新規タンパク質及びそれをコードするＤＮＡ
本発明の目的は、完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうちスプライシングバリアントを含む全長として配列が新規なｃＤＮＡについては、これがコードするタンパク質の生理活性を解析及び同定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することである。本発明によれば、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質が提供される。（ａ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。（ｂ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該ＤＮＡの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該ＤＮＡを導入した遺伝子導入細胞、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
【背景技術】
現在、世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進められている。既に約百数十の原核微生物、下等真核生物の出芽酵母、多細胞性真核生物である線虫で、その全ゲノム配列が決定された。３０億塩基対といわれるヒトのゲノムについては２００１年２月にその塩基配列のドラフトが発表されていたが、２００３年４月に完全配列が解読され公表された。ゲノム配列を明らかにする目的は、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝子間、タンパク質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解するところにある。種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくことは、単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、そこで得られる研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、その社会的な意義も大きい。
ところが単にゲノム配列を決定しただけでは、全ての遺伝子の機能を明らかにできるわけではない。例えば酵母では、ゲノム配列から推定された約６，０００の遺伝子の約半数しか、その機能を推定できなかった。一方、ヒトには約１０万種類のタンパク質が存在するといわれる。そこで、ゲノム配列から明らかにされてくる膨大な量の新しい遺伝子の機能を、迅速かつ効率的に解明していくための「ハイスループット遺伝子機能解析システム」の確立が、強く望まれている。
真核生物のゲノム配列では、多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複数のエクソンに分断されている。そのため、ゲノム配列情報だけからそこにコードされるタンパク質の構造を正確に予測するには、多くの問題がある。一方、イントロンが除かれたｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡでは、タンパク質のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易にその一次構造を明らかにすることが可能である。ヒトのｃＤＮＡの研究では、これまでに５００万以上のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）データが公共データベースに公開されている。
これらの情報は、ヒト遺伝子構造の解明やゲノム配列におけるエクソン領域の予測、あるいはその発現プロファイルの推定など、様々な角度から利用されている。ところが、これらのヒトＥＳＴ情報の多くはｃＤＮＡの３’末端側近傍に集中しているため、特にｍＲＮＡの５’末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。また、世界の研究機関（ヘリックス研究所、かずさＤＮＡ研究所、東大医科学研究所、ドイツ癌研究センター、ＭＧＣプロジェクトなど）で行われている解析の結果明らかにされているｃＤＮＡは４万数千に上り、数的には３万数千と言われる遺伝子座の大半をカバーしていると思われるが、全長クローンとして取得されているｃＤＮＡの割合は８０％程度であることや、重複やスプライスバリアントが含まれていることを考慮すると、まだ取得されていないｃＤＮＡは多数存在していると考えられる。
完全長ｃＤＮＡを取得できれば、その５’末端配列からゲノム配列上でのｍＲＮＡ転写開始点が推定できる上、その配列の中に含まれるｍＲＮＡの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能である。また、翻訳開始点であるａｔｇを５’側に含むことから、正しいフレームでタンパク質への翻訳を行うことができる。したがって、適当な遺伝子発現系を適用することで、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を大量に生産したり、タンパク質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能になる。このように、完全長ｃＤＮＡの解析からはゲノム配列解析を相補する重要な情報が得られる。また、発現可能な全長ｃＤＮＡクローンは、その遺伝子の機能の実証的な解析や産業分野での応用への展開において、その重要性はきわめて高い。
一方、同一のゲノムにコードされたタンパク質であっても、それをコードするｍＲＮＡが転写される際、ゲノム中一部のエクソンが挿入・欠失して結合する異性体（以下、これを「スプライシングバリアントｍＲＮＡ」と称することがある）がある。実際、これらのｍＲＮＡが翻訳されて生成される、複数種の類似のタンパク質（以下、これらを「スプライシングバリアント」と称することがある）が生体内において確認されている。スプライシングバリアントは、組織特異的、発生段階特異的、あるいは疾患特異的に発現し、それぞれ異なる機能を有していると考えられている。
例えば、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅであるＪＡＫ３遺伝子は、Ｓ型、Ｂ型、Ｍ型の３種類のスプライスバリアントが存在し、Ｓ型は造血細胞で発現しているのに対し、Ｂ型とＭ型は造血細胞と上皮細胞で発現している。Ｓ型とＭ型が抗体によって共沈し同じ細胞で発現していることから、複数のスプライスバリアントが共に機能し、細胞内におけるサイトカインのシグナル伝達反応の複雑性をより高めていると推測されている（例えば、Ｌａｉ，Ｋ．Ｓ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４２），２５０２８−２５０３６（１９９５）を参照）。
このようなスプライシングバリアントのｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡも、従来のｃＤＮＡライブラリーやＥＳＴからは取得されにくく、転写開始点を含む完全長ｃＤＮＡライブラリーにより取得される可能性の高いクローンである（例えば、ＷＯ９８／２２５０７号公報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１およびＮＯ．２）を参照）。
特に、プロテインキナーゼは、基質であるタンパク質のセリン、スレオニンあるいはチロシン残基をリン酸化する酵素であり、極めて多くのファミリーが知られている。また、一般にプロテインキナーゼはタンパク質リン酸化を介する細胞内シグナル伝達系を調節することにより、種々の生命現象の制御に関わっていることが知られており、疾患との関係が解明されている遺伝子が多い（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，５０：８２３−８２９（１９８７）を参照）。しかし、ヒトの遺伝子の約３〜４％はプロテインキナーゼの遺伝子であると言われ、ヒトの体内には約千種もの異なるプロテインキナーゼが存在すると推定されており、まだ多くのプロテインキナーゼ遺伝子がクローニングされないままに残されている。したがって、ヒトにおいて分離が進んでいないスプライシングバリアントを含む新規なプロテインキナーゼの全長ｃＤＮＡを提供する意義は大きい。また、プロテインキナーゼは、治療のための標的分子として、またタンパク質自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡの全長を明らかにすることには大きな意義がある。
【発明の開示】
本発明は、完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうちスプライシングバリアントを含む全長として配列が新規なｃＤＮＡについては、これがコードするタンパク質の生理活性を解析及び同定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
本発明者らは、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−１７４（１９９４）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００：１４９−１５６（１９９７））を用いて取得されたスプライシングバリアントを含む配列が新規なｃＤＮＡについて、該ｃＤＮＡクローンの塩基配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列にキナーゼ活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、これらのｃＤＮＡがコードするタンパク質がプロテインキナーゼであると同定した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、以下の（１）〜（１５）に記截の発明が提供される。
（１） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
（２） 上記（１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（３） （１）に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
（４） 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
（７） （６）に記載の細胞により産生される、（１）に記載のタンパク質。
（８） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
（９） （１）または（７）に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
（１０） 抗体がモノクローナル抗体である（９）に記載の抗体。
（１１） モノクローナル抗体が（１）または（７）に記載のタンパク質のキナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする（１０）に記載の抗体。
（１２） （１）または（７）に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
（１３） （６）に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
（１４） （１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ配列情報および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
（１５） （１）に記載のタンパク質および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）を添加し、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
図２は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）およびＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加し、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
図３は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）およびＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加し、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得及び塩基配列の解析
本発明のＤＮＡは、配列番号６〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号６〜１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個（ここで、数個とは、例えば５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失及び／または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードし得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
具体的には、ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号１〜５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号８７〜１１２４、配列番号２の塩基番号１１５〜２０９４、配列番号３の塩基番号１２３２〜２７６４、配列番号４の塩基番号３１６〜１９４７、配列番号５の塩基番号１５１〜１８８１に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３’及び／または５’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明のＤＮＡは、これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得したものでもよいが、具体的には例えば下述の方法により取得することができる。まず、ヒトの組織あるいは培養細胞等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてオリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４（１９９４））によりｃＤＮＡを取得する。具体的には、取得したｍＲＮＡについて酸性ピロフォスファターゼにより５’キャップをはずし、その後露出した５’末端のリン酸基を標的に、オリゴキャップリンカーをＲＮＡライゲースを用いて連結する。ここで、キャップ構造を５’末端に有していないＲＮＡ分子について、上記オリゴキャップリンカーが結合しないように、予め５’末端に存在するリン酸基を、５’キャップは外さないが５’端のリン酸基のみ外す活性を有するフォスファターゼ等を用いて外しておくことは有効である。このＲＮＡ分子を鋳型として、３’側のプライマーとしてオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写を行った後、ＲＮＡ鎖を分解除去する。
さらに取得された１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記オリゴキャップリンカーの部分配列を有するオリゴヌクレオチドを５’プライマーとし、３’末端に特異的なプライマー（オリゴｄＴプライマー等）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。プライマーの鎖長としては、通常１５〜１００塩基、好ましくは１５〜３０塩基が挙げられるが、増幅するｃＤＮＡの鎖長が長い場合には２５〜３５塩基の長さとすることが好ましく、また、Ｌｏｎｇ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ ＰＣＲ（ＬＡ ＰＣＲ：林健志、実験医学別冊・ＰＣＲの最新技術、羊土社；Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４−６８５（１９９４））を用いることが好ましい。
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、取得されたｃＤＮＡクローンを細胞に導入して該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現できるようなタンパク質発現用ベクターが好ましく用いられる。具体的には例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ００９８６４）等が好ましく、また大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
かくして取得されるｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のＤＮＡは、取得されたｃＤＮＡの５’末端あるいは３’末端の塩基配列を解析し、これをＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＥＳＴ等のデータベースについてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））を用いて検索し、その全長について完全に一致する配列が見出されない場合は新規として以下の解析に供することとした。
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号１〜５に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号８７〜１１２４、配列番号２の塩基番号１１５〜２０９４、配列番号３の塩基番号１２３２〜２７６４、配列番号４の塩基番号３１６〜１９４７、配列番号５の塩基番号１５１〜１８８１に示される配列を有するものが挙げられる。
かくして取得されたｃＤＮＡの全長として新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４，７５５−７６３（１９９８））の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されている配列の触媒ドメイン部分と本発明のＤＮＡのこれに対応する部分との一致度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が３０％以上のものか、ｅ−ｖａｌｕｅ（問い合わせ配列がデータベース中に偶然存在する期待値）として１０−４以下のものを示す。
例えば、上位にヒットした触媒ドメイン配列の多くがキナーゼとしての機能を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、即ち、キナーゼ活性を持つであろうという予測が成り立つ。
ＨＭＭＰＦＡＭは、Ｐｆａｍというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有するアミノ酸配列の特徴を、解析対象である塩基配列のコードするアミノ酸配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析である。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない機能でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し機能予測ができる。このように、それがコードするタンパク質がキナーゼ活性を有すると予測されるｃＤＮＡは、後述する生化学的実験によりそのキナーゼ活性を確認することができる。
上記でｃＤＮＡの全長として新規であるとされたクローンとして具体的には、配列番号１〜５に示す塩基配列を有するものが挙げられる。また、これらの塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号６〜１０に示すものが挙げられる。
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のＤＮＡは上記の配列番号１〜５に記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１若しくは数個（ここで言う数個とは、例えば１５個以下、好ましく９個以下、より好ましくは６個以下を意味する）の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、これらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号６〜１０に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１〜５に記載の塩基配列とＢＬＡＳＴ解析で８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
さらに、本発明のＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（宝酒造社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
（２）新規ｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を推定することができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号６〜１０に記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するものも含まれる。
本発明のタンパク質の取得方法としては、（１）に記載の本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクター若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
また、そのＮ末端またはＣ末端に適当なタグが融合するように設計されたベクターなどに挿入してタグを付加したタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。タグとして具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、Ｆｌａｇなどが挙げられる。
上記形質転換体が産生するタンパク質には、タンパク質合成時に重原子などで置換・修飾したアミノ酸を取り込ませることにより修飾することができる。また、タンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。例えば、Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化などの末端修飾、糖鎖付加、脂質付加、アシル化、メチル化、スルホン化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化などであるが、必ずしもこれらに限定されない。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）が挙げられ、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ００９８６４）等が好ましい。
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。昆虫細胞の場合には、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４，（１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１，（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，（１９８４））、および電気パルス法（Ｃｈｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，１３３１（１９８７））等が挙げられる。
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明のＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，（１９８０））等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション保存細胞）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）またはヒト子宮頸部癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）が用いられる。
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９，（１９９４））等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
上記で得られた培養物は細胞または菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。
かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系（または無細胞タンパク質合成系とも称する）に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。無細胞タンパク質合成系として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ（Ｅｄ．ｂｙ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．），１７９−２０９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の無細胞タンパク質合成系、または細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、エピトープペプチド（例えば、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等）をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、キナーゼ活性を有するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
