検体測定装置及び方法
サンプル中のターゲット分子を測定するための装置が開示される。前記装置は、１００ｎｍを超える磁気ラベル（１）を含むモイエティ、前記モイエティに特異的に結合される結合表面（１２）を含み、前記表面に結合する前記モイエティの量が前記サンプル中の前記ターゲット分子の量を指標し、前記表面に結合された前記モイエティの量を検出するための検出手段（３１，３１’）を含み、及び前記サンプル中でそれぞれのモイエティの磁気ラベルの凝集を低減させるために塩を含む。前記装置は好ましくはまた、前記結合表面に前記磁気ラベルを引きつけるための磁場生成装置（４１）を含む。サンプル中でターゲット分子を測定する方法、及び前記装置とともに使用するための使い捨てカートリッジがまた開示される。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気及び／又は磁気化可能ラベルを含むモイエティを用いる、サンプル中のターゲット分子の存在を決定する方法に関する。本発明はさらにかかる方法のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学診断の分野において、唾液、血液、血清、血漿、尿などを含む体液サンプルなどの種々のサンプルにおいて対象となる広い範囲の検体の存在及び濃度を正確に決定できるものであることから、アッセイ系センサ装置は急速に注目度が高くなってきている。
【０００３】
このために、蛍光又は化学発光プローブ、発色基質変換のための酵素又は磁気及び／又は磁気化可能粒子などの検出可能なラベルを含むモイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）が提供されており、これは、測定装置の結合表面、例えばセンサに特異的に結合し得るものである。この結合表面に結合する前記モイエティの量は、前記サンプル中に存在する対象検体又はターゲット分子の量を示すものである。というのは、例えば前記モイエティは、いわゆるサンドイッチアッセイなどにおいて、前記検体を介してのみ前記結合表面に結合し得るからであり、前記モイエティは、いわゆる競合アッセイなどにおいて、前記結合表面の限定された数の空間に前記検体と結合競合するからであり、又はいわゆる阻害アッセイなどにおいて、前記検体がまた特異的に前記モイエティと同じエピトープに結合して前記モイエティが前記結合表面へ結合することを阻害するから、である。さらなる知られたアッセイの例は、例えば国際特許出願公開第２００７／０６０６０１号に開示され、及び他の例も当業者には明らかである。
【０００４】
言い換えると、前記ターゲット分子又は前記モイエティのいずれかが、例えば前記装置の結合表面を定める抗体と特異的に結合し、それにより前記検体の濃度が、前記特異的結合形成の際に前記結合表面領域での検出可能なラベルの存在から決定され得る。多くの適切な特異的結合対の候補が自体知られており、通常、レセプタ分子と分子、例えば薬物との間の鍵と鍵穴タイプに基づくものである。このことは、アッセイ系装置を、特定のタンパク質及びその他の生物学的組成物、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、代謝産物、薬物などの存在又は不存在を決定するため、又はタンパク質、ペプチド、プリオン、酵素、アプタマー、リボザイム及びデオキシリボザイムなどの活性及び触媒的分子の活性及び機能を決定するために、特に適したものとする。例えば、免疫アッセイは、さらに診断及び処置を補助するために体液中の特定のタンパク質の特定の量を決定するために使用されている。
【０００５】
かかるアッセイ系装置の使用は、医学的診断の分野に有望な新たな機会を与えるものである。例えば医院、病院の病室、救急室及び患者の自宅などの実験室外の環境で迅速に医学診断に使用されるためのハンドヘルドバイオセンサシステムの提供などである。対象物の診断試験の例は、心筋梗塞の診断マーカーである心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の検出である。
【０００６】
理解されるべきことは、迅速性に加えて、かかる診断試験は、ある疾患バイオマーカがピコモル範囲での検出が必要とされるなど、高感度が要求される、ということである。かかる診断試験を実行するための特に有望な装置は、前記結合表面に特異的に結合するための磁気又は磁気化可能粒子でラベル化されたモイエティを用いるものである。というのは、磁場は前記磁気ラベルを前記結合表面へ向かって加速（引きつける）することができ、従って前記モイエティと前記結合表面との間で前記結合反応を加速する。結合していないモイエティを、例えば洗浄又は濯ぐことで除去した後、前記結合表面に結合される前記モイエティの量は、前記結合表面の前記表面の近くに存在する磁気ラベルの量により決定され得る。例えば光反射技術又は磁気検出技術などの方法による。
【０００７】
実験室外の環境で試験するために、診断試験がコンパクトで丈夫であることが要求され、かつユーザが補助するステップができるだけ少ないことが要求される。理想的には、ユーザは前記サンプルを使い捨てカートリッジに加えることだけが必要であり、かつ前記診断試験のための全ての試薬が既に前記カートリッジに入れられており、さらに、前記試薬がしばしばドライフォームと参照される固体状態で存在するものである。タンパク質マーカーの検出のため、好ましいサンプルタイプは、血液が全身レベルの直接指標であることから、血液である。多くの場合に、血液はさらに、血球細胞除去処理されて検体試験のために血清又は血漿とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願公開第２００７／０６０６０１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、例えば生物学的サンプルに使用される場合には、前記のように試験アッセイでの磁気又は磁気化可能粒子モイエティの使用には問題があることを見出した。前記サンプルで決定されるべき検体の濃度（レベル）に拘わらず、測定値、即ち前記回収率（リカバリ）が低い、ということが見出された。検体の回収率は、前記サンプルの提供者試験体に強く依存し、同様に対象検体のタイプに依存する。前記干渉が無視できる程度の特定の提供者が存在し、また他の提供者には係る効果は顕著である。平均すると、例えば対象検体としての心臓トロポニンＩについては全ての提供者サンプルの約１５％が、前記アッセイが機能しない顕著な干渉を示す。
【００１０】
従って、前記方法及び装置の再現性が損なわれることが見出された。
【００１１】
さらに、この問題は、ラベル化モイエティの量を操作又は測定するために磁気駆動を利用するアッセイを阻害する。前記アッセイの間に磁場を適用することは、磁気粒子を強制的に集め得る。このことは、磁気粒子が直径１００ｎｍより大きい場合に特にそうである。かかる粒子は磁場がない場合でさえクラスタ化する傾向を持つ。これに代えて又はこれに加えて、磁気粒子及び／又は磁気化可能粒子又はラベルを含むモイエティはサンプルの適用の前に固体形で装置内に堆積されることができ、及び前記装置へ前記流体サンプルが添加される際に再分散されて、前記磁気及び／又は磁気化可能性粒子が最初の塊状状態から分散される。
【００１２】
前記の信頼性及び再現性の問題は、独立請求項に定める本発明により低減され得る。従属請求項は有利な実施態様を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、対象サンプルに塩を添加することが、前記アッセイ方法及びかかるアッセイを実施するための装置に信頼性及び／又は再現性を改善することが見出された。
【００１４】
提供者ごとの変動の理由は、例えば血漿及び血清のタンパク質、脂質、電解質、ホルモンなどのサンプルの組成物が実質的に患者ごとに変動するからである、と考えられている。本発明者による種々の提供者サンプルの分析は、血漿又は血清などのサンプル内の、例えばタンパク質は前記粒子の表面に吸収されて、不可逆的な磁気又は磁気化可能粒子間の相互作用を低減することを示唆する。この問題はまた、全血液がサンプルマトリクスとして、「そのまま」の形又は溶解させた形のいずれかとして適用される場合に現れる。塩の添加は、前記結合表面に結合するために存在する前記モイエティの磁気及び／又は磁気化可能ラベルの塊状化を予防するか少なくとも低減させる、と現在考えられている。従って前記濃度に相対するより正確かつ高精度シグナルが結合事象ごとに検出され、再現性及び信頼性について改善される。
【００１５】
従って、溶解すると、前記装置へ前記サンプルを添加した後前記サンプルと共に分散された磁気及び／又は磁気化可能粒子の塊状化を低減させる塩を含む装置は、前記説明したように有益である。
【００１６】
前記サンプルはあらゆる由来の分析サンプルであって、塩の添加なしで使用されると前記のクラスタ化回収率問題を生じるサンプルであり得る。前記サンプルは、動物又は人間の身体性サンプルであり得る。またはタンパク質及び／又は脂質含有物を含むサンプルであり得る。前記サンプルは、好ましくは唾液、血液、血液血清、血液血漿であり得る。又は前記サンプルはその他の身体からの流体形であり得る。一般的にはかかるサンプルは水系であるが、他の溶媒、例えば標本からの前記サンプルを得た後加えられた溶媒もあり得る。ただし得られたサンプル中の塩の溶解が可能となる必要がある。理解されるべきことは、身体由来ではないが体性流体と同様のクラスタ化成分を含む実験室サンプルもまた、本発明のアッセイ方法で有利に分析され得るということである。
【００１７】
前記モイエティは、生物学的物質又はその断片又は細胞などの生物学的要素の部分である検体の指標であり得る。生物学的物質には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、代謝産物、薬物などが含まれ、又はタンパク質、ペプチド、プリオン、酵素、アプタマー、リボザイム及びデオキシリボザイムなどの活性及び触媒性生体分子の活性度及び機能を決める物質が含まれる。好ましくは前記モイエティは、体性タンパク質及び／又はその断片の存在を指標するものである。前記モイエティは、好ましくは、対象検体と特異的に相互作用するモノ及び／又はポリクローナル抗体である。好ましくは前記モイエティは、心疾患予測をスクリーニングし及び／又は診断し及び／又は決定するために使用され得る検体についての指標となるように選択される。従って、本発明のアッセイは、例えばうっ血性心不全（ＣＨＦ）の試験に有利であり、これは現在Ｂタイプ利尿ペプチド（又ＢＮＰ）又はＧＣ−Ｂとして知られてる利尿ペプチド（ＢＮＰ）を指標するモイエティを使用することで診断され、又はｐｒｏＢＮＰの生物学的不活性のＮ末端断片であるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを指標するモイエティを使用され得る。また、前記アッセイは、トロポニンＩ及び／又はＴの存在を示すモイエティを用いて心筋梗塞又は心不全を試験するために有利である。さらに、前記モイエティは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又は上皮小体ホルモンの存在の指標であり、人又は動物の知られた関連する疾患を診断するために使用され得る副甲状腺機能亢進症又は副甲状腺機能低下症を試験するために使用され得る。
【００１８】
前記サンプル中に溶解させる塩濃度は、好ましくは０．１〜５モル／Ｌであることが必要である。というのはこの範囲であれば磁気ラベルの凝集が抑制され得ることが、見出されたからである。
【００１９】
前記装置に与えられる塩の量は、ある所定の容量のサンプルチャンバを満たした際に、前記クラスタ化抑制効果を与えるに適する濃度に到達するように、調節され得る。従って前記サンプルチャンバと塩の量は、前記アッセイの間、０．１から５モル／Ｌの範囲となるような範囲である。
【００２０】
