新規な芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群及びその用途
サイクロクラスティカス属細菌の芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因となっている酵素を明らかにし、その酵素を芳香族炭化水素の生化学的変換、分解、浄化に利用する。サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群、並びにこの遺伝子群を導入・発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法及び芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、種々の芳香族（芳香環）化合物の分解のキーとなる酵素である芳香環ジオキシゲナーゼ（酸素添加酵素）をコードする遺伝子群、並びにこの遺伝子群を導入・発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法及び芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法に関するものである。
芳香族化合物の多くは毒性または発癌性を持ち環境中においては汚染物質となる。その一方で環境中には芳香族化合物を栄養源として利用し、資化する微生物が存在する。本発明は、このような微生物が有する酵素遺伝子を利用した環境浄化の分野、及び産業上有用な有機低分子化合物の合成に関するものである。
【背景技術】
環境汚染物質となりうる芳香族化合物の細菌による分解、浄化の研究は、環境問題への関心の高まりとあいまって精力的に行われてきた。これらの研究内容としては、特定の芳香族化合物を特異的に分解する細菌の探索、分解経路の解明、また、分解に関与する遺伝子の単離等が挙げられる。現在までに、多岐にわたる細菌種が芳香族化合物を資化する能力を持つものとして単離されてきた。また、芳香族化合物は複雑な過程を経て水と二酸化炭素にまで分解されることや、この分解に必要な遺伝子は多数存在し、これらは大きなプラスミド上又は染色体ＤＮＡ上にクラスターを形成する場合が多いことが明らかになってきた。芳香族化合物分解の初発酵素である芳香族化合物オキシゲナーゼ（酸素添加酵素）には、モノオキシゲナーゼとジオキシゲナーゼの２種類があるが、いづれも芳香族化合物分解におけるキー酵素であると考えられている（Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎ． Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，２６８−２７３，１９９７）。
現在までに多くの芳香族（芳香環）化合物ジオキシゲナーゼ［以後、芳香環ジオキシゲナーゼ（ａｒｏｍａｔｉｃｒｉｎｇ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）と呼ぶ］に関する研究が行われてきた。芳香環ジオキシゲナーゼは、通常、フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）及びフェレドキシンレダクターゼ（還元酵素）（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，別名：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を構成要素とし、さらにジオキシゲナーゼ本体酵素［大サブユニット（α−サブユニット）と小サブユニット（β−サブユニット）の２つからなる］からなる多成分酵素（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）である（以後本酵素を「フェレドキシン性の芳香環ジオキシゲナーゼ」と呼ぶ場合がある）。現在では、種々のフェレドキシン性の芳香環ジオキシゲナーゼの例が知られており、それらをコードする遺伝子の構造や機能の解析も実施されている。現在までに単離され解析された代表的な芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子の例を挙げると、トルエン、ベンゼン等の有機溶媒資化細菌シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）Ｆ１株由来のトルエンジオキシゲナーゼ（ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（ｚｙｌｓｔｒａ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ Ｆ１：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｔｏｄ Ｃ１Ｃ２ＢＡＤＥ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４９４０−１４９４６，１９８９）、及び、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＣＩＢ９８１６−４株由来のナフタレンジオキシゲナーゼ（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｋ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｄｉｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＮＣＢＩ ９８１６． Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７，４３８−４５７，１９９６）、及び、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）分解細菌シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ（ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，３９２−３９８，１９８６）、及び、ノカルディオイデス属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．）ＫＰ７株由来のフェナントレン（フェナンスレン）ジオキシゲナーゼ（Ｓａｉｔｏ，Ａ，Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＫＰ７：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，２１３４−２１４１，２０００）等が知られている。最近、ノカルディオイデス属ＫＰ７株由来のフェナントレンジオキシゲナーゼ遺伝子を始めとするいくつかの芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現した組換え大腸菌を用いて、種々の三環式（多環式）芳香族化合物の水酸化反応が報告された（非特許文献１参照）。（通常、二環式炭化水素であるナフタレン以上が多環式炭化水素と呼ばれており、単環式炭化水素に比べて、分解されにくい傾向がある。）
サイクロクラスティカス（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）属細菌は、γ−プロテオバクテリアに属する海洋細菌であり、トルエン、エチルベンゼン、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレン、ビフェニル、ナフタレン、フェナントレン、アルキルナフタレン等、多環式を含む多種の芳香族炭化水素を分解できることが知られている（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ Ｂｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ａ ｍａｒｉｎｅ ｏｌｉｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ｐａｒｔ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２，２１６９−２１７３，１９９６）。また、サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株は、海洋環境に流出した石油に含まれる芳香族化合物（石油系芳香族化合物）、特に多環式芳香族炭化水素の分解に最も主体的な役割を果たす海洋細菌として、本発明者の１人らによって釜石湾より単離されたものである（Ｋａｓａｉ，Ｙ．，Ｋｉｓｈｉｒａ，Ｈ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｐｌａｙｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｉｎ ａ ｍａｒｉｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，５６２５−５６３３，２００２）。石油系芳香族化合物の分解におけるサイクロクラスティカス属細菌の有用性にもかかわらず、サイクロクラスティカス属細菌に含まれる芳香環ジオキシゲナーゼやこれをコードする遺伝子の知見は、ほとんど無いのが現状であった。わずかに、Ｗａｎｇらによって単離されたｘｙｌＣ１、ｘｙｌＣ２と名付けられた遺伝子（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ Ｂｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ａ ｍａｒｉｎｅ ｏｌｉｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ｐａｒｔ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２，２１６９−２１７３，１９９６）やＧｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔらによって単離されたビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット、ナフタレンジオキシゲナーゼ大サブユニットの一部と思われる２種類のＤＮＡ断片（非特許文献２参照）などに関する報告があったに過ぎない。
非特許文献１ Ｓｈｉｎｄｏ，Ｋ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｃｈｕｎ，Ｈ．−Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｓａｉｔｏ，Ａ．，Ｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍｉｓａｗａ，Ｎ．，Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｆｕｓｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ａｎｄＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｖｅｒａｌ ａｒｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ． Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５，２４７２−２４８１，２００１）。
非特許文献２ Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ａ．Ｄ．，Ｈｅｄｌｕｎｄ，Ｂ．Ｐ．，Ｔｉｃｈｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｔａｌｅｙ， Ｊ．Ｔ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ（ＰＡＨ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇＣｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｕｌｆ ｏｆ Ｍｅｘｉｃｏ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ＰＡＨ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｐｕｇｅｔ ＳｏｕｎｄＣｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７０３−４７１０，１９９８）。
Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔらは、サイクロクラスティカス属細菌がビフェニルジオキシゲナーゼとナフタレンジオキシゲナーゼの２種類のオキシゲナーゼを有しており、これが芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因であると推測した（非特許文献２参照）。しかし、このことは実験的に確認されておらず、サイクロクラスティカス属細菌がどういった理由で多種の芳香族炭化水素を分解できるかについては依然として不明であった。
本発明の目的は、サイクロクラスティカス属細菌の芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因となっている酵素（遺伝子）を明らかにし、その酵素（遺伝子）を用いて、産業上有用な物質への生化学的変換、または、環境毒物の分解、浄化に利用することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、サイクロクラスティカス属のＡ５株という菌株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼが、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、ナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、２−メチルナフタレン（２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、ジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）、ジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ジフェニルメタン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、ビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｙｌ）などの広範な芳香族化合物の芳香環に水酸基を導入し、これらの化合物の分解における初発酵素になっていることを見出した。サイクロクラスティカス属細菌が広範な基質特異性を示す理由として、Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔが複数のジオキシゲナーゼの存在を想定したことからもわかるように、一つの芳香環ジオキシゲナーゼがフェナントレンやナフタレン等の多環式芳香族炭化水素だけでなく、ジフェニルメタンやビフェニル等をも基質とすることは、全く予想外のことであった。さらに本芳香環ジオキシゲナーゼは、１，４−ジメチルナフタレン（１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、または、１，５−ジメチルナフタレン（１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）を基質とした場合、芳香環ではなくメチル基に水酸基が導入された水酸化産物を高収率で生産することがわかった。この結果は、全く予想外のことであった。特に、１，４−ジメチルナフタレンから得られた（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノールは、樹脂原料、染・顔料原料である１，４−ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の１，４−ジメチルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。
本発明は以上のような知見を基に完成されたものである。
即ち、本発明は、（ａ）乃至（１）に示すペプチドをコードする遺伝子である：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、
（ｄ）配列番号６記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、
（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、
（ｇ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｈ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンとして機能するペプチド、
（ｉ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンとして機能するペプチド、
（ｊ）配列番号８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｋ）配列番号８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド、
（ｌ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
また、本発明は、上記の遺伝子のすべて又は一部を導入して得られる微生物であって、芳香族化合物に水酸基を導入できる微生物である。
更に、本発明は、上記微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を得ることを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法である。
更に、本発明は、上記微生物で、芳香族化合物で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法である。
更に、本発明は、芳香族化合物を含む培地が、１，４−ジメチルナフタレン又は１，５−ジメチルナフタレンを含む培地であり、水酸化された芳香族化合物が、メチル基が水酸化された芳香族化合物であることを特徴とする、上記の水酸化された芳香族化合物の製造法である。
更に、本発明は、メチル基が水酸化された芳香族化合物が、（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール、又は（５−メチルナフタレン−１−イル）−メタノールであることを特徴とする、上記の水酸化された芳香族化合物の製造法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、サイクロクラスティカス属Ａ５株に由来する芳香環ジオキシゲナーゼが変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図（化合物１〜化合物７）である。
