核酸分析デバイス及び核酸分析装置
【課題】
本発明の目的は、塩基伸長反応によってプローブに取り込まれるヌクレオチドに付随する蛍光色素一分子と、未反応基質の蛍光分子と、を識別することに関する。
【解決手段】
本発明は、蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスにおいて、光照射により局在型表面プラズモンが発生し、かつ、試料中の核酸を分析するためのプローブが前記表面プラズモンの発生部位に配置されていることに関する。本発明により、表面プラズモンによる蛍光増強効果を効率よく引き起こし、かつ、プローブを蛍光増強効果が及ぶ領域に固定できるため、蛍光分子付き未反応基質を除去しなくとも、塩基伸長反応を計測することが可能となる。
本発明の目的は、塩基伸長反応によってプローブに取り込まれるヌクレオチドに付随する蛍光色素一分子と、未反応基質の蛍光分子と、を識別することに関する。
【解決手段】
本発明は、蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスにおいて、光照射により局在型表面プラズモンが発生し、かつ、試料中の核酸を分析するためのプローブが前記表面プラズモンの発生部位に配置されていることに関する。本発明により、表面プラズモンによる蛍光増強効果を効率よく引き起こし、かつ、プローブを蛍光増強効果が及ぶ領域に固定できるため、蛍光分子付き未反応基質を除去しなくとも、塩基伸長反応を計測することが可能となる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析デバイス及び核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、非特許文献１にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、まず、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ、検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程を実施する。次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を実施する。これら３工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより、試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５０１３９１号公報
【特許文献２】特開２００２−２１４１４２号公報
【特許文献３】特開２００７−２４０３６１号公報
【特許文献４】特開２００８−２０４１２号公報
【特許文献５】ＵＳＰ６０１７６９６
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【非特許文献２】Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005.
【非特許文献３】Anal. Chem. vol. 78, 6238-6245.
【非特許文献４】Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 44017-44021.
【非特許文献５】Nano Letters. 2004, vol.4, 957-961．
【非特許文献６】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640．
【非特許文献７】P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
基板上における伸長反応を用いて塩基配列を解析する場合、非特許文献１で開示された方式に代表されるような、一塩基伸長反応・未反応基質の洗浄・計測を一サイクルとした、いわば、逐次反応方式のものが一般的である。単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列を解析する場合、プローブＤＮＡ上の、一塩基伸長反応によってＤＮＡ二本鎖中に取り込まれたヌクレオチドに付随した蛍光色素一分子の蛍光を計測することになる。しかし、通常の蛍光測定では、プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光分子とその近傍に浮遊している未反応のヌクレオチドに付随している蛍光色素を識別することはできない。そのため、一塩基ずつ伸長したところで、未反応基質を洗浄することが不可欠であった。この洗浄工程が入ることにより、基板上に複雑な流路や送液装置及び廃液処理装置を形成する必要があること、反応試薬も大量に消費してしまうこと、さらに、トータルの解析に必要な反応時間も長くなるという問題があった。
【０００７】
プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光色素一分子と未反応基質の蛍光分子とを識別するためには、プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光色素からの蛍光強度が大きく、浮遊する色素からの強度が小さい条件を作り出さねばならない。
【０００８】
本発明の目的は、塩基伸長反応によってＤＮＡ二本鎖中に取り込まれるヌクレオチドに付随する蛍光色素一分子と、未反応基質の蛍光分子と、を識別することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、発明者らが鋭意検討した結果、複数の向き合った金属体の間に生じる局在型表面プラズモンによる蛍光増強場内に測定のためのプローブを配置し、塩基伸長反応によるＤＮＡ二本鎖中に取り込まれるヌクレオチドに付随する蛍光色素と浮遊する色素を識別する方法を見出した。特に、強い蛍光増強場を作り出す金属構造体の形状と、その局在化された増強場内に測定のためのプローブを固定する方法を鋭意検討し、それらを両立しうる方法を見出した。
【００１０】
本発明は、蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスにおいて、光照射により局在型表面プラズモンが発生し、かつ、試料中の核酸を測定するためのプローブが前記表面プラズモンの発生部位に配置されていることに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、局在型表面プラズモンによる蛍光増強効果を効率よく引き起こし、かつ、測定のためのプローブを蛍光増強効果が及ぶ領域に固定できるため、蛍光分子付き未反応基質を除去しなくとも、塩基伸長反応を計測することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本実施例では、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体を備え、前記支持基体上に接して複数の金属体が向き合って存在し、前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、前記空間と前記支持基体との間に前記金属体とは異なる第二の金属が存在し、前記第二の金属上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイスを開示する。前記金属体を構成する金属と第二の金属との反応性の差を用いて、測定のためのプローブを第二の金属上に特異的に配置することができる。
【００１３】
また、本実施例では、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体を備え、前記支持基体上に接して複数の金属体が向き合って存在し、前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、前記空間と前記支持基体との間に絶縁体が存在し、前記絶縁体上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイスを開示する。前記金属体を構成する金属と絶縁体との反応性の差を用いて、測定のためのプローブを絶縁体上に特異的に配置することができる。
【００１４】
さらに、本実施例では、前記発光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。検出機器の光学フィルタを組み合わせることで、２色以上の蛍光を同時に検出することができる。
【００１５】
さらに、本実施例では、前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。核酸または核酸合成酵素などのタンパク質は、測定対象である核酸を取り込み際の特異性が高く、測定対象のみを特異的に測定することができる。
