本明細書はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の変異体、Ｃｅｌ６Ａ酵素を開示する。本発明は、熱安定性が改善されている新規なセロビオハイドラーゼを提供する。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願に関するクロスリファレンス
本出願は、２００４年５月２９日に提出された米国仮出願 Ｎｏ．６０／６４０，３９８、タイトル、「新規トリコデルマ遺伝子」、Ｆｏｒｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．及び、２００３年６月３日に提出された米国仮出願 Ｎｏ．６０／４７５，８２６、タイトル、「新規トリコデルマ遺伝子」、Ｆｏｒｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．に対し優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府による委託研究の下でなされた発明に対する権利の記述
この研究の一部は、米国エネルギー省との主契約番号ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７の下、再生可能エネルギー研究所との下請け契約番号ＺＣＯ−３００１７−０１により資金提供されたものである。従って、米国政府は本発明について一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本発明は、セロビオヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、セロビオヒドラーゼ酵素変異体及び単離された核酸配に関する。また、本発明は、組換えＣＢＨ２変異体ポリペプチドを生成する方法のほかに、前記核酸配列を含む核酸構築体、ベクター、及び宿主細胞にも関する。
【０００４】
文献
１． Ｓｈｅｅｈａｎ ａｎｄ Ｈｉｍｍｅｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ １５、 ｐｐ ８１７−８２７（１９９９）
2． Ｍａｔｔｉ Ｌｉｎｋｏ Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ ＴＲＩＣＥＬ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｈｙｄｒｏｌａｓｅｓ ｐｐ ９−１１（１９９３）
3． Ｔｕｕｌａ Ｔ． Ｔｅｅｒｉ Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 15、 ｐｐ １６０−１６７ （1997）
4． Ｔ．Ｔ． Ｔｅｅｒｉ ｅｔ ａｌ． Ｓｐｅｃ． Ｐｕｂｌ． − R．Ｓｏｃ． Ｃｈｅｍ．、２４６（Ｒｅｃｅｎｔ Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、ｐｐ ３０２−３０８．（１９９９）
5． ＰＤＢ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ １ＱＫ２ （Ｃｅｌ６Ａ ＝ ＣＢＨ２） Ｊ．−Ｙ． Ｚｏｕ、 Ｇ．Ｊ． Ｋｌｅｙｗｅｇｔ、 Ｊ− Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ、 Ｈ． Ｄｒｉｇｕｅｓ、 Ｗ− Ｎｅｒｉｎｃｋｘ、 Ｍ． Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ、 Ａ． Ｋｏｉｖｕｌａ、 Ｔ．Ｔ． Ｔｅｅｒｉ．、Ｔ．Ａ Ｊｏｎｅｓ、 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ （ＬＯＮＤＯＮ）、 Ｖ．７ ｐ． １０３５ （１９９９）
6． ＰＤＢ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２ＢＶＷ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ ｔｕｎｎｅｌ ｏｆ Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ、 Ｃｅｌ６Ａ、 ｕｐｏｎ ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ．、 Ｖａｒｒｏｔ Ａ、 Ｓｃｈｕｌｅｉｎ M、 Ｄａｖｉｅｓ ＧＪ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９９ Ｊｕ１ １３；３８（２８）：８８８４−９１
7． ＰＤＢ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ １ＤＹＳ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ function ｏｆ Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ ｆａｍｉｌｙ ６ ｃｅｌｌｕｌａｓｅｓ： ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏｇｌｕｃａｎａｓｅ、 Ｃｅｌ６Ｂ、 ａｔ １．６ Ａ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．、 Ｄａｖｉｅｓ ＧＪ、 Ｂｒｚｏｚｏｗｓｋｉ ＡＭ、 Ｄａｕｔｅｒ Ｍ、 Ｖａｒｒｏｔ Ａ、 Ｓｃｈｕｌｅｉｎ Ｍ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２０００ Ｍａｙ １５；３４８ Ｐｔ １ ：２０１−７。
【背景技術】
【０００５】
セルロース及びヘミセルロースは光合成により生産される最も豊富な植物資源である。それらは、加水分解によりポリマー基質を単体糖類にすることができる細胞外酵素を作り出すバクテリア、イーストと真菌を含む、たくさんの微生物によって分解され、エネルギー源として使われることができる（Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、 ｖｏｌ． ２７６、 Ｎｏ．２６、 ｐｐ． ２４３０９−２４３１４、 Ｊｕｎｅ ２９、２００１）。再生不可能な資源の限界が近づくにつれ、主要な再生可能資源となるセルロースの可能性は重要となる（Ｋｒｉｓｈｎａ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈ． ７７： １９３−１９６、２００１）。生物学的工程利用してセルロースを効果的に利用することは、食料、飼料及び燃料の貯蔵量を増やすためのアプローチの一つである（Ｏｈｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｇｅｎ． Ｅｎｇｉｎｅｅｒ． Ｒｅｖ． ｖｏｌ．１４、 ｐｐ． ３６５−４１４、（１９９７）。
【０００６】
セルラーゼはセルロース（ベータ−１、４−グルカン又はベータ D−グルコシド結合）を加水分解して、グルコース、セロビオース、セロオリゴサッカライド及び同種のものを生成する酵素である。セルロースは伝統的に３つの型に分類されている：エンドグルカナーゼ （ＥＣ３−２−１−４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ （ＥＣ３−２−１−９１）（“ＣＢＨ”）及びベータグルコシダーゼ（［ベータ］−D−グルコシドグルハイドラーゼ；ＥＣ３−２−１−２１）（“ＢＧ”）（Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．、 ＴＩＢＴＥＣＨ ５、２５５−２６１、 １９８７； Ｓｈｕｌｅｉｎ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、 １６０、２５、 ｐｐ．２３４−２４３、 １９８８） エンドグルカナーゼは主に、セルロース繊維の無定形の部分に作用するのに対して、セロビオハイドラーゼもまた、結晶セルロースを分解することができる。（Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ ａｎｄ Ｐｅｎｔｔｉｌａ、 Ｍｙｃｏｔａ、 ３０３−３１９、１９９５）。従って、結晶セルロースの効率的な可溶化のためにセルラーゼシステム中にセロビオハイドラーゼが必要であることが知られている（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ、 ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ７： １８９−２０９、 ２０００）。ベータグルコシダーゼはD−グルコース単位をセロビオース、セロオリゴ糖、および他のグルコシドから遊離するために作用する。（Ｆｒｅｅｒ、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ｖｏｌ． ２６８、 Ｎｏ． １３、 ｐｐ． ９３３７−９３４２、１９９３）。
【０００７】
セルラーゼは多くのバクテリア（菌類及び酵母菌）から生産されることが知られている。ある種の菌類は、セルロースの結晶構造を分解することができる完全なセルラーゼ系を生産することができる。多くの酵母由来の糸状菌、は特有の活性を有し、例えば、サッカロマイセス・セレヴィシエ（出芽酵母）は、セルロースの加水分解活性を欠いている。 Ａｒｏ ｅｔ ａｌ．、 ２００１；Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、 １９８８； Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ｖｏｌ． １６０、 Ｎｏ．９、 pp．８７−１１６、１９８８）、及びＣｏｕｇｈｌａｎ ｅｔ ａｌ．。
【０００８】
「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｆｕｎｇａｌ ａｎｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ」 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、 ｐｐ． １１−３０ １９８８を参照のこと。
【０００９】
ＣＢＨ、ＥＧ及びＢＧの真菌セルラーゼ区分は、各区分内で倍数体があることにより、それぞれの区分内に異なる組成物を含む。例えば、多数のＣＢＨｓ、ＥＧｓ及びＢＧｓは、２のＣＢＨｓ、すなわちＣＢＨ２ 及びＣＢＨ２I、少なくとも８のＥＧｓ、すなわち、ＥＧＩ、ＥＧＩＩ、ＥＧIII、ＥＧＩＶ、ＥＧＶ、ＥＧＶＩ、ＥＧＶＩＩ、およびＥＧＶＩＩＩ及び少なくとも５のＢＧｓ、すなわち、ＢＧ１、ＢＧ２、ＢＧ３、ＢＧ４、およびＢＧ５に対する遺伝子を含むことで知られているトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）を含む様々な糸状菌源から単離されてきた。
【００１０】
結晶化セルロースをグルコースへ転換する目的のために、結晶化セルロースの加水分解能力を失わずに単離されたＧＢＨ、ＥＧ及びＢＧそれぞれの区分からの組成物を含むシステムが必要とされる（Ｆｉｌｈｏ ｅｔ ａｌ．、 Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４２： １−５、１９９６）。異なる区分間のセルラーゼ成分の相互作用が見られる。具体的には、ＥＧタイプセルラーゼ及びＣＢＨタイプセルラーゼはより効果的にセルラーゼを分解するために相互作用している。例えば、Ｗｏｏｄ、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、 ６１１^ｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ、 Ｇａｌｗａｙ、 ｖｏｌ． １３、 ｐｐ．４０７−４１０、１９８５参照のこと。
【００１１】
セルラーゼは当該技術分野において、布製品に対する洗剤成分の洗浄効果を高め、柔軟成分として綿布又は類似のものに対する風合い、外観を改善するのに有用であることが知られている。（Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、 ２９：３７−４２、１９９７）。
【００１２】
洗浄効果が向上されたセルラーゼ含有洗剤組成物（ＵＳ Ｐａｔ．Ｎｏ．４、４３５、３０７； ＧＢ Ａｐｐ． Ｎｏｓ．２、０９５、２７５及び２、０９４、８２６）及び布製品に対して風合い及び外観を改善するために使用すること（ＵＳ Ｐａｔ． Ｎｏs．５、６４８、２６３、 ５、６９１、１７８、及び５、７７６、７５７；ＧＢ Ａｐｐ．Ｎｏ．１、３５８、５９９；Ｔｈｅ Ｓｈｉｚｕｏｋａ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒａｌ Ｈａｍｍａｍａｔｓｕ Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｒｅｐｏｒｔ、 Ｖｏｌ． ２４、 ｐｐ． ５４−６１、１９８６）が開示されている。
【００１３】
従って、菌類及びバクテリア由来のセルロースは注目されている。具体的には、トリコデルマ属（例えばトリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）あるいはトリコデルマレーシ）はセルラーゼの結晶構造を分解する完全なセルロースシステムを有する。
【００１４】
セルラーゼ組成物はこれまで開示されてきているが、一般家庭用の洗剤、ストーンウォシュ用組成物又は洗濯用洗剤等に用いるための新しく改良されたセルラーゼ組成物の必要性がいまだ存在する。性能が改良されたセルラーゼについて特別な関心が集まるであろう。
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本発明はセルラーゼタンパク質の単離、ここでは、変異体ＣＢＨ２及び変異体CBH ２をエンコードする核酸に関係する。
【００１６】
ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ （配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４、Ｐ９８、Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、 Ｌ１４４、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｓ２１０、 Ｉ２１２、Ｔ２１４、Ｌ２１５、Ｇ２３１、Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、 Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｖ３２３、Ｎ３２５、Ｉ３３３、Ｇ３３４、 Ｓ３４３、Ｔ３４９、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３８６、Ｆ４１１、Ｓ４１３、 Ａ４１６、Ｑ４２６及び／又はＡ４２９の１つ以上にの残基に気相当する位置における置換又は欠失を含むことを特徴とする、変異体ＣＢＨ２セルラーゼに関係する。第一の側面において、本発明は、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ （配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４Ｅ、Ｐ９８Ｌ、Ｇ１１８Ｐ、Ｍ１２０Ｌ、 Ｍ１３４G／L／Ｖ、Ｔ１４２Ｖ、Ｌ１４４Ｇ／Ｒ／Ｓ、Ｍ１４５Ｌ、Ｔ１４８Ｙ、Ｔ１５４Ａ、Ｌ１７９Ａ、Ｑ２０４Ｅ、Ｖ２０６Ｌ、Ｓ２１０L／R、Ｉ２１２Ｖ、Ｔ２１４Ｍ／Ｙ、Ｌ２１５Ｉ、Ｇ２３１Ｎ、Ｔ２３２Ｖ、Ｖ２５０Ｉ、Ｑ２７６Ｌ、Ｎ２８５Ｑ、Ｓ２９１Ｇ、Ｇ３０８Ａ、Ｔ３１２Ｓ、Ｓ３１６Ｐ、Ｖ３２３L／M／Y、Ｎ３２５D、Ｉ３３３Ｌ、Ｇ３３４Ａ、Ｓ３４３Ｐ、Ｔ３４９Ｌ、Ｇ３６０Ｒ、Ｓ３８０Ｔ、Ａ３８１Ｔ、Ｓ３８６Ｐ、Ｆ４１１Ｙ、Ｓ４１３Ｙ、Ａ４１６Ｇ、Ｑ４２６Ｅ及び／又はＡ４２９Ｔの１つ以上にの残基に気相当する位置における置換又は欠失を含むことを特徴とする、変異体ＣＢＨ２セルラーゼに関係する。
【００１７】
第二の態様において、本発明は、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ （配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４、Ｐ９８、Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｉ２１２、Ｌ２１５、Ｇ２３１、Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｖ３２３、Ｎ３２５、Ｉ３３３、Ｇ３３４、Ｓ３４３、Ｔ３４９、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３８６、Ｆ４１１、Ｓ４１３、Ａ４１６、Q４２６及び／又はA４２９の１つ以上の残基に相当する位置における置換／又は欠失を含むことを特徴とする変異体に関係する。第一の側面において、本発明は、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４Ｅ、Ｐ９８Ｌ、Ｇ１１８Ｐ、Ｍ１２０Ｌ、Ｍ１３４Ｌ、Ｔ１４２Ｖ、Ｍ１４５Ｌ、Ｔ１４８Ｙ、Ｔ１５４Ａ、Ｌ１７９Ａ、Ｑ２０４Ｅ、Ｖ２０６Ｌ、Ｉ２１２Ｖ、Ｌ２１５Ｉ、Ｇ２３１Ｎ、Ｔ２３２Ｖ、Ｖ２５０Ｉ、Ｑ２７６Ｌ、Ｎ２８５Ｑ、Ｓ２９１Ｇ、 Ｇ３０８Ａ、Ｔ３１２Ｓ、Ｓ３１６Ｐ、Ｖ３２３、Ｎ３２５Ｄ、Ｉ３３３Ｌ、Ｇ３３４Ａ、 Ｓ３４３Ｐ、Ｔ３４９Ｌ、Ｇ３６０Ｒ、Ｓ３８０Ｔ、Ａ３８１Ｔ、Ｓ３８６Ｐ、Ｆ４１１Ｙ、Ｓ４１３Ｙ、Ａ４１６Ｇ、Ｑ４２６Ｅ及び／又はＡ４２９Ｔからなる群より選択される残基に相当する１つ以上の位置における置換を含むことを特徴とする変異体に関係する。
【００１８】
第三の態様において、本発明は、変異体ＣＢＨ２セルラーゼに関する。ここで、前記変異体は、ハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２のＰ９８、Ｍ１３４、Ｖ２０６、Ｉ２１２、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｆ４１１及び／又はＳ４１３から成る群から選択される残基に対応する部分の置き換えを有している。第一の側面において、本発明は、変異体ＣＢＨ２セルラーゼに関する。ここで、前記変異体は、ハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２のＰ９８Ｌ、Ｍ１３４Ｇ／Ｌ／Ｖ、Ｖ２０６Ｌ、 Ｉ２１２Ｖ、Ｔ３１２Ｓ、Ｓ３１６Ｐ、Ｆ４１１Ｙ及び／又はＳ４１３Ｙから成る群から選択される残基に対応する部分の置き換えを有している。
【００１９】
第4の実施態様では本発明は、ハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２中の以下の部分より成る群から選択される部分について突然変異を有する変異体ＣＢＨ２セルラーゼに関する。ここで、前記変異体は、空間領域において、１つ以上の残基に対応する位置において置換又は欠失を含んでおり、前記空間領域は、ハイポクレアジェコリーナ由来のＣＢＨ２における（２１０、２１４）、（２５３、２５５、２５７、２５８）、（４１１、 ４１３、 ４１５）、（４１２、 ４１４、 ４１６）、（３１２、３１３）、 ３２３、（２１２、１４９、１５２）、（１３４、１４４）及び９８からなる群より選択される。第一の側面において、ハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２のＳ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｌ、Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ、Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｓ３１６Ｐ、Ｖ２０６Ｌ／Ｓ３１６Ｐ、Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｌ／Ｔ２１４Ｍ／Ｓ３１６Ｐ、Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ、Ｍ１３４Ｇ／Ｌ１４４Ｇ／Ｓ３１６Ｐ、Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ３１６Ｐ及びＭ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｓ／Ｓ３１６Ｐからなる群より選択されるＣＢＨ２変異体を含む。
【００２０】
第５の態様において、本発明はハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２におけるＰ９８、Ｍ１３４、Ｌ１４４、Ｖ２０６、Ｓ２１０、Ｔ２１４、Ｓ３１６、Ｖ３２３及び／又はＳ４１３の１つ以上の残基に対応する位置において置換又は欠失を含むＣＢＨ２変異体を含む。第一の側面において、前記変異体は、ハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２におけるＰ９８Ｌ、Ｍ１３４Ｌ／Ｖ、Ｌ１４４Ｒ、 Ｖ２０６Ｌ、Ｓ２１０Ｌ／Ｒ、Ｔ２１４Ｙ、Ｓ３１６Ｐ、Ｖ３２３Ｙ及び／又はＳ４１３Ｙにおける１つ以上の置換又は欠失を含む。第二の側面において、本発明は、、ハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２における９８Ｌ／１３４Ｖ／２０６Ｌ／２１０Ｒ／２１４Ｙ／３１６Ｐ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｌ／１４４Ｒ／３１６Ｐ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｌ／１４４Ｒ／２０６Ｌ／２１０Ｒ／２１４Ｙ／３１６Ｐ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｖ／３１６Ｐ／３２３Ｙ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｖ／２０６Ｌ／２１０Ｒ／２１４Ｙ／３１６Ｐ／３２３Ｙ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｌ／１４４Ｒ／３１６Ｐ／３２３Ｙ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｌ／１４４Ｒ／２０６Ｌ／２１０Ｒ／２１４Ｙ／３１６Ｐ／３２３Ｙ／４１３Ｙ、９８Ｌ／１３４Ｌ／１４４Ｒ／２１０Ｒ／２１４Ｙ／３１６Ｐ／３２３Ｙ／４１３Ｙ及び９８Ｌ／１３４Ｌ／１４４Ｒ／２１０Ｌ／２１４Ｙ／３１６Ｐ／３２３Ｙ／４１３Ｙからなる群より選択されるＣＢＨ２変異体を含む。
【００２１】
第６の態様において、本発明はセロビオヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。
【００２２】
第一の側面において、本発明は本発明はセロビオヒドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。前記ポリペプチドはファミリー６のグリコシルハイドロラーゼの変異体であり、前記核酸は、前記核酸によりコードされるポリペプチドにおいて酵素の連続移動性に影響を与える残基における置換を含み、前記変異体セロビオヒドラーゼ、ハイポクレアジェコリーナ由来である。第二の側面において、本発明はセロビオヒドラーゼ活性と有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含み、前記ポリペプチドはファミリー６のグリコシルヒドロラーゼの変異体であり、前記核酸は前記核酸によりコードされるポリペプチドにおいて酵素の連続移動性に影響を与える残基における置換を含み、前記変異体セロビオヒドラーゼ、ハイポクレアジェコリーナ由来である。第三の側面において、本発明はセロビオハイドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸を含み、前記ポリペプチドはファミリー６のグリコシルヒドロラーゼの変異体であり、前記核酸は前記核酸によりコードされるポリペプチドにおいて生成物阻害に影響を与える残基における置換を含み、前記変異体セロビオハイドロラーゼはハイポクレアジェコリーナ由来である。
【００２３】
他の側面において、本発明は、変異体ＣＢＨ２セルラーゼをコードする単離された核酸に関係し、前記変異体はハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２における、Ｖ９４、Ｐ９８、Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｉ２１２、Ｌ２１５、Ｇ２３１、Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｖ３２３、Ｎ３２５、Ｉ３３３、Ｇ３３４、Ｓ３４３、Ｔ３４９、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３９０、Ｆ４１１、Ｓ４１３、Ａ４１６、Ｑ４２６及び／又はＡ４２９における１つ以上の残基に対応する位置における置換を含む。
【００２４】
第７の態様において、本発明はＣＢＨ２変異体をコードする核酸を含む発現カセットを含む。該態様の１の側面は調節配列に作動可能に結合しているＣＢＨ２変異体をコードしている核酸を含む構築体である。
【００２５】
第８の態様において、本発明は変異体ＣＢＨ２をコードしている核酸を含むベクターを含む。該態様の１の側面は調節配列に作動可能に結合しているＣＢＨ２変異体をコードしている核酸を含む構築体である。
【００２６】
第９の態様において、本発明は、ＣＢＨ２変異体をコードしている核酸を含むベクターを用いて形質転換した宿主細胞を含む。
【００２７】
第１０の態様において、本発明は、
（a）好適な条件下で、酸を含むベクターを用いて形質転換した宿主細胞を培養してＣＢＨ２変異体を生成する工程と、
（b）ＣＢＨ２変異体を得る工程とを含むことを特徴とするＣＢＨ２変異体を生成する方法を含む。
【００２８】
第１１に態様において、本発明は、界面活性剤及びＣＢＨ２変異体を含む洗剤組成物を含む。該態様の第一の側面において前記洗剤組成物は洗濯用洗剤である。該態様の第二の側面において前記洗剤組成物は食器用洗剤である。第三の側面においては、この変異体ＣＢＨ２セルラーゼは、セルロースを含む布地、具体的にはストーンウォッシュ又はインディゴダイデニムの処理に用いられる。
【００２９】
第１２の実施態様では、本発明はＣＢＨ２変異体を含む食品添加物に関係する。
【００３０】
第１３の実施態様では、本発明はＣＢＨ２変異体とウッドパルプを含む、ウッドパルプの処理方法に関係する。
【００３１】
第１４の実施態様では、本発明は、ＣＢＨ２変異体とバイオマス（生物資源）を含む。バイオマスを糖に転換する方法に関する。
【００３２】
ある実施態様では、本発明のセルラーゼは、細菌、バクテリア、放線菌から生産される。他の実施態様では、このセルラーゼは細菌由来である。最も好ましい実施態様では、この細菌は糸状菌である。この糸状菌は、ユーサコマイセート（Ｅｕａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）属のものであって、具体的には、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、 Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐｐ．、 Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐｐ．、 Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｓｐｐ．、 Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ ｓｐｐ．、 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．、 Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍ ｓｐｐ．、 又はＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ．である。この実施態様のさらなる側面においては、このセルラーゼはセロビオハイドラーゼである。
【００３３】
本発明に関する上述以外の対象物、特徴点及び利点は以下の詳細な説明に開示してある。
【００３４】
詳細な説明や特定の例においては、本発明の好適な実施態様を示しているが、これらは例示するためのものであって、本発明の範囲および基本的な考え方から外れることなく、ここで述べる詳細な説明に基づいて、種々の変形や改良を行うことが可能であることは当該技術の分野のものにとっては明らかな事項であると理解しなければならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
実施例の詳細な説明
本発明は、ここで以下の定義と実施例を用いることで、参照により詳細に説明されるであろう。明確に参照されているすべての配列を含むすべての特許と出版物は、参照によりここに含まれる。
【００３６】
ここに違った形で定義されない限り、そしてここに使ったすべての技術用語、科学用語はは、一般的に、この発明の属する分野の当業者によって理解されているのと同じ意味を持っている。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ、 ｅｔ ａｌ、ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、 ２Ｄ ＥＤ．、 Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９９４）、及びＨａｌｅ & Ｍａｒｈａｍ、ＴＨＥ ＨＡＲＰＥＲ ＣＯＬＬＩＮＳ ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ ＯＦ ＢＩＯＬＯＧＹ、 Ｈａｒｐｅｒ Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ、 ＮＹ （１９９１）は本発明で用いられる全般的な用語の多くについての一般的な辞書である。ここに説明されたそれらに類似しているか、等しいどのような方法と原料でも本発明の実行またはテストに用いることができるけれども、好適な方法と原料は説明される。数値の範囲は定義している数を含めるものである。違った形で示されない限り、塩基配列は左から右に向かって5’末端から3’末端を表す；アミノ酸配列は、左から右に向かって、アミノ末端からカルボキシ末端を表す。専門家は特に本分野の定義と用語についてＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、 ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ（Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）、 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、 ＮＹ、 １９８９、及びＡｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ & Ｓｏｎｓ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ、 １９９３、を参考にすることができる。本発明は、説明された特定の方法、手段、試薬等が変更されるときに、これらに限定されないことは理解される。
【００３７】
ここに提供された見出しは、明細書を全体として理解し得る本発明の実施態様の様々の態様を限定するものではない。従って、すぐ下で定義された用語はこの明細書によってより完全に定義される。
【００３８】
ここに引用されたすべての出版物は、発明に関連して使われる組成物と方法を説明し、これらを明確にするためのりものであり、ここに参照することによって本明細書に取り込まれる。
【００３９】
I．定義
本明細書において用いられる、「ポリペプチド」という語は、ペプチド結合による一本鎖アミノ酸残基による組成物を言う。「タンパク質」という語は、ここで用いられる「ポリペプチド」と同義ある。
【００４０】
「変異体」は、前駆物質タンパク質（例えば、天然タンパク質）から生産されるプロテインであって、１以上のアミノ酸がＣ末端かＮ末端のどちらか又は両方に添加されること、アミノ酸配列中の１以上の異なる部位にけるアミノ酸の置換又はタンパク質の両端またはどちらか又は、アミノ酸配列中の１以上の部位における１以上のアミノ酸の欠失をいう。酵素変異体の調製は、好ましくは天然タンパクをエンコードしたＤＮＡ配列の変更、適切な宿主細胞内でのＤＮＡ配列の形質転換及び生産酵素を形成するような修飾されたＤＮＡ配列の発現によって達成できる。本発明のＣＢＨ２酵素の変異体は、前駆体アミノ酸配列と比較して変更されたアミノ酸配列を含むペプタイドを含む。ここで、変異体ＣＢＨ２酵素は、前駆体酵素が有していたセルロース分解能を有しており、いくつかの特定の様相においては変更された性質を示す。例えば、変異体ＣＢＨ２酵素は、至適ｐＨが高くなり、温度又は酸化安定性が増えるが、セルロース分解能は保持したままである。発現されたセルラーゼ誘導体の機能的な活性が保持されている本発明に応じた変異体は、セルラーゼ変異体ＣＢＨ２酵素をエンコードしているＤＮＡ断片から引き出されることが予想される。例えば、セルラーゼをエンコードしているＤＮＡ断片は、さらに、セルラーゼ領域の機能的な活性が保持されている５’または３’末端のどちらかで、このセルラーゼＤＮＡ配列に接続したヒンジ部またはリンカーをエンコードしているＤＮＡ配列または部分を含む。
【００４１】
「等しい残基」とは、三次構造がエックス線結晶解析によって決定されている前駆物質セルラーゼに対する三次構造のレベルで相同を決定することによって定義される。等しい残基は、セルラーゼ及びハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２の特定アミノ酸残基の主鎖原子のうちの２つ以上の原子座標（ＮのＮ、ＣＡのＣＡ、ＣのＣ及びＯのＯ）が、位置あわせをしたときに、０．１３ｎｍ及び、好ましくは０．１ｎｍ内にあるものと定義される。最良モデルが、問題となるＣＢＨ２のセルラーゼの非水素タンパク質原子の原子座標の最大オーバーラップを与えるように、方向付けられて置かれた後に、位置あわせは達成される。この最良モデルは、利用しうる高解像度での実験的回析データに対して最も低い解離因子（R）を与える結晶モデルである。
【式１】
【００４２】

