと名付けた。ｈｉＡＮフラグメントの５’側半分は、５’プライマー＃２０９１および３’プライマー＃２０９２を使用して、プラスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００２（前出））をテンプレートとして使用してＰＣＲによって合成した。ＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）部位を有する＃２０９１の３７塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｇｇｇｇｔａｃｃａａｔａｔｃｔｇｇａａｃａｇｔｔｃａａａｇｔｇｃｔｃａｔ（配列番号５）。ＥｃｏＲＩ部位およびＡｇｅＩ（ａｃｃｇｇｔ）部位を有する＃２０９２の４７塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｇｇａａｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔａｃｃｇｔｔｔａｇｔｇｔａａｔｇ（配列番号６）。得られる３１４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミド構築のために使用した。ｈｉＡＮフラグメントの３’側半分を、５’プライマー＃２０９３および３’プライマー＃２０６８を使用して、プラスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２（前出））をテンプレートとして使用して合成した。ＮｈｅＩ（ｇｃｔａｇｃ）部位を有する＃２０９３の５２塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｃｇａａｔｔｃｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔ（配列番号７）。＃２０６８の２６塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ａｔａｔｇｇｔａｃｃｇｇｇａｇｇｔｇｇｔｇａａｔｔａ（配列番号８）。得られる９７４ｂｐのＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１３６ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミド構築のために使用した。５’および３’部分を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位に、３部分ライゲーションによってサブクローニングし、プラスミドｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮを得た。
【０１４０】
ｂ．ｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３プラスミド構築
Ｚ３３ペプチドモチーフを有するＤＮＡフラグメントを、４８塩基の＃２０８５ ５’プライマーおよび４８塩基 ＃２０８６ ３’プライマーを用いて、８６塩基 ＃２０８７オリゴヌクレオチドテンプレートを使用してＰＣＲによって合成した。このオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：＃２０８５、４８ｂ：ｇａａａｃｃｇｇｔｃｔｃａｔｃａａｇｔｔｔａａｃａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃ（配列番号９）、＃２０８６、４８ｂ：ｇｔｃｇｃｔａｇｃａｔｃｔａｔｇｔｃｇｔｃｇｃｇａａｔｇｃｔｃｔｔａａｔｃｔｔｇｇｃｇｔｔｇｃｇ（配列番号１０）、＃２０８７、８６ｂ：ａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｃｃｃｃａａｃｃｔｇａａｃｇａｇｇａｇｃａｇｃｇｃａａｃｇｃｃａａｇａｔｔａａｇａｇｃａｔｔｃｇ（配列番号１１）。得られた１３２ｂｐのＰＣＲ産物（ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣ（配列番号１２））を、ＡｇｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮのＡｇｅＩ／ＮｈｅＩ部位に挿入し、プラスミドｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３を得た。１３２ｂｐフラグメントによってコードされるアミノ酸配列は、以下の通りである：ＥＴＧＬＩＫＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＩＤＡＳＤ（配列番号１３）。報告されたＦＺ３３配列：ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１４）には、下線を付している。さらに、下線を付したＴＧは、ＡＣＣＧＧＴ（ＡｇｅＩ部位）としてコードされ、そして下線を付したＡＳはＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ部位）としてコードされる。
【０１４１】
ｃ．ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３プラスミド構築
Ａｄ５ファイバーのＮ末端領域（フラグメントＡ）をコードするｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２由来のＸｂａＩ／ＢｓｔＸＩフラグメント、Ａｄ５ゲノムの右側末端を含有するｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２由来のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメント（フラグメントＢ）、およびＺ３３モチーフをコードするｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３由来のＢｓｔＸＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（フラグメントＣ）を、３部分ライゲーションによってライゲーションし、ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３を得た。
【０１４２】
ｄ．ｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミド構築
Ａｄ５ゲノムの左側末端３５７ｂｐを含有するｐＡｘ３由来のＲｓｒＩＩ／ＣｌａＩフラグメント（３９５６ｂｐ）、Ａｄ５ゲノムの中央の２４ｋｂｐを含有するｐＡｘ３由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、およびｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３由来のＥｃｏＲＩ／ＲｓｒＩＩフラグメントを、３部分ライゲーションによってライゲーションして、ｐＡｘ３−ＦＺ３３を得た。図２は、ｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミドの模式図である。
【０１４３】
ｅ．ｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３プラスミド構築
ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩ消化およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化、およびその後のＥｃｏＲＩでの消化によって、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切り出した。そのフラグメントを、ｐＣＡｃｃ（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ ａｎｄ Ｈａｍａｄａ Ｈ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３０，４２６−４３０．１９９７）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって予め平滑末端化した）部位へ挿入し、ｐＣＡＥＧＦＰを得た。ｐＣＡＥＧＦＰ由来のＣｌａＩフラグメントを、ｐＡｘ３−ＦＺ３３のＣｌａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を得た。左側方向のプラスミドｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３（ここで、ＥＧＦＰをコードする遺伝子を駆動するプロモーターはＥ１Ａプロモーターに対して反対向きである）をアデノウイルス産生のために使用した。
【０１４４】
ｆ．ｐＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３プラスミド構築
プラスミドｐＣＡＺ３（ここで、ｌａｃＺ遺伝子は、ＣＡプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターを有するサイトメガロウイルスエンハンサー）によって駆動される）を作製した（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２００２（前出））。βガラクトシダーゼ発現カセット（ＣＡＺ３、５１５３ｂｐ）を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ消化によって、ｐＣＡＺ３から切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、そしてｐＡｘ３−ＦＺ３３のＳｗａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を得た。左側方向プラスミドｐＡｘ３ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３（ここで、ｌａｃＺ遺伝子を駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターに対して反対向きである）を、アデノウイルス産生のために使用した。
【０１４５】
ｇ．ｐＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３プラスミド構築
プラスミドｐＣＡＵＰ（大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）遺伝子は、ＣＡプロモーターによって駆動される）を作製した（Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）。ＵＰＲＴ遺伝子発現カセット（ＣＡＵＰ、２．８ｋｂｐ）を、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄｌＩＩ消化によってｐＣＡＵＰから切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、そしてｐＡｘ３−ＦＺ３３のＳｗａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を得た。左側方向のプラスミドｐＡｘ３ＣＡＵＰ（Ｌ）−ＦＺ３３（ＵＰＲＴａｓｅを駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターに関して反対方向に向いている）を、アデノウイルス産生のために使用した。
【０１４６】
組換えアデノウイルスの作製のために、各コスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したリポフェクションによって２９３細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクトした２９３細胞から生じるプラークを単離し、そしてウイルスゲノムの制限酵素消化および発現ユニットの配列決定によって評価した。得られたアデノウイルスベクターを、２９３細胞中で拡大し、そして塩化セシウム超遠心分離によって精製した。精製したウイルスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１０％グリセロールとともに透析し、そして−７０℃で使用するまで保存した。ウイルス濃度（ｖｐ／ｍｌ）を決定するために、ウイルス溶液を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中にインキュベートし、そしてＡ２６０で測定した。濃度をｖｐ／ｍｌ＝Ａ２６０×（１．１×１０１２）として規定した。使用前に、ウイルスストックへのレプリコンコンピテントウイルスの混入を、Ｅ１Ａに特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１５）、リバースプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＡ−３’（配列番号１６）、Ｅ１Ｂに特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー：５’−ＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１８）、およびＥ２Ｂ（陽性コントロール）に特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１９）、リバースプライマー：５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧ−３’（配列番号２０）を使用したＰＣＲ分析によって排除した。図３は、このようにして作製したＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。
【０１４７】
1.4. 完全ヒト型ＣＥＡ抗体
本発明では、Ｃ２−４５クローン（ＩｇＧ４κ）を、完全ヒト型抗ＣＥＡモノクローナル抗体として使用した。抗ＣＥＡヒトモノクローナル抗体の調製を、以前に記載されたように行った（Ｉｍａｋｉｉｒｅ， Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， １０８： ５６４−５７０， ２００４；Ｓｈｉｂａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２４：３３５５−３３６０，２００４）。簡単に説明すると、大腸癌由来の精製したＣＥＡで免疫したＫＭマウスの脾細胞を、Ｐ３−Ｕ１マウスミエローマ細胞と融合させた。ＣＥＡ反応性クローンを選択し、プロテインＧカラムを使用して精製した。抗ＣＥＡヒトモノクローナル抗体のＣＥＡＣＡＭとの交差反応性（表１を参照）、抗体のＣＥＡ抗原との親和性（表２を参照）、および抗体に対するＣＥＡ上のエピトープを、それぞれ分析した。
【表１】
表１から明らかなように、Ｃ２−４５クローンは、正常組織にも発現しているＣＥＡファミリーであるＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ１、またはＣＥＡＣＡＭ８とは結合せず、ＣＥＡに特異的に結合することが示された。
【表２】
表２から明らかなように、Ｃ２−４５クローンは、ＣＥＡ抗原に対して高い親和性を有することが示された。
【０１４８】
1.5. ＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの細胞表面上での発現
腹水液として調製したマウス抗ヒトＣＡＲモノクローナル抗体、ＲｍｃＢは、Ｄｒ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ（ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から提供された。抗αＶβ３ｍＡｂ ＭＡＢ１９６１、抗αｖβ５ ＭＡＢ１９７６を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。ヒト細胞株でのヒトＣＥＡの発現を、Ｃ２−４５によって分析した。コントロールヒトＩｇＧ４を、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ＬＴＤ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。コントロールマウスＩｇＧおよびＦＩＴＣを結合させた抗マウスＩｇＧを、ＳｉｇｍａおよびＤａｋｏ Ｊａｐａｎ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）からそれぞれ購入した。培養細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．５％）（Ｓｉｇｍａ）を５分間用いて回収した。脱着した細胞を遠心分離し、そして２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１０５細胞／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ中で再懸濁した。次いで、細胞をＲｍｃＢ、または１０μｇ／ｍＬ Ｃ２−４５または１０μｇ／ｍＬ 抗インテグリン抗体（ＭＡＢ１９６１、ＭＡＢ１９７６）とともに１時間氷上でインキュベートした。続いて、その細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）とともに、３０分間氷上で暗所でインキュベートした。２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄後、その細胞を５００μＬの２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で再懸濁した。分析を、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。
【０１４９】
1.6. インビトロでの遺伝子導入効率
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＥＧＦＰＦＺ３３に感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞の遺伝子導入効率を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。ＥＧＦＰ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法にしたがって行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に、２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有する無血清培地、または抗体を含まない無血清培地で、３７℃、５％ ＣＯ２で１時間処理した。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で洗浄し、次いで、細胞をＡｘ３ＣＡＥＧＦＰＦＺ３３（０〜１，０００ウイルス粒子／細胞）を含有する１ｍｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２中で１時間感染させた。インキュベーションの後、これらの細胞を、無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。抗体と結合させたまたはさせていないＡｄｖの遺伝子導入効率を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。ＧＦＰ活性をＦＡＣＳcａｌｉｂｅｒによって測定した。
【０１５０】
1.7. インビトロでのトランスジーン発現
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３で感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞のトランスジーン発現量を、化学発光レポーター遺伝子アッセイによって評価した。ＬａｃＺ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法に従って行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地で、３７℃、５％ ＣＯ２中で、１時間処理した。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で洗浄し、次いで細胞を、Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（０〜１，０００ウイルス粒子／細胞）を含有する１００μＬの無血清培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２中で、１時間感染させた。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。抗体と結合させたかまたは結合させていないＡｄｖのトランスジーン発現を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。ＬａｃＺ活性をｂ−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって測定した。
【０１５１】
1.8. インビトロでの５−ＦＵの感受性
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＵＰＦＺ３３に感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞の５−ＦＵ感受性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。大腸菌ＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法に従って行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４、およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、５×１０４細胞／ウェルで、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に、２４ウェルプレートに播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地で、３７℃、５％ＣＯ２中で、１時間処理した。インキュベーション後、これらの細胞を、無血清培地で洗浄し、次いで、細胞を、Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を含有する２００μＬの無血清培地（０〜１００ウイルス粒子／細胞）に、３７℃、５％ＣＯ２中で、１時間感染させた。インキュベーション後、これらの細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を、５ＦＵ（０〜１００μＭ）を含有する１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、４日間培養した。抗体を結合させたＡｄｖまたは抗体を結合させていないＡｄｖの５−ＦＵ感受性を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。細胞生存を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
【０１５２】
1.9. 抗ＣＥＡ ｍＡｂと結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介させたインビボｌａｃＺ発現
インビボでの播種性胃癌における、抗ＣＥＡ ｍＡｂと結合させたＺ３３を仲介する遺伝子の遺伝子導入の能力および選択性を評価するために、メス胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）をＪａｐａｎ ＳＬＧから入手した。これらは、各実験の開始時に４週齢であった。ＰＢＳ中で再懸濁した新たに回収した１×１０７個のＭＫＮ−４５の細胞を、腹腔中へ接種した。次に、異種移植の１０日後に、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地と結合体化させたＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ウイルス粒子／動物）を、ウイルスベクター投与の４日後にマウスの腹腔内に投与し、マウスを屠殺し、そして４％パラホルムアルデニドを１５分間全身灌流させることによって固定した。βガラクトシダーゼの発現を検出するために、腹腔をＸ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および４ｍＭ フェリシアン化カリウム）で４時間染色した。
【０１５３】
1.10. マウスモデルにおける腹膜播種性胃癌のための、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介する遺伝子治療
樹立された腫瘍に対する、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合したＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介させた腫瘍特異的遺伝子治療のインビボでの効力を評価するために、全ての動物実験を札幌医科大学によって確立されたガイドラインの下に行った。雄胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）を、Ｊａｐａｎ ＳＬＧから購入した。ＭＫＮ ４５細胞（１×１０７細胞／マウス）の腹腔内注射を受けたマウスを、無作為に、処置計画にしたがって以下の５つのグループに分けた。（ａ）３０μｇのＣ２−４５を含有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）処置（ｎ＝３）；（ｂ）３０μｇのコントロールＩｇＧ４を含有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｃ）抗体を含まないＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｄ）ＰＢＳ、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｅ）処置無し（ｎ＝３）。総容量３００μｌのアデノウイルスベクター（５×１０９ＶＰ）を、腫瘍移植の４日後にマウスの腹腔内に注射した。次の日から、５−ＦＵまたはＰＢＳを、毎日５日間腹腔内投与した。このプロトコルを、２コース連続的に行った。動物を腫瘍移植の１８日後に屠殺し、その後、各動物の腹腔播種性塊を回収し、重量を測定した。
【０１５４】
２．結果
2.1. ＣＥＡ陽性または陰性細胞株におけるＣＡＲおよびインテグリンの発現
本発明者らは、まず、胃癌細胞および正常肝細胞株におけるＣＥＡの発現を調べた。何人かの研究者が、ＭＫＮ−４５はＣＥＡを豊富に産生するが、ＭＫＮ−７４のＣＥＡ産生はほとんどないことを報告している（Ｐｒａｎａｙ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｃａｎ． Ｒｅｓ．， ６１： ３７０-３７５，２００１； ＫＥＮＧ-ＨＳＩＮ ＬＡＮ． ｅｔ ａｌ， ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ．， １１１：１２４１−１２５１，１９９６）。
【０１５５】
図５は、ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現を示す。図５に示されるように、ＣＥＡは、ＭＫＮ−４５（ＣＥＡ陽性胃癌細胞株）において発現されるが（図５Ａ）、ＭＫＮ−７４（ＣＥＡ陰性胃癌細胞株）またはＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞株（正常肝細胞株）においては発現されない（図５Ｂ）。
【０１５６】
次に、一次のアデノウイルスレセプターであるＣＡＲ、および二次のアデノウイルスレセプターであるインテグリンαｖβ３およびαｖβ５の発現もまた、ＦＡＣＳにより分析した。その結果もまた、図５に示す。図５に示す結果は、癌細胞および正常細胞が、明らかにＣＡＲおよび両方のインテグリンを発現することを実証した。したがって、これらのデータは、ヒト細胞株におけるＣＡＲまたはインテグリンの発現が、癌遺伝子治療のための特異的な標的ではないことを示唆する。
【０１５７】
2.2. インビトロでのＣＥＡ陽性細胞に対する遺伝子導入効率の改善
本発明者らは、ファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、そしてＥＧＦＰ遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を使用して、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株における遺伝子導入効率を評価した。これらの研究において、Ｃ２−４５ウイルスコントロールＩｇＧ４との直接比較を行った。
【０１５８】
図６は、ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞およびＭＫＮ−７４細胞への適用は、Ｃ２−４５を用いた遺伝子導入効率が、コントロール抗体を用いたものと同等であるという結果をもたらした（図６ＡおよびＢ）。次いで、本発明者らは、ＭＫＮ−４５細胞上でＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を試験した。ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、顕著に、Ｃ２−４５を用いた遺伝子導入効率は、コントロール抗体と比較して有意に増大した（図６Ｃ）。特に、ＶＰ１０に感染させたＭＫＮ−４５細胞は、遺伝子移入において１５．２倍の増強を示した。他方、ＶＰ１０００に感染させたアデノウイルスベクターである、Ｃ２−４５結合体化アデノウイルスベクターは、９１％のトランスフェクションを誘導した。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体を結合させたＺ３３アデノウイルスベクターが、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスにより仲介される遺伝子導入の効率を増強することができることを実証した。
