検出できるラベルされたヌクレオシド類似体及びその使用方法
本発明は、ヌクレオチド配列の検出のために有用な化合物に関する。特に、本発明は、ラベルされたイミダゾール−PEG化合物、例えばその化合物を組込むヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸、及びそのような化合物の利用方法に関する。本発明はさらに、ラベルされたイミダゾール−PEG化合物を含んで成るキットに関する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野：
本発明は、例えばヌクレオチド配列の検出のために有用な化合物に関する。特に、本発明は、ラベルされたイミダゾール−PEG化合物、例えばその化合物を組込むヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸、及びそのような化合物の利用方法に関する。本発明はさらに、ラベルされたイミダゾール−PEG化合物を含んで成るキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
2.発明の背景：
生医学的研究及び組換えDNA技法に使用される多くの方法は、ラベルされたヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の使用に依存する。ラベルされた形の天然に存在するヌクレオチドとして一般的に適切である修飾されたヌクレオチドに関しては、いくつかの基準が典型的に満たされるべきである。
第１に、修飾された化合物は、ユニークである（すなわちヌクレオチド又はポリヌクレオチドと通常関係しない）置換基又はプローブを含むべきである。
第２に、プローブは、敏感な検出システムを提供するために化学的又は生物学的試薬と特異的に反応すべきである。
【０００３】
第３に、多くの実際的な適用は、類似体が酵素的に代謝される（例えば、類似体が核酸ポリメラーゼのための基質として機能すべきである）ことを必要とするので、類似体は、通常研究される核酸酵素のための比較的効果的な基質であるべきである。このためには、プローブ成分は、塩基の正常なワトソン−クリック水素結合能力を立体的に又は他方では、妨げる環位置上に配置されるべきではない。そのような場合、置換基は、ポリメラーゼ基質として不活性である化合物を生成することができる。
第４に、検出システムは、核酸ハイブリダイゼーション方法と適合できるよう、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの両者中に組込まれるプローブ置換基と相互作用できるべきである。
【０００４】
第５に、少数のプローブ置換基を含むポリヌクレオチドの物理的及び生化学的性質は、実質的に変更されるべきではなく、その結果、ハイブリダイゼーションプローブを用いる現在の方法は広範囲に修飾される必要はない。この基準は、プローブが酵素的手段により導入されるか、又は直接的な化学的手段により導入されるかどうかにかかわらず、満たされるべきである。
最終的に、プローブ成分を結合する連鎖は、正常なヌクレオチド及びポリヌクレオチドが通常ゆだねられるすべての実験条件（例えば、高温での延長されたハイブリダイゼーション時間、フェノール及び有機溶媒抽出又は電気泳動）に対して耐性であるべきである。
【０００５】
ビオチンアビジン複合体の特異性及び強さは、細胞上の又は細胞内の特定のタンパク質、脂質又は炭水化物を可視的に位置決定するための方法を開発するために最近使用されて来た（E. A. Bayer and M. Wilchek, Methods of BiochemzcaZ A7zalysis, 26, 1, 1980）。RNAの染色体位置は、ハイブリダイゼーションプローブとしてRNAに化学的に架橋されるビオチン化されたタンパク質（例えば、チトクロムC）を用いて、電子顕微鏡により決定されて来た。
【０００６】
ハイブリダイゼーションの部位は、アビジンビオチン相互作用により介在される、アビジンフェリチン又はアビジンメタクリレート球体の結合を通して可視化された（Manning など.,Chromosoma, 53,107, 1975 ; Manning, Biochemistry, 61,1364, 1977; Broker, Nucleic Acid Res., 5,363, 1978; and Sodja など., Nucleic Acid Res., 5, 383, 1978）。ポリヌクレオチド配列の検出へのこのアプローチは、高く反復された配列である、試験される特定の場合においては好結果をもたらすが、単一又は低コピー数で存在するポリヌクレオチドの分析のためには一般的に有用でない。
従って、安全で、費用効率が高く、安定し、効率が良く、そしてより敏感な検出を提供する、検出できるラベルされた化合物についての連続した必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
3.発明の要約：
本発明は、イミダゾール化合物に共有結合されるラベルを含む一連の新規ヌクレオチド誘導体を提供する。１つの観点においては、本発明は、ヌクレオチド配列の検出のためのラベルとして有用である種類の化合物に関する。もう１つの観点においては、本発明は、検出できるラベルを含んで成るオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、本発明の化合物の使用方法及び製造方法に関する。
【０００８】
本発明の化合物は、下記式I：
【化１】
【０００９】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００１０】
【化２】
【００１１】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を包含する。
【００１２】
１つの態様においては、リンカーは、(-O-アルキル)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤（個々の化合物は、“検出できるラベル”である）である。
【００１３】
本発明はまた、下記式II：
【化３】
【００１４】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を含んで成るオリゴヌクレオチドも包含する。
【００１７】
１つの態様においては、リンカーは、(-O-アルキル)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である。
【００１８】
もう１つの態様は、試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法を包含し、
ここで前記方法は、前記試験サンプルと、オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブを含んで成る組成物とを接触せしめ、ここで前記オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブは、下記式：
【００１９】
【化５】
【００２０】
[式中、塩基は、下記式：
【化６】
【００２１】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H,-NHC(O)NH2, -NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-0(アルキル),-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【００２２】
【化７】
【００２３】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
Qは、O, S又はNHであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される化合物を含んで成り、
【００２４】
ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは、中位の緊縮条件下で前記標的核酸と選択的に又は特異的にハイブリダイズすることができ；
任意には、前記サンプルを、前記励起できる波長の光に暴露し；そして
前記接触が組成物の色又は蛍光発光の変化を生成するかどうかを検出する；
ことを含んで成り、ここで前記組成物の色又は蛍光発光の変化が、標的核酸が試験サンプルに存在することを示すことを含んで成る。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−又は弱−蛍光化合物、又は消光剤である。
【００２５】
もう1つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項35記載の化合物を含んで成り；
【００２６】
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴とする。
【００２７】
もう１つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の少なくとも１つの一方側上での化合物を含んで成り；
【００２８】
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
（ｄ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｅ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｆ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
【００２９】
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける。
【００３０】
もう１つの態様は、下記式I：
【化８】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００３１】
【化９】
【００３２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
【００３３】
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物の製造方法を包含する。１つの態様においては、リンカーは、(-O-アルキル)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、消光剤、蛍光化合物、又は非−もしくは弱−蛍光化合物である。
【００３４】
もう１つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は検出できるラベル及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
【００３５】
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
【００３６】
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける。
【００３７】
もう１つの態様は、ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ラベルされたヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、本発明のの化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ラベルされたヌクレオチドを検出することを含んで成る。
【００３８】
もう１つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での検出できるラベルを含んで成り；
【００３９】
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
（ｄ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｅ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｆ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
【００４０】
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける。
【００４１】
3.1定義：
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“アルキル基”とは、飽和の枝なし又は枝分かれした一価の炭化水素鎖を意味する。アルキル基の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：C1-C6アルキル基、例えばメチル, エチル, プロピル, イソプロピル, 2-メチル-l-プロピル, 2-メチル-2-プロピル, 2-メチル-1- ブチル, 3-メチル-l-ブチル, 2-メチル-3-ブチル, 2,2-ジメチル-l-プロピル, 2-メチル-l-ペンチル, 3-メチル-1-ペンチル, 4-メチル-1-ペンチル, 2-メチル-2-ペンチル, 3-メチル-2-ペンチル, 4- メチル-2-ペンチル, 2,2-ジメチル-l-ブチル,3,3-ジメチル-1-ブチル, 2-エチル-l-ブチル, ブチル,イソブチル, t-ブチル, ペンチル, イソペンチル, ネオペンチル,及びヘキシル, 並びにより長いアルキル基, 例えばヘプチル, 及び オクチル。アルキル基は、置換されていないか、又は１又は２個の適切な置換基により置換され得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語−O−アルキル（又はアルキル−O−）とは、“アルコキシ基”を意味し、ここでアルキルは上記で定義される通りである。アルコキシ基は、置換されていないか、又は１又は複数の適切な置換基により置換され得る。アルキルオキシ基のアルキル鎖はたとえば、１〜６個の長さの炭素原子であり得る。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“金属”とは、第I又は第II族の金属、例えばLi+, Na+, Ca2+, 又はMg2+を言及するが、但しそれらだけには限定されない。
【００４３】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“置換された”とは、１又は複数の水素原子が個々に独立して、同じか又は異なった置換基により置換されている基を言及する。典型的な置換基は、次のものを言及するが、但しそれらだけには限定されない：アルキル, アルコキシ, -X、-R、-O、 =O、-OR、-O-OR、 -SR、-S、 =S、 -NRR、 =NR、-CX3,、-CN、 -OCN、 -SCN、 -NCO、-NCS、 -NHCHO、 -NHCOC1-C4アルキル、 -NHCOCH3、 -NHCOCH2C1、-NHCOCHC12、 -NHCOCC13、 -NHCOCF3、 -NHCOCH2C6H4-o-NO2、 NHCOCH20C6H4-o-NO2、ここで個々のXは独立して、ハロゲン（好ましくは、-F,-Cl又は-Br）であり、そして個々のRは独立して、−H, アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールへテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル又はヘテロアリールヘテロアルキルである。
【００４４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“結合基”及び“リンカー”とは、交換可能的に使用され、そしてラベルと塩基とを共有結合できるか成分、例えばラベルにヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸を結合する“連鎖”を形成できる成分を言及する。リンカーの例は、O, S又はNHを包含するが、但しそれらだけには限定されない。任意には、結合基又はリンカーは、共有結合である（すなわち、ラベルは塩基に共有結合される）。
【００４５】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“カウンターイオ”とは、安定し、且つ合成的に入手できるイオンを言及する。カウンターイオンの例は、クロリド、ブロミド、ヨージド、スルフェート、ベンゼンスルホネート、p−トルエンスルホネート、p−ブロモベンゼンスルホネート、メタンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート、ホスフェート、過塩素酸塩、テトラフルオロボレート、テトラフェニルボレート、ニトレート、及び芳香族又は脂肪族カルボン酸のアニオンを包含するが、但し、それらだけには限定されない。好ましいカウンターイオンは、上記に列挙されるクロリド、ヨージド、過塩素酸塩及びスルホネートである。
【００４６】
本明細書において使用される場合、“生物学的に適合できる”物質は、好ましくは、使用される場合、毒性でなく、そして生物分子に対して実質的に有害な効果を有さない。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ビオチン”又は“ビオチン誘導体”とは、それぞれビオチン、又はビオチンの原子の１つがもう１つの適切な原子により置換されている化合物を言及し；適切な原子の例は、-O, -N, -P又は-Sを包含するが、但しそれだけには限定されない。ビオチン又はビオチン誘導体の例は、それぞれ次の構造式：
【００４７】
【化１０】
【００４８】
を有する、ビオチン又はイミノビオチンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオ塩基”とは、アデニン、シチジン、グアニン、チミン又はウラシルを言及する。
【００４９】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオ塩基類似体”とは、相補的ヌクレオ塩基又はヌクレオ塩基類似体とワトソン−クリック水素結合を形成できる、置換された又は置換されていない窒素−含有親複素芳香族環を、言及する。好ましくは、ヌクレオ塩基類似体は、プリン、デアザプリン又はピリミジンである。典型的なヌクレオ塩基類似体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【００５０】
７−デアザアデニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒドロキサンチン、プソイドウリジン、５−プロピニルシチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミジン、４−チオウラシル、O6−メチルグアニン、N6−メチルアデニン、O4−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、エテノアデニン、等。追加の典型的なヌクレオ塩基類似体は、引用により本明細書に組込まれる、Fasman, 1989, Practical Ha7idbook-ofBiocheinist7y and Molecular Biology, pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, FL及びそこに引用される文献に見出され得る。
【００５１】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオシド”とは、置換されているか又は置換されていないリボース糖のC1’炭素に共有結合されるヌクレオ塩基から成る化合物を言及する。典型的な置換されたリボース糖は、１又は複数の炭素原子、好ましくは１つの炭素原子、及び最も好ましくは、3’炭素原子が、１又は複数の同じか又は異なった-R, -OR、-NRR又はハロゲン基（ここで、個々のRは独立して、-H, (C1-C6)アルキル、又は（C5-C14）アリールである）により置換されているそれらの糖を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００５２】
