接着結合を持つ細胞の増殖を刺激するＲＮＡｉ方法および組成物
ある種の細胞−細胞結合の下方調節により、接着結合を発現しかつ増殖を中止する細胞、例えば、ヒト角膜内皮細胞の増殖を刺激するための方法および組成物が本願明細書に記載される。１つの具体例において、下方調節はＲＮＡ干渉を用い、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇する剤とを接触させることにより達成される。さらに、角膜実質細胞からヒト角膜内皮細胞を単離する方法、ならびにヒト角膜内皮細胞凝集物の生存度を保存および維持する方法が本願明細書に記載される。また、単離され、所望により貯蔵され、一過性にＰ１２０の発現を下方調節する剤と接触させたヒト角膜内皮細胞および生物学的適合性担体を含む外科的移植片が記載される。本願明細書に記載された方法および組成物は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組織設計中にヒト角膜内皮細胞を拡張するのを助ける新規療法に、および角膜内皮細胞機能障害のｉｎ ｖｉｖｏ処置のために用いることができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府支援）
本発明は、国立眼研究所のＳｃｈｅｆｆｅｒ Ｃ．Ｇ．Ｔｓｅｎｇへの助成番号ＲＯ１ ＥＹ０６８１９および助成番号ＲＯ１ ＥＹ０１５７３５により、全体的および部分的に支援された。米国政府は本願発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
目の重要な屈折要素の角膜は、眼球の多層の透明性で無血管の最も外側の部分である。ヒトが良好に見るためには、角膜の全ての層は透明のままでなければならない。角膜の層上のいずれの曇りまたは不透明な領域も、光の適切な屈折に干渉するであろう。角膜を含む連続層は、眼球表面から内向きに、上皮、ボウマン層、角膜実質、デスメ膜および内皮を含む。
【０００３】
角膜後面を裏打ちし前眼房に向く単層細胞であるヒト角膜内皮は、角膜実質の水和の調節、それ故に、透明性において極めて重要な役割を演じる。ヒト角膜内皮は、角膜の透明性を維持するために必要である、非常に重要な流体抽出あるいはポンプ機能を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
健康な眼において、眼流体は、内部から角膜実質にゆっくり通過し；次いで、過剰な水は角膜内皮によって眼の角膜実質から前眼房に送り込まれる。さらに、角膜におよび角膜の外に移動する流体の割合が、調和して維持されることが非常に重要である。内皮細胞のポンプ機能が減少すれば、角膜実質は膨張し、規則的なパターンの角膜実質のコラーゲンマトリックスは過剰な水によって損なわれるであろう。この結果、角膜実質はかすみ、結局不透明になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
細胞と少なくとも１つの細胞−細胞間結合成分の発現を下方調節する剤とを接触させることを含む、接着結合（ＡＪ）を持つ細胞の増殖を刺激する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、細胞−細胞間結合成分はＡＪ蛋白質またはｐ１９０である。さらなる具体例において、ＡＪ蛋白質はカドヘリンである。まださらなる具体例において、カドヘリンは、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニン（以下、ｐ１２０と略記する）、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンから選択される。
【０００６】
１つの具体例において、ＡＪを持つ細胞は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、角化細胞、外胚葉細胞または内胚葉細胞である。さらなる具体例において、内皮細胞は、例えば、ヒト角膜内皮細胞（以下に、本願明細書ではＨＣＥＣと略記する；本願明細書に用いたＨＣＥＣは、前眼房に向く角膜後面での単層細胞である）、管周囲内皮細胞、脳微細血管内皮細胞、血管内皮細胞、内皮前駆細胞、膣上皮細胞または他のいずれかのタイプの上皮細胞である。まださらなる具体例において、上皮細胞は、例えば、網膜色素上皮細胞、筋上皮細胞、羊膜上皮細胞、泌尿器上皮細胞、乳房上皮細胞、気管支上皮細胞、卵巣上皮細胞、肺胞上皮細胞または他のいずれかのタイプの内皮細胞である。まださらなる具体例において、ＡＪを持つ細胞はＨＣＥＣである。
【０００７】
１つの具体例において、剤は、内皮細胞と一過性に接触させる。さらなる具体例において、前記成分の下方調節はＲＮＡ干渉に起因する。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉は、ｐ１２０の発現を下方調節する。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。
【０００８】
１つの具体例において、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコまたはウサギの体内のごときｉｎ ｖｉｖｏにて剤と接触させる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。さらなる具体例において、接触は哺乳動物の眼において生じる。まださらなる具体例において、哺乳動物の眼は、例えば、水疱性角膜症（無水晶体または偽水晶体の水疱性角膜症を含む）、角膜内皮細胞変性症（フックス変性症）、角膜浮腫、先天性遺伝的内皮変性症、または角膜内皮が損傷される他のいずれかの疾患のごとき、角膜内皮細胞機能障害を有する。まださらなる具体例において、剤は哺乳動物の眼の前眼房に投与される。まださらなる具体例において、剤は、眼の前眼房に直接的に投与される。
【０００９】
１つの具体例において、細胞はＨＣＥＣであって、剤は、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０および／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤である。
【００１０】
さらに、細胞と、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０および／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを接触させ；培地、例えば、成長因子および／または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含有する培地中に細胞を接種し；次いで、その細胞を培養して拡張されたＨＣＥＣを形成することを含む、培養においてＨＣＥＣを拡張する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、剤は、凝集または単層の形態におけるＨＣＥＣと一過性に接触させる。さらなる具体例において、前記成分の下方調節はＲＮＡ干渉に起因する。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉は、ｐ１２０の発現を下方調節する。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉のパルスは、少なくとも約１２時間持続する。まださらなる具体例において、ＨＣＥＣは、ＡＪが形成される凝集状態または単層である。
【００１１】
まださらなる具体例において、前記のＨＣＥＣを拡張する方法は、細胞と分裂促進成長因子とを接触させることを含む。分裂促進成長因子は、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦの他のファミリーのメンバー、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）またはインターロイキン１（ＩＬ−１）を含む。まださらなる具体例において、ＨＣＥＣの増殖が阻害でき、ＡＪ形成が細胞と細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることにより促進できるＨＣＥＣを拡張する方法。細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤の例は、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロスト、イロプロストまたは細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる他の剤を含む。１つの特定の具体例において、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤はコレラ毒素である。
【００１２】
さらに、デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ、次いで、消化後に溶液からＨＣＥＣの凝集物を分離することを含む角膜実質細胞からＨＣＥＣを単離する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＡ、コラゲナーゼＢ、コラゲナーゼＤ、またはコラーゲン中で三重らせんペプチド結合を切断するいずれかの酵素である。もう一つの具体例において、デスメ膜は、少なくとも１つのＨＣＥＣ凝集物の単離のため、約１〜約１８時間、例えば、約１.５〜約１７時間、約５〜１７時間、約７〜約１７時間、約１０〜１６時間、約１２〜１６時間、約１〜約１８時間の他のいずれかの期間、コラゲナーゼを含む溶液と接触させる。１つの具体例において、ＨＣＥＣの凝集物はピペット操作によって消化後に溶液から分離できる。もう一つの具体例において、ＨＣＥＣの凝集物は遠心によって消化後に溶液から分離できる。まだもう一つの具体例において、ＨＣＥＣの凝集物は、消化後に、サイズに基づく細胞分画装置またはメッシュを介するふるいにより溶液から分離できる。
【００１３】
さらに、約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭ、例えば、約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭ、約０.８５ｍＭ〜約１.４ｍＭ、約０.９ｍＭ〜約１.３ｍＭ、約０.９５ｍＭ〜約１.２ｍＭ、約１.０ｍＭ〜約１.１ｍＭのカルシウムイオン濃度、または約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭの他のいずれかの濃度を有する無血清培地中でＨＣＥＣ凝集物を貯蔵することを含む、ＨＣＥＣ凝集物の生存度を保存および維持する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、カルシウムイオン濃度は貯蔵培地中の約１.０８ｍＭである。さらなる具体例において、補足は無血清培地に提供される。
【００１４】
さらに、（ａ）コラゲナーゼを含む溶液を用いて角膜実質細胞から単離され、（ｂ）約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に所望により保存され、次いで（ｃ）ｐ１２０の発現を下方調節する剤と一過性に接触したＨＣＥＣ、ならびに生物学的適合性担体を含む外科移植片が本願明細書に記載される。１つの具体例において、ＨＣＥＣは、分裂促進成長因子とさらに接触させる。もう一つの具体例において、ＨＣＥＣのＡＪ形成は、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤との接触によってさらに促進される。まだもう一つの具体例において、ＨＣＥＣは生物学的適合性担体上に再接種される。生物学的適合性担体はＨＣＥＣ接着を促進し、透明性であり、角膜実質に統合できる。１つの具体例において、生物学的適合性担体はコラーゲン含有細胞間マトリックスである。もう一つの具体例において、生物学的適合性担体は羊膜である。さらなる具体例において、羊膜の厚みは減少させた。まださらなる具体例において、厚みの減少はエキシマーレーザー剥離によって達成された。まださらなる具体例において、剤は、凝集物または単層の形態におけるＨＣＥＣと一過性に接触させる。さらなる具体例において、ｐ１２０の発現を下方調節する剤はＲＮＡ干渉である。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、細胞凝集物として単離されたＨＣＥＣの例示的顕微鏡像である。
【図２Ａ】図２ＡはコラゲナーゼＡ消化から収集されたＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、高カルシウム無血清培地中での図２ＡからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、高カルシウム無血清培地中での図２ＡからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＳＨＥＭ中の図２Ｃに示すＨＣＥＣ凝集物をさらに培養することにより得られた無傷のヒト角膜内皮単層を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｅ】図２ＥはコラゲナーゼＡ消化から収集されたＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、低カルシウム無血清培地中での図２ＥからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、低カルシウム無血清培地中での図２ＥからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｈ】図２Ｈは、低カルシウム無血清培地中で図２Ｇに示すＨＣＥＣ凝集物をさらに培養することにより生成された、散在した単一細胞を示す例示的顕微鏡像である。。
【図３】図３は、後期密集（４週間の培養）でのＡＲＰＥ−１９細胞系を用いるｐ１２０ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量によるＲＮＡｉのノックダウン効率を示す例示的グラフである。
【図４】図４は、対照（ｓｃＲＮＡ）およびｐ１２０ ＲＮＡｉＩノックダウン培養を示す例示的写真であり、ＢｒｄＵの核染色により判断された増殖を示す細胞の各核へのｐ１２０の移行化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
添付した特許請求の範囲は、本願明細書に記載された特徴を特に示す。本開示の特徴および利点のより良好な理解は、本願明細書に記載された原理が利用される例示的具体例を記載する以下の詳細な記載への参照により得られるであろう。
【００１７】
角膜内皮細胞密度および内皮細胞機能は多数の疾患、外傷または老化の結果として減少しかねない。ウサギおよびウシのごとき他の種と異なり、ＨＣＥＣは、それらに限定され、ｉｎ ｖｉｖｏでの微々たる再生能および増殖能がよく知られている。損傷および破壊したＨＣＥＣは、個体によって再生されない。
【００１８】
ＨＣＥＣの破壊および／または機能障害は角膜浮腫または水疱性角膜症に進行し、次いで、それは視力喪失を生じなねない。ＨＣＥＣの悪化が生じる疾患の例はフックス変性としても知られる角膜内皮細胞変性症である。また、角膜内皮に対する外傷および損傷は、損傷、白内障手術または放射状角膜切開に起因しかねない。
【００１９】
すべての角膜移植の約３０パーセントは角膜内皮疾患のために行なわれる。現在、健康な角膜内皮を含む死体供与者角膜の全てまたは部分的な厚みの角膜移植は、損傷または疾患した角膜内皮による視界の損失の唯一の利用可能な療法である。しかしながら、角膜を置換組織として不適当にする感染性疾患リスクの増加および矯正的眼手術の広範囲の使用により、適当な供与者の不足が存在する。さらに、供与者組織として用いる角膜組織の長期間保存は未解決問題のままである。
【００２０】
変性症、外傷および外科的処置の発生によるｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣの損失を補充する主要な手段は、代償性の細胞の移入および拡張である。角膜の内皮細胞機能障害についての代替的療法として、細胞とＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを接触させることにより、ＨＣＥＣのごとき、分化の間にＡＪを形成し、かくして増殖の可能性を失う細胞の増殖を刺激する方法が、本願明細書に記載される。
【００２１】
さらに、ＨＣＥＣの増殖操作は、ｉｎ ｖｉｖｏでの療法およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織設計のための戦略として、機能障害のＨＣＥＣを持つ眼を処置するためにＨＣＥＣを拡張するのを助けることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト角膜内皮を設計する能力は、角膜またはＨＣＥＣの外科的移植を有するという必要性を回避でき、かかる組織を角膜内皮不全に苦しむ眼における視力を回復するための代替的移植片として用い得るために、重要である。結果的に、分裂促進の刺激ならびに細胞質内ｃＡＭＰを上昇させ、ＡＪ再生成で分化を促進する剤で断続的に（パルス様式で）散在および混合した増殖の刺激によるＨＣＥＣの単離、貯蔵および拡張の方法、ならびに角膜内皮組織を置換するための新しい外科的移植片が本願明細書に記載される。
【００２２】
理論的には、有効な設計方法は３つの鍵となる工程：供与者角膜からのＨＣＥＣの単離、移植を可能とするための期間の単離されたＨＣＥＣの保存、ならびに移植に適した適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で単離されたＨＣＥＣの拡張を含むであろう。また、これらの各工程において、ＨＣＥＣは、ＡＪ形成および細胞増殖の間の均衡作用に影響し得る、細胞が曝露される培地によって影響されかねなかった。
【００２３】
ヒト角膜内皮の組織設計のための必要条件は、少数のＨＣＥＣからの有効な単離、貯蔵および拡張を保証することである。もう一つの必要条件は増殖（拡張）が、ＡＪ形成するＨＣＥＣ発現型の維持（回復）よりは正常なＨＣＥＣ発現型の損失と一体とならないことを保証することである。
【００２４】
単離方法
隣接する角膜実質の角膜実質細胞による汚染からＨＣＥＣを単離する方法が本願明細書に開示される。機械的に裸出されたデスメ膜はいくらかの角膜実質組織を含み、角膜実質細胞が存在する。従前の方法は、トリプシンの有無でのＥＤＴＡ、引き続いてトリプシン／ＥＤＴＡの有無によるディスパーゼ、トリプシンまたはＥＤＴＡに続いてのコラゲナーゼ、またはコラゲナーゼに続いてのトリプシンまたはＥＤＴＡを使用する。しかしながら、これらの方法は、マトリックスから細胞を剥離するのに必要とされる培養時間の延長、細胞傷害および収量の減少、または線維芽細胞（角膜実質細胞）汚染のために細胞変性に導いた。さらに、これらの方法は、かかる線維芽細胞（角膜実質細胞）汚染が発生するのを防止するためにさらなる選択培地の使用を必要とした。
【００２５】
本願明細書に開示された方法は、例えば、デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ、次いで、溶液からＨＣＥＣ凝集物を単離する工程を含む。例えば、デスメ膜は、接着ＨＣＥＣがその溶解された膜から剥離され、凝集物から排除される角膜実質細胞なくして溶液中で懸濁されたＨＣＥＣの少なくとも１つの凝集物を形成するのに十分な時間、ある濃度のコラゲナーゼを含む溶液において消化できる。コラゲナーゼ溶液における消化は、形成されたＨＣＥＣ凝集物が角膜実質細胞の汚染を回避するために別々の培養皿に移すことができるために、角膜実質から角膜実質細胞の汚染を除去するのを助ける。かかるＨＣＥＣ凝集物は、ｉｎ ｖｉｖｏ状態と同様に細胞マトリックス相互作用および細胞−細胞ＡＪを保持するであろう。
【００２６】
用いたコラゲナーゼは、例えば、コラゲナーゼＡ、コラゲナーゼＢ、コラゲナーゼＤ、またはコラーゲン中のペプチド結合を切断するいずれかの酵素で有り得る。溶液中のコラゲナーゼＡの濃度は、約０.５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０.７５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約１.５ｍｇ／ｍｌ〜約２.０ｍｇ／ｍｌの範囲、または約０.５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの他のいずれかの範囲であることができる。
【００２７】