図２は、サイクロクラスティカス属Ａ５株に由来する芳香環ジオキシゲナーゼが変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図（化合物８〜化合物９）である。
図３は、サイクロクラスティカス属Ａ５株に由来する芳香環ジオキシゲナーゼが変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図（化合物１０〜化合物１３）である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子源の海洋細菌サイクロクラスティカス属Ａ５株
目的とする遺伝子群の供給源となった海洋細菌サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株は、岩手県釜石湾から、２−メチルナフタレン、フェナントレン等の多環式芳香族炭化水素の資化菌として単離された（Ｋａｓａｉ，Ｙ．，Ｋｉｓｈｉｒａ，Ｈ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，５６２５−５６３３，２００２）。本Ａ５株は、１６ＳｒＤＮＡやｇｙｒＢ遺伝子の配列の分析により、サイクロクラスティカス属細菌に分類されたものである。本菌はまた、原油中に含まれる多環式芳香族炭化水素であるナフタレン、アルキルナフタレン、フェナントレン、アルキルフェナントレン、ジベンゾチオフェン等を分解することができた。サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株は、平成１４年１１月１５日に寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９１０７）。平成１５年１０月６日に原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へ移管（国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０５）。寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）。
２．芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群（本発明の遺伝子群）
本発明の遺伝子群は、芳香環ジオキシゲナーゼを構成する４つのサブユニットをコードする４つの遺伝子からなる。４つのサブユニットとは、大（α）サブユニット、小（β）サブユニット、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ（フェレドキシン還元酵素）である。
１番目の遺伝子である芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットをコードする遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードするものである。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド。
（ａ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能する４６０アミノ酸配列よりなるペプチド（ＰｈｎＡ１とも呼ぶ）である。ここで、「芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能する」とは、芳香環ジオキシゲナーゼを構成する他の３つのサブユニットと複合体を形成し、芳香環ジオキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００，１９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能できる限り、その個数は制限されないが、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内である。
（ｃ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、更に好ましくは「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、配列番号１記載の塩基配列により表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性を指す。
２番目の遺伝子である芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットをコードする遺伝子は、以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードするものである。（ｄ）配列番号６記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド。
（ｄ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能する１７７アミノ酸配列よりなるペプチド（ＰｈｎＡ２とも呼ぶ）である。ここで、「芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能する」とは、芳香環ジオキシゲナーゼを構成する他の３つのサブユニットと複合体を形成し、芳香環ジオキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能できる限り、その個数は制限されないが、通常は、１０アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内である。
（ｆ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、上記で説明したとおりである。
３番目の遺伝子であるフェレドキシンをコードする遺伝子は、以下の（ｇ）、（ｈ）、又は（ｉ）に示すペプチドをコードするものである。（ｇ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｈ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンとして機能するペプチド、（ｉ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンとして機能するペプチド。
（ｇ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼのフェレドキシンとして機能する１０４アミノ酸配列よりなるペプチド（ＰｈｎＡ３とも呼ぶ）である。
（ｈ）のペプチドは、（ｇ）のペプチドに、フェレドキシンとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、フェレドキシンとして機能できる限り、その個数は制限されないが、通常は、６アミノ酸以内であり、更に好ましくは３アミノ酸以内である。
（ｉ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のフェレドキシンとして機能するペプチドである。（ｉ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、上記で説明したとおりである。
４番目の遺伝子であるフェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子は、以下の（ｊ）、（ｋ）、又は（ｌ）に示すペプチドをコードするものである。（ｊ）配列番号８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｋ）配列番号８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド、（ｌ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
（ｊ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼ活性を有する３４０アミノ酸配列よりなるペプチドで（ＰｈｎＡ４とも呼ぶ）ある。
（ｋ）のペプチドは、（ｊ）のペプチドに、フェレドキシンレダクターゼ活性を有する程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、フェレドキシンレダクターゼ活性を有する限り、その個数は制限されないが、通常は、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１４アミノ酸以内であり、更に好ましくは７アミノ酸以内であり、最も好ましくは４アミノ酸以内である。
（ｌ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチドである。（ｌ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、上記で説明したとおりである。
本発明の遺伝子は以下の手順で得ることができる。先ず、サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株のゲノムＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断後、適当なベクターに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベクターにはλファージ由来の各種ベクター、例えば、λｇｔ１０やλＺａｐ１１等、コスミドベクターｐＲＡＦＲ３等、又はｐＵＣ１８やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ等のプラスミドベクターを用いることができる。目的の遺伝子を保持するクローンの選択には、適当な量のインドールをプレートに添加し、青色のインディゴを合成するクローンを選択すればよい。サイクロクラスティカス属Ａ５株の芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子群はクラスターを形成している。それゆえ、選択されたクローン及びそのクローンの持つＤＮＡと重複するＤＮＡ断片を持つクローンの塩基配列を、サンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法により決定することによって、芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット、小サブユニット、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡの全長を単離することができる。
３．水酸化された芳香族化合物の製造法
上記の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群を大腸菌等の微生物に導入し、発現させた組換え微生物を用いて、種々の芳香族化合物と混合培養することで、これらの芳香族化合物に特異的に水酸基を導入することができる。芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群は４つの遺伝子から構成されており、これらすべてを宿主とする微生物に導入し発現させることが望ましい。なお、本体酵素以外のフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼについては、宿主が元々有しているもので代用可能な場合があり、このような場合は必ずしも導入する必要はない。
大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
本発明の方法により、多環式芳香族化合物（アルキル基を有する多環式芳香族炭化水素を含む）やフェニル基を有する芳香族化合物など種々の芳香族化合物に水酸基を導入することができる。下表に、本発明の方法によって製造される水酸化された芳香族化合物（変換産物）と基質として用いる芳香族化合物（基質）を例示する。但し、本発明の方法によって製造される芳香族化合物は、これらの化合物に限定されるわけではない。
上記の変換産物の中で、最も産業利用上、重要な変換産物は（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノールである。本化合物は、樹脂原料、染・顔料原料である１，４−ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の１，４−ジメチルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。現在、１，４−ナフタレンジカルボン酸（化審法化学物質）は１，４−ジメチルナフタレンから石油化学工業により作られているが、環境に優しいバイオプロセス技術への代替技術の開発が求められている。
４．芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法
本発明の微生物は、芳香族化合物で汚染された環境の浄化に利用することができる。ここでいう「環境」には、土壌、海洋、大気のほか、排水なども含まれる。環境の浄化は、上記条件で培養した微生物の培養液、あるいは、微生物を凍結乾燥処理した乾燥粉末を汚染環境に散布することにより行われる。この際、乾燥粉末と増殖を補助する無機塩類を混合・造粒し、粉末状及び顆粒状等に製剤化したものを汚染環境に散布しても良い。処理に用いる微生物の量は、土壌及び海水の汚染状況等に応じ、任意に定めることができるが、通常、汚染土壌１ｍ３あるいは汚染海域１００ｍ２に培養液であれば０．０２Ｌ、乾燥菌体であれば０．１ｇ程度である。また、汚染された大気の浄化は、上記培養液あるいは乾燥菌体を固定化担体を設置した気体の浄化装置に添加し、これに汚染大気を通気することで行う。さらに、汚染された排水の浄化は、同じく上記培養液あるいは乾燥菌体を汚染排水と混合し、好気条件で７〜６０日程度培養することで行う。
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
［実施例１］ サイクロクラスティカス属Ａ５株のＤＮＡライブラリーの作製
サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株を、０．１％（ｗ／ｖ）のフェナントレンを含む１リットルの人工海水に植菌し、２５℃で７日間培養した。集菌した後、Ａ５株の長鎖（ゲノム）ＤＮＡを調製した（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐ．２，１９９４）。５０ｍｇのＡ５株ＤＮＡに０．５ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを添加して３７℃で３０分間反応させ、部分切断を行った。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分画し、１５ｋｂから３０ｋｂの範囲のＤＮＡ断片を回収した。一方、コスミドベクターＬｏｒｉｓｔ６（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５７８９−５７９４，１９８７）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものを用意した。Ａ５株ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分切断断片と上記のコスミドベクターＤＮＡを混合し、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２により連結し、ＧｉｇａｐａｃｋＴＭＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてパッケージングした後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ−１株に感染させた。形質転換したポピュレーションのうち４９０クローンを維持管理し、これをサイクロクラスティカス属Ａ５株のＤＮＡライブラリーとした。
［実施例２］ 芳香環ジオキシゲナーゼをコードするコスミドクローンの同定
実施例１で得られたサイクロクラスティカス属Ａ５株のＤＮＡライブラリーのすべてのコロニーについて、培地にインドールを添加し、インディゴブルーの発色を指標として、芳香環（ジ）オキシゲナーゼ遺伝子群を含むＤＮＡ断片を有するクローンのスクリーニングを行った。その結果、プラスミドｐＨ１ａまたはｐＨ１ｂを含む２クローンに関して明らかにポジティブなシグナルが認められた。これらのプラスミドに含まれる挿入断片の制限酵素マッピングの結果、これら２つの挿入断片は互いにオーバーラップしていることが分かった。以後、各種領域のサブクローニング及び塩基配列の決定には、このｐＨ１ａを用いた。
［実施例３］ 芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子群の塩基配列の決定
実施例２で得られたコスミドクローンｐＨ１ａを制限酵素処理により切り出し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にサブクローニングした。このベクターのマルチクローニング部位の両サイドにはＴ７プロモーター及びＴ３プロモーターが配備されている。クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、それぞれのプロモーターの塩基配列に基づいた以下のＤＮＡプライマーを設計し合成した。
