植物細胞によるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法
【課題】植物細胞において、安定であって、本来の生理活性を保持し、かつアレルゲンとならない糖鎖構造を持つ糖タンパク質を分泌生産する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法であって、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、該植物細胞を培養する工程、および該植物細胞の培養液を回収する工程、を含む前記方法。
【解決手段】ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法であって、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、該植物細胞を培養する工程、および該植物細胞の培養液を回収する工程、を含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、植物細胞によるヒト型糖鎖を持つ異種糖タンパク質の分泌生産方法、上記糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、および上記植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
植物培養細胞を用いた外来タンパク質の製造が行われている。例えば、タバコ培養細胞を用い以下のヒト有用タンパク質の製造が試みられている：
ＧＭ−ＣＳＦ（James EA, Wang C, Wang Z, Reeves R, Shin JH, Magnuson NS, Lee JM, Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. Protein Expr Purif. 19, 131-138 (2000)）、ＩＬ−２およびＩＬ−４（Magnuson NS, Linzmaier PM, Reeves R, An G, HayGlass K, Lee JM, Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture. Protein Expr Purif. 13, 45-52 (1998)）、免疫グロブリン（Magnuson NS, Linzmaier PM, Gao JW, Reeves R, An G, Lee JM, Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells. Protein Expr Purif. 7, 220-228 (1996)）、エリスロポエチン（Matsumoto S, Ishii A, Ikura K, Ueda M, Sasaki R, Expression of human erythropoietin in cultured tobacco cells, Biosci. Biotechnol. Biochem. 57, 1249-1252 (1993)）、α１−アンチトリプシン（Terashima M, Murai Y, Kawamura M, Nakanishi S, Stoltz T, Chen L, Drohan W, Rodriguez RL, Katoh S, Production of functional human alpha 1-antitrypsin by plant cell culture. Appl Microbiol Biotechnol. 52, 516-523 (1999)）など。
【０００３】
その一方、植物培養細胞は、多くのタンパク質あるいは糖タンパク質を分泌することが報告されている（Sturm A, Heterogeneity of the complex N-linked oligosaccharides at specific glycosylation sites of two secreted carrot glycoproteins Eur J Biochem. 199, 169-179 (1991); Okushima Y, Koizumi N, Kusano T, Sano H, Secreted proteins of tobacco cultured BY2 cells: identification of a new member of pathogenesis-related proteins. Plant Mol Biol. 42, 479-488 (2000)；およびOkushima Y, Koizumi N, Kusano T, Sano H, Glycosylation and its adequate processing is critical for protein secretion in tobacco BY2 cells. J. Plant Physiolo. 154, 623-627 (1999)）。なかでも、タバコＢＹ２株培養細胞では、２種のペルオキシダーゼが精製され、それらの遺伝子がクローニングされている（Narita H, Asaka Y, Ikura K, Matsumoto S, Sasaki R, Isolation, characterization and expression of cationic peroxidase isozymes released into the medium of cultured tobacco cells. Eur J Biochem. 228, 855-862 (1995)）。培地にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加することにより、培地に分泌されたタンパク質濃度を上昇させることができること（Magnuson NS, Linzmaier PM, Gao JW, Reeves R, An G, Lee JM, Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells, Protein Expr Purif. 7, 220-228 (1996))、また、Okushima Yら（1999、前述）により、タバコＢＹ２株培養細胞では、数百種ものタンパク質が細胞外に分泌されていることが報告されている。さらにこれらの中には高マンノース型糖鎖を認識するレクチン（コンカナバリンＡ）と反応したことから多くの糖タンパク質が細胞外に分泌されていることが確認されている（Okushima Yら（1999）、前述）。
【０００４】
上記のような植物細胞内で生産させた糖タンパク質（特に免疫グロブリン、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ）は、それら自身の持つシグナルペプチドが植物細胞内の分泌機構においても認識され、そして培養液中に分泌された（James EAら、前述；Magnuson NSら（1998）、前述；Magnuson NSら（1996）、前述）。これらのいずれの糖タンパク質も、その糖鎖が、血中半減期、タンパク質分解酵素への感受性、および安定性に関与することが示唆されているが、実際に植物細胞内で生産され、そして精製された組換えタンパク質の糖鎖構造は調べられておらず、これらは、植物型糖鎖構造をもつと推測される。
【０００５】
タバコ植物体で生産された分泌型抗体分子ｓＩｇＡの糖鎖構造解析では植物型糖鎖を持つことが明らかにされた（Cabanes-Macheteau M, Fitchette-Laine AC, Loutelier-Bourhis C, Lange C, Vine ND, Ma JK, Lerouge P, Faye L, N-Glycosylation of a mouse IgG expressed in transgenic tobacco plants. Glycobiology. 9, 365-372 (1999)）。また、同じくタバコ植物体で別の抗体分子を生産させた場合、細胞内で生産された抗体タンパク質は、タンパク質分解酵素による分解を受け、不安定であった（Stevens LH, Stoopen GM, Elbers IJ, Molthoff JW, Bakker HA, Lommen A, Bosch D, Jordi W, Effect of climate conditions and plant developmental stage on the stability of antibodies expressed in transgenic tobacco. Plant Physiol. 124, 173-182 (2000)）。この抗体には植物型糖鎖が付加していることが、抗植物型糖鎖抗体を用いたウェスタン法により確認された。ヒトやマウスなどで生産された抗体分子の糖鎖に存在するβ１，４−結合したガラクトース残基が、抗体タンパク質の安定化に寄与していることが報告されているが、植物細胞で生産された抗体分子にはこの糖残基が存在しない。このため、タバコ植物体で生産された抗体はタンパク質分解酵素による分解を受けやすくなったと考えられている。
【０００６】
エリスロポイエチンをタバコ培養細胞で生産させた場合、インビトロでの生物学的活性は認められたが、インビボでの活性を検出できなかった（Matsumoto S, Ikura K, Ueda M, Sasaki R Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells. Plant Mol Biol. 27, 1163-1172 (1995))。これもまた、糖鎖が生物学的活性に大きく関わっているエリスロポイエチンが、植物細胞で生産された場合に糖鎖構造が大きく異なることが原因であると結論付けられた。
【０００７】
一方、植物型糖鎖はヒトを含む哺乳類動物においてアレルゲンとなる可能性も示唆されている。すなわち、哺乳類の糖タンパク質糖鎖に見られない植物特有の糖鎖構造β１，２−キシロースあるいはα１，３−フコースがアレルゲンとなることが報告されている（Fotisch K, Altmann F, Haustein D, Vieths S, Involvement of carbohydrate epitopes in the IgE response of celery-allergic patients. Int Arch Allergy Immunol. 120, 30-42 (1999)；Wilson IB, Harthill JE, Mullin NP, Ashford DA, Altmann F, Core alphal, 3-fucose is a key part of the epitope recognized by antibodies reacting against plant N-linked oligosaccharides and is present in a wide variety of plant extracts. Glycobiology. 8, 651-661 (1998)；およびvan Ree R, Cabanes-Macheteau M, Akkerdaas J, Milazzo JP, Loutelier-Bourhis C, Rayon C, Villalba M, Koppelman S, Aalberse R, Rodriguez R, Faye L, Lerouge P, Beta(1,2)-xylose and alpha(1,3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. J Biol Chem. 2000 Apr. 14；275 (15)：11451-11458）。このため、医療用タンパク質においては、β１，２−キシロースあるいはα１，３−フコースをもたない糖鎖構造であることが所望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の開示
本発明は、上記従来の課題を解決し、植物細胞において、安定であって、本来の生理活性を保持し、かつアレルゲンとならない糖鎖構造を持つ糖タンパク質を分泌生産する方法、このような糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、およびこの植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タバコ培養細胞ＢＹ２株において、ヒト由来ガラクトース転移酵素遺伝子ｃＤＮＡを発現させると、培養外液に分泌されたほとんどの糖タンパク質の糖鎖にガラクトースが付加し、そしてβ１，２−キシロースまたはα１，３−フコースをもたない糖鎖構造を有していたことを発見し、本発明を完成するに至った。従って、この遺伝子組換えタバコ培養細胞を用いて、ヒト由来有用タンパク質を生産させることによって、細胞外液にアレルゲンとならない糖鎖構造をもつ目的タンパク質を分泌させることができる。
【００１０】
本発明は、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法に関する。この方法は、植物細胞に、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および得られた植物細胞を培養する工程を含む。
【００１１】
上記方法において、上記ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖は、非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分をもち得る。
【００１２】
上記方法においては、上記外部糖鎖は、直鎖状構造または分岐状構造を有し得る。
【００１３】
上記方法においては、上記分岐糖鎖部分は、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造であり得る。
【００１４】
上記方法においては、上記糖タンパク質は、フコースまたはキシロースを含まなくともよい。
【００１５】
好ましくは、上記分泌生産方法は、上記植物細胞の培養液を回収する工程をさらに含み得る。
【００１６】
１の実施態様においては、上記分泌生産方法は、インビトロで糖または糖鎖を付加する工程をさらに含み得る。
【００１７】
本発明は、１つの局面で、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、かつ該糖鎖付加機構によって糖鎖を付加されたタンパク質を分泌し得る植物細胞に関し、この糖鎖付加機構は、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖を付加し、上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分をもつ。
【００１８】
本発明はまた、上記の方法によって得られたヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質にも関する。
【００１９】
本発明はまた、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法に関し、この方法は、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、およびこの酵素を細胞内小器官で発現させる工程を包含する。
【００２０】
本発明は、さらに、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素のための遺伝子により形質転換された植物細胞であり、ここで、上記酵素が上記植物細胞内に局在し、その結果、上記植物細胞は、ヒト型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を合成することができる、前記植物細胞にも関する。
【００２１】
１の局面においては、上記植物細胞において、前記糖鎖構造は、付加されたガラクトース残基を含む。
【００２２】
１の局面においては、上記植物細胞において、前記糖鎖構造は、β１，２−キシロース又はα１，３−フコースを含まない。
【００２３】
１の局面においては、上記植物細胞において、前記糖鎖構造は、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ2 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、及びＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 から成る群から選ばれる（Ｎ−アセチルグルコサミン）1-2 （マンノース）2-5 （Ｎ−アセチルグルコサミン）2 のＮ結合型糖鎖に付加されたガラクトース残基を含む。
【００２４】
１の局面において、上記植物細胞において、前記酵素は、前記植物内の細胞内小器官内に局在する。
【００２５】
本発明は、さらに、上記植物細胞から再生された植物にも関する。
【００２６】
本発明は、さらに、上記植物から生産された種子にも関する。
【００２７】
本発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明においては、他に特定されない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が使用され得る。これらの手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２９】
本発明の方法は、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の生産方法に関する。本明細書において、「ヒト型糖鎖」とは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基と結合したガラクトース残基を有する糖鎖をいう。ヒト型糖鎖におけるガラクトース残基は糖鎖の末端であってもよいし、ガラクトース残基のさらに外側にシアル酸残基が結合していてもよい。本発明の糖タンパク質は、ヒト型糖鎖のコア糖鎖部分、分岐糖鎖部分、および末端糖鎖部分からなる１つ以上の部分において、キシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合していないことが好ましく、ヒト型糖鎖のいずれの部分においてもキシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合していないことがより好ましく、最も好ましくはヒト型糖鎖中にキシロースおよびフコースのいずれも含まないことがさらにより好ましい。
【００３０】
植物細胞とは、任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得る。本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
【００３１】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００３２】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００３３】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００３４】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００３５】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどを含む。
【００３６】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００３７】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを含む。
【００３８】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどを含む。
【００３９】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００４０】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００４１】
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およびホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
【００４２】
「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素」とは、植物細胞内の糖タンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生じる非還元末端アセチルグルコサミン残基へガラクトース残基を転移し得る酵素である。このような酵素の例としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ラクトースシンターゼ、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。このような酵素は、任意の動物種に由来し得るが、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。
【００４３】
好ましくは、この酵素は、細胞内小器官に局在化する酵素である。本発明者らは、特定の理論に拘束されることは意図しないが、この酵素が細胞内小器官（例えば、小胞体、ゴルジ体など）に存在することによって、植物細胞において、異種糖タンパク質が発現および分泌される際、フコース残基またはキシロース残基が付加する前に、あるいはフコース残基またはキシロース残基が付加しないように作用すると考えられる。
【００４４】
「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子」は、この酵素をコードすることが公知のヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４５】
本明細書では、「遺伝子」とは、構造遺伝子部分をいう。遺伝子には、植物での発現に適切なように、プロモーター、オペレーター、およびターミネーターなどの制御配列が連結され得る。
【００４６】
「異種糖タンパク質」とは、本発明に用いられる植物において本来発現されない糖タンパク質をいう。異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモンおよびサイトカインの例としては、エンケファリン、インターフェロンアルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、絨毛性性腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、エリスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられる。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、分泌型ＩｇＡなどが挙げられる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓのＧタンパク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）などが挙げられる。レセプターおよびマトリックスタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプター、フィブロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子VIIIなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、アルブミン、補体系タンパク質、プラスミノーゲン、コルチコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロキシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）などが挙げられる。
【００４７】
「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の異種糖タンパク質をコードすることが知られるヌクレオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４８】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素および異種糖タンパク質の遺伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、同時に導入してもよい。当業者は、遺伝子導入方法の選択が、形質転換に関して標的とされた植物のタイプに依存しうることを理解するであろう。
【００４９】
植物細胞を形質転換するために好適な方法は、マイクロインジェクション（Crossway et al., BioTechniques 4 : 320-334 (1986))、エレクトロポレーション（Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 5602-5606 (1986)、アグロバクテリウム仲介形質転換（Hinchee et al., Biotechnology 6 : 915-921 (1988)；メイズの形質転換については、Ishida et al., Nature Biotechnology 14 : 745-750 (June 1996)をも参照のこと、直接遺伝子移入（Paszkowski et al., EMBO J. 3 : 2717-2722 (1984); Hayashimoto et al., Plant Physiol 93 : 857-863 (1990)（イネ））、及びAgracetus, Inc., Madison, Wis. 及びDupont, Inc., Wilmington, Del.から入手可能な装置を使用した弾道粒子加速（例えば、Sanford et al., 米国特許第4,945,050号；及びMcCabe et al., Biotechnology 6 : 923-926 (1988)を参照のこと）を含む。
【００５０】
