核酸標識方法、該方法に用いるプライマー・セット、ならびに、該方法によって調製される標識化された核酸
【課題】 固相上に固定されている検出用プローブを用いたハイブリダイゼーション法を応用する核酸検出において、鋳型核酸の塩基配列上に選択されるプローブ配列の位置に依存せず、高い検出感度を達成可能な、標識化された核酸を調製する方法の提供。
【解決手段】 鋳型核酸として用いる一本鎖核酸の塩基配列に対して、複数の相補的な部分塩基配列に基づき、作製される標識付きオリゴヌクレオチド複数種を含むプライマー・セットを用い、各プライマーの３’末端に核酸鎖を伸長することで、５’末端に標識付きオリゴヌクレオチドを内在する標識化された核酸複数種を同時に調製する。
【解決手段】 鋳型核酸として用いる一本鎖核酸の塩基配列に対して、複数の相補的な部分塩基配列に基づき、作製される標識付きオリゴヌクレオチド複数種を含むプライマー・セットを用い、各プライマーの３’末端に核酸鎖を伸長することで、５’末端に標識付きオリゴヌクレオチドを内在する標識化された核酸複数種を同時に調製する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型核酸の全塩基配列中、その部分領域に対して、相補的な塩基配列を有する標識付き核酸を、伸長反応によって調製する核酸標識方法、該方法に用いる標識付きオリゴヌクレオチド型プライマー・セット、ならびに、該方法によって調製される標識化された核酸に関する。特には、検体中に含まれる鋳型核酸から、該鋳型核酸の全塩基配列中、その部分領域に対して、相補的な塩基配列を有する標識付き核酸を、伸長反応によって調製し、プローブ・ハイブリダイゼーション反応による核酸検出用の標識付き核酸試料を調製する際、好適に利用される核酸標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように、種々の生物について、そのゲノム遺伝子、ミトコンドリア遺伝子などの塩基配列に関して、全般的な解析がなされてきている。更には、解明された遺伝子と、生命活動のメカニズム、各種疾病、疾患、遺伝的な体質等との関連性に関する研究も進み、次々と研究成果が報告されている。これらの研究結果から、特定の遺伝子の有無、あるいは、その発現産物の存在量（発現量）を知ることで、例えば、各種疾病、疾患などの要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングを行う上で有用な情報が得られることが判明してきている。また、各種疾病、疾患などの要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングがなされると、効果的な治療方法の選択がより容易となり、疾患の診断のみでなく、その治療にも効果的に利用可能であることも検証されてきている。
【０００３】
検体中における、特定の遺伝子の有無、ならにも、その発現量を検出する方法として、従来から多数の方法が提案され、また、実際に利用もされている。検出対象とする遺伝子あるいは核酸分子について、その塩基配列が判明している際、最も広範に利用されている手法は、該遺伝子あるいは核酸分子の塩基配列中から特徴的な部分塩基配列を選択し、その相補的な塩基配列を有する核酸プローブを利用して、かかる特徴的な部分塩基配列を含む核酸鎖の有無、あるいは、含有量を検出する方法である。具体的には、相補的な塩基配列を有するプローブ用ＤＮＡ鎖を予め調製し、検体中に含まれる遺伝子あるいは核酸分子を一本鎖核酸とした上で、前記ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション反応を行わせ、ハイブリッド体形成の有無、その形成量を何らかの方法を利用して検出する、プローブ・ハイブリダイゼーション法である。
【０００４】
このプローブ・ハイブリダイゼーション法による、特定の核酸分子の検出方法は、形成されるハイブリッド体を分離可能であれば、ハイブリダイゼーション反応自体は、液相中、あるいは、固相表面のいずれで行ってもよい。例えば、固相表面上でハイブリダイゼーション反応を行う場合には、予め、ＤＮＡプローブを固相表面上に結合、または、吸着によって、固定化しておき、形成されるハイブリッド体を固相上に固定、分離する。その際、検体中に含まれる核酸試料に対して、何らかの検出可能な標識物質によって標識化を施しておき、ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成して、固相上に固定、分離された標識化核酸鎖の有無、その量を、該標識物質に起因する信号を利用して、測定する。また、ＤＮＡプローブの固定用固相（基材）としては、ガラスや金属などの平面基板表面を用いるチップ、あるいは、微小粒子表面を用いるビーズ等が体表的な形態である。
【０００５】
プローブ・ハイブリダイゼーション法において、固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用するハイブリダイゼーション反応が好まれる理由の第一は、Ｂ／Ｆ分離が容易であることである。加えて、固相上の所定位置に固定化されているＤＮＡプローブを利用するため、検出領域を物理的に微小化でき、また、検出領域が特定されている結果、高感度の測定が可能となる。その際、複数種のＤＮＡプローブの固定位置を物理的に隔離することにより、同時に、多項目の検出が可能である。さらには、予め、所定量のＤＮＡプローブが固相上に固定化されているＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態を選択すると、その取扱いや応用が一層容易になる利点もある。
【０００６】
例えば、米国アフィメトリックス社では、平面基板上において合成されたオリゴＤＮＡに対し、蛍光色素で標識された核酸を作用させ、そのハイブリダイゼーション反応で形成されるハイブリッド体を、蛍光標識に由来する蛍光により検出する手法を提案している（特許文献１を参照）。この基板上において合成されたオリゴＤＮＡで構成されるＤＮＡアレイと、蛍光色素標識による蛍光検出法を利用することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量の検出を可能としている。
【０００７】
また、富士フィルム社は、基板表面に予め導入されたアミノ基を利用して、別途作製した複数種のＤＮＡプローブを固定化する手法を応用して、ＤＮＡアレイを作製し、このＤＮＡアレイを用いて、標識された２２ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを検出している（特許文献２を参照）。
【０００８】
ところで、上記のような固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用し、ハイブリダイゼーション反応を応用してハイブリッド体形成させて、特定の核酸を検出する方法では、検体となる核酸に予め標識を付しておくことが必要となる。検体の核酸に、標識物質を取り込ませる方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅産物を作製する際に、標識付きデオキシヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰなど）を付加する方法がある。
【０００９】
また、ＰＣＲ増幅産物を作製する際、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の基質となるＡＴＣＧ４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：総称してｄＮＴＰ）と標識付きデオキシヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）をそれぞれ調製して、各ｄＮＴＰの終濃度を揃えることで、作製される増幅産物中に標識付きデオキシヌクレオチドを取り込ませる方法もある。寶酒造株式会社は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の４種の基質ヌクレオチドのうち、一種の基質について蛍光標識されたヌクレオチドに置換し、増幅産物中に標識物質の取り込みを行なっている（特許文献３を参照）。
【００１０】
また、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する方法が知られている（特許文献４を参照）。この予め標識されたプライマーを利用する場合、作製される標識核酸一分子当り、付与される標識物質の量比が制御できるという利点があり、高い定量性が要求される際には、この手法が好適である。
【特許文献１】米国特許第６，４１０，２２９号明細書
【特許文献２】特開２００１−１２８６８３号公報
【特許文献３】特許第３００１９１９号公報
【特許文献４】特許第２６４９７９３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用するハイブリダイゼーション反応を応用する核酸の検出方法は、他の核酸の検出方法と比較し、高感度であるなどの利点を有している。一方、液相中でのハイブリダイゼーション反応を利用する検出方法と比較した際、固相上の反応に付随して、制御困難な問題点は残されている。
【００１２】
例えば、検出対象となる核酸と等しい塩基長を有する、相補的なＤＮＡ全長をプローブＤＮＡとして固定化されているようなｃＤＮＡアレイなどとは異なり、検出対象の核酸の塩基長と比較し、プローブＤＮＡの塩基長が短い系では、固相上に固定されている塩基長の短いプローブＤＮＡと検出対象の核酸とのハイブリッド体を形成した後、Ｂ／Ｆ分離し、検出対象の核酸に付されている蛍光標識の蛍光強度を測定した際、検出対象の核酸上における、プローブＤＮＡとの結合部位の存在位置によって、蛍光強度が大きな影響を受けるという問題がある。
【００１３】
具体的には、検出対象の核酸の５’末端に蛍光標識が付されている場合、プローブＤＮＡとの結合部位がこの５’末端から遠ざかるに従って、測定される蛍光強度が低下する傾向がある。従って、検出対象の核酸の３’末端近傍にプローブＤＮＡとの結合部位を選択する場合と、５’末端近傍にプローブＤＮＡとの結合部位を選択する場合とでは、検出対象の核酸の５’末端に付されている蛍光標識から測定される蛍光強度に顕著な差違があることが判明している。この現象の詳細なメカニズムは、現段階では解明されていないが、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する手法で作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸を利用する際、その高い定量性を損なう要因ともなる。経験的には、５’末端に蛍光標識が付された核酸に対して、固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用する検出を行う際、ＤＮＡプローブとの結合部位をその５’末端の近傍に設定することで、前記の現象による影響を回避することが可能であることは確認されている。
【００１４】
しかしながら、検出対象の核酸をより高く選択性で検出する上では、ＤＮＡプローブの塩基配列は、検出対象の核酸に特異的な塩基配列部分に対して、相補的に選択することが必須である。検出対象の核酸に特異的な塩基配列部分は、かかる検出対象核酸の塩基配列の５’末端近傍には存在していないことも少なくない。その場合には、測定される蛍光強度は低下するが、５’末端から遠い位置に存在する特異的な塩基配列部分を利用するか、あるいは、選択性は低下するが、測定される蛍光強度は高くなる、５’末端近傍の特異性に難を有する塩基配列部分を利用するかの、二律排斥の選択肢のいずれを選択するかで、悩む事態となる。すなわち、定量性に優れた、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する手法で作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸を利用する場合、固相上に固定化されたＤＮＡプローブの利用に依る高い検出感度と、プローブの塩基配列の特異性に因る高い選択性とが両立しない場合も少なくない。
【００１５】
例えば、感染症に罹患している特定の患者に関して、感染症を引き起こす、複数種の起炎菌のうち、何れの起炎菌に起因しているかを同定する場合を考慮する。複数種の起炎菌を遺伝子情報に基づき同定する場合、例えば、各菌が共通に保持しているｒＲＮＡのうち、１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中、個々の菌に特徴的な部分塩基配列が、その同定に利用可能である。具体的には、採取された各起炎菌のゲノム中に含まれる１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を鋳型として、これら起炎菌に共通な塩基配列を有するＰＣＲプライマーを利用し、ＰＣＲ増幅を行うことにより、該１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ試料を調製する。他方、前記ＰＣＲ増幅により調製される、各起炎菌の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列を相互比較し、個々の菌株にユニークな塩基配列部分を選択し、個々の菌株特定用のＤＮＡプローブ一種以上を作製する。共通のＰＣＲプライマーを用いて調製される、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ試料について、個々の菌株特定用のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリッド体形成の有無、その量を検出する。ハイブリッド体形成がなされ、また、その量が所望の水準を超える場合、当該菌株特定用のＤＮＡプローブが有する塩基配列に対して、相補的な部分塩基配列が、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖上に存在していることが確認される。
【００１６】
一般に、分類学上近縁関係にある細菌を対比すると、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における相同性が高くなり、個々の菌株にユニークな塩基配列部分は、極く限られた位置にしか存在しない場合も少なくない。その結果、ある起炎菌の菌株同定に利用される、ユニークな塩基配列部分は、共通のＰＣＲプライマーを用いて調製される、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ中、検出に利用される一本鎖ＤＮＡの５’末端から遠く離れた位置となることもある。その際、５’末端に蛍光標識が付された一本鎖ＤＮＡを検出に利用する場合、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体形成した際、その蛍光標識に起因する蛍光強度は「弱く」しか、測定できない事態も起こる。すなわち、ハイブリッド体形成の有無、その量の定量性に、大きな制限を与える要因となることもある。
【００１７】
通常、検体中に含まれる核酸を鋳型として、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅産物として調製して、実際のプローブ・ハイブリダイゼーション用の一次試料として利用されている。この一次試料は、実質的に、ＰＣＲ増幅により調製された、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片のみを含むものとなる。次いで、かかる二本鎖ＤＮＡ断片を解離させて、互いに相補的な、二つの一本鎖ＤＮＡ断片とした上で、予め標識されたプライマーを用いて、ＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、核酸を標識する手法を適用して、検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体形成が可能な、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製がなされる。
【００１８】
一方、一次試料中に含有されている、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）を選択する。その際、仮に、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、前記の手法を応用して作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）と、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すことが可能な、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製手段の開発が望まれている。
【００１９】
本発明は、前記課題を解決するもので、本発明の目的は、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、予めＰＣＲ増幅により調製される一次試料中に存在する、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、前記標識されたプライマーを用いた核酸鎖の伸長反応を応用して作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）と、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すことが可能な、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製方法を提供することにある。
【００２０】
加えて、本発明の目的には、前記５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製方法において、好適に利用される、標識されたプライマー・セットの提供も含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、前記の課題を解決するため、鋭意、研究、検討を進めた。
【００２２】
検体中に含まれる核酸、例えば、細胞内から採取されるゲノム遺伝子の量自体は、僅かな量であるため、通常、検体中に含まれる核酸（ゲノム遺伝子）を鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を行って、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片を予め調製する。実際のプローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出では、このＰＣＲ反応によって所望の増幅率で増幅されている、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を含有する核酸溶液を、一次試料として利用する。
【００２３】
プローブ・ハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体中において、ハイブリッド体一分子当り、付与される標識物質の量比を制御する上では、ＤＮＡプローブと結合してハイブリッド体を形成する一本鎖ＤＮＡ断片を、予め５’末端に蛍光標識が導入されている標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーに利用して、その３’末端に核酸鎖を伸長して、標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）とすることが必要である。この核酸鎖の伸長反応では、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を解離させ、対応する相補的な一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）を鋳型として、標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に目的の塩基配列を有する核酸鎖の生成を行う。作製される標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ）は、その５’末端には、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチド自体のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）が内在されたものとなる。従って、同じ一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）を鋳型として、核酸鎖の伸長反応を行う際、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチド自体のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）の塩基配列が異なると、得られる標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）の５’末端の塩基配列も当然異なったものとなる。特に、一次試料中に含まれる、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を解離させて得られる、鋳型となる相補的な一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）に対して、標識付きオリゴヌクレオチド自体のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）は、相補的な塩基配列を有するものとする。
【００２４】
さらに、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチドとして、鋳型となる相補的な一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）に対して、異なる部位（位置）において結合する少なくとも二種以上の互いに相違する塩基配列のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）で構成されたものを用いることで、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端を基準として、得られる二種以上の標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）では、その５’末端の位置が互いに相違するものとできることに、本発明者らは想到した。加えて、このように、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端を基準として、その５’末端の位置が互いに相違するように調製された、二種以上の標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）の混合物を利用すると、仮に、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、前記混合物中に含まれる、標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）複数種の一つは、その５’末端近傍に検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）が存在しているものとできることを見出した。以上の知見に加えて、本発明者らは、該５’末端に蛍光標識が付された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）複数種の一つと、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すことを検証して、本発明を完成させた。
【００２５】
すなわち、本発明にかかる核酸標識方法は、
プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に供する、標識化された核酸を調製する手段であって、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
前記伸長反応のプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを構成する前記相補的な塩基配列が相違する、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを用い、
該プライマー・セット中に含まれる、一つの標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長に利用される、一本鎖の鋳型核酸に対して、
該プライマー・セット中に含まれる、他の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記一本鎖の鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する他のオリゴヌクレオチドで構成されている
ことを特徴とする核酸標識方法である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明においては、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブ、例えば、ＤＮＡマイクロアレイを使用する核酸検出の際、仮に、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、本発明の核酸標識方法を利用することで調製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸（一本鎖ＤＮＡ）複数種の一つと、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すものとなり、検出感度、ならびに精度の向上が得られるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明では、上述する核酸標識方法の発明、すなわち、
プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に供する、標識化された核酸を調製する手段であって、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
前記伸長反応のプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを構成する前記相補的な塩基配列が相違する、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを用い、
該プライマー・セット中に含まれる、一つの標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長に利用される、一本鎖の鋳型核酸に対して、
該プライマー・セット中に含まれる、他の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記一本鎖の鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する他のオリゴヌクレオチドで構成されている
ことを特徴とする核酸標識方法における、好ましい態様の一例として、下記の態様を挙げることができる。
【００２８】
具体的には、本発明にかかる核酸標識方法では、
前記伸長反応として、非対称ＰＣＲ反応を利用することができる。あるいは、前記伸長反応として、ＰＣＲ反応を利用することもできる。
【００２９】
一方、前記標識付きオリゴヌクレオチドは、
蛍光物質およびビオチンからなる群から選択される一つ以上の標識を用いて、該オリゴヌクレオチドに標識が付されていることが好ましい。
【００３０】
その際、本発明にかかる核酸標識方法において、
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出は、
固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用していることが望ましい。特に、前記固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブは、
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態であることがより好ましい。
【００３１】
なお、前記鋳型核酸として、
検体中に含まれる核酸からＰＣＲ産物として調製される一本鎖核酸を利用する形態を選択することが望ましい。
【００３２】
本発明にかかる核酸標識方法は、
前記検出対象の核酸は、細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である形態において、より好適に利用される。
【００３３】
加えて、本発明は、上述する本発明にかかる核酸標識方法を利用することで作製が可能となる、標識化された核酸の発明をも提供し、
すなわち、本発明にかかる標識化された核酸は、
上述する構成のいずれかを選択する本発明にかかる核酸標識方法により調製される、標識化された核酸である。
【００３４】
さらには、本発明は、上述する本発明にかかる核酸標識方法に利用されるプライマー・セットの発明も同時に提供しており、
すなわち、本発明にかかるプライマー・セットは、
上述する構成のいずれかを選択する本発明にかかる核酸標識方法において利用可能な、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットである。
【００３５】
例えば、本発明にかかるプライマー・セットは、
前記鋳型核酸の塩基配列に基づき、
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に用いるプローブＤＮＡの塩基配列が選択されている、該鋳型核酸の塩基配列上のプローブ対応部位と、