適切な塩には、リチウム、ナトリウム又はカリウムなどのアルカリ金属塩が挙げられる。好ましくは塩は、ナトリウム（Ｎａ）及び／又はカリウム（Ｋ）塩が含まれ、例えば塩化カリウム（ＫＣｌ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）及びそれらの組合せが挙げられる。かかる塩は、最大の改良を与えることが見出された。即ち、磁気及び／又は磁気化可能粒子の凝集化挙動を最も強く低減させる。
【００２１】
好ましい実施態様では、ＫＣｌ及びＫＢｒの組合せが使用される。これは特に対象検体として、心臓トロポニンＩ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又は副甲状腺ホルモンを含むサンプル中でクラスタ形成を効果的に低減するものである。
【００２２】
又は塩は、カリウムチオシアネート（ＫＳＣＮ）及びグアジニンイソシアネートなどのチオシアネート塩である。かかる塩は、サンプルの挙動、特に血清サンプルの挙動を効果的に改善するものである。血清サンプルの挙動は前記の干渉の影響を強く受けるものである。
【００２３】
前記塩及びモイエティは、ドライフォームとして参照される固体形で装置に一緒に入れられ得る。かかる場合に、本発明は特に効果的となる。というのは磁気及び／又は磁気化可能ラベルモイエティを含む装置を長時間保存することが、使用の前及び／又は使用の際に前記ラベルの強い凝集を生じる恐れがあるからである。例えば、前記装置は、前記結合表面を含むサンプルチャンバに接続された入口を有することができ、前記塩は前記入口に置かれる。前記入口は前記サンプルを濾過する濾過手段を含み、前記濾過手段がさらに前記塩を含む。前記磁気ラベルを持つ前記モイエティから上流に前記塩を置くことで、前記塩は、前記サンプルが前記モイエティを含む測定チャンバに到達する前に前記サンプル中に溶解され得る。
【００２４】
又は、前記塩及び前記モイエティは一緒に固体形で前記装置内に置かれる。前記塩と前記モイエティを混合し、それを前記装置内の同じ場所に一緒に置くことで、前記サンプル中で前記磁気及び／又は磁気化可能ラベルの凝集がより効果的に抑制される。
【００２５】
１つの実施態様では、前記装置は前記サンプルを受ける使い捨てカートリッジであり、ある量の前記塩及び前記モイエティが入れられている。これは、前記カートリッジを受け、前記カートリッジの前記結合表面上の前記モイエティを測定することができる別の装置が使用され得る、という利点を有する。従ってそれぞれのサンプルについて、複数の測定には、前記カートリッジを交換することだけを必要とする。従って、使い捨てカートリッジは前記装置と独立して提供され得る。
【００２６】
前記装置は、前記結合表面の存在を決定するための検出手段を含み得る。好ましくは、かかる手段は、光学手段であって、例えば漏れ全反射（ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）ユニット、又はその他の顕微鏡ユニットであって、前記結合表面上の磁気及び／又は磁気化粒子を検出可能な手段である。又は、前記検出手段は磁気手段であってよく、それを介して前記結合表面上の磁気及び／又は磁気化ラベルを検出することができる、手段である。
【００２７】
前記装置は、前記結合表面上の磁気又は磁気化可能ラベルを引きつけるための磁場発生装置を含む。これは、前記結合表面での前記モイエティの濃度を増加させることで前記結合表面での前記結合反応のために必要な時間を低減する。
【００２８】
本発明の他の実施態様により、サンプル中のターゲット分子を、磁気又は磁気化可能ラベルと本発明による前記塩との組合せを用いて測定する方法が提供される。前記方法は、例えば阻害アッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイなどの生物学的アッセイ又はその一部であり得る。さらに、前記アッセイは液体又は液化（例えば水に溶解して）生物学的サンプルに向けられ得る。前記本発明の方法の構成は、前記装置についての構成と類似する。本発明の方法は同様の有利な効果を持つ。
【００２９】
好ましくは、前記方法はさらに、前記測定の精度をさらに高めるために前記測定ステップに先立って前記結合表面の近くから結合されていない磁気ラベルを除去することを含む。かかる除去は、例えば洗浄又は濯ぎ又は磁気駆動により達成され得る。
【００３０】
前記方法は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを指標するモイエティを用いてうっ血性心不全の診断方法、又は前記モイエティが心臓トロポニンＩ又はＴを指標するように選択される場合には、心筋梗塞の診断方法であり得る。これらの場合のサンプルは好ましくは血液である。かかる診断における決定的なこれらの心臓疾患マーカーの境界レベルは、当技術分野においてよく知られている。前記方法は、前記決定される検体レベルが前記境界レベルと比較され、かかる境界レベルよりも高いか低いかが示されるステップを含む。
【００３１】
本発明の実施態様は、添付の図面を参照して、非限定的な例示により、より詳細に説明される。
【００３２】
理解されるべきことは、図は模式的にのみ示されており寸法通りではない、ということである。さらに理解されるべきことは、図を通じて同じ参照符号は同じ又は類似の部品を示すために使用される、ということである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の適用のための適切な装置の１つの非限定的な例を模式的に示す。
【図２】図２は、本発明の１つの実施態様による装置の一側面を模式的に示す。
【図３】図３は、本発明の１つの例示的実施態様による、サンプルへ塩を加える効果を模式的に示す。
【図４】図４は、本発明の他の例示的実施態様による、サンプルへ塩を加える効果を模式的に示す。
【図５】図５は、本発明の他の例示的実施態様による、サンプルへ塩を加える効果を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明では、「ターゲット分子」とは、濃度又は存在を決定されるべき全ての分子であり得る。ターゲット分子の例は、タンパク質、酵素、ホルモン、ペプチド、核酸などの分子ターゲット、及び病原体細胞、細菌細胞及び真菌細胞などの細胞ターゲットである。前記ターゲット分子は、分析されるサンプル中などに存在するか、センサ装置内で例えば前記装置内で起こる反応を介して形成され得る。前記センサが反応をモニタするために使用される場合、前記ターゲットは例えば前記反応の出発物質又は反応生成物であり得る。
【００３５】
「溶液中で」とは、反応又はアッセイが液体環境で実施されることを意味する。使用される試薬は前記液体媒体中に溶解する必要はなく、懸濁又は分散状態で存在し得る。
【００３６】
選択的結合は、２つのモイエティ（分子）を組合せて形成される。即ちモイエティＡとモイエティＢとであり、前記２つのモイエティは特異的結合を有し、前記モイエティは他の分子よりも他の前記モイエティとより強く又は好んで結合し、他の分子とはほとんど又は全く交差反応性を示さない。一般に、モイエティＡとモイエティＢとの特異的結合の結合係数（Ｋａ）は、少なくとも１０６ｌ／ｍｏｌ、より好ましくは少なくとも１０１０ｌ／ｍｏｌ、さらに好ましくは１０１１ｌ／ｍｏｌ、さらに好ましくは少なくとも１０１２ｌ／ｍｏｌ、特にさらに好ましくは少なくとも１０１３から１０１７ｌ／ｍｏｌである。
【００３７】
図１は、本発明が適用される装置の一例示的実施態様、ここではマイクロ電子センサ装置を示す。前記装置の中心コンポーネントはキャリア１１であり、例えばガラス又はポリスチレンなどの透明プラスチックでできている。前記キャリア１１はサンプルチャンバ２の隣に設けられ、サンプルチャンバ２内に、薬物、抗体、ＤＮＡなどの検出されるべきターゲット成分を含むサンプル流体が提供され得る。
【００３８】
前記サンプルはさらに磁気粒子１、例えば超常磁性ビーズを含む。これらの粒子は通常、抗体などのモイエティ（図示されていない）に結合、例えば接着されており、これは前記キャリア１１と前記サンプルチャンバ２の間の境界、いわゆる結合表面１２と言われる境界を定める前記表面と結合するためである。この結合表面１２は場合により、例えば抗体などのキャプチャ要素でコーティングされ、特異的に前記モイエティと直接的に又はターゲット成分を介して結合し得る。言い換えると、前記結合表面１２は全ての適切なアッセイの一部を形成し得るものである。例えばサンドイッチアッセイでは、前記モイエティは前記結合表面に前記ターゲット分子を介して結合する。また競合アッセイでは、前記モイエティは前記結合表面１２での結合位置について前記ターゲット分子と競合する。また阻害アッセイでは、前記ターゲット分子が前記モイエティがこれらの結合位置に結合することを阻害する。
【００３９】
これらのセンサ装置は、磁場生成装置４１、例えばコイルとコアを持つ電磁石を含み、磁場Ｂを前記結合表面１２及び前記サンプルチャンバ２の隣接する空間に制御可能に生成する。この磁場Ｂに助けられて、磁気粒子１は操作され得る。即ち磁気化され、特に動かされる（磁場勾配が用いられる場合）。従って、例えば、前記表面へ前記磁気粒子１を持つ前記モイエティの結合を加速するために、磁気粒子１を前記表面１２に引きつける。
【００４０】
前記センサ装置は、さらに光源２１、例えば前記キャリア１１内へ透過される入力光ビームＬ１を生成するレーザー又はＬＥＤを含むことができる。前記入力光ビームＬ１は、前記結合表面１２へ全内部反射（ＴＩＲ）の臨界角θｃよりも大きい角度で到達し、従って「出力光ビーム」Ｌ２として全内部反射される。前記出力光ビームＬ２は、他の表面を通って前記キャリア１１を出ていく。これが光検出装置３１、例えば光ダイオードにより検出される。前記光検出装置３１は、前記出力光ビームＬ２の光の量を決定する（例えば、前記スペクトルの全部又はある部分でのこの光ビームの光強度により表現される）。この測定結果は、前記検出装置３１に接続された評価及び記録モジュール３２により評価され、及び場合により所定の観察期間にわたりモニタされる。
【００４１】
前記光源２１において、市販ＤＶＤレーザーダイオード（λ＝６５８ｎｍ）が使用され得る。コリメータレンズが入力光ビームＬ１を平行化するために用いられ、例えば０．５ｍｍのピンホール２３が前記ビーム直径を低減するために使用され得る。正確な測定のためには非常に安定な光源が必要である。しかし、完全に安定な電源を用いる場合でも、レーザーの温度変化は前記出力を変動させランダムに変化させ得る。
【００４２】
この問題に対処するために、前記光源は場合により、前記レーザーの出力レベルをモニタするための組み込み入力光モニタ用ダイオード２２を含み得る。前記モニタ用センサ２２の出力（ローパスフィルタされている）はその後前記評価モジュール３２と結合され得る。前記評価モジュールは前記検出装置３１からの前記（ローパスフィルタされた）光学シグナルを前記モニタ用センサ２２の出力で割算処理される。シグナル対ノイズ比を改善するために、得られたシグナルは時間平均され得る。前記割算処理は、電源変動によるレーザー出力に変動の効果を除去して安定化電源の必要を除き、同様に温度変動によるレーザー出力の変動の効果を除去してペルチェ素子などの予備的措置の必要を除く。
【００４３】
１つの実施態様では、前記レーザー出力自体が測定されず（又は測定されるだけでなく）、前記光源２１の最終出力が（もまた）測定される場合に、さらなる改善が達成される。図１に示されるように、前記レーザー出力の一部分がピンホール２３を出る。この部分のみが前記キャリア１１での実際の測定に使用され、従って前記最も直接の光源シグナルである。明らかにこの部分は前記レーザーの前記出力に関連し、例えば集積モニタ用ダイオード２２により決定されるが、前記光路でのいかなる機械的変化又は不安定性により影響は受けない。
【００４４】
従って、前記入力光ビームＬ１の光の量は、前記ピンホール２３の後及び／又は前記光源２１の最終的な全ての光学コンポーネントの後に測定することが有利である。これは例えば以下の適切な方法で実施され得る。即ち、４５度で置かれ得る平行ガラスプレート２４を用いることで、又は例えば９０％透過／１０％反射ビームスプリッタなどのビームスプリッタをピンホール２３の後ろに挿入し、前記光ビームの小部分を別の入力光モニタ用センサ２２’へ反射させることで、又は前記ピンホール２３又は入力光ビームＬ１の端部に小さいミラーを用いて前記ビームの小部分を検出装置へ反射させることで、などである。
