新規のガラクトオリゴサッカライド組成物およびその調製法
本発明は、ラクトースをガラクトオリゴサッカライドの新規混合物に変換する、新規ガラクトシダーゼ酵素活性を持ちうる、ビフィドバクテリウム ビフィダムの新規な株を提供する。前記オリゴサッカライドの混合物は、腸内ビフィズス菌の増殖を促進し、病原性微生物叢の増殖を抑制することで腸の健康を改善するために、多数の食物製品、または動物の餌に組み込むことが可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトースを新規のガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換可能な、新規のガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせるビフィドバクテリウム ビフィダムの新規株に関する。ガラクトサッカライドは、消化不可能な糖質であり、哺乳動物の胃腸消化酵素に耐性を示すが、特定の大腸菌によって発酵される。本発明はまた、腸内のビフィズス菌の増殖を促進することが可能であり、新規のガラクトオリゴサッカライド組成物を生成するための、ビフィズス菌株の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管内菌叢には、病原性、良性そして有益な属がある。前者が優占種である場合、急性（たとえば胃腸炎）および慢性（たとえば炎症性腸疾患、過敏性腸症候群および腸がん）の両方であり得る腸疾患が発症しうる。１つまたはそれ以上のそれら微生物株を、適切な食物担体に加えることによって、ビフィズス菌等の有益な微生物が優占種となるような腸管内菌叢のバランスをもたらすための試みが為されてきた。そのような生微生物食物サプリメントが体によいことは公知である。しかしながら、食物中、また消化後に、生細菌の生存を保証することは難しい。
【０００３】
腸管内菌叢の食事操作に対する他のアプローチは、プレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）を使用することであり、大腸内の１つまたは限定された数の細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することによる結果として宿主の健康を改善させることによって、宿主に有益な影響を与える、消化不可能な食物成分として定義される。
【０００４】
ヒト大腸管内菌叢は、誕生時点で獲得される。母乳を与えられた胎児では、他の属と容易に競合するビフィズス菌が優占的である。これは、ヒトのミルク成分が促進的であるからである。一方、調乳を与えられた胎児は、バクテロイド、クロストリディア、ビフィズス菌、乳酸菌、グラム陽性球菌、大腸菌および他の群すべてが、全く等しい特性を有する成人の腸と似た、より複雑な腸管内菌叢を持つ。ビフィズス菌は一般的に、大腸感染に対して防御的であると考えられており、おそらくこの差によって、調乳ミルクを与えられた胎児と比較して、母乳を与えられた胎児における感染の頻度が非常に低いことが説明される。
【０００５】
腸管内菌叢の特定の構成要素が、腸疾患の原因に関与してきた。たとえば、マイコバクテリアは、クローン病に関連し、潰瘍性大腸炎は、硫酸減少性細菌によって引き起こされ、腸がんの発達に細菌が関与しうる。有用な常在の腸内細菌の選択的増殖が、プレバイオティックの摂取によって促進される場合には、明らかに有益である。これは、病原性細菌叢が抑制されうるという継続的効果をもたらす。
【０００６】
プレバイオティックとして分類される化合物の群の１つは、ガラクトオリゴサッカライドであり、これは、Ｇｌｃα１−４［β Ｇａｌ１−６］ｎの形態でのガラクトース含有オリゴサッカライドであり、式中ｎ＝２〜５であり、酵素β−ガラクトシダーゼのトランスガラクトシラーゼ活性を用いて、ラクトースシロップから生成される（Crittenden,(1999)、Probiotics（体によい働きをするバクテリア）：論評(Probiotics:A Critial Review.)、Tannock,G(ed)Horizon Scientific Press,Wymondham,pp.141-156。）３つの製品が、僅かに異なる組成を有して現在市販されている。これらのうちの1つ目は、トランスガラクトシル化オリゴサッカライド（ＴＯＳ）であり、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）よりβ−ガラクトシダーゼを用いて生成され(Tanaka et al.,(1983)Bifidobacteria Microflowa,2,17-24)、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサ−ガラクト−オリゴサッカライドからなる。2つ目は、オリゴメート５５（Ｏｌｉｇｏｍａｔｅ ５５）であり、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）より、β−ガラクトシダーゼを用いて調製され（Ito et al.,(1999)、Microbial Ecology in Health and Disease,3,285-292）、３６％のトリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサ−のガラクト−オリゴサッカライド類、１６％のジサッカライド類、ガラクトシルグルコースおよびガラクトシルガラクトース、３８％のモノサッカライド類および１０％のラクトースを含む。最後のものは、トランスガラクトシル化ジサッカライド（ＴＤ）の調製物が、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）より、β−ガラクトシダーゼを用いて生成される（Ito et al., (1993), J. Nutritional Science and Vitaminology, 39,279-288）。
【０００７】
ビフィズス菌の一員が、ラクトースの細菌代謝に関与する、β−ガラクトシダーゼ酵素を生成することが知られている。Moller, P.L. et al. Appl. & Environ. Microbiol., (2001),62,(5)、2276-2283では、ビフィドバクテリウム ビフィダムの株からの、３つのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離および特徴化について記述されている。
米国特許第２００２／００８６３５８号は、ビフィドバクテリウム ビフィダムからの新規のβ−ガラクトシダーゼ、とりわけ、高いトランスガラクトシル化活性を持つ酵素の短化バージョンを記述している。該β−ガラクトシダーゼはラクトースと０．５〜６０％の該ラクトースの存在下で一緒にインキュベーションを実施することが可能であることが言及されている一方で、トランスガラクトシル化反応で生成された、ガラクトオリゴサッカライドの例示的な最大収率は、４４％（添加ラクトース１ｍｇあたりの生成されたオリゴサッカライドのｍｇ）であった。さらに、本米国特許明細書中でのオリゴサッカライドの定義より、生成物が、少なくとも３つの連結糖分子からなることが明白である。
【０００８】
Carbohydrate Research, 201,(1990),115-123中で、Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．は、ビフィドバクテリウム ビフィダムＤＳＭ２０４５６でのラクトース加水分解中の、トランスガラクトシダーゼ化反応による、オリゴサッカライドの形成を記述している。生成されたオリゴサッカライド類の混合物の構造についてのこれらの解析によって、結合が、β−（１→３）、β−（１→６）およびβ−（１→４）−Ｄ−ガラクトシルの順であったことが示された。Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒは、ビフィドバクテリウム ビフィダムによって生成された化合物が、大腸内の細菌の付着に関与していることを示唆している。
【０００９】
ビフィズス菌の株は現在、ガラクトオリゴサッカライドの混合物へラクトースを変換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なだけではなく、また、３５％までのジサッカライドガラビオース（Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ）を含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物を生成することが発見されている。後者は、毒素、たとえばシガ毒素、および大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のような病原体の、腸壁への付着を防止することが可能な抗付着物であることが知られている（Paton, J.C.&Paton,A.W. (1989), Clin.Microbiol.Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350を参照のこと）。
【特許文献１】米国特許第２００２／００８６３５８号
【非特許文献１】Crittenden,(1999)、Probiotics: A Critial Review.、Tannock,G(ed)Horizon Scientific Press,Wymondham,pp.141-156
【非特許文献２】Tanaka et al.,(1983)Bifidobacteria Microflowa,2,17-24
【非特許文献３】Ito et al.,(1999)、Microbial Ecology in Health and Disease,3,285-292
【非特許文献４】Ito et al., (1993), J. Nutritional Science and Vitaminology, 39,279-288
【非特許文献５】Moller, P.L. et al. Appl. & Environ. Microbiol., (2001),62,(5)、2276-2283
【非特許文献６】Carbohydrate Research, 201,(1990),115-123
【非特許文献７】Paton, J.C.&Paton,A.W. (1989), Clin.Microbiol.Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ラクトースを新規のガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換可能な、新規のガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせるビフィドバクテリウム ビフィダムの新規株、及び該ビフィズス菌株の使用に関する開示を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ラクトースを、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライド、および少なくとも１つのペンタサッカライドを含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株を提供する。好ましくは、この混合物は、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の開示するビフィドバクテリウム ビフィダムの新規株が生じる新規ガラクトシダーゼの酵素活性によりラクトースを新規のガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ラクトースを、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライド、および少なくとも１つのペンタサッカライドを含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株を提供する。好ましくは、この混合物は、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含有する。
【００１４】
本発明のガラクトシダーゼ酵素活性に関連して使用される語句「酵素活性（ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、少なくとも１つのガラクトシダーゼ酵素からもたらされる活性である。
【００１５】
本発明のある態様において、ガラクトオリゴサッカライド混合物は、ジサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ、トリサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、テトラサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、ペンタサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃを含み、ここでＧａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。
【００１６】
メチル化解析および酵素加水分解を用いて、ガラクトオリゴサッカライド混合物が、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃのテトラサッカライド、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、およびＧａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−4）Ｇ1ｃのトリサッカライド、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−3）−Ｇａｌ、Ｇａ1（β１−６）−Ｇａｌ、および（α１−６）−Ｇａｌのジサッカライドを有することが判明した。
【００１７】
ラクトースを、以上で定義したガラクトオリゴサッカライド類の混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株は、２００３年３月３１日に、Ｎａｔｉｏａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫにて、ＮＣＩＭＢ４１１７１の受託番号にて預託された。
【００１８】
前記預託されたビフィドバクテリウム ビフィダム株またはその生物学的機能等価物は、以上で定義したようなガラクトオリゴサッカライド混合物を生成するために使用可能である。ガラクトオリゴサッカライドの混合物は、腸中のビフィズス菌、とりわけ起源生成株（ｏｒｉｇｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｓｔｒａｉｎ）の増殖を促進することによって、腸の健康を改善するための製品の一部分を形成しうる。そのような製品は、日用品（たとえば、液体ミルク、全ミルク粉末、スキムミルク粉末、脂肪添加乳粉末、乳清粉末等の乾燥ミルク粉末、乳児ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵日常製品）、飲料、幼児食、シリアル、ビスケット、菓子、ケーキ、食物サプリメント、栄養補助食品、動物の餌、家禽の餌または他の食物または飲料からなる群より選択しうる。
【００１９】