特に好ましいリボース糖は、リボース、2’−デオキシリボース、2’, 3’−ジデオキシリボース、3’−ハロリボース、3’−フルオロリボース、3’−クロロリボース、3’−アルキルリボース、等である。ヌクレオ塩基がA又はGである場合、リボース糖は、ヌクレオ塩基のN9位置に結合される。ヌクレオ塩基がD, T又はUである場合、ペントース糖は、ヌクレオ塩基のN’位置に結合される（例えば、Kornberg and Baker, 1992, DNA Replication, 2nd Ed. , Freeman, San Franciscoを参照のこと）。
【００５３】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオシド類似体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖、又は両者がそれらのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオシドを言及する。典型的なヌクレオ塩基類似体は、前に定義されたそれらである。典型的なリボース糖類似体は、５以上又は５よりも少ない環原子を有する、置換されているか又は置換されていないフラノース、例えばエリトロース及びヘキソース、及び置換されているか又は置換されていない３〜６の炭素の非環式糖を包含するが、但しそれらだけには限定されない。典型的な置換されたフラノース及び非環式糖は、１又は複数の炭素原子が１又は複数の同じか又は異なった-R, -OR, -NRR又はハロゲン原子（ここで、個々のRは独立して、-H, (C1-C6)アルキル又は（C5-C14）アリールである）により置換されているそれらである。
【００５４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド”とは、１又は複数の、典型的には１つのリボース原子が、下記式：
【００５５】
【化１１】
【００５６】
[式中、ａは０〜４の整数である]を有するホスフェートエステルにより置換されているヌクレオシドを言及する。好ましくは、ａは２であり、そしてホスフェートエステルは、リボース、例えばリボース3’−三リン酸、2’−デオキシリボース３−三リン酸、リボース5’− 三リン酸、2’−デオキシリボース5’− 三リン酸、3’−ハロリボース5’− 三リン酸、3’−アルキルリボース5’− 三リン酸、2’, 3’−ジデオキシリボース5’− 三リン酸、等の3’又は5’炭素に結合される。本発明の対照は、酸のみならず、またそのような酸の塩、例えば金属塩でもある。
【００５７】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド誘導体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖及び/又は１又は複数のホスフェートエステルがそのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオチドを言及する。典型的なヌクレオ塩基及びリボース糖類似体は、ヌクレオシド類似体に関して前に記載されるそれらである。典型的なホスフェートエステル類似体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオネート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェート、ペプチド核酸（PNA）モノマー、等、存在するなら、いずれかの結合されたカウンターイオンを包含する。
【００５８】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“保護基”とは、続く反応の間、ヒドロキシル又はアミン成分を再生するために選択的に切断され得る基を意味する。保護基の例は、引用により本明細書に組込まれる、Greene, T. W., Protective Groups in Orga3zic Synthesis, 3rd edition (1999)に見出される。１つの態様においては、保護基は、塩基性反応媒体においては安定するが、しかしまた、酸により切断され得る。
【００５９】
本発明への使用のために適切な、塩基−安定性、酸−不安定保護基の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：エーテル、例えばメチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、メトキシエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、１−エトキシエチル、１−メチル１−メトキシエチル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、O−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、p−メトキシフェニルジフェニルメチル、９−（９−フェニル−10−オキソ）アントラニル、トリメチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ−ブチルメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、及びトリイソプロピルシリル；及びエステル、例えばビバロエート、アダマントエート及び、２，４，６−トリメチルベンゾエート。
【００６０】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“塩”とは、本発明の化合物に存在することができる酸性又は塩基性基の塩を包含するが、但しそれらだけには限定されない。天然において塩基性である化合物は、種々の無機及び有機酸と広範囲の種類の塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の許容できる酸付加塩を調製するために使用され得る酸は、非毒性酸付加塩、すなわち薬理学的に許容できるアニオンを含む塩、例えば次の塩を形成するそれらの酸であるが、但しそれらだけには限定されない：
【００６１】
硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸塩、臭酸塩、ヨウ酸塩、ニトレート、スルフェート、硫酸水素塩、ホスフェート、酸ホスフェート、ニソニコチネート、アセテート、ラクレート、サリチレート、シトレート、酸シトレート、タルトレート、オレエート、タンネート、パントテネート、ビタルタレート、アスコルベート、スクシネート、マレエート、ゲンチシネート、フマレート、グルコネート、グルカネート、サッカレート、ホルメート、ベンゾエート、グルタメート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、p−トルエンスルホネート及びパモエート（すなわち、１，1’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩。
【００６２】
アミノ成分を含む本発明の化合物はまた、上記に言及された酸の他に、種々のアミノ酸と許容できる塩を形成できる。天然において酸性である本発明の化合物は、種々の薬理学的に許容できるカチオンと塩基性塩を形成することができる。そのような塩の例は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、及び特にカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム及び鉄の塩を包含する。
【００６３】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“溶媒化合物”とは、非共有分子間力により結合される、理論又は非理論量の溶媒を含む、本発明の化合物又はその塩を意味する。好ましい溶媒は、揮発性で且つ非毒性である。用語“溶媒化合物”は、水和物を包含する。水和物は、非共有分子間力により結合される、理論又は非理論量の水を含む、本発明の化合物又はその塩を意味する。
【００６４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“包接化合物”とは、閉じ込められるゲスト分子（例えば、溶媒又は水）を有する空間（例えば、チャネル）を含む結晶格子の形での本発明の化合物又はその塩を意味する。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオシド又はヌクレオチド”とは、ヌクレオシド及び/又はヌクレオチド、及び/又はその混合物を言及する。
【００６５】
“ヌクレオシド類似体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖又は両者がそれらのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオシドを言及する。典型的なヌクレオ塩基類似体は、前に定義されたそれらである。典型的なリボース糖類似体は、５以上又は５よりも少ない環原子を有する、置換されているか又は置換されていないフラノース、例えばエリトロース及びヘキソース、並びに置換されているか又は置換されていない３〜６個の端子の非環式糖を包含するが、但しそれらだけには限定されない。典型的な置換されたフラノース及び非環式糖は、１又は複数の炭素原子が１又は複数の同じ又は異なった-R, -OR, -NRR又はハロゲン基（ここで、個々のRは独立して、H, C1-C6アルキル又はC5-C14アリールである）により置換されているそれらの糖である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド”とは、１又は複数の、典型的には１つのリボース炭素が、下記式：
【化１２】
【００６７】
[式中、ａは０〜４の整数である]
を有するホスフェートエステルにより置換されているヌクレオシドを言及する。好ましくは、ａは２であり、そしてホスフェートエステルは、リボース、例えばリボース3’−三リン酸、2’−デオキシリボース３−三リン酸、リボース5’− 三リン酸、2’−デオキシリボース5’− 三リン酸、3’−ハロリボース5’− 三リン酸、3’−アルキルリボース5’− 三リン酸、2’, 3’−ジデオキシリボース5’− 三リン酸、等の3’又は5’炭素に結合される。
【００６８】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド類似体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖及び/又は１又は複数のホスフェートエステルがそのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオチドを言及する。典型的なヌクレオ塩基及びリボース糖類似体は、ヌクレオシド類似体に関して前に記載されるそれらである。典型的なホスフェートエステル類似体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオネート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェート、ペプチド核酸（PNA）モノマー、等、存在するなら、いずれかの結合されたカウンターイオンを包含する。
【００６９】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“核酸”とは、ホスフェートエステルヌクレオチド間連鎖によりお互いに共有結合されるヌクレオシドモノマー単位の線状ポリマー鎖を言及する。特にことわらない限り、“核酸”とは、本明細書において使用される場合、いずれかの長さのポリマー、例えばオリゴヌクレオチド、核酸、及び当業界において通常使用されるような核酸を包含する。従って、本発明の核酸は、少数のモノマー単位（例えば、４〜40個）〜数百のモノマー単位、数千のモノマー単離又はそれよりも多くのモノマー単位の範囲であり得る。そのような核酸はまた、それらの機能に関して、例えばプライマー又はプローブとしても本明細書において記載され得る。核酸が文字の配列、例えば“ATGCCTG”により表される場合いつでも、その配列は5’→3’方向で表されることが理解されるであろう。特にことわらない限り、本明細書に記載される配列の核酸は、2’−デオキシリボ核酸である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“核酸類似体”とは、少なくとも１つのヌクレオシドモノマー単位が“ヌクレオシド類似体”であり、そして/又は少なくとも１つのホスフェートエステルヌクレオチド間連鎖が、“ヌクレオチド類似体”下で定義されたようなホスフェートエステル類似体である核酸を言及する。好ましい種類の核酸類似体は、糖及びヌクレオチド間連鎖が荷電されていない中性アミド、例えばモノホリノカルバメート及びペプチド核酸（“PNA”）により置換されているそれらである。好ましいPNAは、N−（２−アミノエチル）グリシンアミド主鎖を有するそれらである（例えば、Nielsen など., 1991, Science 254: 1497-1500を参照のこと）。
【００７１】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ラベル”とは、ヌクレオシド又はヌクレオチド、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、核酸、核酸類似体又はターミネーターに共有又は非共有結合される検出できる分子又は原子を言及する。１つの態様においては、ヌクレオシド又はヌクレオチド、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、核酸、核酸類似体又はターミネーターは、ヌクレオ塩基に共有結合される検出できるラベルを有する。用語“ラベル”とはまた、もう１つの検出できるラベル、例えば消光剤の検出を調節する分子を言及する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語“検出できるラベル”とは、“直接的に”検出される分子又はラベル（例えば、色原体又は蛍光団）のみならず、また第２、第３、又はそれ以上の結合パートナー（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）（その１つは、“直接的な”ラベルを担持する）へのその結合により“間接的に”検出される成分（例えば、ビオチン）も包含すること意味する。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドは、ビオチン−修飾され、そしてビオチンに高い親和性で結合するアビジン又はストレプトアビジンに基づいて検出システムを用いて検出できる。前記アビジン又はストレプトアビジンは、酵素に接合され得、この存在は、酵素の色原体基質との反応を可能にし、そして進行する色（すなわち、“比色化合物”）を測定することにより検出される。
【００７３】
本発明の方法における有用な酵素の非制限例は、次のものである：ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコーカスヌクレアーゼ、デルタ−V−テスロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ。
【００７４】
ラベルの他の例は、適切な波長の光に暴露される場合、蛍光により検出可能になり、そして顕微鏡又は蛍光計により検出され、そして/又は測定される蛍光化合物を包含する。通常使用される蛍光ラベリング化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。検出できるラベルは、蛍光−放出金属、例えば152Eu、又は金属キレート基、例えばジエチレントリアミン五酢酸又はエチレンジアミン四酢酸を用いて、オリゴヌクレオチドに結合され得るランタニドシリーズの他のものであり得る。
【００７５】
ラベルは、化学発光化合物であり得、この存在は化学反応の間に発生する発光を測定することにより検出される。有用な化学発光ラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルである。同様に、生物発光化合物は、オリゴヌクレオチドをラベルするために使用され、そして発光を測定することにより検出される。この場合、触媒タンパク質は、光化学発光反応の効率を高める。有用な生物発光ラベリング化合物の例は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【００７６】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“受容体色素”とは、光に暴露される場合、蛍光の形でエネルギーを話す化合物を言及する。“状態色素の蛍光団”とは、光に暴露される場合、従来の分光分析手段により検出できるレベルで放射線を放す受容体色素の原子の網状構造体である。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“非−蛍光”とは、放射線に暴露される場合、従来の分光分析手段により検出できるレベルで放射線を放さない化合物を言及する。
【００７７】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“弱蛍光”とは、放射線に暴露される場合、従来の分光分析手段により検出できる低レベルで放射線を放す化合物を言及する。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“光”とは、受容体色素の蛍光を引き起こす、190〜800nmの範囲の波長を有する電磁エネルギーを言及する。
【００７８】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“特異的”とは、通常の試験環境下での試験サンプルにおける意図された標的とのみハイブリダイズするが、しかし他の核酸分子とはハイブリダイズしない、反応に使用される核酸、例えばハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブ、PCRに使用されるプライマー、又は組成物に存在する核酸を言及する。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“選択的”とは、通常の試験環境下での試験サンプルにおける他の核酸とハイブリダイズするよりも、意図される標的物と、より頻繁に、より急速に、又は長い期間、ハイブリダイズする、反応に使用される核酸、例えばハイブリダイゼーションに使用されるプローブ、PCRに使用されるプライマー又は医薬製剤に存在する核酸を言及する。
【００７９】
本明細書において使用される場合、用語“緊縮条件下でハイブリダイズする”とは、お互い少なくとも60％（65％、70％又は75％、又はそれ以上）同一であるヌクレオチド配列が典型的には、お互いハイブリダイズされたまま存続する、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を記載する。緊縮条件は、核酸の性質（例えば、長さ、GC含有率、等）、及び方法自体（ハイブリダイゼーション、増幅、等）に依存する。そのような方法は、当業者に良く知られており、そしてCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6. 3.6に見出され得る。１つの態様においては、緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約45℃での６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）におけるハイブリダイゼーション、続く、約68℃での0.1×SSC、0.2％SDSによる１又は複数回の洗浄である。
【００８０】