【０１５９】
2.3. インビトロでのＣＥＡ陽性細胞に対するトランスジーン発現の改善
次に、本発明者らは、ファイバードメインにＩｇＧ結合配列を担持し、ｌａｃＺ遺伝子（Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３）をコードする遺伝的に改変したＡｄｖを用いて、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株におけるトランスジーン発現を評価した。Ｃ２−４５ウイルスコントロールＩｇＧ４を用いてこれらの研究において、直接比較を行った。
【０１６０】
図７は、ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子発現量の比較を化学発光β−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを用いて行った結果を示すグラフである。Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞（図７Ａ）およびＭＫＮ−７４細胞（図７Ｂ）への適用により、Ｃ２−４５でのトランスジーン発現が、コントロール抗体または抗体なしの場合と同等であるという結果を得た。次に、本発明者らは、ＭＫＮ−４５細胞においてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を試験した。図７Ｃに示されるように、ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、コントロール抗体または抗体なしの場合と比較して、Ｃ２−４５での遺伝子発現は有意に増大した。特に、ＶＰ１，０００に感染させたＭＫＮ−４５細胞は、ｌａｃＺ発現の２０倍の増強を示した。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体と結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３アデノウイルスベクターが、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルス仲介遺伝子発現を増強し得ることを実証した。
【０１６１】
2.4. 抗ＣＥＡ抗体と結合体化したＡｄｖ−ＦＺ３３により仲介されるＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入は、インビトロでＣＥＡ陽性細胞における５−ＦＵに対して感作する
さらに、本発明者らは、ファイバードメインにＩｇＧ結合配列を担持し、ＵＰＲＴ遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３）を使用して、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株において５−ＦＵに対する感受性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）は、ウラシルおよびホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）からの、ピリミジンヌクレオチドの前駆体であるＵＭＰの合成を触媒するピリミジン再利用酵素である。ＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入は、癌細胞耐性５−ＦＵの感受性を改善する。
【０１６２】
図８は、インビトロでＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子導入後の５−ＦＵに対する細胞株の感受性を示すＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。抗体を含まないＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３によって遺伝子導入された全ての細胞株は、５−ＦＵに対するウイルス粒子依存性の感受性増加を示した。Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞およびＭＫＮ−７４細胞への適用は、５−ＦＵ感受性を生じ、Ｃ２−４５は、コントロール抗体または抗体無しの場合と同等であった（図８ＡおよびＢ）。本発明者らは、次に、Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のＭＫＮ−４５細胞に対する効果を試験した。ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、Ｃ２−４５を有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３は、有意に、５−ＦＵに対する細胞の感受性を１００倍まで増大させた（Ｃ２−４５でＩＣ２０、０．２μＭに対して、ＩｇＧ４コントロール抗体で２０μＭ）（図８Ｃ）。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体と結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３が、ＣＥＡ陽性細胞において、５−ＦＵに対する感受性を増強させ得ることを実証した。
【０１６３】
2.5. マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いたＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較
本発明者らはまた、各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて、Ａｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を行った。手順を以下に説明する。
【０１６４】
感染の１日前（Ｄａｙ −１）に、ＭＫＮ−４５細胞株を６ウェルプレートに、１×１０５細胞／ウェルで播種した。Ｄａｙ ０において、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉ（Fukuoka Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供されたか、または市販の各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中に３μｇ／ｍｌの濃度で調節し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加した。陽性コントロールとして、ヒト型抗ＣＥＡ抗体であるＣ２−４５を使用した。Ｉｓｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、それぞれ、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ Ｐ３）、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ ｅＢＭ２ａ）、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ ｅＢＭＧ２ｂ）、およびＭｏｕｓｅ ＩｇＧ３（ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａｔ Ｎｏ ５５３４８４）を使用した。抗体を添加後、１０００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。次いで、無血清ＲＰＭＩ−１６４０にてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を１０００ＶＰ／細胞の濃度に希釈し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって感染させた。インキュベーション後、１０００μｌの無血清ＰＲＭＩ−１６４０にて２回洗浄し、さらに１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。Ｄａｙ １において、ＧＦＰ活性をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒによって測定した。
【０１６５】
図９は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒの測定結果を示すグラフである。マウス抗ＣＥＡ抗体やキメラ方抗体、でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。中でもＣ２−４５は、他のマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体と比較してＥＧＦＰ遺伝子の導入効率が高いことが示された。
【０１６６】
図９に示す結果はまた、このようにファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、ＥＧＦＰ遺伝子のようなマーカー遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を用いて、ヒトＣＥＡ抗原陽性細胞株において遺伝子導入効率の比較を行うことによって、ヒトＣＥＡ抗原に対して特異的に結合し、Ａｄｖの導入効率を改善することができる抗ＣＥＡモノクローナル抗体を同定することができることも実証する。
【０１６７】
なお、図９に結果を示す実験で使用したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、以下の通りである。
１． Ｆ３３−１０４（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG1 (k)
Affinity constant: 3.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１６８】
２． Ｆ３３−６０（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2a (k)
Affinity constant: 3.4 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１６９】
３． Ｆ８２−８１（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2b (k)
Affinity constant: 9.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１７０】
４． Ｆ１１−１２（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG3 (k)
Affinity constant: 11.2 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１７１】
５． Ｃｈ Ｆ１１−３９ （Ｌｏｔ ２）（Arakawa F. et al, Hybridoma 12: 365-379, 1993.）
Class: 同上
Affinity constant: 同上
OD=2.10 (Ab Conc.= 1.5 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 0.75 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１７２】
６． ＩＢ２ （ＩＢＬ社より購入：ｌｏｔ Ｎｏ ９Ｇ−７１７）
class: IgG2a
Ab Conc. = 1mg/ml
【０１７３】
７． Ｂ６．２／ＣＤ６６ （ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎより購入： ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ ５５１３５５）
Class： IgG1
Ab Conc. 0.5mg/ml
【０１７４】
2.6. インビボでのＣＥＡ陽性細胞における抗ＣＥＡ抗体を結合したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の選択的遺伝子移入
選択的遺伝子移入をインビボで評価するために、腹腔内播種性ＣＥＡ陽性腫瘍を有するマウスを、抗体ありまたはなしのＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の腹腔内注射で処置した。Ｘ−ｇａｌによるβ−ガラクトシダーゼの発現を染色するために、発現の強度および選択性を評価した。図１０は、マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を介したＡｄｖ−ＦＺ３３によるＥＧＦＰ遺伝子の導入比較を示す写真である。示されるように、Ｃ２−４５を有するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ＶＰ）を受けたマウスの腹腔は、播種性腫瘍においてβ−ガラクトシダーゼの発現が選択的に増強された（図１０Ｃを参照）。対照的に、コントロールＩｇＧ４を有するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ＶＰ）を受けたマウスは、β−ガラクトシダーゼの発現が弱いことが示された（図１０Ｂを参照）。
【０１７５】
これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体を結合したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３が、インビボでＣＥＡ陽性細胞において、トランスジーンの発現を選択的に増強し得ることを実証した。
【０１７６】
2.7. 抗ＣＥＡ ｍＡｂおよび５−ＦＵを結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３の治療的効果
本発明者らはまた、ＵＰＲＴ（５−ＦＵを５−フルオロウリジンモノホスフェートに直接変換する）を発現するＡｄｖ−ＦＺ３３（Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３）を抗ＣＥＡ ｍＡｂに結合させたものを用いて、播種性胃癌を有する動物においてインビボで遺伝子治療の効果を検証した。処置の手順は以下の通りである。
【０１７７】
まず、１×１０７個のＭＫＮ−４５細胞をマウスの腹腔内に注射した（ｎ＝１５）。注射の４日後に、さらに以下の条件でマウスを処置した：（ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｂ）コントロールＩｇＧ４を結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｃ）Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のみを５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｄ）ベクター無し（ｎ＝３）；および（ｅ）処置無し（ｎ＝３）。５日後〜９日後に、上記（ａ）〜（ｄ）のマウスに対して、１０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを腹腔内注射し、（ｅ）のマウスに対してＰＢＳを腹腔内注射した。１０日後に再び上記（ａ）〜（ｅ）と同じ処置を行い、１１〜１５日後に、再び１０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ（（ａ）〜（ｄ））およびＰＢＳ（（ｅ））を腹腔内注射した。１７日後にマウスを屠殺し、ＣＥＡ標的化Ａｄｖ−ＦＺ３３による治療効果の評価を行った。具体的には、各グループのマウスの重量を測定し、各動物の腫瘍塊の重量を測定し、そして腹腔における転移の数を測定した。
【０１７８】
図１１および図１２に、その結果を示す写真およびグラフをそれぞれ示す。示されるように、Ｃ２−４５を結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３は、腫瘍重量の有意な減少を示し（ｎ＝３；Ｆｉｓｈｅｒ検定：ｐ＝０．０４６）、コントロール抗体よりも優れた抗腫瘍効果を実証した。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、ＣＥＡ産生癌（特に転移癌）の標的化療法、診断等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスの感染効率を特異的に高めることから、ＣＥＡ産生癌特異的な遺伝子療法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのアデノウイルスベクターｐＡｘ３の模式図である。
【図２】Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルス作製のためのｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミドの模式図である。
【図３】本発明において使用されるＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。
【図４】Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスに抗ＣＥＡ抗体を結合させることによって、アデノウイルスをＣＥＡ発現細胞へ効果的に指向化し得ることを示す模式図である。
【図５Ａ】ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現をＦＡＣＳ分析により評価した結果を示すグラフである。ＭＫＮ−４５におけるＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの発現を示す。
【図５Ｂ】ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現をＦＡＣＳ分析により評価した結果を示すグラフである。ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞株におけるＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの発現を示す。
【図６Ａ】Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞における遺伝子導入効率を示す。
【図６Ｂ】Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。ＭＫＮ−７４における遺伝子導入効率を示す。
【図６Ｃ】Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。ＭＫＮ−４５における遺伝子導入効率を示す。
【図７】ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子発現量の比較を化学発光β−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを用いて行った結果を示すグラフである。（Ａ）Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞；（Ｂ）ＭＫＮ−７４；（Ｃ）ＭＫＮ−４５。
【図８】インビトロでＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子導入後の５−ＦＵに対する細胞株の感受性を示すＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。（Ａ）Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞；（Ｂ）ＭＫＮ−７４；（Ｃ）ＭＫＮ−４５。
【図９】各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いてＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を示すＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ測定の結果を表すグラフである。
【図１０】マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を介したＡｄｖ−ＦＺ３３によるＥＧＦＰ遺伝子の導入比較を示す写真である。（Ａ）Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のみ投与；（Ｂ）Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３＋ＩｇＧ４を投与；（Ｃ）Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３＋ｃ２−４５を投与。
【図１１】播種性胃癌を有する動物における、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子治療の効果を示す写真である。
【図１２】ＣＥＡを標的化したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３による遺伝子治療の効果を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＣＥＡ抗体を用いた標的化遺伝子治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、世界で最も一般的な、癌に関連する死の原因である。胃癌の発生率はアジアで高く、日本において、特に胃癌は、癌による死の最も一般的な原因である。現在の処置ストラテジーには、外科手術、化学療法、および放射線療法などがあるが、これらはその治療効果が限られている。したがって、これらの疾患の治療のための新たな治療態様が必要とされていることが明らかである。遺伝子治療は、この点において、進行した胃癌の治療のための合理的なアプローチを代表する。
【０００３】
しかしながら、癌遺伝子治療に対する主要な障壁の１つは、癌細胞への不十分かつ非特異的な遺伝子送達であり、これは、自殺遺伝子療法、免疫学的遺伝子療法のようないくつかの効果的ストラテジーが、遺伝子導入していない癌細胞をある程度治療し得、そして部分的にこの問題を避けることができるにもかかわらず、遺伝子導入していない腫瘍細胞からの再発のために、臨床試験において不満足な結果を導くに至っている。したがって、遺伝子治療における課題は、より良い腫瘍選択性に基づいて現在の治療態様を改善することである。
【０００４】
現在までに、アデノウイルスベクターは高力価で産生され得、そして多くの異なる細胞型に感染し得るため、遺伝子を腫瘍細胞に導入するために広範に適用されている。５型アデノウイルス（Ａｄ５）の感染は、コクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）へのアデノウイルスファイバーノブの高親和性結合、およびそれに続く細胞表面上のインテグリンαｖβ３およびαｖβ５へのペントンベース中のＲＧＤモチーフの結合によって仲介される内部移行によって仲介される。
【０００５】
しかしながら、癌遺伝子治療のためのアデノウイルスベクターの広範な適用は、ＣＡＲが正常細胞および悪性細胞の両方に発現することによる悪性細胞の特異性の欠如のために阻まれている（Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３，１９９７：非特許文献１）。すなわち、ＣＡＲ受容体は肝細胞をはじめとする多くの正常細胞でも十分に発現している。また、癌細胞ではＣＡＲの発現はさまざまであり、扁平上皮癌、悪性黒色腫、前立腺がん、一部の消化器癌などでは極めて発現が低く、通常のアデノウイルスでは十分な遺伝子導入効率が得られない。このような状況で全身にアデノウイルスを投与されると、肝毒性等の副作用が出現してしまうのが実情である。全身性疾患（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）である癌を治療するためには、原発巣のみならず、全身に転移しうる癌細胞に対し全身的な特異的な治療が必要であり、アデノウイルスによる癌遺伝子治療を飛躍させるためには、効率の良い標的化（腫瘍の標的化）が求められている。
【０００６】
近年、アデノウイルスの指向性は、Ａｄ５を代替のレセプターに再標的化するように改変されることができ、それによってウイルス感染をＣＡＲ非依存性にすることができることがわかっている。Ａｄ５カプシド改変のための最も一般的に利用される部位は、ファイバータンパク質ノブドメインである（Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ． Ｔ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８８６：１５８−１７１，１９９９：非特許文献２）。ＣＡＲ非依存性遺伝子送達のためのいくつかのストラテジーが、報告されている。例えば、抗ファイバーノブ抗体および標的化レセプターリガンドの融合タンパク質（Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１００４−１０１２，１９９７：非特許文献３）、ファイバーノブおよび腫瘍関連抗原に対する二重特異的抗体（Ｈａｉｓｍａ， Ｈ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ６： １４６９−１４７４， １９９９：非特許文献４；Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ， Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３： ８８２−８９１， ２００１：非特許文献５）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）結合ドメイン（Ｚ３３）のノブタンパク質および標的化レセプターへの挿入（Ｖｏｌｐｅｒｓ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７７： ２０９３−２１０４， ２００３：非特許文献６）である。本発明者らは、３番目のストラテジー、つまり、ブドウ球菌プロテインＡに由来する合成３３アミノ酸ＩｇＧ結合ドメイン（Ｚ３３）が、アデノウイルスファイバータンパク質に挿入されることに注目する。ファイバーは、３量体になる能力を維持しており、ＩｇＧに高親和性で結合し、ベクター粒子に組み込まれた。Ｖｏｌｐｅｒｓらは、Ｚ３３改変アデノウイルスベクターのＥＧＦＲ発現細胞への遺伝子導入効率は、ＥＧＦＲ特異的モノクローナル抗体との組み合わせによって強力にかつ用量依存的に増強されたことを報告した（非特許文献６）。
【０００７】
ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）は、高度にグリコシル化された同型／異型の細胞表面細胞内接着分子のグループに属し、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーの一部であるヒトＣＥＡ遺伝子ファミリーの原型メンバーである（Ｐａｘｔｏｎ， Ｒ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８４： ９２０−９２４， １９８７：非特許文献７）。ＣＥＡは、種々のヒト組織の癌細胞の９５％までにおいて、および正常胃腸組織および胎児の小腸の上皮細胞の表面に広範に発現されている。
【非特許文献１】Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７５：１３２０−１３２３，１９９７
【非特許文献２】Ｃｕｒｉｅｌ， Ｄ． Ｔ． Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ， ８８６：１５８−１７１，１９９９
【非特許文献３】Ｗａｔｋｉｎｓ， Ｓ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．４：１００４−１０１２，１９９７
【非特許文献４】Ｈａｉｓｍａ， Ｈ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ， ６： １４６９−１４７４， １９９９
【非特許文献５】Ｎｅｔｔｅｌｂｅｃｋ， Ｄ． Ｍ．，ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ３： ８８２−８９１， ２００１
【非特許文献６】Ｖｏｌｐｅｒｓ， Ｃ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ， ７７： ２０９３−２１０４， ２００３
【非特許文献７】Ｐａｘｔｏｎ， Ｒ． Ｊ．，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ， ８４： ９２０−９２４， １９８７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、癌の遺伝子治療は、５型アデノウイルスベクターを使用することによって限定されている。このアプローチの主要な問題は、癌細胞中でのアデノウイルスレセプターであるコクサッキーアデノウイルスレセプター（ＣＡＲ）の発現が弱いことによる遺伝子導入効率が低いこと、および／または正常細胞中でのＣＡＲの発現による副作用に関係していると考えられている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上述のような状況に鑑み、本発明者らは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）を癌細胞中での特異的分子として選択し、ＣＥＡ発現ヒト腫瘍細胞に対し、ファイバー変異型アデノウイルスベクター（Ａｄｖ−ＦＺ３３）と結合させたヒト型抗ＣＡＥモノクローナル抗体を用いて、インビトロおよびインビボの両方において標的化治療の検討を行なった。
【００１０】
その結果、本発明者らは、抗ＣＥＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３による癌細胞に対する標的化効果を実証し、本発明を完成した。