角膜実質細胞からＨＣＥＣの少なくとも１つの凝集物を単離するための溶液は、補足ホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）のごときかかる細胞を培養するのに適当ないずれかの培地を含むことができる。培養基は、例えば、血清、抗生物質、成長因子または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤のごとき他の物質を補足できる。細胞質内ｃＡＭＰを上昇させるために用いることができる剤は、例えば、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよびジブチリルｃＡＭＰのごとき細胞膜浸透性ｃＡＭＰ類似物、およびホスホジエステラーゼ阻害薬のごとき他の細胞内ｃＡＭＰ上昇剤、例えば、イソブチル−メチルキサンチンおよびペントキシフィリン、ホルスコリンおよびコレラ毒素のごときアデニレートシクラーゼ賦活物質、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストのごとき外因性の剤、または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる他の剤を含む。１つの具体例において、培地は、等量のＨＥＰＥＳ緩衝されたＤＭＥＭおよびＨＡＭのＦ１２；５％ウシ胎仔血清；０.５％ジメチルスルホキシド；２ｎｇ／ｍｌマウス上皮成長因子；５μｇ／ｍＬインスリン；５μｇ／ｍｌトランスフェリン；５ｎｇ／ｍｌセレン；０.５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン；１ｎＭコレラ毒素；５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン；および１.２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢを含む。
【００２８】
デスメ膜は、角膜実質細胞からの少なくとも１つのＨＣＥＣ凝集物の単離につき約１〜約１８時間、例えば、約１.５〜約１７時間、約５〜約１７時間、約７〜約１７時間、約１０〜約１６時間、約１２〜約１６時間または約１時間〜約１８時間の他のいずれかの期間、摂氏約３７度の温度で培養できる。ＨＣＥＣを単離するのに必要なコラゲナーゼ溶液における培養時間は、例えば、所望の消化の量、所望のＨＣＥＣ凝集物数、コラゲナーゼ溶液の濃度および／または消化されるべきデスメ膜のサイズに依存し、本願明細書に供された開示に基づいて、当業者により容易に決定できる。
【００２９】
デスメ膜の消化および角膜実質細胞からのＨＣＥＣ凝集物の単離に続いて、凝集物はピペット操作により溶液から集め、取り出すことができる。別法として、ＨＣＥＣ凝集物は、サイズに基づいた細胞分画装置またはメッシュを介して遠心またはふるいを含めた他の方法によって集めることができる。いずれの場合においても、収集は凝集物を分裂させずに生じさせるべきである。
【００３０】
保存／維持方法
前記の単離されたものを含めた単離されたＨＣＥＣ凝集物は、約３週間までまたはそれより長い間、無血清の高カルシウム濃度培地中で連続的に培養されれば円形球にさらに組織化でき、かかる保存されていた球は、発現型の六角形の形状でのＨＣＥＣの単層を与えることができた（図２Ｄ）。高カルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に凝集物を貯蔵することにより、ＨＣＥＣ凝集物の生存度を保存および維持する方法が本願明細書に開示される。
【００３１】
本願明細書に用いた高カルシウムイオン濃度は、貯蔵培地中で約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭカルシウム濃度、例えば、約０.８〜約１.５ｍＭ、約０.８５〜約１.４ｍＭ、約０.９〜約１.３ｍＭ、約０.９５〜約１.２ｍＭ、約１.０〜約１.１ｍＭ、または約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭの他のいずれかの濃度である。１つの具体例において、カルシウムイオン濃度は貯蔵培地中で約１.０８ｍＭである。
【００３２】
貯蔵培地は、カルシウム濃度が前記の基準を満たす限りは、ＨＣＥＣを貯蔵するのに適切ないずれの無血清培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２、またはＳＨＥＭに用いたＤＭＥＭおよびＦ１２の混合物でもあり得る。その培地において、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはフィブロネクチンを含めた他の血清因子が除去される限りは、分裂促進成長因子、抗生物質、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤、ＫＳＦＭサプリメントまたはＳＨＥＭサプリメントのごとき追加の成長サプリメントが添加できる。
【００３３】
一旦、ＨＣＥＣ凝集物が無血清の高カルシウム濃度貯蔵培地に入れられれば、それらは、例えば、約３週間またはそれより長く、例えば、摂氏約３７度の温度にて組織培養インキュベーター中で培養できる。凝集物は、後記のように、貯蔵培地中で浮遊凝集物として残り、例えば、血清含有培地中で引き続いての培養に用いることができる。さらに、ＨＣＥＣ凝集物の増殖は、後記のように刺激し得る。
【００３４】
拡張方法
細胞と、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０およびｐ１９０の発現を下方調節する剤とを接触させることを含む、分化の間にＡＪを形成し、増殖を中止させる増殖細胞を刺激する方法が本願明細書に開示される。例えば、単離され保存されたＨＣＥＣ凝集物の増殖または前記のＨＣＥＣ凝集物から誘導されたＨＣＥＣ単層の増殖は上記方法を用いて刺激できる。
【００３５】
理論によって拘束されることを望むことなく、ＨＣＥＣの細胞−細胞間結合の崩壊が、それらが拡張のために単層として広がるのを助け得ることが提案される。細胞−細胞接触は、ＡＪ、密着帯（ＴＪ）および接着斑を含む。これらの接触のうちＡＪは、細胞の増殖、連絡、特異性、細胞間接着の形成および維持の制御において特に重要である。ＡＪはカドヘリンおよびカテニンによって媒介されたアクチンベースの細胞間結合であり、カルシウム依存性細胞増殖および細胞−細胞接着を媒介する単一の膜貫通ドメイン糖タンパク質の別々のファミリーを表わす。ＡＪの鍵となるメンバーは、カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびｐ１２０を含む。カドヘリンファミリーには、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンがあり、その発現は細胞型に依存する。一般的には、カテニンは、Ｅ−カドヘリン、他のカドヘリンおよびアクチン細胞骨格とのそれらの相互作用に関連する細胞−細胞接着の調節において主な役割を有すると考えられる８０〜１０２キロダルトン蛋白質のファミリーである。ｐ１９０は、アクチン張力繊維力学を調節し、Ｆ−アクチンケーブルの限局性の接着およびミオシン媒介収縮の抑制により、細胞骨格力学の調節において役割を果たすＲｈｏＡファミリーＧＴＰアーゼ活性化蛋白質である。
【００３６】
ＨＣＥＣについては、鍵となるアドヘリンは、Ｅ−カドヘリンまたはＶＥ−カドヘリンではなくＮ−カドヘリンであり（それらは非常に少量で生成される）；また、本願明細書に記載したα−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０およびｐ１９０はＨＣＥＣ中に存在する。古典的には、細胞−細胞間結合は分化細胞の構造要素と見なされている。しかしながら、理論によって拘束されることを望むことなく、これらの細胞−細胞間結合成分の一過性の下方調節によりＨＣＥＣの有系分裂ブロックを解除することは、ＨＣＥＣの拡張を促進できる。かくして、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０およびｐ１９０は、ＨＣＥＣにおいて有系分裂のブロックを解除するための適切な標的である。
【００３７】
ＡＪを持つ細胞の増殖を刺激する従前の方法は、トリプシンのごとき酵素および／またはＥＤＴＡのごとき二価陽イオンのキレート化剤を使用した。しかしながら、トリプシン／ＥＤＴＡを使用する方法は、それが潜在的に有害であるために、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用に有効に用いることができない。さらに、トリプシン／ＥＤＴＡは、周囲の細胞マトリックス相互作用を分離し、さらにＡＪの１以上の成分を標的とする。加えて、トリプシン／ＥＤＴＡはＨＣＥＣおよび隣接する角膜実質細胞を無差別に分離するであろう。細胞−細胞間結合および細胞マトリックス相互作用のかかる非特異性で広い分離後に、ＨＣＥＣは増殖するが、特にＩＬ−１およびｂＦＧＦのごとき成長因子による刺激下で、線維芽細胞に形質転換し、レトロ角膜と名付けられた病理学的状態を模倣する。
【００３８】
１つの具体例において、簡潔なＥＤＴＡ処理は、細胞−細胞接触によって媒介された有系分裂ブロックを放出することにより、ＨＣＥＣ凝集物の増殖を促進した（実施例３）。しかしながら、前記のごとく、かかる処理はヒト移植に不適当であるＨＣＥＣ細胞を生成し、細胞−細胞間結合および細胞マトリックス相互作用の非特異性でかつ広い分離を生じる。
【００３９】
もう一つの具体例において、ＡＪを持つ細胞の増殖は特定の細胞−細胞間結合成分を標的とすることにより刺激できる。細胞−細胞間結合成分をノックダウンして、増殖の可能性の損失と同時に、分化の間にＡＪを発現する細胞の有系分裂ブロックの解除を促進し得る。カドヘリンの例はＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンを含む。カテニンの例は、α−、β−、γ−カテニンおよびｐ１２０を含む。ノックダウンされるＲＮＡｉがｐ１２０であるならば、例えば、ｐ１２０ ＲＮＡｉ １またはｐ１２０ ＲＮＡｉ ３を用いることができる（表５）。ｐ１２０の下方調節は、ＡＲＰＥ−１９細胞（実施例５）につきＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびβ−カテニン、ならびにＨＣＥＣ（実施例６）につきＮ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびβ−カテニンの著しい下方調節で細胞−細胞間結合の溶解に導く。さらに、ｐ１２０はＨＣＥＣにおいて、細胞−細胞間結合から核に移動し、それは、ＢｒｄＵ（ＤＮＡ合成を示す標識）に対する核染色により判断されるような増殖を示す（図４）。カドヘリン（すなわち、ＨＣＥＣについてのＮ−カドヘリン）、α−カテニンおよびβ−カテニンは、細胞−細胞間結合が撹乱された場合に代謝的に不安定であるが、ｐ１２０はそうではない（実施例４、表３）ことが判明し、これはｐ１２０の標的化が特殊でかつより有効であることを示す。
【００４０】
もう一つの具体例において、ＡＪを持つ細胞の増殖はＲＮＡｉノックダウンによってｐ１２０を標的とすることにより刺激できる。ＲＮＡｉとは、細胞への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入をいい、それは、相補的ｍＲＮＡの分解を引き起こし、それにより遺伝子発現を抑制する。公表されたＲＮＡｉ配列を用いて、ｐ１２０を下方調節し得、特定のＲＮＡｉ配列を、例えば、（ａ）所望のｍＲＮＡオープン・リーディング・フレームの異なった標的領域；（ｂ）Ｍｉｔｔａｌ Ｖ，Ｎａｔｕｒｅ（２００４） ５：３５５−３６５に公表されるようなＲＮＡｉデザイン原理；および、（ｃ）その所望のＲＮＡｉが特殊であることを確認するＢＬＡＳＴ検索を考えることによりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢｌｏｃｋｉｔTM ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒに基づき設計できる。
【００４１】
ｉｎ ｖｉｖｏでの適用では、ＲＮＡｉをパルスで適用でき、例えば、ＲＮＡｉをある期間適用した後、回復させ、その時間中に、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤と一緒に分裂促進の刺激、または分裂促進の刺激に続いて細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含む培地が、ＲＮＡｉの次の適用前のある期間適用される。例えば、ＲＮＡｉは、約１２〜約７２時間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの他の時間に適用でき、回復または静止期間は、約１２〜約４８時間のいずれかの期間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの他の時間であり得る。１つの具体例において、ＲＮＡｉは２４時間の期間の間適用され、次いで、続いて、ＲＮＡｉの次のパルス適用が行なわれる前に、２４時間の回復および静止期間を行う。
【００４２】
１つの具体例において、細胞は、哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、サルまたはヒトの体内のごときｉｎ ｖｉｖｏにて剤と接触させる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。さらなる具体例において、接触は哺乳動物の眼において生じる。まださらなる具体例において、哺乳動物の眼は、例えば、水疱性角膜症（無水晶体または偽水晶体の水疱性角膜症を含む）、角膜内皮細胞変性症（フックス変性症）、角膜浮腫、先天性遺伝的内皮変性症、または角膜内皮が損傷されるいずれかの疾患のごとき角膜内皮細胞機能障害を有する。まださらなる具体例において、剤は哺乳動物の前眼房に投与される。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用について、ＲＮＡｉは、パルスにて凝集または単層の形態のＨＣＥＣの培養に適用でき、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤と一緒に分裂促進の刺激を含有するまたは分裂促進の刺激に続いて細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含む培地の置換で分散もしくは混合でき、例えば、ＲＮＡｉはある時間適用され、次いで、ＲＮＡｉの次のパルス適用の前に細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤と一緒に分裂促進の刺激、または分裂促進の刺激に続いて細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含む新鮮な培地で回復または静止期間適用される。例えば、ＲＮＡｉは、約１２〜約７２時間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの時間に適用でき、回復または静止期間は、約１２〜約４８時間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの他の時間であることができる。回復または静止期間の間に適用された新鮮な培地は、補足ホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）のごとき、かかる細胞を培養するのに適当ないずれの培地でもよい。１つの具体例において、ＲＮＡｉは、ＥＧＦおよびｂＦＧＦのごときペプチド成長因子を、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤、例えば、コレラ毒素と一緒に、またはペプチド成長因子に続いて、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を用いて、分裂促進の刺激を含む培地により交換する前に前記の時間の間適用し、ＲＮＡｉの次のパルス適用が行なわれる前に、２４時間または前記のいずれかの時間ＡＪ形成を促進する。
【００４４】
ＲＮＡｉが適用されるべきＨＣＥＣ培養は凝集物または単層の形態のいずれかであることができる。ＨＣＥＣ単層は早期密集（例えば、約１、約２、約３、約４、約５または約７日間の密集）または後期密集（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間の密集）のいずれでも有り得る。ＨＣＥＣ細胞のＲＮＡｉの一過性のトランスフェクション後に、トランスフェクション試薬は除去でき、細胞は前記のごとき細胞培養技術に従い継代および拡張して、特有の六角形のモザイク発現型を維持できる。
【００４５】
さらなる具体例において、ＨＣＥＣに適用された培地は、細胞質内ｃＡＭＰを上昇し得る剤で補足される。理論によって拘束されることを望むことなく、細胞質内ｃＡＭＰの上昇は、線維芽細胞への形質転換および特有のＨＣＥＣ発現型の損失のごとき、ＥＧＦまたはｂＦＧＦ、特にＩＬ−１およびｂＦＧＦのごとき分裂促進の成長因子によって引き起こされた、延長され持続的な増殖により引き起こされた望ましくない副作用を打ち消す。細胞質内ｃＡＭＰを上昇させるために用いることができる剤は、例えば、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよびジブチリルｃＡＭＰのごとき細胞膜浸透性ｃＡＭＰ類似物、およびホスホジエステラーゼ阻害薬のごとき他の細胞内のｃＡＭＰを上昇させる剤、例えば、イソブチル−メチルキサンチンおよびペントキシフィリン、ホルスコリンまたはコレラ毒素のごときアデニレートシクラーゼ賦活物質、またはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストのごとき外因性の剤、または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる他の剤を含む。得られた細胞は、ヒトの移植に適当である。
【００４６】
外科移植片／治療方法
上記の調製されたＨＣＥＣは、適切な担体または支持の有無での組織、すなわち、外科用移植片として送達できる。（ａ）コラゲナーゼを含む溶液を用いて角膜実質細胞から単離され、（ｂ）約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に所望により保存され、および（ｃ）ｐ１２０の発現を下方調節する剤と一過性に接触させたＨＣＥＣ、ならびに生物学的適合性担体を含む外科移植片が本願明細書に開示される。１つの具体例において、ＨＣＥＣは、分裂促進の成長因子とさらに接触させる。もう一つの具体例において、ＨＣＥＣのＡＪ形成は、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させるための剤との接触によってさらに促進される。まだもう一つの具体例において、ＨＣＥＣが、生物学的適合性担体上に再接種される。生物学的適合性担体はＨＣＥＣ接着を促進し、透明性であって、角膜実質に統合できる。１つの具体例において、生物学的適合性担体はコラーゲン含有細胞間マトリックスである。もう一つの具体例において、生物学的適合性担体は羊膜である。さらなる具体例において、羊膜の厚みは減少させた。まださらなる具体例において、厚みの減少はエキシマーレーザー切除によって達成された。まださらなる具体例において、剤は、凝集物または単層の形態におけるＨＣＥＣと一過性に接触させる。さらなる具体例において、ｐ１２０の発現を下方調節する剤はＲＮＡ干渉である。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。
【００４７】
かかる移植片についてのＨＣＥＣ源は、自己（同一個体から）または同種異型（異なる個体から）の源に由来し、角膜内皮疾患の患者を治療するために外科移植片として用いることができる。自家移植片は、移植者自身の組織、例えば、移植者の健全な眼から調製された移植片である。異種移植片は遺伝学的に同一でない個体間の組織の移植片である。異種移植片は、例えば、死体の眼または生体関連の個体から得られた組織から調製し得る。自家移植片は、従来の角膜移植において回避できない同種移植片拒絶を回避するという利点を与える。
【００４８】
加えて、上記の調製されたＨＣＥＣは、角膜実質または全角膜組織のごとき組織を設計または再生するために含むことができる。かかる設計された組織は、外科移植片として、および療法をテストする目的、または組織の機能を増強するための遺伝子治療と合わせるように用いることができる。また、本願明細書に記載された方法および組成物は、同一適用のための他の種に拡張し得る。
【００４９】
実施例
以下の特定の実施例は、単なる例示として構築され、何らその開示の残りに制限的でないものとして、解釈されるべきものである。さらなる詳述なくして、当業者ならば、本願明細書の記載に基づいて、その最も十分な範囲まで本発明を利用できると考える。これにより、本願明細書に引用された全ての刊行物をここに出典明示してその全てを本願明細書の一部とみなす。それに対する引用は、かかる情報の有効性および公の普及を証拠づける。
【００５０】
実施例１：ＨＣＥＣの単離
