新規な生物活性ペプチドおよびその新規な用途
新規なペプチド類が、医薬組成物としてのその使用と共に開示されている。医薬組成物の作製および個体の治療に対する方法も開示されている。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖ペプチドおよびその用途に関する。特に、本発明は、生物活性を有する短鎖ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、疾患の治療用に、および医薬組成物として公知である。例えば、米国特許第６１９１１１３号は、平滑筋細胞の増殖に対する阻害活性を有し、そのため動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄、および平滑筋肉腫などの、平滑筋細胞の増殖に関連する病理状態の予防および治療に有用であるペプチドを開示している。米国特許第６１８４２０８号は、上皮増殖帯の重量増加活性および毛髪成長などの生理過程を調節することが判明している別のペプチドを開示している。更に、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００６４９２号および米国特許出願第１０／２３７４０５号は、ある種のペプチドおよびその医薬組成物は、生物活性であり、免疫応答を調節することができると示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、短鎖ペプチドまたは生物活性を有するペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によるペプチドは、標準的な化学法によって個別に合成された。公知の動物法およびインビトロ法を用いて、こうしたペプチドの多様な機能を、以下に述べる次の各参考文献に記載の方法を用いて分析した。ペプチド名には、コード「ＣＭＳ」と、それに続く番号が与えられる。ペプチド配列および対応するＩＤ番号が、表１に示されている。合計７個の新規ペプチドが、インビボで生物活性を有すると特定し、配列番号の隣に星印で示した。その他残りのペプチドは、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ０３／００６４９２号で以前に報告されたが、新規で発明性のある新たな指示が、本発明において見出された。参照を容易にするために、第ＷＯ０３／００６４９２号に見出される配列に、同じ配列番号を与えた。
【０００５】
【表１】
【０００６】
したがって、本発明の一態様は、配列番号４、５、８〜１１と特定される配列を有する実質的に純粋なペプチドに関する。即ち、本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドにも関する。特定の実施形態では、該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【０００７】
より好ましい実施形態では、該ペプチドは、以下の状態、即ち肝グリコーゲン貯蔵、血中乳酸量、放射線療法誘発免疫不全症、Ｂ型肝炎感染症、皮膚移植拒絶、肝癌、胃癌、炎症、血中脂質、トリグリセリドおよび総コレステロール、免疫過敏症、Ｔリンパ球増殖、混合リンパ球増殖、肥満、ならびに体重過多の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【０００８】
本発明の別の態様は、配列番号４、５、８〜１１と特定される配列を有するペプチドの機能的誘導体である、実質的に純粋なペプチドに関する。即ち、本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列から本質的になる、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドにも関する。特定の実施形態では、機能的誘導体である該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【０００９】
本発明の別の態様は、配列番号４、５、８〜１１の１種を包含するペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１を包含するペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択された生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択された生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるペプチドに隣接して、リーダーペプチドを含有するハイブリッドペプチドに関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる生物活性ペプチドの機能的誘導体を含むペプチドに隣接して、リーダーペプチドを含有するハイブリッドペプチドにも関する。
【００１１】
本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列を含むペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。
【００１２】
特定の実施形態では、前記遺伝子ベクターのいずれかにおいて産生される該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物にも関する。
【００１４】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは外因性ペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝物質を有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になる外因性ペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物にも関する。本明細書で使用する場合の外因性ペプチドとは、非改変自然形態の当該微生物が通常発現する他の任意のペプチドとは異なる、アミノ酸配列を有するペプチドを指す。
【００１５】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは外因性ハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物にも関する。
【００１６】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列を含むペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含む外因性ハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含む外因性ハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物にも関する。
【００１７】
特定の実施形態では、前記微生物のいずれかにおいて産生される該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００１８】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだ、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。
【００１９】
本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む生物活性ペプチドの機能的誘導体を含んだ、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体から本質的になる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明は更に、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。
【００２０】
特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに存在する該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２１】
本発明のまた更なる態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法にも関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体である、アミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法である。
【００２３】
前記態様は更に、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法に関する。
【００２４】
前記方法のいずれかに関して、該ペプチドは、以下のもの、即ち免疫活性、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２５】
本発明のまた更なる態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドの医薬有効量をヒトに投与することを含む、ヒトの治療方法に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体である、アミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドの医薬有効量を投与することを含む、ヒトの治療方法にも関する。
【００２６】
特定の実施形態では、ヒトの治療に使用される前記ペプチドは、以下のヒトの状態、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節するために使用し得るが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２７】
前記核酸配列のいずれかに関して、こうした核酸配列から発現する該ペプチドおよび／またはハイブリッドペプチドは、以下のもの、即ち免疫活性、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２８】
更に別の態様では、本発明は、以下の状態、即ち個人の肝炎、疲労、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量および免疫反応の少なくとも１種を調節する医薬の製造において、配列番号１、２、１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドを使用することに関する。本発明は、配列番号１、２、１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することを含む、個人の肝炎、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量または免疫反応を調節する方法にも関する。
【００２９】
本発明は更に、以下の状態、即ち疲労、炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する医薬の製造において、配列番号３、７もしくは２１またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドを使用することにも関する。本発明は、配列番号３、７もしくは２１またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することを含む、個人における以下の状態、即ち疲労、炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する方法にも関する。
【００３０】
本発明の更なる態様は、配列番号４、５、８〜１１またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるペプチドを含有する栄養組成物、および栄養補助食品を製造するための前記組成物の使用を対象とする。
【００３１】
本発明の更なる態様では、配列番号４、５、８〜１１およびその機能的誘導体のペプチドの強化誘導体が提供される。こうしたペプチドの強化誘導体は、該ペプチドの治療有効性を強化または増強するように、こうしたペプチドに作動可能に連結した強化分子を含む。その強化作用は、延長作用、短縮作用、作用開始の遅延、作用開始の早期化、作用強度の増加、作用強度の減少、副作用の低下、１種または複数の作用創生、作用鎮静の遅延、作用鎮静の早期化、および個人内の個別局所への該ペプチドのターゲティングである場合がある。このような強化分子および強化誘導体の例は、以下に説明する。本発明の幾つかの態様では、強化分子は、ウィルス感染症および免疫障害を治療または予防できるが、治療または予防に限るわけではない。本発明の追加の態様には、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたペプチドを含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるペプチド、およびその誘導体の治療作用を強化する方法であって、治療作用を強化する分子に前記ペプチドを作動可能に連結することを含む方法が含まれる。本発明の幾つかの態様では、治療作用を強化する、作動可能に連結した前記分子は、天然のペプチドにおいて、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたペプチドおよびその誘導体に隣接したペプチドではない。
【００３２】
本発明の更なる態様では、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを含む組成物が提供される。
【００３３】
本発明の追加の態様では、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、生物活性ペプチドの医薬有効量の投与によって、ヒト疾患の作用を低下させる方法が提供される。幾つかの実施形態では、前記のヒトは、以下の状態、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種に罹っている。
【００３４】
本発明の更なる態様では、配列番号１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドを投与することを含む、ある状態を調節または治療する方法であって、前記状態が、個人の疲労、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量および免疫反応からなる群から選択される方法が提供される。
【００３５】
本発明の追加の態様では、配列番号１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人の肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量または免疫反応を調節する方法が提供される。
【００３６】
本発明のまた更なる態様では、肝炎治療用の医薬の製造において、配列番号２もしくは１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドが提供される。
【００３７】
本発明のまた更なる態様では、配列番号２もしくは１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人における肝炎を治療する方法が提供される。
【００３８】
本発明の追加の態様では、疲労軽減用の医薬の製造において、配列番号３またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の更なる態様では、配列番号３またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人における疲労を軽減する方法が提供される。
【００４０】
本発明のまた更なる態様では、以下の状態、即ち炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する医薬の製造において、配列番号２１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの使用が提供される。
【００４１】
本発明のまた更なる態様では、配列番号２１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することを含む、個人における以下の状態、即ち炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する方法が提供される。
【００４２】
本発明の更なる態様では、個人の免疫系を調節する医薬の製造において、配列番号７またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの使用が提供される。
【００４３】
本発明のまた更なる態様では、配列番号７またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人の免疫系を調節する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本明細書に記載のように、本明細書に記載のペプチドは、重要な生物活性を有することが見出された。該ペプチドは、Ｌ−アミノ酸から標準的合成法により容易に合成できるが、個々のペプチドをコードする配列を有する核酸を用いる遺伝子操作によっても合成し得る。引用した文献は全て、その全体を本明細書に組み込んである。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋なペプチド」とは、少なくとも４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは９０％超であるペプチドを指す。最も好ましい実施形態では、その純度は約９９％〜１００％である。実質的に純粋なペプチドは、以下に記載のように複雑な混合物となり得る医薬および栄養製剤の調製のために使用することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリッドペプチド」は、前記に特定した配列またはその機能的誘導体を有する本明細書に記載の元の生物活性ペプチド中に挿入された、追加のペプチドを含有するが、なお実質的に類似の活性を保持するペプチドを指すために使用される。追加の該ペプチドには、例えば、ハイブリッドタンパク質を細胞外部へ分泌するシグナルとして、１種または複数の原核または真核細胞により認識されるアミノ酸配列を含有するリーダーペプチドが含まれる。該分泌は、直接的分泌の場合も、分泌小胞を介した間接的な場合もある。
【００４７】
上述のように、本発明の別の実施形態は、本発明のペプチドから本質的になるペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用する場合、用語「から本質的になる」とは、カルボキシおよび／またはアミノ末端にある追加のアミノ酸と共に、本発明のペプチドのアミノ酸配列を含み、本明細書に示す本発明のペプチドの活性を維持している、ペプチドまたはポリペプチドを指す。したがって、非限定例として、本発明のペプチドの活性が免疫活性の調節である場合、本発明のペプチド「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドは、そのペプチドに関して本明細書に示すような、免疫活性の調節活性を保有し、しかも、該ペプチドまたはポリペプチドの免疫活性の調節能を著しく低下させる、あるいは免疫活性調節剤としての該ペプチドの基本的新規特性にとって著しい変化となる如何なる特性も保有することはなかろう。したがって、前記の例において、免疫活性の調節以外の主要活性を有し、しかも、その内部のどこかに本発明のペプチドのアミノ酸配列を含む全長天然ポリペプチドが、本発明のペプチド「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドを構成することはなかろう。同様に、前記の例において、免疫活性の調節以外の主要活性を有するが、その内部のどこかに本発明のペプチドのアミノ酸配列を含む、遺伝子操作したペプチドまたはポリペプチドが、本発明のペプチド「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドを構成することはなかろう。
【００４８】
好ましい実施形態では、用語「から本質的になる」とは、本発明のペプチドの１種以外に４個以下のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。より好ましい実施形態では、その同じ用語は、本発明のペプチドの１種以外に２個のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。最も好ましい実施形態では、その同じ用語は、本発明のペプチドの１種以外に１個のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００４９】
上記例示に使用した免疫活性の調節例の外に、前記定義は、このようなペプチドに与えられる活性に関して本発明の全てのペプチドにも適用される。特に、前記定義は、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の調節に活性を有する本発明のペプチドに適用される。
【００５０】
当業者であれば、以下に記すようなアッセイを用いて、あるペプチドまたはポリペプチドの活性を測定することにより、該ペプチドまたはポリペプチドが、前記定義に従って本発明のペプチドから本質的になるか否かを、容易に判定することができる。
【００５１】
当業者であれば、本発明の特定のペプチドに関して本明細書に示す、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲などの障害の調節に対するアッセイを用いて、あるペプチドまたはポリペプチドの活性を測定することにより、該ペプチドまたはポリペプチドが、前記定義に従って本発明のペプチドから本質的になるか否かを、容易に判定することができる。
【００５２】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合の用語「障害」とは、標準的方法で測定した際に正常範囲から外れる任意の体内の状態を指す。例えば、人間において、「脂質代謝障害」とは、標準的な医療診断試験で決定した場合、体内の脂質量のいずれかが、性別、身長および年齢に基づいてその特定者にとって正常範囲を超えている状態を指す。
【００５３】
該ペプチドは、適切な任意の経路によって投与し得る。投与経路の例は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、および皮下埋め込みを経由するものであり、リポソーム、持続放出用保護などのデリバリー促進具を用いる場合と用いない場合がある。したがって、本発明は、対象に該ペプチドを注射する用具を包含する。幾つかの実施形態では、該用具はシリンジの場合がある。該ペプチドは、任意の経口投与形態で投与してもよい。その例には、改変しない通常形態もしくは遅延放出形態とした、または胃腸保護の有無いずれの場合もある、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、ロゼンジなどが挙げられるが、それだけに限らない。更に、該ペプチドは、経皮促進具の有無いずれの場合もある、軟膏、クリーム、ゲルなどの任意の局所塗布形態で、または粉末吸入剤、溶解型もしくはリポソーム保護形態として適用してもよい。
【００５４】
本発明を実施する別法として、本明細書に記載の開示ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に追加のアミノ酸を付加することが可能となり得ることは理解されている。例えば、開示ペプチドにその生物学的機能に影響せずに、１個または２個のアミノ酸を付加し得る。３個または４個のアミノ酸を付加し、該ペプチドの機能をなお維持することも可能となり得る。これらのものは全て、同じペプチドの変異体と呼称される。あるいは、該ペプチドからその生物活性に影響せずに、１個または２個のアミノ酸を除去し得る。更に、該ペプチドの生物学的機能に影響せずに、３個または４個のアミノ酸を除去することも可能となり得る。これらのものは、当該ペプチドの断片と呼称される。更に、同じ機能群に属するアミノ酸１個を別のものに保存的に代替するというようなペプチドの誘導体を、本発明の別の態様を実施するために使用してもよい。例えば、非極性または疎水性側鎖を有するペプチドの１側鎖基を、生物活性を低下させずに別のものに置換することは可能となり得る。更なる一例として、リンカー／スペーサーを該ペプチドに挿入して変異体を形成し得るが、該変異体は、この研究に使用する元のペプチド同様、活性部分をなお保持し得る。これらのものも、該ペプチドの変異体と見なされる。本明細書で使用する場合のペプチド類縁体は、天然アミノ酸の構造を模倣したアミノ酸分子、例えば、異なる骨格構造またはＤ−アミノ酸置換の類縁体を有するペプチドを包含する。更なる一例として、該ペプチドの合成に使用されるアミノ酸はＬ光学異性体であるが、配列中のアミノ酸の１個または複数がＤ体で置換されたペプチドは、類似の生物活性を有し得る。特許請求の範囲で使用する場合の用語「機能的誘導体」は、該ペプチドの断片、変異体、類縁体または化学誘導体を包含することを意図している。
【００５５】
医薬製剤における前記ペプチドの使用は、免疫障害、癌、疲労、移植片拒絶などの本明細書に記載の障害に対する考え得る治療として採用し得る。該製剤は、他のペプチドを含めた、他の活性または不活性成分と混合される、特定した該ペプチドの１種を含有してもよい。あるいは、列挙した該ペプチドを使用して、列挙していないペプチドも有する製剤を調製してもよい。該製剤は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または皮内の形態で投与することができる。投与方式は、治療を要する器官に直接通じる動脈内注射でもよい。他の投与方式は、経皮、粉末または噴霧吸入、および当業者に公知の他のデリバリー形態である。該製剤は、経口投与をしてもよく、経口摂取後に該ペプチドの胃内消化を防止するために使用できる担体、または当技術分野で公知の他の任意の担体を含んでもよい。
【００５６】
該医薬製剤は、既知の医薬担体のいずれでも含み得る。適当な担体の例には、当業者に公知の医薬として許容可能な標準的担体のいずれもが含まれる。こうしたものには、それだけに限らないが、生理食塩水、水、油水混合物を含む乳濁液またはトリグリセリド乳濁液、ならびに他種の作用剤、充填剤、コート錠およびカプセルが挙げられる。適切な担体は、医薬組成物の投与方式に基づいて選択し得る。
【００５７】
本発明の更なる態様では、本明細書に記載のペプチドの強化誘導体およびその機能的誘導体が提供される。本発明の生物活性ペプチドは、生物学的に有効または有用な他の分子に結合することにより、追加の効果または用途をもたらし得る、あるいはその治療有効性を高め得る。多数の潜在的な結合用分子、その生物学的効果、および該分子のペプチドへの結合法が、当技術分野で公知である。例示的な結合用分子には、それだけに限らないが、有機化合物、炭水化物、糖類、多糖類、アミノ酸、アミノ酸ポリマー、ペプチド、ステロイド、タンパク質、タンパク質の単離ドメイン、脂質分子、脂肪酸、胆汁酸、ポリアミン、プロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。結合用分子の組合せも使用することができる。
【００５８】
本発明のペプチドの幾つかは、特定の細胞型または組織型に対して明確な治療効果を有する。分子をペプチド薬へ結合することの重要な一目的は、受療者の体内にある特定の部位または区画へのペプチドのターゲティングである。このようにして、ペプチド薬およびその効果を、所期の治療効果が及ぶ細胞型または組織型の部位に集中することができる。これによって、非結合型遊離ペプチドの同程度のモル量が示すと思われる効果を強化することができる。分子を結合することの他の目的には、例えば、ペプチド寿命の延長、ペプチド溶解度の変更、ペプチド活性の変更、およびペプチド生体利用度の変更を含めることができる。
【００５９】
当該ペプチドを結合相手に結合する化学反応は、過度に実験をすることなく、当業者が推測することができる。多様な結合技法が、例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Haas et al., Kidney Intl.,52(6):1693, 1997; Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3):275, 1997; Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61(4):459, 2001; Huang et al., Chem. Biol., 7(7):453, 2000; Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4):397, 1995; Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997; Kramer et al. J. Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994; Toth et al. (J.Med.Chem., 42(19):4010, 1999; Kim et al., (Biomaterials, 23:2311, 2002; Oldham et al. (Int. J. Oncology, 16:125, 2000およびFitzpatrick et al. Anticancer Drug Design, 10:1, 1995に記載されている。
【００６０】
遺伝子治療および治療法
発見したペプチド配列に基づく遺伝子治療は、こうしたペプチドの１種をコードする核酸配列の設計によって行うことができる。該核酸は、化学的に合成し、プロモーターに作動可能に連結し、更に発現ベクター中にクローニングし得る。次いで、該発現ベクターは、遺伝子治療の形態として、人体細胞中に発現させるために人体中に投与される。本明細書で使用する場合の用語「遺伝子ベクター」には、こうした発現ベクターが含まれる。遺伝子治療に使用できるベクターは、アデノ随伴ウィルス(Mizuno, M. et al. (1998), Jpn J Cancer Res 89, 76-80)、ＬＮＳＸベクター(Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) およびレンチウィルス(Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268)を包含するが、各開示内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６１】
ペプチドデリバリー用の他のビヒクルには、所望のペプチドをコードし、生物に移入することができ、該宿主生物の健康に目立った有害作用を及ぼさずに、該ペプチドの投与をすることが望ましい該宿主生物中で複製できる発現ベクターが含まれる。例えば、ペプチドの投与をすることが望ましい宿主生物に対して病原性のない発現ベクターを、その生物に移入し得る。幾つかの実施形態では、発現ベクターは、細菌または真菌生物中で所望のペプチドを産生し、該ペプチドを投与しようとする前記宿主生物の健康に目立った有害作用を及ぼさない。例えば、所望のペプチドをコードする発現ベクターは、乳酸菌、イー・コリまたは酵母などの生物中で所望のペプチドを産生する発現ベクターであってもよい。一実施形態では、該発現ベクターは、哺乳動物腸内に通常見出される微生物、または哺乳動物消化管が許容する微生物において、所望のペプチドを産生する。所望のペプチドが発現できる微生物種の一部には、それだけに限らないが、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．アミロボルス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．クリスパトゥス、Ｌ．ガリナルム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ジョンソニ、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．プランタルム、Ｌ．リューテリ、Ｌ．ラムノススなどのラクトバチルス種；Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アニマルス、Ｂ．ビフィドゥム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ラクティス、Ｂ．ロングムなどのビフィドバクテリウム種；エンテロコッカス・フェーカリスまたはＥｎｔ．ファシウム；スポロラクトバチルス・イヌリヌス；バチルス・ズブチリスまたはバチルス・セレウス；エシェリチア・コリ；プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ；あるいはサッカロミセス・セレビシエまたはサッカロミセス・ブーラルディが含まれる。
【００６２】
本発明のペプチドをコードし、化学的に合成されるか、または、それだけに限らないが、ｃＤＮＡ分子を産生するためのｍＲＮＡの逆転写を含む、他の手段により生成される核酸配列は、当業者に馴染みある遺伝子操作法によって、所望の生物に遺伝子移入するための発現ベクター中に組み込むことができる。該発現ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクターのいずれでもよい。例えば、該発現ベクターは、プラスミド性またはウィルス性遺伝要素に基づくことができる。該発現ベクターは、染色体外で複製するベクター、染色体中に組み込まれるベクターのいずれでもよい。
【００６３】
該発現ベクターは、本発明のペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。該プロモーターは、誘導プロモーターなどの調節可能なプロモーター、または構成プロモーターでもよい。幾つかの実施形態では、該プロモーターは、所望量のペプチド発現をもたらすように選択し得る。その上、所望であれば、該発現ベクターは、ペプチドの産生、提供および／または分泌を促進するために、他の配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸は、該ペプチドの分泌を指示する核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、本発明のペプチドをコードする該核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されていてもよい。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本発明のペプチドをコードするように操作される発現ベクターは、ラクトバチルス種およびバチルス・ズブチリスなどの哺乳動物の通常の腸内細菌相を構成する細菌種中に、本発明のペプチドを発現するように適合している発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターの例は、それぞれＣａｓａｓの米国特許第６１００３８８号およびＢｅｌｌｉｎｉの同第５７２８５７１号に見出すことができる。これらの文書は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている。ある生物中で本発明のペプチドの発現を促進し、該ペプチドを投与しようとする前記宿主生物の健康に有害ではない任意の発現ベクターが、使用し得ることは理解されよう。
【００６５】
幾つかの実施形態では、本発明のペプチドをコードするように操作される発現ベクターは、哺乳動物の腸管が十分に許容する酵母種、例えば、人体腸管にコロニーを形成し、ある種の下痢の治療に使用できるサッカロミセス・セレビシエ、または好ましくはサッカロミセス・ブーラルディ中に、本発明のペプチドを発現するように適合している発現ベクターであってもよい。異種のタンパク質およびペプチドを構成的に発現し、非常に安定であり、そのため有糸分裂および減数分裂中に子孫細胞に良好に継承され、更に、高度の組換えタンパク質分泌を指示する１種または複数のシグナルペプチドに対するコード配列を含み得る酵母発現ベクターは、使用することができる。このような酵母ベクターの例は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている、Ｊａｎｇ他の米国特許第６３９１５８５号に示されている。
【００６６】
本発明のペプチドをコードする発現ベクターは、当技術分野で公知の技法により、該ペプチドを発現させることを意図している生物中に導入してもよい。こうした技法には、例えば、化学的にコンピテントな細菌細胞、電気穿孔または酢酸リチウム形質転換（酵母に対して）の使用を介して細菌、酵母または他の微生物を形質転換する従来法、ならびにこうした手順が有効とは言えない細菌種の形質転換における最近の進歩が含まれる。幾つかの実施形態では、該発現ベクターは、その開示内容の全体が参照により本明細書に明確に組み込まれているＬｅｅｒ他（国際公開第９５／３５３８９号）により開示された方法を用いて、形質転換に抵抗性であることが知られている乳酸菌中に導入される。導入したその配列は、微生物の染色体ＤＮＡに組み込まれる場合も、染色体外ＤＮＡ要素として留まる場合もある。
【００６７】
次いで、該発現ベクターを含有するこの遺伝子操作微生物は、持続的免疫療法を実現するために、消化管、膣、気管などに接種することができる。幾つかの実施形態では、本発明のペプチドを発現する生物は、不活性型で、または好ましくは活性型で摂取される。腸内では、こうした微生物は、前記ペプチドを産生し、分泌または該微生物の溶解によって管腔中にそれを放出し、あるいは該ペプチドを宿主へ別法で提供し、それにより、該ペプチドは宿主生物に対して所期の効果を生じる。他の実施形態では、ペプチドは、宿主に対して鼻腔、膣または小腸の粘膜に提供される。