【００１１】
したがって、本発明は、以下の抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（１）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得し、
上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価し、そして
上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択すること、
によって調製される、抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（２）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（２ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも５０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（３）上記ファイバー変異型アデノウイルスが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
（４）Ｃ２−４５である、上記（１）に記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
【００１２】
本発明はまた、以下に記載する複合体を提供する。
（５）抗ＣＥＡモノクローナル抗体とＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターとの複合体。
（６）上記アデノウイルスベクターが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、上記（５）に記載の複合体。
（７）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（５）または（６）に記載の複合体。
【００１３】
本発明はまた、以下に記載する癌の治療薬を提供する。
（８）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の治療薬。
（９）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（８）に記載の癌の治療薬。
（１０）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、上記（８）または（９）に記載の癌の治療薬。
（１１）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合されている、上記（１０）に記載の癌の治療薬。
（１２）上記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、上記（１０）に記載の癌の治療薬。
（１３）上記リポソームベクターが、飽和リン脂質、不飽和リン脂質、フォスファチジルコリン（ＰＣ）、フォスファチジルセリン（ＰＳ）、フォスファチジルグリセロール（ＰＧ）、フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる群から選択されるリポソーム、または該リポソームの２種以上のいずれかの組み合わせからなるリポソームである、上記（１２）に記載の癌の治療薬
（１４）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現癌細胞を溶解またはその成長を阻害する、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１５）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する、上記（８）〜（１３）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１６）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（８）〜（１５）のいずれかに記載の癌の治療薬。
（１７）上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（１６）に記載の癌の治療薬。
【００１４】
本発明はまた、以下に記載する薬剤の標的化送達方法を提供する。
（１８）抗ＣＥＡ抗体を用いて、薬剤を標的部位へ送達することを包含する、薬剤の標的指向化方法。
（１９）上記抗ＣＥＡ抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（１８）に記載の方法。
（２０）上記薬剤が、上記抗ＣＥＡ抗体と化学的または遺伝子工学的に結合している、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２１）上記薬剤が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を含む、上記（１８）または（１９）に記載の方法。
（２２）上記治療遺伝子が、ウイルスベクターに担持されている、上記（２１）に記載の方法。
（２３）上記ウイルスベクターが、上記抗ＣＥＡ抗体が結合し得るファイバー変異型アデノウイルスである、上記（２２）に記載の方法。
（２４）上記標的部位が、ＣＥＡを特異的に発現している細胞、組織、または臓器である、上記（１８）〜（２３）のいずれかに記載の方法。
【００１５】
本発明はまた、以下に記載する抗ＣＥＡ抗体を使用する方法を提供する。
（２５）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体を用いてＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する方法。
（２６）上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体を用いて、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を溶解またはその成長を阻害する方法。
【００１６】
本発明はまた、以下に記載する抗ＣＥＡモノクローナル抗体の調製方法を提供する。
（２７）腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法であって、
ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
（２８）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞への感染が、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記腫瘍細胞に接触させること、
によって行われる上記（２７）に記載の方法。
（２８ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の代わりに、予め調製された抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いる、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（２９）上記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する上記感染効率を評価することを含み、ここで上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、上記（２７）または（２８）に記載の方法。
（３０）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３１）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３１ａ）上記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも５０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、上記（２９）に記載の方法。
（３２）上記レポーター遺伝子が、ｌａｃＺまたはＥＧＦＰである、上記（２９）〜（３１）のいずれかに記載の方法。
（３３）上記ＣＥＡ陽性腫瘍細胞が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌細胞である、上記（２７）〜（３２）のいずれかに記載の方法。
（３４）上記（２７）〜（３３）のいずれかに記載の方法によって得られる、抗ＣＥＡモノクローナル抗体。
【００１７】
本発明はまた、以下に記載する癌の診断薬を提供する。
（３５）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の診断薬。
（３６）上記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体である、上記（３５）に記載の癌の診断薬。
（３７）上記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（３５）または（３６）に記載の癌の診断薬。
（３８）上記抗ＣＥＡ抗体が、標識されている、上記（３５）〜（３７）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（３９）上記抗ＣＥＡ抗体が、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素によって標識されている、上記（３８）に記載の癌の診断薬。
（４０）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（３５）〜（３９）のいずれかに記載の癌の診断薬。
（４１）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（４０）に記載の診断薬。
【００１８】
本発明はまた、以下に記載する癌の診断方法を提供する。
（４２）被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。
（４３）被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する、上記（４２）に記載の方法。
（４４）上記生体試料と抗ＣＥＡ抗体とを接触させる工程、および
該生体試料中のＣＥＡと該抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量する工程
を包含する、上記（４２）または（４３）に記載の方法。
（４５）上記検出および／または定量する工程が、標識された抗ＣＥＡ抗体を用いて、ＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量することを包含する、上記（４２）〜（４４）のいずれかに記載の方法。
（４６）上記生体試料が、被験者由来の組織、細胞、血液、尿、リンパ液、精液、唾液、または汗である、上記（４２）〜（４５）のいずれかに記載の方法。
（４７）ウエスタンブロット法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、およびプロテインＡ免疫検定法からなる群から選択される免疫測定法に従う、上記（４３）〜（４６）のいずれかに記載の方法。
（４８）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（４２）〜（４７）に記載の方法。
（４９）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（４８）に記載の方法。
【００１９】
本発明はまた、以下のような自己抗体を用いた癌の診断方法を提供する。
（５０）ＣＥＡに対する自己抗体を癌の診断マーカーとして使用する方法。
（５１）被験者由来の生体試料中の抗ＣＥＡ自己抗体を検出および／または定量する工程を包含する、上記（５０）に記載の方法。
（５２）上記癌が、ＣＥＡ産生癌である、上記（５０）または（５１）に記載の方法。
（５３）上記ＣＥＡ産生癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、上記（５２）に記載の方法。
【００２０】
本発明はさらに、以下の抗ＣＥＡ抗体をコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有するベクター、該ベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体、抗ＣＥＡ抗体の製造方法、およびそれにより製造される抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（５４）抗ＣＥＡ抗体をコードするＤＮＡ。
（５５）抗ＣＥＡ抗体のＨ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）をコードするＤＮＡ。
（５６）上記（５４）または（５５）に記載のＤＮＡを含有するベクター。
（５７）上記（５６）に記載のベクターを宿主細胞に導入して得られる形質転換体。
（５８）上記（５７）に記載の形質転換体を適切な培地で培養する工程、および
該培養物から抗ＣＥＡ抗体を収集する工程
を包含する、抗ＣＥＡ抗体の製造方法。
（５９）上記（５８）に記載の方法により製造される、抗ＣＥＡ抗体。
（６０）Ｈ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）またはＬ鎖Ｖ領域（ＣＤＲ１〜３を含む）を含有する、上記（５９）の抗ＣＥＡ抗体。
【００２１】
本発明はまた、以下のような特徴を有する抗ＣＥＡ抗体を提供する。
（６１）特定の細胞に対するウイルスベクターによる遺伝子導入効率を高めることができる、抗ＣＥＡ抗体。
（６２）抗ＣＥＡ抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域を含むヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６３）ヒト型キメラ抗体またはヒト型ＣＤＲ移植抗体である、上記（６２）に記載のヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６４）完全にヒト型である、上記（６２）または（６３）に記載のヒト化抗ＣＥＡ抗体。
（６５）モノクローナル抗体である、上記（６１）〜（６４）に記載の抗ＣＥＡ抗体。
（６６）上記（６１）〜（６５）のいずれかに記載の抗ＣＥＡ抗体と放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤とを化学的または遺伝子工学的に結合させた誘導体。
【発明の効果】
【００２２】
本発明は、抗ＣＥＡ抗体と、ＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変したアデノウイルスベクターとの組み合わせを使用することによって、癌（特にＣＥＡ産生癌）の遺伝子治療を、遺伝子導入効率および特異性の両面において顕著に改善し得る。
【００２３】
本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、ＣＥＡ産生癌（特に転移癌）の標的化療法、診断等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスの感染効率を特異的に高めることから、ＣＥＡ産生癌特異的な遺伝子療法に有用である。
【００２４】
また、マウス抗ＣＥＡ抗体が、臨床試験で癌に対して抗癌剤として使用される場合、モノクローナル抗体の正常組織との交差反応性およびマウスモノクローナル抗体に対するヒトの免疫反応は、主要な問題である。ＣＥＡファミリーは、７つの発現された遺伝子からなる。それらのうち、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、およびＣＥＡＣＡＭ８はしばしば種々のタイプの正常組織に存在するため、非常に障害となる。本発明の完全ヒト型の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いることにより、上記免疫反応の問題は解決される。また、本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、実施例に示すように、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＥＡＣＡＭ６、またはＣＥＡＣＡＭ８のいずれとも交差反応しないため、上記の交差反応性の問題も解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明者らは、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いた癌への遺伝子導入療法において、ＣＥＡ陽性腫瘍細胞への特異的な遺伝子導入効率を高めるモノクローナル抗体を同定した。
【００２６】
本発明者らは、上記モノクローナル抗体を併用して、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスを用いたＣＥＡ陽性もしくは陰性の胃癌細胞または正常細胞への遺伝子導入を評価し、ＣＥＡ陽性胃癌細胞において特異的に遺伝子導入効率が顕著に高まることを見出した。本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、上記Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスとの組み合わせのみならず、他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子など）と組み合わせて、ＣＥＡ産生癌の標的化療法に用いることができる。
【００２７】
ＣＥＡは、正常成人組織において、円柱上皮細胞の腔側に局在し、そのため、正常ＣＥＡは、血流または組織液に直接接していない。それゆえ、腫瘍ＣＥＡは、抗ＣＥＡ抗体を用いた遺伝子治療のための魅力的な標的分子であり得る。
【００２８】
したがって、本発明は、ＣＥＡをマーカーとして利用するＣＥＡ産生癌の診断、および／またはＣＥＡを標的としたＣＥＡ産生癌の標的化療法を提供する。本発明はまた、癌特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。癌特異的ＣＥＡ抗原に特異的に結合し得る抗体を同定することにより、癌のイメージングおよび／または処置のために有用なシステムが提供される。
【００２９】
１．抗ＣＥＡ抗体
本発明は、ＣＥＡに対する抗体を提供する。
【００３０】
本明細書中、「ＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）」、「ＣＥＡタンパク質」、または「ＣＥＡ抗原」とは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにアクセッション番号Ｐ０６７３１で登録されているアミノ酸配列（配列番号１）で特定される７０２アミノ酸残基のタンパク質、ならびに上記タンパク質の断片、またはこれらの誘導体を意味する。ここで、「誘導体」とは、ＣＥＡタンパク質またはその断片のアミノ酸配列において１または複数個（例えば、数個（例、６個））のアミノ酸残基の変異、置換、欠失および／または付加を含み、実質的にＣＥＡタンパク質と同じ抗原性を有するペプチドまたはポリペプチドを意味するものとする。ここで、「実質的に」とは、ＣＥＡの発現によって特徴付けられる疾患の診断および／または治療に使用され得る程度に、抗ＣＥＡ抗体によって特異的に認識されるような特異性の程度を意味する。誘導体の典型的な例には、ＣＥＡ多型、スプライシングなどによる配列変化がある。ここで、「断片」の長さとしては、抗ＣＥＡ抗体に特異的な抗原として認識され得る長さであれば制限はないが、好ましくは６アミノ酸以上、より好ましくは８アミノ酸以上、さらに好ましくは１０アミノ酸以上である。また、これらの断片は、ＣＥＡタンパク質の任意の部分であり得るが、ＣＥＡタンパク質のエピトープに対応するか、エピトープに対応する部分を含んでいることがより好ましい。
【００３１】
本明細書中、「抗ＣＥＡ抗体」または「ＣＥＡに対する抗体」は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をいい、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の断片（本明細書中、「機能的断片」と呼ぶ）または誘導体をも含むものとする。抗体の機能的断片または誘導体には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドのような抗体の機能的断片、またはヒト化抗体（例えば、ＣＤＲ移植完全ヒト型抗体）のような誘導体などが含まれる。本発明に使用する抗体は、以下に詳述するように、動物を免疫化し、血清（ポリクローナル）または脾臓細胞を回収すること（適切な細胞との融合によるハイブリドーマの作製のため）を含む、従来の方法により作製することができる。
【００３２】
本明細書中、抗体があるタンパク質またはその断片に「特異的に結合する」とは、その抗体が他のアミノ酸配列に対するその親和性よりも、これらのタンパク質またはその断片の特定のアミノ酸配列に対して実質的に高い親和性で結合することを意味する。ここで、「実質的に高い親和性」とは、所望の測定装置によって、その特定のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列から区別して検出することが可能な程度に高い親和性を意味し、典型的には、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１、さらにより好ましくは、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、１０１２Ｍ−１またはそれより高い、例えば、最高で１０１３Ｍ−１またはそれより高いものであるような結合親和性を意味する。
【００３３】
本発明の抗ＣＥＡ抗体は、マウス抗ＣＥＡ抗体などのヒト以外の哺乳動物の抗体であってもよいが、ヒト化抗体であることがヒトへの適用には抗原性が低く副作用が少ないため好ましく、完全ヒト型抗体であることが最も好ましい。また、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得るが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
【００３４】
以下、本発明の抗ＣＥＡ抗体の作製において利用し得る、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片等の一般的な作製方法について説明する。
【００３５】
（モノクロナール抗体の作製方法）
モノクローナル抗体産生細胞の作製
ＣＥＡに対するモノクローナル抗体は、以下のようにして作製することができる。ＣＥＡを、哺乳動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与する。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は通常２〜６週毎に１回ずつ、計２〜１０回程度行なわれる。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウスおよびラットが好ましく用いられる。
【００３６】
モノクローナル抗体産生細胞の作製に際しては、抗原を免疫された温血動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の２〜５日後に脾臓またはリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。抗血清中の抗体価の測定は、例えば、後記の標識化タンパク質と抗血清とを反応させたのち、抗体に結合した標識剤の活性を測定することにより行うことができる。融合操作は既知の方法、例えば、コーラーとミルスタインの方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ （１９７５） Ｎａｔｕｒｅ ２５６： ４９５）に従い実施することができる。融合促進剤としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）やセンダイウイルスなどが挙げられるが、好ましくはＰＥＧが用いられる。骨髄腫細胞としては、例えば、ＮＳ−１、Ｐ３Ｕ１、ＳＰ２／０などが挙げられるが、Ｐ３Ｕ１が好ましく用いられる。用いられる抗体産生細胞（脾臓細胞）数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は１：１〜２０：１程度であり、ＰＥＧ（好ましくは、ＰＥＧ１０００〜ＰＥＧ６０００）が１０〜８０％程度の濃度で添加され、約２０〜４０℃、好ましくは約３０〜３７℃で約１〜１０分間インキュベートすることにより効率よく細胞融合を実施できる。
【００３７】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用し得るが、例えば、タンパク質の抗原を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例えば、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に、放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）またはプロテインＡを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したタンパク質を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。モノクローナル抗体の選別は、公知あるいはそれに準じる方法に従って行うことができるが、通常はＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）を添加した動物細胞用培地などで行うことができる。選別および育種用培地としては、ハイブリドーマが生育できるものならばどのような培地を用いても良い。例えば、１〜２０％、好ましくは１０〜２０％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ １６４０培地、１〜１０％のウシ胎仔血清を含むＧＩＴ培地（和光純薬工業（株））またはハイブリドーマ培養用無血清培地（ＳＦＭ−１０１、日水製薬（株））などを用いることができる。培養温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。培養時間は、通常５日〜３週間、好ましくは１週間〜２週間である。培養は、通常５％炭酸ガス下で行うことができる。ハイブリドーマ培養上清の抗体価は、上記の抗血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
【００３８】
モノクロナール抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例えば、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、ＤＥＡＥ）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相またはプロテインＡあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行うことができる。
【００３９】
（ポリクローナル抗体の作製方法）
ＣＥＡに対するポリクローナル抗体は、公知あるいはそれに準じる方法にしたがって製造することができる。例えば、免疫抗原（タンパク質の抗原）と担体タンパク質との複合体をつくり、上記のモノクローナル抗体の製造法と同様に哺乳動物に免疫を行い、該免疫動物から本発明のタンパク質に対する抗体含有物を採取して、抗体の分離精製を行うことにより製造できる。哺乳動物を免疫するために用いられる免疫抗原と担体タンパク質との複合体に関して、担体タンパク質の種類および担体とハプテンとの混合比は、担体に架橋させて免疫したハプテンに対して抗体が効率良くできれば、任意のものを任意の比率で架橋させてもよいが、例えば、ウシ血清アルブミン、ウシサイログロブリン、キーホール・リンペット・ヘモシアニン等を重量比でハプテン１に対し、約０．１〜２０、好ましくは約１〜５の割合でカプリングさせる方法が用いられる。また、ハプテンと担体のカプリングには、種々の縮合剤を用いることができるが、グルタールアルデヒドやカルボジイミド、マレイミド活性エステル、チオール基、ジチオビリジル基を含有する活性エステル試薬等が用いられる。縮合生成物は、温血動物に対して、抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。投与は、通常約２〜６週毎に１回ずつ、計約３〜１０回程度行うことができる。ポリクローナル抗体は、上記の方法で免疫された哺乳動物の血液、腹水など、好ましくは血液から採取することができる。抗血清中のポリクローナル抗体価の測定は、上記の血清中の抗体価の測定と同様にして測定できる。ポリクローナル抗体の分離精製は、上記のモノクローナル抗体の分離精製と同様の免疫グロブリンの分離精製法に従って行うことができる。
【００４０】
（抗体断片または誘導体の製造方法）
Ｆａｂは、ＩｇＧをタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２２４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体がジスルフィド結合で結合した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素パパインで処理して得ることができる。
【００４１】
Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧをタンパク質ペプシンで処理して得られる断片のうち（Ｈ鎖の２３４番目のアミノ酸残基で切断される）、Ｆａｂがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約１０万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得ることができる。
【００４２】