なお、シークエンス反応はＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（パーキンエルマー社）で行い、３７７ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（パーキンエルマー社）で解析した。１３ｋｂ領域の塩基配列を明らかにした。この領域に、公知の芳香環ジオキシゲナーゼの各種サブユニットと、それぞれ有意な相同性を示す産物をコードし得る遺伝子が見出された。そこで、大（α）サブユニットと相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ１（配列番号１）、小（β）サブユニットと相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ２（配列番号２）、フェレドキシンと相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ３（配列番号３）、そしてフェレドキシンレダクターゼ（フェレドキシン還元酵素）（フェレドキシン・ＮＡＤ（Ｐ）Ｈレダクターゼ）と相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ４（配列番号４）と名付けた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ１（配列番号５）は４６０アミノ酸配列よりなっており、他の微生物の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとの相同性は、高い順に、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）Ｆ１９９株、及びアルカリゲネス・ファセアリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｃｅａｌｉｓ）ＡＦＫ２株の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット［ＢｐｈＡ１ｆ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０４９０６２）およびＰｈｎＡｃ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＡＡ７６３２３）］とそれぞれ、６４％及び５２％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ２（配列番号６）は１７７アミノ酸配列よりなっており、他の微生物の芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとの相同性は、高い順に、スフィンゴモナス・アロマティシボランスＦ１９９株、及びスフィンゴピクシス・マクロゴルタビダ（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａ）ＴＦＡ株の芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット［ＢｐｈＡ２ｆ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０４９０６１）およびＴｈｎＡ２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＮ２６４４４）］とそれぞれ、５２％及び３９％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ３（配列番号７）は１０４アミノ酸配列よりなっており、他の微生物のフェレドキシンとの相同性は、高い順に、スフィンゴモナス・アロマティシボランスＦ１９９株、及びスフィンゴモナス・チャングブケンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｃｈｕｎｇｂｕｋｅｎｓｉｓ）のフェレドキシン［ＢｐｈＡ３（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０４９２１１）およびＰｈｎＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＣ９５３２０）］とそれぞれ、６３％及び６３％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ４（配列番号８）は３４０アミノ酸配列よりなっており、他の微生物のフェレドキシンレダクターゼとの相同性は、高い順に、シュードモナス・スタッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＯＸ１株、及びアルカリゲネス・ファセアリスＡＦＫ２株のフェレドキシンレダクターゼ［ＴｏｕＦ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＡＡ０６６５９）およびＰｈｎＡａ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＡＡ７６３２１）］とそれぞれ、５０％及び４７％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
［実施例４］ 芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現するプラスミドの作製
プラスミドｐＨ１ａ（実施例２）をＰｓｔＩとＳａｌＩで切断して得た２．７ｋｂのＰｓｔＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片［ｐｈｎＡ１遺伝子（配列番号１）及びｐｈｎＡ２遺伝子（配列番号２）領域を含む］を、ＰｓｔＩとＳａｌＩで開裂したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋に連結して、プラスミドｐＩＳＰ３を作製した。次に、これに、フェレドキシン遺伝子［ｐｈｎＡ３（配列番号３）］及びフェレドキシンレダクターゼ遺伝子［ｐｈｎＡ４（配列番号４）］を以下のようにして連結した。フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシン遺伝子を含む１．４５ｋｂのＤＮＡ断片の両端に制限酵素ＫｐｎＩとＸｈｏＩ認識配列を作るようにデザインした下記のプライマーＦ−ＫｐとＦｒ−Ｘｈを用いて、ｐＨ１ａを鋳型にＰＣＲ反応を行った。増幅した１．５ｋｂ断片をＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断し、１．４５ｋｂの断片を得、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断して開裂したｐＩＳＰ３と連結させ、プラスミドｐＰｈｎを作製した。このプラスミドにおいて各遺伝子は何れもｌａｃプロモータの支配下にあり、ｐｈｎＡ１−ｐｈｎＡ２−ｐｈｎＡ４−ｐｈｎＡ３の順に並んでいる。このｐＰｈｎを大腸菌ＪＭ１０９株（Ｔａｋａｒａ社）に導入することにより得られた形質転換体［今後、大腸菌（ｐＰｈｎ）と記述する場合がある］を以後の実験に用いた。
［実施例５］ 組換え大腸菌と基質の共存培養
実施例４で作製した大腸菌（ｐＰｈｎ）を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）を含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で対数期前半まで液体培養し、最終濃度が約３０％になるようにグリセロールで懸濁し、−７０〜−８０℃のディープフリーザーに入れることにより、グリセロール保存株とした。また、コントロールとして、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋を有するＪＭ１０９も同様に培養してグリセロール保存株を作製した。
変換反応を開始するにあたって、まず、上記のグリセロール保存株から、大腸菌形質転換体を白金耳で掻き取り、１５０μｇ／ｍｌのＡｐを含むＬＢ培地４ｍｌに懸濁し、１２０ｒｐｍ、３０℃で７〜８時間培養した（前培養）。次に、この前培養を、１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び１０μｇ／ｍｌのチアミン（ｔｈｉａｍｉｎｅ）を含むＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ａｐｐｅｎｄｅｘ Ａ．３参照）７０ｍｌに入れ、１２０ｒｐｍ、３０℃で１６〜１７時間（一晩）培養した（本培養）。これで、ＯＤ ６００ｎｍが約１になる。これを８，０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離して菌体のみを集めた後、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と７ｍｇの基質を含む７０ｍｌのＭ９培地（１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び１０μｇ／ｍｌのチアミンを含む）に懸濁し、１２０ｒｐｍ、３０℃で２〜３日間さらに培養を行った。なお、基質として、多環式芳香族化合物である、ナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、２−メチルナフタレン（２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１，４−ジメチルナフタレン（１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１，５−ジメチルナフタレン（１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、アントラセン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、ピレン（ｐｙｒｅｎｅ）、ベンゾ［ａ］ピレン（ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ）、ジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｅ）、ジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、及び、フェニル環を含む芳香族化合物であるジフェニルメタン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、ビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｙｌ）、２−フェニルベンゾキサゾール（２−ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）を用いた。これらは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、和光純薬、または関東化学から購入した。これらの基質は、通常１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにエタノールに溶かしたものを０．７ｍｌ加えた。培養２〜３日目に７０ｍｌのメタノールを加え３０分間撹拌することにより脂質を抽出し、８，０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離して上清を集め、脂質粗抽出液とした。たいていの場合、この状態で、４℃で数週間保存可能であったが、脂質抽出液はすぐにＨＰＬＣ分析に供した。
［実施例６］ 変換産物のＨＰＬＣ分析
実施例５で調製された脂質粗抽出液６０μｌを１回のｉｎｊｅｃｔｉｏｎに供した。ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの速度でＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣの本体装置としてＷａｔｅｒｓ社のアライアンスシステムを用い、フォトダイオードアレイ検出器としてＷａｔｅｒｓ ９９６型を用いた。展開溶媒の条件は、以下の通りである。
Ａ液：水／メタノール（５０／５０）
Ｂ液：メタノール／２−プロパノール（６０／４０）
０〜５分（Ａ液）、５〜２０分［Ａ液→Ｂ液：凸型グラジエント（Ｎｏ．３、Ｗａｔｅｒｓ）］、２０分〜（Ｂ液）
この条件では通常、３１分以内に全化合物が分離された。２１０〜３５０ｎｍの範囲で吸収極大値を示した波長（ｍａｘ ｐｌｏｔ）でモニターしたピークの面積比をもって変換率とした。
この分析で変換が確認されたものについて次の精製・同定のステップに進めた。なお、精製・同定のステップに進める場合は、培養のスケールを実施例６のスケールの１０倍〜２０倍で行った。
このＨＰＬＣ分析の結果を下の表に示した。＋で示されたものが変換産物が確認されたものである。
〔実施例７〕 変換産物の精製・同定
大腸菌（ｐＰｈｎ）と、実施例６で変換が確認された基質の混合培養液７００ｍｌ〜１，４００ｍｌに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下３００ｍｌ〜５００ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０，（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０ｘ２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。
なお、各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである。
ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（５：１）；ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１）；ｂｉｐｈｅｎｙｌ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１０：１）．
１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１）．
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィフィーの展開溶媒は以下の通りである。
ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（５：１），ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；ｂｉｐｈｅｎｙｌ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１５：１）．
１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１）．
ＭＳスペクトル、及びＮＭＲスペクトルはそれぞれ、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＡＸ５０５Ｗ、及びＢＲＵＫＥＲＡＭＸ４００を用いて測定した。
１．フェナントレンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりフェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（８４．０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物１）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１（１８．２ｍｇ）の純品を得た。化合物１は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｊｅｒｉｎａ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｅｌａｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｙａｇｉ，Ｈ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｄａｖｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｖ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９８，５９８８−５９９６，１９７６）により、シス−３，４−ジヒドロキシ−３，４−ジヒドロフェナントレン（ｃｉｓ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：ｃｉｓ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ−３，４−ｄｉｏｌ）（図１）であると同定した。
２．ナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（４６．２ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物２）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２（７．６ｍｇ）の純品を得た。化合物２は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｎｏｊｉｒｉ，Ｈ．，Ｎａｍ，Ｊ，−Ｗ．，Ｋｏｓａｋａ，Ｍ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｔａｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｆｕｒｉｈａｔａ，Ｋ．，Ｙａｍａｎｅ，Ｈ．，ａｎｄ Ｏｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，３１０５−３１１３，１９９９）により、シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロナフタレン（ｃｉｓ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：ｃｉｓ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（図１）であると同定した。
３．ジベンゾフランの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）の変換実験を行った粗抽出物（８６．５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物３）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（２１．０ｍｇ）の純品を得た。化合物３は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｊｉａ，Ｃ．，Ｐｉａｎｏ，Ｄ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，７５１６−７５２２，２０００）により、２−ヒドロキシジベンゾフラン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）（ＩＵＰＡＣ名：ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ，ｄ］ｆｕｒａｎ−２−ｏｌ）（図１）であると同定した。
４．ジベンゾチオフェンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（４６．８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物４）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（７．２ｍｇ）の純品を得た。化合物４は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｍ．，Ｃａｓｔｌｅ，Ｒ．Ｎ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏａｍｉｎｏ ａｎｄ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅｓ．Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，２１５−２１８，１９８５）により、２−ヒドロキシジベンゾチオフェン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：ｅｎｚｏ［ｂ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｏｌ）（図１）であると同定した。
