有機蛍光色素内包シリカナノ粒子、その製造方法、及びそれを用いた生体物質標識剤
【課題】光退色の少ない有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供する。また、それを用いた生体物質標識剤を提供する。
【解決手段】シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【解決手段】シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。より詳しくは、シリカ骨格中にジスルフィド結合をもち、かつ有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の診断あるいは病態の把握を目的に、血液などに含まれる特定の生体分子（バイオマーカー）の検出が注目されている。現在、生体分子の検出のために抗原抗体反応を利用した免疫分析（イムノアッセイ）が主に用いられている。酵素反応を利用した化学発光法が高感度とされ、現在主流である。
【０００３】
しかしながら、生体物質である酵素を用いるため温度管理などを厳密にするなど煩雑な操作が要求され、より簡便なシステムが求められている。
【０００４】
その一つとして予め蛍光物質で標識された生体物質標識剤を用いる蛍光イムノアッセイ法が知られている。蛍光物質としては、有機色素や、量子ドットを使用することができる。化学発光法に比べ、簡便な操作で行えるものの、用いる蛍光物質の蛍光強度が非常に小さいため、検出感度が十分でなかった。
【０００５】
近年より超早期での疾病の診断を行うため、すなわち、極微量のバイオマーカーの検出を行うため、より高蛍光強度を有する蛍光物質で標識された生体物質標識剤が求められている。その一つとして、複数の蛍光物質を一つのシリカナノ粒子に内包させる技術が開示されている（例えば特許文献１及び２参照）。
【０００６】
一方、特に近年、小動物を対象としたｉｎ ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。
【０００７】
このように、生体内の蛍光材料を励起し、発光を外部に取り出すためには、励起光及び発光が生体を透過する必要がある。紫外光及び可視光は、生体の吸収が高く、ほとんど透過することができないので好ましくない。また、１０００ｎｍ以上の波長では、水の吸収が立ち上がり、透過率が低くなるため好ましくない。
【０００８】
しかしながら、赤〜近赤外線の６５０〜１０００ｎｍは、「生体の窓」及び「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域であり、この範囲内で励起及び発光を示す蛍光材料が求められている。従って有機蛍光色素内包シリカ粒子を本用途に用いるにあたり、その蛍光波長が、６５０〜１０００ｎｍにある有機蛍光色素を選択する必要がある。
【０００９】
ところが、本発明者らが特許文献１に開示されている方法により、蛍光波長が６７０ｎｍであるＣｙ５（商品名ＧＥヘルスケア社製品）を内包するシリカナノ粒子を作製し、その蛍光測定を行ったところ、非常に短時間の励起光照射で退色が起こってしまい、さらなる改善が必要であった。
【００１０】
蛍光色素の退色を低減する方法は古くから知られており、たとえば非特許文献１に記載されているようにメルカプトエタノールなどメルカプト基を有する分子の添加が広く行われている。メルカプト基はジスルフィド結合をつくることで還元性を示す。ここでは、活性な酸素を還元し、失活させることで、酸素による退色を防止できると考えられている。
【００１１】
しかしながら、メルカプトエタノールなどメルカプト基を有する分子はたんぱく質を変性する可能性があり、適用範囲が限られる。
【００１２】
一方、特許文献２には、メルカプト基を有するメルカプトプロピルトリメトキシシランを含み、かつ蛍光性物質を内包するシリカ粒子が開示されている。
【００１３】
そこで、本発明者らが、特許文献１及び２に開示されている方法により、メルカプトプロピルトリメトキシシランを原料に、Ｃｙ５を内包するシリカナノ粒子を作製し、その蛍光測定を行ったところ、短時間の励起光照射で退色が起こってしまい、さらなる改善が必要であることが分かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７４７２２号
【特許文献２】国際公開第２００７／１４２３１６号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】非侵襲・可視化技術ハンドブック ７１０ページ ＮＴＳ出版（２００７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記問題・状況にかんがみなされたものであり、その解決課題は、光退色の少ない有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
【００１８】
１．シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【００１９】
２．前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、下記一般式（１）で表されることを特徴とする前記第１項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式（１）： Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、酸素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００２０】
３．前記第１項又は第２項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、少なくとも下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程（ｂ）：還元反応を行う工程
４．前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、下記一般式（２）で表されるシラン化合物であることを特徴とする前記第３項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
一般式（２）： Ｒ５ｎ（Ｒ６Ｏ）ｍＳｉ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ７ｌ（ＯＲ８）ｋ
式中、ｎ及びｍはｎ＋ｍ＝３を満たし、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数を表す。ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒ５及びＲ７は非加水分解性の置換基を表す。Ｒ６Ｏ及びＲ８Ｏは、加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００２１】
５．前記第１項又は第２項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の上記手段により、光退色の少ない有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【００２３】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ジスルフィド結合を有する骨格をシリカ骨格内に有し、そのジスルフィド基が還元されてなるメルカプト基を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた場合、光退色が飛躍的に抑制可能となることを見出した。
【００２４】
従来法で得られるメルカプト基を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子では、メルカプト基同士が離れており、ジスルフィド結合が形成できず、酸素を還元できなかったため光退色が起こると考察している。
【００２５】
すなわち、ジスルフィド結合をシリカ骨格内に有し、そのジスルフィド基が還元されてなるメルカプト基を特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子、及びそれを用いた生体物質標識剤を得ることができることを見出し、本発明に至った次第である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項５に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２７】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、前記一般式（１）で表されることが好ましい。
【００２８】
また、本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法としては、少なくとも前記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有する態様の製造方法であることが好ましい。この場合、前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、前記一般式（２）で表されるシラン化合物であることが好ましい。
【００２９】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されてなる生体物質標識剤に好適に用いることができる。
【００３０】
以下、本発明とその構成要素、及び発明を実施するための形態について詳細な説明をする。
【００３１】
〔有機蛍光色素〕
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子に用いられる有機蛍光色素としては、特に制限はないが、２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の有機蛍光色素を用いることができる。なかでもｉｎ ｖｉｖｏ光イメージング用途を想定し、「生体の窓」及び「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域である赤〜近赤外線の６５０〜１０００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
【００３２】
有機色素としてフルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００３３】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上ＧＥヘルスケア社製）等を挙げることができる。なかでも蛍光波長が６５０〜１０００ｎｍと「生体の窓」及び「分光領域の窓」にあたるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７が好ましい。
【００３４】
それぞれアミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基誘導体として用いてもよい。この場合、含ケイ素アルコキシド化合物としてアミノ基を有するもの、例えばアミノプロピルトリエトキシシランを用いて、カルボン酸又は活性エステル基と反応させたものを用いることもできる。
【００３５】
〔有機蛍光色素内包シリカナノ粒子とその作製方法〕
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分を含むことを特徴とする。
【００３６】
当該ジスルフィド結合を有する化学構造部分は、下記一般式（１）で表されるものであることが好ましい。
一般式（１）： Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、酸素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００３７】
Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、この場合、エステル結合、アミド結合などとなってもよい。また、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００３８】
好ましい例としては、後述する一般式（２）で表される化学物由来の構造である。
【００３９】
シリカナノ粒子は、公知の方法、例えば、ジャーナルオブコロイドサイエンス ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている、アンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。
【００４０】
粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にできる。また、粒径のばらつきを示す変動係数は２０％以下とすることができる。
【００４１】
本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００４２】
本発明の蛍光体内包シリカナノ粒子は、公知の方法例えば、非特許文献（ラングミュア８巻、２９２１ページ（１９９２年））に記載されている方法を参考にすることができる。
【００４３】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法としては、少なくとも下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有する態様の製造方法であることが好ましい。
【００４４】
工程（ａ）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程（ｂ）：還元反応を行う工程
当該製造方法を、より詳しく説明するならば、下記工程（１）〜（６）を有する態様の製造方法であることが好ましい。
【００４５】
工程（１）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物、テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物及び有機蛍光色素（上述）を混合する。
【００４６】
工程（２）：エタノールなどの有機溶媒、水及び塩基を混合する。
【００４７】
工程（３）：工程（２）で調製した混合液を撹拌しているところに、工程（２）で得られた有機蛍光色素含有液を添加し、反応を進行させる。
【００４８】
工程（４）：ジスルフィド結合をメルカプト基に還元する。
【００４９】
工程（５）：反応混合物から生成した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を、ろ過若しくは遠心分離により回収する。
【００５０】
工程（６）：工程（５）で得られた有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。
【００５１】
上記工程（１）で用いられるジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物は、後工程の還元で生成したメルカプト基が還元性を示すようジスルフィド結合をあらかじめシリカ粒子骨格内にもたせる目的がある。
【００５２】
また、加水分解性置換基を有するシリル基をもつことは、加水分解反応によりシリカ粒子を製造する際に、同時に加水分解され、シリカ粒子骨格内に、ジスルフィド結合を固定する役割がある。これがないとジスルフィド結合を持つ分子が粒子内に内包されず、酸素の失活すなわち光退色の抑制効果がなくなる。
【００５３】
ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物の例としては、下記一般式（２）で表される化合物を用いることができる。
一般式（２）： Ｒ５ｎ（Ｒ６Ｏ）ｍＳｉ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ７ｌ（ＯＲ８）ｋ
式中、ｎ及びｍはｎ＋ｍ＝３を満たし、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数を表す。
【００５４】
ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒ５及びＲ７は非加水分解性の置換基を表す。Ｒ６Ｏ及びＲ８Ｏは、加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、この場合、エステル結合、アミド結合などとなってもよい。また、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００５５】
具体的には、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド（以上ＧＥＬＥＳＴ社製）を挙げることができる。
【００５６】
上記工程（１）で用いられる含ケイ素アルコキシド化合物としては、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシランといったテトラアルコキシドシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランなどのトリアルコキシシランなどを挙げることができる。また有機官能基を有する含ケイ素アルコキシド化合物をあげることができる。具体的にはグリシジルプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
【００５７】
含ケイ素アルコキシド化合物は、上記の一種若しくは二種以上を併用することもできる。
【００５８】
含ケイ素アルコキシド化合物と工程（１）で得られる有機蛍光色素結合分子の混合比に制限はないが、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１×１０−６〜１×１０−２ｍｏｌ／Ｌの範囲内になるように混合することが好ましい。濃度を１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで十分な蛍光が得られる。また１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、シリカ内で均一に分散でき、かつ濃度消光を防止できる点で好ましい。
【００５９】
含ケイ素アルコキシド化合物とジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子の混合比に制限はないが、モル比で２：１以上１０００：１以下になるように混合することが好ましい。ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子が多すぎると生成する粒子がいびつな形状となる。また低すぎる場合、ジスルフィド結合及びその酸化でできるメルカプト基が少なく、還元力が弱くなり光退色を抑制する点で不利になる。
【００６０】
上記工程（２）で用いられる有機溶媒としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。一種若しくは二種以上の混合としてもよい。
【００６１】
また、上記工程（２）で用いられる塩基としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることができ、それぞれ水溶液として用いてもよい。
【００６２】
含ケイ素アルコキシド化合物としてテトラエトキシシラン、有機溶媒としてエタノール、塩基としてアンモニア水を用いた場合のそれぞれの仕込みモル比を以下にあげる。
【００６３】
テトラエトキシシランを１ｍｏｌとした場合、エタノールをａ ｍｏｌ、水をｒ ｍｏｌ、アンモニアをｂ ｍｏｌとすると、ａは２０以上４００以下、ｒは１０以上２００以下、ｂは１０以上４０以下で混合する。具体的には、ジャーナルオブコロイドサイエンス２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている条件を適用することができる。
【００６４】
上記工程（３）において、反応温度は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、室温から５０℃の間で行うことができる。
【００６５】
蛍光色素含有液を添加する方法としては、限定されるものはなくシリンジポンプ、滴下ロートなど用いればよい。
【００６６】
上記工程（３）における反応時間は、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、収率、不溶性副生成物の生成防止等の観点から、１時間以上５０時間以下であることが好ましい。
【００６７】
上記工程（４）により、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元する。ジスルフィド結合方法としては公知の方法、たとえば高温又は高濃度の変性剤（６Ｍ塩酸グアニジン、８Ｍ尿素、１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）などを用いることができる。反応条件は、例えば、室温から５０℃の間で、３０分から２時間撹拌する。
【００６８】
上記工程（５）における反応混合物から生成した蛍光物質内包シリカナノ粒子の回収方法は、通常ナノ粒子の回収で行われるろ過、若しくは遠心分離などを用いることができる。回収した蛍光色素内包シリカナノ粒子は必要に応じて、未反応原料などを除くため、有機溶媒若しくは水による洗浄をしてもよい。
【００６９】
〔有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とを結合する有機分子〕
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００７０】
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の表面に結合し、分子標識物質とも結合しうる有機分子として、例えば無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００７１】
また、後述する生体物質標識剤として用いる場合、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いることができる。
【００７２】
シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
【００７３】
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得ることができる。
【００７４】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
【００７５】
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００７６】
当該分子標識物質としては、例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。
【００７７】
具体例として、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光物質内包シリカナノ粒子のアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００７８】
必要により有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例としてアミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子ができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。
