新規インフルエンザウイルス免疫エピトープ
植物または植物の一部内でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を合成する方法が提供される。方法は、植物中での新規のインフルエンザＨＡタンパク質の発現およびその精製を含む。本発明はインフルエンザＨＡタンパク質および植物脂質を含むＶＬＰも指向する。本発明は、ベクターに加えて、改善されたインフルエンザＨＡをコードする核酸も指向する。ＶＬＰは、インフルエンザワクチンを製剤化するために使用することができるか、または既存のワクチンを濃縮するために使用することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス様粒子の産生に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ抗原、特に他のインフルエンザ株との広範囲の交差反応性を有する修飾されたインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、呼吸系ウイルスに起因するヒトにおける代表的な死因である。一般的な病徴は熱、咽頭炎、息切れおよび筋肉痛を特に含む。インフルエンザシーズンの間に、インフルエンザウイルスは、世界中で集団の１０〜２０％に感染し、毎年２５０，０００〜５００，０００人の死亡をもたらす。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、感染した哺乳類細胞の原形質膜から出芽するエンベロープウイルスである。それらは、存在する核タンパク質およびマトリックスタンパク質抗原に基づいてＡ型、Ｂ型またはＣ型へと分類される。インフルエンザＡ型ウイルスは、表面の糖タンパク質が提示する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の組み合わせに従って亜型へとさらに分類することができる。ＨＡは、ウイルスが宿主細胞に結合し浸透する能力を決定する。ＮＡは宿主細胞およびウイルス表面タンパク質上のグリカン鎖から末端シアル酸残基を除去し、それによりウイルス凝集を妨害し、ウイルス移動性を促進する。現在、１６個のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９個のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型が認識されている。各々のＡ型インフルエンザウイルスは１タイプのＨＡおよび１タイプのＮＡの糖タンパク質を提示する。一般的には、各々の亜型は種特異性を示し、例えば、すべてのＨＡおよびＮＡ亜型は鳥類に感染することが公知であるが、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ７のみがヒトに感染することが示されている（Horimoto 2006; Suzuki 2005）。Ｈ５、Ｈ７およびＨ９を含むインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルスの最も高病原性の形態と判断され、将来のパンデミックを引き起こす可能性が最も高い。
【０００４】
インフルエンザパンデミックは通常、高度に伝播性の毒性のインフルエンザウイルスによって引き起こされ、疾病および死亡のレベルの上昇を世界的にもたらしうる。新しいインフルエンザＡ亜型の出現は２０世紀中で４つの大きなパンデミックをもたらした。１９１８〜１９１９年のスペインかぜ（Ｈ１Ｎ１ウイルスによって引き起こされた）は、１９１７年から１９２０年の間に世界中で５０００万人以上の死亡をもたらした。現在、新しい亜型の出現のリスクまたは動物に固有の亜型のヒトに対する伝播のリスクは常に存在する。特に重要なものは鳥類インフルエンザ（「トリインフルエンザ」とも呼ばれる）の高度に毒性の形態であり、大発生が世界中のいくつかの国で報告されている。多くの事例において、このトリインフルエンザは４８時間以内に１００％に近い死亡率をもたらしうる。最初に１９９７年に香港で同定された鳥類インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の他のアジア諸国およびヨーロッパへの広がりは、野鳥の移動パターンに関連することが提唱されている。
【０００５】
ヒトのインフルエンザに対抗する現行の方法は毎年のワクチン接種による。ワクチンは通常、次の「インフルエンザシーズン」で優勢株と予測されるいくつかの株の組み合わせである。この予測は世界保健機構によって統合される。一般的には、毎年産生されるワクチン用量の数は世界の集団のワクチン接種には十分ではない。例えば、カナダおよび米国は集団の約３分の１の免疫に十分なワクチン用量を得るが、欧州連合では集団の１７％しかワクチン接種することができない。インフルエンザワクチンの世界中の現行の産生は、世界的なインフルエンザパンデミックに直面して不十分であろうことは明らかである。ある年になんとかして必要な年間の産生量を満たすことができたとしても、優勢株は毎年変化し、したがってその年の中で必要性が低い時に備蓄することは実践的ではない。効果的なインフルエンザワクチンの経済的で大規模な産生は、政府および民間産業に同様に重大な関心事である。
【０００６】
現在、ワクチンで使用されるウイルスストックの最も重要なソースは受精卵中で産生される。ウイルス粒子を採取し、不活性化ウイルスワクチンのために界面活性剤によって破壊して不活性化する。弱毒化生ワクチンは低温での増殖に適合したインフルエンザウイルスから作製され、これは正常体温では、ワクチンが弱毒化されることを意味する。かかるワクチンは、合衆国では５乃至４９歳の個人における使用が許可されている。不活性化全ウイルスワクチンは化学薬剤による不活性化によって無害にされ、それらは孵化卵または哺乳類細胞培養において産生されている。これらのすべてのタイプのワクチンはいくつかの特異的な利点および欠点を示す。全ウイルスに由来するワクチンの１つの利点は、かかるワクチンによって誘導される免疫のタイプである。一般に、スプリットワクチンは強い抗体応答を誘導するが、全ウイルスから作製されるワクチンは抗体（液性）および細胞応答の両方を誘導する。機能的抗体応答がワクチンによって誘導される防御と関連することが認可のための基準であっても、Ｔ細胞応答もインフルエンザ免疫において重要であり、高齢者においても良好な防御を提供できるという証拠が増えている。
【０００７】
細胞性免疫反応を誘導するために、全ウイルスから作製されたワクチンが開発された。インフルエンザ菌株（例えばＨ５Ｎ１）の高い病原性に起因して、これらのワクチンはＢＬ３＋施設中で産生される。Ｈ５Ｎ１などの高病原性インフルエンザ株については、いくつかの製造業者はインフルエンザ株の病原性を低下させて無発病性にし、より容易に孵化卵または哺乳類細胞培養において産生されるようにするために、赤血球凝集素遺伝子配列を修飾した。他の業者は、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのタンパク質の遺伝子配列が高収量低病原性インフルエンザドナー株中でクローン化されたリアソータントインフルエンザ株も使用する（Ａ／ＰＲ／８／３４；Quan F-S et al, 2007）。これらの方法は有用なワクチンを産生することができるが、例年の世界的な需要を満たすのに必要なスケールで、多量で低コストで迅速なワクチン産生の必要性に対する解決を提供せず、パンデミックに直面してほとんど確実に不十分となるだろう。
【０００８】
このリバースジェネティクス技術を使用する場合、ＨＡタンパク質の遺伝子配列を変異させて無発病性にすることが必要かもしれない。高病原性インフルエンザ株については、全ウイルスワクチンの産生は、封じ込め手順または生じたワクチンを循環ウイルスの遺伝子配列に正確に一致させないことのいずれかが必要とされる。弱毒化生ワクチンの事例において、投与されたワクチンが宿主からのインフルエンザウイルスと組換えを起こし、新しいインフルエンザウイルスをもたらすリスクがなお存在する。
【０００９】
この方法は抗原エピトープおよび翻訳後修飾を維持しているが、全ウイルスの使用に起因する汚染のリスクおよびウイルス株に依存する収率変動性を含む多数の短所がある。卵の中への導入に起因するウイルスの遺伝的異質性から、最適レベル以下の防御が生じうる。他の短所は、卵を得るための大規模な計画、精製において使用される化学物質に起因する汚染リスク、および長期の生産時間を含む。さらに、卵タンパク質に過度に感受性のある人は、ワクチンの服用にふさわしい候補ではない。
【００１０】
パンデミックの事例において、スプリットワクチン産生は、卵中の増殖のために株を適応させる必要性および達成される産生収率の変動性によって限定される。この技術は近年季節性ワクチンの産生のために使用されてきたが、パンデミックに対して妥当な時間枠で対応することはほとんどできず、世界的な製造能力は限定されている。
【００１１】
インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１のメキシコにおける最近の大発生は、さらに新しい新興株のワクチン産生についての迅速な方法論を発達させる緊急な医学的必要性を強調する。
【００１２】
インフルエンザウイルスは、卵の使用を回避するために哺乳類細胞培養（例えばＭＤＣＫ細胞またはＰＥＲＣ．６細胞または同種のもの）においても産生されている。別のアプローチは、ウイルス遺伝子による細胞の形質転換によってウイルスが産生されるリバースジェネティクスである。しかしながら、これらの方法は手の込んだ方法および特殊な培養環境に加えて全ウイルスの使用も必要とする。
【００１３】
いくつかの組換え産物が組換えインフルエンザワクチン候補として開発されている。これらのアプローチは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Crawford et al, 1999; Johansson, 1999）、ウイルスベクターおよびＤＮＡワクチンコンストラクト（Olsen et al., 1997）を使用するこれらのタンパク質の発現を含む、インフルエンザＡ型のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現、産生および精製に焦点を当てられる。
【００１４】
インフルエンザウイルス感染の詳細は周知である。簡潔には、感染サイクルは、シアル酸含有細胞受容体（糖タンパク質および糖脂質）へのビリオン表面のＨＡタンパク質の付着によって開始される。ＮＡタンパク質はシアル酸受容体のプロセシングを媒介し、細胞の中へのウイルス侵入はＨＡ依存性受容体媒介性エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを含有する内部移行されたエンドソームの酸性域の中で、ＨＡタンパク質はコンフォメーション変化し、ウイルス膜および細胞膜の融合、ならびにウイルス脱外被、ならびにヌクレオカプシドと会合したリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）からのＭ１タンパク質のＭ２媒介性放出をもたらし、ＲＮＰはウイルスＲＮＡ合成のために細胞核へと移動する。ＨＡタンパク質に対する抗体はウイルス感染性を中和することによってウイルス感染を妨害するが、ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス複製の初期段階でのＮＡタンパク質の作用を干渉する。
【００１５】
Crawford et al. (1999)は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるインフルエンザＨＡの発現を開示する。発現されたタンパク質は、トリＨ５およびＨ７インフルエンザ亜型によって引き起こされる致死性インフルエンザ疾患を妨害することができると記載されている。Johansson et al. (1999)は、バキュロウイルスにより発現されたインフルエンザのＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、従来のワクチンによって誘導されたものより優れた免疫応答を動物中で誘導することを教示する。バキュロウイルスにより発現されたウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素の免疫原性および有効性は、相同なＤＮＡワクチン候補と匹敵していた（Olsen et al., 1997）。まとめると、これらのデーターは、インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する高度の防御を、異なる動物モデルにおいて様々な実験的アプローチを使用して、組換えのＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質により誘導できることを実証する。
【００１６】
表面のインフルエンザ糖タンパク質（ＨＡおよびＮＡ）はインフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発のための一次標的であること、およびＭ１はインフルエンザへの細胞性免疫のための保存された標的を提供することが従来の研究により示されているので、新しいワクチン候補は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質の巨大分子性粒子としてこれらのウイルス抗原を含むことができる。ワクチン製品として、ＶＬＰは、サブユニット抗原または組換え抗原よりも免疫原性が高いという長所があり、液性免疫反応および細胞性免疫反応の両方を刺激することができる（Grgacic and Anderson, 2006）。さらに、これらのインフルエンザ抗原を持つ粒子は、インフルエンザウイルスの複数の株に対する中和抗体を誘発するコンフォメーショナルエピトープを提示することができる。
【００１７】
ワクチン目的のための非感染性インフルエンザウイルス株の産生は、不慮の感染を回避する１つの手段である。あるいは、培養されたウイルスの代替物としてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が研究されている。ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するがゲノムを欠損し、したがって複製または二次感染の手段を提供することができない。
【００１８】
いくつかの研究により、組換えインフルエンザタンパク質は、哺乳類発現プラスミドまたはパキュロウイルスベクターを使用する細胞培養においてＶＬＰへと自己集合することが実証された（Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham and Galarza, 2001）。Gomez-Puertas et al. (1999)は、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成がいくつかのウイルスタンパク質の発現レベルに依存することを開示する。Neumann et al. (2000)は、もっぱらクローン化されたｃＤＮＡから感染インフルエンザウイルス様粒子を生成するために哺乳類の発現プラスミドに基づくシステムを確立した。Latham and Galarza (2001)は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスにより感染した昆虫細胞中のインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。これらの研究は、インフルエンザビリオンタンパク質は真核生物細胞中で共発現させると自己集合できることを実証した。
【００１９】
Gomez-Puertas et al. (2000)は、赤血球凝集素（ＨＡ）に加えてインフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）が昆虫細胞からのＶＬＰ出芽に必須であることを教示する。しかしながら、Chen et al. (2007)は、Ｍ１はＶＬＰ形成に必要とされない可能性を教示し、Ｍ１およびＶＬＰの効率的な放出はＨＡの存在およびＮＡにより提供されるシアリダーゼ活性を必要とすることを観察した。ＮＡは細胞表面で糖タンパク質のシアル酸を切断し、ＶＬＰを産生し、培地中にＶＬＰを放出する。
【００２０】
Quan et al (2007)は、バキュロウイルス発現システム（昆虫細胞）で産生されたＶＬＰワクチンは、インフルエンザウイルスのいくつかの株（Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１））に対する防御免疫を誘導することを教示する。Quanによって研究されたＶＬＰは原形質膜から出芽することが観察され、哺乳類システム（ＭＤＣＫ細胞）で得られるものに類似する正しいサイズおよび形態であると判断された。
【００２１】
エンベロープウイルスは感染細胞から「出芽」するときに脂質エンベロープを得て、原形質膜からまたは細胞内小器官の膜から膜を得ることができる。インフルエンザウイルス粒子およびＶＬＰは宿主細胞の原形質膜から出芽する。哺乳類の細胞システムまたはバキュロウイルス細胞システムにおいて、例えば、インフルエンザは原形質膜から出芽する（Quan et al 2007）。
【００２２】
少数のエンベロープウイルスのみが植物に感染することが公知である（例えばトポウイルスおよびラブドウイルスのメンバー）。公知の植物のエンベロープウイルスは、原形質膜からではなく宿主細胞の内膜から出芽することによって特徴づけられる。少数の組換えＶＬＰは植物の宿主において産生されたが、どれも原形質膜に由来しない。現行のインフルエンザＶＬＰ生産技術は複数のウイルスタンパク質の共発現に依存し、パンデミックおよび毎年の流行の事例においては応答時間がワクチン接種に重要であるので、この依存性はこれらの技術の短所となる。ワクチンの開発を加速するために、１つのみのウイルスタンパク質の発現に依存するより単純なＶＬＰ産生システムが所望される。
【００２３】
植物ベースのシステムにおけるインフルエンザＨＡ ＶＬＰの産生はＷＯ２００９／００９８７６中で記載され、インフルエンザＨＡが植物宿主細胞中で自己集合し、ウイルス様粒子で原形質膜から出芽できることを本質的に示した。
【００２４】
インフルエンザから世界人口を守り、将来のパンデミックを食い止めるために、ワクチン製造業者は、ワクチン用量を産生する効果的な迅速な方法を開発する必要があるだろう。ワクチンを産生するための受精卵の現行の使用は不十分であり、長いプロセスを含む。使用されるＨＡタンパク質は各々の株について特異的であり他の株と交差反応せず、より広域なスペクトルのワクチンを提供するためには、したがって、持続的な産生またはいったん新しい株が同定されてからの短い反応時間が必要となる。
【００２５】
ＶＬＰの産生のために使用するＨＡの天然のタンパク質に対して、特定の修飾および／または変異を行うことができ、かかる修飾は、単一投与のみの後でさえ、インフルエンザの１つ以上の株またはいくつかの株を中和する抗体を誘導するより広域のスペクトルを有する赤血球凝集素タンパク質をもたらす。
【発明の概要】
【００２６】
本発明の１つの態様は改善されたインフルエンザワクチンを提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、新規のインフルエンザウイルス様粒子を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、より広域のスペクトルの抗体反応を提供するように修飾された赤血球凝集素タンパク質を提供することである。
【００２９】
本発明は、Ｎ結合型糖タンパク質であるが、Ｎ結合型炭水化物が部分的にまたは完全にない（すなわち、もとの天然のＨＡ配列と比較した場合に消失している(abolish)１つまたは複数の糖鎖付加部位を有する）ウイルスエンベロープと実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドに加えて、ポリペプチドを産生および利用する方法を意図する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、広域スペクトルのインフルエンザワクチンの調製のためのインフルエンザＶＬＰを産生するために、ＨＡ１ドメインからの１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位が修飾された／欠失した／変異した／除去された／消失したＨＡタンパク質を提供することである。
【００３１】
特に、ＨＡ１ドメインは、株Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４に従って番号付けした１位乃至３３１位に位置するアミノ酸を含む。より詳細には、ＨＡ１ドメインは、株Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４に従って番号付けしたタンパク質の３９位乃至３３１位の間のアミノ酸に対応する、球状頭部およびタンパク質のＦ’２ドメインを含む。特に、消失する糖鎖付加部位はタンパク質の球状頭部にもともと存在し、特に配列番号：３４の３９位乃至２７３位の間に位置するアミノ酸に対応する。より詳細には、消失される糖鎖付加部位は、もともとタンパク質のＦ’２ドメイン中に位置し、配列番号：３４の２７４位〜３３１位の間に位置するアミノ酸に特に対応する。
【００３２】
本発明は、ＨＡの抗原性および免疫原性を変更することができるインフルエンザＡ型の赤血球凝集素（ＮＡ）分子中のアミノ酸置換を提供する。これらの置換は、受容体特異性および／または抗体抗原結合の変更によって抗原部位を変更することができる。実施形態の多様性において、置換からもたらされる抗原性の増加はインフルエンザのためのより広域の交差反応性を持つワクチンの産生のために有用でありえる。特に、アミノ酸置換は、受容体結合部位に対応し、特に位置１５４および／または１６５および／または２８６（番号付けは株Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４に従う）に対応する位置で、ＨＡタンパク質の非アスパラギン残基のアミノ酸置換の免疫原的な特徴を持つ分子をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は糖鎖付加部位を除去する／欠失させる／消失させる。
【００３３】
インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、Ｈ５の１５４位および／または１６５位および／または２８６位に対応する１つまたは複数の糖鎖付加されていないアミノ酸を含むことができ、これらの糖鎖付加部位の任意の１つの除去は、野生型ＨＡ分子を持つインフルエンザウイルスに曝露された動物に由来する抗血清との反応性の増加をもたらす。
【００３４】
糖鎖付加部位を破壊するために、三つ組シグナルのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（配列中、ＮはＡｓｎであり、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸でありえ、Ｓ／ＴはＳｅｒまたはＴｈｒの両方でありえる）は、タンパク質工学によって修飾することができる。使用される第１のアプローチは、Ａｓｎを別のアミノ酸によって置換することである。第２のアプローチは、糖鎖付加される予定のアスパラギンに対してｎ＋２位の位置でＳ／Ｔアミノ酸を他のアミノ酸残基によって置換することである。アスパラギン、セリンまたはスレオニンの置換に使用したされる適切なアミノ酸はアラニンであるが、他のアミノ酸も使用することができる。例えば、Ａｓｎは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａによって置換することができる。さらに、ＳｅｒまたはＴｈｒは、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕによって置換することができる。
【００３５】
特に、インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、Ｈ５ ＨＡ中の１５４位および／または１６５位および／または２８６位で非アスパラギンのアミノ酸を含むことができる。
【００３６】
インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、頭部がＮ結合型糖鎖付加部位を欠いている、すなわち、すべての３つの糖鎖付加部位が消失されているＨＡタンパク質を含むことができる。
【００３７】
インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、Ｎ−１５４、Ｎ−１６５およびＮ−２８６（番号付けは株Ａ／ベトナム／１１９４／０４に従う）からなる群から選択される１つまたは複数の除去される糖鎖付加部位を含むことができる。
【００３８】
本発明は異なるインフルエンザ株からの修飾された赤血球凝集素（ＨＡ）を提供する。
【００３９】
本発明は、
ａ）シアル化していない宿主生物またはその一部において活性のある調節領域に作動可能に連結された上で定義されたインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原をコードする核酸を導入することと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で宿主またはその一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生することと
を含む、シアル化していない宿主生物中でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法も提供する。
【００４０】
本発明は、導入工程（工程ａ）において、核酸が宿主中で一過性に発現されるか、または宿主中で安定的に発現されうる上記の方法を含む。さらに、ＶＬＰは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することができる。
【００４１】
さらに、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生のために使用される、シアル化していない宿主生物に関する。特に、ＶＬＰを産生することができる適切な宿主は、例えば、植物もしくはその一部、植物細胞、昆虫もしくはその一部、昆虫細胞、酵母もしくはその一部、または酵母細胞である。
【００４２】
本発明に従えば、シアル化していない宿主生物において活性のある調節領域に作動可能に連結された上述のように定義された修飾インフルエンザＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。抗原は、分子の頭部から１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位（天然の配列中に通常は存在する抗原部位）を欠くインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）でありえる。
【００４３】
本発明は、本明細書において定義されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）も提供する。宿主が昆虫ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の昆虫脂質を含むことができ、宿主が酵母ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の酵母脂質を含むことができ、宿主が植物ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の植物脂質を含むことができる。
【００４４】
さらなる本発明は、植物中で産生され、それによって植物起原の１つまたは複数の脂質（一般的に「植物脂質」と呼ばれる）を含有するＶＬＰを提供する。
【００４５】
本発明は、昆虫細胞の原形質膜からの脂質（一般的に「昆虫脂質」と呼ばれる）を含む昆虫細胞中で産生されたＶＬＰをさらに提供する。
【００４６】
本発明は、酵母細胞の原形質膜からの脂質（一般的に「酵母脂質」と呼ばれる）を含む酵母中で産生されたＶＬＰをさらに提供する。
【００４７】
さらに、ＶＬＰ（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、シアル化しない宿主産生細胞に由来する１つまたは複数の脂質を含む）の効果的な用量を含む組成物は、薬学的に許容される担体との混合において、本発明中に含まれる。薬学的に許容される担体は、経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または皮下投与のために適切でありえる。
【００４８】
アジュバントの存在ありまたはなしで、薬学的に許容される担体との混合において、本明細書において定義されたＶＬＰの免疫学的に効果的な用量を含むワクチン組成物は、本発明中にさらに含まれる。ワクチンは、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で投与することができる。特に、ワクチンはアジュバントの使用なしで投与される。
【００４９】
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法であって、ウイルス様粒子（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の宿主脂質を含む）および薬学的に許容される担体を被験体に投与することを含む方法も提供する。ウイルス様粒子は、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で被験体に投与することができる。
【００５０】
本発明は、本明細書において定義された１つまたは複数のＶＬＰを含むワクチンの効果的な用量を被験体に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法に関する。
【００５１】
上で定義された方法によって治療される被験体は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラ、および同種のものからなる群から選択することができる。特に、被験体は、ヒト患者またはトリ一般（水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリなどの家禽を含む）、特に渡り鳥またはヒト消費のための家禽（ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリ）でありえる。
【００５２】
本発明は、かかる容器を含むキットに加えてシリンジなどの容器も提供し、そのすべては本明細書において定義されたワクチン組成物を含む。
【００５３】
本発明のこの要約は、必ずしも本発明のすべての態様を記載するとは限らない。
本発明のこれらおよび他の特色は添付の図面を参照する以下の記載からより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】インフルエンザウイルスＨＡ Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／０５上の糖鎖付加部位の局在化を示した図である。アミノ酸同一性、ポジション、および位置は、Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４（ＰＤＢファイル：２ＩＢＸ）の構造上のアナロジーによって示される。三重変異体は、球状頭部に位置する糖鎖付加部位Ｎ１５４、Ｎ１６５およびＮ２８６の破壊によって作製された。Bright et al. (2003)からの研究を使用して、可能な抗原部位の位置決めを行った。糖鎖付加の型は、ＨＡ Ｈ１、Ｈ３およびＨ７について文献中で述べられているものに基づいて決定された（Abe Y. et al. (2004)；Vigerust DJ et al (2007)；およびKuroda et al. (1990)）。
【図１Ｂ】ＨＡ単量体のサブドメインの実例を示した図である。Ｆ’１サブドメイン（Ａ／ベトナム／１１９４／０４に従って番号付けした１〜３８；配列番号：３４）、Ｆ’２サブドメイン（２７４〜３３１）およびＦサブドメインが示される。受容体結合部位およびエステラーゼサブドメインはともに球状頭部（３９〜２７３）を形成する。融合ペプチドは白いボックスとして示される。ＨＡの可溶性ブロメライン産物のみが結晶化されて構造が解明されているので、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をＨＡ構造上で見ることができない。
【図２】異なるＡ亜型からのＨＡの単量体の構造を示した図である。脂質二重層（その脂肪性相当物およびその極性頭部と共に）を同様に提示する。構造は、Ha et al（Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002)）Ｈ５鳥類から援用した。
【図３】本発明の実施形態に従うＨ１の発現に使用したアルファルファのプラストシアニンベースの発現カセットの配列を示した図である（配列番号：８）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）シグナルペプチドに下線が引かれる。クローニングに使用したＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限部位を太字で示す。
【図４】Ａ／インドネシア／５／０５からの野生型ＨＡ亜型Ｈ５の発現のために組み立てたプラスミド６６０の表示を示した図である。
【図５】Ａ／インドネシア／５／０５からの糖鎖付加のない変異させたＨＡ亜型Ｈ５の発現のために組み立てたプラスミド６８０の表示を示した図である。
【図６】第１および第２の投薬後の非活性化全ウイルス（ＷＩＶ）に対する抗体力価を示した図である。野生型ＶＬＰまたは三重変異体ＶＬＰ（糖鎖付加されない）のいずれかで免疫されたラットからの血清の反応性を、第１の免疫後（１４日目）または第２の免疫後（３５日目）に評価した。免疫反応性をいくつかのＨ５Ｎ１ウイルスに対して評価した。
【図７】第１および第２の投薬後の赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体力価を示した図である。野生型ＶＬＰまたは三重変異体ＶＬＰ（糖鎖付加されない）で免疫されたラットからのＨＩ力価を、第１の免疫（１４日目）または第２の免疫（３５日目）の１４日後に評価した。いくつかのＨ５Ｎ１ウイルスおよび１つのＨ１Ｎ１ウイルスに対して免疫反応性を評価した。
【図８】インフルエンザＨＡ０についての配列リストを示した図である。
【図９】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ２の配列リストを示した図である。
【図１０】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ３の配列リストを示した図である。
【図１１】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ４の配列リストを示した図である。
【図１２】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ５の配列リストを示した図である。
【図１３】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ６の配列リストを示した図である。
【図１４】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ７の配列リストを示した図である。
【図１５】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ８の配列リストを示した図である。
【図１６】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ９の配列リストを示した図である。
【図１７】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１０の配列リストを示した図である。
【図１８】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１１の配列リストを示した図である。
【図１９】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１２の配列リストを示した図である。
【図２０】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１３の配列リストを示した図である。
【図２１】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１４の配列リストを示した図である。
【図２２】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１５の配列リストを示した図である。
【図２３】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１６の配列リストを示した図である。
【図２４】完全な野生型Ｈ５配列を含有する、６６０ ｐＣＡＭＢＩＡ発現ベクターの配列リストを示した図である。
【図２５Ａ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｂ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｃ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｄ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｅ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｆ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｇ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｈ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｉ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｊ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２６】最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドおよびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含む、完全なＨ５コード領域を含有して産生された断片の配列リストを示した図である。
【図２７】最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドおよびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含む、３つの糖鎖付加部位をすべて除去するように修飾した完全なＨ５コード領域を含有して産生された断片のための配列リストを示した図である。
【図２８Ａ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２８Ｂ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２８Ｃ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２８Ｄ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２９】株Ａ／ベトナム／１１９４／０４からの成熟Ｈ５のアミノ酸配列を示した図である。