（３）本発明のタンパク質が有する活性の確認
本発明のタンパク質は、これを上記（２）に記載のとおり組み換えタンパク質として作製し、これを解析することにより（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに下記（４）に記載の抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
本発明のタンパク質が、キナーゼ活性を有することは、それ自体既知の常法を用いることができる。具体的な方法の例として、基質を該組み換えタンパク質に接触させ、該組み換えタンパク質のキナーゼ活性により基質がリン酸化される際に消費されるＡＴＰ量、生成物の量を測定する方法等を以下に説明する。
反応液としては、基質のリン酸化部位がセリン／スレオニンである、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、マグネシウムイオン、例えば５〜１００ｍＭの塩化マグネシウムあるいは酢酸マグネシウム、および還元剤として１〜１００ｍＭの２−メルカプトエタノール或いは１〜１０ｍＭのジチオスレイトールを含む、リン酸イオンの存在しない、中性から弱塩基性緩衝液、例えば５０ｍＭのトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用い、また、基質のリン酸化部位がチロシンであるＴｙｒプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、塩化マンガン、塩化亜鉛、ＮａＶＯ３、ジチオスレイトールを含むトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いることができる。
この反応液に、ＡＴＰおよびそれぞれに適した基質を加えた後、精製した本発明のタンパク質を添加し、室温〜３７℃で２４時間程度反応後、該タンパク質が有するキナーゼ反応により消費したＡＴＰ量、或いは該タンパク質により行われるキナーゼ反応による生成物を測定する。
ここで、受容体型キナーゼと予想されるタンパク質のキナーゼ活性を測定する場合には、該タンパク質の細胞内部分、あるいはキナーゼ活性中心部分のみを組み換えタンパク質として発現させて上記の反応に用いることが好ましい。
キナーゼ反応に関して、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼである環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼの場合、各キナーゼに対応する環状ヌクレオチドを反応液中に添加することが必要である。例えば、Ａ−キナーゼの場合は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を、Ｇ−キナーゼの場合は環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を添加し、基質としてヒストンを用いる。
リン脂質依存性プロテインキナーゼの場合は、リン脂質を反応液中に添加する。例えば、Ｃ−キナーゼの場合、ホスファチジルセリンを添加し、基質としてヒストンを用いる。カルシウム依存性プロテインキナーゼの場合には、カルモジュリンを反応液に添加し、基質としてミオシンＬ鎖を用いる。ここには、ミオシンＬ鎖キナーゼ、カルモジュリンキナーゼが含まれる。Ｔｙｒプロテインキナーゼの場合は、基質としてチューブリン、ヒストン、カゼイン、ミオシンＬ鎖、ガストリン、アンギオテンシン、チロシン−グルタミン酸（１：４）重合物等を用いる。
キナーゼ活性測定において、基質へのリン酸基の転移に先立ち、キナーゼによるＡＴＰのＡＤＰへの加水分解反応が起こる。ここで加水分解されたＡＴＰ量を測定することで、キナーゼ活性を定義づけることも可能である。この場合、基質非存在下で行った反応液中のＡＴＰ量を測定し、消費ＡＴＰ量をキナーゼ活性とする（Ｗｈｉｔｅｈｏｏｕｓｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：３６９３−３７０１（１９８３））。
キナーゼ反応により消費したＡＴＰ量を測定する場合、上記キナーゼ反応液にルシフェリン、ルシフェラーゼを加え、一定時間反応後、添加したルシフェリン特有の蛍光波長で蛍光強度を測定し、残存ＡＴＰによる蛍光量とする。プロテインキナーゼおよび基質非存在下で測定した、反応液中に存在する全ＡＴＰ蛍光強度から上記蛍光強度を差し引いた値を、キナーゼ活性により消費したＡＴＰ量とし、酵素のキナーゼ活性とする。
キナーゼ反応による生成物を測定する場合は、反応液に添加するＡＴＰとして放射性同位元素である３２ＰをＡＴＰのγ位に含んだ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いる。キナーゼ反応終了後、反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、泳動後のゲルをＸ線フィルムによりオートラジオグラフィーを行い３２Ｐの取り込まれたタンパク質バンドを検出する。また、反応液に１０％トリクロロ酢酸、或いは終濃度９０％となるようにエタノールまたはアセトンを加え、タンパク質を沈殿させる。その後遠心或いはフィルター濾過により上清を除き、さらに同溶液で数回洗浄した後乾燥し、基質タンパク質がリン酸化されたために不溶化画分に移行した３２Ｐを液体シンチレーションカウンターで測定する。放射性同位元素を用いない方法としては、キナーゼ反応終了後の反応液を、クロマトグラフィーにより分離し、リン酸化された基質の溶出位置の変化および変化量で活性を測定することも可能である。この場合、クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを用いることができる。また、基質のリン酸化による質量変化を質量分析装置で測定することにより、活性測定することも可能である。この場合、前述のクロマトグラフィー分離と併用することで、測定精度がさらに上昇する。
このようなキナーゼ活性の解析系は、本発明のキナーゼ活性を有するタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの評価にも用いることができる。なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認は、上記した方法に限定されるものではない。
（４）本発明のタンパク質の機能解析
かくして得られたスプライシングバリアントとして同定されたものを含む新規タンパク質であって、かつキナーゼ活性を有する本発明のタンパク質は、上記（３）で確認されたキナーゼ活性以外の機能を解析することによりその新規の利用法が提供される（このキナーゼ活性以外の機能をさらに解析する対象となるタンパク質を、以下「解析対象タンパク質」と称することがある）。特に、本発明のタンパク質には、公知のタンパク質のスプライシングバリアントが含まれるため、このバリアントが公知のバリアントとどのような異なる機能があるかを同定することは重要である。
具体的な機能の解析方法としては、例えば、（ｉ）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ｉｉ）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（ｉｉｉ）適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、（ｉｖ）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。
（ｉ）の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、ｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。ｍＲＮＡレベルで発現量を解析する場合は、例えば、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｒｉｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））、ＤＮＡチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。ここで、解析の対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、解析対象タンパク質をコードするｃＤＮＡにのみ存在し、公知のバリアントをコードするｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象バリアントと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Ｗｏｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔ．，３２０，１４１−１４５（２００２））等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた組織染色法などが挙げられる。この場合、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
（ｉｉ）の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
（ｉｉｉ）の方法では、本発明のｃＤＮＡを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。ＤＮＡの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のものも同様に細胞へ導入し、比較解析することにより解析対象バリアントに関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質はキナーゼ活性を有するものであることがわかっているので、キナーゼが関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
（ｉｖ）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、ＲＮＡインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
（５）オリゴヌクレオチドの調製
上記（１）に記載の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１〜５で表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントＤＮＡが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１）に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のものを用いることができる。
このＲＮＡインターフェアランス法において標的となる遺伝子（以下これを「標的遺伝子」と称することがある）は、本発明のＤＮＡであれば、如何なるものであってもよい。また、該遺伝子ＤＮＡのオルソログと予想される遺伝子も標的遺伝子とすることができる。これらのＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい１５ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。
また、解析対象タンパク質が公知タンパク質と比較して、挿入型あるいは置換型バリアントである場合は、２本鎖ポリヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部位に設定することができる。また、解析対象タンパク質が公知タンパク質の欠失型バリアントである場合は、欠失部を跨ぐ配列を２本鎖ポリヌクレオチド配列とすることにより、該タンパク質特異的に効果のある配列を選定することができる。さらに、解析対象タンパク質と公知タンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡの塩基配列と比較して、解析対象タンパク質をコードするＤＮＡに特異的な塩基配列を選定することによれば、解析対象タンパク質特異的にその発現を阻害することができる。
ヌクレオチドの鎖長は１５ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１５〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，５，１１５−１８０（１９８３））、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２’−５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは組織を被導入体として用いる場合には１５〜３０ｂｐ、好ましくは１９〜２４ｂｐ、さらに好ましくは２１ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５’または３’末端が一部突出したものも含むが、３’末端が２塩基突出したものを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
被導入体は、細胞、組織あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等であってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞のような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明の遺伝子の導入体内での発現抑制により、本発明の遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
（６）本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。また、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ反応し、公知の、またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用いることにより、対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。このような抗体のエピトープとしては、例えば、対象タンパク質が公知のバリアントと比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、欠失部分の前後のアミノ酸配列（ジャンクション部分）等が好ましい。また、対象タンパク質が公知のバリアントのＮ末またはＣ末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、添加されているアミノ酸配列をエピトープとすることも好ましい。上記以外の方法として、対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、公知の、またはそれ以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、対象タンパク質にのみ反応する抗体を取得することができる。除去する方法としては、公知の、またはそれ以外のバリアントをリガンドとして固定したアフィニティークロマトグラフィー、或いは、公知の、またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用いられる。
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
免疫後、適宜試験的に採血を行ってオクタローニー法、固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６８，５７７（１９８１））によっても行うことができる。
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３５，２５６−２５９（１９８８）；Ｄｕｃｈｏｓａｌ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５，２５８−２６２（１９９２））。
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一過性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するキナーゼ活性等を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触または導入し、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（７）本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、先ずはじめに本発明のタンパク質とスクリーニングに供する物質（以下、これを「被検物質」と称することがある）とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、あるいは上記（６）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。
ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ結合し、公知のまたは他のバリアントには結合しない物質についてその影響を解析するか、または公知のあるいは他のバリアントにおいても同様に結合するか否かを同定し、結合した場合にはその影響の相違を解析することによって、対象タンパク質に対する該物質の影響を解析することができる。また、該物質の個体内での分布を検討することにより、対象タンパク質や公知のまたは他のバリアントに対する影響を解析することができる。
具体的な解析方法としては、例えば、キナーゼ活性を調節する物質を解析する場合には、（２）に記載したＤＮＡ導入体に基質となるタンパク質も同様の方法で導入する。この導入体について選択された物質の存在下／または非存在下で基質となるタンパク質のリン酸化をそれ自体既知の通常用いられる方法により解析する。具体的には、上記（３）に記載の方法等を用いて行うことができる。基質となるタンパク質のリン酸化が、物質の非存在下の場合と比べて増加した場合には、該物質はキナーゼ活性物質として機能する可能性があり、また低下、または阻害された場合には物質はキナーゼ阻害物質として機能する可能性があると同定できる。
ここで、医薬活性成分の取得を目的として調節物質をスクリーニングするために用いる本発明のＤＮＡ、あるいは組み換えタンパク質を用いる場合は、ヒトのＤＮＡあるいはタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってでスクリーニングされた物質は、さらに生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。なお、本発明のタンパク質の機能調節物質の評価は、上記した方法に限定されるものではない。
本発明のタンパク質が有するキナーゼ活性としては、例えば、癌に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、生殖細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、アルツハイマー病発症を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、グリセロール３リン酸を生成する機能、脳皮質発達、神経細胞等遊走を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、脂肪酸やステロールの合成に関連する機能、細胞死に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、インシュリンシグナル伝達等である。そこで、本スクリーニング方法により同定できる化合物は、制癌剤、心疾患治療剤、不妊治療剤、再生組織誘導剤、アルツハイマー病治療剤、神経変性疾患治療剤、糖尿病治療剤として用いられ得るものである。
また、本発明のタンパク質は、精巣、気管、脳グリオーマ細胞由来の培養細胞等から構築されたｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされており、取得された本発明のタンパク質は、上記組織および器官等において特有の機能を有している可能性があるので、該組織および器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得る。 かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（８）本発明のＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、（２）に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
被検物質としては、（７）に記載のものを用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、この被検物質は本発明のＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、この被検物質は本発明のＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（９）本発明のＤＮＡ導入動物
上記（１）に記載の、本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
かくして得られた本発明のＤＮＡ導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
（１０）本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１〜５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。
ここで、対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合、上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配列部分断片を用いることもできるが、他バリアントと異なる立体構造を有している可能性もあるためその全長を用いることもできる。また、ＤＮＡアレイには、対象タンパク質をコードするＤＮＡ配列のうち、他のバリアントＤＮＡと異なる配列を選択することが好ましい。
また、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明の範囲に含まれる。
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。このＤＮＡの塩基配列には、対応するＲＮＡの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、取得された各ｃＤＮＡクローンについて以下の実験を行った結果は、実施例５に纏めて記載した。
実施例１オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト培養細胞（ヒト脳グリオーマ細胞由来の培養細胞であるＨ４細胞、ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−１４８）より、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースでｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
上記で取得したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡと、市販のヒト各組織ｍＲＮＡ（クロンテック社製：精巣（＃６４０２７−１）、気管（＃６４０９１−１））よりオリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４（１９９４））によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。
まず、上記ＲＮＡをＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）およびＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理した後に、オリゴキャップリンカー（配列番号１１）をＲＮＡライゲースを用いて連結した。このＲＮＡ鎖を鋳型としてオリゴｄＴプライマー（配列番号１２）用いた逆転写反応により第１鎖ｃＤＮＡを合成し、続いてＲＮＡ鎖を分解除去した（鈴木ら、タンパク質 核酸 酵素、４１、６０３−６０７（１９９６）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００，１４９−１５６（１９９７））。次いで、５’のＰＣＲプライマー（配列番号１３）と３’のＰＣＲプライマー（配列番号１４）を用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡ鎖をＳｆｉＩにより切断した。
次いで、発現用ベクターであるｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに上記で取得したＳｆｉＩ切断断片をクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。上記で用いたｐＭＥ１８ＳＦＬ３ベクターは、クローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０ ｓｍａｌｌ ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリＡ付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物であるタンパク質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端または３’端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００：ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。