【００６８】
別の治療法は、人体細胞に特定の核酸をデリバリーする手段として、リポソームを使用することである。本明細書に記載のペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターなどの核酸は、Gao, X and Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722、およびその開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６２０７４５６号に記載のように、細胞取込みおよび染色体組込みを促進する環境においてデリバリーすることができる。あるいは、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６２４５４２７号に記載の方法を用いて、該ペプチド自体をリポソーム中に封入し、直接デリバリーすることができる。示した科学刊行物および特許は全て、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６９】
前記の遺伝子治療および治療法に有用な核酸配列は、こうしたペプチドをコードする配列およびその機能的誘導体を包含する。縮重コドン系に基づいてこれらのペプチドおよびその誘導体をコードするために、夥しい核酸配列のうちいずれか１種を使用してもよい。
【実施例１】
【００７０】
ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がマウスの運動誘発疲労に及ぼす効果
目的：ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がＢＡＬＢ／ｃマウスに及ぼす抗疲労効果の調査。
【００７１】
方法：ＢＡＬＢ／ｃマウスの消耗的水泳モデルを用いて、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８の抗疲労効果を観察した。ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８の投与後、消耗的水泳時間、肝グリコーゲン、血清尿素性窒素（ＢＵＮ）および血中乳酸量を観察した。ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８の考え得る抗疲労機構を調査するために、血清マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の各量も観察した。
【００７２】
結果：適切な濃度のＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、食塩水対照と比較して統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）、マウスの消耗的水泳時間を延長し、ＢＵＮ量を低下させ、肝グリコーゲン量を増加させ、血中乳酸の蓄積を減少させることができることが判明した。ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、食塩水対照と比較して統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）、消耗的運動中に血中ＭＤＡ量、ＡＬＴ量およびＡＳＴ量の上昇を抑え、ＳＯＤ活性を増加させることができることも判明した。
【００７３】
結論：ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、抗疲労性を有することが判明したので、疲労関連障害の管理に使用し得る。
【００７４】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
尿素性窒素試薬キット：Beckman Coulter, Inc., Fullerton, California, USA
アントラセンケトン試薬キット：Shanghai Fifth Union Laboratory, Shanghai, China, PRC
ＭＤＡおよびＳＯＤ試薬キット：Nanjing Jiancheng Bio-engineering Corporation, Nanjing, China, PRC
ＡＳＴおよびＡＬＴ試薬キット：Beijing Zhongsheng Bio-engineering High Technology Corporation, Beijing, PRC
【００７５】
１．２ 動物
特定病原体未感染（ＳＰＦ）等級で、体重１８〜２２ｇの雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスをAcademy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR Chinaから入手した。
【００７６】
マウスをＣＭＳ−００１群（２０μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日）、ＣＭＳ−００８群（５００μｇ／ｋｇ／日、１２５μｇ／ｋｇ／日）、および食塩水対照群に無作為に振り分けた。試験物質を腹腔内注射により１日１回、３０日間連続して投与した。試験物質の投与開始から１週間後、マウスを水温２５±１℃で１０分間水泳するように訓練した。
【００７７】
１．３ 実験装置
水泳槽（５０ｃｍ×５０ｃｍ×４０ｃｍ）
完全自動Biochemistry Analyser RA-1000
乳酸自動分析装置１５００ＳＰＯＲＴ
【００７８】
１．４ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がマウスの消耗的水泳時間に及ぼす効果［１］
最後の注射から３０分後、マウスの体重を測定し、体重の５％相当の鉛片を、体から約１ｃｍ離れたマウス尾部に巻きつけた。マウスを水深３０ｃｍ、温度２５±１℃の水泳槽に入れた。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。死亡するまでの水泳時間を記録した。
【００７９】
１．５ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動後の血清尿素性窒素量に及ぼす効果
最後の注射から３０分後、マウスを、水深３０ｃｍ、温度３０±１℃の水泳槽中でおもりを付けずに９０分間泳ぐように配置した。次いで、マウスを３０分間休ませ、血液を眼窩洞から採取した。血清を分離し、そのＢＵＮ量を完全自動Biochemistry Analyzerにより決定した。
【００８０】
１．６ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がマウスの肝グリコーゲン量に及ぼす効果［２］
最後の注射から３０分後、マウスを頚椎脱臼により屠殺した後、肝臓を切除し、食塩水で洗浄し、ろ紙で吸い取って乾燥した。肝臓約１００ｍｇを正確に秤量し、肝グリコーゲン量をアントラセンケトン試薬キットで決定した。
肝臓各１００ｇ中のグリコーゲン重量（ｍｇ）＝ＤＵ／ＤＳ×０．５×均質液容量／肝臓重量（ｇ）×１００×０．９
ＤＵ＝試料の吸光度
ＤＳ＝標準物の吸光度
均質液容量＝８ｍｌ
【００８１】
１．７ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動後のマウスの血中乳酸量に及ぼす効果［３］
最後の注射から３０分後、眼窩洞から先ず血液２０μｌを採取した。次いで、マウスの体重を測定し、体重の４％相当の鉛片を、体から約１ｃｍ離れたマウス尾部に巻きつけた。マウスを水深３０ｃｍ、温度３０±１℃の水泳槽で１０分間泳ぐように配置した。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。運動直後および２０分の休息後に、眼窩洞から再び血液２０μｌを採取した。血液を低張緩衝液４０μｌ中に添加し、その超音波処理をした。血液中の乳酸量を乳酸分析装置で決定した。
【００８２】
運動後の乳酸増加量は、運動直後の乳酸量から運動前の乳酸量を差し引いた量に基づいて計算される。
【００８３】
休息後の乳酸消失量は、運動直後の乳酸量から休息後の乳酸量を差し引いた量に基づいて計算された。
【００８４】
１．８ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が消耗的運動後の血清中ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＡＳＴおよびＡＬＴ量に及ぼす効果
最後の注射から３０分後、マウスを水深３０ｃｍ、温度２５±１℃の水泳槽でおもりを付けずに泳ぐように配置した。マウスが沈む初回時までに、マウスを救出し、直ちに眼窩洞から血液を採取した。血清を分離し、ＭＤＡ、ＳＯＤ、ＡＳＴおよびＡＬＴ量を決定した。
【００８５】
１．９ 統計的方法
群同士間の差異を分散分析ＡＮＯＶＡで分析した。
【００８６】
２ 結果
【００８７】
【表２】
【００８８】
【表３】
【００８９】
【表４】
【００９０】
【表５】
【００９１】
【表６】
【００９２】
結論
この試験は、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が以下の特性を有することを示した。
１．マウスの水泳時間を延長し、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が動物の運動能力を増強できることを示すこと［５］。
２．マウスのＢＵＮを減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が、運動中のエネルギー生成のためにタンパク質異化の必要性を減少させることができることを示すこと［６］。
３．休息中の動物の肝グリコーゲン蓄積量を増加させ、動物の運動能力を増強すること［６］。
４．運動後の血中乳酸量を減少させ、その後の乳酸消失速度を増加させて、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が、運動中の乳酸生成または乳酸消失の速度を減少させることができることを示すこと［７］。
５．ＭＤＡ量を減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動中のフリーラジカル生成を減少させることができることを示すこと［８］。
６．ＳＯＤ量を減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動中のフリーラジカル消失を増加させることができることを示すこと［８］。
７．ＡＬＴおよびＡＳＴ量を減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が、運動中の心臓および肝臓の細胞傷害を保護できることを示すこと。
８．ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、運動関連の疲労障害の管理に有用となり得ること。
【００９３】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Mizunoya W, Oyaizu S, Ishihara K, et al. Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 May; 66(5):1133-6.
2. HE Ling, WANG Ming, CHEN Run etc. The effect of blood lactic acid、blood serum carbamide nitrogen and liver hepatin affected by gen-seng. Prevent Medicine Literature Information, 2002, 8(3):293-294.
3. WANF Xiao-xue, QIU Juan, SONG Yu etc. Study on Effect of Theanine of Fatigue. China Commonality Sanitation Journal, 2002, 18(3):315-317.
4. Thomas D P，Marshall K I. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structure. Int J Sport Med，1988, (9):257-260.
5. JIN Zong-lian. Evaluation principle and method of function food. Beijing: Beijing University Publishing Company, 1995.
6. Sanitation ministry, Evaluation progress and test methods of health care food. Ministry of Public Health, PR China.
7. Westerblad, et al. Changes of intracellular pH due to repetitive stimulation of single fibers from mouse skeletal muscle. J Physiol; 1992 Apr; (499):49-71.
8. Groussard C, Rannou-Bekono F, Machefer G, et al. Changes in blood lipid peroxidation markers and antioxidants after a single sprint anaerobic exercise. Eur J Appl Physiol. 2003 Mar; 89(1):14-20.
【実施例２】
【００９４】
放射線療法誘発免疫低下マウスに対するＣＭＳ−００１の免疫調節効果
目的：放射線療法誘発免疫低下動物モデルに対するＣＭＳ−００１の免疫調節効果の観察。
【００９５】
方法：免疫低下動物モデルは、Ｃｓ１３７照射によって先ず準備した。次いで、ＣＭＳ−００１を適用した後、Ｔリンパ球増殖速度の変化をＭＴＴ法により分析した。
【００９６】
結果：２０μｇ／ｋｇ／日で、ＣＭＳ−００１は、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）をもってＴリンパ球の増殖速度を増加させることができることが判明した。
【００９７】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−００１：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
ハンクス液、ウシ胎児血清およびＲＰＭＩ−１６４０：Hyclone, Logan, Utah
ＣｏｎＡおよびＭＴＴ：Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
【００９８】
１．２ 実験条件
特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）で、体重１８〜２２ｇの雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスをAcademy of Military Medicines and Sciences experimental animal center, PR Chinaから入手した。
【００９９】
１．３ 動物モデルの調製、ＣＭＳ−００１の投与、およびＴリンパ球増殖速度の定量［１］
マウスをＣＭＳ−００１群（２０μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日）、食塩水対照群、および通常対照群に無作為に振り分けた。通常対照群を除く全てのマウスをＣｓ１３７の６００ｒａｄ（８２．８３ｒａｄ／分を７．２分間）に曝露した。試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、照射後１５日間連続して１日１回腹腔内に投与した。試験物質の最終投与の翌日、マウスの脾臓を無菌的に切除した。その脾臓を個々の細胞にばらし、洗浄し、細胞濃度をＲＰＭＩ−１６４０で４×１０６個／ｍｌに調節した。９６穴培養プレートに、１穴当たり細胞１００μｌおよびＣｏｎＡ１００μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌに）を添加した。ＣｏｎＡを含まない基準ブランク対照も調製した。その細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６８時間インキュベートした。Ｔリンパ球の増殖量をＭＴＴ法により決定した［２］。刺激指数を以下の通り算出した。刺激指数（ＳＩ）＝ＣｏｎＡ入り穴の平均ＯＤ値／基準ブランク穴の平均ＯＤ値。
【０１００】
２．結果
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
３．結論
ＣＭＳ−００１は、統計的有意性をもって、放射線誘発免疫低下マウスにおけるＴリンパ球増殖を刺激できることが判明し、ＣＭＳ−００１は、放射線療法後の免疫低下患者に対する免疫刺激剤として使用し得ることを示す。
【０１０３】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. New drugs (Western medicine) research direction principle before clinic. Chinese Sanitation Ministry Drug Political Situation. 1993, 7:128-137.
2. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003, 3(28).
【実施例３】
【０１０４】
マウスにおける皮膚同種移植片の生存に対するＣＭＳ−０１４の効果
目的：皮膚同種移植片モデルによるＣＭＳ−０１４の免疫抑制効果の調査。
【０１０５】
方法：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾部皮膚片をＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、皮膚移植片の平均生存期間（ＭＳＴ）を観察した。
【０１０６】
結果：ＣＭＳ−０１４は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、皮膚移植片の生存を延長できることが判明した。
【０１０７】
結論：ＣＭＳ−０１４は、臓器移植後の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤として使用し得る。
【０１０８】
１ 材料
１．１ 薬物および他の試薬
ＣＭＳ−０１４：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによりにより特注合成された。
サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）：Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland
食塩水：China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, PR China
Ｎａ２Ｓ：Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China
【０１０９】
１．２ 動物
受容動物：特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）の６週齢で、体重１８〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス：Military Medical Academy of Science, China
供与動物：ＳＰＦの６週齢で、体重１８〜２２ｇのＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス：Military Medical Academy of Science, China
【０１１０】
２ 群別および処理
２．１ 群別および試験物質投与
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣＭＳ−０１４群（５００μｇ／ｋｇ／日、２５０μｇ／ｋｇ／日、１２５μｇ／ｋｇ／日）、サイクロスポリンＡ群（１０ｍｇ／ｋｇ／日）、および食塩水対照群（０．５ｍｌ／日）に無作為に振り分けた。そのマウスの半数は雄性、半数は雌性であった。
【０１１１】
試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、５日間腹腔内に注射した後、皮膚移植を行い、更に皮膚移植片の拒絶の終点まで毎日注射をした。
【０１１２】
２．２ 皮膚移植
ＢＡＬＢ／ｃマウス背部の毛１パッチを８％Ｎａ２Ｓ溶液で除去した。翌日、その皮膚を外科的に除去することにより、約１ｃｍ２の創傷床を生成し、次いでその創傷床上に、同性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ供与マウスの全厚尾部皮膚片１ｃｍ２を載せた。その手術部位をパラフィンガーゼ層で被覆、保護した後、絆創膏を施した。移植から６日後に絆創膏を外し［１］、同種移植片の生存性について受容マウスを毎日監視した。拒絶の終点は、同種移植片の１０％未満だけがなお生存しているときに設定した［２］。
【０１１３】
２．３ 統計分析
統計分析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存検定で行った。
【０１１４】
３ 結果
【０１１５】
【表８】
【０１１６】
４ 結論
ＣＭＳ−０１４は、食塩水対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、皮膚同種移植片の生存を延長できることが判明した。ＣＭＳ−０１４は、臓器移植後の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤として使用し得る。
【０１１７】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
［１］ Ｍｉｎｇ Ｊｉａｎｋｕｏ， Ｗａｎｇ Ｘｉｎｇｂｉｎｇ， Ｈｕａｎｇ Ｂａｏｊｕｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｒｏｌｏｎｇｓ Ｓｋｉｎ Ａｌｌｏｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ Ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＣＸＣＲ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｇｒａｆｔ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００３， １７０：１５５６？１５６５．
［２］ Ｓｔｅｖｅｎ Ｈ． Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊｅｒｅｍｙ Ｇｒａｈａｍ， ｅｔ ａｌ． ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｅｌｉｃ， Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｌｏｃｕｓ−Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｏｒ Ｘｅｎｏ−， ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２０００； １６５：２３４１−２３５３．
【実施例４】
【０１１８】
Ｂ型肝炎ウィルスに対するインビトロでのＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３の抑制効果
実施例４ａ ヒト肝炎
試験ペプチドを２．２．１５細胞系の培地へ添加した。インキュベーション後、培地中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、およびＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ（ＨＢＶ−ＤＮＡ）の各濃度を決定し、対照と比較した。適切な濃度のペプチドＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３は、対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、インビトロで抗Ｂ型肝炎ウィルス活性を有することが判明した。これらのペプチドは、Ｂ型肝炎ウィルス感染の管理に使用し得ると結論される。
【０１１９】
１ 材料
ペプチドｃｍｓ−０１７およびｃｍｓ−０２３は、American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, California, USAにより（ｌ−アミノ酸源で）特注合成された。
【０１２０】
ヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡをトランスフェクトした２．２．２．１５細胞系は、国立薬物スクリーニングセンター（上海、中国）（第１試験）および北京大学付属の第一病院感染症科（第２試験）により供給された。
【０１２１】
細胞培養培地ＭＥＭは、GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA製であった。
【０１２２】
ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのアッセイ用Ｅｌｉｓａキットは、Shanghai Shiye Kehua Biotech. Company, Shanghai, PR China製であった。
【０１２３】
ＨＢＶ−ＤＮＡ定量用の蛍光定量ＰＣＲキットは、Zhongshan Medical University, Guangzhou, PR ChinaのＤＡ−ＡＮ遺伝子会社製であった。
【０１２４】
２ 方法
第１試験：最大無毒濃度でのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇに対するペプチドの抑制効果
対数増殖期の２．２．１５細胞を採集し、ＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｍｇ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌを含有）で２×１０６個／ｍｌに調節した。その懸濁液を２４穴培養プレート上に１．５ｍｌ／穴で接種し、付着させるために３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。１試料当たり並行穴３個を用いて、該ペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌに添加した。ブランク対照１組（穴３個）も調製したが、その場合ペプチドを培地に置き換えた。プレートを３７℃、４日間インキュベートし、次いで培地を調製直後の培地（元の培地と同じ組成）で交換し、プレートを更に４日間インキュベートした。インキュベーションの終了までに、培養物の上清を集め、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの力価を、検出キット製造業者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡ法で決定した。薬物の抑制率（％）は、以下のように算出した。
抑制率（％）＝（対照の平均濃度−試料の平均濃度）／対照の平均濃度×１００％
【０１２５】
第２試験：ＨＢＶ−ＤＮＡに対するペプチドの抑制効果
細胞懸濁液の調製およびインキュベーションを前記第１試験同様に繰り返したが、ペプチド濃度は１６０μｇ／ｍｌとした。インキュベーションの終了までに、上清を集め、ＨＢＶ−ＤＮＡ濃度を検出キット製造業者の使用説明書に従って蛍光定量ＰＣＲで決定した。
抑制率（％）＝（対照の平均ＤＮＡ濃度−試料の平均ＤＮＡ濃度）／対照の平均ＤＮＡ濃度×１００％
【０１２６】
統計
統計分析のためにステューデントのｔ検定を用いた。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【０１２７】
結果
【０１２８】
【表９】
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
結論
適切な濃度では、ＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３は、対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、インビトロでＢ型肝炎ウィルスの発生を抑制できることが判明した。これは、ＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３が、Ｂ型肝炎関連ウィルス感染の管理に使用し得ることを示す。
【０１３１】
実施例４ｂ インビボでのアヒルＢ型肝炎に対するＣＭＳ−０１７の抗ウィルス効果
目的：インビボでのアヒルＢ型肝炎ウィルス（ＤＨＢＶ）に対するＣＭＳ−０１７の抗ウィルス効果の調査。
【０１３２】
方法
食塩水に溶解したＣＭＳ−０１７を、筋肉内注射により２８日間ＣｈｏｎｇｑｉｎｇアヒルＢ型肝炎動物モデルへ投与した。ＤＨＢＶ ＤＮＡおよびＤＨＢｓＡｇ（アヒルＢ型肝炎表面抗原）の各血清量を、各々血清ドットブロットハイブリッド形成およびＥＬＩＳＡにより観察し、ブランク対照と比較した。
【０１３３】
結果
ＣＭＳ−０１７は、処置期間中にＤＨＢＶ ＤＮＡおよびＤＨＢｓＡｇの各血清量を低下させることができることが判明した（Ｐ＜０．０１）。７日間処置を中断しても、リバウンドを認めなかった。
【０１３４】
材料および方法
１ 動物モデル［２］
１日齢のＣｈｏｎｇｑｉｎｇアヒルの腹腔内にＤＨＢＶ ＤＮＡ陽性血清（５×１０７コピー／ｍｌ）０．１ｍｌを接種することにより、肝炎動物モデルを樹立した。接種から１０日後、血液試料を外頚静脈から採取し、ジゴキシ標識ＤＨＢＶ ＤＮＡプローブとのドットブロットハイブリッド形成［３］により、感染済みであることを確認した。アヒルを２週齢まで飼育して、試験に参加させた。
【０１３５】
２ 群別および投与
ＤＨＢＶ感染を確認したアヒルを以下の群に無作為に振り分けた。
１）対照群（ｎ＝１２）：生理食塩水を１日１回、１ｍｌ／日で筋肉内注射で投与
２）ＣＭＳ−０１７群（ｎ＝１２）：ＣＭＳ−０１７（生理食塩水１ｍｌに溶解）を１日１回、２００μｇ／ｋｇ／日で筋肉内注射で投与
【０１３６】
処置を４週間続け、観察は、処置終了後更に１週間続けた。血液試料１ｍｌを外頚静脈から、処置開始後０、７、１４、２１、２８および３５日に抜き取った。血清を分離し［４］、分析するまで−２０℃に保存した。
【０１３７】
３ 監視するパラメーター
１）ＤＨＢＶ ＤＮＡ血清量
ＤＨＢＶ ＤＮＡプローブは、製造業者（Roche Co.）の標識キット手順に従って蛍光標識をした。アヒル血清は、ニトロセルロース膜上にドットブロットし（２点／試料）、ＤＨＢＶ ＤＮＡの定量のために蛍光標識プローブとハイブリッド形成させた［３］。ＤＨＢＶ ＤＮＡ４０μｌ＋ＤＨＢｓＡｇ１００μｌを内部標準として使用した。CDP-Star蛍光測定試薬を蛍光増幅のために使用した。Vuego Scan (Brisa-620st)スキャナーを膜走査のために使用し、Discovery Series Quantity Oneソフトウェアをブロットの定量分析のために使用した。ブロット数値は「容量」（容量＝強度×ｍｍ２）として記述した。
【０１３８】
２）ＤＨＢｓＡｇ血清量
ＤＨＢｓＡｇ量は、ＥＬＩＳＡ法［５〜８］で決定し、ＯＤ値をＥＬＩＳＡリーダー（Bio-TEK Co.）により４９０ｎｍで得た。
【０１３９】
４ 統計分析
各群に対してＳＰＳＳソフトウェアを用いて、対応のあるｔ−検定を行った。
【０１４０】
結果
１．血清ＤＨＢＶ ＤＮＡ濃度の変化
【０１４１】
【表１１】
【０１４２】
２．血清ＤＨＢｓＡｇ量の変化
【０１４３】
【表１２】
【０１４４】
結論
適切な濃度では、ＣＭＳ−０１７は、食塩水対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、インビボで抗肝炎性を有することが判明した。ＣＭＳ−０１７は、ウィルス感染関連障害の管理に使用し得る。
【０１４５】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2):89-91.
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4):295-297.
3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1):13-15.
4. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Purification of Duck hepatitis B surface antigen and its applications. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 2001; 26(1):14-16.
5. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. A comparison of specifically immune response in DHBV-infected ducks. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(3):166-168.
6. Tang Ni, Huang Ailong, Qi Zhenyuan, et al. Immune response of acutely infected ducks to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Microbiology and Immunology 2000; 2(4):24-29.
7. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4):209-211.
8. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003,3 (28).
【実施例５】
【０１４６】
ヌードマウス移植ヒト胃癌ＢＧＣ−８２３異種移植片に対するＣＭＳ０２４−１６の抑制効果
１ 材料
２ 薬物および試薬
ＣＭＳ０２４−１６：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
５−Ｆｕ：Tianjin Jinyao Amino Acid Co., Tianjin, PR China
ウシ胎児血清：Hyclone, Logan, Utah
ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地：GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA
【０１４７】
１．２ 動物
特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）の４〜５週齢で、健常な雌性ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウス：Academy of Military Medical Sciences, China
【０１４８】
１．３ 細胞系
ヒト胃癌細胞系ＢＧＣ−８２３：Cancer Research Department, China Medical Science Institute
【０１４９】
２ 方法
２．１ 動物モデルの調製および抗腫瘍効果の決定［１］
対数増殖期のヒト胃癌細胞系ＢＧＣ−８２３を２×１０７個／ｍｌの濃度に調節し、次いでヌードマウスの背部皮下に接種した（０．１ｍｌ／マウス）。接種済み動物を、ＣＭＳ０２４−１６（１６０μｇ／ｋｇ／日、３２０μｇ／ｋｇ／日、および６４０μｇ／ｋｇ／日、全て０．２ｍｌ／日）、陽性対照（５−Ｆｕを０．２ｍｌ／日で２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ならびに陰性対照（生理食塩水、０．２ｍｌ／日）の各群に無作為に分けた。腹腔内注射による試験物質の投与は、腫瘍移植後の翌日に始めて毎日１回３０日間継続して行った。最後の注射後の翌日、腫瘍塊を採集し、その重量を測定した。抑制率＝（陰性対照の平均重量−試験群の平均重量）／（陰性対照の平均重量）×１００％
【０１５０】
２．２ 統計分析
データは平均値±ＳＤで表わした。統計分析のためにＳＰＳＳソフトウェアのＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意性ありと見なした。
【０１５１】
３．結果
【０１５２】
【表１３】
【０１５３】
４．結論
１６０〜６４０μｇ／ｋｇ／日の投与量のＣＭＳ０２４−１６は、生理食塩水群と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、ヌードマウス移植ヒト胃癌ＢＧＣ−８２３異種移植片の増殖を抑制できることが判明した。
【０１５４】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Li XH, Zhang GY, Luo FJ, Xu MH, Li Q. The effect of Helicobacter pylori on the expression of metallo proteinases in gastric carcinoma cell lines. World J Chinese Digestion, 2003, 11(5):544-546.