【００１６】
さらに、本実施例では、前記金属体が、金，銀，白金，アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。これら金属は、局在型表面プラズモンによる増強効果を高めることができる。
【００１７】
さらに、本実施例では、前記複数の向き合った金属体が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。支持基体上の任意の反応点のみを分析すれば良いので、分析装置の構成を簡略化することができる。
【００１８】
さらに、本実施例では、前記複数の金属体間の距離が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。金属体間の距離を小さくすることで、局在型プラズモンによる増強効果を高めることができる。また、測定のためのプローブ固定領域を小さくすることができ、単分子のみが固定化されたグリッドの割合を高めることができる。
【００１９】
さらに、本実施例では、前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。測定対象の核酸に対する増幅工程が不要であるため、解析時間を短縮することができる。
【００２０】
さらに、本実施例では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記蛍光色素を有するヌクレオチド，前記核酸合成酵素，前記プライマ及び前記核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置を開示する。局在型表面プラズモンによる増強効果より、高感度検出に必要な高価な光学部材が不要となる。
【００２１】
さらに、本実施例では、前記核酸分析デバイスに、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、前記核酸分析デバイスに光を照射し、前記金属体が向き合った空間に局在型表面プラズモンを発生させ、前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、核酸試料の塩基配列を解析する方法を開示する。
【００２２】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
【００２３】
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
本実施例のデバイスについて、図１を用いて説明する。プローブ１０１上に捕捉された蛍光色素１０２と未反応基質の蛍光色素１０３とを識別するためには、プローブ１０１上に捕捉された蛍光色素１０２と、浮遊する未反応の蛍光色素１０３に照射される光の強度を変えるか、あるいは、プローブ１０１上の蛍光色素１０２だけの輻射過程を効率よく起こるようにする必要がある。本実施例は、後者の考え方に基づくものであり、Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005（非特許文献２）に報告されているように、局在型表面プラズモンが分子の光吸収による電子遷移と励起一重項から基底状態への輻射遷移の両方の確率を高めるという物理現象に基づくものである。局在型表面プラズモンの蛍光増強効果は、数倍から数十倍程度見込むことができる。その影響が及ぶ範囲は、支持基体１０４上の金属体１０５の構造，形状より異なる。本実施例で示した三角柱に類した構造体が向き合った場合、局在型表面プラズモンによる蛍光増強場は空間１０６となる。従って、本実施例では、プローブ１０１に取り込まれた蛍光色素１０２だけが蛍光増強の恩恵を受け、浮遊する蛍光色素１０３とは数倍から数十倍以上の蛍光強度の差がもたらされる。
【００２５】
表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、Anal. Chem. vol. 78, 6238-6245（非特許文献３）に報告されているようなナノ・メートルオーダーの銀の島構造を用いたものや、Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 44017-44021（非特許文献４）に報告されているような金の直径数十ナノ・メートルの球状微粒子を用いたものが知られている。しかしながら、一つ一つのプローブに対して島状構造を有するパッドや球状微粒子をガラス基板等の平滑基板上に数万から数十万個配置することはほとんど不可能である。特に、プローブを所定の箇所に固定することは不可能である。そこで、発明者らは、強力な局在型表面プラズモンを生成し、かつ、局在型表面プラズモン発生部位近傍の空間１０６にプローブ１０１を固定化しうる構造を鋭意検討した。さらに、製造コストを考えると、半導体や配線基板の製造に用いられている薄膜プロセスを活用して製造できる構造となることも好ましいと考え、構造を検討した。
【００２６】
三角柱が近接すると、その間の空間には、強力な局在型表面プラズモンが発生することが、Nano Letters. 2004, vol.4, 957-961（非特許文献５）に示されている。三角柱間の距離が近いほど強力な局在型表面プラズモンを発生することができる。しかしながら、この金属体の構造では、局在型表面プラズモンが発生する空間に特異的に測定のためのプローブを配置することができない。本発明者らは、鋭意検討した結果、局在型表面プラズモンが発生する空間１０６と支持基体１０４の間に三角柱を構成する金属とは異なる第二の金属１０７を配置することで、その第二の金属１０７にプローブ１０１を固定した構造体を考案した。
【００２７】
局在型表面プラズモンを発生することができる金属体１０５は、金，銀，白金，アルミニウム、または銅などが知られている。第二の金属１０７としては、金属体１０５表面との化学的な性質の差を用いて、プローブ１０１を特異的に固定化できるものであれば特に制限はない。また、適した官能基を選択し、それを第二の金属に付与するか、あるいはプローブ１０１内の官能基と前記官能基またはこれを反応基点として、さらに修飾が施された官能基を反応させることで所望のプローブ１０１を固定化しても良い。この様な金属体１０５と第二の金属１０７の組み合わせとしては、金属体１０５が金，銀，白金などの貴金属であれば、第二の金属１０７は、チタン，ニッケル，クロム，鉄，コバルト，カドミウム，アルミニウム，ガリウム，インジウム，ジルコニア，ニオブ，ハフニウム，タンタルから選ばれる少なくとも１種類以上の金属、また、これらの合金が挙げられる。または、ＩＴＯなどの導電性の酸化膜を用いても良い。第二の金属１０７表面上に形成した酸化膜上に、カルボン酸，ホスホン酸，リン酸エステル，有機シラン化合物を反応させることで、プローブ１０１を固定するための所望な官能基を導入することができる。金属体１０５がアルミニウム、または銅などの場合、第二の金属として、金，銀，水銀，インジウム，パラジウム，ルテニウム，亜鉛から選ばれる少なくとも１種類以上の金属、または、これらの合金が挙げられる。第二の金属表面に、有機硫黄化合物，有機セレン化合物、または、有機テルル化合物などを反応させることで、プローブ１０１を固定するための所望な官能基を導入することができる。
【００２８】
次に、本実施例の空間１０６と支持基体１０４との間に絶縁体が存在する構造体について説明する。用いられる絶縁体としては特に制限はないが、微小領域の加工性の点より、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition），ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などで薄膜が形成可能な材料が望ましい。この様な材料としては、シリコン，チタン，ベリリウム，ジルコニウム，タングステン，ホウ素，ハフニウム，バナジウム，タンタル，アルミニウム，トリウム，モリブデン，鉄などの炭化物，窒化物，ホウ化物，ケイ化物、または酸化物などが挙げられる。
【００２９】
第二の金属１０７や絶縁体上に導入される官能基についても特に制限はないが、プローブ１０１を固定するための反応基点として、アミノ基，チオール基，カルボキシル基，ヒドロキシル基，アルデヒド基，ケトン基などが挙げられる。さらに、プローブ１０１を固定するための反応効率を高める手法として、二価性の化合物を用いて、ＮＨＳ−エステル基，イミドエステル基，スルフィジル基，エポキシ基，ヒドラジド基などの官能基を導入しても良い。また、増強場内への単分子固定化率を高めるために、アビジン，デンドロン，クラウンエーテルなどの嵩高い化合物を介して、プローブ１０１を固定しても良い。
【００３０】