もう１つの態様においては、緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約45℃での６×SSCにおけるハイブリダイゼーション、続く、50〜65℃での0.2×SSC、0.1％SDSによる１又は複数回の洗浄（すなわち、50℃、55℃、60℃又は65℃での１又は複数回の洗浄）である。本発明の核酸は、それらの条件下で、単独で、A又はTヌクレオチドのみから成るヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子を包含しないことが理解される。例えば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）における相補的配列に対する約15〜40個の塩基のオリゴヌクレオチドの緊縮ハイブリダイゼーションは、次の条件下で行われ得る：50mMのKClの塩濃度、10mMのトリスHClの緩衝液濃度、1.5mMのMg2+濃度、７〜7.5のpH及び55〜60℃のアニーリング濃度。
【００８１】
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）における相補的配列に対する約15〜40個の塩基のオリゴヌクレオチドの中位の緊縮条件は、次の条件下で行われ得る：50mMのKClの塩濃度、10mMのトリスHClの緩衝液濃度、1.5mMのMg2+濃度、７〜7.5のpH及び48〜54℃のアニーリング濃度。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）における相補的配列に対する約15〜40個の塩基のオリゴヌクレオチドの低い緊縮条件は、次の条件下で行われ得る：50mMのKClの塩濃度、10mMのトリスHClの緩衝液濃度、1.5mMのMg2+濃度、７〜7.5のpH及び37〜47℃のアニーリング濃度。
【００８２】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“立体的に純粋な”とは、化合物の１つの立体異性体を含んで成り、そしてその化合物の他の立体異性体を実質的に有さない組成物を言及する。例えば、１つのキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物は、その化合物の反対の鏡像異性体を実質的に有さないであろう。２つのキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物は、前記化合物の他のジアステレオマーを実質的に有さないであろう。
【００８３】
典型的な立体的に純粋な化合物は、約80重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約20重量％以下の前記化合物の他の立体異性体、より好ましくは約90重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約10重量％以下の前記化合物の他の立体異性体、さらにより好ましくは、約95重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約５重量％以下の前記化合物の他の立体異性体、及び最も好ましくは、約97重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約３重量％以下の前記化合物の他の立体異性体を含んで成る。
【００８４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“実質的に有さない”とは、１つの化合物を含んで成り、そして検出できるか又は有意な量の他の化合物を有さない組成物を言及する。実質的に有さない典型的な組成物は、約80重量％以上の所望する化合物及び約20重量％以下の１又は複数の他の化合物、より好ましくは約90重量％以上の所望する化合物及び約10重量％以下の１又は複数の他の化合物、さらにより好ましくは約95重量％以上の所望する化合物及び約５重量％以下の１又は複数の他の化合物、及び最も好ましくは約97重量％以上の所望する化合物及び約３重量％以下の１又は複数の他の化合物を含んで成る。
【００８５】
3.2略語：
特定のヌクレオ塩基及びヌクレオシド又はヌクレオチドを言及するために本明細書に使用される略語は、当業界において通常使用されるそれらであり、そして次の通りである：
【００８６】
【表１】
【００８７】
次の追加の略語が明細書に使用される：
明細書を通して使用される略語は、当業界において通常使用されるそれらであり、そして次の通りである：
【００８８】
【表２】
【００８９】
４．本発明の特定の記載：
本発明は、実施され得る実験プロトコール及び分析のために使用され得る検出方法(顕微鏡及び非顕微鏡）の両者において、酵素基質が相当の多様性を提供するので、機能することができるヌクレオチド誘導体に直接的に結合される検出できるラベルを有する発見に由来する。検出できるラベル（例えば、ビオチンヌクレオチド）は、細胞又は粗細胞抽出物により合成され、従って、新生（成長する）ポリヌクレオチド鎖の検出及び/又は単離を可能にする方法に存在するポリヌクレオ中に導入され得る。さらに、酵素は、ポリヌクレオチドにおける高い選択的又は部位特異的位置中にプローブ、例えばビオチンヌクレオチドを導入するための試薬として使用され得る。
【００９０】
１つの態様においては、本発明の化合物は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの5’又は3’末端に、及び/又は配列内に結合され得る。検出感度は例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブに結合される検出可能ラベルの数に依存する。シグナル強度及び検出感度は、オリゴヌクレオチドに結合される検出可能ラベルの数と共に上昇する。内部ラベリングは、オリゴ−又はポリヌクレオチドと標的配列との間に形成されるハイブリッドに対する低い感度及び不安定化効果をもたらす立体的妨害を導入することができる。
【００９１】
従って、ハイブリッド安定性、検出感度及び費用間を妥協するために、一定の態様においては、典型的なオリゴヌクレオチドは、約３個の本発明の化合物を含むことができ、両末端で１つ及び内部で１つ、そして成分間に最少約15個の塩基を有する。本発明の化合物を含むヌクレオチドの合成は、下記例に示されるようにして達成される。C-5炭素原子に結合される検出可能ラベルプローブを含むイミダゾールヌクレオシド三リン酸は、原核及び真核起源の広範囲の種類の精製された次の核酸ポリメラーゼのための実際的な基質であるが、但しそれらだけには限定されない：E. コリのDNAポリメラーゼI、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ、ネズミ（A9）及びヒト（HeLa）細胞からのDNAポリメラーゼα及びβ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、及びヘルペス単純ウィルスのDNAポリメラーゼ。
【００９２】
さらに、検出できるラベルリボヌクレオシド三リン酸は、E. コリ及びバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼのための基質として機能することができる。実際、検出できるラベルされたRNAプローブは、E. コリ又はT7 DNAポリメラーゼを用いて、又は化合物、例えばビオチニル-pCpを共にRNAリガーゼを用いて3’末端−ラベリング方法により、DNA鋳型から酵素的に調製され得る。抗体のそれらの類似体に対する利用可能性により、免疫学的又は親和性方法による新生転写体の単離はまた、実施可能である。
【００９３】
本発明の修飾においては、アリルアミンポリエチレングリコールリンカーアームを通して環に共有結合されるビオチン分子を含むヌクレオチドの類似体、例えばdUTP及びUTP（但し、それらだけには限定されない）が、合成され得る。低レベルのビオチン置換（50分子又はそれ以下/kb）を含むDNAは、置換されていない対照DNAのそれとは区別できない、変性、再結合及びハイブリダイゼーションを有する。
【００９４】
非制限例として、ビオチニル化は、検出試薬又は親和性捕獲マトリックスにより認識され得るプローブに、不良に又は検出できない分子を形質転換するラベル又は“標識”を提供する。ビオチンによりラベルされると、ラベルされたヌクレオチドは、複合体タンパク質及び核酸ブロット及びアレイをプローブするために使用され得る。次に、この標識された分子は、蛍光団、蛍光微小球、酵素、発色団、磁気粒子、又はコロイド状金によりラベルされた適切なアビジン接合体により検出され得る。ビオチニル化された分子はまた、種々の形の固定されたストレプトアビジン、例えばストレプトアビジンアガロースにより捕獲されるか、又は電子顕微鏡のために、反応性金化合物、例えばNANOGOLD(商標)(Nanoprobes, Inc., Yaphank, NY)又は Alexa Fluor(商標); FluoroNanogold ストレプトアビジン 1.4 nm 金クラスター (Molecular Probes, Eugene, OR)により染色され得る。
【００９５】
4.1検出可能ラベル：
4.1.1化合物及びラベルの構造：
１つの観点においては、本発明は、ヌクレオチド配列の検出のためのラベルとして有用である種類の化合物に向けられる。
【００９６】
本発明の第１の態様は、下記式I：
【化１３】
【００９７】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００９８】
【化１４】
【００９９】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を包含する。１つの態様においては、リンカーは、(アルキルO)n，(NH)n，(C(O)NH)n，(NHC(O)NH)n，(NH-アルキル-O-アルキル-NH)n，又は(アルキル)nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、消光剤、蛍光化合物、又は非−又は弱−蛍光化合物である。
【０１００】
本発明の第２の態様は、下記式II：
【化１５】
【０１０１】
[式中、塩基は、下記式：
【化１６】
【０１０２】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H、-NHC(O)NH2, -NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
X, Y及びXの個々は独立して、H,-OH,-0（アルキル）,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【０１０３】
【化１７】
【０１０４】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのリンカーである]で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を包含する。
【０１０５】
式IIの化合物の１つの態様においては、X, Y及びZの少なくとも１つは-OHである。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、X, Y及びZの個々は-OHである。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Y及びZの少なくとも１つは-OHであり、そしてXは、下記式：
【０１０６】
【化１８】
である。
【０１０７】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化１９】
である。
【０１０８】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化２０】
である。
【０１０９】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化２１】
である。
【０１１０】
式IIの化合物のもう１つの態様においは、R1は、-H、-NHC(O)NH2, -NH2,-OH,-O-アルキル, アルキル, 又は‐COOHである。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、リンカーは、(アルキルO)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、消光剤、蛍光化合物、又は非−又は弱−蛍光化合物である。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、リンカーは、(CH2CH2O)n (ここでｎは１〜10の整数である)である。
【０１１１】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、ラベルは、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、蛍光団ha、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである。
【０１１２】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、ラベルは、下記式：
【化２２】
である。
【０１１３】
もう１つの態様は、下記式III ：
【化２３】
で表される化合物を包含する。
【０１１４】
式III の化合物の１つの態様においては、X, Y及びZは独立して、H, OH, 下記式：
【化２４】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１１５】
式III の化合物のもう１つの態様においては、前記化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式IV：
【０１１６】
【化２５】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１１７】
【化２６】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１１８】
もう１つの態様は、下記式V：
【化２７】
【０１１９】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化２８】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２０】
もう１つの態様は、下記式VI：
【化２９】
【０１２１】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３０】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２２】
もう１つの態様においては、前記化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式VII：
【０１２３】
【化３１】
【０１２４】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３２】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２５】
もう１つの態様は、下記式VIII：
【化３３】
【０１２６】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３４】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２７】
もう１つの態様は、下記式IX：
【化３５】
【０１２８】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３６】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２９】
もう１つの態様は、下記式X：
【化３７】
【０１３０】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３８】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１３１】
もう１つの態様は、下記式XI：
【化３９】
【０１３２】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化４０】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１３３】
もう１つの態様は、下記式XII：
【化４１】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３４】
もう１つの態様は、下記式XIII：
【化４２】
【０１３５】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
もう１つの態様は、下記式XIV：
【化４３】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３６】
もう１つの態様は、下記式XV：
【化４４】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３７】
もう１つの態様は、下記式XVI：
【化４５】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３８】
もう１つの態様は、下記式XVII：
【化４６】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３９】
もう１つの態様は、下記式XVIII：
【化４７】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１４０】
もう１つの態様は、下記式XIX：
【化４８】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１４１】
もう１つの態様は、下記式XX：
【化４９】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１４２】
もう１つの態様は、下記式XXI：
【化５０】
【０１４３】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化５１】
【０１４４】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−又は弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１４５】
もう１つの態様は、下記式XXII：
【化５２】
【０１４６】
[式中、塩基は、下記式：
【化５３】
【０１４７】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0（アルキル）,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【０１４８】
【化５４】
【０１４９】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−又は弱−蛍光化合物、又は消光剤である]で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１５０】
１つの態様においては、X, Y及びZの少なくとも１つは、-OHである。
もう１つの態様においては、X, Y及びZの個々は、-OHである。
もう１つの態様においては、Y及びZの少なくとも１つは、-OHであり、そしてXは、下記式：
【０１５１】
【化５５】
[式中、R3は‐H又は金属である]である。
【０１５２】
もう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化５６】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１５３】
もう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化５７】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１５４】