【実施例６】
【０１５５】
インビボでの肝癌Ｈ２２に対するペプチドの抑制効果
目的：マウスにおける肝癌Ｈ２２の増殖に対するペプチドの効果の調査。
【０１５６】
方法：ＢＡＬＢ／ｃマウスを食塩水対照、５−Ｆｕ、正常対照、ペプチドの各群に無作為に分けた。肝癌Ｈ２２細胞を腹腔内注入により移植し、試験物質も毎日１回腹腔内注射により投与した。マウスの生存期間を記録し、各対照と比較した。
【０１５７】
結果：８０μｇ／ｋｇ／日の投与量で、ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、ＣＭＳ０２４．１６は、食塩水対照群と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、Ｈ２２腫瘍細胞の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明した。
【０１５８】
結論：ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６は、肝癌Ｈ２２の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明し、これらのペプチドが癌の管理に使用し得ることを示した。
【０１５９】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
【０１６０】
５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）は、Tianjin Jinyao Aminophenol Ltd., Tianjin, China製であった。
【０１６１】
食塩水は、China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, China製であった。
【０１６２】
ＲＰＭＩ−１６４０およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA製であった。
【０１６３】
Ｄ−ハンクス液は、Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA製であった。
【０１６４】
１．２ 動物
健常ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＡ等級、６〜８週、体重１８〜２２ｇ）は、Animal Center of Military Medical Academy of Science, Beijing, Chinaから入手した。
【０１６５】
１．３ 細胞系
肝癌Ｈ２２細胞株を保持したマウスは、Tumor Department of Medical Institute of China Medical Academy of Science, Beijing, Chinaから入手した。
【０１６６】
１．４ 動物の群別
健常ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６（８０μｇ／ｋｇ／日）、５−Ｆｕ（２０ｍｇ／ｋｇ／日、２日毎に１回）、食塩水（０．２ｍｌ／日）、および正常群（腫瘍細胞を接種していない）の各群に無作為に分けた。
【０１６７】
１．５ 肝癌Ｈ２２マウスモデルの投与
６〜８日間肝癌を接種したマウスを屠殺した。腹水を採集し、細胞濃度をＤ−ハンクス液で５×１０７個／ｍｌに調整した。これを０．２ｍｌ、正常対照を除外して各ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に接種した。
【０１６８】
１．６ 試験物質の投与
試験物質の投与は、細胞接種後の翌日に開始した。該ペプチドおよび食塩水を毎日、５−ＦＵは２日毎に１回、６０日間連続して、またはマウスが死ぬまで投与した。
【０１６９】
１．７ 生存期間の記録
死亡時期を記録し、生存期間の延長を算出した。生存期間延長を以下のように算出した。
生存期間延長率（％）＝（試験群の平均生存日数）−（食塩水対照群の平均生存日数）／（食塩水群の平均生存日数）×１００％
６０日間を超えて生存したマウスを長期間生存マウスと見なした。
【０１７０】
１．８ 統計的方法
統計的比較のためにＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用い、０．０５以下のＰ値を統計的に有意性ありと見なした。
【０１７１】
２ 結果
実験は別々に２回行い、その結果は以下の通りである。
【０１７２】
【表１４】
【０１７３】
【表１５】
【０１７４】
３ 結論
ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６は、食塩水対照群と比較して統計的有意性をもって、Ｈ２２肝癌の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明し、これらのペプチドが癌の管理に使用し得ることを示した。
【０１７５】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Y Zhai and ZJ Lu. Effect of thalidomide on tumor growth in mouse hepatoma H22 model. Ai Zheng, Dec 2003; 22(12):1301-6.
[2] YX Yang, L Zhu, X He, et al. Antitumor activity of mitoxantrone-nanosphere against murine liver tumor H22. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, Jan 2004; 35(1):68-70.
【実施例７】
【０１７６】
ラットにおけるカラゲニン誘発足部腫脹に対するＣＭＳ−０３０の効果
目的：ＣＭＳ−０３０の抗炎症特性の調査。
【０１７７】
方法：カラゲニン誘発足部腫脹動物モデルを使用して、ＣＭＳ−０３０の抗炎症特性を調べた。
【０１７８】
結果：２〜２０μｇ／ｍｌの投与量で、ＣＭＳ−０３０は、統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、対照群と比較して処置群における足部腫脹を抑制できることが判明した。
【０１７９】
結論：ＣＭＳ−０３０は、カラゲニン誘発足部腫脹ラット動物モデルに対して、統計的に有意な抗炎症効果を有することが示された。
【０１８０】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−０３０：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
カラゲニン：Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
デキサメタゾン（ＤＸＭ）：Tianjin JinYao Co. Ltd., Tianjin, PR China
【０１８１】
１．２ 動物
６〜８週齢で体重１８０〜２２０ｇのウィスターラット、Vitalriver Experiment Animal Co. Ltd., Beijing, PR China
【０１８２】
１．３ 方法［１］
ウィスターラットをＤＸＭ群（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）、食塩水対照群（１ｍｌ／日）、および３投与量のＣＭＳ−０３０群（２、１０、２０μｇ／ｍｌ／日）に無作為に振り分けた。薬物は全て、食塩水で０．５ｍｌに希釈し、毎日腹腔内（ｉ．ｐ）に投与した。薬物投与から２週間後、１％カラゲニン食塩水０．１５ｍｌを皮下注射で右足に接種した。０．５時間後、右足の周囲長を精確に測定し、接種後の周囲長から接種前の周囲長を差し引くことにより、足部腫脹を算出した。抑制指数（％）＝（食塩水対照群の足部腫脹−薬物群の足部腫脹）／食塩水対照群の足部腫脹×１００％。
【０１８３】
１．４ 統計分析
一元配置ＡＮＯＶＡの分析を用いて統計分析を行った。
【０１８４】
２ 結果
【０１８５】
【表１６】
【０１８６】
結論
ラットにおけるカラゲニン誘発足部腫脹は、インビボでの急性炎症の確立された動物モデルであり、薬物の抗炎症効果の評価に使用された［２］。カラゲニンは、炎症部位にプロスタグランジンの過剰合成を誘発することができる。他の血管作用物質と共同して、過剰生成プロスタグランジンは局所的腫脹を誘発することになろう。ＣＭＳ−０３０は、統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、ラットにおいてカラゲニンが誘発した足部腫脹を抑制できることが判明した。したがって、ＣＭＳ−０３０は、抗炎症性を有することが示された。
【０１８７】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Li Jinhua, Zhang Huiqing, Zheng Kezhi, et al. Inhibitory effects of Orgotein on the swelling of hind paw in rats induced by carrageenin. Suzhou University Journal of Medical Science, 2002, Vol, 22(4):386-388.
[2] Huang Zhili, Kagoshima Masatoyo, Kagawa Eiichiro, Anti-inflammatory and ulcerogenic effects of 3-(N,N-diethylamino) propylindometacin HCl. Acta Pharmacologica Sinica, 1997, Vol, 18(4):306-308.
【実施例８】
【０１８８】
肥満に対するＣＭＳ−０３０の効果
目的：過食ラットを動物モデルとして用いたＣＭＳ−０３０の抗肥満効果の決定。
【０１８９】
方法：ラットに高栄養食事を６週間与えることにより、肥満モデルを開発した。次いで、そのラットを、ＣＭＳ−０３０（皮下に、１５０、３００および６００μｇ／ｋｇ／日の投与量）または食塩水で４週間処置した。ラットを１週につき１回体重測定し、実験終了時に屠殺して腹部および精巣の脂肪体ならびに血中脂質を測定した。
【０１９０】
結果：ＣＭＳ−０３０は、食塩水対照群と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、ラットにおける体重、脂肪体指数、血清トリグリセリド量、および血清総コレステロール量を減少させることができることが判明した。
【０１９１】
結論：ＣＭＳ−０３０は、抗肥満性を有し、食事誘発肥満障害の管理に使用し得る。
【０１９２】
材料および方法
１ 材料
１．１ 試験物質および動物
ＣＭＳ−０３０は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
特定病原体未感染等級で、体重１３５±１５ｇの雄性スプレイグ・ドーリー（ＳＤ）ラット：Experimental Animal Center of First Military Medical University
【０１９３】
１．２ 試薬キット
トリグリセリドキット：Shanghai Rongcheng Biotechnology Laboratory
血清総コレステロールキット：Zhongsheng Beikong Biotechnology Holding Ltd.
【０１９４】
２ 方法
高栄養および標準栄養食餌の処方は、State Food and Drug Administration, PR China (SFDA)刊行のGuideline for Pre-clinical Research of Anti-obesity Drug［１］ に従って作成した。
【０１９５】
肥満モデル［２］は、ラットに高栄養食事を６週間与えることにより樹立した。標準食事を与えたラットは、正常対照として使用した。次いで、肥満ラットをＣＭＳ−０３０（１５０、３００および６００μｇ／ｋｇ／日を毎日１回、皮下に）または食塩水で４週間処置した。試験物質での処置中には、全てのラットが標準食事を取った。ラットを週毎に体重測定し、実験終了時に屠殺して腹部および精巣の脂肪体、ならびに脾臓、肝臓、腎臓および胸腺の重量を測定した。血中脂質を分析するために、ラット血液も抜き取った。
【０１９６】
脂肪体指数は、脂肪体重量（ｇ）／体重（ｇ）×１０００として算出した。
【０１９７】
臓器指数は、臓器重量（ｇ）／体重（ｇ）×１０００として算出した。
【０１９８】
３ 統計分析
データは、平均値±標準偏差として提示してある。ソフトウェアＤＡＳ（Drug And Statistics Ver1.0）を用いた各群内または群同士間の比較に、対応のあるｔ−検定または単一因子ＡＮＯＶＡを適用した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意性ありと見なした。
【０１９９】
４ 結果
【０２００】
【表１７】
【０２０１】
【表１８】
【０２０２】
【表１９】
【０２０３】
【表２０】
【０２０４】
【表２１】
【０２０５】
結論
適切な投与量のＣＭＳ−０３０は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、栄養肥満ラットにおける体重減少を誘発し、各血中脂質量を低減できることが判明した。該物質の投与中に、食欲に有意な変化はなかった。ＣＭＳ−０３０は、栄養関連の肥満および脂質過多の管理に使用し得る。
【０２０６】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. SFDA, PR China. The guideline for pre-clinical research of new drugs. 1993. 193-194.
2. Bays HE. Current and investigational anti-obesity agents and obesity therapeutic treatment targets. Obes Res. 2004; 12 (8):1197-1211.
【実施例９】
【０２０７】
マウスにおける遅延過敏症に対するＣＭＳ−０３０の効果
目的：マウスにおける遅延過敏症（ＤＴＨ）に対するＣＭＳ−０３０の抑制効果の調査。
【０２０８】
方法：ＣＭＳ−０３０の免疫抑制効果を示すために、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）誘発耳腫脹を使用した。
【０２０９】
結果：１０μｇ／ｋｇ／日で、ＣＭＳ−０３０は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、マウスにおけるＤＮＦＢ誘発耳腫脹を抑制できることが判明した。
【０２１０】
結論：ＣＭＳ−０３０は、免疫抑制特性を有し、免疫関連障害の管理に有用となり得る。
【０２１１】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−０３０：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）：Smack Co. Ltd.
硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）：Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China
【０２１２】
１．２ 動物
特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）の６〜８週齢で、体重１８〜２２ｇのＢａｌｂ／ｃマウス：Military Medical Academy of Science, PR China
【０２１３】
１．３ 方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスを食塩水対照（０．５ｍｌ／日）およびＣＭＳ−０３０（１０μｇ／ｋｇ／日）の各群に無作為に分けた。試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、感作前の２週間、１日１回腹腔内に投与した。
【０２１４】
感作の前日、マウスの腹部を８％Ｎａ２Ｓ溶液で脱毛した。ＤＮＦＢをアセトン／オリーブ油（４：１）に溶解して１％の最終濃度とし、感作のためにその５０μｌを脱毛域に塗布した。初回感作から４日後、遅延過敏症性炎症を引き起こすために、１％ＤＮＦＢ溶液１０μｌを右耳に局所的に塗布した。ＤＮＦＢを含まない溶媒の同容量をベースラインとして左耳に塗布した。２４時間後、直径６ｍｍのパンチを用いて左右両耳の同一箇所から耳組織一片を採取し、その組織を正確に秤量した。左耳の組織重量を同一マウスの右耳の組織重量から差し引くことにより、耳腫脹を算出した［１］。抑制率（％）＝（食塩水対照の耳腫脹−試験群の耳腫脹）／食塩水対照の耳腫脹×１００％。
【０２１５】
１．４ 統計分析
統計分析は、ＳＰＳＳによる一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【０２１６】
２ 結果
【０２１７】
【表２２】
【０２１８】
３ 結論
ＣＭＳ−０３０は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、ＤＮＦＢに対するマウスの遅延過敏症反応を抑制できることが判明した。これは、ＣＭＳ−０３０が過敏症関連免疫障害の管理に使用し得ることを示した。
【０２１９】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Li Weidong, Ren LianSheng, Lin Zhibin, et al. Preliminary study on immunomodulating actions of Actarit in mice. Journal of Beijing Medical University, 2000, Vol, 1(32):1-3.
【実施例１０】
【０２２０】
インビボでのＣＭＳ−０３０の免疫抑制特性に関する試験
目的：ＣＭＳ−０３０の抗同種移植片拒絶特性の調査。
【０２２１】
方法：ＣＭＳ−０３０の免疫抑制特性は、インビトロでのＴリンパ球増殖および混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で観察した。同種移植片の生存に対するＣＭＳ−０３０の効果は、インビボでのマウスの皮膚および心筋同種移植片動物モデルについて観察した。移植片受容動物の形質転換したＴ細胞および脾臓細胞のＩＬ−２分泌に対するＣＭＳ−０３０の効果も、観察した。
【０２２２】
結論：ＣＭＳ−０３０は、抗同種移植片拒絶特性を有することが認められた。Ｔリンパ球活性およびリンパ球によるＩＬ−２分泌の抑制を介して、これを媒介し得る。
【０２２３】
１ 材料および方法
１．１ 動物
５週齢で、特定病原体未感染の雌性および雄性のＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｂ）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ−２ｄ）マウス：Institute for Laboratory Animals of Military Medical Academy of Science (Beijing, China)。雄性および雌性が半々。
【０２２４】
Ｃ５７ＢＬ／６新生児マウスは、自己飼育で得た。
【０２２５】
１．２ 薬物および他の試薬
ＣＭＳ−０３０：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
サイクロスポリン（ＣｓＡ）：Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland。ＣｓＡの全群に対して最終容量０．５ｍｌにして溶解。
ウシ血清、ＲＰＭＩ−１６４０、ハンクス液：GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA
ＭＴＴ、ＣｏｎＡ：Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
ＮａＳ：Tianjin Beilian Fine Chemicals Co., Ltd., Tianjin, PR China
マウスＩＬ−２ Ｅｌｉｓａキット：R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA
【０２２６】
１．３ 動物の群別
インビボ試験に対して、マウスを以下の各群に無作為に分けた。
ＣＭＳ−０３０（１０μｇ／ｋｇ／日）
ＣＭＳ−０３０（２μｇ／ｋｇ／日）
ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）
生理食塩水（０．５ｍｌ／日）
【０２２７】
各溶液は、移植前の５日間、１日１回腹腔内注射により投与し、手術後更に２０日間継続した。
【０２２８】
１．４ インビトロでのＴリンパ球増殖に対するＣＭＳ−０３０の効果［１］
健常Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓を無菌的に切除し、氷冷したＤ−ハンクス液に浸漬した。脾臓細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０中、つや消しスライドグラスで脾臓を破壊することにより調製した。その細胞をＲＰＭＩ−１６４０中、４℃および１２００ｒｐｍで１０分間、２回洗浄した。次いで、細胞数を計数し、各アッセイに必要な濃度に調整した。実験における細胞生存率は、トリパンブルー排除法で決定したが、９５％を超えるべきである。
【０２２９】
健常マウスの脾臓細胞は、９６穴プレート中で培養し、４×１０５個／穴の濃度に調整した。ＣＭＳ−０３０を最終濃度４０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１．６μｇ／ｍｌおよび０．３２μｇ／ｍｌで各穴に添加した。そのプレートを最終濃度５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の存在下、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中６８時間インキュベートした。陽性対照群には、ＣＭＳ−０３０を添加しなかった。陰性対照群には、ＣｏｎＡ、ＣＭＳ−０３０のいずれも添加しなかった。リンパ球の増殖は、インキュベーションの終了時に、臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）比色アッセイにより測定した。ＭＴＴを２０μｌ各穴に添加し、プレートを更に４時間インキュベートした。次いで、イソプロピルアルコール中の０．０４Ｍ ＨＣｌを１００μｌ各穴に添加することにより、ホルマザン沈殿を可溶化した。各試料のＯＤは、６３０ｎｍを基準とした５７０ｎｍで分光法で測定した。
【０２３０】
１．５ インビトロでの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対するＣＭＳ−０３０の効果［２］
健常Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を氷冷したＤ−ハンクス液で洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０中８×１０６個／穴へ再懸濁することにより、応答細胞を形成した。健常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓細胞懸濁液に、３７℃のＲＰＭＩ−１６４０中、５％ＣＯ２中で４５分間マイトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした後、ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、８×１０６個／穴へ再懸濁することにより、刺激細胞を形成した。試験群に対する９６穴培養プレートを用いて、応答細胞１００μｇおよび刺激細胞１００μｇ、更に最終濃度が４０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１．６μｇ／ｍｌまたは０．３２μｇ／ｍｌとなるように、ＣＭＳ−０３０を２０μｌ添加した。陽性対照群に対しては、応答細胞１００μｌ、刺激細胞１００μｌおよびＲＰＭＩ−１６４０を２０μｌ添加した。陰性対照群に対しては、刺激細胞２００μｌおよびＲＰＭＩ−１６４０を２０μｌ添加した。並行する６穴を各組合せに対して用いた。３７℃および５％ＣＯ２で５日間インキュベーションした後、リンパ球の増殖をＭＴＴ比色アッセイにより測定した。
【０２３１】
１．６ インビボでの心臓移植片の生存に対するＣＭＳ−０３０の効果［３］
２４時間齢新生児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから、供与心臓を切除した。その心臓をＤ−ハンクス液に浸漬し、心臓腔から血液を一掃した。その心臓を健常成体Ｂａｌｂ／ｃ受容マウスの耳介道に皮下移植した。心臓および該経路中の空気は、僅かな圧力で追い出した。移植後の６日目から開始して、移植心臓の心電図（ＥＣＧ）を毎日撮った。３日連続ＥＣＧ信号がなければ、移植術が失敗であることを示し、そのマウスを統計分析から除外した。ＥＣＧは毎日追跡し、拒絶時期をＥＣＧ信号が消えた日とした。試験物質は、手術の６日前から開始して腹腔内に投与した。１群につきマウスは１０匹であった。サイクロスポリンＡは１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＭＳ−０３０は１０μｇ／ｋｇ／日または２μｇ／ｋｇ／日、食塩水は０．５ｍｌ／ｋｇ／日を投与した。統計分析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの対数順位検定による食塩水処置群との比較を用いて行った。
【０２３２】
１．７ インビボでの皮膚同種移植片の生存に対するＣＭＳ−０３０の効果［４］
Ｂａｌｂ／ｃマウスの背部の毛１パッチを８％Ｎａ２Ｓ溶液により除去した。翌日、その皮膚を外科的に除去することにより、約１ｃｍ２の創傷床を生成し、次いでその創傷床上に、同性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ供与マウスの全厚尾部皮膚片１ｃｍ２を載せた。その手術部位をパラフィンガーゼ層で被覆、保護した後、絆創膏を施した。移植から８日後に絆創膏を外し、同種移植片の生存性について受容マウスを毎日監視した。拒絶の終点は、同種移植片の１０％未満だけがなお生存しているときに設定した。試験物質による腹腔内処置は、手術の６日前に開始した。１群につきマウスは１０匹であった。サイクロスポリンＡは１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＭＳ−０３０は１０μｇ／ｋｇ／日または２μｇ／ｋｇ／日、食塩水は０．５ｍｌ／ｋｇ／日を投与した。処置は、手術後更に２０日間継続した。
【０２３３】
１．８ インビボでのＴリンパ球増殖に対するＣＭＳ−０３０の効果［５］
皮膚移植片受容マウスの脾臓細胞を分離し、ＲＰＭＩ−１６４０中で４×１０６個／ｍｌに再懸濁した。細胞１００μｌ／穴を９６穴プレート中に添加した。試験穴に対しては、ＣｏｎＡ１００μｌを添加して最終濃度５μｇ／ｍｌとした。対照穴に対しては、ＲＰＭＩ−１６４０を１００μｌ代わりに添加した。１条件につき並行穴４個。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２で６８時間インキュベートした。リンパ球の増殖は、ＭＴＴ比色アッセイにより測定した。各試料のＯＤは、６３０ｎｍを基準とした５７０ｎｍで分光法で測定した。データは、試験群のＯＤを対照群のＯＤで割った刺激指数として表示した。
【０２３４】
１．９ インビボでのＩＬ−２量に対するＣＭＳ−０３０の効果［６］
皮膚移植片受容マウスの脾臓細胞を分離し、ＲＰＭＩ−１６４０中で２×１０６個／ｍｌに再懸濁した。細胞１．５ｍｌ／穴を２４穴プレート中に添加し、付着させるために２４時間インキュベートした。ＣｏｎＡ１００μｌを添加して最終濃度１０μｇ／ｍｌとした。細胞を更に４８時間インキュベートし、続いて遠心分離後に上清を採集した。培養上清中のＩＬ−２量をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２３５】
１．１０ 統計分析
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの対数順位検定による対照群との比較を用いて、同種移植片の生存期間の分析を行った。ステューデントの両側ｔ検定による平均値の分散との比較は、他の実験のために使用した。
【０２３６】
２ 結果
【０２３７】
【表２３】
【０２３８】
【表２４】
【０２３９】
【表２５】
【０２４０】
【表２６】
【０２４１】
【表２７】
【０２４２】
【表２８】
【０２４３】
結論
０．３２μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＭＳ−０３０は、インビトロでのＣｏｎＡ誘発Ｔリンパ球増殖を統計的に有意に抑制できることが判明し、ＣＭＳ−０３０がインビトロでＴリンパ球の増殖を抑制できることを示した。ＭＬＲは、異なるＨＬＡ−ＩＩ分子に対するリンパ球の応答を判定するためのインビトロ実験であり、臓器移植後の拒絶性を予測するモデルである［７］。１．６μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＭＳ−０３０は、混合リンパ球反応を統計的に有意に抑制できることが判明し、ＣＭＳ−０３０が臓器移植後の拒絶性を減少させることができることを示した。
【０２４４】
心臓移植片および皮膚同種移植片の実験は、移植後の拒絶を抑制する研究の動物モデルであった［７］。投与量２μｇ／ｋｇ／日および１０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ−０３０は、統計的有意性をもって移植片の生存を延長できることが判明し、ＣＭＳ−０３０が、宿主免疫応答による移植片の拒絶を抑制できることを示した。皮膚移植片受容マウスから分離した脾臓細胞の分析により、ＣＭＳ−０３０は、いずれも統計的有意性をもって、リンパ球の活性化およびＴリンパ球によるＩＬ−２分泌を抑制できることが明らかとなり、同種移植片の生存延長が、受容動物の免疫応答の抑制により実現されることを示した。
【０２４５】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
［１］ Ｒｏｍａ Ｋａｌｒａ， Ｓｈａｓｈｉ Ｐ． Ｓｉｎｇｈ， Ｊｕａｎ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ Ｐａｔｃｈ ｉｎ ａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ ２００４， ５６３？５６８．
［２］ Ｄｕｂｅｙ ＤＰ， Ｙｕｎｉｓ Ｉ， Ｙｕｎｉｓ ＥＪ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ： ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｌｙｓｉｓ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８６， ８４７−８４８．
［３］ Ｖａｋｅｖａ Ａ Ｌａｕｒｉｌａ Ｐ，Ｍｅｒｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， １９９３， １４３：６５．
［４］ Ｍｉｎｇ Ｊｉａｎｋｕｏ， Ｗａｎｇ Ｘｉｎｇｂｉｎｇ， Ｈｕａｎｇ Ｂａｏｊｕｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｒｏｌｏｎｇｓ Ｓｋｉｎ Ａｌｌｏｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ Ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＣＸＣＲ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｇｒａｆｔ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００３， １７０：１５５６？６５．
［５］ Ｍａｒｉａ Ａ． Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ， Ｍａｎｕｅｌ Ａ． ｄｅ Ｐａｂｌｏ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｌｉｐｉｄｓ ａｓ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２００２， ９：３５２−３５７．
［６］ Ｍａｙｕｍｉ Ｈ，Ｈｉｍｅｎｏ Ｋ，Ｓｈｉｎ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８５， １６９（２）：１４７−１６１．
［７］ Ｒｅｎｅ Ｊ．Ｄｕｑｕｅｓｎｏｙ Ｌｉ ＹＰ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２， １０：５−７．
【実施例１１】
【０２４６】
マウスの運動誘発疲労に対するペプチドの効果
目的：Ｂａｌｂ／ｃマウスに対するペプチドの抗疲労効果の調査。
【０２４７】
方法：雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスの水泳時間をペプチドの抗疲労効果を調べる動物モデルとして使用した。
【０２４８】
結果：ＣＭＳ−００１．３０およびＣＭＳ−００１．３１は、対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、マウスの水泳時間を延長できることが判明した。
【０２４９】
結論：ＣＭＳ−００１．３０およびＣＭＳ−００１．３１は、抗疲労特性を有しており、疲労関連障害の管理に使用し得る。