実施例２オリゴキャップ法で作製したｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’末端の全長性の評価
実施例１で作製したヒトｃＤＮＡライブラリーの５’末端の塩基配列は、これを公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡの配列と比較し、５’末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５’末端が伸びている場合、または５’末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。
次に、ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬによるクローンの評価を行った。ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬは、公共データベース中のＥＳＴの５’末端配列や３’末端配列との比較によって全長ｃＤＮＡの可能性の高いクローンを選択するために、ヘリックス研究所の西川・太田らにより開発された方法である。実施例１で解析したｃＤＮＡクローンの５’末端や３’末端配列をＥＳＴデータベースに登録されている塩基配列と比較し、取得されたｃＤＮＡクローンの配列よりも、５’側または３’側へ伸長しているＥＳＴが存在する場合には、そのクローンは「全長ではない可能性が高い」と判断した。公共データベース中のＥＳＴ配列より５’末端が伸長している場合、あるいは５’末端が短いクローンでも、その差が５０塩基以内の場合を便宜的に全長とし、それ以上短い場合を非全長とした。
実施例３ｃＤＮＡクローンの塩基配列、アミノ酸配列の解析
実施例２で解析したｃＤＮＡクローンの全塩基配列について、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））による相同性検索（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４，７５５−７６３（１９９８））の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を行い、各ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。また、その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライシングバリアントと推定されるクローンについては、そのゲノム配列が解析可能であればどのエクソンが欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。
実施例４キナーゼ活性の測定
（１）タンパク質の調製
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンについて、これがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、該タンパク質がキナーゼ活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）断片を、５’側のプライマーとして各クローンに特異的な下記プライマー、３’側のプライマーとして下記の共通プライマーを使用したＰＣＲ法によって取得した。
これを、ＳＰ６プロモーターを含む翻訳制御領域−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子−ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）切断サイト−ＤＮＡクローニングサイト（ＳｍａＩ，ＳｆｉＩ）−ポリＡシグナル配列を有するベクター（ｐＥＵ−ＳＳ４）のクローニングサイトに挿入した。
上記で調製されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の後、Ｎｉｃｋ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）によって精製した。
透析法によるコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成の方法は既報（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）の方法に従った。反応溶液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液を含み、上記Ｅｒｉｃｋｓｏｎらの方法に準じた以下の成分組成である。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、８０ｍＭ酢酸カリウム、１．６ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン、２ｍＭジチオスレイトール、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．２４ｍＭ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２６ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＮａｓｉｎＴＭ）に、上述したｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ反応容量）を添加して用いた。
上記反応溶液をフロータ・ライザー（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈ ＲＣ）、分画分子量：１０ｋＤａ，容量：１ｍｌ）に入れ、反応液の４０倍容量の透析外液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン、２．５ｍＭジチオスレイトール、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．３ｍＭ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸）に対しての透析系で、反応は２６℃で、４８時間行った。
反応終了後、透析内液を１６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を分離した。この上清を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で５倍希釈し、同緩衝液で平衡化したアフィニティ樹脂であるグルタチオンセファロース・４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）を充填したアフィニティカラムに室温で添加し、目的タンパク質を吸着した。ここで、上記カラムには、取得した遠心上清の１／２量のアフィニティ樹脂を用いた。
さらに、上記で用いたアフィニティ樹脂の１０倍容量の同緩衝液にてカラムを洗浄した後、２ｕｎｉｔｓ／μｌ濃度のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）の同緩衝液による２５倍希釈液を、アフィニティ樹脂と等容量添加し、４℃で４０時間切断反応を行った後、上記緩衝液にて目的タンパク質を溶出した。
（２）目的タンパク質のＡＴＰ消費量を指標とするキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、終濃度１〜１０ｍＭとなるようにジチオスレイトールを添加後、１μＭのＡＴＰと室温で２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ・ルシフェリンキット（和光純薬工業社製）１００μｌを加え、室温で２４時間反応した後、５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。目的タンパク質を添加していない反応系をコントロールとして、同様に５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。このコントロールの値と目的タンパク質を添加した系の値の差を目的タンパク質が消費したＡＴＰ量として、目的タンパク質１ｍｏｌあたりが２４時間に消費するＡＴＰ量（ｍｏｌ）を目的タンパク質のキナーゼ活性として同定した。
（３）目的タンパク質によるポリペプチドのリン酸化を指標としたキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２：Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ：Ｓｉｇｍａ社、Ｓｙｎｔｉｄｅ２：ＢＡＣＨＥＭ ＦＥＩＮＣＨＥＭＩＫＡＬＩＥＮ ＡＧ）０．２μｇとともに、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１〜１０ｍＭジチオスレイトール、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１μＭ ＡＴＰと室温で２時間インキュベートした。反応終了後、反応液を、２０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ１８（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製：０．４６×２５ｃｍ）カラムに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で、２０〜８０％のアセトニトリルの６０分間の直線濃度勾配により流速１ｍｌ／分でペプチドを分離した。ペプチドの溶出は、２１５ｎｍの吸光度により測定した。コントロールとして目的タンパク質を添加しない反応液についても同様に分離し２１５ｎｍの吸光度を測定した。ここで、目的タンパク質を添加することによってピークの減少および溶出位置の変動が検出されるポリペプチドについては、目的タンパク質の有するキナーゼ活性の基質となると判断することができる。
実施例５各ｃＤＮＡクローンの解析結果
（１）ｃ−ｂｎｇｈ４２００５０１７（配列番号１、６）
ｃ−ｂｎｇｈ４２００５０１７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１に示すように、１８２８塩基から成り、そのうち塩基番号８７から１１２４までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、３４５アミノ酸残基から成る（配列番号６）。配列番号６のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号ＡＢ０５３３０８、ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２ ＣＲ７（ｈｕｍａｎ）（以下、これを「ＡＬＳ２ＣＲ７」と称する）が、ｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１４８、２８５アミノ酸残基に亘り９２％の一致度でヒットした。ＡＬＳ２ＣＲ７はａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓの原因遺伝子ａｌｓ２ｃｒ６の近傍に存在する遺伝子がコードするタンパク質（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２９，１６６−１７３，（２００１））で、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎが見出される。
本タンパク質とＡＬＳ２ＣＲ７のアミノ酸配列（データベース登録記号：ＡＢ０５３３０８）をＣＬＵＳＴＡＬＷでアラインメント比較するとＡＬＳ２ＣＲ７は３８４アミノ酸残基から成り、その１〜１３０番が、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号５２〜１８１番と完全に一致し、また１５２〜２８５番が、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１８２〜３１５番と完全に一致する。即ち、本タンパク質はＡＬＳ２ＣＲ７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１〜１５１番を欠失し、Ｎ末端の１〜５１番、およびＣ末端の３１６〜３４５番に新規配列を有する。
このことを遺伝子上で確認するためにＡＬＳ２ＣＲ７がコードされているヒト染色体２番のゲノム配列上で本タンパク質をコードするｃＤＮＡと上記ＡＢ０５３３０８のｃＤＮＡの比較を行った。ＡＢ０５３３０８は１４個のエクソンから成り、本ＤＮＡではその第１、６、１１、１２、１３、１４エクソンを欠失し、第２、３、４、５、７、８、９、１０エクソンを共有していた。上記の本タンパク質のＡＬＳ２ＣＲ７に対する２１アミノ酸の欠失は、第６エクソンのスキップによるものである。また上記の本タンパク質のＮ末の５１アミノ酸残基の付加は、本ＤＮＡの５’末端に上記ＡＢ０５３３０８にない別のエクソンが１つ存在することによるものであった。更に上記の本タンパク質のＣ末の３０アミノ酸残基の付加は、本ＤＮＡの３’末端に上記ＡＢ０５３３０８にない別のエクソンが存在することによるものであった。これらのことより本タンパク質は、ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２ ＣＲ７（ｈｕｍａｎ）とは異なるｐｒｏｍｏｔｅｒから発現するｍＲＮＡに由来するタンパク質であり、Ｎ末端およびＣ末端の配列が異なり、中央に欠失を持つバリアントであることがわかった。
一方、本タンパク質とＡＢ０５３３０８のＨＭＭＰＦＡＭ検索を行ったところ、本タンパク質（配列番号６）のアミノ酸番号１０３−３２５番に、またＡＢ０５３３０８のアミノ酸配列のアミノ酸番号５２〜３３６番に、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。このことから本タンパク質のＡＬＳ２ＣＲ７に対するアミノ酸配列の欠失はｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎに存在することがわかった。しかし本タンパク質のＡＴＰ消費活性を指標としたキナーゼ活性を、実施例４（２）の系で測定したところ、２９．１であり、また、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）を添加したところ（実施例４（３））、基質の、逆相ＨＰＬＣ上でのピークの減少、新規ピークの溶出（図１矢印部分）が確認されたことから、少なくともＳｙｎｔｉｄｅ２を基質とするプロテインキナーゼであることが確認された。
以上のように、本タンパク質はＡＬＳ２ＣＲ７の、Ｎ末端、Ｃ末端ともに異なる配列をもちＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの一部を欠失するが、プロテインキナーゼ活性が見出されたことから、ＡＬＳ２ＣＲ７とは異なる機能をもつタンパク質であることが推定された。
さらに、本タンパク質をコードするｃＤＮＡは、脳グリオーマ細胞由来の培養細胞からクローニングされたものであり、該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが予測された。
（２）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０２５８７９（配列番号２、７）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０２５８７９（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号２に示すように、２１９５塩基から成り、そのうち塩基番号１１５から２０９４までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、６５９アミノ酸残基から成る（配列番号７）。また、配列番号７のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号７のアミノ酸番号４１３−６５９番に示されるアミノ酸配列にＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。
配列番号７のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）あるいは特許データベースＧＥＮＥＳＥＱ中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＸ１６６５５８、およびＷＯ０１／３８５０３号公報に記載されているアミノ酸配列が、ｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１４８、２５７アミノ酸に亘り９９％の一致度でヒットした。ＡＸ１６６５５８は２７８アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜２５７番が配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号４０３〜６５９番と上記のように９９％一致していた。即ち本タンパク質はＡＸ１６６５５８よりＮ末端が４０２アミノ酸残基長く、また、Ｃ末端が２１アミノ酸短いタンパク質である。また、上記特許公報には、ＡＸ１６６５５８タンパク質についてｎｏｖｅｌ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）との記載がある。
さらに、（ｉｉ）データベース記号：ＡＦ０９３６８９（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ＭＥＫ ｋｉｎａｓｅ α）が２７０アミノ酸残基にわたり４３％の一致度で、また、（ｉｉｉ）データベース登録記号：ＡＢ０００７９７（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＮＰＫ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）が２６０アミノ酸残基にわたって４８％の一致度でヒットした。これらはいずれもＭＡＰ ｋｉｎａｓｅカスケード（ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫが順次活性化することでシグナルを伝えていく系）におけるＭＡＰＫＫＫに位置付けられるプロテインキナーゼである。従って、本タンパク質はＭＡＰＫシグナルカスケードに属するタンパク質と推測される。
またＡＸ１６６５５８と本タンパク質のアミノ酸配列の違いを明らかにするため、両ｃＤＮＡをヒト２番染色体ゲノム配列上（データベース登録記号：ｅｍｂ｜ＡＣ０１６７２５｜ＡＣ０１６７２５）で比較した。本ＤＮＡはエクソン３個からなるが、ＡＸ１６６５５８では本ＤＮＡの第１エクソンが無く、第２エクソンの途中から開始し、第３エクソンを途中まで共有したあと、別のエクソンを有していた。ＡＸ１６６５５８のアミノ酸配列はメチオニンから始まっておらず、不完全タンパク質と推定されるが、本タンパク質はメチオニンから始まっており、ＡＸ１６６５５８よりもＮ末が４０２アミノ酸残基長くなっていることが確認された。このようにＮ末に長い新規配列を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡが単離されたのは、実施例１に記載のオリゴキャップ法を用いた優れた一例と考えられる。上記の新規４０２アミノ酸配列をｐｒｏｓｉｔｅ検索すると、６箇所のＮ−グリコシル化部位、１３箇所のＰＫＣによるリン酸化部位、１２箇所のｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅＩＩによるリン酸化部位、１箇所のミリスチル化部位がみいだされ、種々の翻訳後修飾および活性の調節を受ける可能性があることが分かった。従って、本タンパク質はＡＸ１６６５５８にない活性調節部位を持つｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅと推定される。
本タンパク質のＰｆａｍ検索を行うと、配列番号７のアミノ酸番号４１３〜６５９番にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎがみいだされた。そこで本タンパク質のＡＴＰ消費活性を、実施例４（２）の系で測定したところ、６６．６であり、キナーゼ活性があることが確認された。
これらのことより本タンパク質は、上記ＡＸ１６６５５８およびＷＯ０１／３８５０３号公報に記載のタンパク質のＮ末端が伸長したバリアントであり、キナーゼ活性を有することがわかった。また、本ＤＮＡは、精巣からクローニングされたものであり、該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連するものであることが推測された。
（３）ｃ−ｔｒａｃｈ２０２００４８（配列番号３、８）
ｃ−ｔｒａｃｈ２０２００４８（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号３に示すように、３２５５塩基から成り、そのうち塩基番号１２３２から２７６４までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５１０アミノ酸残基から成る（配列番号８）。配列番号８のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号ＡＸ４０５６３３＿１、ｕｎｎａｍｅｄ ＯＲＦが、ｅ−ｖａｌｕｅ：０、５２７アミノ酸残基に亘り９６％の一致度でヒットした。また、ＡＸ４０５６３３＿１は、ＷＯ０２／２２６６０号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９２として記載されているＮｅｋ３（ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）に類似のタンパク質であった。ＡＸ４０５６３３＿１は５２７アミノ酸から成り、該配列のアミノ酸番号１〜３１３番が本タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）の１〜３１３番と、また３３１〜５２７番が本タンパク質の３１４〜５１０番と完全に一致していた。また、ＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸番号１６２番がグリシンであるのに対し、本タンパク質のそれに相当する部分のアミノ酸はバリンであった。
すなわち本タンパク質はＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸番号３１４〜３３０番のアミノ酸配列部分を欠失し、１アミノ酸置換変異をもつバリアントである。ＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸番号１６２番のバリン／グリシン置換は他の公知のバリアントタンパク質（例えば、ＷＯ００／０００６７２８号公報に記載のタンパク質）にも認められていることからＳＮＰによる変異であると考えられる。従って、本質的には中央部（配列番号８のアミノ酸番号３１３番と３１４番の間）の１７アミノ酸の欠失（ＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１４〜３３０番）が本タンパク質の構造を特異にしている。この欠失領域にはＰＫＡでリン酸化される部位１箇所、ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩでリン酸化される部位１箇所、ミリスチル化部位１箇所があり、種々の翻訳後修飾部位となっている。
本ＤＮＡとＡＸ４０５６３３＿１のｃＤＮＡを、ＡＸ４０５６３３＿１がコードされているヒト染色体１３番のゲノム配列（データベース登録記号：ｅｍｎｅｗ｜ＡＬ６７２２２７｜ＡＬ６７２２２７）において比較したところ、本ＤＮＡは ＡＸ４０５６３３＿１の第１０エクソンをスキップすることで１７アミノ酸残基の欠失を生じていることがわかった。
また、配列番号８のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号８のアミノ酸番号２５〜２７８のアミノ酸配列にＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。本タンパク質のＡＴＰ消費量は、実施例４（２）の系で測定したところ、５９．０であり、キナーゼ活性があることが確認された。
これらのことから本タンパク質は、ＡＸ４０５６３３＿１、すなわちＷＯ０２／２２６６０号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９２として記載されているＮｅｋ３（ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）に類似のタンパク質のスプライシングバリアントであり、キナーゼ活性を有するタンパク質であることが推定された。
また、本ＤＮＡは、気管からクローニングされたものであり、本タンパク質は該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが推測された。
（４）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１６６６３（配列番号４、９）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１６６６３（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号４に示すように、２２５９塩基から成り、そのうち塩基番号３１６から１９４７までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５４３アミノ酸残基から成る（配列番号９）。配列番号９のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号ＡＸ３６２２０７＿１、ｕｎｎａｍｅｄ ＯＲＦが、ｅ−ｖａｌｕｅ：０、５０４アミノ酸残基に亘り９９％の一致度でヒットした。ＡＸ３６２２０７＿１は９７４アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列のアミノ酸番号４７０〜９７３番が、配列番号９に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５０２番と下述の４アミノ酸残基を除いて一致している。また、上記ＡＸ３６２２０７＿１は、ＷＯ０２／０８２５３号公報に記載されており、Ｈｕｍａｎ ＥｐｈＡ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｋｉｎａｓｅであると記載されていた。
このアミノ酸配列と配列番号９に記載のアミノ酸配列を詳細に比較したところ、本タンパク質の配列番号９に記載のアミノ酸配列は、上記ＡＸ３６２２０７＿１およびＷＯ０２／０８２５３号公報に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４６９および６８２番、６８３番が欠失しており、アミノ酸番号６８１番、７４０番、８９３番に変異が認められた。
また、配列番号４に記載の塩基配列は、上記ＡＸ３６２２０７＿１およびＷＯ０２／０８２５３号公報に記載の塩基配列の塩基番号１〜１２４８番および２０４２〜２０４７番が欠失しており、２０４０番、２２１９番、２６７７番に変異が認められた。これらのことより本タンパク質は、膜１回貫通受容体型Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅであるＥｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙのＮ末端４６９アミノ酸を欠失したバリアントであることがわかった。
また、本ＤＮＡとＡＸ３６２２０７＿１のｃＤＮＡ配列をＡＸ３６２２０７＿１がコードされているヒト染色体１番のゲノム配列（データベース登録記号：ｅｍｂｌ｜ＡＣ１０４３３６｜ＡＣ１０４３３６）上で比較した。ＡＸ３６２２０７＿１のｃＤＮＡはエクソン１６個からなる。一方、本ＤＮＡはその第５〜１５エクソンと第１６エクソンの途中までを共有し、その後エクソン３個をもつことでＣ末端の４１アミノ酸の新規配列が付加された構造を有している。ＡＸ３６２２０７＿１は第１６エクソンの中で終止コドンが現れ、本タンパク質との非共有配列１アミノ酸をもって終了する。さらに本ＤＮＡはＡＸ３６２２０７＿１の第５エクソン相当の前に、翻訳されない別のエクソン１個をもつことから、本ＤＮＡはＡＸ３６２２０７＿１とはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒにより生じ、ＡＸ３６２２０７＿１のＮ末端を欠失したタンパク質をコードする。このように本ＤＮＡはその構造からＡＸ３６２２０７＿１とは転写調節、翻訳産物ともに異なることを示している。
また、配列番号９のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号９のアミノ酸番号１４０〜３９５番にＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。更に本タンパク質は配列番号９のアミノ酸番号６０〜８３番に膜貫通領域を、また、４６８〜４９７番にＬｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒモチーフを有することがわかった。
したがって本タンパク質は膜貫通受容体のＮ末端細胞外ドメインを大きく欠失し、Ｃ末端寄りにタンパク質相互作用に関与する配列を持ち、さらにＣ末端部分に新規配列をもつタンパク質である。すなわち本タンパク質は細胞外からの刺激にかかわらず細胞内タンパク質と相互作用しシグナル伝達をおこすタンパク質であると推定することができる。
本タンパク質のＡＴＰ消費活性は、実施例４（２）の系で測定したところ、４３．１であり、キナーゼ活性があることが確認された。また、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）、ＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加したところ（実施例４（３））、両基質の、逆相ＨＰＬＣ上での各々の溶出位置が変化したこと（図２矢印部分）から、これらのペプチドを基質とするプロテインキナーゼであることが確認された。
また、本ＤＮＡは、精巣からクローニングされたものであり、本タンパク質は該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが推測された。
（５）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１５３３５（配列番号５、１０）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１５３３５（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号５に示すように、２０２８塩基から成り、そのうち塩基番号１５１から１８８１までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５７６アミノ酸残基から成る（配列番号１０）。配列番号１０のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮ、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３１が、ｅ−ｖａｌｕｅ：０、５７６アミノ酸残基に亘り９９％の一致度でヒットした。Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮは１０１９アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列のアミノ酸番号４４４〜１０１９番が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７６番と下述の３残基を除いて一致している。
Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのアミノ酸配列と配列番号１０に記載のアミノ酸配列を詳細に比較したところ、本タンパク質の配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、上記Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのアミノ酸配列のアミノ番号１〜４４３番が欠失しており、また６２１番、６２３番、および１０１０番に変異が認められた。また本ＤＮＡとＱ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列（データベース登録番号：ＡＦ２８５５９９）を比較したところ、本ＤＮＡはＡＦ２８５５９９の塩基番号１〜１２０２が欠失しており、１２４４番、１８７８番、１８８３番、３０４３番に変異が認められた。
これらのことより本タンパク質は、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３１（ＳＴＰＫ３１）のＮ末端４４３アミノ酸を欠失したバリアントであることがわかった。
Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ（ＥＢＩ）によると、Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮ（ＳＴＰＫ３１）のアミノ酸番号１０５〜２４２番にｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎが、また７８〜１３７番にＴｕｄｏｒ ｄｏｍａｉｎ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎとともに存在するタンパク質に見出される領域）、さらに７１０〜１０１９番にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎが存在する。
一方、本タンパク質はＰｆａｍ検索により配列番号１０のアミノ酸番号２９６〜５２９番にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎが存在するが、Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのＮ末４４３アミノ酸相当部分を欠くため、ＳＴＰＫ３１とは異なる機能をもつタンパク質と考えられる。
更に本ＤＮＡとＡＦ２８５５９９のｃＤＮＡ配列についてゲノム情報をＡＦ２８５５９９がコードされる染色体７番のゲノム配列で比較すると、ＡＦ２８５５９９はエクソン２４個からなり、本ＤＮＡではその第１０エクソンの後半を共有した後、第１１エクソンから第２４エクソンを共有する。このことから、本ＤＮＡはＡＦ２８５５９９とは異なるプロモータから転写された産物と推定される。
本タンパク質のＡＴＰ消費活性は、実施例４（２）の系で測定したところ、３８．０であり、キナーゼ活性があることが確認された。また、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）、ＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加したところ（実施例４（３））、両基質の、逆相ＨＰＬＣ上での各々の溶出位置が変化したこと（図３矢印部分）から、これらのペプチドを基質とするプロテインキナーゼであることが確認された。
これらのことから、本タンパク質はＳｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３１と比較するとＮ末端を欠失したバリアントである。
また、本タンパク質は、データベース中の文献情報（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２７（４），４２２−４２６（２００１））から精子形成に関わることが明らかとなった。さらに、本ＤＮＡは、精巣からクローニングされたものであり、本タンパク質は該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが推測された。
【産業上の利用の可能性】
本発明のタンパク質およびそれをコードするＤＮＡはキナーゼ活性等を有することから、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて該活性を調節する物質をスクリーニングすることができ、該タンパク質が関連する疾患等に作用し得る医薬の開発に有用である。
本出願は、２００２年９月１０日付けの日本特許出願（特願２００２−２６４３４５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【技術分野】
本発明は、新規なタンパク質、該タンパク質をコードするＤＮＡ、該タンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ、該ＤＮＡを有する組換えベクター、該ＤＮＡの部分配列から成るオリゴヌクレオチド、該ＤＮＡを導入した遺伝子導入細胞、及び該タンパク質に特異的に結合する抗体等に関する。
【背景技術】
現在、世界的なレベルで様々な生物のゲノム配列の解明とその解析が進められている。既に約百数十の原核微生物、下等真核生物の出芽酵母、多細胞性真核生物である線虫で、その全ゲノム配列が決定された。３０億塩基対といわれるヒトのゲノムについては２００１年２月にその塩基配列のドラフトが発表されていたが、２００３年４月に完全配列が解読され公表された。ゲノム配列を明らかにする目的は、全ての遺伝子の機能や制御、あるいは遺伝子間、タンパク質間、細胞間さらには個体間における相互作用のネットワークとして複雑な生命現象を理解するところにある。種々の生物種のゲノム情報から生命現象を解明していくことは、単に学術分野における研究課題として重要であるのみならず、そこで得られる研究成果をいかに産業上の応用へと発展させていくかという点で、その社会的な意義も大きい。
ところが単にゲノム配列を決定しただけでは、全ての遺伝子の機能を明らかにできるわけではない。例えば酵母では、ゲノム配列から推定された約６，０００の遺伝子の約半数しか、その機能を推定できなかった。一方、ヒトには約１０万種類のタンパク質が存在するといわれる。そこで、ゲノム配列から明らかにされてくる膨大な量の新しい遺伝子の機能を、迅速かつ効率的に解明していくための「ハイスループット遺伝子機能解析システム」の確立が、強く望まれている。
真核生物のゲノム配列では、多くの場合、一つの遺伝子がイントロンによって複数のエクソンに分断されている。そのため、ゲノム配列情報だけからそこにコードされるタンパク質の構造を正確に予測するには、多くの問題がある。一方、イントロンが除かれたｍＲＮＡから作製されるｃＤＮＡでは、タンパク質のアミノ酸配列の情報が一つの連続した配列情報として得られるため、容易にその一次構造を明らかにすることが可能である。ヒトのｃＤＮＡの研究では、これまでに５００万以上のＥＳＴ（Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ）データが公共データベースに公開されている。
これらの情報は、ヒト遺伝子構造の解明やゲノム配列におけるエクソン領域の予測、あるいはその発現プロファイルの推定など、様々な角度から利用されている。ところが、これらのヒトＥＳＴ情報の多くはｃＤＮＡの３’末端側近傍に集中しているため、特にｍＲＮＡの５’末端近傍の情報が極端に不足している状況にある。また、世界の研究機関（ヘリックス研究所、かずさＤＮＡ研究所、東大医科学研究所、ドイツ癌研究センター、ＭＧＣプロジェクトなど）で行われている解析の結果明らかにされているｃＤＮＡは４万数千に上り、数的には３万数千と言われる遺伝子座の大半をカバーしていると思われるが、全長クローンとして取得されているｃＤＮＡの割合は８０％程度であることや、重複やスプライスバリアントが含まれていることを考慮すると、まだ取得されていないｃＤＮＡは多数存在していると考えられる。
完全長ｃＤＮＡを取得できれば、その５’末端配列からゲノム配列上でのｍＲＮＡ転写開始点が推定できる上、その配列の中に含まれるｍＲＮＡの安定性や翻訳段階での発現制御に関わる因子の解析が可能である。また、翻訳開始点であるａｔｇを５’側に含むことから、正しいフレームでタンパク質への翻訳を行うことができる。したがって、適当な遺伝子発現系を適用することで、そのｃＤＮＡがコードするタンパク質を大量に生産したり、タンパク質を発現させてその生物学的活性を解析することも可能になる。このように、完全長ｃＤＮＡの解析からはゲノム配列解析を相補する重要な情報が得られる。また、発現可能な全長ｃＤＮＡクローンは、その遺伝子の機能の実証的な解析や産業分野での応用への展開において、その重要性はきわめて高い。
一方、同一のゲノムにコードされたタンパク質であっても、それをコードするｍＲＮＡが転写される際、ゲノム中一部のエクソンが挿入・欠失して結合する異性体（以下、これを「スプライシングバリアントｍＲＮＡ」と称することがある）がある。実際、これらのｍＲＮＡが翻訳されて生成される、複数種の類似のタンパク質（以下、これらを「スプライシングバリアント」と称することがある）が生体内において確認されている。スプライシングバリアントは、組織特異的、発生段階特異的、あるいは疾患特異的に発現し、それぞれ異なる機能を有していると考えられている。
例えば、ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅであるＪＡＫ３遺伝子は、Ｓ型、Ｂ型、Ｍ型の３種類のスプライスバリアントが存在し、Ｓ型は造血細胞で発現しているのに対し、Ｂ型とＭ型は造血細胞と上皮細胞で発現している。Ｓ型とＭ型が抗体によって共沈し同じ細胞で発現していることから、複数のスプライスバリアントが共に機能し、細胞内におけるサイトカインのシグナル伝達反応の複雑性をより高めていると推測されている（例えば、Ｌａｉ，Ｋ．Ｓ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４２），２５０２８−２５０３６（１９９５）を参照）。
このようなスプライシングバリアントのｍＲＮＡあるいはｃＤＮＡも、従来のｃＤＮＡライブラリーやＥＳＴからは取得されにくく、転写開始点を含む完全長ｃＤＮＡライブラリーにより取得される可能性の高いクローンである（例えば、ＷＯ９８／２２５０７号公報（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１およびＮＯ．２）を参照）。
特に、プロテインキナーゼは、基質であるタンパク質のセリン、スレオニンあるいはチロシン残基をリン酸化する酵素であり、極めて多くのファミリーが知られている。また、一般にプロテインキナーゼはタンパク質リン酸化を介する細胞内シグナル伝達系を調節することにより、種々の生命現象の制御に関わっていることが知られており、疾患との関係が解明されている遺伝子が多い（例えば、Ｈｕｎｔｅｒ，Ｔ．，Ｃｅｌｌ，５０：８２３−８２９（１９８７）を参照）。しかし、ヒトの遺伝子の約３〜４％はプロテインキナーゼの遺伝子であると言われ、ヒトの体内には約千種もの異なるプロテインキナーゼが存在すると推定されており、まだ多くのプロテインキナーゼ遺伝子がクローニングされないままに残されている。したがって、ヒトにおいて分離が進んでいないスプライシングバリアントを含む新規なプロテインキナーゼの全長ｃＤＮＡを提供する意義は大きい。また、プロテインキナーゼは、治療のための標的分子として、またタンパク質自身に医薬品としての有用性を期待できる。したがって、これらのタンパク質をコードするｃＤＮＡの全長を明らかにすることには大きな意義がある。
【発明の開示】
本発明は、完全長ｃＤＮＡライブラリーに含まれるｃＤＮＡクローンの塩基配列を解析し、このうちスプライシングバリアントを含む全長として配列が新規なｃＤＮＡについては、これがコードするタンパク質の生理活性を解析及び同定し、該生理活性に基づくタンパク質およびそれをコードするＤＮＡの利用方法を提案することを目的とする。
本発明者らは、オリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８：１７１−１７４（１９９４）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００：１４９−１５６（１９９７））を用いて取得されたスプライシングバリアントを含む配列が新規なｃＤＮＡについて、該ｃＤＮＡクローンの塩基配列の相同性に基づきデータベースを検索したところ、該配列にキナーゼ活性を有するタンパク質に特異的な配列を見出し、これらのｃＤＮＡがコードするタンパク質がプロテインキナーゼであると同定した。本発明は、これらの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち本発明によれば、以下の（１）〜（１５）に記截の発明が提供される。
（１） 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
（２） 上記（１）に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ、
（３） （１）に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
（４） 以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（５） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
（６） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡまたは（５）に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
（７） （６）に記載の細胞により産生される、（１）に記載のタンパク質。
（８） （２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
（９） （１）または（７）に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
（１０） 抗体がモノクローナル抗体である（９）に記載の抗体。
（１１） モノクローナル抗体が（１）または（７）に記載のタンパク質のキナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする（１０）に記載の抗体。
（１２） （１）または（７）に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
（１３） （６）に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
（１４） （１）に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ配列情報および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
（１５） （１）に記載のタンパク質および／または（２）〜（４）のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【図面の簡単な説明】
図１は、配列番号６のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）を添加し、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
図２は、配列番号９のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）およびＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加し、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
図３は、配列番号１０のアミノ酸配列を有するタンパク質に基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）およびＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加し、逆相ＨＰＬＣ上でピークを測定した結果を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
（１）完全長ｃＤＮＡの取得及び塩基配列の解析
本発明のＤＮＡは、配列番号６〜１０に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質、または配列番号６〜１０に記載のアミノ酸配列において１若しくは数個（ここで、数個とは、例えば５個以下、好ましくは３個以下、より好ましくは２個以下を意味する）のアミノ酸残基の置換、欠失及び／または付加を含むアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードし得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、該アミノ酸配列をコードする翻訳領域のみでも、あるいはそのｃＤＮＡの全長を含むものでもよい。
具体的には、ｃＤＮＡの全長を含むＤＮＡとしては、例えば配列番号１〜５に記載の塩基配列からなるＤＮＡ等が挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号８７〜１１２４、配列番号２の塩基番号１１５〜２０９４、配列番号３の塩基番号１２３２〜２７６４、配列番号４の塩基番号３１６〜１９４７、配列番号５の塩基番号１５１〜１８８１に示される配列を有するものが挙げられる。さらに上記のｃＤＮＡの全長でなくても、上記翻訳領域とその３’及び／または５’端に隣接する、翻訳領域の発現に最低限必要な部分を含むもの等も本発明のＤＮＡに含まれる。
本発明のＤＮＡは、これを取得できる方法であれば如何なる方法により取得したものでもよいが、具体的には例えば下述の方法により取得することができる。まず、ヒトの組織あるいは培養細胞等からそれ自体既知の通常用いられる方法によりｍＲＮＡを調製する。次に、このｍＲＮＡを鋳型としてオリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４（１９９４））によりｃＤＮＡを取得する。具体的には、取得したｍＲＮＡについて酸性ピロフォスファターゼにより５’キャップをはずし、その後露出した５’末端のリン酸基を標的に、オリゴキャップリンカーをＲＮＡライゲースを用いて連結する。ここで、キャップ構造を５’末端に有していないＲＮＡ分子について、上記オリゴキャップリンカーが結合しないように、予め５’末端に存在するリン酸基を、５’キャップは外さないが５’端のリン酸基のみ外す活性を有するフォスファターゼ等を用いて外しておくことは有効である。このＲＮＡ分子を鋳型として、３’側のプライマーとしてオリゴｄＴプライマーを用いて逆転写酵素により逆転写を行った後、ＲＮＡ鎖を分解除去する。
さらに取得された１本鎖ＤＮＡを鋳型として、上記オリゴキャップリンカーの部分配列を有するオリゴヌクレオチドを５’プライマーとし、３’末端に特異的なプライマー（オリゴｄＴプライマー等）を用いてポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）を行うことにより完全長ｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。プライマーの鎖長としては、通常１５〜１００塩基、好ましくは１５〜３０塩基が挙げられるが、増幅するｃＤＮＡの鎖長が長い場合には２５〜３５塩基の長さとすることが好ましく、また、Ｌｏｎｇ ａｎｄ Ａｃｃｕｒａｔｅ ＰＣＲ（ＬＡ ＰＣＲ：林健志、実験医学別冊・ＰＣＲの最新技術、羊土社；Ｃｈｅｎｇ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６９：６８４−６８５（１９９４））を用いることが好ましい。
このようにして取得されたｃＤＮＡは、これを適当なクローニングベクターに挿入してクローニングを行う。ここで用いられるベクターとしては、取得されたｃＤＮＡクローンを細胞に導入して該ｃＤＮＡがコードするタンパク質を発現できるようなタンパク質発現用ベクターが好ましく用いられる。具体的には例えば、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ００９８６４）等が好ましく、また大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられる。