材料：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハム／Ｆ１２培地、ケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）、ＯｐｔｉＭＥＭ−１培地、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ下垂体抽出物、ヒト組換え上皮成長因子（ｈ−ＥＧＦ）、０.２５％トリプシン／０.５３ｍＭ ＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ディスパーゼＩＩおよびコラゲナーゼＡはＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。ヒドロコルチゾン、ジメチルスルホキシド、コレラ毒素、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地サプリメント、Ｌ−アスコルビン酸、コンドロイチン硫酸、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ−３３３４２色素、トリトンＸ−１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈ−ｂＦＧＦ）、パラホルムアルデヒドおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。マウス抗−ＺＯ−１抗体およびタイプＩコラーゲンはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から得た。マウス抗ラミニン５、ＩＶ型コラーゲンα２鎖、パールカンおよびコネクシン４３抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）からであった。マウス抗ＩＶ型コラーゲンα１抗体はＫａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）からであった。抗フェードマウンティング溶液はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）からであった。マウス抗Ｋｉ６７抗体はＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）からであった。ＤｅａｄＥｎｄＴＭの蛍光測定ＴＵＮＥＬシステムはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からであった。
【００５１】
ヒト組織はヘルシンキ宣言に従い取扱った。ヒト供与者の眼からの１８の角強膜組織をＦｌｏｒｉｄａ Ｌｉｏｎｓ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から得、それらの中央の角膜ボタンのうちのいくつかを角膜移植に用いた。供与者の年齢は１８〜６８歳（４１.４±１５.８歳）の間にあった。全ての組織を試験前の１０日未満の間ＯＰＴＩＳＯＬＲ（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）培地中の４℃に維持した。組織を５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび１.２５ｍｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢを含むＤＭＥＭ培地で３回濯いだ。
【００５２】
中央の角膜を８ｍｍの直径のトレフィンにより取り出した。その後、デスメ膜ならびに角膜内皮細胞を解剖顕微鏡下で末梢性角強膜組織の後面から剥取り、ＳＨＥＭ培地中の２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡで３７℃にて１.５〜１６時間消化し、そのＳＨＥＭ培地は、５％ＦＢＳ、０.５％ジメチルスルホキシド、２ｎｇ／ｍＬ マウスＥＧＦ、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬ セレン、０.５μｇ／ｍＬ ヒドロコルチゾン、１ｎＭコレラ毒素、５０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシンおよび１.２５μｇ／ｍＬ アンフォテリシンＢを補足した、等量のＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭおよびハムＦ１２で調製した。消化後、ＨＣＥＣは凝集物を形成し、それは消化溶液を除去するために２，０００ｒｐｍで３分間の遠心により集めた。また、対照として、デスメ膜ストリップを３時間までＳＨＥＭ培地およびトリプシン／ＥＤＴＡ中の１０ｍｇ／ｍｌディスパーゼＩＩにおいて消化した。
【００５３】
１.５時間のコラゲナーゼ消化は、デスメ膜から内皮細胞を分離し、裸出したデスメ膜を後に残して、緩い凝集物を形成するのに十分であった。３時間の消化後、コラゲナーゼ消化から誘導した内皮細胞凝集物はより緻密になった；しかしながら、デスメ膜はまだ溶解していなかった。１２時間の消化後、デスメ膜は完全に消化され、大部分のＨＣＥＣ凝集物は非常に緻密になった。これらのＨＣＥＣ凝集物において、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイおよびＴＵＮＥＬアッセイによって確認されるように、内皮細胞は高生存度を維持した。それらの少数の緩いままのＨＣＥＣ凝集物はより多くの死細胞を含むことが証明された。これらの結果に基づいて、発明者らは、１２時間の消化の結果、高い細胞生存率で緻密なＨＣＥＣ凝集物を生じると結論した。これらの緻密なＨＣＥＣ凝集物は、それらが細胞−細胞間結合を維持したために、内皮細胞の長期間保存を促進し得る。
【００５４】
結果． デスメ膜が角強膜環組織の末梢性角膜から外科的に取り出した後に、大部分のＨＣＥＣは依然としてデスメ膜に接着し、一方、いくらかの細胞を切り離し（破線および星印によりマークした）、細胞がない領域を創製した（図１Ａ）。ＳＨＥＭ中の３７℃での１.５時間のディスパーゼＩＩ消化後、、ＨＣＥＣは凝集し始めたが、依然としてデスメ膜から脱離しなかった（図１Ｂ）。
【００５５】
対照的に、裸出されたデスメ膜を１.５時間コラゲナーゼＡ中で消化した後、ＨＣＥＣをかなりのクラスタに凝集し、デスメ膜から完全に剥離し（図１Ｃ）、無傷のデスメ膜を後ろに残した。３時間後、コラゲナーゼＡ消化から誘導されたかかる凝集物はより緻密であった。しかしながら、細胞は依然としてデスメ膜から脱離しなく、ディスパーゼＩＩ消化後に分解し始めた（データを示さず）。顕著には、１６時間のコラゲナーゼＡ消化後、デスメ膜は溶解し、大部分のＨＣＥＣ凝集物は緻密であり、異なるサイズおよび形状を示したが（図１Ｄ）、ほとんどが緩みを示さなかった（図１Ｄ、１Ｅ、矢印）。
【００５６】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイは、緻密な凝集物が著しい緑色蛍光を示す生細胞よりなることを示した（図１Ｆ）。対照的に、緩められた凝集物は死細胞を含んでいた（図１Ｆ、矢印によってマークした）。図１Ｅは、図１Ｆの位相差顕微鏡写真である。棒は１００マイクロメートル（μｍ）を表す。発明者らは、これらの細胞が供与者角膜の保存の間に既に死んでいるかもしれなく、かくして、コラゲナーゼＡ消化の間に凝集を形成することができないと推測した。
【００５７】
細胞−細胞間結合および基底膜成分がコラゲナーゼＡ消化後に依然として維持されたかを調べるために、ＨＣＥＣ凝集物をＯＣＴに包埋し、凍結切片のために調製し、免疫染色に付した。結果は、その密着帯ＺＯ−１、ギャップ結合コネクシン−４３、ＩＶ型コラーゲンα１およびα２鎖としてのかかる基底膜成分、ラミニン５およびパールカンは全てＨＣＥＣ凝集物中に存在することを示した。
【００５８】
さらに、核対比染色は、凝集物中のＨＣＥＣが緻密であることを示した。ＴＵＮＥＬアッセイは、わずかなアポトーシスの細胞だけが凝集物の中心に存在することを確認した。
【００５９】
これらの基底膜成分がＨＣＥＣの生存度を維持するのを助けるかをさらに調べるために、コラゲナーゼ単離した凝集物を引き続いて、コラーゲンＩＶおよびラミニン５を除去できる発明者らが報告した処理の４℃での１６時間のディスパーゼＩＩ（ＳＨＥＭ中１０ｍｇ／ｍＬ）で処理した。結果は、生死アッセイにより判断されるように、さらなるディスパーゼＩＩ消化がＨＣＥＣ凝集物を分解させなく、中の細胞は依然として生きていることを示した。しかしながら、ディスパーゼ処理されたＨＣＥＣ凝集物は、ＳＨＥＭ中でプラスチックに容易に付着できなかったが、ディスパーゼ非処理の凝集物は付着できた。これらの結果は、細胞−細胞間結合が、細胞−マトリックス相互作用よりも、凝集物を形成し、ＨＣＥＣの細胞生存率を維持することにより重要な役割を果たすこともでき、基底膜マトリックス成分を凝集物中に残すことが、二次培養の間にプラスチック上でＨＣＥＣの細胞付着を促すことにおいて重要な役割を果たすこともできることを示した。
【００６０】
実施例２：単離したＨＣＥＣ凝集物の貯蔵
得られたＨＣＥＣ凝集物を、異なるサプリメント（表１）を含む無血清の低カルシウムまたは高カルシウム培地中に保存した。貯蔵培地１、ＫＳＦＭベースの培地のカルシウム濃度は、０.０８ミリモル（ｍＭ）であり、発明者らはそれを「低カルシウム」培地と定義した。貯蔵培地２、３およびすべての培地のカルシウム濃度は、ＤＭＥＭ．Ｆ１２の基本培地およびＦＢＳ中のカルシウムに基づいて、約１.０８ｍＭである。発明者らは、約１.０８ミリモル（ｍＭ）のカルシウム濃度を有する培地を「高カルシウム」培地と定義した。
【００６１】
ＨＣＥＣ凝集物は組織培養インキュベーターに約３７℃にて３週間まで貯蔵した。細胞生存率は、生死アッセイによって決定し、血清添加培地（表２）中でそれらを二次培養することにより評価した。
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
結果． 血清添加培地中で培養した場合、ＨＣＥＣ凝集物は、１２時間以内にプラスチック皿に急速に付着した。対照的に、無血清培地で培養した場合、それらは浮遊凝集物として残った（図２Ｃ、２Ｇ）。後者の条件において、浮遊凝集物は、１週間後に低カルシウム無血清培地（培地１）で徐々に分解した（図２Ｆ、２Ｇ）。
【００６４】
対照的に、ＨＣＥＣは、１週間後に高カルシウム無血清培地（培地２および３）の円形球に組織化され（図２Ｂ）、３週までの間緻密な円形球に組織化された（図２Ｃ）。第３週の終わりに、これらの凝集物は１２時間以内に付着し、ＳＨＥＭ中でプラスチック上で接種された場合に４日以内に無傷のヒト角膜内皮シートとして広がった（図２Ｄ）。しかしながら、低カルシウム無血清培地中に保存されたものは単一細胞をほとんど生成することができなかった（図２Ｈ）。棒線は１００μｍを表わす。
【００６５】
これらの結果は、コラゲナーゼ単離されたＨＣＥＣ凝集物を高カルシウム無血清培地中で少なくとも３週間保存でき、かかる保存された凝集物は依然として血清添加培地中の引き続いての培養につき高ＨＣＥＣ生存度を保持することを示した。
【００６６】
実施例３：トリプシン／ＥＤＴＡを用いる、単離されたＨＣＥＣ凝集物の拡張
次いで、消化直後または貯蔵培地中での保存期間後のいずれかで得られたＨＣＥＣ凝集物を、約３７℃の温度および５パーセント（５％）の二酸化炭素（ＣＯ２）下のプラスチック皿上の異なる培養培地（表２）中で培養した。培地を約２〜３日毎に交換した。いくつかのＨＣＥＣ凝集物を、前記の培養前に内皮細胞を単離するために３７℃で１０分間トリプシン／ＥＤＴＡで予め処理した。
【００６７】
ＨＣＥＣ凝集物をＯＣＴに包埋し、凍結薄切に付した。４マイクロメートル（μｍ）の凍結切片を室温（ＲＴ）で３０分間風乾し、次いで、−２０℃にて１０分間冷アセトン中で固定した。免疫染色に用いた切片をＰＢＳに再水和し、０.２％トリトンＸ−１００中で１０分間インキュベートした。各々５分間のＰＢＳでの３回の濯ぎ、および非特異的な染色をブロックするための２％ＢＳＡでのプレインキュベーション後に、切片を抗ラミニン５、ＩＶ型コラーゲンα１およびα２鎖、パールカン、ＺＯ−１およびコネクシン４３（全て１：１００）抗体と１時間インキュベートした。１５分間でのＰＢＳで３回洗浄後、切片をＦＩＴＣ結合第２抗体（１：１００のヤギ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ）と４５分間インキュベートした。
【００６８】
各１０分間の３回のさらなるＰＢＳ洗浄後に、それらをヨウ化プロピジウム（１：１０００）またはＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）で対比染色し、次いで、抗フェード溶液を乗せて、蛍光顕微鏡で分析した。２４ウェルプレートおよびチャンバースライド中で培養したＨＣＥＣを室温にて１５分間４％パラホルムアルデヒド中で固定し、前記の方法を用いて、抗−ＺＯ−１およびコネクシン４３抗体で染色した。
【００６９】
Ｋｉ６７の免疫組織化学染色では、内因性ペルオキシダーゼ活性を０.６％過酸化水素によって１０分間ブロックした。非特異的な染色は１％正常ヤギ血清によって３０分間ブロックした。次いで、細胞を抗Ｋｉ６７抗体（１：１００）と１時間インキュベートした。１５分間のＰＢＳでの３回の洗浄後、細胞をビオチン化したウサギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）で３０分間に続いて、ＡＢＣ試薬で３０分間インキュベートした。反応生成物はＤＡＢで５分間展開し、光学顕微鏡で検討した。
【００７０】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイおよび終末のデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼを媒介としたＦＩＴＣ結合ｄＵＴＰニック末端ＤＮＡ標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いて、各々、細胞の生存率およびアポトーシスを決定した。ＨＣＥＣ凝集物を室温で１５分間ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬とインキュベートした。生細胞は、細胞−細胞質の緑色蛍光染色によって区別し、一方、死細胞は核中の赤色蛍光で染色した。ＴＵＮＥＬアッセイは製造者の指示に従い行った。略言すると、ＨＣＥＣ凝集物の断面は、室温にて２０分間４％ホルムアルデヒドに固定し、１％トリトンＸ−１００で透過処理した。次いで、試料を、ニックされた３’−ヒドロキシルＤＮＡ末端の修復のために外因性ＴｄＴおよびフルオレセイン結合ｄＵＴＰと３７℃にて６０分間インキュベートした。細胞を陽性対照としてＤＮａｓｅ Ｉで処理し、一方、陰性対照はｒＴｄＴ酵素を欠く緩衝液でインキュベートした。アポトーシスの核は、緑色蛍光で標識した。
【００７１】
結果．３７℃での１０分間のトリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理後、ＨＣＥＣ凝集物をより小さなクラスタおよび単一細胞に分離した。大部分の細胞は付着し、２４時間（以内に拡張し（図５Ｂ）、次いで４日後にパッチおよびシートに成長した。１週後、これらの細胞は密集に達し、発現型の六角形の形状を維持した。
【００７２】
免疫染色は、ｉｎ ｖｉｖｏ形態学の維持のためのマーカー：密着帯ＺＯ−１マーカー蛋白質およびギャップ結合コネクシン−４３マーカー蛋白質を発現した密集細胞を示した。これらの結果は、ＥＤＴＡ／トリプシンによるさらなる簡潔な消化の結果、単層へのＨＣＥＣの拡張が成功することを示した。
【００７３】
トリプシン／ＥＤＴＡの前記の簡潔な処理がＨＣＥＣ増殖を刺激するのに必要であったことをさらに確認するために、発明者らは、Ｇ０を除いて細胞周期のすべての相で発現されるＫｉ６７の免疫組織化学染色を行なった。トリプシン／ＥＤＴＡ処理なくしてプラスチックに直接的に接種したＨＣＥＣ凝集物は、ＳＨＥＭ中での１週間の培養後にシート様成長を生じた。しかしながら、Ｋｉ６７陽性の核を成長の周囲で単に時々観察した。また、対照的に、簡潔なトリプシン／ＥＤＴＡ処理後には、ＨＣＥＣ凝集物は、ＳＨＥＭ中でプラスチック上で接種したならば、密集細胞シートを生じるが、非常に多くの細胞は、ランダムに分配されたＫｉ６７陽性の核を示した。この結果は、トリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理が実際に細胞増殖を促進することを示した。
【００７４】
ＳＨＥＭ中の成長因子のさらなるサプリメントが有益であるかを決定するために、簡潔なトリプシン／ＥＤＴＡ処理の有無でのＨＣＥＣ凝集物を、１００μｇ／ｍＬ ＢＰＥ、２０ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦまたは４０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの有無でのＳＨＥＭ中で１週間培養した。結果は、さらなるＢＰＥが、細胞のより多くの点在を刺激する結果、無傷のシートの損失を生じ、トリプシン／ＥＤＴＡで予め処理されるならば、この現象はより顕著になり、大部分の細胞は線維芽細胞の形状に変化することを示した。対照的に、さらなるＮＧＦは前記の劇的な細胞形状変化を生じなく、細胞は、依然としてトリプシン／ＥＤＴＡ処理の有無で無傷のシートを維持した。Ｋｉ６７染色は、ＳＨＥＭ中のＢＰＥまたはＮＧＦのいずれかの添加がトリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理の有無で少数のＫｉ６７陽性の核を与えることを明らかにした。ＢＰＥに比較した場合に、ｂＦＧＦをＳＨＥＭに添加した場合にも同様の結果を得た。
【００７５】
これらの結果は、簡潔なトリプシン／ＥＤＴＡ処理が、これらの４種の培養のすべてにおいてより多数のＫｉ６７陽性細胞を生じ、細胞増殖はＳＨＥＭ中のこれらの３種の成長サプリメントのいずれの添加によっても促進されなかったことを示した。ＳＨＥＭ中のＢＰＥまたはｂＦＧＦの添加の結果、六角形の発現型および細胞−細胞間結合形成を損失させ、これは、これらの各成長サプリメントが細胞の遊走または分化を増加させることを示唆した。しかしながら、全体的には、トリプシン／ＥＤＴＡ処理は不可逆性のＨＣＥＣ損傷を生じさせた。
【００７６】
実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中の細胞−細胞間結合およびそれらの調節分子のｍＲＮＡ発現の決定
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＡＪおよびＴＪならびにそれらの調節分子の発現、ならびに細胞の細胞骨格アクチンケーブルと増殖との相関を決定した。プラスチック上での１４日までのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＡＪ／ＴＪおよびそれらの調節分子のｍＲＮＡ発現を、従来の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。また、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＡＪの陽性発現した成分のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【００７７】
すべてのＰＣＲ断片は予期されたサイズであった。ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣは実質的レベルのＮ−カドヘリン（タイプＩＩ）、Ｅ−カドヘリン（タイプＩＩ）、ＶＥ−カドヘリン、ｐ−カドヘリン、ｐ１２０、ｐ１９０、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡのｍＲＮＡを発現し、ｍＲＮＡレベルでのＥ−カドヘリン（タイプＩ）、Ｎ−カドヘリン（タイプＩ）、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニンおよびＺＯ−１を発現した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣは、１４日間の培養後に、Ｅ−（タイプＩおよびＩＩ）およびＰ−カドヘリンを除いて、同様のレベルの細胞−細胞間結合関連分子ｍＲＮＡを発現した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＮ−カドヘリン（タイプＩＩ）の早期回復は、Ｎ−カドヘリンがｐ１２０により補充および安定化したＡＪの形成の早期ステージに関与し得ることを示した。このステージでは、ｐ１２０は細胞質ゾルおよび核に広がり、転写因子として作用し得る。Ｎ−カドヘリンは、未成熟の兆候として結合から細胞質ゾルまで広がり得る。第２１日にて、Ｎ−カドヘリンは、細胞−細胞間結合の環状バンドを形成し、ｐ１２０は内部細胞膜で環状バンドを形成したが、Ｎ−カドヘリンおよびＶＥ−カドヘリンはＨＣＥＣの細胞質ゾルにあった。このパターンは、ｉｎ ｖｉｖｏで判明したものに似ている成熟パターンを表わす。
【００７８】
トリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理は、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン（タイプＩＩ）、β−カテニンおよびＺＯ−１のかなりの下方調節によって証拠づけられるようなＡＪおよびＴＪの成分を最小に顕著に分離させた（表３）。この場合、ＡＪおよびＴＪは、２日間の培養内に形成しないか、または貧弱に形成した。