【０２５０】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−００１．３０およびＣＭＳ−００１．３１は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）：Japan Kunpeng Medical Corporation
【０２５１】
１．２ 動物
特定病原体未感染（ＳＰＦ）等級で体重１８〜２２ｇの雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス：Academy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR China
【０２５２】
１．３ 群別および方法［１］
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＣＭＳ−００１．３０（２０μｇ／ｋｇ／日）、ＣＭＳ−００１．３１（２０μｇ／ｋｇ／日）、ＥＰＯ（１０００ｕ／ｋｇ／日、週３回）、および食塩水対照の各群に無作為に分けた。試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、１日１回３０日間連続して腹腔内に適用した（ＥＰＯを適用しない場合、ＥＰＯを食塩水で代用した）。１０日目に、マウスを水温２５±１℃で１０分間泳ぐように訓練した。試験物質の最終投与から３０分後、マウスを水泳槽（５０ｃｍ×５０ｃｍ×４０ｃｍ）中で泳ぐように配置した。水深は３０ｃｍ、水温は２５±１℃であった。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。死亡するまでのマウスの水泳時間（分）を記録した。
消耗的水泳時間延長率（ＥＳＴＲ）（％）＝（試験群の平均消耗的水泳時間−食塩水対照の平均消耗的水泳時間）／（食塩水対照の平均消耗的水泳時間）×１００％
【０２５３】
１．４ 統計
群同士間の差異は、ＡＮＯＶＡ分散分析で分析した。
【０２５４】
２ 結果
【０２５５】
【表２９】
【０２５６】
３ 結論
ＣＭＳ００１−３０およびＣＭＳ００１−３１は、抗疲労特性を有することが判明したので、疲労関連障害の管理に使用することができる。
【０２５７】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
１． Ｍｉｚｕｎｏｙａ Ｗ， Ｏｙａｉｚｕ Ｓ， Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｕｒａｎｃｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｎ ａｎ ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｐｏｏｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００２ Ｍａｙ； ６６（５）：１１３３−１１３６．
【０２５８】
上記情報に基づいて、多様な医薬製剤を開示したペプチドから作製することができる。該医薬製剤は、公知の医薬担体のいずれを含んでもよい。適切な担体の例には、医薬として許容される当業者に公知の標準的担体が含まれる。こうした担体には、それだけに限らないが、生理食塩水、水、油水混合物またはトリグリセリド乳濁液を含む乳濁液、ならびに他種の作用剤、充填剤、コート錠およびカプセルが挙げられる。適当な担体は、医薬組成物の投与方式に基づいて選択し得る。
【０２５９】
医薬製剤は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、および皮下埋め込みを介して投与することができる。該ペプチドは、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液などの経口投与の任意の形態、即ち、改変しない通常の形態、もしくは徐放形態、または胃腸保護をして、もしくはせずに投与することもできる。該ペプチドは、軟膏、クリーム、ゲルなどの局所塗布の任意の形態で、経皮的促進用具を使用し、または使用せずに適用することもできる。該ペプチドは、単独で、または他のペプチド配列と組み合わせて、その遺伝子配列中に解釈し込み、発現系の中にクローニングすることにより、生成ペプチド分子を発生させて、本明細書に記載の該ペプチドの活性を利用してもよい。
【０２６０】
各ペプチドの投与量は、１ｎｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重とし得る。好ましい投与量は、注射投与方式に対して、１０ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。しかし、該ペプチドの１種または複数は、正常な生理的応答のカスケードを誘発すると見込まれる受容体を介して作用し得るので、その有効用量は１ｎｇ／ｋｇ体重という少量にもなることができる。あるいは、該ペプチドの１種または複数は、全反応カスケードの単なる開始剤に過ぎないこともある。経口摂取に対しては、その量は、１ｎｇ〜１０ｇ／日／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ〜１ｇ／日／ｋｇ体重、更により好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ／日とし得る。
【０２６１】
前記ペプチド配列に基づく遺伝子治療は、当技術分野で公知の方法に基づき、またその全体が参照により本明細書に組み込まれている、特許公開ＷＯ０３／００６４９２Ａ２にも基づいて実施し得る。該ペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、特許公開ＷＯ２００４／０５５０４２Ａ１に開示された教示に基づいて、他の強化分子と結合させてもよい。
【０２６２】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
１． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ， Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． １９９３， ７：１３４−１３５．
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４． Ｊｉｎｓｈｅｎｇ Ｈｅ， Ｒｕｉｚｈｕ Ｌｉ， Ｔｉｎｇｙｉ Ｚｏｎｇ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ＭＴＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ＮＫ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃｈｉｎａ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ． １９９６， １（６）：３５６−３５８．
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【実施例１２】
【０２６３】
遺伝子操作した乳酸桿菌細菌種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための一例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、当業者によく知られた遺伝子操作の標準的技術を用いて、発現ベクター中へ挿入される。選択された発現ベクターは、乳酸桿菌において機能的な構造性プロモーター、特定の５’ないし３’配向におけるＤＮＡ配列の導入のためのマルチプルクローニングサイト、ならびに抗生物質耐性（クローニング法において助けるための）を与える選択マーカー遺伝子を含有し、ペプチドの生産および／または分泌を補助するための他の配列、例えば、シグナルペプチド配列を含みうる。かかるベクターの例は、Pavlaの米国特許第５，５９２，９０８号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）によって提供される。簡単に言うと、該特許は、乳酸桿菌種において機能する数個の既知のプロモーター、ならびに該細菌中の新規なプロモーター（そのいずれも、乳酸桿菌中でペプチドを発現するように、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されていてもよい）を見出す方法を論じる。上記の米国特許第５，５２９，９０８号に記載のようなラクトバシラス・ラクチス中で活性な１６ないし３５個のほとんど疎水性のアミノ酸よりなるペプチドのようなシグナルペプチドをコードしている核酸は、プロモーターと本発明のペプチドをコードしている核酸との間に挿入され、その結果、シグナルペプチドをコードしている核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸を有するフレーム内にある。
【０２６４】
ペプチドのコーディング配列のほかに、合成されたＤＮＡ配列は、該ＤＮＡの発現ベクター中への連結およびクローニングにおいて助けとなる配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターのマルチプルクローニングサイトにおいて見出される配列に対応する制限酵素認識部位を、該配列の５’および３’末端にて該合成ＤＮＡ中に組み込むことができ、その結果、該配列をベクター内で適当な配向でクローン化することができる。ベクターおよび合成ＤＮＡの両方とも、特定の制限酵素で消化され、次いで、精製される。ベクターおよび合成ＤＮＡとの連結反応の後、イー・コリの適当な株に形質転換する。形質転換された細菌は、ベクターが耐性を与える抗生物質を含有する培地に植える。形質転換された細菌のコロニーを、生育培養およびプラスミド調製法について選択し；正しい配向の合成ＤＮＡの存在を確認する。
【０２６５】
次いで、発現ベクターを乳酸桿菌種、例えば、エル・アシドフィルスの細菌宿主細胞中に形質転換する。形質転換細胞は、ベクター配列内に見出される選択マーカーによって選択され、該ペプチドの分泌は、ウェスタン・ブロットを行い、成長培地中に存在するペプチドのゲル電気泳動を行い、または他の標準的な技術によって証明されうる。細菌の形質転換コロニーを選択し、遺伝子操作した細菌の大量培養を調製するために用いる。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した細菌の培養物を増殖させ、少なくとも、その一部を、その中で細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、細菌培養物は、宿主による腸での消費のためのサプリメントを生産するための種々の方法において処理することができる。これらの処理は、凍結乾燥または細菌を保存するための他の方法を包含し、さらに、細菌と担体薬剤、例えば、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどと組み合わせる。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。例えば、細菌を用いて、ヒト消費用の発酵乳製品または他の食品を製造することができ、その結果、該ペプチドを発現している生物は宿主生物の胃でコロニー形成する。乳酸菌の特定の株をヨーグルト、キムチ、チーズおよびバターなどの食品中に組み込むための多くの異なる方法が、Ohの米国特許第６，０３６，９５２号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）において開示される。多くの経路のうち１つによる細菌の消費において、操作された生物は胃でコロニー形成でき、胃の粘膜層を介する本発明のペプチドの提示および／または吸収を可能にする。
【実施例１３】
【０２６６】
バシラス・サチルスの遺伝子操作形態によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって、発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、イー・コリおよびビー・サチルスの両方において増殖することができ、形質転換細菌のコロニーを選択するための抗生物質耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、例えば、ｐＴＺ１８Ｒ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を含む。該ベクターは、ビー・サチルスにおいて活性な構造性プロモーター、例えば、ビー・サチルスのＳａｃ Ｂ遺伝子由来のプロモーターならびに細菌細胞からの発現した異種蛋白質の有効な輸送を指示するビー・サチルスにおいて活性なシグナルまたはリーダーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有することができる。かかるベクターの一例は、Fahnestockの米国特許第６，２６８，１６９号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。簡単に言うと、上記のように、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡは、当業者によく知られた技術によって、ＤＮＡのクローニングを容易にするための制限酵素部位および／または他の配列を用いて合成されるであろう。イー・コリ中への形質転換、播種、選択およびプラスミドを増殖してプラスミドストックを作成後、該プラスミドをビー・サチルス中に形質転換し、播種培地において、形質転換体を抗生物質耐性によって選択する。
【０２６７】
遺伝子操作したビー・サチルスにおけるペプチドの生産および該細菌からのその分泌は、当業者によく知られた技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはウェスタンブロット後のオートラジオグラフィック検出のためのペプチドの放射能標識を用いて証明される。
遺伝子操作された細菌の培養物を増殖させ、少なくともその一部を細菌が増殖することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。
【実施例１４】
【０２６８】
遺伝子操作されたサッカロミセス酵母種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙されたペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、安定に維持された酵母蛋白質発現ベクターを含み、それは、ｐＡＤＨ１のような構造性酵母プロモーター、酵母およびイー・コリの両方におけるベクターの複製のための部位、選択目的のために栄養要求性酵母突然変異体に栄養を与える遺伝子、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）および、所望により、シグナルペプチドをコードする配列を含む。このようなベクターは、商業的に入手可能であり、当該分野でよく知られているか、または標準的な技術を用いて容易に構築できる。合成ＤＮＡの酵母ベクター中への挿入、イー・コリ中への形質転換、形質転換したイー・コリの選択培地への播種、形質転換した細菌コロニーの選択および該コロニー由来の細菌の成長培養物からのプラスミドＤＮＡの調製後、よく知られた技術、例えば、酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションによって、ベクターをサッカロミセス・セレビシエ中に形質転換する。形質転換のために選択されたサッカロミセス・セレビシエの株は、最少培地プレート上で生育するために、プラスミド上の遺伝子を必要とするであろう突然変異体栄養要求株である。形質転換された酵母コロニーは、ベクター上に提供される遺伝子を欠く成長培地上に酵母を播種することによって、単離される。ベクターおよびその選択遺伝子を受け取り、その遺伝子産物を発現している酵母だけが、最少培地上でコロニーに成長できるであろう。ペプチド分泌の証明は、ウェスタンブロットを行い、成長培地に存在するペプチドのゲル電気泳動を行うことによって、または他の標準的技術によって、得ることができる。
【０２６９】
酵母の形質転換コロニーを選択し、大量培養物を調製するために使用する。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した酵母の培養物を増殖させ、少なくともその一部を、細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、酵母培養物は、宿主による腸での消化のためのサプリメントを生産する種々の方法において処理できる。これらの処理は、凍結乾燥または酵母を保存する他の方法を包含し、さらに、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどの担体物質と細菌を組み合わせることを含む。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。別の具体例において、形質転換した酵母を、当業者によく知られた技術によって、食品、例えば、ヨーグルトおよびケフィールなどの発酵乳製品の生産に用いる。これらの食品中の生きている乳酸菌培養物と同様に、形質転換した酵母は、少なくとも一時的に胃でコロニー形成し、胃の管腔を介してペプチドを宿主へ提供する。
【０２７０】
本発明は上記した方法ならびに多くの場合において本明細書にて記載されるペプチドの実施例を用いて記載されるが、これは単なる例示であって、本発明を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載のペプチドは本発明の実施形態を示し、本発明の同じ原理はまたそのペプチドの生物学的機能に影響を及ぼすことなく修飾される他の機能的に均等なペプチドに適用できることも理解すべきである。さらには、これらペプチドの医薬用途について上記した疾患または障害がその有用性を支持するのに言及されているが、これらの医薬用途は単なる例示であって、特許請求の範囲を限定するのに用いるべきではない。これらペプチドおよびその機能的誘導体は、それ自身、免疫系を強化またはブーストし、疲労を緩和し、正常なヒトまたは感染患者の血中乳酸量を下げるための、健康食品サプリメントとしての使用に限定されるものではなく、他の可能性のある／意図する用途があることは明らかである。かかるいずれの使用もまた本発明の範囲内にある。
【０２７１】
前に公開されている配列を有するペプチドに関して、本発明はその新規かつ予期せぬ使用を提供するものであり、これらの新規な使用はこれらの既知のペプチドを以前には予期されない産業上の用途に用いることを支持すると考える。上記に、および特許請求の範囲に記載される新規な医薬用途とは別に、本明細書の教示に基づいて正常な個体の状態を改善するための食餌または栄養サプリメントとして用いることもできる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、短鎖ペプチドおよびその用途に関する。特に、本発明は、生物活性を有する短鎖ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドは、疾患の治療用に、および医薬組成物として公知である。例えば、米国特許第６１９１１１３号は、平滑筋細胞の増殖に対する阻害活性を有し、そのため動脈硬化、血管形成術後の再狭窄、血管移植後の内腔狭窄、および平滑筋肉腫などの、平滑筋細胞の増殖に関連する病理状態の予防および治療に有用であるペプチドを開示している。米国特許第６１８４２０８号は、上皮増殖帯の重量増加活性および毛髪成長などの生理過程を調節することが判明している別のペプチドを開示している。更に、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／００６４９２号および米国特許出願第１０／２３７４０５号は、ある種のペプチドおよびその医薬組成物は、生物活性であり、免疫応答を調節することができると示唆した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、本発明の目的は、短鎖ペプチドまたは生物活性を有するペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によるペプチドは、標準的な化学法によって個別に合成された。公知の動物法およびインビトロ法を用いて、こうしたペプチドの多様な機能を、以下に述べる次の各参考文献に記載の方法を用いて分析した。ペプチド名には、コード「ＣＭＳ」と、それに続く番号が与えられる。ペプチド配列および対応するＩＤ番号が、表１に示されている。合計７個の新規ペプチドが、インビボで生物活性を有すると特定し、配列番号の隣に星印で示した。その他残りのペプチドは、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ０３／００６４９２号で以前に報告されたが、新規で発明性のある新たな指示が、本発明において見出された。参照を容易にするために、第ＷＯ０３／００６４９２号に見出される配列に、同じ配列番号を与えた。
【０００５】
【表１】
【０００６】
したがって、本発明の一態様は、配列番号４、５、８〜１１と特定される配列を有する実質的に純粋なペプチドに関する。即ち、本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドにも関する。特定の実施形態では、該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【０００７】
より好ましい実施形態では、該ペプチドは、以下の状態、即ち肝グリコーゲン貯蔵、血中乳酸量、放射線療法誘発免疫不全症、Ｂ型肝炎感染症、皮膚移植拒絶、肝癌、胃癌、炎症、血中脂質、トリグリセリドおよび総コレステロール、免疫過敏症、Ｔリンパ球増殖、混合リンパ球増殖、肥満、ならびに体重過多の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【０００８】
本発明の別の態様は、配列番号４、５、８〜１１と特定される配列を有するペプチドの機能的誘導体である、実質的に純粋なペプチドに関する。即ち、本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列から本質的になる、実質的に純粋なペプチドにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体であるアミノ酸配列からなる、実質的に純粋なペプチドにも関する。特定の実施形態では、機能的誘導体である該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【０００９】
本発明の別の態様は、配列番号４、５、８〜１１の１種を包含するペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターに関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１を包含するペプチドからなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択された生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択された生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。
【００１０】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるペプチドに隣接して、リーダーペプチドを含有するハイブリッドペプチドに関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる生物活性ペプチドの機能的誘導体を含むペプチドに隣接して、リーダーペプチドを含有するハイブリッドペプチドにも関する。
【００１１】
本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列を含むペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードするヌクレオチド配列に隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクターにも関する。
【００１２】
特定の実施形態では、前記遺伝子ベクターのいずれかにおいて産生される該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００１３】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になるペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物にも関する。
【００１４】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは外因性ペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝物質を有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になる外因性ペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物にも関する。本明細書で使用する場合の外因性ペプチドとは、非改変自然形態の当該微生物が通常発現する他の任意のペプチドとは異なる、アミノ酸配列を有するペプチドを指す。
【００１５】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むペプチド、好ましくは外因性ハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含むハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含むゲノムを有する微生物にも関する。
【００１６】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列を含むペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含む外因性ハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択される生物活性アミノ酸配列の機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなるペプチドに隣接して、リーダーアミノ酸配列を含む外因性ハイブリッドペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝組成物を有する微生物にも関する。
【００１７】
特定の実施形態では、前記微生物のいずれかにおいて産生される該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００１８】
本発明の更に別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだ、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物に関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されるアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。
【００１９】
本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む生物活性ペプチドの機能的誘導体を含んだ、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体から本質的になる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。本発明は更に、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチドを含む医薬組成物にも関する。
【００２０】
特定の実施形態では、前記医薬組成物のいずれかに存在する該ペプチドは、以下のもの、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２１】
本発明のまた更なる態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法にも関する。
【００２２】
本発明の別の態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体である、アミノ酸配列を含む実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法である。
【００２３】
前記態様は更に、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体である、アミノ酸配列から本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを用意し、実質的に純粋な前記ペプチドを医薬として許容可能な担体と混合することを含む、医薬組成物を作製する方法に関する。
【００２４】
前記方法のいずれかに関して、該ペプチドは、以下のもの、即ち免疫活性、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２５】
本発明のまた更なる態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドの医薬有効量をヒトに投与することを含む、ヒトの治療方法に関する。前記態様は、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体である、アミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドの医薬有効量を投与することを含む、ヒトの治療方法にも関する。
【００２６】
特定の実施形態では、ヒトの治療に使用される前記ペプチドは、以下のヒトの状態、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の１種または複数を調節するために使用し得るが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２７】
前記核酸配列のいずれかに関して、こうした核酸配列から発現する該ペプチドおよび／またはハイブリッドペプチドは、以下のもの、即ち免疫活性、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲を調節できるが、調節対象はそれだけに限らない。
【００２８】
更に別の態様では、本発明は、以下の状態、即ち個人の肝炎、疲労、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量および免疫反応の少なくとも１種を調節する医薬の製造において、配列番号１、２、１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドを使用することに関する。本発明は、配列番号１、２、１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することを含む、個人の肝炎、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量または免疫反応を調節する方法にも関する。
【００２９】
本発明は更に、以下の状態、即ち疲労、炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する医薬の製造において、配列番号３、７もしくは２１またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドを使用することにも関する。本発明は、配列番号３、７もしくは２１またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、アミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することを含む、個人における以下の状態、即ち疲労、炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する方法にも関する。
【００３０】
本発明の更なる態様は、配列番号４、５、８〜１１またはその機能的誘導体からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるペプチドを含有する栄養組成物、および栄養補助食品を製造するための前記組成物の使用を対象とする。
【００３１】
本発明の更なる態様では、配列番号４、５、８〜１１およびその機能的誘導体のペプチドの強化誘導体が提供される。こうしたペプチドの強化誘導体は、該ペプチドの治療有効性を強化または増強するように、こうしたペプチドに作動可能に連結した強化分子を含む。その強化作用は、延長作用、短縮作用、作用開始の遅延、作用開始の早期化、作用強度の増加、作用強度の減少、副作用の低下、１種または複数の作用創生、作用鎮静の遅延、作用鎮静の早期化、および個人内の個別局所への該ペプチドのターゲティングである場合がある。このような強化分子および強化誘導体の例は、以下に説明する。本発明の幾つかの態様では、強化分子は、ウィルス感染症および免疫障害を治療または予防できるが、治療または予防に限るわけではない。本発明の追加の態様には、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたペプチドを含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるペプチド、およびその誘導体の治療作用を強化する方法であって、治療作用を強化する分子に前記ペプチドを作動可能に連結することを含む方法が含まれる。本発明の幾つかの態様では、治療作用を強化する、作動可能に連結した前記分子は、天然のペプチドにおいて、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたペプチドおよびその誘導体に隣接したペプチドではない。
【００３２】
本発明の更なる態様では、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、実質的に純粋なペプチドを含む組成物が提供される。