ハイポクレアジェコリーナ（H．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の特定の残基と機能的に似ている当量の残基は、ハイポクレアジェコリーナ（H．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の特定の残基に定義され、特徴付けられている、タンパク質構造、基質結合、または触媒現象を変更し、修正し、あるいは、これらに寄与している構造を採用するセルラーゼのアミノ酸と定義される。さらに、それらは、与えられた残基の主鎖原子が、相同の位置を占めることに基づいて等価の基準を満たさないかもしれないけれども、残基の側鎖原子の少なくとも2つの原子の座標はハイポクレアジェコリーナ（H．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨの対応する側鎖原子の０．１３ｎｍのところにあるように、相似の位置を占める、セルラーゼ（三次構造はエックス線結晶解析によって得られている）のそれらの残基である。ハイポクレアジェコリーナ（H．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の結晶構造はＺｏｏらにより開示されている（文献５参照）。
【００４３】
「核酸分子」は、ＲＮＡ、ＤＮＡ及びｃＤＮＡ分子を含む。遺伝暗号の退縮の結果として、ＣＢＨ２のような与えられたタンパクをエンコードしている塩基配列の多様性が生まれる。本発明は、遺伝暗号の退縮を、与えられたすべてのＣＢＨ２をコードしているできる限り多くの変異塩基配列を予測するものである。
【００４４】
「非相同の」核酸構築物または配列は、それが発現する細胞固有のものではない配列の一部を有している。制御配列に関する非相同とは、発現を現在調節している同じ遺伝子を調節するために事実上機能しない制御配列（すなわちプロモーター又はエンハンサー）をいう。一般的に、非相同な塩基配列はそれらのもともとの細胞又は遺伝子の一部には存在しないのもであり、感染、トランスフェクション、形質転換、顕微注入、エレクトロポーション又は同様の方法により細胞へ添加されたものである。「非相同な」核酸構築物は、ネイティブの細胞の中で発見された制御シーケンス／ＤＮＡコーディングシーケンスの組み合わせと同じであるか、異なる制御シーケンス／ＤＮＡコーディングシーケンスを組み合わせたものを含む。
【００４５】
ここで用いる「ベクター」という語は、異なる宿主細胞間を輸送することを目的とする核酸構築物である。発現ベクターとは、異質細胞内で、相同なＤＮＡ断片を取り込み、発現させる能力があるベクターをいう。多くの原核又は真核細胞のベクターは市販されている。適切な発現ベクターの選択は、当該技術分野においてよく知られている。
【００４６】
「発現カセット」又は「発現ベクター」は、目的細胞内のある特定の核酸を転写させる一連の特定の核酸要素と共に用いる組み換え処理により、または合成的に生産された核酸構築物である。組み換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、色素体ＤＮＡ、ウイルス又は核酸断片に取り込むことができる。典型的には、多くの塩基配列中の発現ベクターが取り込まれた組み換えカセット部分は、転写され、プロモーターになる。
【００４７】
ここで用いる「プラスミド」という語は、クローニングベクターとして用いられる環状2本鎖ＤＮＡ（ｄｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ（ｄｓ））構築体であり、多くのバクテリア及び幾つかの真核生物において染色体外にある自己複製する遺伝子要素を形成するものである。
【００４８】
ここで用いる「選択マーカー−エンコードヌクレオチド配列」の語は宿主細胞において発現できるヌクレオチド配列をいい、選択マーカーの発現により対応する選択因子の存在下、または必須栄養素の不存在下で発現遺伝子を含む細胞は成長できるようになる。
【００４９】
ここで用いられる「プロモーター」という語は、下流遺伝子転写に直接作用する核酸配列をいう。このプロモーターは一般的に目的遺伝子が発現される宿主細胞内に用いられる。このプロモーターは、他の転写又は翻訳調節核酸配列（「制御配列」ともいう）と共に、与えられる遺伝子の発現に必要である。一般的には、この転写又は翻訳調節配列には、プロモーター塩基配列、リボゾーム結合部位、転写開始又は終了塩基配列を含むがそれらに限られない。
【００５０】
「キメラ遺伝子」又は「非相同核酸構造」は、調節領域を含む、異なる遺伝子の形質転換部分を構成する非野生型遺伝子（すなわち、宿主内に導入されたもの）をいう。宿主細胞の形質転換をするためのキメラ遺伝子構築物は、一般的に異種のタンパク質コーディング配列、または選択マーカーのキメラ遺伝子の中に、形質転換細胞に抗生物質抵抗性を与えているタンパク質をエンコードしている選択マーカー遺伝子と操作可能に接続した転写の規制の部分（促進因子）から構成されている。本発明の典型的なキメラ遺伝子は、タンパク質コード配列及びターミネーター配列の構成要素となる転写調節領域、又はこれらを誘発する転写調節領域を含む。キメラ遺伝子構築体は、目的タンパク質の分泌が必要な場合には、シグナルペプチドをエンコードする第２のＤＮＡ配列も含む。
【００５１】
核酸配列は、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに、「作動可能に結合している」。例えば、分泌リーダーをコードしているＤＮＡは、もしそれが、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質として発現するなら、ポリペプチドに関するＤＮＡと作動可能に結合する。プロモーター又はエンハンサーは、もしそれが、配列の転写に影響するなら、コード配列と作動可能に結合する。又はリボゾーム結合部位は、それが、転写を促進するような位置にあるならば、コード配列と作動可能に結合している。一般に「作動可能に結合」とは結合するＤＮＡ配列が隣接し、分泌開始端部の場合、隣接しかつリーディングフレーム中にあることを意味する。しかし、エンハンサーは隣接している必要はない。結合は、適宜の制限酵素認識部位で連結反応により達成される。そのような部位が存在しない場合、従来方法によりPCR用の合成オリゴヌクレオチド・アダプタ、リンカーまたはプライマーを用いる。
【００５２】
ここで用いる、「遺伝子」の語はポリぺプチド鎖の生成に関するＤＮＡの染色体断片を意味し、コード領域（例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）またはリーダー配列及び３’非翻訳（３’ＵＴＲ）またはトレーラー配列）に先行または後に続く領域、及び個々のコード断片（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。
【００５３】
一般に、配列番号１としてここに提供された野生型配列に対する中から高ストリンジェンシー条件下で、変異体ＣＢＨ２をエンコードする核酸分子はハイブリダイズする。しかし、場合によっては、実質的に異なるコドン使用頻度を有するＣＢＨ２エンコーディング核酸配列の使用が、ＣＢＨ２エンコーディング核酸配列によってエンコードされたタンパク質は天然タンパク質として、同じ又は実質的に同じアミノ酸配列を有する一方で、核酸配列によりエンコードされる新規タンパク質は、実質的に異なったコード配列を包含したものにも、採用される場合がある。例えば、コーディング配列は、宿主によって利用される特定コドンの頻度に従い、特定の原核生物又は真核生物の発現システムにおいて、ＣＢＨ２の発現を早くするために修飾される。Ｔｅ’ｏ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９０：１３−１９、２０００）、は、例えば、糸状菌の発現についての遺伝子の最適化について記載している。
【００５４】
核酸配列は、２つの配列が中〜高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件下でお互いに特異的にハイブリダイズする場合、対照核酸配列に「選択的にハイブリダイズ可能」であると考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合体又はプローブの融点（Ｔｍ）に基づいている。例えば、「最大ストリンジェンシー」は典型的にＴｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃低い）で起こる；「高ストリンジェンシー」はＴｍより約５−１０℃低い温度で起こる；「ゆるやかな」又は「中間ストリンジェンシー」はプローブのＴｍより約１０−２０℃低い温度で起こる；及び「低ストリンジェンシー」はＴｍより約２０−２５℃低い温度で起こる。機能的に、最大のストリンジェンシー条件は、ハイブリダーゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有する配列を同定するために使われることができ；一方、高いストリンジェンシーは、プローブと約８０％以上同一性を有する配列を同定するために使われる。
【００５５】
中間ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシー条件は、本技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 ｅｔ ａｌ．、 １９８９、 Ｃｈａｐｔｅｒｓ ９及び１１、 及び ｉｎ Ａｕｓｕｂｅｌ、 F． M．、 et al．、１９９３を参照のこと。これらは参照によりここに組み込まれる。）高ストリンジェンシー条件の例としては、５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ、５Ｘデンハード溶液、０．５％ＳＤＳ及び１００μg／ml変性キャリアＤＮＡ中、約４２℃でのハイブリダイゼーションを行い、続いて２ＸＳＳＣ及び０．５%ＳＤＳ中で、室温で２回洗浄し、０．１ＸＳＳＣ及び０．５％ＳＤＳ中で、更に４２℃で２回洗浄する。
【００５６】
ここで用いる「組換え体」は、非相同核酸配列の導入により修飾され、または修飾された細胞に由来する細胞またはベクターに関するものが含まれる。従って、例えば組換え細胞は、意図的にヒトが介入した結果として発現されまたは発現されない条件下で、当該細胞の天然型（非組換え体）の中に同一の形態として見られない遺伝子を発現し、または異常発現される天然遺伝子を発現する。
【００５７】
ここに用いる「形質転換」「安定な形質転換」「遺伝子組み換え」の語は、細胞に関して、ゲノムに組み込まれ、または複数の世代を通して維持されているエピゾームプラスミドとして非天然（非相同）核酸配列を有する細胞を意味している。
【００５８】
ここで用いられる、「発現」という語は、ポリペプチドが、遺伝子の核酸シーケンスに基づいて生み出される過程を言う。この過程は転写と翻訳の両方を含む。
【００５９】
核酸配列を細胞のなかに挿入するという文意の中で用いられている「導入」の語は、「トランスフェクション」、又は「形質転換」又は「形質導入」を意味し、核酸配列を真核又は原核細胞に組み込むことを含み、核酸配列が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体又はミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自己複製子へ転換されるか、一時的に発現される（例えば、トランスフェクトｍＲＮＡ）。
【００６０】
「ＣＢＨ２発現」という語は、ｃｂｈ２遺伝子の転写及び翻訳をいう、この生産物はRMA前駆体、ｍＲＮＡ、ポリペプチド、翻訳後調節過程のポリペプチド及びトリコデルマコニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎ）（トリコデルマロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ Ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）（リコデルマレーシ（ｒｅｅｓｅｉ））、又はトリコデルマビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、としても知られている）及び、ハイポクレアシュワイニッチ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｃｈｗｅｉｎｉｔｚｉｉ）等の、関連種由来の新規タンパク質を有する生産物を言う。実施例で示す方法であるが、ＣＢＨ２発現を測定する方法は、ＣＢＨ２タンパクについてのウエスタンブロット、ｃｂｈ２のｍＲＮＡに対してのノザンブロット測定、並びに、以下で説明されているリン酸膨張セルラーゼ及びＰＡＨＢＡＨアッセイ、（a）ＰＡＳＣ：（Ｋａｒｌｓｓｏｎ、 J． ｅｔ ａｌ．（２００１）、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２６８、 ６４９８−６５０７、 Ｗｏｏｄ、 Ｔ． （１９８８） ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ． １６０． Ｂｉｏｍａｓｓ Ｐａｒｔ ａ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ （Ｗｏｏｄ、 Ｗ． & Ｋｅｌｌｏｇ、 Ｓ． Ｅｄｓ．）、 ｐｐ． １９−２５、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ、 ＵＳＡ） 及び (ｂ)ＰＡＨＢＡＨ：（Ｌｅｖｅｒ、 Ｍ． （１９７２） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ４７、 ２７３、 Ｂｌａｋｅｎｅｙ、 Ａ．Ｂ． ＆ Ｍｕｔｔｏｎ、 Ｌ．Ｌ． （１９８０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、 ３１、 ８８９、 Ｈｅｎｒｙ、 Ｒ．Ｊ． （１９８４） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ、 ９０、 ３７）を含む。
【００６１】
「選択的スプライシング」は、複数のイソ型ポリペプチドを単一遺伝子から生成する方法を言い、該スプライシングは該遺伝子の全部ではないが、いくつかをプロセッシングする間、非連続エキソンをつなげる工程を含む。従って、特定のエキソンはいくつかの選択エキソンの1つに接続され、メッセンジャーＲＮＡを形成する。この選択的にスプライスされたｍＲＮＡは、いくつかの部分が共通で、いくつかの部分が異なる、ポリペプチド（スプライス変異体）を生産する。
【００６２】
「シグナル配列」という語は、細胞外への成熟型タンパクの分泌を促進するN末端部分アミノ酸配列である。細胞外タンパク質成熟型は、分泌過程の中で分裂するシグナル配列を欠いている。
【００６３】
「宿主細胞」という語は、ベクターを含み、発現構築物の複製、及び／又は転写又は、転写及び翻訳（発現）を支える細胞である。本発明で用いられる宿主細胞は、大腸菌のような原核生物の細胞又は、酵母菌、植物、昆虫、両生類又は哺乳類のような真核細胞である。一般的には、宿主細胞は糸状菌である。
【００６４】
「糸状菌」という語は、当該技術分野において糸状菌であると認められる任意の又は全ての糸状菌を意味する。好ましい、細菌は、アルペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、 ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）又は エメリセラ（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ）、ハイポクレア（Ｈｙｐｏｃｒｅａ）などそれらの別の有性型からなる群より選択される。無性の工業用菌類であるトリコデルマレーシは子嚢菌類のハイポクレアジェコリーナのクローンの誘導体であることは明らかである。Ｋｕｈｌｓら、ＰＮＡＳ（１９９６）９３：７７５５−７７６０参照。
【００６５】
「セロビオサッカライドという語は、例えば、セロビオースのように、２−８のグルコース単位を含み、β−１,４結合を有する少糖類を言う。
【００６６】
「セルラーゼ」の語は、セルロースポリマーをより短いセロオリゴ糖オリゴマー、セロビオース、及び／又はグルコースに分解する能力を有する酵素の分類をいう。エキソグルカナーゼ、エキソセロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ、及びグルコシダーゼのようなセルラーゼの多くの例は、細菌、植物及びバクテリアを含むセルロース分解能を有する有機体から得られる。
【００６７】
ハイポクレアジェコリーナ由来ＣＢＨ２は、グルコース化加水分解酵素ファミリー６（以下Ｃｅｌ６）のメンバーであり、特にハイポクレアジェコリーナにおいて確立されたグルコース化加水分解酵素ファミリー６の第一のメンバーである（以下Ｃｅｌ６Ａ）。グルコース化加水分解酵素ファミリー６はエンドグルカナーゼ及びセロビオハイドラーゼ／エキソグルカナーゼを含んでおり、ＣＢＨ２は後者である。したがって、ＣＢＨ２、ＣＢＨ２型タンパク質及びＣｅｌ６という語は、ここにおいて互換的に使用される。
【００６８】
「セルロース結合領域」という語は、ここにおいて、セルラーゼ又はそれらの誘導体のセルロース結合活性が含まれるセルロースのアミノ酸配列の部位又は酵素の領域を言う。セルロース結合領域は、一般的にセルロースとセルロース、セルロース誘導体またはそれらのその他の多糖類同等物を非共有結合にすることにより機能する。セルロース結合領域は触媒中心に起因する著しい触媒活性を示さない。他言すれば、セルロース活性部位は、触媒活性を有する構造成分とは区別されるセルロース酵素タンパク質の三次構造の構造成分である。セルロース結合部位とセルロース結合構成要素という語はここでは同義に使用される。
【００６９】
ここにおいて、「界面活性剤」という語は、表面活性特性を有すると当該技術分野で認められている任意の化合物をいう。従って、例えば、界面活性剤は、一般的に洗剤中入っている陰イオン性、陽イオン性及び非イオン性の界面活性剤から成る。陰イオン性界面活性剤は直鎖又は分岐のアルキル・ベンゼン・スルホン酸塩；直鎖又は分岐アルキル基又はアルケニル基を有するアルキル又はアルケニルエーテル硫酸塩；アルキル又はアルケニル硫酸塩；オレフィンスルフォン酸塩；及びアルカンスルフォン酸塩を含む。両性界面活性剤は、4級アンモニウム塩スルフォンサン塩、及びベタイン型両性界面活性剤を含む。そのような両性界面活性剤は同一分子内にプラス及びマイナスに帯電した部分を有している。非イオン性界面活性剤は高級脂肪酸アルカノールアミド又はそれらのアルキレン酸化物の付加物、脂肪酸グリセリンモノエステル及び同種のものだけでなく、ポリオキシアルキレンエーテルも同様に含まれる。
【００７０】
ここで用いる「セルロース含有繊維」とは、天然セルロース物質及び人工セルロース物質（例えば、ジュート、麻、ラミー、レーヨン及びライオセル）を含む綿または非綿含有セルロース含有物から作成されるいかなる縫合又は非縫合織物、毛糸又は繊維をいう。
【００７１】
ここで用いられる「綿を含む布地」とは、純粋な綿又は、綿織布、綿ニット、綿デニム、綿毛糸、原綿（綿花）及び同種のものを含んだ綿混合物をいう。
【００７２】
ここで用いる「ストーンウォシュ組成物」とは、セルロース含有織物のストーンウォシュに用いる製剤を言う。ストーンウォシュ組成物はセルロース含有布地を販売するに先立って加工するために用いられる、すなわち、製造過程において用いられる。対照的に、洗浄組成物は汚れた衣類の洗浄することを対象としており、工業的生産過程においては使用されない。
【００７３】
ここで用いられる「洗浄組成物」は、セルロースを含んだ汚れた布地の洗濯に対する洗浄手段に用いることを意図された混合物である。本発明の文脈中、そのような組成物生物は、セルラーゼ及び界面活性剤に加えて、さらに加水分解酵素、原材料、漂白剤、漂白活性剤、青味剤、蛍光染料、ケーキング抑制剤、マスキング剤、セルラーゼ活性剤、抗酸化剤、及び可溶化剤を含む。
【００７４】
ここで用いる「ｃｂｈ２遺伝子の発現の減少又は排除」とは、ｃｂｈ２遺伝子が遺伝子から削除されているために、組み換え宿主微生物によって発現できないこと；又は機能的なＣＢＨ２酵素が宿主の微生物によって生み出されないように、ｃｂｈ２遺伝子が修飾されていることのどちらかを意味する。
【００７５】
ここで用いる「変異体ｃｂｈ２遺伝子」又は「変異体ＣＢＨ２」は、それぞれ、ハイポクレアジェコリーナ由来のｃｂｈ２遺伝子の核酸シーケンスが、コーディングシーケンスを取り除き、追加し、および／または処理することによって変更されたか、発現されたタンパク質のアミノ酸配列がここに説明された発明と一致するように修正されていることを意味する。
【００７６】
ここで用いる、「精製する」という語は、一般に、細胞を含む遺伝子組換された核酸またはタンパク質を生化学的精製、および／またはカラムクロマトグラフィーにかけることを意味する。
【００７７】
ここで用いる「活性の」又は「生物学的に活性の」とは、ある特定のタンパク質と関係のある生物学的活性を言い、ここでは、互換的に使用される。例えば、プロテアーゼと関係する酵素活性はタンパク質分解であり、実際に、活性を有するプロテアーゼはタンパク質分解活性を有している。このことは、与えられたタンパク質の生物活性は一般に当業者によってそのタンパク質に帰属するどのような生物活性でも言うと理解される。
【００７８】
ここで用いる「濃縮する」という語は、ＣＢＨ２が入手できる、野生型又は自然発生する細菌性のセルラーゼ組成物に見られるＣＢＨ２濃度よりも相対的に高い濃度である。この濃縮する、高める、促進されたという語は、互換的に用いられる。
【００７９】
野生型細菌性セルラーゼ組成物は、天然に自生している細菌源によって生産されるのもであり、1以上のＢＧＬ、ＣＢＨ及びＥＧ成分を含んでいる。そしてこれらの成分のそれぞれは細菌源によって生産される比率で発見される。従ってＣＢＨを高めた組成物は他のセルラーゼ組成物（すなわち、ＥＧｓ、ベータグルコシダーゼ及び他のエンドグルカナーゼ）に対するＣＢＨの割合が高められた、変更された割合のＣＢＨを有する。
【００８０】
「単離された」又は「精製された」の語は、本来有している成分の少なくとも１つを除去した核酸又はアミノ酸を意味する。
【００８１】
従って、図示するように、自然発生的なセルラーゼシステムは、至適ｐＨにおけるイオンクロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、分子ふるい及び同種のものを含むものであり、出版された文献中に記載の分離技術により、大幅に精製された組成物に精製される。例えば、イオン交換クロマトグラフィー（たいていは陰イオン交換クロマトグラフィー）において、ｐＨ勾配又は塩勾配又はｐH及び塩の両者の勾配を用いた溶出により、セルラーゼ組成物を分離することは可能である。精製されたＣＢＨは、最終的にＣＢＨ濃度の高い溶液となる酵素溶液に添加される。可能であれば、他のセルラーゼをエンコードしている１以上の遺伝子の欠損部分と関連して、ＣＢＨをエンコードした遺伝子の過剰発現させる分子遺伝学的方法を用いて、微生物により生産されるＣＢＨの量を多くすることは可能である。
【００８２】
細菌のセルラーゼは１以上のＣＢＨ成分を含んでいる。この異なる成分は、イオン交換クロマトグラフィー及び同種のものを介して分離することが可能な、遺伝的に異なった等電点を有する。単一ＣＢＨ成分又はＣＢＨ成分の組み合わせのどちらか一方が、酵素溶液中に用いられる。
【００８３】
酵素溶液中に用いる場合、ＣＨＢ２の相同体又は変異体成分は遺伝的にバイオマスから可溶糖の放出を高めるのに十分な量が添加されている。追加された同族体または変異体のＣＢＨ２成分の量は、糖化される生物量のタイプに依存しており、熟練した者によって直ちに決定することができる。酵素溶液中に用いる、セルラーゼ組成物中の、相同又は変異ＣＢＨ２成分の重量パーセントは、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、又は好ましくは約２０重量パーセントから、好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、又は好ましくは約５０重量パーセントまでである。さらに、好ましい範囲は、約０．５から１５重量パーセント、約０．５から２０重量パーセント、約１から約１０重量パーセント、約１から約１５重量パーセント、約１から約２０重量パーセント、約１から約２５重量パーセント、約５から約２０重量パーセント、約５から約２５重量パーセント、約５から約３０重量パーセント、約５から約３５重量パーセント、約５から約４０重量パーセント、約５から約４５重量パーセント、約５から約５０重量パーセント、約１０から約２０重量パーセント、約１０から約２５重量パーセント、約１０から約３０重量パーセント、約１０から約３５重量パーセント、約１０から約４０重量パーセント、約１０から約４５重量パーセント、約１０から約５０重量パーセント、約１５から約６０重量パーセント、約１５から約６５重量パーセント、約１５から約７０重量パーセント、約１５から約７５重量パーセント、約１５から約８０重量パーセント、約１５から約８５重量パーセント、約１５から約９５重量パーセントである。しかしながら、（酵素溶液中に）用いられたときに、セルラーゼ組成物中の、あるＥＧタイプの成分に対する相同又は変異ＣＢＨ成分の重量パーセントは、好ましくは約１、好ましくは約５、好ましくは約１０、好ましくは約１５、又は、好ましくは約２０重量パーセントから、好ましくは約２５、好ましくは約３０、好ましくは約３５、好ましくは約４０、好ましくは４５、又は好ましくは約５０重量パーセントまでである。さらに、好ましい範囲は、約０．５から１５重量パーセント、約０−５から２０重量パーセント、約１から約１０重量パーセント、約１から約１５重量パーセント、約１から約２０重量パーセント、約１から約２５重量パーセント、約５から約２０重量パーセント、約５から約２５重量パーセント、約５から約３０重量パーセント、約５から約３５重量パーセント、約５から約４０重量パーセント、約５から約４５重量パーセント、約５から約５０重量パーセント、約１０から約２０重量パーセント、約１０から約２５重量パーセント、約１０から約３０重量パーセント、約１０から約３５重量パーセント、約１０から約４０重量パーセント、約１０から約４５重量パーセント、約１０から約５０重量パーセント、約１５から約２０重量パーセント、約１５から約２５重量パーセント、約１５から約３０重量パーセント、約１５から約３５重量パーセント、約１５から約４０重量パーセント、約１５から約４５重量パーセント、約１５から約５０重量パーセントである。
【００８４】
II．宿主有機体
糸状菌はすべて真菌類及び卵菌類に再分類される。糸状菌は、菌糸の伸長と偏好気性である炭素代謝による栄養生長を伴う、キチン、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖類から構成されている細胞壁を持っている栄養菌糸によって特徴付けられている。
【００８５】
本発明では、糸状菌親細胞はトリコデルマ種の細胞、例えば、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ、 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ、 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ、 Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｈａｒｚｉａｎｕｍ；Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．；Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ及び Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｇｒｉｓｅａを含むＨｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ．； C．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅを含むＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｓｐ．； Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．； Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｓｐ．、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．、及びＥｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｓｐであるがこれらに限られない。ここで用いる「トリコデルマ」又は「トリコデルマ種」という語は、以前にトリコデルマとして分類されているか、トリコデルマとして現在分類されているどのような細菌系統をも言う。
【００８６】
１の実施態様では、糸状菌親細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ細胞である。
【００８７】
（１０２）他の実施態様では、糸状菌親細胞は、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ細胞である。
【００８８】
III．セルラーゼ
セルラーゼは、当該技術分野において、セルロース（ベータ−１,４グルカン又はベータD−グルコシド結合）を加水分解し、グルコース、セロビオース、セロビオオリゴサッカライド及び同種のものを生産する酵素として知られている。上記のように、セルラーゼは伝統的に3つの主クラスに分類される：エンドグルカナーゼ（ＥＣ３−２−１−４）（“ＥＧ”）、エキソグルカナーゼ又はセロビオハイドラーゼ（ＥＣ３−２−１−９１）（“ＣＢＨ”）及びベータグルコシダーゼ（ＥＣ３−２−１−２１）（“ＢＧ”）（Kｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．、 ＴＩＢＴＥＣＨ ５、２５５−２６１、 １９８７； Ｓｃｈｕｌｅｎ、 １９８８）である。
【００８９】
ある特定の細菌は、エキソセロビオハイドラーゼ又はＣＢＨ型セルラーゼ及びベータグルコシダーゼ又はＢＧ型セルラーゼを含む複合的なセルラーゼシステムを生産する（Ｓｃｈｕｌｅｉｎ、 １９８８）。しかしながら、ときどきこれらのシステムは、ＣＢＨ型セルラーゼを含むが、或るときにはこれらのシステムはＣＢＨタイプセルラーゼを欠き、一般にほとんどまたは全くＣＢＨタイプセルラーゼを含まない細菌性セルラーゼを含む場合がある。加えて、ＥＧ成分及びＣＢＨ成分は、セルロースをより効果的に分解するために相乗的に相互作用をすることが示されている。例えば、Ｗｏｏｄ、（１９８５）を参照のこと。この異なった成分、すなわち、複合成分又は完全なセルラーゼシステムの中のさまざまなエンドグルカナーゼ及びエキソセロビオハイドラーゼは、等電点、分子量、グリコシル化度、基質特異性及び酵素活性パターンなどにおいて、一般的に異なる性質を有する。
【００９０】
エンドグルカナーゼ型セルラーゼは、セルロースの結晶化度の低い部分の内部ベータ−１,４グルコシド結合を加水分解し、エキソセロビオハイドラーゼ型セルラーゼは、セルロースの還元又は非還元末端からセロビオースを加水分解する。それは、エンドグルカナーゼ成分の作用はエキソエロビオハイドラーゼ成分によると認められる新しい鎖端を作ることによるエキソセロビオハイドラーゼの作用を大いに促進することができるということになる。さらに、ベータグルコシダーゼタイプのセルラーゼは、セロビオースのような糖質残基を含むグルコシドだけでなく、メチル−β−Dグルコシド及びp−ニトロフェニルグルコシドのようなアルキル及び／又はアリールβ−D−グルコシダーゼの加水分解に触媒作用をすることが示されている。このことは、微生物のための唯一の生産物として、グルコースを生産し、セロビオハイドラーゼ及びエンドグルカナーゼを抑制するセロビオースを減らすか又は排除する。
【００９１】
セルラーゼは、洗浄能力を高めるために、柔軟成分として、及び綿布製品の風合いを改善するために、洗剤組成物中に多くの使用例が見られる（Ｈｅｍｍｐｅｌ、 ＩＴＢ Ｄｙｅｉｎｇ／Ｐｒｉｎｔｉｎｇ／Ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ ３：５−１４、１９９１ ； Ｔｙｎｄａｌｌ、 Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔ ２４： ２３−２６、 １９９２ ； Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｔｅｘｔｉｌｅ Ｃｈｅｍｉｓｔ ａｎｄ Ｃｏｌｏｒｉｓｔ、 ２９：３７−４２、１９９７）。一方その作用機能は、本発明の一部ではないが、セルラーゼの柔軟性及び色の回復特性はセルラーゼ組成物中のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分に起因するものである。実証例として、米国特許Ｎｏs．５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、及び５，７７６，７５７がある。これらは、特定のアルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富なセルラーゼ組成物を含んでいる洗剤成分は、アルカリ性エンドグルカナーゼ成分が豊富でないセルラーゼ組成物と比較すると、処理した衣類に対して色の回復及び柔軟性の改善を与えることができる。更に、そのようなアルカリ性エンドグルカナーゼ成分を洗剤成分へ用いることは、洗剤組成物のｐＨ要件を補完していることを示している（すなわち、米国特許Ｎｏ．５，６４８，２６３、５，６９１，１７８、及び５，７７６，７５７に開示されているように、７．５から１０のアルカリ性のｐＨにおいて最大活性を示すことによる）。
【００９２】
セルラーゼ組成物は、綿を含む布製品を分解し、最終的にこの布製品において強度が低くなることが示唆され（米国特許Ｎｏ．４，８２２，５１６）、セルラーゼ組成物を市販の洗剤成分に使用することをためらう原因となっている。エンドヌクレアーゼ成分から成っているセルラーゼ組成物は、完全なセルラーゼシステムから成っている組成物に比べて綿を含んだ布に対して低い強度損失を示すことが示唆されている。
【００９３】
セルラーゼは、セルラーゼバイオマスをエタノールに分解すること（ここにおいて、セルラーゼがセルラースをグルコースに分解し、酵母又は他の微生物がさらにグルコースをエタノールに発酵させる）において、機械パルプ（Ｐｅｒｅ ｅｔ ａｌ．、 Ｉｎ Ｐｒｏｃ． Ｔａｐｐｉ Ｐｕｌｐｉｎｇ Ｃｏｎｆ．、 Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ、 ＴＮ、 ２７−３１、 ｐｐ． ６９３−６９６、 １９９６）の処理、飼料添加物（ＷＯ ９１／０４６７３）としての使用のために、そして粒子湿式粉砕において有益であることが明らかにされている。
【００９４】
大部分のＣＢＨｓ及びＥＧｓは、リンカーペプタイド（Ｓｕｕｒｎａｋｋｉ ｅｔ ａｌ．、 ２０００）による、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）から分離されたコアドメインを含む多重ドメイン構造を有する。コアドメインは、酵素がセルロースに結合することによりセルロースとＣＢＤの相互作用が起きる活性部位を含んでいる。（ｖａｎ Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．、 １９８６ ； Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７０： ５７５−５８１、１９８８）このＣＢＤｓは、結晶セルロースの加水分解に重量である。セロビオハイドラーゼが結晶セルラースを加水分解する能力は、ＣＢＤが存在しないときには明らかに減少することが示されている。（Ｌｉｎｄｅｒ ａｎｄ Ｔｅｅｒｉ、 J．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ５７： １５−２８、 １９９７）しかしながら、ＣＢＤｓの確かな役割及び作用機能はいまだ憶測の範疇にある。ＣＢＤは、セルロース表面での有効な酵素の濃度を増加することにより（Ｓｔａｈｌｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ． ９： ２８６−２９０、１９９１）、及び／又はセルロース表面から、１本鎖セルロースを分離することにより（Ｔｏｒｍｏ ｅｔ ａｌ．、 ＥＭＢＯ Ｊ． ｖｏｌ． １５、 Ｎｏ． ２１、 ｐｐ． ５７３９−５７５１、 １９９６）、酵素活性を高めるということが示唆されてきた。異なる基質上におけるセルラーゼドメインの効果に関する研究の多くは、パパインを用いた有効なタンパク質分解によりコアプロテインを生産することができたので（Ｔｏｍｍｅ ｅｔ ａｌ．、 １９８８）、セロビオハイドラーゼのコアプロテインを用いて実施することができた。数多くのセルラーゼは特定の文献に開示されており、（その例は以下のものに含まれる）：Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉの例：Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ、 Ｓ．ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、 １： ６９１−６９６、１９８３、 この文献はＣＢＨ１を開示する。Ｔｅｅｒｉ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ、 ５１： ４３−５２、１９８７、 この文献はＣＢＨ２を開示する。Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ以外の主由来のセルラーゼも説明されている、例えば、Ｏｏｉ ｅｔ ａｌ．、 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、 ｖｏｌ． １８、 Ｎｏ．１９、１９９０、この文献は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のエンドグルカナーゼＦ１−ＣＭＣのシークエンスをコードしているｃＤＮＡを開示している。Ｋａｗａｇｕｃｈｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ １７３ （２）： ２８７−８、１９９６、この文献はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ由来のベータグルコシダーゼ１をエンコードしているｃＤＮＡのクローニング及び配列決定を開示している。Ｓａｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ２７： ４３５−４３９、１９９５、この文献はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＩＦＯ ４３０８由来のエンドグルカナーゼＣＭＣａｓｅ−１をエンコードしているｃＤＮＡの塩基配列を開示している。Ｓａａｒｉｌａｈｔｉ ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ ９０： ９−１４、１９９０、この文献はＥｒｗｉｎｉａ ｃａｒｏｔｏｖａｒａ由来のエンドグルカナーゼを開示している。Ｓｐｉｌｌｉａｅｒｔ Ｒ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ． ２２４ （３）： ９２３−３０、１９９４この文献はＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕ由来の熱耐性ベータグルカナーゼをコードしているｂｇｌＡのクローニング及び配列決定を開示している。Ｈａｉｌｄｏｒｓｄｏｔｔｉｒ ｅｔ ａｌ．、 Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ４９ （３）： ２７７−８４、１９９８、 これはグリコシルハイドラーゼ ファミリー１２の熱耐性セルラーゼをエンコードしているＲｈｏｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｍａｒｉｎｕｓ 遺伝子のクローニング、配列決定及び過剰発現を開示している。熱ストレス条件下又は界面活性剤の存在中での性能の改善、高められた特異的活性、基質開裂パターンを変更すること、及び／又はｉｎ ｖｉｔｏｒにおける高レベルでの発現のような改善された性質を有する新規セルラーゼを確立し、特徴づけることが求められている。
【００９５】
さまざまな量のＣＢＨ型、ＥＧ型及びＢＧ型セルラーゼからなる新しく改良されたセルラーゼ組成物生物は：（１）高められた洗浄能力（柔軟成分として機能し、及び／又は綿布の風合いを改善する）を示す洗剤組成物中への使用（例えば、“ストーンウォッシュ”又は“生物研磨”）；（２）低品質なウッドパルプ又は他のバイオマスから糖を生産する組成物中への使用（例えば、バイオエタノール生産）及び／又は（３）食品組成物へ使用することにより重要な意味を持つ。
【００９６】
IV．分子生物学
1つの実施態様において、本発明は糸状菌の中で機能的するプロモーターのコントロール下で変異体のＣＢＨ２遺伝子の発現を提供するものである。これらについて本発明は、組み換え遺伝子の分野の定型技術を用いている。本発明に用いる一般的方法が開示されている基本テキストには、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、 Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （２ｎｄ ｅｄ． １９８９）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、 Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９０）及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、 ｅｄｓ．、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９４）がある。
【００９７】
相同BCH２遺伝子の確立方法
野生型ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の核酸配列を図１に示す。本発明は、１つの側面において、ここで述べるＣＢＨ２相同体をエンコードしている核酸分子を含む。この核酸はＤＮＡ分子である。
【００９８】
ＣＢＨ２をエンコードしているＤＮＡ配列を単離するために用いる方法は、相同なＤＮＡプローブを用いたｃＤＮＡ及び／又はゲノムライブラリーのスクリーニング及びＣＢＨ２に対する活性測定又は抗体を用いた発現のスクリーニングを含め、この技術分野においてよく知られているが、これらに限られない。これらの方法のいくつかは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、 ｅｔ ａｌ． 又はＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ、 Ｆ． Ａｕｓｕｂｅｌ、 ｅｔ ａｌ．、 ｅｄ． Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ． Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８７）（“Ａｕｓｕｂｅｌ”）に記載されている。
【００９９】
ＣＢＨ２核酸を変異させる方法
突然変異を導入することができる本技術分野で知られているどのような方法でも本発明に用いることができる。
【０１００】
本発明は変異体ＣＢＨ２の発現、精製及び／又は使用に関連する。これらの酵素はハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）由来のｃｂｈ２遺伝子を用い遺伝子組み換え法により調製される。精製又は無精製の発酵培地を用いる。
【０１０１】
ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）由来ｃｂｈ２の単離及びクローニングの後、本分野で知られている特定部位の突然変異誘発のような、いくつかの他の方法は、ＣＢＨ２発現変異体の中の置換したアミノ酸に相当する部分の転換、付加又は欠損をさせるために用いられる。さらに、特定部位の突然変異誘発及びＤＮＡレベルでタンパク質発現を変更するアミノ酸の取り込むような他の方法はＳａｍｂｒｏｏｋ、 ｅｔ ａｌ．及び Ａｕｓｕｂｅｌ、 ｅｔ ａｌ．の文献に記載されている。
【０１０２】
ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の変異体のアミノ酸配列をエンコードしているＤＮＡは本分野で知られている様々な方法により調製される。これらの方法は、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２をエンコードしている初期に調製されたＤＮＡの特定部位（又はオリゴヌクレオチド伝達）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発及びカセット突然変異誘発を含むがこれらに限定されない。
【０１０３】
特定部位突然変異誘発は、置換変異体を調製するのに好ましい方法である。この技術は本分野でよく知られている。（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １３： ４４３１―４４４３ （１９８５） 及びＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２: ４８８（１９８７）参照のこと。）簡単に言えば、ＤＮＡの特定部位の突然変異誘発を実行することにおいて、出発ＤＮＡは、最初にそのような出発ＤＮＡの1本鎖へと改変するように意図された突然変異をエンコードしているオリゴヌクレオチドを交雑することによって変更される。ハイブリダイゼーションの後、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーとして交雑オリゴヌクレオチドを用いて、出発ＤＮＡの１本鎖を鋳型として、完全な二本鎖を合成するのに用いられる。したがって、意図する変異をエンコードしたオリゴヌクレオチドはこの２本鎖ＤＮＡに取り込まれる。
【０１０４】
ＰＣＲ変異誘発は出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体すなわちH．ジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２を作るのにも適している。Ｈｉｇｕｃｈｉ、 ｉｎ ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、 ｐｐ．１７７−１８３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 １９９０）及び Ｖａｌｌｅｔｔｅ ｅｔ ａｌ．、 Ｎｕｃ. Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７: ７２３−７３３ （１９８９）参照のこと。 Ｃａｄｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、 ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、 Ｖｏｌ ２、２８−３３（１９９２）も例として参照のこと。簡単に言えば、少量のＤＮＡが開始物としてＰＣＲに用いられるとき、鋳型ＤＮＡの対応する領域からのシークエンスにおいてわずかしか異ならないプライマーは、相対的に大量の特定のＤＮＡ断片を作成するために用いられる。この特定のＤＮＡ断片は、プライマーがＤＮＡ断片から異なる部位のみ、鋳型ＤＮＡとは異なったものとなっている。
【０１０５】
変異体を調製するための方法、カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ ３４： ３１５−３２３ （１９８５）の技術に基づいている。この出発物質は、変異させようとする出発ポリペプチドＤＮＡを含むプラスミド（又は他のベクター）である。変異させようとする出発ＤＮＡ中のコドンは確認されている。特異な制限エンドヌクレアーゼサイトが認識された突然変異サイト各側の上になければならない。もし、そのような制限サイトがなければ、そのようなサイトは、出発ポリペプチド中の適切な位置に前記サイトを挿入するために、上記オリゴヌクレオチドを介した方法を用いて生産される。プラスミドＤＮＡは直線にするために、それらのサイトで切断される。制限サイト間のＤＮＡ配列をエンコードしているけれども意図する変異を含まないオリゴヌクレオチドの二本鎖は、離れて合成され、通常の技術を用いて一緒に交雑されるという一般的な方法を用いて合成される。この２本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットといわれる。このカセットは、直接的にこのプラスミドと結合することができるような、直線になったプラスミドの末端と互換性のある５’末端及び３’末端を有するように作られている。このプラスミドは今や変異ＤＮＡを含む。
【０１０６】
もう一つの方法として、又は加えて、変異体ＣＢＨ２をエンコードしている意図されたアミノ酸配列を決定することができ、そのようなアミノ変異をエンコードしているアミノ酸配列は合成的に生産することができる。
【０１０７】
そのようにして調製された変異体ＣＢＨ２は、たいていの場合セルラーゼの目的とする使用に応じて、さらに変更がなされる。そのような変更は、アミノ酸配列の更なる変更、非相同ポリペプチドへの融合、及び／又は共有結合修飾を含む。
【０１０８】
V． ｃｂｈ２核酸及びＣＢＨ２ポリペプチド
Ａ． 変異体ｃｂｈ型核酸
野生型ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｃｂｈ２の核酸配列を図１に示す。本発明はここで述べる変異体セルラーゼをエンコードする核酸分子を包含する。この核酸は、ＤＮＡ分子である。
【０１０９】
ｃｂｈ２の単離及びクローニングの後、特定部位の突然変異誘発などのこの分野で知られている他の方法は、発現したＣＢＨ２変異体中の置換されたアミノ酸に対応する転換、付加、又は欠損を作るために用いられる。さらに、特定部位の突然変異誘発及びＤＮＡレベルでタンパク質発現を変更するアミノ酸を取り込むような他の方法はＳａｍｂｒｏｏｋ、 ｅｔ ａｌ．及びＡｕｓｕｂｅｌ、ｅｔ ａｌ．の文献に記載されている。
【０１１０】
変異ＣＢＨ２をエンコードしているＤＮＡ配列がＤＮＡ構造の中へクローン化された後、このＤＮＡは微生物の形質転換に用いられる。本発明に関する変異ＣＢＨ２の発現の目的とするこの微生物には、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．由来の種を含めることが好ましいであろう。実際、本発明に関する変異ＣＢＨ２セルラーゼの調製のための好ましいモデルは、すくなくとも変異BCH２の一部又は全てをエンコードしているＤＮＡ断片からなるＤＮＡ構造を有する形質転換されたＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．宿主細胞である。このＤＮＡ構造は一般的にはプロモーターに機能的に付加される。この形質転換させた宿主細胞は意図したタンパク質を発現するような条件下で成長させられる。その後、目的のタンパク質生成物は実質的に均質に精製させる。
【０１１１】
しかしながら、変異ＣＢＨ２をエンコードする与えられたＤＮＡを最もよく発現する媒介はH．ジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）とは違うものであるということは事実であるようだ。従って、変異体ＣＢＨ２のための根源生物と、系統発生的な類似性を持つ形質転換宿主の中で、タンパク質を発現することはとても有利になるであろう。別の実施態様において、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒが発現媒体として用いられた。 Ａ．ｎｉｇｅｒを用いた形質転換技術についてはＷＯ ９８／３１８２１参照のこと。この記載は参照により本発明に組み込まれる。
【０１１２】
従って、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ発現システムは、説明に役立つという目的だけのために、そして本発明の変異体ＣＢＨ２を表現するための1つのオプションとして提供される。当業者においては、しかしながら、変異体ＣＢＨ２の根源は、最適な表現宿主を決定することにおいて考慮されるべきであるということが適切であると考えうるならば、変異ＣＢＨ２をエンコードしているＤＮＡ発現を含むだろう。さらに、当業者は、入手可能なツールを利用しているルーチン的な手法を通して特定の遺伝子のために最もよい表現システムを選ぶことが可能になるであろう。
【０１１３】
B． 変異体ＣＢＨ２ポリペプチド
野生型ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２のアミノ酸配列を図1に示す。変異ＣＢＨ２ポリペプチドは、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）（配列番号２）由来ＣＢＨ２のＶ９４、Ｐ９８、Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、Ｌ１４４、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｓ２１０、Ｉ２１２、Ｔ２１４、Ｌ２１５、Ｇ２３１、Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｖ３２３、Ｎ３２５、Ｉ３３３、Ｇ３３４、Ｓ３４３、Ｔ３４９、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３８６、Ｆ４１１、Ｓ４１３、Ａ４１６、Ｑ４２６及び／又はＡ４２９残基の1以上の対応する部位の置換又は欠損を含む。
【０１１４】
1つの側面において、本発明は（１）９２乃至１００、（２）１１５乃至１２３、（３）１４０乃至１５５、（４）１６０乃至１８０、（５）１９８乃至２１８、（６）２２８乃至２３５、（７）２４０乃至２６０、（８）２７５乃至２９５、（９）３０５乃至３１８、（１０）３２２乃至３３５、（１１）３４０乃至３５０、（１２）３６０乃至３７０、（１３）３７８乃至３９０及び（１４）４１０乃至４３０から成る群より選択される領域において少なくとも１つのアミノ酸が置換又は欠失されているＣｅｌ６Ａファミリーの単離されたＣＢＨ２酵素に関係する。他の側面において、本発明は、（１）９２乃至１００、（２）１１５乃至１２３、（３）１４０乃至１５５、（４）１６０乃至１８０、（５）１９８乃至２１８、（６）２２８乃至２３５、（７）２４０乃至２６０、（８）２７５乃至２９５、（９）３０５乃至３１８、（１０）３２２乃至３３５、（１１）３４０乃至３５０、（１２）３６０乃至３７０、（１３）３７８乃至３９０及び（１４）４１０乃至４３０から成る群より選択される領域において少なくとも１つのアミノ酸が置換されているＣｅｌ６Ａファミリーの単離されたＣＢＨ２酵素に関係する。
【０１１５】
本発明の変異ＣＢＨ２’ｓはＣＢＨ２前駆体のアミノ酸配列由来のアミノ酸配列を有する。この変異ＣＢＨ２のアミノ酸配列は、この前駆体アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の置換、欠損、又は挿入によって、前駆体アミノ酸配列とは異なっている。好ましい実施態様においては、前駆体ＣＢＨ２はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ２）である。ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ２）の成熟アミノ酸配列を図１に示す。従って、本発明はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ２）中に明らかに見られる残基と同じ位置にアミノ酸残基を含むＣＢＨ２変異体に関するものである。ＣＢＨ２相同体の残基（アミノ酸）は、もしそれが、相同であるか（すなわち、全体の１次又は三次構造の位置について対応が見られる）、または特定の残基又はハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ２）中の残基の一部と機能的に類似している（すなわち、化学的又は構造的に結合、同じか似通った反応又は相互作用する機能的能力を有すること）ならば、ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａＣＢＨ２）の残基と等しいことになる。ここで用いるように、番号を付すことは、図1に示すように成熟ＣＢＨ２アミノ酸配列のものに対応させることを意図している。ＣＢＨ２前駆体内の位置に加えて、前駆体ＣＢＨ２中の前駆体ＣＢＨ２が熱ストレス下に置かれたときの不安定さに関係するアミノ酸の位置に対応している特定の残基は、ここでは置換又は欠損として確認されている。このアミノ酸の位置番号（例えば＋５１）は、図１に示した成熟ハイポクレアジェコリーナＣＢＨ２（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａＣＢＨ２）の配列に割り当てられた番号を言う。
【０１１６】
相同性を同定するためのアミノ酸配列の位置合わせは、好ましくは「配列比較アルゴリズム」を用いることで同定することができる。比較のための配列の最適な位置合わせは、例えばＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ、 Ａｄｖ． Ａｐｐｌ． Ｍａｔｈ． ２： ４８２ （１９８１）の局所的相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８： ４４３ （１９７０）の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５： ２４４４ （１９８８）の類似性の調査法、それらアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＧＡＰ、 ＢＥＳＴＦＩＴ、 ＦＡＳＴＡ、 及びＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、目視検査又はカナダのケミカルコンピュータグループＭｏｎｔｒｅａｌによるＭＯＥによって実施することができる。
【０１１７】
配列類似性を特定するのに適切であるアルゴリズムの１つの例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２１５： ４０３−４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターから公的に利用できる。（<ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ>）そのアルゴリズムは、データベース中の長さＷのワードと共に並べた場合にポジティブ評価の閾値Ｔに適合し、または充足させる照会配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、高得点配列対（ｈｉｇｈ ｓｃｏｒｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐａｉｒｓ（ＨＳＰｓ））をまず同定することを含む。それら最初の隣接ワードのヒットは、それらを含む長いＨＳＰｓを見出すための開始点として働く。累積整列得点（ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｃｏｒｅ）ができるだけ増えるように、比較する２つの配列のそれぞれに沿って両方向にワードヒットを展開する。ワードヒットの延長は、累積整列得点が最大達成値より定めた定数Ｘから遠ざかる、あるいは累積得点がゼロまたはそれ以下に下がる、あるいは、または何れかの配列の末端に達する場合に止まる。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速さを特定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、初期設定として、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２ スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ＆ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、 Ｐｒｏｇ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９： １０９１５ （１９８９））整列（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、および両鎖の比較を用いる。
【０１１８】
さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計解析を実施する（例えばＫａｒｌｉｎ ＆ Ａｌｔｓｃｈｕｌ、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０： ５８７３−５７８７ （１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴ アルゴリズムによってもたらされる類似性の１つの指標は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する最小総確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ）（Ｐ（Ｎ））である。例えば、評価核酸とセルラーゼ核酸との比較における最小総確率が、約０．１より小さく、より好ましくは約０．０１ より小さく、さらに最も好ましくは約０．００１ よりも小さい場合に、最も好ましくは0．００１よりも小さい場合に、ある核酸が本発明のセルラーゼ核酸に類似するとみなされる。
【０１１９】
本発明の目的のために、相同性の程度はＧＣＧプログラムパッケージ（Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ ８、 Ａｕｇｕｓｔ １９９４、 Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、 Ｗｉｓ．、 ＵＳＡ ５３７１１） （Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ、 Ｓ．Ｂ． 及びＷｕｎｓｃｈ、 Ｃ． Ｄ．、 （１９７０）、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、４８、 ４４３−４５））において提供されている、５．０のＧＡＰクリエーションペナルティー及び０．３のＧＡＰエクステンションペナルティーのポリヌクレオチドの比較のために設定されているＧＡＰ等の当分野で知られているコンピュータープログラムを用いることが好ましい。
【０１２０】
配列検索は通常、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＤＮＡ配列及び他の公的データベースの核酸配列に対する所与の核酸配列を評価する、ＢＬＡＳＴＮプログラムを用いて行う。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質配列及び他の公的データベースのアミノ酸配列に対する全てのリーディングフレームにおける置換を有する核酸配列を検索するのに適している。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸは、１１．０のオープンギャップペナルティー及び１．０のエクステンドギャップペナルティーの規定パラメーター及びＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックス（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．、１９９７）を用いて行われる。
【０１２１】
ＣＢＨ２セルラーゼの安定性を修正するための追加の特定方法は下に提供される。
【０１２２】
（１）主鎖伸張（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）のエントロピーを低くすることは酵素に安定性をもたらす。例えば、プロリン残基の導入は伸張（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）のエントロピーを低くすることによってタンパク質を安定にする。（Ｗａｔａｎａｂｅ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ． Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２６： ２７７−２８３ （１９９４）参照のこと。）同様に、グリシン残基はβ−炭素を有しておらず、それから、かなり、多くの他の残基より大きな中心立体配座の自由を持っている。好ましくはアラニンとのグリシンの置き換えは、伸張（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ）のエントロピーを減らし、安定性を改善する。（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、ｅｔ ａｌ．、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８４； ６６６３−６６６７（１９８７）参照のこと。）加えて、外部ループの短縮により、安定性を改善することが可能である。超好熱菌が生産したタンパク質はそれらの中温の相同体より短い外部ループを持っていることが観察されている。（Ｒｕｓｓｅｌ、 ｅｔ ａｌ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６： ３７０−３７４ （１９９５）参照のこと）ジスルフィド結合の導入は、また、互いに関連して別個の三次構造を安定させるために効果的である。従って、既存のシステインにアクセス可能な残基のシステインの導入またはジスルフィド結合を成形することができるシステインの対の導入はＣＢＨ２変異体の安定性を変更するであろう。
【０１２３】
（２）側鎖疎水性を増大させることによって内部腔を減少させることは酵素の安定性を変更する。 内部腔の数及び容量を減らすことは疎水相互作用を最大化し、詰込み欠損（ｐａｃｋｉｎｇ ｄｅｆｅｃｔｓ）を減らすことによって酵素の安定性を増やす。（Ｍａｔｔｈｅｗｓ、 Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６２： １３９−１６０ （１９９３）； Ｂｕｒｌｅｙ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９： ２３−２９ （１９８５）； Ｚｕｂｅｒ、 Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｃｈｅｍ． ２９： １７１−１７９ （１９８８）； Ｋｅｌｌｉｓ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｎａｔｕｒｅ ３３３： ７８４−７８６ （１９８８）参照のこと）高温菌からの多重結合のタンパク質がしばしばそれらの中温の対応するものより大きな表面相補性によってより多くの疎水性のサブ・ユニット・インタフェースを持っていることは知られている。（Ｒｕｓｓｅｌ、 ｅｔ ａｌ．上記）この原理は、単遺伝子性のタンパク質の領域インタフェースに適用可能であると信じられている。 疎水性を増大させることによって安定性を改善することができる特定の置換はアルギニンへのリジン、アラニンへのセリン、およびアラニンへのトレオニンを含む。（Ｒｕｓｓｅｌ、 ｅｔ ａｌ．上記）アラニンまたはプロリンへの置換による変更は、結果としてくぼみを縮小し、内部を充填し、疎水性を増大すると伴に側鎖サイズを増やす。くぼみのサイズを減らし、疎水性を高め、ＣＢＨ２の領域の間のインタフェースの相補性を改善するための置換は酵素の安定性を改善する。特に、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、およびイソロイシンから選ばれた異なる残基を持つ、これらの位置の特定の残基の変更は性能を改善する。
【０１２４】
（３）剛性二次構造内（すなわち、α−へリックス及びβ−ターン）の電荷を平衡にすることは安定性を改善する。例えば、アスパラギン酸の上の負電荷によってへリックスN−末端の上の部分的な陽電荷を中和することは構造の安定性を改善する。（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５５： １７８−１８３ （１９９２）参照のこと） 同様に、陽電荷によってへリックスＣ末端の上の部分的な負電荷を中和することは安定性を改善する。β−ターンにおけるペプチドＮ末端との相互作用から陽電荷を取り除くことは、三次構造安定性を与えることにおいて効果的であるはずである。非正帯電残基との置換は、好ましくない陽電荷を、ターン内にあるアミド窒素との相互作用から取り除くことができた。
【０１２５】
（４）三次構造を安定させるために塩橋と水素結合を導入することは効果的である。例えばアスパラギン酸またはグルタミン酸とリジン、アルギニンまたはヒスチジンの間のイオン対相互作用は強い安定効果を導入し、その結果生じる耐熱性の改善を伴う、違う三次構造要素を付加するのに用いられる。さらに、チャージされた残基／チャージされなかった残基水素結合の数と水素結合の数の増加は耐熱性を改善することができる。（Ｔａｎｎｅｒ、 ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５： ２５９７−２６０９（１９９６）を参照のこと）アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、またはグルタミンの置換はバックボーンアミド（ａ ｂａｃｋｂｏｎｅ ａｍｉｄｅ）に水素結合を導入することができる。アルギニンの置換は塩橋を改善し、水素結合をバックボーンカルボニル（ａ ｂａｃｋｂｏｎｅ ｃａｒｂｏｎｙｌ）に導入することができる。
【０１２６】
（５）不耐熱性残基を減らすことは、一般的に熱安定性を増す。例えば、アスパラギンとグルタミンはアミド分解に影響され易く、システインは高温で酸化に影響され易い。感受性の高い位置にあるこれらの残基の数を減らすことは結果として耐熱性を改善する。（Ｒｕｓｓｅｌ、 ｅｔ ａｌ．上記）グルタミンまたはシステイン以外のどのような残基による置換または欠失でも不耐熱性残基を減らすことによって安定性を増大させることができる。
【０１２７】
（６）与えられたリガンドの結合を安定化又は不安定化することは、ＣＢＨ２変異体へ安定性を修正する。例えば、この発明のＣＢＨ２変異体が使われる基質の成分はＣＢＨ２変異体の特定の界面活性物質／熱感受性部位に結合する。置換によりこの部位を修正することによって、この変異体への成分の結合は強化されるか、減少するかもしれない。例えば、ＣＢＨ２の結合凹部の中の非芳香族残基は、セルロース基質の相互作用が、ＣＢＨ２変異体の安定性を増大させて、好ましくはベンジル輪と相互作用する芳香族側鎖の安定化を導入するためにフェニルアラニンまたはチロシンによって置換される。
【０１２８】
（７）任意の界面活性物質／熱感受性リガンドの電気陰性度を増大させることは界面活性物質または温熱ストレス下で安定性を改善する。例えば、フェニルアラニンまたはチロシンをの置換は、溶媒から遮へい性を改善することによりD（アスパラギン酸塩）残基の電気陰性度を増大させることができる。
【０１２９】
VI． 組み換えＣＢＨ２変異体の発現
必要とされるCBH２発現のための方法を特定することは意図しないけれども、変異体のCBH２を表現するためには本発明に係る方法においては使用細胞に依存する。
【０１３０】
本発明は変異体CBHをエンコードしている核酸配列からなる発現ベクターであって、形質を変換、転換、又は移入された宿主細胞を提供する。温度、ｐＨのような培養条件は形質変換、形質転換又は形質移入していない親宿主細胞に対して用いているものと同じであり、それらは本技術分野でよく知られている。
【０１３１】
1のアプローチにおいて、糸状菌細胞又は酵母細胞は、宿主細胞株の中で機能する、つまりこの細胞株の中で発現されるCBHをエンコードするＤＮＡセグメントに結合可能であるプロモーター又は、生物学的活性を有するプロモーター断片又は1つ以上の（例えば、一続きの）エンハンサーにより形質転換される。
【０１３２】
Ａ． 核酸構成物／発現ベクター
ＣＢＨ２をエンコードする天然のまたは合成のポリヌクレオチド断片（「ＣＢＨ２エンコード核酸配列」）は、糸状菌又は酵母菌細胞に導入することが可能で、複製することができる非相同核酸構成物又はベクターに組み込まれる。ここで開示しているこのベクターと方法は、ＣＢＨ２を発現する宿主細胞に用いることに適している。それが、導入される細胞の中で複製され、育成できる限り、どのようなベクターでも使用することができる。数多くの適したベクター及びプロモーターは本技術分野において知られており、商業的に入手可能である。クローニング及び発現ベクターはＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、 １９８９、 Ａｕｓｕｂｅｌ ＦＭ ｅｔ ａｌ．、１９８９、及びＳｔｒａｔｈｅｒｎ ｅｔ ａｌ．、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｙｅａｓｔ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、１９８１において開示されており、それらは明示的に参照によってここに組み込まれる。細菌（糸状菌）に対する適切な発現ベクターは、ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｎｄｅｌ、 Ｃ． Ａ． Ｍ． Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｉｎ： Ｂｅｎｎｅｔｔ、 Ｊ． Ｗ． ａｎｄ Ｌａｓｕｒｅ、 Ｌ． Ｌ．（ｅｄｓ．） Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｆｕｎｇｉ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 pp． ３９６−４２８に記載されている。適切なＤＮＡシーケンスは、さまざまな処置によって、プラスミドまたはベクター（「ベクター」としてここに集合的に参照される）に挿入される。一般的に、ＤＮＡシーケンスは標準的な操作法によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。そのような処置と関連したサブクローニング処置は、当業者の知識の範囲の中にあると考えられる。
【０１３３】
変異体ＣＢＨ２のためにコーディング配列から成っている組換型糸状菌は、糸状菌の選択された株の細胞の中に変異体ＣＢＨ２コーディング配列を含む異種の核酸構成物を導入することによって作り出される。
【０１３４】
一旦変異体ｃｂｈ２核酸配列の好ましい形質が得られると、それは様々な方法により変更される。この配列が非コーディングフランキング領域を含む所で、フランキング領域は切除、変異誘発などを受ける。従って、転位、転換、欠失、および挿入が自然に存在する配列上で起こる。
【０１３５】
選ばれた変異体のｃｂｈ２コーディングシーケンスは、よく知られた組換技術に従って適当なベクターに挿入され、ＣＢＨ２発現が可能な糸状菌を変換するために使われる。遺伝コード固有の縮退のため、実質的に同じかまたは機能的に同じアミノ酸配列をエンコードする他の核酸配列は、変異体のＣＢＨ２をクローンし、発現するために使われる。従って、コード領域の中のそのような置換が本発明によってカバーされた配列変異体に入ることは高く評価される。いくつかの及び全てのこれらの配列変異体は、親CBH２エンコーディング核酸配列についてここに記述されるのと同じ方法で利用することができる。