前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有する、該鋳型核酸の塩基配列上のプライマーに相補的部位の少なくとも二種について、
前記プローブ対応部位を基準点とし、前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の存在位置までの塩基数により、該プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置を定義する際、
前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置が互いに異なるように、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列が選択されている
ことを特徴とするプライマー・セットとすることが好ましい。
【００３６】
その具体例として、
該プライマー・セットに含まれる、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドとして、
下記配列１〜配列９：
配列１； 5' actgctgcctcccgtaggagtctgg 3'
配列２； 5' cgtattaccgcggctgctggcacg 3'
配列３； 5' gcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg 3'
配列４； 5' tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg 3'
配列５； 5' ggtaaggttcttcgcgttgc 3'
配列６； 5' ttgacgtcatccccaccttcctcc 3'
配列７； 5' ccattgtagcacgtgtgtagccc 3'
配列８； 5' tggtgtgacgggcggtgtgtacaag 3'
配列９； 5' taccttgttacgacttcacccca 3'
からなる群から選択される、少なくとも二種以上の塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを含んでいる
ことを特徴とするプライマー・セットを好適な例として示すことができる。
【００３７】
以下に、本発明に関して、より詳しく説明する。
【００３８】
まず、本発明にかかる核酸標識方法の適用対象である、標識化された核酸は、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に際し、検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成可能な、一本鎖核酸部分を有する核酸分子に対して、検出に利用される標識を付したものである。
【００３９】
この検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成可能な一本鎖核酸部分は、検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を鋳型核酸として利用し、該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することにより作製される。この核酸鎖の伸長反応において、プライマーとして用いる標識付きオリゴヌクレオチドは、最終的に作製される一本鎖核酸部分の５’末端となるため、標識付きオリゴヌクレオチド中に含まれる標識は、標識化された核酸において、その５’末端に付与されたものとなる。
【００４０】
本発明において、検体中に含まれる核酸として、例えば、細菌由来の核酸分子が利用できる。換言するならば、例えば、かかる細菌由来の核酸分子の起源となる細菌を含む試料から、検出対象とする細菌由来の核酸分子を抽出する処理などを施し、検体とする。なお、かかる細菌由来の核酸分子の起源となる細菌を含む試料の例として、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿や糞便のような排出物などの生物由来の試料、あるいは、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、当該細菌による汚染を受けている可能性を有する媒体が挙げられる。また、輸出入時における検疫において、細菌による感染が確認された動植物から採取された組織試料も、その対象に含まれる。通常、かかる細菌由来の核酸分子の起源となる細菌を含む試料は、該細菌を、生菌あるいは死滅菌体の状態で含んでいるため、その細胞内に存在する細菌由来の核酸分子に対する抽出処理等を施し、不要な固形成分を除去した後、核酸分子を可溶性画分中に分離・採取して、核酸を含む検体とする。
【００４１】
その際、検体中に含まれる核酸分子は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子のいずれでもよい。なお、対象とする核酸分子がＲＮＡ分子である場合、一旦、このＲＮＡ分子を鋳型として、逆転写酵素反応を利用して、その塩基配列と相補的なＤＮＡ分子、すなわち、ｃＤＮＡ分子を調製する。例えば、一旦、検体中に含まれる核酸分子中から、全ＲＮＡを分離した後、対応するｃＤＮＡ・ライブラリーを構築する。構築されたｃＤＮＡ・ライブラリー中に含まれる、検出対象のＲＮＡ分子に由来するｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応によって、所望の塩基配列領域（標的領域）を含むＤＮＡ断片を調製し、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用することが好ましい。
【００４２】
一方、対象とする核酸分子がＤＮＡ分子である場合、例えば、制限酵素による酵素消化を利用して、所望の塩基配列領域（標的領域）を含むＤＮＡ断片を調製し、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用することもできる。例えば、ＤＮＡゲノムが、一細胞当たり、極僅かな量しか存在していないため、予め、ＤＮＡゲノムを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応によって、所望の塩基配列領域（標的領域）を含むＤＮＡ断片を調製し、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用することが好ましい。
【００４３】
検体中に含まれる核酸分子に基づき、上記ＰＣＲ反応によって所望の増幅率で増幅されている、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を含有する核酸溶液を一次試料として利用する際には、該検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片に加熱処理を施し、解離した一本鎖ＤＮＡ断片を、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用する。この一本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列は、上記ＰＣＲ反応に利用されるＰＣＲプライマーの塩基配列によって、その５’末端と３’末端とが決定され、また、その配列長も決定されている。この全塩基配列が判明している一本鎖ＤＮＡ断片を鋳型核酸として利用し、該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することにより作製される。
【００４４】
本発明にかかる核酸標識方法では、伸長反応のプライマーとして、標識付きオリゴヌクレオチドを少なくとも二種以上利用する。この標識付きオリゴヌクレオチド二種はいずれも、前記全塩基配列が判明している一本鎖ＤＮＡ断片を鋳型核酸として、そのオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長が可能なものとされる。該オリゴヌクレオチド、ならびに、その３’末端に伸長される核酸鎖は、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖のいずれを用いることも可能であるが、通常、ＤＮＡポリメラーゼを利用する伸長反応の適用が可能なＤＮＡ鎖を利用することが好ましい。
【００４５】
前記標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも二種以上は、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、いずれも、鋳型核酸として用いる一本鎖核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列とされる。加えて、該標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも二種以上は、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、相互で相違したものとなるように選択する。本発明にかかるプライマー・セットは、前述のオリゴヌクレオチドの塩基配列が相互に相違している、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー混合物である。該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの含有量比率は、それら標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして、核酸鎖の伸長を行うことで作製される、標識化された核酸複数種の収量が、実質的に等しくなるように選択することが好ましい。
【００４６】
すなわち、原理的には、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の選択に応じて、鋳型核酸として用いる一本鎖核酸とのハイブリダイズ効率、ならびに、その３’末端への核酸鎖の伸長が完了するに要する反応時間に相違が生じる。通常、一本鎖核酸を鋳型核酸として、プライマーを用いた核酸鎖の伸長反応は、一本鎖核酸に対して、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）工程、プライマーの３’末端へ核酸鎖の伸長を行う核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程、作製された、５’末端にプライマーを含む一本鎖核酸と鋳型の一本鎖核酸とを分離する変性処理（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程で構成される。プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチドと鋳型核酸である一本鎖核酸とのハイブリッド体の融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ）は、前記核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程の温度よりも、有意に高く、変性処理（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程の温度よりも、有意に低くなるように、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択する。その際、該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドにおいて、その融解温度Ｔｍは、４５℃〜８０℃の範囲内とし、また、それらの融解温度Ｔｍ間の差違は、１０℃以内、好ましくは、５℃以内となるように、各標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することが望ましい。一般に、各標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の塩基長は、少なくとも、１５塩基〜４０塩基の範囲内に選択することが望ましい。標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の塩基長を、１５塩基未満、例えば、１３塩基に選択しても、塩基配列の種類によっては、融解温度Ｔｍを前述の温度範囲内とすることも可能ではある。一方、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の塩基長を、４０塩基を超える、例えば、４５塩基に選択した際にも、塩基配列の種類によっては、融解温度Ｔｍを前述の温度範囲内とすることも可能ではある。但し、塩基配列の塩基長が４０塩基を超えて、長くなるとともに、目標とする一本鎖核酸中に存在している、前記相補的な塩基配列部分のみでなく、この相補的な塩基配列部分と類似する塩基配列を有する、他の一本鎖核酸に対する、ミスフィット・ハイブリダイゼーションを起こす確率が増すことになる。すなわち、目標とする一本鎖核酸以外に、他の一本鎖核酸を鋳型核酸として、該ミスフィット・ハイブリダイゼーションを起こした標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端へ核酸鎖の伸長反応が起こる確率が増すことになり、本発明の目的には適合しないものとなる。
【００４７】
該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドにおいて、その融解温度Ｔｍを考慮した上で、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの含有量比率を適宜選択することが望ましい。なお、融解温度Ｔｍ間の差違が、上記の好適な範囲内である場合、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの含有量比率は、融解温度Ｔｍが最も高いものと、Ｔｍが最も低いものとの間の含有量比が、１：１〜１：０．１の範囲内となるように、適宜設定することが望ましい。
【００４８】
鋳型核酸を基に、フォワード・プライマーとリバース・プライマーとを用いたＰＣＲ産物を作製する反応を利用して、標識化を施す場合は、上記の範囲内に選択することにより、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドのいずれに対しても、好適に標識化された核酸複数種の調製がなされる。また、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドと、プローブ設定位置との間の位置関係に関しては、鋳型核酸の塩基配列に依って異なるが、通常のＰＣＲ反応によって、プローブ設定位置を超える核酸鎖の伸長が問題なく行える距離（塩基長）であることが好ましく、少なくとも、両者を隔てる距離は、１００００塩基長以下の範囲内にあることが好ましい。
【００４９】
該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドにおいて、個々の標識付きオリゴヌクレオチドに付される標識物質は、そのオリゴヌクレオチド一分子当たり、一定量となるように付す。例えば、そのオリゴヌクレオチド一分子当たり、標識物質が一分子付されている形態は、一般に、より好ましい形態である。
【００５０】
また、個々の標識付きオリゴヌクレオチドに付される標識物質は、そのオリゴヌクレオチドによる、鋳型核酸に用いる一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを阻害しない部位に導入することが望ましい。同時に、鋳型核酸に用いる一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション後、該オリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖伸長反応を行う際、利用されるＤＮＡポリメラーゼなどの核酸鎖合成酵素の結合、ならびに、その核酸鎖伸長反応を阻害しない部位に導入することが望ましい。従って、個々の標識付きオリゴヌクレオチドに付される標識物質は、そのオリゴヌクレオチドの５’末端に導入する形態が、一般に、より好ましい形態となる。具体的には、そのオリゴヌクレオチドを予め合成した後、その５’末端に共有的に結合させることで、当量的に導入可能な標識物質を利用することがより好ましい。
【００５１】
この５’末端に共有的に結合させることで、当量的に導入可能な標識物質の例として、蛍光標識として利用される各種蛍光物質、あるいは、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。ビオチンは、各種ビオチン結合型の標識酵素タンパク質を反応させ、かかる標識酵素タンパク質の酵素活性を指標として、検出を可能とする。ジゴキシゲニンも、各種のジゴキシゲニン結合型の標識酵素タンパク質を反応させ、かかる標識酵素タンパク質の酵素活性を指標として、検出を可能とする。蛍光標識として利用される各種蛍光物質は、かかる蛍光物質に由来する蛍光強度を観測する光学的検出手段を利用することで、高感度の検出を可能とする。また、前記標識酵素タンパク質の酵素活性を指標とする検出法も、酵素活性は、各種発色反応を利用するものとすることで、光学的検出手段の利用が可能であり、高感度の検出を可能とする。
【００５２】
特に、固相上に固定化されたＤＮＡプローブとして、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態を利用する際には、単位面積当たり、高い密度でＤＮＡプローブが存在する状態となる。従って、標識化された核酸とＤＮＡプローブとのハイブリッド体も、単位面積当たり、高い密度で存在する状態で標識を利用した、再現性のよい検出が必要とされる。その場合、標識酵素タンパク質の酵素活性を指標とする検出は、この酵素反応に利用される基質物質の供給にバラツキを生じないように注意が必要となる。それに対して、蛍光標識として利用される各種蛍光物質を利用する際には、励起光強度の均一化は、基質物質供給の均一化と比較すると、格段に容易に達成できる。この観点から、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態を利用する際には、蛍光標識の使用は、より好適な形態となる。かかる蛍光標識に利用可能な蛍光色素としては、従来公知の蛍光色素をいずれも使用することができる。なかでも、量子収率、耐光性、耐ガス性、化学的安定性、さらには、ＤＮＡポリメラーゼの基質としての特性の観点から、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎなどは、本発明においても、好適に利用することができる。
【００５３】
該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドに対して、標識付きオリゴヌクレオチドの種類ごとに、異なる種類の標識物質を用いて、標識することも可能であるが、検出の簡便さを考慮すると、同じ種類の標識物質を用いて標識することが好ましい。すなわち、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを利用して、同一の一本鎖核酸を鋳型核酸として、標識化された核酸の複数種が作製されるが、プローブ・ハイブリダイゼーションにおいて、特定の塩基配列を有するＤＮＡプローブに対して、この標識化された核酸の複数種中の一種以上がハイブリッド体を形成する可能性がある。例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡプローブに対して、標識化された核酸二種がハイブリッド体を形成している場合、この標識化された核酸二種に使用されている標識物質が異なると、個々の標識物質の検出を行った上で、その結果を合算する作業が必要となる。一方、この標識化された核酸二種に使用されている標識物質が同一であると、一度に、標識物質の検出と、その結果の合算がなされるので、検出操作は簡便なものとなる。
【００５４】
本発明にかかる核酸標識方法では、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを利用することにより、同一の一本鎖核酸を鋳型核酸として、各標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖伸長反応を行う結果、標識化された核酸の複数種を含む混合物が作製される。この核酸鎖伸長反応では、該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの相当量は消費されるが、反応終了時、かかる反応液中には、消費されなかった、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが相当量残余している。この混合物中に残留している、複数種の標識付きオリゴヌクレオチド自体が、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ上に固定されているＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成する、目的とする標識化された核酸の検出に際して、検出精度、定量性を阻害する要因となる。従って、プローブ・ハイブリダイゼーション反応に供する前に、混合物中に残留している、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを除去し、目的とする標識化された核酸の精製を行うことが好ましい。
【００５５】
一方、検出用のＤＮＡプローブは、目的とする標識化された核酸とハイブリッド体形成は可能であるが、標識付きオリゴヌクレオチドとは、実質的にハイブリッド体形成が困難となるように、検出用ＤＮＡプローブの塩基配列と、標識付きオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部の塩基配列とを選択することがより好ましい。本発明の目的では、検出用ＤＮＡプローブの塩基配列は、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から、この検出対象である核酸に特異的な部分塩基配列が予め選択されている。本発明にかかる核酸標識方法により作製される、標識化された核酸の複数種の少なくとも一つは、前記検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成する。その際、検出用ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションする部位が、かかる標識化された核酸中、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に伸長される核酸鎖に位置すると、原理的に、標識付きオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部と検出用ＤＮＡプローブとのハイブリッド体形成は回避されるため、好ましい形態である。すなわち、本発明にかかる核酸標識方法において使用されるプライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から予め選択される、該ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を基準として、その３’末端側に位置する部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有することが好ましい。
【００５６】
特に、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中、該ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を基準として、その３’末端側に位置する前記部分塩基配列までの間隔（塩基長）が、３０００塩基長以内、より好ましくは１０００塩基長以内となるように、該標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することがより好ましい。換言すると、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することで調製される標識化された核酸に対して、その５’末端から該ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションする位置までの距離（塩基長）は、１０００塩基長以内となるため、例えば、５’末端に蛍光標識が付された核酸に対して、固相上に固定化されたＤＮＡプローブの結合部位は、その５’末端の近傍に設定された状態が達成され、経験的に、その５’末端の蛍光標識に起因する蛍光は高い強度で測定される状態となる。
【００５７】
検出対象の核酸を複数種の検出用ＤＮＡプローブを利用して検出する際には、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から、該複数種のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列が予め選択される。その際、各ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列に対して、プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドのいずれも、ハイブリッド体形成が困難であり、同時に、各ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を基準として、その３’末端側、３００塩基長以内の範囲に選択される部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドが少なくとも一つ存在するように、該標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することがより好ましい。
【００５８】
具体的には、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中、その３’末端側から、各ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を並べた際、最も３’末端側に位置する第一のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列について、それよりさらに３’末端側、３００塩基長以内の範囲に選択される部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する、第一の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択する。次いで、前記第一のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列に次いで、その５’末端側に位置する第二のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列について、それよりさらに３’末端側、３００塩基長以内の範囲であり、同時に、前記第一のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列よりも５’末端側に選択される部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する、第二の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択する。以後、隣接して位置する、二つのＤＮＡプローブ用の部分塩基配列の間に挟まれた領域に選択される、部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を逐次選択する。その結果、検出対象の核酸を複数種の検出用ＤＮＡプローブを利用して検出する際には、該複数種のＤＮＡプローブの種類数と同じ数の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することができる。本発明にかかる核酸標識方法により作製される、標識化された核酸の複数種は、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用して、作製することがより好ましい。
【００５９】
該複数種のＤＮＡプローブに対して、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用する場合にも、検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として、各標識化された核酸は、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することで調製される。その際、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、少なくとも、前記鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えることが必要である。すなわち、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えることは必要ではあるが、必ずしも、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の５’末端に達するまで、核酸鎖の伸長を行う必要はない。
【００６０】
従って、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用する場合、本発明にかかる核酸標識方法では、プライマーの３’末端へ核酸鎖の伸長を行う核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程における反応条件は、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の５’末端に達するまで、核酸鎖の伸長を行うに必要な反応時間よりも、有意に短く選択することが可能である。例えば、該核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程において伸長可能な核酸鎖の塩基数は、３００〜３０００塩基の範囲、場合に依っては、３００〜１０００塩基の範囲となる反応条件を選択することが可能である。