【００４５】
図１はまた、選択的な第２の光検出装置３１’を示し、これは前記検出装置３１に代えて又は加えて粒子１から発光される蛍光を検出するために使用される。この蛍光は前記入力光ビームＬ１のエバネセンス波により増強されたものである。この蛍光は通常全ての側へ等方的に発光されるので、前記第２の検出装置３１’は原理的にあらゆる位置へ、例えばまた結合表面１２の上に設けることができる。さらに、前記検出装置３１を前記蛍光のサンプリングのために用いることももちろん可能であり、この場合前記蛍光は反射光Ｌ２とは例えばスペクトル的に区別され得る。
【００４６】
前記記載の装置は、磁気粒子１及びターゲット成分の検出のための光学手段を、非限定的例示の方法によってのみ適用するものである。理解されるべきことは、前記結合表面１２に結合される前記ラベル化モイエティの量を検出するための適する全ての技術が使用され得る、ということである。
【００４７】
そのような選択的手段の場合に、前記検出技術は、唾液、血液血清、血液血漿などのサンプル流体のバックグラウンドの影響を除去又は少なくとも低減させるために表面特定的である必要がある。これは以下説明される漏れ全内部反射の原理を用いて達成される。
【００４８】
屈折についてのスネルの法則によれば、２つの媒体Ａ及びＢの境界の法線に関して角度θＡ及びθＢを持つ場合には、次の式を満たす。
ｎＡｓｉｎθＡ＝ｎＢｓｉｎθＢ
ここでｎＡ、ｎＢはそれぞれ媒体Ａ及びＢの屈折率である。高屈折率（例えばｎＡ＝２）を持つ媒体Ａ中での光線は、より低い屈折率の媒体、例えば空気（ｎＢ＝１）又は水（ｎＢ≒１．３）との境界で、角度θＢよりも小さい角度で前記法線から離れるように屈折される。入射光の一部は前記境界で反射され、入射と同じ角度θＡを持つ。入射角度θＡが徐々に増加していくと、屈折角度θＢは９０度になるまで増加する。前記入射に対応する角度は臨界角、θＣとされ、ｓｉｎθｃ＝ｎＢ／ｎＡで与えられる。
【００４９】
入射角がより大きくなると、全ての光は媒体Ａ（ガラス）内部で反射され、これは「全内部反射」とされる。しかし媒体Ａ（ガラス）と媒体Ｂ（空気又は水）の間の境界に非常に接近すると、エバネセンス波が媒体Ｂ中に形成され、それは前記表面から離れるにつれて指数関数的に減衰する。
前記表面から距離ｚの関数として前記場の強度は次のように表される：
【００５０】
【数１】
ここでｋ＝２π／λ、θＡは全反射ビームの入射角、及びｎＡとｎＢはぞれぞれの媒体の屈折率である。
【００５１】
波長λの典型的値、例えばλ＝６５０ｎｍ及びｎＡ＝１．５３とｎＢ＝１．３３とすると、前記場の強度は、約２２８ｎｍの距離離れた後その始めの値よりもｅｘｐ（−１）≒０．３７へ減少する。このエバネセント波が図１の設定で磁気粒子１などの他の媒体と相互作用する場合、前記入射光の部分が前記サンプル流体内へ結合され（これが、「漏れ全内部反射」とされる）、前記反射強度が減少されることとなる（一方クリーンな境界でかつ相互作用がない場合には反射強度は１００％となる）。邪魔物、すなわち前記結合表面１２上又は非常に近い（約２００ｎｍ内）磁気ビーズ（サンプルチャンバ２内のその他の磁気ビーズではなく）の量に依存して、前記反射強度はそれに従い低下する。サンドイッチアッセイの場合、この強度低下は、結合された磁気ビーズの量、従ってターゲット分子の濃度の直接の測定となる。上で説明した約２００ｎｍであるエバネセンス波の相互作用距離を典型的抗体、ターゲット分子及び磁気ビーズの大きさと比較すると、前記バックグラウンドの影響は最小となることが明らかである。より長い波長λは前記相互作用距離を増加させるが、前記バックグラウンド流体の影響は非常に小さいものとなる。
【００５２】
前記説明される手順は適用される磁場とは関係しない。このことは、リアルタイムで調製、測定及び洗浄ステップを光学的にモニタすることを可能とする。前記モニタされたシグナルはまた、測定を制御し、又は個別のプロセスステップを制御するために使用され得る。
【００５３】
典型的応用の材料として、キャリア１１の媒体Ａはガラス及び／又は通常屈折率１．５２である透明プラスチックであり得る。サンプルチャンバ２での媒体Ｂは、水系であり、１．３に近い屈折率を持つものである。これは臨界角θＣが６０度に対応する。入射角７０度は従って、いくらかより大きい屈折率を持つ流体媒体を可能にする実用上の選択である。ｎＡ＝１．５２とすると、ｎＢは最大１．４３まで許容される。より高いｎＢは、より大きいｎＡ及び／又はより大きい入射角を必要とする。
【００５４】
強調されるべきことは、図１に示される本発明の装置の実施態様は、非限定的に例示する方法でのみ示される。本発明は、全てのアッセイ系センサ装置へ適用されることができ、前記アッセイ系センサ装置が前記アッセイ形成を促進する磁気駆動装置を利用するものである。というのは本発明で対処する前記問題は、例えば検出手段の実施上詳細に拘わらず、かかるセンサ装置に一般的に生じるものであるからである。異なる光学原理を利用する検出手段、例えば蛍光ラベルをさらに含む前記モイエティの場合において蛍光量を検出するように構成される前記検出手段を持つ検出手段、又は非光学原理を利用する検出手段、例えば前記磁気粒子１および生成された磁場との間の相互作用の量を検出するように構成される検出手段が、考えられる。
【００５５】
本発明により、前記装置、例えばアッセイ系センサ装置はさらに、好ましくは乾燥形の塩を、前記サンプルチャンバ２内のサンプルを受ける際に前記磁気粒子１の凝集を抑制するために含む。これは、前記結合表面１２に結合するための磁気粒子１を含む前記モイエティがまた乾燥形で前記装置に存在する場合に特に関連することである。というのは前記モイエティを前記流体サンプルで湿潤させる際に、既に説明したように磁気粒子の凝集のため前記アッセイが機能しなくなるからである。
【００５６】
図２に示されるように、前記サンプルチャンバ２は通常入口５２を含み、これはフィルタ５３を含む。前記フィルタは、前記磁気ラベル１及び前記結合表面１２を含む前記乾燥モイエティに前記サンプルを曝露する前に前記サンプルを濾過するためである。１つの好ましい実施態様では、前記塩５１は、前記サンプルチャンバ２内で乾燥形で前記磁気ラベル１を含む前記モイエティと一緒に置かれる。前記塩５１の量は、前記流体サンプルを前記入口５２を介して前記サンプルチャンバ２へ添加すると、前記サンプル中の前記塩濃度が、０．１から５Ｍの範囲となるように選択される。前記塩がこの範囲で選択される場合、前記磁気粒子１と前記サンプル内のタンパク質との間に想定される相互作用により磁気粒子１の不可逆的クラスタ化が十分低減される。次のことが見出された。即ち、このクラスタ化を低減する最良の改善は、前記塩と磁気的にラベル化されたモイエティが前記サンプルチャンバ２内で乾燥形で一緒に、即ち混合される場合であり、なぜなら前記サンプル中の前記塩の最終濃度がより好ましく制御されるからである、ということである。
【００５７】
又は前記塩５１は、前記磁気ラベル１を含む前記モイエティから上流、即ち前記サンプルが前記モイエティで濡れる前に前記塩５１を濡らすような位置に置かれ得る。例えば前記塩５１は入口５２内に置かれるか、又は前記フィルタ５３内に置かれ得る。前記フィルタ５３は例えば、血液細胞を前記サンプルから濾過するために含まれる。
【００５８】
前記サンプルチャンバ２は、本発明の装置に組み込まれた部分であり得る。又は前記サンプルチャンバ２は、この装置の再使用を促進する使い捨てカートリッジであり得る。前記結合表面１２は、前記サンプルチャンバ２の一部分であり得る（図１には図示されていない）。
【００５９】
既に説明したように、サンプル中の磁気粒子１の非可逆的凝集の量は前記サンプルの組成成分に依存する。特に、血漿サンプルは、血漿提供者間で凝集挙動が大きく変動することが示されている。実験的に次のことが確認された。即ち、Ｎａ及びＫ塩、及び特にそのハロゲン化塩が、サンプルの全範囲について磁気粒子１の望ましくないクラスタ化を効果的に低減する、ということである。さらに、次のことが見出された。即ち、特に磁気粒子を凝集させる傾向がある血漿サンプルについて、ＫＳＣＮ及びグアジミンＳＣＮなどのチオシアネート塩はかかるサンプルの磁気凝集を顕著に低減させる、ということである。
【００６０】
しかし理解されるべきことは、他のタイプの塩もまた使用可能である、ということである。例えばＭｇハロゲン化物はまた、Ｎａ及びＫ塩よりはやや低い程度であるが、高いタンパク質含有量を持つサンプル中で磁気粒子の凝集を顕著に低減させる。
【００６１】
また、心臓トロポニン又は副甲状腺ホルモンの存在を決定する場合に、ＫＢｒ及びＫＣｌの混合物が、前記サンプル内の磁気粒子の凝集を特に効果的に低減させることが見出された。
【００６２】
本発明は以下の非限定的な実施例により詳細に説明される。理解されるべきことは、ここで選択された実施例で記載されていない本発明の他の実施態様もまた可能である、ということである。
【００６３】
実施例１
実験は次のように実施された。すなわち、１００％ＥＤＴＡ血漿サンプルに種々の濃度の塩を添加し、そこに５分間磁石を適用した後、形成された粒子凝集サイズが決定された。前記凝集サイズは、光学顕微鏡を用いて確定された。使用された粒子は、ターゲット分子としてトロポニンに対するモノクローナル抗体でコーティングした５００ｎｍサイズの超常磁性粒子１であった。実験結果が表Ｉに示される。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表Ｉは明らかに次のことを示す。ＮａＣｌ及びＫＣｌを前記サンプルに添加することは、ＥＤＴＡ血漿サンプル内の磁気粒子凝集のクラスタサイズを顕著に低減する。４つ以下の磁気粒子１の小さいクラスタのみが全ての塩濃度で観察された。
【００６６】
以下の実験では、異なるタイプの凝集挙動を持つ血漿サンプルへの塩添加の効果が調べられた。３つのタイプの血漿サンプルが使用された；すなわち、磁気粒子１のクラスタ化を実質的に与えない良性サンプル、磁気粒子１の中間的なクラスタ化を与える普通サンプル、及び磁気粒子１の顕著なクラスタ化を与える悪性サンプルである。異なるタイプの血漿サンプルは異なる血漿供与者から得た。
【００６７】
実施例２
アッセイは、種々の血漿供与者からのサンプル（良性、普通、悪性）を用いて実施され、心臓トロポニン（ｃＴｎＩ）を５００ｐＭスパイクした。実験は使い捨てカートリッジを用いて行った。前記カートリッジには、トレーサであるトロポニン抗体（抗−ｃＴｎＩ）でコーティングされた乾燥の５００ｎｍサイズ磁気粒子１と、塩、 ４−（２− ヒロドキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、スクロース及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる乾燥緩衝剤とが含まれる。試験は異なるタイプの塩で繰り返された。
【００６８】
溶液中に与えられた最終塩濃度は３Ｍであった。前記アッセイは次の磁気駆動プロトコルを用いて行った。即ち１分間の粒子とサンプルのインキュベーション及び４分間の前記センサ表面で粒子のパルス駆動であり、前記センサ表面の上でキャプチャ抗−ｃＴｎＩ抗体が結合される。
【００６９】
前記表面へ結合された粒子は、図１の装置について説明されたように漏れ全内部反射の原理を用いて検出される。前記センサのシグナル強度は、結合されていない磁気粒子１をこれらの粒子をセンサ表面から離すように磁力を適用することで除去することで得られた。これらの試験結果は図３に示され、前記センサシグナル強度を、前記良性、普通、悪性の血漿サンプルに添加した塩の濃度の関数として示す。同様に表ＩＩにも示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