オリゴサッカライドの混合物はまた、病原体または病原体によって生成される毒素の腸壁への付着を防止するための医薬品の調製のために使用しうる。この混合物を、しばしば正常の健康な腸管内菌叢を変化させ破壊までする抗生物質投与の後に、または腸における手術の後に、健康な腸の正常な腸管内菌叢を腸内で再構築する目的で、患者に投与しうる。ガラクトオリゴサッカライドの混合物は、以上で言及したビフィドバクテリウム ビフィダムの株または生物学的機能等価物との組み合わせで使用しうる。
【００２０】
語句「生物学的機能等価物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、ラクトースを、以上で定義したようなガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株を意味する。
【００２１】
本発明の他の態様では、有効成分として、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライドおよび少なくとも１つのペンタサッカライドを含む、ビフィズス菌の増殖を促進するための、ガラクトオリゴサッカライド組成物が提供される。
【００２２】
ガラクトオリゴサッカライド組成物は、好ましくは、本明細書にて上述したような、ガラクトオリゴサッカライド混合物を含む。
【００２３】
好ましくは、ガラクトオリゴサッカライド組成物は、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む。
【００２４】
本発明のまた他の態様では、ラクトースまたはラクトース含有物質を、以上で定義したようなビフィドバクテリウム ビフィダムの株で処理することを特徴とする、ビフィズス菌の増殖を促進するための基質を製造するための方法が提供される。
【００２５】
好適なラクトース含有物質は、市販されているラクトース、全ミルク、セミスキムミルク、スキムミルク、乳清および脂肪添加乳（ｆａｔ−ｆｉｌｌｅｄ ｍｉｌｋ）から選択されうる。そのようなミルク製品は、ウシ、バッファロー、ヒツジまたはヤギから得うる。脂肪添加乳は、酪農脂肪を除去した後、植物脂肪または油の添加によって置換されるスキムされた全ミルクとして定義される。
【００２６】
ラクトース以外の糖質基質を含む増殖培地を用いた場合に、本発明によるビフィドバクテリウム ビフィダムが、マルトース、ラフィノース、キシランおよびフルクトースを利用可能であることが判明した。これらの糖質の１つを含む培地中での細菌の培養によって、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、およびβ−フルクトフラノシダーゼの発現がそれぞれ誘導され、その結果として、α−グルコオリゴサッカライド、α−ガラクトオリゴサッカライド、キシロオリゴサッカライドおよびフルクトオリゴサッカライドがそれぞれ生成される。
【００２７】
本発明に至る研究において、腸由来の細菌を、ガラクトシダーゼ生成が可能なもの、つまり、ガラクトオリゴサッカライド（類）を生成する可能性が最も高いものに関して選別を行った。結果として、属ビフィドバクテリウムに属する特定の細菌、とりわけビフィドバクテリウム ビフィダムが、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能であるのみならず、該酵素が、ラクトースを、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物へ変換可能であることが発見された。ビフィドバクテリウム ビフィダムの特定の例が、２００３年３月３１日に、ＮＣＩＭＢ，Ａｂｅｒｄｅｅｎにて、受託番号４１１７１にて預託された。
【００２８】
これらの細菌を培養するために、細菌によって吸収されうる条件を備えたいずれかの栄養供給源を使用することが可能である。適切な培養培地を、例えば、ラクトース、スクロースまたはグルコースのような糖質類；酵母抽出物、トリプトン、肉抽出物（Ｌａｂ Ｌｅｍｃｏ）などのような、窒素を含有する無機的または有機的な栄養供給源；リン酸カリウムのような、無機的栄養供給源；等とともに処方可能である。培養のために、影響培地のｐＨは、６．０〜８．０の範囲、好ましくは７．０であるべきであり、培養は、３５〜４０℃の温度範囲、好ましくは３７℃で、４０〜６４時間、好ましくは５０時間、嫌気的条件で実施する。
【００２９】
前記株は、安定相培養、嫌気的限界培養または振とう培養のような、いずれか公知の培養方法によって培養可能である。細菌細胞を、遠心分離または濾過によって回収することで、さらなる処理を行わずに、反応触媒様のものとして使用可能である。あるいは、細胞は、適切な固定手順によって、固定化状態で使用しうる。
【００３０】
本発明のビフィドバクテリウム ビフィダムは、ラクトース自体、またはミルク製品中に含まれるラクトースを、本発明の新規ガラクトオリゴサッカライド組成物に変換するために使用可能である。変換の後、細菌細胞は遠心分離にて除去可能である。存在するモノサッカライドのいずれかは、たとえば、酵母サッカロマイセス セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）とともにインキュベートして、除去しうる。ついで、混合物を遠心分離および精密濾過に続けてかけうる。得られたＧＯＳ溶液を、続いて噴霧乾燥させ、粉末を得ることも可能である。
【００３１】
この方法によって生成された、本発明のガラクトオリゴサッカライド組成物を含有するミルクは、子供、成人または動物に直接処方することができる。あるいは、ガラクトオリゴサッカライドは酸性条件下および高温条件下で安定であり分解せずに使用可能であるので、パン、菓子のような製品を製造するのにも使用しうる。あるいは、ＧＯＳ粉末を、以上で列記したような製品に加えうる。
【００３２】
ＧＯＳ粉末は、炎症性腸疾患および過敏性腸症候群のような腸疾病を患っている患者に投与可能であり、この場合、２つに分割した用量で、２〜２０ｇ、好ましくは５〜１０ｇ、もっとも好ましくは７ｇの一日用量を摂取しうる。
【００３３】
あるいは、本発明のガラクトオリゴサッカライド組成物を、本発明による、ビフィドバクテリウム ビフィダムの培養液と混合して、腸の健康を改善するための混合物を生成してもよい。そのような混合物は「ＧＩ管中の生細菌食物サプリメントの生存および着床を改善することによって、宿主に有益な影響を与えるプロバイオテックとプレバイオテックの混合」として定義されるシンバイオティック（ｓｙｎｂｉｏｔｉｃ）に分類される（Gibson and Roberfroid, 1995，（ヒト微生物の食物改変：プレバイオティックの概念紹介（Dietary modification of he human microbiota: introducing the concept of prebiotics.）Journal of Nutrition 125, 1401-1412を参照のこと）。このような組み合わせにより、利用可能な選択的基質を提供され、それにより、大腸に都合の悪い環境におけるプロバイオティックの生存が増進される。細菌性プロバイオティックは、ガラクトオリゴサッカライドプレバイオティック中にマイクロ小カプセル化して、たとえば、粉末を生成してよく、ついでこれを、ヨーグルトのような食物製品に加えるか、または栄養補助食品として使用しうる。
【００３４】
本発明のガラクトオリゴサッカライド組成物を含むミルクまたは他の製品を摂取する利点は、クロストリディアのような、腸マイコフローラ中に存在する他のあまり望ましくない細菌の犠牲において、腸中に有益なビフィズス菌のレベルの増加を促進することである。これにより、個々の健康に有害な効果を与えうる、特定の常在細菌の減少がおこる。ついでこれは、胃腸管感染を減少させる。腸炎の予防または治療を補助し、下痢症状を短期化させ、潰瘍性大腸炎および癌のような慢性腸疾患のリスクを減少させる。また、過敏性腸症候群の症状の軽減を補助し得る。
【００３５】
本発明のオリゴサッカライド組成物を、たとえば粉末形態で、含有する餌を与えられる農場動物は、その餌における転換重量の改善を示しうる。
【００３６】
本発明はさらに、以下の実施例に対する参照の方法で記述され得る。
【実施例１】
【００３７】
１０．０ｇ／ｌトリプトン、５．０ｇ／ｌ Ｌａｂ−ＬＥＭＣＯ（肉抽出物）、５．０ｇ／ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／ｌ ＫＨＰＯ、０．０５ｇ／ｌシステインＨＣｌ、１０ｇ／ｌラクトースおよび１ｍｌ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１ｌの培地（ｐＨ７．０）を、１２１℃にて１５分間滅菌した。滅菌の後、この培地に、１．０％（ｖ／ｖ）の新鮮なビフィドバクテリウム ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１培養液を接種させ、嫌気条件下３７℃にて５０時間、インキュベートした。細菌細胞を、遠心分離（３００００ｇ、２０分間）によって回収した。リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．０）で２回洗浄して、細胞をオリゴサッカライド合成反応に使用する準備が出来た。
【００３８】
細菌細胞（β−ガラクトシダーゼ活性の４０ユニット）を、５０ｇのラクトースを含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．０）１００ｍｌ中に再懸濁させた。反応を、４０℃にて進行させ、７時間後、混合液は、３５％（ｗ／ｖ）加水分解生成物（グルコース、ガラクトース）、３７％（ｗ／ｖ）ラクトース、および２〜５のポリマー化の程度で、１８％（ｗ／ｖ）ガラクトオリゴサッカライドの混合物を得た。遠心分離（３０００ｇ、２０分間）による細菌細胞の除去後、モノサッカライド（グルコースおよびガラクトース）を、酵母サッカロマイセス セルビシエとのインキュベーションによって除去した。この酵母を続いて、遠心分離（１００００ｇ、１０分間）によって除去し、ついで混合物を、０．１μ精密濾過フィルターを介して濾過し、生成物の微小生物学的な性質を確保した。ついで糖溶液を噴霧乾燥させて、粉末形態を得た。生成物を、ＡＰＥＸ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅカラム（Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｄ Ｇｌａｍｏｒｇａｎ，ＵＫ）およびＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ ＬａＣｈｒｏｍ製ＲＩ検出器を備える、メルク−日立 ラクロームシステム（Ｍｅｒｃｋ, Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を用いて、高性能液体クロマトグラフィーによって、定量的に解析した。７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを２５℃にて溶出液として、０．８ｍｌ／分の流速で使用した。ガラクトオリゴサッカライド混合物は、２５％のＧａｌ−Ｇａｌ、３５％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、２４％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、および１６％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃから成っていた。
【実施例２】
【００３９】
実施例１に従って調製したビフィドバクテリウム ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１細胞を、撹拌タンク中の５００ｍｌのスキムミルクに加え、（β−ガラクトシダーゼ活性の３００ユニット）を加えた。ラクトース変換を、４０℃にて進行させた。８時間後のガラクトオリゴサッカライド濃度は、２２％（ｗ／ｖ）であり、この混合物は、２８％のＧａｌ−Ｇａｌ、３２％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、２１％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、および１９％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃから成っていた。
【実施例３】
【００４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腸モデル
大腸の状態を、実施例１に従って調製した１％（ｗ／ｖ）のＧＯＳ混合物なし、および該混合物ありで、増殖培地中、健康なヒトボランティアからの１０％（ｗ／ｖ）便ホモジネートを接種させた、３段階の連続発酵（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，３５，１８０−１８７）中で復元した（表２）。モデルは、それぞれの動作容量が２７０、３００、および３００ｍｌである、３つの管、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３からなる。温度を３７℃に設定し、ｐＨと共に自動的に制御した。３つの管中の培養ｐＨは、５．５、６．２および６．８にそれぞれ維持した。各発酵器を磁気撹拌し、Ｏ2を含まないＮ2での連続噴霧（１５ｍｌ／分）によって、嫌気条件を維持した。増殖培地は、以下の成分を含有する。デンプン８ｇ／ｌ、ムチン４ｇ／ｌ、カセイン３ｇ／ｌ、ペプトン水５ｇ／ｌ、トリプトン水５ｇ／ｌ、胆汁Ｎ°３ ０．４ｇ／ｌ、酵母４．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ０．００５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ４．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ４．５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ １．２５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2．６Ｈ2Ｏ ０．１５ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3 １．５ｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０ １ｍｌ、Ｈｅｍｉｎ ０．０５ｇ／ｌ、システイン．ＨＣｌ ０．８ｇ／ｌ。培地を、蠕動ポンプによってＶ１に加え、Ｖ１は連続して、連続チューブを介してＶ２およびＶ３に供給される。本システムを約３６時間の保持時間で操作した。腸モデルを一晩、培養ポンプを変える前に、平衡に維持し、試験基質を含む培地を導入する前、少なくとも１０日間稼動させ、ついでさらに１０日間維持した。試料を、開始時点および各サイクルの終わりで回収した。回収した試料容量は５ｍｌであり、この容量を、細菌群を列挙するために使用した。
【００４１】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