５．ジフェニルメタンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジフェニルメタン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（３３．１ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．５（化合物５）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物５（６．２ｍｇ）の純品を得た。化合物５は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｎａｋａｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｆ．，Ｏｒｇ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，１１，６０７−６１１，１９７８）により、２−ヒドロキシジフェニルメタン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：２−ｂｅｎｚｙｌｐｈｅｎｏｌ）（図１）であると同定した。
６．ビフェニルの変換産物の同定
組換え大腸菌によりビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｙｌ）の変換実験を行った粗抽出物（５４．５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物６）とＲｆ値０．３（化合物７）の２つの産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物６（６．６ｍｇ）及び化合物７（２．３ｍｇ）の純品を得た。化合物６及び７は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｓａｋｕｒａｉ，Ｈ．，Ｔｓｕｋｕｄａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈｉｒａｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７，２７２１−２７２２，２００２）により、それぞれｏ−ビフェニルオール（ｏ−ｂｉｐｈｅｎｙｌｏｌ）（ＩＵＰＡＣ名：２−ｐｈｅｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）及びｍ−ビフェニルオール（ｍ−ｂｉｐｈｅｎｙｌｏｌ）（ＩＵＰＡＣ名：３−ｐｈｅｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）（図１）であると同定した。
７．１−メチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（２８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物８）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物８（７．３ｍｇ）の純品を得た。化合物８は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，Ｂｏｓｅｔｔｉ，Ａ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．Ｄ．，Ｇａｌｌｉ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｎｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，３０３−３１３，１９９５）により、シス−８−メチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（ｃｉｓ−８−ｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ：ＩＵＰＡＣ名）（図２）であると同定した。
８．２−メチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（２８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物９）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物９（１．８ｍｇ）の純品を得た。化合物９は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，Ｂｏｓｅｔｔｉ，Ａ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．Ｄ．，Ｇａｌｌｉ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｎｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，３０３−３１３，１９９５）により、シス−７−メチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（ｃｉｓ−７−ｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ：ＩＵＰＡＣ名）（図２）であると同定した。
９．１，４−ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１，４−ジメチルナフタレン（１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１７６ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物１０），０．１（化合物１１）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１０（４ｍｇ）、化合物１１（６５ｍｇ）の純品を得た。
化合物１０の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １９０．０９９３，ｃａｌｃｄ １９０．０９９４］よりＣ１２Ｈ１４Ｏ２と決定された。化合物１０のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１０は１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅの５，６位が１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌとなったものであると決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４（δ２．３７）及びＨ−８（δ６．５６）からＣ−４ａ（δ１３２．２）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１０は５，８−ジメチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（５，８−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（図３）と同定した。本物質は新規化合物であった。
化合物１１の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １８８．０８３８，ｃａｌｃｄ １８８．０８３８］よりＣ１２Ｈ１２Ｏ２と決定された。化合物１１の１Ｈ ＮＭＲではナフタレン環部分のシグナルには大きな変化がなく、メチル基の信号が消失し、新たに酸素と結合したメチレン基（δ４．９４）及びこれとカップリングした水酸基（δ５．２８）の信号が観測された。以上の結果より、化合物１１は（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｙｌ）−ｍｅｔｈａｎｏｌ）（図３）と同定した。化合物１１はＣＡＳに記載されている既知化合物であったが、化合物１１を芳香環ジオキシゲナーゼ等の酵素（遺伝子）を用いた生変換反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物１１の製造法としても本発明による方法は有効である。なお、この（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノールは、樹脂原料、染・顔料原料である１，４−ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の１，４−ジメチルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。
１０．１，５−ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１，５−ジメチルナフタレン（１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（２０５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３（化合物１２）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１２（４０ｍｇ）の純品を得た。化合物１２の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １７２．０８８８，ｃａｌｄ．１７２．０８８９］よりＣ１２Ｈ１２Ｏと決定された。化合物１２の１Ｈ ＮＭＲではナフタレン環部分のシグナルには大きな変化はなく、メチル基の１本分の信号が消失し、新たに酸素と結合したメチレン基（δ５．０４）が観測された。以上の結果より、化合物１２は（５−メチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール（５−ｍｅｔｈｙｌ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｙｌ）−ｍｅｔｈａｎｏｌ）（図３）と同定した。化合物１２はＣＡＳに記載されている既知化合物であったが、化合物１２を芳香環ジオキシゲナーゼ等の酵素（遺伝子）を用いた生変換反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物１２の製造法としても本発明による方法は有効である。
１１．２，６−ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１１０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物１３）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１３（３０．６ｍｇ）の純品を得た。
化合物１３は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，Ｂｏｓｅｔｔｉ，Ａ．，Ｄｉ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．，Ｇａｌｌｉ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｎｉ，Ｆ．，Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ １，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ−ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４４，３０６−１３，１９９５］により、３，７−ジメチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（３，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（図３）であると同定した。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００２年１１月２９日出願の日本特許出願（特願２００２−３４７２４０）、および、２００３年９月１７出願の日本特許出願（特願２００３−３２４１１７）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明は、サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）細菌に由来する芳香環ジオキシゲナーゼの大（α）サブユニット遺伝子、小（β）サブユニット遺伝子、フェレドキシン遺伝子、及び、フェレドキシンレダクターゼ遺伝子を提供する。本発明による遺伝子群から造られるタンパク質は、石油やコールタール由来の環境汚染物質である芳香族化合物に水酸基を導入することができる。すなわち、本発明による遺伝子群を発現した微生物により、これらの石油系芳香族化合物を特異的に水酸化する方法を提供する。水酸化された芳香族化合物は、微生物等により容易に分解されるようになるので、本発明は、汚染土壌等の環境浄化等に有用である。また、この方法により、産業上有用な水酸化された芳香族化合物を作ることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、種々の芳香族（芳香環）化合物の分解のキーとなる酵素である芳香環ジオキシゲナーゼ（酸素添加酵素）をコードする遺伝子群、並びにこの遺伝子群を導入・発現した微生物を利用した水酸化された芳香族化合物の製造法及び芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法に関するものである。
芳香族化合物の多くは毒性または発癌性を持ち環境中においては汚染物質となる。その一方で環境中には芳香族化合物を栄養源として利用し、資化する微生物が存在する。本発明は、このような微生物が有する酵素遺伝子を利用した環境浄化の分野、及び産業上有用な有機低分子化合物の合成に関するものである。
【背景技術】
環境汚染物質となりうる芳香族化合物の細菌による分解、浄化の研究は、環境問題への関心の高まりとあいまって精力的に行われてきた。これらの研究内容としては、特定の芳香族化合物を特異的に分解する細菌の探索、分解経路の解明、また、分解に関与する遺伝子の単離等が挙げられる。現在までに、多岐にわたる細菌種が芳香族化合物を資化する能力を持つものとして単離されてきた。また、芳香族化合物は複雑な過程を経て水と二酸化炭素にまで分解されることや、この分解に必要な遺伝子は多数存在し、これらは大きなプラスミド上又は染色体ＤＮＡ上にクラスターを形成する場合が多いことが明らかになってきた。芳香族化合物分解の初発酵素である芳香族化合物オキシゲナーゼ（酸素添加酵素）には、モノオキシゲナーゼとジオキシゲナーゼの２種類があるが、いづれも芳香族化合物分解におけるキー酵素であると考えられている（Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｂｉｏｒｅｍｅｄｉａｔｉｏｎ ｄｅｓｉｇｎ． Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，２６８−２７３，１９９７）。
現在までに多くの芳香族（芳香環）化合物ジオキシゲナーゼ［以後、芳香環ジオキシゲナーゼ（ａｒｏｍａｔｉｃｒｉｎｇ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）と呼ぶ］に関する研究が行われてきた。芳香環ジオキシゲナーゼは、通常、フェレドキシン（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ）及びフェレドキシンレダクターゼ（還元酵素）（ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，別名：ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ−ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）を構成要素とし、さらにジオキシゲナーゼ本体酵素［大サブユニット（α−サブユニット）と小サブユニット（β−サブユニット）の２つからなる］からなる多成分酵素（ｍｕｌｔｉ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｅｎｚｙｍｅ）である（以後本酵素を「フェレドキシン性の芳香環ジオキシゲナーゼ」と呼ぶ場合がある）。現在では、種々のフェレドキシン性の芳香環ジオキシゲナーゼの例が知られており、それらをコードする遺伝子の構造や機能の解析も実施されている。現在までに単離され解析された代表的な芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子の例を挙げると、トルエン、ベンゼン等の有機溶媒資化細菌シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）Ｆ１株由来のトルエンジオキシゲナーゼ（ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（ｚｙｌｓｔｒａ，Ｇ．Ｊ．ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ Ｆ１：ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅｔｏｄ Ｃ１Ｃ２ＢＡＤＥ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ． Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４，１４９４０−１４９４６，１９８９）、及び、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）ＮＣＩＢ９８１６−４株由来のナフタレンジオキシゲナーゼ（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｒｅｓｎｉｃｋ，Ｓ．Ｍ．，Ｌｅｅ，Ｋ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｄｉｖｅｒｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．Ｓｔｒａｉｎ ＮＣＢＩ ９８１６． Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７，４３８−４５７，１９９６）、及び、ポリ塩化ビフェニル（ＰＣＢ）分解細菌シュードモナス・シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）ＫＦ７０７株由来のビフェニルジオキシゲナーゼ（ｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）遺伝子（Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，ａｎｄ Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．，Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅ ｃｌｕｓｔｅｒ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｂｉｐｈｅｎｙｌ ａｎｄ ｃｈｌｏｒｏｂｉｐｈｅｎｙｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６６，３９２−３９８，１９８６）、及び、ノカルディオイデス属（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．）ＫＰ７株由来のフェナントレン（フェナンスレン）ジオキシゲナーゼ（Ｓａｉｔｏ，Ａ，Ｉｗａｂｕｃｈｉ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ａ ｎｏｖｅｌ ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｒｏｍＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ｓｐ．ｓｔｒａｉｎ ＫＰ７：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ． Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２，２１３４−２１４１，２０００）等が知られている。最近、ノカルディオイデス属ＫＰ７株由来のフェナントレンジオキシゲナーゼ遺伝子を始めとするいくつかの芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現した組換え大腸菌を用いて、種々の三環式（多環式）芳香族化合物の水酸化反応が報告された（非特許文献１参照）。（通常、二環式炭化水素であるナフタレン以上が多環式炭化水素と呼ばれており、単環式炭化水素に比べて、分解されにくい傾向がある。）