【０１３６】
上で説明したように、本発明はまた変異体のＣＢＨ２-エンコーディング核酸配列の1以上から成る組換型の核酸構成物を含む。この構成物は本発明の配列へ前に向けて又は逆向きに挿入されているプラスミド又はウイルスのベクターのようなベクターから成る。
【０１３７】
非相同核酸構成物は変異体ｃｂｈ２コード配列を：（ｉ）分離して；（ｉｉ）融合タンパク質又はｃｂｈ２コード配列が優性形質コード配列である所のシグナルペプチドコード配列のような付加的コード配列との組み合わせで；（ｉｉｉ）適切な宿主中のコーディング配列の発現のために効果的なプロモーター及びターミネーターエレメント、または５’及び／又は３’の非翻訳領域のような、イントロン及び制御エレメントのような非コード配列との組み合わせで、及び／又は（ｉｖ）ｃｂｈ２コーディング配列が非相同遺伝子であるベクターまたは宿主の環境の中に含まれる。
【０１３８】
本発明の1の態様において、非相同核酸構成物は確立された糸状菌及び酵母菌の系統が好む状態で、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて変異体ＣＢＨ２エンコーディング核酸配列を細胞内へ運搬するのに用いる。長期の変異体ＣＢＨ２の生産の間の安定した発現が好まれる。安定した形質転換体を生成する効果的などのような方法でも、本発明を行うことにおいて使われることになる。
【０１３９】
適切なベクターは典型的には、選択可能マーカーをエンコードしている核酸配列、挿入部位及び適した制御エレメント、すなわち、プロモーター及びターミネーター配列を有している。このベクターは、例えば、イントロン及び制御エレメントのような非コード配列を含む調節領域、すなわち、コード配列と操作可能に結合する宿主細胞（及び／又は修正された可溶性のタンパク質抗原コード配列が正常に表現されないベクター又は宿主細胞環境）内でコード配列を発現するのに効果的なプロモーター及びターミネーターエレメント又は、５’及び／又は３’非翻訳領域からなる。数多くの適切なベクター及びプロモーターは本技術分野においてよく知られており、多くは商業的に入手可能である。そして／又は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、ｅｔ ａｌ．、（上記）に記載されている。
【０１４０】
典型的なプロモーターは構成性プロモーター及び誘発性プロモーターの両方を含み、その例は、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、説明される（ＣｌｏｎＴｅｃｈとＢＡＳＦ）のようにｔｅｔ−ｏｎまたはｔｅｔ−ｏｆｆシステムの中にｔｅｔ応答エレメント（TRE）を含んでいるプロモーター、ベータアクチンプロモーター、および特定の金属塩の添加によって上向き調節されるメタロチオニンプロモーターを含む。プロモーター配列は、表現目的に対して特定の糸状菌によって認識されるＤＮＡ配列である。それは変異体ＣＢＨ２ポリペプチドをエンコードしているＤＮＡ配列と操作可能に結び付く。そのような結合は、開示された発現ベクターの中で変異体ＣＢＨ２ポリペプチドをエンコードしているＤＮＡシーケンスの開始コドンに対するプロモーターの位置合わせを含む。このプロモーター配列は、変異体ＣＢＨ２ポリペプチドの表現を伝達する転写と翻訳制御シーケンスを含んでいる。このプロモーターの例として、アスペルギウスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）Ａ．アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）又は Ａ．オリゼア（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）由来のグルコアミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、又はアルファ−グルコシダーゼをエンコードしている遺伝子；Ａ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）のｇｐｄＡ又はｔｒｐＣ遺伝子；ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）のｃｂｈ１又はｔｒｐ１遺伝子；Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）又はリゾムコアミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼエンコード遺伝子；H．ジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）（Ｔ．レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ））のｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、 ｅｇｌ２、又は他のセルラーゼをエンコードしている遺伝子を含む。
【０１４１】
適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存し、異なる宿主に対する適切なマーカーは本技術分野においてよく知られている。典型的な選択マーカーの遺伝子は、Ａ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）又は Ｔ．レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のａｒｇＢ Ａ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のａｍｄＳ、ニューロスポラクラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）あるいはＴ．レーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）由来のｐｙｒ４、アスペルギウスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）又は Ａ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のｐｙｒＧを含む。さらに典型的な選択マーカーは、非相同核酸構成物の中でｔｒｐ−、ｐｙｒ−、ｌｅｕ−および同類のものなどの突然変異系統の変換に使われた非相同核酸構成物に含まれているｔｒｐｃ、ｔｒｐ１、ｏｌｉＣ３１、ｎｉａＤ又はｌｅｕ２を含むけれどそれらに限定されない。
【０１４２】
そのような選択マーカーは、糸状菌によって通常新陳代謝させられない代謝産物を利用する能力を転換体に与える。例えば、アセトアミダーゼ酵素をエンコードしているハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）由来のａｍｄＳ遺伝子は転換体細胞が窒素源としてアセトアミドを利用することを可能にする。この選択マーカー（例えば、ｐｙｒＧ）は、選択最小培地の上で成長する栄養要求変異体系統の能力を復元し、あるいは、選択マーカー（例えばｏｌｉｃ３１）は、抑制薬または抗生物質があると成長する能力を転換体に与えるかもしれない。
【０１４３】
配列をコードしている選択マーカーは、本分野で一般的に用いられている方法を用いて任意の適切なプラスミド内へクローンされる。典型的なプラスミドはｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＲＡＸ及びｐＵＣ１００を含む。このｐＲＡＸプラスミドはＡ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）内でも複製することができるＡ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）由来のＡＭＡ１配列を含んでいる。
【０１４４】
本発明の実行に関しては、違った形で示されない限り、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の分野において知られている従来の技術を使用する。そのような技術は文献において十分に説明される。例えば Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．、 １９８９； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、 Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、 １９８７； Ａｕｓｕｂｅｌ、 ｅｔ ａｌ．、 １９９３； 及びＣｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、 1991を参照のこと。
【０１４５】
B．ＣＢＨ２生産のための宿主細胞と培養条件
（i）糸状菌
本発明は、結果的に対応する形質変換されていない親真菌との関連において、ＣＢＨ２変異体の生産又は発現に効果的な方法で変換され、選択され、培養される細胞からなる糸状菌を提供する。
【０１４６】
変異体ＣＢＨ２を発現させ及び／又は変換させる親糸状菌種の例は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）を含むがそれらに限られない。例えば、トリコデル マレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）、トリコデルマ ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）；ペニシリウム種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ．）、フミコーラ インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）を含むフミコーラ種（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｓｐ．）、アスペルギウス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｓｐ．）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ．）ハイポクレア属（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｓｐ．）及びエメリセラ属（Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ ｓｐ．）である。
【０１４７】
ＣＢＨ２を発現している細胞は、通常、親糸状菌の培養に用いる条件のもとで培養される。一般的に細胞はＰｏｕｒｑｕｉｅ、 Ｊ． ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ、 ｅｄｓ． Ａｕｂｅｒｔ、 Ｊ． Ｐ． ｅｔ ａｌ．、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 ｐｐ． ７１−８６、 １９８８ 及びＯｍｅｎ、 Ｍ． ｅｔ ａｌ．、 Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６３： １２９８−１３０６、１９９７において開示されているような生理的塩と栄養素を含む標準培地内で培養される。培養条件もまたほぼ決まっており、培養はＣＢＨ２表現が要求されるレベルが達成するまで、振盪培養機または発酵槽内において２８℃で培養される。
【０１４８】
与えられた糸状菌のための好ましい培養条件は科学文献において、および／または米国菌培養収集所（ＡＴＣＣ；「ｈｔｔｐ：／／www．Atcc．org／」）などの真菌についての情報源に見出される。細菌の発育が確立された後に、細胞は、変異体のＣＢＨ２の表現を引き起こし又は可能にするのに効果的な条件下に置かれる。
【０１４９】
ＣＢＨ２コード配列が誘導性のプロモーターの制御下にある場合、誘発因子、例えば、糖、金属塩または抗生物質は、ＣＢＨ２表現を引き起こすために効果的な濃縮で培地に添加される。
【０１５０】
1の実施態様においては、この株はタンパク質の過剰発現に有用であるアスペルギルスニガーを含む。例えば、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の1種であるアワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）ｄｇｒ２４６は、多量の分泌性セルラーゼを分泌することが知られている。ＧＣＤＡＰ３、ＧＣＤＡＰ４およびＧＡＰ３−４のような Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）の1種であるアワモリ（ａｗａｍｏｒｉ）の他の系統は、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ． （Ｗａｒｄ、 Ｍ、 Ｗｉｌｓｏｎ、 L．J． ａｎｄ Ｋｏｄａｍａ、 Ｋ．Ｈ．、 １９９３、 Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３９： ７３８−７４３）で知られている。
【０１５１】
（１６６）他の実施態様においては、この系統はタンパク質の過剰発現に有用であるトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）からなる。例えば、Ｓｈｅｉｒ． Ｎｅｉｓｓ、 ｅｔ ａｌ．、 Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０： ４６−５３ （１９８４）に記載のＲＬ−Ｐ３７は多量のセルラーゼ酵素を分泌することが知られている。ＲＬ−Ｐ３７と機能的に同等な種はトリコデルマレーシ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ）系統ＲＵＴ―Ｃ３０（ＡＴＣＣ Ｎｏ．５６７６５）及びＱＭ９４１４（ＡＴＣＣ Ｎｏ．２６９２１）を含む。これらの系統もまた、変異体のＣＢＨ２を過剰発現することについて有用であるということが予測される。
【０１５２】
潜在的に有害なネイティブセルロース分解活性を欠いた変異体ＣＢＨ２を得ることが要求される場合、変異体ＣＢＨ２をエンコードしているＤＮＡ断片を含むＤＮＡ構成物又はプラスミドの導入に先駆けて1つ以上のセルラーゼ遺伝子を削除させたトリコデルマ宿主細胞を得ることは有用である。そのような系統は、米国特許Ｎｏ．５、２４６、８５３及びＷＯ ９２／０６２０９に開示されている方法により調製される。これらの内容は引用によりここに組み込まれる。１以上のセルラーゼ遺伝子を欠いている宿主微生物の中で変異体ＣＢＨ２セルラーゼを発現することによって、識別とその後の精製処置は簡素化することができる。クローン技術で生産されたトリコデルマ種からのどのような遺伝子、例えば、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、及びｅｇｌ２遺伝子だけでなく、それらをエンコードしているＥＧＩＩＩ及び／又はＥＧＶタンパク質（米国特許Ｎｏ．５、４７５、１０１及びＷＯ ９４／２８１１７をそれぞれ参照のこと）でも欠失させることができる。
【０１５３】
遺伝子欠失は、欠失又は崩壊させるために要求される遺伝子の形を本技術分野で知られている方法によりプラスミドに挿入することによって行われる。この欠失プラスミドは、適切な制限酵素サイト、即ち要求される遺伝子コード領域の内部で切断され、遺伝子コーディングシーケンスまたはその部分は選択マーカーと取り替えられる。欠失又は崩壊される遺伝子の位置からのフランキングＤＮＡ配列は、好ましくは約０．５から２．０ｋｂであり、選択マーカー遺伝子のどちらかの側にある。適切な欠失プラスミドは、欠失された遺伝子を含み、フランキングＤＮＡシーケンスを含む断片と、選択可能なマーカー遺伝子を1つの線形の断片として取り除かれることを可能にするために、その中に存在するユニークな制限酵素サイトを持つ。
【０１５４】
選択マーカーは、形質転換された微生物の検出を可能にするように選ばれなければならない。選ばれた微生物の中で発現するどのような選択マーカー遺伝子でも適切である。例えば、アスペルギウス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）用いるときには、選択マーカーは転換体の中の選択マーカーの存在がその特性に有意に影響しないように選ばれる。そのような選択マーカーは、分析可能な生産物をエンコードする遺伝子である。例えば、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）遺伝子の機能的なコピーは宿主系統の中の欠失がその栄養素要求株の表現型を結果として生じているならば使われうる。同様に、選択マーカーはトリコデルマ種についても存在している。
【０１５５】
１の実施態様においては、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のｐｙｒＧ−誘導株は実際に、それは転換のために選択マーカーを提供する機能的なｐｙｒＧ−遺伝子によって変換される。ｐｙｒＧ−誘導株はフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に抵抗力があるアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）系統の選択によって得られる。このｐｙｒＧ遺伝子はウリジンの生合成のために必要とされている酵素であるオロチジン−５‘−モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードしている。インタクトｐｙｒＧ遺伝子の株はウリジンを欠く培地中で成長するけれども、フルオロオロチン酸に敏感である。ＦＯＡ耐性の選択により、機能的なオロチジンモノリン酸塩脱炭酸酵素を欠き、成長のためにウリジンを必要としているｐｙｒＧ誘導株を選ぶことは可能である。このＦＯＡ選択を用いて、機能的なオロチンピロフォスフォリボシル（ｏｒｔａｔｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）転移酵素を欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をエンコードしている遺伝子の機能的なコピーによってこれらの細胞を形質変換することは可能である（Ｂｅｒｇｅｓ ＆ Ｂａｒｒｅａｕ、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９： ３５９−３６５ （１９９１）、及びｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔｅ ｅｔ ａｌ．、（１９８６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｙｒＧ ｇｅｎｅ． Mol． Gen． Genet． ２０６： ７１−７５）。誘導株の選択は、上で述べたＦＯＡ耐性技術を用いて容易に行うことができ、実際、ｐｙｒＧ遺伝子を選択マーカーとして用いることが好ましい。
【０１５６】
第二の実施態様においては、ハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ． （Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））の ｐｙｒ４−誘導株は、実際に、転換のために選択マーカーを提供する機能的なｐｙｒ４遺伝子を用いて形質転換される。ｐｙｒ４−誘導株はフルオロオロチン酸（ＦＯＡ）に抵抗力があるハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）株の選択によって得られる。このｐｙｒ４−遺伝子はウリジンの生合成のために必要とされている酵素であるオロチジン-5'-モノリン酸デカルボキシラーゼをエンコードしている。インタクトｐｙｒ４−遺伝子の株はウリジンを欠く培地中で成長するけれども、フルオロオロチン酸に敏感である。ＦＯＡ耐性の選択により、機能的なオロチジンモノリン酸塩脱炭酸酵素を欠き、成長のためにウリジンを必要としているｐｙｒ４−誘導株を選ぶことは可能である。このＦＯＡ選択を用いて、機能的なオロチンピロフォスフォリボシル（ｏｒｔａｔｅ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ）転移酵素を欠くウリジン要求株を得ることも可能である。この酵素をエンコードしている遺伝子の機能的なコピーによってこれらの細胞を形質変換することは可能である。（Ｂｅｒｇｅｓ ＆ Ｂａｒｒｅａｕ、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １９： ３５９−３６５ （１９９１））誘導株の選択は、上で述べたＦＯＡ耐性技術を用いて容易に行うことができ、実際、ｐｙｒ４−遺伝子を選択マーカーとして用いることが好ましい。
【０１５７】
アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）のｐｙｒＧ又はハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））のｐｙｒ４の １つ以上のセルラーゼ遺伝子を発現する能力を欠くように形質転換するために、崩壊されたか、欠失されたセルラーゼ遺伝子から成る1つのＤＮＡ断片は欠失プラスミドから単離され、形質転換のためにｐｙｒ−アスペルギウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）又はｐｙｒ−トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ） 宿主に用いられる。形質転換体は、ｐｙｒＧまたはｐｙｒ４のそれぞれの遺伝子産物を表現するそれらの能力に基づいて、識別され、選ばれる。従って形質転換体は宿主株のウリジン栄養要求性を好む。サザンブロット法分析は、部分またはすべての適切なｐｙｒ−選択マーカーによって欠失される遺伝子のゲノムのコピーのコドン領域を置換する2倍体交叉組み込みイベントを識別し、それを確認するために、結果として生じる転換体に対し行われる。
【０１５８】
上で説明した特定のプラスミドベクターはｐｙｒ転換体のプレパラートと関連しているが、本発明はこれらのベクターに制限されない。上記の技術を用いて、様々な遺伝子が、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）またはハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）トリコデルマ種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）の株において欠失されて、置換することができる。さらに、上で議論したように、どのような入手可能な選択マーカーでも使うことができる。実のところ、クローン技術で生み出され、それから識別されているどのような宿主、例えばアスペルギルス属、またはハイポクレア属でも、あるいは遺伝子でも、上記で説明された方法を使って、ゲノムから削除することができる。
【０１５９】
上に述べたように、選ばれた選択マーカーと一致している1の又は複数の機能しない遺伝子を欠くか、または有している宿主の系統はハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）（トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））の誘導株であるかもしれない。例えば、ｐｙｒＧの選択マーカーがアスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）に選ばれるならば、特定のｐｙｒＧ誘導体株は形質転換処置の中の受容体として使われる。また、例えば、ｐｙｒ４の選択マーカーがハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）に選ばれるならば、特定のｐｙｒ4誘導体株は形質転換処置の中の受容体として使われる。同様に、アスペルギルス-ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）遺伝子ａｍｄＳ、ａｒｇＢ、ｔｒｐＣ、ｎｉａＤと等しいハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）（トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））から成る選択マーカー遺伝子が使われるかもしれない。従って、対応する受容株は、それぞれａｓａｒｇｙ−、ｔｒｐＣ−、ｎｉａＤ−のような誘導株でなければならない。
【０１６０】
ＣＢＨ２変異体をエンコードしているＤＮＡは適切な微生物へ挿入するために準備される。本発明によると、ＣＢＨ２変異体をエンコードしているＤＮＡは、機能的なセルロース分解活性を有するタンパク質のためにエンコードするのに必要なＤＮＡから成る。 ＣＢＨ２変異体をエンコードしているＤＮＡ断片は細菌のプロモーター配列、例えば、アスペルギルス種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）の中のｇｌａＡ遺伝子のプロモーターまたはトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．）の中のｃｂｈ１またはｅｇｌ１遺伝子のプロモーターに機能的に付着する。
【０１６１】
ＣＢＨ２変異体をエンコードしているＤＮＡの複数のコピーが、過剰発現を容易にするためにこの株の中に組替えられることもまた予測される。ＣＢＨ２変異体をエンコードするＤＮＡは、変異体をエンコードするこのＤＮＡを運ぶ発現ベクターの構成物によって調製される。ＣＢＨ２変異体をエンコードする挿入されたＤＮＡ断片を運んでいる発現ベクターは与えられた宿主の生物の中で自律的に複製し、または宿主のＤＮＡの中に融合することが可能であるようなベクターでもあり、一般的にはプラスミドである。好ましい実施例の中で、遺伝子の表現を得るための2タイプの発現ベクターが考えられる。一番目は、発現するためにすべてこの遺伝子に由来するプロモーター、遺伝子コドン領域、およびターミネーター配列のＤＮＡ配列である。それ自身の転写及び翻訳調節配列の制御下で、表現するためにその領域を取り除く必要から、望まれていないＤＮＡ配列（例えば、要求されていない領域のコード）を削除することによって、必要な位置で遺伝子を切断することができる。選択マーカーは、また新規な遺伝子配列の複数のコピーされた宿主の中へ組み込むために、選択を受け入れるベクター上に含まれている。
【０１６２】
2番目のタイプの発現ベクターはあらかじめ集められ、ハイレベルの転写と、選択マーカーに必要とされる配列を含んでいる。それが表現カセットプロモーターと重合停止剤配列の転写調節されるように、その遺伝子または遺伝子の部分のコドン領域が、この汎用ベクターに挿入することができるものと考えられる。
【０１６３】
例えば、アスペルギルス属の中で、ｐＲＡＸはそのような汎用発現ベクターである。その遺伝子または部分は強いｇｌａＡプロモーターの下流に挿入することができる。
【０１６４】
例えば、ハイポクレア属の中で、ｐＴＥＸはそのような汎用発現ベクターである。その遺伝子または部分は強いｃｂｈ１プロモーターの下流に挿入することができる。
【０１６５】
ベクター内で、本発明のＣＢＨ２変異体をエンコードしているＤＮＡシーケンスは転写及び翻訳配列、すなわち構造遺伝子への読み枠の中の適当なプロモーター配列とシグナル配列と操作可能に結び付く。このプロモーターは宿主細胞の中で転写活性を示し、相同の、または非相同のタンパク質をエンコードしている遺伝子から宿主細胞に届けられるどのようなＤＮＡシーケンスである可能性がある。任意的なシグナルペプチドはこのＣＢＨ２変異体の細胞外生産を提供する。シグナルシーケンスをエンコードするＤＮＡは、好適には、おのずから発現すべき遺伝子に関係するものであるが、適切なソース、例えばトリコデルマ属のエクソ-セロビオハイドラーゼあるいはエンドグルカナーゼであるが、から得られるシグナルシーケンスが本発明から予測することができる。
【０１６６】
プロモーターとともに本発明の変異体ＣＢＨ２をコードするＤＮＡ配列を結合し、そして適切なベクターへ挿入するために用いる方法は本技術分野でよく知られている。
【０１６７】
上で説明したＤＮＡベクターまたは構成物は形質転換、形質移入、顕微注射、マイクロポレーション（ｍｉｃｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）遺伝子銃攻撃法及び同種の既知の技術によって宿主細胞の中で取り込まれる。
【０１６８】
好ましい形質転換技術において、ハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）（トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））におけるＤＮＡへの細胞壁の透過性は非常に低いうことを考慮しておかなければならない。そのため、目的とするＤＮＡシーケンス、遺伝子、または遺伝子断片の取り込みは最小化される。形質転換処理に先立って、誘導株内で（すなわち、使われた選択マーカーと一致する機能的な遺伝子を欠いている誘導株）でハイポクレア属（Ｈｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．）（トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｓｐ．））の細胞壁の浸透性を高めるための数多くの方法がある。
【０１６９】
（１８４）形質転換のためにアスペルギルス属またはＨｙｐｒｏｃｒｅａ ｓｐ．（トリコデルマｓｐ．）を調製する、本発明における好適な方法は、細菌の菌糸体からプロトプラストを調製する方法に関係する。 Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ． Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ Ａ． ｎｉｇｅｒ ｕｓｉｎｇ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｎｉａＤ ｇｅｎｅ ｆｏｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ． Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １６： ５３−５６； １９８９を参照のこと。菌糸体は発芽した栄養胞子から得ることができる。菌糸体は、原形質を消化する酵素を用いて処理され、最終的にプロトプラストになる。原形質体は、懸濁培地の中の浸透圧安定剤によって保護される。このような安定剤はソルビトール、マンニトール、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、およびそれに類したものを含む。通常、これらの安定剤の濃度は０．８Mと１．２Mの間で変動する。使用するのに望ましいものは、懸濁培地の中のソルビトールの濃度が１．２Mの溶液である。
【０１７０】
宿主株（（アスペルギルス属またはハイポクレア属（トリコデルマ属））の中へＤＮＡを取込むことは、カルシウムイオン濃縮に依存している。一般に、約１０ｍＭのＣａＣｌ_２から約５０ｍＭのＣａＣｌ_２が取込むための溶液に用いられる。取込み溶液の中にはカルシウムイオンが必要であるが、この他に、一般に含まれる他のアイテムとしてはＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス、ｐＨ７−４；１ｍＭ ＥＤＴＡ）または１０ｍＭ ＭＯＰＳ、ｐＨ６．０の緩衝液（モルホニルプロパンスルホン酸（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ ｐｒｏｐａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ））とポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ））と、ポリエチレン・グリコール（ＰＥＧ）などの緩衝システムである。培地の内容物が宿主細胞、例えば、アスペルギルス属またはハイポクレア属系統のどちらかの細胞質の中に送られることを許容している細胞膜を溶融させるために、ポリエチレン・グリコールが機能することが知られており、この結果プラスミドＤＮＡは核に転送される。この融合により、宿主の染色体の中に柔軟に組み込まれたプラスミドＤＮＡの複数のコピーが頻繁に取られる。
【０１７１】
通常、１０^５から１０^６／mLの密度で、好ましくは２ｘ１０^５／mLの密度で透過処理をされたアスペルギルス属の原形質体または細胞を含んでいる懸濁液は、形質変換に用いられる。同様に、１０^８から１０^９／mLの密度で、好ましくは２ｘ１０^８／mLの密度で透過処理されたハイポクレア属（トリコデルマ属）の原形質体または細胞を含んでいる懸濁液は、形質変換に用いられる。適切な溶液（例えば１．２Mのソルビトール；５０mM ＣａＣ１_２）中の、これらの原形質体または細胞の体積１００μｌ液中の細胞は、目的とするＤＮＡに混合される。一般に、高濃度のＰＥＧが取込み溶液に添加される。２５％ＰＥＧ４０００の０．１から１容量は原形質体懸濁液に添加することができる。ジメチルスルホキシド、ヘパリン、スペルミジン、塩化カリウム、及び同種のものの添加物もまた取込み溶液に添加され、形質転換を促進する。
【０１７２】
一般に、混合物は約０℃で１０から３０分の間培養される。ＰＥＧの添加は、それから、さらに目的とする遺伝子またはＤＮＡシーケンスの取り込みを強化するためにこの混合物に添加される。形質転換混合物の５から１５倍の体積の２５％ＰＥＧ４０００が一般的に添加される。しかし、これより大きい、または小さい体積であってよい。２５％ＰＥＧ４０００は好ましくは形質転換混合の体積の約１０倍である。ＰＥＧが添加された後、ソルビトール及びＣａＣｌ_２溶液の添加の前に形質転換混合物は室温でまたは氷の上で培養される。原形質体懸濁液はそれから、溶解した一定分量の増殖培地にさらに添加される。この増殖培地は転換体の成長だけを促進する。目的とする転換体を成長させるために適当な、いかなる増殖培地でも、本発明のにおいて用いることができる。しかしながら、Pyr+転換体が選択している場合、ウリジンを含まない増殖培地を使うことが好ましい。その後、コロニーはウリジンを使い果たした増殖培地の上で形質転換され、精製される。
【０１７３】
この段階において、安定した転換体は、ウリジンを欠いた固形培養媒質上の不完全な外形よりも、転換体のより速い生長率とスムーズな丸いコロニーの形成によって、不安定な転換体と区別できる。さらに、ある場合には、安定性のさらなる試験は、選択的でない固形培地（すなわち ウリジンを含む培地）上での転換体の成長によって行われる。そして、この試験は、ウリジンを欠いている選択培地の上で発芽し、成長した芽胞を収穫し、これらの芽胞のパーセンテージを決定することにより行われる。
【０１７４】
上記の方法に関する特定の実施例において、ＣＢＨ２変異体は、ＣＢＨ２変異体の適切な翻訳過程の結果として、液体培地の中で成長した後に、宿主細胞から活性型として回収される。
【０１７５】
（ii）酵母菌
本発明はまたＣＢＨ２生産のために、宿主細胞として酵母を使用する場合もある。 加水分解酵素をエンコードしているいくつかの他の遺伝子は、酵母菌Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの様々な系統の中で発現されている。これらは、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉ（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ａｎｄ Ｆｏｗｌｅｒ、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ２９： ２２７−２３３、１９９６）由来の２つのエンドゴルカナーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．、 Ｙｅａｓｔ ｖｏｌ． ３、 ｐｐ １７５−１８５、１９８７）、 2のセロビオハイドラーゼ（Ｐｅｎｔｔｉｌａ ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ、 ６３: １０３−１１２、１９８８）及び1のベータ−グルコシダーゼ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｌｉｕｍ ｐｕｌｌｕｌａｎｓ（Ｌｉ ａｎｄ Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ６２、 Ｎｏ． １、 ｐｐ． ２０９−２１３、１９９６）由来の１のキシラナーゼ小麦（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ ５５: ３５３−３５６、１９８７）由来の1のアルファ−アミラーゼ等をエンコードしている配列を含んでいる。さらに、ブチリビブリオ-フィブリソルベンスエンドー［ベータ］−1、4グルカナーゼ（ＥＮＤ１）、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＣＢＨ１）、Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ ｃｅｌｌｏｄｅｘｔｒｉｎａｓｅ（ＣＥＬ１）、およびＥｎｄｏｍｙｃｅｓ ｆｉｂｒｉｌｉｚｅｒｃｅｌｌｏｂｉａｓｅ（Ｂｇｌ１）をエンコードしているセルラーゼ遺伝子カセットはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの実験室株の中での発現には成功している（Ｖａｎ Ｒｅｎｓｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．、 Ｙｅａｓｔ、 ｖｏｌ． １４、 ｐｐ． ６７−７６、１９９８）。
【０１７６】
C．宿主細胞へのＣＢＨ２エンコーディング核酸配列の導入
本発明は、さらに外部発生的に提供される変異体ＣＢＨ２エンコーディング核酸シーケンスから成る、遺伝的に変性させられた細胞と細胞組成を提供する。親細胞または細胞系は、クローニングベクターまたは発現ベクターを用いて遺伝子組み替え（すなわち、形質導入、形質変換、又は移入）が行われた。ベクターは、上で開示したように、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどという形であるかもしれない。
【０１７７】
本発明の形質転換の方法は、糸状菌ゲノムの中へ形質転換ベクターのすべてまたは一部分が安定した組込みが行われた結果として行われる。結果として、自己再生する染色体外形質転換ベクターの維持をしている形質転換もまた、考慮される。
【０１７８】
多くの標準的な形質転換方法は、大量の非相同タンパク質を表現するトリコデルマレーシ細胞系を生産するために用いることができる。トリコデルマのセルラーゼ産出系統へ、ＤＮＡ構成物を導入するために出版された方法のいくつかは、以下に記載されている。Ｌｏｒｉｔｏ、 Ｈａｙｅｓ、 ＤｉＰｉｅｔｒｏ ａｎｄ Ｈａｒｍａｎ、 １９９３、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． ２４： ３４９−３５６； Ｇｏｌｄｍａｎ、 ＶａｎＭｏｎｔａｇｕ ａｎｄ Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、 １９９０、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １７： １６９−１７４； Ｐｅｎｔｔｉｌａ、Ｎｅｖａｌａｉｎｅｎ、 Ｒａｔｔｏ、 Ｓａｌｍｉｎｅｎ ａｎｄ Ｋｎｏｗｌｅｓ、 １９８７、 Ｇｅｎｅ ６： １５５−１６４。アスペルギルス属エルトンに係る方法はＨａｍｅｒ ａｎｄ Ｔｉｍｂｅｒｌａｋｅ、 １９８４、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８１：１４７０−１４７４に記載され、フザリウム属バジャーに係る方法はＰｏｄｉｌａ ａｎｄ Ｋｏｌａｔｔｕｋｕｄｙ、 １９９１、 Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８: ８２０２−８２１２に記載され、ストレプトマイシン属に係る方法はＨｏｐｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．、 １９８５、 Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ Ｉｎｎｅｓ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、 Ｎｏｒｗｉｃｈ、 ＵＫに記載され、バチルス ブリジディに係る方法はＤｅＲｏｓｓｉ、 Ｂｅｒｔａｒｉｎｉ、 Ｒｉｃｃａｒｄｉ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｚｚｉ、 １９９０、 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｌｅｔｔ． ５５： １３５−１３８）に記載されている。
【０１７９】
非相同核酸構成物（発現ベクター）を糸状菌（例えばH．ジェコリーナ）へ導入する他の方法としては、粒子または遺伝子銃の使用、形質転換処理に先立つ糸状菌細胞の透過化処理（例えば、高濃度のアルカリ例えば、０．０５Ｍから０．４M ＣａＣｌ２またはリチウム酢酸塩の使用）、プロトプラストの融合、またはアグロバクターを介した形質転換を含むが、これらに限られない。ポリエチレン・グリコールとＣａＣ１２によるプロトプラストまたはスフェロプラストの処理による糸状菌の模範的な転換法は、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、 Ｅ． I． ｅｔ ａｌ．、 Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ． １６： ５３−５６、 １９８９及びＰｅｎｔｔｉｌａ、M． ｅｔ ａｌ．、 Ｇｅｎｅ、 ６３： １１−２２、１９８８に開示されている。
【０１８０】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための有名な処理のどれでも使うことができる。それらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラストの融合、電気穿孔法、微粒子銃、リポソーム、顕微注射、プラズマベクター、ウイルスベクター、およびクローンゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は外来遺伝物質を宿主細胞に導入するようなほかによく知られている方法の使用をも含まれる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａl．、上記参照のこと）。米国特許Ｎｏ．６、２５５、１５５に記載のアグロバクテリウム介入形質転換法も用いることができる。異種遺伝子を発現することができる宿主細胞内へ少なくとも１つの遺伝子を導入することが可能であれば如何なる方法を用いてもよい。
【０１８１】
加えて、変異体ＣＢＨ２エンコーディング核酸シーケンスから成る非相同核酸構成物はｉｎ ｖｉｖｏ及び例えば注入法などのよく知られた方法によって宿主細胞に導入され、その結果として生じるRNAで転写することができる。
【０１８２】
本発明はさらに、細菌セルラーゼ組成物を生産するためのＡ．ニガー及びH． ジェコリーナのような糸状菌であって、新規で、有益な転換体を含む。本発明は糸状菌、特に変異体ＣＢＨ２をコード配列から、又は内因性ｃｂｈをコード配列から欠失させた菌類の転換体を含む。
【０１８３】
変異体のｃｂｈ２に対するコーディングシーケンスから成っている異種の核酸構成物に関する紹介によれば、遺伝子組み替えの細胞はプロモーターを活性化し、形質転換体を選定し、変異体のＣＢＨ２エンコーディング核酸シーケンスの表現を増幅するのに適切となるように修正された栄養培地の中で培養されている。温度、ｐＨ等の培養条件は、発現のために選択された宿主細胞のためにあらかじめ使われたものであり、本技術分野において明らかである。
【０１８４】
かかる非相同核酸構成物が導入された細胞の子孫は、一般に、非相同核酸構成物の中で見られる変異体ＣＢＨ２エンコーディング核酸シーケンスを含むと考えられる。
【０１８５】
本発明はさらに細菌セルラーゼ組成物生産における使用のためのH．ジェコリーナのような糸状菌であって、斬新で、有益な転換体を含む。アスペルギルスニガーは変異体ＣＢＨ２の生成に用いることができる。本発明は糸状菌、特に変異体ｃｂｈ１をコード配列又はｃｂｈをコード配列から欠失させた菌類の転換体を含む。
【０１８６】
糸状菌の安定した転換体は、固形培養媒質上の不完全な外形よりはむしろ、それらのより速い生長率とスムーズな丸いコロニーの形成によって、不安定な転換体と区別することができる。加えて、ある場合には、固形の非選択的培地上の転換体を成長させ、この培地から、選択培地上で発芽し成長する芽胞を収穫し、そして、これらの芽胞のパーセンテージを決定することによって、安定性のさらなる試験を行うことができる。
【０１８７】
VII． ＣＢＨ２核酸コーディング配列のための分析、および／またはタンパク質発現
変異体ＣＢＨ２エンコーディング核酸構成物によって変換している細胞系による変異体ＣＢＨ２の表現を評価するための検定が、タンパク質レベル、ＲＮＡレベルで、またはセロビオハイドラーゼの活性、および／または生産に対する機能的な生物検定を利用することにより行うことができる。
【０１８８】
ここに説明された変異体ｃｂｈ２の核酸とタンパク質配列の1つの典型的な用途において、糸状菌の遺伝子組み替え系統、例えば、トリコデルマレーシは、ＣＢＨ２の量を増加させるように設計することができる。かかる遺伝子組み替え糸状菌は、より大きなセルロースを分解する能力を有するセルラーゼ組成物を生産するために有益である。このことは、ｃｂｈ２のためのコーディングシーケンスを適当な宿主、例えばアスペルギウスニガーのような糸状菌に導入することによって行われる。
【０１８９】
従って、本発明は、糸状菌または他の適当な宿主の細胞の中にＤＮＡ配列エンコーディング変異体ＣＢＨ２を含む発現ベクターを導入することにより、糸状菌または他の適当な宿主の中で変異体ＣＢＨ２を発現するための方法を提供する。
【０１９０】
別の側面において本発明は、糸状菌または他の適当な宿主の中でＣＢＨ２の発現を変更させる方法をも提供する。かかる変異は内因性ＣＢＨ２の発現の減少または消失を含むものである。
【０１９１】
一般に、変異体ＣＢＨ２の発現の解析に用いられる分析法には、ノザンブロット法、ドットブロット法（ＤＮＡまたはＲＮＡ解析の用いる）、ＲＴ−ＰＣＲ法（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）、又はインサイチュハイブリダイゼーション、適切なラベルプローブの使用（核酸配列に基ずく）及び従来のサザンブロット法及びオートラジオグラフィーがある。
【０１９２】
加えて、変異体ＣＢＨ２の生産及び／又は発現は、例えばセロビオハイドラーゼ活性、発現、および／または生産にかかる分析法によって試料から直接測定することができる。かかる分析法は、Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｃｈｅｍ J． （２００１） ３５６： １９−３０ 及びＭｉｔｓｕｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．、 ＦＥＢＳ （１９９０） ２７５： １３５−１３８に開示されており、参照によりここに組み込まれる。 ＣＢＨ２の分離された可溶性又は不溶性基質を加水分解する能力は、Ｓｒｉｓｏｄｓｕｋ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． （１９９７） ５７： ４９−５７及びＮｉｄｅｔｚｋｙ ａｎｄ Ｃｌａｅｙｓｓｅｎｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． （１９９４） ４４： ９６１−９６６に開示された分析法により測定することができる。セロビオハイドラーゼ、エンドグルカナーゼ又はβ−グルコシダーゼ活性の分析法に有用な基質には、結晶セルロース、濾紙、リン酸増加セルロース、セロオリゴサッカライド、メチルウンベリフェリルラクトシド、メチルウンベリフェリルセロビオシド、オーソニトロフェニ（ｏｒｔｈｏｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）ラクトシド、パラニトロフェニルラクトシド、オーソニトロフェニルセロビオシド、パラニトロフェニルセロビオシドがある。
【０１９３】
更に、タンパク質の発現は、細胞、組織切片の免疫組織学的染色又は組織培養培地のようなイムノアッセイ（免疫測定法）のような免疫学的方法を用いて行うことができる。（例えば、ウエスタンブロット又はＥＬＩＳＡ）かかるイムノアッセイは、質的及び量的にＣＢＨ２変異体の発現を評価するために用いることができる。かかる方法の詳細は当業者によく知られており、この方法を行うための多くの試薬が市販されている。
【０１９４】
変異体ＣＢＨ２の精製物を、様々なイムノアッセイの中で使用される発現されたタンパク質に反応するモノクローナルまたはポリクロナール抗体のいずれかを生産するためにも使用される。（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．、 Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． ｖｏｌ． 11、 Ｎｏ．１１、 ｐｐ． ５７９２−５７９９、１９９１参照のこと）。典型的な分析法としては、エライザ（ＥＬＩＳＡ）、競合イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット法、間接免疫螢光測定法、およびそれに類したものがある。一般に、市販されている抗体、および／またはキットは、セロビオハイドラーゼ タンパク質の発現レベルの多くのイムノアッセイのために使われる。
【０１９５】
VIII．組換体ＣＢＨ２タンパク質の単離と精製
細胞培養中に生産された変異体ＣＢＨ２タンパク質は培地の中に分泌され、そして精製され、又は単離される。しかし、場合によっては、変異体のＣＢＨ２タンパク質は細胞溶解産物から回復することが必要となる細胞の品種によって生み出される場合もある。かかる場合にには、変異体ＣＢＨ２タンパク質は、当業者によって通常用いられている技術を利用して、かかる細胞から精製される。例えば、アフィニティークロマトグラフィー （Ｔｉｌｂｅｕｒｇｈ ｅｔ ａｌ．、 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． １６： ２１５、１９８４）、高い分解パワーを有する原料を使ったイオン交換をも含めた、イオン交換クロマトグラフ法（Ｇｏｙａｌ ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ３６： ３７−５０、１９９１ ； Ｆｌｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １７： ３１４−３１８、１９８３ ； Ｂｈｉｋｈａｂｈａｉ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６： ３３６−３４５、１９８４ ； Ｅｌｌｏｕｚ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ３９６： ３０７−３１７、１９８７）、（Ｍｅｄｖｅ ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８０８： １５３−１６５、１９９８）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（Ｔｏｍａｚ ａｎｄ Ｑｕｅｉｒｏｚ、 Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ ８６５： １２３−１２８、１９９９）、及び二相仕切り（ｔｗｏ−ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）（Ｂｒｕｍｂａｕｅｒ、ｅｔ ａｌ．、 Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７： ２８７−２９５、１９９９）などかあるが、これらに限定されるものではない。
【０１９６】
変異体ＣＢＨ２タンパク質は、特定の結合因子に対する結合親和性（例えば、抗体又は受容体）などの特定の特性を有するタンパク質を分離するために細分化される。これらの抗体又は受容体は選択された分子量の範囲、又は等電点の範囲を有する。
【０１９７】
一度、与えられた変異体ＣＢＨ２の発現が達成されると、その後、生産されたＣＢＨ２タンパク質は細胞または細胞培養から精製される。係る精製に適した典型的な処理方法としては、抗体アフィニティカラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ法；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上またはＤＥＡＥなどの陽イオン交換樹脂によるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニュウム沈殿法；そして、例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−７５を用いたゲルろ過、などがある。さまざまなタンパク質精製の方法が用いられており、係る方法は本分野において知られたものであり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ｖｏｌ． １８２、 Ｎｏ．５７、 ｐｐ． ７７９、１９９０ ； Ｓｃｏｐｅｓ、 Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． ９０： ４７９−９１、１９８２に記載されている。精製手段の選択は、それが用いられる製造工程と生産された特定のタンパク質の性質に依存する。
【０１９８】
IX．ｃｂｈ２とＣＢＨ２の使用
変異体ｃｂｈ核酸、変異体ＣＢＨ２タンパク質、および変異体ＣＢＨ２タンパク質活性から成る組成物の広範囲にわたる用途を発見することは高く評価される（このような用途のいくつかについて以下に説明する。）。
【０１９９】
新規で改良された、さまざまな量のＢＧタイプ、ＥＧタイプ及び変異体ＣＢＨタイプのセルラーゼから成るセルラーゼ組成物は、柔軟剤として作用し、および／または、綿織物の感触を高める（例えば、「ストーンウォッシュ」又は「バイオポリッシュ」）ことができる高い洗浄能力有する洗浄剤組成物や、木材パルプを糖へ分解する組成物（例えば、バイオエタノールの生産）や、及び／又は食品組成物へ適用する用途がある。各タイプのセルラーゼの単離及びその特徴によって、係る組成物の特徴をコントロールすることができる。
【０２００】
大きな耐熱性を持つ変異体（または突然変異体）ＣＢＨｓは、高温おいても活性を維持することができるため、上記の全ての分野において用いることができる。
【０２０１】
わずかな耐熱性を持つ変異体（または突然変異体）ＣＢＨｓは、例えば、存在する他の酵素が影響を受けるこがないように、ある酵素活性がより低温で中立化されることが必要となる分野で用いられる。更に、酵素は、例えば結晶化度またはセルロース系材料の鎖長をコントロールすることにより、セルロース系材料をある程度改質するという用途もある。この改質が要求されたレベルに達した後、糖化温度を非熱安定性ＣＢＨ２の生存温度以上にあげることができる。ＣＢＨ２活性が結晶セルロースの加水分解に必須なので、結晶セルロースの転化は高温では停止してしまう。
【０２０２】
増大した可逆性（すなわち、活性のリホールディング（ｒｅｆｏｌｄｉｎｇ）又は保持（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）が高いめられていること）を有する変異体（または突然変異体）ＣＢＨｓもまた同様な領域で用いられる。熱失活の条件に依存して、可逆的変性は、不可逆的過程と競合し、又は不可逆的過程を支配することができる。増大した可逆性を持つ変異体は、これらの条件のもとで、熱失活に対して増大した抵抗性を持っている。増大した可逆性はまた、非不活性化状態における処理によって不活性化イベントが行われる過程において潜在的利益をもっている。例えば、生物資源をエタノールへ変換するための加水分解と発光の組み合わせ（ＨＨＦ）において、生物資源は最初に高温（５０℃より高い温度を示す）でセルラーゼによって不完全に糖化される。そして、その後温度は、発酵微生物が、糖をエタノールに変換することを可能ならしめるため下げられる。（例えば３０℃まで） もし、経過温度を低下させると、熱的に不活性化したセルラーゼが可逆的に活性を停止し、低温発酵工程の間、糖化はその転換を高いレベルで継続される。
【０２０３】
1のアプローチにおいて、本発明のセルラーゼは感触と外観をよくするために、洗浄剤組成物に使用され、または布の処理にも用いられる。
【０２０４】
ゲノムに挿入されたｃｂｈ遺伝子の少なくとも1つの追加コピーを持っている転換体を使うことによって、セルロースでできた物質製品の加水分解反応速度を増大させることができるかもしれないので、セルロースまたはヘテログリカンを含む製品を、より速い速度で、かつより大きな範囲にわたって分解することができる。紙、綿、セルロース系の紙おむつ、およびそれに類したものであって、セルロースから作られる製品はごみ処理場でより効率的に処理することができる。1の転換体または複数の転換体から得ることができる発酵生成物は、詰ったごみ処理場へ投入される各種セルロース製品を液化することによって、これを分解するために使うことができる。
【０２０５】
個々の糖化及び発酵のプロセスは、生物資源の中に存在するセルロース（例えば、コーンストーバー）がグルコースに転換され、続いて酵母菌がグルコースをエタノールに転換するプロセスである。同時に起こる糖化及び発酵のプロセスは、生物資源の中に存在するセルロース（例えば、コーンストーバー）がグルコースに転換され、同時に同じ反応で酵母菌がグルコースをエタノールに転換するプロセスである。したがって、他のアプローチにおいて、本発明の変異体ＣＢＨタイプのセルラーゼを、生物資源のエタノールへの分解処理に用いることができる。セルロースのようなすぐに入手可能である原材料からエタノールを生産することは安定的に行え、再生可能な燃料源を提供することができる。
【０２０６】
セルロースベースの原料は農業廃棄物、草、および木材と都市廃棄物のような他の低価値生物資源（例えば、再生紙、ヤードクリッピング（ｙａｒｄ ｃｌｉｐｐｉｎｇｓ）などから成る。エタノールはこれらのセルロースでできた物質原料を発酵させて生産することができる。しかし、エタノールへ変換される前に、セルロースを最初に糖に変換しなければならない。
【０２０７】
多種多様な原料に対して、本発明の変異体ＣＢＨを使える可能性があり、使用するための選択基準は、この転化作業が行われる地域に依存している。例えば、米国中西部においては、小麦、わら、コーンストーバー及びバガスのような、農業廃棄物が主要なものである一方、カリフォルニアでは、稲ワラが農業廃物の主要なものである。しかし、入手可能ないかなるセルロース質バイオマスは、いかなる地域においても使われものであるということを理解する必要がある。
【０２０８】
セロビオハイドラーゼの量を増やしたセルラーゼ組成物は、エタノール生産に用いられる。このプロセスによるエタノールは、オクタンエンハンサーとして、又は直接燃料源として利用でき、このエタノールは、石油由来生成物よりも環境にやさしいので、ガソリンの代替燃料としても、有効に活用することができる。エタノールを使用することにより大気の浄化に役立ち、場合によっては、部分的なオゾンレベル及びスモッグを減らことが可能となることが知られている。さらに、ガソリンの代わりにエタノールを利用することは、再生不能なエネルギー源のである石油化学製品の供給の変動を緩衝することにおいて戦略的に重要である。
【０２０９】
エタノールは木、草本、都市の固形廃棄物、および農業と林業の残留物などから糖化と発酵過程を経て、生産することができる。しかし、微生物由来の自然発生するセルラーゼ混合物の中の個々のセルラーゼ酵素の割合は、バイオマスをグルコースに転換するのには効果的ではない。エンドグルカナーゼは、それ自身がセロビオハイドラーゼの作用のための基質であり、従って全体のセルラーゼシステムの加水分解の効率を改善する新しいセルロースチェーン端を生産することができる機能を持っていることが知られている。従って、強化され、あるいは最適化されたセロビオハイドラーゼ活性を利用することによってエタノールの生産量を増加することができる。
【０２１０】
従って、本発明のセロビオハイドラーゼは、そのもの自体を糖に変換するセルロースの加水分解に使用される。１の態様では、変異体セロビオハイドラーゼは発酵微生物の添加に先がけてバイオマスに添加される。２番目の態様では、変異体セロビオハイドラーゼは、バイオマスに対して発酵微生物と同時に添加される。更に、いずれかの態様に存在する他のセルラーゼ成分もある。
【０２１１】
他の態様において、セルロース系物質原料は前処置される。前処理は高温と希酸、濃酸、または薄めのアルカリ溶液のいずれかの添加による。前処理溶液は、少なくとも部分的にヘミセルロース成分を加水分解するのに十分な時間の期間添加されており、その後中和される。
【０２１２】
セルロースにＣＢＨ２を作用させた際の主産物は、ＢＧ活性（例えば細菌のセルラーゼ生成物中の）により、グルコースへ変換するために利用されるセロビオースである。セルロース系バイオマスの前処理によって、またはバイオマス上の酵素作用によって、グルコースとセロビオースを含む他の糖類はバイオマスから入手可能である。このバイオマスのヘミセルロース内容物は（ヘミセルラーゼによって）、キシロース、ガラクトース、マンノース、およびアラビノースなどの糖類に、変換することができる。従って、バイオマス変換過程の中で、酵素糖化法は、他の中間体または最終生成物への生物的または化学的変換に利用可能な糖類を作り出すことができる。従って、バイオマスから発生した糖はエタノールの生成に加えていろいろな過程中において使用される。そのような転化の例はグルコースからエタノールへの発酵（Ｍ．Ｅ． Ｈｉｍｍｅｌ ｅｔ ａｌ． ｐｐ２−４５、 ｉｎ “Ｆｕｅｌｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ｆｒｏｍ Ｂｉｏｍａｓｓ”、 ＡＣＳ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ６６６、 ｅｄ． Ｂ． Ｃ． Ｓａｈａ ａｎｄ Ｊ． Ｗｏｏｄｗａｒｄ、 １９９７による論評）、及びグルコースから２、５−ジケト−Ｄ−グルコネイト（ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．６、５９９、７２２）、酪酸（Ｒ．Ｄａｔｔａ ａｎｄ Ｓ−Ｐ． Ｔｓａｉ ｐｐ２２４−２３６、ｉｂｉｄ）、サッシネイト（Ｒ．Ｒ．Ｇｏｋａｒｎ、 Ｍ． Ａ． Ｅｉｔｅｍａｎ ａｎｄ Ｊ．Ｓｒｉｄｈａｒ ｐｐ２３７−２６３、 ｉｂｉｄ）、１、３−プロパンジオール（Ａ−Ｐ． Ｚｈｅｎｇ、 Ｈ．Ｂｉｅｂｌ ａｎｄ Ｗ−Ｄ． Ｄｅｃｋｗｅｒ ｐｐ２６４−２７９、 ｉｂｉｄ）、 ２、３−ブタンジオールへの生物的転換（Ｃ．Ｓ．Ｇｏｎｇ、 Ｎ． Ｃａｏ ａｎｄ Ｇ．T． Ｔ．ｓａｏ ｐｐ２８０−２９３、 ｉｂｉｄ）、及びキシロースからキシリトールへの化学的及び生物的転化（Ｂ．Ｃ． Ｓａｈａ ａｎｄ Ｒ．Ｊ． Ｂｏｔｈａｓｔ ｐｐ３０７−３１９、 ｉｂｉｄ）などがある。例としてＷＯ ９８／２１３３９も参照のこと。
【０２１３】
本発明の洗剤組成物は、セルラーゼ組成物（セロビオハイドラーゼ内容物とは関係なく、すなわち、セロビオハイドラーゼ無添加、セロビオハイドラーゼが実質的に無添加、セロビオハイドラーゼを多く含むものがある。）のほかに、陰イオン性、非イオン性、および両性の界面活性物質を含む界面活性物質、加水分解酵素、造形剤、漂白剤、青味剤、および蛍光色素、固化抑制剤、可溶化剤、陽イオン界面活性剤、およびそれに類したものが含まれる。これらの全ての成分は、洗剤の分野においてよく知られている。上記のセルラーゼ組成物は、液体の希釈液の中、顆粒の中、エマルジョンの中、ゲルの中、ペーストの中のいずれかまたは同種のものの洗浄剤組成物中に添加することができる。係る製品は当業者によく知られている。固形洗浄剤組成物が使用される時、セルラーゼ組成物は顆粒として製剤化することが好ましい。また好ましくは、この顆粒は、セルラーゼ保護因子を含むように製剤化することができる。更に理解を深めるために、ここに参照により取り込まれている、題名“Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｉｎＣＢＨ２ ｔｙｐｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ” Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｕｍｂｅｒ ６、１６２、７８２を参照のこと。
【０２１４】
好ましくは、セルラーゼ組成物は洗浄剤組成物の総量に対して、約０．００００５重量%から約５重量%添加される。より好ましくは、セルラーゼ組成物は洗浄剤組成物の総量に対して、約０．０００２重量%から約２重量%添加される。
【０２１５】
更に、変異体ＣＢＨ２核酸配列は、関連する核酸配列の同定及び特徴付けに使用することができる。遺伝子又は遺伝子生産物に関する機能の決定（予測又は確認）に有用である数多くの技術は、Ａ．（1） 過剰発現、異所性発現、および他種内発現；（2）黙している逆ゲノム多型法、ターゲットノックアウト、ウイルス誘発性遺伝子サイレンシング（ＶＩＧＳ）、（Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ、 １００ Ｙｅａｒｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、 Ｃａｌｉｓｈｅｒ ａｎｄ Ｈｏｒｚｉｎｅｋ ｅｄｓ．、 Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、 ＮＹ １５： １８９−２０１、１９９９参照のこと）； （3）メチル化状態の分析、特にフランキング調節領域；（4）ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション；のようなＤＮＡ／RNA解析；Ｂ．（1）組み換えタンパク質発現；（2）抗血清生産； （3）免疫学的局在決定；（4）触媒または他の活性に対する生化的検定；（5）リン酸化状態；及び（6）酵母 ２−ハイブリッド法（Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ法）を介したタンパク間の相互作用などの遺伝子生産物解析；Ｃ．過剰発現した発現型に基づいた、または関連する遺伝子の配列相同性による特定の生化学的又はシグナル経路内における遺伝子又は遺伝子生産物の位置などの経路分析及び Ｄ．特定の代謝又は伝達経路内における単離された遺伝子及びその生産物の関与を決定又は確認し、遺伝子の機能決定を助けるためのその他の解析が含まれるが、これらに限られない。
【０２１６】
ここに言及されたすべての特許、特許出願、記事、および出版物はここに参照することによって明確に取り込まれる。
【実施例】
【０２１７】
本発明は、さらに以下の実施例により詳細に説明される。しかしながら、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。添付の図は本発明の明細書の一部である。ここで引用された全ての参考文献の内容は参照により、本発明出願に組み込まれる。
【０２１８】
実施例1
既知のＣｅｌ６Ａセルラーゼのアラインメント
いくつかの変異体は、構造の情報及び調節機構を用いて、８のファミリーメンバーに対するハイポクレアジェコリーナＣｅｌ６Ａの一次配列（ｆｉｒｓｔ ａｌｉｇｎｉｎｇ）により４１のファミリーメンバーから選択された。図３はフミコーラインソランス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓ）（ＱＣｌＳ９）、アクレモニウムセルロイティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｔｙｔｉｃｕｓ）（Ｏ９３８３７）、アグリカスビスポラス（Ａｇａｈｃｕｓ ｂｉｓｐｏｒｖｓ）（Ｐ４９０７５）、ハイポクレアコニンギ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｋｏｎｉｎｇｉｉ）（ＡＦ３１５６８１）、ファネロキエートクリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）（Ｓ７６１４１）、タラロマイセスエメルソニ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ） （Ｑ８Ｎ１ Ｂ５）、レンチヌラエドダス（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ）（ＡＦ２４４３６９）、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ） （Ｐ０７９８７４２）由来のＣＢＨ２分子のアラインメントを示す。アラインメントは、ギャップペナルティーが１０に設定されているベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）ＮＩＴスーツ（Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアープログラムを用いたクラスタル（Ｃｌｕｓｔａｌ）Ｗにより行った。
【０２１９】
アラインメントに基づいて、各種一部位及び多部位アミノ酸変異体が部位異誘発により該タンパク質において行われた。この変異体はコンセンサス配列を用いることにより酵素の熱安定性が改善されていると予測される。図３参照。構造の適合性を調べるために、３Ｄ構造の目視観察を行った。致死となる理由、又は活性部位に近いという理由からＣＢＨ２分子に適合しないと思われる変異体は初期変異体のセットから除いた。
【０２２０】
ＣＢＨ２に対するコンセンサス配列は、本明細書で説明するＣＢＨ２配列のアラインメントにより決定した。図３のアラインメントは、コンセンサス配列の決定の根拠とした。アラインメントのコンセンサス配列は、各位置においてアミノ酸を有し、該アミノ酸配列の大部分を含み、アラインメントの構造に用いた配列である。
【０２２１】
トリコデルマレーシ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＣＢＨ２アミノ酸由来のコンセンサス配列のこれらの位置はタンパク質（ＰＤＢ．ｃｏｄｅ１Ｑｋ２）の３Ｄ構造の試験により評価した。
【０２２２】
画像による観察はシリコングラフィックインディゴ２ソリッドインパクトコンピューター（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｄｉｇｏ２ Ｓｏｌｉｄ Ｉｍｐａｃｔ ｃｏｍｐｕｔｅｒ）のコンピュータープログラムＢＲＡＧＩ（Ｄ． Ｓｃｈｏｍｂｕｒｇ、 Ｊ． Ｒｅｉｃｈｅｌｔ、 J． ＭｏＩ． Ｇｒａｐｈｉｃｓ、 Ｖｏｌ ６、 １６１−１６５ （１９８８））を用いて行った。３Ｄモデルに従い、阻害部位を有さず、構造に適合し、且つ酵素の熱安定性が改善されていると思われるこれらの変異体を熱安定性が改善されたハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２置換体として選択した。幾つかのケースにおいて、ＣＢＨ２分子の３Ｄ構造の目視観察は示唆された配列アラインメントよりも他のアミノ酸によりハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の非保存残基を置換するために重要とされる。幾つかのケースにおいて、該アミノ酸は３Ｄ構造中のグリコシレートである。アラインメントが示すグリコシレートの位置はＳ１０９及びＮ３１０である。これらの位置は変化しなかった。バリンは２１３及び／又は２３７の位置において１つ又は２つのアルギニンと安定した電荷相互作用を有していると考えられることから、Ｖ９４の位置において、バリンをグルタミン酸残基に置換した。Ｔ１２４の位置において、我々は配列アラインメントが適合を示すプロリンを導入した。このアミノ酸はアラインメントされた配列の多くに見ることができ、プロリンのエントロピー効果により安定である。Ｌ１７９の位置において、このアラインメントにおけるＣＢＨ２分子中の唯一の代替的アミノ酸であるアラニンの導入による影響を試験することとした。Ｑ２０４の位置において、グルタミンを、コンセンサス配列において示唆されたアラニンではなく、グルタミン酸残基に置換することとした。なぜならば、アラニンは疎水性コアにおける好適な相互作用を阻害するおそれがある一方で、ＱをＥに置換する変異体を作成することにより分子表面の電荷ネットワークを改善できると考えたからである。我々は、Ｖ２０６をロイシンで置換した。なぜならば、イソロイシンよりロイシンの方が疎水性コアに適合するからである。Ｖ２５０のケースにおいて、我々は空間の制約により、イソロイシンよりもわずかに小さいロイシンを置換することとした。Ｎ２８５の位置において、我々は、アスパラギンをグルタミンに置換することにより安定性における側鎖の長さの影響を調べた。Ｓ２９１において、我々は、アラインメントにおけるＣＢＨ２分子中の唯一の代替的分子であるグリシンの導入による影響を調べた。Ｓ３１６の位置において、我々は、アラインメントにおけるＣＢＨ２分子中の唯一の代替的アミノ酸であるプロピンの導入の影響を調べた。Ｓ３４３の位置において、骨格上で安定であり、かつアラインメントにおいてこの位置で最も多く見られるアミノ酸であるいう理由からこの位置にプロリンを導入した。Ｔ３４９の位置において、スレオニンをコンセンサス配列により示唆されたバリンでなく、ロイシンで置換した。Ｓ４１３の位置において、セリンをチロシンに置換することにより、安定性におけるこの位置の芳香族残基の影響を調べた。
【０２２３】
実施例２
ｃｂｈ２構築体の調製
図２において示されたＣＢＨ２のｃＤＮＡ配列を遺伝子増幅のテンプレートとした。この配列は変異導入のためのテンプレートとしても用いた。
【０２２４】
各種微生物から単離したゲノムＤＮＡより変異体ｃｂｈ２遺伝子の増幅に用いるために以下のＤＮＡプライマーを構築した。本明細書で用いるタンパク質及びＤＮＡ配列に関する記号は、ＩＵＰＡＣ ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｃｏｄｅｓに従う。
【０２２５】
相同５’（ＦＲＧ３６１）及び３’（ＦＲＧ３６２）プライマーをトリコデルマレーシ由来のｃｂｈ２の配列に基づいて作成した。両プライマーはプライマーの５’においてインビトロジェン（登録商標）由来のゲートウェイクローニング配列を含んでいた。プライマー３６１はａｔｔＢ１配列を含み、プライマーＦＲＧ３６２はａｔｔＢ２配列を含む。
【０２２６】
ａｔｔＢ１を除くＦＲＧ３６１の配列は、
ＡＴＧＡＴＴＧＴＣＧＧＣＡＴＴＣＴＣＡＣ（このプライマーは５’末端にハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ ）CBH2のシグナル配列をコードする）（配列番号3）
ａｔｔＢ２を除くＦＲＧ３６２の配列は、
ＴＴＡＣＡＧＧＡＡＣＧＡＴＧＧＧＴＴＴＧＣＧ（このプライマーは３’末端にハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の触媒部位をコードする）（配列番号４）
ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｃｂｈ2 ｃＤＮＡをテンプレートとして提供した。用いたこのｃＤＮＡは、Ｐａｍｅｌａ Ｋ． Ｆｏｒｅｍａｎ ｅｔ ａｌ、 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ 278 Ｎｏ． ３４２００３ ｐａｇｅ ３１９８９の開示に基づき調製したｃＤＮＡライブラリー由来である。このライブラリーは表１に示すプライマーを用いて、ＣＢＨ２触媒ドメインプローブをスクリーニングした。
【表１】