もう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化５８】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１５５】
もう1つの態様においては、R1は-NHC(O)NH2である。
もう１つの態様においては、リンカーは、(CH2CH2O)n (ここでｎは１〜10の整数である)である。
もう１つの態様においては、ラベルは、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である。
もう１つの態様においては、前記蛍光団は、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである。
【０１５６】
もう１つの態様においては、ラベルは、下記式：
【化５９】
である。
【０１５７】
もう１つの態様は、下記式XXIII ：
【化６０】
【０１５８】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化６１】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１５９】
もう１つの態様においては、化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式XXIV：
【０１６０】
【化６２】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１６１】
【化６３】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６２】
もう１つの態様は、下記式XXV：
【化６４】
【０１６３】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化６５】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６４】
もう１つの態様は、下記式XXVI：
【化６６】
【０１６５】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化６７】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６６】
もう１つの態様においては、化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式XXVII：
【０１６７】
【化６８】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１６８】
【化６９】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６９】
もう１つの態様は、下記式XXVIII：
【化７０】
【０１７０】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化７１】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７１】
もう１つの態様は、下記式XXIX：
【化７２】
【０１７２】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化７３】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７３】
もう１つの態様においては、化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式XXX：
【０１７４】
【化７４】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１７５】
【化７５】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７６】
もう１つの態様は、下記式XXXI：
【化７６】
【０１７７】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化７７】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７８】
もう１つの態様は、下記式XXXII：
【化７８】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１７９】
もう１つの態様は、下記式XXXIII：
【化７９】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８０】
もう１つの態様は、下記式XXXIV：
【化８０】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８１】
もう１つの態様は、下記式XXXV：
【化８１】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８２】
もう１つの態様は、下記式XXXVI：
【化８２】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８３】
もう１つの態様は、下記式XXXVII：
【化８３】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８４】
もう１つの態様は、下記式XXXVIII：
【化８４】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８５】
もう１つの態様は、下記式XXXIX：
【化８５】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８６】
もう１つの態様は、下記式XXXX：
【化８６】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８７】
4.1.2検出できるラベル塩基：
本明細書に記載される式Iの化合物は、ヌクレオシド及びヌクレオチドをラベルするために使用され得る。イミダゾール化合物は原則として、式Iの化合物において塩基として適合できる。従って、本発明は、塩基、例えばイミダゾール及び置換されたイミダゾールを包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい塩基は、下記式：
【０１８８】
【化８７】
【０１８９】
[式中、ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖は、塩基のN1に共有結合され；そして
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hである]
で表される化合物を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１９０】
4.1.3結合基又はリンカー：
本発明は、式Iの化合物を供給するために、ラベルにヌクレオシド、ヌクレオチド、又はヌクレオシド又はヌクレオチオ類似体を接合するか又は結合することを含んで成る。ラベルは、種々の手段、例えばイオン誘引又は共有結合により、結合基を通して接合される。好ましくは、化合物は、共有結合を通して結合される。結合基又はリンカーは、試薬、例えばヌクレオシド又はヌクレオチド、又は核酸の“相補的官能価”と反応し、そしてラベルに化合物を結合する“連鎖”を形成することができる。リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり得る。好ましい結合基は、(CH2CH2O)n, (CH2O)n又は(CH2)nを包含するが、但しそれらだけには限定されず、ここで、ｎは約１〜約30、好ましくは約２〜約20、より好ましくは約３〜約10の整数である。任意には、リンカーは共有結合である（すなわち、ラベルは共有結合により塩基に結合され得る）。
【０１９１】
4.1.4ラベル：
ラベルは、当業者に知られているいずれかの検出できるラベルであり得る。式Iの化合物と共に使用され得るラベルは、ビオチン、ビオチン誘導体及びいずれかの蛍光団を包含する。ある態様においては、ビオチン又は蛍光受容体を含むラベルが使用され得る。蛍光受容体は、キサンテン色素、例えばフルオレセイン、及びローダミン色素から選択され得る。結合のための部位として、又は試薬、好ましくはポリヌクレオチドへの結合のための結合官能価として使用さえ得るそれらのキサンテン環上に種々の置換基を有する。多くの適切な形のそれらの化合物は市販されている。蛍光ラベルのもう１つの基は、α又はβ位置にアミノ基を有する、ナフチルアミン及びそれらの誘導体である。
【０１９２】
そのようなナフチルアミノ化合物間に、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−p−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートを包含する。他のラベルは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：クマリン、例えば３−フェニル−７−イソシアネートクマリン；アクリジン、例えば９−イソチオシアネートアクリジン及びアクリジンオレンジ；N−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）−マレイミド；シアニン；BODIPY'色素(Molecular Probes, Eugene, OR)：ベンゾキサジアゾール；スチルベン；ピレン；及び同様のもの。
【０１９３】
好ましくは、ラベルは、ビオチン、フルオレセイン及びローダミン色素から選択される。より好ましくは、ラベルはビオチンである。オリゴヌクレオチドへの結合のためのそれらのラベル及び適切な結合方法は、Khanna など. アメリカ特許第 4,439, 356号; Marshall (1975) gistochemical J., 7 : 299-303; Menchen など., アメリカ特許第 5,188, 934号; Menchen など., ヨーロッパ特許出願第87310256.0 号; Bergot など., 国際出願PCT/U590/05565号 ; 及び Barone など., Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 20 (4-7), 1141-1145, 2001に記載される。
【０１９４】
一定の特定態様においては、ラベルは、ビオチン、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（FAM）、2’, 7’−ジメトキシ−4’, 5’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（JOE）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（R6G）、N, N, N’, N’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（TAMRA）、６−カルボキシ−X−ローダミン（ROX）、４−（4’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（DABCYL）、５−（2’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（EDANS）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、インドジカルボシアニン３（Cy3）、インドジカルボシアニン５（Cy5）、インドジカルボシアニン5.5（CY5.5）、３−（カルボキシペンチル）−3’−エチル−5, 5’−ジメチルオキサカルボ−シアニン（CyA）、又はlH,5H,llH,15H-キサンテノ[2,3, 4 ij : 5, 6, 7 i'j']ジキノリジン-18- イウム, 9- [2 (又は4) [ [ [6 [2, 5-ジオキシ-1-ピロリジニル) オキシ]-6- オキソヘキシル] アミノ] スルホニル]-4 (又は 2)-スルホフェニル]- 2,3, 6,7, 12,13, 16,17-オクタヒドロ-,内部塩（TR又はTexas Red）である。代表的蛍光団は、下記のものを包含する：
【０１９５】
【表３】
【０１９６】
4.1.5糖：
式Iの化合物と一般的に適合する糖は、下記式：
【化８８】
【０１９７】
[式中、R, R’及びR’’は独立して、H, 金属又はモノ−、ジ−、又はトリホスフェートである]
で表されるリボース及びリボース類似体を包含する。それらはまた、ヌクレオシド及びヌクレオチドにおける糖を置換するために使用され得る成分を包含する。
【０１９８】
4.2検出的にラベルされたオリゴヌクレオチドの精製：
式Iの化合物を含むオリゴヌクレオチドは、当業者に知られているいずれかの方法により精製され得る。１つの非制限態様においては、オリゴヌクレオチドは、逆相HPLCにより精製される。手短には、オリゴヌクレオチドを含むサンプルが、Hamilton PRP-1カラム（1.0cm×25cm）に負荷され、そして5％〜50％のアセトニトリル線状グラジエントにより40分にわたって溶出される。
【０１９９】
蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチド種に対応するHPLC画分が集められ、プールされ、そして凍結乾燥される。凍結乾燥に続いて、オリゴヌクレオチドサンプルが水に溶解され、そして例えば、過塩素酸リチウムにより沈殿され、続いて、10,000gで10分間、遠心分離される。次に、得られるペレットは、10％水性アセトンにより洗浄される。この方法は、“標準純度”の単一逆相HPLC（RP-HPLC）オリゴヌクレオチドを生成する。
【０２００】
オリゴヌクレオチドは任意には、“高純度”二重逆相＋イオン交換HPLC（IE＋RP HPLC）精製されたオリゴヌクレオチドを生成するために、イオン交換HPLCにより再精製され得る。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドは、５×10 Sourceカラム（Amersham Phannacia Biotech, Piscataway, NJ）上にそれらを負荷することにより再精製され、そして１MのLiCl、0.1MのTRIS緩衝液（pH8.0）の0％〜50％線状グラジエントを用いて溶出される。オリゴヌクレオチド種に対応するHPLCピークが、集められ、プールされ、過塩素酸リチウムにより沈殿され、そして凍結乾燥される。
【０２０１】
化合物及び/又はオリゴヌクレオチド自体は、例えばVoyager DE BioSpectrometry workstation (PE BioSystems, Framingham, MA)を用いて、質量分光計により、合成及び精製の後、確められ得る。
【０２０２】
4.3検出できるラベルの検出：
検出できるラベルは、制限なしに、ラベルの検出のために適切である、当業者に知られているいずれかの手段により検出され得る。例えば、本発明の一定の修飾されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、適切な条件下で複合体を形成できるポリペプチド（例えば、アビジン又は抗体）と、化合物とを接触することにより検出され得るが、但し、ポリペプチドは、複合体又は複数の複合体が一般的に従来の検出技法により形成される場合、検出され得る１又は複数の成分を含むべきである。他の検出できるラベルは、例えば分光光学的技法により検出され得る。
【０２０３】
4.3.1アビジン：
本発明のビオチン−ラベルされた化合物のための１つのポリペプチド検出器は、アビジンである。アビジンが実質的に表示できるインジケーター分子（例えば、蛍光色素、例えばフルオレセイン又はローダミン）、電子密の試薬（例えば、フェリチン、ヘモシアニン、又はコロイド状金）、又は不溶性反応物を沈殿することができる酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）に結合される場合、プローブの存在、位置及び/又は量が確立され得る。
【０２０４】
アビジン−ビオチン技法は、流動細胞計測法及び光、電子及び蛍光顕微鏡、及び溶液に基づく方法、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）において使用され得る。さらに、アビジン−ビオチン及び抗体−ヘプテン技法は時折、複合体溶液、細胞又は組織サンプルにおける複数標的物の同時、多色彩検出のために組み合わされる。さらに、検出試薬及びサンドイッチプロトコールの適切な選択により、それらの技法は、低い分析物を増殖するために使用され得る。例えば、架橋方法は、アビジン又はストレプトアビジンが２つのビオチニル化された分子間で橋として作用する、シグナル増幅及び改良された組織侵入のための通常の免疫組織技法である。
【０２０５】
アビジンは、不運なことには、核酸又はクロマチン材料と共に使用される場合、ビオチンインジケータータンパク質として低い所望性にする１つの性質を有する。アビジンは、濃縮されたクロマチン、又はそのビオチン−結合性質に無関係である態様で、多量の核酸を含む亜細胞画分に強く結合することが報告されている（Heggeness, Stain Technol., 52, 165, 1977; Heggenessなど., J Cell. Biol., 73,783, 1977; & Bayer など., N. letlzods of Biochernical Analysis, 26, 1, 1980）。
【０２０６】
4.3.2ストレプトアビジン：
ビオチン−含有ヌクレオチド及び誘導体のためのもう1つのプローブは、ストレプトアビジン、すなわち土壌生物ストレプトミセス・アビジン（Streptomyces avidinii）により合成されるアビジン−様タンパク質である。その調製及び精製は、引用により本明細書に組み込まれる、Hoffrnan, など., Proc, Natl. Acad. Sci., 77,4666 (1980)に記載されている。ストレプトアビジンは、アビジンよりも低いpI（5.0）を有し、グリコシル化されず、そしてアビジンよりもDNAに対して低い非特異的結合を示し、そして従って核酸検出を包含する用途において実質的な利点を提供する。
【０２０７】
タンパク質ストレプトアビジンは、カップリングされた可視化システム（例えば、蛍光プローブ（下記4.6.1.1を参照のこと）又は組織化学試薬（下記4.3.3を参照のこと）を、ハイブリダイズされたビオチン−含有ポリヌクレオチドの部位に特異的に方向づけするためのビークルとしての抗−ビオチンIgGに代わるものである。抗−ビオチンIgG以上のストレプトアビジンの利点の１つは、ビオチン対するその親和性がKassn＝1015であり、そしてヘプテンIgG相互作用についての会合定数が107〜1010であることである。早い反応速度及び極度な親和性とは、ビオチニル化されたプローブを局在化するために必要とされる時間がストレプトアビジンに関して、数分であるのに対して、免疫学的試薬に関しては、数字間であろうことを意味する。
【０２０８】
ビオチンストレプトアビジン検出システムを用いての組織サンプルからのタンパク質の分析は、Bio Rad Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot Detection (BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いてのウェスターンブロット検出により例示されるが、当業界において良く知られている。この検出型は、ストレプトアビジンの増殖を伴った、ビオチニル化された第2抗体を使用する。次に、ビオチニル化されたアルカリホスファターゼは、サンドイッチを完結し、そして色を進行する試薬（例えば、５−プロモ−４−クロロ−インドイルホスフェート及びニトロプル−テトラゾリウム）が添加される。これは、ビオチニル化されたアルカリホスファターゼ結合のいずれかの点で紫色の沈殿物を形成する。
【０２０９】
4.3.3単一特異的ウサギIgG抗ビオチン免疫グロプリン：