【００７９】
ヒト内皮デスメ膜のフラットなマウントのスライドを調製し、室温にて風乾し、直ちに室温にて４％のホルムアルデヒドで固定した。免疫染色に用いた切片をＰＢＳ中に再水和し、１５分間０.２％トリトンＸ−１００中でインキュベートした。各々５分間のＰＢＳでの３回の濯ぎ、２％ＢＳＡとプレインキュベーション後に３０分間の非特異的染色をブロックした後、切片を４℃で１６時間、抗Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびｐ１２０（全て１：５０にて）抗体とインキュベートした。１５分間ＰＢＳでの３回洗浄後、切片をテキサスレッドをコンジュゲートした２次抗体（１：１００のロバ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ）と６０分間インキュベートした。各１０分間の３回のさらなるＰＢＳ洗浄後、それらをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）で対比染色し、次いで、抗フェード溶液を組み込み、蛍光顕微鏡で分析した。
【００８０】
結果．ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＨＣＥＣは、１４日間の培養後にｐ１２０、ｐ１９０およびβ−カテニンのレベルを上昇させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣについてのｐ１２０のレベルは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣより４倍高く、これはＨＣＥＣ増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏにて禁止し得る。リアルタイムＰＣＲ結果はＲＴ−ＰＣＲからのものに同等であった。
【００８１】
【表３】
【００８２】
【表４】
【００８３】
また、Ｎ−カドヘリンおよびｐ１２０レベルを免疫染色により、第７、１４および２１日に培養したＨＣＥＣ中で細胞骨格（アクチンケーブル形成）の成熟と相関し、これは、それらの発現が、後期の密集でのＡＪのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟およびＡＪの安定化と相関することを示す。
【００８４】
第１に、Ｎ−、Ｅ−、ＶＥ−カドヘリン、ｐ１２０およびアクチン細胞骨格ケーブルを、内皮細胞を持つデスメ膜の平面封入調製によりｉｎ ｖｉｖｏにてＨＣＥＣ中で同定した。ｉｎ ｖｉｖｏのＨＣＥＣは、主として細胞−細胞境界にて環状のＮ−カドヘリンバンド、細胞質ゾル中で主に連続的な環状のＥ−カドヘリンバンド、および細胞質ゾル中の弱く不連続の環状のＶＥ−カドヘリンバンドを示した。Ｐ１２０は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣ中の細胞−細胞境界に密接する細胞質ゾル中で配置され、環状バンドを形成した。Ｆ−アクチンは隣接する細胞中のものから分離する個々の細胞中で高密度周辺バンド（ＤＰＢ）に配置された。
【００８５】
次に、Ｎ−カドヘリン、ｐ１２０およびアクチン細胞骨格ケーブルの染色パターンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中で同定し、Ｎ−カドヘリン染色はＢｒｄＵラベル化により増殖と相関して、ＨＣＥＣ中の環状のＮ−カドヘリンがｉｎ ｖｉｔｒｏにていつ決定されるか、およびＮ−カドヘリンが細胞有系分裂のブロックと関連するかどうかを決定した。第１の抗体がないｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣを陰性対照として用いた。
【００８６】
結果．第２１日でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣは、ｉｎ ｖｉｖｏのＨＣＥＣの局在および染色パターンに類似する主として細胞−細胞境界で環状のＮ−カドヘリンバンドを示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣの成熟を示す。第７日でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣは破断環状バンドを形成し、第１４日でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣは、細胞−細胞間結合にてＮ−カドヘリンの不完全な環状バンドを依然として示し、これは、これらの培養のステージにてＨＣＥＣが未成熟であることを示す。Ｐ１２０は、第２１日にてｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣにおいて内部細胞膜に配置され、環状バンドであり、これはそのＨＣＥＣが成熟していることを示す。第７および１４日にて、ｐ１２０は、主としてｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣの細胞質ゾルにあり、これは、それらの細胞が依然として未成熟であることを示した。ＢｒｄＵラベル化は、培養の第７日にてＨＣＥＣ増殖速度が第２１日のものより４０倍高いことを示した。
【００８７】
実施例５：ＡＲＰＥ−１９細胞系におけるノックダウンＲＮＡｉによるｐ１２０の一過性の下方調節
材料．ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハム／Ｆ１２培地、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０.２５％トリプシン／０.５３ｍＭ ＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。コラゲナーゼＡはＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。ヒドロコルチゾン、ジメチルスルホキシド、コレラ毒素およびインスリン・トランスフェリン亜セレン酸ナトリウム培地サプリメントをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＡＲＰＥ−１９細胞系はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＧｅｎｅＥｒａｓｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。ＲＮＡｅａｓｙ ＭｉｎｉキットはＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から得た。高容量逆転写キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ）およびリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から取り寄せた。モノクローナル抗−ＶＥ−カドヘリンおよびポリクローナル抗Ｅ−カドヘリン、抗Ｎ−カドヘリンおよびｐ１２０抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た。テキサスレッドをコンジュゲートしたロバ抗ウサギまたはマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）からのものであった。ＦＩＴＣをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。
【００８８】
ＡＲＰＥ−１９細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞を早期（４日間）および後期の密集（４週間、図３）まで培養した。
【００８９】
ＲＮＡｉは、Ｍｉｔｔａｌ Ｖ，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）５：３５５−３６５で公表されたＲＮＡｉ設計原理に従い選定した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢｌｏｃｋｉｔＴＭ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて、Ｄａｖｉｓ ＭＡ，Ｉｒｅｔｏｎ ＲＣ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＡＢ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００３）Ｎｏｖ １０；１６３（３）：５２５−３４に公開された２つのＲＮＡｉ配列に加えて２つのよりｐ１２０に特異的なＲＮＡｉ配列を設計した。ＢＬＡＳＴ検索を行い、選択したＲＮＡｉ配列がｐ１２０に特異的であることを保証した。ＲＮＡｉの標的とされた配列をリストする。
【００９０】
【表５】
【００９１】
無菌、室温、無血清、抗生物質を含まない５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をポリスチレンチューブに移し、その無血清培地に３μｌのＧｅｎｅＥｒａｓｅｒ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬を添加した。次いで、撹拌により完全に混合後、それを室温にて１５分間インキュベートした。次いで、この混合物に３.０μｌの１−μＭ ｐ１２０ ｓｉＲＮＡ試料を添加し、ピペット操作によってゆるやかに混合し、室温にて１５分間インキュベートした。最終のトランスフェクション混合物を２５０μｌの新鮮な血清添加培地中で培養された細胞を含む２４ウェル皿のウェルに滴下し、培養物をインキュベーター中で４８時間培養した後、ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲに付した。
【００９２】
結果．Ｐ１２０ ＲＮＡｉ １および３は最も有効であった。ＲＮＡｉ １および３の間の相乗作用は見られなかった。ノックダウンの効率は、早期の密集ＡＲＰＥ−１９細胞を用いて、９０〜９５％の高さであり；ｐ１２０ ＲＮＡｉの組合せは、いわゆる「オフ標的効果」により効率を増強しなかった。ノックダウンの効率は、後期のＡＲＰＥ−１９細胞を用いて、より低かった（７０〜７５％の高さ）（図３）。ｐ１２０ノックダウン後、Ｅ−およびＶＥ−カドヘリンは損失し、ｐ１９０を下方調節した（表６）。
【００９３】
【表６】
【００９４】
実施例６：ＨＣＥＣにおけるＲＮＡｉノックダウンによるｐ１２０の一過性下方調節
ヒト組織はヘルシンキ宣言に従い取扱った。ヒト供与者の眼からの８つの角強膜組織をＦｌｏｒｉｄａ Ｌｉｏｎｓ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ （Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から得た。それらの中央の角膜ボタンのいくつかを角膜移植に用いた。供与者の年齢は３〜６５歳の間であった。全組織は試験前１０日未満の間に貯蔵培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中に４℃で維持した。組織を５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１.２５ｍｇ／ｍＬアンフォテリシンＢを含有するＤＭＥＭで３回濯いだ。中央の角膜を８ｍｍの直径のトレフィンにより取り出した。その後、デスメ膜および角膜内皮細胞を解剖顕微鏡下、辺縁角強膜組織の後面から剥取り、５％ＦＢＳ、０.５％ジメチルスルホキシド、２ｎｇ／ｍＬマウスＥＧＦ、５μｇ／ｍＬインスリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬセレン、０.５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、１ｎＭコレラ毒素、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１.２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢを補足した等量のＨＲＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭおよびハムＦ１２で調製した補足されたホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）中の１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡで３７℃にて１６時間消化した。消化後、ＨＣＥＣは凝集物を形成し、凝集物を３分間２０００ｒｐｍでの遠心により集めて、消化溶液を除去した。凝集物はＳＨＥＭ培地中で３および１４日間培養した。
【００９５】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣの凝集物／パッチからのＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、溶解し抽出した。抽出したＲＮＡは高容量逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、逆転写した。ＡＪ成分の増幅は、特定のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＰＣＲにより行なった。ＰＣＲプロフィールは、９５℃で６分間の最初の変性に続いて、３５サイクルの９５℃での３０秒の変性、６０℃での１分間のアニーリングおよび７２℃での１分間の伸長から成った。リアルタイムＰＣＲでは、それは、９５℃での１０分間の最初の変性に続いて、４０サイクルの９５℃での３０秒の変性、６０℃での１分間のアニーリングおよび伸長よりなった。
【００９６】
Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡが出現した第２１日にて、ｐ１２０ノックダウン実験を行い、これは、ＡＪが成熟し、細胞が増殖しなかったことを示す。無菌、室温、無血清、抗生物質を含まない５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をポリスチレンチューブに移し、その無血清培地に３μｌのＧｅｎｅＥｒａｓｅｒ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬を添加した。次いで、撹拌により完全に混合後、室温にて１５分間インキュベートした。次いで、この混合物に３.０μｌの１−μＭ ｐ１２０ ｓｉＲＮＡ試料を添加し、ピペット操作によってゆるやかに混合し、室温にて１５分間インキュベートした。最終のトランスフェクション混合物を２５０μｌの新鮮な血清添加培地中で培養された細胞を含む２４ウェル皿のウェルに滴下し、培養物をインキュベーター中で４８時間培養した後、ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲに付して、ｐ１２０、ｐ１９０、Ｅ−、ｖＥ−、Ｎ−カドヘリンおよびβ−カテニンのＲＮＡ変化を検討した。スクランブルＲＮＡｉで処理した試料でｐ１２０、Ｎ−カドヘリンおよびＢｒｄＵ抗体での二重免疫染色／免疫組織化学を対照として用いた。
【００９７】
結果．ｉｎ ｖｉｔｒｏで３週間培養したＨＣＥＣにおけるノックダウンＰ１２０の結果、ｐ１２０、Ｅ−カドヘリンおよびＶＥ−カドヘリンの劇的な下方調節、ｐ１９０の軽度の低下を生じ、β−カテニンの有意な変化はなかった（表７および８）。加えて、ｐ１２０は、ＢｒｄＵの核染色により判断される細胞増殖を示した細胞の核に移行化した（図４）。
【００９８】
【表７】
【００９９】
【表８】
【０１００】
この発明は開示した具体例への参照で特に示され記載されたが、形態および詳細における種々の変形が、添付した特許請求の範囲により包含される発明の範囲から逸脱することなく本願明細書になし得ることは当業者により理解されるであろう。
【技術分野】
【０００１】
（政府支援）
本発明は、国立眼研究所のＳｃｈｅｆｆｅｒ Ｃ．Ｇ．Ｔｓｅｎｇへの助成番号ＲＯ１ ＥＹ０６８１９および助成番号ＲＯ１ ＥＹ０１５７３５により、全体的および部分的に支援された。米国政府は本願発明においてある種の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
目の重要な屈折要素の角膜は、眼球の多層の透明性で無血管の最も外側の部分である。ヒトが良好に見るためには、角膜の全ての層は透明のままでなければならない。角膜の層上のいずれの曇りまたは不透明な領域も、光の適切な屈折に干渉するであろう。角膜を含む連続層は、眼球表面から内向きに、上皮、ボウマン層、角膜実質、デスメ膜および内皮を含む。
【０００３】
角膜後面を裏打ちし前眼房に向く単層細胞であるヒト角膜内皮は、角膜実質の水和の調節、それ故に、透明性において極めて重要な役割を演じる。ヒト角膜内皮は、角膜の透明性を維持するために必要である、非常に重要な流体抽出あるいはポンプ機能を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
健康な眼において、眼流体は、内部から角膜実質にゆっくり通過し；次いで、過剰な水は角膜内皮によって眼の角膜実質から前眼房に送り込まれる。さらに、角膜におよび角膜の外に移動する流体の割合が、調和して維持されることが非常に重要である。内皮細胞のポンプ機能が減少すれば、角膜実質は膨張し、規則的なパターンの角膜実質のコラーゲンマトリックスは過剰な水によって損なわれるであろう。この結果、角膜実質はかすみ、結局不透明になるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
細胞と少なくとも１つの細胞−細胞間結合成分の発現を下方調節する剤とを接触させることを含む、接着結合（ＡＪ）を持つ細胞の増殖を刺激する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、細胞−細胞間結合成分はＡＪ蛋白質またはｐ１９０である。さらなる具体例において、ＡＪ蛋白質はカドヘリンである。まださらなる具体例において、カドヘリンは、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニン（以下、ｐ１２０と略記する）、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンから選択される。
【０００６】
１つの具体例において、ＡＪを持つ細胞は、例えば、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、角化細胞、外胚葉細胞または内胚葉細胞である。さらなる具体例において、内皮細胞は、例えば、ヒト角膜内皮細胞（以下に、本願明細書ではＨＣＥＣと略記する；本願明細書に用いたＨＣＥＣは、前眼房に向く角膜後面での単層細胞である）、管周囲内皮細胞、脳微細血管内皮細胞、血管内皮細胞、内皮前駆細胞、膣上皮細胞または他のいずれかのタイプの上皮細胞である。まださらなる具体例において、上皮細胞は、例えば、網膜色素上皮細胞、筋上皮細胞、羊膜上皮細胞、泌尿器上皮細胞、乳房上皮細胞、気管支上皮細胞、卵巣上皮細胞、肺胞上皮細胞または他のいずれかのタイプの内皮細胞である。まださらなる具体例において、ＡＪを持つ細胞はＨＣＥＣである。
【０００７】
１つの具体例において、剤は、内皮細胞と一過性に接触させる。さらなる具体例において、前記成分の下方調節はＲＮＡ干渉に起因する。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉は、ｐ１２０の発現を下方調節する。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。
【０００８】
１つの具体例において、細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、イヌ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコまたはウサギの体内のごときｉｎ ｖｉｖｏにて剤と接触させる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。さらなる具体例において、接触は哺乳動物の眼において生じる。まださらなる具体例において、哺乳動物の眼は、例えば、水疱性角膜症（無水晶体または偽水晶体の水疱性角膜症を含む）、角膜内皮細胞変性症（フックス変性症）、角膜浮腫、先天性遺伝的内皮変性症、または角膜内皮が損傷される他のいずれかの疾患のごとき、角膜内皮細胞機能障害を有する。まださらなる具体例において、剤は哺乳動物の眼の前眼房に投与される。まださらなる具体例において、剤は、眼の前眼房に直接的に投与される。
【０００９】
１つの具体例において、細胞はＨＣＥＣであって、剤は、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０および／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤である。