かくして取得されるｃＤＮＡライブラリーは、それ自体既知の通常用いられる方法により塩基配列の解析を行う。本発明のＤＮＡは、取得されたｃＤＮＡの５’末端あるいは３’末端の塩基配列を解析し、これをＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＧｅｎｂａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、ＰＤＢ、ＥＳＴ等のデータベースについてＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））を用いて検索し、その全長について完全に一致する配列が見出されない場合は新規として以下の解析に供することとした。
このような完全長ｃＤＮＡの塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、配列番号１〜５に記載の塩基配列を有するものが挙げられる。また、その翻訳領域としては、配列番号１の塩基番号８７〜１１２４、配列番号２の塩基番号１１５〜２０９４、配列番号３の塩基番号１２３２〜２７６４、配列番号４の塩基番号３１６〜１９４７、配列番号５の塩基番号１５１〜１８８１に示される配列を有するものが挙げられる。
かくして取得されたｃＤＮＡの全長として新規な塩基配列を、ＢＬＡＳＴによる相同性検索（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４，７５５−７６３（１９９８））の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）等を行うことにより、該塩基配列がコードするタンパク質の機能を推定することができる。
ＢＬＡＳＴによる相同性検索においては、検索の結果得られた相同性が十分有意なヒット配列に付随する種々のアノテーション情報から、解析対象としているクローンの機能を推定することができる。ここで、十分有意なヒット配列とは、登録されている配列の触媒ドメイン部分と本発明のＤＮＡのこれに対応する部分との一致度（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）が３０％以上のものか、ｅ−ｖａｌｕｅ（問い合わせ配列がデータベース中に偶然存在する期待値）として１０−４以下のものを示す。
例えば、上位にヒットした触媒ドメイン配列の多くがキナーゼとしての機能を確認されたものであるならば、それと配列上類似である解析対象クローンもまた同じ機能、即ち、キナーゼ活性を持つであろうという予測が成り立つ。
ＨＭＭＰＦＡＭは、Ｐｆａｍというタンパク質プロファイルを集積したデータベース中にあるエントリーが有するアミノ酸配列の特徴を、解析対象である塩基配列のコードするアミノ酸配列が有するかどうかを洗い出す方法による解析である。プロファイルは一連の同一特徴を持つタンパク質群から抽出されており、一配列対一配列の全長に亘る比較では明確化できない機能でも、配列中にその特徴領域があればこれを見出し機能予測ができる。このように、それがコードするタンパク質がキナーゼ活性を有すると予測されるｃＤＮＡは、後述する生化学的実験によりそのキナーゼ活性を確認することができる。
上記でｃＤＮＡの全長として新規であるとされたクローンとして具体的には、配列番号１〜５に示す塩基配列を有するものが挙げられる。また、これらの塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号６〜１０に示すものが挙げられる。
かくして取得され、塩基配列が決定され、また機能が推定される本発明のＤＮＡは上記の配列番号１〜５に記載の塩基配列、あるいはその翻訳領域として上記に示した塩基配列を有するものだけでなく、これらの塩基配列において、１若しくは数個（ここで言う数個とは、例えば１５個以下、好ましく９個以下、より好ましくは６個以下を意味する）の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、並びに、これらとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ等も含まれる。これらＤＮＡには前記したとおり、配列番号６〜１０に記載のタンパク質のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸配列が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするものが含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡとは、配列番号１〜５に記載の塩基配列とＢＬＡＳＴ解析で８０％以上、好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列を含むＤＮＡ等が挙げられる。また、ストリンジェントな条件下のハイブリダイゼーションとは、通常のハイブリダイゼーション緩衝液中で、温度が４０〜７０℃、好ましくは６０〜６５℃等で反応を行い、塩濃度が１５ｍＭ〜３００ｍＭ、好ましくは１５ｍＭ〜６０ｍＭ等の洗浄液中で洗浄を行う方法に従って行うことができる。
さらに、本発明のＤＮＡは、上述の方法により取得されたものでも、また合成されたものでもよい。ＤＮＡの塩基配列の置換は、例えばサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（宝酒造社製）や、クイックチェンジサイトダイレクテッドミュータジェネシスキット（ストラタジーン社製）等の市販キットで容易に行うことができる。
（２）新規ｃＤＮＡがコードするタンパク質
本発明のＤＮＡがコードするタンパク質の翻訳領域は、例えば、該ＤＮＡが有する塩基配列について３種類の読み枠によりアミノ酸に変換していき、最も長いポリペプチドをコードする範囲を本発明の翻訳領域としてそのアミノ酸配列を推定することができる。このようなアミノ酸配列として例えば、配列番号６〜１０に記載のもの等が挙げられる。また、本発明のタンパク質は、上記のアミノ酸配列に限られるものではなく、該アミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するものも含まれる。
本発明のタンパク質の取得方法としては、（１）に記載の本発明のＤＮＡを適当な方法により転写／翻訳する方法が好ましく用いられる。具体的には、適当な発現用ベクター若しくは適当なベクターに適当なプロモーターとともに挿入した組換えベクターを作製し、この組換えベクターで適当な宿主微生物を形質転換したり、適当な培養細胞に導入することにより発現させ、これを精製することにより取得することができる。
また、そのＮ末端またはＣ末端に適当なタグが融合するように設計されたベクターなどに挿入してタグを付加したタンパク質も本発明のタンパク質に含まれる。タグとして具体的には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリヒスチジン、Ｆｌａｇなどが挙げられる。
上記形質転換体が産生するタンパク質には、タンパク質合成時に重原子などで置換・修飾したアミノ酸を取り込ませることにより修飾することができる。また、タンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。例えば、Ｎ末端アセチル化、Ｃ末端アミド化などの末端修飾、糖鎖付加、脂質付加、アシル化、メチル化、スルホン化、カルボキシル化、水酸化、リン酸化、ＡＤＰ−リボシル化などであるが、必ずしもこれらに限定されない。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
また、上記形質転換体が産生するタンパク質を、精製の前又は後に適当なタンパク質修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することにより修飾タンパク質とすることができる。これらの修飾タンパク質も上記したキナーゼ活性を有するものであれば本発明の範囲に含まれる。
本発明のタンパク質の産生を行う際、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターの作製に用いるベクターとしては、形質転換体内で該ＤＮＡが発現されるものであれば特に制限はなく、プラスミドベクター、ファージベクターのいずれでもよい。これらのうち通常は、該ＤＮＡが導入される宿主に適したプロモーター等の発現制御領域ＤＮＡが既に挿入されている市販のタンパク質発現用ベクターを用いる。このようなタンパク質発現用ベクターとして、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合では、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ストラタジーン社製）、ｐＧＥＸ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）等が挙げられ、酵母の場合ではｐＥＳＰ−Ｉエクスプレッションベクター（ストラタジーン社製）等が挙げられ、さらに昆虫細胞の場合ではＢａｃＰＡＫ６（クロンテック社製）等が用いられる。また宿主が動物細胞の場合では、ＺＡＰ Ｅｘｐｒｅｓｓ（ストラタジーン社製）、ｐＳＶＫ３（アマシャムファルマシアバイオテク社製）が挙げられ、宿主が哺乳動物細胞等の場合にはｐＭＥ１８ＳＦＬ３（Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ００９８６４）等が好ましい。
発現制御領域が挿入されていないベクターを用いる場合には、発現制御領域として少なくともプロモーターを挿入する必要がある。ここでプロモーターとしては、宿主微生物または培養細胞が保有するプロモーターを用いることができるが、これに限られるものではなく、具体的には例えば、宿主が大腸菌の場合にはＴ３、Ｔ７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ、酵母の場合にはｎｍｔ１プロモーター、Ｇａｌ１プロモーター等を用いることができる。昆虫細胞の場合には、ポリヘドリンプロモーター等を用いることができる。また宿主が動物細胞の場合にはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター等が好ましく用いられる。
また哺乳動物由来のプロモーターが機能可能な宿主を用いる場合には、本発明の遺伝子に固有のプロモーターを用いることもできる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入は、該ＤＮＡまたはこれを含むＤＮＡ断片をベクター中のプロモーターの下流に該遺伝子ＤＮＡがコードするタンパク質のアミノ酸配列を連結して行えばよい。
このようにして作製した組換えベクターは、それ自体既知の方法により後述する宿主を形質転換して、ＤＮＡ導入体を作製することができる。宿主への該ベクターの導入方法として、具体的には、ヒートショック法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５３，１５４，（１９７０））、リン酸カルシウム法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２１，５５１，（１９８３））、ＤＥＡＥデキストラン法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１５，１６６，（１９８２））、インビトロパッケージング法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７２，５８１，（１９７５））、ウィルスベクター法（Ｃｅｌｌ，３７，１０５３，（１９８４））、および電気パルス法（Ｃｈｕ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，１３３１（１９８７））等が挙げられる。
ＤＮＡ導入体を作製するための宿主としては、本発明のＤＮＡが体内で発現するものであれば特に限定されないが、例えば大腸菌、酵母、バキュロウィルス（節足動物多角体ウイルス）−昆虫細胞、あるいは動物細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌ではＢＬ２１、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ストラタジーン社製）等、酵母ではＳＰ−Ｑ０１（ストラタジーン社製）等、バキュロウィルスではＡｃＮＰＶ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））とその宿主であるＳｆ−９（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７４０６，（１９８８））等が挙げられる。また動物細胞としてはマウス繊維芽細胞Ｃ１２７（Ｊ．Ｖｉｏｌ．，２６，２９１，（１９７８））やチャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ細胞（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７，４２１６，（１９８０））等が挙げられるが、発現量やスクリーニングの簡便さから好ましくはアフリカミドリザル腎臓由来ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１：アメリカン タイプ カルチャー コレクション保存細胞）、ヒト胎児腎臓由来ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１５７３）またはヒト子宮頸部癌ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−２）が用いられる。
上記したようなタンパク質発現用ベクターを用いる発現方法の他に、プロモーターを連結した本発明のＤＮＡ断片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５７，２０３６，（１９９３））、あるいはトランスポゾンや挿入配列（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７３９，（１９９４））等を用いてＤＮＡ導入体を作製することもできる。
上記で得られた培養物は細胞または菌体を遠心分離等の方法により収集し、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム、および／または凍結融解等のそれ自体既知の適当な方法により破壊した後、遠心分離や濾過等によりタンパク質粗精製液を得、さらに適当な精製方法を組み合わせることにより精製することができる。
かくして、本発明のタンパク質が取得される。上記したタンパク質発現組換えベクターを用いる発現方法の他に、上記（１）で取得された本発明のＤＮＡを無細胞転写翻訳系（または無細胞タンパク質合成系とも称する）に供することによりタンパク質発現を誘導し、本発明のタンパク質を取得することができる。本発明で用いられる無細胞転写翻訳系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡからタンパク質への翻訳に必要な全ての要素を含む系であり、そこにＤＮＡを加えることによってそのＤＮＡがコードしているタンパク質が合成されるようなあらゆる系を指す。無細胞転写翻訳系の具体例としては、真核細胞、およびバクテリア細胞、又はそれらの一部からの抽出液に基づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。無細胞タンパク質合成系として具体的には、大腸菌、植物種子の胚芽、ウサギ網状赤血球等の細胞抽出液等の既知のものが用いられる。これらは市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液は、Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ（Ｅｄ．ｂｙ Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．ａｎｄ Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｓ．Ｊ．），１７９−２０９，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の無細胞タンパク質合成系、または細胞抽出液としては、大腸菌由来のものは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）とＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。
得られた無細胞転写翻訳系の転写翻訳産物からの、本発明のタンパク質の分離、および精製は、それ自体既知の通常用いられる方法で行うことができる。具体的には、エピトープペプチド（例えば、ポリヒスチジンペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質等）をコードするＤＮＡ領域を、前記した転写翻訳されるべきＤＮＡに導入し、前記の通り発現させ、該タンパク質と親和性を有する物質とのアフィニティーを利用して精製することができる。
目的とするタンパク質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動等で分離し、クマシーブリリアントブルー（シグマ社製）等で染色するか、または後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体により検出する方法等によって確認できる。また一般的に、発現されたタンパク質は生体内に存在するタンパク質分解酵素により切断されること（プロセッシング）が知られている。本発明のタンパク質も当然のことながら切断されたアミノ酸配列の部分断片であっても、キナーゼ活性を有するものであれば、本発明のタンパク質に含まれる。
（３）本発明のタンパク質が有する活性の確認
本発明のタンパク質は、これを上記（２）に記載のとおり組み換えタンパク質として作製し、これを解析することにより（１）で推測した活性を有していることを確認することができる。さらに下記（４）に記載の抗体等との組み合わせにより解析することもできる。
本発明のタンパク質が、キナーゼ活性を有することは、それ自体既知の常法を用いることができる。具体的な方法の例として、基質を該組み換えタンパク質に接触させ、該組み換えタンパク質のキナーゼ活性により基質がリン酸化される際に消費されるＡＴＰ量、生成物の量を測定する方法等を以下に説明する。
反応液としては、基質のリン酸化部位がセリン／スレオニンである、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、マグネシウムイオン、例えば５〜１００ｍＭの塩化マグネシウムあるいは酢酸マグネシウム、および還元剤として１〜１００ｍＭの２−メルカプトエタノール或いは１〜１０ｍＭのジチオスレイトールを含む、リン酸イオンの存在しない、中性から弱塩基性緩衝液、例えば５０ｍＭのトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用い、また、基質のリン酸化部位がチロシンであるＴｙｒプロテインキナーゼの活性を測定する場合は、塩化マンガン、塩化亜鉛、ＮａＶＯ３、ジチオスレイトールを含むトリス−塩酸あるいはＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０〜８．０）を用いることができる。
この反応液に、ＡＴＰおよびそれぞれに適した基質を加えた後、精製した本発明のタンパク質を添加し、室温〜３７℃で２４時間程度反応後、該タンパク質が有するキナーゼ反応により消費したＡＴＰ量、或いは該タンパク質により行われるキナーゼ反応による生成物を測定する。
ここで、受容体型キナーゼと予想されるタンパク質のキナーゼ活性を測定する場合には、該タンパク質の細胞内部分、あるいはキナーゼ活性中心部分のみを組み換えタンパク質として発現させて上記の反応に用いることが好ましい。
キナーゼ反応に関して、Ｓｅｒ／Ｔｈｒプロテインキナーゼである環状ヌクレオチド依存性プロテインキナーゼの場合、各キナーゼに対応する環状ヌクレオチドを反応液中に添加することが必要である。例えば、Ａ−キナーゼの場合は環状ＡＭＰ（ｃＡＭＰ）を、Ｇ−キナーゼの場合は環状ＧＭＰ（ｃＧＭＰ）を添加し、基質としてヒストンを用いる。
リン脂質依存性プロテインキナーゼの場合は、リン脂質を反応液中に添加する。例えば、Ｃ−キナーゼの場合、ホスファチジルセリンを添加し、基質としてヒストンを用いる。カルシウム依存性プロテインキナーゼの場合には、カルモジュリンを反応液に添加し、基質としてミオシンＬ鎖を用いる。ここには、ミオシンＬ鎖キナーゼ、カルモジュリンキナーゼが含まれる。Ｔｙｒプロテインキナーゼの場合は、基質としてチューブリン、ヒストン、カゼイン、ミオシンＬ鎖、ガストリン、アンギオテンシン、チロシン−グルタミン酸（１：４）重合物等を用いる。
キナーゼ活性測定において、基質へのリン酸基の転移に先立ち、キナーゼによるＡＴＰのＡＤＰへの加水分解反応が起こる。ここで加水分解されたＡＴＰ量を測定することで、キナーゼ活性を定義づけることも可能である。この場合、基質非存在下で行った反応液中のＡＴＰ量を測定し、消費ＡＴＰ量をキナーゼ活性とする（Ｗｈｉｔｅｈｏｏｕｓｅ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５８：３６９３−３７０１（１９８３））。
キナーゼ反応により消費したＡＴＰ量を測定する場合、上記キナーゼ反応液にルシフェリン、ルシフェラーゼを加え、一定時間反応後、添加したルシフェリン特有の蛍光波長で蛍光強度を測定し、残存ＡＴＰによる蛍光量とする。プロテインキナーゼおよび基質非存在下で測定した、反応液中に存在する全ＡＴＰ蛍光強度から上記蛍光強度を差し引いた値を、キナーゼ活性により消費したＡＴＰ量とし、酵素のキナーゼ活性とする。
キナーゼ反応による生成物を測定する場合は、反応液に添加するＡＴＰとして放射性同位元素である３２ＰをＡＴＰのγ位に含んだ［γ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いる。キナーゼ反応終了後、反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、泳動後のゲルをＸ線フィルムによりオートラジオグラフィーを行い３２Ｐの取り込まれたタンパク質バンドを検出する。また、反応液に１０％トリクロロ酢酸、或いは終濃度９０％となるようにエタノールまたはアセトンを加え、タンパク質を沈殿させる。その後遠心或いはフィルター濾過により上清を除き、さらに同溶液で数回洗浄した後乾燥し、基質タンパク質がリン酸化されたために不溶化画分に移行した３２Ｐを液体シンチレーションカウンターで測定する。放射性同位元素を用いない方法としては、キナーゼ反応終了後の反応液を、クロマトグラフィーにより分離し、リン酸化された基質の溶出位置の変化および変化量で活性を測定することも可能である。この場合、クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーを用いることができる。また、基質のリン酸化による質量変化を質量分析装置で測定することにより、活性測定することも可能である。この場合、前述のクロマトグラフィー分離と併用することで、測定精度がさらに上昇する。
このようなキナーゼ活性の解析系は、本発明のキナーゼ活性を有するタンパク質のアゴニストやアンタゴニストの評価にも用いることができる。なお、本発明のタンパク質が有する活性の確認は、上記した方法に限定されるものではない。
（４）本発明のタンパク質の機能解析
かくして得られたスプライシングバリアントとして同定されたものを含む新規タンパク質であって、かつキナーゼ活性を有する本発明のタンパク質は、上記（３）で確認されたキナーゼ活性以外の機能を解析することによりその新規の利用法が提供される（このキナーゼ活性以外の機能をさらに解析する対象となるタンパク質を、以下「解析対象タンパク質」と称することがある）。特に、本発明のタンパク質には、公知のタンパク質のスプライシングバリアントが含まれるため、このバリアントが公知のバリアントとどのような異なる機能があるかを同定することは重要である。
具体的な機能の解析方法としては、例えば、（ｉ）各組織、疾患、あるいは発生段階における発現状態を比較解析する方法、（ｉｉ）他のタンパク質、ＤＮＡとの相互作用を解析する方法、（ｉｉｉ）適当な細胞あるいは個体へ導入し、表現型の変化を解析する方法、（ｉｖ）適当な細胞あるいは個体において該タンパク質の発現を阻害して表現型の変化を解析する方法などが挙げられる。
（ｉ）の方法においては、本発明のタンパク質の発現を、ｍＲＮＡレベルあるいはタンパク質レベルで解析することができる。ｍＲＮＡレベルで発現量を解析する場合は、例えば、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｅｄ．ｂｙ Ｈａｒｒｉｓ，Ｎ．ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９０））、ＤＮＡチップを利用したハイブリダイゼーション法、定量ＰＣＲ法等が用いられる。ここで、解析の対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、解析対象タンパク質をコードするｃＤＮＡにのみ存在し、公知のバリアントをコードするｃＤＮＡとはハイブリダイズしないプローブを用いることが好ましい。定量ＰＣＲ法の場合には、対象バリアントと公知バリアント間で異なる長さの増幅断片ができるプライマーを選択して行う方法（Ｗｏｎｇ，Ｙ．Ｗ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔ．，３２０，１４１−１４５（２００２））等が挙げられる。また、タンパク質レベルで解析する場合には、後述する本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体を用いた組織染色法などが挙げられる。この場合、対象タンパク質にのみ反応し、公知のバリアントには反応しない抗体を用いることが好ましい。