また、Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22 : 421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5. 27-37 (1987)(タマネギ); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 8526-8530 (1990)(タバコ・クロロプラスト）；Christou et al., Plant Physiol. 87 : 671-674 (1988)(ダイズ）；McCabe et al., Bio/Technology 6. 923-926 (1988)(ダイズ）；Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 4305-4309 (1988)(メイズ）；Klein et al., Bio/Technology 6 : 559-563 (1988)(メイズ）；Klein et al., Plant Physiol. 91 : 440-444 (1988)(メイズ）；Fromm et al., Bio/Technology 8 :833-839 (1990)；及びGordon-Kamm et al., Plant Cell 2 : 603-618 (1990)(メイズ）；Koziel et al., Biotechnology 11 : 194-200 (1993)(メイズ）；Shimamoto et al., Nature 338 : 274-277 (1989)(イネ）；Christou et al., Biotechnology 9 : 957-962 (1991)(イネ）；Datta et al., Biol/Technology 3 : 736-740 (1990)(イネ）；ヨーロッパ特許出願第EP 0 332 581号（オーチャードグラス、その他のPooideae); Vasil et al., Biotechnology 11 : 1553-1558 (1993)(小麦）；Weeks et al., Plant Physiol. 102 : 1077-1084 (1993)(小麦）；Wan et al., Plant Physiol. 104 : 37-48 (1994)(大麦）；Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89 : 525-533 (1994)(大麦）；Umbeck et al., Bio/Technology 5 : 263-266 (1987)(綿）；Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 11212-11216 (December 1993)(モロコシ）；Somers et al., Bio/Technology 10 : 1589-1594 (December 1992)(オート）；Torbert et al., Plant Cell Reports 14 : 635-640 (1995)(オート）；Weeks et al., Plant Physiol. 102 : 1077-1084 (1993)(小麦）；Chang et al., WO 94/13822 (小麦）及びNehra et al., The Plant Journal 5 : 285-297 (1994)(小麦）をも参照のこと。
【００５１】
マイクロインジェクタイル・ボンバードメントによるメイズ内への組換えＤＮＡ分子の導入のために特に好ましい一連の態様は、Koziel et al., Biotechnology 11 : 194-200 (1993), Hill et al., Euphytica 85 : 119-123 (1995)及びKoziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792 : 164-171 (1996)中に見られる。
【００５２】
追加の好ましい態様は、ＥＰ ０ ２９２ ４３５中に開示されているようなメイズのためのプロトプラスト形質転換方法である。植物の形質転換は、単一のＤＮＡ種又は多数のＤＮＡ種を用いて（すなわち、共同（同時）形質転換）、行われることができ、そしてこれらの技術の両者が、ペルオキシダーゼ・コーディング配列を用いた使用に好適である。
【００５３】
上記遺伝子が導入された植物細胞によって発現および分泌される遺伝子産物は、発現および分泌される遺伝子産物に応じて、当該分野で公知の方法により確認され得る。このような確認方法としては、銀染色、ウェスタンブロッティング、ノーザンハイブリダイゼーション、酵素活性の検出などが挙げられる。
【００５４】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素および異種糖タンパク質を発現する形質転換細胞は、ヒト型の糖鎖を有する異種糖タンパク質を発現および分泌する。つまり、このようにして得られた形質転換植物はヒト型の糖鎖付加機構を有し、この形質転換細胞を培養することにより、ヒト型の糖タンパク質が発現され、そして培養液中に大量に分泌され得る。
【００５５】
このヒト型の糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含む。得られる糖タンパク質の外部糖鎖は、非還元末端糖鎖部分を含む。外部糖鎖は、直鎖状構造を持っていても分岐状構造を持っていてもよい。分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造のいずれかであり得る。形質転換細胞により生産される糖タンパク質は、好ましくは、フコースまたはキシロースを含まない。
【００５６】
得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよい。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
【００５７】
形質転換植物細胞の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Murashige-Skoog(ＭＳ）培地、Gamborg B5（Ｂ）培地、White培地、Nitsch ＆ Nitsch (Nitsch)培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適用量添加されて用いられる。
【００５８】
異なる植物株への上記系の適用は、プロトプラストからその特定の植物株を再生するその能力による。プロトプラストからの穀草の再生のための例示的な方法は記載されている（Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2 : 74, 1985; Toriyama et al., Theor. Appl. Genet., 73 : 16, 1986; Yamada et al., Plant Cell Rep., 4 : 85, 1986; Abdullah et al., Biotechnology, 4 : 1087, 1986)。
【００５９】
プロトプラストから首尾よく再生することができない植物株を形質転換するために、無傷の細胞又は組織内にＤＮＡを導入するための他の方法が使用されうる。例えば、未成熟胚又は外植体からの穀草の再生は、記載されたように行うことができる（Vasil, Biotechnology, 6 : 397, 1988)。
【００６０】
アグロバクテリウム仲介移入も、植物細胞内に遺伝子を導入するために広く適用されうる系である。なぜなら、ＤＮＡが植物の組織内に導入され、それによりプロトプラストから無傷の植物を再生するための必要性をバイパスするからである。植物細胞内にＤＮＡを導入するためのベクターを組み込むアグロバクテリウム仲介植物の使用は、本分野において周知である。例えば、上述の方法を参照のこと。
【００６１】
ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産のためには、形質転換植物細胞が増殖し、そして所望の遺伝子産物を発現および分泌する限り、基本的には、炭素源、窒素源、およびビタミン類、塩類のような植物細胞の生育に必要な微量栄養素を含む任意の組成の培養培地を用いることができる。分泌した異種タンパク質の安定化、および異種タンパク質の分泌の効率化のために、ポリビニルピロリドン、タンパク質分解酵素阻害剤などを添加してもよい。
【００６２】
形質転換植物細胞により発現および分泌された、ヒト型の糖鎖を持つ糖タンパク質は、典型的には、植物細胞の培養液から単離され得る。植物細胞の培養液からの糖タンパク質の単離は、当業者に周知の方法を用いて実施され得る。例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分別沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、培養液から糖タンパク質を精製して単離し得る。
【００６３】
あるいは、本発明の糖タンパク質は、植物細胞から単離または抽出されてもよい。さらには、本発明の糖タンパク質は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供され得る。本発明の糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖付加を有するので、抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適している。
【００６４】
さらに、本発明においては、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行うことができる酵素の遺伝子により形質転換された植物細胞又は植物体は、β１，２−キシロース転移酵素又はα１，３−フコース転移酵素を失活され又はその活性を抑制されることもできる。
【００６５】
Strasser et al. は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを単離している（Strasser R, Mucha J, Mach L, Altmann F, Wilson IB, Glossl J, Steinkellner H, Molecular cloning and functional expression of β１，２−キシロシルトランスフェラーゼcDNA from Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. (2000) 472 : 105-108）。データベース、例えば、NIH GenBankに対するホモロジー・サーチは、いくつかの植物において、いくつかのＥＳＴクローン及びゲノム配列に相当するヌクレオチド配列を示し、そしてアラビドプシスβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に類似している。これらの配列に基づき、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードする核酸を、宿主植物からクローニングし、そしてβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制することにより、低下したキシロシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物を樹立するために使用することができる。β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子発現の抑制は、アンチセンス法、共同（同時）抑制法、ＲＮＡ；法などにより行いうる。
【００６６】
あるいは、低下したキシロシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物は、化学物質による突然変異誘発、オリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発、タギング法などにより樹立されうる。上記植物においては、異種ポリペプチドをコードする遺伝子とともにガラクトース転移酵素をコードする１以上の糖転移酵素遺伝子の導入及び発現は、ヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを作り又はヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを分泌することができる。
【００６７】
同様に、Wilson et al. は、Arabidopsis thalianaからα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを単離した（Wilson IB, Rendic D, Freilinger A, Dumic J, Altmann F, Mucha J, Muller S, Hauser MT Cloning and expression of cDNAs encoding α1,3-fucosyltransferase homologues from Arabidopsis thaliana. Biochim Biophys Acta (2001) 1527 : 88-96)。Leiter et al. は、ヤエナリ（mung bean）からα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを単離した（Leiter, H., Mucha, J. Standacher, E., Grimm, R., Glossl, J., Altmann, F. Purification, cDNA cloning, and expression of GDP-L-Fuc : Asn-linked GlcNAc α1,3-fucosyltransferase from mung beans. J. Biol. Chem. (1999) 274 : 21830-21839)。データベース、例えば、NIH GenBankに対するホモロジー・サーチは、いくつかの植物におけるいくつかのＥＳＴクローン及びゲノム配列に相当するヌクレオチド配列を示し、そしてアラビドブシスのα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に類似している。上記の配列に基づき、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主植物からクローニングされ、そしてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制することにより、低下したフコシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物を樹立するために使用されうる。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子発現の抑制は、アンチセンス法、同時抑制法、ＲＮＡ法などにより行うことができる。
【００６８】
あるいは、低下したフコシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物は、化学物質による突然変異誘発、オリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発、タギング法などにより樹立されうる。上記植物においては、異種ポリペプチドをコードする遺伝子とともにガラクトース転移酵素をコードする１以上の糖転移酵素遺伝子の導入及び発現は、ヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを作り、又はヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを分泌することができる。
【実施例】
【００６９】
（実施例）
実施例を用いて本発明を説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、制限するものではない。
【００７０】
１．ヒトβ１−４ガラクトース転移酵素遺伝子のクローニング
β１−４ガラクトース転移酵素（ｈＧＴ）（ＥＣ２．４．１．３８）は、すでにクローン化されており、４００アミノ酸からなる一次構造が明らかにされている（Masri, K.Aら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 657-663 (1988))。
【００７１】
（１）プライマーの作製と鋳型ＤＮＡ
Masri らの報告を参考にし、以下のようなプライマーを作製した。
ｈＧＴ−５Ｅｃｏ：５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＴＣＣＣＴ−３’（配列番号１）
ｈＧＴ−２Ｓａｌ：３’−ＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧ−５’（配列番号２）
ｈＧＴ−７Ｓｐｅ：３’−ＡＣＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＴＡＡ−５’（配列番号３）
ｈＧＴ６Ｓｐｅ：５’−ＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡ−３’（配列番号４）
鋳型ＤＮＡは、Clontech社から購入したヒトゲノムＤＮＡ、ヒト胎盤ｃＤＮＡ、ヒト腎臓ｃＤＮＡを用いた。
【００７２】
（２）ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
（ｉ）ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−５ＥｃｏとｈＧＴ−７Ｓｐｅとをプライマーに用い；および（ii）ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−２ＳａｌとｈＧＴ６Ｓｐｅとをプライマーに用いた、２つの組み合わせで以下の条件でＰＣＲ反応を行い、ｈＧＴをコードする領域を含む０．４kbおよび０．８kbの断片を得た。
【００７３】
（ＰＣＲ反応系）
鋳型ＤＮＡ１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）４μｌ、プライマー（１０pmol）、Ｔａｇポリメラーゼ（宝酒造（株））０．５μｌ（Ｔｕｂポリメラーゼの場合は０．２μｌ）に水を加えて５０μｌとした。
【００７４】
（ＰＣＲ反応条件）
第１段階：サイクル数１、変性（９４℃）５分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。
第２段階：サイクル数３０、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。
第３段階：サイクル数１、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）２分、伸長（７２℃）５分。
【００７５】
得られた２つの断片を組み合わせてｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを構築し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）にサブクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した。図１に、ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミドの構築を示す。得られたｈＧＴ遺伝子の塩基配列を配列番号５に、そして推定されるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００７６】
得られた配列は、Masri ら（上述）に開示のｈＧＴ配列と比較して以下の点で異なっていた。ａ）位置５２８のＡがＧに、位置５６２のＣがＴに、位置１０４７のＡがＧにそれぞれ変わっていたがコードされるアミノ酸に変化はなかった。ｂ）位置６２２から６３０の９塩基が欠失していた。ｃ）得られた上記の０．４kbおよび０．８kbの断片を接続するためにプライマー作製時に位置４０５のＧをＡに、位置４０８のＴをＡにそれぞれ変換した。
【００７７】
なお、ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡには２つの開始コドン（ＡＴＧ）があるが、本実験では、第２番目の開始コドン（位置３７）から翻訳が始まるように設計した。
【００７８】
２．ｈＧＴ遺伝子のタバコ培養細胞への導入
（１）ｈＧＴは大腸菌で活性型として発現することが報告されている（Aoki, D ら、EMBO J., 9, 3171, (1990)およびNakazawa, Kら、J. Biochem. 113, 747 (1993)）。
【００７９】
ｈＧＴをタバコ培養細胞で発現するために、発現用ベクターｐＧＡｈＧＴを図２に示すように構築した。プロモーターとしては、植物細胞内で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いた。選択マーカーにはカナマイシン耐性遺伝子を用いた。ｐＧＡｈＧＴをアグロバクテリウムを介してタバコ培養細胞に導入した。
【００８０】
アグロバクテリウムの形質転換は、Bevan ら、のtriparental mating法（Bevan, M., Nucleic Acid Res., 12, 8711 (1984)）を用いて行った。ｐＧＡ系プラスミド（An. G., Methods Enzymol. 153, 292 (1987))を持つ大腸菌Escherichia coli ＤＨ５α株（ｓｕＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７）（Bethesda Research Laboratories Inc. : Focus 8(2), 9(1986))、およびヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Bevan, M., Nucleic Acid Res., 12, 8711 (1984)）を持つ大腸菌Escherichia coli ＨＢ１０１を、それぞれ１２．５mg／ｌのテトラサイクリン、５０mg／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムAgrobacterium tumefaciens ＥＨＡ１０１株（Elizanbeth, E.H., J. Bacteriol., 168, 1291 (1986)）を、５０mg／ｌのカナマイシン、２５mg／ｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地で２８℃で２晩培養した。各培養液１．５mlをエッペンドルフチューブにとり集菌した後、ＬＢ培地で３回洗浄した。得られた菌体をそれぞれ１００μｌの２×ＹＴ培地に懸濁した後、３種類の菌を混合し、２×ＹＴ寒天培地に塗抹し、２８℃で培養してｐＧＡ系プラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムに接合伝達させた。２日後、２×ＹＴ寒天培地上で一面に増殖した菌体の一部を白金耳でかきとり、５０mg／ｌのカナマイシン、１２．５mg／ｌのテトラサイクリン、２５mg／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。
【００８１】
タバコ培養細胞の形質転換は、An. G., Plant Mol. Bio. Mannual, A3, 1. に記載の方法により行った。テトラサイクリン１２．５mg／ｌを含むＬＢ培地で２８℃で３６時間培養したアグロバクテリウム（ｐＧＡ系のプラスミドを持つＥＨＡ１０１株）と培養４日目のタバコ培養細胞Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow 2（理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター、ジーンバンク室植物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１より細胞株名ＢＹ−２として入手）の懸濁液をそれぞれ１００μｌ、４mlずつシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃に暗所で静置した。２日後シャーレの中の培養液を遠心管に移して遠心分離（１，０００rpm 、５分）により上澄みを除いた。次に新しい培地を入れて遠心分離し、細胞を１５０〜２００mg／ｌのカナマイシン、２５０gmg ／ｌのカルベニシリンの入った改変ＬＳ寒天培地のプレートに塗抹し、２５℃暗黒下で静置した。約２〜３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。さらに２〜３週間後に、カナマイシン、カルベニシリンを加えた改変ＬＳ培地３０mlに移し、継代培養を行った。約１ケ月間選択を繰り返した。得られたいくつかの耐性株の中から無作為に６つの耐性株（ＧＴ１、４、５、６、８、および９）を選択した。
【００８２】
（２）導入されたｈＧＴ遺伝子の確認
得られた耐性株についてＴ−ＤＮＡ中の、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡ−ＮＯＳターミネーターを含む２．２kbの断片がタバコ培養細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていることをサザン解析により確認した。上記の各耐性株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII で消化した後、サザン解析を行った。
【００８３】