Ｆａｂ’は、上記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した分子量約５万の抗原結合活性を有する抗体断片である。本発明のＦａｂ’は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体を還元剤ジチオスレイトール処理して得ることができる。
【００４３】
上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’はまた、全長抗ＣＥＡ抗体のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）、またはＦａｂ’断片をコードするＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、このベクターを原核生物もしくは真核生物に導入して発現することによっても製造することができる（例えば、Ｃｏ Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１５２，２９６８−２９７６； Ｂｅｔｔｅｒ Ｍ．＆ Ｈｏｒｗｉｔｚ Ａ．Ｈ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４７６−４９６； Ｐｌｕｅｃｋｔｈｕｎ，Ａ．＆ Ｓｋｅｒｒａ Ａ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８９）１７８，４９７−５１５； Ｌａｍｏｙｉ Ｅ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６５２−６６３； Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ Ｊ．ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９８６）１２１，６６３−６６９； Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，ＴＩＢＴＥＣＨ（１９９１）９，１３２−１３７等を参照）。
【００４４】
一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖと略すこともある）は、一本の重鎖可変領域（ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＨと略す）と一本の軽鎖可変領域（ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＶＬと略す）とを適当なペプチドリンカー（以下、Ｐと略す）を用いて連結した、ＶＨ−Ｐ−ＶＬまたはＶＬ−Ｐ−ＶＨポリペプチドを示す（例えば、Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９−５８８３を参照）。本発明の一本鎖抗体は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、一本鎖抗体をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入して発現させることにより、製造することができる。
【００４５】
ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（以下、ｄｓＦｖとも略すこともある）は、ＶＨおよびＶＬ中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドをシステイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基はＲｅｉｔｅｒらにより示された方法（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ７，６９７ （１９９４））に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。本発明で使用されるジスルフィド安定化Ｖ領域断片に含まれるＶＨおよびＶＬは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体のいずれをも用いることができる。
【００４６】
本発明のジスルフィド安定化Ｖ領域断片は、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片をコードするＤＮＡを構築し、これを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入して発現させることにより製造することができる。相補性決定領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｒｅｇｉｏｎ：以下、ＣＤＲと略す）を含むペプチドは、Ｈ鎖またはＬ鎖ＣＤＲの少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のＣＤＲは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【００４７】
本発明のＣＤＲを含むペプチドは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを取得した後、ＣＤＲをコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物用発現ベクターもしくは真核生物用発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物もしくは真核生物へ導入して発現させることにより、製造することができる。また、ＣＤＲを含むペプチドは、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
（ヒト化抗体）
【００４８】
ヒト以外の動物の抗体を、遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト型ＣＤＲ移植抗体、または完全ヒト型抗体などとしたヒト化抗体もまた、本発明において有利に使用することができる。ヒト型キメラ抗体とは、抗体の可変領域（以下、Ｖ領域と表記する）がヒト以外の動物の抗体で、定常領域（以下、Ｃ領域と表記する）がヒト抗体である抗体であり（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ Ｓ．Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．８１（２１），６８５１−６８５５，１９８４）、ヒト型ＣＤＲ移植抗体とは、ヒト以外の動物の抗体のＶ領域中のＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体の適切な位置に移植した抗体である（Ｊｏｎｅｓ Ｐ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ，３２１（６０６９），５２２−５２５，１９８６）。また、完全ヒト型抗体とは、マウスのようなヒト以外の動物で作成した抗体を遺伝子組換え技術によりヒト化部分を１００％含むようにした抗体である。ヒト化抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ、副作用が少なく、その治療効果が長期間持続する。また、ヒト化抗体は、遺伝子組換え技術を利用して様々な形態の分子として作製することができる。例えば、ヒト抗体の重鎖（以下、Ｈ鎖）Ｃ領域としてγ１サブクラスを使用すれば、血中で安定で、かつ抗体依存性細胞障害活性などのエフェクター活性の高いヒト化抗体を作製することができる（Ｃｏ Ｍ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６（５），１１１８−１１２５，１９９６）。エフェクター活性の高いヒト化抗体は、癌などの標的の破壊が望まれる場合に有用である。一方、単に標的を中和する作用のみが必要とされる場合や、エフェクター活性による標的の破壊による副作用が懸念される場合には、ヒト抗体のＨ鎖Ｃ領域としてγ４サブクラスを使用すれば、γ４サブクラスは一般的にエフェクター活性が低いため（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６６（５），１３５１−１３６１，１９８７； Ｂｉｎｄｏｎ Ｃ．Ｉ． ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１６８（１），１２７−１４２，１９８８）、副作用を回避でき、しかもマウス抗体に比べ血中半減期の延長が期待される（Ｓｔｅｐｈｅｎｓ Ｓ． ｅｔ ａｌ．， Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ８５（４），６６８−６７４，１９９５）。さらに、蛋白質工学、遺伝子工学的手法を用いてヒト化抗体を含めた抗体から作製したＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ （Ｂｉｒｄ Ｒ．Ｅ． ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２４２（４８７７），４２３−４２６，１９８８）、ｄｓＦｖ（Ｗｅｂｂｅｒ Ｋ．Ｏ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３２（４），２４９−２５８，１９９５）、ＣＤＲを含むペプチド（Ｍｏｎｆａｒｄｉｎｉ Ｃ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２７１（６），２９６６−２９７１，１９９６）などのより分子量の小さい抗体断片を使用することもできる。これらの抗体断片は、完全な抗体分子に比べ分子量が小さいために、標的組織への移行性に優れており、有利である（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５２，３４０２−３４０８，１９９２）。
【００４９】
本発明のＣＥＡに特異的に結合する抗体（例えば、ヒト化抗体、ヒト抗体およびそれらの抗体断片）に、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させた抗体は、ＣＥＡに特異的に反応する抗体および抗体断片のＨ鎖或いはＬ鎖のＮ末端側或いはＣ末端側、該抗体および抗体断片中の適当な置換基あるいは側鎖、さらには該抗体および抗体断片中の糖鎖に放射性同位元素、治療タンパク質あるいは低分子の薬剤などを化学的あるいは遺伝子工学的に結合させることにより製造することができる（例えば、抗体工学入門、金光修著、地人書館、１９９４を参照）。
【００５０】
２．診断薬および治療薬
本発明はまた、別の態様において、抗ＣＥＡ抗体を含有する癌の診断薬および治療薬を提供する。なお、本願明細書中、用語「癌」と「腫瘍」とは同じ意味を有する用語として使用される。
【００５１】
本明細書の実施例において具体的に記載するように、本発明の抗ＣＥＡ抗体を含有する治療薬または診断薬は、ＣＥＡを発現または高発現することによって特徴づけられる任意の疾患（例えば、胃癌など）の診断または治療に適している。
【００５２】
癌の診断または治療に使用するための本発明の抗ＣＥＡ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、必要に応じて、モニタリング等のための標識物質（例えば、放射性同位元素、蛍光物質など）で標識されていてもよい。
【００５３】
また、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、本発明の診断薬または治療薬において、それ自体が、抗原の活性を減弱させるような中和活性を有する薬剤（ａｇｅｎｔ）であり得るが、必要に応じて、治療効果を奏するための他の薬剤（例えば、放射性同位元素、治療タンパク質、または低分子の薬剤など、あるいは標的への遺伝子導入のためのウイルスベクターもしくは非ウイルスベクター）と化学的または遺伝子工学的に結合され得る。ここで、「化学的な結合」には、イオン結合、水素結合、共有結合、分子間力による結合、疎水性相互作用による結合などが含まれるものとし、「遺伝子工学的な結合」には、例えば、抗体と治療タンパク質とからなる融合タンパク質を遺伝子組換えなどの技術を用いて作製した場合の、抗体と治療タンパク質との間の結合様式などが含まれるものとする。
【００５４】
ｉｎ ｖｉｖｏでの診断に使用するための抗体調製物の調製および使用方法は当該分野でよく知られている。例えば、インジウム−１１１で標識した抗体とキレート剤との結合体（抗体−キレート剤）が、癌胎児性抗原を発現している腫瘍のラジオイムノシンチグラフィーによるイメージングでの使用に関して記述されている（Ｓｕｍｅｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌ． Ｍｅｄ． Ｂｉｏｌ． １９９０ １７：２４７−２５４）。特にこれらの抗体−キレート剤は、再発性の結腸直腸癌を有する疑いのある患者において腫瘍を検出するのに用いられている（Ｇｒｉｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃ． １９９１ ９：６３１−６４０）。磁気共鳴イメージングで用いる標識としての常磁性イオンを有する抗体もまた記載されている（Ｌａｕｆｆｅｒ， Ｒ．Ｂ． Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９９１ ２２：３３９−３４２）。
【００５５】
ＣＥＡに対する抗体も同様に用いることができる。すなわち、ＣＥＡに特異的に結合する標識された抗体を、例えば、癌を有する疑いのある患者に、その患者の疾患の状態の診断または病期診断等の目的で注射することができる。用いる標識は、用いるイメージングの様式に応じて選択し得る。例えば、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）またはヨウ素−１３１（１３１Ｉ）などの放射性標識は、平面スキャンまたはシングルフォトン断層撮影に用いることができる。フッ素−１８（１８Ｆ）などのポジトロン放出標識をポジトロン断層撮影に用いることができる。ガドリニウム（ＩＩＩ）またはマンガン（ＩＩ）などの常磁性イオンを磁気共鳴イメージングに用いることができる。標識の局在性を検査することにより、癌の播種の判定をすることができる。また、器官または組織内の標識の量により、その器官または組織における癌の存在または欠如を決定することができる。
【００５６】
したがって、好ましくは、本発明の診断薬または治療薬中の抗ＣＥＡ抗体は、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、または治療遺伝子を担持したウイルスベクター等と化学的にまたは遺伝子工学的に結合されている。
【００５７】
「放射性同位元素」の例としては、フッ素−１８、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、およびヨウ素−１３１などの放射性ハロゲン元素が挙げられる。これらの放射性ハロゲン元素も上述の放射性金属元素と同様に抗体やペプチドに標識して、放射性診断薬あるいは放射性治療薬として広く利用し得る。例えば、１２５Ｉまたは１３１Ｉでのヨード化は、クロラミンＴ法等の公知の方法により、抗体または抗体断片に結合させることができる。
【００５８】
さらに、診断用としてはテクネチウム−９９ｍ、インジウム−１１１およびガリウム−６７（６７Ｇａ）など、また治療用としてはイットリウム−９０（９０Ｙ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）またはレニウム−１８８（１８８Ｒｅ）などが使用され得る。放射性同位元素を用いて抗体に標識する場合には、通常、金属キレート剤が用いられる。金属キレート剤としては、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ジアミノジチオ化合物、サイクラム、およびＤＯＴＡなどが知られている。これらのキレート剤は抗体に予め結合しておき、その後放射性金属で標識する場合と、放射性金属キレートを形成後、抗体に結合して標識する方法がある。
【００５９】
「治療タンパク質」の例としては、免疫を担う細胞を活性化するサイトカインが好適であり、例えば、ヒトインターロイキン２、ヒト顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子、ヒトマクロファージコロニー刺激因子、ヒトインターロイキン１２等が挙げられる。また、癌細胞を直接殺傷するため、リシンやジフテリア毒素などの毒素を用いることができる。例えば、治療タンパク質との融合抗体については、抗体または抗体断片をコードするｃＤＮＡに治療タンパク質をコードするｃＤＮＡを連結させ、融合抗体をコードするＤＮＡを構築し、このＤＮＡを原核生物または真核生物用の発現ベクターに挿入し、この発現ベクターを原核生物または真核生物へ導入することにより発現させ、融合抗体を製造することができる。
【００６０】
「低分子の薬剤」は、本明細書中で「放射性同位元素」や「治療タンパク質」等以外の診断または治療用化合物を意味するものとして用いられる。「低分子の薬剤」の例としては、ナイトロジェン・マスタード、サイクロファスファミドなどのアルキル化剤、５−フルオロウラシル、メソトレキセートなどの代謝拮抗剤、ダウノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ，ダウノルビシン、ドキソルビシンなどの抗生物質、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンのような植物アルカロイド、タモキシフェン、デキサメタソンなどのホルモン剤等の抗癌剤（臨床腫瘍学（日本臨床腫瘍研究会編 １９９６年 癌と化学療法社））、またはハイドロコーチゾン、プレドニゾンなどのステロイド剤、アスピリン、インドメタシンなどの非ステロイド剤、金チオマレート、ペニシラミンなどの免疫調節剤、サイクロフォスファミド、アザチオプリンなどの免疫抑制剤、マレイン酸クロルフェニラミン、クレマシチンのような抗ヒスタミン剤等の抗炎症剤（炎症と抗炎症療法 昭和５７年 医歯薬出版株式会社）などがあげられる。例えば、ダウノマイシンと抗体を結合させる方法としては、グルタールアルデヒドを介してダウノマイシンと抗体のアミノ基間を結合させる方法、水溶性カルボジイミドを介してダウノマイシンのアミノ基と抗体のカルボキシル基を結合させる方法等があげられる。
【００６１】
「ウイルスベクター」の例としては、本発明の抗ＣＥＡ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクター（例えば、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルス）が使用し得る。このようなウイルスベクターには、細胞増殖関連遺伝子、アポトーシス関連遺伝子、免疫制御遺伝子等の、標的部位（例えば、癌）において、例えば、癌細胞のアポトーシスを誘導するなどの治療効果を奏する遺伝子（治療遺伝子）が組み込まれる。抗ＣＥＡ抗体に結合するウイルスベクターは、抗ＣＥＡ抗体と共に遺伝子治療を必要とする患者に投与された場合、抗ＣＥＡ抗体が認識する抗原（すなわち、ＣＥＡ）が存在する部位に指向されることができる。
【００６２】
３．組換えアデノウイルス発現システムの作製方法
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルスベクターは、当該分野で周知の分子生物学的手法によって作製することができる。例えば、一般的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９； Ａｕｓｂｅｌ． Ｆ ｅｔ ａｌ．：Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７；田村隆明編、改訂第２版 遺伝子工学実験ノート 上・下 洋土社 ２００１などを参照することができる。また、組換えアデノウイルスの作製のためには、ウイルスゲノムの両端に共有結合した末端タンパク質を保持したままのゲノム−末端タンパク質複合体（以下ＤＮＡ−ＴＰＣと略す）を用いる方法、例えば、Ｙｏｓｈｉｄａらの方法（Ｙｏｓｈｉｄａら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ９：２５０３−１５１５ （１９９８））を利用することができる。これらの手法はいずれも当業者に良く知られたものである。典型的な作製方法においては、まず、ｐＡｘＣｗ、ｐＡｘＣＡｗｔ等のコスミドカセットに目的とする遺伝子を組み込んだコスミドを作製する。一方、ウイルスからＤＮＡ−ＴＰＣを調製し、適当な制限酵素で切断しておく。次に、前述のコスミドおよび制限酵素処理したＤＮＡ−ＴＰＣを適切な宿主細胞、例えば２９３細胞にコトランスフェクションする。その後適当な条件で一定期間培養し、培養液中にウイルス粒子として放出された組換えアデノウイルス粒子を回収することができる。
【００６３】
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス粒子は、前述のように組換えアデノウイルス発現用核酸分子を適切な培養細胞にトランスフェクションし、その細胞を更に培養し、培養上清を回収することによって多量に調製することができる。必要であれば、回収したアデノウイルスを更に適切な宿主細胞で必要な回数だけ継代することによって更に大量のアデノウイルベクター粒子を調製することができる。アデノウイルスの増殖および回収のために適した細胞、トランスフェクションの条件、トランスフェクトした細胞の培養条件および培地等は当業者に良く知られたものである。例えば、通常よく使用されるＥ１Ａ、Ｅ１Ｂ領域に欠損のあるアデノウイルスを増殖させる場合には、恒常的にＥ１Ａ、Ｅ１Ｂを発現している２９３細胞等を使用すればよい。更に、必要に応じて、塩化セシウムの濃度勾配遠心法を用いて濃縮精製することもできる。濃縮することにより、１０９〜１０１１粒子／ｍｌ程度の高力価のウイルス液を得ることができる。
【００６４】
本発明において典型的に使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子は、外来遺伝子を組み込むことができ、組み込まれた外来遺伝子を効率的に標的細胞に導入することができる。本発明において使用される組換えアデノウイルス発現用核酸分子に組み込む外来遺伝子としては、直接または間接的に標的細胞に対して細胞毒性を示すような分子をコードする遺伝子、細胞増殖因子、細胞増殖抑制因子、アポトーシス制御遺伝子、癌抑制遺伝子、細胞周期調節遺伝子、免疫調節遺伝子等が挙げられる。更に、非毒性のプロドラッグと組み合わせて使用するための自殺遺伝子を組み込むことも可能である。そのような組み合わせとしては、単純ヘルペスウイルス・チミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）とガンシシクロビルの組み合わせ（ＨＳＶｔｋ／ＧＣＶ）、シトシンデアミナーゼと５−フルオロシトシンの組み合わせ（ＣＤ／５ＦＣ）、ウラシルホスホリラーゼと５−フルオロウラシルの組み合わせ（ＵＰ／５ＦＵ）、ＨＳＶｔｋとＵＰを組み合わせた系（ＵＰＴＫ／５ＦＵ＋ＧＣＶ）が挙げられる。このような外来遺伝子は、一般にはアデノウイルスゲノムのＥ１領域および／またはＥ３領域と置換され、またはこの領域に挿入される。
【００６５】
ファイバー変異型組み換えアデノウイルスの作製方法については、報告されている例を参照し得る（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． １９９８； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００２； Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ２００３など）。
【００６６】
本発明において好適に用いられるベクターの非限定的な例としては、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたＺ３３ファイバー変異型アデノウイルス、アデノウイルスに抗体を任意の方法で結合（共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のアデノウイルスなどが挙げられる。Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスは、図３に模式的にその概要を示すように、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフ（ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１４））をノブ（Ｋｎｏｂ）のＨＩループ部位（ｎｇｔｑｅｔｇｌｉｋ−−−−−ｉｄａｓｄｔｔｐｓａ）に含むＦＺ３３ファイバー変異型Ａｄ５ウイルスをベースとして、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどのレポーター遺伝子が組み込まれたアデノウイルスである。なお、これは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など各種ウイルスの外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した各種変異型ウイルス、または前記各種ウイルスに抗体を任意の方法で結合（例えば、共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の抗ＣＥＡ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターもまた、抗体を任意の方法で結合（ＦＺ３３などの抗体結合分子を結合させる方法、化学的共有結合、ビオチン−アビジンによる架橋、抗体を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターとすることによって、本発明の抗ＣＥＡ抗体とともに使用し得ることを、当業者は理解し得る。
【００６７】
本発明の抗ＣＥＡ抗体に結合し得るように改変されたウイルスベクターを使用する利点として、以下のような点が挙げられる。通常、ウイルスベクターを使用する場合、そのウイルスが本来認識する細胞表面のレセプター（例えば、アデノウイルスの場合のＣＡＲ、またはシンドビスウイルスの場合の高親和性ラミニンレセプター（ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ ｌａｍｉｎｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＬＡＭＲ）、ポリオウイルスの場合のＣＤ１５５、コクサッキーウイルスＡ２１の場合のＩＣＡＭ／ＤＡＦ、麻疹ウイルスの場合のＳＬＡＭ／ＣＤ４６など）を細胞表面に発現している細胞に対して標的化される。したがって、使用するウイルスに特異的な細胞表面レセプターを発現していないか、発現の程度が低い細胞に対しては、通常、ウイルスベクターを用いた遺伝子の効果的な標的指向化導入は困難である。しかしながら、本発明の抗ＣＥＡ抗体と結合し得るかまたは結合するように改変されたウイルスベクターを用いれば、そのウイルスの本来の細胞表面レセプターを発現していない細胞であっても、その細胞がＣＥＡを発現する細胞であれば、その細胞に対してウイルスベクターを用いた治療遺伝子の標的指向化導入および発現が容易に可能となる。図４に、ファイバーノブに結合させた抗ＣＥＡ抗体を結合させることによって、アデノウイルスをＣＥＡ発現細胞へ指向化し得ることを模式的に示す。
【００６８】
なお、本発明において使用される組換えアデノウイルスの作製については、さらに下記文献を参照することができる。
【００６９】
Yoshida Y., Sadata A., Zhang W., Shinoura N. and Hamada H. “Generation of fiber-mutant recombinant adenoviruses for gene therapy of malignant glioma.”Human Gene Therapy, 9(17): 2503-2515, 1998.
【００７０】
Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Effective Gene Transfer to Human Melanomas via Integrin-Targeted Adenoviral Vectors.”Hum. Gene Ther., 13(5): 613-626, 2002.
【００７１】
Nakamura T., Sato K. and Hamada H. “Reduction of natural adenovirus tropism to the liver by both ablation of fiber-Coxsackievirus and adenovirus receptor interaction and use of replaceable short fiber.”J. Virol., 77(4): 2512-2521, 2003.
【００７２】
Uchida H, Tanaka T, Sasaki K, Kato K, Dehari H, Ito Y, Kobune M, Miyagishi M, Taira K, Tahara H, Hamada H. “Adenovirus-Mediated Transfer of siRNA against Survivin Induced Apoptosis and Attenuated Tumor Cell Growth in Vitro and in Vivo.” Mol Ther. 10(1):162-71, 2004.
【００７３】
Volpers C et al. “Antibody-mediated targeting of an adenovirus vector modified to contain a synthetic immunoglobulin G-binding domain in the capsid.” J. Virol. 77: 2093-2104, 2003.
【００７４】
Braisted AC and Wells JA “Minimizing a binding domain from protein A.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5688-5692, 1996.