【００６１】
加えて、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用する場合、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸に対して、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）工程で、該一本鎖核酸上に複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが同時にハイブリダイズする形態を採ることもできる。その際、各標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、その５’末端側に他の標識付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているため、原理的に、他の標識付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている部位を超えて進行できない形態となる。その場合でも、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、少なくとも、前記鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えるという要件を満たしており、全く問題はない。
【００６２】
さらには、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上に、プライマー・セット中に含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが全てハイブリダイズする状況を達成すると、各標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、少なくとも、前記鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えるが、その直後にハイブリダイズしている、次の標識付きオリゴヌクレオチドの直前で停止する形態となる。この形態で作製される、標識化された核酸の複数種は、それぞれ、５’末端に標識付きオリゴヌクレオチドを内在し、その３’末端へ伸長されている核酸鎖は、前記ＤＮＡプローブ一種のみがハイブリッド体形成が可能な、高い特異性を示す形状となる。同時に、かかる標識化された核酸は、前記ＤＮＡプローブ一種のみと選択的にハイブリッド体形成する際、例えば、５’末端に蛍光標識が付された核酸に対して、固相上に固定化されたＤＮＡプローブの結合部位は、その５’末端の近傍に設定された状態が達成され、経験的に、その５’末端の蛍光標識に起因する蛍光は高い強度で測定される状態ともなっている。すなわち、本発明の目的に鑑みると、最も好適な形態の一つとなる。
【００６３】
本発明にかかる核酸標識方法では、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長反応では、必ずしも、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の５’末端に達するまで、核酸鎖の伸長を行う必要はないため、この伸長反応を非対称ＰＣＲ反応の形態で実施することができる。
【００６４】
さらには、上述する鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上に、プライマー・セット中に含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが全てハイブリダイズする状況を利用して、３’末端への核酸鎖の伸長を停止させる形態に代えて、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、次の標識付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする部位の直前に存在する部分塩基配列に相当する、ファワード・プライマーを利用し、該標識付きオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとするＰＣＲ反応を行うことも可能である。
【００６５】
本発明にかかる核酸標識方法は、上で説明したように、検出対象の核酸を複数種の検出用ＤＮＡプローブを利用して検出する際、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から、該複数種のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を予め選択し、これら複数種のＤＮＡプローブを用いて、前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出は、固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用している形態に特に適するものである。特に、前記固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブは、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態である際、本発明にかかる核酸標識方法の利点は、より顕著なものとなる。
【００６６】
以下に、本発明について、より具体的な例を示して、その好適な実施形態について、さらに詳しく説明する。
【００６７】
具体的には、感染症を引き起こす複数の起炎菌を同定する場合に、本発明を応用した例ついて説明する。
【００６８】
細菌の種類を同定する目的では、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出の対象として、各細菌に由来する特定のｒＲＮＡ遺伝子、特に１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を使用することが可能である。特に、感染症の引き起こす複数種の起炎菌に関しては、その細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列は解明されており、各起炎菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の相互比較により、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内から、個々の起炎菌にユニークな塩基配列を選択して、プローブとして使用できる。
【００６９】
感染症を罹患している、特定の患者から採取された試料中に存在している起炎菌の種類を特定することは、当該患者に対する治療を進める際、不可欠な過程である。但し、この核酸検出過程では、患者から採取された試料中に存在している起炎菌の種類は、判明していないため、先ず、試料中に存在している細菌から、ゲノム遺伝子を抽出分離し、ゲノム遺伝子を含む原サンプルとする。この原サンプル中に含有される、細菌由来のゲノム遺伝子量は、多くの場合、そのまま、一定水準以上の検出精度が要求される、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に利用可能な量には、遥かに達しない量である。
【００７０】
現実問題としても、感染症を引き起こしている、起炎菌の候補は複数挙げられる場合が少なくない。これら複数種の起炎菌候補のうち、患者から採取された試料中に存在している起炎菌を特定する際には、複数種の起炎菌候補由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内から、個々の起炎菌にユニークな塩基配列を選択した、検出プローブ複数種について、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、陽性・陰性の判定を行う必要がある。そのため、この原サンプル中に含有される、細菌由来のゲノム遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を利用して、細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ産物として調製する。その際、存在する細菌の種類は不明であるので、複数種の起炎菌候補において、その細菌の種属を問わず、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中に見出される共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をＰＣＲプライマーとしたユニバーサルＰＣＲ法を利用することが必要となる。
【００７１】
複数種の起炎菌候補を対象として、ユニバーサルＰＣＲ法を利用して、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ産物として調製する際、ＰＣＲプライマーとして利用可能な共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としては、下記のものが挙げられる。すなわち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｓａ ｃｏｌｉ 由来の１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中、その５’→３’方向で、９−２７、１０５−１２３、３３９−３５７、５１５−５３１、６８６−７０４、７８５−８０５、９０７−９２６、１０９９−１１１４、１２２４−１２４１、１３９１−１４０６、１４９５−１５１０、１５２５−１５４１に位置する塩基配列は、複数種の起炎菌において、共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）となっている。実際のユニバーサルＰＣＲ用プライマーの設計は、これら共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列を含み、さらに、必要に応じて、その前後１０塩基程度の範囲内塩基配列をも参照して、複数種の起炎菌候補の何れにおいても、一定水準以上の増幅が可能なミックス・プライマーを設計することが望ましい。
【００７２】
設計されるプライマーの塩基長にもよるが、前記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列を含むプライマーの全塩基配列に対して、鋳型となる１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の対応塩基配列部分が、１〜１０塩基の範囲でミスマッチを含んでいる配列であっても、ＰＣＲプライマーとして機能する場合も少なくない。従って、一種類のプライマーを用いることも可能ではあるが、ミスマッチのバリエーションを考慮して、複数種のプライマーを含むミックス・プライマーを用いることで、複数種の起炎菌候補全体において、一定水準以上の増幅効率を維持することが好ましい。さらには、前記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列以外であっても、対象とする複数種の起炎菌候補について、ミックス・プライマー中に含まれる総数が５０以内のバリエーションでカバー可能であれば、配列の共通性がやや劣る領域に相当するプライマーを利用することも可能である。但し、ミックス・プライマー中に含まれる総数が５０を超えると、反応液中に添加するプライマー総量が過多となる、あるいは、プライマー総量を制限すると、個々のプライマー量が少なくなる結果、相対的に増幅効率の低下を引き起こす要因となる。また、ミックス・プライマー中に含まれる総数が５０を超えると、反応液中に添加するプライマー総量に対して、実際の増幅に利用される比率は低くなるため、コスト・パフォーマンスの点でも、好ましいものではない。
【００７３】
本発明においては、一本鎖核酸を鋳型核酸に用いて、プライマーとする複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長反応を行うが、複数種の起炎菌候補から、試料中に存在している起炎菌の種類を特定する際には、前記ユニバーサルＰＣＲを利用して、予め一定水準まで増幅された１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を含むＤＮＡ断片を鋳型核酸に用いることが好ましい。特に、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドとして、５’末端に標識が導入されているオリゴヌクレオチドを利用する場合、その３’末端への核酸鎖伸長反応では、非対称ＰＣＲ、あるいは、通常のＰＣＲのいずれを利用することも可能である。
【００７４】
一方、その際利用する、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドも、複数種起炎菌候補のいずれに対しても、ユニバーサルＰＣＲにより増幅された１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を鋳型核酸として、核酸鎖の伸長反応が可能な、上記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列を含むプライマー配列を選択することが望ましい。すなわち、ユニバーサルＰＣＲに利用した、共通性の高いプライマー配列に対して、その３’末端側（下流）に位置する共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列に基づき設計された、プライマー用オリゴヌクレオチド複数種の５’末端に標識が導入したものが好適に利用される。
【００７５】
検出用プローブは、前記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に挟まれる領域に、ハイブリダイズするように選択されているため、プライマー用オリゴヌクレオチド複数種の塩基配列自体と、検出用プローブとは、直接ハイブリダイズする懸念はない。一方、プライマー用オリゴヌクレオチド複数種のいずれか一つでは、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列に近接して、その３’末端側（下流）に検出用プローブがハイブリダイズすることが可能となる。それに付随して、５’末端に蛍光標識が導入されている核酸に対して、固相上に固定化されている検出用プローブが、その５’末端から遠い位置においてハイブリダイズするように設計されている際に見出される、ハイブリッド体から観測される蛍光強度が低いという問題が回避される。
【００７６】
例えば、複数種起炎菌候補において、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列に対応するように設計される、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの一例として、
下記配列１〜配列９：
配列１； 5' actgctgcctcccgtaggagtctgg 3'
配列２； 5' cgtattaccgcggctgctggcacg 3'
配列３； 5' gcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg 3'
配列４； 5' tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg 3'
配列５； 5' ggtaaggttcttcgcgttgc 3'
配列６； 5' ttgacgtcatccccaccttcctcc 3'
配列７； 5' ccattgtagcacgtgtgtagccc 3'
配列８； 5' tggtgtgacgggcggtgtgtacaag 3'
配列９； 5' taccttgttacgacttcacccca 3'
を挙げることができる。すなわち、該プライマー・セットに含まれる、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドとして、前記配列１〜配列９からなる群から選択される、少なくとも二種以上の塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなる、プライマー・セットを利用することが望ましい。
【００７７】
一本鎖核酸を鋳型核酸として用い、この鋳型核酸にハイブリダイズさせた標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして、その３’末端への核酸鎖伸長反応を行った場合、プライマーの３’末端への核酸鎖伸長反応は、核酸鎖合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が基質のＮＴＰｓを取り込む素過程に依存する結果、一定の反応時間中に伸長される核酸鎖の鎖長はポワソン分布型の分布を示す。すなわち、ある鎖長において、確率極大を示し、それより伸長される核酸鎖鎖長が短い産物を相当量含んでいる。例えば、プライマーのハイブリダイズ部位から鋳型核酸の５’末端までの距離（塩基長）が長い場合、一定の短い反応時間中に、プライマーの３’末端へ伸長される核酸鎖の大半は、鋳型核酸の途中までは到達できるが、５’末端まで到達するものは、極く僅かしかない状態となる。その際、検出用プローブが、鋳型核酸に用いている一本鎖核酸の塩基配列中、プライマーのハイブリダイズ部位の僅かに５’末端側に選択されている場合、前記プライマーの３’末端への核酸鎖伸長がなされた産物のほとんど全ては、該検出用プローブとハイブリッド体形成が可能である。一方、検出用プローブが、鋳型核酸に用いている一本鎖核酸の塩基配列中、その５’末端の近傍に選択されている場合、前記プライマーの３’末端への核酸鎖伸長がなされた産物の極く僅かが、該検出用プローブとハイブリッド体形成が可能である。すなわち、一定の短い反応時間中に、プライマーの３’末端へ伸長される核酸鎖の平均鎖長と比較し、プライマーのハイブリダイズ部位から鋳型核酸の５’末端までの距離（塩基長）が有意に長い場合、検出用プローブの選択位置によって、ハイブリッド体形成が可能な産物の含有比率が大きく異なる。
【００７８】
一方、標識付きオリゴヌクレオチド複数種を利用することにより、一定の短い反応時間中に、プライマーの３’末端へ伸長される核酸鎖の平均鎖長と比較し、鋳型核酸に用いる一本鎖核酸の核酸長が有意に長い場合であっても、一本鎖核酸の５’末端からさほど離れていない部位にハイブリダイズする、標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端へ伸長される核酸鎖は、大半が５’末端まで到達可能である。従って、標識付きオリゴヌクレオチド複数種を利用することにより得られる、標識化された核酸複数種においては、検出用プローブの選択位置に依らず、ハイブリッド体形成が可能な産物の含有比率に有意な差違は無い状態とできる。
【００７９】
この検出用プローブの選択位置に依らず、ハイブリッド体形成が可能な産物の含有比率を平均化する作用と、標識付きオリゴヌクレオチド複数種の何れかにおいて、その３’末端側の近い部位に検出用プローブがハイブリダイズする効果とのが相俟って、検出用プローブの選択位置に影響されず、高い検出感度を達成することが可能となる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に示す態様に限定されるものではない。
【００８１】
（実施例１）
＜プローブＤＮＡの作製＞
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌由来の核酸分子の選択的検出用プローブとして、表１に示す塩基配列を有するプローブＤＮＡを設計した。
【００８２】
具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム領域の塩基配列に基づき、表１に示す８種のプローブの塩基配列を選択した。これらのプローブの塩基配列は、当該菌に対して、非常に特異性が高く、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように選択されている。同時に、それぞれのプローブの塩基配列相互において、ハイブリダイゼーション感度を比較した際、感度のバラツキのないことが期待できるように設計されている。
【００８３】
【表１】
【００８４】
表１中に示す各プローブに対して、ＤＮＡ鎖の合成後、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、核酸の５’末端にチオール基を定法に従って導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−３０℃の冷凍庫内に保存した。
【００８５】
同様な設計手法により、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌由来の核酸分子の選択的検出用プローブとして、表２に示す塩基配列を有するプローブＤＮＡを設計した。
【００８６】
【表２】
【００８７】
＜検体中の核酸鎖増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒの調製＞
起炎菌の検出に利用される、該起炎菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒとして、表３に示す核酸配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。
【００８８】
具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標準株（ＡＴＣＣ １０１４５）由来の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブ・セット、つまり、約１５００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分の塩基配列に基づき、それに相補的な塩基配列を有し、また、当該部分とハイブリダイズさせた際、その融解温度がほぼ揃った複数種のプライマーを設計した。設計された複数種類のプライマーは、互いに、部分的な塩基配列の相違を有するが、この混合プライマーを利用することで、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように設計されている。
【００８９】
【表３】
【００９０】
表３中に示す各Ｐｒｉｍｅｒは、ＤＮＡ鎖の合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製する。このＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ３種、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を混合し、各Ｐｒｉｍｅｒ濃度が、最終濃度１０ ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００９１】
＜Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＮＡ（モデル検体）の抽出＞
［微生物の培養とゲノムＤＮＡ抽出の前処理］
まず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標準株（ＡＴＣＣ １０１４５）を、定法に従って培養した。
【００９２】
この微生物培養液１．０ｍｌ（ＯＤ600＝０．７）を、１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに採取し、遠心分離（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）により菌体を分離した。上清を捨てた後、Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて、菌体を再縣濁した。再縣濁した菌体液から、再度、遠心分離（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）により菌体を分離した。上清を捨てた後、回収された菌体に、下記二種の酵素溶液各５０μｌを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
【００９３】
溶菌処理用酵素溶液
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ５０ μｌ（酵素濃度：２０ ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）
Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ ＳＧ ５０ μｌ（酵素濃度：０．２ ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）
次に、酵素を含む緩衝液中に再縣濁した菌体液を、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、該微生物の細胞膜の溶解処理を行った。
（Ｇｅｎｏｍｅ抽出・精製）
細胞膜の溶解処理後、該微生物由来のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ抽出・精製は、核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、下記の手順に従って行った。
【００９４】
（ステップ１）
先ず、細胞膜の溶解処理を施した微生物縣濁液に、前記キットの溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ液４０μｌとを加え、チューブミキサーを用いて、１０分間激しく攪拌する。この操作により、含有される二本鎖ＤＮＡ分子は、磁性粒子（ビーズ）表面に吸着される。
【００９５】
（ステップ２）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集める。その後、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる。
【００９６】
（ステップ３）
マイクロチューブ内に、洗浄液 ９００ μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁を行う。
【００９７】
（ステップ４）
再び、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集める。その後、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる。
【００９８】
（ステップ５）
前記ステップ３、４の洗浄操作を繰り返して、２度の洗浄を行う。
【００９９】
（ステップ６）
該洗浄液を用いた洗浄後、マイクロチューブ内に７０％エタノール ９００ μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁する。
【０１００】
（ステップ７）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集める。その後、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる。
【０１０１】
（ステップ８）
前記ステップ６、７の洗浄操作を繰り返して、７０％エタノールによる合計２度目の洗浄を行う。
【０１０２】
該７０％エタノールによる２度の洗浄を行った後、マイクロチューブ内に純水 １００ μｌを加え、回収された磁性粒子を含む液をチューブミキサーで１０分間攪拌を行う。この操作により、磁性粒子（ビーズ）表面に吸着されていた二本鎖ＤＮＡ分子は、純水中に再溶出される。
【０１０３】
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集める。最終的に、スタンドにセットした状態のまま、二本鎖ＤＮＡ分子を含む上清を新しいチューブに回収する。
（回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡの検査）
回収された微生物（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５株）由来の、精製済核酸分子を含む液は、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、該液中に含まれるＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡについて、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。
【０１０４】
本実施例では、約１０μｇのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡが回収され、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。
【０１０５】
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英製ガラス基板（サイズ：２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚さ）、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中に浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、基板を取り出し、軽く純水で濯いだ（リンス洗浄）後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。その後、基板を取り出し、純水によるリンス洗浄と、超純水中で超音波洗浄を施した。以上の洗浄操作により、洗浄済みのＤＮＡチップ用石英ガラス基板を用意した。