【０２２７】
ＰＣＲ条件は以下のようであった。１０μｌの１０Ｘ反応緩衝液（１０Ｘ反応緩衝液は１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＩ、 ｐＨ ８−８．５、２５０mM ＫＣｌ、５０mM （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、２０mM MgSO₄を含む。）、（最終濃度で）０．２mMの各ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、１μLの１００ｎｇ／μｌゲノムＤＮＡ、０．５μLのPWOポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、 Ｃａｔ# １６４４−９４７）を１μL当り1単位、（最終濃度で）０．２μMの各プライマー（ＦＲＧ３６１ ａｎｄ ＦＲＧ３６２）、４μｌのＤＭＳＯを水で１００μLに調整する。
【０２２８】
キアゲンゲル抽出キットを用いてアガロースゲルから変異体をコードするフラグメントを精製した。精製されたフラグメントは、インビトロジェン（登録商標）のゲートエウィ（商標）テクノロジー取り扱い説明書（バージョンＣ）を用いたｐＤＯＮＲ（商標）２０１ベクターを用いたクローン反応の実施に用いた。前記説明書を参照により本明細書に援用する。調製されたｐＥＮＴＲＹＣＢＨ２クローンを図４に示す。
【０２２９】
（２４１）ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２の各種部位は変異体の熱安定性に含まれるであろう、それゆえ、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ｃｂｈ２遺伝子は以下で説明するプライマー及び反応試薬を用いた変異誘発を受ける。
【０２３０】
各反応（一部位変異誘発、ランダム変異誘発、領域的変異誘発又は連結反応）のサイクルパラメータを表２に示す。
【表２】