タバコ培養細胞からの染色体ＤＮＡの調製は、渡部の方法（渡部格、「クローニングとシーケンス」、植物バイオテクノロジー実験マニュアル、農村分化社）に従って行った。タバコ培養細胞１０mlを液体窒素で凍結し、乳鉢、乳棒を用いて、粉末状になるまで粉砕した。得られた約５ｇの粉末が融解しないうちに、遠心管（４０ml）中で６０℃に予熱した５mlの２×ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド（cetyltrimethylammonium bromide））液に入れてゆっくりよく混ぜ、６０℃で１０分間以上、時々混ぜながら保温した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）５mlを加え、エマルジョンができるまでよく混ぜてから、遠心分離（２，８００rpm 、１５分、室温）した。上層を新しい４０ml容遠心管に移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて抽出操作を繰り返した。得られた上層に１／１０容量の１０％ＣＴＡＢを入れてよく混合した後、遠心分離操作を行った（２，８００rpm 、１５分、室温）。上層を新しい遠心管に移し、１容量の冷イソプロパノールを入れてよく混ぜ、遠心分離（４，５００rpm 、２０分、室温）した。上清液をアスピレータで除いた後、５mlの１Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液を入れ、５５〜６０℃で完全に溶解した。これに、５mlの冷イソプロパノールを入れ、ＤＮＡが見えたら、チップの先に引っかけてエッペンドルフチューブ（８０％冷エタノール入り）に移しリンスした。さらにＤＮＡを７０％エタノールでリンスし、乾燥した沈殿を、適当量のＴＥ緩衝液に溶かし、５μｌのＲＮＡａｓｅＡ（１０mg／ml）を加え、３７℃で１時間反応させた：２×ＣＴＡＢ液の組成；２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、１．４Ｍ塩化ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；１０％ＣＴＡＢ液の組成；１０％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ塩化ナトリウム。
【００８４】
サザン解析は、以下のように行った。
【００８５】
（ｉ）ＤＮＡの電気泳動およびアルカリ変性：得られた染色体ＤＮＡ ４０μｇを制限酵素で完全分解した後、標準的な方法を用い、１．５％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ）を行った。エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影した後、４００mlの０．２５Ｍ ＨＣｌ中で２０分間振とうした後、液を捨て、４００mlの変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）にゲルを浸し、４５分間ゆっくり振とうした。次いで液を捨て、４００mlの中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（pH７．４））を入れて１５分間ゆっくり振とうした後液を捨て、再び中和溶液を４００ml入れて１５分間ゆっくり振とうした。
【００８６】
（ii）トランスファー：電気泳動後のＤＮＡを、２０×ＳＳＣを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーした。トランスファーは１２時間以上行った。プロットしたメンブレンを、室温で、１時間乾燥させた後、５分間ＵＶ固定を行った。２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム。
【００８７】
（iii ）ＤＮＡプローブの調製：ＤＮＡプローブの調製は、Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて行った。エッペンドルフチューブに次の反応液を調製し、９５℃、３分間加熱後、氷中で急冷した；鋳型ＤＮＡ ２５ng、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ２μｌ、水を加えて５μｌとする。１０×緩衝液、ｄＮＴＰをそれぞれ１．５μｌ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１．８５ＭＢｑ、５０mCi ）を５μｌ加え、Ｈ2 Ｏで２４μｌにフィルアップした。Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ １μｌを加え、３７℃で１０分間保温した後、ＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で溶出させてＤＮＡを精製した。９５℃で３分間加熱した後、氷中で急冷し、ハイブリダイゼーションブローブとした。
【００８８】
（iv）ハイブリダイゼーション：０．０５mg／ml ０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを、以下のプレハイブリダイゼーション溶液に加えて、上記（ii）のメンブレンを浸漬し、４２℃で２時間以上プレハイブリダイゼーションを行った。その後、（iii ）で調製したＤＮＡプローブを加え、４２℃で１２時間以上ハイブリダイゼーションを行った：プレハイブリダイゼーション溶液の組成；５×ＳＳＣ、５０mMリン酸ナトリウム、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液を希釈して使用）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。１００×デンハルト溶液の組成：２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌ ４００、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。
【００８９】
（ｖ）オートラジオグラフィー：以下の順で洗浄した後、標準的な方法によりオートラジオグラフィーを行った。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、２回、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、１回。
【００９０】
上記で得られた耐性株のそれぞれから調製したゲノムＤＮＡのサザン分析の結果を図３に示す。図３に示されるように、ＧＴ１、６、８および９の４株についてｈＧＴ遺伝子が組み込まれていることが確認された。
【００９１】
３．ガラクトシルトランスフェラーゼ形質転換体が分泌する糖タンパク質の解析
（タバコ培養細胞ＧＴ６株細胞外分泌糖タンパク質の調製）
Murashige-Skoog 培地用混合塩類（和光純薬）を用いて調製した改変Murashige-Skoog 培地で、７日間培養したタバコ培養細胞ＧＴ６株の培養液を、室温で２，０００rpm で１０分間遠心分離し、得られた上清をＧＴ６株培養液として回収し、本実施例に用いた。得られた上清を、ｄＨ2 Ｏ（脱イオン水）に対し透析し（１×１０5 倍希釈）、凍結乾燥した。
【００９２】
（Ｎ結合型糖鎖の調製）
凍結乾燥して得たサンプルを１００℃で１０時間ヒドラジン分解することにより、糖鎖の切り出しを行った。ヒドラジン分解物に過剰のアセトンを加え４℃、１０，０００rpm で２０分間遠心分離することで糖鎖を沈殿させた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および無水酢酸存在下で糖鎖をＮアセチル化した後、Ｄｏｗｅｘ ５０×２（室町化学工業）を用いて脱塩処理し、０．１Ｎアンモニア水で平衡化したSephadex G-25 super fineゲル濾過カラム（１．８×１８０cm）で通すことで、Ｎ結合型糖鎖を回収した。
【００９３】
（ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖の調製）
回収したＮ結合型糖鎖を２アミノピリジンを用いてＰＡ化した。ＰＡ化試料を３％酢酸水溶液で平衡化したSephadex G-25 super fineゲル濾過カラム（１．８×１８０cm）に通すことで、ＰＡ化糖鎖を精製した。
【００９４】
（ＨＰＬＣによるＰＡ化糖鎖の分画と解析）
ＰＡ化糖鎖構造は、reversed-phase（ＲＰ）およびsize-fractionation (ＳＦ）ＨＰＬＣの利用、エキソグリコシダーゼ消化による二次元糖鎖マッピング、そしてＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで解析した。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析では、Jasco 821-FP Intelligent Spectrofluorometer を持つJasco 880-PU HPLC を用い、励起および蛍光波長を各々３１０nm、３８０nmとして蛍光強度を測定した。
【００９５】
Cosmosil 5C18-P column (６×２５０mm；ナカライテスク）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、流速１．２ml／min の下で０．０２％ ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を、４０分間で０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出させた。また、Asahipak NH2P-50 column （４．６×２５０mm；昭和電工）を用いたＳＦ−ＨＰＬＣ分析では、流速０．７ml／min の下でｄＨ2 Ｏ−アセトニトリル混合液中のアセトニトリル濃度を、２５分間で２６％から５０％に上昇させることでＰＡ化糖鎖を溶出させた。
【００９６】
（エキソグリコシダーゼ消化によるＰＡ化糖鎖の解析）
βガラクトシダーゼ（Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各ＰＡ化糖鎖を５mUのβガラクトシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）の下で、３７℃で２日間反応させた。同様に、Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各ＰＡ化糖鎖を５mUのＮアセチルグルコサミニダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）の下で、３７℃で２日間反応させた。また、αマンノシダーゼ（Jack bean; Sigma）酵素消化反応については、１０mM酢酸亜鉛および１０μＵのαマンノシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH３．８８）の下で、３７℃で２日間反応させた。各酵素消化反応は１００℃で３分間煮沸することで停止させ、１２，０００rpm で１０分間遠心した後、上清をＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知の糖鎖の溶出時間と比較した。
【００９７】
（ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析）
ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Perkin-Elmer Sciex API-III triple-quadrupole mass spectrometerを用いて行った。スキャンは０．５Da間隔で行った。
【００９８】
（インビトロにおけるシアル酸転移酵素反応）
上述した様に、透析後、凍結乾燥したＧＴ６株細胞培養液由来糖タンパク質を基質として用いた。１mg／ml ＢＳＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５４、２μＭ ＣＭＰ−シアル酸、６mU α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ラット肝臓由来）（和光純薬）および４００μｇ ＧＴ６株細胞培養液由来糖タンパク質を含む６２．５mMカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）の下で、３７℃で５時間シアル酸転移酵素反応を行った。コントロール実験には、基質に４００μｇ ＢＹ２株細胞培養液由来糖タンパク質および４０μｇ胎児アシアロフェツイン（ウシ胎児血清；Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【００９９】
（レクチン染色）
シアル酸転移酵素反応物について１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて１３０Ｖで２時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、１mA／cm2 の定電流下で５０分間ニトロセルロース膜への転移を行った。レクチンブロッティングは、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＳＮＡレクチン（EY Laboratories, Inc.)を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で２００倍希釈して使用した。ブロッティング後、ＰＯＤイムノステインキット（和光純薬）を用いて染色した。
【０１００】
（タバコ培養細胞ＧＴ６株培養液由来ＰＡ化糖鎖の精製）
ＧＴ６株培養液より調製したＰＡ化糖鎖は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＦ−ＨＰＬＣを利用して精製した（それぞれ図４Ａおよび図４Ｂ）。図４Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＰＡ化産物のピークを示す。各ピーク（１〜６）を回収後、それぞれＳＦ−ＨＰＬＣに供した（図４Ｂ）。
【０１０１】
ＳＦ−ＨＰＬＣ分析より得られた６つのピーク（図４ＢにＡ〜Ｆで示される）を除くピークは、Ｎ結合型糖鎖ではなかった。これは、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ｍ／ｚ ２９９．３３（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）およびｍ／ｚ ５０２．５２（ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ）に一致するシグナルが得られなかったことにより確認された。また、ピーク（Ａ〜Ｆ）について解析したＮ結合型糖鎖の構造を図５に示す。図５中、括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【０１０２】
図５に示されるように、Ａ〜Ｆのいずれも、Ｎ−アセチルグルコサミン残基と結合したガラクトース残基を持つヒト型糖鎖であって、フコース残基を含まず、そしてＢおよびＤを除いてキシロース残基を持っていない。
【０１０３】
（タバコ培養細胞ＧＴ６培養液由来ＰＡ化糖鎖の構造解析）
上記ピークＡ（図６のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析から求めた分子量（ｍ／ｚ １３５４．８）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３５４．２７）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １１９２．５、ｍ／ｚ ９９０．５、ｍ／ｚ ８２７．５、ｍ／ｚ ６６５．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（２９９．３３）であると推定され、ピークＡはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１０４】
上記ピークＡからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図６に示すII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図６に示すIII ）であった。
【０１０５】
上記ピークＢ（図７のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析から求めた分子量（ｍ／ｚ １４８６．８）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１４８６．３８）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １３５４．５、ｍ／ｚ １３２４．０、ｍ／ｚ １１２２．０、ｍ／ｚ ９９１．５、ｍ／ｚ ９６０．０、ｍ／ｚ ６６６．０、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３５４．２７）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３２４．２４）、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１１２１．０５）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（９５８．９１）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（２９９．３３）であると推定され、ピークＢはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１０６】
上記ピークＢからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図７のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図７のIII ）であった。
【０１０７】
上記ピークＣ（図８のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １３５５．０）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３５４．２７）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １１９３．５、ｍ／ｚ ９８９．０、ｍ／ｚ ８２７．０、ｍ／ｚ ６６５．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ｍ／ｚ ２９９．３３）であると推定され、ピークＣはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１０８】
上記ピークＣからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図８のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図８のIII ）であった。
【０１０９】
上記ピークＤ（図９のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １４８７．０；図１０のＡ）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １４８６．３８）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １３５４．０、ｍ／ｚ １３２５．０、ｍ／ｚ １１９１．０、ｍ／ｚ １１２１．５、ｍ／ｚ ９８９．５、ｍ／ｚ ８２８．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．５は、各々、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３５４．２７）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３２４．２４）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１２１．０５）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ８２６．８０）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ｍ／ｚ ２９９．３３）であると推定され、ピークＤはこれらの構造を含むことが示唆された（図１０のＢ）。
【０１１０】
上記ピークＤからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図９のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図９のIII ）であった。
【０１１１】
上記ピークＥ（図１１のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １５１６．６）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１５１６．４１）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １３５５．０、ｍ／ｚ １１９３．０、ｍ／ｚ ９９０．０、ｍ／ｚ ８２６．５、ｍ／ｚ ６６５．０、ｍ／ｚ ５０３．５、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３５４．２７）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ｍ／ｚ ２９９．３３）であると推定され、ピークＥはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１１２】
上記ピークＥからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１１のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１１のIII ）であった。
【０１１３】
上記ピークＦ（図１２のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １６７９．８）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１６７８．５５）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １５１７．５、ｍ／ｚ １３１３．５、ｍ／ｚ １１５２．０、ｍ／ｚ ８２７．５、ｍ／ｚ ６６５．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１５１６．４１）、Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３１３．２２）、Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１１５１．０８）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（２９９．３３）であると推定され、ピークＦはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１１４】
上記ピークＦからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１２のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１２のIII ）であった。
【０１１５】
これらの結果を考慮すると、ピークＡ又はＣは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３−ＰＡ）もしくは〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〕〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３−ＰＡ）のいずれかであると考えられる。
【０１１６】
また、ピークＢあるいはＤは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３Ｘ−ＰＡ）又は〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〕〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３Ｘ−ＰＡ）のいずれかであると考えられる。
【０１１７】
また、ピークＥは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ４−ＰＡ）又はα−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ４−ＰＡ）のいずれかであると考えられる。
【０１１８】
そして、ピークＦは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ５−ＰＡ）であると推定される。
【０１１９】
（インビトロにおけるシアル酸転移酵素反応）
ＧＴ６株培養液由来糖タンパク質、ＢＹ２株培養液由来糖タンパク質およびアシアロフェツインを基質として、インビトロシアル酸転移酵素反応を行った。それぞれの反応物を、ニトロセルロース膜への転移後、レクチン染色を行った結果、基質がアシアロフェツイン（図１３、レーン１）、およびＧＴ６株培養液由来糖タンパク質（図１３、レーン２）のレクチン染色は陽性であった。一方、ＢＹ２株培養液由来糖タンパク質（図１３、レーン３）のレクチン染色は陰性であった。このことから、タバコ培養細胞ＧＴ６株培養液由来糖タンパク質糖鎖は、シアル酸転移酵素反応の基質となることが示された。
【０１２０】
（比較例）
（非形質転換体ＢＹ２株培養細胞が分泌する糖タンパク質の解析）
（細胞外分泌糖タンパク質の調製）
ＧＴ６株の代わりにＢＹ２株を用いたことを除いて、上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により、凍結乾燥した培養上清サンプルを得た。
【０１２１】
（Ｎ結合型糖鎖の調製）
Sephadex G-25 super fineゲル濾過カラム（１．８×１８０cm）の代わりに、TSK gel TOYO PERAL HW-40 (TOSOH)ゲル濾過カラム（２．５×３０cm）を用いたことを除いて、上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により、Ｎ結合型糖鎖を回収した。
【０１２２】
（ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖の調製）