【００１０】
さらに、細胞と、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０および／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを接触させ；培地、例えば、成長因子および／または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含有する培地中に細胞を接種し；次いで、その細胞を培養して拡張されたＨＣＥＣを形成することを含む、培養においてＨＣＥＣを拡張する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、剤は、凝集または単層の形態におけるＨＣＥＣと一過性に接触させる。さらなる具体例において、前記成分の下方調節はＲＮＡ干渉に起因する。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉は、ｐ１２０の発現を下方調節する。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉のパルスは、少なくとも約１２時間持続する。まださらなる具体例において、ＨＣＥＣは、ＡＪが形成される凝集状態または単層である。
【００１１】
まださらなる具体例において、前記のＨＣＥＣを拡張する方法は、細胞と分裂促進成長因子とを接触させることを含む。分裂促進成長因子は、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦの他のファミリーのメンバー、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）またはインターロイキン１（ＩＬ−１）を含む。まださらなる具体例において、ＨＣＥＣの増殖が阻害でき、ＡＪ形成が細胞と細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることにより促進できるＨＣＥＣを拡張する方法。細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤の例は、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロスト、イロプロストまたは細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる他の剤を含む。１つの特定の具体例において、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤はコレラ毒素である。
【００１２】
さらに、デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ、次いで、消化後に溶液からＨＣＥＣの凝集物を分離することを含む角膜実質細胞からＨＣＥＣを単離する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、コラゲナーゼは、コラゲナーゼＡ、コラゲナーゼＢ、コラゲナーゼＤ、またはコラーゲン中で三重らせんペプチド結合を切断するいずれかの酵素である。もう一つの具体例において、デスメ膜は、少なくとも１つのＨＣＥＣ凝集物の単離のため、約１〜約１８時間、例えば、約１.５〜約１７時間、約５〜１７時間、約７〜約１７時間、約１０〜１６時間、約１２〜１６時間、約１〜約１８時間の他のいずれかの期間、コラゲナーゼを含む溶液と接触させる。１つの具体例において、ＨＣＥＣの凝集物はピペット操作によって消化後に溶液から分離できる。もう一つの具体例において、ＨＣＥＣの凝集物は遠心によって消化後に溶液から分離できる。まだもう一つの具体例において、ＨＣＥＣの凝集物は、消化後に、サイズに基づく細胞分画装置またはメッシュを介するふるいにより溶液から分離できる。
【００１３】
さらに、約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭ、例えば、約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭ、約０.８５ｍＭ〜約１.４ｍＭ、約０.９ｍＭ〜約１.３ｍＭ、約０.９５ｍＭ〜約１.２ｍＭ、約１.０ｍＭ〜約１.１ｍＭのカルシウムイオン濃度、または約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭの他のいずれかの濃度を有する無血清培地中でＨＣＥＣ凝集物を貯蔵することを含む、ＨＣＥＣ凝集物の生存度を保存および維持する方法が本願明細書に記載される。１つの具体例において、カルシウムイオン濃度は貯蔵培地中の約１.０８ｍＭである。さらなる具体例において、補足は無血清培地に提供される。
【００１４】
さらに、（ａ）コラゲナーゼを含む溶液を用いて角膜実質細胞から単離され、（ｂ）約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に所望により保存され、次いで（ｃ）ｐ１２０の発現を下方調節する剤と一過性に接触したＨＣＥＣ、ならびに生物学的適合性担体を含む外科移植片が本願明細書に記載される。１つの具体例において、ＨＣＥＣは、分裂促進成長因子とさらに接触させる。もう一つの具体例において、ＨＣＥＣのＡＪ形成は、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤との接触によってさらに促進される。まだもう一つの具体例において、ＨＣＥＣは生物学的適合性担体上に再接種される。生物学的適合性担体はＨＣＥＣ接着を促進し、透明性であり、角膜実質に統合できる。１つの具体例において、生物学的適合性担体はコラーゲン含有細胞間マトリックスである。もう一つの具体例において、生物学的適合性担体は羊膜である。さらなる具体例において、羊膜の厚みは減少させた。まださらなる具体例において、厚みの減少はエキシマーレーザー剥離によって達成された。まださらなる具体例において、剤は、凝集物または単層の形態におけるＨＣＥＣと一過性に接触させる。さらなる具体例において、ｐ１２０の発現を下方調節する剤はＲＮＡ干渉である。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ〜Ｆは、細胞凝集物として単離されたＨＣＥＣの例示的顕微鏡像である。
【図２Ａ】図２ＡはコラゲナーゼＡ消化から収集されたＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、高カルシウム無血清培地中での図２ＡからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、高カルシウム無血清培地中での図２ＡからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＳＨＥＭ中の図２Ｃに示すＨＣＥＣ凝集物をさらに培養することにより得られた無傷のヒト角膜内皮単層を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｅ】図２ＥはコラゲナーゼＡ消化から収集されたＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、低カルシウム無血清培地中での図２ＥからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｇ】図２Ｇは、低カルシウム無血清培地中での図２ＥからのＨＣＥＣ凝集物を示す例示的顕微鏡像である。
【図２Ｈ】図２Ｈは、低カルシウム無血清培地中で図２Ｇに示すＨＣＥＣ凝集物をさらに培養することにより生成された、散在した単一細胞を示す例示的顕微鏡像である。。
【図３】図３は、後期密集（４週間の培養）でのＡＲＰＥ−１９細胞系を用いるｐ１２０ ｍＲＮＡのリアルタイムＰＣＲ定量によるＲＮＡｉのノックダウン効率を示す例示的グラフである。
【図４】図４は、対照（ｓｃＲＮＡ）およびｐ１２０ ＲＮＡｉＩノックダウン培養を示す例示的写真であり、ＢｒｄＵの核染色により判断された増殖を示す細胞の各核へのｐ１２０の移行化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
添付した特許請求の範囲は、本願明細書に記載された特徴を特に示す。本開示の特徴および利点のより良好な理解は、本願明細書に記載された原理が利用される例示的具体例を記載する以下の詳細な記載への参照により得られるであろう。
【００１７】
角膜内皮細胞密度および内皮細胞機能は多数の疾患、外傷または老化の結果として減少しかねない。ウサギおよびウシのごとき他の種と異なり、ＨＣＥＣは、それらに限定され、ｉｎ ｖｉｖｏでの微々たる再生能および増殖能がよく知られている。損傷および破壊したＨＣＥＣは、個体によって再生されない。
【００１８】
ＨＣＥＣの破壊および／または機能障害は角膜浮腫または水疱性角膜症に進行し、次いで、それは視力喪失を生じなねない。ＨＣＥＣの悪化が生じる疾患の例はフックス変性としても知られる角膜内皮細胞変性症である。また、角膜内皮に対する外傷および損傷は、損傷、白内障手術または放射状角膜切開に起因しかねない。
【００１９】
すべての角膜移植の約３０パーセントは角膜内皮疾患のために行なわれる。現在、健康な角膜内皮を含む死体供与者角膜の全てまたは部分的な厚みの角膜移植は、損傷または疾患した角膜内皮による視界の損失の唯一の利用可能な療法である。しかしながら、角膜を置換組織として不適当にする感染性疾患リスクの増加および矯正的眼手術の広範囲の使用により、適当な供与者の不足が存在する。さらに、供与者組織として用いる角膜組織の長期間保存は未解決問題のままである。
【００２０】
変性症、外傷および外科的処置の発生によるｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣの損失を補充する主要な手段は、代償性の細胞の移入および拡張である。角膜の内皮細胞機能障害についての代替的療法として、細胞とＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを接触させることにより、ＨＣＥＣのごとき、分化の間にＡＪを形成し、かくして増殖の可能性を失う細胞の増殖を刺激する方法が、本願明細書に記載される。
【００２１】
さらに、ＨＣＥＣの増殖操作は、ｉｎ ｖｉｖｏでの療法およびｉｎ ｖｉｔｒｏでの組織設計のための戦略として、機能障害のＨＣＥＣを持つ眼を処置するためにＨＣＥＣを拡張するのを助けることができる。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのヒト角膜内皮を設計する能力は、角膜またはＨＣＥＣの外科的移植を有するという必要性を回避でき、かかる組織を角膜内皮不全に苦しむ眼における視力を回復するための代替的移植片として用い得るために、重要である。結果的に、分裂促進の刺激ならびに細胞質内ｃＡＭＰを上昇させ、ＡＪ再生成で分化を促進する剤で断続的に（パルス様式で）散在および混合した増殖の刺激によるＨＣＥＣの単離、貯蔵および拡張の方法、ならびに角膜内皮組織を置換するための新しい外科的移植片が本願明細書に記載される。
【００２２】
理論的には、有効な設計方法は３つの鍵となる工程：供与者角膜からのＨＣＥＣの単離、移植を可能とするための期間の単離されたＨＣＥＣの保存、ならびに移植に適した適当なｉｎ ｖｉｔｒｏ環境で単離されたＨＣＥＣの拡張を含むであろう。また、これらの各工程において、ＨＣＥＣは、ＡＪ形成および細胞増殖の間の均衡作用に影響し得る、細胞が曝露される培地によって影響されかねなかった。
【００２３】
ヒト角膜内皮の組織設計のための必要条件は、少数のＨＣＥＣからの有効な単離、貯蔵および拡張を保証することである。もう一つの必要条件は増殖（拡張）が、ＡＪ形成するＨＣＥＣ発現型の維持（回復）よりは正常なＨＣＥＣ発現型の損失と一体とならないことを保証することである。
【００２４】
単離方法
隣接する角膜実質の角膜実質細胞による汚染からＨＣＥＣを単離する方法が本願明細書に開示される。機械的に裸出されたデスメ膜はいくらかの角膜実質組織を含み、角膜実質細胞が存在する。従前の方法は、トリプシンの有無でのＥＤＴＡ、引き続いてトリプシン／ＥＤＴＡの有無によるディスパーゼ、トリプシンまたはＥＤＴＡに続いてのコラゲナーゼ、またはコラゲナーゼに続いてのトリプシンまたはＥＤＴＡを使用する。しかしながら、これらの方法は、マトリックスから細胞を剥離するのに必要とされる培養時間の延長、細胞傷害および収量の減少、または線維芽細胞（角膜実質細胞）汚染のために細胞変性に導いた。さらに、これらの方法は、かかる線維芽細胞（角膜実質細胞）汚染が発生するのを防止するためにさらなる選択培地の使用を必要とした。
【００２５】
本願明細書に開示された方法は、例えば、デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ、次いで、溶液からＨＣＥＣ凝集物を単離する工程を含む。例えば、デスメ膜は、接着ＨＣＥＣがその溶解された膜から剥離され、凝集物から排除される角膜実質細胞なくして溶液中で懸濁されたＨＣＥＣの少なくとも１つの凝集物を形成するのに十分な時間、ある濃度のコラゲナーゼを含む溶液において消化できる。コラゲナーゼ溶液における消化は、形成されたＨＣＥＣ凝集物が角膜実質細胞の汚染を回避するために別々の培養皿に移すことができるために、角膜実質から角膜実質細胞の汚染を除去するのを助ける。かかるＨＣＥＣ凝集物は、ｉｎ ｖｉｖｏ状態と同様に細胞マトリックス相互作用および細胞−細胞ＡＪを保持するであろう。
【００２６】
用いたコラゲナーゼは、例えば、コラゲナーゼＡ、コラゲナーゼＢ、コラゲナーゼＤ、またはコラーゲン中のペプチド結合を切断するいずれかの酵素で有り得る。溶液中のコラゲナーゼＡの濃度は、約０.５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０.７５ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約１.５ｍｇ／ｍｌ〜約２.０ｍｇ／ｍｌの範囲、または約０.５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌの他のいずれかの範囲であることができる。
【００２７】
角膜実質細胞からＨＣＥＣの少なくとも１つの凝集物を単離するための溶液は、補足ホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）のごときかかる細胞を培養するのに適当ないずれかの培地を含むことができる。培養基は、例えば、血清、抗生物質、成長因子または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤のごとき他の物質を補足できる。細胞質内ｃＡＭＰを上昇させるために用いることができる剤は、例えば、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよびジブチリルｃＡＭＰのごとき細胞膜浸透性ｃＡＭＰ類似物、およびホスホジエステラーゼ阻害薬のごとき他の細胞内ｃＡＭＰ上昇剤、例えば、イソブチル−メチルキサンチンおよびペントキシフィリン、ホルスコリンおよびコレラ毒素のごときアデニレートシクラーゼ賦活物質、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストのごとき外因性の剤、または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる他の剤を含む。１つの具体例において、培地は、等量のＨＥＰＥＳ緩衝されたＤＭＥＭおよびＨＡＭのＦ１２；５％ウシ胎仔血清；０.５％ジメチルスルホキシド；２ｎｇ／ｍｌマウス上皮成長因子；５μｇ／ｍＬインスリン；５μｇ／ｍｌトランスフェリン；５ｎｇ／ｍｌセレン；０.５μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン；１ｎＭコレラ毒素；５０μｇ／ｍｌゲンタマイシン；および１.２５μｇ／ｍｌアンフォテリシンＢを含む。
【００２８】
デスメ膜は、角膜実質細胞からの少なくとも１つのＨＣＥＣ凝集物の単離につき約１〜約１８時間、例えば、約１.５〜約１７時間、約５〜約１７時間、約７〜約１７時間、約１０〜約１６時間、約１２〜約１６時間または約１時間〜約１８時間の他のいずれかの期間、摂氏約３７度の温度で培養できる。ＨＣＥＣを単離するのに必要なコラゲナーゼ溶液における培養時間は、例えば、所望の消化の量、所望のＨＣＥＣ凝集物数、コラゲナーゼ溶液の濃度および／または消化されるべきデスメ膜のサイズに依存し、本願明細書に供された開示に基づいて、当業者により容易に決定できる。
【００２９】
デスメ膜の消化および角膜実質細胞からのＨＣＥＣ凝集物の単離に続いて、凝集物はピペット操作により溶液から集め、取り出すことができる。別法として、ＨＣＥＣ凝集物は、サイズに基づいた細胞分画装置またはメッシュを介して遠心またはふるいを含めた他の方法によって集めることができる。いずれの場合においても、収集は凝集物を分裂させずに生じさせるべきである。
【００３０】
保存／維持方法
前記の単離されたものを含めた単離されたＨＣＥＣ凝集物は、約３週間までまたはそれより長い間、無血清の高カルシウム濃度培地中で連続的に培養されれば円形球にさらに組織化でき、かかる保存されていた球は、発現型の六角形の形状でのＨＣＥＣの単層を与えることができた（図２Ｄ）。高カルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に凝集物を貯蔵することにより、ＨＣＥＣ凝集物の生存度を保存および維持する方法が本願明細書に開示される。
【００３１】
本願明細書に用いた高カルシウムイオン濃度は、貯蔵培地中で約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭカルシウム濃度、例えば、約０.８〜約１.５ｍＭ、約０.８５〜約１.４ｍＭ、約０.９〜約１.３ｍＭ、約０.９５〜約１.２ｍＭ、約１.０〜約１.１ｍＭ、または約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭの他のいずれかの濃度である。１つの具体例において、カルシウムイオン濃度は貯蔵培地中で約１.０８ｍＭである。
【００３２】
貯蔵培地は、カルシウム濃度が前記の基準を満たす限りは、ＨＣＥＣを貯蔵するのに適切ないずれの無血清培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２、またはＳＨＥＭに用いたＤＭＥＭおよびＦ１２の混合物でもあり得る。その培地において、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはフィブロネクチンを含めた他の血清因子が除去される限りは、分裂促進成長因子、抗生物質、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤、ＫＳＦＭサプリメントまたはＳＨＥＭサプリメントのごとき追加の成長サプリメントが添加できる。
【００３３】
一旦、ＨＣＥＣ凝集物が無血清の高カルシウム濃度貯蔵培地に入れられれば、それらは、例えば、約３週間またはそれより長く、例えば、摂氏約３７度の温度にて組織培養インキュベーター中で培養できる。凝集物は、後記のように、貯蔵培地中で浮遊凝集物として残り、例えば、血清含有培地中で引き続いての培養に用いることができる。さらに、ＨＣＥＣ凝集物の増殖は、後記のように刺激し得る。
【００３４】
拡張方法
細胞と、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０およびｐ１９０の発現を下方調節する剤とを接触させることを含む、分化の間にＡＪを形成し、増殖を中止させる増殖細胞を刺激する方法が本願明細書に開示される。例えば、単離され保存されたＨＣＥＣ凝集物の増殖または前記のＨＣＥＣ凝集物から誘導されたＨＣＥＣ単層の増殖は上記方法を用いて刺激できる。
【００３５】
理論によって拘束されることを望むことなく、ＨＣＥＣの細胞−細胞間結合の崩壊が、それらが拡張のために単層として広がるのを助け得ることが提案される。細胞−細胞接触は、ＡＪ、密着帯（ＴＪ）および接着斑を含む。これらの接触のうちＡＪは、細胞の増殖、連絡、特異性、細胞間接着の形成および維持の制御において特に重要である。ＡＪはカドヘリンおよびカテニンによって媒介されたアクチンベースの細胞間結合であり、カルシウム依存性細胞増殖および細胞−細胞接着を媒介する単一の膜貫通ドメイン糖タンパク質の別々のファミリーを表わす。ＡＪの鍵となるメンバーは、カドヘリン、α−カテニン、β−カテニンおよびｐ１２０を含む。カドヘリンファミリーには、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンがあり、その発現は細胞型に依存する。一般的には、カテニンは、Ｅ−カドヘリン、他のカドヘリンおよびアクチン細胞骨格とのそれらの相互作用に関連する細胞−細胞接着の調節において主な役割を有すると考えられる８０〜１０２キロダルトン蛋白質のファミリーである。ｐ１９０は、アクチン張力繊維力学を調節し、Ｆ−アクチンケーブルの限局性の接着およびミオシン媒介収縮の抑制により、細胞骨格力学の調節において役割を果たすＲｈｏＡファミリーＧＴＰアーゼ活性化蛋白質である。