【００８０】
《有機蛍光色素内包シリカナノ粒子》
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子１の作製〕
ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基同一分子内にもつ化合物を用いて、下記工程（１）〜（４）の方法により、シリカナノ粒子１を作製した。
【００８１】
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製） １ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１０μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン ４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【００８２】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【００８３】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【００８４】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００８５】
得られたシリカナノ粒子１の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
【００８６】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の還元物（シリカナノ粒子２）の作製〕
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ １ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００８７】
得られたシリカナノ粒子２のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０８ｎｍ、変動係数は１１％であり、シリカナノ粒子１と変化なかった。
【００８８】
得られたシリカナノ粒子２のＦＴ−ＩＲ（日本分光社製 ＦＴ／ＩＲ−４１００）測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【００８９】
〔ジスルフィド結合なし、メルカプト基なしシリカナノ粒子３の作製〕
特許文献１にならい下記工程（１）〜（５）の方法により、ジスルフィド結合もメルカプト基のどちらも有しないＣｙ５内包シリカナノ粒子３を作製した。
【００９０】
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解させたところに、室温下３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学工業社製）１μＬ添加し、３０分撹拌した。
【００９１】
工程（２）：上記工程（１）で得られたＤＭＦ溶液及びテトラエトキシシラン４００μＬを混合した。
【００９２】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【００９３】
工程（４）：上記工程（３）で作製した混合液を室温下、撹拌しているところに、工程（３）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【００９４】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００９５】
得られたシリカナノ粒子３のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１２０ｎｍ、変動係数は１３％であった。
【００９６】
〔ジスルフィド結合なし、メルカプト基ありシリカナノ粒子４の作製〕
特許文献２にならい下記工程（１）〜（５）の方法により、ジスルフィド結合をもたず、メルカプト基を有するＣｙ５内包シリカ粒子４を作製した。
【００９７】
工程（１）：Ｃｙ５のマレイミド誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇをジメチルスルホキシド０．０５ｍＬに溶解させたところに、メルカプト基を有する３−メルカプトプロピルトリメトキシシランをＣｙ５のマレイミド誘導体と等モルになるよう添加混合し、２時間撹拌した。
【００９８】
工程（２）：上記工程（１）で得られたジメチルスルホキシド溶液と、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン７．５μＬを混合した。
【００９９】
工程（３）：上記工程（２）で作製した混合液に、２８質量％アンモニア水溶液６７５μＬを添加混合の後、１００度で１１時間反応させた。
【０１００】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０１】
得られたシリカナノ粒子４のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径３６０ｎｍ、変動係数は１９％であった。
【０１０２】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製及びその還元物（シリカナノ粒子５）の作製〕
Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（インビトロジェン社製）を用いた他はシリカナノ粒子１と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
【０１０３】
工程（１）：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（インビトロジェン社製）１．６ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１０μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【０１０４】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１０５】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１０６】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０７】
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０８】
得られたシリカナノ粒子５のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１０％であった。
【０１０９】
得られたシリカナノ粒子５のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【０１１０】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製及びその還元物（シリカナノ粒子６）の作製〕
Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＡｎａＳｐｅｃ社製）を用いた他はシリカナノ粒子１と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
【０１１１】
工程（１）ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＡｎａＳｐｅｃ社製）１．６ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１０μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【０１１２】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１１３】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１１４】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１１５】
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１１６】
得られたシリカナノ粒子６のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０３ｎｍ、変動係数は１２％であった。
【０１１７】
得られたシリカナノ粒子６のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【０１１８】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製及びその還元物（シリカナノ粒子７）の作製〕
Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィドの代わりに、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）を用いた他はシリカナノ粒子１と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
【０１１９】
工程（１）ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１．３ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１１μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【０１２０】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１２１】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１２２】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１２３】
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１２４】
得られたシリカナノ粒子７のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０８ｎｍ、変動係数は１１％であった。
【０１２５】
得られたシリカナノ粒子７のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【０１２６】
得られたシリカナノ粒子の１ｎＭＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）分散液をそれぞれ調製し、日立分光光度計Ｆ−７０００を使用し、光退色実験を行った。サンプルホルダーにシリカナノ粒子ＰＢＳ分散液を石英セルにいれ、サンプルホルダーに固定した。励起波長６３３ｎｍとし、波長６７０ｎｍの蛍光強度を測定した。その後サンプルホルダーにセルを備えたまま励起光を１０分間照射し、再度蛍光強度を測定した。光照射前の蛍光強度を１００とし、３分間光照射後の蛍光強度を求めた。
【０１２７】
測定結果を表１に示す。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
表１に示した結果から明らかなように、本発明に係るジスルフィド結合をシリカ骨格内に有し、そのジスルフィド結合の還元によりメルカプト基を形成したシリカナノ粒子の５分後の蛍光強度は、公知技術のジスルフィド結合もメルカプト基もないものや、メルカプト基があってもジスルフィド結合の還元ではないもののそれに比べ、著しく大きい。このことは、本発明において、メルカプト基を空間的に近づけることができたことで、酸素を失活させることができ、光退色を抑制したと考えられる。