【０２３１】
増幅生成物は単離され、以下の実施例３乃至６ので説明するように特徴付けられる。
【０２３２】
正確な配列を有する（変異体又は野生型）遺伝子はその後、ＥＮＴＲＹベクターからデスティネーションベクター（ｐＲＡＸｄｅｓ２）に移され、発現ベクターｐＲＡＸｄｅｓＣＢＨ２を得た。
【０２３３】
細胞を変異体ＣＢＨ２セルラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて形質転換した。この構築物を、Ｃａｏ ｅｔ ａｌ．（Ｃａｏ Ｑ−Ｎ、 Ｓｔｕｂｂｓ Ｍ、 Ｎｇｏ ＫＱＰ、 Ｗａｒｄ Ｍ、 Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ａ、 Ｐａｉ ＥＦ、 Ｔｕ Ｇ．Ｃ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ Ｔ （２０００） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ−ＪＴ２ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｊａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｉｎ ｓｕｂｓｉｔｅ Ｓ３ ｔｏ ｋｃａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９：９９１−１００１）に開示されている方法に従い、アスペルギウスニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）ｖｅｒ．ａｗａｍｏｒｉへ転換した。
【０２３４】
実施例３
部位指定変異誘発
実施例１の理論付けに基づき、部位指定ＣＢＨ２変異体を、当該技術分野において既知の方法を用いて調製された以下の５’リン酸化プライマーを用いて作成した。
【表３Ａ】