細菌集団の差を、１６Ｓ ｒＲＮＡの診断領域を標的とするように設計したオリゴヌクレオチドプローブで、ＦＩＳＨにより査定を行った。これらは、市販品として合成され、蛍光色素Ｃｙ３（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ＵＫ Ｌｔｄ．より供給される）でラベルした。使用した分子プローブを表１で示した。総細菌の計数には核酸染色４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用した。発酵管から得た試料を、４％（ｗ／ｖ）パラフィンアルデヒド中で希釈し、４℃にて一晩で定着させた。ついで細胞を１５００×ｇにて５分間遠心分離し、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、ＰＢＳ／９９％エタノール（１：１、ｗ／ｖ）の混合液中に再懸濁させ、−２０℃にて、少なくとも１時間保存した。ついで細胞懸濁液を、ハイブリッド混合液に添加し、一晩放置して、適切な温度にて、各プローブにハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成した混合物を、２μｍ Ｉｓｏｐｏｒｅ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）を用いて吸引濾過した。濾液を除去し、ＳＬｏｗＦａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｅｕｇａｎ，ＯＲ，ＵＳＡ）と共にガラススライド上に置き、蛍光顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ，Ｅ４００）下で検査した。ＤＡＰＩ染色細胞をＵＶ光下で検査し、ハイブリッド細胞を、ＤＭ５１０フィルターを用いて視覚化した。各スライドに対して、少なくとも１５の異なる視野で計数した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
結果
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
結論
表３より、本発明のＧＯＳ混合液が、より良好なプレバイオティック特性（すなわち、ビフィズス菌のより大きな増加、ならびに市販のＧＯＳ等価物と比較した場合の、細菌の減少（表２を参照のこと））を示すことがわかる。該プレバイオティック効果は、管１（Ｖ１）および２（Ｖ２）にてより強く、これは本発明のＧＯＳが、低分子量のオリゴサッカライドからなることを説明している。
【実施例４】
【００４７】
メチル化解析
実施例１に従って調製したガラクトオリゴサッカライド合成生成物を、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ2（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム上でのゲル濾過によって精製し、水３ｍｌ／分で溶出した。
【００４８】
それぞれのガラクト−オリゴサッカライド調製物に関する結合位置を、メチル化解析によって判定した。凍結乾燥した試料（５〜６ｍｇ）を、アルゴンでフラッシュした後、１６時間、２０℃にて、乾燥ジメチル−スルホキシド（ＤＭＳＯ）中で分散させた。これらを、粉末化水酸化ナトリウム（０．５ｇ）およびヨードメタン（４ｍｌ）の連続添加によってメチル化した（Ｃｉｕｃａｎｕ ａｎｄ Ｋｅｒｅｋ，１９８４；ＭａｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９３）。Ｃ１８−結合カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）上での溶出−抽出後、メチル化糖質類を乾燥させ、ＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（１：１ ｖ／ｖ）内に溶出し、乾燥するまで蒸発させた。試料を、トリフルオロ酢酸を用いて加水分解し（Ｂｌａｋｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ，１９８３）、ＮａＢＤ4還元と、酢酸無水物およびＮ−メチルイミダゾールでのアセチル化によって部分的にメチル化されたアルジトール酢酸塩（ＰＭＡＡｓ）へ変換した（Ａｌｂｅｒｓｃｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ，１９６７）。
【００４９】
ＰＭＡＡｓを、発炎イオン化検出器、および温度プログラム：５５℃（２分間）＋４５℃／分（１．９分間）、１４０℃（２分間）、＋２℃／分（３５分間）、２１０℃（４０分間）を用いて、５０％シアノプロピルメチル−５０％フェニルメチルポリシロキサン架橋カラム（Ｔｈａｍｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ, Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ，ＵＫ）上のＧＣによって解析した。ＰＭＡＡｓは、ミオ−イノシトールヘキサ酢酸と比較した、その保持時間を測定し、外部の標準のものと、前記相対保持時間を比較することによって同定した。各糖の標準の混合物を、メチルグリコシドを慎重にメチル化することによって調製した（Ｄｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９１）。ピーク面積は、有効炭素反応因子を用いて相対モル量として表した（Ｓｗｅｅｔ ｅｔ ａｌ，１９７５）。
【００５０】
ＰＭＡＡｓは、その電子−イオン化分子スペクトル（Ｃａｒｐｉｔａ ａｎｄ Ｓｈｉａ，１９８９）によって同定確認した。ＧＣ−ＭＳ解析は、２００℃の供給温度、および７０ｅＶのイオン化電位を用いて、Ｆｉｓｏｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｒｉｏ ＩＳスペクトロメーターに続いて、同一ＧＣにて実施した。
【００５１】
合成生成物のアノマー構造を判定するために、オリゴサッカライドを、３０分間、提案された最適条件にて、α−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ（Ｍｅｌｉｂｉａｓｅ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理した。反応生成物をＨＰＬＣによって解析した。
【００５２】
結果
以上の解析より、オリゴサッカライド構造が、テトラサッカライド分画ではＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、トリサッカライド分画ではＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、そしてジサッカライド区画ではＧａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ（ラクトース基質）、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ（ガラビオース）であると推定された。
ここでＧａｌはガラクトース、Ｇｌｃはグルコースである。
【００５３】
参考文献
１．Albersheim P.D.,D.J.Nevins,P.D.English, and A.Karr.1967、「ガス−液体クロマトグラフィーによる、植物細胞壁ポリサッカライド上の糖類の解析方法（A method for the analysis of sugars on plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.）Carbohydr Res 5:340-345。
２．Blakeney A.B.,P.J.Harris,R.J.Henry and B.A.Stone.1983。「モノサッカライド解析のための、アルジトール酢酸塩の単純かつ迅速な調製（A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis.)」Carbohydr Res 113:291-299。
３．Carpita N.C.,and E.M.Shia.1989。「部分的にメチル化されたアルジトール酢酸塩に関する、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）による、糖質類の結合構造（Linkage structure of carbohydrates by gas chromatography-mass spectroscopy(CD-MS) for partially methylated alditol acetates.)」p。157-216。C.J.Bierman and G.D.McGinnis(ed.)，「ガス−液体クロマトグラフィーおよび質量分析による、糖質類の解析（Analysis of carbohydrates by gas-liquid chromatography and mass spectroscopy.）」CRC Press Poca Raton,Fla。
４．Ciucanu I.,andF.Kerek.1984。「糖質類のペルメチル化のための単純かつ迅速な方法（A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.) 」Carbohydr Res 131:209-217。
５．Doares S.H.,P.Albersheim,and A.G.Darvill.1991。「複合糖質類のグルコシル結合解析のための、標準品の調製のための改善方法（An improved method for the preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrates.）」Carbohydr Res 210:311-317。
６．MacCormick C.A.,J.E.Harris,A.P.Cunning,and V.J.Morris.1993。「アセトバクター キシリヌム株の変異体によって生成されたポリサッカライドアセタンの変異体の特性化(Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutan of Acetobacter xylinumstrain)」CR 1/4.J Appl Bacteriol 74:196-199。
７．Sweet D.P.,R.Shapiro,and P.Albersheim.1975。「部分的にメチル化され、部分的にエチル化されたアルジトール酢酸塩に対する種々のＧＬＣ応答−因子説による、定量的解析（Quantitative analysis by various GLC response-factor theories for partially methylated and partially ethylated alditol acetates.）」Carbohydr Res 40:217-225。
【実施例５】
【００５４】
材料と方法
ＨＴ２９細胞株は、European Collection of Cell Culutures for Applied Microbiology and Researchより入手した。細胞ストックを、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｍＭペニシリン、０．１Ｍ ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ×１００）および２００ｍＭ ａ−グルタミンを含有する高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、湿潤５％ＣＯ2中で３７℃にて培養した。細胞は、４８時間ごとに栄養分を与え、コンフレントになる前に継代した。
【００５５】
オリゴサッカライド感受性のアッセイ
異なる濃度のオリゴサッカライド（０．０１、０．１、１、１０、１００ｍＭ）を含む血清標準培地（１％ ｖ／ｖ）を、Ｏｌａｎｏ−Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１００３によるオリゴサッカライド感受性のアッセイに使用した。細胞には実験培地（目的のオリゴサッカライドを含む）を与え、該培地を毎日変え、付着細胞の測定を、実験培地を除去し、細胞をＣａ＋＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７、９．６ｇ／Ｌ）で洗浄することによって実施した。ついで付着細胞をトリプシン処理し、等容量の血清標準培地で中和した。細胞懸濁液を、Ｉｓｏｔｏｎ ＩＩ中に希釈し、細胞は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ中で計数した。細胞生存パーセンテージを、以下のように計算した。（図１）
％生存＝（処理細胞の平均吸収／対照の平均吸収）×１００
【００５６】
付着アッセイ
ＨＴ２９細胞は、標準培地を用いて、＞９０％コンフレントまで、１２−ウェル組織培養プレート中で培養した。アッセイを実施する前、最終の細胞栄養補給のために、抗生物質を含まない培地を使用した。
【００５７】
病原体は、少なくとも３つの継代培養のために、抗生物質を含まない細胞培養培地中で、嫌気的に増殖させた。アッセイの日に、新たに前還元した組織培養培地に、一晩置いた１０％の病原体培養液を接種し、アッセイの前に４時間インキュベートした。
【００５８】
試験用オリゴサッカライドのストック溶液を、リン酸緩衝食塩水中５Ｍの濃度で調製し、濾過滅菌した。
【００５９】
４時間の病原体培養の１／１０００希釈液を、ＰＢＳ中で調製して、プレートカウントによって数えた。培地を、組織培養プレートから吸引し、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中で１回洗浄した。
【００６０】
各試験用オリゴサッカライドとして、０．５ｍｌのオリゴサッカライド（５Ｍ）溶液を３つのウェルに加えた。オリゴサッカライドを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、対照として含めた。培養懸濁液０．５ｍｌを全てのウェルに加え、プレートをロック混合し、３７℃にて２時間、好気的にインキュベートした。
【００６１】
培養液を吸引して除き、すべてのウェルを、無菌ＰＢＳ（ウェルあたり１ｍｌ）中で３回洗浄した。最終洗浄の後、ＰＢＳを吸引して取り除き、７０μｌトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を各ウェルに加え、混合し、３７℃にて５分間放置した。
【００６２】
１ｍｌＰＢＳをウェルあたりに加え、ピペット混合して、全ての細胞が、ウェルの底から取り除かれたこと、および塊が壊れたことを確認した。
【００６３】
１ｍｌの細胞懸濁液を、ＭＲＤ（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）のユニーバサルボトル中にピペットし、適宜希釈した。希釈液を、ピレート計数アガー（ＰＣＡ）上に撒き、２４時間３７℃にてインキュベートした。
【００６４】
インキュベーションの後、コロニーを計数し、付着の阻害を、対照区（ＰＢＳ）に存在する細菌数に対する、試料中に存在する細菌数（ｃ．ｆ．ｕ ｍｌ-1）の比として計算した（図２）。
【００６５】
結論