【０１３０】
《生体物質標識剤》
シリカナノ粒子２及び４を用い、分子修飾シリカナノ粒子Ａ及びＢを各々調製し、更にこれを用いて生体物質標識剤１及び２を調製して、生体物質標識剤の長期保存性を評価した。
【０１３１】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ａ：シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子２のアミノ基修飾）
シリカナノ粒子２ １ｍｇを純水５ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
【０１３２】
反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を行った。
【０１３３】
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ＡのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
【０１３４】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ｂ：ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子４のアミノ基修飾）
シリカナノ粒子４について、分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製と同様の手順で、アミノ基修飾を行った。
【０１３５】
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ＢのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
【０１３６】
〔生体物質標識剤１の調製〕
（生体物質標識剤１：アミノ基修飾シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製で得られたアミノ基修飾シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子へ０．５ｍｇを純水０．５ｍＬに分散させたもの０．１ｍＬをＤＭＳＯ２ｍＬに添加した。そこへ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をいれ１時間反応させた。過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣなどを遠心分離により除去する、一方で、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去した。
【０１３７】
ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理したシリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子と、ＤＴＴ処理した抗ｈＣＧ抗体を混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。ゲルろ過カラムにより未反応物を除去し、抗ｈＣＧ抗体が結合したシリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子（生体物質標識剤１）を得た。
【０１３８】
〔生体物質標識剤２の調製〕
（生体物質標識剤２：アミノ基修飾ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製で得られたアミノ基修飾ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子について、生体物質標識剤１の調製と同様の手順で、抗ｈＣＧ抗体が結合したジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子（生体物質標識剤２）を得た。
【０１３９】
生体物質標識剤１及び２を用いたイムノアッセイを下記の手順で行った。
１）マイクロプレート上ウェル内にアンチ−ｈαサブニットを固定化した。
２）抗原であるｈＣＧを各ウェルに濃度を変えて入れた。
３）過剰のｈＣＧを洗浄により除去後、各ウェルに生体物質標識剤分散液を入れた。
４）過剰の生体物質標識剤を洗浄により除去した。
５）マイクロプレートリーダーにより各ウェルの蛍光強度を測定した。励起光を３分間連続的に照射し、連続的に検出した蛍光強度を積算した。
【０１４０】
生体標識剤１を用い、ｈＣＧ抗体濃度が１０ｎｇ／ｍＬの時の蛍光強度積算値を１０００としたときの、それぞれの生体標識剤について各ｈＣＧ抗体濃度で測定した蛍光強度積算値を表２に示す。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
生体物質標識剤１又は生体物質標識剤２を用いたところ、どちらも抗原濃度に応じて蛍光強度が上昇した。すなわち、生体物質標識剤１及び生体物質標識剤２はいずれもＢ、抗原認識能を損なっていないことが言える。しかし、本発明の生体物質標識剤１は、従来技術により得られた生体物質標識剤２に比べ、極めて低濃度の抗体濃度であっても検出できることがわかった。
【０１４３】
このことは、励起光を連続照射しても本発明の生体物質標識剤１は光退色が少ないため、蛍光強度を積算することで積算値を上昇させるができたのに対し、生体物質標識剤２では光退色が大きいため励起光を連続照射して蛍光強度を積算しても蛍光強度積算値が上昇しないためといえる。すなわち、この結果により、本発明により高感度検出が可能な生体物質標識剤を提供することができることが分かる。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。より詳しくは、シリカ骨格中にジスルフィド結合をもち、かつ有機蛍光色素を内包したシリカナノ粒子及びそれを用いた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
疾病の診断あるいは病態の把握を目的に、血液などに含まれる特定の生体分子（バイオマーカー）の検出が注目されている。現在、生体分子の検出のために抗原抗体反応を利用した免疫分析（イムノアッセイ）が主に用いられている。酵素反応を利用した化学発光法が高感度とされ、現在主流である。
【０００３】
しかしながら、生体物質である酵素を用いるため温度管理などを厳密にするなど煩雑な操作が要求され、より簡便なシステムが求められている。
【０００４】
その一つとして予め蛍光物質で標識された生体物質標識剤を用いる蛍光イムノアッセイ法が知られている。蛍光物質としては、有機色素や、量子ドットを使用することができる。化学発光法に比べ、簡便な操作で行えるものの、用いる蛍光物質の蛍光強度が非常に小さいため、検出感度が十分でなかった。
【０００５】
近年より超早期での疾病の診断を行うため、すなわち、極微量のバイオマーカーの検出を行うため、より高蛍光強度を有する蛍光物質で標識された生体物質標識剤が求められている。その一つとして、複数の蛍光物質を一つのシリカナノ粒子に内包させる技術が開示されている（例えば特許文献１及び２参照）。
【０００６】
一方、特に近年、小動物を対象としたｉｎ ｖｉｖｏ光イメージングが注目されており、小動物の生体内の細胞を外部より、生体を傷つけることなく（非侵襲で）観察するような光学系装置が各メーカから販売され始めている。これは、生体内の観察したい部位に選択的に集まるような標識をつけた蛍光材料を生体内に注入し、外部より励起光を照射し出てきた発光を外部でモニターする方法である。
【０００７】
このように、生体内の蛍光材料を励起し、発光を外部に取り出すためには、励起光及び発光が生体を透過する必要がある。紫外光及び可視光は、生体の吸収が高く、ほとんど透過することができないので好ましくない。また、１０００ｎｍ以上の波長では、水の吸収が立ち上がり、透過率が低くなるため好ましくない。
【０００８】
しかしながら、赤〜近赤外線の６５０〜１０００ｎｍは、「生体の窓」及び「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域であり、この範囲内で励起及び発光を示す蛍光材料が求められている。従って有機蛍光色素内包シリカ粒子を本用途に用いるにあたり、その蛍光波長が、６５０〜１０００ｎｍにある有機蛍光色素を選択する必要がある。
【０００９】
ところが、本発明者らが特許文献１に開示されている方法により、蛍光波長が６７０ｎｍであるＣｙ５（商品名ＧＥヘルスケア社製品）を内包するシリカナノ粒子を作製し、その蛍光測定を行ったところ、非常に短時間の励起光照射で退色が起こってしまい、さらなる改善が必要であった。
【００１０】
蛍光色素の退色を低減する方法は古くから知られており、たとえば非特許文献１に記載されているようにメルカプトエタノールなどメルカプト基を有する分子の添加が広く行われている。メルカプト基はジスルフィド結合をつくることで還元性を示す。ここでは、活性な酸素を還元し、失活させることで、酸素による退色を防止できると考えられている。
【００１１】
しかしながら、メルカプトエタノールなどメルカプト基を有する分子はたんぱく質を変性する可能性があり、適用範囲が限られる。
【００１２】
一方、特許文献２には、メルカプト基を有するメルカプトプロピルトリメトキシシランを含み、かつ蛍光性物質を内包するシリカ粒子が開示されている。
【００１３】
そこで、本発明者らが、特許文献１及び２に開示されている方法により、メルカプトプロピルトリメトキシシランを原料に、Ｃｙ５を内包するシリカナノ粒子を作製し、その蛍光測定を行ったところ、短時間の励起光照射で退色が起こってしまい、さらなる改善が必要であることが分かった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７４７２２号
【特許文献２】国際公開第２００７／１４２３１６号
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】非侵襲・可視化技術ハンドブック ７１０ページ ＮＴＳ出版（２００７年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、上記問題・状況にかんがみなされたものであり、その解決課題は、光退色の少ない有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供することである。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明に係る上記課題は、以下の手段により解決される。
【００１８】
１．シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【００１９】
２．前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、下記一般式（１）で表されることを特徴とする前記第１項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式（１）： Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、酸素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００２０】
３．前記第１項又は第２項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、少なくとも下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程（ｂ）：還元反応を行う工程