サイクロクラスティカス（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）属細菌は、γ−プロテオバクテリアに属する海洋細菌であり、トルエン、エチルベンゼン、ｏ−、ｍ−、ｐ−キシレン、ビフェニル、ナフタレン、フェナントレン、アルキルナフタレン等、多環式を含む多種の芳香族炭化水素を分解できることが知られている（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ Ｂｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ａ ｍａｒｉｎｅ ｏｌｉｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ｐａｒｔ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２，２１６９−２１７３，１９９６）。また、サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株は、海洋環境に流出した石油に含まれる芳香族化合物（石油系芳香族化合物）、特に多環式芳香族炭化水素の分解に最も主体的な役割を果たす海洋細菌として、本発明者の１人らによって釜石湾より単離されたものである（Ｋａｓａｉ，Ｙ．，Ｋｉｓｈｉｒａ，Ｈ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｐｌａｙｓ ａ ｐｒｉｍａｒｙ ｒｏｌｅ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｉｎ ａ ｍａｒｉｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，５６２５−５６３３，２００２）。石油系芳香族化合物の分解におけるサイクロクラスティカス属細菌の有用性にもかかわらず、サイクロクラスティカス属細菌に含まれる芳香環ジオキシゲナーゼやこれをコードする遺伝子の知見は、ほとんど無いのが現状であった。わずかに、Ｗａｎｇらによって単離されたｘｙｌＣ１、ｘｙｌＣ２と名付けられた遺伝子（Ｗａｎｇ，Ｙ．，Ｌａｕ，Ｐ．Ｃ．Ｋ．，ａｎｄ Ｂｕｔｔｏｎ，Ｄ．Ｋ．，Ａ ｍａｒｉｎｅ ｏｌｉｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｒｂｏｒｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｋｎｏｗｎ ｔｏ ｂｅ ｐａｒｔ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ｓｏｉｌ ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６２，２１６９−２１７３，１９９６）やＧｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔらによって単離されたビフェニルジオキシゲナーゼ大サブユニット、ナフタレンジオキシゲナーゼ大サブユニットの一部と思われる２種類のＤＮＡ断片（非特許文献２参照）などに関する報告があったに過ぎない。
非特許文献１ Ｓｈｉｎｄｏ，Ｋ．，Ｏｈｎｉｓｈｉ，Ｙ．，Ｃｈｕｎ，Ｈ．−Ｋ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｈ．，Ｈａｙａｓｈｉ，Ｍ．，Ｓａｉｔｏ，Ａ．，Ｉｇｕｃｈｉ，Ｋ．，Ｆｕｒｕｋａｗａ，Ｋ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ｈｏｒｉｎｏｕｃｈｉ，Ｓ．，ａｎｄ Ｍｉｓａｗａ，Ｎ．，Ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｒｉｃｙｃｌｉｃ ｆｕｓｅｄ ａｒｏｍａｔｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｕｓｉｎｇＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ａｎｄＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ｓｅｖｅｒａｌ ａｒｅｎｅ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅｓ． Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６５，２４７２−２４８１，２００１）。
非特許文献２ Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔ，Ａ．Ｄ．，Ｈｅｄｌｕｎｄ，Ｂ．Ｐ．，Ｔｉｃｈｉ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ Ｓｔａｌｅｙ， Ｊ．Ｔ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｒｉｎｅ ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ ａｒｏｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ（ＰＡＨ）−ｄｅｇｒａｄｉｎｇＣｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｇｕｌｆ ｏｆ Ｍｅｘｉｃｏ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ＰＡＨ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ Ｐｕｇｅｔ ＳｏｕｎｄＣｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ． Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６４，４７０３−４７１０，１９９８）。
Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔらは、サイクロクラスティカス属細菌がビフェニルジオキシゲナーゼとナフタレンジオキシゲナーゼの２種類のオキシゲナーゼを有しており、これが芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因であると推測した（非特許文献２参照）。しかし、このことは実験的に確認されておらず、サイクロクラスティカス属細菌がどういった理由で多種の芳香族炭化水素を分解できるかについては依然として不明であった。
本発明の目的は、サイクロクラスティカス属細菌の芳香族炭化水素に対する広範な分解能の原因となっている酵素（遺伝子）を明らかにし、その酵素（遺伝子）を用いて、産業上有用な物質への生化学的変換、または、環境毒物の分解、浄化に利用することにある。
【発明の開示】
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を重ねた結果、サイクロクラスティカス属のＡ５株という菌株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼが、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、ナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、２−メチルナフタレン（２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、ジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）、ジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、ジフェニルメタン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、ビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｙｌ）などの広範な芳香族化合物の芳香環に水酸基を導入し、これらの化合物の分解における初発酵素になっていることを見出した。サイクロクラスティカス属細菌が広範な基質特異性を示す理由として、Ｇｅｉｓｅｌｂｒｅｃｈｔが複数のジオキシゲナーゼの存在を想定したことからもわかるように、一つの芳香環ジオキシゲナーゼがフェナントレンやナフタレン等の多環式芳香族炭化水素だけでなく、ジフェニルメタンやビフェニル等をも基質とすることは、全く予想外のことであった。さらに本芳香環ジオキシゲナーゼは、１，４−ジメチルナフタレン（１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、または、１，５−ジメチルナフタレン（１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）を基質とした場合、芳香環ではなくメチル基に水酸基が導入された水酸化産物を高収率で生産することがわかった。この結果は、全く予想外のことであった。特に、１，４−ジメチルナフタレンから得られた（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノールは、樹脂原料、染・顔料原料である１，４−ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の１，４−ジメチルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。
本発明は以上のような知見を基に完成されたものである。
即ち、本発明は、（ａ）乃至（１）に示すペプチドをコードする遺伝子である：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、
（ｄ）配列番号６記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、
（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、
（ｇ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｈ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンとして機能するペプチド、
（ｉ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンとして機能するペプチド、
（ｊ）配列番号８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｋ）配列番号８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド、
（ｌ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
また、本発明は、上記の遺伝子のすべて又は一部を導入して得られる微生物であって、芳香族化合物に水酸基を導入できる微生物である。
更に、本発明は、上記微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を得ることを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法である。
更に、本発明は、上記微生物で、芳香族化合物で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法である。
更に、本発明は、芳香族化合物を含む培地が、１，４−ジメチルナフタレン又は１，５−ジメチルナフタレンを含む培地であり、水酸化された芳香族化合物が、メチル基が水酸化された芳香族化合物であることを特徴とする、上記の水酸化された芳香族化合物の製造法である。
更に、本発明は、メチル基が水酸化された芳香族化合物が、（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール、又は（５−メチルナフタレン−１−イル）−メタノールであることを特徴とする、上記の水酸化された芳香族化合物の製造法である。
【図面の簡単な説明】
図１は、サイクロクラスティカス属Ａ５株に由来する芳香環ジオキシゲナーゼが変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図（化合物１〜化合物７）である。
図２は、サイクロクラスティカス属Ａ５株に由来する芳香環ジオキシゲナーゼが変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図（化合物８〜化合物９）である。
図３は、サイクロクラスティカス属Ａ５株に由来する芳香環ジオキシゲナーゼが変換する芳香族化合物の例とその変換産物を示す図（化合物１０〜化合物１３）である。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
１．遺伝子源の海洋細菌サイクロクラスティカス属Ａ５株
目的とする遺伝子群の供給源となった海洋細菌サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株は、岩手県釜石湾から、２−メチルナフタレン、フェナントレン等の多環式芳香族炭化水素の資化菌として単離された（Ｋａｓａｉ，Ｙ．，Ｋｉｓｈｉｒａ，Ｈ．，Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，６８，５６２５−５６３３，２００２）。本Ａ５株は、１６ＳｒＤＮＡやｇｙｒＢ遺伝子の配列の分析により、サイクロクラスティカス属細菌に分類されたものである。本菌はまた、原油中に含まれる多環式芳香族炭化水素であるナフタレン、アルキルナフタレン、フェナントレン、アルキルフェナントレン、ジベンゾチオフェン等を分解することができた。サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株は、平成１４年１１月１５日に寄託されている（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１９１０７）。平成１５年１０月６日に原寄託よりブタペスト条約に基づく寄託へ移管（国際寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−０８５０５）。寄託機関：独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐａｔｅｎｔ Ｏｒｇａｎｉｓｍ Ｄｅｐｏｓｉｔａｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、日本国茨城県つくば市東１丁目１番１ 中央第６（郵便番号３０５−８５６６）。
２．芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群（本発明の遺伝子群）
本発明の遺伝子群は、芳香環ジオキシゲナーゼを構成する４つのサブユニットをコードする４つの遺伝子からなる。４つのサブユニットとは、大（α）サブユニット、小（β）サブユニット、フェレドキシン、フェレドキシンレダクターゼ（フェレドキシン還元酵素）である。
１番目の遺伝子である芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットをコードする遺伝子は、以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードするものである。
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド。
（ａ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能する４６０アミノ酸配列よりなるペプチド（ＰｈｎＡ１とも呼ぶ）である。ここで、「芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能する」とは、芳香環ジオキシゲナーゼを構成する他の３つのサブユニットと複合体を形成し、芳香環ジオキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
（ｂ）のペプチドは、（ａ）のペプチドに、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。人為的変異を生じさせる手段としては、部位特異的変異誘発法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，６４８７−６５００，１９８２）などを挙げることができるが、これに限定されるわけではない。変異したアミノ酸の数は、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能できる限り、その個数は制限されないが、通常は、３０アミノ酸以内であり、好ましくは２０アミノ酸以内であり、更に好ましくは１０アミノ酸以内であり、最も好ましくは５アミノ酸以内である。