【００７５】
４．薬剤の標的指向化
上記２．の説明からも明らかなように、本発明の抗ＣＥＡ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達することができる。したがって、本発明はまた、抗ＣＥＡ抗体を用いて、疾患の診断および／または治療に有用な薬剤を標的となる疾患の部位へ送達する方法を提供する。
【００７６】
「薬剤（ａｇｅｎｔ）」の例としては、既に説明した放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子などが挙げられる。
【００７７】
典型的な例として、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、抗ＣＥＡ抗体が結合し得る、治療遺伝子を組み込んだファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合される。これにより、アデノウイルス本来の受容体である（ＣＡＲ）に依存する感染のみの場合と比較して、標的細胞への感染効率を高めることができ、ファイバー変異型アデノウイルスを用いた標的部位への治療遺伝子の導入を効果的に行うことができる。
【００７８】
本発明において、「標的部位」は、ＣＥＡを発現または高発現している細胞、組織、臓器等であり、特に、ＣＥＡを高発現している腫瘍細胞である。そのような細胞の非限定的な例として、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌細胞等が本発明の目的にとって好適なものとして挙げられ得る。また、本発明において、「ＣＥＡ産生癌」とは、ＣＥＡを発現または高発現する癌（ＣＥＡ陽性の癌）のことをいうものとする。また、本明細書中、「腫瘍特異的ＣＥＡ抗原」とは、腫瘍細胞において発現しているＣＥＡをいうものとする。
【００７９】
５．本発明の抗ＣＥＡ抗体を用いるエフェクター細胞を介在する疾患の治療およびオプソニン化
本発明はまた、１つの態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＣＥＡ抗体が、被験者に投与された場合に、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を溶解または成長を阻害するように作用する、ＣＥＡの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。
【００８０】
用語「免疫学的エフェクター細胞」は、当該分野で通常用いられる意味で本明細書中でも用いられるが、特に、免疫応答の認識及び活性化段階ではなく、免疫応答のエフェクター段階に関与する免疫細胞を言うものとする。免疫学的エフェクター細胞の非限定的な例には、Ｔ細胞（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ））、ＮＫ細胞、ＮＫ様Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、クッパー細胞、ランゲルハンス細胞、多核白血球（例えば、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞）などが含まれる。例えば、本発明者の抗ＣＥＡ抗体は、免疫学的エフェクター細胞表面上のＦｃ受容体に結合することができる。エフェクター細胞は、特異的なＦｃ受容体を発現して、抗体の結合によって特異的な免疫機能を奏することができ、例えば、好中球は、抗体依存的細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。このように、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現細胞を貪食するか、または溶解させることができる。
【００８１】
本発明者はまた、さらに別の態様において、本発明の治療薬に有効成分として含まれる抗ＣＥＡ抗体が、被験者に投与された場合に、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化するように作用する、ＣＥＡの高発現によって特徴付けられる疾患（例えば、癌）の治療薬、およびそのような治療薬を被験者に投与することによる該疾患の治療方法を提供する。
【００８２】
例えば、本発明の抗ＣＥＡ抗体は、ＣＥＡに対する少なくとも１つの第１の結合特異性と、第２の標的エピトープに対する第２の結合特異性とを含む二重特異的または多重特異的分子であり得る。例えば、上記第２の標的エピトープは、例えば、ヒトＦｃγＲＩ又はヒトＦｃα受容体などのＦｃ受容体であり得る。従って、本発明には、ＦｃγＲ、ＦｃαＲ又はＦｃεＲを発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＣＥＡを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。また上記第２の標的エピトープは抗ＣＥＡ抗体の補体結合部でもあり得る。抗ＣＥＡ抗体は補体を介して補体受容体を発現しているエフェクター細胞（例えば単球、マクロファージ又は多核白血球など）と、ＣＥＡを発現している標的細胞との両方に結合し得る二重特異的または多重特異的分子が含まれる。これらの二重特異的または多重特異的分子は、ＣＥＡ発現細胞をエフェクター細胞に狙わせ、ＣＥＡ発現細胞のファゴサイトーシス、ＡＤＣＣ、サイトカイン放出、またはスーパーオキシドアニオン産生などのＦｃ受容体媒介エフェクター細胞活性を惹起することができる。
【００８３】
６．ＣＥＡを診断マーカーとして検出および／または定量する方法
本発明は、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはそれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法を提供する。
【００８４】
本明細書中、「被験者」とは、ＣＥＡを高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、癌を罹患しているか、そのような疾患を罹患していると疑われるか、またはそのような疾患を罹患する危険性のある、ヒトの被験者を意味するものとする。本発明の目的に従う代表的な「癌」の例としては、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
本明細書中、「生体試料」とは、検査のために採取された被験者由来の細胞、組織、臓器、体液などを意味する。体液には、血液、リンパ液、精液、唾液、汗等が含まれ、血液には、全血の他、血清、血漿などの血液製剤も含まれるものとする。より具体的には、生体試料は、癌細胞（または癌組織）であり得、好ましくは、ＣＥＡ陽性癌細胞である。
【００８６】
本発明はまた、１つの態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、抗ＣＥＡ抗体を用いて免疫学的に検出および／または定量する方法を提供する。
【００８７】
好ましい態様に係る本発明の方法は、（１）生体試料と抗ＣＥＡ抗体とを接触させる工程、および（２）該生体試料中のＣＥＡと該抗ＣＥＡ抗体との結合を検出および／または定量する工程を包含する。
【００８８】
このような方法は、ＣＥＡを例えば、正常細胞と比較して高発現することによって特徴づけられる疾患、代表的には、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌等を含む癌の診断のために使用することができる。通常、ＣＥＡと抗ＣＥＡ抗体との結合体のレベル（または量）に基づいて、生体試料中のＣＥＡのレベル（または量）が評価される。生体試料中のＣＥＡのレベルと正常なヒトのコントロールで測定したレベルとを比較し、その変化（または差違）に基づいて、癌の存在が診断される。通常、正常ヒトコントロールと比較して高いＣＥＡレベルは、癌の存在を示す。この場合、通常少なくとも２倍、好ましくは、５倍程度高いＣＥＡレベルが、被験者が癌を有することを示す陽性結果である。あるいは、生体試料中のＣＥＡの存在そのものが、被験者における癌の存在を示し得る。
【００８９】
ヒト由来の生体試料において、ＣＥＡのようなタンパク質の発現レベルを決定するのに用いることができるアッセイ技術は、当業者によく知られている。このようなアッセイ方法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡアッセイ）、ウエスタンブロット分析、ラジオイムノアッセイ、結合タンパク質競合アッセイ、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイ、およびプロテオミクスアプローチ（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｐｐｒｏａｃｈ）を含む。これらの中で、ＥＬＩＳＡが、生物学的液体における遺伝子の発現タンパク質の診断に好まれることが多い。
【００９０】
もし商業的に容易に入手できない場合、ＥＬＩＳＡ分析は、最初に、ＣＥＡに特異的に結合する抗体、好ましくはモノクローナル抗体の調製を含む。さらに、一般的に、ＣＥＡに特異的に結合するレポーター抗体が調製される。レポーター抗体は、放射性試薬、蛍光試薬または例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素またはアルカリホスファターゼなどの酵素試薬などの検出可能な試薬を付着している。
【００９１】
ＥＬＩＳＡを行う場合、ＣＥＡに特異的に結合する抗体は、例えば、ポリスチレンディッシュなどの、抗体を結合する固体支持体上でインキュベートされる。次に、ディッシュ上の任意の遊離タンパク質結合部位（ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｉｔｅｓ）は、ウシ血清アルブミンなどの非特異的タンパク質とインキュベートすることにより被覆される。次に、分析される試料は、ＣＥＡがポリスチレンディッシュに付着した特異抗体に結合する時間中、ディッシュ内でインキュベートされる。非結合試料はバッファーで洗い流される。ＣＥＡに対して特異的に指向し、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能な試薬を連結したレポーター抗体がディッシュ内に設置され、該レポーター抗体がＣＥＡに結合した任意のモノクローナル抗体に結合する。次に非結合レポーター抗体が洗い流される。比色基質を含むペルオキシダーゼ活性のための試薬が、次にディッシュに加えられる。抗ＣＥＡ抗体に連結した、固定化したペルオキシダーゼが着色反応産物を産生する。所定の時間内に発生した色素の量は、試料中のＣＥＡタンパク質の量に比例している。量的な結果は、通常標準曲線を参照して得られる。
【００９２】
競合アッセイもまた用いることができ、そこでは、ＣＥＡに特異的に結合する抗体が固体支持体に付着しており、標識したＣＥＡおよび患者またはヒト対照に由来する試料が固体支持体上を通過する。固体支持体に付着した検出標識量を試料中のＣＥＡの量に相関させることができる。
【００９３】
上記に例示した個々の測定法以外にも、例えば、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、蛍光免疫検定法、またはプロテインＡ免疫検定法などのいずれかの免疫学的な測定方法を本発明において用いることができる。
【００９４】
ＣＥＡを診断マーカーとして使用する意味において、ＣＥＡの核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いた核酸法（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｅｔｈｏｄ）もまた、肺癌を含む癌のマーカーとしてのＣＥＡのｍＲＮＡを検出するのに用いることができる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）および核酸配列をもとにした増幅（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＮＡＳＡＢＡ）などのその他の核酸法を、様々な悪性腫瘍を診断およびモニタリングするための悪性細胞の検出に用いることができる。例えば、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）は、特定のｍＲＮＡ集団の存在を、何千ものその他のｍＲＮＡ種の複雑な混合物の中で検出するために用いることができる強力な技術である。ＲＴ−ＰＣＲにおいては、１種類のｍＲＮＡが、酵素である逆転写酵素を用いて最初に相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写され、次にそのｃＤＮＡが標準的なＰＣＲ反応と同様に増幅される。このように、ＲＴ−ＰＣＲは、増幅により、単一種のｍＲＮＡの存在を明らかにすることができる。したがって、このｍＲＮＡがそれを産生する細胞に高度に特異的である場合、ＲＴ−ＰＣＲは、特定の種類の細胞の存在を同定するのに用いることができる。また、リアルタイムＰＣＲ法も、ＣＥＡをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を定量し、被験者と健常者との比較において、ＣＥＡをマーカーとして被験者の癌の診断を行うために使用することができる。
【００９５】
また、ＣＥＡをマーカーとして、被験者の癌の進展の経過あるいは治療経過をモニタリングすることもできる。そのような癌としては、ＣＥＡ陽性の癌であれば特に種類を問わず、ＣＥＡ陽性の胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌などの診断に好適に使用することができる。例えば、抗体とマグネチックビーズとを用いた細胞の分別と濃縮（エンリッチメント）、ならびにＲＴ−ＰＣＲ法による高感度のｍＲＮＡの検出法を組み合わせることによって、例えば、５ｍｌの被験者の血液中に存在する数個の腫瘍細胞を検出することが可能である。血液中に存在する腫瘍細胞を検出すること、そのＣＥＡの発現量またはｍＲＮＡの量を検出または測定することによって、感度および特異性の高い腫瘍の診断が可能である。このような方法については、さらに以下の参考文献を参照することができる。
【００９６】
Zieglschmid V, Hollmann C, Bocher O. “Detection of disseminated tumor cells in peripheral blood.” Crit Rev Clin Lab Sci. 2005;42(2):155-96.
【００９７】
Waguri N, Suda T, Nomoto M, Kawai H, Mita Y, Kuroiwa T, Igarashi M, Kobayashi M, Fukuhara Y, Aoyagi Y. “Sensitive and specific detection of circulating cancer cells in patients with hepatocellular carcinoma; detection of human telomerase reverse transcriptase messenger RNA after immunomagnetic separation.” Clin Cancer Res. 2003 Aug 1;9(8):3004-11.
【００９８】
Zhang YL, Feng JG, Gou JM, Zhou LX, Wang P. “Detection of CK20mRNA in peripheral blood of pancreatic cancer and its clinical significance.” World J Gastroenterol. 2005 Feb 21;11(7):1023-7.
【００９９】
Demel U, Tilz GP, Foeldes-Papp Z, Gutierrez B, Albert WH, Bocher O. “Detection of tumour cells in the peripheral blood of patients with breast cancer. Development of a new sensitive and specific immunomolecular assay.” J Exp Clin Cancer Res. 2004 Sep;23(3):465-8.
【０１００】
固体支持体上に配列（すなわち、グリッド化（ｇｒｉｄｄｉｎｇ））されたクローンまたはオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションもまた、その遺伝子の発現の検出および発現レベルの定量の両方に用いることができる。この手法では、ＣＥＡ遺伝子をコードするｃＤＮＡが基材に固定される。基材は、ガラス、ニトロセルロース、ナイロンまたはプラスチックを含むがこれらに限定されない任意の好適な種類であってもよい。ＣＥＡ遺伝子をコードするＤＮＡの少なくとも一部を基材に付着させ、次に、当該組織から単離したＲＮＡまたはＲＮＡのコピーである相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってもよい検体とインキュベートする。基材に結合したＤＮＡと検体とのハイブリダイゼーションは、検体またはハイブリッド検出用の二次分子を放射性標識または蛍光標識することを含むがこれらに限定されないいくつかの手段で検出し定量することができる。本発明において使用し得る標識の非限定的な例としては、放射性同位元素、蛍光基、発光基、フリーラジカル基、粒子、バクテリオファージ、細胞、金属、酵素、または補酵素等が挙げられる。遺伝子の発現レベルの定量は、検体からの信号の強度を、既知の標準から決定したレベルと比較することによってなされる。標準は、標的遺伝子のｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写、収量の定量化、およびこの材料を用いて標準曲線を作成することにより得ることができる。
【０１０１】
プロテオミクスアプローチでは、２次元電気泳動が当業者によく知られた技術である。すなわち、血清などの試料からの個別のタンパク質は、通常ポリアクリルアミドゲル上で、タンパク質の異なる特性による分離を連続的に行うことによって単離することができる。最初に、タンパク質は電流を用いて大きさにより分離される。電流は全てのタンパク質に均等に作用し、それにより、小さいタンパク質は大きいタンパク質よりもゲル上で早く移動する。第２次元では、第１次元に対して直角に電流をかけ、タンパク質を大きさに基づいてではなく、各タンパク質が有する特定の電荷に基づいて分離する。異なる配列の２つのタンパク質で大きさおよび電荷の両方に関して同一なものは存在しないため、２次元分離の結果は、各タンパク質が固有のスポットを占有する正方形のゲルとなる。該スポットの化学的プローブまたは抗体プローブによる分析、またはそれに引き続くタンパク質のマイクロシーケンスにより、所定のタンパク質の相対的な存在度を明らかにし、試料中のタンパク質の同定をすることができる。
【０１０２】
以上詳述した検出および／または定量方法は、組織生検材料および検死解剖材料を含む患者または被験者から得られた様々な細胞、体液および／または組織抽出物（ホモジネートまたは可溶化した組織）に由来する試料について行うことができる。本発明に有用な体液は、血液、尿、唾液または任意のその他の体分泌物またはそれらの派生物を含む。血液は、全血、血漿、血清、または任意の血液の派生物を含む。
【０１０３】
７．抗ＣＥＡ自己抗体を検出および／または定量する方法
本発明はまた、別の態様において、被験者由来の生体試料中のＣＥＡに対する自己抗体（抗ＣＥＡ自己抗体）を検出および／または定量する方法を提供する。
【０１０４】
被験者からの生体試料中の抗ＣＥＡ自己抗体の検出は、任意の多くの方法で行うことができるが、代表的な方法には、免疫アッセイがあり、例えば、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、時間分解蛍光免疫測定法（ＴＲＦＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、発光免疫測定法（ＬＩＡ）、電気化学発光免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、ラテックス凝集法、免疫沈降アッセイ、沈降素反応法、ゲル拡散沈降素反応法、免疫拡散検定法、凝集素検定法、補体結合検定法、免疫放射分析検定法、プロテインＡ免疫検定法等が挙げられる。
【０１０５】
このような免疫アッセイは、様々な方法で実施することができる。例えば、このようなアッセイを実施するための１つの方法は、ＣＥＡタンパク質の固相支持体上への繋留、およびそれに対して特異的な抗ＣＥＡ抗体の検出を包含する。本発明のアッセイに用いられるＣＥＡタンパク質は、当該分野において周知の組換えＤＮＡ技術によって調製し得る。例えば、ＣＥＡタンパク質をコードするＤＮＡを適当な発現ベクター中に遺伝子組換え技術により導入して、ＣＥＡタンパク質を大規模に発現することができる。好ましくは、ＣＥＡの標識、固定化または検出を容易にすることができる融合タンパク質が遺伝子操作される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．に記載された技術を参照）。別法として、ＣＥＡタンパク質は天然の供給源から精製することができる。例えば、当該分野において周知のタンパク質分離技術を用いて前立腺がん細胞から精製する。このような精製技術には、分子シーブクロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィーが包含されるが、これらに限定されない。実際にはＣＥＡタンパク質の固体支持体としては、マイクロタイタープレートが好都合に使用される。
【０１０６】
８．薬剤の標的指向化療法において使用し得る抗体分子を探索する方法
本明細書の実施例に、抗ＣＥＡ抗体とＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターとを用いて具体的に例示したＣＥＡ陽性、陰性または正常細胞への遺伝子導入効率の評価の方法は、ＣＥＡを標的とした標的化療法に使用し得る抗体を同定するための方法として有用である。
【０１０７】
したがって、本発明は、薬剤の標的指向化療法において使用し得る腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を同定する方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、１つの態様において、腫瘍特異的抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの作製方法を提供し、この方法は、
（１）ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、および
（３）上記感染効率が上記ハイブリドーマ由来産物（抗体など）を上記腫瘍細胞と接触させない場合と比較して増大したハイブリドーマを選択し、クローニングする工程
を包含する。
【０１０９】
本発明はまた、腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法を提供する。この調製方法は、
（１）ＣＥＡまたはＣＥＡ陽性腫瘍細胞で哺乳動物を免疫し、免疫した該哺乳動物からのリンパ球をミエローマ細胞と融合させ、ハイブリドーマのライブラリーを作製する工程、および
（２）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物（例えば、抗体など）の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと上記腫瘍細胞とを接触させることによって、上記ファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する。
【０１１０】
ここで、好ましくは、上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物の存在下での、上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞への感染は、
（Ａ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物を、上記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを上記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、上記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）上記ライブラリー由来の上記ハイブリドーマ由来産物と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、上記腫瘍細胞に接触させること、によって行われる。
【０１１１】
上記調製方法では、感染効率を評価した結果、通常、感染効率がハイブリドーマ由来産物（抗体など）を腫瘍細胞と接触させない場合と比較して、またはコントロール抗体と腫瘍細胞とを接触させた場合と比較して、増大したハイブリドーマを選択し、クローニングすることによって、目的のモノクローナル抗体を得ることができる。なお、予め抗ＣＥＡモノクローナル抗体が入手可能な場合（例えば、市販の抗ＣＥＡモノクローナル抗体を使用し得る場合）は、上記のハイブリドーマのライブラリーを作製する工程は省略し得ることは明らかである。好ましい態様では、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程は、レポーター遺伝子発現アッセイによって上記ファイバー変異型アデノウイルスの上記腫瘍細胞に対する上記感染効率を評価することを含む。ここで、上記ファイバー変異型アデノウイルスは、上記感染の際に上記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現することができるように作製されている。また、上記レポーター遺伝子発現アッセイは、例えば、分光光度計あるいはフローサイトメトリーを利用してレポーター遺伝子ＥＧＦＰの発現測定を行うことができる。ここで、上記発現効率の増大したハイブリドーマの選択においては、レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体を使用した場合と比較して、少なくとも２倍、好ましくは、少なくとも１０倍、より好ましくは、少なくとも２０倍、より好ましくは、少なくとも３０倍、より好ましくは、少なくとも４０倍、最も好ましくは、少なくとも５０倍であるモノクローナル抗体が選択される。なお、ここでいう「コントロール抗体」とは、ＩＢＬ社（ｌｏｔ Ｎｏ ９Ｇ−７１７）のようなマウス抗ＣＥＡ抗体のことをいう。
【０１１２】
また、レポーター遺伝子発現アッセイの代替的な実施方法としては、例えば、レポーター遺伝子としてｌａｃＺを使用する場合には、ｌａｃＺ遺伝子産物の発現は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーター測定キット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。また、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を使用する場合には、市販のルシフェラーゼ定量システムとして、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ Ｎｏ．Ｅ１５００）などを使用して測定し得る。
【０１１３】
上記方法において、抗体に結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスとしては、例えば、抗体のＦｃドメインに結合するプロテインＡのＺ３３モチーフをノブのＨＩループ部位に含むＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスが挙げられる。上記方法においては、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスに限らず、抗体とある程度以上のアフィニティー（例えば、結合定数（Ｋａ）が少なくとも１０７Ｍ−１、好ましくは、少なくとも１０８Ｍ−１、より好ましくは、１０９Ｍ−１以上であるような結合親和性；以下同様）をもって結合できる性質を付与したベクターであれば、その種類を問わない。例えば、アデノウイルスにＦＺ３３などの抗体結合分子もしくはペプチドを任意の方法で結合（Ｚ３３などを共有結合、Ｚ３３などをビオチン−アビジンによって架橋、Ｚ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させたＺ３３などの修飾型のアデノウイルス、などが挙げられる。また、アデノウイルスのファイバーのＣＡＲ受容体（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）との結合部位を欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｋｉｒｂｙ Ｉ ｅｔ ａｌ． Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３： ９５０８−９５１４， １９９９．； Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ９： ７６９−７７６， ２００２．； ＲｏｅｌｖｉｎｋＰＷ ｅｔ ａｌ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８６： １５６８−１５７１， １９９９．などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスのインテグリン分子群との反応性を欠いた、ペントンベースタンパク変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。また、アデノウイルスの肝臓への取り込みを欠いたファイバー変異型アデノウイルス、すなわち、Ｓｍｉｔｈ ＴＡ ｅｔ ａｌ （Ｓｍｉｔｈ ＴＡ， Ｉｄａｍａｋａｎｔｉ Ｎ， Ｒｏｌｌｅｎｃｅ ＭＬ， Ｍａｒｓｈａｌｌ−Ｎｅｆｆ Ｊ， Ｋｉｍ Ｊ， Ｍｕｌｇｒｅｗ Ｋ， Ｎｅｍｅｒｏｗ ＧＲ， Ｋａｌｅｋｏ Ｍ， Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ＳＣ． Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ５ ｆｉｂｅｒ ｓｈａｆｔ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２００３ Ｍａｙ ２０；１４（８）：７７７−８７．）などの参考文献に基づいて作られるファイバー変異型アデノウイルスをもとに、抗体とある程度以上のアフィニティーをもって結合できる性質を付与したベクターであっても良い。なお、これらは非限定的な例示であり、他のウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、シンドビスウイル、麻疹ウイルス、センダイウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、コクサッキーウイルス、アデノウイルス随伴ウイルス、など）の外被（エンベロープ）やキャプシドに修飾を施した変異型ウイルス、または上記各種ウイルスにＦＺ３３などの抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（ＦＺ３３などを共有結合、ＦＺ３３などをビオチンーアビジンによって架橋、ＦＺ３３などを化学結合させたポリエチレングリコールでウイルスを包む、など）させた修飾型のウイルスもまた、本発明の方法に使用し得る。あるいは、ウイルスベクターに限らず、リポソームベクター、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドＤＮＡネイキッド（ｎａｋｅｄ）ベクターなどの非ウイルスベクターに、抗体結合分子ないしペプチドを任意の方法で結合（抗体結合分子を化学的に共有結合させる、ビオチンーアビジンによって架橋させる、抗体結合分子を化学結合させたポリエチレングリコールでベクターを包む、など）させた修飾型の非ウイルスベクターも、本発明において有利に使用することができる。
【０１１４】
レポーター遺伝子としては、例えば、ｌａｃＺ、ＥＧＦＰなどの蛍光タンパク、ルシフェラーゼ遺伝子などが挙げられる。これらのレポーター遺伝子は、当業者に周知のレポーター遺伝子アッセイ系を用いて検出し得る。例えば、ｌａｃＺを発現するように調製されたＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスの感染効率は、市販の化学発光β−Ｇａｌレポーターキット（例えば、Ｇａｌａｃｔｏ Ｌｉｇｈｔ Ｐｌｕｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｇｅｎｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製：コード番号Ｔ１０１１）など）を使用して測定し得る。ルシフェラーゼ定量システムとしては Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ （Ｐｒｏｍｅｇａ ， Ｃａｔ ＮｏＥ１５００）などを使用して測定し得る。ＥＧＦＰなどの蛍光タンパクは、分光光度計あるいはフローサイトメトリーによって発現量を測定し得る。
【０１１５】
なお、上記した薬剤の標的指向化療法に使用するためのモノクローナル抗体の作製および精製については、さらに以下の文献を参照することができる。
【０１１６】
Hamada H. and Tsuruo T. “Functional role for the 170- to 180-kDa glycoprotein specific to drug-resistant tumor cells as revealed by monoclonal antibodies.” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83: 7785-7789, 1986.