回収したＮ結合型糖鎖を２アミノピリジンを用いてＰＡ化した。ＰＡ化試料を０．１Ｎアンモニア水溶液で平衡化したTSK gel TOYO PERAL HW-40 (TOSOH)ゲル濾過カラム（２．５×３０cm）に通すことで、ＰＡ化糖鎖を精製した。
【０１２３】
（ＨＰＬＣによるＰＡ化糖鎖の分画と解析）
Jasco 821-FP Intelligent Spectrofluorometerを持つJasco 880-PU HPLCの代わりに、HITACHI FL Detector L-7480を持つHITACHI HPLCシステムを用いたことを除いて、上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により、ＰＡ化糖鎖を分画および解析した。
【０１２４】
（エキソグリコシダーゼ消化によるＰＡ化糖鎖の解析）
Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各ＰＡ化糖鎖を３mUのＮアセチルグルコサミニダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH ５．４５）の下で、３７℃で２日間反応させた。また、αマンノシダーゼ（Jack bean; Sigma）酵素消化反応については、１０mM酢酸亜鉛および１０μＵのαマンノシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．０）の下で、３７℃で２日間反応させた。各酵素消化反応は１００℃で３分間煮沸することで停止させ、１２，０００rpm で１０分間遠心した後、上清をＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知の糖鎖の溶出時間と比較した。
【０１２５】
（ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析）
上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により行った。
【０１２６】
（ＢＹ２株培養液由来ＰＡ化糖鎖の精製）
ＢＹ２培養液より調製したＰＡ化糖鎖もまた、ＲＰ−およびＳＦ−ＨＰＬＣを利用して精製した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。図１４Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＰＡ化産物のピークを示している。各フラクション（Ｉ〜Ｘ）を回収後、それぞれＳＦ−ＨＰＬＣに供した（図１４Ｂ）。
【０１２７】
図１４Ａに示すフラクション（Ｉ、II、III ）は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析においてＮ結合型糖鎖を検出できなかった。これは、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ｍ／ｚ ２９９．３３（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）およびｍ／ｚ ５０２．５２（ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ）に一致するシグナルが得られなかったことによる。フラクションIVからＸまでのピークをさらにＳＦ−ＨＰＬＣ分析すると２１のピークが得られた（図１４Ｂ）。解析したＮ結合型糖鎖の構造を、図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。
【０１２８】
（ＢＹ２株培養液由来ＰＡ化糖鎖の構造解析）
図１４Ｂに示すピークＶ−４、VII −３およびVIII−４のＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、分子量（ｍ／ｚ）は、それぞれ、１６３９．０、１４７６．５、１３１４．５で、ＳＦ−ＨＰＬＣの溶出位置とを考え併せると、個々のピークに存在する糖鎖構造は、ＰＡ化高マンノース糖鎖Ｍａｎ7 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ、Ｍａｎ6 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡおよびＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡに一致した（データ示さず）。
【０１２９】
また、個々のピークの糖鎖のα−マンノシダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析の結果、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ１）と一致した（データ示さず）。また、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてＭａｎ7 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡのアイソマーＭ７Ａ、Ｍ７Ｂ、およびＭ７Ｄと比較すると、ピークＶ−４はＭ７Ａと溶出位置が一致した。Ｍａｎ6 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡのアイソマーＭ６Ｂ、Ｍ６Ｃでは、ピークVII −３はＭ６Ｂと一致し、Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡのアイソマーＭ５ＡとピークVIII−４は一致した。
【０１３０】
これらのデータから、図１４Ｂに示すピークＶ−４、VII −３およびVIII−４は、図１５Ａに示すように、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ７Ａ）、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ６Ｂ）、およびα−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ５Ａ）であった。図中の括弧内に示される数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【０１３１】
図１４Ｂに示すピークIV−１およびＶ−１のＩＳ−ＭＳ分析から求めた分子量（ｍ／ｚ １２６７．５）は、Ｍａｎ3 ＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３ＦＸ；１２６７．１９）の計算値に一致した。また、ＨＰＬＣの溶出位置は、２次元糖鎖マップ上で完全にＭ３ＦＸ標準品に一致した。さらに、個々のピークの糖鎖のαマンノシダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ＭａｎＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＦＸ；９４２．９１）の計算値に一致した（図１７のＡおよびＢ）。
【０１３２】
これらのデータから図１４Ｂに示されるピークIV−１およびＶ−１は、それぞれ、図１５Ｂに示すように、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−〔α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）〕ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ３ＦＸ）であった。
【０１３３】
図１４Ｂに示されるピークVII −２のＩＳ−ＭＳの分析結果より、分子量（ｍ／ｚ １４１７．０）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＧＮＭ３ＦＸ；１４７０．３８）の計算値に一致した。ピークの糖鎖のＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３ＦＸ；１２６７．１９）と一致し、さらにα−マンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭａｎＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＦＸ；９４２．９１）に一致した（図１７のＣ〜Ｅ）。また、ピークVII −２のＲＰ−ＨＰＬＣの溶出位置（図１６のＤ−２）は、２次元糖鎖マップ上で、完全に、ＧＮ1 Ｍ３ＦＸ、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−〔α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）〕ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（図１６のＤ−１）標準品に一致した。
【０１３４】
これらのデータからピークVII −２は、図１５Ｂに示すように、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−〔α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）〕ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３ＦＸ）であった。
【０１３５】
図１４Ｂに示されるピークVII −１およびVIII−３の分子量（ｍ／ｚ １３２４．０）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＧＮＭ３Ｘ；１３２４．２４）の計算値に一致した。ピークVII −１の糖鎖のＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３Ｘ；１１２１．０５）と一致し（図１８ＡのＢ）、さらにαマンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭａｎＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＸ；７９６．７７）に一致した（図１８ＡのＣ）。ＧＮＭ３Ｘの構造として２つのアイソマー型が考えられる。即ち、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）とβ−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）である。ＯＤＳカラム上では、ＧＮ1 Ｍ３Ｘが、ＧＮ1 Ｍ３Ｘよりも先に溶出することが報告されている。ピークVII −１およびVIII−３の溶出位置を考慮すると、図１５Ｂに示すように、ピークVII −１は、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）、ピークVIII−３は、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）であった。
【０１３６】
図１４Ｂに示されるピークＸ−１のＨＰＬＣの溶出位置は、２次元糖鎖マップ上で完全に標準ＧＮ２Ｍ３（１３９５．３２）に一致した。ピークの糖鎖のＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３；９８８．９４）と一致し、さらにα−マンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析で、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ１；６６４．６６）に一致した（データ示さず）。これらのデータからピークＸ−１は、図１５Ａおよび図１５Ｂに示すように、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ２Ｍ３）であった。
【０１３７】
図１４Ｂに示されるピークＸ−２の分子量（ｍ／ｚ １５２９．５）は、ＧｌｃＮＡｃ2 Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＧＮ２Ｍ３Ｘ；１５２７．４３）の計算値に一致した。また、ＨＰＬＣの溶出位置は、２次元糖鎖マップ上で完全にＭ３ＦＸ標準品に一致した。さらに、このピークの糖鎖のαマンノシダーゼ消化物は、ＨＰＬＣ分析で溶出位置が変化することがなかった。しかし、Ｎアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３Ｘ；１１２１．０５）と一致し（図１８ＢのＢ）、さらにα−マンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭａｎＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＸ；７９６．７７）に一致した（図１８ＡのＣ）。これらのデータから、ピークＸ−２は、図１５Ｂに示すように、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ２Ｍ３Ｘ）であった。
【０１３８】
図１４Ｂに示される他のピークIV−２、IV−３、Ｖ−２、Ｖ−３、Ｖ−５、VI−１、VI−２、VI−３、VI−４、VIII−２、IXは、Ｎ結合型糖鎖ではなかった。その理由は、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ｍ／ｚ ２９９．３３（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）およびｍ／ｚ ５０２．５２（ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ）に一致するシグナルが得られなかったことによる。
【０１３９】
４．ホース・ラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の分泌
外来遺伝子、すなわち、３５Ｓ−Ｃｌａ（Kawaoka et al., J. Ferment. Bioeng., 78, 49-53 (1994))から得られたホース・ラディシュ・ペルオキシダーゼ遺伝子を、ベクターｐＢＩ １０１ ＨｍＢ（Akama et al., Plant Cell Rep. 12, 7-11 (1992))のＨｉｎｄIII とＳａｃＩ部位に挿入し、そしてＧＴ６株内に導入した。Ｇ６株の得られたクローン（ＧＴ−ＨＲＰ−５、ＧＴ−ＨＲＰ−１９）を培養した後、上清を回収し、そして標準的な等電点電気泳動に供した。結果として、図１９に示すように、ＨＲＰのpI ７．８の電気泳動バンドが、クローンＧＴ−ＨＲＰ−５、ＧＴ−ＨＲＰ−１９の上清中に検出され、そしてこのことにより、外来タンパク質も、ＧａｌＴ遺伝子により形質転換された植物細胞から分泌されたことを確認した。さらに図２０は、上述のように、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離された、クローンＧＴ−ＨＲＰ−５により分泌されたタンパク質のレクチン染色の結果を示す。ＲＣＡ１２０染色は、ＧＴ−ＨＲＰ−５が陽性シグナルをもつことを示し（図２０（Ｃ））、そしてそれゆえ、分泌されたＨＲＰが、ガラクトースが付加された糖鎖構造をもっていたことが示された。
【０１４０】
産業上の利用可能性
本発明により、植物細胞によるヒト型糖鎖を持つ異種糖タンパク質の分泌生産方法、この糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、およびこの植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質が提供される。本発明のヒト型の糖鎖を持つ糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖を持つために、抗原性を有さない。それゆえ、ヒトを含む動物への投与のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ｈＧＴのクローニングの方法の模式図である。
【図２】ｈＧＴ発現用ベクターｐＧＡｈＧＴの構築方法の模式図である。
【図３】形質転換体タバコ培養細胞のゲノムのサザン解析を示す写真である。図３（Ａ）は、ゲノムＤＮＡ（４０μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消化し、そしてその後に電気泳動を行なったときの結果を示す。左側の数字はＤＮＡ分子量マーカーの位置を表す。図３（Ｂ）は、各形質転換体に組み込まれた、プロモーター、ｈＧＴ、ターミネーターを含む２．２kbの断片の模式図を示す。
【図４Ａ】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図４Ｂ】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図５】ＧＴ６株培養液中に分泌された糖タンパク質の糖鎖の構造およびその分析結果を示す図である。図中に示される括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【図６】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図７】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図８】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図９】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１０】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖のＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。ＢはＡの部分拡大図である。
【図１１】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１２】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１３】ＧＴ６株培養液由来糖タンパク質、ＢＹ２株培養液由来糖タンパク質およびアシアロフェツインを基質として、インビトロシアル酸転移酵素反応を行った結果を示す図である。
【図１４Ａ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１４Ｂ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１５Ａ】ＧＴ６株培養液中に分泌された糖タンパク質の糖鎖の構造およびその分析結果を示す図である。図中に示される括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【図１５Ｂ】ＧＴ６株培養液中に分泌された糖タンパク質の糖鎖の構造およびその分析結果を示す図である。図中に示される括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【図１６】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１７】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１８Ａ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１８Ｂ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１９】等電点電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。培養されたタバコ細胞の消耗培地中のタンパク質を、等電点電気泳動により分析し、そしてペルオキシダーゼ活性のために染色した。野生型はＢＹ２株を意味する。ＷＴ−ＨＲＰは、ＨＲＰによるＢＹ２株の形質転換体を意味する。ＧＴ−ＨＲＰは、ＨＲＰ遺伝子によるＧＴ６株の形質転換体を意味する。
【図２０】トランスジェニック培養タバコ細胞の消耗培地中のタンパク質のレクチン染色結果を示す図面に代わる写真である。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、そしてクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue)（Ａ）により染色し、又はニトロセルロース膜に転写し、そしてＣｏｎＡ（Ｂ）、とＲＣＡ１２０（Ｃ）により処理した。野生型は、ＢＹ２株を意味する。ＷＴ−ＨＲＰ−２は、ＨＲＰ遺伝子によるＢＹ２株の形質転換体の中の１を意味する。ＧＴ−ＨＲＰ−５は、ＨＲＰ遺伝子によるＧＴ６株の形質転換体の中の１を意味する。
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、植物細胞によるヒト型糖鎖を持つ異種糖タンパク質の分泌生産方法、上記糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、および上記植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
植物培養細胞を用いた外来タンパク質の製造が行われている。例えば、タバコ培養細胞を用い以下のヒト有用タンパク質の製造が試みられている：
ＧＭ−ＣＳＦ（James EA, Wang C, Wang Z, Reeves R, Shin JH, Magnuson NS, Lee JM, Production and characterization of biologically active human GM-CSF secreted by genetically modified plant cells. Protein Expr Purif. 19, 131-138 (2000)）、ＩＬ−２およびＩＬ−４（Magnuson NS, Linzmaier PM, Reeves R, An G, HayGlass K, Lee JM, Secretion of biologically active human interleukin-2 and interleukin-4 from genetically modified tobacco cells in suspension culture. Protein Expr Purif. 13, 45-52 (1998)）、免疫グロブリン（Magnuson NS, Linzmaier PM, Gao JW, Reeves R, An G, Lee JM, Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells. Protein Expr Purif. 7, 220-228 (1996)）、エリスロポエチン（Matsumoto S, Ishii A, Ikura K, Ueda M, Sasaki R, Expression of human erythropoietin in cultured tobacco cells, Biosci. Biotechnol. Biochem. 57, 1249-1252 (1993)）、α１−アンチトリプシン（Terashima M, Murai Y, Kawamura M, Nakanishi S, Stoltz T, Chen L, Drohan W, Rodriguez RL, Katoh S, Production of functional human alpha 1-antitrypsin by plant cell culture. Appl Microbiol Biotechnol. 52, 516-523 (1999)）など。
【０００３】
その一方、植物培養細胞は、多くのタンパク質あるいは糖タンパク質を分泌することが報告されている（Sturm A, Heterogeneity of the complex N-linked oligosaccharides at specific glycosylation sites of two secreted carrot glycoproteins Eur J Biochem. 199, 169-179 (1991); Okushima Y, Koizumi N, Kusano T, Sano H, Secreted proteins of tobacco cultured BY2 cells: identification of a new member of pathogenesis-related proteins. Plant Mol Biol. 42, 479-488 (2000)；およびOkushima Y, Koizumi N, Kusano T, Sano H, Glycosylation and its adequate processing is critical for protein secretion in tobacco BY2 cells. J. Plant Physiolo. 154, 623-627 (1999)）。なかでも、タバコＢＹ２株培養細胞では、２種のペルオキシダーゼが精製され、それらの遺伝子がクローニングされている（Narita H, Asaka Y, Ikura K, Matsumoto S, Sasaki R, Isolation, characterization and expression of cationic peroxidase isozymes released into the medium of cultured tobacco cells. Eur J Biochem. 228, 855-862 (1995)）。培地にポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を添加することにより、培地に分泌されたタンパク質濃度を上昇させることができること（Magnuson NS, Linzmaier PM, Gao JW, Reeves R, An G, Lee JM, Enhanced recovery of a secreted mammalian protein from suspension culture of genetically modified tobacco cells, Protein Expr Purif. 7, 220-228 (1996))、また、Okushima Yら（1999、前述）により、タバコＢＹ２株培養細胞では、数百種ものタンパク質が細胞外に分泌されていることが報告されている。さらにこれらの中には高マンノース型糖鎖を認識するレクチン（コンカナバリンＡ）と反応したことから多くの糖タンパク質が細胞外に分泌されていることが確認されている（Okushima Yら（1999）、前述）。