４．前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、下記一般式（２）で表されるシラン化合物であることを特徴とする前記第３項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
一般式（２）： Ｒ５ｎ（Ｒ６Ｏ）ｍＳｉ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ７ｌ（ＯＲ８）ｋ
式中、ｎ及びｍはｎ＋ｍ＝３を満たし、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数を表す。ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒ５及びＲ７は非加水分解性の置換基を表す。Ｒ６Ｏ及びＲ８Ｏは、加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００２１】
５．前記第１項又は第２項に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の上記手段により、光退色の少ない有機蛍光色素内包シリカナノ粒子及びその製造方法を提供することができる。また、それを用いた生体物質標識剤を提供することができる。
【００２３】
本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討の結果、ジスルフィド結合を有する骨格をシリカ骨格内に有し、そのジスルフィド基が還元されてなるメルカプト基を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた場合、光退色が飛躍的に抑制可能となることを見出した。
【００２４】
従来法で得られるメルカプト基を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子では、メルカプト基同士が離れており、ジスルフィド結合が形成できず、酸素を還元できなかったため光退色が起こると考察している。
【００２５】
すなわち、ジスルフィド結合をシリカ骨格内に有し、そのジスルフィド基が還元されてなるメルカプト基を特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子、及びそれを用いた生体物質標識剤を得ることができることを見出し、本発明に至った次第である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする。この特徴は、請求項１から請求項５に係る発明に共通する技術的特徴である。
【００２７】
本発明の実施態様としては、本発明の効果発現の観点から、前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、前記一般式（１）で表されることが好ましい。
【００２８】
また、本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法としては、少なくとも前記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有する態様の製造方法であることが好ましい。この場合、前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、前記一般式（２）で表されるシラン化合物であることが好ましい。
【００２９】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されてなる生体物質標識剤に好適に用いることができる。
【００３０】
以下、本発明とその構成要素、及び発明を実施するための形態について詳細な説明をする。
【００３１】
〔有機蛍光色素〕
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子に用いられる有機蛍光色素としては、特に制限はないが、２００〜７００ｎｍの範囲内の波長の紫外〜近赤外光により励起されたときに、４００〜９００ｎｍの範囲内の波長の可視〜近赤外光の発光を示す態様の有機蛍光色素を用いることができる。なかでもｉｎ ｖｉｖｏ光イメージング用途を想定し、「生体の窓」及び「分光領域の窓」と呼ばれる生体の透過率が特異的に高い領域である赤〜近赤外線の６５０〜１０００ｎｍの範囲内にあることが好ましい。
【００３２】
有機色素としてフルオレセイン系色素分子、ローダミン系色素分子、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（インビトロジェン社製）系色素分子、ＢＯＤＩＰＹ（インビトロジェン社製）系色素分子、カスケード系色素分子、クマリン系色素分子、エオジン系色素分子、ＮＢＤ系色素分子、ピレン系色素分子、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ系色素分子、シアニン系色素分子等を挙げることができる。
【００３３】
具体的には、５−カルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−フルオレセイン、５，６−ジカルボキシ−フルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，４′，５′，７，７′−ヘキサクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−２′，４，７，７′−テトラクロロフルオレセイン、６−カルボキシ−４′，５′−ジクロロ−２′，７′−ジメトキシフルオレセイン、ナフトフルオレセイン、５−カルボキシ−ローダミン、６−カルボキシ−ローダミン、５，６−ジカルボキシ−ローダミン、ローダミン ６Ｇ、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ３５０，Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、ＢＯＤＩＰＹＦＬ，ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５（以上インビトロジェン社製）、メトキシクマリン、エオジン、ＮＢＤ、ピレン、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（以上ＧＥヘルスケア社製）等を挙げることができる。なかでも蛍光波長が６５０〜１０００ｎｍと「生体の窓」及び「分光領域の窓」にあたるＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７が好ましい。
【００３４】
それぞれアミノ基、メルカプト基、マレイミド基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、カルボキシル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基など活性エステル基誘導体として用いてもよい。この場合、含ケイ素アルコキシド化合物としてアミノ基を有するもの、例えばアミノプロピルトリエトキシシランを用いて、カルボン酸又は活性エステル基と反応させたものを用いることもできる。
【００３５】
〔有機蛍光色素内包シリカナノ粒子とその作製方法〕
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子は、シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分を含むことを特徴とする。
【００３６】
当該ジスルフィド結合を有する化学構造部分は、下記一般式（１）で表されるものであることが好ましい。
一般式（１）： Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、酸素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００３７】
Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、この場合、エステル結合、アミド結合などとなってもよい。また、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００３８】
好ましい例としては、後述する一般式（２）で表される化学物由来の構造である。
【００３９】
シリカナノ粒子は、公知の方法、例えば、ジャーナルオブコロイドサイエンス ２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている、アンモニア水などを用いたアルカリ性条件下でテトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解を行う「ストーバー法」と呼ばれる方法により製造することが好ましい。
【００４０】
粒径は、添加する水、エタノール、アルカリ量などについて公知の反応条件を適用することで自在に調整でき、平均粒径３０〜８００ｎｍ程度にできる。また、粒径のばらつきを示す変動係数は２０％以下とすることができる。
【００４１】
本発明において、平均粒径とは、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影し十分な数の粒子について断面積を計測し、その計測値を相当する円の面積としたときの直径を粒径として求めた。本願においては、１０００個の粒子の粒径の算術平均を平均粒径とした。変動係数も、１０００個の粒子の粒径分布から算出した値とした。
【００４２】
本発明の蛍光体内包シリカナノ粒子は、公知の方法例えば、非特許文献（ラングミュア８巻、２９２１ページ（１９９２年））に記載されている方法を参考にすることができる。
【００４３】
本発明の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法としては、少なくとも下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有する態様の製造方法であることが好ましい。
【００４４】
工程（ａ）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程（ｂ）：還元反応を行う工程
当該製造方法を、より詳しく説明するならば、下記工程（１）〜（６）を有する態様の製造方法であることが好ましい。
【００４５】
工程（１）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物、テトラエトキシシランなどの含ケイ素アルコキシド化合物及び有機蛍光色素（上述）を混合する。
【００４６】
工程（２）：エタノールなどの有機溶媒、水及び塩基を混合する。
【００４７】
工程（３）：工程（２）で調製した混合液を撹拌しているところに、工程（２）で得られた有機蛍光色素含有液を添加し、反応を進行させる。
【００４８】
工程（４）：ジスルフィド結合をメルカプト基に還元する。
【００４９】
工程（５）：反応混合物から生成した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を、ろ過若しくは遠心分離により回収する。
【００５０】
工程（６）：工程（５）で得られた有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を分子標識物質と結合させ、生体物質標識剤を得る。
【００５１】
上記工程（１）で用いられるジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物は、後工程の還元で生成したメルカプト基が還元性を示すようジスルフィド結合をあらかじめシリカ粒子骨格内にもたせる目的がある。
【００５２】