（ｉｉ）の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法等が挙げられる。該方法においても、解析対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントも同様にして相互作用する物質を解析し、対象タンパク質特異的に相互作用する物質を同定することが好ましい。
（ｉｉｉ）の方法では、本発明のｃＤＮＡを導入する細胞は特に制限はないが、ヒト培養細胞等が特に好ましく用いられる。ＤＮＡの細胞への導入法としては、上記（２）に記載のものが挙げられる。さらに導入細胞の表現型としては、細胞の生死、細胞の増殖速度、細胞の分化、細胞が神経細胞の場合には神経突起の伸長度、細胞内タンパク質の局在や移行など顕微鏡等で観察可能なものや、細胞内の特定タンパク質の発現変化など生化学的実験により解析可能なものも含む。これらの表現型は、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のものも同様に細胞へ導入し、比較解析することにより解析対象バリアントに関連する表現型を同定することができる。また、本発明のタンパク質はキナーゼ活性を有するものであることがわかっているので、キナーゼが関連する疾患に見られる表現型等に注目して解析することも好ましい。
（ｉｖ）の方法では、後述するオリゴヌクレオチドを用いた方法や、ＲＮＡインターフェアレンス法により効率的に行うことができる。この方法においても、解析する対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、公知のバリアントやその他のバリアントについても同様の解析を行い、比較解析することにより対象タンパク質特異的な機能を同定することができる。
（５）オリゴヌクレオチドの調製
上記（１）に記載の方法で取得した本発明のＤＮＡまたはその断片を用いて、ＤＮＡ合成機などを用いる常法により、本発明のＤＮＡの一部の配列を有するアンチセンス・オリゴヌクレオチド、センス・オリゴヌクレオチド等のオリゴヌクレオチドを調製することができる。
該オリゴヌクレオチドとしては、上記ＤＮＡの有する塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。具体例としては、配列番号１〜５で表される塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するＤＮＡまたは該ＤＮＡと相補的な配列を有するＤＮＡを挙げることができる。ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントＤＮＡが存在するスプライシングバリアントの場合には、公知のバリアントと異なる部分の塩基配列を選択することが好ましい。センスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして用いる場合には、両者の融解温度（Ｔｍ）および塩基数が極端に変わることのない上記のオリゴヌクレオチドが好ましい。また、配列の長さは、一般的には５〜１００塩基であり、好ましくは１０〜６０塩基であり、より好ましくは１５〜５０塩基である。
また、これらオリゴヌクレオチドの誘導体も本発明のオリゴヌクレオチドとして利用することができる。該オリゴヌクレオチド誘導体としては、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合がペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、あるいはオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体等をあげることができる。
また、本発明のオリゴヌクレオチドは、これを２本鎖ＲＮＡとして調製することにより、ＲＮＡインターフェアレンス法に適用することができる。２本鎖ＲＮＡの作製方法、及びＲＮＡインターフェアレンス法については、例えば、Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４９４−４９８（２００１）に記載の方法等を用いることができる。上記２本鎖ＲＮＡは、そのすべてがＲＮＡである必要はない。具体的には、その一部がＤＮＡであるものとして、ＷＯ０２／１０３７４号公報に記載のものを用いることができる。
このＲＮＡインターフェアランス法において標的となる遺伝子（以下これを「標的遺伝子」と称することがある）は、本発明のＤＮＡであれば、如何なるものであってもよい。また、該遺伝子ＤＮＡのオルソログと予想される遺伝子も標的遺伝子とすることができる。これらのＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一な配列を有するＲＮＡからなる２本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「２本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい１５ｂｐ以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と８０％以上の相同性を有することを意味する。
また、解析対象タンパク質が公知タンパク質と比較して、挿入型あるいは置換型バリアントである場合は、２本鎖ポリヌクレオチド配列は挿入あるいは置換部位に設定することができる。また、解析対象タンパク質が公知タンパク質の欠失型バリアントである場合は、欠失部を跨ぐ配列を２本鎖ポリヌクレオチド配列とすることにより、該タンパク質特異的に効果のある配列を選定することができる。さらに、解析対象タンパク質と公知タンパク質のそれぞれをコードするＤＮＡの塩基配列と比較して、解析対象タンパク質をコードするＤＮＡに特異的な塩基配列を選定することによれば、解析対象タンパク質特異的にその発現を阻害することができる。
ヌクレオチドの鎖長は１５ｂｐから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１５〜５００ｂｐ程度のものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、３０ｂｐ以上の長い２本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，５，１１５−１８０（１９８３））、該２本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２’−５’−ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物または該動物由来の細胞あるいは組織を被導入体として用いる場合には１５〜３０ｂｐ、好ましくは１９〜２４ｂｐ、さらに好ましくは２１ｂｐの２本鎖ポリヌクレオチドを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドはその全体が２本鎖である必要はなく、５’または３’末端が一部突出したものも含むが、３’末端が２塩基突出したものを用いることが好ましい。２本鎖ポリヌクレオチドは相補性を有する２本鎖のポリヌクレオチドを意味するが、自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
２本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては特に制限はないが、それ自体既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより２本鎖とすることができる。会合の方法としては上記ポリヌクレオチドを混合し、２本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した２本鎖ポリヌクレオチドは、アガロースゲル等を用いて確認し、残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する。
このようにして調製した２本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳を受け得るものであれば如何なるものであってもよいが、具体的には、植物、動物に属するものが挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、及びヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、及び他の昆虫が含まれる。好ましくは、細胞は脊椎動物細胞である。
被導入体は、細胞、組織あるいは個体を意味する。ここで細胞とは、生殖系列または体性、分化全能または多分化能、分割または非分割、実質組織または上皮、不滅化したものまたは形質転換したもの等であってよい。細胞は、配偶子または胚であってよく、胚の場合、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚からの細胞であり、胎児組織を含む。さらには、幹細胞のような未分化細胞、または胎児組織を含む器官または組織の細胞のような分化細胞、または生物内に存在する任意の他の細胞であってよい。分化している細胞型には、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞及び内分泌腺または外分泌腺の細胞が含まれる。
被導入体への２本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウィルス感染、２本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウイルス感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、非経口（皮下、筋肉内及び静脈内投与を含む）、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法やウイルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、２本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、２本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
導入する２本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により２本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００ｎＭが好ましい。
ＲＮＡインターフェアレンスによる本発明の遺伝子の導入体内での発現抑制により、本発明の遺伝子がコードするタンパク質の機能の確認、あるいは新たな機能の解析等を行うことができる。
（６）本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体
本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体の調製方法としては、通常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原として用いられるポリペプチドについても、公知の方法に従って抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配列を選択して用いることができる。エピトープの選択方法としては、例えばＥｐｉｔｏｐｅ Ａｄｖｉｓｅｒ（富士通九州システムエンジニアリング社製）等の市販のソフトウェアを用いることができる。また、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ反応し、公知の、またはそれ以外のバリアントには反応しない抗体を用いることにより、対象タンパク質に特異的な機能を同定することができる。このような抗体のエピトープとしては、例えば、対象タンパク質が公知のバリアントと比較して欠失しているアミノ酸配列がある場合、欠失部分の前後のアミノ酸配列（ジャンクション部分）等が好ましい。また、対象タンパク質が公知のバリアントのＮ末またはＣ末が添加されているアミノ酸配列を有する場合、添加されているアミノ酸配列をエピトープとすることも好ましい。上記以外の方法として、対象タンパク質に対して取得したポリクローナル抗体から、公知の、またはそれ以外のバリアントに反応する抗体を除去することにより、対象タンパク質にのみ反応する抗体を取得することができる。除去する方法としては、公知の、またはそれ以外のバリアントをリガンドとして固定したアフィニティークロマトグラフィー、或いは、公知の、またはそれ以外のバリアントによる免疫沈降法等が用いられる。
上記の抗原として用いるポリペプチドは、公知の方法に従って合成した合成ペプチドでも、また本発明のタンパク質そのものを用いることもできる。抗原となるポリペプチドは、公知の方法に従って適当な溶液等に調製して、哺乳動物、例えばウサギ、マウス、ラット等に免疫を行えばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキャリアタンパク質とのコンジュゲートにして用いたり、アジュバント等を加えて免疫を行うのが好ましい。
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、例えば皮下、腹腔内、静脈内、あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。具体的には、例えばＢＡＬＢ／ｃマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等が用いられる。また、抗原の摂取量としては、抗原がポリペプチドの場合０．３〜０．５ｍｇ／１回程度が好ましいが、ポリペプチドの種類、また免疫する動物種によっては適宜調節される。
免疫後、適宜試験的に採血を行ってオクタローニー法、固相酵素免疫検定法（以下、これを「ＥＬＩＳＡ法」と称することがある）やウエスタンブロッティング等の方法で抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具体的には、例えば、公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取得する方法等が挙げられる。抗体成分の精製は、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等の方法を用いることができる。
また、該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させたハイブリドーマを用いる（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５（１９７５））ことによりモノクローナル抗体を作製することもできる。モノクローナル抗体は、例えば以下の方法により取得することができる。
まず、上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取得する。抗体産生細胞は、形質細胞、及びその前駆細胞であるリンパ球であり、これは個体の何れから取得してもよいが、好ましくは脾臓、リンパ節、末梢血等から取得する。これらの細胞と融合させるミエローマとしては、一般的にはマウスから得られた株化細胞、例えば８−アザグアニン耐性マウス（ＢＡＬＢ／ｃ由来等）ミエローマ細胞株であるＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５８０）、Ｐ３−ＮＳ１／１Ａｇ４．１（理研セルバンク：ＲＣＢ００９５）等が好ましく用いられる。細胞の融合は、抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当な割合で混合し、適当な細胞融合培地、例えばＲＰＭＩ１６４０やイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、あるいはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等に、５０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を溶解したもの等を用いることにより行うことができる。また電気融合法（Ｕ．Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ，６８，５７７（１９８１））によっても行うことができる。
ハイブリドーマは、用いたミエローマ細胞株が８−アザグアニン耐性株であることを利用して適量のヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）液を含む正常培地（ＨＡＴ培地）中で５％ＣＯ２、３７℃で適当時間培養することにより選択することができる。この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって適宜選択して用いることができる。選択されたハイブリドーマが産生する抗体の抗体価を上記した方法により解析し、抗体価の高い抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等により分離し、分離した融合細胞を適当な培地で培養して得られる培養上清から硫安分画、アフィニティクロマトググラフィー等の適当な方法により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。また精製には市販のモノクローナル抗体精製キットを用いることもできる。さらには、免疫した動物と同系統の動物、またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブリドーマを増殖させることにより、本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹水を得ることもできる。
また、本発明のタンパク質としてヒト由来のものを取得した場合には、かかるポリペプチド、あるいはその部分ペプチドを抗原として、ヒト末梢血リンパ球を移植したＳｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ（ＳＣＩＤ）マウスに上記した方法と同様にして免疫し、該免疫動物の抗体産生細胞とヒトのミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製することによってもヒト型抗体を作製することができる（Ｍｏｓｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，３３５，２５６−２５９（１９８８）；Ｄｕｃｈｏｓａｌ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５，２５８−２６２（１９９２））。
また、取得したヒト型抗体を産生するハイブリドーマからＲＮＡを抽出し、目的のヒト型抗体をコードする遺伝子をクローニングして、この遺伝子を適当なベクターに挿入し、これを適当な宿主に導入して発現させることにより、さらに大量にヒト型抗体を作製することができる。ここで、抗原との結合性の低い抗体は、それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさらに結合性の高い抗体として取得することもできる。一過性抗体等の部分フラグメントは、例えばパパイン等を用いてＦａｂ部分とＦｃ部分を切断し、アフィニティカラム等を用いてＦａｂ部分を回収することによって作製することができる。
かくして得られる本発明のタンパク質と特異的に結合する抗体は、本発明のタンパク質に特異的に結合することによって該タンパク質が有するキナーゼ活性等を阻害する中和抗体として用いることもできる。タンパク質が有する活性を阻害するものの選択方法としては特に制限はないが、例えば、上記（２）で作製したＤＮＡ導入体に抗体を接触または導入し、導入体中の目的タンパク質の機能が阻害されるか否かを解析する方法等が挙げられる。
かかる中和抗体は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（７）本発明のタンパク質が有する活性を調節する分子のスクリーニング
本発明のタンパク質に特異的に結合し、かつ本発明のタンパク質の機能（活性）を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質をスクリーニングすることにより本発明のタンパク質の機能調節物質（以下、これを「調節物質」と称することがある）を得ることができる。
この調節物質のスクリーニング方法は、本発明のタンパク質に特異的に結合し、且つ該タンパク質の活性を阻害、拮抗または増強する作用を有する物質が得られる方法であれば如何なるものであってもよい。例えば、先ずはじめに本発明のタンパク質とスクリーニングに供する物質（以下、これを「被検物質」と称することがある）とを接触させ、該タンパク質との結合性を指標として選抜した後に、本発明のタンパク質が有する活性の変化を指標として被検物質を選抜する方法を用いることができる。
被検物質としては、本発明のタンパク質と相互作用して、該タンパク質が有する活性に影響を及ぼす可能性のある物質であれば如何なるものであってもよいが、具体的には、例えば、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、低分子化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、動物組織抽出液等が挙げられる。これらの物質は新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。
被検物質と本発明のタンパク質の相互作用の解析法としては、それ自体既知の常法を用いることができるが、具体的には、例えば、酵母ツーハイブリッド法、蛍光偏光解消法、表面プラズモン法、ファージディスプレイ法、リボソーマルディスプレイ法、あるいは上記（６）に記載した抗体との競合解析法等が挙げられる。このような方法により、本発明のタンパク質に結合する活性を見いだされた物質は、次に該物質の存在下で本発明のタンパク質が有する活性がどのような影響を受けるかを解析することによって、調節物質として用いられるか否かが同定される。
ここで、対象タンパク質が、公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合には、対象タンパク質にのみ結合し、公知のまたは他のバリアントには結合しない物質についてその影響を解析するか、または公知のあるいは他のバリアントにおいても同様に結合するか否かを同定し、結合した場合にはその影響の相違を解析することによって、対象タンパク質に対する該物質の影響を解析することができる。また、該物質の個体内での分布を検討することにより、対象タンパク質や公知のまたは他のバリアントに対する影響を解析することができる。
具体的な解析方法としては、例えば、キナーゼ活性を調節する物質を解析する場合には、（２）に記載したＤＮＡ導入体に基質となるタンパク質も同様の方法で導入する。この導入体について選択された物質の存在下／または非存在下で基質となるタンパク質のリン酸化をそれ自体既知の通常用いられる方法により解析する。具体的には、上記（３）に記載の方法等を用いて行うことができる。基質となるタンパク質のリン酸化が、物質の非存在下の場合と比べて増加した場合には、該物質はキナーゼ活性物質として機能する可能性があり、また低下、または阻害された場合には物質はキナーゼ阻害物質として機能する可能性があると同定できる。
ここで、医薬活性成分の取得を目的として調節物質をスクリーニングするために用いる本発明のＤＮＡ、あるいは組み換えタンパク質を用いる場合は、ヒトのＤＮＡあるいはタンパク質を用いることが好ましい。さらに上記方法によってでスクリーニングされた物質は、さらに生体内でのスクリーニングによって医薬候補としての選択を行ってもよい。なお、本発明のタンパク質の機能調節物質の評価は、上記した方法に限定されるものではない。
本発明のタンパク質が有するキナーゼ活性としては、例えば、癌に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、心筋発達に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の運動性を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、生殖細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、細胞分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、精子の分化を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、アルツハイマー病発症を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、グリセロール３リン酸を生成する機能、脳皮質発達、神経細胞等遊走を制御するパスウェイ上のシグナル伝達機能、脂肪酸やステロールの合成に関連する機能、細胞死に関連するパスウェイ上のシグナル伝達機能、インシュリンシグナル伝達等である。そこで、本スクリーニング方法により同定できる化合物は、制癌剤、心疾患治療剤、不妊治療剤、再生組織誘導剤、アルツハイマー病治療剤、神経変性疾患治療剤、糖尿病治療剤として用いられ得るものである。
また、本発明のタンパク質は、精巣、気管、脳グリオーマ細胞由来の培養細胞等から構築されたｃＤＮＡライブラリーよりクローニングされており、取得された本発明のタンパク質は、上記組織および器官等において特有の機能を有している可能性があるので、該組織および器官に特有の疾患の治療剤として用いられ得る。 かかる調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（８）本発明のＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング
スクリーニングの方法としては、被検物質の存在下で本発明のタンパク質、あるいはそれをコードするｍＲＮＡの発現量を解析する方法等が挙げられる。具体的には、例えば、（２）に記載した本発明のタンパク質を発現する細胞を被検物質を含む適当な培地で培養し、該細胞内に発現している本発明のタンパク質量をＥＬＩＳＡ等の常法を用いて解析するか、あるいは該細胞内の本発明のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量を、定量的逆転写ＰＣＲ法や、ノーザンブロット法等により解析することにより行うことができる。