【図３０Ａ】株Ｂ／フロリダ／４／２００６からの成熟ＨＡの核酸配列を示した図である。
【図３０Ｂ】株Ｂ／フロリダ／４／２００６からの成熟ＨＡのアミノ酸配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生に関する。より詳細には、本発明はインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
【００５６】
以下の記載は特定の実施形態である。
【００５７】
１−ＨＡタンパク質
本明細書において使用される時、「タンパク質」は、特定の形態を達成するために二次構造、三次構造または四次構造へと折り畳まれる、ペプチド結合によって結合される一連のアミノ酸を一般的に指す。あるいは、ポリペプチド、ペプチドまたはペプチドフラグメントという用語は、類似する情況で使用することができる。
【００５８】
「赤血球凝集素ドメイン」という用語は、ＨＡ０前駆体ポリペプチド、またはＨＡ１ドメインおよびＨＡ２のドメインのいずれかを含むペプチドを指す。赤血球凝集素ドメインは、シグナルペプチド、膜貫通ドメインまたは天然に存在するタンパク質中で見出される細胞質尾部を含まない。
【００５９】
インフルエンザウイルスに関して、本明細書において使用される時「赤血球凝集素」または「ＨＡ」という用語は、インフルエンザウイルス粒子の外側上で見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、一般的にはシグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、ならびにＣ末端および小さな細胞質尾部で膜通過アンカー部位を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体の膜のタイプＩ糖タンパク質である（図１Ｂ）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知であり利用可能である。例えば、バイオディフェンスパブリックヘルスベース（ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｂａｓｅ）（インフルエンザウイルス；URL: biohealthbase.orgを参照）または全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照）を参照（その両者は参照として本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
インフルエンザＨＡに関する構造的情報
ＨＡ単量体は、２つの別個の機能ドメイン（球状頭部ドメインおよびステムドメイン）で細分することができる。一次配列とＨＡの構造との間のこれらのドメインの一致を図１Ｂおよび図２で示す。ステムドメインは、酸性ｐＨで行なうことができる並外れたコンフォメーション変化を介してウイルスの伝染性および病原性に関与する。ステムドメインは４つのサブドメインとしてさらに記載され、それらは融合ペプチド（低ｐＨのコンフォメーショナル状態で宿主膜との融合に関与する２６アミノ酸の疎水性ストレッチ）、ステムドメインそれ自体（２つの極端に異なるコンフォメーションに適合することができる）、膜貫通ドメイン（ＴｍＤ）（脂質ラフトに対するＨＡの親和性を決定する）、細胞質尾部（Ｃ尾部）（ＨＡの分泌に関与する）である。球状頭部は、２つのサブドメイン（受容体結合（ＲＢ）ドメインおよび痕跡のエステラーゼドメイン（Ｅ））に分けられる。エステラーゼサブドメインは、タンパク質の表面からかなり埋まっており、したがってＨＡに対して作製された大多数の抗体は、受容体結合ドメインに結合する（頭部の最上部分によって図２中に示される）。
【００６１】
「ホモ三量体」または「ホモ三量体の」という用語は、オリゴマーが３つのＨＡタンパク質分子によって形成されることを示す。ＨＡタンパク質は７５ｋＤａの単量体前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、それは伸長した三量体タンパク質へと表面で集合する。高病原性鳥類株については、前駆体タンパク質は、三量体化が起こる前に、ジスルフィド結合によって連結される２つのポリペプチド鎖、ＨＡ１（３２８アミノ酸）およびＨＡ２（２２１アミノ酸；膜貫通領域を含む）へと保存された活性化切断部位（融合ペプチドとも呼ばれる）で細胞内で切断される。この工程はウイルス感染性に重要であるが、タンパク質の三量体化に必須ではない。哺乳類インフルエンザウイルス株および非病原性鳥類インフルエンザウイルス株については、前駆体ＨＡ０は、宿主の呼吸管の細胞によって、または細菌もしくはマイコプラズマの共感染によって分泌されたプロテアーゼによって細胞外で切断される。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内部へのＨＡの挿入、シグナルペプチド切断、およびタンパク質の糖鎖付加は、翻訳と同時に起こる事象である。ＨＡの正しい再折畳みは、タンパク質の糖鎖付加および６つの鎖内ジスルフィド結合の形成を必要とする。ＨＡ三量体はシスゴルジ複合体およびトランスゴルジ複合体内で集合し、膜貫通ドメインが三量体化プロセスにおいて役割を果たす。ブロメライン処理したＨＡタンパク質の結晶構造（膜貫通ドメインを欠損する）は、インフルエンザ株の中で高度に保存された構造を示した。感染プロセス（前駆体ＨＡ０が２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２へと切断されることを必要とする）の間にＨＡが大きなコンフォメーション変化を受けることも立証された。ＨＡタンパク質はプロセシングを受ける（すなわち、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２のドメインを含む）か、またはプロセシングを受けない（すなわち、ＨＡ０ドメインを含む）。
【００６２】
本発明は、膜貫通ドメインを含むＨＡタンパク質の使用に関し、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含み、例えば、ＨＡタンパク質はＨＡ０、またはＨＡ１およびＨＡ２を含むプロセシングされたＨＡでありえる。
【００６３】
本発明のＨＡは任意の亜型から得ることができる。例えば、ＨＡは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６のものでありえる。
【００６４】
本発明は、修飾したＮ−グリカンを有するＨＡを含むＶＬＰを含む。本発明の組換えＨＡは、当技術分野において公知の任意の赤血球凝集素の配列に基づいたアミノ酸配列も含むことができ（例えば、バイオディフェンスパブリックヘルスベース（インフルエンザウイルス；URL: biohealthbase.orgを参照）、または全米バイオテクノロジー情報センター（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照）を参照）、ペプチド抗原部位をマスクする糖残基を除去するために、天然のＮ結合型糖鎖付加部位は除去／変異／欠失／修飾される。
【００６５】
さらに、ＨＡは、１つまたは複数の新興インフルエンザウイルスまたは新しく同定されたインフルエンザウイルスから単離した赤血球凝集素の配列に基づくことができる。
【００６６】
さらに、ＨＡ亜型の組み合わせを含むＶＬＰは産生することができる。例えば、ＶＬＰは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、またはその組み合わせからの１つまたは複数のＨＡを含むことができる。ＨＡの組み合わせの選択は、ＶＬＰから調製したワクチン使用の意図によって決定することができる。例えば、トリの接種における使用のためのワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組み合わせを含むことができ、その一方でヒトの接種に有用なＶＬＰは、１つまたは複数の亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３またはＨ５からの亜型を含むことができる。しかしながら、他のＨＡ亜型の組み合わせはＶＬＰの使用に応じて調製することができる。ＨＡ亜型の組み合わせを含むＶＬＰを産生するために、所望されるＨＡ亜型は同じ細胞（例えば植物細胞）内で共発現することができる。
【００６７】
特に、本明細書において記載されるように産生されたＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望されるならばＮＡはＨＡと共発現させることができる。
【００６８】
２−インフルエンザ亜型
本発明は、例えば非常に優勢なＡ亜型ならびにそれほど一般的でないＢ型およびＣ型を含むが、これらに限定されないすべての型のヒトインフルエンザウイルス、ならびに他のインフルエンザ亜型から得られるＨＡを含む。
【００６９】
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から得られたＨＡを含むＶＬＰも含む。例えば、ＶＬＰは、亜型Ｈ１（配列番号：１によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：７によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：８によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：９によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１０によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：１５によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号：１６によってコードされる）またはその組み合わせからの１つまたは複数のＨＡを含むことができる。１つまたは複数のＨＡの合成が１つまたは複数のインフルエンザ亜型から得られたＨＡの組み合わせを含むＶＬＰの形成をもたらすことを保証するために、１つまたは複数のインフルエンザ亜型からの１つまたは複数のＨＡは、植物細胞または昆虫細胞内で共発現させることができる。ＨＡの組み合わせの選択は、ＶＬＰから調製したワクチン使用の意図によって決定することができる。例えば、ヒトの接種における使用のためのワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組み合わせ、特に、１つまたは複数の亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ７、特にＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５を含むことができる。
【００７０】
しかしながら、他のＨＡ亜型の組み合わせは、接種物の使用に応じて調製することができる。
【００７１】
３−産生の方法
さらに、本発明は、宿主においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法を提供する。したがって、本発明は、単一エンベロープタンパク質の発現からのＶＬＰ、および宿主発現システムにおけるウイルスＶＬＰを産生する方法を提供する。方法は、宿主またはその一部において活性のある調節領域に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を導入すること、および核酸の発現を可能にする条件下で宿主または宿主の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生することを含む。
【００７２】
本発明の調節エレメントは、形質転換または一過性発現に適用可能な、特に植物、昆虫または酵母などの様々な宿主生物内の発現のために、対象となるコード領域とも組み合わせることができる。
【００７３】
特に、かかる生物は、植物（単子葉植物および双子葉植物の両方）、例えば、トウモロコシ、穀物用植物、コムギ、オオムギ、カラスムギ、タバコ属の種、アブラナ属の種、ダイズ、インゲンマメ、エンドウ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、チョウセンニンジン、およびシロイヌナズナであるが、これらに限定されない。
【００７４】
これらの生物の安定した形質転換および再生のための方法は、当技術分野において確立され、当業者に公知である。形質転換され再生された植物を得る方法は、当技術分野において周知である。
【００７５】
「形質転換」によって、遺伝子型、表現型、または両方によって明示される遺伝情報（ヌクレオチド配列）の安定した種間移行が意味される。キメラコンストラクトから宿主への遺伝情報の種間移行は遺伝性であり、遺伝情報の移行は安定性であるか、または移行は一過性であり遺伝情報の移行は遺伝可能ではないと判断される。
【００７６】
本発明のコンストラクトを発現するために、一過性発現方法を使用することができる（Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348を参照；参照として本明細書に組み込まれる）。あるいは、Kapila et al. 1997（参照として本明細書に組み込まれる）によって記載された真空に基づく一過性発現方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、アグロ接種またはアグロインフィルトレーションの方法を含むが、これらに限定されず、しかしながら、他の一過性方法も上述されるように使用することができる。アグロ接種またはアグロインフィルトレーションのいずれかにより、所望される核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば、葉、植物の地上構造の一部（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部（茎、根、花）、または全草の細胞間の空間に入り込む。表皮の通過後に、アグロバクテリウムは感染し、細胞へとｔ−ＤＮＡコピーを移行させる。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染した細胞中で対象となるタンパク質の産生をもたらすが、核の内部でのｔ−ＤＮＡの継代は一過性である。
【００７７】
４−宿主生物
本発明のＶＬＰは、グリコフォーラム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ）中で同定されるように、タンパク質をシアル化する能力の欠損（例えばシアリダーゼの欠損）によって特徴づけられる、植物細胞、昆虫細胞、真菌、および海綿動物、腔腸動物、環形動物、節足動物、軟体動物、線形動物、輪形動物、扁形動物、毛顎動物、有触手動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、古細菌を含む他の生物などの宿主細胞中で産生することができる（例えば、URL: glycoforum.gr.jp/science/word/evolution/ES-AOSE.htmlを参照）。
【００７８】
本明細書において記載されるように産生されたＶＬＰは、典型的にはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望されれば、ＮＡはＨＡと共発現することができる。
【００７９】
特に、本発明のＶＬＰは、植物細胞、植物全体またはその一部（葉、種子または他の植物素材などの）において産生することができる。
【００８０】
「植物素材」という用語によって、植物に由来する任意の材料が意味される。植物素材は、植物全体、組織、細胞または任意のその画分を含むことができる。さらに、植物素材は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体の抽出物、またはその組み合わせを含むことができる。さらに、植物素材は、植物葉、茎、果実、根またはその組み合わせからの植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはその組み合わせを含むことができる。植物素材は、任意の加工工程が行われていない植物またはその一部を含むことができる。しかしながら、植物材料に対して、以下に定義されるような最小の加工工程、またはより厳密な加工（クロマトグラフィー、電気泳動および同種のものを含むがこれらに限定されない当技術分野内で一般に公知である部分的または実質的なタンパク質精製を使用する技術を含む）を行うことができることも意図される。
【００８１】
「最小限の加工」という用語によって、植物素材、例えば、対象となるタンパク質を含む植物またはその一部を、部分的に精製して、植物抽出物、ホモジネート、植物ホモジネートの画分または同種のものを得る（すなわち最小限に加工する）ことが意味される。部分的精製は、植物の細胞構造を破壊すること、それによって可溶性植物成分、および例えば遠心分離、濾過またはその組み合わせであるがこれらに限定されないものによって分離することができる不溶性植物成分を含む組成物を生成することを含むことができるが、これらに限定されない。この点に関して、葉または他の組織の細胞外空間内の分泌タンパク質を真空または遠心による抽出を使用して容易に得ることができるか、または細胞外空間内からタンパク質を圧搾または遊離させるために圧力下でのローラーを介する通過もしくは粉砕または同種のものによって組織を抽出することができる。可溶性タンパク質の粗抽出物の調製物は二次的な植物産物からの混入がほとんどないので、最小限の加工は可溶性タンパク質の粗抽出物の調製物も含みうる。さらに、最小限の加工は、葉からの可溶性タンパクの水抽出、続いて任意の適切な塩による沈殿を含むことができる。他の方法は、抽出物の直接使用を可能にするために大規模浸軟および液汁抽出を含みうる。
【００８２】
植物素材（植物材料または組織の形態で）は、被験体に経口送達することができる。植物素材は、食事へのサプリメントの一部分として他の食品と共に投与されるか、またはカプセル化して投与することができる。植物素材もしくは組織は、食味性を改善もしくは増加させるために濃縮するか、または必要に応じて、他の材料、成分もしくは医薬品賦形剤と共に提供することもできる。
【００８３】
本発明の考慮される部分は、本発明のキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、植物細胞または種子である。植物細胞から全植物体を再生する方法も当技術分野において公知である。一般に、形質転換された植物細胞の同定を促進するために選択マーカーが使用される場合、形質転換された植物細胞は、適切な培地（抗生物質などの選択薬剤を含むことができる）中で培養される。いったんカルスが形成されたなら、公知の方法に従う適切な植物ホルモンを用いることによって芽形成は促進することができ、シュートを植物の再生のための発根培地に移す。次いで、種子または栄養繁殖技術の使用のいずれかからの反復世代を確立するために、植物を使用することができる。トランスジェニック植物は組織培養を使用せずに生成することもできる。
【００８４】
本発明の考慮される部分は、本発明に従う、ＶＬＰ産生のための組換えＨＡ０をコードする核酸を含むキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、樹木、酵母、細菌、真菌および昆虫および動物細胞である。
【００８５】
対象となるタンパク質を含む植物、または対象となるタンパク質を含むＶＬＰを発現する植物は、必要性および状況に応じた様々な手段で、被験体または標的生物に投与できることが意図される。例えば、植物から得られる対象となるタンパク質は、粗製形態、部分精製形態、または精製形態のいずれかで使用前に抽出することができる。タンパク質が精製される予定ならば、食用植物または非食用植物のいずれかにおいて産生することができる。さらに、タンパク質が経口投与されるならば、植物の組織を収穫し被験体に直接食物として与えるか、または収穫された組織を食物として与える前に乾燥させるか、または事前に収穫することなく動物を植物上で放牧させることができる。収穫された植物の組織を動物用食物内の食品サプリメントとして提供することも本発明の範囲内である判断される。植物の組織が、ほとんどまたはまったくさらに加工されずに、動物に食物として与えられるならば、投与されている植物組織が食用であることが好ましい。
【００８６】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は植物中での導入遺伝子の発現を限定することに関与し、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を打ち消すためにジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）からのサイレンシングサプレッサーの共発現を使用することができる（Brigneti et al., 1998）。代替のサイレンシングサプレッサーは当技術分野において周知であり、本明細書において記載されるように使用することができ（Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；参照として本明細書に組み込まれる）、例えば、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、柑橘トリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ）潜在ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）またはニンニク共通潜在ウイルスのｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）であるが、これらに限定されない。したがって、サイレンシングサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であるが、これらに限定されないものは、植物内での高レベルタンパク質産生をさらに保証するために、対象となるタンパク質をコードする核酸配列と共に共発現させることができる。
【００８７】
エンベロープウイルスのＶＬＰは、一般的には出芽する膜からエンベロープを取得する。植物原形質膜は、免疫刺激効果がある植物性ステロール相補物を有している。この可能性を調査するために、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰをアジュバントの存在下において動物に投与し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体応答）を決定した（図７）。
【００８８】
植物中のＶＬＰの産生は、昆虫細胞培養中のこれらの粒子の産生を上回るいくつかの利点を示す。植物脂質は特異的な免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を促進することができる。植物膜は脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からできており、植物ならびにある種の細菌および原虫類に特有なグリコスフィンゴ脂質も含有する。スフィンゴ脂質は、ＰＣまたはＰＥのようなグリセロールのエステルではなく、むしろ１８個以上の炭素を含有する脂肪酸鎖とアミド結合を形成する長鎖アミノアルコールからなるという点で独特である。スフィンゴ糖脂質に加えてＰＣおよびＰＥは、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに胸腺および肝臓中のＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞などの哺乳類の免疫細胞によって発現されるＣＤ１分子と結合することができる（Tsuji M, 2006）。さらに、植物脂質の存在下のアジュバント効果の可能性に加えて、植物Ｎ−グリカンが抗原提示細胞による糖タンパク質抗原の捕捉を促進する能力（Saint-Jore-Dupas, 2007）は、植物中のＶＬＰの産生で有利でありえる。
【００８９】
理論に束縛されるものではないが、植物で作製されたＶＬＰが他の産生／製造システムにおいて作製されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し、生全ウイルスワクチンまたは弱毒化全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応と比較した場合、植物で作製されたＶＬＰによって誘導された免疫反応がより強くなることが予想される。
【００９０】
全ウイルスから作製されたワクチンとは異なって、ＶＬＰは非感染性であり、したがって制限的な生物学的封じ込めは、感染性の全ウイルスを用いて作業するときほど重要な問題ではなく、産生には必要とされないので、ＶＬＰは有利である。植物で作製されたＶＬＰは、発現システムを温室または野外で生育させることを可能にし、したがって有意に経済的であることおよびスケールアップに適切であることによって、一層の利点をさらに提供する。
【００９１】
さらに、植物は、シアル酸残基の合成およびタンパク質への付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で産生することができ、植物中のＶＬＰ産生を保証するために、ＮＡを共発現する必要性、またはシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）により産生する細胞または抽出物を処理する必要性はない。
【００９２】
特に、本発明に従って産生されたＶＬＰは、ＲＮＡを結合することが公知であるＭ１タンパク質を含まない。ＲＮＡはＶＬＰ調製物の混入物であり、ヒトワクチンとしての使用のためのＶＬＰ産物についての規制認可を得るときには所望されない。
【００９３】
５−核酸
本発明は、シアル化しない宿主生物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００９４】
本発明は、宿主発現ベクターの中へのＨＡ（例えばヒトインフルエンザＡウイルスＨＡであるが、これらに限定されない）をコードする核酸のクローニング、およびワクチン産生のために適切な宿主からのインフルエンザＶＬＰの製造を記載するが、これらに限定されない。ＶＬＰは、形質転換された宿主細胞（例えば植物細胞または昆虫細胞）中で、機能的および免疫原的に同型の巨大分子性タンパク質構造（インフルエンザサブウイルス粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む）へと自己集合する組換えインフルエンザ構造タンパク質からなる試薬を産生するためにも使用することができる。
【００９５】
本発明は、ヌクレオチド配列のＨ１（配列番号：１によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：７によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：８によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：９によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１０によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：１５によってコードされる）およびＨ１６（配列番号：１６によってコードされる）も含む。
【００９６】
特に、本発明は、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをそれぞれコードするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７；ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをコードする核酸にそれぞれハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７；またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをそれぞれコードする核酸の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７を含み；ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
【００９７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは当技術分野において公知である。（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、１９９５年およびサプリメント；Maniatis et al.、Molecular Cloning （A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社、１９８２年；Sambrook and Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版２００１年を参照；その各々は参照として本明細書に組み込まれる）。１つのかかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃の４×ＳＳＣ中で約１６〜２０時間のハイブリダイゼーション、続いて６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１時間の洗浄、または６５℃の０．１×ＳＳＣ中で各々２０分間または３０分間の２回の洗浄でありえる。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で一晩（１６〜２０時間）、続いて６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１時間の洗浄、または６５℃の０．１×ＳＳＣ中で各々２０分間もしくは３０分間または一晩（１６〜２０時間）２回の洗浄、または６５℃でＣｈｕｒｃｈ水性リン酸緩衝液（７％ ＳＤＳ；０．５Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中でハイブリダイゼーション、そして５０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で各々２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、または６５℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で各々２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄でありえる。
【００９８】
さらに、本発明は、Ｈ１（配列番号：１）、Ｈ５（配列番号：５）またはＨ７（配列番号：７）からのＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
【００９９】
配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されたものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定することができる（例えば以下のパラメーターを使用するが、これらに限定されない：ギャップペナルティ５、トップダイアゴナル数５、固定ギャップペナルティ１０、ｋ−タプル２、フローティングギャップ１０およびウィンドサイズ５）。しかしながら、比較のための配列のアライメントの他の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444)のアルゴリズムであり、これらのアルゴリズムのコンピューターによる遂行（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）によって、または手動アライメントおよび目視検査によって行われるものである。
【０１００】
したがって、本発明は、安定的発現システムまたは一過性発現システムによる使用に適切なキメラコンストラクトを含む適切なベクターをさらに含む。遺伝情報は１つまたは複数のコンストラクト内でも提供することができる。例えば、対象となるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を１つのコンストラクト中に導入し、対象となるタンパク質の糖鎖付加を修飾するタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列は個別のコンストラクトを使用して導入することができる。次いで、これらのヌクレオチド配列を宿主内で共発現させることができる。しかしながら、対象となるタンパク質および対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質の両方をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトも使用することができる。この事例において、ヌクレオチド配列は、対象となるプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結されたタンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の配列、および対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２の配列（第２の配列はプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結される）を含むだろう。
【０１０１】
「共発現される」によって、宿主内でおよそ同じ時間で、および宿主の同じ組織内で２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が発現されることが意味される。しかしながら、ヌクレオチド配列が正確に同じ時間で発現される必要はない。むしろ、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は、コードされた産物が相互作用する機会を有するような様式で発現される。例えば、対象となるタンパク質の糖鎖付加を修飾するタンパク質は、対象となるタンパク質の糖鎖付加の修飾が行われるように、対象となるタンパク質が発現される期間の前にまたはその間に発現させることができる。２つまたはそれ以上の配列の両方の配列が発現されるという条件下でおよそ同じ時間で宿主内で導入される場合には、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は一過性発現システムを使用して共発現させることができる。あるいは、ヌクレオチド配列のうちの１つ（例えば対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする配列）を含むプラットフォーム宿主は、一過性様式にまたは安定的様式で、対象となるタンパク質をコードする追加の配列により形質転換することができる。この事例において、対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする配列は、所望される発生ステージの間に所望される組織内で発現させることができるか、またはその発現は誘導可能プロモーターを使用して誘導することができ、対象となるタンパク質を、コードする追加の配列を類似する条件下でおよび同じ組織で発現させて、ヌクレオチド配列が共発現されることを保証することができる。
【０１０２】
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して、植物細胞へと導入することができる。かかる技術の総説については、例えば、Weissbach and Weissbach、Methods for Plant Molecular Biology、アカデミー・プレス（Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨークＶＩＩＩ、ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Geierson and Corey、Plant Molecular Biology、第２版（１９８８）；およびPlant Metabolism中のMiki and Iyer、Fundamentals of Gene Transfer in Plants.、第２版DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell（編）、アディソン・ウェズリー・ラングマン社（Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ．）ロンドン、ｐｐ．５６１−５７９（１９９７）を参照。他の方法は、直接的ＤＮＡ取込、リポソームの使用、エレクトロポレーション（例えばプロトプラストを使用して）、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、およびバキュームインフィルトレーションを含む。例えば、Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991)、Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991)、Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987)、Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987)、Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)；Howell et al. (Science 208: 1265, 1980)、Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)、DeBlock et al. (Plant Physiology 91: 694-701, 1989)、Methods for Plant Molecular Biology（Weissbach and Weissbach編、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、１９８８年）、Methods in Plant Molecular Biology（Schuler and Zielinski編、アカデミックプレス社、１９８９年）、Liu and Lomonossoff(J. Virol Meth, 105:343-348, 2002)、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；および第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日に出願された米国特許出願シリアル番号０８／４３８，６６６、および１９９２年９月２５日に出願された米国特許出願シリアル番号０７／９５１，７１５を参照（そのすべては参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０３】