【０１０６】
［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に加え、室温で２時間攪拌し、均一に溶解した。続いて、前記洗浄済み石英ガラス基板をシランカップリング剤水溶液中に浸し、室温で２０分間放置した。石英ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面をリンス洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に、乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、前記アミノシランカップリング剤の基板表面への結合処理を完結させた。基板表面には、該アミノシランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【０１０７】
同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を調製した。前記ベーク処理の終了後、石英ガラス基板を室温まで放冷した。次いで、表面にアミノ基が導入された石英ガラス基板を、ＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理の間に、アミノシランカップリング剤処理によって基板表面に導入されたアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、石英ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた石英ガラス基板を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒を用いて洗浄し、未反応のＥＭＣＳを除去した。さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で、前記表面処理済み石英ガラス基板を乾燥した。
【０１０８】
［３］プローブＤＮＡ
＜プローブＤＮＡの作製＞で作製した検出用プローブＤＮＡを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように、マイクロ・バイアルに分注した後、凍結乾燥を行った。水分を除いたプローブＤＮＡをそれぞれ収納するマイクロ・バイアルは、下記の手順で、バブルジェット方式によるスポッティング用のＤＮＡ溶液の調製に利用した。
【０１０９】
［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ溶液の吐出、および基板表面への固定化
グリセリン７．０ｗｔ％、エチレングリコール５．０ｗｔ％、ヘキサントリオール５．０ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を調製した。続いて、先に用意した８種類のプローブＤＮＡ（表１）をそれぞれ収納するマイクロ・バイアル中に、ＤＮＡ濃度が、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように、前記混合溶媒を所定量加えて、ＤＮＡ溶液（インク）を調製した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０ キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【０１１０】
なお、基板面上へのＤＮＡ溶液のスポッティングに使用するため、前記バブルジェットプリンターは、平板への印字が可能なように改造が施されている。また、このバブルジェットプリンターの印字ヘッドは、所定のファイル作成方法に従って、印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液液滴を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【０１１１】
続いて、上記の改造を施したバブルジェットプリンターを用いて、表面にマレイミド基が導入された石英ガラス基板に対して、所定の印字パターンに従って、各ＤＮＡ溶液のスポッティング操作を行い、アレイを作製した。アレイ状のスポッティング操作が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、石英ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のチオール基とを反応させ、プローブＤＮＡの固定を行った。
【０１１２】
［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、基板表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流した。石英ガラス基板表面に、目的とする複数種の一本鎖ＤＮＡがアレイ状に固定されている遺伝子チップが得られた。
＜ゲノムＤＮＡ抽出物中の検体ＤＮＡのＰＣＲ増幅＞
上記微生物由来のゲノムＤＮＡ抽出物中から、検体ＤＮＡとなる、１６ｓ ｒＲＮＡの遺伝子のＰＣＲ増幅を、下記の手順・条件で行う。
【０１１３】
先ず、上記表３に示す、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を含むＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ混合物、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を含むＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ混合物を用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を行う。該ＰＣＲ増幅反応は、市販のＰＣＲキット（TAKARA ExTaq）を利用して行い、その反応溶液組成を、表４に示す。
【０１１４】
一方、ＰＣＲ反応の温度条件は、下記表４に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーを利用して、増幅反応を行った。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
このＰＣＲ増幅反応の終了後、市販のＰＣＲ産物精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて、Ｐｒｉｍｅｒを除去し、ＰＣＲ増幅産物を回収した。その際、得られたＰＣＲ増幅産物の定量を行った。
＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞
蛍光標識として、Ｃｙ３を５’末端に結合した、標識付きオリゴヌクレオチドを利用して、標識化ＤＮＡ鎖の調製を下記の手順・条件で行った。
【０１１７】
ヌクレオチド鎖の合成後、常法に従って、蛍光標識化合物Ｃｙ３を、該ヌクレオチド鎖の５’末端に共有的に結合させた。その後、ＨＰＬＣを用いて、標識付きオリゴヌクレオチドの精製を行った。表５に、合成された標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列と、その結合部位（Ｅ．ｃｏｌｉ由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの塩基数）を示す。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
上記ＰＣＲ増幅反応で得られるＰＣＲ増幅産物を鋳型とし、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５に示す塩基配列を有する９種の標識付きオリゴヌクレオチドの混合物を利用して、相補的なＤＮＡ鎖の伸長反応を下記の手順・条件で行う。
【０１２０】
該ＤＮＡ鎖の伸長反応は、市販のＰＣＲキット（TAKARA ExTaq）を利用して、片鎖ＰＣＲ反応の形態で実施した。その反応溶液組成を、表６に示す。
【０１２１】
一方、この伸長反応の温度条件は、下記表６に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーを利用して、増幅反応を行った。
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
このＤＮＡ鎖伸長反応の終了後、市販のＰＣＲ産物精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて、Ｐｒｉｍｅｒを除去し、標識付きオリゴヌクレオチド由来の蛍光標識Ｃｙ３が５’末端に付加された増幅産物を回収した。その際、得られた増幅産物の定量を行った。
＜ハイブリダイゼーション法による検体ＤＮＡの検出＞
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製した遺伝子チップと、＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体ＤＮＡとを用いて、ハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光標識を利用して、形成されるハイブリト体の検出を行った。
【０１２４】
（遺伝子チップのブロッキング）
100mM NaCl/ 10mM Phosphate Buffer中に、ＢＳＡ（牛血清アルブミンFraction V：Ｓｉｇｍａ社製）を濃度１ｗｔ％となるように添加し、ＢＳＡ溶液を調製する。このＢＳＡ溶液中に、＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製した遺伝子チップを室温で２時間浸し、遺伝子チップの石英ガラス基板表面に対して、ＢＳＡによるブロッキング処理を施した。ブロッキング処理の終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（NaCl 300mM、 Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, Na3C6H5O7・2H2O) 30mM、 pH 7.0）で、遺伝子チップの石英ガラス基板表面に残余するＢＳＡ溶液を洗浄した。次いで、純水でリンス洗浄した後、スピンドライ装置で遺伝子チップ表面の水切りを行った。
（ハイブリダイゼーション反応）
前記ブロッキング処理を施した遺伝子チップをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、標識化検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を下記の手順・条件で行った。
【０１２５】
使用したハイブリダイゼーション溶液の組成、条件を以下に示す。
【０１２６】
［ハイブリダイゼーション溶液］
＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した、精製済み標識化検体ＤＮＡを、１０％ＨＣＯＮＨ2を添加した６×ＳＳＰＥ緩衝液中に溶解した溶液を使用した。
６×ＳＳＰＥ/ 10% Form amide / Target (2nd PCR Products 全量)
(６×ＳＳＰＥ： NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、pH 7.4)
［ハイブリダイゼーション条件］
ハイブリダイゼーション反応、反応後の洗浄・乾燥の操作は、表７の条件で行った。
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
＜ハイブリット体の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、スピンドライ乾燥済み遺伝子チップ上の各プローブＤＮＡのスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１２９】
表８に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子５’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１３０】
【表８】
【０１３１】
上記のハイブリダイゼーション反応において使用した、標識化検体ＤＮＡ試料は、表５に示す、９種の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列から、その３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖の混合物である。その結果、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８に対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つは、その５’末端に近い部位でプローブＤＮＡとハイブリッド体形成が可能となっている。換言すると、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポット点では、各プローブＤＮＡに対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つが、その５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成して、固定化されている。かかる５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成したものでは、５’末端に付加されている蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光が高い効率で観測される。すなわち、蛍光標識Ｃｙ３の導入に利用する、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドについて、その塩基配列を、複数種のプローブＤＮＡのいずれかが、その５’末端に近い部位でハイブリッド体形成が可能となるように選択することで、複数種のプローブＤＮＡのいずれにおいても、形成されたハイブリッド体に起因する蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の均一化が達成されている。
【０１３２】
加えて、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来する、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて、同様の手順で遺伝子チップを作製した。この遺伝子チップについても、ブロッキング処理を施した後、前記の標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８とのハイブリッド体形成に起因する、蛍光は検出されなかった。
【０１３３】
（比較例１）
実施例１に記載する＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞の工程において、ＤＮＡ鎖伸長反応に用いるＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５中、配列９の標識付きオリゴヌクレオチドのみを使用して、標識化ＤＮＡ鎖を調製した。その後、調製された標識化ＤＮＡ鎖を同様の手順で精製して、１種の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を得た。
【０１３４】
この単一の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、遺伝子チップ上に固定化したプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８とハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、遺伝子チップ上のプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１３５】
表９に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
前記配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−３〜Ｐａ−８では、ハイブリッド体形成に起因する蛍光が観測されている。その際、かかる配列１の標識付きオリゴヌクレオチド由来の塩基配列をその５’末端に有する標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−３〜Ｐａ−８が結合する部位は、異なっている。すなわち、該標識化ＤＮＡ鎖の５’末端から、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−３が結合する部位が、次第に遠くなるとともに、測定される蛍光強度が減少している。結果として、ハイブリッド体形成が可能な、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−３のスポット点で観測される蛍光強度は、表９に示すように、大きな相違（蛍光強度のバラツキ）を示すことになる。
【０１３８】
勿論、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて作製される遺伝子チップでは、該配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖とのハイブリッド体形成に起因する蛍光は観測されなかった。
【０１３９】
（実施例２）
実施例１に記載する＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞の工程において、ＤＮＡ鎖伸長反応に用いるＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５に示す９種の標識付きオリゴヌクレオチドの混合物、さらにＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、実施例１の表３に記載するＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを加えて、標識化ＤＮＡ鎖を調製した。その後、調製された標識化ＤＮＡ鎖を同様の手順で精製して、複数種の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を得た。
【０１４０】
この標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、遺伝子チップ上に固定化したプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８とハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、遺伝子チップ上のプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１４１】
表１０に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１４２】
【表１０】
【０１４３】
その結果、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８に対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つは、その５’末端に近い部位でプローブＤＮＡとハイブリッド体形成が可能となっている。換言すると、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポット点では、各プローブＤＮＡに対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つが、その５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成して、固定化されている。かかる５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成したものでは、５’末端に付加されている蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光が高い効率で観測される。すなわち、蛍光標識Ｃｙ３の導入に利用する、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドについて、その塩基配列を、複数種のプローブＤＮＡのいずれかが、その５’末端に近い部位でハイブリッド体形成が可能となるように選択することで、複数種のプローブＤＮＡのいずれにおいても、形成されたハイブリッド体に起因する蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の均一化が達成されている。
【０１４４】
加えて、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来する、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて、同様の手順で遺伝子チップを作製した。この遺伝子チップについても、ブロッキング処理を施した後、前記の標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８とのハイブリッド体形成に起因する、蛍光は検出されなかった。
【０１４５】
（比較例２）
比較例１に記載する＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞の工程において、ＤＮＡ鎖伸長反応に用いるＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５中、配列９の標識付きオリゴヌクレオチド、さらにＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、実施例１の表３に記載するＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを加えて、標識化ＤＮＡ鎖を調製した。その後、調製された標識化ＤＮＡ鎖を同様の手順で精製して、１種の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を得た。
【０１４６】
この単一の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、遺伝子チップ上に固定化したプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８とハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、遺伝子チップ上のプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１４７】
表１１に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１４８】
【表１１】
【０１４９】
前記配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５では、ハイブリッド体形成に起因する蛍光が観測されている。その際、かかる配列９の標識付きオリゴヌクレオチド由来の塩基配列をその５’末端に有する標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５が結合する部位は、異なっている。すなわち、該標識化ＤＮＡ鎖の５’末端から、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５が結合する部位は、次第に遠くなるとともに、測定される蛍光強度が減少している。結果として、ハイブリッド体形成が可能な、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５のスポット点で観測される蛍光強度は、表１１に示すように、大きな相違（蛍光強度のバラツキ）を示すことになる。
【０１５０】
勿論、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて作製される遺伝子チップでは、該配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖とのハイブリッド体形成に起因する蛍光は観測されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明にかかる核酸標識方法は、検体中に含まれる鋳型核酸から、該鋳型核酸の全塩基配列中、その部分領域に対して、相補的な塩基配列を有する標識付き核酸を、伸長反応によって調製し、プローブ・ハイブリダイゼーション反応による核酸検出用の標識付き核酸試料を調製する際、好適に利用可能である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鋳型核酸の全塩基配列中、その部分領域に対して、相補的な塩基配列を有する標識付き核酸を、伸長反応によって調製する核酸標識方法、該方法に用いる標識付きオリゴヌクレオチド型プライマー・セット、ならびに、該方法によって調製される標識化された核酸に関する。特には、検体中に含まれる鋳型核酸から、該鋳型核酸の全塩基配列中、その部分領域に対して、相補的な塩基配列を有する標識付き核酸を、伸長反応によって調製し、プローブ・ハイブリダイゼーション反応による核酸検出用の標識付き核酸試料を調製する際、好適に利用される核酸標識方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトゲノム計画に代表されるように、種々の生物について、そのゲノム遺伝子、ミトコンドリア遺伝子などの塩基配列に関して、全般的な解析がなされてきている。更には、解明された遺伝子と、生命活動のメカニズム、各種疾病、疾患、遺伝的な体質等との関連性に関する研究も進み、次々と研究成果が報告されている。これらの研究結果から、特定の遺伝子の有無、あるいは、その発現産物の存在量（発現量）を知ることで、例えば、各種疾病、疾患などの要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングを行う上で有用な情報が得られることが判明してきている。また、各種疾病、疾患などの要因に関して、より詳細な特徴付けやタイピングがなされると、効果的な治療方法の選択がより容易となり、疾患の診断のみでなく、その治療にも効果的に利用可能であることも検証されてきている。
【０００３】
検体中における、特定の遺伝子の有無、ならにも、その発現量を検出する方法として、従来から多数の方法が提案され、また、実際に利用もされている。検出対象とする遺伝子あるいは核酸分子について、その塩基配列が判明している際、最も広範に利用されている手法は、該遺伝子あるいは核酸分子の塩基配列中から特徴的な部分塩基配列を選択し、その相補的な塩基配列を有する核酸プローブを利用して、かかる特徴的な部分塩基配列を含む核酸鎖の有無、あるいは、含有量を検出する方法である。具体的には、相補的な塩基配列を有するプローブ用ＤＮＡ鎖を予め調製し、検体中に含まれる遺伝子あるいは核酸分子を一本鎖核酸とした上で、前記ＤＮＡプローブとハイブリダイゼーション反応を行わせ、ハイブリッド体形成の有無、その形成量を何らかの方法を利用して検出する、プローブ・ハイブリダイゼーション法である。
【０００４】
このプローブ・ハイブリダイゼーション法による、特定の核酸分子の検出方法は、形成されるハイブリッド体を分離可能であれば、ハイブリダイゼーション反応自体は、液相中、あるいは、固相表面のいずれで行ってもよい。例えば、固相表面上でハイブリダイゼーション反応を行う場合には、予め、ＤＮＡプローブを固相表面上に結合、または、吸着によって、固定化しておき、形成されるハイブリッド体を固相上に固定、分離する。その際、検体中に含まれる核酸試料に対して、何らかの検出可能な標識物質によって標識化を施しておき、ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成して、固相上に固定、分離された標識化核酸鎖の有無、その量を、該標識物質に起因する信号を利用して、測定する。また、ＤＮＡプローブの固定用固相（基材）としては、ガラスや金属などの平面基板表面を用いるチップ、あるいは、微小粒子表面を用いるビーズ等が体表的な形態である。
【０００５】
プローブ・ハイブリダイゼーション法において、固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用するハイブリダイゼーション反応が好まれる理由の第一は、Ｂ／Ｆ分離が容易であることである。加えて、固相上の所定位置に固定化されているＤＮＡプローブを利用するため、検出領域を物理的に微小化でき、また、検出領域が特定されている結果、高感度の測定が可能となる。その際、複数種のＤＮＡプローブの固定位置を物理的に隔離することにより、同時に、多項目の検出が可能である。さらには、予め、所定量のＤＮＡプローブが固相上に固定化されているＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態を選択すると、その取扱いや応用が一層容易になる利点もある。
【０００６】
例えば、米国アフィメトリックス社では、平面基板上において合成されたオリゴＤＮＡに対し、蛍光色素で標識された核酸を作用させ、そのハイブリダイゼーション反応で形成されるハイブリッド体を、蛍光標識に由来する蛍光により検出する手法を提案している（特許文献１を参照）。この基板上において合成されたオリゴＤＮＡで構成されるＤＮＡアレイと、蛍光色素標識による蛍光検出法を利用することで、検体中に含まれる特定の核酸の有無や量の検出を可能としている。