図３及び表ＩＩから、Ｎａ及びＫ塩が全ての血漿タイプのシグナル強度の顕著な改善を与えることが分かる。これは、より多くの磁気ラベル１がｃＴｎＩを介して抗−ｃＴｎＩ抗体に結合したことを意味し、磁気粒子１のクラスタ化を抑制することを示すものである。特にＫＢｒは、普通及び悪性血漿にも良好に作用し、塩が添加されない対応するサンプルタイプと比較すると３倍程度の改善が見られる。
【００７２】
実施例３
アッセイは、種々の血漿供与者からの良性及び悪性サンプルを用いて実施され、心臓トロポニン（ｃＴｎＩ）を５００ｐＭスパイクした。実験は使い捨てカートリッジを用いて行った。前記カートリッジには、トレーサであるトロポニン抗体（抗−ｃＴｎＩ）でコーティングされた乾燥の５００ｎｍ磁気粒子１と、塩、４−（２−ヒロドキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、スクロース及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる乾燥バッファとが含まれる。試験は異なるタイプの塩で繰り返された。溶液中に与えられた最終塩濃度は１００ｍＭであった。
【００７３】
前記アッセイは次の磁気駆動プロトコルを用いて行った。即ち１分間の粒子とサンプルのインキュベーション及び４分間の前記センサ表面で粒子をパルス駆動することであり、前記センサ表面の上でキャプチャ抗−ｃＴｎＩ抗体が結合される。
【００７４】
前記表面へ結合された粒子は、図１の装置について説明されたように漏れ全内部反射の原理を用いて検出される。前記センサのシグナル強度は、結合されていない磁気粒子１をこれらの粒子をセンサ表面から離すように磁力を適用することで除去することで得られた。これらの試験結果は図３に示され、前記センサシグナル強度を、前記良性、悪性の血漿サンプルに添加した塩の濃度の関数として示す。同様に表ＩＩＩにも示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
次のことが明確に示される。即ち、チオシアネート塩、及び特にグアニジンチオシアネート塩が悪性血漿内のセンサシグナル強度を顕著に改善する、ことである。これは、より多くの磁気ラベル１が前記ｃＴｎＩを介して抗−ｃＴｎＩ抗体に結合されることを意味し、従って磁気粒子１のクラスタ化を低減することを示す。
【００７７】
実施例４
アッセイは、種々の血漿提供者（Ｓ６９８、Ｓ７０１、Ｓ７０５、Ｓ７１０）からのサンプル及び５００ｐＭの副甲状腺ホルモン（ＰＨＦ）をスパイクした緩衝液を用いて行った。試験は、使い捨てカートリッジ内で行った。前記カートリッジには、トレーサーとして抗−ＰＨＴ抗体をコーティングした乾燥５００ｎｍサイズ磁気粒子とＫＣｌ（１．５Ｍ）、ＨＥＰＥＳ、スクロース及びＢＳＡからなる乾燥緩衝物を含む。コントロールサンプルにＫＣｌは添加されていない。それぞれの試験はそれぞれのサンプルについて２回行った。
【００７８】
前記アッセイは、２分間前記粒子をサンプルとインキュベーションし、さらに８分間キャプチャ抗−ＰＴＨ抗体を結合した前記センサ表面の前記粒子をパルス駆動する磁気駆動プロトコルを用いて実施された。前記表面に結合した粒子は、既に説明した漏れ全内部反射を用いて検出された。
【００７９】
前記センサのシグナルの強度は、結合していない磁気粒子１を、これらの粒子をセンサ表面から離すように磁力を適用することで得た。これらの実験の結果は図５に示され、１つのサンプルに対して２回の試験による平均センサシグナル強度が、種々の血漿サンプルと緩衝液サンプルに添加された塩の関数として示されおり、表ＩＶにまとめられている。
【００８０】
【表４】
【００８１】
これらから次のことが分かる。即ち、悪性サンプルＳ７１０（このサンプルの小さいシグナル強度から、粒子１がこのサンプル中では強くクラスタ化していることが明らかである）以外の全てのサンプルタイプは、ＫＣｌの添加がセンサシグナツ強度を顕著に改善すること、である。これは、より多くの磁気ラベル１が、前記抗−ＰＴＨ抗体に前記ＰＴＨを介して前記センサ表面に結合されたことを意味し、このことはこれらのサンプル中で磁気粒子１の阻害クラスタ化を低減することを示す。予想できるように、前記緩衝液でのシグナル強度の改善は、前記緩衝液中のタンパク質の不存在により達成されたものである。これはまた、サンプル中のかかるタンパク質含有量は磁気粒子１の非可逆的凝集の原因であることを明らかに示すものである。
【００８２】
前記の心臓トロポニンＩ又はＰＴＨについての実験で得られたものと同様な改善がまた。実験で使用されたそれぞれの抗体をＮ−末端ｐｒｏＢｒａｉｎ利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）と交換した実験でも得られた。従って、本発明は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの決定に依存するアッセイにおいても同様に有効である。
【００８３】
まとめると、前記実験例は、前記サンプルに適切な塩を添加することが、磁気粒子１でラベル化された前記モイエティの凝集挙動を大きく改善する、ということを明らかに示す。
【００８４】
強調されるべきことは、前記実験例は本発明の範囲を限定することを意図するものではない、ということであり、かつここでは簡潔性の理由から与えられなかった多くの実験例が存在する、ということである。例えば、凝集挙動の同様の低減は、唾液などの他の高タンパク質含有材料においても観察された。従って、本発明は、唾液中のＴＨＣ、モルフィン、メタンフェタミン、アンメタフィン及びコカインなどの薬物の乱用を検出するためのアッセイ系の磁気粒子への応用可能なものである。かかるアッセイにおいて、例えば１ＭのＮａＣｌの添加が磁気粒子１の凝集を顕著に低減させることが見出された。
【００８５】
当業者であれば、本発明の記載に基づき、必要な磁気化可能又は磁気粒子に基づくアッセイについてなんら困難なく、本発明の利点を与えるタンパク質及び塩のその他の組合せについて認識することができるはずである。
【００８６】
留意すべきことは、前記実施態様は本発明を限定するものではなく、当業者であれば、特許請求の範囲の範囲から離れることなく、多くの変更・変法を設計することができるはずである、ということである。特許請求の範囲において、括弧内の参照符号は特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない。用語「含む」は、請求項に記載される要素又はステップが複数であることを除外するものではない。要素の前に付される「１つの」はそれが複数であることを除外するものではない。本発明は、いくつかの別々の要素からなるハードウェアの手段で実施され得る。いくつかの手段が列記される装置に係る請求項において、それらの手段のいくつかはハードウェアの１つの事項及び同じ事項により実施され得る。ある手段が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せが有利なものではないということを意味するものではない。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、磁気及び／又は磁気化可能ラベルを含むモイエティを用いる、サンプル中のターゲット分子の存在を決定する方法に関する。本発明はさらにかかる方法のための装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
医学診断の分野において、唾液、血液、血清、血漿、尿などを含む体液サンプルなどの種々のサンプルにおいて対象となる広い範囲の検体の存在及び濃度を正確に決定できるものであることから、アッセイ系センサ装置は急速に注目度が高くなってきている。
【０００３】
このために、蛍光又は化学発光プローブ、発色基質変換のための酵素又は磁気及び／又は磁気化可能粒子などの検出可能なラベルを含むモイエティ（ｍｏｉｅｔｙ）が提供されており、これは、測定装置の結合表面、例えばセンサに特異的に結合し得るものである。この結合表面に結合する前記モイエティの量は、前記サンプル中に存在する対象検体又はターゲット分子の量を示すものである。というのは、例えば前記モイエティは、いわゆるサンドイッチアッセイなどにおいて、前記検体を介してのみ前記結合表面に結合し得るからであり、前記モイエティは、いわゆる競合アッセイなどにおいて、前記結合表面の限定された数の空間に前記検体と結合競合するからであり、又はいわゆる阻害アッセイなどにおいて、前記検体がまた特異的に前記モイエティと同じエピトープに結合して前記モイエティが前記結合表面へ結合することを阻害するから、である。さらなる知られたアッセイの例は、例えば国際特許出願公開第２００７／０６０６０１号に開示され、及び他の例も当業者には明らかである。
【０００４】
言い換えると、前記ターゲット分子又は前記モイエティのいずれかが、例えば前記装置の結合表面を定める抗体と特異的に結合し、それにより前記検体の濃度が、前記特異的結合形成の際に前記結合表面領域での検出可能なラベルの存在から決定され得る。多くの適切な特異的結合対の候補が自体知られており、通常、レセプタ分子と分子、例えば薬物との間の鍵と鍵穴タイプに基づくものである。このことは、アッセイ系装置を、特定のタンパク質及びその他の生物学的組成物、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、代謝産物、薬物などの存在又は不存在を決定するため、又はタンパク質、ペプチド、プリオン、酵素、アプタマー、リボザイム及びデオキシリボザイムなどの活性及び触媒的分子の活性及び機能を決定するために、特に適したものとする。例えば、免疫アッセイは、さらに診断及び処置を補助するために体液中の特定のタンパク質の特定の量を決定するために使用されている。
【０００５】
かかるアッセイ系装置の使用は、医学的診断の分野に有望な新たな機会を与えるものである。例えば医院、病院の病室、救急室及び患者の自宅などの実験室外の環境で迅速に医学診断に使用されるためのハンドヘルドバイオセンサシステムの提供などである。対象物の診断試験の例は、心筋梗塞の診断マーカーである心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の検出である。
【０００６】
理解されるべきことは、迅速性に加えて、かかる診断試験は、ある疾患バイオマーカがピコモル範囲での検出が必要とされるなど、高感度が要求される、ということである。かかる診断試験を実行するための特に有望な装置は、前記結合表面に特異的に結合するための磁気又は磁気化可能粒子でラベル化されたモイエティを用いるものである。というのは、磁場は前記磁気ラベルを前記結合表面へ向かって加速（引きつける）することができ、従って前記モイエティと前記結合表面との間で前記結合反応を加速する。結合していないモイエティを、例えば洗浄又は濯ぐことで除去した後、前記結合表面に結合される前記モイエティの量は、前記結合表面の前記表面の近くに存在する磁気ラベルの量により決定され得る。例えば光反射技術又は磁気検出技術などの方法による。
【０００７】
実験室外の環境で試験するために、診断試験がコンパクトで丈夫であることが要求され、かつユーザが補助するステップができるだけ少ないことが要求される。理想的には、ユーザは前記サンプルを使い捨てカートリッジに加えることだけが必要であり、かつ前記診断試験のための全ての試薬が既に前記カートリッジに入れられており、さらに、前記試薬がしばしばドライフォームと参照される固体状態で存在するものである。タンパク質マーカーの検出のため、好ましいサンプルタイプは、血液が全身レベルの直接指標であることから、血液である。多くの場合に、血液はさらに、血球細胞除去処理されて検体試験のために血清又は血漿とする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際特許出願公開第２００７／０６０６０１号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者は、例えば生物学的サンプルに使用される場合には、前記のように試験アッセイでの磁気又は磁気化可能粒子モイエティの使用には問題があることを見出した。前記サンプルで決定されるべき検体の濃度（レベル）に拘わらず、測定値、即ち前記回収率（リカバリ）が低い、ということが見出された。検体の回収率は、前記サンプルの提供者試験体に強く依存し、同様に対象検体のタイプに依存する。前記干渉が無視できる程度の特定の提供者が存在し、また他の提供者には係る効果は顕著である。平均すると、例えば対象検体としての心臓トロポニンＩについては全ての提供者サンプルの約１５％が、前記アッセイが機能しない顕著な干渉を示す。