（ｃ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチドである。（ｃ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度であり、好ましくは「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度であり、更に好ましくは「０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは、配列番号１記載の塩基配列により表されるＤＮＡと通常高い相同性を有する。高い相同性とは、６０％以上の相同性、好ましくは７５％以上の相同性、更に好ましくは９０％以上の相同性を指す。
２番目の遺伝子である芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットをコードする遺伝子は、以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードするものである。（ｄ）配列番号６記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｅ）配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド。
（ｄ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能する１７７アミノ酸配列よりなるペプチド（ＰｈｎＡ２とも呼ぶ）である。ここで、「芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能する」とは、芳香環ジオキシゲナーゼを構成する他の３つのサブユニットと複合体を形成し、芳香環ジオキシゲナーゼ活性を発揮できることをいう。
（ｅ）のペプチドは、（ｄ）のペプチドに、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能できる限り、その個数は制限されないが、通常は、１０アミノ酸以内であり、更に好ましくは５アミノ酸以内である。
（ｆ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来の芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチドである。（ｆ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、上記で説明したとおりである。
３番目の遺伝子であるフェレドキシンをコードする遺伝子は、以下の（ｇ）、（ｈ）、又は（ｉ）に示すペプチドをコードするものである。（ｇ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｈ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンとして機能するペプチド、（ｉ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンとして機能するペプチド。
（ｇ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼのフェレドキシンとして機能する１０４アミノ酸配列よりなるペプチド（ＰｈｎＡ３とも呼ぶ）である。
（ｈ）のペプチドは、（ｇ）のペプチドに、フェレドキシンとして機能できる程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、フェレドキシンとして機能できる限り、その個数は制限されないが、通常は、６アミノ酸以内であり、更に好ましくは３アミノ酸以内である。
（ｉ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のフェレドキシンとして機能するペプチドである。（ｉ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、上記で説明したとおりである。
４番目の遺伝子であるフェレドキシンレダクターゼをコードする遺伝子は、以下の（ｊ）、（ｋ）、又は（ｌ）に示すペプチドをコードするものである。（ｊ）配列番号８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、（ｋ）配列番号８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド、（ｌ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
（ｊ）のペプチドは、サイクロクラスティカス属Ａ５株から得られた芳香環ジオキシゲナーゼのフェレドキシンレダクターゼ活性を有する３４０アミノ酸配列よりなるペプチドで（ＰｈｎＡ４とも呼ぶ）ある。
（ｋ）のペプチドは、（ｊ）のペプチドに、フェレドキシンレダクターゼ活性を有する程度の変異が導入されたペプチドである。このような変異は、自然界において生じる変異のほかに、人為的な変異をも含む。変異したアミノ酸の数は、フェレドキシンレダクターゼ活性を有する限り、その個数は制限されないが、通常は、２０アミノ酸以内であり、好ましくは１４アミノ酸以内であり、更に好ましくは７アミノ酸以内であり、最も好ましくは４アミノ酸以内である。
（ｌ）のペプチドは、ＤＮＡ同士のハイブリダイゼーションを利用することにより得られる細菌由来のフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチドである。（ｌ）のペプチドにおける「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、上記で説明したとおりである。
本発明の遺伝子は以下の手順で得ることができる。先ず、サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株のゲノムＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断後、適当なベクターに連結し、ゲノムＤＮＡライブラリーを作製する。ベクターにはλファージ由来の各種ベクター、例えば、λｇｔ１０やλＺａｐ１１等、コスミドベクターｐＲＡＦＲ３等、又はｐＵＣ１８やｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ等のプラスミドベクターを用いることができる。目的の遺伝子を保持するクローンの選択には、適当な量のインドールをプレートに添加し、青色のインディゴを合成するクローンを選択すればよい。サイクロクラスティカス属Ａ５株の芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子群はクラスターを形成している。それゆえ、選択されたクローン及びそのクローンの持つＤＮＡと重複するＤＮＡ断片を持つクローンの塩基配列を、サンガー法やマキサム−ギルバート法等の一般的な方法により決定することによって、芳香環ジオキシゲナーゼの大サブユニット、小サブユニット、フェレドキシン、及びフェレドキシンレダクターゼをコードするＤＮＡの全長を単離することができる。
３．水酸化された芳香族化合物の製造法
上記の芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群を大腸菌等の微生物に導入し、発現させた組換え微生物を用いて、種々の芳香族化合物と混合培養することで、これらの芳香族化合物に特異的に水酸基を導入することができる。芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子群は４つの遺伝子から構成されており、これらすべてを宿主とする微生物に導入し発現させることが望ましい。なお、本体酵素以外のフェレドキシンとフェレドキシンレダクターゼについては、宿主が元々有しているもので代用可能な場合があり、このような場合は必ずしも導入する必要はない。
大腸菌や放線菌等の種々の微生物のベクターの情報や外来遺伝子の導入・発現法は、多くの実験書に記載されているので（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＣＳＨＬ Ｐｒｅｓｓ，２００１；Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｄ．Ａ．，Ｂｉｂｂ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｈａｔｅｒ，Ｋ．Ｆ．，Ｂｒｕｔｏｎ，Ｃ．Ｊ．，Ｋｉｅｓｅｒ，Ｈ．Ｍ．，Ｌｙｄｉａｔｅ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｐ．，Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｍ．，Ｓｃｈｒｅｍｐｆ，Ｈ． Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｎｏｒｗｉｃｈ，ＵＫ，１９８５）、それらに従ってベクターの選択、遺伝子の導入、発現を行うことができる。
本発明の方法により、多環式芳香族化合物（アルキル基を有する多環式芳香族炭化水素を含む）やフェニル基を有する芳香族化合物など種々の芳香族化合物に水酸基を導入することができる。下表に、本発明の方法によって製造される水酸化された芳香族化合物（変換産物）と基質として用いる芳香族化合物（基質）を例示する。但し、本発明の方法によって製造される芳香族化合物は、これらの化合物に限定されるわけではない。
上記の変換産物の中で、最も産業利用上、重要な変換産物は（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノールである。本化合物は、樹脂原料、染・顔料原料である１，４−ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の１，４−ジメチルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。現在、１，４−ナフタレンジカルボン酸（化審法化学物質）は１，４−ジメチルナフタレンから石油化学工業により作られているが、環境に優しいバイオプロセス技術への代替技術の開発が求められている。
４．芳香族化合物で汚染された環境の浄化方法
本発明の微生物は、芳香族化合物で汚染された環境の浄化に利用することができる。ここでいう「環境」には、土壌、海洋、大気のほか、排水なども含まれる。環境の浄化は、上記条件で培養した微生物の培養液、あるいは、微生物を凍結乾燥処理した乾燥粉末を汚染環境に散布することにより行われる。この際、乾燥粉末と増殖を補助する無機塩類を混合・造粒し、粉末状及び顆粒状等に製剤化したものを汚染環境に散布しても良い。処理に用いる微生物の量は、土壌及び海水の汚染状況等に応じ、任意に定めることができるが、通常、汚染土壌１ｍ３あるいは汚染海域１００ｍ２に培養液であれば０．０２Ｌ、乾燥菌体であれば０．１ｇ程度である。また、汚染された大気の浄化は、上記培養液あるいは乾燥菌体を固定化担体を設置した気体の浄化装置に添加し、これに汚染大気を通気することで行う。さらに、汚染された排水の浄化は、同じく上記培養液あるいは乾燥菌体を汚染排水と混合し、好気条件で７〜６０日程度培養することで行う。
以下、実施例により本発明について具体的に説明する。もっとも、本発明はこれにより限定されるものではない。
【実施例】
［実施例１］ サイクロクラスティカス属Ａ５株のＤＮＡライブラリーの作製
サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）Ａ５株を、０．１％（ｗ／ｖ）のフェナントレンを含む１リットルの人工海水に植菌し、２５℃で７日間培養した。集菌した後、Ａ５株の長鎖（ゲノム）ＤＮＡを調製した（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐ．２，１９９４）。５０ｍｇのＡ５株ＤＮＡに０．５ユニットの制限酵素Ｓａｕ３ＡＩを添加して３７℃で３０分間反応させ、部分切断を行った。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分画し、１５ｋｂから３０ｋｂの範囲のＤＮＡ断片を回収した。一方、コスミドベクターＬｏｒｉｓｔ６（Ｓｔａｓｋａｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９，５７８９−５７９４，１９８７）を制限酵素ＢａｍＨＩで切断したものを用意した。Ａ５株ＤＮＡのＳａｕ３ＡＩ部分切断断片と上記のコスミドベクターＤＮＡを混合し、Ｔａｋａｒａ ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２により連結し、ＧｉｇａｐａｃｋＴＭＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いてパッケージングした後、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＸＬ−１株に感染させた。形質転換したポピュレーションのうち４９０クローンを維持管理し、これをサイクロクラスティカス属Ａ５株のＤＮＡライブラリーとした。
［実施例２］ 芳香環ジオキシゲナーゼをコードするコスミドクローンの同定
実施例１で得られたサイクロクラスティカス属Ａ５株のＤＮＡライブラリーのすべてのコロニーについて、培地にインドールを添加し、インディゴブルーの発色を指標として、芳香環（ジ）オキシゲナーゼ遺伝子群を含むＤＮＡ断片を有するクローンのスクリーニングを行った。その結果、プラスミドｐＨ１ａまたはｐＨ１ｂを含む２クローンに関して明らかにポジティブなシグナルが認められた。これらのプラスミドに含まれる挿入断片の制限酵素マッピングの結果、これら２つの挿入断片は互いにオーバーラップしていることが分かった。以後、各種領域のサブクローニング及び塩基配列の決定には、このｐＨ１ａを用いた。
［実施例３］ 芳香環ジオキシゲナーゼをコードする遺伝子群の塩基配列の決定
実施例２で得られたコスミドクローンｐＨ１ａを制限酵素処理により切り出し、クローニングベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）にサブクローニングした。このベクターのマルチクローニング部位の両サイドにはＴ７プロモーター及びＴ３プロモーターが配備されている。クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列を決定するため、それぞれのプロモーターの塩基配列に基づいた以下のＤＮＡプライマーを設計し合成した。
なお、シークエンス反応はＤｙｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（パーキンエルマー社）で行い、３７７ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（パーキンエルマー社）で解析した。１３ｋｂ領域の塩基配列を明らかにした。この領域に、公知の芳香環ジオキシゲナーゼの各種サブユニットと、それぞれ有意な相同性を示す産物をコードし得る遺伝子が見出された。そこで、大（α）サブユニットと相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ１（配列番号１）、小（β）サブユニットと相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ２（配列番号２）、フェレドキシンと相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ３（配列番号３）、そしてフェレドキシンレダクターゼ（フェレドキシン還元酵素）（フェレドキシン・ＮＡＤ（Ｐ）Ｈレダクターゼ）と相同の産物をコードし得る遺伝子をｐｈｎＡ４（配列番号４）と名付けた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ１（配列番号５）は４６０アミノ酸配列よりなっており、他の微生物の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとの相同性は、高い順に、スフィンゴモナス・アロマティシボランス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓａｒｏｍａｔｉｃｉｖｏｒａｎｓ）Ｆ１９９株、及びアルカリゲネス・ファセアリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓｆａｃｅａｌｉｓ）ＡＦＫ２株の芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニット［ＢｐｈＡ１ｆ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０４９０６２）およびＰｈｎＡｃ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＡＡ７６３２３）］とそれぞれ、６４％及び５２％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ２（配列番号６）は１７７アミノ酸配列よりなっており、他の微生物の芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとの相同性は、高い順に、スフィンゴモナス・アロマティシボランスＦ１９９株、及びスフィンゴピクシス・マクロゴルタビダ（Ｓｐｈｉｎｇｏｐｙｘｉｓｍａｃｒｏｇｏｌｔａｂｉｄａ）ＴＦＡ株の芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニット［ＢｐｈＡ２ｆ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０４９０６１）およびＴｈｎＡ２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＮ２６４４４）］とそれぞれ、５２％及び３９％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ３（配列番号７）は１０４アミノ酸配列よりなっており、他の微生物のフェレドキシンとの相同性は、高い順に、スフィンゴモナス・アロマティシボランスＦ１９９株、及びスフィンゴモナス・チャングブケンシス（Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓｃｈｕｎｇｂｕｋｅｎｓｉｓ）のフェレドキシン［ＢｐｈＡ３（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＮＰ＿０４９２１１）およびＰｈｎＲ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＡＡＣ９５３２０）］とそれぞれ、６３％及び６３％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