【００３３】
本発明の追加の態様では、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる、生物活性ペプチドの医薬有効量の投与によって、ヒト疾患の作用を低下させる方法が提供される。幾つかの実施形態では、前記のヒトは、以下の状態、即ち疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種に罹っている。
【００３４】
本発明の更なる態様では、配列番号１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドを投与することを含む、ある状態を調節または治療する方法であって、前記状態が、個人の疲労、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量および免疫反応からなる群から選択される方法が提供される。
【００３５】
本発明の追加の態様では、配列番号１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなる生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人の肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量または免疫反応を調節する方法が提供される。
【００３６】
本発明のまた更なる態様では、肝炎治療用の医薬の製造において、配列番号２もしくは１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドが提供される。
【００３７】
本発明のまた更なる態様では、配列番号２もしくは１５またはその機能的誘導体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人における肝炎を治療する方法が提供される。
【００３８】
本発明の追加の態様では、疲労軽減用の医薬の製造において、配列番号３またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドが提供される。
【００３９】
本発明の更なる態様では、配列番号３またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人における疲労を軽減する方法が提供される。
【００４０】
本発明のまた更なる態様では、以下の状態、即ち炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する医薬の製造において、配列番号２１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの使用が提供される。
【００４１】
本発明のまた更なる態様では、配列番号２１またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することを含む、個人における以下の状態、即ち炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する方法が提供される。
【００４２】
本発明の更なる態様では、個人の免疫系を調節する医薬の製造において、配列番号７またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの使用が提供される。
【００４３】
本発明のまた更なる態様では、配列番号７またはその機能的誘導体を含む、またはそれから本質的になる、またはそれからなるアミノ酸配列を有する、生物活性ペプチドの医薬有効量を投与することによって、個人の免疫系を調節する方法が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
本明細書に記載のように、本明細書に記載のペプチドは、重要な生物活性を有することが見出された。該ペプチドは、Ｌ−アミノ酸から標準的合成法により容易に合成できるが、個々のペプチドをコードする配列を有する核酸を用いる遺伝子操作によっても合成し得る。引用した文献は全て、その全体を本明細書に組み込んである。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋なペプチド」とは、少なくとも４０％、より好ましくは６０％、より好ましくは９０％超であるペプチドを指す。最も好ましい実施形態では、その純度は約９９％〜１００％である。実質的に純粋なペプチドは、以下に記載のように複雑な混合物となり得る医薬および栄養製剤の調製のために使用することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「ハイブリッドペプチド」は、前記に特定した配列またはその機能的誘導体を有する本明細書に記載の元の生物活性ペプチド中に挿入された、追加のペプチドを含有するが、なお実質的に類似の活性を保持するペプチドを指すために使用される。追加の該ペプチドには、例えば、ハイブリッドタンパク質を細胞外部へ分泌するシグナルとして、１種または複数の原核または真核細胞により認識されるアミノ酸配列を含有するリーダーペプチドが含まれる。該分泌は、直接的分泌の場合も、分泌小胞を介した間接的な場合もある。
【００４７】
上述のように、本発明の別の実施形態は、本発明のペプチドから本質的になるペプチドまたはポリペプチドである。本明細書で使用する場合、用語「から本質的になる」とは、カルボキシおよび／またはアミノ末端にある追加のアミノ酸と共に、本発明のペプチドのアミノ酸配列を含み、本明細書に示す本発明のペプチドの活性を維持している、ペプチドまたはポリペプチドを指す。したがって、非限定例として、本発明のペプチドの活性が免疫活性の調節である場合、本発明のペプチド「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドは、そのペプチドに関して本明細書に示すような、免疫活性の調節活性を保有し、しかも、該ペプチドまたはポリペプチドの免疫活性の調節能を著しく低下させる、あるいは免疫活性調節剤としての該ペプチドの基本的新規特性にとって著しい変化となる如何なる特性も保有することはなかろう。したがって、前記の例において、免疫活性の調節以外の主要活性を有し、しかも、その内部のどこかに本発明のペプチドのアミノ酸配列を含む全長天然ポリペプチドが、本発明のペプチド「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドを構成することはなかろう。同様に、前記の例において、免疫活性の調節以外の主要活性を有するが、その内部のどこかに本発明のペプチドのアミノ酸配列を含む、遺伝子操作したペプチドまたはポリペプチドが、本発明のペプチド「から本質的になる」ペプチドまたはポリペプチドを構成することはなかろう。
【００４８】
好ましい実施形態では、用語「から本質的になる」とは、本発明のペプチドの１種以外に４個以下のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。より好ましい実施形態では、その同じ用語は、本発明のペプチドの１種以外に２個のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。最も好ましい実施形態では、その同じ用語は、本発明のペプチドの１種以外に１個のアミノ酸を有するペプチドまたはポリペプチドを指す。
【００４９】
上記例示に使用した免疫活性の調節例の外に、前記定義は、このようなペプチドに与えられる活性に関して本発明の全てのペプチドにも適用される。特に、前記定義は、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の調節に活性を有する本発明のペプチドに適用される。
【００５０】
当業者であれば、以下に記すようなアッセイを用いて、あるペプチドまたはポリペプチドの活性を測定することにより、該ペプチドまたはポリペプチドが、前記定義に従って本発明のペプチドから本質的になるか否かを、容易に判定することができる。
【００５１】
当業者であれば、本発明の特定のペプチドに関して本明細書に示す、疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲などの障害の調節に対するアッセイを用いて、あるペプチドまたはポリペプチドの活性を測定することにより、該ペプチドまたはポリペプチドが、前記定義に従って本発明のペプチドから本質的になるか否かを、容易に判定することができる。
【００５２】
本明細書および特許請求の範囲で使用する場合の用語「障害」とは、標準的方法で測定した際に正常範囲から外れる任意の体内の状態を指す。例えば、人間において、「脂質代謝障害」とは、標準的な医療診断試験で決定した場合、体内の脂質量のいずれかが、性別、身長および年齢に基づいてその特定者にとって正常範囲を超えている状態を指す。
【００５３】
該ペプチドは、適切な任意の経路によって投与し得る。投与経路の例は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、および皮下埋め込みを経由するものであり、リポソーム、持続放出用保護などのデリバリー促進具を用いる場合と用いない場合がある。したがって、本発明は、対象に該ペプチドを注射する用具を包含する。幾つかの実施形態では、該用具はシリンジの場合がある。該ペプチドは、任意の経口投与形態で投与してもよい。その例には、改変しない通常形態もしくは遅延放出形態とした、または胃腸保護の有無いずれの場合もある、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液、ロゼンジなどが挙げられるが、それだけに限らない。更に、該ペプチドは、経皮促進具の有無いずれの場合もある、軟膏、クリーム、ゲルなどの任意の局所塗布形態で、または粉末吸入剤、溶解型もしくはリポソーム保護形態として適用してもよい。
【００５４】
本発明を実施する別法として、本明細書に記載の開示ペプチドのアミノまたはカルボキシ末端に追加のアミノ酸を付加することが可能となり得ることは理解されている。例えば、開示ペプチドにその生物学的機能に影響せずに、１個または２個のアミノ酸を付加し得る。３個または４個のアミノ酸を付加し、該ペプチドの機能をなお維持することも可能となり得る。これらのものは全て、同じペプチドの変異体と呼称される。あるいは、該ペプチドからその生物活性に影響せずに、１個または２個のアミノ酸を除去し得る。更に、該ペプチドの生物学的機能に影響せずに、３個または４個のアミノ酸を除去することも可能となり得る。これらのものは、当該ペプチドの断片と呼称される。更に、同じ機能群に属するアミノ酸１個を別のものに保存的に代替するというようなペプチドの誘導体を、本発明の別の態様を実施するために使用してもよい。例えば、非極性または疎水性側鎖を有するペプチドの１側鎖基を、生物活性を低下させずに別のものに置換することは可能となり得る。更なる一例として、リンカー／スペーサーを該ペプチドに挿入して変異体を形成し得るが、該変異体は、この研究に使用する元のペプチド同様、活性部分をなお保持し得る。これらのものも、該ペプチドの変異体と見なされる。本明細書で使用する場合のペプチド類縁体は、天然アミノ酸の構造を模倣したアミノ酸分子、例えば、異なる骨格構造またはＤ−アミノ酸置換の類縁体を有するペプチドを包含する。更なる一例として、該ペプチドの合成に使用されるアミノ酸はＬ光学異性体であるが、配列中のアミノ酸の１個または複数がＤ体で置換されたペプチドは、類似の生物活性を有し得る。特許請求の範囲で使用する場合の用語「機能的誘導体」は、該ペプチドの断片、変異体、類縁体または化学誘導体を包含することを意図している。
【００５５】
医薬製剤における前記ペプチドの使用は、免疫障害、癌、疲労、移植片拒絶などの本明細書に記載の障害に対する考え得る治療として採用し得る。該製剤は、他のペプチドを含めた、他の活性または不活性成分と混合される、特定した該ペプチドの１種を含有してもよい。あるいは、列挙した該ペプチドを使用して、列挙していないペプチドも有する製剤を調製してもよい。該製剤は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または皮内の形態で投与することができる。投与方式は、治療を要する器官に直接通じる動脈内注射でもよい。他の投与方式は、経皮、粉末または噴霧吸入、および当業者に公知の他のデリバリー形態である。該製剤は、経口投与をしてもよく、経口摂取後に該ペプチドの胃内消化を防止するために使用できる担体、または当技術分野で公知の他の任意の担体を含んでもよい。
【００５６】
該医薬製剤は、既知の医薬担体のいずれでも含み得る。適当な担体の例には、当業者に公知の医薬として許容可能な標準的担体のいずれもが含まれる。こうしたものには、それだけに限らないが、生理食塩水、水、油水混合物を含む乳濁液またはトリグリセリド乳濁液、ならびに他種の作用剤、充填剤、コート錠およびカプセルが挙げられる。適切な担体は、医薬組成物の投与方式に基づいて選択し得る。
【００５７】
本発明の更なる態様では、本明細書に記載のペプチドの強化誘導体およびその機能的誘導体が提供される。本発明の生物活性ペプチドは、生物学的に有効または有用な他の分子に結合することにより、追加の効果または用途をもたらし得る、あるいはその治療有効性を高め得る。多数の潜在的な結合用分子、その生物学的効果、および該分子のペプチドへの結合法が、当技術分野で公知である。例示的な結合用分子には、それだけに限らないが、有機化合物、炭水化物、糖類、多糖類、アミノ酸、アミノ酸ポリマー、ペプチド、ステロイド、タンパク質、タンパク質の単離ドメイン、脂質分子、脂肪酸、胆汁酸、ポリアミン、プロテアーゼ阻害剤などが挙げられる。結合用分子の組合せも使用することができる。
【００５８】
本発明のペプチドの幾つかは、特定の細胞型または組織型に対して明確な治療効果を有する。分子をペプチド薬へ結合することの重要な一目的は、受療者の体内にある特定の部位または区画へのペプチドのターゲティングである。このようにして、ペプチド薬およびその効果を、所期の治療効果が及ぶ細胞型または組織型の部位に集中することができる。これによって、非結合型遊離ペプチドの同程度のモル量が示すと思われる効果を強化することができる。分子を結合することの他の目的には、例えば、ペプチド寿命の延長、ペプチド溶解度の変更、ペプチド活性の変更、およびペプチド生体利用度の変更を含めることができる。
【００５９】
当該ペプチドを結合相手に結合する化学反応は、過度に実験をすることなく、当業者が推測することができる。多様な結合技法が、例えば、各々その全体が参照により本明細書に組み込まれている、Haas et al., Kidney Intl.,52(6):1693, 1997; Fiume et al., Ital J Gastroenterol Hepatol, 29(3):275, 1997; Di Stefano et al., Biochem. Pharmacol., 61(4):459, 2001; Huang et al., Chem. Biol., 7(7):453, 2000; Leopold et al., J. Pharmacokinet. Biopharm., 23(4):397, 1995; Patel et al., Bioconjugate Chem., 8(3):434, 1997; Kramer et al. J. Biol. Chem., 269(14): 10621, 1994; Toth et al. (J.Med.Chem., 42(19):4010, 1999; Kim et al., (Biomaterials, 23:2311, 2002; Oldham et al. (Int. J. Oncology, 16:125, 2000およびFitzpatrick et al. Anticancer Drug Design, 10:1, 1995に記載されている。
【００６０】
遺伝子治療および治療法
発見したペプチド配列に基づく遺伝子治療は、こうしたペプチドの１種をコードする核酸配列の設計によって行うことができる。該核酸は、化学的に合成し、プロモーターに作動可能に連結し、更に発現ベクター中にクローニングし得る。次いで、該発現ベクターは、遺伝子治療の形態として、人体細胞中に発現させるために人体中に投与される。本明細書で使用する場合の用語「遺伝子ベクター」には、こうした発現ベクターが含まれる。遺伝子治療に使用できるベクターは、アデノ随伴ウィルス(Mizuno, M. et al. (1998), Jpn J Cancer Res 89, 76-80)、ＬＮＳＸベクター(Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) およびレンチウィルス(Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268)を包含するが、各開示内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６１】
ペプチドデリバリー用の他のビヒクルには、所望のペプチドをコードし、生物に移入することができ、該宿主生物の健康に目立った有害作用を及ぼさずに、該ペプチドの投与をすることが望ましい該宿主生物中で複製できる発現ベクターが含まれる。例えば、ペプチドの投与をすることが望ましい宿主生物に対して病原性のない発現ベクターを、その生物に移入し得る。幾つかの実施形態では、発現ベクターは、細菌または真菌生物中で所望のペプチドを産生し、該ペプチドを投与しようとする前記宿主生物の健康に目立った有害作用を及ぼさない。例えば、所望のペプチドをコードする発現ベクターは、乳酸菌、イー・コリまたは酵母などの生物中で所望のペプチドを産生する発現ベクターであってもよい。一実施形態では、該発現ベクターは、哺乳動物腸内に通常見出される微生物、または哺乳動物消化管が許容する微生物において、所望のペプチドを産生する。所望のペプチドが発現できる微生物種の一部には、それだけに限らないが、Ｌ．アシドフィルス、Ｌ．アミロボルス、Ｌ．カゼイ、Ｌ．クリスパトゥス、Ｌ．ガリナルム、Ｌ．ガッセリ、Ｌ．ジョンソニ、Ｌ．パラカゼイ、Ｌ．プランタルム、Ｌ．リューテリ、Ｌ．ラムノススなどのラクトバチルス種；Ｂ．アドレセンティス、Ｂ．アニマルス、Ｂ．ビフィドゥム、Ｂ．ブレーベ、Ｂ．インファンティス、Ｂ．ラクティス、Ｂ．ロングムなどのビフィドバクテリウム種；エンテロコッカス・フェーカリスまたはＥｎｔ．ファシウム；スポロラクトバチルス・イヌリヌス；バチルス・ズブチリスまたはバチルス・セレウス；エシェリチア・コリ；プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ；あるいはサッカロミセス・セレビシエまたはサッカロミセス・ブーラルディが含まれる。
【００６２】
本発明のペプチドをコードし、化学的に合成されるか、または、それだけに限らないが、ｃＤＮＡ分子を産生するためのｍＲＮＡの逆転写を含む、他の手段により生成される核酸配列は、当業者に馴染みある遺伝子操作法によって、所望の生物に遺伝子移入するための発現ベクター中に組み込むことができる。該発現ベクターは、ＤＮＡベクター、ＲＮＡベクターのいずれでもよい。例えば、該発現ベクターは、プラスミド性またはウィルス性遺伝要素に基づくことができる。該発現ベクターは、染色体外で複製するベクター、染色体中に組み込まれるベクターのいずれでもよい。
【００６３】
該発現ベクターは、本発明のペプチドをコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。該プロモーターは、誘導プロモーターなどの調節可能なプロモーター、または構成プロモーターでもよい。幾つかの実施形態では、該プロモーターは、所望量のペプチド発現をもたらすように選択し得る。その上、所望であれば、該発現ベクターは、ペプチドの産生、提供および／または分泌を促進するために、他の配列を含んでもよい。幾つかの実施形態では、本発明のペプチドをコードする核酸は、該ペプチドの分泌を指示する核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、本発明のペプチドをコードする該核酸は、シグナルペプチドをコードする核酸に作動可能に連結されていてもよい。
【００６４】
幾つかの実施形態では、本発明のペプチドをコードするように操作される発現ベクターは、ラクトバチルス種およびバチルス・ズブチリスなどの哺乳動物の通常の腸内細菌相を構成する細菌種中に、本発明のペプチドを発現するように適合している発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターの例は、それぞれＣａｓａｓの米国特許第６１００３８８号およびＢｅｌｌｉｎｉの同第５７２８５７１号に見出すことができる。これらの文書は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている。ある生物中で本発明のペプチドの発現を促進し、該ペプチドを投与しようとする前記宿主生物の健康に有害ではない任意の発現ベクターが、使用し得ることは理解されよう。
【００６５】
幾つかの実施形態では、本発明のペプチドをコードするように操作される発現ベクターは、哺乳動物の腸管が十分に許容する酵母種、例えば、人体腸管にコロニーを形成し、ある種の下痢の治療に使用できるサッカロミセス・セレビシエ、または好ましくはサッカロミセス・ブーラルディ中に、本発明のペプチドを発現するように適合している発現ベクターであってもよい。異種のタンパク質およびペプチドを構成的に発現し、非常に安定であり、そのため有糸分裂および減数分裂中に子孫細胞に良好に継承され、更に、高度の組換えタンパク質分泌を指示する１種または複数のシグナルペプチドに対するコード配列を含み得る酵母発現ベクターは、使用することができる。このような酵母ベクターの例は、その全体が参照により本明細書に明確に組み込まれている、Ｊａｎｇ他の米国特許第６３９１５８５号に示されている。
【００６６】
本発明のペプチドをコードする発現ベクターは、当技術分野で公知の技法により、該ペプチドを発現させることを意図している生物中に導入してもよい。こうした技法には、例えば、化学的にコンピテントな細菌細胞、電気穿孔または酢酸リチウム形質転換（酵母に対して）の使用を介して細菌、酵母または他の微生物を形質転換する従来法、ならびにこうした手順が有効とは言えない細菌種の形質転換における最近の進歩が含まれる。幾つかの実施形態では、該発現ベクターは、その開示内容の全体が参照により本明細書に明確に組み込まれているＬｅｅｒ他（国際公開第９５／３５３８９号）により開示された方法を用いて、形質転換に抵抗性であることが知られている乳酸菌中に導入される。導入したその配列は、微生物の染色体ＤＮＡに組み込まれる場合も、染色体外ＤＮＡ要素として留まる場合もある。
【００６７】
次いで、該発現ベクターを含有するこの遺伝子操作微生物は、持続的免疫療法を実現するために、消化管、膣、気管などに接種することができる。幾つかの実施形態では、本発明のペプチドを発現する生物は、不活性型で、または好ましくは活性型で摂取される。腸内では、こうした微生物は、前記ペプチドを産生し、分泌または該微生物の溶解によって管腔中にそれを放出し、あるいは該ペプチドを宿主へ別法で提供し、それにより、該ペプチドは宿主生物に対して所期の効果を生じる。他の実施形態では、ペプチドは、宿主に対して鼻腔、膣または小腸の粘膜に提供される。
【００６８】
別の治療法は、人体細胞に特定の核酸をデリバリーする手段として、リポソームを使用することである。本明細書に記載のペプチドをコードする核酸配列を含有する発現ベクターなどの核酸は、Gao, X and Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722、およびその開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６２０７４５６号に記載のように、細胞取込みおよび染色体組込みを促進する環境においてデリバリーすることができる。あるいは、その開示内容の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６２４５４２７号に記載の方法を用いて、該ペプチド自体をリポソーム中に封入し、直接デリバリーすることができる。示した科学刊行物および特許は全て、参照により本明細書に組み込まれている。
【００６９】
前記の遺伝子治療および治療法に有用な核酸配列は、こうしたペプチドをコードする配列およびその機能的誘導体を包含する。縮重コドン系に基づいてこれらのペプチドおよびその誘導体をコードするために、夥しい核酸配列のうちいずれか１種を使用してもよい。
【実施例１】
【００７０】
ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がマウスの運動誘発疲労に及ぼす効果
目的：ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がＢＡＬＢ／ｃマウスに及ぼす抗疲労効果の調査。
【００７１】
方法：ＢＡＬＢ／ｃマウスの消耗的水泳モデルを用いて、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８の抗疲労効果を観察した。ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８の投与後、消耗的水泳時間、肝グリコーゲン、血清尿素性窒素（ＢＵＮ）および血中乳酸量を観察した。ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８の考え得る抗疲労機構を調査するために、血清マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の各量も観察した。
【００７２】
結果：適切な濃度のＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、食塩水対照と比較して統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）、マウスの消耗的水泳時間を延長し、ＢＵＮ量を低下させ、肝グリコーゲン量を増加させ、血中乳酸の蓄積を減少させることができることが判明した。ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、食塩水対照と比較して統計的に有意に（Ｐ＜０．０５）、消耗的運動中に血中ＭＤＡ量、ＡＬＴ量およびＡＳＴ量の上昇を抑え、ＳＯＤ活性を増加させることができることも判明した。
【００７３】
結論：ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、抗疲労性を有することが判明したので、疲労関連障害の管理に使用し得る。
【００７４】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
尿素性窒素試薬キット：Beckman Coulter, Inc., Fullerton, California, USA
アントラセンケトン試薬キット：Shanghai Fifth Union Laboratory, Shanghai, China, PRC
ＭＤＡおよびＳＯＤ試薬キット：Nanjing Jiancheng Bio-engineering Corporation, Nanjing, China, PRC
ＡＳＴおよびＡＬＴ試薬キット：Beijing Zhongsheng Bio-engineering High Technology Corporation, Beijing, PRC
【００７５】
１．２ 動物
特定病原体未感染（ＳＰＦ）等級で、体重１８〜２２ｇの雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスをAcademy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR Chinaから入手した。
【００７６】
マウスをＣＭＳ−００１群（２０μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日）、ＣＭＳ−００８群（５００μｇ／ｋｇ／日、１２５μｇ／ｋｇ／日）、および食塩水対照群に無作為に振り分けた。試験物質を腹腔内注射により１日１回、３０日間連続して投与した。試験物質の投与開始から１週間後、マウスを水温２５±１℃で１０分間水泳するように訓練した。
【００７７】
１．３ 実験装置
水泳槽（５０ｃｍ×５０ｃｍ×４０ｃｍ）
完全自動Biochemistry Analyser RA-1000
乳酸自動分析装置１５００ＳＰＯＲＴ
【００７８】
１．４ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がマウスの消耗的水泳時間に及ぼす効果［１］
最後の注射から３０分後、マウスの体重を測定し、体重の５％相当の鉛片を、体から約１ｃｍ離れたマウス尾部に巻きつけた。マウスを水深３０ｃｍ、温度２５±１℃の水泳槽に入れた。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。死亡するまでの水泳時間を記録した。
【００７９】
１．５ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動後の血清尿素性窒素量に及ぼす効果
最後の注射から３０分後、マウスを、水深３０ｃｍ、温度３０±１℃の水泳槽中でおもりを付けずに９０分間泳ぐように配置した。次いで、マウスを３０分間休ませ、血液を眼窩洞から採取した。血清を分離し、そのＢＵＮ量を完全自動Biochemistry Analyzerにより決定した。
【００８０】
１．６ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８がマウスの肝グリコーゲン量に及ぼす効果［２］
最後の注射から３０分後、マウスを頚椎脱臼により屠殺した後、肝臓を切除し、食塩水で洗浄し、ろ紙で吸い取って乾燥した。肝臓約１００ｍｇを正確に秤量し、肝グリコーゲン量をアントラセンケトン試薬キットで決定した。
肝臓各１００ｇ中のグリコーゲン重量（ｍｇ）＝ＤＵ／ＤＳ×０．５×均質液容量／肝臓重量（ｇ）×１００×０．９
ＤＵ＝試料の吸光度
ＤＳ＝標準物の吸光度
均質液容量＝８ｍｌ
【００８１】
１．７ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動後のマウスの血中乳酸量に及ぼす効果［３］
最後の注射から３０分後、眼窩洞から先ず血液２０μｌを採取した。次いで、マウスの体重を測定し、体重の４％相当の鉛片を、体から約１ｃｍ離れたマウス尾部に巻きつけた。マウスを水深３０ｃｍ、温度３０±１℃の水泳槽で１０分間泳ぐように配置した。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。運動直後および２０分の休息後に、眼窩洞から再び血液２０μｌを採取した。血液を低張緩衝液４０μｌ中に添加し、その超音波処理をした。血液中の乳酸量を乳酸分析装置で決定した。
【００８２】
運動後の乳酸増加量は、運動直後の乳酸量から運動前の乳酸量を差し引いた量に基づいて計算される。
【００８３】
休息後の乳酸消失量は、運動直後の乳酸量から休息後の乳酸量を差し引いた量に基づいて計算された。
【００８４】
１．８ ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が消耗的運動後の血清中ＳＯＤ、ＭＤＡ、ＡＳＴおよびＡＬＴ量に及ぼす効果
最後の注射から３０分後、マウスを水深３０ｃｍ、温度２５±１℃の水泳槽でおもりを付けずに泳ぐように配置した。マウスが沈む初回時までに、マウスを救出し、直ちに眼窩洞から血液を採取した。血清を分離し、ＭＤＡ、ＳＯＤ、ＡＳＴおよびＡＬＴ量を決定した。
【００８５】
１．９ 統計的方法
群同士間の差異を分散分析ＡＮＯＶＡで分析した。
【００８６】
２ 結果
【００８７】
【表２】
【００８８】
【表３】
【００８９】
【表４】
【００９０】
【表５】
【００９１】
【表６】
【００９２】
結論
この試験は、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が以下の特性を有することを示した。
１．マウスの水泳時間を延長し、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が動物の運動能力を増強できることを示すこと［５］。
２．マウスのＢＵＮを減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が、運動中のエネルギー生成のためにタンパク質異化の必要性を減少させることができることを示すこと［６］。
３．休息中の動物の肝グリコーゲン蓄積量を増加させ、動物の運動能力を増強すること［６］。
４．運動後の血中乳酸量を減少させ、その後の乳酸消失速度を増加させて、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が、運動中の乳酸生成または乳酸消失の速度を減少させることができることを示すこと［７］。
５．ＭＤＡ量を減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動中のフリーラジカル生成を減少させることができることを示すこと［８］。
６．ＳＯＤ量を減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が運動中のフリーラジカル消失を増加させることができることを示すこと［８］。
７．ＡＬＴおよびＡＳＴ量を減少させ、ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８が、運動中の心臓および肝臓の細胞傷害を保護できることを示すこと。
８．ＣＭＳ−００１およびＣＭＳ−００８は、運動関連の疲労障害の管理に有用となり得ること。
【００９３】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Mizunoya W, Oyaizu S, Ishihara K, et al. Protocol for measuring the endurance capacity of mice in an adjustable-current swimming pool. Biosci Biotechnol Biochem. 2002 May; 66(5):1133-6.