【０００７】
また、富士フィルム社は、基板表面に予め導入されたアミノ基を利用して、別途作製した複数種のＤＮＡプローブを固定化する手法を応用して、ＤＮＡアレイを作製し、このＤＮＡアレイを用いて、標識された２２ｍｅｒの一本鎖ＤＮＡを検出している（特許文献２を参照）。
【０００８】
ところで、上記のような固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用し、ハイブリダイゼーション反応を応用してハイブリッド体形成させて、特定の核酸を検出する方法では、検体となる核酸に予め標識を付しておくことが必要となる。検体の核酸に、標識物質を取り込ませる方法としては、例えば、ＰＣＲ増幅産物を作製する際に、標識付きデオキシヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰなど）を付加する方法がある。
【０００９】
また、ＰＣＲ増幅産物を作製する際、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の基質となるＡＴＣＧ４種のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ：総称してｄＮＴＰ）と標識付きデオキシヌクレオチド（例えば、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ）をそれぞれ調製して、各ｄＮＴＰの終濃度を揃えることで、作製される増幅産物中に標識付きデオキシヌクレオチドを取り込ませる方法もある。寶酒造株式会社は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素の４種の基質ヌクレオチドのうち、一種の基質について蛍光標識されたヌクレオチドに置換し、増幅産物中に標識物質の取り込みを行なっている（特許文献３を参照）。
【００１０】
また、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する方法が知られている（特許文献４を参照）。この予め標識されたプライマーを利用する場合、作製される標識核酸一分子当り、付与される標識物質の量比が制御できるという利点があり、高い定量性が要求される際には、この手法が好適である。
【特許文献１】米国特許第６，４１０，２２９号明細書
【特許文献２】特開２００１−１２８６８３号公報
【特許文献３】特許第３００１９１９号公報
【特許文献４】特許第２６４９７９３号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用するハイブリダイゼーション反応を応用する核酸の検出方法は、他の核酸の検出方法と比較し、高感度であるなどの利点を有している。一方、液相中でのハイブリダイゼーション反応を利用する検出方法と比較した際、固相上の反応に付随して、制御困難な問題点は残されている。
【００１２】
例えば、検出対象となる核酸と等しい塩基長を有する、相補的なＤＮＡ全長をプローブＤＮＡとして固定化されているようなｃＤＮＡアレイなどとは異なり、検出対象の核酸の塩基長と比較し、プローブＤＮＡの塩基長が短い系では、固相上に固定されている塩基長の短いプローブＤＮＡと検出対象の核酸とのハイブリッド体を形成した後、Ｂ／Ｆ分離し、検出対象の核酸に付されている蛍光標識の蛍光強度を測定した際、検出対象の核酸上における、プローブＤＮＡとの結合部位の存在位置によって、蛍光強度が大きな影響を受けるという問題がある。
【００１３】
具体的には、検出対象の核酸の５’末端に蛍光標識が付されている場合、プローブＤＮＡとの結合部位がこの５’末端から遠ざかるに従って、測定される蛍光強度が低下する傾向がある。従って、検出対象の核酸の３’末端近傍にプローブＤＮＡとの結合部位を選択する場合と、５’末端近傍にプローブＤＮＡとの結合部位を選択する場合とでは、検出対象の核酸の５’末端に付されている蛍光標識から測定される蛍光強度に顕著な差違があることが判明している。この現象の詳細なメカニズムは、現段階では解明されていないが、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する手法で作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸を利用する際、その高い定量性を損なう要因ともなる。経験的には、５’末端に蛍光標識が付された核酸に対して、固相上に固定化されたＤＮＡプローブを利用する検出を行う際、ＤＮＡプローブとの結合部位をその５’末端の近傍に設定することで、前記の現象による影響を回避することが可能であることは確認されている。
【００１４】
しかしながら、検出対象の核酸をより高く選択性で検出する上では、ＤＮＡプローブの塩基配列は、検出対象の核酸に特異的な塩基配列部分に対して、相補的に選択することが必須である。検出対象の核酸に特異的な塩基配列部分は、かかる検出対象核酸の塩基配列の５’末端近傍には存在していないことも少なくない。その場合には、測定される蛍光強度は低下するが、５’末端から遠い位置に存在する特異的な塩基配列部分を利用するか、あるいは、選択性は低下するが、測定される蛍光強度は高くなる、５’末端近傍の特異性に難を有する塩基配列部分を利用するかの、二律排斥の選択肢のいずれを選択するかで、悩む事態となる。すなわち、定量性に優れた、予め標識されたプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を行い、核酸を標識する手法で作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸を利用する場合、固相上に固定化されたＤＮＡプローブの利用に依る高い検出感度と、プローブの塩基配列の特異性に因る高い選択性とが両立しない場合も少なくない。
【００１５】
例えば、感染症に罹患している特定の患者に関して、感染症を引き起こす、複数種の起炎菌のうち、何れの起炎菌に起因しているかを同定する場合を考慮する。複数種の起炎菌を遺伝子情報に基づき同定する場合、例えば、各菌が共通に保持しているｒＲＮＡのうち、１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中、個々の菌に特徴的な部分塩基配列が、その同定に利用可能である。具体的には、採取された各起炎菌のゲノム中に含まれる１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を鋳型として、これら起炎菌に共通な塩基配列を有するＰＣＲプライマーを利用し、ＰＣＲ増幅を行うことにより、該１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ試料を調製する。他方、前記ＰＣＲ増幅により調製される、各起炎菌の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子由来二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列を相互比較し、個々の菌株にユニークな塩基配列部分を選択し、個々の菌株特定用のＤＮＡプローブ一種以上を作製する。共通のＰＣＲプライマーを用いて調製される、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ試料について、個々の菌株特定用のＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応を行い、ハイブリッド体形成の有無、その量を検出する。ハイブリッド体形成がなされ、また、その量が所望の水準を超える場合、当該菌株特定用のＤＮＡプローブが有する塩基配列に対して、相補的な部分塩基配列が、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖上に存在していることが確認される。
【００１６】
一般に、分類学上近縁関係にある細菌を対比すると、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列における相同性が高くなり、個々の菌株にユニークな塩基配列部分は、極く限られた位置にしか存在しない場合も少なくない。その結果、ある起炎菌の菌株同定に利用される、ユニークな塩基配列部分は、共通のＰＣＲプライマーを用いて調製される、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ中、検出に利用される一本鎖ＤＮＡの５’末端から遠く離れた位置となることもある。その際、５’末端に蛍光標識が付された一本鎖ＤＮＡを検出に利用する場合、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体形成した際、その蛍光標識に起因する蛍光強度は「弱く」しか、測定できない事態も起こる。すなわち、ハイブリッド体形成の有無、その量の定量性に、大きな制限を与える要因となることもある。
【００１７】
通常、検体中に含まれる核酸を鋳型として、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片を、ＰＣＲ増幅産物として調製して、実際のプローブ・ハイブリダイゼーション用の一次試料として利用されている。この一次試料は、実質的に、ＰＣＲ増幅により調製された、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片のみを含むものとなる。次いで、かかる二本鎖ＤＮＡ断片を解離させて、互いに相補的な、二つの一本鎖ＤＮＡ断片とした上で、予め標識されたプライマーを用いて、ＤＮＡ鎖の伸長反応を行い、核酸を標識する手法を適用して、検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体形成が可能な、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製がなされる。
【００１８】
一方、一次試料中に含有されている、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列に基づき、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）を選択する。その際、仮に、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、前記の手法を応用して作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）と、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すことが可能な、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製手段の開発が望まれている。
【００１９】
本発明は、前記課題を解決するもので、本発明の目的は、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、予めＰＣＲ増幅により調製される一次試料中に存在する、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、前記標識されたプライマーを用いた核酸鎖の伸長反応を応用して作製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）と、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すことが可能な、５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製方法を提供することにある。
【００２０】
加えて、本発明の目的には、前記５’末端に蛍光標識が付された核酸（特に、一本鎖ＤＮＡ断片）の調製方法において、好適に利用される、標識されたプライマー・セットの提供も含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明者らは、前記の課題を解決するため、鋭意、研究、検討を進めた。
【００２２】
検体中に含まれる核酸、例えば、細胞内から採取されるゲノム遺伝子の量自体は、僅かな量であるため、通常、検体中に含まれる核酸（ゲノム遺伝子）を鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を行って、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片を予め調製する。実際のプローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出では、このＰＣＲ反応によって所望の増幅率で増幅されている、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を含有する核酸溶液を、一次試料として利用する。
【００２３】
プローブ・ハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体中において、ハイブリッド体一分子当り、付与される標識物質の量比を制御する上では、ＤＮＡプローブと結合してハイブリッド体を形成する一本鎖ＤＮＡ断片を、予め５’末端に蛍光標識が導入されている標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーに利用して、その３’末端に核酸鎖を伸長して、標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）とすることが必要である。この核酸鎖の伸長反応では、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を解離させ、対応する相補的な一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）を鋳型として、標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に目的の塩基配列を有する核酸鎖の生成を行う。作製される標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ）は、その５’末端には、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチド自体のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）が内在されたものとなる。従って、同じ一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）を鋳型として、核酸鎖の伸長反応を行う際、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチド自体のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）の塩基配列が異なると、得られる標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）の５’末端の塩基配列も当然異なったものとなる。特に、一次試料中に含まれる、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を解離させて得られる、鋳型となる相補的な一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）に対して、標識付きオリゴヌクレオチド自体のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）は、相補的な塩基配列を有するものとする。
【００２４】
さらに、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチドとして、鋳型となる相補的な一本鎖ＤＮＡ断片（相補鎖）に対して、異なる部位（位置）において結合する少なくとも二種以上の互いに相違する塩基配列のＤＮＡ断片（オリゴヌクレオチド）で構成されたものを用いることで、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端を基準として、得られる二種以上の標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）では、その５’末端の位置が互いに相違するものとできることに、本発明者らは想到した。加えて、このように、検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端を基準として、その５’末端の位置が互いに相違するように調製された、二種以上の標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）の混合物を利用すると、仮に、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、前記混合物中に含まれる、標識化された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）複数種の一つは、その５’末端近傍に検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）が存在しているものとできることを見出した。以上の知見に加えて、本発明者らは、該５’末端に蛍光標識が付された核酸（一本鎖ＤＮＡ断片）複数種の一つと、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すことを検証して、本発明を完成させた。
【００２５】
すなわち、本発明にかかる核酸標識方法は、
プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に供する、標識化された核酸を調製する手段であって、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
前記伸長反応のプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを構成する前記相補的な塩基配列が相違する、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを用い、
該プライマー・セット中に含まれる、一つの標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長に利用される、一本鎖の鋳型核酸に対して、
該プライマー・セット中に含まれる、他の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記一本鎖の鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する他のオリゴヌクレオチドで構成されている
ことを特徴とする核酸標識方法である。
【発明の効果】
【００２６】
本発明においては、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブ、例えば、ＤＮＡマイクロアレイを使用する核酸検出の際、仮に、検出用ＤＮＡプローブの結合部位（位置）として、該検出対象の遺伝子に相当するＤＮＡ断片の５’末端から遠く離れた位置を選択した場合であっても、本発明の核酸標識方法を利用することで調製される、５’末端に蛍光標識が付された核酸（一本鎖ＤＮＡ）複数種の一つと、固相上に固定化された検出用ＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーション反応により形成されるハイブリッド体において、前記蛍光標識に起因する蛍光は、十分な蛍光強度を示すものとなり、検出感度、ならびに精度の向上が得られるという利点がある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明では、上述する核酸標識方法の発明、すなわち、
プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に供する、標識化された核酸を調製する手段であって、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
前記伸長反応のプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを構成する前記相補的な塩基配列が相違する、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを用い、
該プライマー・セット中に含まれる、一つの標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長に利用される、一本鎖の鋳型核酸に対して、
該プライマー・セット中に含まれる、他の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記一本鎖の鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する他のオリゴヌクレオチドで構成されている
ことを特徴とする核酸標識方法における、好ましい態様の一例として、下記の態様を挙げることができる。
【００２８】
具体的には、本発明にかかる核酸標識方法では、
前記伸長反応として、非対称ＰＣＲ反応を利用することができる。あるいは、前記伸長反応として、ＰＣＲ反応を利用することもできる。
【００２９】
一方、前記標識付きオリゴヌクレオチドは、
蛍光物質およびビオチンからなる群から選択される一つ以上の標識を用いて、該オリゴヌクレオチドに標識が付されていることが好ましい。
【００３０】
その際、本発明にかかる核酸標識方法において、
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出は、
固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用していることが望ましい。特に、前記固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブは、
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態であることがより好ましい。
【００３１】
なお、前記鋳型核酸として、
検体中に含まれる核酸からＰＣＲ産物として調製される一本鎖核酸を利用する形態を選択することが望ましい。
【００３２】
本発明にかかる核酸標識方法は、
前記検出対象の核酸は、細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である形態において、より好適に利用される。
【００３３】
加えて、本発明は、上述する本発明にかかる核酸標識方法を利用することで作製が可能となる、標識化された核酸の発明をも提供し、
すなわち、本発明にかかる標識化された核酸は、
上述する構成のいずれかを選択する本発明にかかる核酸標識方法により調製される、標識化された核酸である。
【００３４】
さらには、本発明は、上述する本発明にかかる核酸標識方法に利用されるプライマー・セットの発明も同時に提供しており、
すなわち、本発明にかかるプライマー・セットは、
上述する構成のいずれかを選択する本発明にかかる核酸標識方法において利用可能な、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットである。
【００３５】
例えば、本発明にかかるプライマー・セットは、
前記鋳型核酸の塩基配列に基づき、
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に用いるプローブＤＮＡの塩基配列が選択されている、該鋳型核酸の塩基配列上のプローブ対応部位と、
前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有する、該鋳型核酸の塩基配列上のプライマーに相補的部位の少なくとも二種について、
前記プローブ対応部位を基準点とし、前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の存在位置までの塩基数により、該プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置を定義する際、
前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置が互いに異なるように、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列が選択されている
ことを特徴とするプライマー・セットとすることが好ましい。
【００３６】
その具体例として、
該プライマー・セットに含まれる、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドとして、
下記配列１〜配列９：
配列１； 5' actgctgcctcccgtaggagtctgg 3'
配列２； 5' cgtattaccgcggctgctggcacg 3'
配列３； 5' gcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg 3'
配列４； 5' tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg 3'
配列５； 5' ggtaaggttcttcgcgttgc 3'
配列６； 5' ttgacgtcatccccaccttcctcc 3'
配列７； 5' ccattgtagcacgtgtgtagccc 3'
配列８； 5' tggtgtgacgggcggtgtgtacaag 3'
配列９； 5' taccttgttacgacttcacccca 3'
からなる群から選択される、少なくとも二種以上の塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを含んでいる
ことを特徴とするプライマー・セットを好適な例として示すことができる。
【００３７】
以下に、本発明に関して、より詳しく説明する。
【００３８】
まず、本発明にかかる核酸標識方法の適用対象である、標識化された核酸は、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に際し、検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成可能な、一本鎖核酸部分を有する核酸分子に対して、検出に利用される標識を付したものである。
【００３９】
この検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成可能な一本鎖核酸部分は、検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を鋳型核酸として利用し、該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することにより作製される。この核酸鎖の伸長反応において、プライマーとして用いる標識付きオリゴヌクレオチドは、最終的に作製される一本鎖核酸部分の５’末端となるため、標識付きオリゴヌクレオチド中に含まれる標識は、標識化された核酸において、その５’末端に付与されたものとなる。
【００４０】
本発明において、検体中に含まれる核酸として、例えば、細菌由来の核酸分子が利用できる。換言するならば、例えば、かかる細菌由来の核酸分子の起源となる細菌を含む試料から、検出対象とする細菌由来の核酸分子を抽出する処理などを施し、検体とする。なお、かかる細菌由来の核酸分子の起源となる細菌を含む試料の例として、ヒト、家畜等の動物由来の血液、喀痰、胃液、膣分泌物、口腔内粘液等の体液、尿や糞便のような排出物などの生物由来の試料、あるいは、食中毒、汚染の対象となる食品、飲料水及び温泉水のような環境中の水等、当該細菌による汚染を受けている可能性を有する媒体が挙げられる。また、輸出入時における検疫において、細菌による感染が確認された動植物から採取された組織試料も、その対象に含まれる。通常、かかる細菌由来の核酸分子の起源となる細菌を含む試料は、該細菌を、生菌あるいは死滅菌体の状態で含んでいるため、その細胞内に存在する細菌由来の核酸分子に対する抽出処理等を施し、不要な固形成分を除去した後、核酸分子を可溶性画分中に分離・採取して、核酸を含む検体とする。
【００４１】
その際、検体中に含まれる核酸分子は、ＲＮＡ分子、ＤＮＡ分子のいずれでもよい。なお、対象とする核酸分子がＲＮＡ分子である場合、一旦、このＲＮＡ分子を鋳型として、逆転写酵素反応を利用して、その塩基配列と相補的なＤＮＡ分子、すなわち、ｃＤＮＡ分子を調製する。例えば、一旦、検体中に含まれる核酸分子中から、全ＲＮＡを分離した後、対応するｃＤＮＡ・ライブラリーを構築する。構築されたｃＤＮＡ・ライブラリー中に含まれる、検出対象のＲＮＡ分子に由来するｃＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応によって、所望の塩基配列領域（標的領域）を含むＤＮＡ断片を調製し、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用することが好ましい。
【００４２】
一方、対象とする核酸分子がＤＮＡ分子である場合、例えば、制限酵素による酵素消化を利用して、所望の塩基配列領域（標的領域）を含むＤＮＡ断片を調製し、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用することもできる。例えば、ＤＮＡゲノムが、一細胞当たり、極僅かな量しか存在していないため、予め、ＤＮＡゲノムを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応によって、所望の塩基配列領域（標的領域）を含むＤＮＡ断片を調製し、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用することが好ましい。
【００４３】