図２で示した結果は、ジサッカライド分画の存在下での、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＥＣおよびＳ．トリフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｕｒｉｕｍ）の付着に対する強力な阻害を示唆しており、該阻害はまたＧＯＳ混合物においても存在する。トリサッカライドより高次のサッカライド（＞ｔｒｉ）分画が混合物に含まれると、Ｓ．トリフィムリウムに対する抗付着作用がより低いことが認められる。
【００６６】
該オリゴサッカライド感受性アッセイは、オリゴサッカライド混合物が、ＨＴ２９細胞に対して毒性を示さないことを確認するために実施される（図１）。
【００６７】
参考文献
Olano-Martin E.,Williams M.R.,Gibson G.R.,Rastall R.A.2003。「ペクチンおよびペクチン−オリゴサッカライドは、ヒト大腸細胞株ＨＴ２９に対して指向するように、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７シガ毒素を阻害する。(Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29.)」FEMS Microbiol Letters 218(1):101-105。
【００６８】
図１は、添加されるオリゴサッカライド濃度を変えることの、２４時間後及び４８時間後の細胞の生存率への影響を示す。
図２は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＥＰＥＣ 、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＶＴＥＣおよびサルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のＨＴ２９細胞への付着に対する、オリゴサッカライド混合物（ＡＬＬ）と、該混合物中の他の分画が与える影響を示す。
【実施例６】
【００６９】
本実験で使用したＧＯＳ生成物は、先述（実施例１）と同様に製造し、イヌリンは、オラフティ（Ｏｒａｆｔｉ）（Ｂｅｌｇｉｕｍ）より入手した。
【００７０】
４０匹の離乳したオスブタすべては、ＪＳＲジェネンティクス社（ＪＳＲ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ），Ｓｏｕｔｈｂｕｒｎ，Ｄｒｉｆｆｉｅｌｄ，Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、ＹＯ２５ ９ＥＤから購入した。
【００７１】
リーディング大学（Ｒｅａｄｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に到着した時に、ブタは、７日間の間、１０匹、４群で飼い、輸送の後、落ち着かせ、ユニットおよび餌に慣れさせた。輸送時のブタの平均体重は１４．７０ｋｇであった。
【００７２】
７日間の順応期間に続き、ブタを、同一のユニット内の、個々の囲いに移した。個々の囲いにおけるブタの平均体重は、１７．４６ｇであった。
【００７３】
ブタを、個々の耳入れ墨で同定し、これらはまた、防水ストックマーカーを用いて個々に番号付けした。それぞれの個々の囲いは、それぞれのブタを記録するのに使用したのと同一の同定番号で番号付けした。
【００７４】
１０匹のブタを、４つの餌、すなわち、対照区餌（ＮＥＧ）、実施例１に従い調製した１．６％（ｗ／ｗ）ＧＯＳを対照区餌に添加した餌、４％（ｗ／ｗ）ＧＯＳを対照区餌に添加した餌、及び、１．６％（ｗ／ｗ）イヌリンを対照区餌に添加した餌、の内の１つに割り当てた。
【００７５】
ブタは、本研究の間、おが屑の上に寝かせた。さらに、退屈を紛らわすためのおもちゃとして、また環境を向上させるものとして、藁を提供した。
【００７６】
本研究の間、ブタには、自由な給餌のために、Ｄｅｌｔａｗｅａｎ １５ ＮＧＰペレット（ＡＢＮ，ＡＢＮ Ｈｏｕｓｅ，ＰＯ Ｂｏｘ２５０，Ｏｕｎｄｌｅ Ｒｄ，Ｗｏｏｄｓｔｏｎ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ．ＰＥ ９ＱＦ）、完全給餌用飼料を与えた。
Ｄｅｌｔａｗｅａｎ １５ ＮＧＰの栄養／ミネラル組成は下記の通り。
【００７７】
ブタ餌にはまた、許容されている抗酸化剤、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびエソキシクインが含まれた。
【００７８】
同一の給餌投与における２匹または３匹のブタは、同一群の囲い内で個々に育成したが、給餌に際しては、ブタを無作為に割り付けた。ブタが、個々の囲いから逃げることによる混乱を避けるために、本法ではブタをグループ分けし、それにより、特定のブタが正しく給餌投与用の食物だけを摂取することが出来るようにしている。同一の給餌投与に際して、２匹または３匹のグループの、個々の飼育ブタを、ユニットにわたって、無作為に割り付けた。
【００７９】
糞試料を、試験餌の給餌開始時、および給餌の４週間後に、各ブタより回収し、糞における微生物群を、先に記述した（実施例３）ように、ＦＩＳＨ（表４）を用いて判定した。実験終了時には、ブタを屠殺して、近位および遠位大腸内の内容物を試料として得た。ｐＨ値（表５）、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）（表６）および微生物集団（表７）を、近位および遠位腸内容試料中で判定した。データは、平均値からの標準偏差を示している。差は、スチューデントｔ−検定によって解析した。差は、Ｐ＜０．０５で有意であると考えられた。
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】
【００８４】
結論
表５：ＧＯＳの存在下で、遠位大腸にてｐＨの減少があり（１．６％に対して、また特に４％に対して）、これは、ＳＣＦＡデータ（表６）と組み合わせて、ＧＯＳ生成物が、近位大腸に到達したことを示唆している（発酵生成物が増加している）。
【００８５】
表７：ＧＯＳ（４％）の存在により、近位大腸にて、有益な細菌（ビフィズス菌、乳酸菌）の集団数が著しく増加したことが示されている。集団数のこの増加は、遠位部分、および糞試料では小さく、ＧＯＳ生成物が、主に近位大腸で発酵されるようであるとの事実によって説明可能である。１．６％のＧＯＳの投与でも同様の傾向が示された。
【００８６】
近位大腸において、ビフィズス菌集団数の増加が見られ、また、酢酸（ビフィズス菌の主な発酵生成物）の生成の増加がみられた。このことは、ＧＯＳ生成物が、ビフィズス菌種に対して、非常に選択的であることを示唆している。
【実施例７】
【００８７】
ケーススタディー
ケーススタディー１−炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
潰瘍性大腸炎（ＩＢＤの２つの主要な形態のうちの１つ）と診断された４３歳の女性の患者を、実施例１に従って調製したＧＯＳ生成物の効果のケーススタディーとして引用する。
【００８８】
この患者は、５年に及び潰瘍性大腸炎を患っており、試験期間前、および期間中の投薬はなかった。抗炎症性薬剤スルファサラジンが以前に使用されていたが、ポジティブな効果はなかった。この患者は、標準食では、食物を消化することが困難であり、吐き気、下痢および腹痛に苦しんでいた。後者は左側大腸であり、下降結腸の炎症に基づく大腸炎との診断と相関した。
【００８９】
（２回の分割用量での）１日に７ｇ／ｄの総用量でのをＧＯＳを摂取させた。摂取から４日以内に、症状が改善し始めた。患者は、食事をより消化することが可能になり、腸の痛みが軽減し始め、吐き気も軽減した。内視鏡による臨床解析はなされなかったが、体調が良くなっているという患者の感触には顕著な改善が認められた。食事になされた変更は、ＧＯＳの添加のみであった。６週間後においてもこの効果は持続していた。
【００９０】
プラセボ対照区は存在しないが、多数の患者における研究において、このケーススタディーが、ＩＢＤの１つの主要な形態での、プレバイオティックＧＯＳのポジティブな効果に関する事例となる証拠を示している。
【００９１】
ケーススタディー２−過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
３年間ＩＢＳを患っている２７歳の男性に、２回の分割用量で、実施例１に従って調製した７ｇ／ｄ ＧＯＳを摂取させた。この投与期間より以前では、この男性は膨満感、便秘、腸痛および疲労感を経験していた。これらは、ＩＢＳに関連する旧来の症状である。この患者は、６ヶ月間、抗生物質を摂取せず、小麦／グルテンおよび糖を含まない食事を摂取した。
【００９２】
プレバイオティック摂取の後、これら症状において明瞭な効果が３日以内に見られ、その後持続された。この被験者は、「マラソンを走る準備が出来ている」という言葉をもって、全般的な健康や腸の健康における劇的な改善を報告した。彼は、無理なく通常の食事を摂取することが可能になっている。
【００９３】
この報告は、対照試験ではないが、ＧＯＳが、ＩＢＳ状態を改善し、よりよい生活の質（クオリティー オブ ライフ）を回復させうることを示す、事例証拠としてはたらく。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラクトースを新規のガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換可能な、新規のガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせるビフィドバクテリウム ビフィダムの新規株に関する。ガラクトサッカライドは、消化不可能な糖質であり、哺乳動物の胃腸消化酵素に耐性を示すが、特定の大腸菌によって発酵される。本発明はまた、腸内のビフィズス菌の増殖を促進することが可能であり、新規のガラクトオリゴサッカライド組成物を生成するための、ビフィズス菌株の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト腸管内菌叢には、病原性、良性そして有益な属がある。前者が優占種である場合、急性（たとえば胃腸炎）および慢性（たとえば炎症性腸疾患、過敏性腸症候群および腸がん）の両方であり得る腸疾患が発症しうる。１つまたはそれ以上のそれら微生物株を、適切な食物担体に加えることによって、ビフィズス菌等の有益な微生物が優占種となるような腸管内菌叢のバランスをもたらすための試みが為されてきた。そのような生微生物食物サプリメントが体によいことは公知である。しかしながら、食物中、また消化後に、生細菌の生存を保証することは難しい。
【０００３】
腸管内菌叢の食事操作に対する他のアプローチは、プレバイオティック（ｐｒｅｂｉｏｔｉｃ）を使用することであり、大腸内の１つまたは限定された数の細菌の増殖および／または活性を選択的に刺激することによる結果として宿主の健康を改善させることによって、宿主に有益な影響を与える、消化不可能な食物成分として定義される。
【０００４】
ヒト大腸管内菌叢は、誕生時点で獲得される。母乳を与えられた胎児では、他の属と容易に競合するビフィズス菌が優占的である。これは、ヒトのミルク成分が促進的であるからである。一方、調乳を与えられた胎児は、バクテロイド、クロストリディア、ビフィズス菌、乳酸菌、グラム陽性球菌、大腸菌および他の群すべてが、全く等しい特性を有する成人の腸と似た、より複雑な腸管内菌叢を持つ。ビフィズス菌は一般的に、大腸感染に対して防御的であると考えられており、おそらくこの差によって、調乳ミルクを与えられた胎児と比較して、母乳を与えられた胎児における感染の頻度が非常に低いことが説明される。
【０００５】
腸管内菌叢の特定の構成要素が、腸疾患の原因に関与してきた。たとえば、マイコバクテリアは、クローン病に関連し、潰瘍性大腸炎は、硫酸減少性細菌によって引き起こされ、腸がんの発達に細菌が関与しうる。有用な常在の腸内細菌の選択的増殖が、プレバイオティックの摂取によって促進される場合には、明らかに有益である。これは、病原性細菌叢が抑制されうるという継続的効果をもたらす。
【０００６】
プレバイオティックとして分類される化合物の群の１つは、ガラクトオリゴサッカライドであり、これは、Ｇｌｃα１−４［β Ｇａｌ１−６］ｎの形態でのガラクトース含有オリゴサッカライドであり、式中ｎ＝２〜５であり、酵素β−ガラクトシダーゼのトランスガラクトシラーゼ活性を用いて、ラクトースシロップから生成される（Crittenden,(1999)、Probiotics（体によい働きをするバクテリア）：論評(Probiotics:A Critial Review.)、Tannock,G(ed)Horizon Scientific Press,Wymondham,pp.141-156。）３つの製品が、僅かに異なる組成を有して現在市販されている。これらのうちの1つ目は、トランスガラクトシル化オリゴサッカライド（ＴＯＳ）であり、アスペルギルス オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ）よりβ−ガラクトシダーゼを用いて生成され(Tanaka et al.,(1983)Bifidobacteria Microflowa,2,17-24)、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサ−ガラクト−オリゴサッカライドからなる。2つ目は、オリゴメート５５（Ｏｌｉｇｏｍａｔｅ ５５）であり、Ａ．オリザエ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）およびストレプトコッカス サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）より、β−ガラクトシダーゼを用いて調製され（Ito et al.,(1999)、Microbial Ecology in Health and Disease,3,285-292）、３６％のトリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサ−のガラクト−オリゴサッカライド類、１６％のジサッカライド類、ガラクトシルグルコースおよびガラクトシルガラクトース、３８％のモノサッカライド類および１０％のラクトースを含む。最後のものは、トランスガラクトシル化ジサッカライド（ＴＤ）の調製物が、Ｓ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）より、β−ガラクトシダーゼを用いて生成される（Ito et al., (1993), J. Nutritional Science and Vitaminology, 39,279-288）。
【０００７】
ビフィズス菌の一員が、ラクトースの細菌代謝に関与する、β−ガラクトシダーゼ酵素を生成することが知られている。Moller, P.L. et al. Appl. & Environ. Microbiol., (2001),62,(5)、2276-2283では、ビフィドバクテリウム ビフィダムの株からの、３つのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の単離および特徴化について記述されている。
米国特許第２００２／００８６３５８号は、ビフィドバクテリウム ビフィダムからの新規のβ−ガラクトシダーゼ、とりわけ、高いトランスガラクトシル化活性を持つ酵素の短化バージョンを記述している。該β−ガラクトシダーゼはラクトースと０．５〜６０％の該ラクトースの存在下で一緒にインキュベーションを実施することが可能であることが言及されている一方で、トランスガラクトシル化反応で生成された、ガラクトオリゴサッカライドの例示的な最大収率は、４４％（添加ラクトース１ｍｇあたりの生成されたオリゴサッカライドのｍｇ）であった。さらに、本米国特許明細書中でのオリゴサッカライドの定義より、生成物が、少なくとも３つの連結糖分子からなることが明白である。