「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモーター」によって、典型的には遺伝子のタンパク質コード領域の上流であるが必ずしもそうではない核酸の一部が意味され、それはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなることができる。調節領域に活性があり、対象となる遺伝子と作動可能に会合しているかまたは作動可能に連結される場合、これは対象となる遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介することができるか、または発生的遺伝子活性化または時間的遺伝子活性化を制御することができる。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基底プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答する誘導可能エレメント、負の調節エレメントなどのプロモーター活性を媒介するエレメントまたは転写エンハンサーを含む。「調節領域」は、本明細書において使用される時、転写の後に活性のあるエレメント、例えば、翻訳および転写のエンハンサー、翻訳および転写のリプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性デターミナントなどの遺伝子発現を修飾する調節エレメントも含む。これらの後者エレメントのいくつかのものは、コード領域に近くに位置することができる。
【０１０４】
本開示の文脈において、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、典型的には構造遺伝子のコード配列に対して通常上流（５’）であるが必ずしもそうではないＤＮＡの配列を指し、それはＲＮＡポリメラーゼおよび／または特定の部位での転写の開始に必要とされる他の因子のための認識を提供することによって、コード領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内、または配列の３’に位置する他のヌクレオチド配列も、対象となるコード領域の発現の調節に寄与できることを理解すべきである。特定の部位での開始を保証するためにＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。大部分であるがすべてではない真核生物プロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス（通常、転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基対からなる保存された核酸配列）を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基底プロモーターエレメントに加えて、遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント（上でリストされるような）を含む。
【０１０５】
発生的に調節されるもの、誘導可能なもの、または構成的なものを含むいくつかのタイプの調節領域がある。発生的に調節される調節領域、またはその制御下で遺伝子の差異的な発現を制御する調節領域は、その器官または組織の発生の間の特異的時間で特定の器官または器官の組織内で活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特異的発生段階の特定の器官または組織内で優先的に活性があってもよく、それらは、植物内の他の器官または組織で発生的に調節される様式でも、または基底レベルででも同様に活性があってもよい。例えば、組織特異的調節領域の実例は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む特異的調節領域を参照（Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130）。葉特異的プロモーターの一例は、プラストシアニンプロモーターを含む（図３；ＵＳ７，１２５，９７８、参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０６】
誘導可能調節領域は、インデューサーに応答して１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。インデューサーの非存在下において、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。典型的には、転写を活性化するために誘導可能調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は不活性形態で存在し、次いでそれはインデューサーによって直接または間接的に活性形態に変換される。しかしながら、タンパク質因子も存在しなくてもよい。ンデューサーは、タンパク質、代謝物質、増殖調節因子、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学薬剤、または熱、寒冷、塩もしくは有毒物質によって直接、またはウイルスなどの病原菌もしくは病原体の作用を介して間接的に、課された生理的ストレスでありえる。誘導可能調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、潅水、加熱または類似する方法によってなど、細胞または植物にインデューサーを外部的に適用することによって、インデューサーに曝露することができる。誘導可能調節エレメントは植物遺伝子または非植物遺伝子のいずれかに由来しうる（例えGatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358；参照として組み込まれる）。可能性のある誘導可能プロモーターの実例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108；参照として組み込まれる）、ステロイド誘導可能プロモーター（Aoyama, T. and Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404；参照として組み込まれる）およびエタノール誘導可能プロモーター（Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132；Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180、参照として組み込まれる）、サイトカイニン誘導可能なＩＢ６遺伝子およびＣＫＩ１遺伝子（Brandstatter, I. and Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019；Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985；参照として組み込まれる）ならびにオーキシン誘導可能エレメント、ＤＲ５（Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971；参照として組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
構成的調節領域は、植物の様々な部分にわたって、および植物発生の全体にわたって連続的に遺伝子の発現を指令する。公知の構成的調節エレメントの実例は、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物（Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812）、コメのアクチン１遺伝子（Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165）、アクチン２遺伝子（An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121）、またはｔｍｓ ２遺伝子（Ｕ．Ｓ．５，４２８，１４７、参照として本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467）、トウモロコシのユビキチン１遺伝子（Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、シロイヌナズナのユビキチン１および６遺伝子（Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、ならびにタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004）と結合したプロモーターを含む。本明細書において使用される時「構成的」という用語は、構成的調節領域の制御下で遺伝子がすべての細胞タイプにおいて同じレベルで発現することを必ずしも示さないが、存在量の変動はしばしば観察されても遺伝子が広範囲の細胞タイプにおいて発現することを示す。
【０１０８】
「作動可能に連結された」によって、特定の配列（例えば調節エレメントおよび対象となるコード領域）が、遺伝子発現の媒介または修飾などの意図された機能を実行するために直接または間接的に相互作用することが意味される。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介されうる。
【０１０９】
本発明の１つまたは複数のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、またはコンストラクト、またはベクターによって形質転換される任意の適切な植物宿主において発現することができる。適切な宿主の実例は、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属の種、トウモロコシ、タバコ属の種、アルファルファ、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、カラスムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタおよび同種のものを含む農作物を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝子コンストラクトは、３’非翻訳領域をさらに含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡの前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラックの追加をもたらすことによって通常特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルは、変動がないわけではないが、カノニカル形態５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって一般に認識される。本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝子コンストラクトは、エンハンサー（翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれか）も必要に応じてさらに含むことができる。これらのエンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含むことができる。完全な配列の翻訳を保証するために、開始コドンはコード配列のリーディングフレームと同調しなくてはならない。
【０１１１】
適切な３’領域の非限定例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウムの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、ならびにダイズ貯蔵タンパク質遺伝子およびリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）遺伝子などの植物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写される非翻訳領域、ならびにプラストシアニン発現調節に使用されるプロモーター（Pwee and Gray 1993；参照として本明細書に組み込まれる）である。プラストシアニンプロモーターの一例は、ＵＳ７，１２５，９７８（参照として本明細書に組み込まれる）中で記載される。
【０１１２】
本明細書において記載されるように、葉発現において実証された効率を持つエンハンサー配列を含むプロモーターは一過性発現に効果的であることが見出されてきた。理論に束縛されるものではないが、核マトリックスへの付着による光合成の遺伝子の上流調節エレメントの付着は、強い発現を媒介することができる。例えば、エンドウのプラストシアニン遺伝子の翻訳開始部位から−７８４までは、強いレポーター遺伝子発現を媒介するために使用することができる。
【０１１３】
光合成の遺伝子からの調節領域（例えば、プラストシアニン調節領域（ＵＳ７，１２５，９７８；参照として本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Leutwiler et a; 1986；参照として本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と会合するStockhaus et al.1989；参照として本明細書に組み込まれる）から得られた調節領域であるが、これらに限定されない）の使用は本発明に従って使用することができる。
【０１１４】
形質転換された植物細胞の同定を支援するために、本発明のコンストラクトは植物選択マーカーを含んでいるようにさらに操作することができる。有用な選択マーカーは、抗生物質（例えばゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン）または除草剤（ホスフィノトリシン、グリフォサート、クロロスルフロンおよび同種のものなど）などの化学物質に対する耐性を提供する酵素を含む。同様に、色変化（ＧＵＳ（β‐グルクロニダーゼ）など）または発光（ルシフェラーゼまたはＧＦＰなど）によって識別可能な化合物の産生を提供する酵素を使用することができる。
【０１１５】
これらの遺伝子のもたらされたｃＤＮＡコピーは、宿主発現システムによって要求されるような適切な発現ベクター中でクローン化することができる。あるいは、植物に適切な発現ベクターの実例は、以下に記載されるバキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）社）であり、公知の方法を使用して、および製造者の使用説明書によって提供された情報を使用して、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミドがもたらされる。
【０１１６】
本発明は、上記されるように、植物中で作動可能な調節エレメントに作動可能に連結されたＨＡをコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトをさらに指向する。植物細胞中で作動可能な調節エレメントおよび本発明に従って使用することができるものの実例は、プラストシアニン調節領域（ＵＳ７，１２５，９７８；参照として本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Leutwiler et al; 1986；参照として本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と会合する、Stockhaus et al. 1989；参照として本明細書に組み込まれる）から得られる調節領域を含むが、これらに限定されない。コンストラクトが昆虫細胞中で発現されるならば、昆虫細胞中で作動可能な調節エレメントの実例は、ポリヘドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター、ｇｐ６４プロモーターおよび同種のものを含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明は、ＨＡ（例えば、ヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５ウイルスＨＡ（Ｈ５Ｎ１）であるが、これらに限定されない）をコードする核酸の植物、酵母または昆虫の発現ベクター（例えばバキュロウイルス発現ベクター）へのクローニング、および形質転換された植物細胞または形質転換された昆虫細胞中で、機能的および免疫原的に同型の巨大分子性タンパク質構造（インフルエンザサブウイルス粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む）へと自己集合する組換えインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチンの候補または試薬の産生をさらに提供する。
【０１１８】
ＨＡをコードする核酸、例えば、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ遺伝子、またはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５ウイルスＨＡ遺伝子であるが、これらに限定されないものを、適切な細胞株、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えばＳｆ−９細胞株；ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４０４７）中で、例えば、バキュロウイルス発現システムを使用して、発現させることができる。他の昆虫細胞株も使用することができる。
【０１１９】
ＨＡをコードする核酸は、代わって、植物細胞または植物中で発現させることができる。ＨＡをコードする核酸は、ＨＡ ＲＮＡを使用する逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成することができる。一例として、ＲＮＡは、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスもしくはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスから、またはインフルエンザウイルスに感染させた細胞から単離することができる。逆転写およびＰＣＲのために、ＨＡ ＲＮＡ（例えば、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ遺伝子またはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスＨＡ０遺伝子であるが、これらに限定されないもの）に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。さらに、ＨＡをコードする核酸は、当業者に公知であるような方法を使用して、化学的に合成することができる。
【０１２０】
６−タンパク質
本発明は、ヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７（Ｈ１、Ｈ５またはＨ７からのＨＡをそれぞれコードする）、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをコードする核酸にそれぞれハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをそれぞれコードする核酸の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７によってコードされる１つまたは複数のＨＡタンパク質も含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。
【０１２１】
同様に、本発明は、以下の亜型Ｈ１（配列番号：１によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：７によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：８によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：９によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１０によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：１５によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号：１６によってコードされる）と関連するＨＡ；およびＨ１（配列番号：１）、Ｈ２（配列番号：２）、Ｈ３（配列番号：３）、Ｈ４（配列番号：４）、Ｈ５（配列番号：５）、Ｈ６（配列番号：６）、Ｈ７（配列番号：７）、Ｈ８（配列番号：８）、Ｈ９（配列番号：９）、Ｈ１０（配列番号：１０）、Ｈ１１（配列番号：１１）、Ｈ１２（配列番号：１２）、Ｈ１３（配列番号：１３）、Ｈ１４（配列番号：１４）、Ｈ１５（配列番号：１５）、Ｈ１６（配列番号：１６）と約６０乃至１００％もしくはその間の任意の量の配列同一性、特に約７０乃至１００％の相同性もしくはその間の任意の量、８０乃至１００％もしくはその間の任意の量、９０〜１００％もしくはその間の任意の量、または９５〜１００％もしくはその間の任意の量の配列同一性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
【０１２２】
７−ＶＬＰ
したがって、本発明は１つまたは複数のＨＡ型または亜型を含むＶＬＰに関する。
【０１２３】
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）、または「複数のウイルス様粒子」もしくは「複数のＶＬＰ」という用語は、自己集合し、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰは一般的には、感染中に産生されるビリオンに形態学的および抗原的に類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠損し、したがって非感染性である。いくつかの実例において、ＶＬＰは単一のタンパク質種、または１つ以上のタンパク種を含むことができる。１つ以上のタンパク種を含むＶＬＰについては、タンパク種はウイルスの同じ種からでありえるか、またはウイルスの異なる種、属、亜科または科（ＩＣＴＶ命名法によって表記されるように）からのタンパク質を含むことができる。他の実例において、ＶＬＰを含む１つまたは複数のタンパク種は、天然に存在する配列から修飾されてもよい。ＶＬＰは植物宿主細胞および昆虫宿主細胞を含む適切な宿主細胞中で産生することができる。宿主細胞からの抽出に続いて、そして適切な条件下での単離およびさらなる精製に際して、ＶＬＰはインタクトな構造として精製することができる。
【０１２４】
本発明は、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得る、インフルエンザに由来するＶＬＰも含むが、これらに限定されない。例えば、ＶＬＰが植物をベースのシステム中で発現されるならば、ＶＬＰは細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得ることができる。
【０１２５】
一般的には、「脂質」という用語は、脂溶性（親油性）で天然に存在する分子を指す。この用語は、より具体的には、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリドならびにリン脂質を含む）に加えて、他の脂溶性のステロール含有代謝物質またはステロールを指すのにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロールおよびタンパク質と共に、すべての生体膜の主要な成分である。リン脂質の実例は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、および同種のものを含む。ステロールの実例は、動物性ステロール（例えばコレステロール）および植物性ステロールを含む。２００以上の植物性ステロールが様々な植物種において同定され、最も一般的なものは、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラジカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはβ−シトステロールである。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞、または細胞が得られる生物の培養または増殖の条件に応じて変動しうる。
【０１２６】
細胞膜は一般的には、様々な機能のために、脂質二重層に加えてタンパク質を含む。特定の脂質の局所的な濃縮は、「脂質ラフト」と呼ばれて、脂質二重層において見出すことができる。理論に束縛されるものではないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染因子の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックスなどの細胞または生物の他の構造成分との相互作用における有意な役割を有することができる。
【０１２７】
本発明に従ってインフルエンザに由来するタンパク質から産生されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質はＶＬＰ調製物の混入物であるＲＮＡを結合すること（Wakefield and Brownlee, 1989）が公知である。ＶＬＰ産物についての規制認可を得るときにＲＮＡの存在は所望されず、したがってＲＮＡを欠損するＶＬＰ調製物は有利であろう。
【０１２８】
本発明のいくつかの態様に従う植物中で産生されたＶＬＰは、植物に由来する脂質と複合体を形成することができる。ＶＬＰはＨＡ０、ＨＡ１もしくはＨＡ２ペプチドまたはその組合せを含むことができる。植物に由来する脂質は、脂質二重層形態であり、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含むことができる。植物に由来する脂質は、ＶＬＰが産生される植物の原形質膜の脂質成分、および例えば１つまたは複数の植物由来脂質（ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質または植物性ステロールまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない）を含むことができる。植物に由来する脂質は「植物脂質」とも呼ぶことができる。
【０１２９】
植物において、インフルエンザＶＬＰは原形質膜から出芽し、したがってＶＬＰの脂質組成はそれらの起原を反映する。本発明に従って産生されたＶＬＰは、植物に由来する脂質と複合体を形成したＨＡを含む。植物脂質は特異的免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を促進することができる。植物膜は脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から構成されており、スフィンゴ糖脂質、サポニンおよび植物性ステロールも含有する。さらに、脂質ラフトも植物原形質膜に見出され、これらのマイクロドメインはスフィンゴ脂質およびステロールに富んでいる。植物において、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む、様々な植物性ステロールが存在することが公知である（Mongrand et al., 2004）。
【０１３０】
スフィンゴ糖脂質に加えて、ＰＣおよびＰＥは、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに胸腺および肝臓中のＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞などの哺乳類の免疫細胞によって発現されたＣＤ１分子と結合することができる（Tsuji M,. 2006）。ＣＤ１分子はクラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に構造的に類似しており、それらの役割はＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）に対して糖脂質抗原を提示することである。活性化に際して、ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞および樹状細胞などの先天性免疫細胞を活性化し、抗体を産生するＢ細胞およびＴ細胞のような適応免疫細胞も活性化する。
【０１３１】
様々な植物性ステロールを原形質膜に見出すことができ、特異的相補物は、種、生育条件、栄養素源または病原体状態（いくつかの因子が挙げられる）に応じて変動してもよい。一般的には、β−シトステロールは最も多量にある植物性ステロールである。
【０１３２】
原形質膜由来エンベロープなどの脂質二重層と複合体を形成したインフルエンザＶＬＰにおいて提示された植物性ステロールは、有利なワクチン組成物を提供することができる。理論に束縛されるものではないが、原形質膜由来エンベロープなどの脂質二重層と複合体を形成した植物で作製されたＶＬＰは、他の発現システム中で作製されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し、生または弱毒化された全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応に類似する。
【０１３３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、植物に由来する脂質二重層と複合体を形成したＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態において、植物に由来する脂質二重層は、ＶＬＰのエンベロープを構成することができる。
【０１３４】
８−組成物
したがって、本発明は、効果的な用量のＶＬＰ（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５インドネシアでありえる。さらに、インフルエンザウイルス感染に対する被験体の免疫を誘導する方法が提供される。方法は、ウイルス様粒子（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を投与することを含む。ウイルス様粒子は、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で被験体に投与することができる。
【０１３５】
９−治療の方法
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する免疫、または「免疫応答の誘発」を被験体において誘導する方法であって、本明細書において定義されるような組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１３６】
「免疫応答」は、一般的には適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は一般的には液性応答および細胞媒介性応答を含む。液性応答は、Ｂリンパ球系列（Ｂ細胞）の細胞において産生される分泌抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌抗体は、侵入微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面上の抗原に結合し、抗体は破壊のために微生物に目印を付ける。液性免疫は、一般的には、抗体産生およびそれに伴うプロセスに加えて、抗体のエフェクター機能（Ｔｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生、メモリー細胞生成、ファゴサイトーシスのオプソニン促進、病原菌除去および同種のものを含む）を指すために使用される。
【０１３７】
細胞媒介性応答は、抗体を含まないが、むしろマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および抗原に応答した様々なサイトカインの放出を含む免疫応答である。細胞媒介性免疫は、一般的に、何らかのＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化およびＴ細胞媒介性応答を指すために使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染への応答において特に重要である。
【０１３８】
本発明の組換えＨＡ ＶＬＰは、ワクチンを補足してそれらをより効果的にし、必要な投与量を減少させるために、既存のインフルエンザワクチンと併用して使用することができる。当業者に公知であるように、ワクチンは１つまたは複数のインフルエンザウイルスに対して指向することができる。適切なワクチンの実例は，サノフィ・パスツール（Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ）社、ＩＤ・バイオメディカル（ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）社、メリアル（Ｍｅｒｉａｌ）社、シノバック（Ｓｉｎｏｖａｃ）社、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）社、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社、メディミューン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）社、グラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）社、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）社、サノフィ・アベンティス（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）社、セローノ（Ｓｅｒｏｎｏ）社、シレ・ファーマシューティカルズ（Ｓｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社および同種のものから商業的に入手可能なものを含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
所望されるならば、本発明のＶＬＰは、当業者に公知であるような適切なアジュバントと混合することができる。さらに、ＶＬＰは、上で定義されるように標的生物の処置に効果的な用量のＶＬＰを含むワクチン組成物中で使用することができる。さらに、本発明に従って産生されたＶＬＰは、異なるインフルエンザタンパク質（例えばノイラミニダーゼ（ＮＡ））を使用して得られるＶＬＰと組み合わせることができる。
【０１４０】
したがって、本発明は、１つまたは複数のＶＬＰを含むワクチンの効果的な用量を投与することを含む、動物または標的生物中でインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法を提供する。ワクチンは、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で投与することができる。
【０１４１】
図６および７中で示されるように、インビトロの分析は、変異させたＡ／インドネシア／５／０５ Ｈ５ ＶＬＰ、ならびにＡ／ベトナム／１２０３／０４；Ａ／アンホイ／１／０５およびＡ／トルコ／５８２／０６などの他のインフルエンザ株（すべてＨ５Ｎ１株）に対して作製された抗体の交差反応性を示すが、検査されたＨ１Ｎ１に対してのみより低い赤血球凝集反応性を示す（図７）。
【０１４２】
重要なことに、変異させたＨ５Ｎ１（糖鎖が付加されないＨ５タンパク質）の単一投薬後に産生された抗体は、１４日後に試験されたすべてのＨ５株に対して、野生型Ｈ５に対して産生された抗体よりもより高い応答を誘導し、この糖鎖が付加されなかった免疫原は野生型ものよりも迅速な応答を提供できることを示した。
【０１４３】
したがって、これらのデータは、Ｎ結合型炭水化物を欠く変異させたＨ５赤血球凝集素ウイルスタンパク質を含む、植物で作製されたインフルエンザＶＬＰは、病原性インフルエンザ株に特異的免疫応答を誘導し、この応答が交差反応性であり、１回の単一投薬後に迅速に起こることを実証する。
【０１４４】
１０−被験体
本発明のＶＬＰを投与することができる被験体または標的生物の実例は、ヒトおよび霊長類、トリ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、シチメンチョウ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウマ科の動物、ウマ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモットまたは他のげっ歯類、アザラシ、クジラ、および同種のものを含むが、これらに限定されないかかる標的生物は例示的であり、本発明の適用および使用に対して限定して判断されるべきではない。
【０１４５】
本発明は、他の哺乳類または宿主動物、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ、鳥類、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、シチメンチョウ、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラ、および同種のものに感染するインフルエンザウイルスにも関する。
【０１４６】
特に、上で定義されるような方法によって治療される被験体は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、イヌ、ネコ、フェレット、家畜および同種のものを含む群から選択することができる。特に、被験体は、ヒト患者またはトリ一般（水鳥、渡り鳥、家禽（ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリなどの）を含む）、特に渡り鳥またはヒトの消費のための家禽（ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリ）でありえる。より詳細には、被験体はヒトである。
【０１４７】
１１−容器、シリンジおよびキットなど
本発明は、本明細書において定義されるような組成物を含む容器も提供する。特に、容器は単一単位用量、または防腐剤を含む複数投与量形態を含有する。より詳細には、容器は、本明細書において定義されるような組成物またはワクチンにより充填済みの「使用のために準備済み」のシリンジである。
【０１４８】
より詳細には、本発明は、本明細書において定義されるようなワクチンまたは組成物を含む容器、および前記組成物／ワクチンの使用／投与方法の説明書を含むキットも提供する。
【０１４９】
本発明はここで以下の非限定例を単なる参照として詳細に記載される。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
材料および方法
１．変異させ糖鎖付加のないＨ５を得るためのＡ／インドネシア／５／０５（配列番号：１７）からの野生型Ｈ５の変異。
三重変異体は、野生型ＨＡの球状頭部に位置する糖鎖付加部位のＮ１５４、Ｎ１６５およびＮ２８６の除去によって、より具体的には糖鎖付加配列パターンＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓ中にあるＴｈｒまたはＳｅｒのＡｌａ残基による置換によって作製された。したがって、三重変異体は以下の３つのアミノ酸置換を含有する。Ｔ１５６Ａ、Ｔ１６７ＡおよびＳ２８８Ａ（開始の配列番号：１７に従って番号付けした）。３つのアミノ酸置換は、鋳型として野生型ＨＡ発現ベクター（６６０コンストラクト、図４）を使用して、Darveau et al. (1995)中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション方法によって行なわれた。
