核酸類縁体並びに診断薬および分析方法におけるその使用方法

【課題】診断薬の分野において従来技術による解決し得ない問題を解決するために、例えば一つまたはそれ以上の化学的または微生物学的個体単位についてその捕捉、認識、検出、同定または定量化などを行うために幾つかの核酸類縁体を提供すること。
【解決手段】相補的配列の従来公知の核酸とハイブリッドを形成し、而もそのハイブリッドのＴｍ値における安定性を相当する配列を持つ従来公知の核酸が形成するハイブリッドよりも高くするような特性および／または相当する配列を持つ前記従来公知の相当する核酸よりも不適合の程度に関与する配列と比較した相補的配列に対する選択性をより大きくする特性といった、従来知られていない特性を有する新規な構造の核酸類縁体及びを診断薬または分析にかかる核酸類縁体を使用する方法。

【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
【数１−１】

【背景技術】
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【数１−２】

【０００３】
【数２−１】

【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明によって以下が提供される：
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【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１Ａ】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図１Ｂ】天然のデオキシリボヌクレオチド（Ａ）および本発明のペプチド核酸（ＰＮＡ）（Ｂ）を示す。
【図２Ａ】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポ−タ−基を示す。
【図２Ｂ】ＤＮＡ認識のための天然および非天然の核酸塩基およびリポ−タ−基を示す。
【図３】以下の概略図を示したものである：すなわち、（ａ）Ａｃｒ¹−（Ｔａｅｇ）₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（ＡｃｒＴ₁₀Ｌｙｓ−ＮＨ₂）による光開裂；Ａｃｒ¹−（Ｔａｅｇ）₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂のジアゾ−結合アクリジンによるフォトフットプリントおよび好ましいＫＭｎＯ₄−開裂；および（ｃ）Ｓ₁−ヌクレア−ゼで増進せしめられた開裂と（ｄ）Ａｃｒ¹−（Ｔａｅｇ）₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂結合部位のミクロコッカスヌクレア−ゼによる開裂。
【図４】ＰＮＡモノマ−シントンのいくつかの例を示す。
【図５】Ａｃｒ¹リガンドおよび一つのＰＮＡであるＡｃｒ¹−（Ｔａｅｇ）₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂を示す。
【図６】モノマ−シントンを調製する一般的な概略図である。
【図７】Ａｃｒ¹リガンドを調製する一般的概略図である。
【図８】線状の未保護ＰＮＡアミドの調製を図示する固相ＰＮＡ合成の一般的概略図である。
【図９】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示すものである：（Ａ）ＨＦ−開列後の粗製Ｈ−［Ｔａｅｇ］₁₅−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（凍結乾燥前）；（Ｂ）ＨＦ開裂後の粗製Ａｃｒ¹−［Ｔａｅｇ］₁₅−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（凍結乾燥前）；および（Ｃ）精製Ａｃｒ¹−［Ｔａｅｇ］₁₅−Ｌｙｓ−ＮＨ₂・緩衝液Ａ、５％ＣＨ₃ＣＮ／９５％Ｈ₂Ｏ／０．０４４５％ＴＦＡ；緩衝液Ｂ、６０％ＣＨ₃ＣＮ／４０％Ｈ₂Ｏ／０．０３９０％ＴＦＡ；直線勾配、３０分でＢが０−１００％；流量、１．２ｍｌ／分；カラム、ＶｙｄａｃＣ１８（５μｍ、０．４６ｘ２５ｃｍ）。
【図１０】以下の分析ＨＰＬＣクロマトグラムを示す：すなわち、（Ａ）精製Ｈ−［Ｔａｅｇ］₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂および（Ｂ）Ｈ−［Ｔａｅｇ］₅−Ｃａｅｇ−［Ｔａｅｇ］₄−Ｌｙｓ−ＮＨ₂−第９図におけると同一条件を使用。