【００３６】
ＨＣＥＣについては、鍵となるアドヘリンは、Ｅ−カドヘリンまたはＶＥ−カドヘリンではなくＮ−カドヘリンであり（それらは非常に少量で生成される）；また、本願明細書に記載したα−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０およびｐ１９０はＨＣＥＣ中に存在する。古典的には、細胞−細胞間結合は分化細胞の構造要素と見なされている。しかしながら、理論によって拘束されることを望むことなく、これらの細胞−細胞間結合成分の一過性の下方調節によりＨＣＥＣの有系分裂ブロックを解除することは、ＨＣＥＣの拡張を促進できる。かくして、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０およびｐ１９０は、ＨＣＥＣにおいて有系分裂のブロックを解除するための適切な標的である。
【００３７】
ＡＪを持つ細胞の増殖を刺激する従前の方法は、トリプシンのごとき酵素および／またはＥＤＴＡのごとき二価陽イオンのキレート化剤を使用した。しかしながら、トリプシン／ＥＤＴＡを使用する方法は、それが潜在的に有害であるために、ｉｎ ｖｉｖｏでの適用に有効に用いることができない。さらに、トリプシン／ＥＤＴＡは、周囲の細胞マトリックス相互作用を分離し、さらにＡＪの１以上の成分を標的とする。加えて、トリプシン／ＥＤＴＡはＨＣＥＣおよび隣接する角膜実質細胞を無差別に分離するであろう。細胞−細胞間結合および細胞マトリックス相互作用のかかる非特異性で広い分離後に、ＨＣＥＣは増殖するが、特にＩＬ−１およびｂＦＧＦのごとき成長因子による刺激下で、線維芽細胞に形質転換し、レトロ角膜と名付けられた病理学的状態を模倣する。
【００３８】
１つの具体例において、簡潔なＥＤＴＡ処理は、細胞−細胞接触によって媒介された有系分裂ブロックを放出することにより、ＨＣＥＣ凝集物の増殖を促進した（実施例３）。しかしながら、前記のごとく、かかる処理はヒト移植に不適当であるＨＣＥＣ細胞を生成し、細胞−細胞間結合および細胞マトリックス相互作用の非特異性でかつ広い分離を生じる。
【００３９】
もう一つの具体例において、ＡＪを持つ細胞の増殖は特定の細胞−細胞間結合成分を標的とすることにより刺激できる。細胞−細胞間結合成分をノックダウンして、増殖の可能性の損失と同時に、分化の間にＡＪを発現する細胞の有系分裂ブロックの解除を促進し得る。カドヘリンの例はＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリンおよびＰ−カドヘリンを含む。カテニンの例は、α−、β−、γ−カテニンおよびｐ１２０を含む。ノックダウンされるＲＮＡｉがｐ１２０であるならば、例えば、ｐ１２０ ＲＮＡｉ １またはｐ１２０ ＲＮＡｉ ３を用いることができる（表５）。ｐ１２０の下方調節は、ＡＲＰＥ−１９細胞（実施例５）につきＥ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびβ−カテニン、ならびにＨＣＥＣ（実施例６）につきＮ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびβ−カテニンの著しい下方調節で細胞−細胞間結合の溶解に導く。さらに、ｐ１２０はＨＣＥＣにおいて、細胞−細胞間結合から核に移動し、それは、ＢｒｄＵ（ＤＮＡ合成を示す標識）に対する核染色により判断されるような増殖を示す（図４）。カドヘリン（すなわち、ＨＣＥＣについてのＮ−カドヘリン）、α−カテニンおよびβ−カテニンは、細胞−細胞間結合が撹乱された場合に代謝的に不安定であるが、ｐ１２０はそうではない（実施例４、表３）ことが判明し、これはｐ１２０の標的化が特殊でかつより有効であることを示す。
【００４０】
もう一つの具体例において、ＡＪを持つ細胞の増殖はＲＮＡｉノックダウンによってｐ１２０を標的とすることにより刺激できる。ＲＮＡｉとは、細胞への二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入をいい、それは、相補的ｍＲＮＡの分解を引き起こし、それにより遺伝子発現を抑制する。公表されたＲＮＡｉ配列を用いて、ｐ１２０を下方調節し得、特定のＲＮＡｉ配列を、例えば、（ａ）所望のｍＲＮＡオープン・リーディング・フレームの異なった標的領域；（ｂ）Ｍｉｔｔａｌ Ｖ，Ｎａｔｕｒｅ（２００４） ５：３５５−３６５に公表されるようなＲＮＡｉデザイン原理；および、（ｃ）その所望のＲＮＡｉが特殊であることを確認するＢＬＡＳＴ検索を考えることによりＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢｌｏｃｋｉｔTM ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒに基づき設計できる。
【００４１】
ｉｎ ｖｉｖｏでの適用では、ＲＮＡｉをパルスで適用でき、例えば、ＲＮＡｉをある期間適用した後、回復させ、その時間中に、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤と一緒に分裂促進の刺激、または分裂促進の刺激に続いて細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含む培地が、ＲＮＡｉの次の適用前のある期間適用される。例えば、ＲＮＡｉは、約１２〜約７２時間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの他の時間に適用でき、回復または静止期間は、約１２〜約４８時間のいずれかの期間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの他の時間であり得る。１つの具体例において、ＲＮＡｉは２４時間の期間の間適用され、次いで、続いて、ＲＮＡｉの次のパルス適用が行なわれる前に、２４時間の回復および静止期間を行う。
【００４２】
１つの具体例において、細胞は、哺乳動物、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、サルまたはヒトの体内のごときｉｎ ｖｉｖｏにて剤と接触させる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。さらなる具体例において、接触は哺乳動物の眼において生じる。まださらなる具体例において、哺乳動物の眼は、例えば、水疱性角膜症（無水晶体または偽水晶体の水疱性角膜症を含む）、角膜内皮細胞変性症（フックス変性症）、角膜浮腫、先天性遺伝的内皮変性症、または角膜内皮が損傷されるいずれかの疾患のごとき角膜内皮細胞機能障害を有する。まださらなる具体例において、剤は哺乳動物の前眼房に投与される。
【００４３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ適用について、ＲＮＡｉは、パルスにて凝集または単層の形態のＨＣＥＣの培養に適用でき、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤と一緒に分裂促進の刺激を含有するまたは分裂促進の刺激に続いて細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含む培地の置換で分散もしくは混合でき、例えば、ＲＮＡｉはある時間適用され、次いで、ＲＮＡｉの次のパルス適用の前に細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤と一緒に分裂促進の刺激、または分裂促進の刺激に続いて細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を含む新鮮な培地で回復または静止期間適用される。例えば、ＲＮＡｉは、約１２〜約７２時間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの時間に適用でき、回復または静止期間は、約１２〜約４８時間、例えば、約１２時間、約１６時間、約２０時間、約２４時間、約２８時間、約３２時間、約３６時間、約４０時間、約４４時間、約４８時間、約５２時間、約５６時間、約６０時間、約６４時間、約６８時間、約７２時間または約１２〜約７２時間の間のいずれかの他の時間であることができる。回復または静止期間の間に適用された新鮮な培地は、補足ホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）のごとき、かかる細胞を培養するのに適当ないずれの培地でもよい。１つの具体例において、ＲＮＡｉは、ＥＧＦおよびｂＦＧＦのごときペプチド成長因子を、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤、例えば、コレラ毒素と一緒に、またはペプチド成長因子に続いて、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤を用いて、分裂促進の刺激を含む培地により交換する前に前記の時間の間適用し、ＲＮＡｉの次のパルス適用が行なわれる前に、２４時間または前記のいずれかの時間ＡＪ形成を促進する。
【００４４】
ＲＮＡｉが適用されるべきＨＣＥＣ培養は凝集物または単層の形態のいずれかであることができる。ＨＣＥＣ単層は早期密集（例えば、約１、約２、約３、約４、約５または約７日間の密集）または後期密集（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間の密集）のいずれでも有り得る。ＨＣＥＣ細胞のＲＮＡｉの一過性のトランスフェクション後に、トランスフェクション試薬は除去でき、細胞は前記のごとき細胞培養技術に従い継代および拡張して、特有の六角形のモザイク発現型を維持できる。
【００４５】
さらなる具体例において、ＨＣＥＣに適用された培地は、細胞質内ｃＡＭＰを上昇し得る剤で補足される。理論によって拘束されることを望むことなく、細胞質内ｃＡＭＰの上昇は、線維芽細胞への形質転換および特有のＨＣＥＣ発現型の損失のごとき、ＥＧＦまたはｂＦＧＦ、特にＩＬ−１およびｂＦＧＦのごとき分裂促進の成長因子によって引き起こされた、延長され持続的な増殖により引き起こされた望ましくない副作用を打ち消す。細胞質内ｃＡＭＰを上昇させるために用いることができる剤は、例えば、８−ブロモ−ｃＡＭＰおよびジブチリルｃＡＭＰのごとき細胞膜浸透性ｃＡＭＰ類似物、およびホスホジエステラーゼ阻害薬のごとき他の細胞内のｃＡＭＰを上昇させる剤、例えば、イソブチル−メチルキサンチンおよびペントキシフィリン、ホルスコリンまたはコレラ毒素のごときアデニレートシクラーゼ賦活物質、またはプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストのごとき外因性の剤、または細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる他の剤を含む。得られた細胞は、ヒトの移植に適当である。
【００４６】
外科移植片／治療方法
上記の調製されたＨＣＥＣは、適切な担体または支持の有無での組織、すなわち、外科用移植片として送達できる。（ａ）コラゲナーゼを含む溶液を用いて角膜実質細胞から単離され、（ｂ）約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中に所望により保存され、および（ｃ）ｐ１２０の発現を下方調節する剤と一過性に接触させたＨＣＥＣ、ならびに生物学的適合性担体を含む外科移植片が本願明細書に開示される。１つの具体例において、ＨＣＥＣは、分裂促進の成長因子とさらに接触させる。もう一つの具体例において、ＨＣＥＣのＡＪ形成は、細胞質内ｃＡＭＰを上昇させるための剤との接触によってさらに促進される。まだもう一つの具体例において、ＨＣＥＣが、生物学的適合性担体上に再接種される。生物学的適合性担体はＨＣＥＣ接着を促進し、透明性であって、角膜実質に統合できる。１つの具体例において、生物学的適合性担体はコラーゲン含有細胞間マトリックスである。もう一つの具体例において、生物学的適合性担体は羊膜である。さらなる具体例において、羊膜の厚みは減少させた。まださらなる具体例において、厚みの減少はエキシマーレーザー切除によって達成された。まださらなる具体例において、剤は、凝集物または単層の形態におけるＨＣＥＣと一過性に接触させる。さらなる具体例において、ｐ１２０の発現を下方調節する剤はＲＮＡ干渉である。まださらなる具体例において、剤は二本鎖ＲＮＡである。まださらなる具体例において、ＲＮＡ干渉はパルスで適用される。
【００４７】
かかる移植片についてのＨＣＥＣ源は、自己（同一個体から）または同種異型（異なる個体から）の源に由来し、角膜内皮疾患の患者を治療するために外科移植片として用いることができる。自家移植片は、移植者自身の組織、例えば、移植者の健全な眼から調製された移植片である。異種移植片は遺伝学的に同一でない個体間の組織の移植片である。異種移植片は、例えば、死体の眼または生体関連の個体から得られた組織から調製し得る。自家移植片は、従来の角膜移植において回避できない同種移植片拒絶を回避するという利点を与える。
【００４８】
加えて、上記の調製されたＨＣＥＣは、角膜実質または全角膜組織のごとき組織を設計または再生するために含むことができる。かかる設計された組織は、外科移植片として、および療法をテストする目的、または組織の機能を増強するための遺伝子治療と合わせるように用いることができる。また、本願明細書に記載された方法および組成物は、同一適用のための他の種に拡張し得る。
【００４９】
実施例
以下の特定の実施例は、単なる例示として構築され、何らその開示の残りに制限的でないものとして、解釈されるべきものである。さらなる詳述なくして、当業者ならば、本願明細書の記載に基づいて、その最も十分な範囲まで本発明を利用できると考える。これにより、本願明細書に引用された全ての刊行物をここに出典明示してその全てを本願明細書の一部とみなす。それに対する引用は、かかる情報の有効性および公の普及を証拠づける。
【００５０】
実施例１：ＨＣＥＣの単離
材料：ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハム／Ｆ１２培地、ケラチノサイト無血清培地（ＫＳＦＭ）、ＯｐｔｉＭＥＭ−１培地、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ウシ下垂体抽出物、ヒト組換え上皮成長因子（ｈ−ＥＧＦ）、０.２５％トリプシン／０.５３ｍＭ ＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ）、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。ディスパーゼＩＩおよびコラゲナーゼＡはＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。ヒドロコルチゾン、ジメチルスルホキシド、コレラ毒素、インスリン−トランスフェリン−亜セレン酸ナトリウム培地サプリメント、Ｌ−アスコルビン酸、コンドロイチン硫酸、ヨウ化プロピジウム、Ｈｏｅｃｈｓｔ−３３３４２色素、トリトンＸ−１００、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈ−ｂＦＧＦ）、パラホルムアルデヒドおよびＦＩＴＣ結合抗マウスＩｇＧは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ.Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。マウス抗−ＺＯ−１抗体およびタイプＩコラーゲンはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）から得た。マウス抗ラミニン５、ＩＶ型コラーゲンα２鎖、パールカンおよびコネクシン４３抗体は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）からであった。マウス抗ＩＶ型コラーゲンα１抗体はＫａｍｉｙａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）からであった。抗フェードマウンティング溶液はＶｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）からであった。マウス抗Ｋｉ６７抗体はＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）からであった。ＤｅａｄＥｎｄＴＭの蛍光測定ＴＵＮＥＬシステムはＰｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からであった。
【００５１】
ヒト組織はヘルシンキ宣言に従い取扱った。ヒト供与者の眼からの１８の角強膜組織をＦｌｏｒｉｄａ Ｌｉｏｎｓ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ（Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から得、それらの中央の角膜ボタンのうちのいくつかを角膜移植に用いた。供与者の年齢は１８〜６８歳（４１.４±１５.８歳）の間にあった。全ての組織を試験前の１０日未満の間ＯＰＴＩＳＯＬＲ（Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）培地中の４℃に維持した。組織を５０ｍｇ／ｍＬのゲンタマイシンおよび１.２５ｍｇ／ｍＬのアンフォテリシンＢを含むＤＭＥＭ培地で３回濯いだ。
【００５２】
中央の角膜を８ｍｍの直径のトレフィンにより取り出した。その後、デスメ膜ならびに角膜内皮細胞を解剖顕微鏡下で末梢性角強膜組織の後面から剥取り、ＳＨＥＭ培地中の２ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡで３７℃にて１.５〜１６時間消化し、そのＳＨＥＭ培地は、５％ＦＢＳ、０.５％ジメチルスルホキシド、２ｎｇ／ｍＬ マウスＥＧＦ、５μｇ／ｍＬ インスリン、５μｇ／ｍＬ トランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬ セレン、０.５μｇ／ｍＬ ヒドロコルチゾン、１ｎＭコレラ毒素、５０μｇ／ｍＬ ゲンタマイシンおよび１.２５μｇ／ｍＬ アンフォテリシンＢを補足した、等量のＨＥＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭおよびハムＦ１２で調製した。消化後、ＨＣＥＣは凝集物を形成し、それは消化溶液を除去するために２，０００ｒｐｍで３分間の遠心により集めた。また、対照として、デスメ膜ストリップを３時間までＳＨＥＭ培地およびトリプシン／ＥＤＴＡ中の１０ｍｇ／ｍｌディスパーゼＩＩにおいて消化した。
【００５３】
１.５時間のコラゲナーゼ消化は、デスメ膜から内皮細胞を分離し、裸出したデスメ膜を後に残して、緩い凝集物を形成するのに十分であった。３時間の消化後、コラゲナーゼ消化から誘導した内皮細胞凝集物はより緻密になった；しかしながら、デスメ膜はまだ溶解していなかった。１２時間の消化後、デスメ膜は完全に消化され、大部分のＨＣＥＣ凝集物は非常に緻密になった。これらのＨＣＥＣ凝集物において、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイおよびＴＵＮＥＬアッセイによって確認されるように、内皮細胞は高生存度を維持した。それらの少数の緩いままのＨＣＥＣ凝集物はより多くの死細胞を含むことが証明された。これらの結果に基づいて、発明者らは、１２時間の消化の結果、高い細胞生存率で緻密なＨＣＥＣ凝集物を生じると結論した。これらの緻密なＨＣＥＣ凝集物は、それらが細胞−細胞間結合を維持したために、内皮細胞の長期間保存を促進し得る。
【００５４】
結果． デスメ膜が角強膜環組織の末梢性角膜から外科的に取り出した後に、大部分のＨＣＥＣは依然としてデスメ膜に接着し、一方、いくらかの細胞を切り離し（破線および星印によりマークした）、細胞がない領域を創製した（図１Ａ）。ＳＨＥＭ中の３７℃での１.５時間のディスパーゼＩＩ消化後、、ＨＣＥＣは凝集し始めたが、依然としてデスメ膜から脱離しなかった（図１Ｂ）。
【００５５】
対照的に、裸出されたデスメ膜を１.５時間コラゲナーゼＡ中で消化した後、ＨＣＥＣをかなりのクラスタに凝集し、デスメ膜から完全に剥離し（図１Ｃ）、無傷のデスメ膜を後ろに残した。３時間後、コラゲナーゼＡ消化から誘導されたかかる凝集物はより緻密であった。しかしながら、細胞は依然としてデスメ膜から脱離しなく、ディスパーゼＩＩ消化後に分解し始めた（データを示さず）。顕著には、１６時間のコラゲナーゼＡ消化後、デスメ膜は溶解し、大部分のＨＣＥＣ凝集物は緻密であり、異なるサイズおよび形状を示したが（図１Ｄ）、ほとんどが緩みを示さなかった（図１Ｄ、１Ｅ、矢印）。