【０１５１】
簡潔には、以下の３つのＰＣＲ増幅を、異なる３ペアのプライマーにより鋳型として６６０ ｐＣＡＭＢＩＡ発現ベクターで平行して行った。
１）Ｐｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：１８）およびＨＡ５−Ｔ１５６Ａ．ｒ（配列番号：１９）；
２）ＨＡ５−Ｔ１６７Ａ．Ｃ（配列番号：２０）およびＨＡ５−Ｓ２８８Ａ．ｒ（配列番号：２１）；ならびに
３）ＨＡ５−Ｓ２８８Ａ．Ｃ（配列番号：２２）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号：２３）。
【０１５２】
３つの反応から得た増幅産物をともに混合し、プライマーとしてＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：１８）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：２３）を使用して、第４の反応（組み立て反応）のための鋳型として混合物を使った。もたらされた断片をＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中に位置する）およびＳａｃＩ（断片の３’末端にある）により消化し、事前に同じ酵素により消化したｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏの中にクローン化した。６８０と命名したもたらされたプラスミドを図５中に示す（配列番号：２９）。
【０１５３】
２．発現カセットの組み立て
すべての操作は、Sambrook and Russell（２００１；参照として本明細書に組み込まれる）の一般的な分子生物学プロトコールを使用して実行した。第１のクローニング工程は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の上流調節エレメントおよび下流調節エレメントを含有する受容体プラスミドを組み立てることであった。プラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ配列は、オリゴヌクレオチドプライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃ（配列番号：２４）およびＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒ（配列番号：２５）を使用して、アルファルファゲノムＤＮＡから増幅した。もたらされた増幅産物をＸｍａＩおよびＳａｃＩにより消化し、事前に同じ酵素により消化したｐＣＡＭＢＩＡ２３００（キャンビア（Ｃａｍｂｉａ）社、キャンベラ、オーストラリア）の中へライゲーションして、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏ Ｐｌａｓｔｏを生成した。同様に、プラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲ配列およびターミネーターは、プライマーのＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃ（配列番号：２６）およびＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒ（配列番号：２７）を使用してアルファルファゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏの同じ部位の中へ挿入する前にＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩにより産物を消化して、ｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏを生成した。
【０１５４】
３．Ｈ５発現カセットの組み立て
インフルエンザ株Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１；アクセッション番号ＬＡＮＬ ＩＳＤＮ１２５８７３）からの赤血球凝集素をコードする断片は、エポック・バイオラボ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ）社（シュガーランド、テキサス、アメリカ）によって合成された。最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドを含む完全なＨ５コード領域（配列番号：１７）およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含有する、産生された断片を、配列番号：２８（および変異体Ｈ５の事例においては配列番号：２９）中で提示する。Ｈ５コード領域を、Darveau et al. (1995)中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってプラストシアニンベースの発現カセットの中へクローン化した。簡潔には、第１のＰＣＲ増幅物を、プライマーのＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：３０）およびＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号：３１）、ならびに鋳型としてｐＣＡＭＢＩＡ ｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏを使用して得た。平行して、鋳型としてＨ５コード断片、プライマーのＰｌａｓｔｏ−ＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃ（配列番号：６）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：３２）を用いて、第２の増幅を行った。両方の反応から得た増幅をともに混合し、プライマーとしてＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：３３）を使用し、混合物を鋳型として、第３の反応（組み立て反応）を行った。たらされた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中の）およびＳａｃＩ（断片の３’末端で）で消化し、事前に同じ酵素で消化したｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏの中へクローン化した。６６０と命名したもたらされたプラスミドを図５中で提示するが、「変異させた」Ｈ５タンパク質からもたらされたプラスミドは６８０と命名する。
【０１５５】
Hamilton et al. (2002)中で記載されるように、ＨｃＰｒｏコンストラクト（３５ＨｃＰｒｏ）を調製した。すべてクローンをコンストラクトの全体性を確認するために配列決定した。プラスミドを使用して、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＧＬ１；ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア２０１０８、アメリカ）を形質転換した（Mattanovich et al., 1989）。すべてのＡ．ツメファシエンス株の全体性を制限マッピングによって確認した。
【０１５６】
４．植物バイオマスの調製、接種物、アグロインフィルトレーションおよび収穫
植物のニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を、市販のピートモス基質で満たした低地において種子から育てた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。種まきの３週間後に、個別の苗木を選び、ポットに移植し、同じ環境条件下の温室中でさらに３週間成長させた。形質転換前に、頂芽および腋芽を、植物から芽をはさむことによってまたは化学的に植物を処理することによってのいずれかで、様々な時間で以下に示すように除去した。
【０１５７】
プラスミド６６０またはプラスミド６８０によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、それらが０．６乃至１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６により補足されたＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁物を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６））中で再懸濁した。Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348)によって記載されるように、シリンジインフィルトレーションを行った。バキュームインフィルトレーションのために、Ａ．ツメファシエンス懸濁物を遠心分離し、インフィルトレーション培地中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。ニコチアナ・ベンサミアナの全植物体を、２０〜４０トルの真空下で気密性ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中で転倒させて２分間置いた。シリンジインフィルトレーションまたはバキュームインフィルトレーションに続いて、収穫までの４〜５日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。
【０１５８】
５．葉サンプリングおよび全タンパク質抽出
インキュベーションに続いて、植物の地上構造の部分を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。冷却した５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドの３体積中で、凍結破砕した各々の植物材料のサンプルをホモジナイズ（ポリトロン）することによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で２０分間２０，０００ｇで遠心分離し、清澄化した粗抽出物（上清）を分析のために保存した。清澄化した粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード分析（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、ヘラクレス、カリフォルニア）によって決定した。
【０１５９】
６．タンパク質分析およびイムノブロット
タンパク質濃度はＢＣＡプロテインアッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）（ピアース・バイオケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社ロックポート、イリノイ）によって決定した。タンパク質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーにより染色した。染色したゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用してデンシトメトリー解析を行った。
【０１６０】
ＳＥＣからの溶出画分からのタンパク質をアセトンにより沈殿させ（Bollag et al., 1996）、１／５体積の平衡／溶出緩衝液中で再懸濁し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ロッシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、インディアナポリス、インディアナ）上に電気的に転写した。イムノブロット前に、膜は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン２０により４℃で１６〜１８時間ブロックした。
【０１６１】
イムノブロットは以下の抗体を用いたインキュベーションによって行った。Ｈ１の検出については、マウス抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、コンコード、マサチューセッツ、アメリカ、カタログ番号１０−１５０）（ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で２μｇ／ｍｌ）、およびＨ５の検出については、ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１／４０００に希釈したウサギ抗Ｈ５（ベトナム）抗体（イミューン・テクノロジー（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、ウッドサイド、ニューヨーク、アメリカ）、カタログ番号ＩＴ−００３−００５Ｖ）。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ウエストグローブ、ペンシルバニア、アメリカ、カタログ番号１１５−０３５−１４６）（ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１／１２０００に希釈した）を、二次抗体として使用した。免疫反応性複合体を化学発光によって検出した（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）。ヒトＩｇＧ抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素へのコンジュゲーションは、ＥＺ−リンクプラス（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ）（登録商標）アクティベーティッドペルオキシダーゼコンジュゲーションキット（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ピアース社、ロックフォード、イリノイ）の使用によって実行した。
【０１６２】
Ｈ５についての赤血球凝集分析はNayak and Reichl (2004)によって記載された方法に基づいた。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続的な２倍希釈を、１ウェルあたり１００μＬの希釈サンプルを残して、１００μＬのＰＢＳを含むＶ底の９６ウェルマイクロタイタープレート中で作製した。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁物（バイオ・リンク社（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．）、シラキュース、ニューヨーク）を各々のウェルに追加し、プレートを室温で２時間インキュベーションした。完全な赤血球凝集を示す最高希釈の逆数をＨＡ活性として記録した。平行して、組換えＨＡスタンダード（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（プロテイン・サイエンス社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、メリデン、コネチカット）をＰＢＳ中で希釈し、各々のプレートで対照として使用した。
【０１６３】
７．Ｈ５ ＶＬＰ精製
６６０または６８０をインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナの凍結葉を、市販のブレンダーを使用して、１．５体積の５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０４％メタ重亜硫酸ナトリウム中でホモジナイズした。生じた抽出物に１ｍＭ ＰＭＳＦを補足し、１Ｍ酢酸でｐＨ６に調節し、５分間４２℃で加熱した。ｐＨシフトおよび熱処理によって沈殿させた混入物を吸着するために珪藻土（ＤＥ）を熱処理した抽出物に追加し、スラリーをワットマンの濾紙を通して濾過した。生じた清澄化抽出物は残りのＤＥを除去するために室温で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．８／０．２μｍアクロパック（Ａｃｒｏｐａｃｋ）２０フィルターを通し、フェチュイン−アガロース親和性カラム（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ、アメリカ）上にロードした。４００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス（ｐＨ６）中での洗浄工程に続いて、結合タンパク質を１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）により溶出した。溶出されたＶＬＰは、０．０００５％（ｖ／ｖ）の最終濃度までツイーン８０で補足した。ＶＬＰを１００ｋＤａ分子量カットオフアミコンの膜で濃縮し、４℃で３０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．０１％ツイーン８０および０．０１％チメロサールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で再懸濁した。懸濁したＶＬＰを使用前にフィルター滅菌した。
【０１６４】
８．動物研究
インフルエンザＶＬＰ投与に対する免疫応答に関する試験を、６〜８週間齢のメスのウィスターラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社）により行った。１３匹のラットを、対照群について３匹、植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５野生型ワクチン（６６０）群および変異体ワクチン（６８０）群の両方について５匹の動物の３群へとランダムに分けた。８群を筋肉内免疫のために使用し、６群を鼻腔内経路の投与を試験するために使用した。すべての群は、２用量のレジメン（追加接種免疫は第１の免疫の１４日後に行われる）で免疫された。
【０１６５】
後肢中の筋肉内投与のために、麻酔をしていないラットを、植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５ワクチン（１５μｇ）、植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５変異型のワクチン、またはＰＢＳのいずれかで免疫した。
【０１６６】
すべての抗原調製物は、免疫の前に１：１体積比で、アルハイドロゲル（ミョウバン；アキュレイト・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストベリー、ニューヨーク、アメリカ）と１％の最終濃度に混合した。
【０１６７】
血液採取および脾臓採取
頚静脈血液採取を、麻酔した動物で第１の免疫の１４日後および第２の免疫の１４日後に行なった。８０００ｇで１０分間遠心分離することによって血清を採取した。
【０１６８】
第２の免疫の３週間後に、ＣＯ2ガスでラットを麻酔し、終了と同時に直ちに心臓穿刺を使用して血液を採取した。
【０１６９】
脾臓採取をラットで行った。採取された脾臓をゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ中に置き、１０ｍｌのシリンジからプランジャーにより５０ｍｌのコニカルチューブ中につぶした。つぶした脾臓を２回リンスし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＡＣＫ溶解緩衝液中に室温で５分間再懸濁した。脾細胞をＰＢＳ−ゲンタマイシン中で洗浄し、５％ＲＰＭＩ中に再懸濁し、カウントした。脾細胞を増殖分析のために使用した。
【０１７０】
抗体力価：
Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／アンホイ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ２）
血清の抗インフルエンザの抗体力価を、第１の免疫の１４日後に加えて、第２の免疫の２１日後（屠殺時）に測定した。力価は、コーティング抗原として非活性化ウイルスＡ／インドネシア／５／０５を使用する酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。終了点力価は、陰性対照サンプルのＯＤ値の少なくとも０．１以上のＯＤ値に達した最高希釈の逆数値として表現した。
【０１７１】
抗体クラス決定（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）のために、力価は以前に記載されるようにＥＬＩＳＡによって最終採血で評価された。
【０１７２】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価
血清の赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価は、以前に記載されるように第２の免疫の１４および３５日後に測定された（WHO 2002；Kendal 1982）。株Ａ／インドネシア／５／０５；Ａ／アンホイ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）またはＡ／ベトナム／１２０３／２００４からの非活性化ウイルス調製物を使用して、ＨＩ活性についてラット血清サンプルを試験した。血清は、コレラ菌から調製された受容体破壊酵素ＩＩ（ＲＤＥ ＩＩ）（デンカ生研社（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．）、東京、日本）で前処理した（Ｋｅｎｄａｌ １９８２）。ＨＩ分析は０．５％シチメンチョウ赤血球で行った。ＨＩ抗体力価は、凝集の完全阻害を引き起こす最高希釈の逆数として定義された。
【０１７３】
結果
野生型ＶＬＰまたは変異体ＶＬＰのいずれかにより免疫されたラットからの血清の反応性は、第１の免疫の１４日後（１４日目）または第２の免疫の１４日後（３５日目）に評価した。ラットは、すべてミョウバンと共に製剤化した１５μｇの抗原で免疫した。免疫反応性は、クレード１（Ａ／ベトナム／１２０３／０４）、クレード２．１（Ａ／インドネシア／５／０５）、クレード２．２（Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５）およびクレード２．３（Ａ／アンホイ／１／０５）のＨ５Ｎ１ウイルスに対して評価した。第１の投薬後に、変異体ＶＬＰは、検査されたすべてのＨ５Ｎ１株について野生型よりも高い抗体反応を誘導した（図６）。鳥類株Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５に対する免疫反応性は、第１の投薬後に統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。免疫反応性をＨ１Ｎ１ウイルス（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）に対しても評価し、追加接種注射後に免疫反応性を示した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１つの群あたり５匹のラットの終了点力価の逆数(reciprocal end-point titer)ＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を示す。＊野生型ＶＬＰと比較してｐ＜０．０５。
【０１７４】
野生型または変異体ＶＬＰにより免疫されたラットからのＨＩ力価は、第１の免疫の１４日後（１４日目）または第２の免疫の１４日後（３５日目）に評価した。ＨＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルスを使用して測定した。第１の免疫後に、変異体ＶＬＰは、検査されたすべてのＨ５Ｎ１ウイルスに対して野生型ＶＬＰよりも高いＨＩ抗体応答を誘導する（図７）。Ａ／インドネシア／５／０５およびＡ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５のインフルエンザ株については統計的有意性が達成された。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１つの群あたり５匹のラットの終了点力価の逆数ＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を示す。＊野生型ＶＬＰと比較してｐ＜０．０５。
【０１７５】
これらのデータは、「変異させた」糖鎖付加のないＨ５タンパク質が、広域スペクトルで迅速な活性のあるインフルエンザワクチンとして、ＶＬＰの産生のための天然のＨ５タンパク質に対する非常に興味深い代替物となることを強く示唆する。
【０１７６】
すべての引用は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本発明は１つまたは複数の特定の実施形態に関して記載された。しかしながら、請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなしに、多数の変形および修飾を行うことができることは当業者に明らかだろう。
【０１７８】
参考文献
【技術分野】
【０００１】
本発明はウイルス様粒子の産生に関する。より具体的には、本発明は、インフルエンザ抗原、特に他のインフルエンザ株との広範囲の交差反応性を有する修飾されたインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、呼吸系ウイルスに起因するヒトにおける代表的な死因である。一般的な病徴は熱、咽頭炎、息切れおよび筋肉痛を特に含む。インフルエンザシーズンの間に、インフルエンザウイルスは、世界中で集団の１０〜２０％に感染し、毎年２５０，０００〜５００，０００人の死亡をもたらす。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、感染した哺乳類細胞の原形質膜から出芽するエンベロープウイルスである。それらは、存在する核タンパク質およびマトリックスタンパク質抗原に基づいてＡ型、Ｂ型またはＣ型へと分類される。インフルエンザＡ型ウイルスは、表面の糖タンパク質が提示する赤血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の組み合わせに従って亜型へとさらに分類することができる。ＨＡは、ウイルスが宿主細胞に結合し浸透する能力を決定する。ＮＡは宿主細胞およびウイルス表面タンパク質上のグリカン鎖から末端シアル酸残基を除去し、それによりウイルス凝集を妨害し、ウイルス移動性を促進する。現在、１６個のＨＡ（Ｈ１〜Ｈ１６）および９個のＮＡ（Ｎ１〜Ｎ９）亜型が認識されている。各々のＡ型インフルエンザウイルスは１タイプのＨＡおよび１タイプのＮＡの糖タンパク質を提示する。一般的には、各々の亜型は種特異性を示し、例えば、すべてのＨＡおよびＮＡ亜型は鳥類に感染することが公知であるが、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ７のみがヒトに感染することが示されている（Horimoto 2006; Suzuki 2005）。Ｈ５、Ｈ７およびＨ９を含むインフルエンザウイルスはインフルエンザＡ型ウイルスの最も高病原性の形態と判断され、将来のパンデミックを引き起こす可能性が最も高い。
【０００４】
インフルエンザパンデミックは通常、高度に伝播性の毒性のインフルエンザウイルスによって引き起こされ、疾病および死亡のレベルの上昇を世界的にもたらしうる。新しいインフルエンザＡ亜型の出現は２０世紀中で４つの大きなパンデミックをもたらした。１９１８〜１９１９年のスペインかぜ（Ｈ１Ｎ１ウイルスによって引き起こされた）は、１９１７年から１９２０年の間に世界中で５０００万人以上の死亡をもたらした。現在、新しい亜型の出現のリスクまたは動物に固有の亜型のヒトに対する伝播のリスクは常に存在する。特に重要なものは鳥類インフルエンザ（「トリインフルエンザ」とも呼ばれる）の高度に毒性の形態であり、大発生が世界中のいくつかの国で報告されている。多くの事例において、このトリインフルエンザは４８時間以内に１００％に近い死亡率をもたらしうる。最初に１９９７年に香港で同定された鳥類インフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）の他のアジア諸国およびヨーロッパへの広がりは、野鳥の移動パターンに関連することが提唱されている。
【０００５】
ヒトのインフルエンザに対抗する現行の方法は毎年のワクチン接種による。ワクチンは通常、次の「インフルエンザシーズン」で優勢株と予測されるいくつかの株の組み合わせである。この予測は世界保健機構によって統合される。一般的には、毎年産生されるワクチン用量の数は世界の集団のワクチン接種には十分ではない。例えば、カナダおよび米国は集団の約３分の１の免疫に十分なワクチン用量を得るが、欧州連合では集団の１７％しかワクチン接種することができない。インフルエンザワクチンの世界中の現行の産生は、世界的なインフルエンザパンデミックに直面して不十分であろうことは明らかである。ある年になんとかして必要な年間の産生量を満たすことができたとしても、優勢株は毎年変化し、したがってその年の中で必要性が低い時に備蓄することは実践的ではない。効果的なインフルエンザワクチンの経済的で大規模な産生は、政府および民間産業に同様に重大な関心事である。
【０００６】
現在、ワクチンで使用されるウイルスストックの最も重要なソースは受精卵中で産生される。ウイルス粒子を採取し、不活性化ウイルスワクチンのために界面活性剤によって破壊して不活性化する。弱毒化生ワクチンは低温での増殖に適合したインフルエンザウイルスから作製され、これは正常体温では、ワクチンが弱毒化されることを意味する。かかるワクチンは、合衆国では５乃至４９歳の個人における使用が許可されている。不活性化全ウイルスワクチンは化学薬剤による不活性化によって無害にされ、それらは孵化卵または哺乳類細胞培養において産生されている。これらのすべてのタイプのワクチンはいくつかの特異的な利点および欠点を示す。全ウイルスに由来するワクチンの１つの利点は、かかるワクチンによって誘導される免疫のタイプである。一般に、スプリットワクチンは強い抗体応答を誘導するが、全ウイルスから作製されるワクチンは抗体（液性）および細胞応答の両方を誘導する。機能的抗体応答がワクチンによって誘導される防御と関連することが認可のための基準であっても、Ｔ細胞応答もインフルエンザ免疫において重要であり、高齢者においても良好な防御を提供できるという証拠が増えている。
【０００７】
細胞性免疫反応を誘導するために、全ウイルスから作製されたワクチンが開発された。インフルエンザ菌株（例えばＨ５Ｎ１）の高い病原性に起因して、これらのワクチンはＢＬ３＋施設中で産生される。Ｈ５Ｎ１などの高病原性インフルエンザ株については、いくつかの製造業者はインフルエンザ株の病原性を低下させて無発病性にし、より容易に孵化卵または哺乳類細胞培養において産生されるようにするために、赤血球凝集素遺伝子配列を修飾した。他の業者は、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼのタンパク質の遺伝子配列が高収量低病原性インフルエンザドナー株中でクローン化されたリアソータントインフルエンザ株も使用する（Ａ／ＰＲ／８／３４；Quan F-S et al, 2007）。これらの方法は有用なワクチンを産生することができるが、例年の世界的な需要を満たすのに必要なスケールで、多量で低コストで迅速なワクチン産生の必要性に対する解決を提供せず、パンデミックに直面してほとんど確実に不十分となるだろう。
【０００８】
このリバースジェネティクス技術を使用する場合、ＨＡタンパク質の遺伝子配列を変異させて無発病性にすることが必要かもしれない。高病原性インフルエンザ株については、全ウイルスワクチンの産生は、封じ込め手順または生じたワクチンを循環ウイルスの遺伝子配列に正確に一致させないことのいずれかが必要とされる。弱毒化生ワクチンの事例において、投与されたワクチンが宿主からのインフルエンザウイルスと組換えを起こし、新しいインフルエンザウイルスをもたらすリスクがなお存在する。
【０００９】
この方法は抗原エピトープおよび翻訳後修飾を維持しているが、全ウイルスの使用に起因する汚染のリスクおよびウイルス株に依存する収率変動性を含む多数の短所がある。卵の中への導入に起因するウイルスの遺伝的異質性から、最適レベル以下の防御が生じうる。他の短所は、卵を得るための大規模な計画、精製において使用される化学物質に起因する汚染リスク、および長期の生産時間を含む。さらに、卵タンパク質に過度に感受性のある人は、ワクチンの服用にふさわしい候補ではない。
【００１０】
パンデミックの事例において、スプリットワクチン産生は、卵中の増殖のために株を適応させる必要性および達成される産生収率の変動性によって限定される。この技術は近年季節性ワクチンの産生のために使用されてきたが、パンデミックに対して妥当な時間枠で対応することはほとんどできず、世界的な製造能力は限定されている。
【００１１】
インフルエンザＡ型Ｈ１Ｎ１のメキシコにおける最近の大発生は、さらに新しい新興株のワクチン産生についての迅速な方法論を発達させる緊急な医学的必要性を強調する。
【００１２】
インフルエンザウイルスは、卵の使用を回避するために哺乳類細胞培養（例えばＭＤＣＫ細胞またはＰＥＲＣ．６細胞または同種のもの）においても産生されている。別のアプローチは、ウイルス遺伝子による細胞の形質転換によってウイルスが産生されるリバースジェネティクスである。しかしながら、これらの方法は手の込んだ方法および特殊な培養環境に加えて全ウイルスの使用も必要とする。
【００１３】
いくつかの組換え産物が組換えインフルエンザワクチン候補として開発されている。これらのアプローチは、バキュロウイルス感染昆虫細胞（Crawford et al, 1999; Johansson, 1999）、ウイルスベクターおよびＤＮＡワクチンコンストラクト（Olsen et al., 1997）を使用するこれらのタンパク質の発現を含む、インフルエンザＡ型のＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質の発現、産生および精製に焦点を当てられる。
【００１４】
インフルエンザウイルス感染の詳細は周知である。簡潔には、感染サイクルは、シアル酸含有細胞受容体（糖タンパク質および糖脂質）へのビリオン表面のＨＡタンパク質の付着によって開始される。ＮＡタンパク質はシアル酸受容体のプロセシングを媒介し、細胞の中へのウイルス侵入はＨＡ依存性受容体媒介性エンドサイトーシスに依存する。インフルエンザビリオンを含有する内部移行されたエンドソームの酸性域の中で、ＨＡタンパク質はコンフォメーション変化し、ウイルス膜および細胞膜の融合、ならびにウイルス脱外被、ならびにヌクレオカプシドと会合したリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）からのＭ１タンパク質のＭ２媒介性放出をもたらし、ＲＮＰはウイルスＲＮＡ合成のために細胞核へと移動する。ＨＡタンパク質に対する抗体はウイルス感染性を中和することによってウイルス感染を妨害するが、ＮＡタンパク質に対する抗体は、ウイルス複製の初期段階でのＮＡタンパク質の作用を干渉する。
【００１５】
Crawford et al. (1999)は、バキュロウイルス感染昆虫細胞におけるインフルエンザＨＡの発現を開示する。発現されたタンパク質は、トリＨ５およびＨ７インフルエンザ亜型によって引き起こされる致死性インフルエンザ疾患を妨害することができると記載されている。Johansson et al. (1999)は、バキュロウイルスにより発現されたインフルエンザのＨＡタンパク質およびＮＡタンパク質は、従来のワクチンによって誘導されたものより優れた免疫応答を動物中で誘導することを教示する。バキュロウイルスにより発現されたウマインフルエンザウイルスの赤血球凝集素の免疫原性および有効性は、相同なＤＮＡワクチン候補と匹敵していた（Olsen et al., 1997）。まとめると、これらのデーターは、インフルエンザウイルスの攻撃感染に対する高度の防御を、異なる動物モデルにおいて様々な実験的アプローチを使用して、組換えのＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質により誘導できることを実証する。
【００１６】
表面のインフルエンザ糖タンパク質（ＨＡおよびＮＡ）はインフルエンザウイルスに対する防御免疫の誘発のための一次標的であること、およびＭ１はインフルエンザへの細胞性免疫のための保存された標的を提供することが従来の研究により示されているので、新しいワクチン候補は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのタンパク質の巨大分子性粒子としてこれらのウイルス抗原を含むことができる。ワクチン製品として、ＶＬＰは、サブユニット抗原または組換え抗原よりも免疫原性が高いという長所があり、液性免疫反応および細胞性免疫反応の両方を刺激することができる（Grgacic and Anderson, 2006）。さらに、これらのインフルエンザ抗原を持つ粒子は、インフルエンザウイルスの複数の株に対する中和抗体を誘発するコンフォメーショナルエピトープを提示することができる。
【００１７】
ワクチン目的のための非感染性インフルエンザウイルス株の産生は、不慮の感染を回避する１つの手段である。あるいは、培養されたウイルスの代替物としてウイルス様粒子（ＶＬＰ）が研究されている。ＶＬＰは、ウイルスカプシドの構造を模倣するがゲノムを欠損し、したがって複製または二次感染の手段を提供することができない。
【００１８】
いくつかの研究により、組換えインフルエンザタンパク質は、哺乳類発現プラスミドまたはパキュロウイルスベクターを使用する細胞培養においてＶＬＰへと自己集合することが実証された（Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham and Galarza, 2001）。Gomez-Puertas et al. (1999)は、インフルエンザＶＬＰの効率的な形成がいくつかのウイルスタンパク質の発現レベルに依存することを開示する。Neumann et al. (2000)は、もっぱらクローン化されたｃＤＮＡから感染インフルエンザウイルス様粒子を生成するために哺乳類の発現プラスミドに基づくシステムを確立した。Latham and Galarza (2001)は、ＨＡ、ＮＡ、Ｍ１およびＭ２遺伝子を共発現する組換えバキュロウイルスにより感染した昆虫細胞中のインフルエンザＶＬＰの形成を報告した。これらの研究は、インフルエンザビリオンタンパク質は真核生物細胞中で共発現させると自己集合できることを実証した。
【００１９】
Gomez-Puertas et al. (2000)は、赤血球凝集素（ＨＡ）に加えてインフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）が昆虫細胞からのＶＬＰ出芽に必須であることを教示する。しかしながら、Chen et al. (2007)は、Ｍ１はＶＬＰ形成に必要とされない可能性を教示し、Ｍ１およびＶＬＰの効率的な放出はＨＡの存在およびＮＡにより提供されるシアリダーゼ活性を必要とすることを観察した。ＮＡは細胞表面で糖タンパク質のシアル酸を切断し、ＶＬＰを産生し、培地中にＶＬＰを放出する。
【００２０】
Quan et al (2007)は、バキュロウイルス発現システム（昆虫細胞）で産生されたＶＬＰワクチンは、インフルエンザウイルスのいくつかの株（Ａ／ＰＲ８／３４（Ｈ１Ｎ１））に対する防御免疫を誘導することを教示する。Quanによって研究されたＶＬＰは原形質膜から出芽することが観察され、哺乳類システム（ＭＤＣＫ細胞）で得られるものに類似する正しいサイズおよび形態であると判断された。