【０１１７】
Hamada H. and Tsuruo T. “Determination of membrane antigens by a covalent crosslinking method with monoclonal antibodies.”Anal. Biochem., 160: 483-488, 1987.
【０１１８】
Hamada H., Hagiwara K., Nakajima T. and Tsuruo T. “Phosphorylation of the Mr 170,000 to 180,000 glycoprotein specific to multidrug-resistant tumor cells: Effects of verapamil, trifluoperazine, and phorbol esters.”Cancer Res., 47: 2860-2865, 1987.
【０１１９】
Hamada H. and Tsuruo T. “Purification of the 170- to 180 kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance: The 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase.”J. Biol. Chem., 263: 1454-1458, 1988.
【０１２０】
Mishell BB, Shiigi SM eds. “Selected Methods in Cellular Immunology” WH Freeman and Co., San Francisco, 1980. (邦訳 細胞免疫実験操作法、今井ら訳、理工学社、1982)
【０１２１】
Birch JR and Lennox ES eds. “Monoclonal antibodies: Principles and Applications.” Wiley-Liss, New York, 1995.
【０１２２】
Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Academic Press, London, 1983.
【０１２３】
Goding JW “Monoclonal antibodies: Principles and practice.” Third ed. Academic Press, London, 1996.
【０１２４】
上記の腫瘍特異的抗原に対する抗ＣＥＡモノクローナル抗体を同定する方法により、ＣＥＡ産生癌細胞の標的化治療に実用化可能な抗体を系統的に探索することができる。
【０１２５】
９．標的化療法における標的分子および抗体の配列決定およびクローニング
本発明の上記方法により、同定された抗体のアミノ酸配列およびそれをコードする核酸配列は、当業者に周知の配列決定法により決定することができる。
【０１２６】
アミノ酸配列決定法としては、気相シークエンサー（例えば、Ｐｒｏｃｉｓｅ ４９０ｃＬＣ ＡＢＩ社、ＨＰ２４１ ＨＰ社など）を用いるアミノ酸配列の決定方法、酵素や化学分解により切断して得られたペプチドのＨＰＬＣによる分離、ゲル電気泳動によるペプチドマップ法、質量分析装置によるＨＰＬＣで分離されたペプチドのアミノ酸配列分析等が使用され得る。核酸配列の決定方法としては、ＰＣＲを用いたサイクルシークエンス法などのような当業者に周知の核酸配列の決定法が使用され得る。
【０１２７】
得られた標的分子またはそれに対する抗体のＤＮＡの塩基配列が決定されれば、それに基づいて遺伝子工学的手法により、本発明の抗体を作製したり、他の分子との融合体を作製したりすることができる。目的とするＤＮＡは、プラスミドベクターによるクローニング法等の当業者に周知の分子生物学的手法を用いて大量に得ることができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ． ｅｔ ａｌ．：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９等を参照）。
【０１２８】
１０．製剤化および製剤の投与方法
本発明の抗体を含有する治療薬、本発明の抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、および治療遺伝子を担持したウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている治療薬は、公知の手法に基づいて製剤化することができる。
【０１２９】
本発明の治療薬の製剤化にあたっては、常法に従い、必要に応じて薬学的に許容される担体を添加することができる。例えば、界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられるが、これらに制限されず、その他常用の担体を適宜使用することができる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油６０、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を挙げることができる。
【０１３０】
本発明の治療薬の剤型の種類としては、例えば、経口剤として錠剤、粉末剤、丸剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、軟・硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、舌下剤、ペースト剤等、非経口剤として注射剤、坐剤、経皮剤、軟膏剤、硬膏剤、外用液剤等が挙げられ、当業者においては投与経路や投与対象等に応じた最適の剤型を選ぶことができる。有効成分は、製剤中０．１から９９．９重量％含有することができる。
【０１３１】
本発明の薬剤の有効成分の投与量は、投与対象、対象臓器、症状、投与方法などにより差はあるが、経口投与の場合、一般的に例えば、患者（６０ｋｇとして）に対して一日につき約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ、好ましくは約１．０〜１００ｍｇ、より好ましくは約１．０〜５０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その一回投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば、注射剤の形では通常例えば、患者（６０ｋｇに対して）、一日につき約０．０１から３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１から２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を静脈注射により投与するのが好都合である。しかしながら、最終的には、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状等を考慮して、医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。
【０１３２】
このようにして得られる製剤は、例えば、ヒトやその他の哺乳動物（例えば、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して投与することができる。ヒト以外の動物の場合も、上記の６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
【０１３３】
本発明の治療剤は、対象となる細胞、組織、臓器、または癌の種類は特定のものに限定されないが、ＣＥＡ産生癌（例えば、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、および前立腺癌）の治療に用いることができる。
【０１３４】
また、本発明において典型的に使用されるウイルスベクター粒子は、医薬組成物の成分の一つとして、抗ＣＥＡ抗体と組み合わせて、治療、特に腫瘍の治療のために使用することができる。組換えアデノウイルス粒子と抗ＣＥＡ抗体との組み合わせを治療のために使用する場合は、これら単独で使用してもよいが、一般には製薬的に許容できる担体と共に使用される。そのような担体としては、既に上記したような担体、ならびに水、生理食塩水、グルコース、ヒトアルブミン等の水性等張溶液が好ましい。更に、製薬的に通常使用される添加剤、保存剤、防腐剤、衡量等を添加することもできる。そのように調製した医薬組成物は、治療すべき疾病に依存して適切な投与形態、投与経路によって投与することができる。投与形態としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル、錠剤、顆粒剤、注射剤、軟膏等が挙げられる。本発明の抗ＣＥＡ抗体−ウイルスベクター粒子またはこれを含む医薬組成物を治療のために投与する場合は、通常成人一人当たり１回に１０３〜１０１５個のウイルス粒子を投与するのが好ましいが、疾病の状態や標的細胞・組織の性質によって変更してよい。投与回数は、１日１回〜数回でよく、投与期間は１日〜数ヶ月以上にわたってもよく、１〜数回の投入を１セットとして、長期にわたって断続的に多数セットを投与してもよい。また、本発明において使用されるウイルスベクター粒子またはウイルスベクター核酸分子は、特定の細胞および／または組織の検出、または疾病状態の診断に使用することができる。例えば、ウイルスベクターの核酸分子に検出可能なマーカー遺伝子を組込み、これを適切な宿主細胞にトランスフェクションして得られたウイルスベクター粒子は、抗ＣＥＡ抗体と組み合わせて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。あるいは、抗ＣＥＡ抗体に検出可能な標識を結合させて腫瘍細胞を検出診断するために使用することができる。
【０１３５】
以下、実施例によって本発明をより具体的に記載するが、本発明の範囲は、以下の実施例によって限定されない。
【実施例】
【０１３６】
１．材料および方法
1.1. 細胞培養
高レベルのＣＥＡを産生するヒト胃腺癌から樹立したＭＫＮ４５細胞株を、日本癌研究リサーチリソースバンク（Ｊａｐａｎｅｓｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ）（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から入手した。ＭＫＮ−７４（ＣＥＡを発現しないヒト胃癌細胞）は、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉから提供された。ヒト正常肝細胞株であるＣｈａｎ−ｌｉｖｅｒは、Ｄｒ．Ｎｉｉｔｕ（Ｆｏｒｔｈ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓａｐｐｏｒｏ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）により提供された。これらの細胞を、１０％ ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ １６４０中で、３７℃、５％ ＣＯ２で増殖させた。
【０１３７】
1.2. ｐＡｘ３プラスミド構築
Ｓａｉｔｏらによって最初に開発されたコスミドＤＮＡ ｐＡｄｅｘ１ｃｗは、アデノウイルスゲノムの最左端の３３塩基対（ｂｐ）および最右端の約２００塩基対（ｂｐ）の両方を欠失するため、本発明者らは、アデノウイルスゲノムの左端および右端の両方の全長配列を提供する組換えアデノウイルス産生のためにコスミドＤＮＡを作製することを試みた。コスミドｐＡｘ３５７−ＦＲＧＤ（単にｐＡｘ３と略記されることもある）は、以下のようにこのプロジェクトのために構築された。Ａｄ５ゲノムの左端の３５７ｂｐを、Ａｄ５ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、そしてＭｕｎＩ（ｃａａｔｔｇ）、ＰａｃＩ（ｔｔａａｔｔａａ）、およびＢａｍＨＩ（ｇｇａｔｃｄ）部位を含む５’プライマー：５’ＣＣＧＣＡＡＴＴＧＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＴＡ−３’（配列番号２）、およびＣｌａＩ（ａｔｃｇａｔ）、ＳｗａＩ（ａｔｔｔａａａｔ）、およびＢｇｌＩＩ（ａｇａｔｃｔ）部位を含む３’プライマー：５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＡＴＡＧＡＴＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＡＡＡＴＡＴＴＡＣＧＣＧＣ−３’（配列番号３）を用いてＰＣＲによって得た。得られた４０１ｂｐのＰＣＲ産物を、ＭｕｎＩおよびＣｌａＩで消化し、そしてＣｌｏｎｔｅｃｈ（Ｊａｐａｎ ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入したｐＷＥ１５コスミドのＥｃｏＲＩ（ＭｕｎＩ接着末端と互換性）およびＣｌａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＷＥ３５７ＰａｃＩを得た。Ａｄ５ゲノムの３５７ｂｐ左側末端を含有するｐＷＥ３５７ＰａｃＩ由来のＣｌａＩ／ＲｓｒＩＩフラグメント（フラグメントＡ）を、ｐＡｘ−ＦＲＧＤ由来のＡｄ５ゲノムＤＮＡの約２４ｋｂｐの中央部分を含有するＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント（フラグメントＢ）（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３（５）：６１３−２６，２００２）、およびｐＡｘＦＲＧＤ由来のＦＲＧＤファイバー変異体Ａｄ５ゲノムの右側６．７ｋｂｐを含有するＥｃｏＲＩ／ＲｅｒＩＩフラグメント（フラグメントＣ）へ、フラグメントＡ、ＢおよびＣの３部分ライゲーションによってライゲーションした。得られたコスミドＤＮＡを、ｐＡｘ３５７−ＦＲＧＤと命名した（これはまた、単にｐＡｘ３とも略記される）。
【０１３８】
図１は、本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのアデノウイルスベクターｐＡｘ３の模式図である。図１に示されるように、ｐＡｘ３プラスミドＤＮＡは、ＰａｃＩ部位を、Ａｄ５ゲノム（Ａｄ５ゲノムのヌクレオチド（ｎｔ）１〜３５７）の左側末端および右側末端の両方に含有し、続いてＢｇｌＩＩ、ＳｗａＩ、ＣｌａＩ、およびＳａｌＩ制限酵素部位を含有する。ｐＡｘ３は、ｎｔ３５８〜３３２８のＥ１ＡおよびＥ１８コード領域を欠失する。これはまた、Ｅ３をコードする１．８ｋｂｐ ＸｂａＩ−ＸｂａＩフラグメントを欠失する。それは、ＲＧＤファイバー変異をコードするＣＤＣＲＧＤＣＦＣをファイバーノブのＨＩループに含有し、Ａｄ５ゲノムの全長右側末端を含有する。ＲＧＤ変異を有するファイバーノブＨＩループのＤＮＡ配列は、以下の通りであり：ＴＧＴＧＡＣＴＧＣＣＧＣＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＴＧＣＣＣＡＡＧＴＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＧＧＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＴＣＡＴＡＣＡＴＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＡＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＡＴ（配列番号４）、ＳａｃＩＩ部位をＲＧＤリガンド（ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ）コード領域に有し、続いてＡｓｅＩ、ＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ、ＭｌｕＩ、およびＳａｌＩ制限酵素部位を有する。
【０１３９】
1.3. ＦＺ３３アデノウイルスベクター構築のためのプラスミド
ａ．プラスミドｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮ構築
ＡｄｖファイバーノブＨＩループの遺伝子工学を簡略化するために、本発明者らはまず、Ａｇｅｌ（ＡＣＣＧＧＴ）部位およびＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）部位を含有するＨＩループをコードするＤＮＡフラグメントを作製し、このフラグメントをｈｉＡＮと名付けた。ｈｉＡＮフラグメントの５’側半分は、５’プライマー＃２０９１および３’プライマー＃２０９２を使用して、プラスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ．２００２（前出））をテンプレートとして使用してＰＣＲによって合成した。ＫｐｎＩ（ｇｇｔａｃｃ）部位を有する＃２０９１の３７塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｇｇｇｇｔａｃｃａａｔａｔｃｔｇｇａａｃａｇｔｔｃａａａｇｔｇｃｔｃａｔ（配列番号５）。ＥｃｏＲＩ部位およびＡｇｅＩ（ａｃｃｇｇｔ）部位を有する＃２０９２の４７塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｇｇａａｔｔｃｇｇｃｇｃｇｃｃａｃｃｇｇｔｔｔｃｃｔｇｔｇｔａｃｃｇｔｔｔａｇｔｇｔａａｔｇ（配列番号６）。得られる３１４ｂｐのＰＣＲフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミド構築のために使用した。ｈｉＡＮフラグメントの３’側半分を、５’プライマー＃２０９３および３’プライマー＃２０６８を使用して、プラスミドｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．２００２（前出））をテンプレートとして使用して合成した。ＮｈｅＩ（ｇｃｔａｇｃ）部位を有する＃２０９３の５２塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ｃｃｇａａｔｔｃｃｇｃｔａｇｃｇａｃａｃａａｃｔｃｃａａｇｔｇｃａｔａｃｔｃｔａｔｇｔｃａｔｔｔｔｃａｔ（配列番号７）。＃２０６８の２６塩基プライマーの配列は、以下の通りである：ａｔａｔｇｇｔａｃｃｇｇｇａｇｇｔｇｇｔｇａａｔｔａ（配列番号８）。得られる９７４ｂｐのＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、１３６ｂｐのＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮプラスミド構築のために使用した。５’および３’部分を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ部位に、３部分ライゲーションによってサブクローニングし、プラスミドｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮを得た。
【０１４０】
ｂ．ｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３プラスミド構築
Ｚ３３ペプチドモチーフを有するＤＮＡフラグメントを、４８塩基の＃２０８５ ５’プライマーおよび４８塩基 ＃２０８６ ３’プライマーを用いて、８６塩基 ＃２０８７オリゴヌクレオチドテンプレートを使用してＰＣＲによって合成した。このオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである：＃２０８５、４８ｂ：ｇａａａｃｃｇｇｔｃｔｃａｔｃａａｇｔｔｔａａｃａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃ（配列番号９）、＃２０８６、４８ｂ：ｇｔｃｇｃｔａｇｃａｔｃｔａｔｇｔｃｇｔｃｇｃｇａａｔｇｃｔｃｔｔａａｔｃｔｔｇｇｃｇｔｔｇｃｇ（配列番号１０）、＃２０８７、８６ｂ：ａｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｃｇｃｃｇｃｔｔｔｔａｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃａｃｇａｃｃｃｃａａｃｃｔｇａａｃｇａｇｇａｇｃａｇｃｇｃａａｃｇｃｃａａｇａｔｔａａｇａｇｃａｔｔｃｇ（配列番号１１）。得られた１３２ｂｐのＰＣＲ産物（ＧＡＡＡＣＣＧＧＴＣＴＣＡＴＣＡＡＧＴＴＴＡＡＣＡＴＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＧＡＧＧＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＣＣＣＣＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＴＴＡＡＧＡＧＣＡＴＴＣＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＡＧＡＴＧＣＴＡＧＣＧＡＣ（配列番号１２））を、ＡｇｅＩおよびＮｈｅＩで消化し、ｐＳＫＩＩ＋ｈｉＡＮのＡｇｅＩ／ＮｈｅＩ部位に挿入し、プラスミドｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３を得た。１３２ｂｐフラグメントによってコードされるアミノ酸配列は、以下の通りである：ＥＴＧＬＩＫＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤＩＤＡＳＤ（配列番号１３）。報告されたＦＺ３３配列：ＦＮＭＱＱＱＲＲＦＹＥＡＬＨＤＰＮＬＮＥＥＱＲＮＡＫＩＫＳＩＲＤＤ（配列番号１４）には、下線を付している。さらに、下線を付したＴＧは、ＡＣＣＧＧＴ（ＡｇｅＩ部位）としてコードされ、そして下線を付したＡＳはＧＣＴＡＧＣ（ＮｈｅＩ部位）としてコードされる。
【０１４１】
ｃ．ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３プラスミド構築
Ａｄ５ファイバーのＮ末端領域（フラグメントＡ）をコードするｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２由来のＸｂａＩ／ＢｓｔＸＩフラグメント、Ａｄ５ゲノムの右側末端を含有するｐＷＥ６．７Ｒ−Ｆ／ｗｔ−２由来のＢａｍＨＩ／ＸｂａＩフラグメント（フラグメントＢ）、およびＺ３３モチーフをコードするｐＳＫＩＩ＋Ｚ３３由来のＢｓｔＸＩ／ＢａｍＨＩフラグメント（フラグメントＣ）を、３部分ライゲーションによってライゲーションし、ｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３を得た。
【０１４２】
ｄ．ｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミド構築
Ａｄ５ゲノムの左側末端３５７ｂｐを含有するｐＡｘ３由来のＲｓｒＩＩ／ＣｌａＩフラグメント（３９５６ｂｐ）、Ａｄ５ゲノムの中央の２４ｋｂｐを含有するｐＡｘ３由来のＣｌａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメント、およびｐＷＥ６．７Ｒ−ＦＺ３３由来のＥｃｏＲＩ／ＲｓｒＩＩフラグメントを、３部分ライゲーションによってライゲーションして、ｐＡｘ３−ＦＺ３３を得た。図２は、ｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミドの模式図である。
【０１４３】
ｅ．ｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３プラスミド構築
ＥＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするＤＮＡフラグメントを、ＮｏｔＩ消化およびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼによる平滑末端化、およびその後のＥｃｏＲＩでの消化によって、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から切り出した。そのフラグメントを、ｐＣＡｃｃ（Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．ＢＢＲＣ（Ｙｏｓｈｉｄａ Ｙ ａｎｄ Ｈａｍａｄａ Ｈ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２３０，４２６−４３０．１９９７）のＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ（Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって予め平滑末端化した）部位へ挿入し、ｐＣＡＥＧＦＰを得た。ｐＣＡＥＧＦＰ由来のＣｌａＩフラグメントを、ｐＡｘ３−ＦＺ３３のＣｌａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を得た。左側方向のプラスミドｐＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ（Ｌ）−ＦＺ３３（ここで、ＥＧＦＰをコードする遺伝子を駆動するプロモーターはＥ１Ａプロモーターに対して反対向きである）をアデノウイルス産生のために使用した。
【０１４４】
ｆ．ｐＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３プラスミド構築
プラスミドｐＣＡＺ３（ここで、ｌａｃＺ遺伝子は、ＣＡプロモーター（ニワトリβアクチンプロモーターを有するサイトメガロウイルスエンハンサー）によって駆動される）を作製した（Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ． ２００２（前出））。βガラクトシダーゼ発現カセット（ＣＡＺ３、５１５３ｂｐ）を、ＢａｍＨＩ／ＢｇｌＩＩ消化によって、ｐＣＡＺ３から切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、そしてｐＡｘ３−ＦＺ３３のＳｗａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３を得た。左側方向プラスミドｐＡｘ３ＣＡＺ３（Ｌ）−ＦＺ３３（ここで、ｌａｃＺ遺伝子を駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターに対して反対向きである）を、アデノウイルス産生のために使用した。
【０１４５】
ｇ．ｐＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３プラスミド構築
