新規フラバノール化合物及びその製造方法
【課題】抗酸化作用により生体内に生成した活性酸素や過酸化脂質によって引き起こされる障害を抑制する能力を有し、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる、新規化合物の提供。
【解決手段】下記式（１）で表されるフラバノール化合物。
該化合物は、リンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることによって製造することができる。
【解決手段】下記式（１）で表されるフラバノール化合物。
該化合物は、リンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることによって製造することができる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有し、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる新規フラバノール化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗酸化化合物としては、例えばビタミン−Ｃ（アスコルビン酸）などの水溶性抗酸化化合物、ビタミン−Ｅ（α−トコフェロール）などの脂溶性抗酸化化合物が知られているが、ポリフェノールの中でも幅広い植物に含まれるプロアントシアニジン（ＰＡ）の機能性が健康食品分野において近年関心を集めている。ＰＡは、フラバンユニットから構成され、酸性条件下分解してフラバンユニットの４位にカルボカチオンが生成するという化学的性質を持っており、トルエン−α−チオール、フロログルシノールなどの求核剤を共存させると、それらがカチオンをトラップしてフラバンユニットとの結合物質が生成することが知られている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2003/024951号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2004/103988号パンフレット
【非特許文献１】Torres, J.L., et al., 2005. Conjugation of Catechins with Cysteine Generates Antioxidant Compounds with Enhanced Neuroprotective Activity. Phytochemistry 66, 2032-2037.
【非特許文献２】Selga, A. & Torres, J.L., 2005. Efficient Preparation of Catechin Thio Conjugates by One Step Extraction/Depolymerization of Pine (Pinus pinaster) Bark Procyanidins. J. Agric. Food Chem. 53, 7760-7765.
【非特許文献３】Lozano, C., et al., 2005. Effect of New Antioxidant Cysteinyl-Flavanol Conjugates on Skin Cancer Cells. FEBS Letters 579, 4219-4225.
【非特許文献４】Selga, A., et al., 2004. Efficient One Pot Extraction and Depolymerization of Grape (Vitis vinifera) Pomace Procaynidins for the Preparation of Antioxidant Thio-Conjugates. J. Agric. Food Chem. 52, 467-473.
【非特許文献５】Mitjans, M., et al., 2004. Immunomodulatory Activity of a New Family of Antioxidants Obtained from Grape Polyphenols. J. Agric. Food Chem. 52, 7297-7299.
【非特許文献６】Torres, J.L., et al., 2002. Cysteinyl-flavan-3-ol Conjugates from Grape Procyanidins. Antioxidant and Antiproliferative Properties. Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 2497-2509.
【非特許文献７】Torres, J.L. and Bobet, R., 2001. New Flavanol Derivatives from Grape (Vitis vinifera) Byproducts. Antioxidant Aminoethylthio-Flavan-3-ol Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols. J. Agric. Food Chem. 49, 4627-4634.
【非特許文献８】Tanaka, T., et al., 1994. Chemical Evidence for the De-astringency (Insolubilization of Tannins) of Persimmon Fruit. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 20, 3013-3022.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる、新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、リンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体画分とＳＨ基を有するアミノ酸であるアセチルシステインを求核剤として反応させ、新規フラバノール類化合物として４β−（Ｎ−アセチル−Ｓ−Ｌ−システイニル）−（−）−エピカテキン（ＮＡＣ−ＥＰＣ）を単離し、この化合物がビタミンＣを上回る強い抗酸化活性を有することを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記式（１）で表されるフラバノール化合物を提供する。
【化１】
また、本発明は、リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と求核剤とを反応させることを含む、前記フラバノール化合物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、抗酸化作用を有する新規フラバノール化合物を提供することができる。この新規フラバノール化合物は、抗酸化作用を有するので、生体内に生成した活性酸素や過酸化脂質によって引き起こされる障害を抑制する能力を有し、健康上の障害、美容上の障害の予防、治療に有効であり、医薬品、飲食品、化粧品などに応用、加工ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上記式（１）で表されるフラバノール化合物は、例えばプロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることによって製造することができる。ここで用いるプロシアジンは、２量体以外にも３〜１５量体のいずれか、あるいは混合体であってもよい。