【０００４】
上記のような植物細胞内で生産させた糖タンパク質（特に免疫グロブリン、インターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ）は、それら自身の持つシグナルペプチドが植物細胞内の分泌機構においても認識され、そして培養液中に分泌された（James EAら、前述；Magnuson NSら（1998）、前述；Magnuson NSら（1996）、前述）。これらのいずれの糖タンパク質も、その糖鎖が、血中半減期、タンパク質分解酵素への感受性、および安定性に関与することが示唆されているが、実際に植物細胞内で生産され、そして精製された組換えタンパク質の糖鎖構造は調べられておらず、これらは、植物型糖鎖構造をもつと推測される。
【０００５】
タバコ植物体で生産された分泌型抗体分子ｓＩｇＡの糖鎖構造解析では植物型糖鎖を持つことが明らかにされた（Cabanes-Macheteau M, Fitchette-Laine AC, Loutelier-Bourhis C, Lange C, Vine ND, Ma JK, Lerouge P, Faye L, N-Glycosylation of a mouse IgG expressed in transgenic tobacco plants. Glycobiology. 9, 365-372 (1999)）。また、同じくタバコ植物体で別の抗体分子を生産させた場合、細胞内で生産された抗体タンパク質は、タンパク質分解酵素による分解を受け、不安定であった（Stevens LH, Stoopen GM, Elbers IJ, Molthoff JW, Bakker HA, Lommen A, Bosch D, Jordi W, Effect of climate conditions and plant developmental stage on the stability of antibodies expressed in transgenic tobacco. Plant Physiol. 124, 173-182 (2000)）。この抗体には植物型糖鎖が付加していることが、抗植物型糖鎖抗体を用いたウェスタン法により確認された。ヒトやマウスなどで生産された抗体分子の糖鎖に存在するβ１，４−結合したガラクトース残基が、抗体タンパク質の安定化に寄与していることが報告されているが、植物細胞で生産された抗体分子にはこの糖残基が存在しない。このため、タバコ植物体で生産された抗体はタンパク質分解酵素による分解を受けやすくなったと考えられている。
【０００６】
エリスロポイエチンをタバコ培養細胞で生産させた場合、インビトロでの生物学的活性は認められたが、インビボでの活性を検出できなかった（Matsumoto S, Ikura K, Ueda M, Sasaki R Characterization of a human glycoprotein (erythropoietin) produced in cultured tobacco cells. Plant Mol Biol. 27, 1163-1172 (1995))。これもまた、糖鎖が生物学的活性に大きく関わっているエリスロポイエチンが、植物細胞で生産された場合に糖鎖構造が大きく異なることが原因であると結論付けられた。
【０００７】
一方、植物型糖鎖はヒトを含む哺乳類動物においてアレルゲンとなる可能性も示唆されている。すなわち、哺乳類の糖タンパク質糖鎖に見られない植物特有の糖鎖構造β１，２−キシロースあるいはα１，３−フコースがアレルゲンとなることが報告されている（Fotisch K, Altmann F, Haustein D, Vieths S, Involvement of carbohydrate epitopes in the IgE response of celery-allergic patients. Int Arch Allergy Immunol. 120, 30-42 (1999)；Wilson IB, Harthill JE, Mullin NP, Ashford DA, Altmann F, Core alphal, 3-fucose is a key part of the epitope recognized by antibodies reacting against plant N-linked oligosaccharides and is present in a wide variety of plant extracts. Glycobiology. 8, 651-661 (1998)；およびvan Ree R, Cabanes-Macheteau M, Akkerdaas J, Milazzo JP, Loutelier-Bourhis C, Rayon C, Villalba M, Koppelman S, Aalberse R, Rodriguez R, Faye L, Lerouge P, Beta(1,2)-xylose and alpha(1,3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. J Biol Chem. 2000 Apr. 14；275 (15)：11451-11458）。このため、医療用タンパク質においては、β１，２−キシロースあるいはα１，３−フコースをもたない糖鎖構造であることが所望される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の開示
本発明は、上記従来の課題を解決し、植物細胞において、安定であって、本来の生理活性を保持し、かつアレルゲンとならない糖鎖構造を持つ糖タンパク質を分泌生産する方法、このような糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、およびこの植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究の結果、タバコ培養細胞ＢＹ２株において、ヒト由来ガラクトース転移酵素遺伝子ｃＤＮＡを発現させると、培養外液に分泌されたほとんどの糖タンパク質の糖鎖にガラクトースが付加し、そしてβ１，２−キシロースまたはα１，３−フコースをもたない糖鎖構造を有していたことを発見し、本発明を完成するに至った。従って、この遺伝子組換えタバコ培養細胞を用いて、ヒト由来有用タンパク質を生産させることによって、細胞外液にアレルゲンとならない糖鎖構造をもつ目的タンパク質を分泌させることができる。
【００１０】
本発明は、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法に関する。この方法は、植物細胞に、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および得られた植物細胞を培養する工程を含む。
【００１１】
上記方法において、上記ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖は、非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分をもち得る。
【００１２】
上記方法においては、上記外部糖鎖は、直鎖状構造または分岐状構造を有し得る。
【００１３】
上記方法においては、上記分岐糖鎖部分は、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造であり得る。
【００１４】
上記方法においては、上記糖タンパク質は、フコースまたはキシロースを含まなくともよい。
【００１５】
好ましくは、上記分泌生産方法は、上記植物細胞の培養液を回収する工程をさらに含み得る。
【００１６】
１の実施態様においては、上記分泌生産方法は、インビトロで糖または糖鎖を付加する工程をさらに含み得る。
【００１７】
本発明は、１つの局面で、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、かつ該糖鎖付加機構によって糖鎖を付加されたタンパク質を分泌し得る植物細胞に関し、この糖鎖付加機構は、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖を付加し、上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分をもつ。
【００１８】
本発明はまた、上記の方法によって得られたヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質にも関する。
【００１９】
本発明はまた、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産方法に関し、この方法は、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、およびこの酵素を細胞内小器官で発現させる工程を包含する。
【００２０】
本発明は、さらに、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素のための遺伝子により形質転換された植物細胞であり、ここで、上記酵素が上記植物細胞内に局在し、その結果、上記植物細胞は、ヒト型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を合成することができる、前記植物細胞にも関する。
【００２１】
１の局面においては、上記植物細胞において、前記糖鎖構造は、付加されたガラクトース残基を含む。
【００２２】
１の局面においては、上記植物細胞において、前記糖鎖構造は、β１，２−キシロース又はα１，３−フコースを含まない。
【００２３】
１の局面においては、上記植物細胞において、前記糖鎖構造は、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ2 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、及びＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 から成る群から選ばれる（Ｎ−アセチルグルコサミン）1-2 （マンノース）2-5 （Ｎ−アセチルグルコサミン）2 のＮ結合型糖鎖に付加されたガラクトース残基を含む。
【００２４】
１の局面において、上記植物細胞において、前記酵素は、前記植物内の細胞内小器官内に局在する。
【００２５】
本発明は、さらに、上記植物細胞から再生された植物にも関する。
【００２６】
本発明は、さらに、上記植物から生産された種子にも関する。
【００２７】
本発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を詳細に説明する。
【００２８】
本発明においては、他に特定されない限り、当該分野で公知である、タンパク質の分離および分析法、ならびに免疫学的手法が使用され得る。これらの手法は、市販のキット、抗体、標識物質などを使用して行い得る。
【００２９】
本発明の方法は、ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の生産方法に関する。本明細書において、「ヒト型糖鎖」とは、Ｎ−アセチルグルコサミン残基と結合したガラクトース残基を有する糖鎖をいう。ヒト型糖鎖におけるガラクトース残基は糖鎖の末端であってもよいし、ガラクトース残基のさらに外側にシアル酸残基が結合していてもよい。本発明の糖タンパク質は、ヒト型糖鎖のコア糖鎖部分、分岐糖鎖部分、および末端糖鎖部分からなる１つ以上の部分において、キシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合していないことが好ましく、ヒト型糖鎖のいずれの部分においてもキシロースおよびフコースの少なくとも一方が結合していないことがより好ましく、最も好ましくはヒト型糖鎖中にキシロースおよびフコースのいずれも含まないことがさらにより好ましい。
【００３０】
植物細胞とは、任意の植物細胞であり得る。植物細胞は、培養細胞、培養組織、培養器官、または植物体のいずれの形態であってもよい。好ましくは、培養細胞、培養組織、または培養器官であり、より好ましくは培養細胞である。本発明の生産方法に使用され得る植物種は、遺伝子導入を行い得る任意の植物種であり得る。本発明の生産方法に使用され得る植物種の例としては、ナス科、イネ科、アブラナ科、バラ科、マメ科、ウリ科、シソ科、ユリ科、アカザ科、セリ科の植物が挙げられる。
【００３１】
ナス科の植物の例としては、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ、Ｓｏｌａｎｕｍ、Ｄａｔｕｒａ、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｏｎ、またはＰｅｔｕｎｉａに属する植物が挙げられ、例えば、タバコ、ナス、ジャガイモ、トマト、トウガラシ、ペチュニアなどを含む。
【００３２】
イネ科の植物の例としては、Ｏｒｙｚａ、Ｈｏｒｄｅｎｕｍ、Ｓｅｃａｌｅ、Ｓｃｃｃｈａｒｕｍ、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ、またはＺｅａに属する植物が挙げられ、例えば、イネ、オオムギ、ライムギ、ヒエ、モロコシ、トウモロコシなどを含む。
【００３３】
アブラナ科の植物の例としては、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｗａｓａｂｉａ、またはＣａｐｓｅｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、大根、アブラナ、シロイヌナズナ、ワサビ、ナズナなどを含む。
【００３４】
バラ科の植物の例としては、Ｏｒｕｎｕｓ、Ｍａｌｕｓ、Ｐｙｎｕｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ、またはＲｏｓａに属する植物が挙げられ、例えば、ウメ、モモ、リンゴ、ナシ、オランダイチゴ、バラなどを含む。
【００３５】
マメ科の植物の例としては、Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｖｉｇｎａ、Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ、Ｐｉｓｕｍ、Ｖｉｃｉａ、Ａｒａｃｈｉｓ、Ｔｒｉｆｏｌｉｕｍ、Ａｌｐｈａｌｆａ、またはＭｅｄｉｃａｇｏに属する植物が挙げられ、例えば、ダイズ、アズキ、インゲンマメ、エンドウ、ソラマメ、ラッカセイ、クローバ、ウマゴヤシなどを含む。
【００３６】
ウリ科の植物の例としては、Ｌｕｆｆａ、Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ、またはＣｕｃｕｍｉｓに属する植物が挙げられ、例えば、ヘチマ、カボチャ、キュウリ、メロンなどを含む。
【００３７】
シソ科の植物の例としては、Ｌａｖａｎｄｕｌａ、Ｍｅｎｔｈａ、またはＰｅｒｉｌｌａに属する植物が挙げられ、例えば、ラベンダー、ハッカ、シソなどを含む。
【００３８】
ユリ科に属する植物の例としては、Ａｌｌｉｕｍ、Ｌｉｌｉｕｍ、またはＴｕｌｉｐａに属する植物が挙げられ、例えば、ネギ、ニンニク、ユリ、チューリップなどを含む。
【００３９】
アカザ科の植物の例としては、Ｓｐｉｎａｃｉａに属する植物が挙げられ、例えば、ホウレンソウを含む。
【００４０】
セリ科の植物の例としては、Ａｎｇｅｌｉｃａ、Ｄａｕｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｔａｅｎｉａ、またはＡｐｉｔｕｍに属する植物が挙げられ、例えば、シシウド、ニンジン、ミツバ、セロリなどを含む。
【００４１】
本発明の生産方法に用いられる植物は、好ましくはタバコ、トマト、ジャガイモ、イネ、トウモロコシ、ダイコン、ダイズ、エンドウ、ウマゴヤシ、およびホウレンソウであり、より好ましくは、タバコ、トマト、ジャガイモ、トウモロコシ、およびダイズである。
【００４２】
「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素」とは、植物細胞内の糖タンパク質のタンパク質部分の合成後、糖鎖付加の際に生じる非還元末端アセチルグルコサミン残基へガラクトース残基を転移し得る酵素である。このような酵素の例としては、ガラクトシルトランスフェラーゼ、ラクトースシンターゼ、β−ガラクトシダーゼが挙げられる。このような酵素は、任意の動物種に由来し得るが、哺乳動物に由来することが好ましく、ヒトに由来することがより好ましい。
【００４３】
好ましくは、この酵素は、細胞内小器官に局在化する酵素である。本発明者らは、特定の理論に拘束されることは意図しないが、この酵素が細胞内小器官（例えば、小胞体、ゴルジ体など）に存在することによって、植物細胞において、異種糖タンパク質が発現および分泌される際、フコース残基またはキシロース残基が付加する前に、あるいはフコース残基またはキシロース残基が付加しないように作用すると考えられる。
【００４４】
「非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子」は、この酵素をコードすることが公知のヌクレオチド配列を用いて任意の動物細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４５】
本明細書では、「遺伝子」とは、構造遺伝子部分をいう。遺伝子には、植物での発現に適切なように、プロモーター、オペレーター、およびターミネーターなどの制御配列が連結され得る。
【００４６】
「異種糖タンパク質」とは、本発明に用いられる植物において本来発現されない糖タンパク質をいう。異種糖タンパク質の例としては、酵素、ホルモン、サイトカイン、抗体、ワクチン、レセプター、血清タンパク質などが挙げられる。酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、キナーゼ、グルコセレブロシダーゼ（ｇｌｕｃｏｃｅｒｅｂｒｏｓｉｄａｓｅ）、アルファ−ガラクトシダーゼ、フィターゼ、ＴＰＡ（ｔｉｓｓｕｅ−ｔｙｐｅ ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ）、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）などが挙げられる。ホルモンおよびサイトカインの例としては、エンケファリン、インターフェロンアルファ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、絨毛性性腺刺激ホルモン、インターロイキン−２、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ、エリスロポイエチン、血管内皮細胞増殖因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、プロラクチン、卵胞刺激ホルモンなどが挙げられる。抗体の例としては、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、分泌型ＩｇＡなどが挙げられる。ワクチンの例としては、Ｂ型肝炎表面抗原、ロタウイルス抗原、大腸菌エンテロトキシン、マラリア抗原、狂犬病ウイルスｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓのＧタンパク質、ＨＩＶウイルス糖タンパク質（例えば、ｇｐ１２０）などが挙げられる。レセプターおよびマトリックスタンパク質の例としては、ＥＧＦレセプター、フィブロネクチン、α１−アンチトリプシン、凝固因子VIIIなどが挙げられる。血清タンパク質の例としては、アルブミン、補体系タンパク質、プラスミノーゲン、コルチコステロイド結合グロブリン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、スロキシン結合グロブリン（Ｔｈｒｏｘｉｎｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｇｌｏｂｕｌｉｎ）、プロテインＣ（ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ）などが挙げられる。
【００４７】
「異種糖タンパク質の遺伝子」は、目的の異種糖タンパク質をコードすることが知られるヌクレオチド配列を用いて任意の細胞から単離してもよいし、市販のものを購入してもよいし、これらを植物での発現に適切なように改変して用いてもよい。
【００４８】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素および異種糖タンパク質の遺伝子は、当該分野で公知の方法により、植物細胞へ導入される。これらの遺伝子は、別々に導入してもよいし、同時に導入してもよい。当業者は、遺伝子導入方法の選択が、形質転換に関して標的とされた植物のタイプに依存しうることを理解するであろう。
【００４９】
植物細胞を形質転換するために好適な方法は、マイクロインジェクション（Crossway et al., BioTechniques 4 : 320-334 (1986))、エレクトロポレーション（Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 5602-5606 (1986)、アグロバクテリウム仲介形質転換（Hinchee et al., Biotechnology 6 : 915-921 (1988)；メイズの形質転換については、Ishida et al., Nature Biotechnology 14 : 745-750 (June 1996)をも参照のこと、直接遺伝子移入（Paszkowski et al., EMBO J. 3 : 2717-2722 (1984); Hayashimoto et al., Plant Physiol 93 : 857-863 (1990)（イネ））、及びAgracetus, Inc., Madison, Wis. 及びDupont, Inc., Wilmington, Del.から入手可能な装置を使用した弾道粒子加速（例えば、Sanford et al., 米国特許第4,945,050号；及びMcCabe et al., Biotechnology 6 : 923-926 (1988)を参照のこと）を含む。
【００５０】
また、Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22 : 421-477 (1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5. 27-37 (1987)(タマネギ); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 : 8526-8530 (1990)(タバコ・クロロプラスト）；Christou et al., Plant Physiol. 87 : 671-674 (1988)(ダイズ）；McCabe et al., Bio/Technology 6. 923-926 (1988)(ダイズ）；Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 : 4305-4309 (1988)(メイズ）；Klein et al., Bio/Technology 6 : 559-563 (1988)(メイズ）；Klein et al., Plant Physiol. 91 : 440-444 (1988)(メイズ）；Fromm et al., Bio/Technology 8 :833-839 (1990)；及びGordon-Kamm et al., Plant Cell 2 : 603-618 (1990)(メイズ）；Koziel et al., Biotechnology 11 : 194-200 (1993)(メイズ）；Shimamoto et al., Nature 338 : 274-277 (1989)(イネ）；Christou et al., Biotechnology 9 : 957-962 (1991)(イネ）；Datta et al., Biol/Technology 3 : 736-740 (1990)(イネ）；ヨーロッパ特許出願第EP 0 332 581号（オーチャードグラス、その他のPooideae); Vasil et al., Biotechnology 11 : 1553-1558 (1993)(小麦）；Weeks et al., Plant Physiol. 102 : 1077-1084 (1993)(小麦）；Wan et al., Plant Physiol. 104 : 37-48 (1994)(大麦）；Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89 : 525-533 (1994)(大麦）；Umbeck et al., Bio/Technology 5 : 263-266 (1987)(綿）；Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 : 11212-11216 (December 1993)(モロコシ）；Somers et al., Bio/Technology 10 : 1589-1594 (December 1992)(オート）；Torbert et al., Plant Cell Reports 14 : 635-640 (1995)(オート）；Weeks et al., Plant Physiol. 102 : 1077-1084 (1993)(小麦）；Chang et al., WO 94/13822 (小麦）及びNehra et al., The Plant Journal 5 : 285-297 (1994)(小麦）をも参照のこと。
【００５１】
マイクロインジェクタイル・ボンバードメントによるメイズ内への組換えＤＮＡ分子の導入のために特に好ましい一連の態様は、Koziel et al., Biotechnology 11 : 194-200 (1993), Hill et al., Euphytica 85 : 119-123 (1995)及びKoziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792 : 164-171 (1996)中に見られる。