【００５６】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイは、緻密な凝集物が著しい緑色蛍光を示す生細胞よりなることを示した（図１Ｆ）。対照的に、緩められた凝集物は死細胞を含んでいた（図１Ｆ、矢印によってマークした）。図１Ｅは、図１Ｆの位相差顕微鏡写真である。棒は１００マイクロメートル（μｍ）を表す。発明者らは、これらの細胞が供与者角膜の保存の間に既に死んでいるかもしれなく、かくして、コラゲナーゼＡ消化の間に凝集を形成することができないと推測した。
【００５７】
細胞−細胞間結合および基底膜成分がコラゲナーゼＡ消化後に依然として維持されたかを調べるために、ＨＣＥＣ凝集物をＯＣＴに包埋し、凍結切片のために調製し、免疫染色に付した。結果は、その密着帯ＺＯ−１、ギャップ結合コネクシン−４３、ＩＶ型コラーゲンα１およびα２鎖としてのかかる基底膜成分、ラミニン５およびパールカンは全てＨＣＥＣ凝集物中に存在することを示した。
【００５８】
さらに、核対比染色は、凝集物中のＨＣＥＣが緻密であることを示した。ＴＵＮＥＬアッセイは、わずかなアポトーシスの細胞だけが凝集物の中心に存在することを確認した。
【００５９】
これらの基底膜成分がＨＣＥＣの生存度を維持するのを助けるかをさらに調べるために、コラゲナーゼ単離した凝集物を引き続いて、コラーゲンＩＶおよびラミニン５を除去できる発明者らが報告した処理の４℃での１６時間のディスパーゼＩＩ（ＳＨＥＭ中１０ｍｇ／ｍＬ）で処理した。結果は、生死アッセイにより判断されるように、さらなるディスパーゼＩＩ消化がＨＣＥＣ凝集物を分解させなく、中の細胞は依然として生きていることを示した。しかしながら、ディスパーゼ処理されたＨＣＥＣ凝集物は、ＳＨＥＭ中でプラスチックに容易に付着できなかったが、ディスパーゼ非処理の凝集物は付着できた。これらの結果は、細胞−細胞間結合が、細胞−マトリックス相互作用よりも、凝集物を形成し、ＨＣＥＣの細胞生存率を維持することにより重要な役割を果たすこともでき、基底膜マトリックス成分を凝集物中に残すことが、二次培養の間にプラスチック上でＨＣＥＣの細胞付着を促すことにおいて重要な役割を果たすこともできることを示した。
【００６０】
実施例２：単離したＨＣＥＣ凝集物の貯蔵
得られたＨＣＥＣ凝集物を、異なるサプリメント（表１）を含む無血清の低カルシウムまたは高カルシウム培地中に保存した。貯蔵培地１、ＫＳＦＭベースの培地のカルシウム濃度は、０.０８ミリモル（ｍＭ）であり、発明者らはそれを「低カルシウム」培地と定義した。貯蔵培地２、３およびすべての培地のカルシウム濃度は、ＤＭＥＭ．Ｆ１２の基本培地およびＦＢＳ中のカルシウムに基づいて、約１.０８ｍＭである。発明者らは、約１.０８ミリモル（ｍＭ）のカルシウム濃度を有する培地を「高カルシウム」培地と定義した。
【００６１】
ＨＣＥＣ凝集物は組織培養インキュベーターに約３７℃にて３週間まで貯蔵した。細胞生存率は、生死アッセイによって決定し、血清添加培地（表２）中でそれらを二次培養することにより評価した。
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
結果． 血清添加培地中で培養した場合、ＨＣＥＣ凝集物は、１２時間以内にプラスチック皿に急速に付着した。対照的に、無血清培地で培養した場合、それらは浮遊凝集物として残った（図２Ｃ、２Ｇ）。後者の条件において、浮遊凝集物は、１週間後に低カルシウム無血清培地（培地１）で徐々に分解した（図２Ｆ、２Ｇ）。
【００６４】
対照的に、ＨＣＥＣは、１週間後に高カルシウム無血清培地（培地２および３）の円形球に組織化され（図２Ｂ）、３週までの間緻密な円形球に組織化された（図２Ｃ）。第３週の終わりに、これらの凝集物は１２時間以内に付着し、ＳＨＥＭ中でプラスチック上で接種された場合に４日以内に無傷のヒト角膜内皮シートとして広がった（図２Ｄ）。しかしながら、低カルシウム無血清培地中に保存されたものは単一細胞をほとんど生成することができなかった（図２Ｈ）。棒線は１００μｍを表わす。
【００６５】
これらの結果は、コラゲナーゼ単離されたＨＣＥＣ凝集物を高カルシウム無血清培地中で少なくとも３週間保存でき、かかる保存された凝集物は依然として血清添加培地中の引き続いての培養につき高ＨＣＥＣ生存度を保持することを示した。
【００６６】
実施例３：トリプシン／ＥＤＴＡを用いる、単離されたＨＣＥＣ凝集物の拡張
次いで、消化直後または貯蔵培地中での保存期間後のいずれかで得られたＨＣＥＣ凝集物を、約３７℃の温度および５パーセント（５％）の二酸化炭素（ＣＯ２）下のプラスチック皿上の異なる培養培地（表２）中で培養した。培地を約２〜３日毎に交換した。いくつかのＨＣＥＣ凝集物を、前記の培養前に内皮細胞を単離するために３７℃で１０分間トリプシン／ＥＤＴＡで予め処理した。
【００６７】
ＨＣＥＣ凝集物をＯＣＴに包埋し、凍結薄切に付した。４マイクロメートル（μｍ）の凍結切片を室温（ＲＴ）で３０分間風乾し、次いで、−２０℃にて１０分間冷アセトン中で固定した。免疫染色に用いた切片をＰＢＳに再水和し、０.２％トリトンＸ−１００中で１０分間インキュベートした。各々５分間のＰＢＳでの３回の濯ぎ、および非特異的な染色をブロックするための２％ＢＳＡでのプレインキュベーション後に、切片を抗ラミニン５、ＩＶ型コラーゲンα１およびα２鎖、パールカン、ＺＯ−１およびコネクシン４３（全て１：１００）抗体と１時間インキュベートした。１５分間でのＰＢＳで３回洗浄後、切片をＦＩＴＣ結合第２抗体（１：１００のヤギ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ）と４５分間インキュベートした。
【００６８】
各１０分間の３回のさらなるＰＢＳ洗浄後に、それらをヨウ化プロピジウム（１：１０００）またはＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）で対比染色し、次いで、抗フェード溶液を乗せて、蛍光顕微鏡で分析した。２４ウェルプレートおよびチャンバースライド中で培養したＨＣＥＣを室温にて１５分間４％パラホルムアルデヒド中で固定し、前記の方法を用いて、抗−ＺＯ−１およびコネクシン４３抗体で染色した。
【００６９】
Ｋｉ６７の免疫組織化学染色では、内因性ペルオキシダーゼ活性を０.６％過酸化水素によって１０分間ブロックした。非特異的な染色は１％正常ヤギ血清によって３０分間ブロックした。次いで、細胞を抗Ｋｉ６７抗体（１：１００）と１時間インキュベートした。１５分間のＰＢＳでの３回の洗浄後、細胞をビオチン化したウサギ抗マウスＩｇＧ（１：１００）で３０分間に続いて、ＡＢＣ試薬で３０分間インキュベートした。反応生成物はＤＡＢで５分間展開し、光学顕微鏡で検討した。
【００７０】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイおよび終末のデオキシリボヌクレオチジルトランスフェラーゼを媒介としたＦＩＴＣ結合ｄＵＴＰニック末端ＤＮＡ標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを用いて、各々、細胞の生存率およびアポトーシスを決定した。ＨＣＥＣ凝集物を室温で１５分間ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイ試薬とインキュベートした。生細胞は、細胞−細胞質の緑色蛍光染色によって区別し、一方、死細胞は核中の赤色蛍光で染色した。ＴＵＮＥＬアッセイは製造者の指示に従い行った。略言すると、ＨＣＥＣ凝集物の断面は、室温にて２０分間４％ホルムアルデヒドに固定し、１％トリトンＸ−１００で透過処理した。次いで、試料を、ニックされた３’−ヒドロキシルＤＮＡ末端の修復のために外因性ＴｄＴおよびフルオレセイン結合ｄＵＴＰと３７℃にて６０分間インキュベートした。細胞を陽性対照としてＤＮａｓｅ Ｉで処理し、一方、陰性対照はｒＴｄＴ酵素を欠く緩衝液でインキュベートした。アポトーシスの核は、緑色蛍光で標識した。
【００７１】
結果．３７℃での１０分間のトリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理後、ＨＣＥＣ凝集物をより小さなクラスタおよび単一細胞に分離した。大部分の細胞は付着し、２４時間（以内に拡張し（図５Ｂ）、次いで４日後にパッチおよびシートに成長した。１週後、これらの細胞は密集に達し、発現型の六角形の形状を維持した。
【００７２】
免疫染色は、ｉｎ ｖｉｖｏ形態学の維持のためのマーカー：密着帯ＺＯ−１マーカー蛋白質およびギャップ結合コネクシン−４３マーカー蛋白質を発現した密集細胞を示した。これらの結果は、ＥＤＴＡ／トリプシンによるさらなる簡潔な消化の結果、単層へのＨＣＥＣの拡張が成功することを示した。
【００７３】
トリプシン／ＥＤＴＡの前記の簡潔な処理がＨＣＥＣ増殖を刺激するのに必要であったことをさらに確認するために、発明者らは、Ｇ０を除いて細胞周期のすべての相で発現されるＫｉ６７の免疫組織化学染色を行なった。トリプシン／ＥＤＴＡ処理なくしてプラスチックに直接的に接種したＨＣＥＣ凝集物は、ＳＨＥＭ中での１週間の培養後にシート様成長を生じた。しかしながら、Ｋｉ６７陽性の核を成長の周囲で単に時々観察した。また、対照的に、簡潔なトリプシン／ＥＤＴＡ処理後には、ＨＣＥＣ凝集物は、ＳＨＥＭ中でプラスチック上で接種したならば、密集細胞シートを生じるが、非常に多くの細胞は、ランダムに分配されたＫｉ６７陽性の核を示した。この結果は、トリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理が実際に細胞増殖を促進することを示した。
【００７４】
ＳＨＥＭ中の成長因子のさらなるサプリメントが有益であるかを決定するために、簡潔なトリプシン／ＥＤＴＡ処理の有無でのＨＣＥＣ凝集物を、１００μｇ／ｍＬ ＢＰＥ、２０ｎｇ／ｍＬ ＮＧＦまたは４０ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦの有無でのＳＨＥＭ中で１週間培養した。結果は、さらなるＢＰＥが、細胞のより多くの点在を刺激する結果、無傷のシートの損失を生じ、トリプシン／ＥＤＴＡで予め処理されるならば、この現象はより顕著になり、大部分の細胞は線維芽細胞の形状に変化することを示した。対照的に、さらなるＮＧＦは前記の劇的な細胞形状変化を生じなく、細胞は、依然としてトリプシン／ＥＤＴＡ処理の有無で無傷のシートを維持した。Ｋｉ６７染色は、ＳＨＥＭ中のＢＰＥまたはＮＧＦのいずれかの添加がトリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理の有無で少数のＫｉ６７陽性の核を与えることを明らかにした。ＢＰＥに比較した場合に、ｂＦＧＦをＳＨＥＭに添加した場合にも同様の結果を得た。
【００７５】
これらの結果は、簡潔なトリプシン／ＥＤＴＡ処理が、これらの４種の培養のすべてにおいてより多数のＫｉ６７陽性細胞を生じ、細胞増殖はＳＨＥＭ中のこれらの３種の成長サプリメントのいずれの添加によっても促進されなかったことを示した。ＳＨＥＭ中のＢＰＥまたはｂＦＧＦの添加の結果、六角形の発現型および細胞−細胞間結合形成を損失させ、これは、これらの各成長サプリメントが細胞の遊走または分化を増加させることを示唆した。しかしながら、全体的には、トリプシン／ＥＤＴＡ処理は不可逆性のＨＣＥＣ損傷を生じさせた。
【００７６】
実施例４：ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中の細胞−細胞間結合およびそれらの調節分子のｍＲＮＡ発現の決定
ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＡＪおよびＴＪならびにそれらの調節分子の発現、ならびに細胞の細胞骨格アクチンケーブルと増殖との相関を決定した。プラスチック上での１４日までのｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＡＪ／ＴＪおよびそれらの調節分子のｍＲＮＡ発現を、従来の逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって決定した。また、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＡＪの陽性発現した成分のｍＲＮＡ発現をリアルタイムＰＣＲによって決定した。
【００７７】
すべてのＰＣＲ断片は予期されたサイズであった。ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣは実質的レベルのＮ−カドヘリン（タイプＩＩ）、Ｅ−カドヘリン（タイプＩＩ）、ＶＥ−カドヘリン、ｐ−カドヘリン、ｐ１２０、ｐ１９０、Ｒａｃ１およびＲｈｏＡのｍＲＮＡを発現し、ｍＲＮＡレベルでのＥ−カドヘリン（タイプＩ）、Ｎ−カドヘリン（タイプＩ）、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニンおよびＺＯ−１を発現した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣは、１４日間の培養後に、Ｅ−（タイプＩおよびＩＩ）およびＰ−カドヘリンを除いて、同様のレベルの細胞−細胞間結合関連分子ｍＲＮＡを発現した。ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中のＮ−カドヘリン（タイプＩＩ）の早期回復は、Ｎ−カドヘリンがｐ１２０により補充および安定化したＡＪの形成の早期ステージに関与し得ることを示した。このステージでは、ｐ１２０は細胞質ゾルおよび核に広がり、転写因子として作用し得る。Ｎ−カドヘリンは、未成熟の兆候として結合から細胞質ゾルまで広がり得る。第２１日にて、Ｎ−カドヘリンは、細胞−細胞間結合の環状バンドを形成し、ｐ１２０は内部細胞膜で環状バンドを形成したが、Ｎ−カドヘリンおよびＶＥ−カドヘリンはＨＣＥＣの細胞質ゾルにあった。このパターンは、ｉｎ ｖｉｖｏで判明したものに似ている成熟パターンを表わす。
【００７８】
トリプシン／ＥＤＴＡの簡潔な処理は、ＶＥ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン（タイプＩＩ）、β−カテニンおよびＺＯ−１のかなりの下方調節によって証拠づけられるようなＡＪおよびＴＪの成分を最小に顕著に分離させた（表３）。この場合、ＡＪおよびＴＪは、２日間の培養内に形成しないか、または貧弱に形成した。
【００７９】
ヒト内皮デスメ膜のフラットなマウントのスライドを調製し、室温にて風乾し、直ちに室温にて４％のホルムアルデヒドで固定した。免疫染色に用いた切片をＰＢＳ中に再水和し、１５分間０.２％トリトンＸ−１００中でインキュベートした。各々５分間のＰＢＳでの３回の濯ぎ、２％ＢＳＡとプレインキュベーション後に３０分間の非特異的染色をブロックした後、切片を４℃で１６時間、抗Ｎ−カドヘリン、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリンおよびｐ１２０（全て１：５０にて）抗体とインキュベートした。１５分間ＰＢＳでの３回洗浄後、切片をテキサスレッドをコンジュゲートした２次抗体（１：１００のロバ抗ウサギまたは抗マウスＩｇＧ）と６０分間インキュベートした。各１０分間の３回のさらなるＰＢＳ洗浄後、それらをＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（１０μｇ／ｍＬ）で対比染色し、次いで、抗フェード溶液を組み込み、蛍光顕微鏡で分析した。
【００８０】
結果．ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したＨＣＥＣは、１４日間の培養後にｐ１２０、ｐ１９０およびβ−カテニンのレベルを上昇させた。ｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣについてのｐ１２０のレベルは、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣより４倍高く、これはＨＣＥＣ増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏにて禁止し得る。リアルタイムＰＣＲ結果はＲＴ−ＰＣＲからのものに同等であった。
【００８１】
【表３】
【００８２】
【表４】
【００８３】
また、Ｎ−カドヘリンおよびｐ１２０レベルを免疫染色により、第７、１４および２１日に培養したＨＣＥＣ中で細胞骨格（アクチンケーブル形成）の成熟と相関し、これは、それらの発現が、後期の密集でのＡＪのｉｎ ｖｉｔｒｏ成熟およびＡＪの安定化と相関することを示す。
【００８４】
第１に、Ｎ−、Ｅ−、ＶＥ−カドヘリン、ｐ１２０およびアクチン細胞骨格ケーブルを、内皮細胞を持つデスメ膜の平面封入調製によりｉｎ ｖｉｖｏにてＨＣＥＣ中で同定した。ｉｎ ｖｉｖｏのＨＣＥＣは、主として細胞−細胞境界にて環状のＮ−カドヘリンバンド、細胞質ゾル中で主に連続的な環状のＥ−カドヘリンバンド、および細胞質ゾル中の弱く不連続の環状のＶＥ−カドヘリンバンドを示した。Ｐ１２０は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＨＣＥＣ中の細胞−細胞境界に密接する細胞質ゾル中で配置され、環状バンドを形成した。Ｆ−アクチンは隣接する細胞中のものから分離する個々の細胞中で高密度周辺バンド（ＤＰＢ）に配置された。
【００８５】
次に、Ｎ−カドヘリン、ｐ１２０およびアクチン細胞骨格ケーブルの染色パターンを、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣ中で同定し、Ｎ−カドヘリン染色はＢｒｄＵラベル化により増殖と相関して、ＨＣＥＣ中の環状のＮ−カドヘリンがｉｎ ｖｉｔｒｏにていつ決定されるか、およびＮ−カドヘリンが細胞有系分裂のブロックと関連するかどうかを決定した。第１の抗体がないｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣを陰性対照として用いた。
【００８６】
結果．第２１日でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣは、ｉｎ ｖｉｖｏのＨＣＥＣの局在および染色パターンに類似する主として細胞−細胞境界で環状のＮ−カドヘリンバンドを示し、これは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣの成熟を示す。第７日でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣは破断環状バンドを形成し、第１４日でのｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣは、細胞−細胞間結合にてＮ−カドヘリンの不完全な環状バンドを依然として示し、これは、これらの培養のステージにてＨＣＥＣが未成熟であることを示す。Ｐ１２０は、第２１日にてｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣにおいて内部細胞膜に配置され、環状バンドであり、これはそのＨＣＥＣが成熟していることを示す。第７および１４日にて、ｐ１２０は、主としてｉｎ ｖｉｔｒｏのＨＣＥＣの細胞質ゾルにあり、これは、それらの細胞が依然として未成熟であることを示した。ＢｒｄＵラベル化は、培養の第７日にてＨＣＥＣ増殖速度が第２１日のものより４０倍高いことを示した。
【００８７】
実施例５：ＡＲＰＥ−１９細胞系におけるノックダウンＲＮＡｉによるｐ１２０の一過性の下方調節
材料．ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハム／Ｆ１２培地、ヒト上皮成長因子（ｈＥＧＦ）、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、アンフォテリシンＢ、ゲンタマイシン、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および０.２５％トリプシン／０.５３ｍＭ ＥＤＴＡ（トリプシン／ＥＤＴＡ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。コラゲナーゼＡはＲｏｃｈｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から得た。ヒドロコルチゾン、ジメチルスルホキシド、コレラ毒素およびインスリン・トランスフェリン亜セレン酸ナトリウム培地サプリメントをＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ＡＲＰＥ−１９細胞系はＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入した。ＧｅｎｅＥｒａｓｅｒＴＭ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。ＲＮＡｅａｓｙ ＭｉｎｉキットはＱｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）から得た。高容量逆転写キット（Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ）およびリアルタイムＰＣＲプライマーおよびプローブは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）から取り寄せた。モノクローナル抗−ＶＥ−カドヘリンおよびポリクローナル抗Ｅ−カドヘリン、抗Ｎ−カドヘリンおよびｐ１２０抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た。テキサスレッドをコンジュゲートしたロバ抗ウサギまたはマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）からのものであった。ＦＩＴＣをコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈからのものであった。