プローブ１０１についても、測定対象の核酸１０８を捕捉できるものであれば特に制限はない。核酸１０８を直接捕捉できる様なプローブとしては、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡなどの核酸、または、酵素などのタンパク質が挙げられる。また、染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター、ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを介して、核酸１０８を捕捉しても良い。
【００３１】
金属体１０５の適切な形状，大きさは、照射する光の波長によって異なる。すなわち、表面プラズモンの発生に適する共鳴周波数は、金属構造体表面の自由電子群と光との相互作用によるものである。励起光を可視光とすると、金属構造体の大きさは、幅・高さともに、１０から１０００ｎｍ程度が適しているが、この条件に縛られるものではない。図２（Ａ）の様な円柱が角柱で結ばれ、角柱の間に局在型表面プラズモンが発生する空間２０６があるもの、（Ｂ）の様に、円柱が並んで、最も小さい円柱内に空間２０６があるものなどが挙げられる。また、（Ｃ）の様に、金属体２０５，空間２０６、及び第二の金属２０７以外の領域を支持基体２０４を構成する材料よりも屈折率が低い材料２０９で覆っても良い。屈折率が低い材料２０９で覆われた領域に、未反応の蛍光色素が入れないため、この蛍光色素由来のバックグランドを低減することができる。
【００３２】
第二の金属上にプローブを固定した核酸分析デバイスの製造方法を、図３を用いて説明する。
【００３３】
（１）第二の金属膜の形成
平滑な支持基体３０４上に第二の金属３０７（薄膜）を形成する。平滑な支持基体３０４には、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板等が用いられる。金属体３０５を形成した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。第二の金属３０７は、上記裏面より励起光を照射する場合にはその厚さは薄いほど好ましく、より好ましくは５〜１００ｎｍである。薄膜は蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いて作られる。
【００３４】
（２）シリコン膜の形成，（３）シリコンのパターニング
第二の金属３０７上に、厚さが５ｎｍ以上にシリコン膜を形成する。薄膜形成方法は、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどが好ましい。得られたシリコン膜に対して、フォトリソグラフィ，エッチングを施し、金属体３０５間の局在型表面プラズモンが生じる空間３０６を作成するためのパターニングを行う。パターンは、向き合った金属体３０５をアレイ状に配置するための所望のパターンに準じる。例えば、１μｍピッチで向き合った金属体３０５を構成した場合、形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。フォトリソグラフィは、既存のｉ線（波長３６５ｎｍ），ＫｒＦエキシマレーザー（波長２４８ｎｍ），ＡｒＦエキシマレーザー（波長１９３ｎｍ），Ｘ線、または電子線を光源とした方法を用いることができる。エッチングのパターニングの精度を高めるには、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）を用いることが好ましい。
【００３５】
（４）絶縁膜の形成，（５）絶縁膜のエッチング，（６）シリコンのエッチング
シリコン上にＣＶＤを用いて、絶縁膜を形成する。絶縁膜の厚さは、金属体３０５間の距離を制御するものである。金属体３０５間の距離が短い程、局在型表面プラズモンによる蛍光増強効果を高めることができる。好ましい厚さは５０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。本実施例の絶縁膜の膜厚で制御する方法は、１５ｎｍ以下の距離の制御も精度良く行え、製造上のバラツキを小さくできる。この様な絶縁膜としては、半導体のゲート電極のサイドウォール（側壁酸化膜）製造プロセスで用いられる二酸化ケイ素や窒化ケイ素が好ましい。本実施例では、絶縁膜を用いるプロセスを示したが、（４）の薄膜形成から（６）のエッチングプロセスでの膜厚を制御できればよく、金属膜で実施しても良い。これらのプロセスで用いられるエッチングについては、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。
【００３６】
（７）金属膜の形成，（８）仕切り板の除去
金属膜の厚さは、金属体３０５の高さを制御するものである。局在型表面プラズモンが効果的に生じる厚さは、計測時に用いる励起波長により異なる。望ましい厚さは１０００ｎｍ以下である。薄膜形成方法としては、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いることができる。仕切り板の除去は、一般的なウェット（またはドライ）エッチングを行う。具体的には、二酸化ケイ素，窒化ケイ素ともに、フッ酸または、フッ酸を含む溶液を用いる。
【００３７】
（９）レジスト塗布，（１０）パターニング
パターニングの大きさや形状は、局在型表面プラズモンの効果に大きく関わる。図３に示した様な、三角形に類似した形状であれば、三角形の一辺が１０００ｎｍ以下であることが好ましい。レジスト３１３としては、電子線用のネガ型ポジストを用いることができる。具体的には、ＴＥＢＮ−１（株式会社トクヤマ社製）が挙げられる。レジストをスピンナーで塗布した後、ホットプレートで２〜５分程度プリベイクする。加速電圧５０〜１００ＫＶの電子線で描画した後、乳酸エチル，イソプロパノール、またはエタノールで現像する。
【００３８】
（１１）エッチング，（１２）レジスト除去
パターニングされたレジストをマスクとして、金属体３０５を形成する。パターン精度を高めるには、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。レジスト除去には、広く一般的に用いられるオゾンアッシングのプロセスを用いることができる。
【００３９】
（１３）プローブ固定
プローブ１０１が核酸である場合、固定方法には種々の方法が考えられるが、例としてアミノシラン処理を用いる方法を記述する。第二の金属３０７の酸化膜にアミノシラン処理を行い、アミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応する。次に、予めビオチンを末端に修飾しておいたプローブを反応させることにより、近接した二つの金属体３０５の間に
プローブを固定する。これにより、核酸分析デバイスが完成する。
【００４０】
プローブ１０１が核酸合成酵素の様なタンパク質であっても、同様の方法で固定化することができる。具体的には、アミノ化された酸化膜上に二価性試薬であるＮ−（４−Maleimidobutyryloxy）succinimide（同仁化学研究所社製，ＧＭＢＳ）を反応させた後、核酸合成酵素を反応させることで核酸合成酵素を固定することができる。その他、酸化膜上にニトロセルロース，ポリアクリルアミドなどとの物理吸着を利用する方法，ヒスチジンとニッケルイオンやコバルトイオンとの特異的な親和を利用する方法、またはビオチンとアビジンの結合を利用する方法などを用いることができる。
【００４１】
絶縁体上にプローブを固定した核酸分析デバイスの製造方法について、図４を用いて、図３との違いを中心に説明する。
【００４２】
（１）絶縁膜の形成
支持基体４０４上に、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどにより、絶縁膜４１４を形成した後、金属膜４０７を形成する。金属膜４０７は、絶縁膜４１４と金属体４０５と密着性を向上させるものである。絶縁膜４１４として、スピンコータで製膜可能な層間絶縁膜（日立化成工業社製，ＨＳＧ）などを用いても良い。（２）シリコン膜の形成〜（８）仕切り板の除去のプロセスは図３と同様である。
【００４３】
（Ａ）金属膜のエッチング
空間４０６界面に絶縁膜４１４を露出させるために、金属膜４０７をエッチングする。エッチングはドライ（または、ウェット）エッチングのどちらでも良いが、加工精度を高めるためには、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。（９）レジスト塗布〜（１３）プローブ固定のプロセスは図３と同様に行う。
【実施例２】
【００４４】