検体中に含まれる核酸分子に基づき、上記ＰＣＲ反応によって所望の増幅率で増幅されている、検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片を含有する核酸溶液を一次試料として利用する際には、該検出対象の遺伝子に相当する二本鎖ＤＮＡ断片に加熱処理を施し、解離した一本鎖ＤＮＡ断片を、「検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸」として利用する。この一本鎖ＤＮＡ断片の塩基配列は、上記ＰＣＲ反応に利用されるＰＣＲプライマーの塩基配列によって、その５’末端と３’末端とが決定され、また、その配列長も決定されている。この全塩基配列が判明している一本鎖ＤＮＡ断片を鋳型核酸として利用し、該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することにより作製される。
【００４４】
本発明にかかる核酸標識方法では、伸長反応のプライマーとして、標識付きオリゴヌクレオチドを少なくとも二種以上利用する。この標識付きオリゴヌクレオチド二種はいずれも、前記全塩基配列が判明している一本鎖ＤＮＡ断片を鋳型核酸として、そのオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長が可能なものとされる。該オリゴヌクレオチド、ならびに、その３’末端に伸長される核酸鎖は、ＲＮＡ鎖、ＤＮＡ鎖のいずれを用いることも可能であるが、通常、ＤＮＡポリメラーゼを利用する伸長反応の適用が可能なＤＮＡ鎖を利用することが好ましい。
【００４５】
前記標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも二種以上は、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、いずれも、鋳型核酸として用いる一本鎖核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列とされる。加えて、該標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも二種以上は、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列は、相互で相違したものとなるように選択する。本発明にかかるプライマー・セットは、前述のオリゴヌクレオチドの塩基配列が相互に相違している、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー混合物である。該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの含有量比率は、それら標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして、核酸鎖の伸長を行うことで作製される、標識化された核酸複数種の収量が、実質的に等しくなるように選択することが好ましい。
【００４６】
すなわち、原理的には、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の選択に応じて、鋳型核酸として用いる一本鎖核酸とのハイブリダイズ効率、ならびに、その３’末端への核酸鎖の伸長が完了するに要する反応時間に相違が生じる。通常、一本鎖核酸を鋳型核酸として、プライマーを用いた核酸鎖の伸長反応は、一本鎖核酸に対して、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）工程、プライマーの３’末端へ核酸鎖の伸長を行う核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程、作製された、５’末端にプライマーを含む一本鎖核酸と鋳型の一本鎖核酸とを分離する変性処理（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程で構成される。プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチドと鋳型核酸である一本鎖核酸とのハイブリッド体の融解温度（ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ；Ｔｍ）は、前記核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程の温度よりも、有意に高く、変性処理（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）工程の温度よりも、有意に低くなるように、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択する。その際、該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドにおいて、その融解温度Ｔｍは、４５℃〜８０℃の範囲内とし、また、それらの融解温度Ｔｍ間の差違は、１０℃以内、好ましくは、５℃以内となるように、各標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することが望ましい。一般に、各標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の塩基長は、少なくとも、１５塩基〜４０塩基の範囲内に選択することが望ましい。標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の塩基長を、１５塩基未満、例えば、１３塩基に選択しても、塩基配列の種類によっては、融解温度Ｔｍを前述の温度範囲内とすることも可能ではある。一方、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列の塩基長を、４０塩基を超える、例えば、４５塩基に選択した際にも、塩基配列の種類によっては、融解温度Ｔｍを前述の温度範囲内とすることも可能ではある。但し、塩基配列の塩基長が４０塩基を超えて、長くなるとともに、目標とする一本鎖核酸中に存在している、前記相補的な塩基配列部分のみでなく、この相補的な塩基配列部分と類似する塩基配列を有する、他の一本鎖核酸に対する、ミスフィット・ハイブリダイゼーションを起こす確率が増すことになる。すなわち、目標とする一本鎖核酸以外に、他の一本鎖核酸を鋳型核酸として、該ミスフィット・ハイブリダイゼーションを起こした標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端へ核酸鎖の伸長反応が起こる確率が増すことになり、本発明の目的には適合しないものとなる。
【００４７】
該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドにおいて、その融解温度Ｔｍを考慮した上で、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの含有量比率を適宜選択することが望ましい。なお、融解温度Ｔｍ間の差違が、上記の好適な範囲内である場合、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの含有量比率は、融解温度Ｔｍが最も高いものと、Ｔｍが最も低いものとの間の含有量比が、１：１〜１：０．１の範囲内となるように、適宜設定することが望ましい。
【００４８】
鋳型核酸を基に、フォワード・プライマーとリバース・プライマーとを用いたＰＣＲ産物を作製する反応を利用して、標識化を施す場合は、上記の範囲内に選択することにより、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドのいずれに対しても、好適に標識化された核酸複数種の調製がなされる。また、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドと、プローブ設定位置との間の位置関係に関しては、鋳型核酸の塩基配列に依って異なるが、通常のＰＣＲ反応によって、プローブ設定位置を超える核酸鎖の伸長が問題なく行える距離（塩基長）であることが好ましく、少なくとも、両者を隔てる距離は、１００００塩基長以下の範囲内にあることが好ましい。
【００４９】
該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドにおいて、個々の標識付きオリゴヌクレオチドに付される標識物質は、そのオリゴヌクレオチド一分子当たり、一定量となるように付す。例えば、そのオリゴヌクレオチド一分子当たり、標識物質が一分子付されている形態は、一般に、より好ましい形態である。
【００５０】
また、個々の標識付きオリゴヌクレオチドに付される標識物質は、そのオリゴヌクレオチドによる、鋳型核酸に用いる一本鎖核酸とのハイブリダイゼーションを阻害しない部位に導入することが望ましい。同時に、鋳型核酸に用いる一本鎖核酸とのハイブリダイゼーション後、該オリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖伸長反応を行う際、利用されるＤＮＡポリメラーゼなどの核酸鎖合成酵素の結合、ならびに、その核酸鎖伸長反応を阻害しない部位に導入することが望ましい。従って、個々の標識付きオリゴヌクレオチドに付される標識物質は、そのオリゴヌクレオチドの５’末端に導入する形態が、一般に、より好ましい形態となる。具体的には、そのオリゴヌクレオチドを予め合成した後、その５’末端に共有的に結合させることで、当量的に導入可能な標識物質を利用することがより好ましい。
【００５１】
この５’末端に共有的に結合させることで、当量的に導入可能な標識物質の例として、蛍光標識として利用される各種蛍光物質、あるいは、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。ビオチンは、各種ビオチン結合型の標識酵素タンパク質を反応させ、かかる標識酵素タンパク質の酵素活性を指標として、検出を可能とする。ジゴキシゲニンも、各種のジゴキシゲニン結合型の標識酵素タンパク質を反応させ、かかる標識酵素タンパク質の酵素活性を指標として、検出を可能とする。蛍光標識として利用される各種蛍光物質は、かかる蛍光物質に由来する蛍光強度を観測する光学的検出手段を利用することで、高感度の検出を可能とする。また、前記標識酵素タンパク質の酵素活性を指標とする検出法も、酵素活性は、各種発色反応を利用するものとすることで、光学的検出手段の利用が可能であり、高感度の検出を可能とする。
【００５２】
特に、固相上に固定化されたＤＮＡプローブとして、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態を利用する際には、単位面積当たり、高い密度でＤＮＡプローブが存在する状態となる。従って、標識化された核酸とＤＮＡプローブとのハイブリッド体も、単位面積当たり、高い密度で存在する状態で標識を利用した、再現性のよい検出が必要とされる。その場合、標識酵素タンパク質の酵素活性を指標とする検出は、この酵素反応に利用される基質物質の供給にバラツキを生じないように注意が必要となる。それに対して、蛍光標識として利用される各種蛍光物質を利用する際には、励起光強度の均一化は、基質物質供給の均一化と比較すると、格段に容易に達成できる。この観点から、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態を利用する際には、蛍光標識の使用は、より好適な形態となる。かかる蛍光標識に利用可能な蛍光色素としては、従来公知の蛍光色素をいずれも使用することができる。なかでも、量子収率、耐光性、耐ガス性、化学的安定性、さらには、ＤＮＡポリメラーゼの基質としての特性の観点から、ＦＩＴＣ、ＦＡＭ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＴＡＭＲＡ、Ｄａｂｃｙｌ、ＲＯＸ、ＴＥＴ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＨＥＸ、Ｃｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎなどは、本発明においても、好適に利用することができる。
【００５３】
該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドに対して、標識付きオリゴヌクレオチドの種類ごとに、異なる種類の標識物質を用いて、標識することも可能であるが、検出の簡便さを考慮すると、同じ種類の標識物質を用いて標識することが好ましい。すなわち、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを利用して、同一の一本鎖核酸を鋳型核酸として、標識化された核酸の複数種が作製されるが、プローブ・ハイブリダイゼーションにおいて、特定の塩基配列を有するＤＮＡプローブに対して、この標識化された核酸の複数種中の一種以上がハイブリッド体を形成する可能性がある。例えば、特定の塩基配列を有するＤＮＡプローブに対して、標識化された核酸二種がハイブリッド体を形成している場合、この標識化された核酸二種に使用されている標識物質が異なると、個々の標識物質の検出を行った上で、その結果を合算する作業が必要となる。一方、この標識化された核酸二種に使用されている標識物質が同一であると、一度に、標識物質の検出と、その結果の合算がなされるので、検出操作は簡便なものとなる。
【００５４】
本発明にかかる核酸標識方法では、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを利用することにより、同一の一本鎖核酸を鋳型核酸として、各標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖伸長反応を行う結果、標識化された核酸の複数種を含む混合物が作製される。この核酸鎖伸長反応では、該プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの相当量は消費されるが、反応終了時、かかる反応液中には、消費されなかった、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが相当量残余している。この混合物中に残留している、複数種の標識付きオリゴヌクレオチド自体が、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイ上に固定されているＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成する、目的とする標識化された核酸の検出に際して、検出精度、定量性を阻害する要因となる。従って、プローブ・ハイブリダイゼーション反応に供する前に、混合物中に残留している、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを除去し、目的とする標識化された核酸の精製を行うことが好ましい。
【００５５】
一方、検出用のＤＮＡプローブは、目的とする標識化された核酸とハイブリッド体形成は可能であるが、標識付きオリゴヌクレオチドとは、実質的にハイブリッド体形成が困難となるように、検出用ＤＮＡプローブの塩基配列と、標識付きオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部の塩基配列とを選択することがより好ましい。本発明の目的では、検出用ＤＮＡプローブの塩基配列は、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から、この検出対象である核酸に特異的な部分塩基配列が予め選択されている。本発明にかかる核酸標識方法により作製される、標識化された核酸の複数種の少なくとも一つは、前記検出用ＤＮＡプローブとハイブリッド体を形成する。その際、検出用ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションする部位が、かかる標識化された核酸中、プライマーとして利用する標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に伸長される核酸鎖に位置すると、原理的に、標識付きオリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド部と検出用ＤＮＡプローブとのハイブリッド体形成は回避されるため、好ましい形態である。すなわち、本発明にかかる核酸標識方法において使用されるプライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から予め選択される、該ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を基準として、その３’末端側に位置する部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有することが好ましい。
【００５６】
特に、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中、該ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を基準として、その３’末端側に位置する前記部分塩基配列までの間隔（塩基長）が、３０００塩基長以内、より好ましくは１０００塩基長以内となるように、該標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することがより好ましい。換言すると、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することで調製される標識化された核酸に対して、その５’末端から該ＤＮＡプローブがハイブリダイゼーションする位置までの距離（塩基長）は、１０００塩基長以内となるため、例えば、５’末端に蛍光標識が付された核酸に対して、固相上に固定化されたＤＮＡプローブの結合部位は、その５’末端の近傍に設定された状態が達成され、経験的に、その５’末端の蛍光標識に起因する蛍光は高い強度で測定される状態となる。
【００５７】
検出対象の核酸を複数種の検出用ＤＮＡプローブを利用して検出する際には、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から、該複数種のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列が予め選択される。その際、各ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列に対して、プライマー・セットに含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドのいずれも、ハイブリッド体形成が困難であり、同時に、各ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を基準として、その３’末端側、３００塩基長以内の範囲に選択される部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドが少なくとも一つ存在するように、該標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することがより好ましい。
【００５８】
具体的には、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中、その３’末端側から、各ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を並べた際、最も３’末端側に位置する第一のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列について、それよりさらに３’末端側、３００塩基長以内の範囲に選択される部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する、第一の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択する。次いで、前記第一のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列に次いで、その５’末端側に位置する第二のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列について、それよりさらに３’末端側、３００塩基長以内の範囲であり、同時に、前記第一のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列よりも５’末端側に選択される部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する、第二の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択する。以後、隣接して位置する、二つのＤＮＡプローブ用の部分塩基配列の間に挟まれた領域に選択される、部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する、標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を逐次選択する。その結果、検出対象の核酸を複数種の検出用ＤＮＡプローブを利用して検出する際には、該複数種のＤＮＡプローブの種類数と同じ数の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列を選択することができる。本発明にかかる核酸標識方法により作製される、標識化された核酸の複数種は、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用して、作製することがより好ましい。
【００５９】
該複数種のＤＮＡプローブに対して、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用する場合にも、検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として、各標識化された核酸は、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長することで調製される。その際、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、少なくとも、前記鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えることが必要である。すなわち、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えることは必要ではあるが、必ずしも、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の５’末端に達するまで、核酸鎖の伸長を行う必要はない。
【００６０】
従って、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用する場合、本発明にかかる核酸標識方法では、プライマーの３’末端へ核酸鎖の伸長を行う核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程における反応条件は、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の５’末端に達するまで、核酸鎖の伸長を行うに必要な反応時間よりも、有意に短く選択することが可能である。例えば、該核酸鎖合成（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）工程において伸長可能な核酸鎖の塩基数は、３００〜３０００塩基の範囲、場合に依っては、３００〜１０００塩基の範囲となる反応条件を選択することが可能である。
【００６１】
加えて、前述する選択手順に従って、その塩基配列が選択された、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを利用する場合、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸に対して、プライマーをハイブリダイズさせるアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）工程で、該一本鎖核酸上に複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが同時にハイブリダイズする形態を採ることもできる。その際、各標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、その５’末端側に他の標識付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているため、原理的に、他の標識付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしている部位を超えて進行できない形態となる。その場合でも、該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、少なくとも、前記鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えるという要件を満たしており、全く問題はない。
【００６２】
さらには、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上に、プライマー・セット中に含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが全てハイブリダイズする状況を達成すると、各標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長は、少なくとも、前記鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、該標識付きオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション部位の５’末端側に位置する、前記ＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を超えるが、その直後にハイブリダイズしている、次の標識付きオリゴヌクレオチドの直前で停止する形態となる。この形態で作製される、標識化された核酸の複数種は、それぞれ、５’末端に標識付きオリゴヌクレオチドを内在し、その３’末端へ伸長されている核酸鎖は、前記ＤＮＡプローブ一種のみがハイブリッド体形成が可能な、高い特異性を示す形状となる。同時に、かかる標識化された核酸は、前記ＤＮＡプローブ一種のみと選択的にハイブリッド体形成する際、例えば、５’末端に蛍光標識が付された核酸に対して、固相上に固定化されたＤＮＡプローブの結合部位は、その５’末端の近傍に設定された状態が達成され、経験的に、その５’末端の蛍光標識に起因する蛍光は高い強度で測定される状態ともなっている。すなわち、本発明の目的に鑑みると、最も好適な形態の一つとなる。
【００６３】
本発明にかかる核酸標識方法では、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長反応では、必ずしも、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の５’末端に達するまで、核酸鎖の伸長を行う必要はないため、この伸長反応を非対称ＰＣＲ反応の形態で実施することができる。
【００６４】
さらには、上述する鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上に、プライマー・セット中に含まれる、前記複数種の標識付きオリゴヌクレオチドが全てハイブリダイズする状況を利用して、３’末端への核酸鎖の伸長を停止させる形態に代えて、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸上、次の標識付きオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする部位の直前に存在する部分塩基配列に相当する、ファワード・プライマーを利用し、該標識付きオリゴヌクレオチドをリバース・プライマーとするＰＣＲ反応を行うことも可能である。
【００６５】
本発明にかかる核酸標識方法は、上で説明したように、検出対象の核酸を複数種の検出用ＤＮＡプローブを利用して検出する際、鋳型核酸として利用される一本鎖核酸の塩基配列中から、該複数種のＤＮＡプローブ用の部分塩基配列を予め選択し、これら複数種のＤＮＡプローブを用いて、前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出は、固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用している形態に特に適するものである。特に、前記固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブは、ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態である際、本発明にかかる核酸標識方法の利点は、より顕著なものとなる。
【００６６】
以下に、本発明について、より具体的な例を示して、その好適な実施形態について、さらに詳しく説明する。
【００６７】
具体的には、感染症を引き起こす複数の起炎菌を同定する場合に、本発明を応用した例ついて説明する。
【００６８】
細菌の種類を同定する目的では、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出の対象として、各細菌に由来する特定のｒＲＮＡ遺伝子、特に１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を使用することが可能である。特に、感染症の引き起こす複数種の起炎菌に関しては、その細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列は解明されており、各起炎菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列の相互比較により、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内から、個々の起炎菌にユニークな塩基配列を選択して、プローブとして使用できる。