【図１１Ａ】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ₁₀−ＬｙｓのｄＡ₁₀・５’−³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ）をＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養した。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１１Ｂ】第１１ａ図および第１１ｂ図は、ＡｃｒＴ₁₀−ＬｙｓのｄＡ₁₀・５’−³²Ｐで標識したオリゴヌクレオチドへの結合を示す；（１）（５’−ＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ）をＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓの存在下または不存在下およびオリゴヌクレオチドの存在下または不存在下で培養した。（２）（５’−ＧＡＴＣＣＡ₁₀Ｇ）および試料を”自然の条件”下（第１１ａ図）または”変性条件”下（第１１ｂ図）でポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ａ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂とｄＡ₁₀／ｄＴ₁₀標識配列を含む³²Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ｂ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂とｄＡ₁₀／ｄＴ₁₀標識配列を含む³²Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。（ＰＡＧＥ）およびオ−トラジオグラフィ−によって分析した。
【図１２Ｃ】第１２ａ−ｃ図は、ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂錯体についての化学的、光化学的および酵素的プロ−ビングを示す。ｄｓＤＮＡ−ＡｃｒＴ₁₀−Ｌｙｓ−ＮＨ₂とｄＡ₁₀／ｄＴ₁₀標識配列を含む³²Ｐ−ｅｎｄ標識化ＤＮＡフラグメントとの間の錯体を、アフィニティ−光開裂（第１２ａ図、レ−ン１−３；第１２ｂ図、レ−ン１−３）、過マンガン酸塩プロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン４−６）またはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓヌクレア−ゼによるプロ−ビング（第１２ｂ図、レ−ン８−１０）もしくはヌクレア−ゼＳ１によるプロ−ビング（第１２ｃ図）によってプロ−ブした。Ａ鎖（第１２ａ図）またはＴ鎖（第１２ｂ図、第１２ｃ図）をプロ−ブした。
【図１３】保護ＰＮＡシントンを合成する手法を示す。
【図１４】保護アデニンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１５】保護グアニンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１６】ＰＮＡ主鎖改変のいくつかの例を示す。
【図１７】通常のアミノ酸に相当する側鎖を有するチミンモノマ−シントンを合成する手法を示す。
【図１８Ａ】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１８Ｂ】第１８ａ図および第１８図ｂはそれぞれ、チミンモノマ−シントンのアミノプロピル類縁体およびプロピオニル類縁体を合成する手法を示す。
【図１９】チミンモノマ−シントンのアミノエチル−β−アラニン類縁体を合成する手法を示す。
【図２０】ＰＮＡｓ−Ｔ₁₀、−Ｔ₉Ｃおよび−Ｔ₈Ｃ₂が、高い配列特異性をもって二本鎖ＤＮＡに結合することを実証するＰＡＧＥラジオオ−トグラフを示す。
【図２１】Ａ₁₀／Ｔ₁₀二本鎖ＤＮＡ標的に結合した長さの異なるＰＮＡ類の熱安定性を示すＰＡＧＥオ−トラジオグラフのデンシトメ−タ−走査に基づくグラフである。
【図２２】Ａ１０／Ｔ１０二重鎖ＤＮＡ標的に結合させた、長さの異なるＰＮＡの熱安定性を示す、ＰＡＧＥオートラジオグラフのデンシトメトリ走査に基くグラフである。
【図２３】ＤＮＡに対する制限酵素活性が、ＰＮＡを制限酵素認識部位の近位に結合させた場合抑制されることを実証する電気泳動ゲル染色を示す。
【図２４】¹²⁵Ｉで標識したＰＮＡ−Ｔ₁₀が相補的ｄＡ₁₀オリゴヌクレオチドに結合することを実証するＰＡＧＥオ−トラジオグラフを示す。
【図２５】第２５ａ図から第２５ｃ図は、固定化したＰＮＡとマッチするまたは塩基一つがミスマッチしたオリゴ−ＤＮＡ類との間で異なる温度において実現される結合の百分率を示す。
【図２６】第２６図は、転写された鎖へのＴ₁₀によるＲＮＡポリメラ−ゼ転写抑制を示すオ−トラジオグラフである。
【図２７】標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の一つに相補的である固定化されたＤＮＡに捕捉されかつ異なる温度において洗浄された標識化プラスミドｄｓＤＮＡ類の混合物のオ−トラジオグラフである。
【図２８】第２８図は、ＰＮＡによる鎖置換を用いたプラスミドｄｓＤＮＡの定量を実証する臭化エチジウムゲルとそのオ−トラジオグラフとを組合せたものである。

【特許請求の範囲】
【請求項１】
本願明細書に記載されるような、核酸類縁体。

【図１Ａ】