プラスミドｐＣＡＵＰ（大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴａｓｅ）遺伝子は、ＣＡプロモーターによって駆動される）を作製した（Ｋａｎａｉ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．）。ＵＰＲＴ遺伝子発現カセット（ＣＡＵＰ、２．８ｋｂｐ）を、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄｌＩＩ消化によってｐＣＡＵＰから切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼによって平滑末端化し、そしてｐＡｘ３−ＦＺ３３のＳｗａＩ部位にライゲーションし、コスミドｐＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を得た。左側方向のプラスミドｐＡｘ３ＣＡＵＰ（Ｌ）−ＦＺ３３（ＵＰＲＴａｓｅを駆動するプロモーターは、Ｅ１Ａプロモーターに関して反対方向に向いている）を、アデノウイルス産生のために使用した。
【０１４６】
組換えアデノウイルスの作製のために、各コスミドを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したリポフェクションによって２９３細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクトした２９３細胞から生じるプラークを単離し、そしてウイルスゲノムの制限酵素消化および発現ユニットの配列決定によって評価した。得られたアデノウイルスベクターを、２９３細胞中で拡大し、そして塩化セシウム超遠心分離によって精製した。精製したウイルスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で、１０％グリセロールとともに透析し、そして−７０℃で使用するまで保存した。ウイルス濃度（ｖｐ／ｍｌ）を決定するために、ウイルス溶液を０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中にインキュベートし、そしてＡ２６０で測定した。濃度をｖｐ／ｍｌ＝Ａ２６０×（１．１×１０１２）として規定した。使用前に、ウイルスストックへのレプリコンコンピテントウイルスの混入を、Ｅ１Ａに特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＡＴＴＡＣＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＧＣＣＧＣ−３’（配列番号１５）、リバースプライマー：５’−ＣＣＣＡＴＴＴＡＡＣＡＣＧＣＣＡＴＧＣＡ−３’（配列番号１６）、Ｅ１Ｂに特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＣＧＧＣＴＧＣＴＧＴＴＧＣＴＴＴＴＴＴＧ−３’（配列番号１７）、リバースプライマー：５’−ＧＴＡＴＣＴＴＣＡＴＣＧＣＴＡＧＡＧＣＣ−３’（配列番号１８）、およびＥ２Ｂ（陽性コントロール）に特異的なプライマー：フォワードプライマー：５’−ＴＣＧＴＴＴＣＴＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧ−３’（配列番号１９）、リバースプライマー：５’−ＣＡＴＣＴＧＡＡＣＴＣＡＡＡＧＣＧＴＧＧ−３’（配列番号２０）を使用したＰＣＲ分析によって排除した。図３は、このようにして作製したＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。
【０１４７】
1.4. 完全ヒト型ＣＥＡ抗体
本発明では、Ｃ２−４５クローン（ＩｇＧ４κ）を、完全ヒト型抗ＣＥＡモノクローナル抗体として使用した。抗ＣＥＡヒトモノクローナル抗体の調製を、以前に記載されたように行った（Ｉｍａｋｉｉｒｅ， Ｔ．，ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ， １０８： ５６４−５７０， ２００４；Ｓｈｉｂａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２４：３３５５−３３６０，２００４）。簡単に説明すると、大腸癌由来の精製したＣＥＡで免疫したＫＭマウスの脾細胞を、Ｐ３−Ｕ１マウスミエローマ細胞と融合させた。ＣＥＡ反応性クローンを選択し、プロテインＧカラムを使用して精製した。抗ＣＥＡヒトモノクローナル抗体のＣＥＡＣＡＭとの交差反応性（表１を参照）、抗体のＣＥＡ抗原との親和性（表２を参照）、および抗体に対するＣＥＡ上のエピトープを、それぞれ分析した。
【表１】
表１から明らかなように、Ｃ２−４５クローンは、正常組織にも発現しているＣＥＡファミリーであるＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ１、またはＣＥＡＣＡＭ８とは結合せず、ＣＥＡに特異的に結合することが示された。
【表２】
表２から明らかなように、Ｃ２−４５クローンは、ＣＥＡ抗原に対して高い親和性を有することが示された。
【０１４８】
1.5. ＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの細胞表面上での発現
腹水液として調製したマウス抗ヒトＣＡＲモノクローナル抗体、ＲｍｃＢは、Ｄｒ Ｊｅｆｆｒｅｙ Ｂｅｒｇｅｌｓｏｎ（ｔｈｅ Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）から提供された。抗αＶβ３ｍＡｂ ＭＡＢ１９６１、抗αｖβ５ ＭＡＢ１９７６を、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）から購入した。ヒト細胞株でのヒトＣＥＡの発現を、Ｃ２−４５によって分析した。コントロールヒトＩｇＧ４を、Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ ＬＴＤ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＫ）から購入した。コントロールマウスＩｇＧおよびＦＩＴＣを結合させた抗マウスＩｇＧを、ＳｉｇｍａおよびＤａｋｏ Ｊａｐａｎ（Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）からそれぞれ購入した。培養細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（０．５％）（Ｓｉｇｍａ）を５分間用いて回収した。脱着した細胞を遠心分離し、そして２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１０５細胞／ｍＬの濃度で含有するＰＢＳ中で再懸濁した。次いで、細胞をＲｍｃＢ、または１０μｇ／ｍＬ Ｃ２−４５または１０μｇ／ｍＬ 抗インテグリン抗体（ＭＡＢ１９６１、ＭＡＢ１９７６）とともに１時間氷上でインキュベートした。続いて、その細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ結合体化ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｄａｋｏ）とともに、３０分間氷上で暗所でインキュベートした。２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で洗浄後、その細胞を５００μＬの２％ ＢＳＡ／ＰＢＳ中で再懸濁した。分析を、ＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）で行った。
【０１４９】
1.6. インビトロでの遺伝子導入効率
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＥＧＦＰＦＺ３３に感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞の遺伝子導入効率を、ＦＡＣＳ分析によって評価した。ＥＧＦＰ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法にしたがって行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に、２×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有する無血清培地、または抗体を含まない無血清培地で、３７℃、５％ ＣＯ２で１時間処理した。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で洗浄し、次いで、細胞をＡｘ３ＣＡＥＧＦＰＦＺ３３（０〜１，０００ウイルス粒子／細胞）を含有する１ｍｌの無血清培地で３７℃、５％ＣＯ２中で１時間感染させた。インキュベーションの後、これらの細胞を、無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を、１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。抗体と結合させたまたはさせていないＡｄｖの遺伝子導入効率を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。ＧＦＰ活性をＦＡＣＳcａｌｉｂｅｒによって測定した。
【０１５０】
1.7. インビトロでのトランスジーン発現
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３で感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞のトランスジーン発現量を、化学発光レポーター遺伝子アッセイによって評価した。ＬａｃＺ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法に従って行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に１×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレート中に播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地で、３７℃、５％ ＣＯ２中で、１時間処理した。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で洗浄し、次いで細胞を、Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（０〜１，０００ウイルス粒子／細胞）を含有する１００μＬの無血清培地を用いて、３７℃、５％ ＣＯ２中で、１時間感染させた。インキュベーションの後、これらの細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を１０％ ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。抗体と結合させたかまたは結合させていないＡｄｖのトランスジーン発現を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。ＬａｃＺ活性をｂ−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）によって測定した。
【０１５１】
1.8. インビトロでの５−ＦＵの感受性
抗ヒトＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＵＰＦＺ３３に感染させたＣＥＡ陽性および陰性細胞の５−ＦＵ感受性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。大腸菌ＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入を、以下の方法に従って行った。ＭＫＮ−４５、ＭＫＮ−７４、およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞を、５×１０４細胞／ウェルで、アデノウイルスベクターでの感染の１日前に、２４ウェルプレートに播種した。細胞を、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地で、３７℃、５％ＣＯ２中で、１時間処理した。インキュベーション後、これらの細胞を、無血清培地で洗浄し、次いで、細胞を、Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を含有する２００μＬの無血清培地（０〜１００ウイルス粒子／細胞）に、３７℃、５％ＣＯ２中で、１時間感染させた。インキュベーション後、これらの細胞を無血清培地で２回洗浄し、次いで、細胞を、５ＦＵ（０〜１００μＭ）を含有する１０％ＦＢＳ ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、４日間培養した。抗体を結合させたＡｄｖまたは抗体を結合させていないＡｄｖの５−ＦＵ感受性を、ＣＥＡ陽性または陰性細胞株および正常肝細胞を感染させることによって比較した。細胞生存を、ＭＴＴアッセイによって評価した。
【０１５２】
1.9. 抗ＣＥＡ ｍＡｂと結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介させたインビボｌａｃＺ発現
インビボでの播種性胃癌における、抗ＣＥＡ ｍＡｂと結合させたＺ３３を仲介する遺伝子の遺伝子導入の能力および選択性を評価するために、メス胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）をＪａｐａｎ ＳＬＧから入手した。これらは、各実験の開始時に４週齢であった。ＰＢＳ中で再懸濁した新たに回収した１×１０７個のＭＫＮ−４５の細胞を、腹腔中へ接種した。次に、異種移植の１０日後に、３μｇ／ｍｌの抗体（Ｃ２−４５またはコントロールヒトＩｇＧ４）を含有するか、または抗体を含有しない無血清培地と結合体化させたＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ウイルス粒子／動物）を、ウイルスベクター投与の４日後にマウスの腹腔内に投与し、マウスを屠殺し、そして４％パラホルムアルデニドを１５分間全身灌流させることによって固定した。βガラクトシダーゼの発現を検出するために、腹腔をＸ−ｇａｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、１ｍｇ／ｍｌ Ｘ−ｇａｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、および４ｍＭ フェリシアン化カリウム）で４時間染色した。
【０１５３】
1.10. マウスモデルにおける腹膜播種性胃癌のための、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介する遺伝子治療
樹立された腫瘍に対する、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合したＡｄｖ−ＦＺ３３を仲介させた腫瘍特異的遺伝子治療のインビボでの効力を評価するために、全ての動物実験を札幌医科大学によって確立されたガイドラインの下に行った。雄胸腺欠損ヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕ）を、Ｊａｐａｎ ＳＬＧから購入した。ＭＫＮ ４５細胞（１×１０７細胞／マウス）の腹腔内注射を受けたマウスを、無作為に、処置計画にしたがって以下の５つのグループに分けた。（ａ）３０μｇのＣ２−４５を含有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）処置（ｎ＝３）；（ｂ）３０μｇのコントロールＩｇＧ４を含有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｃ）抗体を含まないＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｄ）ＰＢＳ、続いて５−ＦＵ（１０ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝３）；（ｅ）処置無し（ｎ＝３）。総容量３００μｌのアデノウイルスベクター（５×１０９ＶＰ）を、腫瘍移植の４日後にマウスの腹腔内に注射した。次の日から、５−ＦＵまたはＰＢＳを、毎日５日間腹腔内投与した。このプロトコルを、２コース連続的に行った。動物を腫瘍移植の１８日後に屠殺し、その後、各動物の腹腔播種性塊を回収し、重量を測定した。
【０１５４】
２．結果
2.1. ＣＥＡ陽性または陰性細胞株におけるＣＡＲおよびインテグリンの発現
本発明者らは、まず、胃癌細胞および正常肝細胞株におけるＣＥＡの発現を調べた。何人かの研究者が、ＭＫＮ−４５はＣＥＡを豊富に産生するが、ＭＫＮ−７４のＣＥＡ産生はほとんどないことを報告している（Ｐｒａｎａｙ Ｄ． ｅｔ ａｌ， Ｃａｎ． Ｒｅｓ．， ６１： ３７０-３７５，２００１； ＫＥＮＧ-ＨＳＩＮ ＬＡＮ． ｅｔ ａｌ， ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ．， １１１：１２４１−１２５１，１９９６）。
【０１５５】
図５は、ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現を示す。図５に示されるように、ＣＥＡは、ＭＫＮ−４５（ＣＥＡ陽性胃癌細胞株）において発現されるが（図５Ａ）、ＭＫＮ−７４（ＣＥＡ陰性胃癌細胞株）またはＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞株（正常肝細胞株）においては発現されない（図５Ｂ）。
【０１５６】
次に、一次のアデノウイルスレセプターであるＣＡＲ、および二次のアデノウイルスレセプターであるインテグリンαｖβ３およびαｖβ５の発現もまた、ＦＡＣＳにより分析した。その結果もまた、図５に示す。図５に示す結果は、癌細胞および正常細胞が、明らかにＣＡＲおよび両方のインテグリンを発現することを実証した。したがって、これらのデータは、ヒト細胞株におけるＣＡＲまたはインテグリンの発現が、癌遺伝子治療のための特異的な標的ではないことを示唆する。
【０１５７】
2.2. インビトロでのＣＥＡ陽性細胞に対する遺伝子導入効率の改善
本発明者らは、ファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、そしてＥＧＦＰ遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を使用して、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株における遺伝子導入効率を評価した。これらの研究において、Ｃ２−４５ウイルスコントロールＩｇＧ４との直接比較を行った。
【０１５８】
図６は、ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞およびＭＫＮ−７４細胞への適用は、Ｃ２−４５を用いた遺伝子導入効率が、コントロール抗体を用いたものと同等であるという結果をもたらした（図６ＡおよびＢ）。次いで、本発明者らは、ＭＫＮ−４５細胞上でＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を試験した。ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、顕著に、Ｃ２−４５を用いた遺伝子導入効率は、コントロール抗体と比較して有意に増大した（図６Ｃ）。特に、ＶＰ１０に感染させたＭＫＮ−４５細胞は、遺伝子移入において１５．２倍の増強を示した。他方、ＶＰ１０００に感染させたアデノウイルスベクターである、Ｃ２−４５結合体化アデノウイルスベクターは、９１％のトランスフェクションを誘導した。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体を結合させたＺ３３アデノウイルスベクターが、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスにより仲介される遺伝子導入の効率を増強することができることを実証した。
【０１５９】
2.3. インビトロでのＣＥＡ陽性細胞に対するトランスジーン発現の改善
次に、本発明者らは、ファイバードメインにＩｇＧ結合配列を担持し、ｌａｃＺ遺伝子（Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３）をコードする遺伝的に改変したＡｄｖを用いて、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株におけるトランスジーン発現を評価した。Ｃ２−４５ウイルスコントロールＩｇＧ４を用いてこれらの研究において、直接比較を行った。
【０１６０】
図７は、ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子発現量の比較を化学発光β−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを用いて行った結果を示すグラフである。Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞（図７Ａ）およびＭＫＮ−７４細胞（図７Ｂ）への適用により、Ｃ２−４５でのトランスジーン発現が、コントロール抗体または抗体なしの場合と同等であるという結果を得た。次に、本発明者らは、ＭＫＮ−４５細胞においてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を試験した。図７Ｃに示されるように、ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、コントロール抗体または抗体なしの場合と比較して、Ｃ２−４５での遺伝子発現は有意に増大した。特に、ＶＰ１，０００に感染させたＭＫＮ−４５細胞は、ｌａｃＺ発現の２０倍の増強を示した。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体と結合させたＡｄｖ−ＦＺ３３アデノウイルスベクターが、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルス仲介遺伝子発現を増強し得ることを実証した。
【０１６１】
2.4. 抗ＣＥＡ抗体と結合体化したＡｄｖ−ＦＺ３３により仲介されるＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入は、インビトロでＣＥＡ陽性細胞における５−ＦＵに対して感作する
さらに、本発明者らは、ファイバードメインにＩｇＧ結合配列を担持し、ＵＰＲＴ遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３）を使用して、ヒトＣＥＡ陽性または陰性細胞株において５−ＦＵに対する感受性を、ＭＴＴアッセイによって評価した。大腸菌ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）は、ウラシルおよびホスホリボシルピロホスフェート（ＰＲＰＰ）からの、ピリミジンヌクレオチドの前駆体であるＵＭＰの合成を触媒するピリミジン再利用酵素である。ＵＰＲＴ遺伝子の遺伝子導入は、癌細胞耐性５−ＦＵの感受性を改善する。
【０１６２】
図８は、インビトロでＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子導入後の５−ＦＵに対する細胞株の感受性を示すＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。抗体を含まないＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３によって遺伝子導入された全ての細胞株は、５−ＦＵに対するウイルス粒子依存性の感受性増加を示した。Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞およびＭＫＮ−７４細胞への適用は、５−ＦＵ感受性を生じ、Ｃ２−４５は、コントロール抗体または抗体無しの場合と同等であった（図８ＡおよびＢ）。本発明者らは、次に、Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のＭＫＮ−４５細胞に対する効果を試験した。ＣＥＡ陰性細胞とは対照的に、Ｃ２−４５を有するＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３は、有意に、５−ＦＵに対する細胞の感受性を１００倍まで増大させた（Ｃ２−４５でＩＣ２０、０．２μＭに対して、ＩｇＧ４コントロール抗体で２０μＭ）（図８Ｃ）。これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体と結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３が、ＣＥＡ陽性細胞において、５−ＦＵに対する感受性を増強させ得ることを実証した。
【０１６３】
2.5. マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いたＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較
本発明者らはまた、各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて、Ａｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を行った。手順を以下に説明する。
【０１６４】
感染の１日前（Ｄａｙ −１）に、ＭＫＮ−４５細胞株を６ウェルプレートに、１×１０５細胞／ウェルで播種した。Ｄａｙ ０において、Ｄｒ．Ｋｕｒｏｋｉ（Fukuoka Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から提供されたか、または市販の各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、無血清ＲＰＭＩ−１６４０中に３μｇ／ｍｌの濃度で調節し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加した。陽性コントロールとして、ヒト型抗ＣＥＡ抗体であるＣ２−４５を使用した。Ｉｓｔｙｐｅ ｃｏｎｔｒｏｌとして、それぞれ、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ１（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ Ｐ３）、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ａ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ ｅＢＭ２ａ）、Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ２ｂ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， ｃｌｏｎｅ ｅＢＭＧ２ｂ）、およびＭｏｕｓｅ ＩｇＧ３（ ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ， Ｃａｔ Ｎｏ ５５３４８４）を使用した。抗体を添加後、１０００μｌの無血清ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄した。次いで、無血清ＲＰＭＩ−１６４０にてＡｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３を１０００ＶＰ／細胞の濃度に希釈し、１０００μｌの容量で各種細胞に添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによって感染させた。インキュベーション後、１０００μｌの無血清ＰＲＭＩ−１６４０にて２回洗浄し、さらに１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で２４時間培養した。Ｄａｙ １において、ＧＦＰ活性をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒによって測定した。