【０００８】
Carbohydrate Research, 201,(1990),115-123中で、Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ．は、ビフィドバクテリウム ビフィダムＤＳＭ２０４５６でのラクトース加水分解中の、トランスガラクトシダーゼ化反応による、オリゴサッカライドの形成を記述している。生成されたオリゴサッカライド類の混合物の構造についてのこれらの解析によって、結合が、β−（１→３）、β−（１→６）およびβ−（１→４）−Ｄ−ガラクトシルの順であったことが示された。Ｄｕｍｏｒｔｉｅｒは、ビフィドバクテリウム ビフィダムによって生成された化合物が、大腸内の細菌の付着に関与していることを示唆している。
【０００９】
ビフィズス菌の株は現在、ガラクトオリゴサッカライドの混合物へラクトースを変換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なだけではなく、また、３５％までのジサッカライドガラビオース（Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ）を含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物を生成することが発見されている。後者は、毒素、たとえばシガ毒素、および大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）のような病原体の、腸壁への付着を防止することが可能な抗付着物であることが知られている（Paton, J.C.&Paton,A.W. (1989), Clin.Microbiol.Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350を参照のこと）。
【特許文献１】米国特許第２００２／００８６３５８号
【非特許文献１】Crittenden,(1999)、Probiotics: A Critial Review.、Tannock,G(ed)Horizon Scientific Press,Wymondham,pp.141-156
【非特許文献２】Tanaka et al.,(1983)Bifidobacteria Microflowa,2,17-24
【非特許文献３】Ito et al.,(1999)、Microbial Ecology in Health and Disease,3,285-292
【非特許文献４】Ito et al., (1993), J. Nutritional Science and Vitaminology, 39,279-288
【非特許文献５】Moller, P.L. et al. Appl. & Environ. Microbiol., (2001),62,(5)、2276-2283
【非特許文献６】Carbohydrate Research, 201,(1990),115-123
【非特許文献７】Paton, J.C.&Paton,A.W. (1989), Clin.Microbiol.Revs., 11, 450-479; Carlsson, K.A. (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ラクトースを新規のガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換可能な、新規のガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせるビフィドバクテリウム ビフィダムの新規株、及び該ビフィズス菌株の使用に関する開示を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ラクトースを、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライド、および少なくとも１つのペンタサッカライドを含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株を提供する。好ましくは、この混合物は、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含有する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の開示するビフィドバクテリウム ビフィダムの新規株が生じる新規ガラクトシダーゼの酵素活性によりラクトースを新規のガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は、ラクトースを、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライド、および少なくとも１つのペンタサッカライドを含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株を提供する。好ましくは、この混合物は、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含有する。
【００１４】
本発明のガラクトシダーゼ酵素活性に関連して使用される語句「酵素活性（ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」は、少なくとも１つのガラクトシダーゼ酵素からもたらされる活性である。
【００１５】
本発明のある態様において、ガラクトオリゴサッカライド混合物は、ジサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ、トリサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、テトラサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、ペンタサッカライド、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃを含み、ここでＧａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す。
【００１６】
メチル化解析および酵素加水分解を用いて、ガラクトオリゴサッカライド混合物が、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃのテトラサッカライド、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、およびＧａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−4）Ｇ1ｃのトリサッカライド、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−3）−Ｇａｌ、Ｇａ1（β１−６）−Ｇａｌ、および（α１−６）−Ｇａｌのジサッカライドを有することが判明した。
【００１７】
ラクトースを、以上で定義したガラクトオリゴサッカライド類の混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株は、２００３年３月３１日に、Ｎａｔｉｏａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫにて、ＮＣＩＭＢ４１１７１の受託番号にて預託された。
【００１８】
前記預託されたビフィドバクテリウム ビフィダム株またはその生物学的機能等価物は、以上で定義したようなガラクトオリゴサッカライド混合物を生成するために使用可能である。ガラクトオリゴサッカライドの混合物は、腸中のビフィズス菌、とりわけ起源生成株（ｏｒｉｇｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｒ ｓｔｒａｉｎ）の増殖を促進することによって、腸の健康を改善するための製品の一部分を形成しうる。そのような製品は、日用品（たとえば、液体ミルク、全ミルク粉末、スキムミルク粉末、脂肪添加乳粉末、乳清粉末等の乾燥ミルク粉末、乳児ミルク、アイスクリーム、ヨーグルト、チーズ、発酵日常製品）、飲料、幼児食、シリアル、ビスケット、菓子、ケーキ、食物サプリメント、栄養補助食品、動物の餌、家禽の餌または他の食物または飲料からなる群より選択しうる。
【００１９】
オリゴサッカライドの混合物はまた、病原体または病原体によって生成される毒素の腸壁への付着を防止するための医薬品の調製のために使用しうる。この混合物を、しばしば正常の健康な腸管内菌叢を変化させ破壊までする抗生物質投与の後に、または腸における手術の後に、健康な腸の正常な腸管内菌叢を腸内で再構築する目的で、患者に投与しうる。ガラクトオリゴサッカライドの混合物は、以上で言及したビフィドバクテリウム ビフィダムの株または生物学的機能等価物との組み合わせで使用しうる。
【００２０】
語句「生物学的機能等価物（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）」は、ラクトースを、以上で定義したようなガラクトオリゴサッカライドの混合物に変換するガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能なビフィドバクテリウム ビフィダムの株を意味する。
【００２１】
本発明の他の態様では、有効成分として、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライドおよび少なくとも１つのペンタサッカライドを含む、ビフィズス菌の増殖を促進するための、ガラクトオリゴサッカライド組成物が提供される。
【００２２】
ガラクトオリゴサッカライド組成物は、好ましくは、本明細書にて上述したような、ガラクトオリゴサッカライド混合物を含む。
【００２３】
好ましくは、ガラクトオリゴサッカライド組成物は、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む。
【００２４】
本発明のまた他の態様では、ラクトースまたはラクトース含有物質を、以上で定義したようなビフィドバクテリウム ビフィダムの株で処理することを特徴とする、ビフィズス菌の増殖を促進するための基質を製造するための方法が提供される。
【００２５】
好適なラクトース含有物質は、市販されているラクトース、全ミルク、セミスキムミルク、スキムミルク、乳清および脂肪添加乳（ｆａｔ−ｆｉｌｌｅｄ ｍｉｌｋ）から選択されうる。そのようなミルク製品は、ウシ、バッファロー、ヒツジまたはヤギから得うる。脂肪添加乳は、酪農脂肪を除去した後、植物脂肪または油の添加によって置換されるスキムされた全ミルクとして定義される。
【００２６】
ラクトース以外の糖質基質を含む増殖培地を用いた場合に、本発明によるビフィドバクテリウム ビフィダムが、マルトース、ラフィノース、キシランおよびフルクトースを利用可能であることが判明した。これらの糖質の１つを含む培地中での細菌の培養によって、α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、およびβ−フルクトフラノシダーゼの発現がそれぞれ誘導され、その結果として、α−グルコオリゴサッカライド、α−ガラクトオリゴサッカライド、キシロオリゴサッカライドおよびフルクトオリゴサッカライドがそれぞれ生成される。
【００２７】
本発明に至る研究において、腸由来の細菌を、ガラクトシダーゼ生成が可能なもの、つまり、ガラクトオリゴサッカライド（類）を生成する可能性が最も高いものに関して選別を行った。結果として、属ビフィドバクテリウムに属する特定の細菌、とりわけビフィドバクテリウム ビフィダムが、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じさせることが可能であるのみならず、該酵素が、ラクトースを、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む、ガラクトオリゴサッカライド混合物へ変換可能であることが発見された。ビフィドバクテリウム ビフィダムの特定の例が、２００３年３月３１日に、ＮＣＩＭＢ，Ａｂｅｒｄｅｅｎにて、受託番号４１１７１にて預託された。
【００２８】
これらの細菌を培養するために、細菌によって吸収されうる条件を備えたいずれかの栄養供給源を使用することが可能である。適切な培養培地を、例えば、ラクトース、スクロースまたはグルコースのような糖質類；酵母抽出物、トリプトン、肉抽出物（Ｌａｂ Ｌｅｍｃｏ）などのような、窒素を含有する無機的または有機的な栄養供給源；リン酸カリウムのような、無機的栄養供給源；等とともに処方可能である。培養のために、影響培地のｐＨは、６．０〜８．０の範囲、好ましくは７．０であるべきであり、培養は、３５〜４０℃の温度範囲、好ましくは３７℃で、４０〜６４時間、好ましくは５０時間、嫌気的条件で実施する。
【００２９】
前記株は、安定相培養、嫌気的限界培養または振とう培養のような、いずれか公知の培養方法によって培養可能である。細菌細胞を、遠心分離または濾過によって回収することで、さらなる処理を行わずに、反応触媒様のものとして使用可能である。あるいは、細胞は、適切な固定手順によって、固定化状態で使用しうる。
【００３０】
本発明のビフィドバクテリウム ビフィダムは、ラクトース自体、またはミルク製品中に含まれるラクトースを、本発明の新規ガラクトオリゴサッカライド組成物に変換するために使用可能である。変換の後、細菌細胞は遠心分離にて除去可能である。存在するモノサッカライドのいずれかは、たとえば、酵母サッカロマイセス セルビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｖｉｓｉａｅ）とともにインキュベートして、除去しうる。ついで、混合物を遠心分離および精密濾過に続けてかけうる。得られたＧＯＳ溶液を、続いて噴霧乾燥させ、粉末を得ることも可能である。
【００３１】
この方法によって生成された、本発明のガラクトオリゴサッカライド組成物を含有するミルクは、子供、成人または動物に直接処方することができる。あるいは、ガラクトオリゴサッカライドは酸性条件下および高温条件下で安定であり分解せずに使用可能であるので、パン、菓子のような製品を製造するのにも使用しうる。あるいは、ＧＯＳ粉末を、以上で列記したような製品に加えうる。
【００３２】
ＧＯＳ粉末は、炎症性腸疾患および過敏性腸症候群のような腸疾病を患っている患者に投与可能であり、この場合、２つに分割した用量で、２〜２０ｇ、好ましくは５〜１０ｇ、もっとも好ましくは７ｇの一日用量を摂取しうる。
【００３３】