【００２１】
エンベロープウイルスは感染細胞から「出芽」するときに脂質エンベロープを得て、原形質膜からまたは細胞内小器官の膜から膜を得ることができる。インフルエンザウイルス粒子およびＶＬＰは宿主細胞の原形質膜から出芽する。哺乳類の細胞システムまたはバキュロウイルス細胞システムにおいて、例えば、インフルエンザは原形質膜から出芽する（Quan et al 2007）。
【００２２】
少数のエンベロープウイルスのみが植物に感染することが公知である（例えばトポウイルスおよびラブドウイルスのメンバー）。公知の植物のエンベロープウイルスは、原形質膜からではなく宿主細胞の内膜から出芽することによって特徴づけられる。少数の組換えＶＬＰは植物の宿主において産生されたが、どれも原形質膜に由来しない。現行のインフルエンザＶＬＰ生産技術は複数のウイルスタンパク質の共発現に依存し、パンデミックおよび毎年の流行の事例においては応答時間がワクチン接種に重要であるので、この依存性はこれらの技術の短所となる。ワクチンの開発を加速するために、１つのみのウイルスタンパク質の発現に依存するより単純なＶＬＰ産生システムが所望される。
【００２３】
植物ベースのシステムにおけるインフルエンザＨＡ ＶＬＰの産生はＷＯ２００９／００９８７６中で記載され、インフルエンザＨＡが植物宿主細胞中で自己集合し、ウイルス様粒子で原形質膜から出芽できることを本質的に示した。
【００２４】
インフルエンザから世界人口を守り、将来のパンデミックを食い止めるために、ワクチン製造業者は、ワクチン用量を産生する効果的な迅速な方法を開発する必要があるだろう。ワクチンを産生するための受精卵の現行の使用は不十分であり、長いプロセスを含む。使用されるＨＡタンパク質は各々の株について特異的であり他の株と交差反応せず、より広域なスペクトルのワクチンを提供するためには、したがって、持続的な産生またはいったん新しい株が同定されてからの短い反応時間が必要となる。
【００２５】
ＶＬＰの産生のために使用するＨＡの天然のタンパク質に対して、特定の修飾および／または変異を行うことができ、かかる修飾は、単一投与のみの後でさえ、インフルエンザの１つ以上の株またはいくつかの株を中和する抗体を誘導するより広域のスペクトルを有する赤血球凝集素タンパク質をもたらす。
【発明の概要】
【００２６】
本発明の１つの態様は改善されたインフルエンザワクチンを提供することである。
【００２７】
本発明のさらなる態様は、新規のインフルエンザウイルス様粒子を提供することである。
【００２８】
本発明のさらなる態様は、より広域のスペクトルの抗体反応を提供するように修飾された赤血球凝集素タンパク質を提供することである。
【００２９】
本発明は、Ｎ結合型糖タンパク質であるが、Ｎ結合型炭水化物が部分的にまたは完全にない（すなわち、もとの天然のＨＡ配列と比較した場合に消失している(abolish)１つまたは複数の糖鎖付加部位を有する）ウイルスエンベロープと実質的に同一のアミノ酸残基配列を有するポリペプチドに加えて、ポリペプチドを産生および利用する方法を意図する。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、広域スペクトルのインフルエンザワクチンの調製のためのインフルエンザＶＬＰを産生するために、ＨＡ１ドメインからの１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位が修飾された／欠失した／変異した／除去された／消失したＨＡタンパク質を提供することである。
【００３１】
特に、ＨＡ１ドメインは、株Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４に従って番号付けした１位乃至３３１位に位置するアミノ酸を含む。より詳細には、ＨＡ１ドメインは、株Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４に従って番号付けしたタンパク質の３９位乃至３３１位の間のアミノ酸に対応する、球状頭部およびタンパク質のＦ’２ドメインを含む。特に、消失する糖鎖付加部位はタンパク質の球状頭部にもともと存在し、特に配列番号：３４の３９位乃至２７３位の間に位置するアミノ酸に対応する。より詳細には、消失される糖鎖付加部位は、もともとタンパク質のＦ’２ドメイン中に位置し、配列番号：３４の２７４位〜３３１位の間に位置するアミノ酸に特に対応する。
【００３２】
本発明は、ＨＡの抗原性および免疫原性を変更することができるインフルエンザＡ型の赤血球凝集素（ＮＡ）分子中のアミノ酸置換を提供する。これらの置換は、受容体特異性および／または抗体抗原結合の変更によって抗原部位を変更することができる。実施形態の多様性において、置換からもたらされる抗原性の増加はインフルエンザのためのより広域の交差反応性を持つワクチンの産生のために有用でありえる。特に、アミノ酸置換は、受容体結合部位に対応し、特に位置１５４および／または１６５および／または２８６（番号付けは株Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４に従う）に対応する位置で、ＨＡタンパク質の非アスパラギン残基のアミノ酸置換の免疫原的な特徴を持つ分子をもたらす。特定の実施形態において、アミノ酸置換は糖鎖付加部位を除去する／欠失させる／消失させる。
【００３３】
インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、Ｈ５の１５４位および／または１６５位および／または２８６位に対応する１つまたは複数の糖鎖付加されていないアミノ酸を含むことができ、これらの糖鎖付加部位の任意の１つの除去は、野生型ＨＡ分子を持つインフルエンザウイルスに曝露された動物に由来する抗血清との反応性の増加をもたらす。
【００３４】
糖鎖付加部位を破壊するために、三つ組シグナルのＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（配列中、ＮはＡｓｎであり、ＸはＰｒｏ以外の任意のアミノ酸でありえ、Ｓ／ＴはＳｅｒまたはＴｈｒの両方でありえる）は、タンパク質工学によって修飾することができる。使用される第１のアプローチは、Ａｓｎを別のアミノ酸によって置換することである。第２のアプローチは、糖鎖付加される予定のアスパラギンに対してｎ＋２位の位置でＳ／Ｔアミノ酸を他のアミノ酸残基によって置換することである。アスパラギン、セリンまたはスレオニンの置換に使用したされる適切なアミノ酸はアラニンであるが、他のアミノ酸も使用することができる。例えば、Ａｓｎは、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒまたはＡｌａによって置換することができる。さらに、ＳｅｒまたはＴｈｒは、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕによって置換することができる。
【００３５】
特に、インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、Ｈ５ ＨＡ中の１５４位および／または１６５位および／または２８６位で非アスパラギンのアミノ酸を含むことができる。
【００３６】
インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、頭部がＮ結合型糖鎖付加部位を欠いている、すなわち、すべての３つの糖鎖付加部位が消失されているＨＡタンパク質を含むことができる。
【００３７】
インフルエンザウイルスの抗原性の増加したＨＡ分子は、Ｎ−１５４、Ｎ−１６５およびＮ−２８６（番号付けは株Ａ／ベトナム／１１９４／０４に従う）からなる群から選択される１つまたは複数の除去される糖鎖付加部位を含むことができる。
【００３８】
本発明は異なるインフルエンザ株からの修飾された赤血球凝集素（ＨＡ）を提供する。
【００３９】
本発明は、
ａ）シアル化していない宿主生物またはその一部において活性のある調節領域に作動可能に連結された上で定義されたインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）抗原をコードする核酸を導入することと、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で宿主またはその一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生することと
を含む、シアル化していない宿主生物中でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法も提供する。
【００４０】
本発明は、導入工程（工程ａ）において、核酸が宿主中で一過性に発現されるか、または宿主中で安定的に発現されうる上記の方法を含む。さらに、ＶＬＰは、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して精製することができる。
【００４１】
さらに、本発明は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生のために使用される、シアル化していない宿主生物に関する。特に、ＶＬＰを産生することができる適切な宿主は、例えば、植物もしくはその一部、植物細胞、昆虫もしくはその一部、昆虫細胞、酵母もしくはその一部、または酵母細胞である。
【００４２】
本発明に従えば、シアル化していない宿主生物において活性のある調節領域に作動可能に連結された上述のように定義された修飾インフルエンザＨＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸が提供される。抗原は、分子の頭部から１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位（天然の配列中に通常は存在する抗原部位）を欠くインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）でありえる。
【００４３】
本発明は、本明細書において定義されたインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）も提供する。宿主が昆虫ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の昆虫脂質を含むことができ、宿主が酵母ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の酵母脂質を含むことができ、宿主が植物ならば、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）はインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の植物脂質を含むことができる。
【００４４】
さらなる本発明は、植物中で産生され、それによって植物起原の１つまたは複数の脂質（一般的に「植物脂質」と呼ばれる）を含有するＶＬＰを提供する。
【００４５】
本発明は、昆虫細胞の原形質膜からの脂質（一般的に「昆虫脂質」と呼ばれる）を含む昆虫細胞中で産生されたＶＬＰをさらに提供する。
【００４６】
本発明は、酵母細胞の原形質膜からの脂質（一般的に「酵母脂質」と呼ばれる）を含む酵母中で産生されたＶＬＰをさらに提供する。
【００４７】
さらに、ＶＬＰ（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、シアル化しない宿主産生細胞に由来する１つまたは複数の脂質を含む）の効果的な用量を含む組成物は、薬学的に許容される担体との混合において、本発明中に含まれる。薬学的に許容される担体は、経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または皮下投与のために適切でありえる。
【００４８】
アジュバントの存在ありまたはなしで、薬学的に許容される担体との混合において、本明細書において定義されたＶＬＰの免疫学的に効果的な用量を含むワクチン組成物は、本発明中にさらに含まれる。ワクチンは、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で投与することができる。特に、ワクチンはアジュバントの使用なしで投与される。
【００４９】
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法であって、ウイルス様粒子（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の宿主脂質を含む）および薬学的に許容される担体を被験体に投与することを含む方法も提供する。ウイルス様粒子は、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で被験体に投与することができる。
【００５０】
本発明は、本明細書において定義された１つまたは複数のＶＬＰを含むワクチンの効果的な用量を被験体に投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法に関する。
【００５１】
上で定義された方法によって治療される被験体は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラ、および同種のものからなる群から選択することができる。特に、被験体は、ヒト患者またはトリ一般（水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリなどの家禽を含む）、特に渡り鳥またはヒト消費のための家禽（ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリ）でありえる。
【００５２】
本発明は、かかる容器を含むキットに加えてシリンジなどの容器も提供し、そのすべては本明細書において定義されたワクチン組成物を含む。
【００５３】
本発明のこの要約は、必ずしも本発明のすべての態様を記載するとは限らない。
本発明のこれらおよび他の特色は添付の図面を参照する以下の記載からより明らかになるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５４】
【図１Ａ】インフルエンザウイルスＨＡ Ｈ５ Ａ／インドネシア／５／０５上の糖鎖付加部位の局在化を示した図である。アミノ酸同一性、ポジション、および位置は、Ａ／ベトナム／１１９４／０４；配列番号：３４（ＰＤＢファイル：２ＩＢＸ）の構造上のアナロジーによって示される。三重変異体は、球状頭部に位置する糖鎖付加部位Ｎ１５４、Ｎ１６５およびＮ２８６の破壊によって作製された。Bright et al. (2003)からの研究を使用して、可能な抗原部位の位置決めを行った。糖鎖付加の型は、ＨＡ Ｈ１、Ｈ３およびＨ７について文献中で述べられているものに基づいて決定された（Abe Y. et al. (2004)；Vigerust DJ et al (2007)；およびKuroda et al. (1990)）。
【図１Ｂ】ＨＡ単量体のサブドメインの実例を示した図である。Ｆ’１サブドメイン（Ａ／ベトナム／１１９４／０４に従って番号付けした１〜３８；配列番号：３４）、Ｆ’２サブドメイン（２７４〜３３１）およびＦサブドメインが示される。受容体結合部位およびエステラーゼサブドメインはともに球状頭部（３９〜２７３）を形成する。融合ペプチドは白いボックスとして示される。ＨＡの可溶性ブロメライン産物のみが結晶化されて構造が解明されているので、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部をＨＡ構造上で見ることができない。
【図２】異なるＡ亜型からのＨＡの単量体の構造を示した図である。脂質二重層（その脂肪性相当物およびその極性頭部と共に）を同様に提示する。構造は、Ha et al（Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002)）Ｈ５鳥類から援用した。
【図３】本発明の実施形態に従うＨ１の発現に使用したアルファルファのプラストシアニンベースの発現カセットの配列を示した図である（配列番号：８）。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）シグナルペプチドに下線が引かれる。クローニングに使用したＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）およびＳａｃＩ（ＧＡＧＣＴＣ）制限部位を太字で示す。
【図４】Ａ／インドネシア／５／０５からの野生型ＨＡ亜型Ｈ５の発現のために組み立てたプラスミド６６０の表示を示した図である。
【図５】Ａ／インドネシア／５／０５からの糖鎖付加のない変異させたＨＡ亜型Ｈ５の発現のために組み立てたプラスミド６８０の表示を示した図である。
【図６】第１および第２の投薬後の非活性化全ウイルス（ＷＩＶ）に対する抗体力価を示した図である。野生型ＶＬＰまたは三重変異体ＶＬＰ（糖鎖付加されない）のいずれかで免疫されたラットからの血清の反応性を、第１の免疫後（１４日目）または第２の免疫後（３５日目）に評価した。免疫反応性をいくつかのＨ５Ｎ１ウイルスに対して評価した。
【図７】第１および第２の投薬後の赤血球凝集阻害（ＨＩ）抗体力価を示した図である。野生型ＶＬＰまたは三重変異体ＶＬＰ（糖鎖付加されない）で免疫されたラットからのＨＩ力価を、第１の免疫（１４日目）または第２の免疫（３５日目）の１４日後に評価した。いくつかのＨ５Ｎ１ウイルスおよび１つのＨ１Ｎ１ウイルスに対して免疫反応性を評価した。
【図８】インフルエンザＨＡ０についての配列リストを示した図である。
【図９】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ２の配列リストを示した図である。
【図１０】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ３の配列リストを示した図である。
【図１１】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ４の配列リストを示した図である。
【図１２】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ５の配列リストを示した図である。
【図１３】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ６の配列リストを示した図である。
【図１４】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ７の配列リストを示した図である。
【図１５】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ８の配列リストを示した図である。
【図１６】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ９の配列リストを示した図である。
【図１７】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１０の配列リストを示した図である。
【図１８】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１１の配列リストを示した図である。
【図１９】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１２の配列リストを示した図である。
【図２０】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１３の配列リストを示した図である。
【図２１】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１４の配列リストを示した図である。
【図２２】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１５の配列リストを示した図である。
【図２３】インフルエンザＨＡタンパク質亜型Ｈ１６の配列リストを示した図である。
【図２４】完全な野生型Ｈ５配列を含有する、６６０ ｐＣＡＭＢＩＡ発現ベクターの配列リストを示した図である。
【図２５Ａ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｂ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｃ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｄ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｅ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｆ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｇ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｈ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｉ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２５Ｊ】ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列リストを示した図である。
【図２６】最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドおよびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含む、完全なＨ５コード領域を含有して産生された断片の配列リストを示した図である。
【図２７】最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドおよびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含む、３つの糖鎖付加部位をすべて除去するように修飾した完全なＨ５コード領域を含有して産生された断片のための配列リストを示した図である。
【図２８Ａ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２８Ｂ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２８Ｃ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２８Ｄ】ＰＣＲ増幅のプライマーのための配列リストを示した図である。
【図２９】株Ａ／ベトナム／１１９４／０４からの成熟Ｈ５のアミノ酸配列を示した図である。
【図３０Ａ】株Ｂ／フロリダ／４／２００６からの成熟ＨＡの核酸配列を示した図である。
【図３０Ｂ】株Ｂ／フロリダ／４／２００６からの成熟ＨＡのアミノ酸配列を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
本発明はウイルス様粒子（ＶＬＰ）の産生に関する。より詳細には、本発明はインフルエンザ抗原を含むウイルス様粒子の産生を指向する。
【００５６】
以下の記載は特定の実施形態である。
【００５７】
１−ＨＡタンパク質
本明細書において使用される時、「タンパク質」は、特定の形態を達成するために二次構造、三次構造または四次構造へと折り畳まれる、ペプチド結合によって結合される一連のアミノ酸を一般的に指す。あるいは、ポリペプチド、ペプチドまたはペプチドフラグメントという用語は、類似する情況で使用することができる。
【００５８】
「赤血球凝集素ドメイン」という用語は、ＨＡ０前駆体ポリペプチド、またはＨＡ１ドメインおよびＨＡ２のドメインのいずれかを含むペプチドを指す。赤血球凝集素ドメインは、シグナルペプチド、膜貫通ドメインまたは天然に存在するタンパク質中で見出される細胞質尾部を含まない。
【００５９】
インフルエンザウイルスに関して、本明細書において使用される時「赤血球凝集素」または「ＨＡ」という用語は、インフルエンザウイルス粒子の外側上で見出される糖タンパク質を指す。ＨＡは、一般的にはシグナルペプチド、ＨＡ１ドメイン、ならびにＣ末端および小さな細胞質尾部で膜通過アンカー部位を含むＨＡ２ドメインを含むホモ三量体の膜のタイプＩ糖タンパク質である（図１Ｂ）。ＨＡをコードするヌクレオチド配列は周知であり利用可能である。例えば、バイオディフェンスパブリックヘルスベース（ＢｉｏＤｅｆｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ｂａｓｅ）（インフルエンザウイルス；URL: biohealthbase.orgを参照）または全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照）を参照（その両者は参照として本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
インフルエンザＨＡに関する構造的情報
ＨＡ単量体は、２つの別個の機能ドメイン（球状頭部ドメインおよびステムドメイン）で細分することができる。一次配列とＨＡの構造との間のこれらのドメインの一致を図１Ｂおよび図２で示す。ステムドメインは、酸性ｐＨで行なうことができる並外れたコンフォメーション変化を介してウイルスの伝染性および病原性に関与する。ステムドメインは４つのサブドメインとしてさらに記載され、それらは融合ペプチド（低ｐＨのコンフォメーショナル状態で宿主膜との融合に関与する２６アミノ酸の疎水性ストレッチ）、ステムドメインそれ自体（２つの極端に異なるコンフォメーションに適合することができる）、膜貫通ドメイン（ＴｍＤ）（脂質ラフトに対するＨＡの親和性を決定する）、細胞質尾部（Ｃ尾部）（ＨＡの分泌に関与する）である。球状頭部は、２つのサブドメイン（受容体結合（ＲＢ）ドメインおよび痕跡のエステラーゼドメイン（Ｅ））に分けられる。エステラーゼサブドメインは、タンパク質の表面からかなり埋まっており、したがってＨＡに対して作製された大多数の抗体は、受容体結合ドメインに結合する（頭部の最上部分によって図２中に示される）。
【００６１】
「ホモ三量体」または「ホモ三量体の」という用語は、オリゴマーが３つのＨＡタンパク質分子によって形成されることを示す。ＨＡタンパク質は７５ｋＤａの単量体前駆体タンパク質（ＨＡ０）として合成され、それは伸長した三量体タンパク質へと表面で集合する。高病原性鳥類株については、前駆体タンパク質は、三量体化が起こる前に、ジスルフィド結合によって連結される２つのポリペプチド鎖、ＨＡ１（３２８アミノ酸）およびＨＡ２（２２１アミノ酸；膜貫通領域を含む）へと保存された活性化切断部位（融合ペプチドとも呼ばれる）で細胞内で切断される。この工程はウイルス感染性に重要であるが、タンパク質の三量体化に必須ではない。哺乳類インフルエンザウイルス株および非病原性鳥類インフルエンザウイルス株については、前駆体ＨＡ０は、宿主の呼吸管の細胞によって、または細菌もしくはマイコプラズマの共感染によって分泌されたプロテアーゼによって細胞外で切断される。宿主細胞の小胞体（ＥＲ）膜内部へのＨＡの挿入、シグナルペプチド切断、およびタンパク質の糖鎖付加は、翻訳と同時に起こる事象である。ＨＡの正しい再折畳みは、タンパク質の糖鎖付加および６つの鎖内ジスルフィド結合の形成を必要とする。ＨＡ三量体はシスゴルジ複合体およびトランスゴルジ複合体内で集合し、膜貫通ドメインが三量体化プロセスにおいて役割を果たす。ブロメライン処理したＨＡタンパク質の結晶構造（膜貫通ドメインを欠損する）は、インフルエンザ株の中で高度に保存された構造を示した。感染プロセス（前駆体ＨＡ０が２つのポリペプチド鎖ＨＡ１およびＨＡ２へと切断されることを必要とする）の間にＨＡが大きなコンフォメーション変化を受けることも立証された。ＨＡタンパク質はプロセシングを受ける（すなわち、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２のドメインを含む）か、またはプロセシングを受けない（すなわち、ＨＡ０ドメインを含む）。
【００６２】
本発明は、膜貫通ドメインを含むＨＡタンパク質の使用に関し、ＨＡ１ドメインおよびＨＡ２ドメインを含み、例えば、ＨＡタンパク質はＨＡ０、またはＨＡ１およびＨＡ２を含むプロセシングされたＨＡでありえる。
【００６３】
本発明のＨＡは任意の亜型から得ることができる。例えば、ＨＡは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５またはＨ１６のものでありえる。
【００６４】
本発明は、修飾したＮ−グリカンを有するＨＡを含むＶＬＰを含む。本発明の組換えＨＡは、当技術分野において公知の任意の赤血球凝集素の配列に基づいたアミノ酸配列も含むことができ（例えば、バイオディフェンスパブリックヘルスベース（インフルエンザウイルス；URL: biohealthbase.orgを参照）、または全米バイオテクノロジー情報センター（URL: ncbi.nlm.nih.govを参照）を参照）、ペプチド抗原部位をマスクする糖残基を除去するために、天然のＮ結合型糖鎖付加部位は除去／変異／欠失／修飾される。
【００６５】
さらに、ＨＡは、１つまたは複数の新興インフルエンザウイルスまたは新しく同定されたインフルエンザウイルスから単離した赤血球凝集素の配列に基づくことができる。
【００６６】
さらに、ＨＡ亜型の組み合わせを含むＶＬＰは産生することができる。例えば、ＶＬＰは、亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、またはその組み合わせからの１つまたは複数のＨＡを含むことができる。ＨＡの組み合わせの選択は、ＶＬＰから調製したワクチン使用の意図によって決定することができる。例えば、トリの接種における使用のためのワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組み合わせを含むことができ、その一方でヒトの接種に有用なＶＬＰは、１つまたは複数の亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３またはＨ５からの亜型を含むことができる。しかしながら、他のＨＡ亜型の組み合わせはＶＬＰの使用に応じて調製することができる。ＨＡ亜型の組み合わせを含むＶＬＰを産生するために、所望されるＨＡ亜型は同じ細胞（例えば植物細胞）内で共発現することができる。
【００６７】
特に、本明細書において記載されるように産生されたＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望されるならばＮＡはＨＡと共発現させることができる。
【００６８】
２−インフルエンザ亜型
本発明は、例えば非常に優勢なＡ亜型ならびにそれほど一般的でないＢ型およびＣ型を含むが、これらに限定されないすべての型のヒトインフルエンザウイルス、ならびに他のインフルエンザ亜型から得られるＨＡを含む。
【００６９】
本発明は、１つまたは複数のインフルエンザ亜型から得られたＨＡを含むＶＬＰも含む。例えば、ＶＬＰは、亜型Ｈ１（配列番号：１によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：７によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：８によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：９によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１０によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：１５によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号：１６によってコードされる）またはその組み合わせからの１つまたは複数のＨＡを含むことができる。１つまたは複数のＨＡの合成が１つまたは複数のインフルエンザ亜型から得られたＨＡの組み合わせを含むＶＬＰの形成をもたらすことを保証するために、１つまたは複数のインフルエンザ亜型からの１つまたは複数のＨＡは、植物細胞または昆虫細胞内で共発現させることができる。ＨＡの組み合わせの選択は、ＶＬＰから調製したワクチン使用の意図によって決定することができる。例えば、ヒトの接種における使用のためのワクチンは、ＨＡ亜型の任意の組み合わせ、特に、１つまたは複数の亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１０、Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３およびＮ７、特にＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５を含むことができる。
【００７０】
しかしながら、他のＨＡ亜型の組み合わせは、接種物の使用に応じて調製することができる。
【００７１】
３−産生の方法
さらに、本発明は、宿主においてウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法を提供する。したがって、本発明は、単一エンベロープタンパク質の発現からのＶＬＰ、および宿主発現システムにおけるウイルスＶＬＰを産生する方法を提供する。方法は、宿主またはその一部において活性のある調節領域に作動可能に連結された抗原をコードする核酸を導入すること、および核酸の発現を可能にする条件下で宿主または宿主の一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生することを含む。
【００７２】
本発明の調節エレメントは、形質転換または一過性発現に適用可能な、特に植物、昆虫または酵母などの様々な宿主生物内の発現のために、対象となるコード領域とも組み合わせることができる。
【００７３】
特に、かかる生物は、植物（単子葉植物および双子葉植物の両方）、例えば、トウモロコシ、穀物用植物、コムギ、オオムギ、カラスムギ、タバコ属の種、アブラナ属の種、ダイズ、インゲンマメ、エンドウ、アルファルファ、ジャガイモ、トマト、チョウセンニンジン、およびシロイヌナズナであるが、これらに限定されない。
【００７４】
これらの生物の安定した形質転換および再生のための方法は、当技術分野において確立され、当業者に公知である。形質転換され再生された植物を得る方法は、当技術分野において周知である。
【００７５】
「形質転換」によって、遺伝子型、表現型、または両方によって明示される遺伝情報（ヌクレオチド配列）の安定した種間移行が意味される。キメラコンストラクトから宿主への遺伝情報の種間移行は遺伝性であり、遺伝情報の移行は安定性であるか、または移行は一過性であり遺伝情報の移行は遺伝可能ではないと判断される。
【００７６】
本発明のコンストラクトを発現するために、一過性発現方法を使用することができる（Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348を参照；参照として本明細書に組み込まれる）。あるいは、Kapila et al. 1997（参照として本明細書に組み込まれる）によって記載された真空に基づく一過性発現方法を使用することができる。これらの方法は、例えば、アグロ接種またはアグロインフィルトレーションの方法を含むが、これらに限定されず、しかしながら、他の一過性方法も上述されるように使用することができる。アグロ接種またはアグロインフィルトレーションのいずれかにより、所望される核酸を含むアグロバクテリアの混合物は、組織、例えば、葉、植物の地上構造の一部（茎、葉および花を含む）、植物の他の一部（茎、根、花）、または全草の細胞間の空間に入り込む。表皮の通過後に、アグロバクテリウムは感染し、細胞へとｔ−ＤＮＡコピーを移行させる。ｔ−ＤＮＡはエピソームとして転写され、ｍＲＮＡは翻訳され、感染した細胞中で対象となるタンパク質の産生をもたらすが、核の内部でのｔ−ＤＮＡの継代は一過性である。
【００７７】
４−宿主生物
本発明のＶＬＰは、グリコフォーラム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｕｍ）中で同定されるように、タンパク質をシアル化する能力の欠損（例えばシアリダーゼの欠損）によって特徴づけられる、植物細胞、昆虫細胞、真菌、および海綿動物、腔腸動物、環形動物、節足動物、軟体動物、線形動物、輪形動物、扁形動物、毛顎動物、有触手動物、クラミジア、スピロヘータ、グラム陽性菌、シアノバクテリア、古細菌を含む他の生物などの宿主細胞中で産生することができる（例えば、URL: glycoforum.gr.jp/science/word/evolution/ES-AOSE.htmlを参照）。
【００７８】
本明細書において記載されるように産生されたＶＬＰは、典型的にはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含まない。しかしながら、ＨＡおよびＮＡを含むＶＬＰが所望されれば、ＮＡはＨＡと共発現することができる。
【００７９】
特に、本発明のＶＬＰは、植物細胞、植物全体またはその一部（葉、種子または他の植物素材などの）において産生することができる。
【００８０】
「植物素材」という用語によって、植物に由来する任意の材料が意味される。植物素材は、植物全体、組織、細胞または任意のその画分を含むことができる。さらに、植物素材は、細胞内植物成分、細胞外植物成分、植物の液体もしくは固体の抽出物、またはその組み合わせを含むことができる。さらに、植物素材は、植物葉、茎、果実、根またはその組み合わせからの植物、植物細胞、組織、液体抽出物またはその組み合わせを含むことができる。植物素材は、任意の加工工程が行われていない植物またはその一部を含むことができる。しかしながら、植物材料に対して、以下に定義されるような最小の加工工程、またはより厳密な加工（クロマトグラフィー、電気泳動および同種のものを含むがこれらに限定されない当技術分野内で一般に公知である部分的または実質的なタンパク質精製を使用する技術を含む）を行うことができることも意図される。
【００８１】
「最小限の加工」という用語によって、植物素材、例えば、対象となるタンパク質を含む植物またはその一部を、部分的に精製して、植物抽出物、ホモジネート、植物ホモジネートの画分または同種のものを得る（すなわち最小限に加工する）ことが意味される。部分的精製は、植物の細胞構造を破壊すること、それによって可溶性植物成分、および例えば遠心分離、濾過またはその組み合わせであるがこれらに限定されないものによって分離することができる不溶性植物成分を含む組成物を生成することを含むことができるが、これらに限定されない。この点に関して、葉または他の組織の細胞外空間内の分泌タンパク質を真空または遠心による抽出を使用して容易に得ることができるか、または細胞外空間内からタンパク質を圧搾または遊離させるために圧力下でのローラーを介する通過もしくは粉砕または同種のものによって組織を抽出することができる。可溶性タンパク質の粗抽出物の調製物は二次的な植物産物からの混入がほとんどないので、最小限の加工は可溶性タンパク質の粗抽出物の調製物も含みうる。さらに、最小限の加工は、葉からの可溶性タンパクの水抽出、続いて任意の適切な塩による沈殿を含むことができる。他の方法は、抽出物の直接使用を可能にするために大規模浸軟および液汁抽出を含みうる。
【００８２】
植物素材（植物材料または組織の形態で）は、被験体に経口送達することができる。植物素材は、食事へのサプリメントの一部分として他の食品と共に投与されるか、またはカプセル化して投与することができる。植物素材もしくは組織は、食味性を改善もしくは増加させるために濃縮するか、または必要に応じて、他の材料、成分もしくは医薬品賦形剤と共に提供することもできる。
【００８３】