また、加水分解性置換基を有するシリル基をもつことは、加水分解反応によりシリカ粒子を製造する際に、同時に加水分解され、シリカ粒子骨格内に、ジスルフィド結合を固定する役割がある。これがないとジスルフィド結合を持つ分子が粒子内に内包されず、酸素の失活すなわち光退色の抑制効果がなくなる。
【００５３】
ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物の例としては、下記一般式（２）で表される化合物を用いることができる。
一般式（２）： Ｒ５ｎ（Ｒ６Ｏ）ｍＳｉ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ７ｌ（ＯＲ８）ｋ
式中、ｎ及びｍはｎ＋ｍ＝３を満たし、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数を表す。
【００５４】
ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒ５及びＲ７は非加水分解性の置換基を表す。Ｒ６Ｏ及びＲ８Ｏは、加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、この場合、エステル結合、アミド結合などとなってもよい。また、互いに同一でも異なっていてもよい。
【００５５】
具体的には、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド（以上ＧＥＬＥＳＴ社製）を挙げることができる。
【００５６】
上記工程（１）で用いられる含ケイ素アルコキシド化合物としては、テトラエトキシシラン、テトラメトキシシランといったテトラアルコキシドシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルエトキシシラン、フェニルトリエトキシシランなどのトリアルコキシシランなどを挙げることができる。また有機官能基を有する含ケイ素アルコキシド化合物をあげることができる。具体的にはグリシジルプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
【００５７】
含ケイ素アルコキシド化合物は、上記の一種若しくは二種以上を併用することもできる。
【００５８】
含ケイ素アルコキシド化合物と工程（１）で得られる有機蛍光色素結合分子の混合比に制限はないが、最終的に得られるシリカナノ粒子中に１×１０−６〜１×１０−２ｍｏｌ／Ｌの範囲内になるように混合することが好ましい。濃度を１×１０−６ｍｏｌ／Ｌ以上とすることで十分な蛍光が得られる。また１×１０−２ｍｏｌ／Ｌ以下とすることで、シリカ内で均一に分散でき、かつ濃度消光を防止できる点で好ましい。
【００５９】
含ケイ素アルコキシド化合物とジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子の混合比に制限はないが、モル比で２：１以上１０００：１以下になるように混合することが好ましい。ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する分子が多すぎると生成する粒子がいびつな形状となる。また低すぎる場合、ジスルフィド結合及びその酸化でできるメルカプト基が少なく、還元力が弱くなり光退色を抑制する点で不利になる。
【００６０】
上記工程（２）で用いられる有機溶媒としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、メタノール、エタノール、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどが用いられる。一種若しくは二種以上の混合としてもよい。
【００６１】
また、上記工程（２）で用いられる塩基としては、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で用いられるものであればよく、アンモニア、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムなどを用いることができ、それぞれ水溶液として用いてもよい。
【００６２】
含ケイ素アルコキシド化合物としてテトラエトキシシラン、有機溶媒としてエタノール、塩基としてアンモニア水を用いた場合のそれぞれの仕込みモル比を以下にあげる。
【００６３】
テトラエトキシシランを１ｍｏｌとした場合、エタノールをａ ｍｏｌ、水をｒ ｍｏｌ、アンモニアをｂ ｍｏｌとすると、ａは２０以上４００以下、ｒは１０以上２００以下、ｂは１０以上４０以下で混合する。具体的には、ジャーナルオブコロイドサイエンス２６巻、６２ページ（１９６８年）に記載されている条件を適用することができる。
【００６４】
上記工程（３）において、反応温度は通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、室温から５０℃の間で行うことができる。
【００６５】
蛍光色素含有液を添加する方法としては、限定されるものはなくシリンジポンプ、滴下ロートなど用いればよい。
【００６６】
上記工程（３）における反応時間は、通常の含ケイ素アルコキシド化合物の加水分解反応で適用される条件でよく、収率、不溶性副生成物の生成防止等の観点から、１時間以上５０時間以下であることが好ましい。
【００６７】
上記工程（４）により、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元する。ジスルフィド結合方法としては公知の方法、たとえば高温又は高濃度の変性剤（６Ｍ塩酸グアニジン、８Ｍ尿素、１％ＳＤＳ（硫酸ドデシルナトリウム）などを用いることができる。反応条件は、例えば、室温から５０℃の間で、３０分から２時間撹拌する。
【００６８】
上記工程（５）における反応混合物から生成した蛍光物質内包シリカナノ粒子の回収方法は、通常ナノ粒子の回収で行われるろ過、若しくは遠心分離などを用いることができる。回収した蛍光色素内包シリカナノ粒子は必要に応じて、未反応原料などを除くため、有機溶媒若しくは水による洗浄をしてもよい。
【００６９】
〔有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とを結合する有機分子〕
本発明に係る生体物質標識剤は、有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質とが有機分子により結合されている。上記結合の態様としては特に限定されず、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着及び化学吸着等が挙げられる。結合の安定性から共有結合などの結合力の強い結合が好ましい。
【００７０】
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の表面に結合し、分子標識物質とも結合しうる有機分子として、例えば無機物と有機物を結合させるために広く用いられている化合物であるシランカップリング剤を用いることができる。このシランカップリング剤は、分子の一端に加水分解でシラノール基を与えるアルコキシシリル基を有し、他端に、カルボキシル基、アミノ基、エポキシ基、アルデヒド基などの官能基を有する化合物であり、上記シラノール基の酸素原子を介して無機物と結合する。具体的には、メルカプトプロピルトリエトキシシラン、グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、アミノプロピルトリエトキシシランなどがあげられる。
【００７１】
また、後述する生体物質標識剤として用いる場合、生体物質との非特異的吸着を抑制するためポリエチレングリコール鎖をもつシランカップリング剤（例えば、Ｇｅｌｅｓｔ社製ＰＥＧ−ｓｉｌａｎｅ ｎｏ．ＳＩＭ６４９２．７）を用いることができる。
【００７２】
シランカップリング剤を用いる場合、二種以上を併用してもよい。
【００７３】
有機蛍光色素内包シリカナノ粒子とシランカップリング剤との反応手順は、公知の手法を用いることができる。例えば、得られた蛍光色素内包シリカナノ粒子を純水中に分散させ、アミノプロピルトリエトキシシランを添加し、室温で１２時間反応させる。反応終了後、遠心分離又はろ過により表面がアミノプロピル基で修飾された蛍光物質内包シリカナノ粒子を得ることができる。
【００７４】
〔生体物質標識剤〕
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と、分子標識物質と有機分子を介して結合させて得られる。
【００７５】
本発明に係る生体物質標識剤は分子標識物質が目的とする生体物質と特異的に結合及び／又は反応することにより、生体物質の標識が可能となる。
【００７６】
当該分子標識物質としては、例えば、ヌクレオチド鎖、タンパク質、抗体等が挙げられる。
【００７７】
具体例として、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した蛍光物質内包シリカナノ粒子のアミノ基と抗体中のカルボキシル基とを反応させることで、アミド結合を介し抗体を有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と結合させることができる。必要に応じＥＤＣ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−［３−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ］ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）のような縮合剤を用いることもできる。
【００７８】
必要により有機分子修飾された有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と直接結合しうる部位と、分子標的物質と結合しうる部位とを有するリンカー化合物を用いることができる。具体例としてアミノ基と選択的に反応する部位とメルカプト基と選択的に反応する部位の両方をもつｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４［Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ］−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ：Ｐｉｅｒｃｅ社製）を用いると、アミノプロピルトリエトキシシランで修飾した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子のアミノ基と、抗体中のメルカプト基を結合させることで、抗体結合した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子ができる。
【実施例】
【００７９】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、実施例において「部」あるいは「％」の表示を用いるが、特に断りがない限り「質量部」あるいは「質量％」を表す。
【００８０】
《有機蛍光色素内包シリカナノ粒子》
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子１の作製〕
ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基同一分子内にもつ化合物を用いて、下記工程（１）〜（４）の方法により、シリカナノ粒子１を作製した。
【００８１】