核酸分析デバイスの使用形態の一例について図５を参照しながら説明する。支持基体５０１の上に、金属体が格子状に配置されている領域５０２が複数搭載されている。金属体は、先に述べた、近接した二つの金属体の間にプローブを固定した構造体が該当する。配置の間隔は、解析しようとする核酸試料，蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを支持基体５０１とし、１マイクロ・メートル間隔で格子状に金属構造体を配置した領域５０２を５mm×８mmとすると、１領域当たり４０００万種類の核酸分子を解析でき、その領域を８個程度、支持基体５０１上に搭載することができる。したがって、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分に正確に行うことができ、一枚の基板上で８解析程度行うことができる。前記のように、複数の反応領域を支持基体５０１の上に設けるには、予め流路５０４を設けた反応チャンバー５０３を光透過性支持基体５０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー５０３は、流路の形成には流路５０４の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体からなり、デバイス上に張り合わせて使用することになる。具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット５０５，反応液を送り出す分注ユニット５０６，液の流れを制御するバルブ５０７，廃液タンク５０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応終了時には、洗浄液が反応チャンバー５０３の流路５０４を通じて供給され、廃液タンク５０８に収納される。
【実施例３】
【００４５】
核酸分析装置の実施例について図６を用いて説明する。本実施例では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、カバープレート６０１と検出窓６０２と溶液交換用口である注入口６０３と排出口６０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス６０５を設置する。なお、カバープレート６０１と検出窓６０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓６０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０７から発振するレーザ光６０８および６０９を、レーザ光６０９のみをλ／４板６１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー６１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ６１２によって集光し、その後、プリズム６１３を介してデバイス６０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、レーザ照射により、デバイス６０５表面上に存在する金属体において局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属に結合したプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓６０２を介して出射される。また、検出窓６０２より出射される蛍光は、対物レンズ６１４（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ６１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ６１６により２次元ＣＣＤカメラ６１７上に結像される。
【００４６】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献６）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することが出来る。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【００４７】
さらに、本実施例では、P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181（非特許文献７）に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図２】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図３】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図４】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図５】核酸分析デバイスを使用形態の一例を説明するため概略図。
【図６】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための概略図。
【符号の説明】
【００４９】
１０１，２０１，３０１，４０１ プローブ
１０２ 蛍光色素
１０３ 未反応基質の蛍光色素
１０４，２０４，３０４，４０４，５０１ 支持基体
１０５，２０５，３０５，４０５ 金属体
１０６，２０６，３０６ 局在型表面プラズモンが生じる空間
１０７，２０７，３０７ 第二の金属
１０８ 核酸
２０９ 低屈折率材料
３１０ シリコン
３１１ 絶縁体
３１２ 仕切り板
３１３ レジスト
４０７ 金属膜
４１４ 絶縁膜
５０２ 金属体が格子状に配置されている領域
５０３ 反応チャンバー
５０４ 流路
５０５ 温調ユニット
５０６ 分注ユニット
５０７ バルブ
５０８ 廃液タンク
６０１ カバープレート
６０２ 検出窓
６０３ 注入口
６０４ 排出口
６０５ デバイス
６０６ ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０７ ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０８，６０９ レーザ光
６１０ λ／４板
６１１ ダイクロイックミラー
６１２ レンズ
６１３ プリズム
６１４ 対物レンズ
６１５ 光学フィルタ
６１６ 結像レンズ
６１７ ２次元ＣＣＤカメラ
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分析デバイス及び核酸分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸分析デバイスとして、ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
【０００３】
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
【０００４】
これに対し、近年、非特許文献１にあるように、基板にＤＮＡなどを固定してその塩基配列を決定する方法が提案されている。基板表面にランダムに分析すべき試料ＤＮＡ断片を１分子ずつ捕捉し、ほぼ１塩基ずつ伸長させて、その結果を蛍光計測より検出することにより塩基配列を決定するものである。具体的には、まず、ＤＮＡポリメラーゼの基質として鋳型ＤＮＡに取り込まれてＤＮＡ鎖伸長反応を保護基の存在により停止することができ、且つ、検出され得る標識を持つ４種のｄＮＴＰの誘導体（ＭｄＮＴＰ）を用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行わせる工程を実施する。次いで取り込まれたＭｄＮＴＰを蛍光等で検出する工程、及びＭｄＮＴＰを伸長可能な状態に戻す工程を実施する。これら３工程を１サイクルとし、該サイクルを繰り返すことにより、試料ＤＮＡの塩基配列を決定する。本技術では、ＤＮＡ断片を１分子ずつ配列決定することができるため、同時に数多くの断片を解析することができ、解析スループットを大きくすることができる。また、本方式では、単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列が決定できるため、従来技術の問題であったクローニングやＰＣＲ等での試料ＤＮＡの精製，増幅が不要にできる可能性があり、ゲノム解析や遺伝子診断の迅速化が期待できる。
【０００５】
【特許文献１】特表２００７−５０１３９１号公報
【特許文献２】特開２００２−２１４１４２号公報
【特許文献３】特開２００７−２４０３６１号公報
【特許文献４】特開２００８−２０４１２号公報
【特許文献５】ＵＳＰ６０１７６９６
【非特許文献１】P.N.A.S. 2003, Vol. 100, pp. 3960-3964.
【非特許文献２】Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005.
【非特許文献３】Anal. Chem. vol. 78, 6238-6245.
【非特許文献４】Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 44017-44021.