ビオチン様プローブ検出のためのタンパク質は、単一異的ウサギIgG抗ビオチン免疫グロブリンである。この化合物は、ウシ血清アルブミン−接合されたビオチンによりウサギを免疫化し、続いて親和性クロマトグラフィーにより精製することにより調製され得る（Berger, Melody in Enzynzology, 62,319, (1979)）。抗−ビオチン抗体は、クロマチン材料への抗体のほとんど無いか、存在するなら、非特異的結合が生じるので、現場ハイブリダイゼーションによる染色体上の特異的ポリヌクレオチド配列の検出において非常に有用であることがわかっている。
【０２１０】
4.3.4免疫学的及び組織化学的方法：
ビオチンの検出のための免疫学的及び組織化学的方法は、その基本的アプローチが遺伝子マッピングの急速な方法、現場ハイブリダイゼーション、及びブロットハイブリダイゼーション方法による特定核酸配列の検出のための非放射線方法のために有用であることを示している。この技法は、新規の臨床学的診断方法の開発に使用され得る。
このアプローチを用いて、特定のデオキシリボ核酸又はリボ核酸分子、特に生存生物（例えば、細菌、菌類、ウィルス、酵母又は哺乳類）由来の分子の存在を決定することが可能である。これは、患者又は他の対象における病因体含有核酸の診断を可能にする。
【０２１１】
さらに、それは、抗生物質耐性を決定するために細菌をスクリーニングするための方法を提供する。従って、例えばストレプトコーカス・ピオゲネス（Streptococcus pyrogenes）又はネイセリア・メニンギチジス（Neisseris meningitides）におけるペニシリン耐性；スタフィロコーカス・アウレウス（Staplalococcus auteus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、シュードモナス・アエルキノア（Pseudomonas aeruqinosa）、ストレプトコーカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）又はネイセリア・コノルホエアエ（Neisseria gouorrhoeae）におけるテトラサイクリン耐性；及びマイコバクテリウム・ツベルキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)におけるアミノグリコシド耐性が決定され得る。
【０２１２】
それらの方法においては、核酸配列に対して相補的であり、生物又はその抗生物質耐性を特徴づけ、そしてさらに、本発明の１又は複数の修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが調製される。このポリヌクレオチドは、研究される生物から得られる核酸によりハイブリダイズされる。ハイブリダイズの失敗は、生物又は特徴的耐性の不在を示す。次に、ハイブリダイズされた核酸重複体は、その重複体と、検出可能成分を担持する適切なポリペプチドとの間で複合体を形成し、そして適切な検出技法を用いて、その複合体の存在を検出することにより同定される。正の検出は、複合体、重複体及び従って、興味ある核酸配列が存在することを示す。
【０２１３】
このアプローチは、遺伝子障害、例えばサラセミア及び鎌状赤血球貧血症の診断に拡張され得るが、但しそれらだけには限定されない。その存在又は不在（サラセミアの場合）が障害に関連するデオキシリボヌクレオチド酸遺伝子配列が、適切な検出可能ポリペプチドとの複合体形成に基づいて、本発明のポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに従って検出され得る。
【０２１４】
染色体上の特定の遺伝子座に対する遺伝子又はそれらの転写体のマッピングは、単調で退屈な及び時間の浪費、例えば主に、細胞融合及び体細胞遺伝学の技法を伴う。現場ハイブリダイゼーションは染色体ポリテニゼーションを受ける種、例えばショウジョウバエにおける単一の遺伝子配列をマッピングするために都合良く使用されて来たが、ほとんどの高等真核生物の染色体におけるユニークな配列遺伝子の検出は、標準オハイブリダイゼーション方法を用いて困難であった。組換えDNA技法は真核細胞に見出される実質的にすべての単一コピー配列の分子クローニングを実施可能にして来たので、そのようなクローン化されたゲノムフラグメントの染色体起源をマッピングするための急速且つ敏感な方法を有することは非常に有益であろう。
【０２１５】
修飾されたヌクレオチドは、放射性同位体の使用を回避する現場ハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングの方法に使用され得る。この方法は、ニック翻訳によりDNAプローブ中に酵素的に組込まれ得るチミジン類似体含有ビオチンを利用する。現場ハイブリダイゼーションの後、ビオチン分子は、親和性精製された抗−ビオチン抗体のための標識として作用する。
【０２１６】
ポリテン染色体は、現場遺伝子マッピングのための間接的免疫蛍光により検出されたので、本発明の修飾されたヌクレオチドを用いてのプローブの効力を確立するための試験システムとして使用される。それらのクローンの多くは、放射性同位体を用いる従来の現場ハイブリダイゼーション方法によりショウジョウバエ染色体地図上の特定のバンドをすでに割り当てられて来た。
【０２１７】
この免疫学的方法はまた、サテライトDNAがマウス中期染色体のセントロメア領域までマッピングされている哺乳類染色体と実施できることがまた示されている。この結果は、ヒト及び他の哺乳類からの染色体における単一コピー（ユニーク）配列についての単純遺伝子マッピング方法の開発のための基本的な基礎を提供する。そのような方法は、染色体の遺伝子機構の理解を高く促進すべきであり、そして臨床学的細胞遺伝子診断を、より急速且つ実際的にする。
【０２１８】
染色体拡張が攻撃される単一段階の“抗体サンドイッチ”方法、すなわちウサギ抗ビオチンIgGとの後ハイブリダイゼーションは、成功するが、このプロトコールは明白な遺伝子割り当てのための十分な蛍光を生成することはできない。しかしながら、より強い蛍光比色シグナルが、Lamm など., (1972);及び Wofsy, など., (1974)により記載される“ハプテン−抗体サンドイッチ技法”を用いることにより達成され得る。この方法においては、一次抗体（例えば、非特異的ウサギ抗ビオチンIgG）が、ヘプタン化された試薬、例えば２，４−ジニトロフルオロベンゼンにより化学的に修飾され、好ましくは免疫グロブリンの抗原親和性カラム（ビオチンSepharoseTM）への結合を伴う。
【０２１９】
15〜20ほどの多くのヘプテン（DNP）基が、その抗原結合親和性又は特異性を低めることなく、一次抗体にカップリングされ得る（Wallace and Wofsy, 1979を参照のこと）。試験サンプルの一次抗体処理、続いて、蛍光ラベルされた抗IgGよりもむしろ蛍光ラベルされた抗ヘプテンIgG抗体とのインキュベーションを行う場合、蛍光シグナルの５〜７倍の上昇が達成され得る。
【０２２０】
単一特異的テンジュクネズミ抗DNP IgGがまた入手できるので、二次抗体はビオチンによりハプテン化され得、そして従って２種の抗−ヘプテンIgG集団、すなわちDNPラベルされた抗−ビオチンIgG及びビオチン−ラベルされた抗−DNP IgGを生成することができる。それらは他方では、数回のハプテン−抗体サンドイッチを達成するため使用され得、そして次に、多くの哺乳類種からのIgG分子に対して特異的に結合し、そしてその付随する有用性を伴って、一次抗体シグナルの莫大な増幅をもたらす、スタフィロコーカス・アウレウスからの蛍光ラベルされたプロテインAにより追跡され得る。
【０２２１】
ビオチニル化されたDNAプローブによりハイブリダイズされたポリテン染色体が、ストレプトアビジンと共にインキュベートされ、続いて、ビオチン及びFITCにより二重ラベルされたウシ血清アルブミン（FITC、ビオチニル−BSA）と共にインキュベートされる。４個のストレプトアビジンサブユニットの１つのみがたぶん、個々のビオチン化されたDNA部位での結合に包含されるので、実質的に１つのラベルされたBSA分子が、ストレプトアビジンビオチニルヌクレオチド複合体の残る３個の非接合されたサブユニットの個々に結合することができる。この単一ストレプトアビジン＋FITC、ビオチニル−BSA層からの蛍光シグナルが、基本的な“抗体サンドイッチ方法”を用いて、対照に比較されるであろう。
【０２２２】
“抗体サンドイッチ”及びストレプトアビジン＋FITC、ビオチニル−BSA検出強度が比較できる場合、ストレプトアビジン＋FITC、ビオチニルBSAシステムを、複数“ハプテン抗体サンドイッチ”アプローチに類似する態様で、単一コピー感受性に増強することができる。BSA上のビオチン基のいくつかは、第１層のストレプトアビジンに結合されないので、第２層のストレプトアビジンは、十分なシグナルが得られるまで、添加され得る。例えば、第２層において、２つのストレプトアビジンプロモーターのみが個々の第１層BSAに結合し、そしてそれらのストレプトアビジンプロモーターの個々の３個のFITCビオチニルBSA分子を結合する場合、第２層強度は第１層からの強度の２倍であり；第３層に関しては、類似する結合理論によれば、蛍光強度は第１層の強度の12倍であり、その結果、全体強度は急速に上昇するであろう。
【０２２３】
連続的に添加される層に関しては、より大きなキャリヤータンパク質、例えばBSAよりもむしろチオグロブリンが、結合される蛍光及びビオチンプローブの量を最大にするために使用され得る。ビオチンプローブとキャリヤータンパク質との間に長いリンカーアームを使用することがまた必要である。長いリンカーアームは、ビオチン化された蛍光キャリヤー分子の個々の接合されていないストレプトアビジンサブユニットへの理論的供給を立体的に最適化し、そしてビオチン化された蛍光キャリヤーに結合する続く層におけるストレプトアビジンプロモーターの数を最大にすべきである。適切な調節は、蛍光プローブ及びビオチンによるキャリヤータンパク質の置換が溶解性及び/又は非特異的結合問題を引き起こさないことを保証するために行われる。
【０２２４】
ストレプトアビジン−キャリヤータンパク質供給システムは、その供給速度の他に、免疫蛍光アプローチよりも２つの有意な利点を有する。第２に、キャリヤータンパク質のみが修飾される必要があり、そしてビオチン基がストレプトアビジンに接近できる限り、機能的又はさらに全体的構造統合性を維持する必要はない。
【０２２５】
ハイブリダイズされたプローブを可視化するための蛍光方法に代わる方法は、酵素、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを、不溶性の着色された沈殿物への可溶性基質の酵素転換が光顕微鏡可視化を可能にするハイブリダイゼーション部位に向けることである。この技法の重要な利点は、組織化学的方法が蛍光検出よりも10〜100倍、敏感であることである。さらに、着色された沈殿物は、集中的な光照射により漂白されず、従って蛍光光顕微鏡の一般的な欠点の１つを回避する。
【０２２６】
それらの酵素は、二官能価試薬、例えばグルタルアルデヒドを用いて、又はペルオキシダーゼの場合、ペルオキシダーゼ炭化水素成分のアルデヒドへの酸化及び所望するタンパク質のε−アミノ基とのそれらの残基へのカップリングを通して、“ハプテン抗体サンドイッチ”技法において、蛍光プローブの代わりに、最終抗体にカップリングされ得る。ストレプトアビジンビオチン化されたキャリヤータンパク質方法に関しては、それにカップリングされるビオチニル基を有する酵素が、蛍光ビオチン化されたキャリヤーシステムを置換する。他方では、酵素は、ビオチン化されたBSA又はチログロブリンを用いて前の層に構築されるストレプトアビジン部位の増幅を伴って、ストレプトアビジンの最後の層に、ビオチンを通してカップリングされ得る。
【０２２７】
非常に低いレベルの蛍光の検出及び/又は映像化は、レーザー及び光電子増倍管から構成される、現在入手できる像増幅器又はシステムを用いて可能である。それらの方法は、個々の光子のレベル以下の光の検出を可能にする。適切なデジタル処理システムにより、像の個々の点（すなわち、個々の画素）が目的での点により放される光子の数に厳密に比例する像が生成され得る。細胞又は細胞の一部がレーザー線を通して流れるこの種類のシステム又は流動システムを用いて、100〜眼により検出され得る1000以上の因子の蛍光材料についての検出感度の上昇を得ることができる。この上昇は、単一のコピー遺伝子の蛍光を検出するために十分である。
【０２２８】
4.3.5他の検出技法：
式Iの化合物はまた、例えば酵素又は蛍光団による接合により、シグナル生成化合物に直接的に接合され得る。本発明の例示的な酵素は、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、オキシドレダクターゼ、及びペルオキシダーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本発明の例示的蛍光化合物は、上記セレクション4.1.4に開示されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されず、そしてまた、ローダミン及びその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロンを包含する。本発明の例示的な化学発光化合物は、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを包含するが、但しそれだけには限定されない。
【０２２９】
ラベルを検出するための手段は、当業者に良く知られている。例えば、ラベルが蛍光ラベルである場合、それは、光の適切な波長を有する蛍光色素を励起し、そして得られる蛍光を、例えば顕微鏡、視覚的調査、写真フィルム、電子検出器、例えば電荷カップリングされた装置又は光増幅器の使用、及び同様のものによる検出により検出され得る。同様に、酵素ラベルは、酵素のための適切な基質を供給し、そしてその得られる反応生成物を検出することにより検出され得る。最終的に、単純な比色ラベルがしばしば、ラベルにより結合される色彩を観察することにより、単純に検出される。従って、種々のディップステックアッセイにおいては、接合された金がしばしばピンク色に出現する。
【０２３０】
4,4 ホスホラミジット合成：
本発明のもう１つの好ましい種類の試薬は、本発明の化合物を組み込むホスホラミジット化合物である。ホスホラミジット試薬は、下記一般構造：
【０２３１】
【化８９】
【０２３２】
を有し、そして本発明の化合物の糖のヒドロキシル基（例えば、3’又は5’ヒドロキシル基）と共有結合を形成することができる。従って、本発明は、5’-OH又は3’-OHでホスホラミジット試薬を含んで成る、式Ｉ−XLのいずれかの化合物からホスホラミジット化合物を製造するための方法を提供する。そのようなホスホラミジット試薬は特に、本発明の化合物によりラベルされた核酸の自動化学合成のために有用である。
【０２３３】
そのようなホスホラミジット試薬は、ヌクレオシド又はヌクレオチド、又は核酸のヒドロキシル基、例えば5’−ヒドロキシル基と反応する場合、ホスフェートエステル連鎖を生成するために、酸化されるホスフィットエステル連鎖を形成する。ホスホラミジット化学の詳細な議論に関しては、例えば引用により本明細書に組込まれるCarruthers など., アメリカ特許第4, 458, 066号 及び 4,415, 732号 及び Gait, 1985, Oligonucleotide Syntlaesis : A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Englandを参照のこと。ホスホラミジット試薬は、ヌクレオシド又は非ヌクレオシド性であり得る。
【０２３４】
4.5検出可能ラベル−含有オリゴヌクレオチド：
本発明はさらに、本発明の化合物を含んで成るオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドにおける１又は複数のヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、いずれの長さのものでもあり得るが、但し、好ましくは少なくとも８個の長さのヌクレオチドである。他の態様においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、10, 12, 15, 18, 20又はそれ以上の長さのヌクレオチドである。ある態様においては、オリゴヌクレオチドは、50以下、40以下、又は30以下の長さのヌクレオチドである。
【０２３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは典型的には、相補的塩基対合を形成し、そして3’末端で相補的鎖の合成の起点として作用する-OH基を与える。従って、その主鎖は、ホスホジエステル連鎖を通して１つに必ずしも制限される必要はない。例えば、それはペプチド連鎖に基づいて主鎖又はペプチド核酸としてOの代わりにSを有するホスホロチオエート誘導体から構成され得る。
一般的に、検出できるラベルされたオリゴヌクレオチドは、種々の異なった個体支持体、例えば調節された多孔性ガラス又はポリスチレンにより合成され得るが、但しそれらだけには限定されない。
【０２３６】
4.6検出可能ラベルの使用方法：
ハイブリダイゼーションを検出するための手段として検出可能ラベルを使用するいくつかのハイブリダイゼーションアッセイ形は記載されており、それらのいくつかは下記に記載される。それらのアッセイは例えば、サンプルにおける特定のヌクレオチド配列の存在を検出し、標的核酸配列内の突然変異の存在を検出するために、標的核酸上の連続配列の存在を検出し、核酸ハイブリダイゼーションの運動学をモニターし、そしてPCR反応の進行をモニターするために有用である。
【０２３７】
ハイブリダイズする配列は、安定したハイブリッドを提供するためには完全な相補性を有する必要はない。多くの情況下で、約10％以下の塩基が、４個の又はそれ以上のヌクレオチドの無視できるループのミスマッチである安定したハイブリッドが形成するであろう。従って、本明細書において使用される場合、用語“相補的”とは、特にことわらない限り、一般的に、約90％又はそれ以上の相同性が存在するアッセイ条件下でその“補体”と安定した重複体を形成するオリゴヌクレオチドを言及する。
【０２３８】
4.6.1標的核酸の検出：
核酸ハイブリダイゼーション現象の検出のために本発明の化合物を使用する典型的な態様が本明細書に記載される。
本明細書に記載されるアッセイ形は単一の検出可能ラベルのみを使用するシステムにより表されるが、多−レポーターシステムもまた実施され得る。そのような多−レポーターシステムは、単一反応体積における複数のハイブリダイゼーション現象の分析を必要とする用途において好都合である。そのようなシステムにおいては、レポーター分子の個々が、他のレポーターの発光の間スペクトル分解できる発光を生成する。
【０２３９】
4.6.1.1プローブ方法：
１つのアッセイ形においては、単一のオリゴヌクレオチドプローブが使用される。プローブは、本発明の化合物を含んで成る。化合物は、プローブの3’末端又は5’末端に結合されるか、又はプローブ配列内のいずれかのヌクレオチドで存在するっことができる。
オリゴヌクレオチドプローブ企画及び合成の基本原理は良く知られている。それらの基本原理は一般的に、本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプローブの企画及び合成に適用する。
【０２４０】
本発明は、実質的に無限の数の異なったオリゴヌクレオチドプローブを包含する。例えば、本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、長さの点で相当に変化することができる。好ましい長さは、考慮、例えば標的核酸の長さ、興味あるヌクレオチド配列の長さ、標的核酸型（すなわち、DNA又はRNA）、標的核酸G−C含有率、及びプローブ上の検出可能ラベルの空間に依存するであろう。好ましくは、本発明の実施に使用されるプローブの長さは、20〜200個のヌクレオチドである。より好ましくは、前記長さは、40〜100個のヌクレオチドである。