サイクロクラスティカス属Ａ５株のＰｈｎＡ４（配列番号８）は３４０アミノ酸配列よりなっており、他の微生物のフェレドキシンレダクターゼとの相同性は、高い順に、シュードモナス・スタッツエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｓｔｕｔｚｅｒｉ）ＯＸ１株、及びアルカリゲネス・ファセアリスＡＦＫ２株のフェレドキシンレダクターゼ［ＴｏｕＦ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＣＡＡ０６６５９）およびＰｈｎＡａ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．ＢＡＡ７６３２１）］とそれぞれ、５０％及び４７％の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を有していた。
［実施例４］ 芳香環ジオキシゲナーゼ遺伝子を発現するプラスミドの作製
プラスミドｐＨ１ａ（実施例２）をＰｓｔＩとＳａｌＩで切断して得た２．７ｋｂのＰｓｔＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片［ｐｈｎＡ１遺伝子（配列番号１）及びｐｈｎＡ２遺伝子（配列番号２）領域を含む］を、ＰｓｔＩとＳａｌＩで開裂したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋に連結して、プラスミドｐＩＳＰ３を作製した。次に、これに、フェレドキシン遺伝子［ｐｈｎＡ３（配列番号３）］及びフェレドキシンレダクターゼ遺伝子［ｐｈｎＡ４（配列番号４）］を以下のようにして連結した。フェレドキシンレダクターゼ及びフェレドキシン遺伝子を含む１．４５ｋｂのＤＮＡ断片の両端に制限酵素ＫｐｎＩとＸｈｏＩ認識配列を作るようにデザインした下記のプライマーＦ−ＫｐとＦｒ−Ｘｈを用いて、ｐＨ１ａを鋳型にＰＣＲ反応を行った。増幅した１．５ｋｂ断片をＫｐｎＩとＸｈｏＩで切断し、１．４５ｋｂの断片を得、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩで切断して開裂したｐＩＳＰ３と連結させ、プラスミドｐＰｈｎを作製した。このプラスミドにおいて各遺伝子は何れもｌａｃプロモータの支配下にあり、ｐｈｎＡ１−ｐｈｎＡ２−ｐｈｎＡ４−ｐｈｎＡ３の順に並んでいる。このｐＰｈｎを大腸菌ＪＭ１０９株（Ｔａｋａｒａ社）に導入することにより得られた形質転換体［今後、大腸菌（ｐＰｈｎ）と記述する場合がある］を以後の実験に用いた。
［実施例５］ 組換え大腸菌と基質の共存培養
実施例４で作製した大腸菌（ｐＰｈｎ）を、１５０μｇ／ｍｌのアンピシリン（Ａｐ）を含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）で対数期前半まで液体培養し、最終濃度が約３０％になるようにグリセロールで懸濁し、−７０〜−８０℃のディープフリーザーに入れることにより、グリセロール保存株とした。また、コントロールとして、大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＳＫ＋を有するＪＭ１０９も同様に培養してグリセロール保存株を作製した。
変換反応を開始するにあたって、まず、上記のグリセロール保存株から、大腸菌形質転換体を白金耳で掻き取り、１５０μｇ／ｍｌのＡｐを含むＬＢ培地４ｍｌに懸濁し、１２０ｒｐｍ、３０℃で７〜８時間培養した（前培養）。次に、この前培養を、１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び１０μｇ／ｍｌのチアミン（ｔｈｉａｍｉｎｅ）を含むＭ９培地（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．”Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９，Ａｐｐｅｎｄｅｘ Ａ．３参照）７０ｍｌに入れ、１２０ｒｐｍ、３０℃で１６〜１７時間（一晩）培養した（本培養）。これで、ＯＤ ６００ｎｍが約１になる。これを８，０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離して菌体のみを集めた後、最終濃度１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）と７ｍｇの基質を含む７０ｍｌのＭ９培地（１５０μｇ／ｍｌのＡｐ、０．４％（ｗ／ｖ）のグルコース、及び１０μｇ／ｍｌのチアミンを含む）に懸濁し、１２０ｒｐｍ、３０℃で２〜３日間さらに培養を行った。なお、基質として、多環式芳香族化合物である、ナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、２−メチルナフタレン（２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１，４−ジメチルナフタレン（１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、１，５−ジメチルナフタレン（１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）、フェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）、アントラセン（ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）、ピレン（ｐｙｒｅｎｅ）、ベンゾ［ａ］ピレン（ｂｅｎｚｏ［ａ］ｐｙｒｅｎｅ）、ジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎｅ）、ジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）、及び、フェニル環を含む芳香族化合物であるジフェニルメタン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）、ビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｙｌ）、２−フェニルベンゾキサゾール（２−ｐｈｅｎｙｌｂｅｎｚｏｘａｚｏｌｅ）を用いた。これらは、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、和光純薬、または関東化学から購入した。これらの基質は、通常１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにエタノールに溶かしたものを０．７ｍｌ加えた。培養２〜３日目に７０ｍｌのメタノールを加え３０分間撹拌することにより脂質を抽出し、８，０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離して上清を集め、脂質粗抽出液とした。たいていの場合、この状態で、４℃で数週間保存可能であったが、脂質抽出液はすぐにＨＰＬＣ分析に供した。
［実施例６］ 変換産物のＨＰＬＣ分析
実施例５で調製された脂質粗抽出液６０μｌを１回のｉｎｊｅｃｔｉｏｎに供した。ＸＴｅｒｒａ ＭＳ Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を用い、１ｍｌ／ｍｉｎの速度でＨＰＬＣを行った。ＨＰＬＣの本体装置としてＷａｔｅｒｓ社のアライアンスシステムを用い、フォトダイオードアレイ検出器としてＷａｔｅｒｓ ９９６型を用いた。展開溶媒の条件は、以下の通りである。
Ａ液：水／メタノール（５０／５０）
Ｂ液：メタノール／２−プロパノール（６０／４０）
０〜５分（Ａ液）、５〜２０分［Ａ液→Ｂ液：凸型グラジエント（Ｎｏ．３、Ｗａｔｅｒｓ）］、２０分〜（Ｂ液）
この条件では通常、３１分以内に全化合物が分離された。２１０〜３５０ｎｍの範囲で吸収極大値を示した波長（ｍａｘ ｐｌｏｔ）でモニターしたピークの面積比をもって変換率とした。
この分析で変換が確認されたものについて次の精製・同定のステップに進めた。なお、精製・同定のステップに進める場合は、培養のスケールを実施例６のスケールの１０倍〜２０倍で行った。
このＨＰＬＣ分析の結果を下の表に示した。＋で示されたものが変換産物が確認されたものである。
〔実施例７〕 変換産物の精製・同定
大腸菌（ｐＰｈｎ）と、実施例６で変換が確認された基質の混合培養液７００ｍｌ〜１，４００ｍｌに等量のメタノールを添加し、室温で２時間撹拌した。これを７，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ遠心分離し、上清を回収した。上清は減圧下３００ｍｌ〜５００ｍｌまで濃縮し、等量の酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）で２度抽出した。酢酸エチル層を減圧下濃縮し生成物含有エキスを得た。エキスをシリカゲル［０．２５ｎｍ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０，（Ｍｅｒｃｋ）］を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にかけ、変換産物の確認を行った後、シリカゲルカラム［２０ｘ２５０ｍｍ，Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ６０（Ｍｅｒｃｋ）］を用いたカラムクロマトグラフィーに供し、純品を得た。
なお、各基質におけるＴＬＣの展開溶媒は以下の通りである。
ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（５：１）；ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１）；ｂｉｐｈｅｎｙｌ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１０：１）．
１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１）．
また、各基質におけるカラムクロマトグラフィフィーの展開溶媒は以下の通りである。
ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１：１）；ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（５：１），ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；ｂｉｐｈｅｎｙｌ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（１５：１）．
１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；２−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（４：１）；１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（３：１）；２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ，ｈｅｘａｎｅ−ＥｔＯＡｃ（２：１）．
ＭＳスペクトル、及びＮＭＲスペクトルはそれぞれ、ＪＥＯＬ ＪＭＳ−ＡＸ５０５Ｗ、及びＢＲＵＫＥＲＡＭＸ４００を用いて測定した。
１．フェナントレンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりフェナントレン（ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（８４．０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物１）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物１（１８．２ｍｇ）の純品を得た。化合物１は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｊｅｒｉｎａ，Ｄ．Ｍ．，Ｓｅｌａｎｄｅｒ，Ｈ．，Ｙａｇｉ，Ｈ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｄａｖｅｙ，Ｊ．Ｆ．，Ｍａｈａｄｅｖａｎ，Ｖ．，ａｎｄ Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｔ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，９８，５９８８−５９９６，１９７６）により、シス−３，４−ジヒドロキシ−３，４−ジヒドロフェナントレン（ｃｉｓ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：ｃｉｓ−３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｐｈｅｎａｎｔｈｒｅｎｅ−３，４−ｄｉｏｌ）（図１）であると同定した。
２．ナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりナフタレン（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（４６．２ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物２）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物２（７．６ｍｇ）の純品を得た。化合物２は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｎｏｊｉｒｉ，Ｈ．，Ｎａｍ，Ｊ，−Ｗ．，Ｋｏｓａｋａ，Ｍ．，Ｍｏｒｉ，Ｋ．，Ｔａｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｆｕｒｉｈａｔａ，Ｋ．，Ｙａｍａｎｅ，Ｈ．，ａｎｄ Ｏｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８１，３１０５−３１１３，１９９９）により、シス−１，２−ジヒドロキシ−１，２−ジヒドロナフタレン（ｃｉｓ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：ｃｉｓ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（図１）であると同定した。
３．ジベンゾフランの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジベンゾフラン（ｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）の変換実験を行った粗抽出物（８６．５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物３）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物３（２１．０ｍｇ）の純品を得た。化合物３は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｊｉａ，Ｃ．，Ｐｉａｎｏ，Ｄ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｙ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６５，７５１６−７５２２，２０００）により、２−ヒドロキシジベンゾフラン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｆｕｒａｎ）（ＩＵＰＡＣ名：ｄｉｂｅｎｚｏ［ｂ，ｄ］ｆｕｒａｎ−２−ｏｌ）（図１）であると同定した。
４．ジベンゾチオフェンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジベンゾチオフェン（ｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（４６．８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物４）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物４（７．２ｍｇ）の純品を得た。化合物４は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｎｉｓｈｉｏｋａ，Ｍ．，Ｃａｓｔｌｅ，Ｒ．Ｎ．ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｍ．Ｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｍｏｎｏａｍｉｎｏ ａｎｄ ｍｏｎｏｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅｓ．Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌ．Ｃｈｅｍ．，２２，２１５−２１８，１９８５）により、２−ヒドロキシジベンゾチオフェン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｂｅｎｚｏｔｈｉｏｐｈｅｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：ｅｎｚｏ［ｂ］ｂｅｎｚｏ［ｂ］ｔｈｉｏｐｈｅｎ−２−ｏｌ）（図１）であると同定した。
５．ジフェニルメタンの変換産物の同定
組換え大腸菌によりジフェニルメタン（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（３３．１ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．５（化合物５）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物５（６．２ｍｇ）の純品を得た。化合物５は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｎａｋａｉ，Ｙ．ａｎｄ Ｙａｍａｄａ，Ｆ．，Ｏｒｇ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．，１１，６０７−６１１，１９７８）により、２−ヒドロキシジフェニルメタン（２−ｈｙｄｒｏｘｙｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ）（ＩＵＰＡＣ名：２−ｂｅｎｚｙｌｐｈｅｎｏｌ）（図１）であると同定した。
６．ビフェニルの変換産物の同定
組換え大腸菌によりビフェニル（ｂｉｐｈｅｎｙｌ）の変換実験を行った粗抽出物（５４．５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物６）とＲｆ値０．３（化合物７）の２つの産物が生成していることが判明した。両産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物６（６．６ｍｇ）及び化合物７（２．３ｍｇ）の純品を得た。化合物６及び７は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｓａｋｕｒａｉ，Ｈ．，Ｔｓｕｋｕｄａ，Ｔ．，ａｎｄ Ｈｉｒａｏ，Ｔ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６７，２７２１−２７２２，２００２）により、それぞれｏ−ビフェニルオール（ｏ−ｂｉｐｈｅｎｙｌｏｌ）（ＩＵＰＡＣ名：２−ｐｈｅｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）及びｍ−ビフェニルオール（ｍ−ｂｉｐｈｅｎｙｌｏｌ）（ＩＵＰＡＣ名：３−ｐｈｅｎｙｌｐｈｅｎｏｌ）（図１）であると同定した。