プロシアニジン２量体は、例えばリンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分であってもよく、好ましくはリンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体画分である。ここで、「リンゴ未熟果実」とは、リンゴの果実が成熟する前に人為的に摘果したもの、あるいは落下などにより自然にリンゴ果樹より脱落したものをいう。
プロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応は、好ましくは酸性条件下で行う。用いる酸としては、有機酸又は無機酸のいずれであってもよい。有機酸としては、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、エリソルビン酸などが挙げられる。好ましくは、アスコルビン酸である。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。好ましくは、塩酸である。これらの酸は、単独で、又は２種以上混合して用いてもよい。
プロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応は、好ましくは20〜95℃、より好ましくは50〜90℃、最も好ましくは70℃である。
プロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応に用いられる溶媒としては、好ましくは水、メタノール、エタノールなどが用いられる。医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などに使用することを考えると、溶媒は、好ましくは水、エタノールである。これらの溶媒は、単独で、又は２種以上混合して用いてもよい。
【０００８】
前記反応後、残渣を濾別して、濾液を濃縮したあと常法により精製する。濃縮液の精製は、濃縮液を膜処理（限外濾過や逆浸透など）又は吸着剤処理などにより行うことができる。吸着剤としては、メタクリル酸吸着剤、ポリアクリルアミドゲル、スチレン−ジビニルベンゼン吸着剤、修飾デキストランゲル、親水性ビニルポリマー、逆相シリカゲル、イオン交換樹脂などが挙げられる。これらの吸着剤を用いる場合、本発明の新規フラバノール化合物は、吸着剤に吸着する画分に含まれる。この画分をメタノールなどのアルコール又は含水アルコール、アセトンなどで溶出させることにより、本発明の新規フラバノール化合物を得ることができる。
以下、ＮＡＣ−ＥＰＣの製造方法の例を記載する。これらの実施例は本発明を詳細に説明する目的で特に好ましい様態を示したものであるが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【実施例】
【０００９】
（実施例１）
リンゴ未熟果実由来のポリフェノールより得られたプロシアニジン２量体画分2.8ｇ、アセチルシステイン（還元型）（和光純薬工業（株）製）56ｇ、アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）0.5ｇ、１％塩酸300mlを混合し、70℃で１時間反応させた。この反応液を冷水で冷却した後Sephadex ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）を充填したカラム（容量約200ml）に負荷し、非吸着物質を水200mlで洗浄した後、40％メタノール300mlずつで溶出する画分をそれぞれ回収し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、凍結乾燥して褐色粉末の画分１（収量2.48ｇ）を得た。画分１をさらに下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、類白色粉末として下記式のＮＡＣ−ＥＰＣ（収量0.95ｇ）を分取精製した。
【００１０】
ＨＰＬＣ条件：
装置：Hitachi ＨＰＬＣシステム（Hitachi Ltd., Tokyo, Japan）
カラム：Inertsil ＯＤＳ−３（φ20×250mm、GL Sciences Inc., Tokyo, Japan）
カラム温度：40℃；流速：12ml/min；注入量：50〜100mg/mlメタノール；ＵＶ検出：280nm
移動相：18％メタノール
【００１１】
（実施例２ ＤＰＰＨラジカル消去活性）
新規フラバノール化合物であるＮＡＣ−ＥＰＣのＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性を測定した。すなわち、96穴ウェルプレート中でサンプルの希釈系列を調製し（１ウェル100μL）、750μMのＤＰＰＨのエタノール溶液100μLを加え、暗黒条件下、室温で30分間インキュベーションした後にプレートリーダーを用いて517nmでの吸光度を測定した。吸光度を半減させる供試物質の最終濃度（ＩＣ50）を求め、これを抗酸化活性の指標とした。対照化合物として、ビタミンＣ（Ｖｃ）を用いた。結果を図１に示す。
図１の結果から、本発明の新規フラバノール化合物の活性（ＩＣ50（mM））は、Ｖｃに比べて非常に強いものであった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の新規フラバノール化合物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示すグラフである。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗酸化活性を有し、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる新規フラバノール化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
抗酸化化合物としては、例えばビタミン−Ｃ（アスコルビン酸）などの水溶性抗酸化化合物、ビタミン−Ｅ（α−トコフェロール）などの脂溶性抗酸化化合物が知られているが、ポリフェノールの中でも幅広い植物に含まれるプロアントシアニジン（ＰＡ）の機能性が健康食品分野において近年関心を集めている。ＰＡは、フラバンユニットから構成され、酸性条件下分解してフラバンユニットの４位にカルボカチオンが生成するという化学的性質を持っており、トルエン−α−チオール、フロログルシノールなどの求核剤を共存させると、それらがカチオンをトラップしてフラバンユニットとの結合物質が生成することが知られている。
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2003/024951号パンフレット
【特許文献２】国際公開第2004/103988号パンフレット
【非特許文献１】Torres, J.L., et al., 2005. Conjugation of Catechins with Cysteine Generates Antioxidant Compounds with Enhanced Neuroprotective Activity. Phytochemistry 66, 2032-2037.