【表３Ｂ】

【表３Ｃ】

変異体をコードするコドンを下線付き太字で示す。
【０２３５】
変異誘発は、クイックチェンジ部位指定変異誘発キット（ストラタジェン、Ｌａ、Ｊｏｌｌａ、カルフォルニア；カタログＮｏ．２００５１３）を用いて行った。
【０２３６】
この変異誘発反応には以下の反応試薬を用いた。
【表４】

【０２３７】
増幅生成物を回収し（プライマー、ヌクレオチド、酵素、ミネラルオイル、塩、及び他の成分から精製し、）Ｄｐｎｌを用いて消化した。１μｌのＤｐｎｌ（１０Ｕ／μｌ）をＰＣＲ混合物に添加し、３７℃で９０分インキュベートした。この反応性生物をＱｌＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（キアゲン、カタログＮｏ．２８１０６）を用いて取り扱い説明書に従って精製した。溶出体積は３５μｌ溶出緩衝液であった。
【０２３８】
２本鎖非変異ＤＮＡを除去するために、溶出サンプルをＤｐｎｌ制限酵素で２回消化した。インビトロジェンの１μｌのＤｐｎｌ（カタログＮｏ．１５２４２−０１９）及び４μｌの反応緩衝液（リアクト４（Ｒｅａｃｔ ４）は ＤｐｎＩに１０Ｘ溶液として添付されていおり、最終的に１：１０で希釈して用いた。）をサンプルに添加し、３７℃で９０分インキュベートした。２μｌの反応サンプルを１０μｌのＯｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｔｏｐ１０ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（インビトロジェン、カタログＮｏ．Ｃ４０４０−５０）の形質転換に用いた。ＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６：５５７−５８０参照のこと）において３７℃で１時間育成した後、この細胞を選択的カナマイシンプレート上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２３９】
陽性クローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２＊ＴＹ培地で育成し、プラスミドＤＮＡをＱｌＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログＮｏ．２７１０６）を用いて単離した。このプラスミドの配列決定を行い、変異配列が正確に導入されていることを確認した。
【０２４０】
正しい配列を有する変異体を、ゲートウェイクローニング法（インビトロジェン、カタログＮｏ．１１７９１０１９）に従って、ＬＲ反応を利用してアスペルギウスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターｐＲＡＸｄｅｓ＃２へ転換した。発現クローンをアスペルギウスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＡＰ４へプロップラスト形質転換した後、部位指定変異誘発（ＳＤＭ）を熱安定性の変異についてスクリーニングした（表４）。
【０２４１】
実施例４
コンビネーションライブラリー
ＳＤＭスクリーニングの間に同定された一部位変異体の結果：９８、１３４、２０６、２１２、３１２、３１６、４１１及び４１３、に基づいて、２つのクイックチェンジライブラリー（ＱＣ２Ｃ及びＱＣ２Ｄ）を構築した。
【０２４２】
変異体Ｐ９８Ｌ、Ｍ１３４Ｖ、Ｖ２０６Ｌ、Ｉ２１２Ｖ、Ｔ３１２Ｓ、Ｓ３１６Ｐ、Ｆ４１１Y及びＳ４１３Ｙをクイックチェンジ法（ＱＣ）を用いてライブラリーにおいてランダムに組み合わせた。ＱＣライブラリーを作成するために、部位指定変異誘発キット（カタログＮｏ．２００５１３、ストラタジェン）を用いた。
【０２４３】
プライマーは以下の表５に示すように調製した。
【表５】