【０２４１】
プローブの長さにかかわらず、プローブは、ヌクレオチド配列において変化することができる。本発明に使用されるプローブのヌクレオチド配列は、標的核酸の配列に依存するであろう。プローブのヌクレオチド配列は、選択された現場ハイブリダイゼーション条件下での標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的核酸に対して十分な相補性を有するべきである。好ましくは、プローブと標的核酸との間の塩基対適合は、少なくとも80％である。より好ましくは、塩基対適合は約100％である。
オリゴヌクレオチドにおける検出可能ラベルの合計数及び空間は変化することができる。好ましくは、検出可能ラベルは、オリゴヌクレオチドの3’末端から５個の塩基内に組込まれる。
【０２４２】
4.6.1.2 5’→3’エキソヌクレアーゼアッセイ：
5’→3’エキソヌクレアーゼアッセイとして本明細書に言及される、さらにもう１つのアッセイ形においては、レポーターラベル、例えば蛍光団、及び消光剤ラベル、例えばテトラメチルローダミン、Black Hole Quenchers (BioSearch Technologies, Novato, CA), DABCYL, 又はQSY-4の両者を含む二重ラベルされたプローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーションに基づいて消化され、それにより、プローブからラベルの１つ又は両者が遊離される（Lee など., 1993, US, 4, 88 : 7276 7280 ; アメリカ特許第5, 538, 848 号及び第 5, 210, 015号）。
【０２４３】
本発明の方法においては、蛍光団又は消光剤のいずれか又は両者が、本発明の化合物を用いて、オリゴヌクレオチド中に組込まれ得る。この方法においては、二重ラベルされたプローブが、標的核酸にハイブリダイズされる。さらに、オリゴヌクレオチドプライマーが、プローブから上流の位置で、すなわちプローブに対して5’方向、及び標的核酸の3’末端に隣接して、標的核酸にハイブリダイズされる。次に、プライマーは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素、例えばDNAポリメラーゼを用いて延長され、それにより延長されたプライマーが形成される。
【０２４４】
プライマー延長反応の間、ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、レポーターラベルを含む第１プローブフラグメント及び消光剤ラベルを含む第２プローブフラグメントを形成するために、プローブを消化するよう作用する。従って、レポーター及び消光剤ラベルが分離され、そしてレポーターの蛍光が消化されなくなる。この方法は、Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CAから入手できるTaqMan(商標)キット及び試薬を用いて行われ得る。
【０２４５】
4.6.1.3 同時PCR：
本明細書に記載されるアッセイは、核酸増幅段階、例えばPCRと組合して行われ得る。すなわち、ハイブリダイゼーションアッセイを行う前、核酸サンプルのすべて又は一部が増幅され得る。増幅段階と組合して行われる場合、ハイブリダイゼーションアッセイは、エンド−ポイント形又は同時形で行われ得る。エンド−ポイント形においては、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応が完結した後、例えばPCR反応の増幅サイクルのすべて又は実質的にすべてが完結された後、実施される。同時形においては、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応の間、例えばPCRの個々の熱サイクルの後、複数回、実施される（Higuch, アメリカ特許第5,994,056号及び第6,171,785号；それらの個々は引用により本明細書に組み込まれる）。同時形は、標的核酸の初期量の定量的測定が必要とされる場合、例えば病原体核酸のコピー数が血液サンプルに存在する場合、好ましい。
【０２４６】
4.6.1.4リボヌクレアーゼ活性の検出：
検出可能ラベル−含有核酸はまた、サンプルにおけるRNアーゼ活性の存在及び/又は量を検出するために使用され得る。
手短には、リボヌクレアーゼ活性は、RNアーゼ基質として作用する合成オリゴヌクレオチドをサンプルと共に、リボヌクレアーゼ酵素による基質の分解のために十分な時間インキュベートすることにより検出される。基質は、切断部位として機能する内部位置での少なくとも１つのリボヌクレオチド残基、切断部位の一方上でのレポーター色素、又は切断部位の他方上での消光剤色素を含む一本鎖核酸分子を含んで成る。内部リボヌクレアーゼ残基の切断に基づいて、発光が消光色素により消光されるレポーター色素が検出できるようになる。従って、蛍光シグナルの検出は、リボヌクレアーゼ切断現象が生じ、そして従って、サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する。
【０２４７】
１つの態様においては、本発明のRNアーゼ検出方法は、１又は複数の陽性対照と共に行われる。１つの態様においては、陽性対照は、定量的陽性対照である。
【０２４８】
4.6.1.5 エンドヌクレアーゼ活性の検出：
検出可能ラベル含有核酸はまた、サンプルにおけるエンドヌクレアーゼ活性の存在及び/又は量を検出するために使用され得る。
手短には、エンドヌクレアーゼ活性は、ラベルされたオリゴヌクレオチドを、サンプルと共に、エンドヌクレアーゼ酵素、又はエンドヌクレオ分解活性を有する他の分子による基質の分解のために十分な時間インキュベートすることにより検出される。
【０２４９】
基質は、切断部位として機能する内部位置での少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド残基、前記切断部位の一方側上でのレポーター色素、及び前記切断部位の他方側上での消光剤色素を含む一本鎖核酸分子を含んで成る。内部リボヌクレアーゼ残基の切断に基づいて、この発光が消光剤色素により消光されるレポーター色素が検出できるようになる。従って、蛍光シグナルの検出は、エンドヌクレオ分解性切断現象が生じ、そして従って、サンプルがエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示す。
１つの態様においては、本発明のエンドヌクレアーゼ検出方法は、１又は複数の陽性対照と共に行われる。１つの態様において、その陽性対照は、定量的陽性対照である。
【０２５０】
4.6.1.6 TdT活性の検出：
検出可能ラベル含有核酸はまた、サンプルにおける末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）活性の存在及び/又は量を検出するために使用され得る。
手短には、TdT活性は、ラベルされていないオリゴ−又はポリヌクレオチドを、ラベルを担持するヌクレオチド三リン酸の存在下で、サンプルと共に、TdT酵素、又はTdT活性を有する他の分子による１又は複数のラベルされたヌクレオチド三リン酸の基質への付加のために十分な時間インキュベートすることにより検出される。基質は、少なくとも１つの遊離3’OH基を含む一本鎖又は二本鎖核酸分子を含んで成る。基質へのラベルの付加は、ラベルされたヌクレオチド三リン酸からのオリゴ−又はポリヌクレオチドの分離に基づいて検出され得る。
【０２５１】
１つの態様においては、本発明のTdT検出方法は、１又は複数の陽性対照と共に実施される。１つの態様においては、陽性対照は、定量的陽性対照である。１つの態様においては、オリゴ−又はポリヌクレオチドは、内部部位で消光剤によりラベルされ、そしてラベルされたヌクレオチドは内部部位で蛍光団によりラベルされ、そしてラベルされたヌクレオチド三リン酸はラベルとして消光剤分子を担持する。上記２種の態様のいずれかにおいては、ラベルされたヌクレオチド三リン酸の付加は、TdT活性の同時検出を可能にする。そのようなアッセイは、オリゴ−又はポリヌクレオチド上のラベルが、蛍光共鳴エネルギートランスファー（FRET）が消化剤と蛍光団との間で生じるよう配置されることを必要とする。
【０２５２】
4.6.1.7 染色体核型分類：
本発明はまた、染色体核型分類方法も提供する。この方法においては、既知の遺伝子に対応し、そして修飾されたヌクレオチドを含む修飾されたポリヌクレオチドが調製される。それらのポリヌクレオチドは、染色体デオキシリボ核酸によりハイブリダイズされ、そして得られる重複体は、複合体形式を可能にするための適切な条件下で適切なポリペプチドと接触される。前記ポリペプチドは、複合体の位置が決定され、そして特定の遺伝子の位置が確定されるよう、検出可能成分を含む。
【０２５３】
4.6.1.8 腫瘍細胞の検出：
腫瘍細胞は、本発明に従って修飾され、そしてポリペプチド、例えばα−胎児タンパク質又は癌胎児性抗原（この存在が特定の腫瘍細胞についての診断である）の生成に関連するデオキシリボ核酸遺伝子配列から合成されるメッセンジャーリボ核酸に対して相補的であるポリヌクレオチドを調製することにより診断され得る。従ってハイブリダイゼーション及びハイブリッド重複体が、腫瘍細胞の検出方法を提供する。
【０２５４】
4.7キット：
本発明はさらに、本発明の生成物を含んで成るキットを提供する。そのようなキットは、中でも、本明細書に記載される方法の実施のために、又は本明細書に記載される組成物の合成のための材料を提供するために有用である。一般的に、本発明のキットは、１又は複数の容器に、本発明の化合物、又は本発明の化合物を組み込むオリゴヌクレオチドを含んで成る。追加の成分が、本発明の化合物を利用する特定の用途に依存して、キットに含まれ得る。
【０２５５】
例えば、キットがセクション4.6.1.3に記載される同時PCRアッセイに向けられる場合、キットはさらに、DNAポリメラーゼを含むことができる。本発明のキットがセクション4.5.1.4のRNアーゼ検出アッセイの実施に向けられる場合、キットはさらに、RNアーゼを含まない水を含むことができる。キットが二本鎖又は一本鎖DNA分子の末端ラベリングに向けられる場合、キットはさらに末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含んで成る。キットが酵素アッセイ、例えばエンドヌクレアーゼ活性又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性のアッセイに向けられる場合、キットはさらに、既知比活性の標準量のエンドヌクレアーゼ又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む。
【０２５６】
そのようなキットは任意には、１又は複数の次のものを含む：負及び/又は陽性対照、緩衝液、及びキットの試薬の使用のための説明書。キットが診断用途のために意図される場合、キットはさらに、診断用途のための調節是認を示すラベルを含むことができる。
【０２５７】
4.8 検出可能ラベルの一般的な合成：
本発明はさらに、本発明の純粋な例示であるが、しかし本発明の範囲を制限しない次の例の考慮により明確にされるべきであろう。
本発明の化合物は、スキーム１−５に例示される合成方法を通して得られる。本発明の化合物及びその中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は既知の合成方法及び試薬を用いて、市販の材料から調製され得る。
【０２５８】
4.8.1 スキーム１：リンカーラベル化合物の合成：
【化９０】
リンカー及びラベルを含んで成る化合物を合成するために有用な方法を概略し、ここでリンカーは例えばポリエチレングリコール又はポリメチレンであり、そしてラベルは比色、化学発光、生物発光又は蛍光発光化合物である。
【０２５９】
第１に、化合物２のカルボキシル基が、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）基により置換され、アミド化及びペプチドカップリングが促進される。しかしながら、他の適切なカップリング基は、当業界において良く知られており、例えば次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：1−[ビス（ジメチルアミノ）メチレン]−ヘキサフルオロホスフェート−１，３−オキシド−O−（ベンゾトリアゾール−１−イル）N, N, N’, N’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、ジシクロへキシルカルボジイミド（DCC）、又はO−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）。
【０２６０】
ジアミン１（ここでリンカーはテトラエチレングリコール又はテトラメチレングリコールである）は市販されている（Aldrich Chemical Co. , Milwaukee, Wisconsin）。さらに、QはSH又はOHであり得、この場合、アミンは任意には、保護され得る。化合物３への化合物１の転換のために適切な有機溶媒は、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、キシレン、炭化水素溶媒（例えば、ペンタン、ヘキサン及びヘプタン）、及びそれらの混合物を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２６１】
化合物２への化合物１の添加の後、反応混合物は約２日間、攪拌され、そして反応混合物は、反応が適切な分析方法、好ましくは薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される場合、実質的に完結するまで、攪拌される。次に、反応混合物は、当業界に知られている方法により消化され、そして化合物２が単離され、そして所望には、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。
【０２６２】
4.8.2 スキーム２：保護されたα−置換された−リンカー−ラベル化合物の合成：
【化９１】
【０２６３】
スキーム２は、−リンカー−ラベル化合物５を形成するために、R2−置換された化合物４によるリンカーラベル化合物３のカップリングを示し、ここでR2は本明細書に記載され、そして−Pgは保護基である。
好ましくは、化合物５を合成するために、約１当量の４及び1.5当量の３の溶液が、不活性雰囲気下で適切な有機溶媒に溶解される。極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル又はジメチルスルホキシド）の使用が好ましい。溶液は、約15℃〜ほぼ室温の範囲内の一定温度で、好ましくは室温で維持され、そして塩基、好ましくはアミン塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンが添加されるが、但しそれらだけには限定されない。好ましくは、約10当量の置換されたアミンが１回の添加で添加される。
【０２６４】
アミン塩基の添加の後、反応混合物は、室温で約１〜４時間、好ましくは反応混合物の温度が一定に維持するような速度で攪拌される。反応混合物は、その反応が、適切な分析方法、好ましくは薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより分析される場合、実質的に完結するまで、この温度で攪拌される。次に、反応混合物は消光され、化合物５を含む混合物が得られた。化合物５は、当業界において知られている技法（例えば、分離用HPLC又はフラッシュクロマトグラフィー）により精製される。しかしながら、化合物５を含む粗調製物はまた、さらに精製しないで次の段階に使用され得る。
【０２６５】
4.8.3 スキーム３：α−置換されたリンカー−ラベルされた化合物の保護解除：
【化９２】
【０２６６】
スキーム３は、置換されたリンカーラベルされた化合物５の保護解除のために有用な方法を概略する。保護解除についての典型的方法は、極性有機溶媒に化合物５を溶解することを包含する。化合物６への化合物５の転換のために適切な有機溶媒は、メタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル又はジメチルスルホキシドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。化合物５が溶解された後、保護解除剤が添加される。適切な保護解除剤は、化合物におけるいずれの他の成分とも反応しないで、保護基を除去するであろう。
【０２６７】
適切な保護解除試薬の例は、ピペリジン、モルホリン及びDBUを包含するが、但しそれらだけには限定されない。反応混合物は、反応が、適切な分析方法、好ましくはニンヒドリン、薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより決定される場合、実質的に完結するまで（例えば、約12時間）、室温で攪拌される。次に、反応混合物が消光され、そして化合物６が作業により単離され、そして所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。
【０２６８】
4.8.4 スキーム４：オキサノシン化合物の合成：
【化９３】
【０２６９】
式７のプリン糖は、室温で、pH3−４の緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム）及び無菌水に、化合物７を溶解することにより、式８のオキサノシン糖化合物に転換され得る。次に、亜硝酸ナトリウムが添加され、そしてその溶液が室温で攪拌される。反応混合物は、反応が、適切な分析方法、好ましくは高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより決定される場合、実質的に完結するまで（例えば、約24時間）、室温で攪拌される。次に、反応混合物が消光され、そして化合物６が作業により単離され、そして所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【０２７０】
4.8.5 スキーム５：ウレア−置換されたイミダゾールアミド検出可能ラベルの合成：
【化９４】
【０２７１】
検出可能ラベル化合物８は、緩衝液（例えば、硼酸ナトリウム）中、オキサノシン化合物8と、無菌水中、置換されたリンカーラベル化合物６とを接触することにより合成され得る。反応混合物は、反応が、適切な分析方法、好ましくは高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより決定される場合、実質的に完結するまで（例えば、約24時間）、34℃〜40℃で軽く攪拌しながらインキュベーターに維持される。次に、反応混合物が消光され、そして化合物９が作業により単離され、そして所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【０２７２】
4.8.6 スキーム６：置換されていないイミダゾール−アミン検出可能ラベルの合成：
【化９５】
【０２７３】
化合物12は、当業者に知られている方法を用いて、グリコシル化された塩基11を生成するために、ハロゲン置換されたイミダゾール10をまずグリコシル化することにより合成され得る（例えば、引用により本明細書に組込まれるNucleic Acid Research (1995), 23 (4), 647-653 and Tetrahedron Asynzmetfy (1996), 7 (12), 3455-3464を参照のこと）。次に、グリコシル化された塩基11は、化合物12のために適切な条件下で、置換された−リンカーラベル化合物６と接触せしめられる。
【０２７４】