【００１０】
従って、前記方法及び装置の再現性が損なわれることが見出された。
【００１１】
さらに、この問題は、ラベル化モイエティの量を操作又は測定するために磁気駆動を利用するアッセイを阻害する。前記アッセイの間に磁場を適用することは、磁気粒子を強制的に集め得る。このことは、磁気粒子が直径１００ｎｍより大きい場合に特にそうである。かかる粒子は磁場がない場合でさえクラスタ化する傾向を持つ。これに代えて又はこれに加えて、磁気粒子及び／又は磁気化可能粒子又はラベルを含むモイエティはサンプルの適用の前に固体形で装置内に堆積されることができ、及び前記装置へ前記流体サンプルが添加される際に再分散されて、前記磁気及び／又は磁気化可能性粒子が最初の塊状状態から分散される。
【００１２】
前記の信頼性及び再現性の問題は、独立請求項に定める本発明により低減され得る。従属請求項は有利な実施態様を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
驚くべきことに、対象サンプルに塩を添加することが、前記アッセイ方法及びかかるアッセイを実施するための装置に信頼性及び／又は再現性を改善することが見出された。
【００１４】
提供者ごとの変動の理由は、例えば血漿及び血清のタンパク質、脂質、電解質、ホルモンなどのサンプルの組成物が実質的に患者ごとに変動するからである、と考えられている。本発明者による種々の提供者サンプルの分析は、血漿又は血清などのサンプル内の、例えばタンパク質は前記粒子の表面に吸収されて、不可逆的な磁気又は磁気化可能粒子間の相互作用を低減することを示唆する。この問題はまた、全血液がサンプルマトリクスとして、「そのまま」の形又は溶解させた形のいずれかとして適用される場合に現れる。塩の添加は、前記結合表面に結合するために存在する前記モイエティの磁気及び／又は磁気化可能ラベルの塊状化を予防するか少なくとも低減させる、と現在考えられている。従って前記濃度に相対するより正確かつ高精度シグナルが結合事象ごとに検出され、再現性及び信頼性について改善される。
【００１５】
従って、溶解すると、前記装置へ前記サンプルを添加した後前記サンプルと共に分散された磁気及び／又は磁気化可能粒子の塊状化を低減させる塩を含む装置は、前記説明したように有益である。
【００１６】
前記サンプルはあらゆる由来の分析サンプルであって、塩の添加なしで使用されると前記のクラスタ化回収率問題を生じるサンプルであり得る。前記サンプルは、動物又は人間の身体性サンプルであり得る。またはタンパク質及び／又は脂質含有物を含むサンプルであり得る。前記サンプルは、好ましくは唾液、血液、血液血清、血液血漿であり得る。又は前記サンプルはその他の身体からの流体形であり得る。一般的にはかかるサンプルは水系であるが、他の溶媒、例えば標本からの前記サンプルを得た後加えられた溶媒もあり得る。ただし得られたサンプル中の塩の溶解が可能となる必要がある。理解されるべきことは、身体由来ではないが体性流体と同様のクラスタ化成分を含む実験室サンプルもまた、本発明のアッセイ方法で有利に分析され得るということである。
【００１７】
前記モイエティは、生物学的物質又はその断片又は細胞などの生物学的要素の部分である検体の指標であり得る。生物学的物質には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ホルモン、代謝産物、薬物などが含まれ、又はタンパク質、ペプチド、プリオン、酵素、アプタマー、リボザイム及びデオキシリボザイムなどの活性及び触媒性生体分子の活性度及び機能を決める物質が含まれる。好ましくは前記モイエティは、体性タンパク質及び／又はその断片の存在を指標するものである。前記モイエティは、好ましくは、対象検体と特異的に相互作用するモノ及び／又はポリクローナル抗体である。好ましくは前記モイエティは、心疾患予測をスクリーニングし及び／又は診断し及び／又は決定するために使用され得る検体についての指標となるように選択される。従って、本発明のアッセイは、例えばうっ血性心不全（ＣＨＦ）の試験に有利であり、これは現在Ｂタイプ利尿ペプチド（又ＢＮＰ）又はＧＣ−Ｂとして知られてる利尿ペプチド（ＢＮＰ）を指標するモイエティを使用することで診断され、又はｐｒｏＢＮＰの生物学的不活性のＮ末端断片であるＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを指標するモイエティを使用され得る。また、前記アッセイは、トロポニンＩ及び／又はＴの存在を示すモイエティを用いて心筋梗塞又は心不全を試験するために有利である。さらに、前記モイエティは、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）又は上皮小体ホルモンの存在の指標であり、人又は動物の知られた関連する疾患を診断するために使用され得る副甲状腺機能亢進症又は副甲状腺機能低下症を試験するために使用され得る。
【００１８】
前記サンプル中に溶解させる塩濃度は、好ましくは０．１〜５モル／Ｌであることが必要である。というのはこの範囲であれば磁気ラベルの凝集が抑制され得ることが、見出されたからである。
【００１９】
前記装置に与えられる塩の量は、ある所定の容量のサンプルチャンバを満たした際に、前記クラスタ化抑制効果を与えるに適する濃度に到達するように、調節され得る。従って前記サンプルチャンバと塩の量は、前記アッセイの間、０．１から５モル／Ｌの範囲となるような範囲である。
【００２０】
適切な塩には、リチウム、ナトリウム又はカリウムなどのアルカリ金属塩が挙げられる。好ましくは塩は、ナトリウム（Ｎａ）及び／又はカリウム（Ｋ）塩が含まれ、例えば塩化カリウム（ＫＣｌ）、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、臭化カリウム（ＫＢｒ）、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）及びそれらの組合せが挙げられる。かかる塩は、最大の改良を与えることが見出された。即ち、磁気及び／又は磁気化可能粒子の凝集化挙動を最も強く低減させる。
【００２１】
好ましい実施態様では、ＫＣｌ及びＫＢｒの組合せが使用される。これは特に対象検体として、心臓トロポニンＩ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又は副甲状腺ホルモンを含むサンプル中でクラスタ形成を効果的に低減するものである。
【００２２】
又は塩は、カリウムチオシアネート（ＫＳＣＮ）及びグアジニンイソシアネートなどのチオシアネート塩である。かかる塩は、サンプルの挙動、特に血清サンプルの挙動を効果的に改善するものである。血清サンプルの挙動は前記の干渉の影響を強く受けるものである。
【００２３】
前記塩及びモイエティは、ドライフォームとして参照される固体形で装置に一緒に入れられ得る。かかる場合に、本発明は特に効果的となる。というのは磁気及び／又は磁気化可能ラベルモイエティを含む装置を長時間保存することが、使用の前及び／又は使用の際に前記ラベルの強い凝集を生じる恐れがあるからである。例えば、前記装置は、前記結合表面を含むサンプルチャンバに接続された入口を有することができ、前記塩は前記入口に置かれる。前記入口は前記サンプルを濾過する濾過手段を含み、前記濾過手段がさらに前記塩を含む。前記磁気ラベルを持つ前記モイエティから上流に前記塩を置くことで、前記塩は、前記サンプルが前記モイエティを含む測定チャンバに到達する前に前記サンプル中に溶解され得る。
【００２４】
又は、前記塩及び前記モイエティは一緒に固体形で前記装置内に置かれる。前記塩と前記モイエティを混合し、それを前記装置内の同じ場所に一緒に置くことで、前記サンプル中で前記磁気及び／又は磁気化可能ラベルの凝集がより効果的に抑制される。
【００２５】
１つの実施態様では、前記装置は前記サンプルを受ける使い捨てカートリッジであり、ある量の前記塩及び前記モイエティが入れられている。これは、前記カートリッジを受け、前記カートリッジの前記結合表面上の前記モイエティを測定することができる別の装置が使用され得る、という利点を有する。従ってそれぞれのサンプルについて、複数の測定には、前記カートリッジを交換することだけを必要とする。従って、使い捨てカートリッジは前記装置と独立して提供され得る。
【００２６】
前記装置は、前記結合表面の存在を決定するための検出手段を含み得る。好ましくは、かかる手段は、光学手段であって、例えば漏れ全反射（ｆｒｕｓｔｒａｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）ユニット、又はその他の顕微鏡ユニットであって、前記結合表面上の磁気及び／又は磁気化粒子を検出可能な手段である。又は、前記検出手段は磁気手段であってよく、それを介して前記結合表面上の磁気及び／又は磁気化ラベルを検出することができる、手段である。
【００２７】
前記装置は、前記結合表面上の磁気又は磁気化可能ラベルを引きつけるための磁場発生装置を含む。これは、前記結合表面での前記モイエティの濃度を増加させることで前記結合表面での前記結合反応のために必要な時間を低減する。
【００２８】
本発明の他の実施態様により、サンプル中のターゲット分子を、磁気又は磁気化可能ラベルと本発明による前記塩との組合せを用いて測定する方法が提供される。前記方法は、例えば阻害アッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイなどの生物学的アッセイ又はその一部であり得る。さらに、前記アッセイは液体又は液化（例えば水に溶解して）生物学的サンプルに向けられ得る。前記本発明の方法の構成は、前記装置についての構成と類似する。本発明の方法は同様の有利な効果を持つ。
【００２９】
好ましくは、前記方法はさらに、前記測定の精度をさらに高めるために前記測定ステップに先立って前記結合表面の近くから結合されていない磁気ラベルを除去することを含む。かかる除去は、例えば洗浄又は濯ぎ又は磁気駆動により達成され得る。
【００３０】
前記方法は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰを指標するモイエティを用いてうっ血性心不全の診断方法、又は前記モイエティが心臓トロポニンＩ又はＴを指標するように選択される場合には、心筋梗塞の診断方法であり得る。これらの場合のサンプルは好ましくは血液である。かかる診断における決定的なこれらの心臓疾患マーカーの境界レベルは、当技術分野においてよく知られている。前記方法は、前記決定される検体レベルが前記境界レベルと比較され、かかる境界レベルよりも高いか低いかが示されるステップを含む。
【００３１】
本発明の実施態様は、添付の図面を参照して、非限定的な例示により、より詳細に説明される。
【００３２】
理解されるべきことは、図は模式的にのみ示されており寸法通りではない、ということである。さらに理解されるべきことは、図を通じて同じ参照符号は同じ又は類似の部品を示すために使用される、ということである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、本発明の適用のための適切な装置の１つの非限定的な例を模式的に示す。
【図２】図２は、本発明の１つの実施態様による装置の一側面を模式的に示す。
【図３】図３は、本発明の１つの例示的実施態様による、サンプルへ塩を加える効果を模式的に示す。
【図４】図４は、本発明の他の例示的実施態様による、サンプルへ塩を加える効果を模式的に示す。