被検物質としては、（７）に記載のものを用いることができる。この解析により、被検物質の非存在下で培養された当該細胞内で発現されたタンパク質、あるいはｍＲＮＡ量と比べてその量が増加すれば、この被検物質は本発明のＤＮＡの発現促進物質として機能する可能性があり、逆に減少した場合には、この被検物質は本発明のＤＮＡの発現阻害物質として用いられ得ると判断することができる。
かかる発現調節物質は、臨床へ応用するに際し、上記有効成分を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（９）本発明のＤＮＡ導入動物
上記（１）に記載の、本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体子宮に移植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排卵させた後、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を摘出し、該受精卵に導入ＤＮＡをマイクロインジェクション等の方法により導入する。この後、適当な方法で培養した後、生存している受精卵を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産させる。新生仔に目的のＤＮＡが導入されているか否かは、該個体の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロット解析を行うことにより同定することができる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が挙げられる。
かくして得られた本発明のＤＮＡ導入動物は、この個体を交配し、導入されたＤＮＡが安定的に保持されていることを確認しながら通常の飼育環境で継代飼育することによりその子孫を得ることができる。また、体外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維持することもできる。
本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺乳動物は、本発明のＤＮＡの生体内における機能の解析や、またこれを調節する物質のスクリーニング系等として用いることができる。
（１０）本発明のタンパク質及びそれをコードする塩基配列を含むＤＮＡの他の利用
本発明のタンパク質は、それを基盤上に結合させた担体として利用することができる。また、本発明のタンパク質をコードする塩基配列、例えば、配列番号１〜５に記載の塩基配列を有するＤＮＡ及びその部分断片は、それらを基板上に結合させた担体として用いられ得る。これらを、以下、「プロテインチップ」、「ＤＮＡチップ」または「ＤＮＡアレイ」（ＤＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）と称することがある。これらのプロテインチップ、又はＤＮＡチップもしくはアレイには、本発明のタンパク質やＤＮＡ以外に、他のタンパク質やＤＮＡが含まれていてもよい。
ここで、対象タンパク質が公知のバリアントが存在するスプライシングバリアントである場合、上記プロテインチップには対象タンパク質特異的なアミノ酸配列部分断片を用いることもできるが、他バリアントと異なる立体構造を有している可能性もあるためその全長を用いることもできる。また、ＤＮＡアレイには、対象タンパク質をコードするＤＮＡ配列のうち、他のバリアントＤＮＡと異なる配列を選択することが好ましい。
また、タンパク質やＤＮＡを結合させる基盤としては、ナイロン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロース膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられるが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用いられる。また該基盤へのタンパク質、あるいはＤＮＡの結合は、それ自体公知の通常用いられる方法により容易に行うことができる。これらのプロテインチップ、ＤＮＡチップ、あるいはＤＮＡアレイも、本発明の範囲に含まれる。
また、本発明のタンパク質のアミノ酸配列及びＤＮＡの塩基配列は、配列情報としても用いることができる。このＤＮＡの塩基配列には、対応するＲＮＡの塩基配列も含まれる。すなわち、得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが読みとり可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することにより、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築できる。このデータベースには、他の種類のタンパク質やそれをコードするＤＮＡの塩基配列が含まれていてもよい。また、本発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行うコンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記録媒体としては、例えば、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＤＶＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＡＭ等の光ディスク、半導体メモリ等を挙げることができる。
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。なお、取得された各ｃＤＮＡクローンについて以下の実験を行った結果は、実施例５に纏めて記載した。
実施例１オリゴキャップ法によるｃＤＮＡライブラリーの作製
ヒト培養細胞（ヒト脳グリオーマ細胞由来の培養細胞であるＨ４細胞、ＡＴＣＣ：ＨＴＢ−１４８）より、文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））記載の方法によりｍＲＮＡを抽出した。さらに、オリゴｄＴセルロースでｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製した。
上記で取得したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡと、市販のヒト各組織ｍＲＮＡ（クロンテック社製：精巣（＃６４０２７−１）、気管（＃６４０９１−１））よりオリゴキャップ法（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３８，１７１−１７４（１９９４））によりｃＤＮＡライブラリーを作製した。
まず、上記ＲＮＡをＢＡＰ（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）およびＴＡＰ（Ｔｏｂａｃｃｏ Ａｃｉｄ Ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）で処理した後に、オリゴキャップリンカー（配列番号１１）をＲＮＡライゲースを用いて連結した。このＲＮＡ鎖を鋳型としてオリゴｄＴプライマー（配列番号１２）用いた逆転写反応により第１鎖ｃＤＮＡを合成し、続いてＲＮＡ鎖を分解除去した（鈴木ら、タンパク質 核酸 酵素、４１、６０３−６０７（１９９６）；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００，１４９−１５６（１９９７））。次いで、５’のＰＣＲプライマー（配列番号１３）と３’のＰＣＲプライマー（配列番号１４）を用いＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）により２本鎖ｃＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡ鎖をＳｆｉＩにより切断した。
次いで、発現用ベクターであるｐＭＥ１８ＳＦＬ３（ＧｅｎＢａｎｋ ＡＢ００９８６４）のＤｒａＩＩＩサイトに上記で取得したＳｆｉＩ切断断片をクローニングし、ｃＤＮＡライブラリーを作成した。上記で用いたｐＭＥ１８ＳＦＬ３ベクターは、クローニング部位の上流にＳＲαプロモーターとＳＶ４０ ｓｍａｌｌ ｔイントロンが組み込まれており、またその下流にはＳＶ４０ポリＡ付加シグナル配列が挿入されている。ｐＭＥ１８ＳＦＬ３のクローン化部位は非対称性のＤｒａＩＩＩサイトとなっており、ｃＤＮＡ断片の末端にはこれと相補的なＳｆｉＩ部位を付加しているので、クローン化したｃＤＮＡ断片はＳＲαプロモーターの下流に一方向性に挿入される。したがって、全長ｃＤＮＡを含むクローンでは、得られたプラスミドをそのままＣＯＳ細胞に導入することにより、一過的に遺伝子を発現させることが可能である。すなわち、非常に容易に、遺伝子産物であるタンパク質として、あるいはそれらの生物学的活性として実験的に解析することが可能となっている。
これらより得たクローンのプラスミドＤＮＡについて、ｃＤＮＡの５’端または３’端の塩基配列をＤＮＡシーケンシング試薬（Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＫｉｔまたはＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ Ｒｅａｄｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ：ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用い、マニュアルに従ってシーケンシング反応後、ＤＮＡシーケンサー（ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００：ＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）でＤＮＡ塩基配列を解析した。
実施例２オリゴキャップ法で作製したｃＤＮＡライブラリーからのクローンの５’末端の全長性の評価
実施例１で作製したヒトｃＤＮＡライブラリーの５’末端の塩基配列は、これを公共データベース中のヒト既知ｍＲＮＡの配列と比較し、５’末端配列が一致する全クローンについて、公共データベース中の既知ｍＲＮＡ配列より長く５’末端が伸びている場合、または５’末端は短いが翻訳開始コドンは有している場合を「全長」と判断し、翻訳開始コドンを含んでいない場合を「非全長」と判断した。
次に、ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬによるクローンの評価を行った。ＥＳＴｉＭａｔｅＦＬは、公共データベース中のＥＳＴの５’末端配列や３’末端配列との比較によって全長ｃＤＮＡの可能性の高いクローンを選択するために、ヘリックス研究所の西川・太田らにより開発された方法である。実施例１で解析したｃＤＮＡクローンの５’末端や３’末端配列をＥＳＴデータベースに登録されている塩基配列と比較し、取得されたｃＤＮＡクローンの配列よりも、５’側または３’側へ伸長しているＥＳＴが存在する場合には、そのクローンは「全長ではない可能性が高い」と判断した。公共データベース中のＥＳＴ配列より５’末端が伸長している場合、あるいは５’末端が短いクローンでも、その差が５０塩基以内の場合を便宜的に全長とし、それ以上短い場合を非全長とした。
実施例３ｃＤＮＡクローンの塩基配列、アミノ酸配列の解析
実施例２で解析したｃＤＮＡクローンの全塩基配列について、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３−４１０（１９９０））による相同性検索（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｓｅａｒｃｈ）や、ＨＭＭＥＲ（隠れＭａｒｋｏｖモデルによる配列解析手法；Ｅｄｄｙ，Ｓ．Ｒ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ １４，７５５−７６３（１９９８））の機能群のひとつであるＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索（ｐｒｏｆｉｌｅ ｓｅａｒｃｈ：ｈｔｔｐ：／／ｐｆａｍ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ）を行い、各ｃＤＮＡクローンがコードするタンパク質の機能を推定した。また、その塩基配列の一部が完全に一致する公知のクローンが存在するスプライシングバリアントと推定されるクローンについては、そのゲノム配列が解析可能であればどのエクソンが欠失してスプライシングしたものであるかを解析した。
実施例４キナーゼ活性の測定
（１）タンパク質の調製
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンについて、これがコードするタンパク質を無細胞タンパク質合成系を用いて合成し、該タンパク質がキナーゼ活性を有するか否かを以下の生化学的実験により解析した。
実施例３でキナーゼ活性を有すると推定されたｃＤＮＡクローンのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）断片を、５’側のプライマーとして各クローンに特異的な下記プライマー、３’側のプライマーとして下記の共通プライマーを使用したＰＣＲ法によって取得した。
これを、ＳＰ６プロモーターを含む翻訳制御領域−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子−ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）切断サイト−ＤＮＡクローニングサイト（ＳｍａＩ，ＳｆｉＩ）−ポリＡシグナル配列を有するベクター（ｐＥＵ−ＳＳ４）のクローニングサイトに挿入した。
上記で調製されたプラスミドＤＮＡを鋳型として、ＳＰ６ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いて転写を行い、得られたＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿の後、Ｎｉｃｋ Ｃｏｌｕｍｎ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）によって精製した。
透析法によるコムギ胚芽抽出液を用いた無細胞タンパク質合成の方法は既報（Ｅｎｄｏ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２５，２２１−２３０）の方法に従った。反応溶液は、容量の２４％のコムギ胚芽抽出液を含み、上記Ｅｒｉｃｋｓｏｎらの方法に準じた以下の成分組成である。２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、８０ｍＭ酢酸カリウム、１．６ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン、２ｍＭジチオスレイトール、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．２４ｍＭ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２６ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸、０．４ｍｇ／ｍｌクレアチンキナーゼ、１０００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＲＮａｓｉｎＴＭ）に、上述したｍＲＮＡ（１ｍｇ／ｍｌ反応容量）を添加して用いた。
上記反応溶液をフロータ・ライザー（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｆｌｏａｔ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（Ｂｉｏｔｅｃｈ ＲＣ）、分画分子量：１０ｋＤａ，容量：１ｍｌ）に入れ、反応液の４０倍容量の透析外液（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ、ｐＨ７．６、１００ｍＭ酢酸カリウム、２．７ｍＭ酢酸マグネシウム、０．４ｍＭスペルミジン、２．５ｍＭジチオスレイトール、２０種類のＬ−アミノ酸（各０．３ｍＭ）、１．２ｍＭ ＡＴＰ、０．２５ｍＭ ＧＴＰ、１６ｍＭクレアチンリン酸）に対しての透析系で、反応は２６℃で、４８時間行った。
反応終了後、透析内液を１６，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を分離した。この上清を、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭジチオスレイトールを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）で５倍希釈し、同緩衝液で平衡化したアフィニティ樹脂であるグルタチオンセファロース・４Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社製）を充填したアフィニティカラムに室温で添加し、目的タンパク質を吸着した。ここで、上記カラムには、取得した遠心上清の１／２量のアフィニティ樹脂を用いた。
さらに、上記で用いたアフィニティ樹脂の１０倍容量の同緩衝液にてカラムを洗浄した後、２ｕｎｉｔｓ／μｌ濃度のＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅａｓｅ（アマシャムバイオサイエンス社製）の同緩衝液による２５倍希釈液を、アフィニティ樹脂と等容量添加し、４℃で４０時間切断反応を行った後、上記緩衝液にて目的タンパク質を溶出した。
（２）目的タンパク質のＡＴＰ消費量を指標とするキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）中で、終濃度１〜１０ｍＭとなるようにジチオスレイトールを添加後、１μＭのＡＴＰと室温で２４時間インキュベートした後、ルシフェラーゼ・ルシフェリンキット（和光純薬工業社製）１００μｌを加え、室温で２４時間反応した後、５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。目的タンパク質を添加していない反応系をコントロールとして、同様に５６０ｎｍの蛍光強度を測定した。このコントロールの値と目的タンパク質を添加した系の値の差を目的タンパク質が消費したＡＴＰ量として、目的タンパク質１ｍｏｌあたりが２４時間に消費するＡＴＰ量（ｍｏｌ）を目的タンパク質のキナーゼ活性として同定した。
（３）目的タンパク質によるポリペプチドのリン酸化を指標としたキナーゼ活性の測定
上記（１）で単離した目的タンパク質は、ウシ血清アルブミンを標準として定量した。０．１μｇの目的タンパク質を、基質としての標準ポリペプチド（Ｃｄｃ２、Ａｒｇ２−ＯＨ、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＤＮＡ−ＰＫ、ＰＴＫ１、ＰＴＫ２：Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＭＬＣＫＳ、ＣａＭＫＩＩ：Ｓｉｇｍａ社、Ｓｙｎｔｉｄｅ２：ＢＡＣＨＥＭ ＦＥＩＮＣＨＥＭＩＫＡＬＩＥＮ ＡＧ）０．２μｇとともに、０．２ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、１〜１０ｍＭジチオスレイトール、８ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）、１μＭ ＡＴＰと室温で２時間インキュベートした。反応終了後、反応液を、２０％アセトニトリルを含む０．１％トリフルオロ酢酸で平衡化したＢａｋｅｒｂｏｎｄ Ｃ１８（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ社製：０．４６×２５ｃｍ）カラムに添加し、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で、２０〜８０％のアセトニトリルの６０分間の直線濃度勾配により流速１ｍｌ／分でペプチドを分離した。ペプチドの溶出は、２１５ｎｍの吸光度により測定した。コントロールとして目的タンパク質を添加しない反応液についても同様に分離し２１５ｎｍの吸光度を測定した。ここで、目的タンパク質を添加することによってピークの減少および溶出位置の変動が検出されるポリペプチドについては、目的タンパク質の有するキナーゼ活性の基質となると判断することができる。
実施例５各ｃＤＮＡクローンの解析結果
（１）ｃ−ｂｎｇｈ４２００５０１７（配列番号１、６）
ｃ−ｂｎｇｈ４２００５０１７（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号１に示すように、１８２８塩基から成り、そのうち塩基番号８７から１１２４までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）である。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、３４５アミノ酸残基から成る（配列番号６）。配列番号６のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号ＡＢ０５３３０８、ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２ ＣＲ７（ｈｕｍａｎ）（以下、これを「ＡＬＳ２ＣＲ７」と称する）が、ｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１４８、２８５アミノ酸残基に亘り９２％の一致度でヒットした。ＡＬＳ２ＣＲ７はａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓの原因遺伝子ａｌｓ２ｃｒ６の近傍に存在する遺伝子がコードするタンパク質（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２９，１６６−１７３，（２００１））で、ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎが見出される。
本タンパク質とＡＬＳ２ＣＲ７のアミノ酸配列（データベース登録記号：ＡＢ０５３３０８）をＣＬＵＳＴＡＬＷでアラインメント比較するとＡＬＳ２ＣＲ７は３８４アミノ酸残基から成り、その１〜１３０番が、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号５２〜１８１番と完全に一致し、また１５２〜２８５番が、配列番号６に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１８２〜３１５番と完全に一致する。即ち、本タンパク質はＡＬＳ２ＣＲ７のアミノ酸配列のアミノ酸番号１３１〜１５１番を欠失し、Ｎ末端の１〜５１番、およびＣ末端の３１６〜３４５番に新規配列を有する。
このことを遺伝子上で確認するためにＡＬＳ２ＣＲ７がコードされているヒト染色体２番のゲノム配列上で本タンパク質をコードするｃＤＮＡと上記ＡＢ０５３３０８のｃＤＮＡの比較を行った。ＡＢ０５３３０８は１４個のエクソンから成り、本ＤＮＡではその第１、６、１１、１２、１３、１４エクソンを欠失し、第２、３、４、５、７、８、９、１０エクソンを共有していた。上記の本タンパク質のＡＬＳ２ＣＲ７に対する２１アミノ酸の欠失は、第６エクソンのスキップによるものである。また上記の本タンパク質のＮ末の５１アミノ酸残基の付加は、本ＤＮＡの５’末端に上記ＡＢ０５３３０８にない別のエクソンが１つ存在することによるものであった。更に上記の本タンパク質のＣ末の３０アミノ酸残基の付加は、本ＤＮＡの３’末端に上記ＡＢ０５３３０８にない別のエクソンが存在することによるものであった。これらのことより本タンパク質は、ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２ ＣＲ７（ｈｕｍａｎ）とは異なるｐｒｏｍｏｔｅｒから発現するｍＲＮＡに由来するタンパク質であり、Ｎ末端およびＣ末端の配列が異なり、中央に欠失を持つバリアントであることがわかった。
一方、本タンパク質とＡＢ０５３３０８のＨＭＭＰＦＡＭ検索を行ったところ、本タンパク質（配列番号６）のアミノ酸番号１０３−３２５番に、またＡＢ０５３３０８のアミノ酸配列のアミノ酸番号５２〜３３６番に、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。このことから本タンパク質のＡＬＳ２ＣＲ７に対するアミノ酸配列の欠失はｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎに存在することがわかった。しかし本タンパク質のＡＴＰ消費活性を指標としたキナーゼ活性を、実施例４（２）の系で測定したところ、２９．１であり、また、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）を添加したところ（実施例４（３））、基質の、逆相ＨＰＬＣ上でのピークの減少、新規ピークの溶出（図１矢印部分）が確認されたことから、少なくともＳｙｎｔｉｄｅ２を基質とするプロテインキナーゼであることが確認された。
以上のように、本タンパク質はＡＬＳ２ＣＲ７の、Ｎ末端、Ｃ末端ともに異なる配列をもちＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの一部を欠失するが、プロテインキナーゼ活性が見出されたことから、ＡＬＳ２ＣＲ７とは異なる機能をもつタンパク質であることが推定された。
さらに、本タンパク質をコードするｃＤＮＡは、脳グリオーマ細胞由来の培養細胞からクローニングされたものであり、該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが予測された。
（２）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０２５８７９（配列番号２、７）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０２５８７９（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号２に示すように、２１９５塩基から成り、そのうち塩基番号１１５から２０９４までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、６５９アミノ酸残基から成る（配列番号７）。また、配列番号７のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号７のアミノ酸番号４１３−６５９番に示されるアミノ酸配列にＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。