あるいは、本発明のガラクトオリゴサッカライド組成物を、本発明による、ビフィドバクテリウム ビフィダムの培養液と混合して、腸の健康を改善するための混合物を生成してもよい。そのような混合物は「ＧＩ管中の生細菌食物サプリメントの生存および着床を改善することによって、宿主に有益な影響を与えるプロバイオテックとプレバイオテックの混合」として定義されるシンバイオティック（ｓｙｎｂｉｏｔｉｃ）に分類される（Gibson and Roberfroid, 1995，（ヒト微生物の食物改変：プレバイオティックの概念紹介（Dietary modification of he human microbiota: introducing the concept of prebiotics.）Journal of Nutrition 125, 1401-1412を参照のこと）。このような組み合わせにより、利用可能な選択的基質を提供され、それにより、大腸に都合の悪い環境におけるプロバイオティックの生存が増進される。細菌性プロバイオティックは、ガラクトオリゴサッカライドプレバイオティック中にマイクロ小カプセル化して、たとえば、粉末を生成してよく、ついでこれを、ヨーグルトのような食物製品に加えるか、または栄養補助食品として使用しうる。
【００３４】
本発明のガラクトオリゴサッカライド組成物を含むミルクまたは他の製品を摂取する利点は、クロストリディアのような、腸マイコフローラ中に存在する他のあまり望ましくない細菌の犠牲において、腸中に有益なビフィズス菌のレベルの増加を促進することである。これにより、個々の健康に有害な効果を与えうる、特定の常在細菌の減少がおこる。ついでこれは、胃腸管感染を減少させる。腸炎の予防または治療を補助し、下痢症状を短期化させ、潰瘍性大腸炎および癌のような慢性腸疾患のリスクを減少させる。また、過敏性腸症候群の症状の軽減を補助し得る。
【００３５】
本発明のオリゴサッカライド組成物を、たとえば粉末形態で、含有する餌を与えられる農場動物は、その餌における転換重量の改善を示しうる。
【００３６】
本発明はさらに、以下の実施例に対する参照の方法で記述され得る。
【実施例１】
【００３７】
１０．０ｇ／ｌトリプトン、５．０ｇ／ｌ Ｌａｂ−ＬＥＭＣＯ（肉抽出物）、５．０ｇ／ｌ酵母抽出物、３．０ｇ／ｌ ＫＨＰＯ、０．０５ｇ／ｌシステインＨＣｌ、１０ｇ／ｌラクトースおよび１ｍｌ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０を含有する１ｌの培地（ｐＨ７．０）を、１２１℃にて１５分間滅菌した。滅菌の後、この培地に、１．０％（ｖ／ｖ）の新鮮なビフィドバクテリウム ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１培養液を接種させ、嫌気条件下３７℃にて５０時間、インキュベートした。細菌細胞を、遠心分離（３００００ｇ、２０分間）によって回収した。リン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．０）で２回洗浄して、細胞をオリゴサッカライド合成反応に使用する準備が出来た。
【００３８】
細菌細胞（β−ガラクトシダーゼ活性の４０ユニット）を、５０ｇのラクトースを含むリン酸緩衝液（０．０２Ｍ、ｐＨ７．０）１００ｍｌ中に再懸濁させた。反応を、４０℃にて進行させ、７時間後、混合液は、３５％（ｗ／ｖ）加水分解生成物（グルコース、ガラクトース）、３７％（ｗ／ｖ）ラクトース、および２〜５のポリマー化の程度で、１８％（ｗ／ｖ）ガラクトオリゴサッカライドの混合物を得た。遠心分離（３０００ｇ、２０分間）による細菌細胞の除去後、モノサッカライド（グルコースおよびガラクトース）を、酵母サッカロマイセス セルビシエとのインキュベーションによって除去した。この酵母を続いて、遠心分離（１００００ｇ、１０分間）によって除去し、ついで混合物を、０．１μ精密濾過フィルターを介して濾過し、生成物の微小生物学的な性質を確保した。ついで糖溶液を噴霧乾燥させて、粉末形態を得た。生成物を、ＡＰＥＸ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅカラム（Ｊｏｎｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｄ Ｇｌａｍｏｒｇａｎ，ＵＫ）およびＭｅｒｃｋ−Ｈｉｔａｃｈｉ ＬａＣｈｒｏｍ製ＲＩ検出器を備える、メルク−日立 ラクロームシステム（Ｍｅｒｃｋ, Ｐｏｏｌｅ，Ｄｏｒｓｅｔ，ＵＫ）を用いて、高性能液体クロマトグラフィーによって、定量的に解析した。７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルを２５℃にて溶出液として、０．８ｍｌ／分の流速で使用した。ガラクトオリゴサッカライド混合物は、２５％のＧａｌ−Ｇａｌ、３５％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、２４％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、および１６％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃから成っていた。
【実施例２】
【００３９】
実施例１に従って調製したビフィドバクテリウム ビフィダムＮＣＩＭＢ４１１７１細胞を、撹拌タンク中の５００ｍｌのスキムミルクに加え、（β−ガラクトシダーゼ活性の３００ユニット）を加えた。ラクトース変換を、４０℃にて進行させた。８時間後のガラクトオリゴサッカライド濃度は、２２％（ｗ／ｖ）であり、この混合物は、２８％のＧａｌ−Ｇａｌ、３２％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、２１％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、および１９％のＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃから成っていた。
【実施例３】
【００４０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ腸モデル
大腸の状態を、実施例１に従って調製した１％（ｗ／ｖ）のＧＯＳ混合物なし、および該混合物ありで、増殖培地中、健康なヒトボランティアからの１０％（ｗ／ｖ）便ホモジネートを接種させた、３段階の連続発酵（Ｍａｃｆａｒｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙ，３５，１８０−１８７）中で復元した（表２）。モデルは、それぞれの動作容量が２７０、３００、および３００ｍｌである、３つの管、Ｖ１、Ｖ２およびＶ３からなる。温度を３７℃に設定し、ｐＨと共に自動的に制御した。３つの管中の培養ｐＨは、５．５、６．２および６．８にそれぞれ維持した。各発酵器を磁気撹拌し、Ｏ2を含まないＮ2での連続噴霧（１５ｍｌ／分）によって、嫌気条件を維持した。増殖培地は、以下の成分を含有する。デンプン８ｇ／ｌ、ムチン４ｇ／ｌ、カセイン３ｇ／ｌ、ペプトン水５ｇ／ｌ、トリプトン水５ｇ／ｌ、胆汁Ｎ°３ ０．４ｇ／ｌ、酵母４．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ4 ０．００５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ ４．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ ４．５ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4 ０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ １．２５ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2．６Ｈ2Ｏ ０．１５ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3 １．５ｇ／ｌ、Ｔｗｅｅｎ８０ １ｍｌ、Ｈｅｍｉｎ ０．０５ｇ／ｌ、システイン．ＨＣｌ ０．８ｇ／ｌ。培地を、蠕動ポンプによってＶ１に加え、Ｖ１は連続して、連続チューブを介してＶ２およびＶ３に供給される。本システムを約３６時間の保持時間で操作した。腸モデルを一晩、培養ポンプを変える前に、平衡に維持し、試験基質を含む培地を導入する前、少なくとも１０日間稼動させ、ついでさらに１０日間維持した。試料を、開始時点および各サイクルの終わりで回収した。回収した試料容量は５ｍｌであり、この容量を、細菌群を列挙するために使用した。
【００４１】
蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）
細菌集団の差を、１６Ｓ ｒＲＮＡの診断領域を標的とするように設計したオリゴヌクレオチドプローブで、ＦＩＳＨにより査定を行った。これらは、市販品として合成され、蛍光色素Ｃｙ３（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ ＵＫ Ｌｔｄ．より供給される）でラベルした。使用した分子プローブを表１で示した。総細菌の計数には核酸染色４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を使用した。発酵管から得た試料を、４％（ｗ／ｖ）パラフィンアルデヒド中で希釈し、４℃にて一晩で定着させた。ついで細胞を１５００×ｇにて５分間遠心分離し、リン酸−緩衝食塩水（ＰＢＳ、０．１Ｍ、ｐＨ７．０）にて２回洗浄し、ＰＢＳ／９９％エタノール（１：１、ｗ／ｖ）の混合液中に再懸濁させ、−２０℃にて、少なくとも１時間保存した。ついで細胞懸濁液を、ハイブリッド混合液に添加し、一晩放置して、適切な温度にて、各プローブにハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成した混合物を、２μｍ Ｉｓｏｐｏｒｅ膜フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ），Ｈｅｒｔｓ，ＵＫ）を用いて吸引濾過した。濾液を除去し、ＳＬｏｗＦａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ, Ｅｕｇａｎ，ＯＲ，ＵＳＡ）と共にガラススライド上に置き、蛍光顕微鏡（Ｎｉｃｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ，Ｅ４００）下で検査した。ＤＡＰＩ染色細胞をＵＶ光下で検査し、ハイブリッド細胞を、ＤＭ５１０フィルターを用いて視覚化した。各スライドに対して、少なくとも１５の異なる視野で計数した。
【００４２】
【表１】
【００４３】
結果
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【００４６】
結論
表３より、本発明のＧＯＳ混合液が、より良好なプレバイオティック特性（すなわち、ビフィズス菌のより大きな増加、ならびに市販のＧＯＳ等価物と比較した場合の、細菌の減少（表２を参照のこと））を示すことがわかる。該プレバイオティック効果は、管１（Ｖ１）および２（Ｖ２）にてより強く、これは本発明のＧＯＳが、低分子量のオリゴサッカライドからなることを説明している。
【実施例４】
【００４７】
メチル化解析
実施例１に従って調製したガラクトオリゴサッカライド合成生成物を、Ｂｉｏｇｅｌ Ｐ2（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のカラム上でのゲル濾過によって精製し、水３ｍｌ／分で溶出した。
【００４８】
それぞれのガラクト−オリゴサッカライド調製物に関する結合位置を、メチル化解析によって判定した。凍結乾燥した試料（５〜６ｍｇ）を、アルゴンでフラッシュした後、１６時間、２０℃にて、乾燥ジメチル−スルホキシド（ＤＭＳＯ）中で分散させた。これらを、粉末化水酸化ナトリウム（０．５ｇ）およびヨードメタン（４ｍｌ）の連続添加によってメチル化した（Ｃｉｕｃａｎｕ ａｎｄ Ｋｅｒｅｋ，１９８４；ＭａｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ，１９９３）。Ｃ１８−結合カートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｋ、ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｗａｔｆｏｒｄ，ＵＫ）上での溶出−抽出後、メチル化糖質類を乾燥させ、ＣＨＣｌ3／ＣＨ3ＯＨ（１：１ ｖ／ｖ）内に溶出し、乾燥するまで蒸発させた。試料を、トリフルオロ酢酸を用いて加水分解し（Ｂｌａｋｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ，１９８３）、ＮａＢＤ4還元と、酢酸無水物およびＮ−メチルイミダゾールでのアセチル化によって部分的にメチル化されたアルジトール酢酸塩（ＰＭＡＡｓ）へ変換した（Ａｌｂｅｒｓｃｈｅｉｍ ｅｔ ａｌ，１９６７）。
【００４９】
ＰＭＡＡｓを、発炎イオン化検出器、および温度プログラム：５５℃（２分間）＋４５℃／分（１．９分間）、１４０℃（２分間）、＋２℃／分（３５分間）、２１０℃（４０分間）を用いて、５０％シアノプロピルメチル−５０％フェニルメチルポリシロキサン架橋カラム（Ｔｈａｍｅｓ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ, Ｍａｉｄｅｎｈｅａｄ，ＵＫ）上のＧＣによって解析した。ＰＭＡＡｓは、ミオ−イノシトールヘキサ酢酸と比較した、その保持時間を測定し、外部の標準のものと、前記相対保持時間を比較することによって同定した。各糖の標準の混合物を、メチルグリコシドを慎重にメチル化することによって調製した（Ｄｏａｒｅｓ ｅｔ ａｌ，１９９１）。ピーク面積は、有効炭素反応因子を用いて相対モル量として表した（Ｓｗｅｅｔ ｅｔ ａｌ，１９７５）。
【００５０】
ＰＭＡＡｓは、その電子−イオン化分子スペクトル（Ｃａｒｐｉｔａ ａｎｄ Ｓｈｉａ，１９８９）によって同定確認した。ＧＣ−ＭＳ解析は、２００℃の供給温度、および７０ｅＶのイオン化電位を用いて、Ｆｉｓｏｎｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｒｉｏ ＩＳスペクトロメーターに続いて、同一ＧＣにて実施した。
【００５１】
合成生成物のアノマー構造を判定するために、オリゴサッカライドを、３０分間、提案された最適条件にて、α−ガラクトシダーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ（Ｍｅｌｉｂｉａｓｅ、シグマ（Ｓｉｇｍａ））で処理した。反応生成物をＨＰＬＣによって解析した。
【００５２】
結果
以上の解析より、オリゴサッカライド構造が、テトラサッカライド分画ではＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、トリサッカライド分画ではＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、そしてジサッカライド区画ではＧａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ（ラクトース基質）、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ（ガラビオース）であると推定された。
ここでＧａｌはガラクトース、Ｇｌｃはグルコースである。
【００５３】
参考文献
１．Albersheim P.D.,D.J.Nevins,P.D.English, and A.Karr.1967、「ガス−液体クロマトグラフィーによる、植物細胞壁ポリサッカライド上の糖類の解析方法（A method for the analysis of sugars on plant cell-wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.）Carbohydr Res 5:340-345。