本発明の考慮される部分は、本発明のキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、植物細胞または種子である。植物細胞から全植物体を再生する方法も当技術分野において公知である。一般に、形質転換された植物細胞の同定を促進するために選択マーカーが使用される場合、形質転換された植物細胞は、適切な培地（抗生物質などの選択薬剤を含むことができる）中で培養される。いったんカルスが形成されたなら、公知の方法に従う適切な植物ホルモンを用いることによって芽形成は促進することができ、シュートを植物の再生のための発根培地に移す。次いで、種子または栄養繁殖技術の使用のいずれかからの反復世代を確立するために、植物を使用することができる。トランスジェニック植物は組織培養を使用せずに生成することもできる。
【００８４】
本発明の考慮される部分は、本発明に従う、ＶＬＰ産生のための組換えＨＡ０をコードする核酸を含むキメラ遺伝子コンストラクトを含有するトランスジェニックの植物、樹木、酵母、細菌、真菌および昆虫および動物細胞である。
【００８５】
対象となるタンパク質を含む植物、または対象となるタンパク質を含むＶＬＰを発現する植物は、必要性および状況に応じた様々な手段で、被験体または標的生物に投与できることが意図される。例えば、植物から得られる対象となるタンパク質は、粗製形態、部分精製形態、または精製形態のいずれかで使用前に抽出することができる。タンパク質が精製される予定ならば、食用植物または非食用植物のいずれかにおいて産生することができる。さらに、タンパク質が経口投与されるならば、植物の組織を収穫し被験体に直接食物として与えるか、または収穫された組織を食物として与える前に乾燥させるか、または事前に収穫することなく動物を植物上で放牧させることができる。収穫された植物の組織を動物用食物内の食品サプリメントとして提供することも本発明の範囲内である判断される。植物の組織が、ほとんどまたはまったくさらに加工されずに、動物に食物として与えられるならば、投与されている植物組織が食用であることが好ましい。
【００８６】
転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）は植物中での導入遺伝子の発現を限定することに関与し、導入遺伝子ｍＲＮＡの特異的分解を打ち消すためにジャガイモウイルスＹ（ＨｃＰｒｏ）からのサイレンシングサプレッサーの共発現を使用することができる（Brigneti et al., 1998）。代替のサイレンシングサプレッサーは当技術分野において周知であり、本明細書において記載されるように使用することができ（Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14；参照として本明細書に組み込まれる）、例えば、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ（タバコエッチウイルス−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ）、ＢＹＶ−ｐ２１、トマトブッシースタントウイルスのｐ１９（ＴＢＳＶ ｐ１９）、トマトクリンクルウイルスのカプシドタンパク質（ＴＣＶ−ＣＰ）、キュウリモザイクウイルスの２ｂ（ＣＭＶ−２ｂ）ジャガイモウイルスＸのｐ２５（ＰＶＸ−ｐ２５）、ジャガイモウイルスＭのｐ１１（ＰＶＭ−ｐ１１）、ジャガイモウイルスＳのｐ１１（ＰＶＳ−ｐ１１）、ブルーベリースコーチウイルスのｐ１６（ＢＳｃＶ−ｐ１６）、柑橘トリステザウイルスのｐ２３（ＣＴＶ−ｐ２３）、ブドウ葉巻随伴ウイルス−２のｐ２４（ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４）、ブドウウイルスＡのｐ１０（ＧＶＡ−ｐ１０）、ブドウウイルスＢのｐ１４（ＧＶＢ−ｐ１４）、ヘラクレウム（Ｈｅｒａｃｌｅｕｍ）潜在ウイルスのｐ１０（ＨＬＶ−ｐ１０）またはニンニク共通潜在ウイルスのｐ１６（ＧＣＬＶ−ｐ１６）であるが、これらに限定されない。したがって、サイレンシングサプレッサー、例えば、ＨｃＰｒｏ、ＴＥＶ−ｐ１／ＨＣ−Ｐｒｏ、ＢＹＶ−ｐ２１、ＴＢＳＶ ｐ１９、ＴＣＶ−ＣＰ、ＣＭＶ２ｂ、ＰＶＸ−ｐ２５、ＰＶＭ−ｐ１１、ＰＶＳ−ｐ１１、ＢＳｃＶ−ｐ１６、ＣＴＶ−ｐ２３、ＧＬＲａＶ−２ ｐ２４、ＧＢＶ−ｐ１４、ＨＬＶ−ｐ１０、ＧＣＬＶ−ｐ１６またはＧＶＡ−ｐ１０であるが、これらに限定されないものは、植物内での高レベルタンパク質産生をさらに保証するために、対象となるタンパク質をコードする核酸配列と共に共発現させることができる。
【００８７】
エンベロープウイルスのＶＬＰは、一般的には出芽する膜からエンベロープを取得する。植物原形質膜は、免疫刺激効果がある植物性ステロール相補物を有している。この可能性を調査するために、植物で作製されたＨ５ ＶＬＰをアジュバントの存在下において動物に投与し、ＨＡＩ（赤血球凝集阻害抗体応答）を決定した（図７）。
【００８８】
植物中のＶＬＰの産生は、昆虫細胞培養中のこれらの粒子の産生を上回るいくつかの利点を示す。植物脂質は特異的な免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を促進することができる。植物膜は脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）からできており、植物ならびにある種の細菌および原虫類に特有なグリコスフィンゴ脂質も含有する。スフィンゴ脂質は、ＰＣまたはＰＥのようなグリセロールのエステルではなく、むしろ１８個以上の炭素を含有する脂肪酸鎖とアミド結合を形成する長鎖アミノアルコールからなるという点で独特である。スフィンゴ糖脂質に加えてＰＣおよびＰＥは、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに胸腺および肝臓中のＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞などの哺乳類の免疫細胞によって発現されるＣＤ１分子と結合することができる（Tsuji M, 2006）。さらに、植物脂質の存在下のアジュバント効果の可能性に加えて、植物Ｎ−グリカンが抗原提示細胞による糖タンパク質抗原の捕捉を促進する能力（Saint-Jore-Dupas, 2007）は、植物中のＶＬＰの産生で有利でありえる。
【００８９】
理論に束縛されるものではないが、植物で作製されたＶＬＰが他の産生／製造システムにおいて作製されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し、生全ウイルスワクチンまたは弱毒化全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応と比較した場合、植物で作製されたＶＬＰによって誘導された免疫反応がより強くなることが予想される。
【００９０】
全ウイルスから作製されたワクチンとは異なって、ＶＬＰは非感染性であり、したがって制限的な生物学的封じ込めは、感染性の全ウイルスを用いて作業するときほど重要な問題ではなく、産生には必要とされないので、ＶＬＰは有利である。植物で作製されたＶＬＰは、発現システムを温室または野外で生育させることを可能にし、したがって有意に経済的であることおよびスケールアップに適切であることによって、一層の利点をさらに提供する。
【００９１】
さらに、植物は、シアル酸残基の合成およびタンパク質への付加に関与する酵素を含まない。ＶＬＰはノイラミニダーゼ（ＮＡ）の非存在下で産生することができ、植物中のＶＬＰ産生を保証するために、ＮＡを共発現する必要性、またはシアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）により産生する細胞または抽出物を処理する必要性はない。
【００９２】
特に、本発明に従って産生されたＶＬＰは、ＲＮＡを結合することが公知であるＭ１タンパク質を含まない。ＲＮＡはＶＬＰ調製物の混入物であり、ヒトワクチンとしての使用のためのＶＬＰ産物についての規制認可を得るときには所望されない。
【００９３】
５−核酸
本発明は、シアル化しない宿主生物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を提供する。
【００９４】
本発明は、宿主発現ベクターの中へのＨＡ（例えばヒトインフルエンザＡウイルスＨＡであるが、これらに限定されない）をコードする核酸のクローニング、およびワクチン産生のために適切な宿主からのインフルエンザＶＬＰの製造を記載するが、これらに限定されない。ＶＬＰは、形質転換された宿主細胞（例えば植物細胞または昆虫細胞）中で、機能的および免疫原的に同型の巨大分子性タンパク質構造（インフルエンザサブウイルス粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む）へと自己集合する組換えインフルエンザ構造タンパク質からなる試薬を産生するためにも使用することができる。
【００９５】
本発明は、ヌクレオチド配列のＨ１（配列番号：１によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：７によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：８によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：９によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１０によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：１５によってコードされる）およびＨ１６（配列番号：１６によってコードされる）も含む。
【００９６】
特に、本発明は、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをそれぞれコードするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７；ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをコードする核酸にそれぞれハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７；またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをそれぞれコードする核酸の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７を含み；ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、宿主細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
【００９７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは当技術分野において公知である。（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubel et al.編、１９９５年およびサプリメント；Maniatis et al.、Molecular Cloning （A Laboratory Manual）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）社、１９８２年；Sambrook and Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第３版２００１年を参照；その各々は参照として本明細書に組み込まれる）。１つのかかるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例は、６５℃の４×ＳＳＣ中で約１６〜２０時間のハイブリダイゼーション、続いて６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１時間の洗浄、または６５℃の０．１×ＳＳＣ中で各々２０分間または３０分間の２回の洗浄でありえる。あるいは、例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃の５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ中で一晩（１６〜２０時間）、続いて６５℃の０．１×ＳＳＣ中で１時間の洗浄、または６５℃の０．１×ＳＳＣ中で各々２０分間もしくは３０分間または一晩（１６〜２０時間）２回の洗浄、または６５℃でＣｈｕｒｃｈ水性リン酸緩衝液（７％ ＳＤＳ；０．５Ｍ ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ７．２；１０ｍＭ ＥＤＴＡ）中でハイブリダイゼーション、そして５０℃の０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で各々２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄、または６５℃の２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で各々２０分間もしくは３０分間の２回の洗浄でありえる。
【００９８】
さらに、本発明は、Ｈ１（配列番号：１）、Ｈ５（配列番号：５）またはＨ７（配列番号：７）からのＨＡをコードするヌクレオチド配列と、約７０、７５、８０、８５、８７、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％またはその間の任意の量の配列同一性または配列類似性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
【００９９】
配列同一性または配列類似性は、ＤＮＡＳＩＳ内で提供されたものなどのヌクレオチド配列比較プログラムを使用して決定することができる（例えば以下のパラメーターを使用するが、これらに限定されない：ギャップペナルティ５、トップダイアゴナル数５、固定ギャップペナルティ１０、ｋ−タプル２、フローティングギャップ１０およびウィンドサイズ５）。しかしながら、比較のための配列のアライメントの他の方法は当技術分野において周知であり、例えば、Smith & Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482)、Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、Pearson & Lipman (1988, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444)のアルゴリズムであり、これらのアルゴリズムのコンピューターによる遂行（例えばＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＢＬＡＳＴ）によって、または手動アライメントおよび目視検査によって行われるものである。
【０１００】
したがって、本発明は、安定的発現システムまたは一過性発現システムによる使用に適切なキメラコンストラクトを含む適切なベクターをさらに含む。遺伝情報は１つまたは複数のコンストラクト内でも提供することができる。例えば、対象となるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を１つのコンストラクト中に導入し、対象となるタンパク質の糖鎖付加を修飾するタンパク質をコードする第２のヌクレオチド配列は個別のコンストラクトを使用して導入することができる。次いで、これらのヌクレオチド配列を宿主内で共発現させることができる。しかしながら、対象となるタンパク質および対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質の両方をコードするヌクレオチド配列を含むコンストラクトも使用することができる。この事例において、ヌクレオチド配列は、対象となるプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結されたタンパク質をコードする第１の核酸配列を含む第１の配列、および対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする第２の核酸配列を含む第２の配列（第２の配列はプロモーターまたは調節領域に作動可能に連結される）を含むだろう。
【０１０１】
「共発現される」によって、宿主内でおよそ同じ時間で、および宿主の同じ組織内で２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列が発現されることが意味される。しかしながら、ヌクレオチド配列が正確に同じ時間で発現される必要はない。むしろ、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は、コードされた産物が相互作用する機会を有するような様式で発現される。例えば、対象となるタンパク質の糖鎖付加を修飾するタンパク質は、対象となるタンパク質の糖鎖付加の修飾が行われるように、対象となるタンパク質が発現される期間の前にまたはその間に発現させることができる。２つまたはそれ以上の配列の両方の配列が発現されるという条件下でおよそ同じ時間で宿主内で導入される場合には、２つまたはそれ以上のヌクレオチド配列は一過性発現システムを使用して共発現させることができる。あるいは、ヌクレオチド配列のうちの１つ（例えば対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする配列）を含むプラットフォーム宿主は、一過性様式にまたは安定的様式で、対象となるタンパク質をコードする追加の配列により形質転換することができる。この事例において、対象となるタンパク質の糖鎖付加プロフィールを修飾するタンパク質をコードする配列は、所望される発生ステージの間に所望される組織内で発現させることができるか、またはその発現は誘導可能プロモーターを使用して誘導することができ、対象となるタンパク質を、コードする追加の配列を類似する条件下でおよび同じ組織で発現させて、ヌクレオチド配列が共発現されることを保証することができる。
【０１０２】
本発明のコンストラクトは、Ｔｉプラスミド、Ｒｉプラスミド、植物ウイルスベクター、直接的ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを使用して、植物細胞へと導入することができる。かかる技術の総説については、例えば、Weissbach and Weissbach、Methods for Plant Molecular Biology、アカデミー・プレス（Ａｃａｄｅｍｙ Ｐｒｅｓｓ）社、ニューヨークＶＩＩＩ、ｐｐ．４２１−４６３（１９８８）；Geierson and Corey、Plant Molecular Biology、第２版（１９８８）；およびPlant Metabolism中のMiki and Iyer、Fundamentals of Gene Transfer in Plants.、第２版DT. Dennis, DH Turpin, DD Lefebrve, DB Layzell（編）、アディソン・ウェズリー・ラングマン社（Ａｄｄｉｓｏｎ Ｗｅｓｌｙ，Ｌａｎｇｍａｎｓ Ｌｔｄ．）ロンドン、ｐｐ．５６１−５７９（１９９７）を参照。他の方法は、直接的ＤＮＡ取込、リポソームの使用、エレクトロポレーション（例えばプロトプラストを使用して）、マイクロインジェクション、マイクロプロジェクタイルまたはウィスカー、およびバキュームインフィルトレーションを含む。例えば、Bilang, et al. (Gene 100: 247-250 (1991)、Scheid et al. (Mol. Gen. Genet. 228: 104-112, 1991)、Guerche et al. (Plant Science 52: 111-116, 1987)、Neuhause et al. (Theor. Appl Genet. 75: 30-36, 1987)、Klein et al., Nature 327: 70-73 (1987)；Howell et al. (Science 208: 1265, 1980)、Horsch et al. (Science 227: 1229-1231, 1985)、DeBlock et al. (Plant Physiology 91: 694-701, 1989)、Methods for Plant Molecular Biology（Weissbach and Weissbach編、アカデミックプレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．）、１９８８年）、Methods in Plant Molecular Biology（Schuler and Zielinski編、アカデミックプレス社、１９８９年）、Liu and Lomonossoff(J. Virol Meth, 105:343-348, 2002)、米国特許第４，９４５，０５０号；第５，０３６，００６号；および第５，１００，７９２号、１９９５年５月１０日に出願された米国特許出願シリアル番号０８／４３８，６６６、および１９９２年９月２５日に出願された米国特許出願シリアル番号０７／９５１，７１５を参照（そのすべては参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０３】
「調節領域」、「調節エレメント」または「プロモーター」によって、典型的には遺伝子のタンパク質コード領域の上流であるが必ずしもそうではない核酸の一部が意味され、それはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれか、またはＤＮＡおよびＲＮＡの両方からなることができる。調節領域に活性があり、対象となる遺伝子と作動可能に会合しているかまたは作動可能に連結される場合、これは対象となる遺伝子の発現をもたらすことができる。調節エレメントは、器官特異性を媒介することができるか、または発生的遺伝子活性化または時間的遺伝子活性化を制御することができる。「調節領域」は、プロモーターエレメント、基底プロモーター活性を示すコアプロモーターエレメント、外部刺激に応答する誘導可能エレメント、負の調節エレメントなどのプロモーター活性を媒介するエレメントまたは転写エンハンサーを含む。「調節領域」は、本明細書において使用される時、転写の後に活性のあるエレメント、例えば、翻訳および転写のエンハンサー、翻訳および転写のリプレッサー、上流活性化配列、ならびにｍＲＮＡ不安定性デターミナントなどの遺伝子発現を修飾する調節エレメントも含む。これらの後者エレメントのいくつかのものは、コード領域に近くに位置することができる。
【０１０４】
本開示の文脈において、「調節エレメント」または「調節領域」という用語は、典型的には構造遺伝子のコード配列に対して通常上流（５’）であるが必ずしもそうではないＤＮＡの配列を指し、それはＲＮＡポリメラーゼおよび／または特定の部位での転写の開始に必要とされる他の因子のための認識を提供することによって、コード領域の発現を制御する。しかしながら、イントロン内、または配列の３’に位置する他のヌクレオチド配列も、対象となるコード領域の発現の調節に寄与できることを理解すべきである。特定の部位での開始を保証するためにＲＮＡポリメラーゼまたは他の転写因子のための認識を提供する調節エレメントの一例は、プロモーターエレメントである。大部分であるがすべてではない真核生物プロモーターエレメントは、ＴＡＴＡボックス（通常、転写開始部位の約２５塩基対上流に位置するアデノシンおよびチミジンのヌクレオチド塩基対からなる保存された核酸配列）を含有する。プロモーターエレメントは、転写の開始に関与する基底プロモーターエレメントに加えて、遺伝子発現を修飾する他の調節エレメント（上でリストされるような）を含む。
【０１０５】
発生的に調節されるもの、誘導可能なもの、または構成的なものを含むいくつかのタイプの調節領域がある。発生的に調節される調節領域、またはその制御下で遺伝子の差異的な発現を制御する調節領域は、その器官または組織の発生の間の特異的時間で特定の器官または器官の組織内で活性化される。しかしながら、発生的に調節されるいくつかの調節領域は、特異的発生段階の特定の器官または組織内で優先的に活性があってもよく、それらは、植物内の他の器官または組織で発生的に調節される様式でも、または基底レベルででも同様に活性があってもよい。例えば、組織特異的調節領域の実例は、ナピンプロモーターおよびクルシフェリンプロモーターを含む特異的調節領域を参照（Rask et al., 1998, J. Plant Physiol. 152: 595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell 14: 125-130）。葉特異的プロモーターの一例は、プラストシアニンプロモーターを含む（図３；ＵＳ７，１２５，９７８、参照として本明細書に組み込まれる）。
【０１０６】
誘導可能調節領域は、インデューサーに応答して１つまたは複数のＤＮＡ配列または遺伝子の転写を直接または間接的に活性化することができるものである。インデューサーの非存在下において、ＤＮＡ配列または遺伝子は転写されない。典型的には、転写を活性化するために誘導可能調節領域に特異的に結合するタンパク質因子は不活性形態で存在し、次いでそれはインデューサーによって直接または間接的に活性形態に変換される。しかしながら、タンパク質因子も存在しなくてもよい。ンデューサーは、タンパク質、代謝物質、増殖調節因子、除草剤もしくはフェノール化合物などの化学薬剤、または熱、寒冷、塩もしくは有毒物質によって直接、またはウイルスなどの病原菌もしくは病原体の作用を介して間接的に、課された生理的ストレスでありえる。誘導可能調節領域を含有する植物細胞は、噴霧、潅水、加熱または類似する方法によってなど、細胞または植物にインデューサーを外部的に適用することによって、インデューサーに曝露することができる。誘導可能調節エレメントは植物遺伝子または非植物遺伝子のいずれかに由来しうる（例えGatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358；参照として組み込まれる）。可能性のある誘導可能プロモーターの実例は、テトラサイクリン誘導可能プロモーター（Gatz, C.,1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108；参照として組み込まれる）、ステロイド誘導可能プロモーター（Aoyama, T. and Chua, N.H.,1997, Plant J. 2, 397-404；参照として組み込まれる）およびエタノール誘導可能プロモーター（Salter, M.G., et al, 1998, Plant Journal 16, 127-132；Caddick, M.X., et al,1998, Nature Biotech. 16, 177-180、参照として組み込まれる）、サイトカイニン誘導可能なＩＢ６遺伝子およびＣＫＩ１遺伝子（Brandstatter, I. and Kieber, J.J.,1998, Plant Cell 10, 1009-1019；Kakimoto, T., 1996, Science 274, 982-985；参照として組み込まれる）ならびにオーキシン誘導可能エレメント、ＤＲ５（Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell 9, 1963-1971；参照として組み込まれる）を含むが、これらに限定されない。
【０１０７】
構成的調節領域は、植物の様々な部分にわたって、および植物発生の全体にわたって連続的に遺伝子の発現を指令する。公知の構成的調節エレメントの実例は、ＣａＭＶ ３５Ｓ転写物（Odell et al., 1985, Nature, 313: 810-812）、コメのアクチン１遺伝子（Zhang et al, 1991, Plant Cell, 3: 1155-1165）、アクチン２遺伝子（An et al., 1996, Plant J., 10: 107-121）、またはｔｍｓ ２遺伝子（Ｕ．Ｓ．５，４２８，１４７、参照として本明細書に組み込まれる）、およびトリオースリン酸イソメラーゼ１遺伝子（Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106: 459-467）、トウモロコシのユビキチン１遺伝子（Cornejo et al, 1993, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、シロイヌナズナのユビキチン１および６遺伝子（Holtorf et al, 1995, Plant Mol. Biol. 29: 637-646）、ならびにタバコ翻訳開始因子４Ａ遺伝子（Mandel et al, 1995 Plant Mol. Biol. 29: 995-1004）と結合したプロモーターを含む。本明細書において使用される時「構成的」という用語は、構成的調節領域の制御下で遺伝子がすべての細胞タイプにおいて同じレベルで発現することを必ずしも示さないが、存在量の変動はしばしば観察されても遺伝子が広範囲の細胞タイプにおいて発現することを示す。
【０１０８】
「作動可能に連結された」によって、特定の配列（例えば調節エレメントおよび対象となるコード領域）が、遺伝子発現の媒介または修飾などの意図された機能を実行するために直接または間接的に相互作用することが意味される。作動可能に連結された配列の相互作用は、例えば、作動可能に連結された配列と相互作用するタンパク質によって媒介されうる。
【０１０９】
本発明の１つまたは複数のヌクレオチド配列は、本発明のヌクレオチド配列、またはコンストラクト、またはベクターによって形質転換される任意の適切な植物宿主において発現することができる。適切な宿主の実例は、アルファルファ、キャノーラ、アブラナ属の種、トウモロコシ、タバコ属の種、アルファルファ、ジャガイモ、チョウセンニンジン、エンドウ、カラスムギ、コメ、ダイズ、コムギ、オオムギ、ヒマワリ、ワタおよび同種のものを含む農作物を含むが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝子コンストラクトは、３’非翻訳領域をさらに含むことができる。３’非翻訳領域は、ポリアデニル化シグナル、およびｍＲＮＡのプロセシングまたは遺伝子発現をもたらすことができる他の調節シグナルを含有するＤＮＡセグメントを含む遺伝子の一部を指す。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡの前駆体の３’末端にポリアデニル酸トラックの追加をもたらすことによって通常特徴づけられる。ポリアデニル化シグナルは、変動がないわけではないが、カノニカル形態５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって一般に認識される。本発明の１つまたは複数のキメラ遺伝子コンストラクトは、エンハンサー（翻訳エンハンサーまたは転写エンハンサーのいずれか）も必要に応じてさらに含むことができる。これらのエンハンサー領域は当業者に周知であり、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接した配列を含むことができる。完全な配列の翻訳を保証するために、開始コドンはコード配列のリーディングフレームと同調しなくてはならない。
【０１１１】
適切な３’領域の非限定例は、ノパリンシンターゼ（Ｎｏｓ遺伝子）などのアグロバクテリウムの腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、ならびにダイズ貯蔵タンパク質遺伝子およびリブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）遺伝子などの植物遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３’転写される非翻訳領域、ならびにプラストシアニン発現調節に使用されるプロモーター（Pwee and Gray 1993；参照として本明細書に組み込まれる）である。プラストシアニンプロモーターの一例は、ＵＳ７，１２５，９７８（参照として本明細書に組み込まれる）中で記載される。
【０１１２】
本明細書において記載されるように、葉発現において実証された効率を持つエンハンサー配列を含むプロモーターは一過性発現に効果的であることが見出されてきた。理論に束縛されるものではないが、核マトリックスへの付着による光合成の遺伝子の上流調節エレメントの付着は、強い発現を媒介することができる。例えば、エンドウのプラストシアニン遺伝子の翻訳開始部位から−７８４までは、強いレポーター遺伝子発現を媒介するために使用することができる。
【０１１３】
光合成の遺伝子からの調節領域（例えば、プラストシアニン調節領域（ＵＳ７，１２５，９７８；参照として本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Leutwiler et a; 1986；参照として本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と会合するStockhaus et al.1989；参照として本明細書に組み込まれる）から得られた調節領域であるが、これらに限定されない）の使用は本発明に従って使用することができる。
【０１１４】
形質転換された植物細胞の同定を支援するために、本発明のコンストラクトは植物選択マーカーを含んでいるようにさらに操作することができる。有用な選択マーカーは、抗生物質（例えばゲンタマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン）または除草剤（ホスフィノトリシン、グリフォサート、クロロスルフロンおよび同種のものなど）などの化学物質に対する耐性を提供する酵素を含む。同様に、色変化（ＧＵＳ（β‐グルクロニダーゼ）など）または発光（ルシフェラーゼまたはＧＦＰなど）によって識別可能な化合物の産生を提供する酵素を使用することができる。
【０１１５】
これらの遺伝子のもたらされたｃＤＮＡコピーは、宿主発現システムによって要求されるような適切な発現ベクター中でクローン化することができる。あるいは、植物に適切な発現ベクターの実例は、以下に記載されるバキュロウイルス発現ベクター、例えばｐＦａｓｔＢａｃ１（インビトロゲン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）社）であり、公知の方法を使用して、および製造者の使用説明書によって提供された情報を使用して、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベースのプラスミドがもたらされる。
【０１１６】
本発明は、上記されるように、植物中で作動可能な調節エレメントに作動可能に連結されたＨＡをコードする核酸を含む遺伝子コンストラクトをさらに指向する。植物細胞中で作動可能な調節エレメントおよび本発明に従って使用することができるものの実例は、プラストシアニン調節領域（ＵＳ７，１２５，９７８；参照として本明細書に組み込まれる）、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ；ＵＳ４，９６２，０２８；参照として本明細書に組み込まれる）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質（ＣＡＢ；Leutwiler et al; 1986；参照として本明細書に組み込まれる）、ＳＴ−ＬＳ１（光化学系ＩＩの酸素発生複合体と会合する、Stockhaus et al. 1989；参照として本明細書に組み込まれる）から得られる調節領域を含むが、これらに限定されない。コンストラクトが昆虫細胞中で発現されるならば、昆虫細胞中で作動可能な調節エレメントの実例は、ポリヘドロン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｎ）プロモーター、ｇｐ６４プロモーターおよび同種のものを含むが、これらに限定されない。
【０１１７】
本発明は、ＨＡ（例えば、ヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５ウイルスＨＡ（Ｈ５Ｎ１）であるが、これらに限定されない）をコードする核酸の植物、酵母または昆虫の発現ベクター（例えばバキュロウイルス発現ベクター）へのクローニング、および形質転換された植物細胞または形質転換された昆虫細胞中で、機能的および免疫原的に同型の巨大分子性タンパク質構造（インフルエンザサブウイルス粒子およびインフルエンザＶＬＰを含む）へと自己集合する組換えインフルエンザ構造タンパク質からなるインフルエンザワクチンの候補または試薬の産生をさらに提供する。
【０１１８】
ＨＡをコードする核酸、例えば、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ遺伝子、またはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５ウイルスＨＡ遺伝子であるが、これらに限定されないものを、適切な細胞株、例えば、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞（例えばＳｆ−９細胞株；ＡＴＣＣ ＰＴＡ−４０４７）中で、例えば、バキュロウイルス発現システムを使用して、発現させることができる。他の昆虫細胞株も使用することができる。
【０１１９】
ＨＡをコードする核酸は、代わって、植物細胞または植物中で発現させることができる。ＨＡをコードする核酸は、ＨＡ ＲＮＡを使用する逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって合成することができる。一例として、ＲＮＡは、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスもしくはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスから、またはインフルエンザウイルスに感染させた細胞から単離することができる。逆転写およびＰＣＲのために、ＨＡ ＲＮＡ（例えば、ヒトインフルエンザＡ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）ウイルスＨＡ遺伝子またはヒトインフルエンザＡ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１）ウイルスＨＡ０遺伝子であるが、これらに限定されないもの）に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。さらに、ＨＡをコードする核酸は、当業者に公知であるような方法を使用して、化学的に合成することができる。
【０１２０】
６−タンパク質
本発明は、ヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７（Ｈ１、Ｈ５またはＨ７からのＨＡをそれぞれコードする）、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをコードする核酸にそれぞれハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７、またはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、Ｈ１、Ｈ５もしくはＨ７からのＨＡをそれぞれコードする核酸の相補物にハイブリダイズするヌクレオチド配列の配列番号：１；配列番号：５；配列番号：７によってコードされる１つまたは複数のＨＡタンパク質も含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。