例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Journal of Heterocyclic Chemistry (2000), 37 (1), 119-126 ; Australian Journal of Chemistry (1987), 40 (8), 1399-1413; Khim. Farm. Zh. (1977), 11 (10), 38-42; Chemistry of Eeterocyclic Compounds (2000), 36 (2), 182-184; Inddian Journal of Chemistry, Sect. B, (1982), 21B(10), 928-640を参照のこと。化合物12は、所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【０２７５】
4.9 スキーム７：置換されていないイミダゾールアミド化合物の合成：
【化９６】
【０２７６】
化合物13は、当業者に知られている方法を用いて、グリコシル化された塩基11(a)を生成するために、カルボキシ官能化されたイミダゾール10をまずグリコシル化することにより合成され得る。例えば、引用により本明細書に組込まれるNucleic Acid Research (1995), 23 (4), 647-653; Bioorg. Med. Chem. Lett. , (1995), 5 (15), 1679-1684; 及び Setrahedron Ssymme7ry (1996), 7 (12), 3455-3464を参照のこと。グリコシル化された塩基11（ａ）が11（ｂ）に転換され、そして次に、化合物13の形成のために適切な条件下で、ラベル化合物６と反応される。
【０２７７】
例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Journal of Heterocyclic Chemistry (2000), 37 (1), 119-126 ; Australian Journal of Chemistry (1987), 40 (8), 1399-1413; Khim. Farm. Zh. (1977), 11 (10), 38-42; Chemistry of Heterocyclic Compounds (2000), 36 (2), 182-184; Indian Journal of Chemistry, Sect. B, (1982), 21B (10), 928-640を参照のこと。化合物13は、所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【実施例】
【０２７８】
4.10 例：本発明の化合物の合成：
4.10.1 例１：ビオチン−PEG−アミンの合成：
【化９７】
【０２７９】
2.0Lの丸底フラスコを、テトラエチレングリコールジアミン（7.0g, 36.4mモル）（Molecular BioSciences ; Boulder, COから市販されている）及びジクロロメタン（600ml）により充填した。この透明な溶液に、ジクロロメタン（100ml）中、ヒドロキシスクシンイミド（“NHS”）ビオチン（2.73g、8.0mモル）（Molecular BioScienceから入手できる）の懸濁液を、50分間にわたって添加した。反応を室温で２日間、攪拌した。溶媒を回転蒸発器上で減圧下で除去し、そして生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（70％の収率）。
【０２８０】
4.10.2 例２：FMOC−メチル−PEG−ビオチンの合成：
【化９８】
【０２８１】
DMSO DMF (6ml, 5:1の比)中、FMOC−ホモアニリン（0.65g、2.0mモル）（Flukaから市販されている）、ビオチンPEGアミン（0.56g、1.34mモル）の溶液に、DMF中、HBTU（5ml、1.0mM溶液）を、冷却条件下で添加した。５分間の攪拌の後、N, N−ジイソプロピルエチルアミン（1.0ml）を添加し、そして反応混合物を1.0時間、室温で攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発し、そして生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（50％収率）。
【０２８２】
4.10.3 例３：メチル−PEG−ビオチンの合成：
【化９９】
【０２８３】
FMOC保護基を、１，８−ジアサビシクロ[5.4.0]−ウンデク−７−エン（DBU）を用いて、アミンから除去した。メタノール中、FMOCホモアニリンPEGビオチン（0.25g、0.345mモル）の溶液に、DBU（0.2g、1.31mモル）を室温で添加し、そして反応を一晩、攪拌した。メタノールを真空下で除去し、そして生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（87％収率）。
【０２８４】
4.10.4 例４：オキサノシン三リン酸の合成：
【化１００】
【０２８５】
グアノシン三リン酸（210mg、0.384mモル、リチウム塩）（Sigma, St. Louis, MOから入手できる）を、酢酸ナトリウム緩衝液（2ml、12M、pH3.7）及び無菌水（4ml）の溶液に、室温で溶解した。この透明な溶液に、無菌水（2ml）中、亜硝酸ナトリウム（50mg、0.724mモル、1.88当量）を、軽く攪拌しながら室温で添加し、そして反応を24時間、放置した。この反応ン分析用PLCは、１つの主要（キサントシン）及び１つのマイナー（オキサノシン）なピークを示し、そして検出できる出発材料を示さなかった。化合物を、分離用カラム（Zorbax, S -C 18, 21.2 mm x 25 cm, Part # 880975-102) (Agilent Technologies (Palo Alto, CA)から市販されている)を用いて精製した。予測される生成物を含む、集められた画分を一緒にプールし、そして凍結乾燥した。精製されたオキサノシン三リン酸を、水と共に２日の凍結乾燥した後、白色固形物（42mg、21％の収率）として得た。
【０２８６】
4.10.5 例５：αメチル−PEG−ビオチンイミダゾール三リン酸の合成：
【化１０１】
【０２８７】
硼酸ナトリウム緩衝液（12ml、250mM、pH9.0）中、オキサノシン三リン酸（15mg、0.0286mモル）の溶液に、無菌水（1.0ml）中、メチル−PEG−ビオチン（20mg、0.0398mモル、1.39当量）を添加した。この反応混合物を、シェーカーを用いて、軽く動かしながら、38℃で24時間インキュベーターにおいて維持した。反応混合物をHPLCにより分析し、そして所望する生成物、すなわち有意な量のオキサノシン及び少々のアミンを見出した。化合物を、RP-HPLC（Symmetry Semi prep column, C-18, 7. 8 x 300 mm, Part # WAT 066235, Waters Corporation, Milord, MAからの）により精製し、そして11mg（40％の収率）を単離した。
【０２８８】
4.10.6 イミダゾール−PEG−ビオチンによるTDTラベリング：
本発明の化合物は、逆相HPLCにより精製され、そして分子質量により定量化された非放射性リボヌクレオチド類似体を包含するが、ただしそれらだけには限定されない。前記化合物は、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）のための基質として使用され得る。例示的な例として、イミダゾール−PEG−ピオチンは、鋳型無関係のビオチニル化のための二本鎖又は一本鎖DNA分子の3’ヒドロキシル末端に移行され得る。イミダゾール−PEG−ビオチンによりラベルされたDNAフラグメントは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイに効果的にハイブリダイズし、そしてストレプトアビジン蛍光色素接合体による染色を通して容易に検出され得る。
【０２８９】
4.10.7 フラグメント化及びラベリング：
ゲノムDNAサンプル（10mMのTRIS緩衝液中、50ng, pH8.3）を、マスター混合物、MgCl2、及び所望する組のCYP450多型体を増幅するのに適切な１組のプライマーと共に混合した。マスター混合物は次の成分を含んだ：TRIS HCl緩衝液、pH8.3；硫酸アンモニウム；DNAポリメラーゼ、ウラシル−N−グリコシラーゼ、及びデオキシヌクレオチド三リン酸dATP, dCTP, dTTP, dGTP及びdUTPの個々。反応を次の熱サイクルプロフィールにゆだねた：50℃で２分、95℃で10分、（35サイクル）95℃で15秒、67℃で4分、続いて72℃で７分のインキュベーション、及び４℃での維持。
【０２９０】
PCR反応からのPCR反応生成物からのアンプリコンのアリコートを、DNアーゼI及びホスファターゼの混合物と共にインキュベートし、アンプリコンを25−100bpの長さに切断し、そしてPCR混合物におけるdNTPを脱リン酸化した。続いてフラグメント化されたアンプリコンを、TdTを用いて、イミダゾール−PEG−ビオチンによりラベルした。
【０２９１】
4.10.7.1 DNアーゼフラグメント反応：
PCR反応生成物を、DNアーゼI、EDTA、アルカリホスファターゼ及び水を含むDNアーゼフラグメント化試薬と共に組合した。その混合物を、25℃で20分、次に95℃で10分インキュベートした。次に、フラグメント化されたアンプリコンを、TdT反応の開始の前、４℃で維持した。
【０２９２】
4.10.7.2 TdTラベリング反応：
次に、DNアーゼフラグメント化されたアンプリコンを、TdT緩衝液（1Mのカコジル酸カリウム、250mMのトリス塩基、10mMのCoCl2及び0.2mMのDTT、pH7.6）、イミダゾールPEGビオチン、TdT、水を含むラベリング混合物と共にインキュベートし、そして37℃で１時間、次に95℃で5分間、攪拌した。次に、イミダゾール−PEG−ビオチンによりラベルされたアンプリコンを、ハイブリダイゼーション溶液に移す前、４℃で維持した。
【０２９３】
4.10.8 マイクロアレイハイブリダイゼーション：
ラベルされたアンプリコンを、マイクロアレイハイブリダイゼーション緩衝液（SSPE, Triton X-100, 標準化オリゴヌクレオチド、Denhardt溶液、及び脱イオン水）に移した。
変性されたサンプルを、45℃での30分間のハイブリダイゼーションのためにフルーイディックスステーション上に負荷し、続いて50℃で洗浄し、ストレプトアビジンフィコエリトリンにより10分間、染色し、そして室温で洗浄した。マイクロアレイを、レーザーにより走査し、ソフトウェアにより遺伝子型信号に転換される蛍光強度値を生成した。PEG−ビオチンイミダゾール化合物によるハイブリダイゼーション性能を、次のいくつかの測定基準によりモニターした：バックグラウンド強度（BG）、チップ強度値：重要な完全適合（重要突然変異部位のためのKeyPM）及び参照完全適合（RefPM）、通過率（重要及び参照）、及び重要突然変異部位のための識別割合。
【０２９４】
マイクロアレイ上でのイミダゾールPEG−ビオチンの移行効率及び機能的性能を評価するために、２種の臨床学的サンプル及び対照サンプルを、250μMのイミダゾール−PEG−ビオチンの存在下で種々の量のTdT（200, 400及び800単位）によりラベルした。
【０２９５】
【表４】
【０２９６】
表４は、イミダゾールPEGビオチンラベルによるヌクレオシドのラベリングの効率を示す。特に、表４は、CYP450多型体の検出におけるイミダゾールPEGビオチンラベルの効率を示す。
本発明は、本明細書に記載される特定の態様により範囲を制限されない。実際、本発明の種々の修飾は、前述の記載及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、本発明の範囲内にある。
本明細書に引用される種々の出版物、特許及び特許出願は、その開示を引用により本明細書に組込まれる。
【技術分野】
【０００１】
1.発明の分野：
本発明は、例えばヌクレオチド配列の検出のために有用な化合物に関する。特に、本発明は、ラベルされたイミダゾール−PEG化合物、例えばその化合物を組込むヌクレオシド、ヌクレオチド及び核酸、及びそのような化合物の利用方法に関する。本発明はさらに、ラベルされたイミダゾール−PEG化合物を含んで成るキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
2.発明の背景：
生医学的研究及び組換えDNA技法に使用される多くの方法は、ラベルされたヌクレオチド又はポリヌクレオチド誘導体の使用に依存する。ラベルされた形の天然に存在するヌクレオチドとして一般的に適切である修飾されたヌクレオチドに関しては、いくつかの基準が典型的に満たされるべきである。
第１に、修飾された化合物は、ユニークである（すなわちヌクレオチド又はポリヌクレオチドと通常関係しない）置換基又はプローブを含むべきである。
第２に、プローブは、敏感な検出システムを提供するために化学的又は生物学的試薬と特異的に反応すべきである。
【０００３】
第３に、多くの実際的な適用は、類似体が酵素的に代謝される（例えば、類似体が核酸ポリメラーゼのための基質として機能すべきである）ことを必要とするので、類似体は、通常研究される核酸酵素のための比較的効果的な基質であるべきである。このためには、プローブ成分は、塩基の正常なワトソン−クリック水素結合能力を立体的に又は他方では、妨げる環位置上に配置されるべきではない。そのような場合、置換基は、ポリメラーゼ基質として不活性である化合物を生成することができる。
第４に、検出システムは、核酸ハイブリダイゼーション方法と適合できるよう、一本鎖及び二本鎖ポリヌクレオチドの両者中に組込まれるプローブ置換基と相互作用できるべきである。
【０００４】
第５に、少数のプローブ置換基を含むポリヌクレオチドの物理的及び生化学的性質は、実質的に変更されるべきではなく、その結果、ハイブリダイゼーションプローブを用いる現在の方法は広範囲に修飾される必要はない。この基準は、プローブが酵素的手段により導入されるか、又は直接的な化学的手段により導入されるかどうかにかかわらず、満たされるべきである。
最終的に、プローブ成分を結合する連鎖は、正常なヌクレオチド及びポリヌクレオチドが通常ゆだねられるすべての実験条件（例えば、高温での延長されたハイブリダイゼーション時間、フェノール及び有機溶媒抽出又は電気泳動）に対して耐性であるべきである。
【０００５】
ビオチンアビジン複合体の特異性及び強さは、細胞上の又は細胞内の特定のタンパク質、脂質又は炭水化物を可視的に位置決定するための方法を開発するために最近使用されて来た（E. A. Bayer and M. Wilchek, Methods of BiochemzcaZ A7zalysis, 26, 1, 1980）。RNAの染色体位置は、ハイブリダイゼーションプローブとしてRNAに化学的に架橋されるビオチン化されたタンパク質（例えば、チトクロムC）を用いて、電子顕微鏡により決定されて来た。
【０００６】
ハイブリダイゼーションの部位は、アビジンビオチン相互作用により介在される、アビジンフェリチン又はアビジンメタクリレート球体の結合を通して可視化された（Manning など.,Chromosoma, 53,107, 1975 ; Manning, Biochemistry, 61,1364, 1977; Broker, Nucleic Acid Res., 5,363, 1978; and Sodja など., Nucleic Acid Res., 5, 383, 1978）。ポリヌクレオチド配列の検出へのこのアプローチは、高く反復された配列である、試験される特定の場合においては好結果をもたらすが、単一又は低コピー数で存在するポリヌクレオチドの分析のためには一般的に有用でない。
従って、安全で、費用効率が高く、安定し、効率が良く、そしてより敏感な検出を提供する、検出できるラベルされた化合物についての連続した必要性が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
3.発明の要約：
本発明は、イミダゾール化合物に共有結合されるラベルを含む一連の新規ヌクレオチド誘導体を提供する。１つの観点においては、本発明は、ヌクレオチド配列の検出のためのラベルとして有用である種類の化合物に関する。もう１つの観点においては、本発明は、検出できるラベルを含んで成るオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、本発明の化合物の使用方法及び製造方法に関する。
【０００８】
本発明の化合物は、下記式I：
【化１】
【０００９】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００１０】
【化２】
【００１１】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を包含する。
【００１２】
１つの態様においては、リンカーは、(-O-アルキル)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤（個々の化合物は、“検出できるラベル”である）である。
【００１３】
本発明はまた、下記式II：
【化３】
【００１４】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００１５】
【化４】
【００１６】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を含んで成るオリゴヌクレオチドも包含する。
【００１７】
１つの態様においては、リンカーは、(-O-アルキル)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である。
【００１８】
もう１つの態様は、試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法を包含し、
ここで前記方法は、前記試験サンプルと、オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブを含んで成る組成物とを接触せしめ、ここで前記オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブは、下記式：
【００１９】
【化５】
【００２０】
[式中、塩基は、下記式：
【化６】
【００２１】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H,-NHC(O)NH2, -NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-0(アルキル),-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【００２２】
【化７】
【００２３】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
Qは、O, S又はNHであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される化合物を含んで成り、
【００２４】
ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは、中位の緊縮条件下で前記標的核酸と選択的に又は特異的にハイブリダイズすることができ；
任意には、前記サンプルを、前記励起できる波長の光に暴露し；そして
前記接触が組成物の色又は蛍光発光の変化を生成するかどうかを検出する；
ことを含んで成り、ここで前記組成物の色又は蛍光発光の変化が、標的核酸が試験サンプルに存在することを示すことを含んで成る。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−又は弱−蛍光化合物、又は消光剤である。
【００２５】
もう1つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項35記載の化合物を含んで成り；
【００２６】
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴とする。
【００２７】