2. HE Ling, WANG Ming, CHEN Run etc. The effect of blood lactic acid、blood serum carbamide nitrogen and liver hepatin affected by gen-seng. Prevent Medicine Literature Information, 2002, 8(3):293-294.
3. WANF Xiao-xue, QIU Juan, SONG Yu etc. Study on Effect of Theanine of Fatigue. China Commonality Sanitation Journal, 2002, 18(3):315-317.
4. Thomas D P，Marshall K I. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structure. Int J Sport Med，1988, (9):257-260.
5. JIN Zong-lian. Evaluation principle and method of function food. Beijing: Beijing University Publishing Company, 1995.
6. Sanitation ministry, Evaluation progress and test methods of health care food. Ministry of Public Health, PR China.
7. Westerblad, et al. Changes of intracellular pH due to repetitive stimulation of single fibers from mouse skeletal muscle. J Physiol; 1992 Apr; (499):49-71.
8. Groussard C, Rannou-Bekono F, Machefer G, et al. Changes in blood lipid peroxidation markers and antioxidants after a single sprint anaerobic exercise. Eur J Appl Physiol. 2003 Mar; 89(1):14-20.
【実施例２】
【００９４】
放射線療法誘発免疫低下マウスに対するＣＭＳ−００１の免疫調節効果
目的：放射線療法誘発免疫低下動物モデルに対するＣＭＳ−００１の免疫調節効果の観察。
【００９５】
方法：免疫低下動物モデルは、Ｃｓ１３７照射によって先ず準備した。次いで、ＣＭＳ−００１を適用した後、Ｔリンパ球増殖速度の変化をＭＴＴ法により分析した。
【００９６】
結果：２０μｇ／ｋｇ／日で、ＣＭＳ−００１は、統計的有意差（Ｐ＜０．０５）をもってＴリンパ球の増殖速度を増加させることができることが判明した。
【００９７】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−００１：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
ハンクス液、ウシ胎児血清およびＲＰＭＩ−１６４０：Hyclone, Logan, Utah
ＣｏｎＡおよびＭＴＴ：Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
【００９８】
１．２ 実験条件
特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）で、体重１８〜２２ｇの雄性ＢＡＬＢ／ｃマウスをAcademy of Military Medicines and Sciences experimental animal center, PR Chinaから入手した。
【００９９】
１．３ 動物モデルの調製、ＣＭＳ−００１の投与、およびＴリンパ球増殖速度の定量［１］
マウスをＣＭＳ−００１群（２０μｇ／ｋｇ／日、５μｇ／ｋｇ／日）、食塩水対照群、および通常対照群に無作為に振り分けた。通常対照群を除く全てのマウスをＣｓ１３７の６００ｒａｄ（８２．８３ｒａｄ／分を７．２分間）に曝露した。試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、照射後１５日間連続して１日１回腹腔内に投与した。試験物質の最終投与の翌日、マウスの脾臓を無菌的に切除した。その脾臓を個々の細胞にばらし、洗浄し、細胞濃度をＲＰＭＩ−１６４０で４×１０６個／ｍｌに調節した。９６穴培養プレートに、１穴当たり細胞１００μｌおよびＣｏｎＡ１００μｌ（最終濃度５μｇ／ｍｌに）を添加した。ＣｏｎＡを含まない基準ブランク対照も調製した。その細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６８時間インキュベートした。Ｔリンパ球の増殖量をＭＴＴ法により決定した［２］。刺激指数を以下の通り算出した。刺激指数（ＳＩ）＝ＣｏｎＡ入り穴の平均ＯＤ値／基準ブランク穴の平均ＯＤ値。
【０１００】
２．結果
【０１０１】
【表７】
【０１０２】
３．結論
ＣＭＳ−００１は、統計的有意性をもって、放射線誘発免疫低下マウスにおけるＴリンパ球増殖を刺激できることが判明し、ＣＭＳ−００１は、放射線療法後の免疫低下患者に対する免疫刺激剤として使用し得ることを示す。
【０１０３】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. New drugs (Western medicine) research direction principle before clinic. Chinese Sanitation Ministry Drug Political Situation. 1993, 7:128-137.
2. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003, 3(28).
【実施例３】
【０１０４】
マウスにおける皮膚同種移植片の生存に対するＣＭＳ−０１４の効果
目的：皮膚同種移植片モデルによるＣＭＳ−０１４の免疫抑制効果の調査。
【０１０５】
方法：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの尾部皮膚片をＢＡＬＢ／ｃマウスに移植し、皮膚移植片の平均生存期間（ＭＳＴ）を観察した。
【０１０６】
結果：ＣＭＳ−０１４は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、皮膚移植片の生存を延長できることが判明した。
【０１０７】
結論：ＣＭＳ−０１４は、臓器移植後の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤として使用し得る。
【０１０８】
１ 材料
１．１ 薬物および他の試薬
ＣＭＳ−０１４：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによりにより特注合成された。
サイクロスポリンＡ（ＣｓＡ）：Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland
食塩水：China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, PR China
Ｎａ２Ｓ：Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China
【０１０９】
１．２ 動物
受容動物：特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）の６週齢で、体重１８〜２２ｇのＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２ｄ）マウス：Military Medical Academy of Science, China
供与動物：ＳＰＦの６週齢で、体重１８〜２２ｇのＣ５７ＢＬ／６（Ｈ−２ｂ）マウス：Military Medical Academy of Science, China
【０１１０】
２ 群別および処理
２．１ 群別および試験物質投与
ＢＡＬＢ／ｃマウスをＣＭＳ−０１４群（５００μｇ／ｋｇ／日、２５０μｇ／ｋｇ／日、１２５μｇ／ｋｇ／日）、サイクロスポリンＡ群（１０ｍｇ／ｋｇ／日）、および食塩水対照群（０．５ｍｌ／日）に無作為に振り分けた。そのマウスの半数は雄性、半数は雌性であった。
【０１１１】
試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、５日間腹腔内に注射した後、皮膚移植を行い、更に皮膚移植片の拒絶の終点まで毎日注射をした。
【０１１２】
２．２ 皮膚移植
ＢＡＬＢ／ｃマウス背部の毛１パッチを８％Ｎａ２Ｓ溶液で除去した。翌日、その皮膚を外科的に除去することにより、約１ｃｍ２の創傷床を生成し、次いでその創傷床上に、同性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ供与マウスの全厚尾部皮膚片１ｃｍ２を載せた。その手術部位をパラフィンガーゼ層で被覆、保護した後、絆創膏を施した。移植から６日後に絆創膏を外し［１］、同種移植片の生存性について受容マウスを毎日監視した。拒絶の終点は、同種移植片の１０％未満だけがなお生存しているときに設定した［２］。
【０１１３】
２．３ 統計分析
統計分析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存検定で行った。
【０１１４】
３ 結果
【０１１５】
【表８】
【０１１６】
４ 結論
ＣＭＳ−０１４は、食塩水対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、皮膚同種移植片の生存を延長できることが判明した。ＣＭＳ−０１４は、臓器移植後の拒絶反応を抑制するために、免疫抑制剤として使用し得る。
【０１１７】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
［１］ Ｍｉｎｇ Ｊｉａｎｋｕｏ， Ｗａｎｇ Ｘｉｎｇｂｉｎｇ， Ｈｕａｎｇ Ｂａｏｊｕｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｒｏｌｏｎｇｓ Ｓｋｉｎ Ａｌｌｏｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ Ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＣＸＣＲ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｇｒａｆｔ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００３， １７０：１５５６？１５６５．
［２］ Ｓｔｅｖｅｎ Ｈ． Ｂｏｒｅｎｓｔｅｉｎ， Ｊｅｒｅｍｙ Ｇｒａｈａｍ， ｅｔ ａｌ． ＣＤ８＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ Ａｒｅ Ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｌｌｅｌｉｃ， Ｂｕｔ Ｎｏｔ Ｌｏｃｕｓ−Ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ｏｒ Ｘｅｎｏ−， ＨＬＡ Ｃｌａｓｓ Ｉ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ａｎｔｉｇｅｎｓ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２０００； １６５：２３４１−２３５３．
【実施例４】
【０１１８】
Ｂ型肝炎ウィルスに対するインビトロでのＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３の抑制効果
実施例４ａ ヒト肝炎
試験ペプチドを２．２．１５細胞系の培地へ添加した。インキュベーション後、培地中のＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）、およびＢ型肝炎ウィルスＤＮＡ（ＨＢＶ−ＤＮＡ）の各濃度を決定し、対照と比較した。適切な濃度のペプチドＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３は、対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、インビトロで抗Ｂ型肝炎ウィルス活性を有することが判明した。これらのペプチドは、Ｂ型肝炎ウィルス感染の管理に使用し得ると結論される。
【０１１９】
１ 材料
ペプチドｃｍｓ−０１７およびｃｍｓ−０２３は、American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, California, USAにより（ｌ−アミノ酸源で）特注合成された。
【０１２０】
ヒトＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）ＤＮＡをトランスフェクトした２．２．２．１５細胞系は、国立薬物スクリーニングセンター（上海、中国）（第１試験）および北京大学付属の第一病院感染症科（第２試験）により供給された。
【０１２１】
細胞培養培地ＭＥＭは、GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA製であった。
【０１２２】
ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇのアッセイ用Ｅｌｉｓａキットは、Shanghai Shiye Kehua Biotech. Company, Shanghai, PR China製であった。
【０１２３】
ＨＢＶ−ＤＮＡ定量用の蛍光定量ＰＣＲキットは、Zhongshan Medical University, Guangzhou, PR ChinaのＤＡ−ＡＮ遺伝子会社製であった。
【０１２４】
２ 方法
第１試験：最大無毒濃度でのＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇに対するペプチドの抑制効果
対数増殖期の２．２．１５細胞を採集し、ＭＥＭ（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン１００ｍｇ／ｍｌおよびストレプトマイシン１００Ｕ／ｍｌを含有）で２×１０６個／ｍｌに調節した。その懸濁液を２４穴培養プレート上に１．５ｍｌ／穴で接種し、付着させるために３７℃、５％ＣＯ２で４８時間インキュベートした。１試料当たり並行穴３個を用いて、該ペプチドを最終濃度４００μｇ／ｍｌに添加した。ブランク対照１組（穴３個）も調製したが、その場合ペプチドを培地に置き換えた。プレートを３７℃、４日間インキュベートし、次いで培地を調製直後の培地（元の培地と同じ組成）で交換し、プレートを更に４日間インキュベートした。インキュベーションの終了までに、培養物の上清を集め、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの力価を、検出キット製造業者の使用説明書に従ってＥＬＩＳＡ法で決定した。薬物の抑制率（％）は、以下のように算出した。
抑制率（％）＝（対照の平均濃度−試料の平均濃度）／対照の平均濃度×１００％
【０１２５】
第２試験：ＨＢＶ−ＤＮＡに対するペプチドの抑制効果
細胞懸濁液の調製およびインキュベーションを前記第１試験同様に繰り返したが、ペプチド濃度は１６０μｇ／ｍｌとした。インキュベーションの終了までに、上清を集め、ＨＢＶ−ＤＮＡ濃度を検出キット製造業者の使用説明書に従って蛍光定量ＰＣＲで決定した。
抑制率（％）＝（対照の平均ＤＮＡ濃度−試料の平均ＤＮＡ濃度）／対照の平均ＤＮＡ濃度×１００％
【０１２６】
統計
統計分析のためにステューデントのｔ検定を用いた。Ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【０１２７】
結果
【０１２８】
【表９】
【０１２９】
【表１０】
【０１３０】
結論
適切な濃度では、ＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３は、対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、インビトロでＢ型肝炎ウィルスの発生を抑制できることが判明した。これは、ＣＭＳ−０１７およびＣＭＳ−０２３が、Ｂ型肝炎関連ウィルス感染の管理に使用し得ることを示す。
【０１３１】
実施例４ｂ インビボでのアヒルＢ型肝炎に対するＣＭＳ−０１７の抗ウィルス効果
目的：インビボでのアヒルＢ型肝炎ウィルス（ＤＨＢＶ）に対するＣＭＳ−０１７の抗ウィルス効果の調査。
【０１３２】
方法
食塩水に溶解したＣＭＳ−０１７を、筋肉内注射により２８日間ＣｈｏｎｇｑｉｎｇアヒルＢ型肝炎動物モデルへ投与した。ＤＨＢＶ ＤＮＡおよびＤＨＢｓＡｇ（アヒルＢ型肝炎表面抗原）の各血清量を、各々血清ドットブロットハイブリッド形成およびＥＬＩＳＡにより観察し、ブランク対照と比較した。
【０１３３】
結果
ＣＭＳ−０１７は、処置期間中にＤＨＢＶ ＤＮＡおよびＤＨＢｓＡｇの各血清量を低下させることができることが判明した（Ｐ＜０．０１）。７日間処置を中断しても、リバウンドを認めなかった。
【０１３４】
材料および方法
１ 動物モデル［２］
１日齢のＣｈｏｎｇｑｉｎｇアヒルの腹腔内にＤＨＢＶ ＤＮＡ陽性血清（５×１０７コピー／ｍｌ）０．１ｍｌを接種することにより、肝炎動物モデルを樹立した。接種から１０日後、血液試料を外頚静脈から採取し、ジゴキシ標識ＤＨＢＶ ＤＮＡプローブとのドットブロットハイブリッド形成［３］により、感染済みであることを確認した。アヒルを２週齢まで飼育して、試験に参加させた。
【０１３５】
２ 群別および投与
ＤＨＢＶ感染を確認したアヒルを以下の群に無作為に振り分けた。
１）対照群（ｎ＝１２）：生理食塩水を１日１回、１ｍｌ／日で筋肉内注射で投与
２）ＣＭＳ−０１７群（ｎ＝１２）：ＣＭＳ−０１７（生理食塩水１ｍｌに溶解）を１日１回、２００μｇ／ｋｇ／日で筋肉内注射で投与
【０１３６】
処置を４週間続け、観察は、処置終了後更に１週間続けた。血液試料１ｍｌを外頚静脈から、処置開始後０、７、１４、２１、２８および３５日に抜き取った。血清を分離し［４］、分析するまで−２０℃に保存した。
【０１３７】
３ 監視するパラメーター
１）ＤＨＢＶ ＤＮＡ血清量
ＤＨＢＶ ＤＮＡプローブは、製造業者（Roche Co.）の標識キット手順に従って蛍光標識をした。アヒル血清は、ニトロセルロース膜上にドットブロットし（２点／試料）、ＤＨＢＶ ＤＮＡの定量のために蛍光標識プローブとハイブリッド形成させた［３］。ＤＨＢＶ ＤＮＡ４０μｌ＋ＤＨＢｓＡｇ１００μｌを内部標準として使用した。CDP-Star蛍光測定試薬を蛍光増幅のために使用した。Vuego Scan (Brisa-620st)スキャナーを膜走査のために使用し、Discovery Series Quantity Oneソフトウェアをブロットの定量分析のために使用した。ブロット数値は「容量」（容量＝強度×ｍｍ２）として記述した。
【０１３８】
２）ＤＨＢｓＡｇ血清量
ＤＨＢｓＡｇ量は、ＥＬＩＳＡ法［５〜８］で決定し、ＯＤ値をＥＬＩＳＡリーダー（Bio-TEK Co.）により４９０ｎｍで得た。
【０１３９】
４ 統計分析
各群に対してＳＰＳＳソフトウェアを用いて、対応のあるｔ−検定を行った。
【０１４０】
結果
１．血清ＤＨＢＶ ＤＮＡ濃度の変化
【０１４１】
【表１１】
【０１４２】
２．血清ＤＨＢｓＡｇ量の変化
【０１４３】
【表１２】
【０１４４】
結論
適切な濃度では、ＣＭＳ−０１７は、食塩水対照と比較して統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもって、インビボで抗肝炎性を有することが判明した。ＣＭＳ−０１７は、ウィルス感染関連障害の管理に使用し得る。
【０１４５】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2):89-91.
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4):295-297.
3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1):13-15.
4. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Purification of Duck hepatitis B surface antigen and its applications. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 2001; 26(1):14-16.
5. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. A comparison of specifically immune response in DHBV-infected ducks. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(3):166-168.
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7. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4):209-211.
8. Qiu Zhi-qiang. The influence of Fuzheng buxuegao to blood system and immunity function affected by radiotherapy. Lanzhou Medical Transaction, 2003,3 (28).
【実施例５】
【０１４６】
ヌードマウス移植ヒト胃癌ＢＧＣ−８２３異種移植片に対するＣＭＳ０２４−１６の抑制効果
１ 材料
２ 薬物および試薬
ＣＭＳ０２４−１６：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
５−Ｆｕ：Tianjin Jinyao Amino Acid Co., Tianjin, PR China
ウシ胎児血清：Hyclone, Logan, Utah
ＲＰＭＩ−１６４０細胞培養培地：GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA
【０１４７】
１．２ 動物
特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）の４〜５週齢で、健常な雌性ＢＡＬＢ／ｃ（ｎｕ／ｎｕ）ヌードマウス：Academy of Military Medical Sciences, China
【０１４８】
１．３ 細胞系
ヒト胃癌細胞系ＢＧＣ−８２３：Cancer Research Department, China Medical Science Institute
【０１４９】
２ 方法
２．１ 動物モデルの調製および抗腫瘍効果の決定［１］
対数増殖期のヒト胃癌細胞系ＢＧＣ−８２３を２×１０７個／ｍｌの濃度に調節し、次いでヌードマウスの背部皮下に接種した（０．１ｍｌ／マウス）。接種済み動物を、ＣＭＳ０２４−１６（１６０μｇ／ｋｇ／日、３２０μｇ／ｋｇ／日、および６４０μｇ／ｋｇ／日、全て０．２ｍｌ／日）、陽性対照（５−Ｆｕを０．２ｍｌ／日で２０ｍｇ／ｋｇ／日）、ならびに陰性対照（生理食塩水、０．２ｍｌ／日）の各群に無作為に分けた。腹腔内注射による試験物質の投与は、腫瘍移植後の翌日に始めて毎日１回３０日間継続して行った。最後の注射後の翌日、腫瘍塊を採集し、その重量を測定した。抑制率＝（陰性対照の平均重量−試験群の平均重量）／（陰性対照の平均重量）×１００％
【０１５０】
２．２ 統計分析
データは平均値±ＳＤで表わした。統計分析のためにＳＰＳＳソフトウェアのＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意性ありと見なした。
【０１５１】
３．結果
【０１５２】
【表１３】
【０１５３】
４．結論
１６０〜６４０μｇ／ｋｇ／日の投与量のＣＭＳ０２４−１６は、生理食塩水群と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、ヌードマウス移植ヒト胃癌ＢＧＣ−８２３異種移植片の増殖を抑制できることが判明した。
【０１５４】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. Li XH, Zhang GY, Luo FJ, Xu MH, Li Q. The effect of Helicobacter pylori on the expression of metallo proteinases in gastric carcinoma cell lines. World J Chinese Digestion, 2003, 11(5):544-546.
【実施例６】
【０１５５】
インビボでの肝癌Ｈ２２に対するペプチドの抑制効果
目的：マウスにおける肝癌Ｈ２２の増殖に対するペプチドの効果の調査。
【０１５６】
方法：ＢＡＬＢ／ｃマウスを食塩水対照、５−Ｆｕ、正常対照、ペプチドの各群に無作為に分けた。肝癌Ｈ２２細胞を腹腔内注入により移植し、試験物質も毎日１回腹腔内注射により投与した。マウスの生存期間を記録し、各対照と比較した。
【０１５７】
結果：８０μｇ／ｋｇ／日の投与量で、ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、ＣＭＳ０２４．１６は、食塩水対照群と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、Ｈ２２腫瘍細胞の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明した。
【０１５８】
結論：ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６は、肝癌Ｈ２２の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明し、これらのペプチドが癌の管理に使用し得ることを示した。
【０１５９】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
【０１６０】
５−ＦＵ（５−フルオロウラシル）は、Tianjin Jinyao Aminophenol Ltd., Tianjin, China製であった。
【０１６１】
食塩水は、China OTSUKA Pharmaceutical Co. Ltd., Tianjin, China製であった。
【０１６２】
ＲＰＭＩ−１６４０およびウシ胎児血清（ＦＢＳ）は、GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA製であった。
【０１６３】
Ｄ−ハンクス液は、Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA製であった。
【０１６４】
１．２ 動物
健常ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＣＬＡ等級、６〜８週、体重１８〜２２ｇ）は、Animal Center of Military Medical Academy of Science, Beijing, Chinaから入手した。
【０１６５】
１．３ 細胞系
肝癌Ｈ２２細胞株を保持したマウスは、Tumor Department of Medical Institute of China Medical Academy of Science, Beijing, Chinaから入手した。
【０１６６】
１．４ 動物の群別
健常ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６（８０μｇ／ｋｇ／日）、５−Ｆｕ（２０ｍｇ／ｋｇ／日、２日毎に１回）、食塩水（０．２ｍｌ／日）、および正常群（腫瘍細胞を接種していない）の各群に無作為に分けた。
【０１６７】
１．５ 肝癌Ｈ２２マウスモデルの投与
６〜８日間肝癌を接種したマウスを屠殺した。腹水を採集し、細胞濃度をＤ−ハンクス液で５×１０７個／ｍｌに調整した。これを０．２ｍｌ、正常対照を除外して各ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内に接種した。
【０１６８】
１．６ 試験物質の投与
試験物質の投与は、細胞接種後の翌日に開始した。該ペプチドおよび食塩水を毎日、５−ＦＵは２日毎に１回、６０日間連続して、またはマウスが死ぬまで投与した。
【０１６９】
１．７ 生存期間の記録
死亡時期を記録し、生存期間の延長を算出した。生存期間延長を以下のように算出した。
生存期間延長率（％）＝（試験群の平均生存日数）−（食塩水対照群の平均生存日数）／（食塩水群の平均生存日数）×１００％
６０日間を超えて生存したマウスを長期間生存マウスと見なした。
【０１７０】
１．８ 統計的方法
統計的比較のためにＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を用い、０．０５以下のＰ値を統計的に有意性ありと見なした。
【０１７１】
２ 結果
実験は別々に２回行い、その結果は以下の通りである。
【０１７２】
【表１４】
【０１７３】
【表１５】
【０１７４】
３ 結論
ＣＭＳ０２４．０４、ＣＭＳ０２４．０５、ＣＭＳ０２４．１４、およびＣＭＳ０２４．１６は、食塩水対照群と比較して統計的有意性をもって、Ｈ２２肝癌の移植を受けたマウスの生存を延長できることが判明し、これらのペプチドが癌の管理に使用し得ることを示した。
【０１７５】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Y Zhai and ZJ Lu. Effect of thalidomide on tumor growth in mouse hepatoma H22 model. Ai Zheng, Dec 2003; 22(12):1301-6.