配列番号７のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）あるいは特許データベースＧＥＮＥＳＥＱ中に、（ｉ）データベース登録記号ＡＸ１６６５５８、およびＷＯ０１／３８５０３号公報に記載されているアミノ酸配列が、ｅ−ｖａｌｕｅ：５×１０−１４８、２５７アミノ酸に亘り９９％の一致度でヒットした。ＡＸ１６６５５８は２７８アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列中のアミノ酸番号１〜２５７番が配列番号７に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号４０３〜６５９番と上記のように９９％一致していた。即ち本タンパク質はＡＸ１６６５５８よりＮ末端が４０２アミノ酸残基長く、また、Ｃ末端が２１アミノ酸短いタンパク質である。また、上記特許公報には、ＡＸ１６６５５８タンパク質についてｎｏｖｅｌ ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｋｉｎａｓｅ（ＭＡＰＫ）との記載がある。
さらに、（ｉｉ）データベース記号：ＡＦ０９３６８９（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ ＭＥＫ ｋｉｎａｓｅ α）が２７０アミノ酸残基にわたり４３％の一致度で、また、（ｉｉｉ）データベース登録記号：ＡＢ０００７９７（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＮＰＫ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）が２６０アミノ酸残基にわたって４８％の一致度でヒットした。これらはいずれもＭＡＰ ｋｉｎａｓｅカスケード（ＭＡＰＫＫＫ、ＭＡＰＫＫ、ＭＡＰＫが順次活性化することでシグナルを伝えていく系）におけるＭＡＰＫＫＫに位置付けられるプロテインキナーゼである。従って、本タンパク質はＭＡＰＫシグナルカスケードに属するタンパク質と推測される。
またＡＸ１６６５５８と本タンパク質のアミノ酸配列の違いを明らかにするため、両ｃＤＮＡをヒト２番染色体ゲノム配列上（データベース登録記号：ｅｍｂ｜ＡＣ０１６７２５｜ＡＣ０１６７２５）で比較した。本ＤＮＡはエクソン３個からなるが、ＡＸ１６６５５８では本ＤＮＡの第１エクソンが無く、第２エクソンの途中から開始し、第３エクソンを途中まで共有したあと、別のエクソンを有していた。ＡＸ１６６５５８のアミノ酸配列はメチオニンから始まっておらず、不完全タンパク質と推定されるが、本タンパク質はメチオニンから始まっており、ＡＸ１６６５５８よりもＮ末が４０２アミノ酸残基長くなっていることが確認された。このようにＮ末に長い新規配列を有するタンパク質をコードするｃＤＮＡが単離されたのは、実施例１に記載のオリゴキャップ法を用いた優れた一例と考えられる。上記の新規４０２アミノ酸配列をｐｒｏｓｉｔｅ検索すると、６箇所のＮ−グリコシル化部位、１３箇所のＰＫＣによるリン酸化部位、１２箇所のｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅＩＩによるリン酸化部位、１箇所のミリスチル化部位がみいだされ、種々の翻訳後修飾および活性の調節を受ける可能性があることが分かった。従って、本タンパク質はＡＸ１６６５５８にない活性調節部位を持つｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅと推定される。
本タンパク質のＰｆａｍ検索を行うと、配列番号７のアミノ酸番号４１３〜６５９番にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎがみいだされた。そこで本タンパク質のＡＴＰ消費活性を、実施例４（２）の系で測定したところ、６６．６であり、キナーゼ活性があることが確認された。
これらのことより本タンパク質は、上記ＡＸ１６６５５８およびＷＯ０１／３８５０３号公報に記載のタンパク質のＮ末端が伸長したバリアントであり、キナーゼ活性を有することがわかった。また、本ＤＮＡは、精巣からクローニングされたものであり、該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連するものであることが推測された。
（３）ｃ−ｔｒａｃｈ２０２００４８（配列番号３、８）
ｃ−ｔｒａｃｈ２０２００４８（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号３に示すように、３２５５塩基から成り、そのうち塩基番号１２３２から２７６４までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５１０アミノ酸残基から成る（配列番号８）。配列番号８のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号ＡＸ４０５６３３＿１、ｕｎｎａｍｅｄ ＯＲＦが、ｅ−ｖａｌｕｅ：０、５２７アミノ酸残基に亘り９６％の一致度でヒットした。また、ＡＸ４０５６３３＿１は、ＷＯ０２／２２６６０号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９２として記載されているＮｅｋ３（ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）に類似のタンパク質であった。ＡＸ４０５６３３＿１は５２７アミノ酸から成り、該配列のアミノ酸番号１〜３１３番が本タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８）の１〜３１３番と、また３３１〜５２７番が本タンパク質の３１４〜５１０番と完全に一致していた。また、ＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸番号１６２番がグリシンであるのに対し、本タンパク質のそれに相当する部分のアミノ酸はバリンであった。
すなわち本タンパク質はＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸番号３１４〜３３０番のアミノ酸配列部分を欠失し、１アミノ酸置換変異をもつバリアントである。ＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸番号１６２番のバリン／グリシン置換は他の公知のバリアントタンパク質（例えば、ＷＯ００／０００６７２８号公報に記載のタンパク質）にも認められていることからＳＮＰによる変異であると考えられる。従って、本質的には中央部（配列番号８のアミノ酸番号３１３番と３１４番の間）の１７アミノ酸の欠失（ＡＸ４０５６３３＿１のアミノ酸配列のアミノ酸番号３１４〜３３０番）が本タンパク質の構造を特異にしている。この欠失領域にはＰＫＡでリン酸化される部位１箇所、ｃａｓｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ＩＩでリン酸化される部位１箇所、ミリスチル化部位１箇所があり、種々の翻訳後修飾部位となっている。
本ＤＮＡとＡＸ４０５６３３＿１のｃＤＮＡを、ＡＸ４０５６３３＿１がコードされているヒト染色体１３番のゲノム配列（データベース登録記号：ｅｍｎｅｗ｜ＡＬ６７２２２７｜ＡＬ６７２２２７）において比較したところ、本ＤＮＡは ＡＸ４０５６３３＿１の第１０エクソンをスキップすることで１７アミノ酸残基の欠失を生じていることがわかった。
また、配列番号８のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号８のアミノ酸番号２５〜２７８のアミノ酸配列にＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。本タンパク質のＡＴＰ消費量は、実施例４（２）の系で測定したところ、５９．０であり、キナーゼ活性があることが確認された。
これらのことから本タンパク質は、ＡＸ４０５６３３＿１、すなわちＷＯ０２／２２６６０号公報にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９２として記載されているＮｅｋ３（ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ）に類似のタンパク質のスプライシングバリアントであり、キナーゼ活性を有するタンパク質であることが推定された。
また、本ＤＮＡは、気管からクローニングされたものであり、本タンパク質は該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが推測された。
（４）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１６６６３（配列番号４、９）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１６６６３（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号４に示すように、２２５９塩基から成り、そのうち塩基番号３１６から１９４７までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５４３アミノ酸残基から成る（配列番号９）。配列番号９のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号ＡＸ３６２２０７＿１、ｕｎｎａｍｅｄ ＯＲＦが、ｅ−ｖａｌｕｅ：０、５０４アミノ酸残基に亘り９９％の一致度でヒットした。ＡＸ３６２２０７＿１は９７４アミノ酸からなり、そのアミノ酸配列のアミノ酸番号４７０〜９７３番が、配列番号９に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５０２番と下述の４アミノ酸残基を除いて一致している。また、上記ＡＸ３６２２０７＿１は、ＷＯ０２／０８２５３号公報に記載されており、Ｈｕｍａｎ ＥｐｈＡ ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｋｉｎａｓｅであると記載されていた。
このアミノ酸配列と配列番号９に記載のアミノ酸配列を詳細に比較したところ、本タンパク質の配列番号９に記載のアミノ酸配列は、上記ＡＸ３６２２０７＿１およびＷＯ０２／０８２５３号公報に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜４６９および６８２番、６８３番が欠失しており、アミノ酸番号６８１番、７４０番、８９３番に変異が認められた。
また、配列番号４に記載の塩基配列は、上記ＡＸ３６２２０７＿１およびＷＯ０２／０８２５３号公報に記載の塩基配列の塩基番号１〜１２４８番および２０４２〜２０４７番が欠失しており、２０４０番、２２１９番、２６７７番に変異が認められた。これらのことより本タンパク質は、膜１回貫通受容体型Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅであるＥｐｈｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｆａｍｉｌｙのＮ末端４６９アミノ酸を欠失したバリアントであることがわかった。
また、本ＤＮＡとＡＸ３６２２０７＿１のｃＤＮＡ配列をＡＸ３６２２０７＿１がコードされているヒト染色体１番のゲノム配列（データベース登録記号：ｅｍｂｌ｜ＡＣ１０４３３６｜ＡＣ１０４３３６）上で比較した。ＡＸ３６２２０７＿１のｃＤＮＡはエクソン１６個からなる。一方、本ＤＮＡはその第５〜１５エクソンと第１６エクソンの途中までを共有し、その後エクソン３個をもつことでＣ末端の４１アミノ酸の新規配列が付加された構造を有している。ＡＸ３６２２０７＿１は第１６エクソンの中で終止コドンが現れ、本タンパク質との非共有配列１アミノ酸をもって終了する。さらに本ＤＮＡはＡＸ３６２２０７＿１の第５エクソン相当の前に、翻訳されない別のエクソン１個をもつことから、本ＤＮＡはＡＸ３６２２０７＿１とはａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒにより生じ、ＡＸ３６２２０７＿１のＮ末端を欠失したタンパク質をコードする。このように本ＤＮＡはその構造からＡＸ３６２２０７＿１とは転写調節、翻訳産物ともに異なることを示している。
また、配列番号９のアミノ酸配列について、ＨＭＭＰＦＡＭによるタンパク質特徴検索を行ったところ配列番号９のアミノ酸番号１４０〜３９５番にＰｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎの特徴を示す配列（Ｐｆａｍにｐｋｉｎａｓｅとしてエントリーされるアミノ酸配列）を見出した。更に本タンパク質は配列番号９のアミノ酸番号６０〜８３番に膜貫通領域を、また、４６８〜４９７番にＬｅｕｃｉｎｅ Ｚｉｐｐｅｒモチーフを有することがわかった。
したがって本タンパク質は膜貫通受容体のＮ末端細胞外ドメインを大きく欠失し、Ｃ末端寄りにタンパク質相互作用に関与する配列を持ち、さらにＣ末端部分に新規配列をもつタンパク質である。すなわち本タンパク質は細胞外からの刺激にかかわらず細胞内タンパク質と相互作用しシグナル伝達をおこすタンパク質であると推定することができる。
本タンパク質のＡＴＰ消費活性は、実施例４（２）の系で測定したところ、４３．１であり、キナーゼ活性があることが確認された。また、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）、ＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加したところ（実施例４（３））、両基質の、逆相ＨＰＬＣ上での各々の溶出位置が変化したこと（図２矢印部分）から、これらのペプチドを基質とするプロテインキナーゼであることが確認された。
また、本ＤＮＡは、精巣からクローニングされたものであり、本タンパク質は該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが推測された。
（５）ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１５３３５（配列番号５、１０）
ｃ−ｔｅｓｔｉ２０１５３３５（以下、これを「本ＤＮＡ」と称し、該ＤＮＡによりコードされるタンパク質を「本タンパク質」と称する）は、配列番号５に示すように、２０２８塩基から成り、そのうち塩基番号１５１から１８８１までがオープンリーディングフレーム（終止コドンを含む）になっていた。オープンリーディングフレームから予測されるアミノ酸配列は、５７６アミノ酸残基から成る（配列番号１０）。配列番号１０のアミノ酸配列についてＢＬＡＳＴを用いて相同性検索を行ったところ、ＮＲＤＢタンパク質データベース（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＴＲＥＭＢＬＥ、ＧＥＮＰＥＰＴ、ＰＤＢから作成された重複のないアミノ酸配列のデータベース）中に、データベース登録記号Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮ、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３１が、ｅ−ｖａｌｕｅ：０、５７６アミノ酸残基に亘り９９％の一致度でヒットした。Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮは１０１９アミノ酸から成り、そのアミノ酸配列のアミノ酸番号４４４〜１０１９番が、配列番号１０に記載のアミノ酸配列のアミノ酸番号１〜５７６番と下述の３残基を除いて一致している。
Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのアミノ酸配列と配列番号１０に記載のアミノ酸配列を詳細に比較したところ、本タンパク質の配列番号１０に記載のアミノ酸配列は、上記Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのアミノ酸配列のアミノ番号１〜４４３番が欠失しており、また６２１番、６２３番、および１０１０番に変異が認められた。また本ＤＮＡとＱ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのアミノ酸配列をコードする塩基配列（データベース登録番号：ＡＦ２８５５９９）を比較したところ、本ＤＮＡはＡＦ２８５５９９の塩基番号１〜１２０２が欠失しており、１２４４番、１８７８番、１８８３番、３０４３番に変異が認められた。
これらのことより本タンパク質は、Ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３１（ＳＴＰＫ３１）のＮ末端４４３アミノ酸を欠失したバリアントであることがわかった。
Ｉｎｔｅｒｐｒｏｓｃａｎ（ＥＢＩ）によると、Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮ（ＳＴＰＫ３１）のアミノ酸番号１０５〜２４２番にｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｏｍａｉｎが、また７８〜１３７番にＴｕｄｏｒ ｄｏｍａｉｎ（Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎとともに存在するタンパク質に見出される領域）、さらに７１０〜１０１９番にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎが存在する。
一方、本タンパク質はＰｆａｍ検索により配列番号１０のアミノ酸番号２９６〜５２９番にｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｄｏｍａｉｎが存在するが、Ｑ９ＢＸＵ１｜ＳＴ３１＿ＨＵＭＡＮのＮ末４４３アミノ酸相当部分を欠くため、ＳＴＰＫ３１とは異なる機能をもつタンパク質と考えられる。
更に本ＤＮＡとＡＦ２８５５９９のｃＤＮＡ配列についてゲノム情報をＡＦ２８５５９９がコードされる染色体７番のゲノム配列で比較すると、ＡＦ２８５５９９はエクソン２４個からなり、本ＤＮＡではその第１０エクソンの後半を共有した後、第１１エクソンから第２４エクソンを共有する。このことから、本ＤＮＡはＡＦ２８５５９９とは異なるプロモータから転写された産物と推定される。
本タンパク質のＡＴＰ消費活性は、実施例４（２）の系で測定したところ、３８．０であり、キナーゼ活性があることが確認された。また、基質としてＳｙｎｔｉｄｅ２（配列番号２１）、ＣａＭＫＩＩ（配列番号２２）を添加したところ（実施例４（３））、両基質の、逆相ＨＰＬＣ上での各々の溶出位置が変化したこと（図３矢印部分）から、これらのペプチドを基質とするプロテインキナーゼであることが確認された。
これらのことから、本タンパク質はＳｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ３１と比較するとＮ末端を欠失したバリアントである。
また、本タンパク質は、データベース中の文献情報（Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２７（４），４２２−４２６（２００１））から精子形成に関わることが明らかとなった。さらに、本ＤＮＡは、精巣からクローニングされたものであり、本タンパク質は該組織に特有の器官の発生、機能および疾患に関連することが推測された。
【産業上の利用の可能性】
本発明のタンパク質およびそれをコードするＤＮＡはキナーゼ活性等を有することから、該タンパク質あるいはそれをコードするＤＮＡを用いて該活性を調節する物質をスクリーニングすることができ、該タンパク質が関連する疾患等に作用し得る医薬の開発に有用である。
本出願は、２００２年９月１０日付けの日本特許出願（特願２００２−２６４３４５）に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容もここに参照として取り込まれる。
【配列表】
【図１】
【図２】
【図３】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が請求項１または７に記載のタンパク質のキナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【請求項１】
以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質。
（ａ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号６〜１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換及び／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつキナーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
請求項１に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項３】
請求項１に記載のタンパク質をコードする完全長ｃＤＮＡ。
【請求項４】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）の何れかのＤＮＡ。
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列を有するＤＮＡ。
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列において、１若しくは数個の塩基が欠失、置換及び／または付加された塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜５のいずれかに記載の塩基配列あるいはその相補配列を有するＤＮＡをストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列を有し、かつキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項５】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項５に記載の組み換えベクターを導入した遺伝子導入細胞または該細胞からなる個体。
【請求項７】
請求項６に記載の細胞により産生される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列中の連続した５〜１００塩基と同じ配列を有するセンスオリゴヌクレオチド、当該センスオリゴヌクレオチドと相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び、当該センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド誘導体から成る群から選ばれるオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１または７に記載のタンパク質に特異的に結合する抗体あるいはその部分フラグメント。
【請求項１０】
抗体がモノクローナル抗体である請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
モノクローナル抗体が請求項１または７に記載のタンパク質のキナーゼ活性を中和する作用を有することを特徴とする請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１または７に記載のタンパク質と被検物質を接触させ、該被検物質による該タンパク質が有する活性の変化を測定することを特徴とする、該タンパク質の活性調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
請求項６に記載の遺伝子導入細胞と被検物質を接触させ、該細胞に導入されているＤＮＡの発現レベルの変化を検出することを特徴とする、該ＤＮＡの発現調節物質のスクリーニング方法。
【請求項１４】
請求項１に記載のタンパク質のアミノ酸配列から選択される少なくとも１以上のアミノ酸配列情報および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡの塩基配列から選択される少なくとも１以上の塩基配列情報を保存したコンピュータ読み取り可能記録媒体。
【請求項１５】
請求項１に記載のタンパク質および／または請求項２〜４のいずれかに記載のＤＮＡを結合させた担体。
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０２４９１３
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【発行日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５３５９２６（Ｐ２００４−５３５９２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１５５２
【国際出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【出願人】（５０２２３５５２２）バイオテクノロジー開発技術研究組合 (2)
【出願人】（５０２２６２４６９）ゾイジーン株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
【国際公開日】平成１６年３月２５日（２００４．３．２５）
【発行日】平成１８年１月１２日（２００６．１．１２）
【国際特許分類】
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＪＰ２００３／０１１５５２
【国際出願日】平成１５年９月１０日（２００３．９．１０）
【出願人】（５０２２３５５２２）バイオテクノロジー開発技術研究組合 (2)
【出願人】（５０２２６２４６９）ゾイジーン株式会社 (8)
【Ｆターム（参考）】
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