【図５】図５は、本発明の他の例示的実施態様による、サンプルへ塩を加える効果を模式的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明では、「ターゲット分子」とは、濃度又は存在を決定されるべき全ての分子であり得る。ターゲット分子の例は、タンパク質、酵素、ホルモン、ペプチド、核酸などの分子ターゲット、及び病原体細胞、細菌細胞及び真菌細胞などの細胞ターゲットである。前記ターゲット分子は、分析されるサンプル中などに存在するか、センサ装置内で例えば前記装置内で起こる反応を介して形成され得る。前記センサが反応をモニタするために使用される場合、前記ターゲットは例えば前記反応の出発物質又は反応生成物であり得る。
【００３５】
「溶液中で」とは、反応又はアッセイが液体環境で実施されることを意味する。使用される試薬は前記液体媒体中に溶解する必要はなく、懸濁又は分散状態で存在し得る。
【００３６】
選択的結合は、２つのモイエティ（分子）を組合せて形成される。即ちモイエティＡとモイエティＢとであり、前記２つのモイエティは特異的結合を有し、前記モイエティは他の分子よりも他の前記モイエティとより強く又は好んで結合し、他の分子とはほとんど又は全く交差反応性を示さない。一般に、モイエティＡとモイエティＢとの特異的結合の結合係数（Ｋａ）は、少なくとも１０６ｌ／ｍｏｌ、より好ましくは少なくとも１０１０ｌ／ｍｏｌ、さらに好ましくは１０１１ｌ／ｍｏｌ、さらに好ましくは少なくとも１０１２ｌ／ｍｏｌ、特にさらに好ましくは少なくとも１０１３から１０１７ｌ／ｍｏｌである。
【００３７】
図１は、本発明が適用される装置の一例示的実施態様、ここではマイクロ電子センサ装置を示す。前記装置の中心コンポーネントはキャリア１１であり、例えばガラス又はポリスチレンなどの透明プラスチックでできている。前記キャリア１１はサンプルチャンバ２の隣に設けられ、サンプルチャンバ２内に、薬物、抗体、ＤＮＡなどの検出されるべきターゲット成分を含むサンプル流体が提供され得る。
【００３８】
前記サンプルはさらに磁気粒子１、例えば超常磁性ビーズを含む。これらの粒子は通常、抗体などのモイエティ（図示されていない）に結合、例えば接着されており、これは前記キャリア１１と前記サンプルチャンバ２の間の境界、いわゆる結合表面１２と言われる境界を定める前記表面と結合するためである。この結合表面１２は場合により、例えば抗体などのキャプチャ要素でコーティングされ、特異的に前記モイエティと直接的に又はターゲット成分を介して結合し得る。言い換えると、前記結合表面１２は全ての適切なアッセイの一部を形成し得るものである。例えばサンドイッチアッセイでは、前記モイエティは前記結合表面に前記ターゲット分子を介して結合する。また競合アッセイでは、前記モイエティは前記結合表面１２での結合位置について前記ターゲット分子と競合する。また阻害アッセイでは、前記ターゲット分子が前記モイエティがこれらの結合位置に結合することを阻害する。
【００３９】
これらのセンサ装置は、磁場生成装置４１、例えばコイルとコアを持つ電磁石を含み、磁場Ｂを前記結合表面１２及び前記サンプルチャンバ２の隣接する空間に制御可能に生成する。この磁場Ｂに助けられて、磁気粒子１は操作され得る。即ち磁気化され、特に動かされる（磁場勾配が用いられる場合）。従って、例えば、前記表面へ前記磁気粒子１を持つ前記モイエティの結合を加速するために、磁気粒子１を前記表面１２に引きつける。
【００４０】
前記センサ装置は、さらに光源２１、例えば前記キャリア１１内へ透過される入力光ビームＬ１を生成するレーザー又はＬＥＤを含むことができる。前記入力光ビームＬ１は、前記結合表面１２へ全内部反射（ＴＩＲ）の臨界角θｃよりも大きい角度で到達し、従って「出力光ビーム」Ｌ２として全内部反射される。前記出力光ビームＬ２は、他の表面を通って前記キャリア１１を出ていく。これが光検出装置３１、例えば光ダイオードにより検出される。前記光検出装置３１は、前記出力光ビームＬ２の光の量を決定する（例えば、前記スペクトルの全部又はある部分でのこの光ビームの光強度により表現される）。この測定結果は、前記検出装置３１に接続された評価及び記録モジュール３２により評価され、及び場合により所定の観察期間にわたりモニタされる。
【００４１】
前記光源２１において、市販ＤＶＤレーザーダイオード（λ＝６５８ｎｍ）が使用され得る。コリメータレンズが入力光ビームＬ１を平行化するために用いられ、例えば０．５ｍｍのピンホール２３が前記ビーム直径を低減するために使用され得る。正確な測定のためには非常に安定な光源が必要である。しかし、完全に安定な電源を用いる場合でも、レーザーの温度変化は前記出力を変動させランダムに変化させ得る。
【００４２】
この問題に対処するために、前記光源は場合により、前記レーザーの出力レベルをモニタするための組み込み入力光モニタ用ダイオード２２を含み得る。前記モニタ用センサ２２の出力（ローパスフィルタされている）はその後前記評価モジュール３２と結合され得る。前記評価モジュールは前記検出装置３１からの前記（ローパスフィルタされた）光学シグナルを前記モニタ用センサ２２の出力で割算処理される。シグナル対ノイズ比を改善するために、得られたシグナルは時間平均され得る。前記割算処理は、電源変動によるレーザー出力に変動の効果を除去して安定化電源の必要を除き、同様に温度変動によるレーザー出力の変動の効果を除去してペルチェ素子などの予備的措置の必要を除く。
【００４３】
１つの実施態様では、前記レーザー出力自体が測定されず（又は測定されるだけでなく）、前記光源２１の最終出力が（もまた）測定される場合に、さらなる改善が達成される。図１に示されるように、前記レーザー出力の一部分がピンホール２３を出る。この部分のみが前記キャリア１１での実際の測定に使用され、従って前記最も直接の光源シグナルである。明らかにこの部分は前記レーザーの前記出力に関連し、例えば集積モニタ用ダイオード２２により決定されるが、前記光路でのいかなる機械的変化又は不安定性により影響は受けない。
【００４４】
従って、前記入力光ビームＬ１の光の量は、前記ピンホール２３の後及び／又は前記光源２１の最終的な全ての光学コンポーネントの後に測定することが有利である。これは例えば以下の適切な方法で実施され得る。即ち、４５度で置かれ得る平行ガラスプレート２４を用いることで、又は例えば９０％透過／１０％反射ビームスプリッタなどのビームスプリッタをピンホール２３の後ろに挿入し、前記光ビームの小部分を別の入力光モニタ用センサ２２’へ反射させることで、又は前記ピンホール２３又は入力光ビームＬ１の端部に小さいミラーを用いて前記ビームの小部分を検出装置へ反射させることで、などである。
【００４５】
図１はまた、選択的な第２の光検出装置３１’を示し、これは前記検出装置３１に代えて又は加えて粒子１から発光される蛍光を検出するために使用される。この蛍光は前記入力光ビームＬ１のエバネセンス波により増強されたものである。この蛍光は通常全ての側へ等方的に発光されるので、前記第２の検出装置３１’は原理的にあらゆる位置へ、例えばまた結合表面１２の上に設けることができる。さらに、前記検出装置３１を前記蛍光のサンプリングのために用いることももちろん可能であり、この場合前記蛍光は反射光Ｌ２とは例えばスペクトル的に区別され得る。
【００４６】
前記記載の装置は、磁気粒子１及びターゲット成分の検出のための光学手段を、非限定的例示の方法によってのみ適用するものである。理解されるべきことは、前記結合表面１２に結合される前記ラベル化モイエティの量を検出するための適する全ての技術が使用され得る、ということである。
【００４７】
そのような選択的手段の場合に、前記検出技術は、唾液、血液血清、血液血漿などのサンプル流体のバックグラウンドの影響を除去又は少なくとも低減させるために表面特定的である必要がある。これは以下説明される漏れ全内部反射の原理を用いて達成される。
【００４８】
屈折についてのスネルの法則によれば、２つの媒体Ａ及びＢの境界の法線に関して角度θＡ及びθＢを持つ場合には、次の式を満たす。
ｎＡｓｉｎθＡ＝ｎＢｓｉｎθＢ
ここでｎＡ、ｎＢはそれぞれ媒体Ａ及びＢの屈折率である。高屈折率（例えばｎＡ＝２）を持つ媒体Ａ中での光線は、より低い屈折率の媒体、例えば空気（ｎＢ＝１）又は水（ｎＢ≒１．３）との境界で、角度θＢよりも小さい角度で前記法線から離れるように屈折される。入射光の一部は前記境界で反射され、入射と同じ角度θＡを持つ。入射角度θＡが徐々に増加していくと、屈折角度θＢは９０度になるまで増加する。前記入射に対応する角度は臨界角、θＣとされ、ｓｉｎθｃ＝ｎＢ／ｎＡで与えられる。
【００４９】
入射角がより大きくなると、全ての光は媒体Ａ（ガラス）内部で反射され、これは「全内部反射」とされる。しかし媒体Ａ（ガラス）と媒体Ｂ（空気又は水）の間の境界に非常に接近すると、エバネセンス波が媒体Ｂ中に形成され、それは前記表面から離れるにつれて指数関数的に減衰する。
前記表面から距離ｚの関数として前記場の強度は次のように表される：
【００５０】
【数１】
ここでｋ＝２π／λ、θＡは全反射ビームの入射角、及びｎＡとｎＢはぞれぞれの媒体の屈折率である。
【００５１】
波長λの典型的値、例えばλ＝６５０ｎｍ及びｎＡ＝１．５３とｎＢ＝１．３３とすると、前記場の強度は、約２２８ｎｍの距離離れた後その始めの値よりもｅｘｐ（−１）≒０．３７へ減少する。このエバネセント波が図１の設定で磁気粒子１などの他の媒体と相互作用する場合、前記入射光の部分が前記サンプル流体内へ結合され（これが、「漏れ全内部反射」とされる）、前記反射強度が減少されることとなる（一方クリーンな境界でかつ相互作用がない場合には反射強度は１００％となる）。邪魔物、すなわち前記結合表面１２上又は非常に近い（約２００ｎｍ内）磁気ビーズ（サンプルチャンバ２内のその他の磁気ビーズではなく）の量に依存して、前記反射強度はそれに従い低下する。サンドイッチアッセイの場合、この強度低下は、結合された磁気ビーズの量、従ってターゲット分子の濃度の直接の測定となる。上で説明した約２００ｎｍであるエバネセンス波の相互作用距離を典型的抗体、ターゲット分子及び磁気ビーズの大きさと比較すると、前記バックグラウンドの影響は最小となることが明らかである。より長い波長λは前記相互作用距離を増加させるが、前記バックグラウンド流体の影響は非常に小さいものとなる。
【００５２】
前記説明される手順は適用される磁場とは関係しない。このことは、リアルタイムで調製、測定及び洗浄ステップを光学的にモニタすることを可能とする。前記モニタされたシグナルはまた、測定を制御し、又は個別のプロセスステップを制御するために使用され得る。
【００５３】
典型的応用の材料として、キャリア１１の媒体Ａはガラス及び／又は通常屈折率１．５２である透明プラスチックであり得る。サンプルチャンバ２での媒体Ｂは、水系であり、１．３に近い屈折率を持つものである。これは臨界角θＣが６０度に対応する。入射角７０度は従って、いくらかより大きい屈折率を持つ流体媒体を可能にする実用上の選択である。ｎＡ＝１．５２とすると、ｎＢは最大１．４３まで許容される。より高いｎＢは、より大きいｎＡ及び／又はより大きい入射角を必要とする。
【００５４】
強調されるべきことは、図１に示される本発明の装置の実施態様は、非限定的に例示する方法でのみ示される。本発明は、全てのアッセイ系センサ装置へ適用されることができ、前記アッセイ系センサ装置が前記アッセイ形成を促進する磁気駆動装置を利用するものである。というのは本発明で対処する前記問題は、例えば検出手段の実施上詳細に拘わらず、かかるセンサ装置に一般的に生じるものであるからである。異なる光学原理を利用する検出手段、例えば蛍光ラベルをさらに含む前記モイエティの場合において蛍光量を検出するように構成される前記検出手段を持つ検出手段、又は非光学原理を利用する検出手段、例えば前記磁気粒子１および生成された磁場との間の相互作用の量を検出するように構成される検出手段が、考えられる。
【００５５】
本発明により、前記装置、例えばアッセイ系センサ装置はさらに、好ましくは乾燥形の塩を、前記サンプルチャンバ２内のサンプルを受ける際に前記磁気粒子１の凝集を抑制するために含む。これは、前記結合表面１２に結合するための磁気粒子１を含む前記モイエティがまた乾燥形で前記装置に存在する場合に特に関連することである。というのは前記モイエティを前記流体サンプルで湿潤させる際に、既に説明したように磁気粒子の凝集のため前記アッセイが機能しなくなるからである。