【００５２】
追加の好ましい態様は、ＥＰ ０ ２９２ ４３５中に開示されているようなメイズのためのプロトプラスト形質転換方法である。植物の形質転換は、単一のＤＮＡ種又は多数のＤＮＡ種を用いて（すなわち、共同（同時）形質転換）、行われることができ、そしてこれらの技術の両者が、ペルオキシダーゼ・コーディング配列を用いた使用に好適である。
【００５３】
上記遺伝子が導入された植物細胞によって発現および分泌される遺伝子産物は、発現および分泌される遺伝子産物に応じて、当該分野で公知の方法により確認され得る。このような確認方法としては、銀染色、ウェスタンブロッティング、ノーザンハイブリダイゼーション、酵素活性の検出などが挙げられる。
【００５４】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素および異種糖タンパク質を発現する形質転換細胞は、ヒト型の糖鎖を有する異種糖タンパク質を発現および分泌する。つまり、このようにして得られた形質転換植物はヒト型の糖鎖付加機構を有し、この形質転換細胞を培養することにより、ヒト型の糖タンパク質が発現され、そして培養液中に大量に分泌され得る。
【００５５】
このヒト型の糖タンパク質は、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、このコア糖鎖は、複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含む。得られる糖タンパク質の外部糖鎖は、非還元末端糖鎖部分を含む。外部糖鎖は、直鎖状構造を持っていても分岐状構造を持っていてもよい。分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造のいずれかであり得る。形質転換細胞により生産される糖タンパク質は、好ましくは、フコースまたはキシロースを含まない。
【００５６】
得られた形質転換植物細胞は、培養細胞の状態で維持されてもよいし、特定の組織または器官へと分化させてもよいし、完全な植物体に再生させてもよい。あるいは、完全な植物体から得られる、種子、果実、葉、根、茎、花などの部分であってもよい。
【００５７】
形質転換植物細胞の培養、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Murashige-Skoog(ＭＳ）培地、Gamborg B5（Ｂ）培地、White培地、Nitsch ＆ Nitsch (Nitsch)培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適用量添加されて用いられる。
【００５８】
異なる植物株への上記系の適用は、プロトプラストからその特定の植物株を再生するその能力による。プロトプラストからの穀草の再生のための例示的な方法は記載されている（Fujimura et al., Plant Tissue Culture Letters, 2 : 74, 1985; Toriyama et al., Theor. Appl. Genet., 73 : 16, 1986; Yamada et al., Plant Cell Rep., 4 : 85, 1986; Abdullah et al., Biotechnology, 4 : 1087, 1986)。
【００５９】
プロトプラストから首尾よく再生することができない植物株を形質転換するために、無傷の細胞又は組織内にＤＮＡを導入するための他の方法が使用されうる。例えば、未成熟胚又は外植体からの穀草の再生は、記載されたように行うことができる（Vasil, Biotechnology, 6 : 397, 1988)。
【００６０】
アグロバクテリウム仲介移入も、植物細胞内に遺伝子を導入するために広く適用されうる系である。なぜなら、ＤＮＡが植物の組織内に導入され、それによりプロトプラストから無傷の植物を再生するための必要性をバイパスするからである。植物細胞内にＤＮＡを導入するためのベクターを組み込むアグロバクテリウム仲介植物の使用は、本分野において周知である。例えば、上述の方法を参照のこと。
【００６１】
ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質の分泌生産のためには、形質転換植物細胞が増殖し、そして所望の遺伝子産物を発現および分泌する限り、基本的には、炭素源、窒素源、およびビタミン類、塩類のような植物細胞の生育に必要な微量栄養素を含む任意の組成の培養培地を用いることができる。分泌した異種タンパク質の安定化、および異種タンパク質の分泌の効率化のために、ポリビニルピロリドン、タンパク質分解酵素阻害剤などを添加してもよい。
【００６２】
形質転換植物細胞により発現および分泌された、ヒト型の糖鎖を持つ糖タンパク質は、典型的には、植物細胞の培養液から単離され得る。植物細胞の培養液からの糖タンパク質の単離は、当業者に周知の方法を用いて実施され得る。例えば、塩析（硫酸アンモニウム沈殿、リン酸ナトリウム沈殿など）、溶媒沈殿（アセトンまたはエタノールなどによる蛋白質分別沈殿法）、透析、ゲル濾過、イオン交換、逆相等のカラムクロマトグラフィー、限外濾過、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の手法を単独で、または組み合わせて用いて、培養液から糖タンパク質を精製して単離し得る。
【００６３】
あるいは、本発明の糖タンパク質は、植物細胞から単離または抽出されてもよい。さらには、本発明の糖タンパク質は、形質転換細胞中に含まれたままの状態で食用に供され得る。本発明の糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖付加を有するので、抗原性を有さず、それゆえ、ヒトを含む動物への投与に適している。
【００６４】
さらに、本発明においては、非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行うことができる酵素の遺伝子により形質転換された植物細胞又は植物体は、β１，２−キシロース転移酵素又はα１，３−フコース転移酵素を失活され又はその活性を抑制されることもできる。
【００６５】
Strasser et al. は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）からβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを単離している（Strasser R, Mucha J, Mach L, Altmann F, Wilson IB, Glossl J, Steinkellner H, Molecular cloning and functional expression of β１，２−キシロシルトランスフェラーゼcDNA from Arabidopsis thaliana. FEBS Lett. (2000) 472 : 105-108）。データベース、例えば、NIH GenBankに対するホモロジー・サーチは、いくつかの植物において、いくつかのＥＳＴクローン及びゲノム配列に相当するヌクレオチド配列を示し、そしてアラビドプシスβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に類似している。これらの配列に基づき、β１，２−キシロシルトランスフェラーゼをコードする核酸を、宿主植物からクローニングし、そしてβ１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制することにより、低下したキシロシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物を樹立するために使用することができる。β１，２−キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子発現の抑制は、アンチセンス法、共同（同時）抑制法、ＲＮＡ；法などにより行いうる。
【００６６】
あるいは、低下したキシロシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物は、化学物質による突然変異誘発、オリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発、タギング法などにより樹立されうる。上記植物においては、異種ポリペプチドをコードする遺伝子とともにガラクトース転移酵素をコードする１以上の糖転移酵素遺伝子の導入及び発現は、ヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを作り又はヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを分泌することができる。
【００６７】
同様に、Wilson et al. は、Arabidopsis thalianaからα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを単離した（Wilson IB, Rendic D, Freilinger A, Dumic J, Altmann F, Mucha J, Muller S, Hauser MT Cloning and expression of cDNAs encoding α1,3-fucosyltransferase homologues from Arabidopsis thaliana. Biochim Biophys Acta (2001) 1527 : 88-96)。Leiter et al. は、ヤエナリ（mung bean）からα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするｃＤＮＡを単離した（Leiter, H., Mucha, J. Standacher, E., Grimm, R., Glossl, J., Altmann, F. Purification, cDNA cloning, and expression of GDP-L-Fuc : Asn-linked GlcNAc α1,3-fucosyltransferase from mung beans. J. Biol. Chem. (1999) 274 : 21830-21839)。データベース、例えば、NIH GenBankに対するホモロジー・サーチは、いくつかの植物におけるいくつかのＥＳＴクローン及びゲノム配列に相当するヌクレオチド配列を示し、そしてアラビドブシスのα１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列に類似している。上記の配列に基づき、α１，３−フコシルトランスフェラーゼをコードする核酸は、宿主植物からクローニングされ、そしてα１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を抑制することにより、低下したフコシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物を樹立するために使用されうる。α１，３−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子発現の抑制は、アンチセンス法、同時抑制法、ＲＮＡ法などにより行うことができる。
【００６８】
あるいは、低下したフコシルトランスフェラーゼ活性をもつ植物細胞又は植物は、化学物質による突然変異誘発、オリゴヌクレオチドを用いた部位指定突然変異誘発、タギング法などにより樹立されうる。上記植物においては、異種ポリペプチドをコードする遺伝子とともにガラクトース転移酵素をコードする１以上の糖転移酵素遺伝子の導入及び発現は、ヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを作り、又はヒト型グリカン構造をもつ異種ポリペプチドを分泌することができる。
【実施例】
【００６９】
（実施例）
実施例を用いて本発明を説明する。以下の実施例は、本発明を例示するものであって、制限するものではない。
【００７０】
１．ヒトβ１−４ガラクトース転移酵素遺伝子のクローニング
β１−４ガラクトース転移酵素（ｈＧＴ）（ＥＣ２．４．１．３８）は、すでにクローン化されており、４００アミノ酸からなる一次構造が明らかにされている（Masri, K.Aら、Biochem. Biophys. Res. Commun., 157, 657-663 (1988))。
【００７１】
（１）プライマーの作製と鋳型ＤＮＡ
Masri らの報告を参考にし、以下のようなプライマーを作製した。
ｈＧＴ−５Ｅｃｏ：５’−ＡＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＡＴＧＣＣＡＧＧＣＧＣＧＣＧＴＣＣＣＴ−３’（配列番号１）
ｈＧＴ−２Ｓａｌ：３’−ＴＣＧＡＴＣＧＣＡＡＡＡＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＴＧ−５’（配列番号２）
ｈＧＴ−７Ｓｐｅ：３’−ＡＣＧＧＧＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＣＧＡＴＧＡＴＣＡＴＡＡ−５’（配列番号３）
ｈＧＴ６Ｓｐｅ：５’−ＡＡＧＡＣＴＡＧＴＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡ−３’（配列番号４）
鋳型ＤＮＡは、Clontech社から購入したヒトゲノムＤＮＡ、ヒト胎盤ｃＤＮＡ、ヒト腎臓ｃＤＮＡを用いた。
【００７２】
（２）ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡのクローニング
（ｉ）ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−５ＥｃｏとｈＧＴ−７Ｓｐｅとをプライマーに用い；および（ii）ヒト胎盤ｃＤＮＡを鋳型とし、ｈＧＴ−２ＳａｌとｈＧＴ６Ｓｐｅとをプライマーに用いた、２つの組み合わせで以下の条件でＰＣＲ反応を行い、ｈＧＴをコードする領域を含む０．４kbおよび０．８kbの断片を得た。
【００７３】
（ＰＣＲ反応系）
鋳型ＤＮＡ１μｌ、１０×ＰＣＲ緩衝液５μｌ、ｄＮＴＰｓ（２００μＭ）４μｌ、プライマー（１０pmol）、Ｔａｇポリメラーゼ（宝酒造（株））０．５μｌ（Ｔｕｂポリメラーゼの場合は０．２μｌ）に水を加えて５０μｌとした。
【００７４】
（ＰＣＲ反応条件）
第１段階：サイクル数１、変性（９４℃）５分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。
第２段階：サイクル数３０、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）１分、伸長（７２℃）２分。
第３段階：サイクル数１、変性（９４℃）１分、アニーリング（５５℃）２分、伸長（７２℃）５分。
【００７５】
得られた２つの断片を組み合わせてｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを構築し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）にサブクローニングした。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ＋（ＳＫ）は、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社から購入した。図１に、ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡを含むプラスミドの構築を示す。得られたｈＧＴ遺伝子の塩基配列を配列番号５に、そして推定されるアミノ酸配列を配列番号６に示す。
【００７６】
得られた配列は、Masri ら（上述）に開示のｈＧＴ配列と比較して以下の点で異なっていた。ａ）位置５２８のＡがＧに、位置５６２のＣがＴに、位置１０４７のＡがＧにそれぞれ変わっていたがコードされるアミノ酸に変化はなかった。ｂ）位置６２２から６３０の９塩基が欠失していた。ｃ）得られた上記の０．４kbおよび０．８kbの断片を接続するためにプライマー作製時に位置４０５のＧをＡに、位置４０８のＴをＡにそれぞれ変換した。
【００７７】
なお、ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡには２つの開始コドン（ＡＴＧ）があるが、本実験では、第２番目の開始コドン（位置３７）から翻訳が始まるように設計した。
【００７８】
２．ｈＧＴ遺伝子のタバコ培養細胞への導入
（１）ｈＧＴは大腸菌で活性型として発現することが報告されている（Aoki, D ら、EMBO J., 9, 3171, (1990)およびNakazawa, Kら、J. Biochem. 113, 747 (1993)）。
【００７９】
ｈＧＴをタバコ培養細胞で発現するために、発現用ベクターｐＧＡｈＧＴを図２に示すように構築した。プロモーターとしては、植物細胞内で構成的に発現するカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター）を用いた。選択マーカーにはカナマイシン耐性遺伝子を用いた。ｐＧＡｈＧＴをアグロバクテリウムを介してタバコ培養細胞に導入した。
【００８０】
アグロバクテリウムの形質転換は、Bevan ら、のtriparental mating法（Bevan, M., Nucleic Acid Res., 12, 8711 (1984)）を用いて行った。ｐＧＡ系プラスミド（An. G., Methods Enzymol. 153, 292 (1987))を持つ大腸菌Escherichia coli ＤＨ５α株（ｓｕＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（φ８０ｌａｃＺΔＭ１５）、ｈｓｄＲ１７）（Bethesda Research Laboratories Inc. : Focus 8(2), 9(1986))、およびヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（Bevan, M., Nucleic Acid Res., 12, 8711 (1984)）を持つ大腸菌Escherichia coli ＨＢ１０１を、それぞれ１２．５mg／ｌのテトラサイクリン、５０mg／ｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ培地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムAgrobacterium tumefaciens ＥＨＡ１０１株（Elizanbeth, E.H., J. Bacteriol., 168, 1291 (1986)）を、５０mg／ｌのカナマイシン、２５mg／ｌのクロラムフェニコールを含む２×ＹＴ培地で２８℃で２晩培養した。各培養液１．５mlをエッペンドルフチューブにとり集菌した後、ＬＢ培地で３回洗浄した。得られた菌体をそれぞれ１００μｌの２×ＹＴ培地に懸濁した後、３種類の菌を混合し、２×ＹＴ寒天培地に塗抹し、２８℃で培養してｐＧＡ系プラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムに接合伝達させた。２日後、２×ＹＴ寒天培地上で一面に増殖した菌体の一部を白金耳でかきとり、５０mg／ｌのカナマイシン、１２．５mg／ｌのテトラサイクリン、２５mg／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布した。２８℃で２日間培養した後、単一コロニーを選択した。
【００８１】
タバコ培養細胞の形質転換は、An. G., Plant Mol. Bio. Mannual, A3, 1. に記載の方法により行った。テトラサイクリン１２．５mg／ｌを含むＬＢ培地で２８℃で３６時間培養したアグロバクテリウム（ｐＧＡ系のプラスミドを持つＥＨＡ１０１株）と培養４日目のタバコ培養細胞Nicotiana tabacum L. cv. bright yellow 2（理化学研究所ライフサイエンス筑波研究センター、ジーンバンク室植物細胞開発銀行のカタログ番号ＲＰＣ１より細胞株名ＢＹ−２として入手）の懸濁液をそれぞれ１００μｌ、４mlずつシャーレに入れてよく混ぜ、２５℃に暗所で静置した。２日後シャーレの中の培養液を遠心管に移して遠心分離（１，０００rpm 、５分）により上澄みを除いた。次に新しい培地を入れて遠心分離し、細胞を１５０〜２００mg／ｌのカナマイシン、２５０gmg ／ｌのカルベニシリンの入った改変ＬＳ寒天培地のプレートに塗抹し、２５℃暗黒下で静置した。約２〜３週間後にカルス化した細胞を新しいプレートに移植し、増殖しているクローンを選択した。さらに２〜３週間後に、カナマイシン、カルベニシリンを加えた改変ＬＳ培地３０mlに移し、継代培養を行った。約１ケ月間選択を繰り返した。得られたいくつかの耐性株の中から無作為に６つの耐性株（ＧＴ１、４、５、６、８、および９）を選択した。
【００８２】
（２）導入されたｈＧＴ遺伝子の確認
得られた耐性株についてＴ−ＤＮＡ中の、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター−ｈＧＴ遺伝子ｃＤＮＡ−ＮＯＳターミネーターを含む２．２kbの断片がタバコ培養細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれていることをサザン解析により確認した。上記の各耐性株からゲノムＤＮＡを調製し、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄIII で消化した後、サザン解析を行った。
【００８３】
タバコ培養細胞からの染色体ＤＮＡの調製は、渡部の方法（渡部格、「クローニングとシーケンス」、植物バイオテクノロジー実験マニュアル、農村分化社）に従って行った。タバコ培養細胞１０mlを液体窒素で凍結し、乳鉢、乳棒を用いて、粉末状になるまで粉砕した。得られた約５ｇの粉末が融解しないうちに、遠心管（４０ml）中で６０℃に予熱した５mlの２×ＣＴＡＢ（セチルトリメチルアンモニウムブロミド（cetyltrimethylammonium bromide））液に入れてゆっくりよく混ぜ、６０℃で１０分間以上、時々混ぜながら保温した。クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）５mlを加え、エマルジョンができるまでよく混ぜてから、遠心分離（２，８００rpm 、１５分、室温）した。上層を新しい４０ml容遠心管に移し、クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を用いて抽出操作を繰り返した。得られた上層に１／１０容量の１０％ＣＴＡＢを入れてよく混合した後、遠心分離操作を行った（２，８００rpm 、１５分、室温）。上層を新しい遠心管に移し、１容量の冷イソプロパノールを入れてよく混ぜ、遠心分離（４，５００rpm 、２０分、室温）した。上清液をアスピレータで除いた後、５mlの１Ｍ塩化ナトリウムを含むＴＥ緩衝液を入れ、５５〜６０℃で完全に溶解した。これに、５mlの冷イソプロパノールを入れ、ＤＮＡが見えたら、チップの先に引っかけてエッペンドルフチューブ（８０％冷エタノール入り）に移しリンスした。さらにＤＮＡを７０％エタノールでリンスし、乾燥した沈殿を、適当量のＴＥ緩衝液に溶かし、５μｌのＲＮＡａｓｅＡ（１０mg／ml）を加え、３７℃で１時間反応させた：２×ＣＴＡＢ液の組成；２％ＣＴＡＢ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH８．０）、１．４Ｍ塩化ナトリウム、１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）；１０％ＣＴＡＢ液の組成；１０％ＣＴＡＢ、０．７Ｍ塩化ナトリウム。
【００８４】
サザン解析は、以下のように行った。
【００８５】
（ｉ）ＤＮＡの電気泳動およびアルカリ変性：得られた染色体ＤＮＡ ４０μｇを制限酵素で完全分解した後、標準的な方法を用い、１．５％アガロースゲル電気泳動（５０Ｖ）を行った。エチジウムブロマイドで染色し、写真撮影した後、４００mlの０．２５Ｍ ＨＣｌ中で２０分間振とうした後、液を捨て、４００mlの変性溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨ）にゲルを浸し、４５分間ゆっくり振とうした。次いで液を捨て、４００mlの中和溶液（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（pH７．４））を入れて１５分間ゆっくり振とうした後液を捨て、再び中和溶液を４００ml入れて１５分間ゆっくり振とうした。
【００８６】
（ii）トランスファー：電気泳動後のＤＮＡを、２０×ＳＳＣを用いてナイロンメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーした。トランスファーは１２時間以上行った。プロットしたメンブレンを、室温で、１時間乾燥させた後、５分間ＵＶ固定を行った。２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ ＮａＣｌ、０．３Ｍクエン酸ナトリウム。
【００８７】
（iii ）ＤＮＡプローブの調製：ＤＮＡプローブの調製は、Ｒａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（宝酒造）を用いて行った。エッペンドルフチューブに次の反応液を調製し、９５℃、３分間加熱後、氷中で急冷した；鋳型ＤＮＡ ２５ng、Ｒａｎｄｏｍ Ｐｒｉｍｅｒ ２μｌ、水を加えて５μｌとする。１０×緩衝液、ｄＮＴＰをそれぞれ１．５μｌ、［α−32Ｐ］ｄＣＴＰ（１．８５ＭＢｑ、５０mCi ）を５μｌ加え、Ｈ2 Ｏで２４μｌにフィルアップした。Ｋｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ １μｌを加え、３７℃で１０分間保温した後、ＮＡＰ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）で溶出させてＤＮＡを精製した。９５℃で３分間加熱した後、氷中で急冷し、ハイブリダイゼーションブローブとした。