７．１−メチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（２８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物８）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物８（７．３ｍｇ）の純品を得た。化合物８は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，Ｂｏｓｅｔｔｉ，Ａ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．Ｄ．，Ｇａｌｌｉ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｎｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，３０３−３１３，１９９５）により、シス−８−メチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（ｃｉｓ−８−ｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ：ＩＵＰＡＣ名）（図２）であると同定した。
８．２−メチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１−メチルナフタレン（１−ｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（２８ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物９）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、化合物９（１．８ｍｇ）の純品を得た。化合物９は、以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較（Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，Ｂｏｓｅｔｔｉ，Ａ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．Ｄ．，Ｇａｌｌｉ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｎｉ，Ｆ．，ａｎｄ Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，４４，３０３−３１３，１９９５）により、シス−７−メチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（ｃｉｓ−７−ｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ：ＩＵＰＡＣ名）（図２）であると同定した。
９．１，４−ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１，４−ジメチルナフタレン（１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１７６ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物１０），０．１（化合物１１）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１０（４ｍｇ）、化合物１１（６５ｍｇ）の純品を得た。
化合物１０の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １９０．０９９３，ｃａｌｃｄ １９０．０９９４］よりＣ１２Ｈ１４Ｏ２と決定された。化合物１０のＨＭＱＣ及びＤＱＦ ＣＯＳＹスペクトル分析により、化合物１０は１，４−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅの５，６位が１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｄｉｏｌとなったものであると決定された。これはＨＭＢＣスペクトルにおいて、Ｈ−４（δ２．３７）及びＨ−８（δ６．５６）からＣ−４ａ（δ１３２．２）へ観測された遠隔スピン結合によっても確認された。以上の結果より、化合物１０は５，８−ジメチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（５，８−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（図３）と同定した。本物質は新規化合物であった。
化合物１１の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １８８．０８３８，ｃａｌｃｄ １８８．０８３８］よりＣ１２Ｈ１２Ｏ２と決定された。化合物１１の１Ｈ ＮＭＲではナフタレン環部分のシグナルには大きな変化がなく、メチル基の信号が消失し、新たに酸素と結合したメチレン基（δ４．９４）及びこれとカップリングした水酸基（δ５．２８）の信号が観測された。以上の結果より、化合物１１は（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール（４−ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｙｌ）−ｍｅｔｈａｎｏｌ）（図３）と同定した。化合物１１はＣＡＳに記載されている既知化合物であったが、化合物１１を芳香環ジオキシゲナーゼ等の酵素（遺伝子）を用いた生変換反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物１１の製造法としても本発明による方法は有効である。なお、この（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノールは、樹脂原料、染・顔料原料である１，４−ナフタレンジカルボン酸を、石油成分の１，４−ジメチルナフタレンからバイオプロセスにより製造する場合の重要な合成中間体となる。
１０．１，５−ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により１，５−ジメチルナフタレン（１，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（２０５ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．３（化合物１２）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１２（４０ｍｇ）の純品を得た。化合物１２の分子式は、ＨＲ−ＥＩＭＳ［ｆｏｕｎｄ １７２．０８８８，ｃａｌｄ．１７２．０８８９］よりＣ１２Ｈ１２Ｏと決定された。化合物１２の１Ｈ ＮＭＲではナフタレン環部分のシグナルには大きな変化はなく、メチル基の１本分の信号が消失し、新たに酸素と結合したメチレン基（δ５．０４）が観測された。以上の結果より、化合物１２は（５−メチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール（５−ｍｅｔｈｙｌ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｙｌ）−ｍｅｔｈａｎｏｌ）（図３）と同定した。化合物１２はＣＡＳに記載されている既知化合物であったが、化合物１２を芳香環ジオキシゲナーゼ等の酵素（遺伝子）を用いた生変換反応により製造できるという報告はこれが最初である。従って、化合物１２の製造法としても本発明による方法は有効である。
１１．２，６−ジメチルナフタレンの変換産物の同定
組換え大腸菌により２，６−ジメチルナフタレン（２，６−ｄｉｍｅｔｈｙｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ）の変換実験を行った粗抽出物（１１０ｍｇ）をＴＬＣに供したところ、Ｒｆ値０．２（化合物１３）の産物が生成していることが判明した。本産物をシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、化合物１３（３０．６ｍｇ）の純品を得た。
化合物１３は以前に報告されたＭＳとＮＭＲのスペクトルデータとの比較［Ｂｅｓｔｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｄ．，Ｂｏｓｅｔｔｉ，Ａ．，Ｄｉ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｐ．，Ｇａｌｌｉ，Ｅ．，Ｌｅｏｎｉ，Ｂ．，Ｐｅｌｉｚｚｏｎｉ，Ｆ．，Ｓｅｌｌｏ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅｓ ｔｏ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ １，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｉｏｎ−ａｎｄ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，４４，３０６−１３，１９９５］により、３，７−ジメチル−１，２−ジヒドロナフタレン−１，２−ジオール（３，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏ−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１，２−ｄｉｏｌ）（図３）であると同定した。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本出願は、２００２年１１月２９日出願の日本特許出願（特願２００２−３４７２４０）、および、２００３年９月１７出願の日本特許出願（特願２００３−３２４１１７）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
【産業上の利用可能性】
本発明は、サイクロクラスティカス属（Ｃｙｃｌｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ ｓｐ．）細菌に由来する芳香環ジオキシゲナーゼの大（α）サブユニット遺伝子、小（β）サブユニット遺伝子、フェレドキシン遺伝子、及び、フェレドキシンレダクターゼ遺伝子を提供する。本発明による遺伝子群から造られるタンパク質は、石油やコールタール由来の環境汚染物質である芳香族化合物に水酸基を導入することができる。すなわち、本発明による遺伝子群を発現した微生物により、これらの石油系芳香族化合物を特異的に水酸化する方法を提供する。水酸化された芳香族化合物は、微生物等により容易に分解されるようになるので、本発明は、汚染土壌等の環境浄化等に有用である。また、この方法により、産業上有用な水酸化された芳香族化合物を作ることができる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド。
【請求項２】
以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ｄ）配列番号６記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、
（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド。
【請求項３】
以下の（ｇ）、（ｈ）、又は（ｉ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ｇ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｈ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンとして機能するペプチド、
（ｉ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンとして機能するペプチド。
【請求項４】
以下の（ｊ）、（ｋ）、又は（ｌ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ｊ）配列番号８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｋ）配列番号８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド、
（ｌ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至４に記載の遺伝子のすべて又は一部を導入して得られる微生物であって、芳香族化合物に水酸基を導入できる微生物。
【請求項６】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を得ることを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の微生物で、芳香族化合物で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
【請求項９】
芳香族化合物を含む培地が、１，４−ジメチルナフタレン又は１，５−ジメチルナフタレンを含む培地であり、水酸化された芳香族化合物が、メチル基が水酸化された芳香族化合物であることを特徴とする、請求項７記載の水酸化された芳香族化合物の製造法。
【請求項１０】
メチル基が水酸化された芳香族化合物が、（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール、又は（５−メチルナフタレン−１−イル）−メタノールであることを特徴とする、請求項９記載の水酸化された芳香族化合物の製造法。
【請求項１】
以下の（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ａ）配列番号５記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｂ）配列番号５記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド、
（ｃ）配列番号１記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ大サブユニットとして機能するペプチド。
【請求項２】
以下の（ｄ）、（ｅ）、又は（ｆ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ｄ）配列番号６記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｅ）配列番号６記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつ芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド、
（ｆ）配列番号２記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、芳香環ジオキシゲナーゼ小サブユニットとして機能するペプチド。
【請求項３】
以下の（ｇ）、（ｈ）、又は（ｉ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ｇ）配列番号７記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｈ）配列番号７記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンとして機能するペプチド、
（ｉ）配列番号３記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンとして機能するペプチド。
【請求項４】
以下の（ｊ）、（ｋ）、又は（ｌ）に示すペプチドをコードする遺伝子：
（ｊ）配列番号８記載のアミノ酸配列からなるペプチド、
（ｋ）配列番号８記載のアミノ酸配列において１もしくは複数個のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、かつフェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド、
（ｌ）配列番号４記載の塩基配列からなるＤＮＡ又はそれと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡがコードする細菌由来のペプチドであって、フェレドキシンレダクターゼ活性を有するペプチド。
【請求項５】
請求項１乃至４に記載の遺伝子のすべて又は一部を導入して得られる微生物であって、芳香族化合物に水酸基を導入できる微生物。
【請求項６】
微生物が大腸菌であることを特徴とする請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
請求項５又は６に記載の微生物を、芳香族化合物を含む培地で培養して培養物又は菌体から水酸化された芳香族化合物を得ることを特徴とする、水酸化された芳香族化合物の製造法。
【請求項８】
請求項５又は６に記載の微生物で、芳香族化合物で汚染された環境を浄化することを特徴とする環境の浄化方法。
【請求項９】
芳香族化合物を含む培地が、１，４−ジメチルナフタレン又は１，５−ジメチルナフタレンを含む培地であり、水酸化された芳香族化合物が、メチル基が水酸化された芳香族化合物であることを特徴とする、請求項７記載の水酸化された芳香族化合物の製造法。
【請求項１０】
メチル基が水酸化された芳香族化合物が、（４−ヒドロキシメチル−ナフタレン−１−イル）−メタノール、又は（５−メチルナフタレン−１−イル）−メタノールであることを特徴とする、請求項９記載の水酸化された芳香族化合物の製造法。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０５０８７５
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５７０７２３（Ｐ２００４−５７０７２３）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５１０２
【国際出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年６月１７日（２００４．６．１７）
【発行日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１５１０２
【国際出願日】平成１５年１１月２６日（２００３．１１．２６）
【出願人】（５９１００１９４９）株式会社海洋バイオテクノロジー研究所 (33)
【Ｆターム（参考）】
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