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＧＥヘルスケア社製） １ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１０μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン ４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【００８２】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【００８３】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【００８４】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００８５】
得られたシリカナノ粒子１の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ；日立社製Ｓ−８００型）観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１２％であった。
【００８６】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の還元物（シリカナノ粒子２）の作製〕
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ １ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００８７】
得られたシリカナノ粒子２のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０８ｎｍ、変動係数は１１％であり、シリカナノ粒子１と変化なかった。
【００８８】
得られたシリカナノ粒子２のＦＴ−ＩＲ（日本分光社製 ＦＴ／ＩＲ−４１００）測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【００８９】
〔ジスルフィド結合なし、メルカプト基なしシリカナノ粒子３の作製〕
特許文献１にならい下記工程（１）〜（５）の方法により、ジスルフィド結合もメルカプト基のどちらも有しないＣｙ５内包シリカナノ粒子３を作製した。
【００９０】
工程（１）：Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体１ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）をジメチルホルムアミド１ｍＬに溶解させたところに、室温下３−アミノプロピルトリエトキシシラン（信越化学工業社製）１μＬ添加し、３０分撹拌した。
【００９１】
工程（２）：上記工程（１）で得られたＤＭＦ溶液及びテトラエトキシシラン４００μＬを混合した。
【００９２】
工程（３）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【００９３】
工程（４）：上記工程（３）で作製した混合液を室温下、撹拌しているところに、工程（３）で作製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【００９４】
工程（５）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【００９５】
得られたシリカナノ粒子３のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１２０ｎｍ、変動係数は１３％であった。
【００９６】
〔ジスルフィド結合なし、メルカプト基ありシリカナノ粒子４の作製〕
特許文献２にならい下記工程（１）〜（５）の方法により、ジスルフィド結合をもたず、メルカプト基を有するＣｙ５内包シリカ粒子４を作製した。
【００９７】
工程（１）：Ｃｙ５のマレイミド誘導体（ＧＥヘルスケア社製）１ｍｇをジメチルスルホキシド０．０５ｍＬに溶解させたところに、メルカプト基を有する３−メルカプトプロピルトリメトキシシランをＣｙ５のマレイミド誘導体と等モルになるよう添加混合し、２時間撹拌した。
【００９８】
工程（２）：上記工程（１）で得られたジメチルスルホキシド溶液と、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン７．５μＬを混合した。
【００９９】
工程（３）：上記工程（２）で作製した混合液に、２８質量％アンモニア水溶液６７５μＬを添加混合の後、１００度で１１時間反応させた。
【０１００】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０１】
得られたシリカナノ粒子４のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径３６０ｎｍ、変動係数は１９％であった。
【０１０２】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製及びその還元物（シリカナノ粒子５）の作製〕
Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（インビトロジェン社製）を用いた他はシリカナノ粒子１と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
【０１０３】
工程（１）：Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（インビトロジェン社製）１．６ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１０μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【０１０４】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１０５】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１０６】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０７】
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１０８】
得られたシリカナノ粒子５のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１１０ｎｍ、変動係数は１０％であった。
【０１０９】
得られたシリカナノ粒子５のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【０１１０】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製及びその還元物（シリカナノ粒子６）の作製〕
Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＡｎａＳｐｅｃ社製）を用いた他はシリカナノ粒子１と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
【０１１１】
工程（１）ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ ６４７のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＡｎａＳｐｅｃ社製）１．６ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１０μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【０１１２】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１１３】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１１４】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１１５】
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１１６】
得られたシリカナノ粒子６のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０３ｎｍ、変動係数は１２％であった。
【０１１７】
得られたシリカナノ粒子６のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【０１１８】
〔シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製及びその還元物（シリカナノ粒子７）の作製〕
Ｃｙ５のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体の代わりに、ＤｙＬｉｇｈｔ６４９のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］ジスルフィドの代わりに、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）を用いた他はシリカナノ粒子１と同様の手順によりシリカ骨格内にジスルフィド結合を有する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の作製、及びその還元物の作製を行った。
【０１１９】
工程（１）ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル誘導体（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）１．３ｍｇ（０．００１２６ｍｍｏｌ）、ビス［３−（トリエトキシシリル）プロピル］テトラスルフィド（ＧＥＬＥＳＴ社製）１１μＬ（０．０２１ｍｍｏｌ）及びテトラエトキシシラン４００μＬ（１．７９６ｍｍｏｌ）を混合した。
【０１２０】
工程（２）：エタノール４０ｍＬ、１４％アンモニア水１０ｍＬを混合した。
【０１２１】
工程（３）：工程２で作製した混合液を室温下撹拌しているところに、工程（１）で調製した混合液を添加した。添加開始から１２時間撹拌を行った。
【０１２２】
工程（４）：反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１２３】
工程（５）：工程（４）で得られたシリカナノ粒子１ｎＭ水分散液を調製したところに、８Ｍ尿素を添加、室温下２時間撹拌した。反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を一回ずつ行った。
【０１２４】
得られたシリカナノ粒子７のＳＥＭ観察を行ったところ、平均粒径１０８ｎｍ、変動係数は１１％であった。
【０１２５】
得られたシリカナノ粒子７のＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、メルカプト基に由来する吸収が観測でき、ジスルフィド結合をメルカプト基に還元できたことを確認した。
【０１２６】
得られたシリカナノ粒子の１ｎＭＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）分散液をそれぞれ調製し、日立分光光度計Ｆ−７０００を使用し、光退色実験を行った。サンプルホルダーにシリカナノ粒子ＰＢＳ分散液を石英セルにいれ、サンプルホルダーに固定した。励起波長６３３ｎｍとし、波長６７０ｎｍの蛍光強度を測定した。その後サンプルホルダーにセルを備えたまま励起光を１０分間照射し、再度蛍光強度を測定した。光照射前の蛍光強度を１００とし、３分間光照射後の蛍光強度を求めた。
【０１２７】
測定結果を表１に示す。
【０１２８】
【表１】
【０１２９】
表１に示した結果から明らかなように、本発明に係るジスルフィド結合をシリカ骨格内に有し、そのジスルフィド結合の還元によりメルカプト基を形成したシリカナノ粒子の５分後の蛍光強度は、公知技術のジスルフィド結合もメルカプト基もないものや、メルカプト基があってもジスルフィド結合の還元ではないもののそれに比べ、著しく大きい。このことは、本発明において、メルカプト基を空間的に近づけることができたことで、酸素を失活させることができ、光退色を抑制したと考えられる。