【非特許文献５】Nano Letters. 2004, vol.4, 957-961．
【非特許文献６】P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640．
【非特許文献７】P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
基板上における伸長反応を用いて塩基配列を解析する場合、非特許文献１で開示された方式に代表されるような、一塩基伸長反応・未反応基質の洗浄・計測を一サイクルとした、いわば、逐次反応方式のものが一般的である。単一ＤＮＡ分子毎に塩基配列を解析する場合、プローブＤＮＡ上の、一塩基伸長反応によってＤＮＡ二本鎖中に取り込まれたヌクレオチドに付随した蛍光色素一分子の蛍光を計測することになる。しかし、通常の蛍光測定では、プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光分子とその近傍に浮遊している未反応のヌクレオチドに付随している蛍光色素を識別することはできない。そのため、一塩基ずつ伸長したところで、未反応基質を洗浄することが不可欠であった。この洗浄工程が入ることにより、基板上に複雑な流路や送液装置及び廃液処理装置を形成する必要があること、反応試薬も大量に消費してしまうこと、さらに、トータルの解析に必要な反応時間も長くなるという問題があった。
【０００７】
プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光色素一分子と未反応基質の蛍光分子とを識別するためには、プローブＤＮＡ上に捕捉された蛍光色素からの蛍光強度が大きく、浮遊する色素からの強度が小さい条件を作り出さねばならない。
【０００８】
本発明の目的は、塩基伸長反応によってＤＮＡ二本鎖中に取り込まれるヌクレオチドに付随する蛍光色素一分子と、未反応基質の蛍光分子と、を識別することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
そこで、発明者らが鋭意検討した結果、複数の向き合った金属体の間に生じる局在型表面プラズモンによる蛍光増強場内に測定のためのプローブを配置し、塩基伸長反応によるＤＮＡ二本鎖中に取り込まれるヌクレオチドに付随する蛍光色素と浮遊する色素を識別する方法を見出した。特に、強い蛍光増強場を作り出す金属構造体の形状と、その局在化された増強場内に測定のためのプローブを固定する方法を鋭意検討し、それらを両立しうる方法を見出した。
【００１０】
本発明は、蛍光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスにおいて、光照射により局在型表面プラズモンが発生し、かつ、試料中の核酸を測定するためのプローブが前記表面プラズモンの発生部位に配置されていることに関する。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、局在型表面プラズモンによる蛍光増強効果を効率よく引き起こし、かつ、測定のためのプローブを蛍光増強効果が及ぶ領域に固定できるため、蛍光分子付き未反応基質を除去しなくとも、塩基伸長反応を計測することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本実施例では、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体を備え、前記支持基体上に接して複数の金属体が向き合って存在し、前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、前記空間と前記支持基体との間に前記金属体とは異なる第二の金属が存在し、前記第二の金属上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイスを開示する。前記金属体を構成する金属と第二の金属との反応性の差を用いて、測定のためのプローブを第二の金属上に特異的に配置することができる。
【００１３】
また、本実施例では、発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、支持基体を備え、前記支持基体上に接して複数の金属体が向き合って存在し、前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、前記空間と前記支持基体との間に絶縁体が存在し、前記絶縁体上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイスを開示する。前記金属体を構成する金属と絶縁体との反応性の差を用いて、測定のためのプローブを絶縁体上に特異的に配置することができる。
【００１４】
さらに、本実施例では、前記発光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。検出機器の光学フィルタを組み合わせることで、２色以上の蛍光を同時に検出することができる。
【００１５】
さらに、本実施例では、前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。核酸または核酸合成酵素などのタンパク質は、測定対象である核酸を取り込み際の特異性が高く、測定対象のみを特異的に測定することができる。
【００１６】
さらに、本実施例では、前記金属体が、金，銀，白金，アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。これら金属は、局在型表面プラズモンによる増強効果を高めることができる。
【００１７】
さらに、本実施例では、前記複数の向き合った金属体が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。支持基体上の任意の反応点のみを分析すれば良いので、分析装置の構成を簡略化することができる。
【００１８】
さらに、本実施例では、前記複数の金属体間の距離が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。金属体間の距離を小さくすることで、局在型プラズモンによる増強効果を高めることができる。また、測定のためのプローブ固定領域を小さくすることができ、単分子のみが固定化されたグリッドの割合を高めることができる。
【００１９】
さらに、本実施例では、前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイスを開示する。測定対象の核酸に対する増幅工程が不要であるため、解析時間を短縮することができる。
【００２０】
さらに、本実施例では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記蛍光色素を有するヌクレオチド，前記核酸合成酵素，前記プライマ及び前記核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置を開示する。局在型表面プラズモンによる増強効果より、高感度検出に必要な高価な光学部材が不要となる。
【００２１】
さらに、本実施例では、前記核酸分析デバイスに、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、前記核酸分析デバイスに光を照射し、前記金属体が向き合った空間に局在型表面プラズモンを発生させ、前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、核酸試料の塩基配列を解析する方法を開示する。
【００２２】
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、図を参照して説明する。
【００２３】
ここでは、本発明を完全に理解してもらうため、特定の実施形態について詳細な説明を行うが、本発明はここに記した内容に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２４】
本実施例のデバイスについて、図１を用いて説明する。プローブ１０１上に捕捉された蛍光色素１０２と未反応基質の蛍光色素１０３とを識別するためには、プローブ１０１上に捕捉された蛍光色素１０２と、浮遊する未反応の蛍光色素１０３に照射される光の強度を変えるか、あるいは、プローブ１０１上の蛍光色素１０２だけの輻射過程を効率よく起こるようにする必要がある。本実施例は、後者の考え方に基づくものであり、Physical Review Letters 2006, 96, pp 113002-113005（非特許文献２）に報告されているように、局在型表面プラズモンが分子の光吸収による電子遷移と励起一重項から基底状態への輻射遷移の両方の確率を高めるという物理現象に基づくものである。局在型表面プラズモンの蛍光増強効果は、数倍から数十倍程度見込むことができる。その影響が及ぶ範囲は、支持基体１０４上の金属体１０５の構造，形状より異なる。本実施例で示した三角柱に類した構造体が向き合った場合、局在型表面プラズモンによる蛍光増強場は空間１０６となる。従って、本実施例では、プローブ１０１に取り込まれた蛍光色素１０２だけが蛍光増強の恩恵を受け、浮遊する蛍光色素１０３とは数倍から数十倍以上の蛍光強度の差がもたらされる。
【００２５】