【００８８】
（iv）ハイブリダイゼーション：０．０５mg／ml ０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを、以下のプレハイブリダイゼーション溶液に加えて、上記（ii）のメンブレンを浸漬し、４２℃で２時間以上プレハイブリダイゼーションを行った。その後、（iii ）で調製したＤＮＡプローブを加え、４２℃で１２時間以上ハイブリダイゼーションを行った：プレハイブリダイゼーション溶液の組成；５×ＳＳＣ、５０mMリン酸ナトリウム、５０％（ｗ／ｖ）ホルムアミド、５×デンハルト溶液（１００×デンハルト溶液を希釈して使用）、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ。１００×デンハルト溶液の組成：２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、２％（ｗ／ｖ）Ｆｉｃｏｌ ４００、２％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）。
【００８９】
（ｖ）オートラジオグラフィー：以下の順で洗浄した後、標準的な方法によりオートラジオグラフィーを行った。２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、２回、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で１５分間、１回。
【００９０】
上記で得られた耐性株のそれぞれから調製したゲノムＤＮＡのサザン分析の結果を図３に示す。図３に示されるように、ＧＴ１、６、８および９の４株についてｈＧＴ遺伝子が組み込まれていることが確認された。
【００９１】
３．ガラクトシルトランスフェラーゼ形質転換体が分泌する糖タンパク質の解析
（タバコ培養細胞ＧＴ６株細胞外分泌糖タンパク質の調製）
Murashige-Skoog 培地用混合塩類（和光純薬）を用いて調製した改変Murashige-Skoog 培地で、７日間培養したタバコ培養細胞ＧＴ６株の培養液を、室温で２，０００rpm で１０分間遠心分離し、得られた上清をＧＴ６株培養液として回収し、本実施例に用いた。得られた上清を、ｄＨ2 Ｏ（脱イオン水）に対し透析し（１×１０5 倍希釈）、凍結乾燥した。
【００９２】
（Ｎ結合型糖鎖の調製）
凍結乾燥して得たサンプルを１００℃で１０時間ヒドラジン分解することにより、糖鎖の切り出しを行った。ヒドラジン分解物に過剰のアセトンを加え４℃、１０，０００rpm で２０分間遠心分離することで糖鎖を沈殿させた。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および無水酢酸存在下で糖鎖をＮアセチル化した後、Ｄｏｗｅｘ ５０×２（室町化学工業）を用いて脱塩処理し、０．１Ｎアンモニア水で平衡化したSephadex G-25 super fineゲル濾過カラム（１．８×１８０cm）で通すことで、Ｎ結合型糖鎖を回収した。
【００９３】
（ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖の調製）
回収したＮ結合型糖鎖を２アミノピリジンを用いてＰＡ化した。ＰＡ化試料を３％酢酸水溶液で平衡化したSephadex G-25 super fineゲル濾過カラム（１．８×１８０cm）に通すことで、ＰＡ化糖鎖を精製した。
【００９４】
（ＨＰＬＣによるＰＡ化糖鎖の分画と解析）
ＰＡ化糖鎖構造は、reversed-phase（ＲＰ）およびsize-fractionation (ＳＦ）ＨＰＬＣの利用、エキソグリコシダーゼ消化による二次元糖鎖マッピング、そしてＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うことで解析した。ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）分析では、Jasco 821-FP Intelligent Spectrofluorometer を持つJasco 880-PU HPLC を用い、励起および蛍光波長を各々３１０nm、３８０nmとして蛍光強度を測定した。
【００９５】
Cosmosil 5C18-P column (６×２５０mm；ナカライテスク）を用いたＲＰ−ＨＰＬＣ分析では、流速１．２ml／min の下で０．０２％ ＴＦＡ水溶液中のアセトニトリル濃度を、４０分間で０％から６％に増加させることでＰＡ化糖鎖を溶出させた。また、Asahipak NH2P-50 column （４．６×２５０mm；昭和電工）を用いたＳＦ−ＨＰＬＣ分析では、流速０．７ml／min の下でｄＨ2 Ｏ−アセトニトリル混合液中のアセトニトリル濃度を、２５分間で２６％から５０％に上昇させることでＰＡ化糖鎖を溶出させた。
【００９６】
（エキソグリコシダーゼ消化によるＰＡ化糖鎖の解析）
βガラクトシダーゼ（Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各ＰＡ化糖鎖を５mUのβガラクトシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）の下で、３７℃で２日間反応させた。同様に、Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各ＰＡ化糖鎖を５mUのＮアセチルグルコサミニダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．５）の下で、３７℃で２日間反応させた。また、αマンノシダーゼ（Jack bean; Sigma）酵素消化反応については、１０mM酢酸亜鉛および１０μＵのαマンノシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH３．８８）の下で、３７℃で２日間反応させた。各酵素消化反応は１００℃で３分間煮沸することで停止させ、１２，０００rpm で１０分間遠心した後、上清をＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知の糖鎖の溶出時間と比較した。
【００９７】
（ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析）
ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Perkin-Elmer Sciex API-III triple-quadrupole mass spectrometerを用いて行った。スキャンは０．５Da間隔で行った。
【００９８】
（インビトロにおけるシアル酸転移酵素反応）
上述した様に、透析後、凍結乾燥したＧＴ６株細胞培養液由来糖タンパク質を基質として用いた。１mg／ml ＢＳＡ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ ＣＦ−５４、２μＭ ＣＭＰ−シアル酸、６mU α２，６−シアリルトランスフェラーゼ（ラット肝臓由来）（和光純薬）および４００μｇ ＧＴ６株細胞培養液由来糖タンパク質を含む６２．５mMカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH６．０）の下で、３７℃で５時間シアル酸転移酵素反応を行った。コントロール実験には、基質に４００μｇ ＢＹ２株細胞培養液由来糖タンパク質および４０μｇ胎児アシアロフェツイン（ウシ胎児血清；Ｓｉｇｍａ）を用いた。
【００９９】
（レクチン染色）
シアル酸転移酵素反応物について１２．５％ポリアクリルアミドゲルを用いて１３０Ｖで２時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、１mA／cm2 の定電流下で５０分間ニトロセルロース膜への転移を行った。レクチンブロッティングは、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ＳＮＡレクチン（EY Laboratories, Inc.)を、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ溶液で２００倍希釈して使用した。ブロッティング後、ＰＯＤイムノステインキット（和光純薬）を用いて染色した。
【０１００】
（タバコ培養細胞ＧＴ６株培養液由来ＰＡ化糖鎖の精製）
ＧＴ６株培養液より調製したＰＡ化糖鎖は、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＦ−ＨＰＬＣを利用して精製した（それぞれ図４Ａおよび図４Ｂ）。図４Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＰＡ化産物のピークを示す。各ピーク（１〜６）を回収後、それぞれＳＦ−ＨＰＬＣに供した（図４Ｂ）。
【０１０１】
ＳＦ−ＨＰＬＣ分析より得られた６つのピーク（図４ＢにＡ〜Ｆで示される）を除くピークは、Ｎ結合型糖鎖ではなかった。これは、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ｍ／ｚ ２９９．３３（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）およびｍ／ｚ ５０２．５２（ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ）に一致するシグナルが得られなかったことにより確認された。また、ピーク（Ａ〜Ｆ）について解析したＮ結合型糖鎖の構造を図５に示す。図５中、括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【０１０２】
図５に示されるように、Ａ〜Ｆのいずれも、Ｎ−アセチルグルコサミン残基と結合したガラクトース残基を持つヒト型糖鎖であって、フコース残基を含まず、そしてＢおよびＤを除いてキシロース残基を持っていない。
【０１０３】
（タバコ培養細胞ＧＴ６培養液由来ＰＡ化糖鎖の構造解析）
上記ピークＡ（図６のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析から求めた分子量（ｍ／ｚ １３５４．８）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３５４．２７）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １１９２．５、ｍ／ｚ ９９０．５、ｍ／ｚ ８２７．５、ｍ／ｚ ６６５．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（２９９．３３）であると推定され、ピークＡはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１０４】
上記ピークＡからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図６に示すII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図６に示すIII ）であった。
【０１０５】
上記ピークＢ（図７のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析から求めた分子量（ｍ／ｚ １４８６．８）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１４８６．３８）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １３５４．５、ｍ／ｚ １３２４．０、ｍ／ｚ １１２２．０、ｍ／ｚ ９９１．５、ｍ／ｚ ９６０．０、ｍ／ｚ ６６６．０、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３５４．２７）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３２４．２４）、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１１２１．０５）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（９５８．９１）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（２９９．３３）であると推定され、ピークＢはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１０６】
上記ピークＢからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図７のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図７のIII ）であった。
【０１０７】
上記ピークＣ（図８のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １３５５．０）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３５４．２７）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １１９３．５、ｍ／ｚ ９８９．０、ｍ／ｚ ８２７．０、ｍ／ｚ ６６５．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ｍ／ｚ ２９９．３３）であると推定され、ピークＣはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１０８】
上記ピークＣからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図８のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図８のIII ）であった。
【０１０９】
上記ピークＤ（図９のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １４８７．０；図１０のＡ）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １４８６．３８）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １３５４．０、ｍ／ｚ １３２５．０、ｍ／ｚ １１９１．０、ｍ／ｚ １１２１．５、ｍ／ｚ ９８９．５、ｍ／ｚ ８２８．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．５は、各々、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３５４．２７）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３２４．２４）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１２１．０５）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ８２６．８０）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ｍ／ｚ ２９９．３３）であると推定され、ピークＤはこれらの構造を含むことが示唆された（図１０のＢ）。
【０１１０】
上記ピークＤからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図９のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図９のIII ）であった。
【０１１１】
上記ピークＥ（図１１のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １５１６．６）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１５１６．４１）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １３５５．０、ｍ／ｚ １１９３．０、ｍ／ｚ ９９０．０、ｍ／ｚ ８２６．５、ｍ／ｚ ６６５．０、ｍ／ｚ ５０３．５、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １３５４．２７）、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ １１９２．１３）、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ９８８．９４）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ｍ／ｚ ５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ｍ／ｚ ２９９．３３）であると推定され、ピークＥはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１１２】
上記ピークＥからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１１のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１１のIII ）であった。
【０１１３】
上記ピークＦ（図１２のＩ）のＩＳ−ＭＳ分析結果から求めた分子量（ｍ／ｚ １６７９．８）は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１６７８．５５）に一致した。また、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析により得られたシグナル、ｍ／ｚ １５１７．５、ｍ／ｚ １３１３．５、ｍ／ｚ １１５２．０、ｍ／ｚ ８２７．５、ｍ／ｚ ６６５．５、ｍ／ｚ ５０３．０、ｍ／ｚ ３００．０は、各々、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１５１６．４１）、Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１３１３．２２）、Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（１１５１．０８）、Ｍａｎ2 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（８２６．８０）、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（６６４．６６）、ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（５０２．５２）、ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（２９９．３３）であると推定され、ピークＦはこれらの構造を含むことが示唆された（データは示さず）。
【０１１４】
上記ピークＦからのβガラクトシダーゼ消化物は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１２のII）であり、さらに、そのＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（図１２のIII ）であった。
【０１１５】
これらの結果を考慮すると、ピークＡ又はＣは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３−ＰＡ）もしくは〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〕〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３−ＰＡ）のいずれかであると考えられる。
【０１１６】
また、ピークＢあるいはＤは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３Ｘ−ＰＡ）又は〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〕〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮ1 Ｍ３Ｘ−ＰＡ）のいずれかであると考えられる。
【０１１７】
また、ピークＥは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ４−ＰＡ）又はα−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ４−ＰＡ）のいずれかであると考えられる。
【０１１８】
そして、ピークＦは、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−Ｇａｌ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧａｌＧＮＭ５−ＰＡ）であると推定される。
【０１１９】
（インビトロにおけるシアル酸転移酵素反応）
ＧＴ６株培養液由来糖タンパク質、ＢＹ２株培養液由来糖タンパク質およびアシアロフェツインを基質として、インビトロシアル酸転移酵素反応を行った。それぞれの反応物を、ニトロセルロース膜への転移後、レクチン染色を行った結果、基質がアシアロフェツイン（図１３、レーン１）、およびＧＴ６株培養液由来糖タンパク質（図１３、レーン２）のレクチン染色は陽性であった。一方、ＢＹ２株培養液由来糖タンパク質（図１３、レーン３）のレクチン染色は陰性であった。このことから、タバコ培養細胞ＧＴ６株培養液由来糖タンパク質糖鎖は、シアル酸転移酵素反応の基質となることが示された。
【０１２０】
（比較例）
（非形質転換体ＢＹ２株培養細胞が分泌する糖タンパク質の解析）
（細胞外分泌糖タンパク質の調製）
ＧＴ６株の代わりにＢＹ２株を用いたことを除いて、上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により、凍結乾燥した培養上清サンプルを得た。
【０１２１】
（Ｎ結合型糖鎖の調製）
Sephadex G-25 super fineゲル濾過カラム（１．８×１８０cm）の代わりに、TSK gel TOYO PERAL HW-40 (TOSOH)ゲル濾過カラム（２．５×３０cm）を用いたことを除いて、上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により、Ｎ結合型糖鎖を回収した。
【０１２２】
（ピリジルアミノ化（ＰＡ化）糖鎖の調製）
回収したＮ結合型糖鎖を２アミノピリジンを用いてＰＡ化した。ＰＡ化試料を０．１Ｎアンモニア水溶液で平衡化したTSK gel TOYO PERAL HW-40 (TOSOH)ゲル濾過カラム（２．５×３０cm）に通すことで、ＰＡ化糖鎖を精製した。
【０１２３】
（ＨＰＬＣによるＰＡ化糖鎖の分画と解析）
Jasco 821-FP Intelligent Spectrofluorometerを持つJasco 880-PU HPLCの代わりに、HITACHI FL Detector L-7480を持つHITACHI HPLCシステムを用いたことを除いて、上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により、ＰＡ化糖鎖を分画および解析した。
【０１２４】
（エキソグリコシダーゼ消化によるＰＡ化糖鎖の解析）
Ｎアセチルグルコサミニダーゼ（Diplococcus pneumoniae; Roche)酵素消化反応について、各ＰＡ化糖鎖を３mUのＮアセチルグルコサミニダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH ５．４５）の下で、３７℃で２日間反応させた。また、αマンノシダーゼ（Jack bean; Sigma）酵素消化反応については、１０mM酢酸亜鉛および１０μＵのαマンノシダーゼを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH４．０）の下で、３７℃で２日間反応させた。各酵素消化反応は１００℃で３分間煮沸することで停止させ、１２，０００rpm で１０分間遠心した後、上清をＨＰＬＣに供した。試料糖鎖の溶出時間は既知の糖鎖の溶出時間と比較した。
【０１２５】
（ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析）
上記ＧＴ６株の場合と同様の方法により行った。
【０１２６】
（ＢＹ２株培養液由来ＰＡ化糖鎖の精製）
ＢＹ２培養液より調製したＰＡ化糖鎖もまた、ＲＰ−およびＳＦ−ＨＰＬＣを利用して精製した（図１４Ａおよび１４Ｂ）。図１４Ａは、ＲＰ−ＨＰＬＣによるＰＡ化産物のピークを示している。各フラクション（Ｉ〜Ｘ）を回収後、それぞれＳＦ−ＨＰＬＣに供した（図１４Ｂ）。
【０１２７】
図１４Ａに示すフラクション（Ｉ、II、III ）は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析においてＮ結合型糖鎖を検出できなかった。これは、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ｍ／ｚ ２９９．３３（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）およびｍ／ｚ ５０２．５２（ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ）に一致するシグナルが得られなかったことによる。フラクションIVからＸまでのピークをさらにＳＦ−ＨＰＬＣ分析すると２１のピークが得られた（図１４Ｂ）。解析したＮ結合型糖鎖の構造を、図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。
【０１２８】
（ＢＹ２株培養液由来ＰＡ化糖鎖の構造解析）
図１４Ｂに示すピークＶ−４、VII −３およびVIII−４のＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、分子量（ｍ／ｚ）は、それぞれ、１６３９．０、１４７６．５、１３１４．５で、ＳＦ−ＨＰＬＣの溶出位置とを考え併せると、個々のピークに存在する糖鎖構造は、ＰＡ化高マンノース糖鎖Ｍａｎ7 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ、Ｍａｎ6 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡおよびＭａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡに一致した（データ示さず）。