【０２４４】
プライマー混合物は以下のように調製した。
【０２４５】
３０μｌのプライマー９８及び１３４（前記表）を１０μｌの他のそれぞれのプライマー（前記表）と混合した。２つの異なるプライマーの濃度を調べて、１つのプライマーが平均２つのアミノ酸置換基と第二の６アミノ酸を含むようにした。
【０２４６】
変異反応は以下の反応試薬を用いて行った。
【表６】

【０２４７】
増幅生成物をＤｐｎｌを用いて消化した。１μｌのＤｐｎｌ（１０Ｕ／μｌ）をＰＣＲ混合物に添加し、３７℃で９０分インキュベートした。このＰＣＲ反応性生物を、ＱｌＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（２５０）（キアゲン、カタログＮｏ．２８１０６）を用いて、その取り扱い説明書に従い、精製した。溶出体積は３５μｌ溶出緩衝液であった。
【０２４８】
２本鎖非変異ＤＮＡを除去するために、溶出サンプルをＤｐｎｌ制限酵素で２回消化した。インビトロジェンの１μｌのＤｐｎｌ（カタログＮｏ．１５２４２−０１９）及び４μｌの反応緩衝液（リアクト４（Ｒｅａｃｔ ４）はＤｐｎＩに１０Ｘ溶液として添付されていおり、最終的に１：１０で希釈して用いた。）をサンプルに添加し、３７℃で９０分インキュベートした。２μｌの反応サンプルを１０μｌのＯｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｔｏｐ１０ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（インビトロジェン、カタログＮｏ．Ｃ４０４０−５０）の形質転換に用いた。ＳＯＣ培地（Ｈａｎａｈａｎ （１９８３） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １６６：５５７−５８０参照のこと）において３７℃で１時間育成した後、この細胞を選択的カナマイシンプレート上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０２４９】
陽性クローンを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２＊ＴＹ培地で育成し、プラスミドＤＮＡをＱｌＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（カタログＮｏ．２７１０６）を用いて単離した。このプラスミドの配列決定を行い、変異配列が正確に導入されていることを確認した。
【０２５０】
正しい配列を有する変異体を、ゲートウェイクローニング法（インビトロジェン、カタログＮｏ．１１７９１０１９）に従って、ＬＲ反応を利用してアスペルギウスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）発現ベクターｐＲＡＸｄｅｓ＃２へ転換した。発現クローンをアスペルギウスニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）ＡＰ４へプロップラスト形質転換した後、部位指定変異誘発（ＳＤＭ）を熱安定性の変異についてスクリーニングした（表１５及び１６）。
【０２５１】
実施例５
領域変異誘発
上述のように、ＳＤＭスクリーニングの間に同定された一部位変異体の結果に基づいて、ランダムに変異されているＣＢＨ２の３Ｄ構造を同定し、熱安定性をスクリーニングした。空間領域を構成するアミノ酸（群）は、［２１０、２１４］、［２５３、２５５、 ２５７、２５８］、［４１１、４１３、４１５］、［４１２、４１４、４１６］、［３１２、３１３］、３２３、［２１２、１４９、１５２］、［１３４、１４４］及び９８である。
【０２５２】
（２６６）［２１０、２１４］、［２５３、２５５、２５７、２５８］、［４１１、４１３、４１５］、［４１２、４１４、４１６］、［３１２、３１３］、３２３、［２１２、１４９、１５２］、［１３４、１４４］及び９８の位置において十分にランダム化されたライブラリーをスクリーニングした。上に列挙されているカッコ間の（例えば、［２１０、２１４］）アミノ酸を一緒にランダム化し、３２３及び９８を単独でランダム化した。変異体ＣＢＨ２−Ｓ３１６Ｐ又はＣＢＨ２−Ｖ２０６Ｌ−Ｓ３１６Ｐをこれらのライブラリーの骨格とした。
【０２５３】
ＮＮＳプライマーを構築し、インビトロジェンが作成した。
【表７】

【０２５４】
ＰＣＲはＰｆｕ ＵｌｔｒａＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジェン、カタログＮｏ．６００３８０）を用いて、以下のように行った。
【表８】

【０２５５】
ＰＣＲフラグメントを１％ＬＴＭゲル上に置き、キアゲンゲル抽出キット（ストラタジェン、カタログＮｏ．２８７０６）を用いて精製した。この精製フラグメントをＰｆｕ Ｕｌｔｒａ（上記）、及びａｔｔＢ２フランキング配列を有するｃｂｈ２プライマーに融合させた。
【０２５６】
精製されたｃｂｈ２遺伝子は、取り扱い説明書（インビトロジェン、カタログＮｏ．１１７８９０１３）のように、ＢＰ反応を用いて、ゲートウェイエントリーベクターｐＤＯＮ２０１へ形質転換した。陽性好ましくはローンは２＊ＴＹプレート上でカナマイシン（５０μｌ／ｍｌ）により選択した。このプレート表面を掬い取り、ゲートウェイＬＲ反応を用いたｐＲＡＸｄｅｓｔ＃２へ形質転換するためのプラスミドを調整した。このベクターをＮｏｔｌで消化し、ＬＲ反応の形質転換頻度を最適化した。プロトプラスト形質転換を、Ａ．ｎｉｇｅｒ ＡＰ４における９つのＣＢＨ２領域ライブラリーを生成するために用い、変更された熱安定性をスクリーニングした（表１７）。
【０２５７】
実施例６
多重変異体
一部位変異誘発の発現及び熱安定性の結果に基づき、振とうフラスコの中でのみ生成する多重変異体のセットを設計した。
【０２５８】
ＣＢＨ２変異体ＦＣＡ５５７（Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ）（実施例４ＱＣライブラリー）をＣＢＨ２変異体ＦＣＡ ５６４（Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ）、 ＦＣＡ５６８（Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ）及び ＦＣＡ５７０（Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ３１６Ｐ）（実施例５の領域ライブラリー）（表９）と組合せ、改善された熱安定性を示すＣＢＨ２分子を得た。
【表９】

【０２５９】
プライマーを構築し、インビトロジェンに発注した
【表１０】

【０２６０】
全９つのＣＢＨ２の組合せを構築するために必要に全フラグメント（Ａ−Ｆ）を得るために、ＰＣＲを以下の表１１に示す反応試薬を用いて行った。
【表１１】

【０２６１】
ＰＣＲフラグメントを１％ＬＴＭゲル上に置き、キアゲンゲル抽出キット（ストラタジェン、カタログＮｏ．２８７０６）を用いて精製した。この精製フラグメントをＰｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡ（上記）、及びＣＢＨ２−ａｔｔＢ２プライマー（上記）に融合させ、表１２に示す完全なＣＢＨ２の組合せを得た。
【表１２】

【０２６２】
完全なＣＢＨ２−ａｔｔＢ分子を１％ＬＴＭアガロースから精製し、Ａ．ｎｉｇｅｒ ＡＰ４発現ベクターｐＲＡＸｄｅｓｔ＃２へ形質転換した。この方法は、デスティネーションベクターへａｔｔＢ−ＰＣＲ生成物をクローニングするための１チューブ法（インビトロジェンマニュアル）である。
【０２６３】
３μｌの反応サンプルを、マニュアルに従って、１００μｌのＤＨ５αｍａｘ−エフィシエンシーコンピテントセル（ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌｓ）の形質転換に用いた。ＳＯＣ培地で、３７℃、１時間育成した後、この細胞を選択のためのアンピリシンプレート（１００μｇ／ｍｌ）上で平板培養し、３７℃で一晩インキュベートした。陽性クローンを２＋ＴＹ培地及び１００μｇ／ｍｌのアンピリシンで育成した。プラスミドＤＮＡをＱｌＡｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（キアゲン、カタログＮｏ．２７１０６）を用いて単離し、配列決定した。
【０２６４】
正確な配列を有する変異体を、ゲートウェイクローニング法（インビトロジェン、カタログＮｏ．１１７９１０１９）に従い、ＬＲ反応を利用して、Ａ．ｎｉｇｅｒ発現ベクターｐＲＡＸｄｅｓｔ＃２に転換した。発現したクローンをＡ．ｎｉｇｅｒＡＰ４にプロトプラスト転換した後、多重変異体を発現させ、単離し（実施例７に記載のように）、熱安定性を解析した（表１８及び１９）。
【０２６５】
実施例７
ＣＢＨ２及びその変体の発現及び振とうフラスコ育成からの単離
熱変性試験の（実施例９）におけるＴｍ測定のための試料を提供するために、発現クローンを振とうフラスコ内で育成し、以下のようにＣＢＨ２分子を精製した。
【０２６６】
変異体ＣＢＨ２セルラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターを用いて細胞を形質転換した。この構築物をＣａｏ ｅｔ ａｌ （Ｃａｏ Ｑ−Ｎ、 Ｓｔｕｂｂｓ Ｍ、 Ｎｇｏ ＫＱＰ、 Ｗａｒｄ Ｍ、 Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ Ａ、 Ｐａｉ ＥＦ、 Ｔｕ Ｇ−Ｃ ａｎｄ Ｈｏｆｍａｎｎ Ｔ （２０００） Ｐｅｎｉｃｉｌｌｏｐｅｐｓｉｎ−ＪＴ２ ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒｏｍ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ jａｎｔｈｉｎｅｌｌｕｍ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｂｏｎｄ ｉｎ ｓｕｂｓｉｔｅ Ｓ３ ｔｏ ｋｃａｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ９： ９９１−１００１）により説明された方法に従って、この構築物はＡ．ｎｉｇｅｒ ａｗａｍｏｒｉ内で形質転換した。
【０２６７】
Ａ．ｎｉｇｅｒ ａｗａｍｏｒｉの形質転換体をウリジンを欠く最小培地で育成した（Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ． １９８３）。形質転換体は、Ｃａｏ ｅｔ ａｌに記載のように、胞子形成している育成アガーから、１ｃｍ^２の胞子懸濁液を１００ｍｌの振とうフラスコに接種し、３日間３７℃で育成し、その後セルラーゼ活性をスクリーニングした。
【０２６８】
ＣＢＨ２活性のアッセイはリン酸膨張セルロース（ＰＡＳＣ：０．５ｍＭ 酢酸ナトリウム中０．５％ＰＡＳＣ、ｐＨ４．８５）の加水分解を基にした。糖の低減はＰＡＨＢＡＨアッセイ（ＰＡＨＢＡＨ：２％ＮａＯＨ、１９５ｍｌ中２．９７５ｇのＰＡＨＢＡＨ、９、７５ｇのＮａ−Ｋ−酒石酸塩）により測定した。ＰＡＳＣ：（Ｋａｒｌｓｓｏｎ、 Ｊ． ｅｔ ａｌ． （２００１）、 Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ２６８、 ６４９８−６５０７、 Ｗｏｏｄ、 T． （１９８８） ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 Ｖｏｌ． １６０． Ｂｉｏｍａｓｓ Ｐａｒｔ ａ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ Ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ （Ｗｏｏｄ、 Ｗ． ＆ Ｋｅｌｌｏｇ、 Ｓ．Ｅｄｓ．）、 ｐｐ． １９−２５、 Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、 Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、 ＣＡ、 ＵＳＡ）ａｎｄ ＰＡＨＢＡＨ： （Ｌｅｖｅｒ、 Ｍ． （１９７２） Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、 ４７、 ２７３、 Ｂｌａｋｅｎｅｙ、 Ａ．Ｂ． ＆ Ｍｕｔｔｏｎ、 ＬＬ （１９８０） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ、 ３１、 ８８９、 Ｈｅｎｒｙ、 Ｒ．Ｊ．（1984） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｒｅｗｉｎｇ、 ９０、 ３７）。
【０２６９】
Ｃｅｌ６Ａ野生型及び変異体を、以下の２つのうちの１つの方法を用いて、疎水性相互クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によりこれらの培地の無細胞懸濁液から精製した。
【０２７０】
ＳＤＭ変異体については、ファルマシア フェニルセファロースレジン（１．６ｍｌ＝１ｍｌカラム）（カタログＮｏ．１７−０９７３−０５）を含むＢｉｏ−ＲＡＤ Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐカラム（カタログＮｏ．７３１−１５５０）を用いた。１乃至２カラム容量（ＣＶ）の水で洗浄し、その後、５ＣＶの緩衝液Ａ（０．０２０Ｍリン酸ナトリウム、０．５ｍＭ硫酸アンモニウム、ｐＨ６．８）でこのレジンを平衡化した。４ｍＭ硫酸アンモニウムを最終濃度が０．５Ｍになるようにこの上清に添加した。２ＣＶの上清をカラムに付加し、カラムを５ＣＶの緩衝液Ａで洗浄し、４ＣＶの０．０２０Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で溶出した。ろ過された液体は精製されたＣＢＨ２を含んでいた。
【０２７１】
多重変異体（実施例６）については、カラムはアプライドバイオシステム製造のＰｏｒｏｓ（登録商標）２０ＨＰ２レジンを用いて設計変更されたノバゲンバキューム（Ｎｏ−ｖａｇｅｎ ｖａｃｕｕｍ）上で行った。ＨＩＣカラムは５ＣＶの緩衝液Ａで平衡化した。最終濃度が０．５Ｍになるようにこの上清に添加した。ろ過した上清をカラムに付加し、カラムを１０ＣＶの緩衝液Ａで洗浄し、１０ＣＶの０．０２０Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．８で溶出した。分画を収集し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルアッセイの結果に基づき、ＣＢＨ２の有無に従いプールした。
【０２７２】
必要に応じて、シグマーアルドリッチより提供のプロトコルに従って、エンドグルカナーセＨで上清を処理することによりＣＢＨ２分子の脱グリコシレート化を行う。
【０２７３】
実施例８
熱失活によるＣＢＨ２変異体の熱安定性
不可逆的な熱失活に対する安定性が変更されたＣＢＨ２分子と野生型ＣＢＨ２との比較は、ストリンジェント条件下での各種温度のインキュベーション前後における、無細胞上清と等量のＰＡＳＣ活性の測定により同定した。用いたストリンジェント条件は、０．１ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．８５で１：１希釈剤した上清を、（示されたように）６１℃又は６５℃のいずれかの温度で、１時間インキュベートし、１０分間氷上に置くという条件である。残留活性％（評価条件でインキュベートした後の残りの活性の％）は初期活性（ストリンジェント条件に曝す前のＰＡＳＣに対するＣＢＨ２活性）を残留活性で除して算出した。
【０２７４】
ＣＢＨ２変異体及び野生型の熱失活に対する安定性のスクリーニングは以下の方法に従って測定した。
【０２７５】
Ａ．溶液及び培地
以下の溶液／培地をＣＢＨ２変異体の不可逆的な熱失活に対する安定性の決定に用いた。
【０２７６】
１．マルトース含有最小培地（ＭＭ培地）は以下の表１３のように調製した．
【表１３】

【０２７７】
ｉ．５ｇのアビセル ＰＨ１０１（フルカ １１３６５）を１リットルガラスビーカに入れ、１２ｍｌまでの水を添加し、濃厚スラリーを生成する．
ｉｉ．このビーカーを氷上に置く．
ｉｉｉ．１５０ｍｌの氷上冷却した８５％オルト−リン酸（Ａｒｔ．１０００５７３ メルク）を添加し、約１時間、ウルトラツラックス（ｕｌｔｒａ ｔｕｒｒａｘ）をもちいてシブキを生じないように高速で撹拌する．
ｉｖ．１００ｍｌの氷上冷却したアセトンを添加し、非常に濃厚なスラリーに対してはセルロースアモルファスの沈殿を緩やかに生ずるので、必要に応じてスパチュラーでよく混合する．
ｖ．この非常に濃厚なスラリーを１リットルまでの水で希釈し、６×２５０ｍｌのソーバル（Sorvall）コンテナへ移すのに十分な液体を調製する．
ｖｉ．１０ｋで１５分間、遠沈し、上清を廃棄する．
ｖｉｉ．ペレットとビーカーに入るだけの水とを混合し、再度遠沈する．
ｖｉｉｉ．工程ｖ及びｖｉを少なくとも３回繰り返し、ｐＨが４．０−５．０にする．
ｉｘ．リン酸をよく洗浄するために、４ＮのＮａＯＨを一滴水に添加する．
ｘ．ペレットを３００ｍｌまでの水と混合し、ホモジナイズする．
ｘｉ．このスラリーの濃度を乾燥重量で測定する．
このスラリーを１２１℃で２０分間滅菌し、冷却後冷蔵庫で保管する。
【０２７８】
３．ＰＡＨＢＡＨ試薬は、１００ｍｌの２％ＮａＯＨ中に１−５ｇＰＡＨＢＡＨに５ｇのナトリウム−カリウム−酒石酸塩含むように調製する．
４．セロビオースストック溶液は、セロビオースをＭＱ水に、０、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．５、０．７、及び１ｍｇ／ｍｌの濃度で調製する。
【０２７９】
Ｂ．サンプル調製
１．１エウェルあたり、２００μｌ最小培地＋マルトース（上記）を含む９６Ｗフィルター処理されたＭＴＰ’ｓ（ミリポア ＃ＭＡＧＶＳ２２１０）中のＡ．ｎｉｇｅｒ変異体を８０−９０％の湿度のオービタルシェーカーにおいて７日間３３℃で育成する．
２．育成インキュベートの後、この培養物をバキューム連結管を用いて、フィルターろ過し、ろ過液（上清）を新たな９６ＷフラットＭＴＰ’ｓ（グレイナー、＃６５５１０１）の中に収集し、４℃で保管する。
【０２８０】
Ｃ．評価温度におけるストリンジェント条件
１．１ウェルあたり６０μｌの上清を６０μｌの１００ｍＭのＮａＡｃ、ｐＨ４．８５で希釈する（１：１希釈）。（残りの上清について、残っている糖を調べる場合には、１９０μｌの１００ｍＭＮａＡｃ、ｐＨ４．８を１ウェルあたり１０μｌの上清に添加し、この希釈された上清の溶液２０μｌに、１５０μｌのＰＡＨＢＡＨ試薬を添加してＰＡＨＢＡＨ残留糖アッセイを行う（Ｅを参照のこと）．
２．２０μｌの希釈上清を新たなフラット９６ＷＭＴＰに移し、４℃で保存する（残留活性に供するため）．
３．残りの希釈上清（約１００μｌ）を１時間６１℃（又は６５℃）で（残留活性のために）インキュベートする．
４．氷上で１０分間冷却する。
【０２８１】
Ｄ．ＰＡＳＣインキュベーション；スモールスケール転換（ＳＳＣ）アッセイ
１．新しいフラットＴＭＰ’ｓ中に、１８０μｌ／ウェルの良く撹拌された５０ｍＭ ＮａＡｃ、ｐＨ４．８５中０．５％ＰＡＳＣ溶液を調製する．
２ａ．残留活性を測定するための１つのプレートに、ＰＡＳＣ−ＭＴＰ’ｓに予備インキュベートされた調製済みの希釈上清を１ウェルあたり２０μｌ移す（上下に混合する）．
２ｂ．初期活性を測定するための第二のプレートに、１ウェルあたり１８０μｌのＰＡＳＣ溶液を保存されていた２０μｌの未処理希釈剤上清に添加し、上下に混合する．
３．上清―ＰＡＳＣＭＴＰ’ｓを密閉し、９００ｒｐｍで撹拌しながら５０℃で２時間インキュベートする．
４．氷上で１０分間冷却する．
５．上清-ＰＡＳＣ混合液を新たなフィルターＭＴＰに移し、バキューム連結管においてろ過し、ろ過液を収集する。
【０２８２】
Ｅ．ＰＡＨＢＡＨ残留糖アッセイ
１．新しい９６ＷフラットＭＴＰに１ウェルあたり１５０μｌのＰＡＨＢＡＨ試薬を入れる．２．２０μｌの上清―ＰＡＳＣ溶液のフィルターろ過液をＰＡＨＢＡＨに添加する（上下に混合する）．
３．第一のＭＴＰ；２０μｌのセロビオースストック溶液の１列をキャリブレーションラインの中に置く（Ａ４参照）．
４．６９℃、１時間、９００ｒｐｍでインキュベートし、室温で冷却し、２０００ｒｐｍ、２分間で遠沈する．
５．スペクトラマックス（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘｓ）スペクトロフォトメーター（スペクトラ、サニーバリュー、カリフォルニア、米国）のＭＴＰリーダーでＯＤ４１０のエンドポイントを直接測定する。
【０２８３】
Ｆ．データ処理（Ｓｐａｄ−ｉｔ）
１．セロビオースの希釈ウェルの読み取り値から、ＯＤ４１０に対するセロビオース濃度（ｍｇ／ｍｌ）のキャリブレーションラインをプロットする．
２．キャリブレーションカーブ及びサンプルウェルの読み取り値を用いて、各サンプルの初期及び残留活性セロビオース濃度（ｍｇ／ｍｌ）を計算する．
３．残留活性％を計算する。
【０２８４】
部位指定変異誘発によるＣＢＨ２変異体の残留活性測定
【表１４】

【０２８５】
野生型（ＷＴ）及び変異体の残留活性％の値は３つの測定の平均値である。標準偏差はこれらの測定値から計算した。
【０２８６】
上の表は、６１℃又は６５℃で１時間ストリンジェント条件でインキュベーションした後に、１部位変異体（ＳＤＭ、実施例３）において残留活性を有していたことを示す。TWクローンの残留活性をこのデータのサブセットに示す（各プレートに１つのWTがある。）WTの平均値は６１℃で２１．４％及び６５℃で６５％であった。測定条件下で、熱安定性を有する分子であるＷＴよりもあらゆる変異体の方が高い残留活性を有することが明らかである。
【０２８７】
CBH2組合せ変異体の残留活性の測定
表１５及び１６に示した２つの結果は、実施例４において生成された変異体を異なる温度においてインキュベーションし、残留活性を測定した結果である。
【０２８８】
2つの表（表１５及び１６）は、独立した２つの実験において測定された値であるので、以下に別個に示した。
【０２８９】
測定条件下で、熱安定性を有する分子であるＷＴよりもあらゆる変異体の方が高い残留活性を有することが明らかである。
【表１５】

【０２９０】
特に定義しない限り、残留活性％の平均値は４つの測定の平均値である。（８）は、８つの測定値の平均値であることを示す。標準偏差は、これらのこれらの測定値から計算された。
【表１６】

【０２９１】
残留活性％の平均値は括弧の中の測定数の平均値である。標準偏差は、これらのこれらの測定値から計算された。
【０２９２】
領域変異誘発により得られたCBH2変異体の残留活性
表１７は、実施例５で生成された６１℃でインキュベーションされあた後の残留活性％を示す。
【表１７】

【０２９３】
特に定義しない限り、残留活性％の平均値は３つの測定の平均値である。（３２）は、３２の測定値の平均値であることを示す。標準偏差は、これらのこれらの測定値から計算された。
【０２９４】
測定条件下で、熱安定性を有する分子であるWT及び／又はS316Pよりもあらゆる変異体の方が高い残留活性を有することが明らかである。
【０２９５】
実施例９
Tm測定によりCBH2変異体の熱安定性
ＣＢＨ２セルラーゼ変異体を実施例７に従って、クローン化し、発現させ、及び精製した。熱変性データは、ＭＩｃｒｏｃａｌ（ミクロカル）（ノーサンプトン、マサチューセッツ、米国）のＶＰ−ＤＳＣミクロカロリーメータにより収集した。緩衝液条件は図のように、５０ｍＭビストリスプロパン／５０ｍＭ酢酸アンモニウム／氷酢酸、ｐＨ５．５又は５．０であった。タンパク質濃度は約０．２５ｍｇｓ／ｍｌであった。９０（ｃａｌ／℃）のスキャン速度において、２５乃至８０℃の3つの熱スキャンを行った。第一スキャンはＣＢＨ２の熱変性を示し、熱変性の中点を決定するために用いた。Ｔｍ：用いたソフトウェアーは温度（℃）カーブに対するＣｐ（ｃａｌ／℃）を作成する。この曲線に従ってＴｍを決定する。第二及び第三スキャンにおける熱変性の欠失により示されるように、熱変性は全てのケースで不可逆的であった。
【表１８】

【０２９６】
全変異体データはグリコシル化ＦＣＡ５００（野性型ｒＣＢＨ２）Ｔｍを参照する。「ＴｍＧ」は、精製された組み換えタンパク質の測定値である。「ＴｍＤＧ」は、精製前にEｎｄｏＨで脱グリコシル化した組換えタンパク質の測定値である。
【表１９】