表面プラズモンによる蛍光増強の現象については、Anal. Chem. vol. 78, 6238-6245（非特許文献３）に報告されているようなナノ・メートルオーダーの銀の島構造を用いたものや、Nanotechnology, 2007, vol. 18, pp 44017-44021（非特許文献４）に報告されているような金の直径数十ナノ・メートルの球状微粒子を用いたものが知られている。しかしながら、一つ一つのプローブに対して島状構造を有するパッドや球状微粒子をガラス基板等の平滑基板上に数万から数十万個配置することはほとんど不可能である。特に、プローブを所定の箇所に固定することは不可能である。そこで、発明者らは、強力な局在型表面プラズモンを生成し、かつ、局在型表面プラズモン発生部位近傍の空間１０６にプローブ１０１を固定化しうる構造を鋭意検討した。さらに、製造コストを考えると、半導体や配線基板の製造に用いられている薄膜プロセスを活用して製造できる構造となることも好ましいと考え、構造を検討した。
【００２６】
三角柱が近接すると、その間の空間には、強力な局在型表面プラズモンが発生することが、Nano Letters. 2004, vol.4, 957-961（非特許文献５）に示されている。三角柱間の距離が近いほど強力な局在型表面プラズモンを発生することができる。しかしながら、この金属体の構造では、局在型表面プラズモンが発生する空間に特異的に測定のためのプローブを配置することができない。本発明者らは、鋭意検討した結果、局在型表面プラズモンが発生する空間１０６と支持基体１０４の間に三角柱を構成する金属とは異なる第二の金属１０７を配置することで、その第二の金属１０７にプローブ１０１を固定した構造体を考案した。
【００２７】
局在型表面プラズモンを発生することができる金属体１０５は、金，銀，白金，アルミニウム、または銅などが知られている。第二の金属１０７としては、金属体１０５表面との化学的な性質の差を用いて、プローブ１０１を特異的に固定化できるものであれば特に制限はない。また、適した官能基を選択し、それを第二の金属に付与するか、あるいはプローブ１０１内の官能基と前記官能基またはこれを反応基点として、さらに修飾が施された官能基を反応させることで所望のプローブ１０１を固定化しても良い。この様な金属体１０５と第二の金属１０７の組み合わせとしては、金属体１０５が金，銀，白金などの貴金属であれば、第二の金属１０７は、チタン，ニッケル，クロム，鉄，コバルト，カドミウム，アルミニウム，ガリウム，インジウム，ジルコニア，ニオブ，ハフニウム，タンタルから選ばれる少なくとも１種類以上の金属、また、これらの合金が挙げられる。または、ＩＴＯなどの導電性の酸化膜を用いても良い。第二の金属１０７表面上に形成した酸化膜上に、カルボン酸，ホスホン酸，リン酸エステル，有機シラン化合物を反応させることで、プローブ１０１を固定するための所望な官能基を導入することができる。金属体１０５がアルミニウム、または銅などの場合、第二の金属として、金，銀，水銀，インジウム，パラジウム，ルテニウム，亜鉛から選ばれる少なくとも１種類以上の金属、または、これらの合金が挙げられる。第二の金属表面に、有機硫黄化合物，有機セレン化合物、または、有機テルル化合物などを反応させることで、プローブ１０１を固定するための所望な官能基を導入することができる。
【００２８】
次に、本実施例の空間１０６と支持基体１０４との間に絶縁体が存在する構造体について説明する。用いられる絶縁体としては特に制限はないが、微小領域の加工性の点より、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ（Chemical Vapor Deposition），ＰＶＤ（Physical Vapor Deposition）などで薄膜が形成可能な材料が望ましい。この様な材料としては、シリコン，チタン，ベリリウム，ジルコニウム，タングステン，ホウ素，ハフニウム，バナジウム，タンタル，アルミニウム，トリウム，モリブデン，鉄などの炭化物，窒化物，ホウ化物，ケイ化物、または酸化物などが挙げられる。
【００２９】
第二の金属１０７や絶縁体上に導入される官能基についても特に制限はないが、プローブ１０１を固定するための反応基点として、アミノ基，チオール基，カルボキシル基，ヒドロキシル基，アルデヒド基，ケトン基などが挙げられる。さらに、プローブ１０１を固定するための反応効率を高める手法として、二価性の化合物を用いて、ＮＨＳ−エステル基，イミドエステル基，スルフィジル基，エポキシ基，ヒドラジド基などの官能基を導入しても良い。また、増強場内への単分子固定化率を高めるために、アビジン，デンドロン，クラウンエーテルなどの嵩高い化合物を介して、プローブ１０１を固定しても良い。
【００３０】
プローブ１０１についても、測定対象の核酸１０８を捕捉できるものであれば特に制限はない。核酸１０８を直接捕捉できる様なプローブとしては、ＤＮＡ，ＲＮＡ，ＰＮＡなどの核酸、または、酵素などのタンパク質が挙げられる。また、染色体，核様体，細胞膜，細胞壁，ウイルス，抗原，抗体，レクチン，ハプテン，レセプター、ペプチド，スフィンゴ糖，スフィンゴ脂質などを介して、核酸１０８を捕捉しても良い。
【００３１】
金属体１０５の適切な形状，大きさは、照射する光の波長によって異なる。すなわち、表面プラズモンの発生に適する共鳴周波数は、金属構造体表面の自由電子群と光との相互作用によるものである。励起光を可視光とすると、金属構造体の大きさは、幅・高さともに、１０から１０００ｎｍ程度が適しているが、この条件に縛られるものではない。図２（Ａ）の様な円柱が角柱で結ばれ、角柱の間に局在型表面プラズモンが発生する空間２０６があるもの、（Ｂ）の様に、円柱が並んで、最も小さい円柱内に空間２０６があるものなどが挙げられる。また、（Ｃ）の様に、金属体２０５，空間２０６、及び第二の金属２０７以外の領域を支持基体２０４を構成する材料よりも屈折率が低い材料２０９で覆っても良い。屈折率が低い材料２０９で覆われた領域に、未反応の蛍光色素が入れないため、この蛍光色素由来のバックグランドを低減することができる。
【００３２】
第二の金属上にプローブを固定した核酸分析デバイスの製造方法を、図３を用いて説明する。
【００３３】
（１）第二の金属膜の形成
平滑な支持基体３０４上に第二の金属３０７（薄膜）を形成する。平滑な支持基体３０４には、ガラス基板，サファイア基板，樹脂基板等が用いられる。金属体３０５を形成した面と反対側の裏面より励起光を照射する必要がある場合には、光透過性に優れた石英基板やサファイア基板を用いればよい。第二の金属３０７は、上記裏面より励起光を照射する場合にはその厚さは薄いほど好ましく、より好ましくは５〜１００ｎｍである。薄膜は蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いて作られる。
【００３４】
（２）シリコン膜の形成，（３）シリコンのパターニング
第二の金属３０７上に、厚さが５ｎｍ以上にシリコン膜を形成する。薄膜形成方法は、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどが好ましい。得られたシリコン膜に対して、フォトリソグラフィ，エッチングを施し、金属体３０５間の局在型表面プラズモンが生じる空間３０６を作成するためのパターニングを行う。パターンは、向き合った金属体３０５をアレイ状に配置するための所望のパターンに準じる。例えば、１μｍピッチで向き合った金属体３０５を構成した場合、形成領域を１mm×１mmとすると、１００万反応サイトを形成できる。フォトリソグラフィは、既存のｉ線（波長３６５ｎｍ），ＫｒＦエキシマレーザー（波長２４８ｎｍ），ＡｒＦエキシマレーザー（波長１９３ｎｍ），Ｘ線、または電子線を光源とした方法を用いることができる。エッチングのパターニングの精度を高めるには、ＲＩＥ（Reactive Ion Etching）を用いることが好ましい。
【００３５】
（４）絶縁膜の形成，（５）絶縁膜のエッチング，（６）シリコンのエッチング
シリコン上にＣＶＤを用いて、絶縁膜を形成する。絶縁膜の厚さは、金属体３０５間の距離を制御するものである。金属体３０５間の距離が短い程、局在型表面プラズモンによる蛍光増強効果を高めることができる。好ましい厚さは５０ｎｍ以下、より好ましくは１５ｎｍ以下である。本実施例の絶縁膜の膜厚で制御する方法は、１５ｎｍ以下の距離の制御も精度良く行え、製造上のバラツキを小さくできる。この様な絶縁膜としては、半導体のゲート電極のサイドウォール（側壁酸化膜）製造プロセスで用いられる二酸化ケイ素や窒化ケイ素が好ましい。本実施例では、絶縁膜を用いるプロセスを示したが、（４）の薄膜形成から（６）のエッチングプロセスでの膜厚を制御できればよく、金属膜で実施しても良い。これらのプロセスで用いられるエッチングについては、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。
【００３６】
（７）金属膜の形成，（８）仕切り板の除去
金属膜の厚さは、金属体３０５の高さを制御するものである。局在型表面プラズモンが効果的に生じる厚さは、計測時に用いる励起波長により異なる。望ましい厚さは１０００ｎｍ以下である。薄膜形成方法としては、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどを用いることができる。仕切り板の除去は、一般的なウェット（またはドライ）エッチングを行う。具体的には、二酸化ケイ素，窒化ケイ素ともに、フッ酸または、フッ酸を含む溶液を用いる。
【００３７】
（９）レジスト塗布，（１０）パターニング
パターニングの大きさや形状は、局在型表面プラズモンの効果に大きく関わる。図３に示した様な、三角形に類似した形状であれば、三角形の一辺が１０００ｎｍ以下であることが好ましい。レジスト３１３としては、電子線用のネガ型ポジストを用いることができる。具体的には、ＴＥＢＮ−１（株式会社トクヤマ社製）が挙げられる。レジストをスピンナーで塗布した後、ホットプレートで２〜５分程度プリベイクする。加速電圧５０〜１００ＫＶの電子線で描画した後、乳酸エチル，イソプロパノール、またはエタノールで現像する。