【０１２１】
同様に、本発明は、以下の亜型Ｈ１（配列番号：１によってコードされる）、Ｈ２（配列番号：２によってコードされる）、Ｈ３（配列番号：３によってコードされる）、Ｈ４（配列番号：４によってコードされる）、Ｈ５（配列番号：５によってコードされる）、Ｈ６（配列番号：６によってコードされる）、Ｈ７（配列番号：７によってコードされる）、Ｈ８（配列番号：８によってコードされる）、Ｈ９（配列番号：９によってコードされる）、Ｈ１０（配列番号：１０によってコードされる）、Ｈ１１（配列番号：１１によってコードされる）、Ｈ１２（配列番号：１２によってコードされる）、Ｈ１３（配列番号：１３によってコードされる）、Ｈ１４（配列番号：１４によってコードされる）、Ｈ１５（配列番号：１５によってコードされる）、Ｈ１６（配列番号：１６によってコードされる）と関連するＨＡ；およびＨ１（配列番号：１）、Ｈ２（配列番号：２）、Ｈ３（配列番号：３）、Ｈ４（配列番号：４）、Ｈ５（配列番号：５）、Ｈ６（配列番号：６）、Ｈ７（配列番号：７）、Ｈ８（配列番号：８）、Ｈ９（配列番号：９）、Ｈ１０（配列番号：１０）、Ｈ１１（配列番号：１１）、Ｈ１２（配列番号：１２）、Ｈ１３（配列番号：１３）、Ｈ１４（配列番号：１４）、Ｈ１５（配列番号：１５）、Ｈ１６（配列番号：１６）と約６０乃至１００％もしくはその間の任意の量の配列同一性、特に約７０乃至１００％の相同性もしくはその間の任意の量、８０乃至１００％もしくはその間の任意の量、９０〜１００％もしくはその間の任意の量、または９５〜１００％もしくはその間の任意の量の配列同一性を有するとして特徴づけられるヌクレオチド配列を含み、ヌクレオチド配列は、発現させた場合ＶＬＰを形成する赤血球凝集素タンパク質をコードし、ＶＬＰは抗体の産生を誘導する。例えば、植物細胞内でのヌクレオチド配列の発現はＶＬＰを形成し、ＶＬＰは、成熟ＨＡ、ＨＡ０、ＨＡ１またはＨＡ２を含むＨＡの結合が可能な抗体を産生するために使用することができる。ＶＬＰは被験体に投与された場合免疫応答を誘導する。
【０１２２】
７−ＶＬＰ
したがって、本発明は１つまたは複数のＨＡ型または亜型を含むＶＬＰに関する。
【０１２３】
「ウイルス様粒子」（ＶＬＰ）、または「複数のウイルス様粒子」もしくは「複数のＶＬＰ」という用語は、自己集合し、インフルエンザＨＡタンパク質などの構造タンパク質を含む構造を指す。ＶＬＰは一般的には、感染中に産生されるビリオンに形態学的および抗原的に類似するが、複製に十分な遺伝情報を欠損し、したがって非感染性である。いくつかの実例において、ＶＬＰは単一のタンパク質種、または１つ以上のタンパク種を含むことができる。１つ以上のタンパク種を含むＶＬＰについては、タンパク種はウイルスの同じ種からでありえるか、またはウイルスの異なる種、属、亜科または科（ＩＣＴＶ命名法によって表記されるように）からのタンパク質を含むことができる。他の実例において、ＶＬＰを含む１つまたは複数のタンパク種は、天然に存在する配列から修飾されてもよい。ＶＬＰは植物宿主細胞および昆虫宿主細胞を含む適切な宿主細胞中で産生することができる。宿主細胞からの抽出に続いて、そして適切な条件下での単離およびさらなる精製に際して、ＶＬＰはインタクトな構造として精製することができる。
【０１２４】
本発明は、ＶＬＰタンパク質が発現される細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得る、インフルエンザに由来するＶＬＰも含むが、これらに限定されない。例えば、ＶＬＰが植物をベースのシステム中で発現されるならば、ＶＬＰは細胞の原形質膜から脂質エンベロープを得ることができる。
【０１２５】
一般的には、「脂質」という用語は、脂溶性（親油性）で天然に存在する分子を指す。この用語は、より具体的には、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリグリセリド、ジグリセリド、およびモノグリセリドならびにリン脂質を含む）に加えて、他の脂溶性のステロール含有代謝物質またはステロールを指すのにも使用される。リン脂質は、糖脂質、ステロールおよびタンパク質と共に、すべての生体膜の主要な成分である。リン脂質の実例は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、および同種のものを含む。ステロールの実例は、動物性ステロール（例えばコレステロール）および植物性ステロールを含む。２００以上の植物性ステロールが様々な植物種において同定され、最も一般的なものは、カンペステロール、スチグマステロール、エルゴステロール、ブラジカステロール、デルタ−７−スチグマステロール、デルタ−７−アベナステロール、ダウノステロール（ｄａｕｎｏｓｔｅｒｏｌ）、シトステロール、２４−メチルコレステロール、コレステロールまたはβ−シトステロールである。当業者が理解するように、細胞の原形質膜の脂質組成は、細胞、または細胞が得られる生物の培養または増殖の条件に応じて変動しうる。
【０１２６】
細胞膜は一般的には、様々な機能のために、脂質二重層に加えてタンパク質を含む。特定の脂質の局所的な濃縮は、「脂質ラフト」と呼ばれて、脂質二重層において見出すことができる。理論に束縛されるものではないが、脂質ラフトは、エンドサイトーシスおよびエキソサイトーシス、ウイルスまたは他の感染因子の侵入または放出、細胞間シグナル伝達、細胞内マトリックスおよび細胞外マトリックスなどの細胞または生物の他の構造成分との相互作用における有意な役割を有することができる。
【０１２７】
本発明に従ってインフルエンザに由来するタンパク質から産生されたＶＬＰは、Ｍ１タンパク質を含まない。Ｍ１タンパク質はＶＬＰ調製物の混入物であるＲＮＡを結合すること（Wakefield and Brownlee, 1989）が公知である。ＶＬＰ産物についての規制認可を得るときにＲＮＡの存在は所望されず、したがってＲＮＡを欠損するＶＬＰ調製物は有利であろう。
【０１２８】
本発明のいくつかの態様に従う植物中で産生されたＶＬＰは、植物に由来する脂質と複合体を形成することができる。ＶＬＰはＨＡ０、ＨＡ１もしくはＨＡ２ペプチドまたはその組合せを含むことができる。植物に由来する脂質は、脂質二重層形態であり、ＶＬＰを囲むエンベロープをさらに含むことができる。植物に由来する脂質は、ＶＬＰが産生される植物の原形質膜の脂質成分、および例えば１つまたは複数の植物由来脂質（ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、スフィンゴ糖脂質または植物性ステロールまたはその組み合わせを含むが、これらに限定されない）を含むことができる。植物に由来する脂質は「植物脂質」とも呼ぶことができる。
【０１２９】
植物において、インフルエンザＶＬＰは原形質膜から出芽し、したがってＶＬＰの脂質組成はそれらの起原を反映する。本発明に従って産生されたＶＬＰは、植物に由来する脂質と複合体を形成したＨＡを含む。植物脂質は特異的免疫細胞を刺激し、誘導された免疫応答を促進することができる。植物膜は脂質、ホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）から構成されており、スフィンゴ糖脂質、サポニンおよび植物性ステロールも含有する。さらに、脂質ラフトも植物原形質膜に見出され、これらのマイクロドメインはスフィンゴ脂質およびステロールに富んでいる。植物において、スチグマステロール、シトステロール、２４−メチルコレステロールおよびコレステロールを含む、様々な植物性ステロールが存在することが公知である（Mongrand et al., 2004）。
【０１３０】
スフィンゴ糖脂質に加えて、ＰＣおよびＰＥは、樹状細胞およびマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに胸腺および肝臓中のＢリンパ球およびＴリンパ球を含む他の細胞などの哺乳類の免疫細胞によって発現されたＣＤ１分子と結合することができる（Tsuji M,. 2006）。ＣＤ１分子はクラスＩの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に構造的に類似しており、それらの役割はＮＫＴ細胞（ナチュラルキラーＴ細胞）に対して糖脂質抗原を提示することである。活性化に際して、ＮＫＴ細胞は、ＮＫ細胞および樹状細胞などの先天性免疫細胞を活性化し、抗体を産生するＢ細胞およびＴ細胞のような適応免疫細胞も活性化する。
【０１３１】
様々な植物性ステロールを原形質膜に見出すことができ、特異的相補物は、種、生育条件、栄養素源または病原体状態（いくつかの因子が挙げられる）に応じて変動してもよい。一般的には、β−シトステロールは最も多量にある植物性ステロールである。
【０１３２】
原形質膜由来エンベロープなどの脂質二重層と複合体を形成したインフルエンザＶＬＰにおいて提示された植物性ステロールは、有利なワクチン組成物を提供することができる。理論に束縛されるものではないが、原形質膜由来エンベロープなどの脂質二重層と複合体を形成した植物で作製されたＶＬＰは、他の発現システム中で作製されたＶＬＰよりも強い免疫反応を誘導し、生または弱毒化された全ウイルスワクチンによって誘導された免疫反応に類似する。
【０１３３】
したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、植物に由来する脂質二重層と複合体を形成したＶＬＰを提供する。いくつかの実施形態において、植物に由来する脂質二重層は、ＶＬＰのエンベロープを構成することができる。
【０１３４】
８−組成物
したがって、本発明は、効果的な用量のＶＬＰ（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。インフルエンザウイルスＨＡタンパク質は、Ｈ５インドネシアでありえる。さらに、インフルエンザウイルス感染に対する被験体の免疫を誘導する方法が提供される。方法は、ウイルス様粒子（インフルエンザウイルスＨＡタンパク質、１つまたは複数の植物脂質を含む）および薬学的に許容される担体を投与することを含む。ウイルス様粒子は、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で被験体に投与することができる。
【０１３５】
９−治療の方法
本発明は、インフルエンザウイルス感染に対する免疫、または「免疫応答の誘発」を被験体において誘導する方法であって、本明細書において定義されるような組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１３６】
「免疫応答」は、一般的には適応免疫系の応答を指す。適応免疫系は一般的には液性応答および細胞媒介性応答を含む。液性応答は、Ｂリンパ球系列（Ｂ細胞）の細胞において産生される分泌抗体によって媒介される免疫の態様である。分泌抗体は、侵入微生物（ウイルスまたは細菌など）の表面上の抗原に結合し、抗体は破壊のために微生物に目印を付ける。液性免疫は、一般的には、抗体産生およびそれに伴うプロセスに加えて、抗体のエフェクター機能（Ｔｈ２細胞活性化およびサイトカイン産生、メモリー細胞生成、ファゴサイトーシスのオプソニン促進、病原菌除去および同種のものを含む）を指すために使用される。
【０１３７】
細胞媒介性応答は、抗体を含まないが、むしろマクロファージ、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ）、抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球の活性化、および抗原に応答した様々なサイトカインの放出を含む免疫応答である。細胞媒介性免疫は、一般的に、何らかのＴｈ細胞活性化、Ｔｃ細胞活性化およびＴ細胞媒介性応答を指すために使用される。細胞媒介性免疫は、ウイルス感染への応答において特に重要である。
【０１３８】
本発明の組換えＨＡ ＶＬＰは、ワクチンを補足してそれらをより効果的にし、必要な投与量を減少させるために、既存のインフルエンザワクチンと併用して使用することができる。当業者に公知であるように、ワクチンは１つまたは複数のインフルエンザウイルスに対して指向することができる。適切なワクチンの実例は，サノフィ・パスツール（Ｓａｎｏｆｉ−Ｐａｓｔｅｕｒ）社、ＩＤ・バイオメディカル（ＩＤ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）社、メリアル（Ｍｅｒｉａｌ）社、シノバック（Ｓｉｎｏｖａｃ）社、カイロン（Ｃｈｉｒｏｎ）社、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）社、メディミューン（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ）社、グラクソ・スミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）社、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）社、サノフィ・アベンティス（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）社、セローノ（Ｓｅｒｏｎｏ）社、シレ・ファーマシューティカルズ（Ｓｈｉｒｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社および同種のものから商業的に入手可能なものを含むが、これらに限定されない。
【０１３９】
所望されるならば、本発明のＶＬＰは、当業者に公知であるような適切なアジュバントと混合することができる。さらに、ＶＬＰは、上で定義されるように標的生物の処置に効果的な用量のＶＬＰを含むワクチン組成物中で使用することができる。さらに、本発明に従って産生されたＶＬＰは、異なるインフルエンザタンパク質（例えばノイラミニダーゼ（ＮＡ））を使用して得られるＶＬＰと組み合わせることができる。
【０１４０】
したがって、本発明は、１つまたは複数のＶＬＰを含むワクチンの効果的な用量を投与することを含む、動物または標的生物中でインフルエンザウイルス感染に対する免疫を誘導する方法を提供する。ワクチンは、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内で、または皮下で投与することができる。
【０１４１】
図６および７中で示されるように、インビトロの分析は、変異させたＡ／インドネシア／５／０５ Ｈ５ ＶＬＰ、ならびにＡ／ベトナム／１２０３／０４；Ａ／アンホイ／１／０５およびＡ／トルコ／５８２／０６などの他のインフルエンザ株（すべてＨ５Ｎ１株）に対して作製された抗体の交差反応性を示すが、検査されたＨ１Ｎ１に対してのみより低い赤血球凝集反応性を示す（図７）。
【０１４２】
重要なことに、変異させたＨ５Ｎ１（糖鎖が付加されないＨ５タンパク質）の単一投薬後に産生された抗体は、１４日後に試験されたすべてのＨ５株に対して、野生型Ｈ５に対して産生された抗体よりもより高い応答を誘導し、この糖鎖が付加されなかった免疫原は野生型ものよりも迅速な応答を提供できることを示した。
【０１４３】
したがって、これらのデータは、Ｎ結合型炭水化物を欠く変異させたＨ５赤血球凝集素ウイルスタンパク質を含む、植物で作製されたインフルエンザＶＬＰは、病原性インフルエンザ株に特異的免疫応答を誘導し、この応答が交差反応性であり、１回の単一投薬後に迅速に起こることを実証する。
【０１４４】
１０−被験体
本発明のＶＬＰを投与することができる被験体または標的生物の実例は、ヒトおよび霊長類、トリ、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、シチメンチョウ、ニワトリ、ブタ、ヒツジ、ウマ科の動物、ウマ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、ウサギ、マウス、ラット、モルモットまたは他のげっ歯類、アザラシ、クジラ、および同種のものを含むが、これらに限定されないかかる標的生物は例示的であり、本発明の適用および使用に対して限定して判断されるべきではない。
【０１４５】
本発明は、他の哺乳類または宿主動物、例えば、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ、鳥類、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、シチメンチョウ、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラ、および同種のものに感染するインフルエンザウイルスにも関する。
【０１４６】
特に、上で定義されるような方法によって治療される被験体は、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）、水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、ニワトリ、イヌ、ネコ、フェレット、家畜および同種のものを含む群から選択することができる。特に、被験体は、ヒト患者またはトリ一般（水鳥、渡り鳥、家禽（ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリなどの）を含む）、特に渡り鳥またはヒトの消費のための家禽（ウズラ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ニワトリ）でありえる。より詳細には、被験体はヒトである。
【０１４７】
１１−容器、シリンジおよびキットなど
本発明は、本明細書において定義されるような組成物を含む容器も提供する。特に、容器は単一単位用量、または防腐剤を含む複数投与量形態を含有する。より詳細には、容器は、本明細書において定義されるような組成物またはワクチンにより充填済みの「使用のために準備済み」のシリンジである。
【０１４８】
より詳細には、本発明は、本明細書において定義されるようなワクチンまたは組成物を含む容器、および前記組成物／ワクチンの使用／投与方法の説明書を含むキットも提供する。
【０１４９】
本発明はここで以下の非限定例を単なる参照として詳細に記載される。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
材料および方法
１．変異させ糖鎖付加のないＨ５を得るためのＡ／インドネシア／５／０５（配列番号：１７）からの野生型Ｈ５の変異。
三重変異体は、野生型ＨＡの球状頭部に位置する糖鎖付加部位のＮ１５４、Ｎ１６５およびＮ２８６の除去によって、より具体的には糖鎖付加配列パターンＮ−Ｘ−Ｔ／Ｓ中にあるＴｈｒまたはＳｅｒのＡｌａ残基による置換によって作製された。したがって、三重変異体は以下の３つのアミノ酸置換を含有する。Ｔ１５６Ａ、Ｔ１６７ＡおよびＳ２８８Ａ（開始の配列番号：１７に従って番号付けした）。３つのアミノ酸置換は、鋳型として野生型ＨＡ発現ベクター（６６０コンストラクト、図４）を使用して、Darveau et al. (1995)中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション方法によって行なわれた。
【０１５１】
簡潔には、以下の３つのＰＣＲ増幅を、異なる３ペアのプライマーにより鋳型として６６０ ｐＣＡＭＢＩＡ発現ベクターで平行して行った。
１）Ｐｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：１８）およびＨＡ５−Ｔ１５６Ａ．ｒ（配列番号：１９）；
２）ＨＡ５−Ｔ１６７Ａ．Ｃ（配列番号：２０）およびＨＡ５−Ｓ２８８Ａ．ｒ（配列番号：２１）；ならびに
３）ＨＡ５−Ｓ２８８Ａ．Ｃ（配列番号：２２）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−ＳａｃＩ．ｒ（配列番号：２３）。
【０１５２】
３つの反応から得た増幅産物をともに混合し、プライマーとしてＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：１８）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：２３）を使用して、第４の反応（組み立て反応）のための鋳型として混合物を使った。もたらされた断片をＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中に位置する）およびＳａｃＩ（断片の３’末端にある）により消化し、事前に同じ酵素により消化したｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏの中にクローン化した。６８０と命名したもたらされたプラスミドを図５中に示す（配列番号：２９）。
【０１５３】
２．発現カセットの組み立て
すべての操作は、Sambrook and Russell（２００１；参照として本明細書に組み込まれる）の一般的な分子生物学プロトコールを使用して実行した。第１のクローニング工程は、アルファルファプラストシアニン遺伝子の上流調節エレメントおよび下流調節エレメントを含有する受容体プラスミドを組み立てることであった。プラストシアニンプロモーターおよび５’ＵＴＲ配列は、オリゴヌクレオチドプライマーＸｍａＩ−ｐＰｌａｓ．ｃ（配列番号：２４）およびＳａｃＩ−ＡＴＧ−ｐＰｌａｓ．ｒ（配列番号：２５）を使用して、アルファルファゲノムＤＮＡから増幅した。もたらされた増幅産物をＸｍａＩおよびＳａｃＩにより消化し、事前に同じ酵素により消化したｐＣＡＭＢＩＡ２３００（キャンビア（Ｃａｍｂｉａ）社、キャンベラ、オーストラリア）の中へライゲーションして、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏ Ｐｌａｓｔｏを生成した。同様に、プラストシアニン遺伝子の３’ＵＴＲ配列およびターミネーターは、プライマーのＳａｃＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｃ（配列番号：２６）およびＥｃｏＲＩ−ＰｌａｓＴｅｒ．ｒ（配列番号：２７）を使用してアルファルファゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＣＡＭＢＩＡｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏの同じ部位の中へ挿入する前にＳａｃＩおよびＥｃｏＲＩにより産物を消化して、ｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏを生成した。
【０１５４】
３．Ｈ５発現カセットの組み立て
インフルエンザ株Ａ／インドネシア／５／０５（Ｈ５Ｎ１；アクセッション番号ＬＡＮＬ ＩＳＤＮ１２５８７３）からの赤血球凝集素をコードする断片は、エポック・バイオラボ（Ｅｐｏｃｈ Ｂｉｏｌａｂｓ）社（シュガーランド、テキサス、アメリカ）によって合成された。最初のＡＴＧのすぐ上流のＨｉｎｄＩＩＩ部位が隣接する天然のシグナルペプチドを含む完全なＨ５コード領域（配列番号：１７）およびストップ（ＴＡＡ）コドンのすぐ下流のＳａｃＩ部位を含有する、産生された断片を、配列番号：２８（および変異体Ｈ５の事例においては配列番号：２９）中で提示する。Ｈ５コード領域を、Darveau et al. (1995)中で提示されたＰＣＲベースのライゲーション法によってプラストシアニンベースの発現カセットの中へクローン化した。簡潔には、第１のＰＣＲ増幅物を、プライマーのＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：３０）およびＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｐｌａｓｔｏ．ｒ（配列番号：３１）、ならびに鋳型としてｐＣＡＭＢＩＡ ｐｒｏｍｏＰｌａｓｔｏを使用して得た。平行して、鋳型としてＨ５コード断片、プライマーのＰｌａｓｔｏ−ＳｐＨＡ（Ｉｎｄ）．ｃ（配列番号：６）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：３２）を用いて、第２の増幅を行った。両方の反応から得た増幅をともに混合し、プライマーとしてＰｌａｔｏ−４４３ｃ（配列番号：４）およびＨＡ（Ｉｎｄ）−Ｓａｃ．ｒ（配列番号：３３）を使用し、混合物を鋳型として、第３の反応（組み立て反応）を行った。たらされた断片を、ＢａｍＨＩ（プラストシアニンプロモーター中の）およびＳａｃＩ（断片の３’末端で）で消化し、事前に同じ酵素で消化したｐＣＡＭＢＩＡＰｌａｓｔｏの中へクローン化した。６６０と命名したもたらされたプラスミドを図５中で提示するが、「変異させた」Ｈ５タンパク質からもたらされたプラスミドは６８０と命名する。
【０１５５】
Hamilton et al. (2002)中で記載されるように、ＨｃＰｒｏコンストラクト（３５ＨｃＰｒｏ）を調製した。すべてクローンをコンストラクトの全体性を確認するために配列決定した。プラスミドを使用して、エレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）（ＡＧＬ１；ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア２０１０８、アメリカ）を形質転換した（Mattanovich et al., 1989）。すべてのＡ．ツメファシエンス株の全体性を制限マッピングによって確認した。
【０１５６】
４．植物バイオマスの調製、接種物、アグロインフィルトレーションおよび収穫
植物のニコチアナ・ベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）植物を、市販のピートモス基質で満たした低地において種子から育てた。１６／８の光周期および２５℃昼／２０℃夜の温度レジーム下の温室中で植物を成長させた。種まきの３週間後に、個別の苗木を選び、ポットに移植し、同じ環境条件下の温室中でさらに３週間成長させた。形質転換前に、頂芽および腋芽を、植物から芽をはさむことによってまたは化学的に植物を処理することによってのいずれかで、様々な時間で以下に示すように除去した。
【０１５７】
プラスミド６６０またはプラスミド６８０によりトランスフェクションしたアグロバクテリアを、それらが０．６乃至１．６の間のＯＤ６００に到達するまで、１０ｍＭ ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２０μＭアセトシリンゴン、５０μｇ／ｍｌカナマイシンおよび２５μｇ／ｍｌカルベニシリンｐＨ５．６により補足されたＹＥＢ培地中で増殖させた。アグロバクテリウム懸濁物を使用の前に遠心分離し、インフィルトレーション培地（１０ｍＭ ＭｇＣｌ2および１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．６））中で再懸濁した。Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348)によって記載されるように、シリンジインフィルトレーションを行った。バキュームインフィルトレーションのために、Ａ．ツメファシエンス懸濁物を遠心分離し、インフィルトレーション培地中で再懸濁し、４℃で一晩保存した。インフィルトレーションの日に、培養バッチを２．５培養体積で希釈し、使用の前に暖めた。ニコチアナ・ベンサミアナの全植物体を、２０〜４０トルの真空下で気密性ステンレス鋼タンク中の細菌懸濁液中で転倒させて２分間置いた。シリンジインフィルトレーションまたはバキュームインフィルトレーションに続いて、収穫までの４〜５日のインキュベーション期間、植物を温室に戻した。
【０１５８】
５．葉サンプリングおよび全タンパク質抽出
インキュベーションに続いて、植物の地上構造の部分を収穫し、−８０℃で凍結し、破砕して細かくした。冷却した５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリドの３体積中で、凍結破砕した各々の植物材料のサンプルをホモジナイズ（ポリトロン）することによって、全可溶性タンパク質を抽出した。ホモジナイゼーション後に、スラリーを４℃で２０分間２０，０００ｇで遠心分離し、清澄化した粗抽出物（上清）を分析のために保存した。清澄化した粗抽出物の全タンパク質含有量を、参照スタンダードとしてウシ血清アルブミンを使用して、ブラッドフォード分析（バイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）社、ヘラクレス、カリフォルニア）によって決定した。
【０１５９】
６．タンパク質分析およびイムノブロット
タンパク質濃度はＢＣＡプロテインアッセイ（ｐｒｏｔｅｉｎ ａｓｓａｙ）（ピアース・バイオケミカルズ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）社ロックポート、イリノイ）によって決定した。タンパク質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クマシーブルーにより染色した。染色したゲルをスキャンし、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を使用してデンシトメトリー解析を行った。
【０１６０】
ＳＥＣからの溶出画分からのタンパク質をアセトンにより沈殿させ（Bollag et al., 1996）、１／５体積の平衡／溶出緩衝液中で再懸濁し、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、免疫検出のためにポリビニレンジフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（ロッシュ・ダイアグノスティックス社（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、インディアナポリス、インディアナ）上に電気的に転写した。イムノブロット前に、膜は、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中の５％スキムミルクおよび０．１％ツイーン２０により４℃で１６〜１８時間ブロックした。
【０１６１】
イムノブロットは以下の抗体を用いたインキュベーションによって行った。Ｈ１の検出については、マウス抗インフルエンザＡ型モノクローナル抗体（フィッツジェラルド・インダストリーズ・インターナショナル（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）社、コンコード、マサチューセッツ、アメリカ、カタログ番号１０−１５０）（ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で２μｇ／ｍｌ）、およびＨ５の検出については、ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１／４０００に希釈したウサギ抗Ｈ５（ベトナム）抗体（イミューン・テクノロジー（Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社、ウッドサイド、ニューヨーク、アメリカ）、カタログ番号ＩＴ−００３−００５Ｖ）。ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ウエストグローブ、ペンシルバニア、アメリカ、カタログ番号１１５−０３５−１４６）（ＴＢＳ−０．１％ツイーン２０中の２％スキムミルク中で１／１２０００に希釈した）を、二次抗体として使用した。免疫反応性複合体を化学発光によって検出した（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）。ヒトＩｇＧ抗体のホースラディッシュペルオキシダーゼ酵素へのコンジュゲーションは、ＥＺ−リンクプラス（ＥＺ−Ｌｉｎｋ Ｐｌｕｓ）（登録商標）アクティベーティッドペルオキシダーゼコンジュゲーションキット（Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）（ピアース社、ロックフォード、イリノイ）の使用によって実行した。
【０１６２】
Ｈ５についての赤血球凝集分析はNayak and Reichl (2004)によって記載された方法に基づいた。簡潔には、試験サンプル（１００μＬ）の連続的な２倍希釈を、１ウェルあたり１００μＬの希釈サンプルを残して、１００μＬのＰＢＳを含むＶ底の９６ウェルマイクロタイタープレート中で作製した。１００マイクロリットルの０．２５％シチメンチョウ赤血球懸濁物（バイオ・リンク社（Ｂｉｏ Ｌｉｎｋ Ｉｎｃ．）、シラキュース、ニューヨーク）を各々のウェルに追加し、プレートを室温で２時間インキュベーションした。完全な赤血球凝集を示す最高希釈の逆数をＨＡ活性として記録した。平行して、組換えＨＡスタンダード（Ａ／ベトナム／１２０３／２００４ Ｈ５Ｎ１）（プロテイン・サイエンス社（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、メリデン、コネチカット）をＰＢＳ中で希釈し、各々のプレートで対照として使用した。
【０１６３】
７．Ｈ５ ＶＬＰ精製
６６０または６８０をインフィルトレーションしたＮ．ベンサミアナの凍結葉を、市販のブレンダーを使用して、１．５体積の５０ｍＭトリス（ｐＨ８）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０４％メタ重亜硫酸ナトリウム中でホモジナイズした。生じた抽出物に１ｍＭ ＰＭＳＦを補足し、１Ｍ酢酸でｐＨ６に調節し、５分間４２℃で加熱した。ｐＨシフトおよび熱処理によって沈殿させた混入物を吸着するために珪藻土（ＤＥ）を熱処理した抽出物に追加し、スラリーをワットマンの濾紙を通して濾過した。生じた清澄化抽出物は残りのＤＥを除去するために室温で１０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．８／０．２μｍアクロパック（Ａｃｒｏｐａｃｋ）２０フィルターを通し、フェチュイン−アガロース親和性カラム（シグマ−アルドリッチ社、セントルイス、ミズーリ、アメリカ）上にロードした。４００ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス（ｐＨ６）中での洗浄工程に続いて、結合タンパク質を１．５Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６）により溶出した。溶出されたＶＬＰは、０．０００５％（ｖ／ｖ）の最終濃度までツイーン８０で補足した。ＶＬＰを１００ｋＤａ分子量カットオフアミコンの膜で濃縮し、４℃で３０分間１０，０００×ｇで遠心分離し、０．０１％ツイーン８０および０．０１％チメロサールを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で再懸濁した。懸濁したＶＬＰを使用前にフィルター滅菌した。
【０１６４】
８．動物研究
インフルエンザＶＬＰ投与に対する免疫応答に関する試験を、６〜８週間齢のメスのウィスターラット（チャールズ・リバー・ラボラトリーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社）により行った。１３匹のラットを、対照群について３匹、植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５野生型ワクチン（６６０）群および変異体ワクチン（６８０）群の両方について５匹の動物の３群へとランダムに分けた。８群を筋肉内免疫のために使用し、６群を鼻腔内経路の投与を試験するために使用した。すべての群は、２用量のレジメン（追加接種免疫は第１の免疫の１４日後に行われる）で免疫された。
【０１６５】
後肢中の筋肉内投与のために、麻酔をしていないラットを、植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５ワクチン（１５μｇ）、植物で作製されたＶＬＰ Ｈ５変異型のワクチン、またはＰＢＳのいずれかで免疫した。
【０１６６】
すべての抗原調製物は、免疫の前に１：１体積比で、アルハイドロゲル（ミョウバン；アキュレイト・ケミカル・アンド・サイエンティフィック社（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストベリー、ニューヨーク、アメリカ）と１％の最終濃度に混合した。
【０１６７】
血液採取および脾臓採取
頚静脈血液採取を、麻酔した動物で第１の免疫の１４日後および第２の免疫の１４日後に行なった。８０００ｇで１０分間遠心分離することによって血清を採取した。
【０１６８】
第２の免疫の３週間後に、ＣＯ2ガスでラットを麻酔し、終了と同時に直ちに心臓穿刺を使用して血液を採取した。
【０１６９】
脾臓採取をラットで行った。採取された脾臓をゲンタマイシンを補足したＲＰＭＩ中に置き、１０ｍｌのシリンジからプランジャーにより５０ｍｌのコニカルチューブ中につぶした。つぶした脾臓を２回リンスし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、ＡＣＫ溶解緩衝液中に室温で５分間再懸濁した。脾細胞をＰＢＳ−ゲンタマイシン中で洗浄し、５％ＲＰＭＩ中に再懸濁し、カウントした。脾細胞を増殖分析のために使用した。
【０１７０】
抗体力価：
Ａ／ベトナム／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／アンホイ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／ニューカレドニア／２０／９９（Ｈ１Ｎ２）
血清の抗インフルエンザの抗体力価を、第１の免疫の１４日後に加えて、第２の免疫の２１日後（屠殺時）に測定した。力価は、コーティング抗原として非活性化ウイルスＡ／インドネシア／５／０５を使用する酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）によって決定した。終了点力価は、陰性対照サンプルのＯＤ値の少なくとも０．１以上のＯＤ値に達した最高希釈の逆数値として表現した。
【０１７１】
抗体クラス決定（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭ）のために、力価は以前に記載されるようにＥＬＩＳＡによって最終採血で評価された。
【０１７２】
赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価
血清の赤血球凝集阻害（ＨＩ）力価は、以前に記載されるように第２の免疫の１４および３５日後に測定された（WHO 2002；Kendal 1982）。株Ａ／インドネシア／５／０５；Ａ／アンホイ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）；Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５（Ｈ５Ｎ１）またはＡ／ベトナム／１２０３／２００４からの非活性化ウイルス調製物を使用して、ＨＩ活性についてラット血清サンプルを試験した。血清は、コレラ菌から調製された受容体破壊酵素ＩＩ（ＲＤＥ ＩＩ）（デンカ生研社（Ｄｅｎｋａ Ｓｅｉｋｅｎ Ｃｏ．）、東京、日本）で前処理した（Ｋｅｎｄａｌ １９８２）。ＨＩ分析は０．５％シチメンチョウ赤血球で行った。ＨＩ抗体力価は、凝集の完全阻害を引き起こす最高希釈の逆数として定義された。
【０１７３】
結果