【０１６５】
図９は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒの測定結果を示すグラフである。マウス抗ＣＥＡ抗体やキメラ方抗体、でもコントロールに比し、いずれも遺伝子導入効率を上昇させる事が出来た。中でもＣ２−４５は、他のマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体と比較してＥＧＦＰ遺伝子の導入効率が高いことが示された。
【０１６６】
図９に示す結果はまた、このようにファイバードメイン中にＩｇＧ結合配列を担持し、ＥＧＦＰ遺伝子のようなマーカー遺伝子をコードする遺伝的に改変したＡｄｖ（Ａｘ３ＣＡＥＧＦＰ−ＦＺ３３）を用いて、ヒトＣＥＡ抗原陽性細胞株において遺伝子導入効率の比較を行うことによって、ヒトＣＥＡ抗原に対して特異的に結合し、Ａｄｖの導入効率を改善することができる抗ＣＥＡモノクローナル抗体を同定することができることも実証する。
【０１６７】
なお、図９に結果を示す実験で使用したマウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、以下の通りである。
１． Ｆ３３−１０４（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG1 (k)
Affinity constant: 3.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１６８】
２． Ｆ３３−６０（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2a (k)
Affinity constant: 3.4 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１６９】
３． Ｆ８２−８１（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG2b (k)
Affinity constant: 9.5 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１７０】
４． Ｆ１１−１２（Ikeda S.et al, Mol. Immunol., 29: 229-240, 1992., Kuroki M. et al, Hybridoma, 11:391-407, 1992.）
Class: IgG3 (k)
Affinity constant: 11.2 x 10(+8)/M
OD=14.0 (Ab Conc.= 10.0 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 5.0 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１７１】
５． Ｃｈ Ｆ１１−３９ （Ｌｏｔ ２）（Arakawa F. et al, Hybridoma 12: 365-379, 1993.）
Class: 同上
Affinity constant: 同上
OD=2.10 (Ab Conc.= 1.5 mg/ml)
Vol.= 0.5 ml
Total Ab= 0.75 mg
Buffer: 0.01 M BBS, pH 8.0
【０１７２】
６． ＩＢ２ （ＩＢＬ社より購入：ｌｏｔ Ｎｏ ９Ｇ−７１７）
class: IgG2a
Ab Conc. = 1mg/ml
【０１７３】
７． Ｂ６．２／ＣＤ６６ （ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎより購入： ｃａｔａｌｏｇ Ｎｏ ５５１３５５）
Class： IgG1
Ab Conc. 0.5mg/ml
【０１７４】
2.6. インビボでのＣＥＡ陽性細胞における抗ＣＥＡ抗体を結合したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の選択的遺伝子移入
選択的遺伝子移入をインビボで評価するために、腹腔内播種性ＣＥＡ陽性腫瘍を有するマウスを、抗体ありまたはなしのＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３の腹腔内注射で処置した。Ｘ−ｇａｌによるβ−ガラクトシダーゼの発現を染色するために、発現の強度および選択性を評価した。図１０は、マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を介したＡｄｖ−ＦＺ３３によるＥＧＦＰ遺伝子の導入比較を示す写真である。示されるように、Ｃ２−４５を有するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ＶＰ）を受けたマウスの腹腔は、播種性腫瘍においてβ−ガラクトシダーゼの発現が選択的に増強された（図１０Ｃを参照）。対照的に、コントロールＩｇＧ４を有するＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３（５×１０９ＶＰ）を受けたマウスは、β−ガラクトシダーゼの発現が弱いことが示された（図１０Ｂを参照）。
【０１７５】
これらの結果は、抗ＣＥＡ抗体を結合したＡｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３が、インビボでＣＥＡ陽性細胞において、トランスジーンの発現を選択的に増強し得ることを実証した。
【０１７６】
2.7. 抗ＣＥＡ ｍＡｂおよび５−ＦＵを結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３の治療的効果
本発明者らはまた、ＵＰＲＴ（５−ＦＵを５−フルオロウリジンモノホスフェートに直接変換する）を発現するＡｄｖ−ＦＺ３３（Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３）を抗ＣＥＡ ｍＡｂに結合させたものを用いて、播種性胃癌を有する動物においてインビボで遺伝子治療の効果を検証した。処置の手順は以下の通りである。
【０１７７】
まず、１×１０７個のＭＫＮ−４５細胞をマウスの腹腔内に注射した（ｎ＝１５）。注射の４日後に、さらに以下の条件でマウスを処置した：（ａ）抗ＣＥＡモノクローナル抗体を結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｂ）コントロールＩｇＧ４を結合したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｃ）Ａｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３のみを５×１０９ＶＰで腹腔内投与（ｎ＝３）；（ｄ）ベクター無し（ｎ＝３）；および（ｅ）処置無し（ｎ＝３）。５日後〜９日後に、上記（ａ）〜（ｄ）のマウスに対して、１０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵを腹腔内注射し、（ｅ）のマウスに対してＰＢＳを腹腔内注射した。１０日後に再び上記（ａ）〜（ｅ）と同じ処置を行い、１１〜１５日後に、再び１０ｍｇ／ｋｇの５ＦＵ（（ａ）〜（ｄ））およびＰＢＳ（（ｅ））を腹腔内注射した。１７日後にマウスを屠殺し、ＣＥＡ標的化Ａｄｖ−ＦＺ３３による治療効果の評価を行った。具体的には、各グループのマウスの重量を測定し、各動物の腫瘍塊の重量を測定し、そして腹腔における転移の数を測定した。
【０１７８】
図１１および図１２に、その結果を示す写真およびグラフをそれぞれ示す。示されるように、Ｃ２−４５を結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３は、腫瘍重量の有意な減少を示し（ｎ＝３；Ｆｉｓｈｅｒ検定：ｐ＝０．０４６）、コントロール抗体よりも優れた抗腫瘍効果を実証した。
【産業上の利用可能性】
【０１７９】
本発明の抗ＣＥＡモノクローナル抗体は、ＣＥＡ産生癌（特に転移癌）の標的化療法、診断等の用途において有用である。特に、抗体のＦｃドメインに結合するように改変されたファイバー変異型アデノウイルスと共に用いた場合、ＣＥＡ陽性細胞に対するアデノウイルスの感染効率を特異的に高めることから、ＣＥＡ産生癌特異的な遺伝子療法に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】本発明において代表的な例として使用される組換えアデノウイルス作製のためのアデノウイルスベクターｐＡｘ３の模式図である。
【図２】Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルス作製のためのｐＡｘ３−ＦＺ３３プラスミドの模式図である。
【図３】本発明において使用されるＺ３３ファイバー変異型アデノウイルスのファイバー部分の構造の模式図である。
【図４】Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスに抗ＣＥＡ抗体を結合させることによって、アデノウイルスをＣＥＡ発現細胞へ効果的に指向化し得ることを示す模式図である。
【図５Ａ】ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現をＦＡＣＳ分析により評価した結果を示すグラフである。ＭＫＮ−４５におけるＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの発現を示す。
【図５Ｂ】ヒト培養細胞株におけるＣＥＡおよびアデノウイルスエントリーレセプターの発現をＦＡＣＳ分析により評価した結果を示すグラフである。ＭＫＮ−７４およびＣｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞株におけるＣＥＡ、ＣＡＲ、およびインテグリンの発現を示す。
【図６Ａ】Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞における遺伝子導入効率を示す。
【図６Ｂ】Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。ＭＫＮ−７４における遺伝子導入効率を示す。
【図６Ｃ】Ａｘ３ＥＧＦＰＦＺ３３によって感染させたＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子導入効率の比較をＦＡＣＳ ｃａｌｉｂｅｒを用いて行った結果を示すグラフである。ＭＫＮ−４５における遺伝子導入効率を示す。
【図７】ＣＥＡ抗原陽性および陰性株における遺伝子発現量の比較を化学発光β−ｇａｌレポーター遺伝子アッセイを用いて行った結果を示すグラフである。（Ａ）Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞；（Ｂ）ＭＫＮ−７４；（Ｃ）ＭＫＮ−４５。
【図８】インビトロでＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子導入後の５−ＦＵに対する細胞株の感受性を示すＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。（Ａ）Ｃｈａｎｇ−ｌｉｖｅｒ細胞；（Ｂ）ＭＫＮ−７４；（Ｃ）ＭＫＮ−４５。
【図９】各種マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いてＡｄｖ−ＦＺ３３による遺伝子導入効率の比較を示すＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒ測定の結果を表すグラフである。
【図１０】マウス抗ＣＥＡモノクローナル抗体を介したＡｄｖ−ＦＺ３３によるＥＧＦＰ遺伝子の導入比較を示す写真である。（Ａ）Ａｘ３ＣＡＺ３−ＦＺ３３のみ投与；（Ｂ）Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３＋ＩｇＧ４を投与；（Ｃ）Ａｘ３ＣＡＺ３−Ｆ３３＋ｃ２−４５を投与。
【図１１】播種性胃癌を有する動物における、抗ＣＥＡ ｍＡｂを結合させたＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３を用いた遺伝子治療の効果を示す写真である。
【図１２】ＣＥＡを標的化したＡｘ３ＣＡＵＰ−ＦＺ３３による遺伝子治療の効果を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＥＡモノクローナル抗体とＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターとの複合体。
【請求項２】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｃ２−４５である、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記アデノウイルスベクターが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の治療薬。
【請求項７】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項６に記載の癌の治療薬。
【請求項８】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項７に記載の癌の治療剤。
【請求項９】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｃ２−４５である、請求項６〜８のいずれかに記載の癌の治療剤。
【請求項１０】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、請求項６〜９のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１１】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合されている、請求項１０に記載の癌の治療薬。
【請求項１２】
前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、請求項１０に記載の癌の治療薬。
【請求項１３】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現癌細胞を溶解またはその成長を阻害する、請求項６〜１２のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１４】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する、請求項６〜１２のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１５】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項６〜１４のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１６】
腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法であって、
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得する工程、および
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下での、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞への感染が、
（Ａ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、前記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、前記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、前記腫瘍細胞に接触させること、
によって行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現アッセイによって前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する前記感染効率を評価することを含み、ここで前記ファイバー変異型アデノウイルスは、前記感染の際に前記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の診断薬。
【請求項２２】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の癌の診断薬。
【請求項２３】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項２１または２２に記載の癌の診断薬。
【請求項２４】
被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。
【請求項２５】
被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得し、
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価し、そして
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択すること、
によって調製される抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて、免疫学的に検出および／または定量する、請求項２４に記載の方法。
【請求項１】
抗ＣＥＡモノクローナル抗体とＩｇＧ結合モチーフを有する遺伝的に改変されたアデノウイルスベクターとの複合体。
【請求項２】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｃ２−４５である、請求項１〜３のいずれかに記載の複合体。
【請求項５】
前記アデノウイルスベクターが、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターである、請求項１〜４のいずれかに記載の複合体。
【請求項６】
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の治療薬。
【請求項７】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項６に記載の癌の治療薬。
【請求項８】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項７に記載の癌の治療剤。
【請求項９】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｃ２−４５である、請求項６〜８のいずれかに記載の癌の治療剤。
【請求項１０】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、放射性同位元素、治療タンパク質、低分子の薬剤、治療遺伝子を担持したウイルスベクター、および薬剤を担持した非ウイルスベクターのうちのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせと化学的または遺伝子工学的に結合されている、請求項６〜９のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１１】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、Ｚ３３ファイバー変異型アデノウイルスベクターに結合されている、請求項１０に記載の癌の治療薬。
【請求項１２】
前記非ウイルスベクターが、リポソームベクター、重合リポソーム、脂質小胞、デンドリマー、ポリエチレングリコール集合体、ポリリジン、デキストラン、ポリヒドロキシ酪酸、センダイウイルスエンベロープベクター、プラスミドベクター、およびプラスミドＤＮＡネイキッドベクターからなる群から選択される、請求項１０に記載の癌の治療薬。
【請求項１３】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、免疫学的エフェクター細胞を介在して、ＣＥＡ発現癌細胞を溶解またはその成長を阻害する、請求項６〜１２のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１４】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、ＣＥＡ発現細胞をオプソニン化する、請求項６〜１２のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１５】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項６〜１４のいずれかに記載の癌の治療薬。
【請求項１６】
腫瘍特異的ＣＥＡ抗原に対するモノクローナル抗体を調製する方法であって、
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得する工程、および
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率を評価する工程、
を包含する、方法。
【請求項１７】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下での、前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞への感染が、
（Ａ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体を、前記腫瘍細胞と接触させた後、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に接触させるか、
（Ｂ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとをあらかじめ反応させてから、前記腫瘍細胞に接触させるか、または
（Ｃ）前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体と、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスとを、同時に投与することによって、前記腫瘍細胞に接触させること、
によって行われる請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記感染効率を評価する工程が、レポーター遺伝子発現アッセイによって前記ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する前記感染効率を評価することを含み、ここで前記ファイバー変異型アデノウイルスは、前記感染の際に前記感染効率を評価するためのレポーター遺伝子を発現する、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも１０倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を含有する、癌の診断薬。
【請求項２２】
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体が、
当該抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価した場合に、
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体である、請求項２１に記載の癌の診断薬。
【請求項２３】
前記癌が、胃癌、大腸癌、肺癌、転移性肝癌、胆道癌、膵癌、食道癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項２１または２２に記載の癌の診断薬。
【請求項２４】
被験者由来の生体試料中のＣＥＡタンパク質もしくはその断片、またはこれらをコードする核酸を診断マーカーとして検出および／または定量する工程を包含する、癌の診断方法。
【請求項２５】
被験者由来の生体試料中のＣＥＡを、
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を取得し、
前記抗ＣＥＡモノクローナル抗体の存在下で、抗体に結合するように改変したファイバー変異型アデノウイルスと前記腫瘍細胞とを接触させることによって、前記ファイバー変異型アデノウイルスを前記腫瘍細胞に感染させ、該ファイバー変異型アデノウイルスの前記腫瘍細胞に対する感染効率をレポーター遺伝子発現アッセイによって評価し、そして
前記レポーター遺伝子の発現量が、コントロール抗体と比較して少なくとも２倍高くなるようなモノクローナル抗体を選択すること、
によって調製される抗ＣＥＡモノクローナル抗体を用いて、免疫学的に検出および／または定量する、請求項２４に記載の方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５Ａ】
【図５Ｂ】
【図６Ａ】
【図６Ｂ】
【図６Ｃ】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【公開番号】特開２００７−２０４９４（Ｐ２００７−２０４９４Ａ）
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−２０８８００（Ｐ２００５−２０８８００）
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５９１１９０９５５）北海道 (121)
【出願人】（５９８０１５０８４）学校法人福岡大学 (114)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１９年２月１日（２００７．２．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年７月１９日（２００５．７．１９）
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第１項適用申請有り
【出願人】（５９１１９０９５５）北海道 (121)
【出願人】（５９８０１５０８４）学校法人福岡大学 (114)
【Ｆターム（参考）】
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