【０１２９】
また、個々のピークの糖鎖のα−マンノシダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析の結果、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ１）と一致した（データ示さず）。また、ＲＰ−ＨＰＬＣを用いてＭａｎ7 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡのアイソマーＭ７Ａ、Ｍ７Ｂ、およびＭ７Ｄと比較すると、ピークＶ−４はＭ７Ａと溶出位置が一致した。Ｍａｎ6 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡのアイソマーＭ６Ｂ、Ｍ６Ｃでは、ピークVII −３はＭ６Ｂと一致し、Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡのアイソマーＭ５ＡとピークVIII−４は一致した。
【０１３０】
これらのデータから、図１４Ｂに示すピークＶ−４、VII −３およびVIII−４は、図１５Ａに示すように、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ７Ａ）、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ６Ｂ）、およびα−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ５Ａ）であった。図中の括弧内に示される数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【０１３１】
図１４Ｂに示すピークIV−１およびＶ−１のＩＳ−ＭＳ分析から求めた分子量（ｍ／ｚ １２６７．５）は、Ｍａｎ3 ＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３ＦＸ；１２６７．１９）の計算値に一致した。また、ＨＰＬＣの溶出位置は、２次元糖鎖マップ上で完全にＭ３ＦＸ標準品に一致した。さらに、個々のピークの糖鎖のαマンノシダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ＭａｎＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＦＸ；９４２．９１）の計算値に一致した（図１７のＡおよびＢ）。
【０１３２】
これらのデータから図１４Ｂに示されるピークIV−１およびＶ−１は、それぞれ、図１５Ｂに示すように、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−〔α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）〕ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（Ｍ３ＦＸ）であった。
【０１３３】
図１４Ｂに示されるピークVII −２のＩＳ−ＭＳの分析結果より、分子量（ｍ／ｚ １４１７．０）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＧＮＭ３ＦＸ；１４７０．３８）の計算値に一致した。ピークの糖鎖のＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３ＦＸ；１２６７．１９）と一致し、さらにα−マンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭａｎＸｙｌＦｕｃＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＦＸ；９４２．９１）に一致した（図１７のＣ〜Ｅ）。また、ピークVII −２のＲＰ−ＨＰＬＣの溶出位置（図１６のＤ−２）は、２次元糖鎖マップ上で、完全に、ＧＮ1 Ｍ３ＦＸ、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−〔α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）〕ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（図１６のＤ−１）標準品に一致した。
【０１３４】
これらのデータからピークVII −２は、図１５Ｂに示すように、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−〔α−Ｌ−Ｆｕｃ−（１→３）〕ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３ＦＸ）であった。
【０１３５】
図１４Ｂに示されるピークVII −１およびVIII−３の分子量（ｍ／ｚ １３２４．０）は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＧＮＭ３Ｘ；１３２４．２４）の計算値に一致した。ピークVII −１の糖鎖のＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３Ｘ；１１２１．０５）と一致し（図１８ＡのＢ）、さらにαマンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭａｎＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＸ；７９６．７７）に一致した（図１８ＡのＣ）。ＧＮＭ３Ｘの構造として２つのアイソマー型が考えられる。即ち、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）とβ−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）である。ＯＤＳカラム上では、ＧＮ1 Ｍ３Ｘが、ＧＮ1 Ｍ３Ｘよりも先に溶出することが報告されている。ピークVII −１およびVIII−３の溶出位置を考慮すると、図１５Ｂに示すように、ピークVII −１は、α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）、ピークVIII−３は、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ1 Ｍ３Ｘ）であった。
【０１３６】
図１４Ｂに示されるピークＸ−１のＨＰＬＣの溶出位置は、２次元糖鎖マップ上で完全に標準ＧＮ２Ｍ３（１３９５．３２）に一致した。ピークの糖鎖のＮアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３；９８８．９４）と一致し、さらにα−マンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析で、ＭａｎＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ１；６６４．６６）に一致した（データ示さず）。これらのデータからピークＸ−１は、図１５Ａおよび図１５Ｂに示すように、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ２Ｍ３）であった。
【０１３７】
図１４Ｂに示されるピークＸ−２の分子量（ｍ／ｚ １５２９．５）は、ＧｌｃＮＡｃ2 Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＧＮ２Ｍ３Ｘ；１５２７．４３）の計算値に一致した。また、ＨＰＬＣの溶出位置は、２次元糖鎖マップ上で完全にＭ３ＦＸ標準品に一致した。さらに、このピークの糖鎖のαマンノシダーゼ消化物は、ＨＰＬＣ分析で溶出位置が変化することがなかった。しかし、Ｎアセチルグルコサミニダーゼ消化物は、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、Ｍａｎ3 ＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（Ｍ３Ｘ；１１２１．０５）と一致し（図１８ＢのＢ）、さらにα−マンノシダーゼで消化すると、ＳＦ−ＨＰＬＣ分析およびＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析でＭａｎＸｙｌＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ（ＭＸ；７９６．７７）に一致した（図１８ＡのＣ）。これらのデータから、ピークＸ−２は、図１５Ｂに示すように、β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→６）〔β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→２）−α−Ｄ−Ｍａｎ−（１→３）〕〔β−Ｄ−Ｘｙｌ−（１→２）〕β−Ｄ−Ｍａｎ−（１→４）−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃ−（１→４）−ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ（ＧＮ２Ｍ３Ｘ）であった。
【０１３８】
図１４Ｂに示される他のピークIV−２、IV−３、Ｖ−２、Ｖ−３、Ｖ−５、VI−１、VI−２、VI−３、VI−４、VIII−２、IXは、Ｎ結合型糖鎖ではなかった。その理由は、ＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果、ｍ／ｚ ２９９．３３（ＧｌｃＮＡｃ−ＰＡ）およびｍ／ｚ ５０２．５２（ＧｌｃＮＡｃ2 −ＰＡ）に一致するシグナルが得られなかったことによる。
【０１３９】
４．ホース・ラディシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の分泌
外来遺伝子、すなわち、３５Ｓ−Ｃｌａ（Kawaoka et al., J. Ferment. Bioeng., 78, 49-53 (1994))から得られたホース・ラディシュ・ペルオキシダーゼ遺伝子を、ベクターｐＢＩ １０１ ＨｍＢ（Akama et al., Plant Cell Rep. 12, 7-11 (1992))のＨｉｎｄIII とＳａｃＩ部位に挿入し、そしてＧＴ６株内に導入した。Ｇ６株の得られたクローン（ＧＴ−ＨＲＰ−５、ＧＴ−ＨＲＰ−１９）を培養した後、上清を回収し、そして標準的な等電点電気泳動に供した。結果として、図１９に示すように、ＨＲＰのpI ７．８の電気泳動バンドが、クローンＧＴ−ＨＲＰ−５、ＧＴ−ＨＲＰ−１９の上清中に検出され、そしてこのことにより、外来タンパク質も、ＧａｌＴ遺伝子により形質転換された植物細胞から分泌されたことを確認した。さらに図２０は、上述のように、標準的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分離された、クローンＧＴ−ＨＲＰ−５により分泌されたタンパク質のレクチン染色の結果を示す。ＲＣＡ１２０染色は、ＧＴ−ＨＲＰ−５が陽性シグナルをもつことを示し（図２０（Ｃ））、そしてそれゆえ、分泌されたＨＲＰが、ガラクトースが付加された糖鎖構造をもっていたことが示された。
【０１４０】
産業上の利用可能性
本発明により、植物細胞によるヒト型糖鎖を持つ異種糖タンパク質の分泌生産方法、この糖タンパク質を分泌し得る植物細胞、およびこの植物細胞によって分泌されるヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質が提供される。本発明のヒト型の糖鎖を持つ糖タンパク質は、ヒト型の糖鎖を持つために、抗原性を有さない。それゆえ、ヒトを含む動物への投与のために有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】ｈＧＴのクローニングの方法の模式図である。
【図２】ｈＧＴ発現用ベクターｐＧＡｈＧＴの構築方法の模式図である。
【図３】形質転換体タバコ培養細胞のゲノムのサザン解析を示す写真である。図３（Ａ）は、ゲノムＤＮＡ（４０μｇ）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で消化し、そしてその後に電気泳動を行なったときの結果を示す。左側の数字はＤＮＡ分子量マーカーの位置を表す。図３（Ｂ）は、各形質転換体に組み込まれた、プロモーター、ｈＧＴ、ターミネーターを含む２．２kbの断片の模式図を示す。
【図４Ａ】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図４Ｂ】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図５】ＧＴ６株培養液中に分泌された糖タンパク質の糖鎖の構造およびその分析結果を示す図である。図中に示される括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【図６】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図７】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図８】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図９】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１０】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖のＩＳ−ＭＳ／ＭＳ分析の結果を示す図である。ＢはＡの部分拡大図である。
【図１１】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１２】ＧＴ６株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１３】ＧＴ６株培養液由来糖タンパク質、ＢＹ２株培養液由来糖タンパク質およびアシアロフェツインを基質として、インビトロシアル酸転移酵素反応を行った結果を示す図である。
【図１４Ａ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１４Ｂ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１５Ａ】ＧＴ６株培養液中に分泌された糖タンパク質の糖鎖の構造およびその分析結果を示す図である。図中に示される括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【図１５Ｂ】ＧＴ６株培養液中に分泌された糖タンパク質の糖鎖の構造およびその分析結果を示す図である。図中に示される括弧内の数字は、図に示されるそれぞれの構造の糖鎖のモル比を表す。
【図１６】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１７】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１８Ａ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１８Ｂ】ＢＹ２株培養液から調製したＰＡ化糖鎖およびそのエキソグリコシダーゼ消化物の高速液体クロマトグラフィーによる分析を示す図である。
【図１９】等電点電気泳動の結果を示す図面に代わる写真である。培養されたタバコ細胞の消耗培地中のタンパク質を、等電点電気泳動により分析し、そしてペルオキシダーゼ活性のために染色した。野生型はＢＹ２株を意味する。ＷＴ−ＨＲＰは、ＨＲＰによるＢＹ２株の形質転換体を意味する。ＧＴ−ＨＲＰは、ＨＲＰ遺伝子によるＧＴ６株の形質転換体を意味する。
【図２０】トランスジェニック培養タバコ細胞の消耗培地中のタンパク質のレクチン染色結果を示す図面に代わる写真である。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分画し、そしてクーマシー・ブリリアント・ブルー（Coomassie brilliant blue)（Ａ）により染色し、又はニトロセルロース膜に転写し、そしてＣｏｎＡ（Ｂ）、とＲＣＡ１２０（Ｃ）により処理した。野生型は、ＢＹ２株を意味する。ＷＴ−ＨＲＰ−２は、ＨＲＰ遺伝子によるＢＹ２株の形質転換体の中の１を意味する。ＧＴ−ＨＲＰ−５は、ＨＲＰ遺伝子によるＧＴ６株の形質転換体の中の１を意味する。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法であって、
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
上記植物細胞を培養する工程、を含む前記方法。
【請求項２】
前記ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質が、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外部糖鎖が直鎖状構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外部糖鎖が分岐状構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質がフコースまたはキシロースを含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞の培養液を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
インビトロで糖または糖鎖を付加する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、かつ、上記糖鎖付加機構によって糖鎖を付加されたタンパク質を分泌し得る植物細胞であって、上記糖鎖付加機構が、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖を付加し、ここで上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を有する、前記植物細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって得られるヒト型糖鎖を有する糖タンパク質。
【請求項１１】
ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法であって、
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
該酵素を細胞内小器官で発現させる工程、を含む前記方法。
【請求項１２】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素のための遺伝子により形質転換された植物細胞であり、ここで、上記酵素が上記植物細胞内に局在し、その結果、上記植物細胞は、ヒト型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を合成することができる、前記植物細胞。
【請求項１３】
前記糖鎖構造が、付加されたガラクトース残基を含む、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１４】
前記糖鎖構造が、β１，２−キシロース又はα１，３−フコースを含まない、請求項１３に記載の植物細胞。
【請求項１５】
前記糖鎖構造が、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ2 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、及びＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 から成る群から選ばれる（Ｎ−アセチルグルコサミン）1-2 （マンノース）2-5 （Ｎ−アセチルグルコサミン）2 のＮ結合型糖鎖に付加されたガラクトース残基を含む、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１６】
前記酵素が、前記植物内の細胞内小器官内に局在する、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１７】
請求項１２に記載の植物細胞から再生された植物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の植物から生産された種子。
【請求項１】
ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法であって、
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
上記植物細胞を培養する工程、を含む前記方法。
【請求項２】
前記ヒト型糖鎖を持つ糖タンパク質が、コア糖鎖および外部糖鎖を含み、上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記外部糖鎖が直鎖状構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記外部糖鎖が分岐状構造を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記分岐糖鎖部分が、モノ、バイ、トリ、またはテトラ構造である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記糖タンパク質がフコースまたはキシロースを含まない、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記植物細胞の培養液を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
インビトロで糖または糖鎖を付加する工程をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る糖鎖付加機構を備え、かつ、上記糖鎖付加機構によって糖鎖を付加されたタンパク質を分泌し得る植物細胞であって、上記糖鎖付加機構が、コア糖鎖および外部糖鎖を含む糖鎖を付加し、ここで上記コア糖鎖が複数のマンノースおよびアセチルグルコサミンを実質的に含み、そして上記外部糖鎖が非還元末端ガラクトースを含む末端糖鎖部分を有する、前記植物細胞。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法によって得られるヒト型糖鎖を有する糖タンパク質。
【請求項１１】
ヒト型糖鎖をもつ糖タンパク質の分泌生産方法であって、
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素の遺伝子および異種糖タンパク質の遺伝子を導入して形質転換された植物細胞を得る工程、および
該酵素を細胞内小器官で発現させる工程、を含む前記方法。
【請求項１２】
非還元末端アセチルグルコサミン残基へのガラクトース残基の転移反応を行い得る酵素のための遺伝子により形質転換された植物細胞であり、ここで、上記酵素が上記植物細胞内に局在し、その結果、上記植物細胞は、ヒト型糖鎖構造をもつ糖タンパク質を合成することができる、前記植物細胞。
【請求項１３】
前記糖鎖構造が、付加されたガラクトース残基を含む、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１４】
前記糖鎖構造が、β１，２−キシロース又はα１，３−フコースを含まない、請求項１３に記載の植物細胞。
【請求項１５】
前記糖鎖構造が、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ5 ＧｌｃＮＡｃ2 、ＧｌｃＮＡｃ2 Ｍａｎ3 ＧｌｃＮＡｃ2 、及びＧｌｃＮＡｃ1 Ｍａｎ4 ＧｌｃＮＡｃ2 から成る群から選ばれる（Ｎ−アセチルグルコサミン）1-2 （マンノース）2-5 （Ｎ−アセチルグルコサミン）2 のＮ結合型糖鎖に付加されたガラクトース残基を含む、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１６】
前記酵素が、前記植物内の細胞内小器官内に局在する、請求項１２に記載の植物細胞。
【請求項１７】
請求項１２に記載の植物細胞から再生された植物。
【請求項１８】
請求項１７に記載の植物から生産された種子。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【図２】
【図３】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４Ａ】
【図１４Ｂ】
【図１５Ａ】
【図１５Ｂ】
【図１６】
【図１７】
【図１８Ａ】
【図１８Ｂ】
【図１９】
【図２０】
【公開番号】特開２００８−２１２１６１（Ｐ２００８−２１２１６１Ａ）
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００８−１３１５５５（Ｐ２００８−１３１５５５）
【出願日】平成２０年５月２０日（２００８．５．２０）
【分割の表示】特願２００２−５５８５２０（Ｐ２００２−５５８５２０）の分割
【原出願日】平成１４年１月１８日（２００２．１．１８）
【出願人】（５９０００００２０）ザ ダウ ケミカル カンパニー (24)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年９月１８日（２００８．９．１８）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年５月２０日（２００８．５．２０）
【分割の表示】特願２００２−５５８５２０（Ｐ２００２−５５８５２０）の分割
【原出願日】平成１４年１月１８日（２００２．１．１８）
【出願人】（５９０００００２０）ザ ダウ ケミカル カンパニー (24)
【氏名又は名称原語表記】ＴＨＥ ＤＯＷ ＣＨＥＭＩＣＡＬ ＣＯＭＰＡＮＹ
【Ｆターム（参考）】
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