【００３８】
（１１）エッチング，（１２）レジスト除去
パターニングされたレジストをマスクとして、金属体３０５を形成する。パターン精度を高めるには、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。レジスト除去には、広く一般的に用いられるオゾンアッシングのプロセスを用いることができる。
【００３９】
（１３）プローブ固定
プローブ１０１が核酸である場合、固定方法には種々の方法が考えられるが、例としてアミノシラン処理を用いる方法を記述する。第二の金属３０７の酸化膜にアミノシラン処理を行い、アミノ基を導入する。その後、ビオチン−スクシンイミド（Pierce社製ＮＨＳ−Biotin）を反応させた後、ストレプトアビジンを反応する。次に、予めビオチンを末端に修飾しておいたプローブを反応させることにより、近接した二つの金属体３０５の間に
プローブを固定する。これにより、核酸分析デバイスが完成する。
【００４０】
プローブ１０１が核酸合成酵素の様なタンパク質であっても、同様の方法で固定化することができる。具体的には、アミノ化された酸化膜上に二価性試薬であるＮ−（４−Maleimidobutyryloxy）succinimide（同仁化学研究所社製，ＧＭＢＳ）を反応させた後、核酸合成酵素を反応させることで核酸合成酵素を固定することができる。その他、酸化膜上にニトロセルロース，ポリアクリルアミドなどとの物理吸着を利用する方法，ヒスチジンとニッケルイオンやコバルトイオンとの特異的な親和を利用する方法、またはビオチンとアビジンの結合を利用する方法などを用いることができる。
【００４１】
絶縁体上にプローブを固定した核酸分析デバイスの製造方法について、図４を用いて、図３との違いを中心に説明する。
【００４２】
（１）絶縁膜の形成
支持基体４０４上に、蒸着，スパッタリング，ＣＶＤ，ＰＶＤなどにより、絶縁膜４１４を形成した後、金属膜４０７を形成する。金属膜４０７は、絶縁膜４１４と金属体４０５と密着性を向上させるものである。絶縁膜４１４として、スピンコータで製膜可能な層間絶縁膜（日立化成工業社製，ＨＳＧ）などを用いても良い。（２）シリコン膜の形成〜（８）仕切り板の除去のプロセスは図３と同様である。
【００４３】
（Ａ）金属膜のエッチング
空間４０６界面に絶縁膜４１４を露出させるために、金属膜４０７をエッチングする。エッチングはドライ（または、ウェット）エッチングのどちらでも良いが、加工精度を高めるためには、微細加工が可能なＲＩＥが望ましい。（９）レジスト塗布〜（１３）プローブ固定のプロセスは図３と同様に行う。
【実施例２】
【００４４】
核酸分析デバイスの使用形態の一例について図５を参照しながら説明する。支持基体５０１の上に、金属体が格子状に配置されている領域５０２が複数搭載されている。金属体は、先に述べた、近接した二つの金属体の間にプローブを固定した構造体が該当する。配置の間隔は、解析しようとする核酸試料，蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。例えば、２５mm×７５mmのスライドガラスを支持基体５０１とし、１マイクロ・メートル間隔で格子状に金属構造体を配置した領域５０２を５mm×８mmとすると、１領域当たり４０００万種類の核酸分子を解析でき、その領域を８個程度、支持基体５０１上に搭載することができる。したがって、例えば、ＲＮＡの発現解析に用いる場合には、一細胞当たり約４０万分子のＲＮＡが発現していることから、ＲＮＡの発現頻度解析をデジタルカウンティングのように十分に正確に行うことができ、一枚の基板上で８解析程度行うことができる。前記のように、複数の反応領域を支持基体５０１の上に設けるには、予め流路５０４を設けた反応チャンバー５０３を光透過性支持基体５０１の上にかぶせることで達成できる。反応チャンバー５０３は、流路の形成には流路５０４の溝を予め掘ったＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）等の樹脂基体からなり、デバイス上に張り合わせて使用することになる。具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット５０５，反応液を送り出す分注ユニット５０６，液の流れを制御するバルブ５０７，廃液タンク５０８から構成される。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応終了時には、洗浄液が反応チャンバー５０３の流路５０４を通じて供給され、廃液タンク５０８に収納される。
【実施例３】
【００４５】
核酸分析装置の実施例について図６を用いて説明する。本実施例では、核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、カバープレート６０１と検出窓６０２と溶液交換用口である注入口６０３と排出口６０４から構成される反応チャンバーに前記のデバイス６０５を設置する。なお、カバープレート６０１と検出窓６０２の材質として、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）を使用する。また、検出窓６０２の厚さは０.１７mmとする。ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０６およびＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）６０７から発振するレーザ光６０８および６０９を、レーザ光６０９のみをλ／４板６１０によって円偏光し、ダイクロイックミラー６１１（４１０ｎｍ以下を反射）によって、前記２つのレーザ光を同軸になるよう調整した後、レンズ６１２によって集光し、その後、プリズム６１３を介してデバイス６０５へ臨界角以上で照射する。本実施例によれば、レーザ照射により、デバイス６０５表面上に存在する金属体において局在型表面プラズモンが発生し、第二の金属に結合したプローブにより捕捉された標的物質の蛍光体は蛍光増強場内に存在することになる。蛍光体はレーザ光で励起され、その増強された蛍光の一部は検出窓６０２を介して出射される。また、検出窓６０２より出射される蛍光は、対物レンズ６１４（×６０，ＮＡ１.３５，作動距離０.１５mm）により平行光束とされ、光学フィルタ６１５により背景光及び励起光が遮断され、結像レンズ６１６により２次元ＣＣＤカメラ６１７上に結像される。
【００４６】
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640（非特許文献６）に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することが出来る。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
【００４７】
さらに、本実施例では、P.N.A.S. 2008, vol. 105, pp 1176-1181（非特許文献７）に開示されているような、洗浄工程が必要ないことからリアルタイムで伸長反応を計測することも可能である。上記のように、本実施例の核酸分析デバイスを用いて核酸分析装置を組上げることで、洗浄工程を入れることなく、解析時間の短縮化，デバイス及び分析装置の簡便化が図れ、逐次反応方式のみならず、リアルタイムで塩基の伸長反応を計測することも可能となり、従来技術に対して大幅なスループットの改善が図れる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図２】本実施例における核酸分析デバイスの概略図。
【図３】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図４】核酸分析デバイスの製造方法の一例を説明するためのフロー図。
【図５】核酸分析デバイスを使用形態の一例を説明するため概略図。
【図６】核酸分析デバイスを用いた核酸分析装置の一例を説明するための概略図。
【符号の説明】
【００４９】
１０１，２０１，３０１，４０１ プローブ
１０２ 蛍光色素
１０３ 未反応基質の蛍光色素
１０４，２０４，３０４，４０４，５０１ 支持基体
１０５，２０５，３０５，４０５ 金属体
１０６，２０６，３０６ 局在型表面プラズモンが生じる空間
１０７，２０７，３０７ 第二の金属
１０８ 核酸
２０９ 低屈折率材料
３１０ シリコン
３１１ 絶縁体
３１２ 仕切り板
３１３ レジスト
４０７ 金属膜
４１４ 絶縁膜
５０２ 金属体が格子状に配置されている領域
５０３ 反応チャンバー
５０４ 流路
５０５ 温調ユニット
５０６ 分注ユニット
５０７ バルブ
５０８ 廃液タンク
６０１ カバープレート
６０２ 検出窓
６０３ 注入口
６０４ 排出口
６０５ デバイス
６０６ ＹＡＧレーザ光源（波長５３２ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０７ ＹＡＧレーザ光源（波長３５５ｎｍ，出力２０ｍＷ）
６０８，６０９ レーザ光
６１０ λ／４板
６１１ ダイクロイックミラー
６１２ レンズ
６１３ プリズム
６１４ 対物レンズ
６１５ 光学フィルタ
６１６ 結像レンズ
６１７ ２次元ＣＣＤカメラ
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体を備え、
前記支持基体上に複数の金属体が向き合って存在し、
前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、
前記空間と前記支持基体との間に前記金属体とは異なる第二の金属が存在し、