【非特許文献２】Selga, A. & Torres, J.L., 2005. Efficient Preparation of Catechin Thio Conjugates by One Step Extraction/Depolymerization of Pine (Pinus pinaster) Bark Procyanidins. J. Agric. Food Chem. 53, 7760-7765.
【非特許文献３】Lozano, C., et al., 2005. Effect of New Antioxidant Cysteinyl-Flavanol Conjugates on Skin Cancer Cells. FEBS Letters 579, 4219-4225.
【非特許文献４】Selga, A., et al., 2004. Efficient One Pot Extraction and Depolymerization of Grape (Vitis vinifera) Pomace Procaynidins for the Preparation of Antioxidant Thio-Conjugates. J. Agric. Food Chem. 52, 467-473.
【非特許文献５】Mitjans, M., et al., 2004. Immunomodulatory Activity of a New Family of Antioxidants Obtained from Grape Polyphenols. J. Agric. Food Chem. 52, 7297-7299.
【非特許文献６】Torres, J.L., et al., 2002. Cysteinyl-flavan-3-ol Conjugates from Grape Procyanidins. Antioxidant and Antiproliferative Properties. Bioorganic & Medicinal Chemistry 10, 2497-2509.
【非特許文献７】Torres, J.L. and Bobet, R., 2001. New Flavanol Derivatives from Grape (Vitis vinifera) Byproducts. Antioxidant Aminoethylthio-Flavan-3-ol Conjugates from a Polymeric Waste Fraction Used as a Source of Flavanols. J. Agric. Food Chem. 49, 4627-4634.
【非特許文献８】Tanaka, T., et al., 1994. Chemical Evidence for the De-astringency (Insolubilization of Tannins) of Persimmon Fruit. J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 20, 3013-3022.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などとして利用することができる、新規化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、リンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体画分とＳＨ基を有するアミノ酸であるアセチルシステインを求核剤として反応させ、新規フラバノール類化合物として４β−（Ｎ−アセチル−Ｓ−Ｌ−システイニル）−（−）−エピカテキン（ＮＡＣ−ＥＰＣ）を単離し、この化合物がビタミンＣを上回る強い抗酸化活性を有することを見いだし、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、下記式（１）で表されるフラバノール化合物を提供する。
【化１】
また、本発明は、リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と求核剤とを反応させることを含む、前記フラバノール化合物の製造方法を提供する。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により、抗酸化作用を有する新規フラバノール化合物を提供することができる。この新規フラバノール化合物は、抗酸化作用を有するので、生体内に生成した活性酸素や過酸化脂質によって引き起こされる障害を抑制する能力を有し、健康上の障害、美容上の障害の予防、治療に有効であり、医薬品、飲食品、化粧品などに応用、加工ができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
上記式（１）で表されるフラバノール化合物は、例えばプロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることによって製造することができる。ここで用いるプロシアジンは、２量体以外にも３〜１５量体のいずれか、あるいは混合体であってもよい。
プロシアニジン２量体は、例えばリンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分であってもよく、好ましくはリンゴ未熟果実由来のプロシアニジン２量体画分である。ここで、「リンゴ未熟果実」とは、リンゴの果実が成熟する前に人為的に摘果したもの、あるいは落下などにより自然にリンゴ果樹より脱落したものをいう。
プロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応は、好ましくは酸性条件下で行う。用いる酸としては、有機酸又は無機酸のいずれであってもよい。有機酸としては、酢酸、クエン酸、アスコルビン酸、蓚酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、酒石酸、エリソルビン酸などが挙げられる。好ましくは、アスコルビン酸である。無機酸としては、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。好ましくは、塩酸である。これらの酸は、単独で、又は２種以上混合して用いてもよい。
プロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応は、好ましくは20〜95℃、より好ましくは50〜90℃、最も好ましくは70℃である。
プロシアニジン２量体と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤との反応に用いられる溶媒としては、好ましくは水、メタノール、エタノールなどが用いられる。医薬品、化粧品、健康食品、食品添加物などに使用することを考えると、溶媒は、好ましくは水、エタノールである。これらの溶媒は、単独で、又は２種以上混合して用いてもよい。
【０００８】
前記反応後、残渣を濾別して、濾液を濃縮したあと常法により精製する。濃縮液の精製は、濃縮液を膜処理（限外濾過や逆浸透など）又は吸着剤処理などにより行うことができる。吸着剤としては、メタクリル酸吸着剤、ポリアクリルアミドゲル、スチレン−ジビニルベンゼン吸着剤、修飾デキストランゲル、親水性ビニルポリマー、逆相シリカゲル、イオン交換樹脂などが挙げられる。これらの吸着剤を用いる場合、本発明の新規フラバノール化合物は、吸着剤に吸着する画分に含まれる。この画分をメタノールなどのアルコール又は含水アルコール、アセトンなどで溶出させることにより、本発明の新規フラバノール化合物を得ることができる。
以下、ＮＡＣ−ＥＰＣの製造方法の例を記載する。これらの実施例は本発明を詳細に説明する目的で特に好ましい様態を示したものであるが、本発明はこれらに制限されるものではない。
【実施例】
【０００９】
（実施例１）
リンゴ未熟果実由来のポリフェノールより得られたプロシアニジン２量体画分2.8ｇ、アセチルシステイン（還元型）（和光純薬工業（株）製）56ｇ、アスコルビン酸（和光純薬工業（株）製）0.5ｇ、１％塩酸300mlを混合し、70℃で１時間反応させた。この反応液を冷水で冷却した後Sephadex ＬＨ−２０（ファルマシア（株）製）を充填したカラム（容量約200ml）に負荷し、非吸着物質を水200mlで洗浄した後、40％メタノール300mlずつで溶出する画分をそれぞれ回収し、ロータリーエバポレーターを用いて減圧濃縮し、凍結乾燥して褐色粉末の画分１（収量2.48ｇ）を得た。画分１をさらに下記の条件で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供し、類白色粉末として下記式のＮＡＣ−ＥＰＣ（収量0.95ｇ）を分取精製した。
【００１０】
ＨＰＬＣ条件：
装置：Hitachi ＨＰＬＣシステム（Hitachi Ltd., Tokyo, Japan）
カラム：Inertsil ＯＤＳ−３（φ20×250mm、GL Sciences Inc., Tokyo, Japan）
カラム温度：40℃；流速：12ml/min；注入量：50〜100mg/mlメタノール；ＵＶ検出：280nm
移動相：18％メタノール
【００１１】
（実施例２ ＤＰＰＨラジカル消去活性）
新規フラバノール化合物であるＮＡＣ−ＥＰＣのＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）ラジカル消去活性を測定した。すなわち、96穴ウェルプレート中でサンプルの希釈系列を調製し（１ウェル100μL）、750μMのＤＰＰＨのエタノール溶液100μLを加え、暗黒条件下、室温で30分間インキュベーションした後にプレートリーダーを用いて517nmでの吸光度を測定した。吸光度を半減させる供試物質の最終濃度（ＩＣ50）を求め、これを抗酸化活性の指標とした。対照化合物として、ビタミンＣ（Ｖｃ）を用いた。結果を図１に示す。
図１の結果から、本発明の新規フラバノール化合物の活性（ＩＣ50（mM））は、Ｖｃに比べて非常に強いものであった。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明の新規フラバノール化合物のＤＰＰＨラジカル消去活性を示すグラフである。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表されるフラバノール化合物。
【化１】
【請求項２】
リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることを含む、請求項１記載のフラバノール化合物の製造方法。
【請求項３】
リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と求核剤との反応を70℃で行う、請求項２記載の製造方法。
【請求項１】
下記式（１）で表されるフラバノール化合物。
【化１】
【請求項２】
リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と、アセチルシステイン及びその塩からなる群より選ばれる求核剤とを反応させることを含む、請求項１記載のフラバノール化合物の製造方法。
【請求項３】
リンゴ果実由来のプロシアニジン２量体画分と求核剤との反応を70℃で行う、請求項２記載の製造方法。
【図１】
【公開番号】特開２００８−２０１７４５（Ｐ２００８−２０１７４５Ａ）
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−４１２５０（Ｐ２００７−４１２５０）
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月４日（２００８．９．４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年２月２１日（２００７．２．２１）
【出願人】（０００００００５５）アサヒビール株式会社 (535)
【Ｆターム（参考）】
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