【００５６】
図２に示されるように、前記サンプルチャンバ２は通常入口５２を含み、これはフィルタ５３を含む。前記フィルタは、前記磁気ラベル１及び前記結合表面１２を含む前記乾燥モイエティに前記サンプルを曝露する前に前記サンプルを濾過するためである。１つの好ましい実施態様では、前記塩５１は、前記サンプルチャンバ２内で乾燥形で前記磁気ラベル１を含む前記モイエティと一緒に置かれる。前記塩５１の量は、前記流体サンプルを前記入口５２を介して前記サンプルチャンバ２へ添加すると、前記サンプル中の前記塩濃度が、０．１から５Ｍの範囲となるように選択される。前記塩がこの範囲で選択される場合、前記磁気粒子１と前記サンプル内のタンパク質との間に想定される相互作用により磁気粒子１の不可逆的クラスタ化が十分低減される。次のことが見出された。即ち、このクラスタ化を低減する最良の改善は、前記塩と磁気的にラベル化されたモイエティが前記サンプルチャンバ２内で乾燥形で一緒に、即ち混合される場合であり、なぜなら前記サンプル中の前記塩の最終濃度がより好ましく制御されるからである、ということである。
【００５７】
又は前記塩５１は、前記磁気ラベル１を含む前記モイエティから上流、即ち前記サンプルが前記モイエティで濡れる前に前記塩５１を濡らすような位置に置かれ得る。例えば前記塩５１は入口５２内に置かれるか、又は前記フィルタ５３内に置かれ得る。前記フィルタ５３は例えば、血液細胞を前記サンプルから濾過するために含まれる。
【００５８】
前記サンプルチャンバ２は、本発明の装置に組み込まれた部分であり得る。又は前記サンプルチャンバ２は、この装置の再使用を促進する使い捨てカートリッジであり得る。前記結合表面１２は、前記サンプルチャンバ２の一部分であり得る（図１には図示されていない）。
【００５９】
既に説明したように、サンプル中の磁気粒子１の非可逆的凝集の量は前記サンプルの組成成分に依存する。特に、血漿サンプルは、血漿提供者間で凝集挙動が大きく変動することが示されている。実験的に次のことが確認された。即ち、Ｎａ及びＫ塩、及び特にそのハロゲン化塩が、サンプルの全範囲について磁気粒子１の望ましくないクラスタ化を効果的に低減する、ということである。さらに、次のことが見出された。即ち、特に磁気粒子を凝集させる傾向がある血漿サンプルについて、ＫＳＣＮ及びグアジミンＳＣＮなどのチオシアネート塩はかかるサンプルの磁気凝集を顕著に低減させる、ということである。
【００６０】
しかし理解されるべきことは、他のタイプの塩もまた使用可能である、ということである。例えばＭｇハロゲン化物はまた、Ｎａ及びＫ塩よりはやや低い程度であるが、高いタンパク質含有量を持つサンプル中で磁気粒子の凝集を顕著に低減させる。
【００６１】
また、心臓トロポニン又は副甲状腺ホルモンの存在を決定する場合に、ＫＢｒ及びＫＣｌの混合物が、前記サンプル内の磁気粒子の凝集を特に効果的に低減させることが見出された。
【００６２】
本発明は以下の非限定的な実施例により詳細に説明される。理解されるべきことは、ここで選択された実施例で記載されていない本発明の他の実施態様もまた可能である、ということである。
【００６３】
実施例１
実験は次のように実施された。すなわち、１００％ＥＤＴＡ血漿サンプルに種々の濃度の塩を添加し、そこに５分間磁石を適用した後、形成された粒子凝集サイズが決定された。前記凝集サイズは、光学顕微鏡を用いて確定された。使用された粒子は、ターゲット分子としてトロポニンに対するモノクローナル抗体でコーティングした５００ｎｍサイズの超常磁性粒子１であった。実験結果が表Ｉに示される。
【００６４】
【表１】
【００６５】
表Ｉは明らかに次のことを示す。ＮａＣｌ及びＫＣｌを前記サンプルに添加することは、ＥＤＴＡ血漿サンプル内の磁気粒子凝集のクラスタサイズを顕著に低減する。４つ以下の磁気粒子１の小さいクラスタのみが全ての塩濃度で観察された。
【００６６】
以下の実験では、異なるタイプの凝集挙動を持つ血漿サンプルへの塩添加の効果が調べられた。３つのタイプの血漿サンプルが使用された；すなわち、磁気粒子１のクラスタ化を実質的に与えない良性サンプル、磁気粒子１の中間的なクラスタ化を与える普通サンプル、及び磁気粒子１の顕著なクラスタ化を与える悪性サンプルである。異なるタイプの血漿サンプルは異なる血漿供与者から得た。
【００６７】
実施例２
アッセイは、種々の血漿供与者からのサンプル（良性、普通、悪性）を用いて実施され、心臓トロポニン（ｃＴｎＩ）を５００ｐＭスパイクした。実験は使い捨てカートリッジを用いて行った。前記カートリッジには、トレーサであるトロポニン抗体（抗−ｃＴｎＩ）でコーティングされた乾燥の５００ｎｍサイズ磁気粒子１と、塩、 ４−（２− ヒロドキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、スクロース及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる乾燥緩衝剤とが含まれる。試験は異なるタイプの塩で繰り返された。
【００６８】
溶液中に与えられた最終塩濃度は３Ｍであった。前記アッセイは次の磁気駆動プロトコルを用いて行った。即ち１分間の粒子とサンプルのインキュベーション及び４分間の前記センサ表面で粒子のパルス駆動であり、前記センサ表面の上でキャプチャ抗−ｃＴｎＩ抗体が結合される。
【００６９】
前記表面へ結合された粒子は、図１の装置について説明されたように漏れ全内部反射の原理を用いて検出される。前記センサのシグナル強度は、結合されていない磁気粒子１をこれらの粒子をセンサ表面から離すように磁力を適用することで除去することで得られた。これらの試験結果は図３に示され、前記センサシグナル強度を、前記良性、普通、悪性の血漿サンプルに添加した塩の濃度の関数として示す。同様に表ＩＩにも示す。
【００７０】
【表２】
【００７１】
図３及び表ＩＩから、Ｎａ及びＫ塩が全ての血漿タイプのシグナル強度の顕著な改善を与えることが分かる。これは、より多くの磁気ラベル１がｃＴｎＩを介して抗−ｃＴｎＩ抗体に結合したことを意味し、磁気粒子１のクラスタ化を抑制することを示すものである。特にＫＢｒは、普通及び悪性血漿にも良好に作用し、塩が添加されない対応するサンプルタイプと比較すると３倍程度の改善が見られる。
【００７２】
実施例３
アッセイは、種々の血漿供与者からの良性及び悪性サンプルを用いて実施され、心臓トロポニン（ｃＴｎＩ）を５００ｐＭスパイクした。実験は使い捨てカートリッジを用いて行った。前記カートリッジには、トレーサであるトロポニン抗体（抗−ｃＴｎＩ）でコーティングされた乾燥の５００ｎｍ磁気粒子１と、塩、４−（２−ヒロドキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、スクロース及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）からなる乾燥バッファとが含まれる。試験は異なるタイプの塩で繰り返された。溶液中に与えられた最終塩濃度は１００ｍＭであった。
【００７３】
前記アッセイは次の磁気駆動プロトコルを用いて行った。即ち１分間の粒子とサンプルのインキュベーション及び４分間の前記センサ表面で粒子をパルス駆動することであり、前記センサ表面の上でキャプチャ抗−ｃＴｎＩ抗体が結合される。
【００７４】
前記表面へ結合された粒子は、図１の装置について説明されたように漏れ全内部反射の原理を用いて検出される。前記センサのシグナル強度は、結合されていない磁気粒子１をこれらの粒子をセンサ表面から離すように磁力を適用することで除去することで得られた。これらの試験結果は図３に示され、前記センサシグナル強度を、前記良性、悪性の血漿サンプルに添加した塩の濃度の関数として示す。同様に表ＩＩＩにも示す。
【００７５】
【表３】
【００７６】
次のことが明確に示される。即ち、チオシアネート塩、及び特にグアニジンチオシアネート塩が悪性血漿内のセンサシグナル強度を顕著に改善する、ことである。これは、より多くの磁気ラベル１が前記ｃＴｎＩを介して抗−ｃＴｎＩ抗体に結合されることを意味し、従って磁気粒子１のクラスタ化を低減することを示す。
【００７７】
実施例４
アッセイは、種々の血漿提供者（Ｓ６９８、Ｓ７０１、Ｓ７０５、Ｓ７１０）からのサンプル及び５００ｐＭの副甲状腺ホルモン（ＰＨＦ）をスパイクした緩衝液を用いて行った。試験は、使い捨てカートリッジ内で行った。前記カートリッジには、トレーサーとして抗−ＰＨＴ抗体をコーティングした乾燥５００ｎｍサイズ磁気粒子とＫＣｌ（１．５Ｍ）、ＨＥＰＥＳ、スクロース及びＢＳＡからなる乾燥緩衝物を含む。コントロールサンプルにＫＣｌは添加されていない。それぞれの試験はそれぞれのサンプルについて２回行った。
【００７８】
前記アッセイは、２分間前記粒子をサンプルとインキュベーションし、さらに８分間キャプチャ抗−ＰＴＨ抗体を結合した前記センサ表面の前記粒子をパルス駆動する磁気駆動プロトコルを用いて実施された。前記表面に結合した粒子は、既に説明した漏れ全内部反射を用いて検出された。
【００７９】
前記センサのシグナルの強度は、結合していない磁気粒子１を、これらの粒子をセンサ表面から離すように磁力を適用することで得た。これらの実験の結果は図５に示され、１つのサンプルに対して２回の試験による平均センサシグナル強度が、種々の血漿サンプルと緩衝液サンプルに添加された塩の関数として示されおり、表ＩＶにまとめられている。
【００８０】
【表４】
【００８１】
これらから次のことが分かる。即ち、悪性サンプルＳ７１０（このサンプルの小さいシグナル強度から、粒子１がこのサンプル中では強くクラスタ化していることが明らかである）以外の全てのサンプルタイプは、ＫＣｌの添加がセンサシグナツ強度を顕著に改善すること、である。これは、より多くの磁気ラベル１が、前記抗−ＰＴＨ抗体に前記ＰＴＨを介して前記センサ表面に結合されたことを意味し、このことはこれらのサンプル中で磁気粒子１の阻害クラスタ化を低減することを示す。予想できるように、前記緩衝液でのシグナル強度の改善は、前記緩衝液中のタンパク質の不存在により達成されたものである。これはまた、サンプル中のかかるタンパク質含有量は磁気粒子１の非可逆的凝集の原因であることを明らかに示すものである。
【００８２】
前記の心臓トロポニンＩ又はＰＴＨについての実験で得られたものと同様な改善がまた。実験で使用されたそれぞれの抗体をＮ−末端ｐｒｏＢｒａｉｎ利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）と交換した実験でも得られた。従って、本発明は、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの決定に依存するアッセイにおいても同様に有効である。
【００８３】
まとめると、前記実験例は、前記サンプルに適切な塩を添加することが、磁気粒子１でラベル化された前記モイエティの凝集挙動を大きく改善する、ということを明らかに示す。
【００８４】
強調されるべきことは、前記実験例は本発明の範囲を限定することを意図するものではない、ということであり、かつここでは簡潔性の理由から与えられなかった多くの実験例が存在する、ということである。例えば、凝集挙動の同様の低減は、唾液などの他の高タンパク質含有材料においても観察された。従って、本発明は、唾液中のＴＨＣ、モルフィン、メタンフェタミン、アンメタフィン及びコカインなどの薬物の乱用を検出するためのアッセイ系の磁気粒子への応用可能なものである。かかるアッセイにおいて、例えば１ＭのＮａＣｌの添加が磁気粒子１の凝集を顕著に低減させることが見出された。
【００８５】
当業者であれば、本発明の記載に基づき、必要な磁気化可能又は磁気粒子に基づくアッセイについてなんら困難なく、本発明の利点を与えるタンパク質及び塩のその他の組合せについて認識することができるはずである。
【００８６】