【００６９】
感染症を罹患している、特定の患者から採取された試料中に存在している起炎菌の種類を特定することは、当該患者に対する治療を進める際、不可欠な過程である。但し、この核酸検出過程では、患者から採取された試料中に存在している起炎菌の種類は、判明していないため、先ず、試料中に存在している細菌から、ゲノム遺伝子を抽出分離し、ゲノム遺伝子を含む原サンプルとする。この原サンプル中に含有される、細菌由来のゲノム遺伝子量は、多くの場合、そのまま、一定水準以上の検出精度が要求される、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に利用可能な量には、遥かに達しない量である。
【００７０】
現実問題としても、感染症を引き起こしている、起炎菌の候補は複数挙げられる場合が少なくない。これら複数種の起炎菌候補のうち、患者から採取された試料中に存在している起炎菌を特定する際には、複数種の起炎菌候補由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内から、個々の起炎菌にユニークな塩基配列を選択した、検出プローブ複数種について、プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用して、陽性・陰性の判定を行う必要がある。そのため、この原サンプル中に含有される、細菌由来のゲノム遺伝子を鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を利用して、細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ産物として調製する。その際、存在する細菌の種類は不明であるので、複数種の起炎菌候補において、その細菌の種属を問わず、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中に見出される共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）をＰＣＲプライマーとしたユニバーサルＰＣＲ法を利用することが必要となる。
【００７１】
複数種の起炎菌候補を対象として、ユニバーサルＰＣＲ法を利用して、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を含むＤＮＡ断片をＰＣＲ産物として調製する際、ＰＣＲプライマーとして利用可能な共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）としては、下記のものが挙げられる。すなわち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉｓａ ｃｏｌｉ 由来の１６ｓ ｒＲＮＡの塩基配列中、その５’→３’方向で、９−２７、１０５−１２３、３３９−３５７、５１５−５３１、６８６−７０４、７８５−８０５、９０７−９２６、１０９９−１１１４、１２２４−１２４１、１３９１−１４０６、１４９５−１５１０、１５２５−１５４１に位置する塩基配列は、複数種の起炎菌において、共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）となっている。実際のユニバーサルＰＣＲ用プライマーの設計は、これら共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列を含み、さらに、必要に応じて、その前後１０塩基程度の範囲内塩基配列をも参照して、複数種の起炎菌候補の何れにおいても、一定水準以上の増幅が可能なミックス・プライマーを設計することが望ましい。
【００７２】
設計されるプライマーの塩基長にもよるが、前記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列を含むプライマーの全塩基配列に対して、鋳型となる１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の対応塩基配列部分が、１〜１０塩基の範囲でミスマッチを含んでいる配列であっても、ＰＣＲプライマーとして機能する場合も少なくない。従って、一種類のプライマーを用いることも可能ではあるが、ミスマッチのバリエーションを考慮して、複数種のプライマーを含むミックス・プライマーを用いることで、複数種の起炎菌候補全体において、一定水準以上の増幅効率を維持することが好ましい。さらには、前記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列以外であっても、対象とする複数種の起炎菌候補について、ミックス・プライマー中に含まれる総数が５０以内のバリエーションでカバー可能であれば、配列の共通性がやや劣る領域に相当するプライマーを利用することも可能である。但し、ミックス・プライマー中に含まれる総数が５０を超えると、反応液中に添加するプライマー総量が過多となる、あるいは、プライマー総量を制限すると、個々のプライマー量が少なくなる結果、相対的に増幅効率の低下を引き起こす要因となる。また、ミックス・プライマー中に含まれる総数が５０を超えると、反応液中に添加するプライマー総量に対して、実際の増幅に利用される比率は低くなるため、コスト・パフォーマンスの点でも、好ましいものではない。
【００７３】
本発明においては、一本鎖核酸を鋳型核酸に用いて、プライマーとする複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端への核酸鎖の伸長反応を行うが、複数種の起炎菌候補から、試料中に存在している起炎菌の種類を特定する際には、前記ユニバーサルＰＣＲを利用して、予め一定水準まで増幅された１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を含むＤＮＡ断片を鋳型核酸に用いることが好ましい。特に、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドとして、５’末端に標識が導入されているオリゴヌクレオチドを利用する場合、その３’末端への核酸鎖伸長反応では、非対称ＰＣＲ、あるいは、通常のＰＣＲのいずれを利用することも可能である。
【００７４】
一方、その際利用する、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドも、複数種起炎菌候補のいずれに対しても、ユニバーサルＰＣＲにより増幅された１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の一部または全長を鋳型核酸として、核酸鎖の伸長反応が可能な、上記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列を含むプライマー配列を選択することが望ましい。すなわち、ユニバーサルＰＣＲに利用した、共通性の高いプライマー配列に対して、その３’末端側（下流）に位置する共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列に基づき設計された、プライマー用オリゴヌクレオチド複数種の５’末端に標識が導入したものが好適に利用される。
【００７５】
検出用プローブは、前記共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に挟まれる領域に、ハイブリダイズするように選択されているため、プライマー用オリゴヌクレオチド複数種の塩基配列自体と、検出用プローブとは、直接ハイブリダイズする懸念はない。一方、プライマー用オリゴヌクレオチド複数種のいずれか一つでは、そのオリゴヌクレオチドの塩基配列に近接して、その３’末端側（下流）に検出用プローブがハイブリダイズすることが可能となる。それに付随して、５’末端に蛍光標識が導入されている核酸に対して、固相上に固定化されている検出用プローブが、その５’末端から遠い位置においてハイブリダイズするように設計されている際に見出される、ハイブリッド体から観測される蛍光強度が低いという問題が回避される。
【００７６】
例えば、複数種起炎菌候補において、１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子中の共通性の高い領域（ｃｏｎｓｅｒｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の塩基配列に対応するように設計される、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドの一例として、
下記配列１〜配列９：
配列１； 5' actgctgcctcccgtaggagtctgg 3'
配列２； 5' cgtattaccgcggctgctggcacg 3'
配列３； 5' gcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg 3'
配列４； 5' tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg 3'
配列５； 5' ggtaaggttcttcgcgttgc 3'
配列６； 5' ttgacgtcatccccaccttcctcc 3'
配列７； 5' ccattgtagcacgtgtgtagccc 3'
配列８； 5' tggtgtgacgggcggtgtgtacaag 3'
配列９； 5' taccttgttacgacttcacccca 3'
を挙げることができる。すなわち、該プライマー・セットに含まれる、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドとして、前記配列１〜配列９からなる群から選択される、少なくとも二種以上の塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなる、プライマー・セットを利用することが望ましい。
【００７７】
一本鎖核酸を鋳型核酸として用い、この鋳型核酸にハイブリダイズさせた標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして、その３’末端への核酸鎖伸長反応を行った場合、プライマーの３’末端への核酸鎖伸長反応は、核酸鎖合成酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が基質のＮＴＰｓを取り込む素過程に依存する結果、一定の反応時間中に伸長される核酸鎖の鎖長はポワソン分布型の分布を示す。すなわち、ある鎖長において、確率極大を示し、それより伸長される核酸鎖鎖長が短い産物を相当量含んでいる。例えば、プライマーのハイブリダイズ部位から鋳型核酸の５’末端までの距離（塩基長）が長い場合、一定の短い反応時間中に、プライマーの３’末端へ伸長される核酸鎖の大半は、鋳型核酸の途中までは到達できるが、５’末端まで到達するものは、極く僅かしかない状態となる。その際、検出用プローブが、鋳型核酸に用いている一本鎖核酸の塩基配列中、プライマーのハイブリダイズ部位の僅かに５’末端側に選択されている場合、前記プライマーの３’末端への核酸鎖伸長がなされた産物のほとんど全ては、該検出用プローブとハイブリッド体形成が可能である。一方、検出用プローブが、鋳型核酸に用いている一本鎖核酸の塩基配列中、その５’末端の近傍に選択されている場合、前記プライマーの３’末端への核酸鎖伸長がなされた産物の極く僅かが、該検出用プローブとハイブリッド体形成が可能である。すなわち、一定の短い反応時間中に、プライマーの３’末端へ伸長される核酸鎖の平均鎖長と比較し、プライマーのハイブリダイズ部位から鋳型核酸の５’末端までの距離（塩基長）が有意に長い場合、検出用プローブの選択位置によって、ハイブリッド体形成が可能な産物の含有比率が大きく異なる。
【００７８】
一方、標識付きオリゴヌクレオチド複数種を利用することにより、一定の短い反応時間中に、プライマーの３’末端へ伸長される核酸鎖の平均鎖長と比較し、鋳型核酸に用いる一本鎖核酸の核酸長が有意に長い場合であっても、一本鎖核酸の５’末端からさほど離れていない部位にハイブリダイズする、標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端へ伸長される核酸鎖は、大半が５’末端まで到達可能である。従って、標識付きオリゴヌクレオチド複数種を利用することにより得られる、標識化された核酸複数種においては、検出用プローブの選択位置に依らず、ハイブリッド体形成が可能な産物の含有比率に有意な差違は無い状態とできる。
【００７９】
この検出用プローブの選択位置に依らず、ハイブリッド体形成が可能な産物の含有比率を平均化する作用と、標識付きオリゴヌクレオチド複数種の何れかにおいて、その３’末端側の近い部位に検出用プローブがハイブリダイズする効果とのが相俟って、検出用プローブの選択位置に影響されず、高い検出感度を達成することが可能となる。
【実施例】
【００８０】
以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、以下に述べる実施例は、本発明にかかる最良の実施形態の一例ではあるが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に示す態様に限定されるものではない。
【００８１】
（実施例１）
＜プローブＤＮＡの作製＞
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌由来の核酸分子の選択的検出用プローブとして、表１に示す塩基配列を有するプローブＤＮＡを設計した。
【００８２】
具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ菌の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム領域の塩基配列に基づき、表１に示す８種のプローブの塩基配列を選択した。これらのプローブの塩基配列は、当該菌に対して、非常に特異性が高く、十分なハイブリダイゼーション感度が期待できるように選択されている。同時に、それぞれのプローブの塩基配列相互において、ハイブリダイゼーション感度を比較した際、感度のバラツキのないことが期待できるように設計されている。
【００８３】
【表１】
【００８４】
表１中に示す各プローブに対して、ＤＮＡ鎖の合成後、ＤＮＡマイクロアレイに固定するための官能基として、核酸の５’末端にチオール基を定法に従って導入した。官能基の導入後、精製し、凍結乾燥した。凍結乾燥した内部標準用プローブは、−３０℃の冷凍庫内に保存した。
【００８５】
同様な設計手法により、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ菌由来の核酸分子の選択的検出用プローブとして、表２に示す塩基配列を有するプローブＤＮＡを設計した。
【００８６】
【表２】
【００８７】
＜検体中の核酸鎖増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒの調製＞
起炎菌の検出に利用される、該起炎菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子（標的遺伝子）増幅用ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒとして、表３に示す核酸配列を有するＤＮＡプライマーを設計した。
【００８８】
具体的には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標準株（ＡＴＣＣ １０１４５）由来の１６ｓ ｒＲＮＡをコーディングしているゲノム部分を特異的に増幅するプローブ・セット、つまり、約１５００塩基長の１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域の両端部分の塩基配列に基づき、それに相補的な塩基配列を有し、また、当該部分とハイブリダイズさせた際、その融解温度がほぼ揃った複数種のプライマーを設計した。設計された複数種類のプライマーは、互いに、部分的な塩基配列の相違を有するが、この混合プライマーを利用することで、変異株や、ゲノム上に複数存在する１６ｓ ｒＲＮＡコーディング領域も同時に増幅できるように設計されている。
【００８９】
【表３】
【００９０】
表３中に示す各Ｐｒｉｍｅｒは、ＤＮＡ鎖の合成後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により精製する。このＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ３種、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を混合し、各Ｐｒｉｍｅｒ濃度が、最終濃度１０ ｐｍｏｌ／μｌとなるようにＴＥ緩衝液に溶解した。
【００９１】
＜Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＤＮＡ（モデル検体）の抽出＞
［微生物の培養とゲノムＤＮＡ抽出の前処理］
まず、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ標準株（ＡＴＣＣ １０１４５）を、定法に従って培養した。
【００９２】
この微生物培養液１．０ｍｌ（ＯＤ600＝０．７）を、１．５ｍｌ容量のマイクロチューブに採取し、遠心分離（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）により菌体を分離した。上清を捨てた後、Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ：ｐＨ ８．０、２５ｍＭ ＥＤＴＡ）３００μｌを加え、ミキサーを用いて、菌体を再縣濁した。再縣濁した菌体液から、再度、遠心分離（８５００ｒｐｍ、５ｍｉｎ、４℃）により菌体を分離した。上清を捨てた後、回収された菌体に、下記二種の酵素溶液各５０μｌを加え、ミキサーを用いて再縣濁した。
【００９３】
溶菌処理用酵素溶液
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ ５０ μｌ（酵素濃度：２０ ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）
Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｉｄａｓｅ ＳＧ ５０ μｌ（酵素濃度：０．２ ｍｇ／ｍｌ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ）
次に、酵素を含む緩衝液中に再縣濁した菌体液を、３７℃のインキュベーター内で３０分間静置し、該微生物の細胞膜の溶解処理を行った。
（Ｇｅｎｏｍｅ抽出・精製）
細胞膜の溶解処理後、該微生物由来のＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡ抽出・精製は、核酸精製キット（ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｇｅｎｏｍｅ−：ＴＯＹＯＢＯ社製）を用いて、下記の手順に従って行った。
【００９４】
（ステップ１）
先ず、細胞膜の溶解処理を施した微生物縣濁液に、前記キットの溶解・吸着液７５０μｌと磁性ビーズ液４０μｌとを加え、チューブミキサーを用いて、１０分間激しく攪拌する。この操作により、含有される二本鎖ＤＮＡ分子は、磁性粒子（ビーズ）表面に吸着される。
【００９５】
（ステップ２）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集める。その後、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる。
【００９６】
（ステップ３）
マイクロチューブ内に、洗浄液 ９００ μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁を行う。
【００９７】
（ステップ４）
再び、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集める。その後、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる。
【００９８】
（ステップ５）
前記ステップ３、４の洗浄操作を繰り返して、２度の洗浄を行う。
【００９９】
（ステップ６）
該洗浄液を用いた洗浄後、マイクロチューブ内に７０％エタノール ９００ μｌを加え、ミキサーで５ｓｅｃ程度攪拌して再縣濁する。
【０１００】
（ステップ７）
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブの壁面に集める。その後、スタンドにセットした状態のまま、上清を捨てる。
【０１０１】
（ステップ８）
前記ステップ６、７の洗浄操作を繰り返して、７０％エタノールによる合計２度目の洗浄を行う。
【０１０２】
該７０％エタノールによる２度の洗浄を行った後、マイクロチューブ内に純水 １００ μｌを加え、回収された磁性粒子を含む液をチューブミキサーで１０分間攪拌を行う。この操作により、磁性粒子（ビーズ）表面に吸着されていた二本鎖ＤＮＡ分子は、純水中に再溶出される。
【０１０３】
次に、分離用スタンド（Ｍａｇｉｃａｌ Ｔｒａｐｐｅｒ）にマイクロチューブをセットし、３０秒間静置して磁性粒子をチューブ壁面に集める。最終的に、スタンドにセットした状態のまま、二本鎖ＤＮＡ分子を含む上清を新しいチューブに回収する。
（回収したＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡの検査）
回収された微生物（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＡＴＣＣ １０１４５株）由来の、精製済核酸分子を含む液は、定法に従って、アガロース電気泳動と２６０／２８０ｎｍの吸光度測定を行い、該液中に含まれるＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡについて、その品質（低分子核酸の混入量、分解の程度）と回収量を検定した。
【０１０４】
本実施例では、約１０μｇのＧｅｎｏｍｅ ＤＮＡが回収され、Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡのデグラデーションやｒＲＮＡの混入は認められなかった。
【０１０５】
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞
［１］ガラス基板の洗浄
合成石英製ガラス基板（サイズ：２５ｍｍ（幅）×７５ｍｍ（長さ）×１ｍｍ（厚さ）、飯山特殊ガラス社製）を耐熱、耐アルカリ性のラックに入れ、所定の濃度に調製した超音波洗浄用の洗浄液に浸した。一晩洗浄液中に浸した後、２０分間超音波洗浄を行った。続いて、基板を取り出し、軽く純水で濯いだ（リンス洗浄）後、超純水中で２０分超音波洗浄を行った。次に、８０℃に加熱した１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液中に１０分間基板を浸した。その後、基板を取り出し、純水によるリンス洗浄と、超純水中で超音波洗浄を施した。以上の洗浄操作により、洗浄済みのＤＮＡチップ用石英ガラス基板を用意した。
【０１０６】
［２］表面処理
シランカップリング剤ＫＢＭ−６０３（信越シリコーン社製）を、１％の濃度となるように純水中に加え、室温で２時間攪拌し、均一に溶解した。続いて、前記洗浄済み石英ガラス基板をシランカップリング剤水溶液中に浸し、室温で２０分間放置した。石英ガラス基板を引き上げ、軽く純水で表面をリンス洗浄した後、窒素ガスを基板の両面に吹き付けて乾燥させた。次に、乾燥した基板を１２０℃に加熱したオーブン中で１時間ベークし、前記アミノシランカップリング剤の基板表面への結合処理を完結させた。基板表面には、該アミノシランカップリング剤由来のアミノ基が導入された。
【０１０７】
同仁化学研究所社製のＮ−マレイミドカプロイロキシスクシイミド（Ｎ−（６−Ｍａｌｅｉｍｉｄｏｃａｐｒｏｙｌｏｘｙ）ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｏ；以下、ＥＭＣＳと略す）を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒中に最終濃度が０．３ｍｇ／ｍｌとなるように溶解したＥＭＣＳ溶液を調製した。前記ベーク処理の終了後、石英ガラス基板を室温まで放冷した。次いで、表面にアミノ基が導入された石英ガラス基板を、ＥＭＣＳ溶液中に室温で２時間浸した。この浸漬処理の間に、アミノシランカップリング剤処理によって基板表面に導入されたアミノ基と、ＥＭＣＳのスクシイミド基とが反応し、石英ガラス基板表面にＥＭＣＳ由来のマレイミド基が導入された。ＥＭＣＳ溶液から引き上げた石英ガラス基板を、ジメチルスルホキシドとエタノールの１：１混合溶媒を用いて洗浄し、未反応のＥＭＣＳを除去した。さらに、エタノールにより洗浄した後、窒素ガス雰囲気下で、前記表面処理済み石英ガラス基板を乾燥した。
【０１０８】
［３］プローブＤＮＡ
＜プローブＤＮＡの作製＞で作製した検出用プローブＤＮＡを純水に溶解し、それぞれ、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように、マイクロ・バイアルに分注した後、凍結乾燥を行った。水分を除いたプローブＤＮＡをそれぞれ収納するマイクロ・バイアルは、下記の手順で、バブルジェット方式によるスポッティング用のＤＮＡ溶液の調製に利用した。
【０１０９】
［４］ＢＪプリンターによるＤＮＡ溶液の吐出、および基板表面への固定化
グリセリン７．０ｗｔ％、エチレングリコール５．０ｗｔ％、ヘキサントリオール５．０ｗｔ％、アセチレノールＥＨ（川研ファインケミカル社製）１．０ｗｔ％を含む水溶液を調製した。続いて、先に用意した８種類のプローブＤＮＡ（表１）をそれぞれ収納するマイクロ・バイアル中に、ＤＮＡ濃度が、最終濃度（インク溶解時）１０μＭとなるように、前記混合溶媒を所定量加えて、ＤＮＡ溶液（インク）を調製した。得られたＤＮＡ溶液をバブルジェットプリンター（商品名：ＢＪＦ−８５０ キヤノン社製）用インクタンクに充填し、印字ヘッドに装着した。
【０１１０】
なお、基板面上へのＤＮＡ溶液のスポッティングに使用するため、前記バブルジェットプリンターは、平板への印字が可能なように改造が施されている。また、このバブルジェットプリンターの印字ヘッドは、所定のファイル作成方法に従って、印字パターンを入力することにより、約５ピコリットルのＤＮＡ溶液液滴を約１２０マイクロメートルピッチでスポッティングすることが可能となっている。
【０１１１】
続いて、上記の改造を施したバブルジェットプリンターを用いて、表面にマレイミド基が導入された石英ガラス基板に対して、所定の印字パターンに従って、各ＤＮＡ溶液のスポッティング操作を行い、アレイを作製した。アレイ状のスポッティング操作が確実に行われていることを確認した後、３０分間加湿チャンバー内に静置し、石英ガラス基板表面のマレイミド基とプローブＤＮＡ５’末端のチオール基とを反応させ、プローブＤＮＡの固定を行った。
【０１１２】
［５］洗浄
３０分間の反応後、１００ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により、基板表面に残ったＤＮＡ溶液を洗い流した。石英ガラス基板表面に、目的とする複数種の一本鎖ＤＮＡがアレイ状に固定されている遺伝子チップが得られた。
＜ゲノムＤＮＡ抽出物中の検体ＤＮＡのＰＣＲ増幅＞
上記微生物由来のゲノムＤＮＡ抽出物中から、検体ＤＮＡとなる、１６ｓ ｒＲＮＡの遺伝子のＰＣＲ増幅を、下記の手順・条件で行う。
【０１１３】
先ず、上記表３に示す、Ｆｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を含むＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ混合物、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ ３種を含むＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ混合物を用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲ増幅反応を行う。該ＰＣＲ増幅反応は、市販のＰＣＲキット（TAKARA ExTaq）を利用して行い、その反応溶液組成を、表４に示す。
【０１１４】
一方、ＰＣＲ反応の温度条件は、下記表４に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーを利用して、増幅反応を行った。
【０１１５】
【表４】
【０１１６】
このＰＣＲ増幅反応の終了後、市販のＰＣＲ産物精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて、Ｐｒｉｍｅｒを除去し、ＰＣＲ増幅産物を回収した。その際、得られたＰＣＲ増幅産物の定量を行った。
＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞
蛍光標識として、Ｃｙ３を５’末端に結合した、標識付きオリゴヌクレオチドを利用して、標識化ＤＮＡ鎖の調製を下記の手順・条件で行った。
【０１１７】
ヌクレオチド鎖の合成後、常法に従って、蛍光標識化合物Ｃｙ３を、該ヌクレオチド鎖の５’末端に共有的に結合させた。その後、ＨＰＬＣを用いて、標識付きオリゴヌクレオチドの精製を行った。表５に、合成された標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列と、その結合部位（Ｅ．ｃｏｌｉ由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの塩基数）を示す。