【０２９７】
全変異体データはグリコシル化ＦＣＡ５００（野性型ｒＣＢＨ２）Ｔｍを参照する。「ＴｍＧ」は、精製された組み換えタンパク質の測定値である。「ＴｍＤＧ」は、精製前にEｎｄｏＨで脱グリコシル化した組換えタンパク質の測定値である。
【０２９８】
ＣＢＨ２セルラーゼ変異体に導入された変異は、野生型と比較して変異体ＣＢＨ２セルラーゼの熱安定性に影響を与えていた。
【０２９９】
この実験及び以下の実験に用いた脱グリコシル化タンパク質は、Ｎ結合を除去するための既知の方法を用いて行った（例えば、 Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． （２００１） ３５８：４２３−４３０参照）。Ｔａｉ、 Ｔ．、 ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． （１９７５） ２５０、 ８５６９の参照のこと。
【０３００】
実施例１０
ＣＢＨ２変異体のＰＡＳＣ特異活性
この実施例は、Ａ．ｎｉｇｅｒでクローン化された野生型配ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）ＣＢＨ２と比較したＣＢＨ２変異体のリン酸膨張セルラーゼにおける特異性能を試験する。
【０３０１】
リン酸膨張セルラーゼ（ＰＡＳＣ）
ＰＡＳＣはＷａｌｓｅｔｈ （１９７１） Ｔａｐｐｉ ３５： ２２８ （１９７１） 及びＷｏｏｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． １２１ ：３５３ （１９７１）に記載の方法に従って、アビセルから調製した。この物質を緩衝液及び水で希釈し、酢酸ナトリウムの最終濃度が５０ｍＭ、ｐＨ５．０になるように、１％ｗ／ｖまで希釈した。
【０３０２】
セルロース誘導体基質に対するこれらの変異体の相対的特異性を当分野で知られている方法により決定した。例えば、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９９８ Ｓｐｒｉｎｇ； ７０−７２（）：３９５−４０３参照。
【０３０３】
標準的セルロース誘導体転換アッセイをこの試験に用いた。Ｂａｋｅｒ（上記）参照。このアッセイにおいて、酵素及び緩衝化基質をコンテナの中に置き、特定の温度で一晩測定した。１００ｍＭのグリシンを、この反応混合物のｐＨが少なくとも１０になるのに充分な量を添加することにより反応を停止させた。一旦反応が停止すると、この反応混合物の一部を０．２ミクロンの膜でろ過して固形物を取り除いた。Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．、 Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７０−７２：３９５ − ４０３（１９９８）に記載の方法にしたがいＨＰＬＣによりろ過溶液の可溶化糖をアッセイした。
【０３０４】
これらの変異体の相対的活性は、５０ｍＭ ＮａＯＨ、ｐＨ５．０中１％のＰＡＳＣを用いて５３℃、１４００ｒｐｍで３．５時間、振とうすることにより決定した。酵素は、０．７５、１、５及び３ｍｇ／ｇセルロースの濃度で添加した。タンパク質濃度はＤＯ２８０（Ｌｅａｃｈ ａｎｄ Ｓｃｈｅｒａｇａ １９６０ （Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． ８２：４７９０−４７９２）を用いて測定した。比較された変異体は、ＦＣＡ５００．３、 ＦＣＡ５２３、 ＦＣＡ５３６、及びＦＣＡ５４０−５５０である。明確化のために、図８は、ＦＣＡ５４０、ＦＣＡ５４２、ＦＣＡ５４５、ＦＣＡ５４７、ＦＣＡ５４９、及びＦＣＡ５５０のみを示した。これらの全変異体サンプルはＦＣＡ５２４及びＣＦＡ５４５の結果と同様の活性を示した。
【０３０５】
上の濃度依存データ（図８）の値と比較して、変異体により生成された総糖量（平均値）とＣＦＡ５００．３（野性型）により生成された総糖量（平均値）を平均化した。これらの比を図９に示す。これらの比は、活性の高くないＦＣＡ５４７、ＦＣＡ５４９、及びＦＣＡ５５０を除いては、全て同様の値であった。
【０３０６】
エラーバーはこの比の平均値のシングルＳＤである。比が１であることは、このアッセイにおいて変異体が野生型と似た活性を有することを示している。この基質において、安定化された全変異体は活性を保持していた。
【０３０７】
実施例１１
ＣＢＨ２変異体のＰＣＳ特異活性
この試験は、ＣＢＨ２変異体の前処理されたコーンストーバーにおける活性を、Ａ．ｎｉｇｅｒ内でクローン化された野生型ハイポクレアジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）と比較する。
【０３０８】
前処理コーンストーバー（ＰＣＳ）
コーンストーバーをＳｃｈｅｌｌ、 Ｄ． ｅｔ ａｌ．、 Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． １０５：６９−８６（２００３）に記載のように、２％ｗ／ｗのＨ_２ＳＯ_４で前処理し、その後、脱イオン水で複数回洗浄し、ｐＨ４．５のペーストを得る。酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）最終濃度５０ｍＭの酢酸ナトリウムになるように添加し、必要に応じて、この混合物を、１Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ５．０に滴定する。反応混合物中のセルロース濃度は約７％である。ＣＢＨ２の特異性は５３℃、７００ｒｐｍ、２０時間でＰＳＣとインキュベーションすることにより試験した。０．７５、１．５及び２．５ｍｇ／ｇセルロースの異なる３つの濃度のＣＢＨ２（ＰＣＳ中）を、８．５ｍｇＣＢＨ２欠失セルラーゼ株ブロス／ｇセルロースに添加した（ハイポクレアジェコリーナ（トリコデルマレーシとも言う）におけるＣＢＨ２の欠失の議論のため。米国特許Ｎｏ．５、８６１、２７１及び５、６５０、３２２参照のこと。結果を図１０に示す。ＣＢＨ２を後で加えないＣＢＨ２欠失株（ベースライン活性を示す。ＣＢＨ２変異体は、ＰＣＳの再構成された全セルラーゼにおいて、野生型ＣＢＨ２と同様の活性を有していた。このことは、欠失株に戻し添加された野生型株は欠失株以上の活性を有することを示す。変異体は同様の条件において同様の活性を有していた。
【０３０９】
同様のアッセイを上で説明する他の変異体について行った。２回試験の総糖量の平均値を各濃度において平均化し、この値をＦＣＡ５００−３（野生型）における同様の２回試験の平均値で割った。これらの比を図１１に示す。これらの比は、活性の高くないＦＣＡ５４７、ＦＣＡ５４９、及びＦＣＡ５５０を除いては、全て同様の値であった。比が１であることは、このアッセイにおいて変異体が野生型と似た活性を有することを示している。この基質において、安定化された全変異体は活性を保持していた。
【０３１０】
実施例１２
各種温度におけるＣＢＨ２変異体の特異活性
この実施例は各種温度において各酵素（安定化変異体及び野生型）が活性をどれくらい長く保持しているかを試験する。
【０３１１】
実施例１０で説明したアッセイを以下のように変更して用いた。１％ＰＡＳＣ中、５３℃、６５℃、及び７５℃の各音素で、３００ｒｐｍ振とうで、各種培養時間インキュベーションして、ＣＢＨ２により生成された総糖量を、各温度においてこれらの酵素（変異体及び野生型）の活性保持時間の長さを決定するために用いた。
【０３１２】
５３℃において、変異体は全時間において野生型と同様の活性を有していた（図１２参照）。５３℃における酵素の安定性において、酵素の半減期をこのデータを下に決定した、。６５℃において、ＦＣＡ５４３及びＦＣＡ５００により生成される総糖量は、ＦＣＡ５４３がＦＣＡ５００よりも長時間活性を保っていることを示した（図１３）。この変異体の半減期は約２４時間であると見積もられた。野生型は約４時間であった。しかしながら、両酵素は７２時間以内に失活した。７５℃において、第一の時間において、ＦＣＡ５４３はＦＣＡ５００よりも多くの糖を生成した（図１４）。
【０３１３】
実施例１３
他のセルラーゼとのＣＢＨ２特異活性
この実施例は、ＣＢＨ２変異体（安定化された）を他のセルラーゼと組み合わせてバイオマス転換への使用を行った。
【０３１４】
アシドサーマスセルロイティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｓ）Ｅ１コアに、野生型ＣＢＨ１及び２（それぞれ、ＦＣＡ３０１及びＦＣＡ５００）、あるいは、安定化ＣＢＨ１及び２（それぞれ、ＦＣＡ４６９及びＣＦＡ５４３）のいずれかを加えた酵素混合物を、ＰＣＳ（実施例１１）を基質として用いた標準的な転換アッセイにおいて、３８℃、５３℃、及び６５℃の温度で、５ｍｇ／ｍｌセルロース及び１０ｍｇ／ｍｌセルロースにおいて試験を行った。１日、２日及び５日目に反応を停止してサンプルを回収した。
【０３１５】
ＣＢＨ１変異体は米国公開公報２００５００５４０３９に記載されており、参照により本明細書に援用する。アシドサーマスセルロイティクス（Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｙｔｉｃｓ）由来のＥ１コアは米国特許Ｎｏ．５、７１２、１４２に記載されている。ＷＯ９１／０５０３９； ＷＯ ９３／１５１８６；ＵＳ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５、２７５、９４４；ＷＯ ９６／０２５５１；米国特許Ｎｏ．５、５３６、６５５及びWO ００／７００３１も参照のこと。ＧｅｎＢａｎｋ Ｕ３３２１２も参照のこと。
【０３１６】
３８℃における結果は、変異体混合物の特異的活性は野生型混合物と同様であった。（図１５参照）。５３℃においても同様な性能を示した。（データ示さず）。
【０３１７】
安定化された変異体混合物は６５℃において野生型混合物よりも有意に高い特異活性を示した。
【０３１８】
実施例１１で述べたアッセイと同じ標準条件を用いて、５６℃、５９℃、及び６２℃の温度、１０ｍｇ／ｍｌセルロース、並びに２４、４８、及び１２０時間の反応時間で安定化された変異体混合物の特異活性を試験した。前記３つの反応時間において、５６℃の結果がより高い温度の結果よりも良かった。全反応時間の結果より、最適な温度が５９℃であった。
【０３１９】
以上言及した本発明の方法及びシステムに関し、本発明の範囲及び精神を逸脱することなく種々の改良や改変を行うはことは、当業者にとって自明のことである。本発明の特定の好ましい実施態様に関連して本発明を説明してきたが、本発明は当該特定の実施態様に過度に限定されるものではないことは当然のことである。従って、分子生物学の分野及び関連分野の当業者に明らかであるような本発明を実施するための前述の方法に関する種々の変更は本発明の範囲内に含まれるものである。
【図面の簡単な説明】
【０３２０】
【図１】図1は、H．ジェコリーナ由来野生型Ｃｅｌ６Ａ（ＣＢＨ２）のアミノ酸配列（配列番号２）である。
【図２】図2は、H．ジェコリーナ由来野生型の核酸配列（配列番号２）である。H．ジェコリーナＣＢＨ２の三次構造である。
【図３Ａ】図3Ａは、入手可能な結晶構造があるＣｅｌ６ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。 配列は以下の通りである：Ｈｕｍｉｃｏｌａ ｉｎｓｏｌｅｎｓＣＢＨ２、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ ＣＢＨ２、ＡｇａｒｉｃｕｓＣＢＨ２、Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍＣＢＨ２、Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｋｏｎｉｎｉｇｉＣＢＨ２、Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｕｍＣＢＨ２、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ ＣＢＨ２、 T． ｒｅｅｓｅｉ （すなわち、 Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ ＣＢＨ２、及びコンセンサス配列。配列アラインメントは、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ ソフトフェアープログラムを用いて、ギャップペナルティーを１０として、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗにより行った。
【図３Ｂ】図3Ｂは、入手可能な結晶構造があるＣｅｌ６ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】図3Ｃは、入手可能な結晶構造があるＣｅｌ６ファミリーメンバーのアミノ酸配列を示す。
【図４】図４は、ｐＲＡＸベクターである。該ベクターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ゲノムＤＮＡフラグメントAMA1配列５２５９ｂｐ Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメント（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ ａｎｄ Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ、 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １９９６ １９：５６５−５７４）が挿入されている以外は、プラスミドｐＧＡＰＴ２に基づいている。ベース１乃至１１３４はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターを含む。ベース３０９８乃至３３５６及び４９５０乃至４９７１はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼターミネーターを含む。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｐｙｒＧ遺伝子は糸状菌形質転換のマーカーであり、３３５７乃至４９４９に挿入されている。遺伝子が挿入される多重クローニング部位（ＭＣＳ）がある。
【図５】図５はｐＲＡＸｄｅｓ２ベクターの構成である。このベクターはプラスミドベクターｐＲＡＸ１に基づくものである。ゲートウェイカセットがｐＲＡＸ１ベクターに挿入されている（環状プラスミドの内部矢印により示される）。このカセットは組み替え配列ａｔｔＲ１ 及びａｔｔＲ２と選択マーカーｃａｔＨ及びｃｃｄＢを含んでいる。このベクターはＧａｔｅｗａｙＴＭ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： ｖｅｒｓｉｏｎ １ ｐａｇｅ ３４−３８に記載の方法により作成され、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により供給されるＥ．Ｃｏｌｉ ＤＢ３．１内でのみ複製することができる。他のＥ．Ｃｏｌｉ内においては、ｃｃｂＢ遺伝子は致死する。最初のＰＣＲフラグメントは、ａｔｔＢ１／2組み変え配列を含むプライマーを用いて作成された。このフラグメントはｐＤＯＮＲ２０１（インビトロジェンから市販されている）と組み換えられ；このベクターはａｔｔＢ１／２組み変え配列とｃａｔＨ、ｃｃｂＢを組み替え部位内に含む。インビトロゲンからのＢＰ ｃｌｏｎａｓｅ酵素は、このいわゆるＥＮＴＲＹベクターの中でＰＣＲ破片を組み換えさせるために使われ、ｃｃｄＢを表現しているクローンが生き残らないので、挿入されたＰＣＲ破片を持つクローンは５０ｐｇ／ｍｌカナマイシンで選択することができる。ａｔｔ配列は変更されて、ａｔｔＬ１とａｔｔＬ２と呼ばれる。第二段階は、このクローンをｐＲＡＸｄｅｓ２ベクター（組み換え部位の間にａｔｔＲ１とａｔｔＲ２ ｃａｔＨとｃｃｄＢを含む）と組み替えさせることである。窒素からのＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ酵素は、目的とするベクターの中でＥＮＴＲＹベクターからのインサートを組み換えさせるために使われる。窒素からのＬＲ ｃｌｏｎａｓｅ酵素は、ベクターの中でＥＮＴＲＹベクターからの挿入を組み替えさせるために使われる。ｃｃｄＢが致死なので、ｐＲＡＸＣＢＨ２ベクターは100μｇ／ｍｌアンピシリンを用いて選択され、ＥＮＴＲＹベクターはアンピシリンに敏感である。この方法によって、発現ベクターは調製され、形質転換されたＡ． ｎｉｇｅｒ を使用することができる。
【図６】図6はアスペルギルス属の中でＣＢＨ２変異体をエンコードしている核酸の表現のために使われたｐＲＡＸｄｅｓ２ｃｂｈ1ベクターの説明を提供する。ＣＢＨ２酵素相同体または変異体をエンコードしている核酸はベクターの中にａｔｔ配列の相同的組み換えによってクローン技術で生み出された。
【図７】図7は、ｐＥＮＴＲＹ−ＣＢＨ２ベクターの図を示す。
【図８】図８は、異なる変異体によるリン酸膨張セルロースからの濃度依存糖放出のグラフである。変異体はこの基質に対してい幅広い活性を示す。
【図９】図９は、ＰＡＳＣにより測定される、変異体による（平均）総糖生成と、野生型ＣＢＨ２による平均）総糖生成の棒グラフである。
【図１０】図１０は、酵素量の変化させた場合の糖放出の量を示したグラフである。野生型酵素はＣＦＡ５００．３（白ダイヤ）及び変異体はＦＣＡ５４３（Ｐ９８Ｌ／ＶＭ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ）（白四角）で示す。ＣＢＨ２欠失株由来のブロスを対照とした。
【図１１】図１１は、前処理されたコーンストーバーを用いて測定した、変異体による（平均）総糖生成と、野生型ＣＢＨ２による平均）総糖生成の棒グラフである。ｙ軸の最小メモリは、０．６であり、この値は、ＣＢＨ２欠失株により生成される（平均）総糖を、野生型ＣＢＨ２とＣＢＨ２欠失株の組み合わせにより生成される（平均）総糖で除した値である。１の値は野生型の活性レベルを示す。
【図１２】図１２は、経時試験のグラフである。５３℃において経時的にＣＢＨ２分子によりＰＡＳＣから放出される総糖を示す。変異体は黒三角（▲）、野生型は白四角（□）で示す。
【図１３】図１３は、経時試験のグラフである。６５℃において経時的にＣＢＨ２分子によりＰＡＳＣから放出される総糖を示す。変異体は黒三角（▲）、野生型は白四角（□）で示す。
【図１４】図１４は経時試験のグラフである。７５℃において経時的にＣＢＨ２分子によりＰＡＳＣから放出される総糖を示す。変異体は黒三角（▲）、野生型は白四角（□）で示す。
【図１５】図１５は、３８℃においてセルラーゼ混合物の特異的性能を示しているグラフである。該混合物はＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｅ触媒コア、並びに野生型又は変異体セロビオヒドラーゼのいずれか一方を含む。野生型は、３０１及び５００で示す。野生型は野生型ＣＢＨ２（すなわち３０１）、及び野生型ＣＢＨ２（すなわち５００）を用いた。該変異体は、４６９及び５４３を用いた。４９６は変異体ＣＢＨ２及び５４３は変異体ＣＢＨ２を示す。
【図１６】図１６は、３８℃においてセルラーゼ混合物の特異的性能を示しているグラフである。該混合物はＡｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｅ触媒コア、並びに野生型又は変異体セロビオヒドラーゼのいずれか一方を含む。野生型は、３０１及び５００で示す。野生型は野生型ＣＢＨ２（すなわち３０１）、及び野生型ＣＢＨ２（すなわち５００）を用いた。該変異体は、４６９及び５４３を用いた。４９６は変異体ＣＢＨ２及び５４３は変異体ＣＢＨ２を示す。
【図１７】図１７は、図１６で説明した変異体セルラーゼ混合物の各種温度におけるスモールスケール糖転化圧制の結果を示すグラフである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体ＣＢＨ２セルラーゼであって、前記変異体が、ハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（配列番号２）由来のＣＢＨ２におけるＶ９４、Ｐ９８、Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、Ｌ１４４、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｓ２１０、Ｉ２１２、Ｔ２１４、Ｌ２１５、Ｇ２３１、Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、Ｖ３２３、Ｎ３２５、１３３３、Ｇ３３４、Ｓ３４３、Ｔ３４９、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３８６、Ｆ４１１、Ｓ４１３、Ａ４１６、Ｑ４２６及び／又はＡ４２９の１つ以上にの残基に相当する位置における置換又は欠失を含むことを特徴とする、変異体ＣＢＨ２セルラーゼ。
【請求項２】
請求項１に記載の変異体ＣＢＨ２セルラーゼであって、前記変異体がハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４Ｅ、Ｐ９８Ｌ、Ｇ１１８Ｐ、Ｍ１２０Ｌ、Ｍ１３４（Ｇ／Ｌ／Ｖ）、Ｔ１４２Ｖ、Ｌ１４４（Ｇ／Ｒ／Ｓ）、Ｍ１４５Ｌ、Ｔ１４８Ｙ、Ｔ１５４Ａ、Ｌ１７９Ａ、Ｑ２０４Ｅ、Ｖ２０６Ｌ、Ｓ２１０（Ｌ／Ｒ）、Ｉ２１２Ｖ、Ｔ２１４（Ｍ／Ｙ）、Ｌ２１５Ｉ、Ｇ２３１Ｎ、Ｔ２３２Ｖ、Ｖ２５０Ｉ、Ｑ２７６Ｌ、Ｎ２８５Ｑ、Ｓ２９１Ｇ、Ｇ３０８Ａ、Ｔ３１２Ｓ、Ｓ３１６Ｐ、Ｖ３２３（Ｌ／Ｍ／Ｙ）、Ｎ３２５Ｄ、Ｉ３３３Ｌ、Ｇ３３４Ａ、Ｓ３４３Ｐ、Ｔ３４９Ｌ、Ｇ３６０Ｒ、Ｓ３８０Ｔ、Ａ３８１Ｔ、Ｓ３８６Ｐ、Ｆ４１１Ｙ、Ｓ４１３Ｙ、Ａ４１６Ｇ、Ｑ４２６Ｅ及び／又はＡ４２９Ｔの１つ以上にの残基に相当する位置における置換又は欠失を含むことを特徴とする、変異体ＣＢＨ２セルラーゼ。
【請求項３】
変異体ＣＢＨ２セルラーゼであって、 前記変異体がハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ（配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４、Ｐ９８、 Ｇ１１８、Ｍ１２０、Ｍ１３４、Ｔ１４２、Ｌ１４４、Ｍ１４５、Ｔ１４８、Ｔ１５４、 Ｌ１７９、Ｑ２０４、Ｖ２０６、Ｓ２１０、Ｉ２１２、Ｔ２１４、Ｌ２１５、Ｇ２３１、 Ｔ２３２、Ｖ２５０、Ｑ２７６、Ｎ２８５、Ｓ２９１、Ｇ３０８、Ｔ３１２、Ｓ３１６、 Ｖ３２３、Ｎ３２５、Ｉ３３３、Ｇ３３４、S３４３、Ｔ３４９、Ｇ３６０、Ｓ３８０、Ａ３８１、Ｓ３８６、Ｆ４１１、Ｓ４１３、Ａ４１６、Ｑ４２６及び／又はＡ４２９の１つ以上の残基に相当する位置における置換／又は欠失を含むことを特徴とする変異体。
【請求項４】
変異体ＣＢＨ２セルラーゼであって、前記変異体がハイポクレアジェコリーナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ ｊｅｃｏｒｉｎａ （配列番号２））由来のＣＢＨ２におけるＶ９４Ｅ、Ｐ９８Ｌ、Ｇ１１８Ｐ、Ｍ１２０Ｌ、Ｍ１３４L、Ｔ１４２Ｖ、Ｌ１４４Ｒ、Ｍ１４５Ｌ、T１４８Ｙ、Ｔ１５４A、Ｌ１７９Ａ、Ｑ２０４Ｅ、Ｖ２０６Ｌ、Ｓ２１０Ｒ、Ｉ２１２Ｖ、Ｔ２１４Ｙ、Ｌ２１５Ｉ、Ｇ２３１Ｎ、Ｔ２３２Ｖ、Ｖ２５０Ｉ、Ｑ２７６Ｌ、Ｎ２８５Ｑ、 Ｓ２９１Ｇ、Ｇ３０８Ａ、Ｔ３１２Ｓ、S３１６Ｐ、Ｖ３２３（Ｎ／Ｙ）、Ｎ３２５Ｄ、Ｉ３３３Ｌ、Ｇ３３４Ａ、Ｓ３４３Ｐ、Ｔ３４９Ｌ、Ｇ３６０Ｒ、Ｓ３８０Ｔ、Ａ３８１Ｔ、 Ｓ３８６Ｐ、Ｆ４１１Ｙ、Ｓ４１３Ｙ、Ａ４１６Ｇ、Ａ４２９Ｔ及びＱ４２６Ｅからなる群より選択される残基に相当する１つ以上の位置における置換を含むことを特徴とする変異体。
【請求項５】
変異体ＣＢＨ２セルラーゼであって、前記変異体ＣＢＨ２がハイポクレアジェコリーナ（配列番号２）由来のＣＢＨ２における
ｉ．Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ；
ｉｉ．Ｍ１３４Ｇ／Ｌ１４４Ｇ／Ｓ３１６Ｐ；
ｉｉｉ．Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ３１６Ｐ；
ｉｖ．Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｓ／Ｓ３１６Ｐ；
ｖ．Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｖｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ２１０Ｌ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｖｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｖｉｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｉｘ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｌ／Ｌ１４４Ｒ／Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｉｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｉｖ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｓ３１６Ｐ；
ｘｖ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｖｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｖｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｖｉｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｉｘ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｔ３１２Ｓ；
ｘｘｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｔ１５４Ａ／Ｖ２０６Ｌ／Ｓ３１６Ｐ；
ｘｘｉｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｆ４１１Ｙ；
ｘｘｉｖ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ；
ｘｘｖ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｖｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｖｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｖｉｉｉ．Ｐ９８Ｌ／Ｍ１３４Ｖ／Ｖ２０６Ｌ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｉｘ．Ｐ９８Ｌ／Ｔ１５４Ａ／Ｉ２１２Ｖ／Ｆ４１１Ｙ；
ｘｘｘ．Ｐ９８Ｌ／Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｘｉ．Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｘｉｉ．Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｌ；
ｘｘｘｉｉｉ．Ｓ３１６Ｐ／Ｖ３２３Ｙ；
ｘｘｘｉｖ．Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｓ３１６Ｐ；
ｘｘｘｖ．Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ；
ｘｘｘｖｉ．Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｆ４１１Ｙ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｘｖｉｉ．Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｘｖｉｉｉ．Ｖ２０６Ｌ／Ｉ２１２Ｖ／Ｔ３１２Ｓ／Ｓ３１６Ｐ／Ｓ４１３Ｙ；
ｘｘｘｉｘ．Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｌ／Ｔ２１４Ｍ／Ｓ３１６Ｐ；
ｘｉ．Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｓ３１６Ｐ；
ｘｌｉ．Ｖ２０６Ｌ／Ｓ２１０Ｒ／Ｔ２１４Ｙ／Ｓ３１６Ｐ；及び
ｘｌｉｉ．Ｖ２０６Ｌ／Ｓ３１６Ｐ；から成る群より選択される変異を必ず含むことを特徴とする、変異体。
【請求項６】
請求項１のＣＢＨ２変異体をコードする核酸配列。
【請求項７】
請求項４のＣＢＨ２変異体をコードする核酸配列。
【請求項８】
請求項５のＣＢＨ２変異体をコードする核酸。
【請求項９】
請求項６のＣＢＨ２変異体をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１０】
請求項７に記載のＣＢＨ２変異体をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１１】
請求項８に記載のＣＢＨ２変異体をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１２】
請求項９のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１０のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項１４】
請求項１１のベクターを用いて形質転換された宿主細胞。
【請求項１５】
ＣＢＨ２変異体を生成する方法であって、
（a）好適な条件下で、請求項１２の宿主細胞を培養してＣＢＨ２変異体を生成する工程と、
（b）ＣＢＨ２変異体を得る工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
ＣＢＨ２変異体を生成する方法であって、
（a）好適な条件下で、請求項１３の宿主細胞を培養してＣＢＨ２変異体を生成する工程と、
（b）ＣＢＨ２変異体を得る工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
ＣＢＨ２変異体を生成する方法であって、
（a）好適な条件下で、請求項１４の宿主細胞を培養してＣＢＨ２変異体を生成する工程と、
（b）ＣＢＨ２変異体を得る工程とを含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
界面活性剤及び請求項１のＣＢＨ２を含むことを特徴とするＣＢＨ２変異体を含む洗剤組成物。
【請求項１９】
洗濯用洗剤であることを特徴とする、請求項１８に記載の洗剤組成物。
【請求項２０】
食器用洗剤であることを特徴とする、請求項１８に記載の洗剤組成物。
【請求項２１】
請求項１に記載のＣＢＨ２変異体を含む食品添加物。
【請求項２２】
請求項１に記載のＣＢＨ２変異体にウッドパルプを接触させる工程を含むことを特徴とするウッドパルプを処理する方法。
【請求項２３】
バイオマスを請求項１のＣＢＨ２変異体に接触させる工程を含むことを特徴とするバイオマスを転化する方法。

【図１】

【図２】

【図３Ａ】

【図３Ｂ】

【図３Ｃ】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

【図１２】

【図１３】

【図１４】

【図１５】

【図１６】

【図１７】

【公表番号】特表２００８−５２６２０６（Ｐ２００８−５２６２０６Ａ）
【公表日】平成２０年７月２４日（２００８．７．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００７−５４９５９２（Ｐ２００７−５４９５９２）
【出願日】平成１７年１２月２２日（２００５．１２．２２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４７２６６
【国際公開番号】ＷＯ２００６／０７４００５
【国際公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【出願人】（５００２８４５８０）ジェネンコー・インターナショナル・インク (67)
【Ｆターム（参考）】