前記第二の金属上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記発光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属体が、金，銀，白金，アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の向き合った金属体が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の金属体間の距離が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイス
【請求項８】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体を備え、
前記支持基体上に接して複数の金属体が向き合って存在し、
前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、
前記空間と前記支持基体との間に絶縁体が存在し、
前記絶縁体上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイス。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記発光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１０】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１１】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属体が、金，銀，白金，アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１２】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の向き合った金属体が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１３】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の金属体間の距離が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１４】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記蛍光色素を有するヌクレオチド，前記核酸合成酵素，前記プライマ及び前記核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法であって、
前記核酸分析デバイスに、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、
前記核酸分析デバイスに光を照射し、前記金属体が向き合った空間に局在型表面プラズモンを発生させ、
前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、
核酸試料の塩基配列を解析する方法。
【請求項１】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体を備え、
前記支持基体上に複数の金属体が向き合って存在し、
前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、
前記空間と前記支持基体との間に前記金属体とは異なる第二の金属が存在し、
前記第二の金属上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイス。
【請求項２】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記発光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項３】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項４】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属体が、金，銀，白金，アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項５】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の向き合った金属体が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項６】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の金属体間の距離が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項７】
請求項１記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイス
【請求項８】
発光測定により試料中の核酸を分析する核酸分析デバイスであって、
支持基体を備え、
前記支持基体上に接して複数の金属体が向き合って存在し、
前記金属体が向き合った空間に光照射により局在型表面プラズモンが発生し、
前記空間と前記支持基体との間に絶縁体が存在し、
前記絶縁体上に、試料中の核酸を分析するためのプローブを有する核酸分析デバイス。
【請求項９】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記発光が蛍光であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１０】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが核酸またはタンパク質から選ばれる一つ以上の高分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１１】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記金属体が、金，銀，白金，アルミニウム、または銅から選ばれる金属を含む１種類以上の金属から成ることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１２】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の向き合った金属体が、前記支持基体上にアレイ状に配置されていることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１３】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記複数の金属体間の距離が１５ｎｍ以下であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１４】
請求項８記載の核酸分析デバイスにおいて、
前記プローブが単分子であることを特徴とする核酸分析デバイス。
【請求項１５】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いる核酸分析装置であって、
核酸分析デバイスに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、
前記核酸分析デバイスに光を照射する手段と、
前記核酸分析デバイス上において前記ヌクレオチド，前記蛍光色素を有するヌクレオチド，前記核酸合成酵素，前記プライマ及び前記核酸試料からなる１種類以上の生体分子が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段と、を備え、
前記核酸試料の塩基配列情報を取得することを特徴とする核酸分析装置。
【請求項１６】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の核酸分析デバイスを用いた核酸分析方法であって、
前記核酸分析デバイスに、蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマ及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給し、
前記核酸分析デバイスに光を照射し、前記金属体が向き合った空間に局在型表面プラズモンを発生させ、
前記ヌクレオチド，前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定し、
核酸試料の塩基配列を解析する方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【公開番号】特開２００９−３００２４１（Ｐ２００９−３００２４１Ａ）
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１５４７９８（Ｐ２００８−１５４７９８）
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２１年１２月２４日（２００９．１２．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年６月１３日（２００８．６．１３）
【出願人】（５０１３８７８３９）株式会社日立ハイテクノロジーズ (4,325)
【Ｆターム（参考）】
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