留意すべきことは、前記実施態様は本発明を限定するものではなく、当業者であれば、特許請求の範囲の範囲から離れることなく、多くの変更・変法を設計することができるはずである、ということである。特許請求の範囲において、括弧内の参照符号は特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきではない。用語「含む」は、請求項に記載される要素又はステップが複数であることを除外するものではない。要素の前に付される「１つの」はそれが複数であることを除外するものではない。本発明は、いくつかの別々の要素からなるハードウェアの手段で実施され得る。いくつかの手段が列記される装置に係る請求項において、それらの手段のいくつかはハードウェアの１つの事項及び同じ事項により実施され得る。ある手段が相互に異なる従属請求項に記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せが有利なものではないということを意味するものではない。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルを受ける装置であり、前記装置は：
前記サンプル中に検体の存在を指標するモイエティを含み、前記モイエティは直径が１００ｎｍよりも大きい磁気及び／又は磁気化可能ラベルを含み、前記装置がさらに、前記サンプル中に溶解させて前記サンプルと接触する際に前記モイエティの凝集を低減させる量の塩を含む、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であり、前記塩が、前記サンプルを受けた後前記サンプル中に溶解した前記塩の濃度が、０．１から５モル／Ｌの範囲となる量で存在する、装置。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の装置であり、前記塩が、アルカリ金属塩の群の１以上の塩を含むように選択される、装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置であり、前記塩が、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化ナトリウム及びヨウ化ナトリウム及びそれらの組合せを含む群から選択される、装置。
【請求項５】
請求項４に記載の装置であり、前記塩が、臭化カリウムと塩化カリウムの組合せを含む、装置。
【請求項６】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の装置であり、前記塩がチオシアネート塩である、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置であり、前記チオシアネート塩が、カリウムチオシアネート及びグアジニンチオシアネートを含む群から選択される、装置。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の装置であり、前記モイエティが心臓疾患の指標である、装置。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置であり、前記モイエティが、心臓トロポニンＩ又はＴ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又はＰＨＴの１以上の指標である、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体であるか又は含む、装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の装置であり、前記塩及び前記モイエティの量が、前記装置にサンプルを適用する前に固体物質として前記装置に存在する、装置。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置であり、さらに、サンプルチャンバへ接続されるサンプル入口を含み、前記塩の量が前記入口に置かれる、装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置であり、前記入口が前記サンプルを濾過するためのフィルタ手段を含み、前記フィルタ手段が、前記塩の量を含む、装置。
【請求項１３】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置であり、さらに前記モイエティを結合するための結合表面及び前記結合したモイエティの存在を検出するための検出手段を含む、装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の装置であり、さらに、前記磁気及び／又は磁気化可能ラベルを前記結合表面に引きつけるための磁場生成装置を含む、装置。
【請求項１５】
サンプル中の検体の存在を決定するための方法であり、前記方法は次のステップ：
磁気及び／又は磁気化可能なラベルを含み、かつ直径が１００ｎｍを超える、モイエティを準備し、
前記モイエティを結合するための結合表面を準備し、前記結合されたモイエティが前記サンプル中の検体の存在の指標であり、
前記サンプルを前記モイエティに接触させ、及び前記結合表面上の前記モイエティの存在を測定して前記検体の存在を決定し、及び
前記方法において、前記サンプル中の前記モイエティの凝集を低減するための塩の量を前記サンプル中に、測定前又は少なくとも測定中に溶解させる、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であり、前記サンプルが、血液、血液血漿及び血液血清の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６のいずれか１項に記載の方法であり、前記塩が、臭化カリウムと塩化カリウムの組合せを含み、かつ前記モイエティが、心臓トロポニンＩ又はＴ、ＴＮ−ｐｒｏＢＮＰ及び副甲状腺ホルモンの少なくとも１つの存在の指標であるように選択される、方法。
【請求項１】
サンプルを受ける装置であり、前記装置は：
前記サンプル中に検体の存在を指標するモイエティを含み、前記モイエティは直径が１００ｎｍよりも大きい磁気及び／又は磁気化可能ラベルを含み、前記装置がさらに、前記サンプル中に溶解させて前記サンプルと接触する際に前記モイエティの凝集を低減させる量の塩を含む、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であり、前記塩が、前記サンプルを受けた後前記サンプル中に溶解した前記塩の濃度が、０．１から５モル／Ｌの範囲となる量で存在する、装置。
【請求項３】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の装置であり、前記塩が、アルカリ金属塩の群の１以上の塩を含むように選択される、装置。
【請求項４】
請求項３に記載の装置であり、前記塩が、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、臭化カリウム、塩化ナトリウム及びヨウ化ナトリウム及びそれらの組合せを含む群から選択される、装置。
【請求項５】
請求項４に記載の装置であり、前記塩が、臭化カリウムと塩化カリウムの組合せを含む、装置。
【請求項６】
請求項１又は２のいずれか１項に記載の装置であり、前記塩がチオシアネート塩である、装置。
【請求項７】
請求項６に記載の装置であり、前記チオシアネート塩が、カリウムチオシアネート及びグアジニンチオシアネートを含む群から選択される、装置。
【請求項８】
請求項１乃至７のいずれか１項に記載の装置であり、前記モイエティが心臓疾患の指標である、装置。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれか１項に記載の装置であり、前記モイエティが、心臓トロポニンＩ又はＴ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ又はＰＨＴの１以上の指標である、モノクローナル及び／又はポリクローナル抗体であるか又は含む、装置。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか１項に記載の装置であり、前記塩及び前記モイエティの量が、前記装置にサンプルを適用する前に固体物質として前記装置に存在する、装置。
【請求項１１】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置であり、さらに、サンプルチャンバへ接続されるサンプル入口を含み、前記塩の量が前記入口に置かれる、装置。
【請求項１２】
請求項１１に記載の装置であり、前記入口が前記サンプルを濾過するためのフィルタ手段を含み、前記フィルタ手段が、前記塩の量を含む、装置。
【請求項１３】
請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の装置であり、さらに前記モイエティを結合するための結合表面及び前記結合したモイエティの存在を検出するための検出手段を含む、装置。
【請求項１４】
請求項１３に記載の装置であり、さらに、前記磁気及び／又は磁気化可能ラベルを前記結合表面に引きつけるための磁場生成装置を含む、装置。
【請求項１５】
サンプル中の検体の存在を決定するための方法であり、前記方法は次のステップ：
磁気及び／又は磁気化可能なラベルを含み、かつ直径が１００ｎｍを超える、モイエティを準備し、
前記モイエティを結合するための結合表面を準備し、前記結合されたモイエティが前記サンプル中の検体の存在の指標であり、
前記サンプルを前記モイエティに接触させ、及び前記結合表面上の前記モイエティの存在を測定して前記検体の存在を決定し、及び
前記方法において、前記サンプル中の前記モイエティの凝集を低減するための塩の量を前記サンプル中に、測定前又は少なくとも測定中に溶解させる、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であり、前記サンプルが、血液、血液血漿及び血液血清の少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６のいずれか１項に記載の方法であり、前記塩が、臭化カリウムと塩化カリウムの組合せを含み、かつ前記モイエティが、心臓トロポニンＩ又はＴ、ＴＮ−ｐｒｏＢＮＰ及び副甲状腺ホルモンの少なくとも１つの存在の指標であるように選択される、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２０１３−５１５９５６（Ｐ２０１３−５１５９５６Ａ）
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５４５５０１（Ｐ２０１２−５４５５０１）
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５５８７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７７３３３
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５９００００２４８）コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ (12,071)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２５年５月９日（２０１３．５．９）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年１２月１６日（２０１０．１２．１６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＢ２０１０／０５５８７３
【国際公開番号】ＷＯ２０１１／０７７３３３
【国際公開日】平成２３年６月３０日（２０１１．６．３０）
【出願人】（５９００００２４８）コーニンクレッカ フィリップス エレクトロニクス エヌ ヴィ (12,071)
【Ｆターム（参考）】
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