２．Blakeney A.B.,P.J.Harris,R.J.Henry and B.A.Stone.1983。「モノサッカライド解析のための、アルジトール酢酸塩の単純かつ迅速な調製（A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis.)」Carbohydr Res 113:291-299。
３．Carpita N.C.,and E.M.Shia.1989。「部分的にメチル化されたアルジトール酢酸塩に関する、ガスクロマトグラフィー−質量分析（ＧＣ−ＭＳ）による、糖質類の結合構造（Linkage structure of carbohydrates by gas chromatography-mass spectroscopy(CD-MS) for partially methylated alditol acetates.)」p。157-216。C.J.Bierman and G.D.McGinnis(ed.)，「ガス−液体クロマトグラフィーおよび質量分析による、糖質類の解析（Analysis of carbohydrates by gas-liquid chromatography and mass spectroscopy.）」CRC Press Poca Raton,Fla。
４．Ciucanu I.,andF.Kerek.1984。「糖質類のペルメチル化のための単純かつ迅速な方法（A simple and rapid method for the permethylation of carbohydrates.) 」Carbohydr Res 131:209-217。
５．Doares S.H.,P.Albersheim,and A.G.Darvill.1991。「複合糖質類のグルコシル結合解析のための、標準品の調製のための改善方法（An improved method for the preparation of standards for the glycosyl-linkage analysis of complex carbohydrates.）」Carbohydr Res 210:311-317。
６．MacCormick C.A.,J.E.Harris,A.P.Cunning,and V.J.Morris.1993。「アセトバクター キシリヌム株の変異体によって生成されたポリサッカライドアセタンの変異体の特性化(Characterization of a variant of polysaccharide acetan produced by a mutan of Acetobacter xylinumstrain)」CR 1/4.J Appl Bacteriol 74:196-199。
７．Sweet D.P.,R.Shapiro,and P.Albersheim.1975。「部分的にメチル化され、部分的にエチル化されたアルジトール酢酸塩に対する種々のＧＬＣ応答−因子説による、定量的解析（Quantitative analysis by various GLC response-factor theories for partially methylated and partially ethylated alditol acetates.）」Carbohydr Res 40:217-225。
【実施例５】
【００５４】
材料と方法
ＨＴ２９細胞株は、European Collection of Cell Culutures for Applied Microbiology and Researchより入手した。細胞ストックを、５％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ｍＭペニシリン、０．１Ｍ ストレプトマイシン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ×１００）および２００ｍＭ ａ−グルタミンを含有する高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、湿潤５％ＣＯ2中で３７℃にて培養した。細胞は、４８時間ごとに栄養分を与え、コンフレントになる前に継代した。
【００５５】
オリゴサッカライド感受性のアッセイ
異なる濃度のオリゴサッカライド（０．０１、０．１、１、１０、１００ｍＭ）を含む血清標準培地（１％ ｖ／ｖ）を、Ｏｌａｎｏ−Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，１００３によるオリゴサッカライド感受性のアッセイに使用した。細胞には実験培地（目的のオリゴサッカライドを含む）を与え、該培地を毎日変え、付着細胞の測定を、実験培地を除去し、細胞をＣａ＋＋を含まないリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７、９．６ｇ／Ｌ）で洗浄することによって実施した。ついで付着細胞をトリプシン処理し、等容量の血清標準培地で中和した。細胞懸濁液を、Ｉｓｏｔｏｎ ＩＩ中に希釈し、細胞は、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｕｎｔｅｒ中で計数した。細胞生存パーセンテージを、以下のように計算した。（図１）
％生存＝（処理細胞の平均吸収／対照の平均吸収）×１００
【００５６】
付着アッセイ
ＨＴ２９細胞は、標準培地を用いて、＞９０％コンフレントまで、１２−ウェル組織培養プレート中で培養した。アッセイを実施する前、最終の細胞栄養補給のために、抗生物質を含まない培地を使用した。
【００５７】
病原体は、少なくとも３つの継代培養のために、抗生物質を含まない細胞培養培地中で、嫌気的に増殖させた。アッセイの日に、新たに前還元した組織培養培地に、一晩置いた１０％の病原体培養液を接種し、アッセイの前に４時間インキュベートした。
【００５８】
試験用オリゴサッカライドのストック溶液を、リン酸緩衝食塩水中５Ｍの濃度で調製し、濾過滅菌した。
【００５９】
４時間の病原体培養の１／１０００希釈液を、ＰＢＳ中で調製して、プレートカウントによって数えた。培地を、組織培養プレートから吸引し、細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）中で１回洗浄した。
【００６０】
各試験用オリゴサッカライドとして、０．５ｍｌのオリゴサッカライド（５Ｍ）溶液を３つのウェルに加えた。オリゴサッカライドを含まないリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）を、対照として含めた。培養懸濁液０．５ｍｌを全てのウェルに加え、プレートをロック混合し、３７℃にて２時間、好気的にインキュベートした。
【００６１】
培養液を吸引して除き、すべてのウェルを、無菌ＰＢＳ（ウェルあたり１ｍｌ）中で３回洗浄した。最終洗浄の後、ＰＢＳを吸引して取り除き、７０μｌトリプシン／ＥＤＴＡ溶液を各ウェルに加え、混合し、３７℃にて５分間放置した。
【００６２】
１ｍｌＰＢＳをウェルあたりに加え、ピペット混合して、全ての細胞が、ウェルの底から取り除かれたこと、および塊が壊れたことを確認した。
【００６３】
１ｍｌの細胞懸濁液を、ＭＲＤ（Ｍａｘｉｍｕｍ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｄｉｌｕｅｎｔ）のユニーバサルボトル中にピペットし、適宜希釈した。希釈液を、ピレート計数アガー（ＰＣＡ）上に撒き、２４時間３７℃にてインキュベートした。
【００６４】
インキュベーションの後、コロニーを計数し、付着の阻害を、対照区（ＰＢＳ）に存在する細菌数に対する、試料中に存在する細菌数（ｃ．ｆ．ｕ ｍｌ-1）の比として計算した（図２）。
【００６５】
結論
図２で示した結果は、ジサッカライド分画の存在下での、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＰＥＣおよびＳ．トリフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｕｒｉｕｍ）の付着に対する強力な阻害を示唆しており、該阻害はまたＧＯＳ混合物においても存在する。トリサッカライドより高次のサッカライド（＞ｔｒｉ）分画が混合物に含まれると、Ｓ．トリフィムリウムに対する抗付着作用がより低いことが認められる。
【００６６】
該オリゴサッカライド感受性アッセイは、オリゴサッカライド混合物が、ＨＴ２９細胞に対して毒性を示さないことを確認するために実施される（図１）。
【００６７】
参考文献
Olano-Martin E.,Williams M.R.,Gibson G.R.,Rastall R.A.2003。「ペクチンおよびペクチン−オリゴサッカライドは、ヒト大腸細胞株ＨＴ２９に対して指向するように、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７シガ毒素を阻害する。(Pectins and pectic-oligosaccharides inhibit Escherichia coli O157:H7 Shiga toxin as directed towards the human colonic cell line HT29.)」FEMS Microbiol Letters 218(1):101-105。
【００６８】
図１は、添加されるオリゴサッカライド濃度を変えることの、２４時間後及び４８時間後の細胞の生存率への影響を示す。
図２は、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＥＰＥＣ 、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＶＴＥＣおよびサルモネラ チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のＨＴ２９細胞への付着に対する、オリゴサッカライド混合物（ＡＬＬ）と、該混合物中の他の分画が与える影響を示す。
【実施例６】
【００６９】
本実験で使用したＧＯＳ生成物は、先述（実施例１）と同様に製造し、イヌリンは、オラフティ（Ｏｒａｆｔｉ）（Ｂｅｌｇｉｕｍ）より入手した。
【００７０】
４０匹の離乳したオスブタすべては、ＪＳＲジェネンティクス社（ＪＳＲ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｌｔｄ），Ｓｏｕｔｈｂｕｒｎ，Ｄｒｉｆｆｉｅｌｄ，Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ、ＹＯ２５ ９ＥＤから購入した。
【００７１】
リーディング大学（Ｒｅａｄｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に到着した時に、ブタは、７日間の間、１０匹、４群で飼い、輸送の後、落ち着かせ、ユニットおよび餌に慣れさせた。輸送時のブタの平均体重は１４．７０ｋｇであった。
【００７２】
７日間の順応期間に続き、ブタを、同一のユニット内の、個々の囲いに移した。個々の囲いにおけるブタの平均体重は、１７．４６ｇであった。
【００７３】
ブタを、個々の耳入れ墨で同定し、これらはまた、防水ストックマーカーを用いて個々に番号付けした。それぞれの個々の囲いは、それぞれのブタを記録するのに使用したのと同一の同定番号で番号付けした。
【００７４】
１０匹のブタを、４つの餌、すなわち、対照区餌（ＮＥＧ）、実施例１に従い調製した１．６％（ｗ／ｗ）ＧＯＳを対照区餌に添加した餌、４％（ｗ／ｗ）ＧＯＳを対照区餌に添加した餌、及び、１．６％（ｗ／ｗ）イヌリンを対照区餌に添加した餌、の内の１つに割り当てた。
【００７５】
ブタは、本研究の間、おが屑の上に寝かせた。さらに、退屈を紛らわすためのおもちゃとして、また環境を向上させるものとして、藁を提供した。
【００７６】
本研究の間、ブタには、自由な給餌のために、Ｄｅｌｔａｗｅａｎ １５ ＮＧＰペレット（ＡＢＮ，ＡＢＮ Ｈｏｕｓｅ，ＰＯ Ｂｏｘ２５０，Ｏｕｎｄｌｅ Ｒｄ，Ｗｏｏｄｓｔｏｎ，Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ．ＰＥ ９ＱＦ）、完全給餌用飼料を与えた。
Ｄｅｌｔａｗｅａｎ １５ ＮＧＰの栄養／ミネラル組成は下記の通り。
【００７７】
ブタ餌にはまた、許容されている抗酸化剤、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびエソキシクインが含まれた。
【００７８】
同一の給餌投与における２匹または３匹のブタは、同一群の囲い内で個々に育成したが、給餌に際しては、ブタを無作為に割り付けた。ブタが、個々の囲いから逃げることによる混乱を避けるために、本法ではブタをグループ分けし、それにより、特定のブタが正しく給餌投与用の食物だけを摂取することが出来るようにしている。同一の給餌投与に際して、２匹または３匹のグループの、個々の飼育ブタを、ユニットにわたって、無作為に割り付けた。
【００７９】
糞試料を、試験餌の給餌開始時、および給餌の４週間後に、各ブタより回収し、糞における微生物群を、先に記述した（実施例３）ように、ＦＩＳＨ（表４）を用いて判定した。実験終了時には、ブタを屠殺して、近位および遠位大腸内の内容物を試料として得た。ｐＨ値（表５）、短鎖脂肪酸（ＳＣＦＡ）（表６）および微生物集団（表７）を、近位および遠位腸内容試料中で判定した。データは、平均値からの標準偏差を示している。差は、スチューデントｔ−検定によって解析した。差は、Ｐ＜０．０５で有意であると考えられた。
【００８０】
【表４】
【００８１】
【表５】
【００８２】
【表６】
【００８３】
【表７】
【００８４】
結論
表５：ＧＯＳの存在下で、遠位大腸にてｐＨの減少があり（１．６％に対して、また特に４％に対して）、これは、ＳＣＦＡデータ（表６）と組み合わせて、ＧＯＳ生成物が、近位大腸に到達したことを示唆している（発酵生成物が増加している）。
【００８５】
表７：ＧＯＳ（４％）の存在により、近位大腸にて、有益な細菌（ビフィズス菌、乳酸菌）の集団数が著しく増加したことが示されている。集団数のこの増加は、遠位部分、および糞試料では小さく、ＧＯＳ生成物が、主に近位大腸で発酵されるようであるとの事実によって説明可能である。１．６％のＧＯＳの投与でも同様の傾向が示された。
【００８６】
近位大腸において、ビフィズス菌集団数の増加が見られ、また、酢酸（ビフィズス菌の主な発酵生成物）の生成の増加がみられた。このことは、ＧＯＳ生成物が、ビフィズス菌種に対して、非常に選択的であることを示唆している。
【実施例７】
【００８７】
ケーススタディー
ケーススタディー１−炎症性腸疾患（ＩＢＤ）
潰瘍性大腸炎（ＩＢＤの２つの主要な形態のうちの１つ）と診断された４３歳の女性の患者を、実施例１に従って調製したＧＯＳ生成物の効果のケーススタディーとして引用する。
【００８８】
この患者は、５年に及び潰瘍性大腸炎を患っており、試験期間前、および期間中の投薬はなかった。抗炎症性薬剤スルファサラジンが以前に使用されていたが、ポジティブな効果はなかった。この患者は、標準食では、食物を消化することが困難であり、吐き気、下痢および腹痛に苦しんでいた。後者は左側大腸であり、下降結腸の炎症に基づく大腸炎との診断と相関した。
【００８９】
