【課題】新規アミラーゼ及び新規トランスフェラーゼならびにそれらを組み合わせて用いるα，α−トレハロースの製造法の提供。
【解決手段】少なくとも還元末端から３つ以上のグルコース残基がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、その還元末端のα−１，４結合をα−１，α−１結合に転移させる作用を有する新規トランスフェラーゼ、その製造法、その遺伝子。また、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解し、２糖及び／又は単糖を遊離する新規アミラーゼ、その製造法、その遺伝子、及びそれを上記新規トランスフェラーゼと組み合わせて用いたα，α−トレハロースの製造法。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成される３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖及び／又は２糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼ。
【請求項２】
少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα−１，α−１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα−１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解し、α，α−トレハロースを遊離する主要な活性を有する請求項１に記載の新規アミラーゼ。
【請求項３】
基質の分子鎖中のα−１，４結合をエンド型で加水分解する活性を合わせ持つ、請求項１或いは２に記載の新規アミラーゼ。
【請求項４】
グルコシルトレハロース、マルトオリゴシルトレハロース等のトレハロースオリゴ糖を基質とし、還元末端側の２つ目と３つ目のグルコース間のα−１，４結合を加水分解し、α，α−トレハロースを遊離する活性を有する、請求項１、２或いは３に記載の新規アミラーゼ。
【請求項５】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法による分子量が約６１，０００〜６４，０００である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項６】
下記の理化学的性質を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の酵素：
（１） 至適ｐＨ：４．５〜５．５
（２） 至適温度：６０〜８５℃
（３） 安定ｐＨ：４．０〜１０．０
（４） 温度安定性：８０℃で６時間の処理により１００％残存。
【請求項７】
等電点電気泳動法による等電点が４．３〜５．４である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項８】
５ｍＭ ＣｕＳＯ4 で１００％阻害される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項９】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌から得られる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の酵素。
【請求項１０】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌から得られる、請求項９に記載の酵素。
【請求項１１】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌がＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＫＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６２６）或いはその変異株である、請求項１０に記載の酵素。
【請求項１２】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌がＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＤＳＭ ５８３３株或いはその変異株である、請求項１０に記載の酵素。
【請求項１３】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌がＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ ３３９０９株或いはその変異株である、請求項１０に記載の酵素。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアミラーゼを産生する能力を有する細菌を培地に培養し、培養物より、トレハロースオリゴ糖を基質としてα，α−トレハロースを生成する活性を指標とする活性測定法に基づいて、該アミラーゼを単離精製することを特徴とする請求項１〜１３のいずれか一項に記載のアミラーゼの製造法。
【請求項１５】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目の古細菌を培養する、請求項１４に記載のアミラーゼの製造法。
【請求項１６】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する細菌を培養する、請求項１５に記載のアミラーゼの製造法。
【請求項１７】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属するＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＫＭ１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４６２６）を培養する、請求項１６に記載のアミラーゼの製造法。
【請求項１８】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属するＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＤＳＭ ５８３３株を培養する、請求項１６に記載のアミラーゼの製造法。
【請求項１９】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属するＳｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ ３３９０９株を培養する、請求項１６に記載のアミラーゼの製造法。
【請求項２０】
請求項１記載の新規アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【請求項２１】
請求項２記載の新規アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２０記載のＤＮＡ断片。
【請求項２２】
糖鎖中のα‐１，４結合をエンド型で加水分解する活性を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、請求項２０または２１記載のＤＮＡ断片。
【請求項２３】
前記新規アミラーゼが、トレハロースオリゴ糖を基質とし、還元末端側の２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する活性を有するものである、請求項２０〜２２のいずれか一項記載のＤＮＡ断片。
【請求項２４】
（１）糖鎖中のα‐１，４グルコシド結合をエンド型で加水分解する活性、
（２）少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成され、かつその結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して主に単糖および／または２糖を遊離する活性、および
（３）少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα‐１，α‐１結合であり、かつ該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する主要な活性
を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【請求項２５】
前記新規アミラーゼの至適温度が６０〜８５℃である、請求項２０〜２４のいずれか一項記載のＤＮＡ断片。
【請求項２６】
図３４に示される制限酵素地図で表される、請求項２０〜２５のいずれか一項記載のＤＮＡ断片。
【請求項２７】
図３８に示される制限酵素地図で表される、請求項２０〜２５のいずれか一項記載のＤＮＡ断片。
【請求項２８】
配列番号６に示されるアミノ酸配列、またはその等価配列をコードするＤＮＡ配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【請求項２９】
配列番号５に示される塩基配列の６４２番から２３１５番までの塩基配列を含んでなる、請求項２８記載のＤＮＡ断片。
【請求項３０】
配列番号５に示される塩基配列の６３９番から２３１５番までの塩基配列を含んでなる、請求項２８記載のＤＮＡ断片。