【０１１８】
【表５】
【０１１９】
上記ＰＣＲ増幅反応で得られるＰＣＲ増幅産物を鋳型とし、Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５に示す塩基配列を有する９種の標識付きオリゴヌクレオチドの混合物を利用して、相補的なＤＮＡ鎖の伸長反応を下記の手順・条件で行う。
【０１２０】
該ＤＮＡ鎖の伸長反応は、市販のＰＣＲキット（TAKARA ExTaq）を利用して、片鎖ＰＣＲ反応の形態で実施した。その反応溶液組成を、表６に示す。
【０１２１】
一方、この伸長反応の温度条件は、下記表６に示すプロトコールに従って、市販のサーマルサイクラーを利用して、増幅反応を行った。
【０１２２】
【表６】
【０１２３】
このＤＮＡ鎖伸長反応の終了後、市販のＰＣＲ産物精製用カラム（QIAGEN QIAquick PCR Purification Kit）を用いて、Ｐｒｉｍｅｒを除去し、標識付きオリゴヌクレオチド由来の蛍光標識Ｃｙ３が５’末端に付加された増幅産物を回収した。その際、得られた増幅産物の定量を行った。
＜ハイブリダイゼーション法による検体ＤＮＡの検出＞
＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製した遺伝子チップと、＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した標識化検体ＤＮＡとを用いて、ハイブリダイゼーション反応を行い、蛍光標識を利用して、形成されるハイブリト体の検出を行った。
【０１２４】
（遺伝子チップのブロッキング）
100mM NaCl/ 10mM Phosphate Buffer中に、ＢＳＡ（牛血清アルブミンFraction V：Ｓｉｇｍａ社製）を濃度１ｗｔ％となるように添加し、ＢＳＡ溶液を調製する。このＢＳＡ溶液中に、＜ＤＮＡマイクロアレイの作製＞で作製した遺伝子チップを室温で２時間浸し、遺伝子チップの石英ガラス基板表面に対して、ＢＳＡによるブロッキング処理を施した。ブロッキング処理の終了後、０．１ｗｔ％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を含む２×ＳＳＣ溶液（NaCl 300mM、 Sodium Citrate (trisodium citrate dihydrate, Na3C6H5O7・2H2O) 30mM、 pH 7.0）で、遺伝子チップの石英ガラス基板表面に残余するＢＳＡ溶液を洗浄した。次いで、純水でリンス洗浄した後、スピンドライ装置で遺伝子チップ表面の水切りを行った。
（ハイブリダイゼーション反応）
前記ブロッキング処理を施した遺伝子チップをハイブリダイゼーション装置（Genomic Solutions Inc. Hybridization Station）にセットし、標識化検体ＤＮＡとプローブＤＮＡとのハイブリダイゼーション反応を下記の手順・条件で行った。
【０１２５】
使用したハイブリダイゼーション溶液の組成、条件を以下に示す。
【０１２６】
［ハイブリダイゼーション溶液］
＜検体の増幅と標識化（ＰＣＲ増幅＆蛍光標識の取り込み）＞で作製した、精製済み標識化検体ＤＮＡを、１０％ＨＣＯＮＨ2を添加した６×ＳＳＰＥ緩衝液中に溶解した溶液を使用した。
６×ＳＳＰＥ/ 10% Form amide / Target (2nd PCR Products 全量)
(６×ＳＳＰＥ： NaCl 900mM、NaH2PO4・H2O 60mM、EDTA 6mM、pH 7.4)
［ハイブリダイゼーション条件］
ハイブリダイゼーション反応、反応後の洗浄・乾燥の操作は、表７の条件で行った。
【０１２７】
【表７】
【０１２８】
＜ハイブリット体の検出（蛍光測定）＞
ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、スピンドライ乾燥済み遺伝子チップ上の各プローブＤＮＡのスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１２９】
表８に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子５’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１３０】
【表８】
【０１３１】
上記のハイブリダイゼーション反応において使用した、標識化検体ＤＮＡ試料は、表５に示す、９種の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列から、その３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖の混合物である。その結果、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８に対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つは、その５’末端に近い部位でプローブＤＮＡとハイブリッド体形成が可能となっている。換言すると、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポット点では、各プローブＤＮＡに対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つが、その５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成して、固定化されている。かかる５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成したものでは、５’末端に付加されている蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光が高い効率で観測される。すなわち、蛍光標識Ｃｙ３の導入に利用する、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドについて、その塩基配列を、複数種のプローブＤＮＡのいずれかが、その５’末端に近い部位でハイブリッド体形成が可能となるように選択することで、複数種のプローブＤＮＡのいずれにおいても、形成されたハイブリッド体に起因する蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の均一化が達成されている。
【０１３２】
加えて、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来する、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて、同様の手順で遺伝子チップを作製した。この遺伝子チップについても、ブロッキング処理を施した後、前記の標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８とのハイブリッド体形成に起因する、蛍光は検出されなかった。
【０１３３】
（比較例１）
実施例１に記載する＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞の工程において、ＤＮＡ鎖伸長反応に用いるＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５中、配列９の標識付きオリゴヌクレオチドのみを使用して、標識化ＤＮＡ鎖を調製した。その後、調製された標識化ＤＮＡ鎖を同様の手順で精製して、１種の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を得た。
【０１３４】
この単一の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、遺伝子チップ上に固定化したプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８とハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、遺伝子チップ上のプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１３５】
表９に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１３６】
【表９】
【０１３７】
前記配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−３〜Ｐａ−８では、ハイブリッド体形成に起因する蛍光が観測されている。その際、かかる配列１の標識付きオリゴヌクレオチド由来の塩基配列をその５’末端に有する標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−３〜Ｐａ−８が結合する部位は、異なっている。すなわち、該標識化ＤＮＡ鎖の５’末端から、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−３が結合する部位が、次第に遠くなるとともに、測定される蛍光強度が減少している。結果として、ハイブリッド体形成が可能な、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−３のスポット点で観測される蛍光強度は、表９に示すように、大きな相違（蛍光強度のバラツキ）を示すことになる。
【０１３８】
勿論、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて作製される遺伝子チップでは、該配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖とのハイブリッド体形成に起因する蛍光は観測されなかった。
【０１３９】
（実施例２）
実施例１に記載する＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞の工程において、ＤＮＡ鎖伸長反応に用いるＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５に示す９種の標識付きオリゴヌクレオチドの混合物、さらにＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、実施例１の表３に記載するＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを加えて、標識化ＤＮＡ鎖を調製した。その後、調製された標識化ＤＮＡ鎖を同様の手順で精製して、複数種の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を得た。
【０１４０】
この標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、遺伝子チップ上に固定化したプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８とハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、遺伝子チップ上のプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１４１】
表１０に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１４２】
【表１０】
【０１４３】
その結果、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８に対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つは、その５’末端に近い部位でプローブＤＮＡとハイブリッド体形成が可能となっている。換言すると、プローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポット点では、各プローブＤＮＡに対して、該標識化ＤＮＡ鎖の混合物中の一つが、その５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成して、固定化されている。かかる５’末端に近い部位においてハイブリッド体を形成したものでは、５’末端に付加されている蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光が高い効率で観測される。すなわち、蛍光標識Ｃｙ３の導入に利用する、複数種の標識付きオリゴヌクレオチドについて、その塩基配列を、複数種のプローブＤＮＡのいずれかが、その５’末端に近い部位でハイブリッド体形成が可能となるように選択することで、複数種のプローブＤＮＡのいずれにおいても、形成されたハイブリッド体に起因する蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の均一化が達成されている。
【０１４４】
加えて、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａの１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に由来する、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて、同様の手順で遺伝子チップを作製した。この遺伝子チップについても、ブロッキング処理を施した後、前記の標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、ハイブリダイゼーション反応を行った。その結果、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８とのハイブリッド体形成に起因する、蛍光は検出されなかった。
【０１４５】
（比較例２）
比較例１に記載する＜ＰＣＲ増幅産物を鋳型とした標識化ＤＮＡ鎖の調製＞の工程において、ＤＮＡ鎖伸長反応に用いるＲｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒとして、表５中、配列９の標識付きオリゴヌクレオチド、さらにＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒとして、実施例１の表３に記載するＦｏｒｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを加えて、標識化ＤＮＡ鎖を調製した。その後、調製された標識化ＤＮＡ鎖を同様の手順で精製して、１種の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を得た。
【０１４６】
この単一の標識化ＤＮＡ鎖からなる標識化検体ＤＮＡ試料を用いて、遺伝子チップ上に固定化したプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８とハイブリダイゼーション反応を行った。ハイブリダイゼーション反応終了後、遺伝子チップ用蛍光検出装置（Ａｘｏｎ社製、GenePix 4000B）を用いて、遺伝子チップ上のプローブＤＮＡ；Ｐａ−１〜Ｐａ−８のスポットについて、蛍光標識Ｃｙ３由来の蛍光強度の測定を行った。
【０１４７】
表１１に、各プローブＤＮＡのスポット点で観測された蛍光強度、ならびに、該プローブＤＮＡの結合部位（１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子３’末端からの凡その塩基数）を示す。
【０１４８】
【表１１】
【０１４９】
前記配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５では、ハイブリッド体形成に起因する蛍光が観測されている。その際、かかる配列９の標識付きオリゴヌクレオチド由来の塩基配列をその５’末端に有する標識化ＤＮＡ鎖に対して、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５が結合する部位は、異なっている。すなわち、該標識化ＤＮＡ鎖の５’末端から、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５が結合する部位は、次第に遠くなるとともに、測定される蛍光強度が減少している。結果として、ハイブリッド体形成が可能な、プローブＤＮＡ；Ｐａ−８〜Ｐａ−５のスポット点で観測される蛍光強度は、表１１に示すように、大きな相違（蛍光強度のバラツキ）を示すことになる。
【０１５０】
勿論、表２に示すプローブＤＮＡ；Ｈｉ−１〜Ｈｉ−８を用いて作製される遺伝子チップでは、該配列９の標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端にＤＮＡ鎖が伸長された標識化ＤＮＡ鎖とのハイブリッド体形成に起因する蛍光は観測されなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１５１】
本発明にかかる核酸標識方法は、検体中に含まれる鋳型核酸から、該鋳型核酸の全塩基配列中、その部分領域に対して、相補的な塩基配列を有する標識付き核酸を、伸長反応によって調製し、プローブ・ハイブリダイゼーション反応による核酸検出用の標識付き核酸試料を調製する際、好適に利用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に供する、標識化された核酸を調製する手段であって、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
前記伸長反応のプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを構成する前記相補的な塩基配列が相違する、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを用い、
該プライマー・セット中に含まれる、一つの標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長に利用される、一本鎖の鋳型核酸に対して、
該プライマー・セット中に含まれる、他の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記一本鎖の鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する他のオリゴヌクレオチドで構成されている
ことを特徴とする核酸標識方法。
【請求項２】
前記伸長反応は、非対称ＰＣＲ反応である
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸標識方法。
【請求項３】
前記伸長反応は、ＰＣＲ反応である
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸標識方法。
【請求項４】
前記標識付きオリゴヌクレオチドは、
蛍光物質およびビオチンからなる群から選択される一つ以上の標識を用いて、該オリゴヌクレオチドに標識が付されている
ことを特徴とする請求項２または３に記載の核酸標識方法。
【請求項５】
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出は、
固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用している
ことを特徴とする請求項４に記載の核酸標識方法。
【請求項６】
前記固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブは、
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態である
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型核酸として、
検体中に含まれる核酸からＰＣＲ産物として調製される一本鎖核酸を利用する
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸標識方法。
【請求項８】
前記検出対象の核酸は、
細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸標識方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸標識方法により調製される、標識化された核酸。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸標識方法において利用可能な、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セット。
【請求項１１】
前記鋳型核酸の塩基配列に基づき、
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に用いるプローブＤＮＡの塩基配列が選択されている、該鋳型核酸の塩基配列上のプローブ対応部位と、
前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有する、該鋳型核酸の塩基配列上のプライマーに相補的部位の少なくとも二種について、
前記プローブ対応部位を基準点とし、前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の存在位置までの塩基数により、該プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置を定義する際、
前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置が互いに異なるように、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列が選択されている
ことを特徴とする請求項１０に記載のプライマー・セット。
【請求項１２】
該プライマー・セットに含まれる、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドとして、
下記配列１〜配列９：
配列１； 5' actgctgcctcccgtaggagtctgg 3'
配列２； 5' cgtattaccgcggctgctggcacg 3'
配列３； 5' gcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg 3'
配列４； 5' tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg 3'
配列５； 5' ggtaaggttcttcgcgttgc 3'
配列６； 5' ttgacgtcatccccaccttcctcc 3'
配列７； 5' ccattgtagcacgtgtgtagccc 3'
配列８； 5' tggtgtgacgggcggtgtgtacaag 3'
配列９； 5' taccttgttacgacttcacccca 3'
からなる群から選択される、少なくとも二種以上の塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを含んでいる
ことを特徴とする請求項１１に記載のプライマー・セット。
【請求項１】
プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に供する、標識化された核酸を調製する手段であって、
検体中に含まれる核酸から調製される一本鎖核酸を、鋳型核酸として利用し、
該鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、
該標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖を伸長する、伸長反応を行って、該標識付きオリゴヌクレオチドを５’末端に内在している核酸を調製して、標識化された核酸とする際、
前記伸長反応のプライマーとして、該オリゴヌクレオチドを構成する前記相補的な塩基配列が相違する、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セットを用い、
該プライマー・セット中に含まれる、一つの標識付きオリゴヌクレオチドの３’末端に核酸鎖の伸長に利用される、一本鎖の鋳型核酸に対して、
該プライマー・セット中に含まれる、他の標識付きオリゴヌクレオチドの少なくとも一つは、前記一本鎖の鋳型核酸の塩基配列中に含まれる部分塩基配列に対して、相補的な塩基配列を有する他のオリゴヌクレオチドで構成されている
ことを特徴とする核酸標識方法。
【請求項２】
前記伸長反応は、非対称ＰＣＲ反応である
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸標識方法。
【請求項３】
前記伸長反応は、ＰＣＲ反応である
ことを特徴とする請求項１に記載の核酸標識方法。
【請求項４】
前記標識付きオリゴヌクレオチドは、
蛍光物質およびビオチンからなる群から選択される一つ以上の標識を用いて、該オリゴヌクレオチドに標識が付されている
ことを特徴とする請求項２または３に記載の核酸標識方法。
【請求項５】
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出は、
固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブに対するハイブリダイゼーション反応を利用している
ことを特徴とする請求項４に記載の核酸標識方法。
【請求項６】
前記固相表面に固定あるいは吸着されているＤＮＡプローブは、
ＤＮＡチップまたはＤＮＡマイクロアレイの形態である
ことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記鋳型核酸として、
検体中に含まれる核酸からＰＣＲ産物として調製される一本鎖核酸を利用する
ことを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸標識方法。
【請求項８】
前記検出対象の核酸は、
細菌由来の１６ｓ ｒＲＮＡ遺伝子である
ことを特徴とする請求項１〜７のいずれか一項に記載の核酸標識方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸標識方法により調製される、標識化された核酸。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の核酸標識方法において利用可能な、少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドを含んでなるプライマー・セット。
【請求項１１】
前記鋳型核酸の塩基配列に基づき、
前記プローブ・ハイブリダイゼーション法を利用する核酸検出に用いるプローブＤＮＡの塩基配列が選択されている、該鋳型核酸の塩基配列上のプローブ対応部位と、
前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列を有する、該鋳型核酸の塩基配列上のプライマーに相補的部位の少なくとも二種について、
前記プローブ対応部位を基準点とし、前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の存在位置までの塩基数により、該プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置を定義する際、
前記プライマーに相補的部位の少なくとも二種の相対的位置が互いに異なるように、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドの塩基配列が選択されている
ことを特徴とする請求項１０に記載のプライマー・セット。
【請求項１２】
該プライマー・セットに含まれる、前記少なくとも二種以上の標識付きオリゴヌクレオチドとして、
下記配列１〜配列９：
配列１； 5' actgctgcctcccgtaggagtctgg 3'
配列２； 5' cgtattaccgcggctgctggcacg 3'
配列３； 5' gcgtggactaccagggtatctaatcctgtttg 3'
配列４； 5' tcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcggg 3'
配列５； 5' ggtaaggttcttcgcgttgc 3'
配列６； 5' ttgacgtcatccccaccttcctcc 3'
配列７； 5' ccattgtagcacgtgtgtagccc 3'
配列８； 5' tggtgtgacgggcggtgtgtacaag 3'
配列９； 5' taccttgttacgacttcacccca 3'
からなる群から選択される、少なくとも二種以上の塩基配列を有する標識付きオリゴヌクレオチドを含んでいる
ことを特徴とする請求項１１に記載のプライマー・セット。
【公開番号】特開２００６−１８０７５５（Ｐ２００６−１８０７５５Ａ）
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−３７６７１５（Ｐ２００４−３７６７１５）
【出願日】平成１６年１２月２７日（２００４．１２．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．バブルジェット
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年７月１３日（２００６．７．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年１２月２７日（２００４．１２．２７）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．バブルジェット
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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