（２回の分割用量での）１日に７ｇ／ｄの総用量でのをＧＯＳを摂取させた。摂取から４日以内に、症状が改善し始めた。患者は、食事をより消化することが可能になり、腸の痛みが軽減し始め、吐き気も軽減した。内視鏡による臨床解析はなされなかったが、体調が良くなっているという患者の感触には顕著な改善が認められた。食事になされた変更は、ＧＯＳの添加のみであった。６週間後においてもこの効果は持続していた。
【００９０】
プラセボ対照区は存在しないが、多数の患者における研究において、このケーススタディーが、ＩＢＤの１つの主要な形態での、プレバイオティックＧＯＳのポジティブな効果に関する事例となる証拠を示している。
【００９１】
ケーススタディー２−過敏性腸症候群（ＩＢＳ）
３年間ＩＢＳを患っている２７歳の男性に、２回の分割用量で、実施例１に従って調製した７ｇ／ｄ ＧＯＳを摂取させた。この投与期間より以前では、この男性は膨満感、便秘、腸痛および疲労感を経験していた。これらは、ＩＢＳに関連する旧来の症状である。この患者は、６ヶ月間、抗生物質を摂取せず、小麦／グルテンおよび糖を含まない食事を摂取した。
【００９２】
プレバイオティック摂取の後、これら症状において明瞭な効果が３日以内に見られ、その後持続された。この被験者は、「マラソンを走る準備が出来ている」という言葉をもって、全般的な健康や腸の健康における劇的な改善を報告した。彼は、無理なく通常の食事を摂取することが可能になっている。
【００９３】
この報告は、対照試験ではないが、ＧＯＳが、ＩＢＳ状態を改善し、よりよい生活の質（クオリティー オブ ライフ）を回復させうることを示す、事例証拠としてはたらく。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトースを、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライド、および少なくとも１つのペンタサッカライドを含有する、ガラクトオリゴサッカライド混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じることが可能な、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）株。
【請求項２】
前記ガラクトオリゴサッカライド混合物中において、前記ジサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌであり、前記トリサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記テトラサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記ペンタサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、ここでＧａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す、請求項１に記載の株。
【請求項３】
前記ガラクトオリゴサッカライド混合物が、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、およびＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃを含む、請求項１または請求項２に記載の株。
【請求項４】
前記ガラクトオリゴサッカライド混合物が、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の株。
【請求項５】
２００３年３月３１日に、Ｎａｔｉｏａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫにて、ＮＣＩＭＢ４１１７１の受託番号にて預託された、請求項１〜４のいずれか１つに記載の株、またはその生物学的機能等価物。
【請求項６】
有効成分として、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライドおよび少なくとも１つのペンタサッカライドの混合物を含有する、ビフィズス菌の特異的増殖を促進するための、ガラクトオリゴサッカライド組成物。
【請求項７】
前記ジサッカライドが、Ｇａｌ−Ｇａｌであり、前記トリサッカライドが、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記テトラサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記ペンタサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、およびＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃを含む、請求項６または請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む、請求項６〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
培養された請求項１〜５のいずれか１つに記載のビフィドバクテリウム ビフィダムの株と、請求項６〜９のいずれか１つに記載の組成物との組み合わせを含む、腸の健康を改善するための組成物。
【請求項１１】
治療としてヒトまたは動物に投与する方法に使用するための、請求項６〜９のいずれか１つに記載のビフィドバクテリウムの増殖を促進するための組成物。
【請求項１２】
病原体または病原体によって生成される毒素の腸壁への付着を防止するための医薬品の調製における、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【請求項１３】
抗生物質の投与または施術後に正常な腸管内菌叢を再構築するための医薬品の調製における、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれかにおいて定義された前記ガラクトオリゴサッカライドの混合物を生成するための、請求項１〜５のいずれか１つに記載の、ビフィドバクテリウム ビフィダムの株の使用。
【請求項１５】
請求項８にて定義された前記ガラクトサッカライドの混合物を生成するための、請求項５に記載の株の使用。
【請求項１６】
前記ガラクトオリゴサッカライドの混合物が、腸の健康を改善するための製品の一部である、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記製品が、日用品、飲料、幼児食、シリアル、ビスケット、菓子、ケーキ、食物サプリメント、栄養補助食品、動物の餌、家禽餌または他の食物または飲料からなる群より選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ビフィズス菌の増殖を促進するための基質を製造する方法であって、ラクトースまたはラクトース含有物質を、請求項１〜５のいずれか１つに記載のビフィドバクテリウム ビフィダムの株で処理することを特徴とする、該方法。
【請求項１９】
前記ラクトース含有物質が、市販されているラクトース、全ミルク、セミスキムミルク、スキムミルク、乳清および脂肪添加乳からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ミルクが、ウシ、バッファロー、ヒツジまたはヤギより得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ビフィドバクテリウム ビフィダム細胞の除去の後に基質を噴霧乾燥させて、粉末を作成することを含む、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１】
ラクトースを、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライド、および少なくとも１つのペンタサッカライドを含有する、ガラクトオリゴサッカライド混合物に変換する、ガラクトシダーゼ酵素活性を生じることが可能な、ビフィドバクテリウム ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）株。
【請求項２】
前記ガラクトオリゴサッカライド混合物中において、前記ジサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌであり、前記トリサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記テトラサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記ペンタサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、ここでＧａｌはガラクトース残基を、Ｇｌｃはグルコース残基を表す、請求項１に記載の株。
【請求項３】
前記ガラクトオリゴサッカライド混合物が、Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、およびＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃを含む、請求項１または請求項２に記載の株。
【請求項４】
前記ガラクトオリゴサッカライド混合物が、２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の株。
【請求項５】
２００３年３月３１日に、Ｎａｔｉｏａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫにて、ＮＣＩＭＢ４１１７１の受託番号にて預託された、請求項１〜４のいずれか１つに記載の株、またはその生物学的機能等価物。
【請求項６】
有効成分として、少なくとも１つのジサッカライド、少なくとも１つのトリサッカライド、少なくとも１つのテトラサッカライドおよび少なくとも１つのペンタサッカライドの混合物を含有する、ビフィズス菌の特異的増殖を促進するための、ガラクトオリゴサッカライド組成物。
【請求項７】
前記ジサッカライドが、Ｇａｌ−Ｇａｌであり、前記トリサッカライドが、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記テトラサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃであり、前記ペンタサッカライドがＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃである、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
Ｇａｌ（α１−６）−Ｇａｌ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−３）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃ、およびＧａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−６）−Ｇａｌ（β１−４）−Ｇｌｃを含む、請求項６または請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
２０〜３５％ｗ／ｖのジサッカライド、２０〜３５％ｗ／ｖのトリサッカライド、１５〜２５％ｗ／ｖのテトラサッカライド、および１０〜２０％ｗ／ｖのペンタサッカライドを含む、請求項６〜８のいずれか１つに記載の組成物。
【請求項１０】
培養された請求項１〜５のいずれか１つに記載のビフィドバクテリウム ビフィダムの株と、請求項６〜９のいずれか１つに記載の組成物との組み合わせを含む、腸の健康を改善するための組成物。
【請求項１１】
治療としてヒトまたは動物に投与する方法に使用するための、請求項６〜９のいずれか１つに記載のビフィドバクテリウムの増殖を促進するための組成物。
【請求項１２】
病原体または病原体によって生成される毒素の腸壁への付着を防止するための医薬品の調製における、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【請求項１３】
抗生物質の投与または施術後に正常な腸管内菌叢を再構築するための医薬品の調製における、請求項６〜１０のいずれか１つに記載の組成物の使用。
【請求項１４】
請求項６〜９のいずれかにおいて定義された前記ガラクトオリゴサッカライドの混合物を生成するための、請求項１〜５のいずれか１つに記載の、ビフィドバクテリウム ビフィダムの株の使用。
【請求項１５】
請求項８にて定義された前記ガラクトサッカライドの混合物を生成するための、請求項５に記載の株の使用。
【請求項１６】
前記ガラクトオリゴサッカライドの混合物が、腸の健康を改善するための製品の一部である、請求項１４または請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記製品が、日用品、飲料、幼児食、シリアル、ビスケット、菓子、ケーキ、食物サプリメント、栄養補助食品、動物の餌、家禽餌または他の食物または飲料からなる群より選択される、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ビフィズス菌の増殖を促進するための基質を製造する方法であって、ラクトースまたはラクトース含有物質を、請求項１〜５のいずれか１つに記載のビフィドバクテリウム ビフィダムの株で処理することを特徴とする、該方法。
【請求項１９】
前記ラクトース含有物質が、市販されているラクトース、全ミルク、セミスキムミルク、スキムミルク、乳清および脂肪添加乳からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ミルクが、ウシ、バッファロー、ヒツジまたはヤギより得られる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ビフィドバクテリウム ビフィダム細胞の除去の後に基質を噴霧乾燥させて、粉末を作成することを含む、請求項１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【公表番号】特表２００７−５２７１９９（Ｐ２００７−５２７１９９Ａ）
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５００２６７（Ｐ２００６−５００２６７）
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８１５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３２９
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０５４０８８４８）クラサド インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年９月２７日（２００７．９．２７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年６月３０日（２００４．６．３０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＧＢ２００４／００２８１５
【国際公開番号】ＷＯ２００５／００３３２９
【国際公開日】平成１７年１月１３日（２００５．１．１３）
【出願人】（５０５４０８８４８）クラサド インコーポレイテッド (3)
【Ｆターム（参考）】
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