[2] YX Yang, L Zhu, X He, et al. Antitumor activity of mitoxantrone-nanosphere against murine liver tumor H22. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban, Jan 2004; 35(1):68-70.
【実施例７】
【０１７６】
ラットにおけるカラゲニン誘発足部腫脹に対するＣＭＳ−０３０の効果
目的：ＣＭＳ−０３０の抗炎症特性の調査。
【０１７７】
方法：カラゲニン誘発足部腫脹動物モデルを使用して、ＣＭＳ−０３０の抗炎症特性を調べた。
【０１７８】
結果：２〜２０μｇ／ｍｌの投与量で、ＣＭＳ−０３０は、統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、対照群と比較して処置群における足部腫脹を抑制できることが判明した。
【０１７９】
結論：ＣＭＳ−０３０は、カラゲニン誘発足部腫脹ラット動物モデルに対して、統計的に有意な抗炎症効果を有することが示された。
【０１８０】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−０３０：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
カラゲニン：Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
デキサメタゾン（ＤＸＭ）：Tianjin JinYao Co. Ltd., Tianjin, PR China
【０１８１】
１．２ 動物
６〜８週齢で体重１８０〜２２０ｇのウィスターラット、Vitalriver Experiment Animal Co. Ltd., Beijing, PR China
【０１８２】
１．３ 方法［１］
ウィスターラットをＤＸＭ群（０．２ｍｇ／ｋｇ／日）、食塩水対照群（１ｍｌ／日）、および３投与量のＣＭＳ−０３０群（２、１０、２０μｇ／ｍｌ／日）に無作為に振り分けた。薬物は全て、食塩水で０．５ｍｌに希釈し、毎日腹腔内（ｉ．ｐ）に投与した。薬物投与から２週間後、１％カラゲニン食塩水０．１５ｍｌを皮下注射で右足に接種した。０．５時間後、右足の周囲長を精確に測定し、接種後の周囲長から接種前の周囲長を差し引くことにより、足部腫脹を算出した。抑制指数（％）＝（食塩水対照群の足部腫脹−薬物群の足部腫脹）／食塩水対照群の足部腫脹×１００％。
【０１８３】
１．４ 統計分析
一元配置ＡＮＯＶＡの分析を用いて統計分析を行った。
【０１８４】
２ 結果
【０１８５】
【表１６】
【０１８６】
結論
ラットにおけるカラゲニン誘発足部腫脹は、インビボでの急性炎症の確立された動物モデルであり、薬物の抗炎症効果の評価に使用された［２］。カラゲニンは、炎症部位にプロスタグランジンの過剰合成を誘発することができる。他の血管作用物質と共同して、過剰生成プロスタグランジンは局所的腫脹を誘発することになろう。ＣＭＳ−０３０は、統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、ラットにおいてカラゲニンが誘発した足部腫脹を抑制できることが判明した。したがって、ＣＭＳ−０３０は、抗炎症性を有することが示された。
【０１８７】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Li Jinhua, Zhang Huiqing, Zheng Kezhi, et al. Inhibitory effects of Orgotein on the swelling of hind paw in rats induced by carrageenin. Suzhou University Journal of Medical Science, 2002, Vol, 22(4):386-388.
[2] Huang Zhili, Kagoshima Masatoyo, Kagawa Eiichiro, Anti-inflammatory and ulcerogenic effects of 3-(N,N-diethylamino) propylindometacin HCl. Acta Pharmacologica Sinica, 1997, Vol, 18(4):306-308.
【実施例８】
【０１８８】
肥満に対するＣＭＳ−０３０の効果
目的：過食ラットを動物モデルとして用いたＣＭＳ−０３０の抗肥満効果の決定。
【０１８９】
方法：ラットに高栄養食事を６週間与えることにより、肥満モデルを開発した。次いで、そのラットを、ＣＭＳ−０３０（皮下に、１５０、３００および６００μｇ／ｋｇ／日の投与量）または食塩水で４週間処置した。ラットを１週につき１回体重測定し、実験終了時に屠殺して腹部および精巣の脂肪体ならびに血中脂質を測定した。
【０１９０】
結果：ＣＭＳ−０３０は、食塩水対照群と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、ラットにおける体重、脂肪体指数、血清トリグリセリド量、および血清総コレステロール量を減少させることができることが判明した。
【０１９１】
結論：ＣＭＳ−０３０は、抗肥満性を有し、食事誘発肥満障害の管理に使用し得る。
【０１９２】
材料および方法
１ 材料
１．１ 試験物質および動物
ＣＭＳ−０３０は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
特定病原体未感染等級で、体重１３５±１５ｇの雄性スプレイグ・ドーリー（ＳＤ）ラット：Experimental Animal Center of First Military Medical University
【０１９３】
１．２ 試薬キット
トリグリセリドキット：Shanghai Rongcheng Biotechnology Laboratory
血清総コレステロールキット：Zhongsheng Beikong Biotechnology Holding Ltd.
【０１９４】
２ 方法
高栄養および標準栄養食餌の処方は、State Food and Drug Administration, PR China (SFDA)刊行のGuideline for Pre-clinical Research of Anti-obesity Drug［１］ に従って作成した。
【０１９５】
肥満モデル［２］は、ラットに高栄養食事を６週間与えることにより樹立した。標準食事を与えたラットは、正常対照として使用した。次いで、肥満ラットをＣＭＳ−０３０（１５０、３００および６００μｇ／ｋｇ／日を毎日１回、皮下に）または食塩水で４週間処置した。試験物質での処置中には、全てのラットが標準食事を取った。ラットを週毎に体重測定し、実験終了時に屠殺して腹部および精巣の脂肪体、ならびに脾臓、肝臓、腎臓および胸腺の重量を測定した。血中脂質を分析するために、ラット血液も抜き取った。
【０１９６】
脂肪体指数は、脂肪体重量（ｇ）／体重（ｇ）×１０００として算出した。
【０１９７】
臓器指数は、臓器重量（ｇ）／体重（ｇ）×１０００として算出した。
【０１９８】
３ 統計分析
データは、平均値±標準偏差として提示してある。ソフトウェアＤＡＳ（Drug And Statistics Ver1.0）を用いた各群内または群同士間の比較に、対応のあるｔ−検定または単一因子ＡＮＯＶＡを適用した。Ｐ＜０．０５を統計的に有意性ありと見なした。
【０１９９】
４ 結果
【０２００】
【表１７】
【０２０１】
【表１８】
【０２０２】
【表１９】
【０２０３】
【表２０】
【０２０４】
【表２１】
【０２０５】
結論
適切な投与量のＣＭＳ−０３０は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、栄養肥満ラットにおける体重減少を誘発し、各血中脂質量を低減できることが判明した。該物質の投与中に、食欲に有意な変化はなかった。ＣＭＳ−０３０は、栄養関連の肥満および脂質過多の管理に使用し得る。
【０２０６】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
1. SFDA, PR China. The guideline for pre-clinical research of new drugs. 1993. 193-194.
2. Bays HE. Current and investigational anti-obesity agents and obesity therapeutic treatment targets. Obes Res. 2004; 12 (8):1197-1211.
【実施例９】
【０２０７】
マウスにおける遅延過敏症に対するＣＭＳ−０３０の効果
目的：マウスにおける遅延過敏症（ＤＴＨ）に対するＣＭＳ−０３０の抑制効果の調査。
【０２０８】
方法：ＣＭＳ−０３０の免疫抑制効果を示すために、２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）誘発耳腫脹を使用した。
【０２０９】
結果：１０μｇ／ｋｇ／日で、ＣＭＳ−０３０は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、マウスにおけるＤＮＦＢ誘発耳腫脹を抑制できることが判明した。
【０２１０】
結論：ＣＭＳ−０３０は、免疫抑制特性を有し、免疫関連障害の管理に有用となり得る。
【０２１１】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−０３０：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
２，４−ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）：Smack Co. Ltd.
硫化ナトリウム（Ｎａ２Ｓ）：Tianjin Beilian Chemical Co. Ltd., Tianjin, PR China
【０２１２】
１．２ 動物
特定病原体未感染等級（ＳＰＦ）の６〜８週齢で、体重１８〜２２ｇのＢａｌｂ／ｃマウス：Military Medical Academy of Science, PR China
【０２１３】
１．３ 方法
ＢＡＬＢ／ｃマウスを食塩水対照（０．５ｍｌ／日）およびＣＭＳ−０３０（１０μｇ／ｋｇ／日）の各群に無作為に分けた。試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、感作前の２週間、１日１回腹腔内に投与した。
【０２１４】
感作の前日、マウスの腹部を８％Ｎａ２Ｓ溶液で脱毛した。ＤＮＦＢをアセトン／オリーブ油（４：１）に溶解して１％の最終濃度とし、感作のためにその５０μｌを脱毛域に塗布した。初回感作から４日後、遅延過敏症性炎症を引き起こすために、１％ＤＮＦＢ溶液１０μｌを右耳に局所的に塗布した。ＤＮＦＢを含まない溶媒の同容量をベースラインとして左耳に塗布した。２４時間後、直径６ｍｍのパンチを用いて左右両耳の同一箇所から耳組織一片を採取し、その組織を正確に秤量した。左耳の組織重量を同一マウスの右耳の組織重量から差し引くことにより、耳腫脹を算出した［１］。抑制率（％）＝（食塩水対照の耳腫脹−試験群の耳腫脹）／食塩水対照の耳腫脹×１００％。
【０２１５】
１．４ 統計分析
統計分析は、ＳＰＳＳによる一元配置ＡＮＯＶＡを用いて行った。
【０２１６】
２ 結果
【０２１７】
【表２２】
【０２１８】
３ 結論
ＣＭＳ−０３０は、食塩水対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０５）をもって、ＤＮＦＢに対するマウスの遅延過敏症反応を抑制できることが判明した。これは、ＣＭＳ−０３０が過敏症関連免疫障害の管理に使用し得ることを示した。
【０２１９】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
[1] Li Weidong, Ren LianSheng, Lin Zhibin, et al. Preliminary study on immunomodulating actions of Actarit in mice. Journal of Beijing Medical University, 2000, Vol, 1(32):1-3.
【実施例１０】
【０２２０】
インビボでのＣＭＳ−０３０の免疫抑制特性に関する試験
目的：ＣＭＳ−０３０の抗同種移植片拒絶特性の調査。
【０２２１】
方法：ＣＭＳ−０３０の免疫抑制特性は、インビトロでのＴリンパ球増殖および混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で観察した。同種移植片の生存に対するＣＭＳ−０３０の効果は、インビボでのマウスの皮膚および心筋同種移植片動物モデルについて観察した。移植片受容動物の形質転換したＴ細胞および脾臓細胞のＩＬ−２分泌に対するＣＭＳ−０３０の効果も、観察した。
【０２２２】
結論：ＣＭＳ−０３０は、抗同種移植片拒絶特性を有することが認められた。Ｔリンパ球活性およびリンパ球によるＩＬ−２分泌の抑制を介して、これを媒介し得る。
【０２２３】
１ 材料および方法
１．１ 動物
５週齢で、特定病原体未感染の雌性および雄性のＢａｌｂ／ｃ（Ｈ−２ｂ）およびＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｈ−２ｄ）マウス：Institute for Laboratory Animals of Military Medical Academy of Science (Beijing, China)。雄性および雌性が半々。
【０２２４】
Ｃ５７ＢＬ／６新生児マウスは、自己飼育で得た。
【０２２５】
１．２ 薬物および他の試薬
ＣＭＳ−０３０：Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaによる特注合成
サイクロスポリン（ＣｓＡ）：Novartis Pharmaceutical Co. Ltd., Basel, Switzerland。ＣｓＡの全群に対して最終容量０．５ｍｌにして溶解。
ウシ血清、ＲＰＭＩ−１６４０、ハンクス液：GIBCO（登録商標）, Invitrogen, Carlsbad, California, USA
ＭＴＴ、ＣｏｎＡ：Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA
ＮａＳ：Tianjin Beilian Fine Chemicals Co., Ltd., Tianjin, PR China
マウスＩＬ−２ Ｅｌｉｓａキット：R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA
【０２２６】
１．３ 動物の群別
インビボ試験に対して、マウスを以下の各群に無作為に分けた。
ＣＭＳ−０３０（１０μｇ／ｋｇ／日）
ＣＭＳ−０３０（２μｇ／ｋｇ／日）
ＣｓＡ（１０ｍｇ／ｋｇ／日）
生理食塩水（０．５ｍｌ／日）
【０２２７】
各溶液は、移植前の５日間、１日１回腹腔内注射により投与し、手術後更に２０日間継続した。
【０２２８】
１．４ インビトロでのＴリンパ球増殖に対するＣＭＳ−０３０の効果［１］
健常Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓を無菌的に切除し、氷冷したＤ−ハンクス液に浸漬した。脾臓細胞は、ＲＰＭＩ−１６４０中、つや消しスライドグラスで脾臓を破壊することにより調製した。その細胞をＲＰＭＩ−１６４０中、４℃および１２００ｒｐｍで１０分間、２回洗浄した。次いで、細胞数を計数し、各アッセイに必要な濃度に調整した。実験における細胞生存率は、トリパンブルー排除法で決定したが、９５％を超えるべきである。
【０２２９】
健常マウスの脾臓細胞は、９６穴プレート中で培養し、４×１０５個／穴の濃度に調整した。ＣＭＳ−０３０を最終濃度４０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１．６μｇ／ｍｌおよび０．３２μｇ／ｍｌで各穴に添加した。そのプレートを最終濃度５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）の存在下、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中６８時間インキュベートした。陽性対照群には、ＣＭＳ−０３０を添加しなかった。陰性対照群には、ＣｏｎＡ、ＣＭＳ−０３０のいずれも添加しなかった。リンパ球の増殖は、インキュベーションの終了時に、臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム（ＭＴＴ）比色アッセイにより測定した。ＭＴＴを２０μｌ各穴に添加し、プレートを更に４時間インキュベートした。次いで、イソプロピルアルコール中の０．０４Ｍ ＨＣｌを１００μｌ各穴に添加することにより、ホルマザン沈殿を可溶化した。各試料のＯＤは、６３０ｎｍを基準とした５７０ｎｍで分光法で測定した。
【０２３０】
１．５ インビトロでの混合リンパ球反応（ＭＬＲ）に対するＣＭＳ−０３０の効果［２］
健常Ｂａｌｂ／ｃマウスの脾臓細胞を氷冷したＤ−ハンクス液で洗浄し、ＲＰＭＩ−１６４０中８×１０６個／穴へ再懸濁することにより、応答細胞を形成した。健常Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓細胞懸濁液に、３７℃のＲＰＭＩ−１６４０中、５％ＣＯ２中で４５分間マイトマイシン（２５μｇ／ｍｌ）とインキュベートした後、ＲＰＭＩ−１６４０で洗浄し、８×１０６個／穴へ再懸濁することにより、刺激細胞を形成した。試験群に対する９６穴培養プレートを用いて、応答細胞１００μｇおよび刺激細胞１００μｇ、更に最終濃度が４０μｇ／ｍｌ、８μｇ／ｍｌ、１．６μｇ／ｍｌまたは０．３２μｇ／ｍｌとなるように、ＣＭＳ−０３０を２０μｌ添加した。陽性対照群に対しては、応答細胞１００μｌ、刺激細胞１００μｌおよびＲＰＭＩ−１６４０を２０μｌ添加した。陰性対照群に対しては、刺激細胞２００μｌおよびＲＰＭＩ−１６４０を２０μｌ添加した。並行する６穴を各組合せに対して用いた。３７℃および５％ＣＯ２で５日間インキュベーションした後、リンパ球の増殖をＭＴＴ比色アッセイにより測定した。
【０２３１】
１．６ インビボでの心臓移植片の生存に対するＣＭＳ−０３０の効果［３］
２４時間齢新生児Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから、供与心臓を切除した。その心臓をＤ−ハンクス液に浸漬し、心臓腔から血液を一掃した。その心臓を健常成体Ｂａｌｂ／ｃ受容マウスの耳介道に皮下移植した。心臓および該経路中の空気は、僅かな圧力で追い出した。移植後の６日目から開始して、移植心臓の心電図（ＥＣＧ）を毎日撮った。３日連続ＥＣＧ信号がなければ、移植術が失敗であることを示し、そのマウスを統計分析から除外した。ＥＣＧは毎日追跡し、拒絶時期をＥＣＧ信号が消えた日とした。試験物質は、手術の６日前から開始して腹腔内に投与した。１群につきマウスは１０匹であった。サイクロスポリンＡは１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＭＳ−０３０は１０μｇ／ｋｇ／日または２μｇ／ｋｇ／日、食塩水は０．５ｍｌ／ｋｇ／日を投与した。統計分析は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの対数順位検定による食塩水処置群との比較を用いて行った。
【０２３２】
１．７ インビボでの皮膚同種移植片の生存に対するＣＭＳ−０３０の効果［４］
Ｂａｌｂ／ｃマウスの背部の毛１パッチを８％Ｎａ２Ｓ溶液により除去した。翌日、その皮膚を外科的に除去することにより、約１ｃｍ２の創傷床を生成し、次いでその創傷床上に、同性のＣ５７ＢＬ／６Ｊ供与マウスの全厚尾部皮膚片１ｃｍ２を載せた。その手術部位をパラフィンガーゼ層で被覆、保護した後、絆創膏を施した。移植から８日後に絆創膏を外し、同種移植片の生存性について受容マウスを毎日監視した。拒絶の終点は、同種移植片の１０％未満だけがなお生存しているときに設定した。試験物質による腹腔内処置は、手術の６日前に開始した。１群につきマウスは１０匹であった。サイクロスポリンＡは１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＣＭＳ−０３０は１０μｇ／ｋｇ／日または２μｇ／ｋｇ／日、食塩水は０．５ｍｌ／ｋｇ／日を投与した。処置は、手術後更に２０日間継続した。
【０２３３】
１．８ インビボでのＴリンパ球増殖に対するＣＭＳ−０３０の効果［５］
皮膚移植片受容マウスの脾臓細胞を分離し、ＲＰＭＩ−１６４０中で４×１０６個／ｍｌに再懸濁した。細胞１００μｌ／穴を９６穴プレート中に添加した。試験穴に対しては、ＣｏｎＡ１００μｌを添加して最終濃度５μｇ／ｍｌとした。対照穴に対しては、ＲＰＭＩ−１６４０を１００μｌ代わりに添加した。１条件につき並行穴４個。細胞は、３７℃および５％ＣＯ２で６８時間インキュベートした。リンパ球の増殖は、ＭＴＴ比色アッセイにより測定した。各試料のＯＤは、６３０ｎｍを基準とした５７０ｎｍで分光法で測定した。データは、試験群のＯＤを対照群のＯＤで割った刺激指数として表示した。
【０２３４】
１．９ インビボでのＩＬ−２量に対するＣＭＳ−０３０の効果［６］
皮膚移植片受容マウスの脾臓細胞を分離し、ＲＰＭＩ−１６４０中で２×１０６個／ｍｌに再懸濁した。細胞１．５ｍｌ／穴を２４穴プレート中に添加し、付着させるために２４時間インキュベートした。ＣｏｎＡ１００μｌを添加して最終濃度１０μｇ／ｍｌとした。細胞を更に４８時間インキュベートし、続いて遠心分離後に上清を採集した。培養上清中のＩＬ−２量をＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２３５】
１．１０ 統計分析
Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒの対数順位検定による対照群との比較を用いて、同種移植片の生存期間の分析を行った。ステューデントの両側ｔ検定による平均値の分散との比較は、他の実験のために使用した。
【０２３６】
２ 結果
【０２３７】
【表２３】
【０２３８】
【表２４】
【０２３９】
【表２５】
【０２４０】
【表２６】
【０２４１】
【表２７】
【０２４２】
【表２８】
【０２４３】
結論
０．３２μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＭＳ−０３０は、インビトロでのＣｏｎＡ誘発Ｔリンパ球増殖を統計的に有意に抑制できることが判明し、ＣＭＳ−０３０がインビトロでＴリンパ球の増殖を抑制できることを示した。ＭＬＲは、異なるＨＬＡ−ＩＩ分子に対するリンパ球の応答を判定するためのインビトロ実験であり、臓器移植後の拒絶性を予測するモデルである［７］。１．６μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌの濃度で、ＣＭＳ−０３０は、混合リンパ球反応を統計的に有意に抑制できることが判明し、ＣＭＳ−０３０が臓器移植後の拒絶性を減少させることができることを示した。
【０２４４】
心臓移植片および皮膚同種移植片の実験は、移植後の拒絶を抑制する研究の動物モデルであった［７］。投与量２μｇ／ｋｇ／日および１０μｇ／ｋｇ／日のＣＭＳ−０３０は、統計的有意性をもって移植片の生存を延長できることが判明し、ＣＭＳ−０３０が、宿主免疫応答による移植片の拒絶を抑制できることを示した。皮膚移植片受容マウスから分離した脾臓細胞の分析により、ＣＭＳ−０３０は、いずれも統計的有意性をもって、リンパ球の活性化およびＴリンパ球によるＩＬ−２分泌を抑制できることが明らかとなり、同種移植片の生存延長が、受容動物の免疫応答の抑制により実現されることを示した。
【０２４５】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
［１］ Ｒｏｍａ Ｋａｌｒａ， Ｓｈａｓｈｉ Ｐ． Ｓｉｎｇｈ， Ｊｕａｎ Ｃ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ ａｎｄ Ａｎｔｉ−Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ Ｎｉｃｏｔｉｎｅ Ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ Ｐａｔｃｈ ｉｎ ａｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｒｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｍａｙ ２００４， ５６３？５６８．
［２］ Ｄｕｂｅｙ ＤＰ， Ｙｕｎｉｓ Ｉ， Ｙｕｎｉｓ ＥＪ， ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌａｒ ｔｙｐｉｎｇ： ｍｉｘｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｌｙｓｉｓ． Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８６， ８４７−８４８．
［３］ Ｖａｋｅｖａ Ａ Ｌａｕｒｉｌａ Ｐ，Ｍｅｒｉ Ｓ， ｅｔ ａｌ．． Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｔｔａｃｋ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ． Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ， １９９３， １４３：６５．
［４］ Ｍｉｎｇ Ｊｉａｎｋｕｏ， Ｗａｎｇ Ｘｉｎｇｂｉｎｇ， Ｈｕａｎｇ Ｂａｏｊｕｎ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｐｒｏｌｏｎｇｓ Ｓｋｉｎ Ａｌｌｏｇｒａｆｔ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｂｙ Ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＣＸＣＲ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ Ｇｒａｆｔ． Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， ２００３， １７０：１５５６？６５．
［５］ Ｍａｒｉａ Ａ． Ｐｕｅｒｔｏｌｌａｎｏ， Ｍａｎｕｅｌ Ａ． ｄｅ Ｐａｂｌｏ， ｅｔ ａｌ． Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｄｉｅｔａｒｙ Ｌｉｐｉｄｓ ａｓ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃｅｌｌｓ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ． Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ． ２００２， ９：３５２−３５７．
［６］ Ｍａｙｕｍｉ Ｈ，Ｈｉｍｅｎｏ Ｋ，Ｓｈｉｎ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｄｒｕｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ａｌｌｏｇｒａｆｔｓ ｉｎ ｍｉｃｅ． Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， １９８５， １６９（２）：１４７−１６１．
［７］ Ｒｅｎｅ Ｊ．Ｄｕｑｕｅｓｎｏｙ Ｌｉ ＹＰ． Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ． ２００２， １０：５−７．
【実施例１１】
【０２４６】
マウスの運動誘発疲労に対するペプチドの効果
目的：Ｂａｌｂ／ｃマウスに対するペプチドの抗疲労効果の調査。
【０２４７】
方法：雄性Ｂａｌｂ／ｃマウスの水泳時間をペプチドの抗疲労効果を調べる動物モデルとして使用した。
【０２４８】
結果：ＣＭＳ−００１．３０およびＣＭＳ−００１．３１は、対照と比較して統計的有意性（Ｐ＜０．０１）をもって、マウスの水泳時間を延長できることが判明した。
【０２４９】
結論：ＣＭＳ−００１．３０およびＣＭＳ−００１．３１は、抗疲労特性を有しており、疲労関連障害の管理に使用し得る。
【０２５０】
１ 材料および方法
１．１ 薬物および試薬
ＣＭＳ−００１．３０およびＣＭＳ−００１．３１は、Shenzhen Kangzhe Pharmaceutical Co. Ltd., Shenzhen, PR Chinaにより特注合成された。
エリスロポエチン（ＥＰＯ）：Japan Kunpeng Medical Corporation
【０２５１】
１．２ 動物
特定病原体未感染（ＳＰＦ）等級で体重１８〜２２ｇの雄性Ｂａｌｂ／ｃマウス：Academy of Military Medicines and Sciences Experimental Animal Center, PR China
【０２５２】
１．３ 群別および方法［１］
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、ＣＭＳ−００１．３０（２０μｇ／ｋｇ／日）、ＣＭＳ−００１．３１（２０μｇ／ｋｇ／日）、ＥＰＯ（１０００ｕ／ｋｇ／日、週３回）、および食塩水対照の各群に無作為に分けた。試験物質を食塩水０．５ｍｌに溶解し、１日１回３０日間連続して腹腔内に適用した（ＥＰＯを適用しない場合、ＥＰＯを食塩水で代用した）。１０日目に、マウスを水温２５±１℃で１０分間泳ぐように訓練した。試験物質の最終投与から３０分後、マウスを水泳槽（５０ｃｍ×５０ｃｍ×４０ｃｍ）中で泳ぐように配置した。水深は３０ｃｍ、水温は２５±１℃であった。マウスの四肢は、その全過程で動かし続けられた。死亡するまでのマウスの水泳時間（分）を記録した。
消耗的水泳時間延長率（ＥＳＴＲ）（％）＝（試験群の平均消耗的水泳時間−食塩水対照の平均消耗的水泳時間）／（食塩水対照の平均消耗的水泳時間）×１００％
【０２５３】
１．４ 統計
群同士間の差異は、ＡＮＯＶＡ分散分析で分析した。
【０２５４】
２ 結果
【０２５５】
【表２９】
【０２５６】
３ 結論
ＣＭＳ００１−３０およびＣＭＳ００１−３１は、抗疲労特性を有することが判明したので、疲労関連障害の管理に使用することができる。
【０２５７】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
１． Ｍｉｚｕｎｏｙａ Ｗ， Ｏｙａｉｚｕ Ｓ， Ｉｓｈｉｈａｒａ Ｋ， ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｍｅａｓｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｕｒａｎｃｅ ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ ｍｉｃｅ ｉｎ ａｎ ａｄｊｕｓｔａｂｌｅ−ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｗｉｍｍｉｎｇ ｐｏｏｌ． Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２００２ Ｍａｙ； ６６（５）：１１３３−１１３６．
【０２５８】
上記情報に基づいて、多様な医薬製剤を開示したペプチドから作製することができる。該医薬製剤は、公知の医薬担体のいずれを含んでもよい。適切な担体の例には、医薬として許容される当業者に公知の標準的担体が含まれる。こうした担体には、それだけに限らないが、生理食塩水、水、油水混合物またはトリグリセリド乳濁液を含む乳濁液、ならびに他種の作用剤、充填剤、コート錠およびカプセルが挙げられる。適当な担体は、医薬組成物の投与方式に基づいて選択し得る。
【０２５９】