【請求項３１】
配列番号５に示される塩基配列の１番から２６９１番までの塩基配列を含んでなる、請求項２８載のＤＮＡ断片。
【請求項３２】
配列番号８に示されるアミノ酸配列、またはその等価配列をコードするＤＮＡ配列を含んでなる、ＤＮＡ断片。
【請求項３３】
配列番号７に示される塩基配列の１１７６番から２８４３番までの塩基配列を含んでなる、請求項３２記載のＤＮＡ断片。
【請求項３４】
配列番号７に示される塩基配列の１番から３６００番までの塩基配列を含んでなる、請求項３２記載のＤＮＡ断片。
【請求項３５】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂａｌｅｓ目に属する古細菌由来である、請求項２０〜３４のいずれか一項記載のＤＮＡ断片。
【請求項３６】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ属に属する古細菌由来である、請求項３５記載のＤＮＡ断片。
【請求項３７】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ ＫＭ１株由来である、請求項３６記載のＤＮＡ断片。
【請求項３８】
Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ ＡＴＣＣ３３９０９株由来である、請求項３６記載のＤＮＡ断片。
【請求項３９】
配列番号５に示される塩基配列の６３９番または６４２番から２３１５番までの塩基配列、またはその相補体に、４０℃、５×ＳＳＣのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成された３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して、主に単糖および／または２糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片。
【請求項４０】
配列番号５に示される塩基配列の６３９番または６４２番から２３１５番までの塩基配列、またはその相補体に、４０℃、５×ＳＳＣのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ、少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα‐１，α‐１結合であり、かつ該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片。
【請求項４１】
配列番号７に示される塩基配列の１３９３番から２１２１番までの塩基配列、またはその相補体に、６０℃、６ｘＳＳＰＥのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成された３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して、主に単糖および／または２糖を遊離する活性を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片。
【請求項４２】
配列番号７に示される塩基配列の１３９３番から２１２１番までの塩基配列、またはその相補体に、６０℃、６ｘＳＳＰＥのイオン強度下でハイブリッドを形成し、かつ少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα‐１，α‐１結合であり、かつ該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する主要な活性を有する新規アミラーゼをコードするＤＮＡ断片、および該ＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片。
【請求項４３】
配列番号６に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号８に示されるアミノ酸配列またはその等価配列を含んでなる、ポリペプチド。
【請求項４５】
そのＮ末端に更にＭｅｔを有してなる、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
少なくとも還元末端側の三糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα‐１，α‐１結合で、該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα‐１，４結合である、３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する作用を有する、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項４７】
（１）糖鎖中のα‐１，４グルコシド結合をエンド型で加水分解する活性、
（２）少なくとも還元末端から３つ以上の糖がグルコース単位で構成され、かつその結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、還元末端側から加水分解して単糖および／または２糖を遊離する活性、および
（３）少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα‐１，α‐１結合であり、かつ該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する主要な活性
を有する、請求項４３〜４５のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項４８】
作用の至適温度が６０〜８５℃である、請求項４３〜４７のいずれか一項記載のポリペプチド。
【請求項４９】
請求項２０〜４２のいずれか一項記載のＤＮＡ断片を含んでなる、組換えＤＮＡ分子。
【請求項５０】
請求項２０〜４２のいずれか一項記載のＤＮＡ断片がプラスミドベクターに組み込まれてなる、請求項４９記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５１】
プラスミドｐＫＡ２である、請求項４９または５０記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５２】
プラスミドｐ０９Ａ１である、請求項４９または５０記載の組換えＤＮＡ分子。
【請求項５３】
請求項４９〜５２のいずれか一項記載の組換えＤＮＡ分子によって形質転換された、宿主細胞。
【請求項５４】
宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＢａｃｉｌｌｕｓ属に属する微生物である、請求項５３記載の宿主細胞。
【請求項５５】
宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株である、請求項５４記載の宿主細胞。
【請求項５６】
組換え新規アミラーゼの製造法であって、 該組換え新規アミラーゼが
少なくとも還元末端側の３糖がグルコース単位で構成され、該末端側の１つ目と２つ目のグルコース間の結合がα‐１，α‐１結合であり、かつ該末端側の２つ目と３つ目のグルコース間の結合がα‐１，４結合である３糖以上の糖を基質とし、２つ目と３つ目のグルコース間のα‐１，４結合を加水分解し、α，α‐トレハロースを遊離する主要な活性
を有するものであり、
請求項５３〜５５のいずれか一項記載の宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規アミラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなる、方法。
【請求項５７】
請求項２０〜４２のいずれか一項記載のＤＮＡ断片によりコードされる組換え新規アミラーゼ、または請求項４３〜４８のいずれか一項記載のポリペプチドを含んでなる組換え新規アミラーゼの製造法であって、
請求項５３〜５５のいずれか一項記載の宿主細胞を培養し、その培養物中に前記組換え新規アミラーゼを生成させ、これを採取することを含んでなる、方法。

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【図１８】

【図１９】

【図２０】

【図２１】

【図２２】

【図２３】

【図２４】

【図２５】

【図２６】

【図２７】

【図２８】

【図２９】

【図３０】

【図３１】

【図３２Ａ】

【図３２Ｂ】

【図３３】

【図３４】

【図３５】

【図３６】

【図３７】

【図３８】

【図３９】

【図４０】

【図４１Ａ】

【図４１Ｂ】

【図４２】

【公開番号】特開２００８−１３９（Ｐ２００８−１３９Ａ）
【公開日】平成２０年１月１０日（２００８．１．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−１９６４００（Ｐ２００７−１９６４００）
【出願日】平成１９年７月２７日（２００７．７．２７）
【分割の表示】特願平８−５０１９３９の分割
【原出願日】平成７年６月１４日（１９９５．６．１４）
【出願人】（０００２５３５０３）キリンホールディングス株式会社 (247)
【Ｆターム（参考）】