【０１３０】
《生体物質標識剤》
シリカナノ粒子２及び４を用い、分子修飾シリカナノ粒子Ａ及びＢを各々調製し、更にこれを用いて生体物質標識剤１及び２を調製して、生体物質標識剤の長期保存性を評価した。
【０１３１】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ａ：シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子２のアミノ基修飾）
シリカナノ粒子２ １ｍｇを純水５ｍＬに分散させた。アミノプロピルトリエトキシシラン水分散液１００μＬを添加し、室温で１２時間撹拌した。
【０１３２】
反応混合物を１００００ｇで６０分遠心分離を行い、上澄みを除去した。エタノールを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順でエタノールと純水による洗浄を行った。
【０１３３】
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ＡのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
【０１３４】
〔分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製〕
（分子修飾シリカナノ粒子Ｂ：ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子４のアミノ基修飾）
シリカナノ粒子４について、分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製と同様の手順で、アミノ基修飾を行った。
【０１３５】
得られたアミノ基修飾したシリカナノ粒子ＢのＦＴ−ＩＲ測定を行ったところ、アミノ基に由来する吸収が観測でき、アミノ基修飾できたことを確認できた。
【０１３６】
〔生体物質標識剤１の調製〕
（生体物質標識剤１：アミノ基修飾シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ａの調製で得られたアミノ基修飾シリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子へ０．５ｍｇを純水０．５ｍＬに分散させたもの０．１ｍＬをＤＭＳＯ２ｍＬに添加した。そこへ、ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ社製）をいれ１時間反応させた。過剰のｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣなどを遠心分離により除去する、一方で、抗ｈＣＧ抗体を１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）で還元処理を行い、ゲルろ過カラムにより過剰のＤＴＴを除去した。
【０１３７】
ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ処理したシリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子と、ＤＴＴ処理した抗ｈＣＧ抗体を混合し、１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。ゲルろ過カラムにより未反応物を除去し、抗ｈＣＧ抗体が結合したシリカ骨格内のジスルフィド結合の還元によるメルカプト基もつシリカナノ粒子（生体物質標識剤１）を得た。
【０１３８】
〔生体物質標識剤２の調製〕
（生体物質標識剤２：アミノ基修飾ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子への抗体結合体）
分子修飾シリカナノ粒子Ｂの調製で得られたアミノ基修飾ジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子について、生体物質標識剤１の調製と同様の手順で、抗ｈＣＧ抗体が結合したジスルフィド結合の還元ではないメルカプト基をもつシリカナノ粒子（生体物質標識剤２）を得た。
【０１３９】
生体物質標識剤１及び２を用いたイムノアッセイを下記の手順で行った。
１）マイクロプレート上ウェル内にアンチ−ｈαサブニットを固定化した。
２）抗原であるｈＣＧを各ウェルに濃度を変えて入れた。
３）過剰のｈＣＧを洗浄により除去後、各ウェルに生体物質標識剤分散液を入れた。
４）過剰の生体物質標識剤を洗浄により除去した。
５）マイクロプレートリーダーにより各ウェルの蛍光強度を測定した。励起光を３分間連続的に照射し、連続的に検出した蛍光強度を積算した。
【０１４０】
生体標識剤１を用い、ｈＣＧ抗体濃度が１０ｎｇ／ｍＬの時の蛍光強度積算値を１０００としたときの、それぞれの生体標識剤について各ｈＣＧ抗体濃度で測定した蛍光強度積算値を表２に示す。
【０１４１】
【表２】
【０１４２】
生体物質標識剤１又は生体物質標識剤２を用いたところ、どちらも抗原濃度に応じて蛍光強度が上昇した。すなわち、生体物質標識剤１及び生体物質標識剤２はいずれもＢ、抗原認識能を損なっていないことが言える。しかし、本発明の生体物質標識剤１は、従来技術により得られた生体物質標識剤２に比べ、極めて低濃度の抗体濃度であっても検出できることがわかった。
【０１４３】
このことは、励起光を連続照射しても本発明の生体物質標識剤１は光退色が少ないため、蛍光強度を積算することで積算値を上昇させるができたのに対し、生体物質標識剤２では光退色が大きいため励起光を連続照射して蛍光強度を積算しても蛍光強度積算値が上昇しないためといえる。すなわち、この結果により、本発明により高感度検出が可能な生体物質標識剤を提供することができることが分かる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【請求項２】
前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式（１）： Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、酸素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、少なくとも下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程（ｂ）：還元反応を行う工程
【請求項４】
前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、下記一般式（２）で表されるシラン化合物であることを特徴とする請求項３に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
一般式（２）： Ｒ５ｎ（Ｒ６Ｏ）ｍＳｉ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ７ｌ（ＯＲ８）ｋ
式中、ｎ及びｍはｎ＋ｍ＝３を満たし、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数を表す。ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒ５及びＲ７は非加水分解性の置換基を表す。Ｒ６Ｏ及びＲ８Ｏは、加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【請求項１】
シリカ粒子中に有機蛍光色素を内包した有機蛍光色素内包シリカナノ粒子であって、シリカ骨格内にジスルフィド結合を有する化学構造部分と当該ジスルフィド結合が還元されて生じたメルカプト基を有する化学構造部分とを含むことを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
【請求項２】
前記ジスルフィド結合を有する化学構造部分が、下記一般式（１）で表されることを特徴とする請求項１に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子。
一般式（１）： Ｏ−ＳｉＲ１Ｒ２−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ３Ｒ４−Ｏ
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、各々独立に、酸素原子又は炭素数１〜６のアルキル基、又は炭素数６〜１０のアリール基を表し、互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項３】
請求項１又は請求項２に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を製造する有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法であって、少なくとも下記工程（ａ）及び工程（ｂ）を有することを特徴とする有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
工程（ａ）：ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物を、有機蛍光色素及び含ケイ素アルコキシドと混合し、塩基性条件下、加水分解反応を行う工程
工程（ｂ）：還元反応を行う工程
【請求項４】
前記ジスルフィド結合及び加水分解性置換基を有するシリル基を有する化合物が、下記一般式（２）で表されるシラン化合物であることを特徴とする請求項３に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子の製造方法。
一般式（２）： Ｒ５ｎ（Ｒ６Ｏ）ｍＳｉ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−ＳｉＲ７ｌ（ＯＲ８）ｋ
式中、ｎ及びｍはｎ＋ｍ＝３を満たし、ｍは０〜２の整数、ｎは１〜３の整数を表す。ｌ及びｋはｌ＋ｋ＝３を満たし、ｌは０〜２の整数、ｋは１〜３の整数を表す。Ｒ５及びＲ７は非加水分解性の置換基を表す。Ｒ６Ｏ及びＲ８Ｏは、加水分解性の炭素数１〜６のアルコキシ基を表し、複数ある場合互いに同一でも異なっていてもよい。Ｘ及びＹは、各々独立に、直鎖状又は途中に枝分かれ構造を有する、炭素数１〜１２の炭化水素鎖を表し、途中に、酸素原子、硫黄原子、又は窒素原子のいずれかのヘテロ元素を含んでよく、互いに同一でも異なっていてもよい。
【請求項５】
請求項１又は請求項２に記載の有機蛍光色素内包シリカナノ粒子を用いた生体物質標識剤であって、当該有機蛍光色素内包シリカナノ粒子と分子標識物質とが、有機分子を介して結合されていることを特徴とする生体物質標識剤。
【公開番号】特開２０１１−２３１２００（Ｐ２０１１−２３１２００Ａ）
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１０−１０１８６６（Ｐ２０１０−１０１８６６）
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【出願人】（３０３０００４２０）コニカミノルタエムジー株式会社 (2,950)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２３年１１月１７日（２０１１．１１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年４月２７日（２０１０．４．２７）
【出願人】（３０３０００４２０）コニカミノルタエムジー株式会社 (2,950)
【Ｆターム（参考）】
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