野生型ＶＬＰまたは変異体ＶＬＰのいずれかにより免疫されたラットからの血清の反応性は、第１の免疫の１４日後（１４日目）または第２の免疫の１４日後（３５日目）に評価した。ラットは、すべてミョウバンと共に製剤化した１５μｇの抗原で免疫した。免疫反応性は、クレード１（Ａ／ベトナム／１２０３／０４）、クレード２．１（Ａ／インドネシア／５／０５）、クレード２．２（Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５）およびクレード２．３（Ａ／アンホイ／１／０５）のＨ５Ｎ１ウイルスに対して評価した。第１の投薬後に、変異体ＶＬＰは、検査されたすべてのＨ５Ｎ１株について野生型よりも高い抗体反応を誘導した（図６）。鳥類株Ａ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５に対する免疫反応性は、第１の投薬後に統計的に有意であった（ｐ＜０．０５）。免疫反応性をＨ１Ｎ１ウイルス（Ａ／ニューカレドニア／２０／９９）に対しても評価し、追加接種注射後に免疫反応性を示した。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１つの群あたり５匹のラットの終了点力価の逆数(reciprocal end-point titer)ＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を示す。＊野生型ＶＬＰと比較してｐ＜０．０５。
【０１７４】
野生型または変異体ＶＬＰにより免疫されたラットからのＨＩ力価は、第１の免疫の１４日後（１４日目）または第２の免疫の１４日後（３５日目）に評価した。ＨＩ抗体応答は不活性化Ｈ５Ｎ１全ウイルスを使用して測定した。第１の免疫後に、変異体ＶＬＰは、検査されたすべてのＨ５Ｎ１ウイルスに対して野生型ＶＬＰよりも高いＨＩ抗体応答を誘導する（図７）。Ａ／インドネシア／５／０５およびＡ／シチメンチョウ／トルコ／１／０５のインフルエンザ株については統計的有意性が達成された。ＧＭＴ：幾何平均力価。値は、１つの群あたり５匹のラットの終了点力価の逆数ＧＭＴ（ｌｎ）である。バーは平均偏差を示す。＊野生型ＶＬＰと比較してｐ＜０．０５。
【０１７５】
これらのデータは、「変異させた」糖鎖付加のないＨ５タンパク質が、広域スペクトルで迅速な活性のあるインフルエンザワクチンとして、ＶＬＰの産生のための天然のＨ５タンパク質に対する非常に興味深い代替物となることを強く示唆する。
【０１７６】
すべての引用は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１７７】
本発明は１つまたは複数の特定の実施形態に関して記載された。しかしながら、請求項において定義された本発明の範囲から逸脱することなしに、多数の変形および修飾を行うことができることは当業者に明らかだろう。
【０１７８】
参考文献
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡ１ドメインを有するインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子であって、前記ＨＡ１ドメインは、Ｎ結合型糖鎖付加が完全にまたは部分的にない、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子。
【請求項２】
ＨＡ１ドメインに由来する１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位が消失しており、消失する前記糖鎖付加部位はタンパク質の免疫原性の球状頭部に当初存在する、請求項１に記載のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子。
【請求項３】
前記消失する糖鎖付加部位が、前記免疫原性の球状頭部の受容体結合サブドメイン内若しくは付近にあるか、又は、ＨＡ１ドメインのＦ’２サブドメイン内または若しくは付近にある、請求項２に記載のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子。
【請求項４】
前記糖鎖付加部位が、糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであって、Ｎがアスパラギンであり、Ｘがプロリン以外のアミノ酸であり、Ｓはセリンであり、Ｔはスレオニンであるる、前記糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔからなる、請求項３に記載のＨＡ分子。
【請求項５】
糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ中に含まれる１つまたは複数のアスパラギン残基が、非アスパラギンのアミノ酸で置換される、請求項４に記載のＨＡ分子。
【請求項６】
前記アスパラギン残基が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項５に記載のＨＡ分子。
【請求項７】
前記アスパラギン残基が、アラニンで置換される、請求項６に記載のＨＡ分子。
【請求項８】
糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ中に含まれる１つ若しくは複数のセリン残基またはスレオニン残基が、非セリンアミノ酸および非スレオニンアミノ酸で置換される、請求項４または５に記載のＨＡ分子。
【請求項９】
糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ中に含まれる１つ若しくは複数のセリン残基またはスレオニン残基が、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項８に記載のＨＡ分子。
【請求項１０】
前記セリン残基またはスレオニン残基が、アラニンで置換される、請求項９に記載のＨＡ分子。
【請求項１１】
前記糖鎖付加部位が、アミノ酸３９乃至３３１（番号付けは株Ａ／ベトナム／１１９４／０４に従う）の間に位置する三つ組に対応する位置にあり、前記Ｎ糖鎖付加部位の消失が、ＨＡ分子を、天然のＨＡ分子に対して特異的な抗体に対してより抗原性にする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＨＡ分子。
【請求項１２】
前記糖鎖付加部位が、１５４位、１６５位および２８６位からなる群から選択される位置にある、請求項１１に記載のＨＡ分子。
【請求項１３】
１つの消失した糖鎖付加部位を有する、請求項１２に記載のＨＡ分子。
【請求項１４】
２つの消失した糖鎖付加部位を有する、請求項１２に記載のＨＡ分子。
【請求項１５】
３つの消失した糖鎖付加部位を有する、請求項１２に記載のＨＡ分子。
【請求項１６】
前記インフルエンザがＡ型およびＢ型のものである、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項１７】
前記インフルエンザがＢ型のものである、請求項１６に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項１８】
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群から選択される１つまたは複数のＡ亜型に由来する、請求項１６に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項１９】
前記ＨＡ亜型が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０からなる群から選択される１つまたは複数の亜型からなる、請求項１８に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項２０】
前記ＨＡ亜型が、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７からなる群から選択される１つまたは複数の亜型からなる、請求項１９に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項２１】
前記インフルエンザ赤血球凝集素が、Ｂ型またはＡ型亜型Ｈ３からなる、請求項１６に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２３】
１５４、１６５および２８６からなる群から選択されるアミノ酸をコードする１つまたは複数の残基が、非アスパラギンをコードしている、配列番号：１７に従って定義される核酸。
【請求項２４】
１５４、１６５および２８６からなる群から選択されるアミノ酸をコードする前記１つまたは複数の残基が、アラニンをコードしている、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
１５４＋２、１６５＋２および２８６＋２からなる群から選択されるアミノ酸をコードする１つまたは複数の残基が、非セリンおよび非スレオニンをコードしている、配列番号：１７に従って定義される核酸。
【請求項２６】
１５４＋２、１６５＋２および２８６＋２からなる群から選択されるアミノ酸をコードする前記１つまたは複数の残基が、アラニンをコードしている、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
請求項２３、２４、２５または２６のいずれか一項に記載の核酸に対して９０％の同一性を有する核酸。
【請求項２８】
配列番号：２９に従って定義される核酸。
【請求項２９】
配列番号：２９に対して９０％の同一性を有する核酸。
【請求項３０】
シアル化していない宿主生物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸を含む発現カセット。
【請求項３１】
前記調節領域が、プラストシアニン調節領域；ナピンプロモーター、クルシフェリンプロモーター、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質若しくはＳＴ−ＬＳから得られる調節領域、ポリへドロンプロモーター、およびｇｐ６４プロモーターからなる群から選択される、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３２】
前記プラストシアニン調節領域が、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））に由来する、請求項３１に記載の発現カセット。
【請求項３３】
シアル化していない宿主生物中でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）シアル化していない宿主生物またはその一部において活性のある調節領域に作動可能に連結された、請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸を導入する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で前記宿主または一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む前記方法。
【請求項３４】
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が前記宿主中で一過性に発現されるか、または前記宿主中で安定的に発現されうる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シアル化していない宿主生物が、植物、昆虫および酵母からなる群から選択される、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記植物が、植物細胞、植物全体およびその一部からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物細胞が、Ｎ．ベンチアミナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈｉａｍｉｎａ）に由来する、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
ｃ）前記宿主を採取し、前記ＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＡ１ドメインを有するインフルエンザ赤血球凝集素分子を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＨＡ１サブドメイン由来の１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位が消失している、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４０】
前記ＶＬＰが免疫原性である、請求項３９に記載のＶＬＰ。
【請求項４１】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４２】
請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４３】
前記宿主脂質が植物脂質である、請求項４１または４２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４４】
植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを持つインフルエンザウイルスＨＡを含む、請求項４１、４２または４３のいずれか一項に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４５】
前記インフルエンザＨＡタンパク質が、Ｈ５インドネシアである、請求項４４に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４６】
被験体におけるウイルス感染の予防または治療のためのワクチンの製品のための請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰの使用。
【請求項４７】
前記被験体が、ヒトまたはトリからなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
被験体におけるインフルエンザウイルス感染の予防または治療のための請求項３９乃４５のいずれか一項に記載のＶＬＰの使用。
【請求項４９】
前記被験体がヒトまたは鳥類からなる群から選択される、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
薬学的に許容される担体と混合されている、効果的な用量の、請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む組成物。
【請求項５１】
前記薬学的に許容される担体が、経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与のために適切である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的に許容される担体と混合されている請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む、インフルエンザウイルス疾患にかかるリスクがある個体を免疫するための組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、液体形態、懸濁形態、固体形態または粉末形態である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物が、経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与に適している、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
アジュバントの存在ありまたはなしで薬学的に許容される担体と混合されている請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰの免疫学的に効果的な用量を含む、ワクチン組成物。
【請求項５６】
前記薬学的に許容される担体が、経口で、皮膚内で、鼻腔内、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で投与するのに適切である、請求項５５に記載のワクチン。
【請求項５７】
前記アジュバントを欠く、請求項５６に記載のワクチン。
【請求項５８】
生理学的に許容される賦形剤またはアジュバント中の混合に混合されている請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰを含むウイルス性ワクチン。
【請求項５９】
ヒトワクチンまたはトリワクチンである、請求項５８に記載のワクチン。
【請求項６０】
病徴の出現前の予防に；または病徴の出現後の感染の治療に適している、請求項５９に記載のワクチン。
【請求項６１】
インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法であって、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載の、または請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子、１つまたは複数の宿主脂質、および薬学的に許容される担体投与することを含む方法。
【請求項６２】
前記ウイルス様粒子が、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で被験体に投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
効果的な用量の、請求項５０に記載の組成物または請求項５５に記載のワクチンを投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
【請求項６４】
請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のウイルス様粒子を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
【請求項６５】
前記ウイルス様粒子が、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で被験体に投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記被験体が、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラなどからなる群から選択される、請求項６１乃至６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記被験体が、ヒトおよびトリからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記被験体がヒトである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項５５に記載のワクチンを含む容器。
【請求項７０】
請求項６９に記載の容器であって、単一単位用量を含有する前記容器。
【請求項７１】
請求項６９に記載の容器であって、複数投与量の形態である前記容器。
【請求項７２】
請求項６９、７０または７１のいずれか一項に記載の容器であって、シリンジである前記容器。
【請求項７３】
請求項５５に記載のワクチンで充填済みのシリンジ。
【請求項７４】
請求項６９乃至７３のいずれか一項に記載の容器、および前記ワクチンの使用／投与方法についての説明書を含むキット。
【請求項７５】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された植物細胞。
【請求項７６】
一過性または安定的に形質転換されている、請求項７５に記載の植物細胞。
【請求項７７】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された植物の一部。
【請求項７８】
一過性または安定的に形質転換されている、請求項７７に記載の植物の一部。
【請求項７９】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された植物。
【請求項８０】
一過性または安定的に形質転換されている請求項７９に記載の植物。
【請求項８１】
請求項３０、３１または３２のいずれか一項に記載の発現カセットによりトランスフェクションされたアグロバクテリウム細胞。
【請求項１】
ＨＡ１ドメインを有するインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子であって、前記ＨＡ１ドメインは、Ｎ結合型糖鎖付加が完全にまたは部分的にない、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子。
【請求項２】
ＨＡ１ドメインに由来する１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位が消失しており、消失する前記糖鎖付加部位はタンパク質の免疫原性の球状頭部に当初存在する、請求項１に記載のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子。
【請求項３】
前記消失する糖鎖付加部位が、前記免疫原性の球状頭部の受容体結合サブドメイン内若しくは付近にあるか、又は、ＨＡ１ドメインのＦ’２サブドメイン内または若しくは付近にある、請求項２に記載のインフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）分子。
【請求項４】
前記糖鎖付加部位が、糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔであって、Ｎがアスパラギンであり、Ｘがプロリン以外のアミノ酸であり、Ｓはセリンであり、Ｔはスレオニンであるる、前記糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔからなる、請求項３に記載のＨＡ分子。
【請求項５】
糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ中に含まれる１つまたは複数のアスパラギン残基が、非アスパラギンのアミノ酸で置換される、請求項４に記載のＨＡ分子。
【請求項６】
前記アスパラギン残基が、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項５に記載のＨＡ分子。
【請求項７】
前記アスパラギン残基が、アラニンで置換される、請求項６に記載のＨＡ分子。
【請求項８】
糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ中に含まれる１つ若しくは複数のセリン残基またはスレオニン残基が、非セリンアミノ酸および非スレオニンアミノ酸で置換される、請求項４または５に記載のＨＡ分子。
【請求項９】
糖鎖付加認識三つ組Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ中に含まれる１つ若しくは複数のセリン残基またはスレオニン残基が、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕからなる群から選択されるアミノ酸で置換される、請求項８に記載のＨＡ分子。
【請求項１０】
前記セリン残基またはスレオニン残基が、アラニンで置換される、請求項９に記載のＨＡ分子。
【請求項１１】
前記糖鎖付加部位が、アミノ酸３９乃至３３１（番号付けは株Ａ／ベトナム／１１９４／０４に従う）の間に位置する三つ組に対応する位置にあり、前記Ｎ糖鎖付加部位の消失が、ＨＡ分子を、天然のＨＡ分子に対して特異的な抗体に対してより抗原性にする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載のＨＡ分子。
【請求項１２】
前記糖鎖付加部位が、１５４位、１６５位および２８６位からなる群から選択される位置にある、請求項１１に記載のＨＡ分子。
【請求項１３】
１つの消失した糖鎖付加部位を有する、請求項１２に記載のＨＡ分子。
【請求項１４】
２つの消失した糖鎖付加部位を有する、請求項１２に記載のＨＡ分子。
【請求項１５】
３つの消失した糖鎖付加部位を有する、請求項１２に記載のＨＡ分子。
【請求項１６】
前記インフルエンザがＡ型およびＢ型のものである、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項１７】
前記インフルエンザがＢ型のものである、請求項１６に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項１８】
前記ＨＡが、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６からなる群から選択される１つまたは複数のＡ亜型に由来する、請求項１６に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項１９】
前記ＨＡ亜型が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ５、Ｈ７、Ｈ９およびＨ１０からなる群から選択される１つまたは複数の亜型からなる、請求項１８に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項２０】
前記ＨＡ亜型が、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７からなる群から選択される１つまたは複数の亜型からなる、請求項１９に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項２１】
前記インフルエンザ赤血球凝集素が、Ｂ型またはＡ型亜型Ｈ３からなる、請求項１６に記載のインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）。
【請求項２２】
請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のインフルエンザＨＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む核酸。
【請求項２３】
１５４、１６５および２８６からなる群から選択されるアミノ酸をコードする１つまたは複数の残基が、非アスパラギンをコードしている、配列番号：１７に従って定義される核酸。
【請求項２４】
１５４、１６５および２８６からなる群から選択されるアミノ酸をコードする前記１つまたは複数の残基が、アラニンをコードしている、請求項２３に記載の核酸。
【請求項２５】
１５４＋２、１６５＋２および２８６＋２からなる群から選択されるアミノ酸をコードする１つまたは複数の残基が、非セリンおよび非スレオニンをコードしている、配列番号：１７に従って定義される核酸。
【請求項２６】
１５４＋２、１６５＋２および２８６＋２からなる群から選択されるアミノ酸をコードする前記１つまたは複数の残基が、アラニンをコードしている、請求項２５に記載の核酸。
【請求項２７】
請求項２３、２４、２５または２６のいずれか一項に記載の核酸に対して９０％の同一性を有する核酸。
【請求項２８】
配列番号：２９に従って定義される核酸。
【請求項２９】
配列番号：２９に対して９０％の同一性を有する核酸。
【請求項３０】
シアル化していない宿主生物において活性のある調節領域に作動可能に連結された、請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸を含む発現カセット。
【請求項３１】
前記調節領域が、プラストシアニン調節領域；ナピンプロモーター、クルシフェリンプロモーター、またはリブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣＯ）、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質若しくはＳＴ−ＬＳから得られる調節領域、ポリへドロンプロモーター、およびｇｐ６４プロモーターからなる群から選択される、請求項３０に記載の発現カセット。
【請求項３２】
前記プラストシアニン調節領域が、アルファルファ（ムラサキウマゴヤシ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｓａｔｉｖａ））に由来する、請求項３１に記載の発現カセット。
【請求項３３】
シアル化していない宿主生物中でインフルエンザウイルス様粒子（ＶＬＰ）を産生する方法であって、
ａ）シアル化していない宿主生物またはその一部において活性のある調節領域に作動可能に連結された、請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸を導入する工程と、
ｂ）核酸の発現を可能にする条件下で前記宿主または一部をインキュベーションして、それによってＶＬＰを産生する工程と
を含む前記方法。
【請求項３４】
前記導入工程（工程ａ）において、前記核酸が前記宿主中で一過性に発現されるか、または前記宿主中で安定的に発現されうる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シアル化していない宿主生物が、植物、昆虫および酵母からなる群から選択される、請求項３３または３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記植物が、植物細胞、植物全体およびその一部からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記植物細胞が、Ｎ．ベンチアミナ（Ｎ．ｂｅｎｔｈｉａｍｉｎａ）に由来する、請求項３６に記載の核酸。
【請求項３８】
ｃ）前記宿主を採取し、前記ＶＬＰを精製する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
ＨＡ１ドメインを有するインフルエンザ赤血球凝集素分子を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）であって、前記ＨＡ１サブドメイン由来の１つまたは複数のＮ結合型糖鎖付加部位が消失している、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４０】
前記ＶＬＰが免疫原性である、請求項３９に記載のＶＬＰ。
【請求項４１】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされるウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４２】
請求項１乃至２１のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスＨＡタンパク質および１つまたは複数の宿主脂質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４３】
前記宿主脂質が植物脂質である、請求項４１または４２に記載のウイルス様粒子。
【請求項４４】
植物特異的Ｎ−グリカンまたは修飾Ｎ−グリカンを持つインフルエンザウイルスＨＡを含む、請求項４１、４２または４３のいずれか一項に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４５】
前記インフルエンザＨＡタンパク質が、Ｈ５インドネシアである、請求項４４に記載のウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項４６】
被験体におけるウイルス感染の予防または治療のためのワクチンの製品のための請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰの使用。
【請求項４７】
前記被験体が、ヒトまたはトリからなる群から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
被験体におけるインフルエンザウイルス感染の予防または治療のための請求項３９乃４５のいずれか一項に記載のＶＬＰの使用。
【請求項４９】
前記被験体がヒトまたは鳥類からなる群から選択される、請求項４８に記載の使用。
【請求項５０】
薬学的に許容される担体と混合されている、効果的な用量の、請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む組成物。
【請求項５１】
前記薬学的に許容される担体が、経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与のために適切である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
薬学的に許容される担体と混合されている請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰを含む、インフルエンザウイルス疾患にかかるリスクがある個体を免疫するための組成物。
【請求項５３】
前記組成物が、液体形態、懸濁形態、固体形態または粉末形態である、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記組成物が、経口投与、皮内投与、鼻腔内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与に適している、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
アジュバントの存在ありまたはなしで薬学的に許容される担体と混合されている請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰの免疫学的に効果的な用量を含む、ワクチン組成物。
【請求項５６】
前記薬学的に許容される担体が、経口で、皮膚内で、鼻腔内、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で投与するのに適切である、請求項５５に記載のワクチン。
【請求項５７】
前記アジュバントを欠く、請求項５６に記載のワクチン。
【請求項５８】
生理学的に許容される賦形剤またはアジュバント中の混合に混合されている請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のＶＬＰを含むウイルス性ワクチン。
【請求項５９】
ヒトワクチンまたはトリワクチンである、請求項５８に記載のワクチン。
【請求項６０】
病徴の出現前の予防に；または病徴の出現後の感染の治療に適している、請求項５９に記載のワクチン。
【請求項６１】
インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法であって、請求項１乃至２１のいずれか一項に記載の、または請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸によってコードされる、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質を含むウイルス様粒子、１つまたは複数の宿主脂質、および薬学的に許容される担体投与することを含む方法。
【請求項６２】
前記ウイルス様粒子が、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で被験体に投与される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
効果的な用量の、請求項５０に記載の組成物または請求項５５に記載のワクチンを投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
【請求項６４】
請求項３９乃至４５のいずれか一項に記載のウイルス様粒子を投与することを含む、インフルエンザウイルス感染に対する免疫を被験体において誘導する方法。
【請求項６５】
前記ウイルス様粒子が、経口で、皮膚内で、鼻腔内で、筋肉内で、腹腔内で、静脈内でまたは皮下で被験体に投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記被験体が、ヒト、霊長類、ウマ、ブタ、トリ（鳥類）水鳥、渡り鳥、ウズラ、アヒル、ガチョウ、家禽、ニワトリ、ラクダ、イヌ科の動物、イヌ、ネコ科の動物、ネコ、トラ、ヒョウ、ジャコウネコ、ミンク、ブナテン、フェレット、家で飼われるペット、家畜、マウス、ラット、アザラシ、クジラなどからなる群から選択される、請求項６１乃至６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記被験体が、ヒトおよびトリからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記被験体がヒトである、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
請求項５５に記載のワクチンを含む容器。
【請求項７０】
請求項６９に記載の容器であって、単一単位用量を含有する前記容器。
【請求項７１】
請求項６９に記載の容器であって、複数投与量の形態である前記容器。
【請求項７２】
請求項６９、７０または７１のいずれか一項に記載の容器であって、シリンジである前記容器。
【請求項７３】
請求項５５に記載のワクチンで充填済みのシリンジ。
【請求項７４】
請求項６９乃至７３のいずれか一項に記載の容器、および前記ワクチンの使用／投与方法についての説明書を含むキット。
【請求項７５】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された植物細胞。
【請求項７６】
一過性または安定的に形質転換されている、請求項７５に記載の植物細胞。
【請求項７７】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された植物の一部。
【請求項７８】
一過性または安定的に形質転換されている、請求項７７に記載の植物の一部。
【請求項７９】
請求項２２乃至２９のいずれか一項に記載の核酸により形質転換された植物。
【請求項８０】
一過性または安定的に形質転換されている請求項７９に記載の植物。
【請求項８１】
請求項３０、３１または３２のいずれか一項に記載の発現カセットによりトランスフェクションされたアグロバクテリウム細胞。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２５Ｅ】
【図２５Ｆ】
【図２５Ｇ】
【図２５Ｈ】
【図２５Ｉ】
【図２５Ｊ】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【図１Ｂ】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５Ａ】
【図２５Ｂ】
【図２５Ｃ】
【図２５Ｄ】
【図２５Ｅ】
【図２５Ｆ】
【図２５Ｇ】
【図２５Ｈ】
【図２５Ｉ】
【図２５Ｊ】
【図２６】
【図２７】
【図２８Ａ】
【図２８Ｂ】
【図２８Ｃ】
【図２８Ｄ】
【図２９】
【図３０Ａ】
【図３０Ｂ】
【公表番号】特表２０１１−５２８２２３（Ｐ２０１１−５２８２２３Ａ）
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１１−５１７７２５（Ｐ２０１１−５１７７２５）
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１０４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００６４５２
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５０２１２１３９５）メディカゴ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２１年７月１５日（２００９．７．１５）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００１０４０
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／００６４５２
【国際公開日】平成２２年１月２１日（２０１０．１．２１）
【出願人】（５０２１２１３９５）メディカゴ インコーポレイテッド (13)
【Ｆターム（参考）】
[ Back to top ]