【００８８】
ＡＲＰＥ−１９細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１）＋１０％ＦＢＳ中で培養した。細胞を早期（４日間）および後期の密集（４週間、図３）まで培養した。
【００８９】
ＲＮＡｉは、Ｍｉｔｔａｌ Ｖ，Ｎａｔｕｒｅ（２００４）５：３５５−３６５で公表されたＲＮＡｉ設計原理に従い選定した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＢｌｏｃｋｉｔＴＭ ＲＮＡｉ Ｄｅｓｉｇｎｅｒを用いて、Ｄａｖｉｓ ＭＡ，Ｉｒｅｔｏｎ ＲＣ，Ｒｅｙｎｏｌｄｓ ＡＢ，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．（２００３）Ｎｏｖ １０；１６３（３）：５２５−３４に公開された２つのＲＮＡｉ配列に加えて２つのよりｐ１２０に特異的なＲＮＡｉ配列を設計した。ＢＬＡＳＴ検索を行い、選択したＲＮＡｉ配列がｐ１２０に特異的であることを保証した。ＲＮＡｉの標的とされた配列をリストする。
【００９０】
【表５】
【００９１】
無菌、室温、無血清、抗生物質を含まない５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をポリスチレンチューブに移し、その無血清培地に３μｌのＧｅｎｅＥｒａｓｅｒ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬を添加した。次いで、撹拌により完全に混合後、それを室温にて１５分間インキュベートした。次いで、この混合物に３.０μｌの１−μＭ ｐ１２０ ｓｉＲＮＡ試料を添加し、ピペット操作によってゆるやかに混合し、室温にて１５分間インキュベートした。最終のトランスフェクション混合物を２５０μｌの新鮮な血清添加培地中で培養された細胞を含む２４ウェル皿のウェルに滴下し、培養物をインキュベーター中で４８時間培養した後、ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲに付した。
【００９２】
結果．Ｐ１２０ ＲＮＡｉ １および３は最も有効であった。ＲＮＡｉ １および３の間の相乗作用は見られなかった。ノックダウンの効率は、早期の密集ＡＲＰＥ−１９細胞を用いて、９０〜９５％の高さであり；ｐ１２０ ＲＮＡｉの組合せは、いわゆる「オフ標的効果」により効率を増強しなかった。ノックダウンの効率は、後期のＡＲＰＥ−１９細胞を用いて、より低かった（７０〜７５％の高さ）（図３）。ｐ１２０ノックダウン後、Ｅ−およびＶＥ−カドヘリンは損失し、ｐ１９０を下方調節した（表６）。
【００９３】
【表６】
【００９４】
実施例６：ＨＣＥＣにおけるＲＮＡｉノックダウンによるｐ１２０の一過性下方調節
ヒト組織はヘルシンキ宣言に従い取扱った。ヒト供与者の眼からの８つの角強膜組織をＦｌｏｒｉｄａ Ｌｉｏｎｓ Ｅｙｅ Ｂａｎｋ （Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）から得た。それらの中央の角膜ボタンのいくつかを角膜移植に用いた。供与者の年齢は３〜６５歳の間であった。全組織は試験前１０日未満の間に貯蔵培地（Ｏｐｔｉｓｏｌ；Ｃｈｉｒｏｎ Ｖｉｓｉｏｎ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）中に４℃で維持した。組織を５０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１.２５ｍｇ／ｍＬアンフォテリシンＢを含有するＤＭＥＭで３回濯いだ。中央の角膜を８ｍｍの直径のトレフィンにより取り出した。その後、デスメ膜および角膜内皮細胞を解剖顕微鏡下、辺縁角強膜組織の後面から剥取り、５％ＦＢＳ、０.５％ジメチルスルホキシド、２ｎｇ／ｍＬマウスＥＧＦ、５μｇ／ｍＬインスリン、５μｇ／ｍＬトランスフェリン、５ｎｇ／ｍＬセレン、０.５μｇ／ｍＬヒドロコルチゾン、１ｎＭコレラ毒素、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシンおよび１.２５μｇ／ｍＬアンフォテリシンＢを補足した等量のＨＲＰＥＳ緩衝ＤＭＥＭおよびハムＦ１２で調製した補足されたホルモン上皮培地（ＳＨＥＭ）中の１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡで３７℃にて１６時間消化した。消化後、ＨＣＥＣは凝集物を形成し、凝集物を３分間２０００ｒｐｍでの遠心により集めて、消化溶液を除去した。凝集物はＳＨＥＭ培地中で３および１４日間培養した。
【００９５】
ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＨＣＥＣの凝集物／パッチからのＲＮＡをＲＮＡｅａｓｙミニ・キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、溶解し抽出した。抽出したＲＮＡは高容量逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、逆転写した。ＡＪ成分の増幅は、特定のプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼ（Ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＰＣＲにより行なった。ＰＣＲプロフィールは、９５℃で６分間の最初の変性に続いて、３５サイクルの９５℃での３０秒の変性、６０℃での１分間のアニーリングおよび７２℃での１分間の伸長から成った。リアルタイムＰＣＲでは、それは、９５℃での１０分間の最初の変性に続いて、４０サイクルの９５℃での３０秒の変性、６０℃での１分間のアニーリングおよび伸長よりなった。
【００９６】
Ｅ−カドヘリンｍＲＮＡが出現した第２１日にて、ｐ１２０ノックダウン実験を行い、これは、ＡＪが成熟し、細胞が増殖しなかったことを示す。無菌、室温、無血清、抗生物質を含まない５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をポリスチレンチューブに移し、その無血清培地に３μｌのＧｅｎｅＥｒａｓｅｒ ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬を添加した。次いで、撹拌により完全に混合後、室温にて１５分間インキュベートした。次いで、この混合物に３.０μｌの１−μＭ ｐ１２０ ｓｉＲＮＡ試料を添加し、ピペット操作によってゆるやかに混合し、室温にて１５分間インキュベートした。最終のトランスフェクション混合物を２５０μｌの新鮮な血清添加培地中で培養された細胞を含む２４ウェル皿のウェルに滴下し、培養物をインキュベーター中で４８時間培養した後、ＲＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲに付して、ｐ１２０、ｐ１９０、Ｅ−、ｖＥ−、Ｎ−カドヘリンおよびβ−カテニンのＲＮＡ変化を検討した。スクランブルＲＮＡｉで処理した試料でｐ１２０、Ｎ−カドヘリンおよびＢｒｄＵ抗体での二重免疫染色／免疫組織化学を対照として用いた。
【００９７】
結果．ｉｎ ｖｉｔｒｏで３週間培養したＨＣＥＣにおけるノックダウンＰ１２０の結果、ｐ１２０、Ｅ−カドヘリンおよびＶＥ−カドヘリンの劇的な下方調節、ｐ１９０の軽度の低下を生じ、β−カテニンの有意な変化はなかった（表７および８）。加えて、ｐ１２０は、ＢｒｄＵの核染色により判断される細胞増殖を示した細胞の核に移行化した（図４）。
【００９８】
【表７】
【００９９】
【表８】
【０１００】
この発明は開示した具体例への参照で特に示され記載されたが、形態および詳細における種々の変形が、添付した特許請求の範囲により包含される発明の範囲から逸脱することなく本願明細書になし得ることは当業者により理解されるであろう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニンおよび／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを一過性に接触させることを含むことを特徴とする接着結合を持つ細胞の増殖を刺激する方法。
【請求項２】
下方調節がＲＮＡ干渉に起因し、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ干渉がｐ１２０カテニンの発現を下方調節することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ干渉がパルスで適用されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡ干渉のパルスが少なくとも約１２時間続くことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
接触がｉｎ ｖｉｖｏで生じることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
接触が哺乳動物の眼において生じることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の眼が、角膜内皮細胞機能障害を有することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
剤を哺乳動物の前眼房に投与することをさらに含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
接着結合を持つ細胞が、ヒト角膜内皮細胞であって、剤が、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニンおよび／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤が、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストから選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１２】
細胞とＮ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニンおよび／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを一過性に接触させ；次いで、細胞を培養して、拡張したヒト角膜内皮細胞を形成するを含むことを特徴とする培養においてヒト角膜内皮細胞を拡張する方法。
【請求項１３】
下方調節がＲＮＡ干渉に起因し、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ干渉がｐ１２０カテニンの発現を下方調節することを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡ干渉がパルスで適用されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ干渉のパルスが少なくとも約１２時間続くことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒト角膜内皮細胞が、早期または後期の密集にて凝集物または単層の形態であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤が、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストから選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ；次いで、消化後に溶液からヒト角膜内皮細胞の少なくとも１つの凝集物を分離することを含むことを特徴とする角膜実質細胞からヒト角膜内皮細胞を単離する方法。
【請求項２０】
コラゲナーゼがコラゲナーゼＡであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
コラゲナーゼ接触が約１２〜約１６時間であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中でヒト角膜内皮細胞凝集物を貯蔵することを含むことを特徴とするヒト角膜内皮細胞凝集物の生存度を保存および維持する方法。
【請求項２３】
（ａ）コラゲナーゼを含む溶液を用いて、角膜実質細胞から単離され、（ｂ）約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中で所望により保存され、次いで（ｃ）ｐ１２０カテニンの発現を下方調節する剤と一過性に接触したヒト角膜内皮細胞；ならびに生物学的適合性担体を含む外科用移植片。
【請求項２４】
生物学的適合性担体が羊膜である請求項２３記載の外科用移植片。
【請求項２５】
下方調節がＲＮＡ干渉によって生じ、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることをさらに含む請求項２３記載の外科用移植片。
【請求項１】
細胞と、Ｅ−カドヘリン、ＶＥ−カドヘリン、Ｐ−カドヘリン、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニンおよび／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを一過性に接触させることを含むことを特徴とする接着結合を持つ細胞の増殖を刺激する方法。
【請求項２】
下方調節がＲＮＡ干渉に起因し、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
ＲＮＡ干渉がｐ１２０カテニンの発現を下方調節することを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＲＮＡ干渉がパルスで適用されることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
ＲＮＡ干渉のパルスが少なくとも約１２時間続くことを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
接触がｉｎ ｖｉｖｏで生じることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項７】
接触が哺乳動物の眼において生じることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項８】
哺乳動物の眼が、角膜内皮細胞機能障害を有することを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項９】
剤を哺乳動物の前眼房に投与することをさらに含むことを特徴とする請求項６記載の方法。
【請求項１０】
接着結合を持つ細胞が、ヒト角膜内皮細胞であって、剤が、Ｎ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニンおよび／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項１１】
細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤が、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストから選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項１２】
細胞とＮ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、ｐ１２０カテニンおよび／またはｐ１９０の発現を下方調節する剤とを一過性に接触させ；次いで、細胞を培養して、拡張したヒト角膜内皮細胞を形成するを含むことを特徴とする培養においてヒト角膜内皮細胞を拡張する方法。
【請求項１３】
下方調節がＲＮＡ干渉に起因し、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることをさらに含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ＲＮＡ干渉がｐ１２０カテニンの発現を下方調節することを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＲＮＡ干渉がパルスで適用されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
ＲＮＡ干渉のパルスが少なくとも約１２時間続くことを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ヒト角膜内皮細胞が、早期または後期の密集にて凝集物または単層の形態であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１８】
細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤が、８−ブロモ−ｃＡＭＰ、ジブチリルｃＡＭＰ、イソブチル−メチルキサンチン、ペントキシフィリン、ホルスコリン、コレラ毒素、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、フェニル酪酸、ブタプロストまたはイロプロストから選択されることを特徴とする請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
デスメ膜とコラゲナーゼを含む溶液とを接触させ；次いで、消化後に溶液からヒト角膜内皮細胞の少なくとも１つの凝集物を分離することを含むことを特徴とする角膜実質細胞からヒト角膜内皮細胞を単離する方法。
【請求項２０】
コラゲナーゼがコラゲナーゼＡであることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
コラゲナーゼ接触が約１２〜約１６時間であることを特徴とする請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中でヒト角膜内皮細胞凝集物を貯蔵することを含むことを特徴とするヒト角膜内皮細胞凝集物の生存度を保存および維持する方法。
【請求項２３】
（ａ）コラゲナーゼを含む溶液を用いて、角膜実質細胞から単離され、（ｂ）約０.８ｍＭ〜約１.５ｍＭのカルシウムイオン濃度を有する無血清培地中で所望により保存され、次いで（ｃ）ｐ１２０カテニンの発現を下方調節する剤と一過性に接触したヒト角膜内皮細胞；ならびに生物学的適合性担体を含む外科用移植片。
【請求項２４】
生物学的適合性担体が羊膜である請求項２３記載の外科用移植片。
【請求項２５】
下方調節がＲＮＡ干渉によって生じ、細胞と分裂促進の成長因子および細胞質内ｃＡＭＰを上昇させる剤とを接触させることをさらに含む請求項２３記載の外科用移植片。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公表番号】特表２０１０−５０５００１（Ｐ２０１０−５０５００１Ａ）
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５３０６０５（Ｐ２００９−５３０６０５）
【出願日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７９７５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０３１９１
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０９０８９７５３）ティシューテック・インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＳＳＵＥＴＥＣＨ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年２月１８日（２０１０．２．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０７９７５７
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１０３１９１
【国際公開日】平成２０年８月２８日（２００８．８．２８）
【出願人】（５０９０８９７５３）ティシューテック・インコーポレイテッド (1)
【氏名又は名称原語表記】ＴＩＳＳＵＥＴＥＣＨ， ＩＮＣ．
【Ｆターム（参考）】
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