医薬製剤は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、および皮下埋め込みを介して投与することができる。該ペプチドは、例えば、錠剤、カプセル、懸濁液、溶液などの経口投与の任意の形態、即ち、改変しない通常の形態、もしくは徐放形態、または胃腸保護をして、もしくはせずに投与することもできる。該ペプチドは、軟膏、クリーム、ゲルなどの局所塗布の任意の形態で、経皮的促進用具を使用し、または使用せずに適用することもできる。該ペプチドは、単独で、または他のペプチド配列と組み合わせて、その遺伝子配列中に解釈し込み、発現系の中にクローニングすることにより、生成ペプチド分子を発生させて、本明細書に記載の該ペプチドの活性を利用してもよい。
【０２６０】
各ペプチドの投与量は、１ｎｇ〜１０ｇ／ｋｇ体重とし得る。好ましい投与量は、注射投与方式に対して、１０ｎｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１μｇ〜１ｍｇ／ｋｇである。しかし、該ペプチドの１種または複数は、正常な生理的応答のカスケードを誘発すると見込まれる受容体を介して作用し得るので、その有効用量は１ｎｇ／ｋｇ体重という少量にもなることができる。あるいは、該ペプチドの１種または複数は、全反応カスケードの単なる開始剤に過ぎないこともある。経口摂取に対しては、その量は、１ｎｇ〜１０ｇ／日／ｋｇ体重、より好ましくは０．１μｇ〜１ｇ／日／ｋｇ体重、更により好ましくは１μｇ〜１０ｍｇ／日とし得る。
【０２６１】
前記ペプチド配列に基づく遺伝子治療は、当技術分野で公知の方法に基づき、またその全体が参照により本明細書に組み込まれている、特許公開ＷＯ０３／００６４９２Ａ２にも基づいて実施し得る。該ペプチドは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、特許公開ＷＯ２００４／０５５０４２Ａ１に開示された教示に基づいて、他の強化分子と結合させてもよい。
【０２６２】
参考資料
以下の参考資料を出典明示によりその全内容を本明細書の一部とする。
１． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇｓ， Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． １９９３， ７：１３４−１３５．
２． Ｓｈｕｙｕｎ Ｘｕ， Ｒｕｌｉａｎ Ｂｉａｎ， Ｘｉｕ Ｃｈｅｎ． Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ． Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ． １９９１， １２２１−１２３４．
３． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃ ｉｓｓｕｅｄ ｂｙ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． １９９３， ７：１４０．
４． Ｊｉｎｓｈｅｎｇ Ｈｅ， Ｒｕｉｚｈｕ Ｌｉ， Ｔｉｎｇｙｉ Ｚｏｎｇ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ＭＴＴ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｔｅｓｔｉｎｇ ＮＫ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ． Ｃｈｉｎａ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ． １９９６， １（６）：３５６−３５８．
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６． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃ ｉｓｓｕｅｄ ｂｙ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． １９９３， ７：１４１．
７． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃ ｉｓｓｕｅｄ ｂｙ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． １９９３， ７：１３２−１３３．
８． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ ｎｅｗ ｄｒｕｇ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃ ｉｓｓｕｅｄ ｂｙ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ． １９９３， ７：１２８−１２９．
９． Ｙｕａｎｐｅｉ Ｚｈａｎｇ， Ｈｕａｉｄｅ Ｓｕ． Ｐｈａｍａｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ （ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）． Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ． １９９８， １３７−１３８．
１０． Ｊｉａｔａｉ Ｌｉ， ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ）． Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｈｏｕｓｅ． １９９８， １３３８−１３３９．
【実施例１２】
【０２６３】
遺伝子操作した乳酸桿菌細菌種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための一例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、当業者によく知られた遺伝子操作の標準的技術を用いて、発現ベクター中へ挿入される。選択された発現ベクターは、乳酸桿菌において機能的な構造性プロモーター、特定の５’ないし３’配向におけるＤＮＡ配列の導入のためのマルチプルクローニングサイト、ならびに抗生物質耐性（クローニング法において助けるための）を与える選択マーカー遺伝子を含有し、ペプチドの生産および／または分泌を補助するための他の配列、例えば、シグナルペプチド配列を含みうる。かかるベクターの例は、Pavlaの米国特許第５，５９２，９０８号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）によって提供される。簡単に言うと、該特許は、乳酸桿菌種において機能する数個の既知のプロモーター、ならびに該細菌中の新規なプロモーター（そのいずれも、乳酸桿菌中でペプチドを発現するように、本発明のペプチドをコードしている核酸に作動可能に連結されていてもよい）を見出す方法を論じる。上記の米国特許第５，５２９，９０８号に記載のようなラクトバシラス・ラクチス中で活性な１６ないし３５個のほとんど疎水性のアミノ酸よりなるペプチドのようなシグナルペプチドをコードしている核酸は、プロモーターと本発明のペプチドをコードしている核酸との間に挿入され、その結果、シグナルペプチドをコードしている核酸は、本発明のペプチドをコードしている核酸を有するフレーム内にある。
【０２６４】
ペプチドのコーディング配列のほかに、合成されたＤＮＡ配列は、該ＤＮＡの発現ベクター中への連結およびクローニングにおいて助けとなる配列を含んでいてもよい。例えば、ベクターのマルチプルクローニングサイトにおいて見出される配列に対応する制限酵素認識部位を、該配列の５’および３’末端にて該合成ＤＮＡ中に組み込むことができ、その結果、該配列をベクター内で適当な配向でクローン化することができる。ベクターおよび合成ＤＮＡの両方とも、特定の制限酵素で消化され、次いで、精製される。ベクターおよび合成ＤＮＡとの連結反応の後、イー・コリの適当な株に形質転換する。形質転換された細菌は、ベクターが耐性を与える抗生物質を含有する培地に植える。形質転換された細菌のコロニーを、生育培養およびプラスミド調製法について選択し；正しい配向の合成ＤＮＡの存在を確認する。
【０２６５】
次いで、発現ベクターを乳酸桿菌種、例えば、エル・アシドフィルスの細菌宿主細胞中に形質転換する。形質転換細胞は、ベクター配列内に見出される選択マーカーによって選択され、該ペプチドの分泌は、ウェスタン・ブロットを行い、成長培地中に存在するペプチドのゲル電気泳動を行い、または他の標準的な技術によって証明されうる。細菌の形質転換コロニーを選択し、遺伝子操作した細菌の大量培養を調製するために用いる。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した細菌の培養物を増殖させ、少なくとも、その一部を、その中で細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、細菌培養物は、宿主による腸での消費のためのサプリメントを生産するための種々の方法において処理することができる。これらの処理は、凍結乾燥または細菌を保存するための他の方法を包含し、さらに、細菌と担体薬剤、例えば、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどと組み合わせる。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。例えば、細菌を用いて、ヒト消費用の発酵乳製品または他の食品を製造することができ、その結果、該ペプチドを発現している生物は宿主生物の胃でコロニー形成する。乳酸菌の特定の株をヨーグルト、キムチ、チーズおよびバターなどの食品中に組み込むための多くの異なる方法が、Ohの米国特許第６，０３６，９５２号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）において開示される。多くの経路のうち１つによる細菌の消費において、操作された生物は胃でコロニー形成でき、胃の粘膜層を介する本発明のペプチドの提示および／または吸収を可能にする。
【実施例１３】
【０２６６】
バシラス・サチルスの遺伝子操作形態によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙したペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって、発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、イー・コリおよびビー・サチルスの両方において増殖することができ、形質転換細菌のコロニーを選択するための抗生物質耐性遺伝子を含有するシャトルベクター、例えば、ｐＴＺ１８Ｒ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を含む。該ベクターは、ビー・サチルスにおいて活性な構造性プロモーター、例えば、ビー・サチルスのＳａｃ Ｂ遺伝子由来のプロモーターならびに細菌細胞からの発現した異種蛋白質の有効な輸送を指示するビー・サチルスにおいて活性なシグナルまたはリーダーペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含有することができる。かかるベクターの一例は、Fahnestockの米国特許第６，２６８，１６９号（出典明示により、全体として本明細書の一部とされる）に開示される。簡単に言うと、上記のように、本発明のペプチドをコードしているＤＮＡは、当業者によく知られた技術によって、ＤＮＡのクローニングを容易にするための制限酵素部位および／または他の配列を用いて合成されるであろう。イー・コリ中への形質転換、播種、選択およびプラスミドを増殖してプラスミドストックを作成後、該プラスミドをビー・サチルス中に形質転換し、播種培地において、形質転換体を抗生物質耐性によって選択する。
【０２６７】
遺伝子操作したビー・サチルスにおけるペプチドの生産および該細菌からのその分泌は、当業者によく知られた技術、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析またはウェスタンブロット後のオートラジオグラフィック検出のためのペプチドの放射能標識を用いて証明される。
遺伝子操作された細菌の培養物を増殖させ、少なくともその一部を細菌が増殖することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。
【実施例１４】
【０２６８】
遺伝子操作されたサッカロミセス酵母種によるペプチドの送達
下記に、上記のような宿主へ本発明のペプチドを送達するための別例の方法を提供する。上記の表Ａに列挙されたペプチドのうち１つをコードするＤＮＡ配列は、化学的手段によって合成され、該ＤＮＡ配列は、遺伝子操作技術（全ての技術は当該分野で知られている）によって発現ベクター中へ挿入される。選択される発現ベクターは、安定に維持された酵母蛋白質発現ベクターを含み、それは、ｐＡＤＨ１のような構造性酵母プロモーター、酵母およびイー・コリの両方におけるベクターの複製のための部位、選択目的のために栄養要求性酵母突然変異体に栄養を与える遺伝子、マルチプルクローニングサイト（ＭＣＳ）および、所望により、シグナルペプチドをコードする配列を含む。このようなベクターは、商業的に入手可能であり、当該分野でよく知られているか、または標準的な技術を用いて容易に構築できる。合成ＤＮＡの酵母ベクター中への挿入、イー・コリ中への形質転換、形質転換したイー・コリの選択培地への播種、形質転換した細菌コロニーの選択および該コロニー由来の細菌の成長培養物からのプラスミドＤＮＡの調製後、よく知られた技術、例えば、酢酸リチウム形質転換またはエレクトロポレーションによって、ベクターをサッカロミセス・セレビシエ中に形質転換する。形質転換のために選択されたサッカロミセス・セレビシエの株は、最少培地プレート上で生育するために、プラスミド上の遺伝子を必要とするであろう突然変異体栄養要求株である。形質転換された酵母コロニーは、ベクター上に提供される遺伝子を欠く成長培地上に酵母を播種することによって、単離される。ベクターおよびその選択遺伝子を受け取り、その遺伝子産物を発現している酵母だけが、最少培地上でコロニーに成長できるであろう。ペプチド分泌の証明は、ウェスタンブロットを行い、成長培地に存在するペプチドのゲル電気泳動を行うことによって、または他の標準的技術によって、得ることができる。
【０２６９】
酵母の形質転換コロニーを選択し、大量培養物を調製するために使用する。所望のペプチドを発現している遺伝子操作した酵母の培養物を増殖させ、少なくともその一部を、細菌が複製することのできる宿主生物の消化管、膣、気管または他の領域に投与する。所望により、酵母培養物は、宿主による腸での消化のためのサプリメントを生産する種々の方法において処理できる。これらの処理は、凍結乾燥または酵母を保存する他の方法を包含し、さらに、溶液、溶媒、分散培地、遅延剤、エマルジョンなどの担体物質と細菌を組み合わせることを含む。サプリメントを調製するためのこれらの薬剤の使用は、当該分野でよく知られている。別の具体例において、形質転換した酵母を、当業者によく知られた技術によって、食品、例えば、ヨーグルトおよびケフィールなどの発酵乳製品の生産に用いる。これらの食品中の生きている乳酸菌培養物と同様に、形質転換した酵母は、少なくとも一時的に胃でコロニー形成し、胃の管腔を介してペプチドを宿主へ提供する。
【０２７０】
本発明は上記した方法ならびに多くの場合において本明細書にて記載されるペプチドの実施例を用いて記載されるが、これは単なる例示であって、本発明を限定すると解釈すべきではない。本明細書に記載のペプチドは本発明の実施形態を示し、本発明の同じ原理はまたそのペプチドの生物学的機能に影響を及ぼすことなく修飾される他の機能的に均等なペプチドに適用できることも理解すべきである。さらには、これらペプチドの医薬用途について上記した疾患または障害がその有用性を支持するのに言及されているが、これらの医薬用途は単なる例示であって、特許請求の範囲を限定するのに用いるべきではない。これらペプチドおよびその機能的誘導体は、それ自身、免疫系を強化またはブーストし、疲労を緩和し、正常なヒトまたは感染患者の血中乳酸量を下げるための、健康食品サプリメントとしての使用に限定されるものではなく、他の可能性のある／意図する用途があることは明らかである。かかるいずれの使用もまた本発明の範囲内にある。
【０２７１】
前に公開されている配列を有するペプチドに関して、本発明はその新規かつ予期せぬ使用を提供するものであり、これらの新規な使用はこれらの既知のペプチドを以前には予期されない産業上の用途に用いることを支持すると考える。上記に、および特許請求の範囲に記載される新規な医薬用途とは別に、本明細書の教示に基づいて正常な個体の状態を改善するための食餌または栄養サプリメントとして用いることもできる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
前記栄養障害が、以下の状態：肝グリコーゲン貯蔵、血中乳酸量、血中脂質量、トリグリセリド量および総コレステロール量、肥満、ならびに体重過多の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項４】
前記代謝障害が、以下の状態：肝グリコーゲン貯蔵、血中乳酸量、血中脂質量、トリグリセリド量および総コレステロール量、肥満、ならびに体重過多の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項５】
前記脂質代謝が、以下の状態：血中脂質量、トリグリセリド量および総コレステロール量、肥満、ならびに体脂肪過多の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項６】
前記アシドーシスが、以下の状態：高血中乳酸量（複数）の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項７】
免疫活性の前記調節が、以下の状態：放射線療法誘発免疫不全症、免疫過敏症、Ｔリンパ球増殖、および混合リンパ球増殖の少なくとも１種の調節を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
前記癌増殖が、以下の癌：肝癌および胃癌の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１０】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項９に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１１】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体を含む、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１２】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項１１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１３】
本質的に、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１４】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項１３に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１５】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの強化誘導体を含む分子であって、前記強化誘導体が、前記生物活性ペプチドに作動可能に連結した強化分子を含み、前記強化分子が、前記生物活性ペプチドの治療有効性を強化する、強化誘導体を含む分子。
【請求項１６】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１７】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだペプチドをコードする、核酸配列を含む遺伝子組成物を有する微生物。
【請求項１８】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだ実質的に純粋なペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの医薬有効量の投与を含む、ヒト疾患の作用を低下させる方法。
【請求項２０】
前記ヒトが、以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種に罹っている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
以下の状態：個人の疲労、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量および免疫反応の少なくとも１種を調節する医薬の製造における、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２２】
配列番号１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人の肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量または免疫反応を調節する方法。
【請求項２３】
肝炎を治療する医薬の製造における、配列番号２もしくは１５を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２４】
配列番号２もしくは１５を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人における肝炎を治療する方法。
【請求項２５】
疲労を軽減する医薬の製造における、配列番号３を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２６】
配列番号３を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人における疲労を軽減する方法。
【請求項２７】
以下の状態：炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する医薬の製造における、配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２８】
配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人における以下の状態：炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する方法。
【請求項２９】
個人の免疫系を調節する医薬の製造における、配列番号７を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項３０】
配列番号７を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人の免疫系を調節する方法。
【請求項１】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む、実質的に純粋なペプチド。
【請求項２】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項３】
前記栄養障害が、以下の状態：肝グリコーゲン貯蔵、血中乳酸量、血中脂質量、トリグリセリド量および総コレステロール量、肥満、ならびに体重過多の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項４】
前記代謝障害が、以下の状態：肝グリコーゲン貯蔵、血中乳酸量、血中脂質量、トリグリセリド量および総コレステロール量、肥満、ならびに体重過多の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項５】
前記脂質代謝が、以下の状態：血中脂質量、トリグリセリド量および総コレステロール量、肥満、ならびに体脂肪過多の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項６】
前記アシドーシスが、以下の状態：高血中乳酸量（複数）の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項７】
免疫活性の前記調節が、以下の状態：放射線療法誘発免疫不全症、免疫過敏症、Ｔリンパ球増殖、および混合リンパ球増殖の少なくとも１種の調節を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項８】
前記癌増殖が、以下の癌：肝癌および胃癌の少なくとも１種を含む、請求項２に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項９】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列から本質的になる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１０】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項９に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１１】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体を含む、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１２】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項１１に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１３】
本質的に、配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの機能的誘導体からなる、実質的に純粋なペプチド。
【請求項１４】
以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種を調節する、請求項１３に記載の実質的に純粋なペプチド。
【請求項１５】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの強化誘導体を含む分子であって、前記強化誘導体が、前記生物活性ペプチドに作動可能に連結した強化分子を含み、前記強化分子が、前記生物活性ペプチドの治療有効性を強化する、強化誘導体を含む分子。
【請求項１６】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む遺伝子ベクター。
【請求項１７】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだペプチドをコードする、核酸配列を含む遺伝子組成物を有する微生物。
【請求項１８】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を含んだ実質的に純粋なペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号４、５、８〜１１からなる群から選択されたアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドの医薬有効量の投与を含む、ヒト疾患の作用を低下させる方法。
【請求項２０】
前記ヒトが、以下の状態：疲労、栄養障害、代謝障害、脂質代謝障害、アシドーシス、免疫活性、放射線作用、肝炎、移植臓器拒絶、癌増殖および食欲の少なくとも１種に罹っている、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
以下の状態：個人の疲労、肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量および免疫反応の少なくとも１種を調節する医薬の製造における、配列番号１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２２】
配列番号１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人の肝グリコーゲン貯蔵量、血中乳酸量または免疫反応を調節する方法。
【請求項２３】
肝炎を治療する医薬の製造における、配列番号２もしくは１５を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２４】
配列番号２もしくは１５を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人における肝炎を治療する方法。
【請求項２５】
疲労を軽減する医薬の製造における、配列番号３を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２６】
配列番号３を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人における疲労を軽減する方法。
【請求項２７】
以下の状態：炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する医薬の製造における、配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項２８】
配列番号２１を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人における以下の状態：炎症、食欲、体重、体脂肪、血中脂質量、血中トリグリセリド量、血中コレステロール量、炎症および免疫の少なくとも１種を調節する方法。
【請求項２９】
個人の免疫系を調節する医薬の製造における、配列番号７を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の使用。
【請求項３０】
配列番号７を含むアミノ酸配列を有する生物活性ペプチドまたはその機能的誘導体の医薬有効量を投与することを含む、個人の免疫系を調節する方法。
【公表番号】特表２００９−５０６７５７（Ｐ２００９−５０６７５７Ａ）
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−５２３９６９（Ｐ２００８−５２３９６９）
【出願日】平成１８年７月２１日（２００６．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８１３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１５９１８
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０６２６３３９８）シーエムエス・ペプタイズ・パテント・ホールディング・カンパニー・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＭＳ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年２月１９日（２００９．２．１９）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年７月２１日（２００６．７．２１）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２８１３５
【国際公開番号】ＷＯ２００７／０１５９１８
【国際公開日】平成１９年２月８日（２００７．２．８）
【出願人】（５０６２６３３９８）シーエムエス・ペプタイズ・パテント・ホールディング・カンパニー・リミテッド (4)
【氏名又は名称原語表記】ＣＭＳ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｈｏｌｄｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｉｍｉｔｅｄ
【Ｆターム（参考）】
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