もう１つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の少なくとも１つの一方側上での化合物を含んで成り；
【００２８】
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
（ｄ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｅ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｆ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
【００２９】
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける。
【００３０】
もう１つの態様は、下記式I：
【化８】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００３１】
【化９】
【００３２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
【００３３】
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物の製造方法を包含する。１つの態様においては、リンカーは、(-O-アルキル)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、消光剤、蛍光化合物、又は非−もしくは弱−蛍光化合物である。
【００３４】
もう１つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は検出できるラベル及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
【００３５】
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
【００３６】
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける。
【００３７】
もう１つの態様は、ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ラベルされたヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、本発明のの化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ラベルされたヌクレオチドを検出することを含んで成る。
【００３８】
もう１つの態様は、試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法を包含し、ここで前記方法は、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での検出できるラベルを含んで成り；
【００３９】
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
（ｄ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｅ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｆ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
【００４０】
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける。
【００４１】
3.1定義：
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“アルキル基”とは、飽和の枝なし又は枝分かれした一価の炭化水素鎖を意味する。アルキル基の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：C1-C6アルキル基、例えばメチル, エチル, プロピル, イソプロピル, 2-メチル-l-プロピル, 2-メチル-2-プロピル, 2-メチル-1- ブチル, 3-メチル-l-ブチル, 2-メチル-3-ブチル, 2,2-ジメチル-l-プロピル, 2-メチル-l-ペンチル, 3-メチル-1-ペンチル, 4-メチル-1-ペンチル, 2-メチル-2-ペンチル, 3-メチル-2-ペンチル, 4- メチル-2-ペンチル, 2,2-ジメチル-l-ブチル,3,3-ジメチル-1-ブチル, 2-エチル-l-ブチル, ブチル,イソブチル, t-ブチル, ペンチル, イソペンチル, ネオペンチル,及びヘキシル, 並びにより長いアルキル基, 例えばヘプチル, 及び オクチル。アルキル基は、置換されていないか、又は１又は２個の適切な置換基により置換され得る。
【００４２】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語−O−アルキル（又はアルキル−O−）とは、“アルコキシ基”を意味し、ここでアルキルは上記で定義される通りである。アルコキシ基は、置換されていないか、又は１又は複数の適切な置換基により置換され得る。アルキルオキシ基のアルキル鎖はたとえば、１〜６個の長さの炭素原子であり得る。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“金属”とは、第I又は第II族の金属、例えばLi+, Na+, Ca2+, 又はMg2+を言及するが、但しそれらだけには限定されない。
【００４３】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“置換された”とは、１又は複数の水素原子が個々に独立して、同じか又は異なった置換基により置換されている基を言及する。典型的な置換基は、次のものを言及するが、但しそれらだけには限定されない：アルキル, アルコキシ, -X、-R、-O、 =O、-OR、-O-OR、 -SR、-S、 =S、 -NRR、 =NR、-CX3,、-CN、 -OCN、 -SCN、 -NCO、-NCS、 -NHCHO、 -NHCOC1-C4アルキル、 -NHCOCH3、 -NHCOCH2C1、-NHCOCHC12、 -NHCOCC13、 -NHCOCF3、 -NHCOCH2C6H4-o-NO2、 NHCOCH20C6H4-o-NO2、ここで個々のXは独立して、ハロゲン（好ましくは、-F,-Cl又は-Br）であり、そして個々のRは独立して、−H, アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アリールアルキル、アリールへテロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル又はヘテロアリールヘテロアルキルである。
【００４４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“結合基”及び“リンカー”とは、交換可能的に使用され、そしてラベルと塩基とを共有結合できるか成分、例えばラベルにヌクレオシド、ヌクレオチド又は核酸を結合する“連鎖”を形成できる成分を言及する。リンカーの例は、O, S又はNHを包含するが、但しそれらだけには限定されない。任意には、結合基又はリンカーは、共有結合である（すなわち、ラベルは塩基に共有結合される）。
【００４５】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“カウンターイオ”とは、安定し、且つ合成的に入手できるイオンを言及する。カウンターイオンの例は、クロリド、ブロミド、ヨージド、スルフェート、ベンゼンスルホネート、p−トルエンスルホネート、p−ブロモベンゼンスルホネート、メタンスルホネート、トリフルオロメタンスルホネート、ホスフェート、過塩素酸塩、テトラフルオロボレート、テトラフェニルボレート、ニトレート、及び芳香族又は脂肪族カルボン酸のアニオンを包含するが、但し、それらだけには限定されない。好ましいカウンターイオンは、上記に列挙されるクロリド、ヨージド、過塩素酸塩及びスルホネートである。
【００４６】
本明細書において使用される場合、“生物学的に適合できる”物質は、好ましくは、使用される場合、毒性でなく、そして生物分子に対して実質的に有害な効果を有さない。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ビオチン”又は“ビオチン誘導体”とは、それぞれビオチン、又はビオチンの原子の１つがもう１つの適切な原子により置換されている化合物を言及し；適切な原子の例は、-O, -N, -P又は-Sを包含するが、但しそれだけには限定されない。ビオチン又はビオチン誘導体の例は、それぞれ次の構造式：
【００４７】
【化１０】
【００４８】
を有する、ビオチン又はイミノビオチンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオ塩基”とは、アデニン、シチジン、グアニン、チミン又はウラシルを言及する。
【００４９】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオ塩基類似体”とは、相補的ヌクレオ塩基又はヌクレオ塩基類似体とワトソン−クリック水素結合を形成できる、置換された又は置換されていない窒素−含有親複素芳香族環を、言及する。好ましくは、ヌクレオ塩基類似体は、プリン、デアザプリン又はピリミジンである。典型的なヌクレオ塩基類似体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【００５０】
７−デアザアデニン、イノシン、ネブラリン、ニトロピロール、ニトロインドール、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、ヒドロキサンチン、プソイドウリジン、５−プロピニルシチジン、イソシチジン、イソグアニン、７−デアザグアニン、２−チオピリミジン、６−チオグアニン、４−チオチミジン、４−チオウラシル、O6−メチルグアニン、N6−メチルアデニン、O4−メチルチミン、５，６−ジヒドロチミン、５，６−ジヒドロウラシル、４−メチルインドール、エテノアデニン、等。追加の典型的なヌクレオ塩基類似体は、引用により本明細書に組込まれる、Fasman, 1989, Practical Ha7idbook-ofBiocheinist7y and Molecular Biology, pp. 385-394, CRC Press, Boca Raton, FL及びそこに引用される文献に見出され得る。
【００５１】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオシド”とは、置換されているか又は置換されていないリボース糖のC1’炭素に共有結合されるヌクレオ塩基から成る化合物を言及する。典型的な置換されたリボース糖は、１又は複数の炭素原子、好ましくは１つの炭素原子、及び最も好ましくは、3’炭素原子が、１又は複数の同じか又は異なった-R, -OR、-NRR又はハロゲン基（ここで、個々のRは独立して、-H, (C1-C6)アルキル、又は（C5-C14）アリールである）により置換されているそれらの糖を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【００５２】
特に好ましいリボース糖は、リボース、2’−デオキシリボース、2’, 3’−ジデオキシリボース、3’−ハロリボース、3’−フルオロリボース、3’−クロロリボース、3’−アルキルリボース、等である。ヌクレオ塩基がA又はGである場合、リボース糖は、ヌクレオ塩基のN9位置に結合される。ヌクレオ塩基がD, T又はUである場合、ペントース糖は、ヌクレオ塩基のN’位置に結合される（例えば、Kornberg and Baker, 1992, DNA Replication, 2nd Ed. , Freeman, San Franciscoを参照のこと）。
【００５３】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオシド類似体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖、又は両者がそれらのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオシドを言及する。典型的なヌクレオ塩基類似体は、前に定義されたそれらである。典型的なリボース糖類似体は、５以上又は５よりも少ない環原子を有する、置換されているか又は置換されていないフラノース、例えばエリトロース及びヘキソース、及び置換されているか又は置換されていない３〜６の炭素の非環式糖を包含するが、但しそれらだけには限定されない。典型的な置換されたフラノース及び非環式糖は、１又は複数の炭素原子が１又は複数の同じか又は異なった-R, -OR, -NRR又はハロゲン原子（ここで、個々のRは独立して、-H, (C1-C6)アルキル又は（C5-C14）アリールである）により置換されているそれらである。
【００５４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド”とは、１又は複数の、典型的には１つのリボース原子が、下記式：
【００５５】
【化１１】
【００５６】
[式中、ａは０〜４の整数である]を有するホスフェートエステルにより置換されているヌクレオシドを言及する。好ましくは、ａは２であり、そしてホスフェートエステルは、リボース、例えばリボース3’−三リン酸、2’−デオキシリボース３−三リン酸、リボース5’− 三リン酸、2’−デオキシリボース5’− 三リン酸、3’−ハロリボース5’− 三リン酸、3’−アルキルリボース5’− 三リン酸、2’, 3’−ジデオキシリボース5’− 三リン酸、等の3’又は5’炭素に結合される。本発明の対照は、酸のみならず、またそのような酸の塩、例えば金属塩でもある。
【００５７】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド誘導体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖及び/又は１又は複数のホスフェートエステルがそのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオチドを言及する。典型的なヌクレオ塩基及びリボース糖類似体は、ヌクレオシド類似体に関して前に記載されるそれらである。典型的なホスフェートエステル類似体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオネート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェート、ペプチド核酸（PNA）モノマー、等、存在するなら、いずれかの結合されたカウンターイオンを包含する。
【００５８】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“保護基”とは、続く反応の間、ヒドロキシル又はアミン成分を再生するために選択的に切断され得る基を意味する。保護基の例は、引用により本明細書に組込まれる、Greene, T. W., Protective Groups in Orga3zic Synthesis, 3rd edition (1999)に見出される。１つの態様においては、保護基は、塩基性反応媒体においては安定するが、しかしまた、酸により切断され得る。
【００５９】
本発明への使用のために適切な、塩基−安定性、酸−不安定保護基の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：エーテル、例えばメチル、メトキシメチル、メチルチオメチル、メトキシエトキシメチル、ビス（２−クロロエトキシ）メチル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチオフラニル、１−エトキシエチル、１−メチル１−メトキシエチル、ｔ−ブチル、アリル、ベンジル、O−ニトロベンジル、トリフェニルメチル、α−ナフチルジフェニルメチル、p−メトキシフェニルジフェニルメチル、９−（９−フェニル−10−オキソ）アントラニル、トリメチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ｔ−ブチルメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、トリベンジルシリル、及びトリイソプロピルシリル；及びエステル、例えばビバロエート、アダマントエート及び、２，４，６−トリメチルベンゾエート。
【００６０】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“塩”とは、本発明の化合物に存在することができる酸性又は塩基性基の塩を包含するが、但しそれらだけには限定されない。天然において塩基性である化合物は、種々の無機及び有機酸と広範囲の種類の塩を形成することができる。そのような塩基性化合物の許容できる酸付加塩を調製するために使用され得る酸は、非毒性酸付加塩、すなわち薬理学的に許容できるアニオンを含む塩、例えば次の塩を形成するそれらの酸であるが、但しそれらだけには限定されない：
【００６１】
硫酸、クエン酸、マレイン酸、酢酸、シュウ酸、塩酸塩、臭酸塩、ヨウ酸塩、ニトレート、スルフェート、硫酸水素塩、ホスフェート、酸ホスフェート、ニソニコチネート、アセテート、ラクレート、サリチレート、シトレート、酸シトレート、タルトレート、オレエート、タンネート、パントテネート、ビタルタレート、アスコルベート、スクシネート、マレエート、ゲンチシネート、フマレート、グルコネート、グルカネート、サッカレート、ホルメート、ベンゾエート、グルタメート、メタンスルホネート、エタンスルホネート、ベンゼンスルホネート、p−トルエンスルホネート及びパモエート（すなわち、１，1’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３−ナフトエート））塩。
【００６２】
アミノ成分を含む本発明の化合物はまた、上記に言及された酸の他に、種々のアミノ酸と許容できる塩を形成できる。天然において酸性である本発明の化合物は、種々の薬理学的に許容できるカチオンと塩基性塩を形成することができる。そのような塩の例は、アルカリ金属又はアルカリ土類金属、及び特にカルシウム、マグネシウム、ナトリウム、リチウム、亜鉛、カリウム及び鉄の塩を包含する。
【００６３】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“溶媒化合物”とは、非共有分子間力により結合される、理論又は非理論量の溶媒を含む、本発明の化合物又はその塩を意味する。好ましい溶媒は、揮発性で且つ非毒性である。用語“溶媒化合物”は、水和物を包含する。水和物は、非共有分子間力により結合される、理論又は非理論量の水を含む、本発明の化合物又はその塩を意味する。
【００６４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“包接化合物”とは、閉じ込められるゲスト分子（例えば、溶媒又は水）を有する空間（例えば、チャネル）を含む結晶格子の形での本発明の化合物又はその塩を意味する。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオシド又はヌクレオチド”とは、ヌクレオシド及び/又はヌクレオチド、及び/又はその混合物を言及する。
【００６５】
“ヌクレオシド類似体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖又は両者がそれらのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオシドを言及する。典型的なヌクレオ塩基類似体は、前に定義されたそれらである。典型的なリボース糖類似体は、５以上又は５よりも少ない環原子を有する、置換されているか又は置換されていないフラノース、例えばエリトロース及びヘキソース、並びに置換されているか又は置換されていない３〜６個の端子の非環式糖を包含するが、但しそれらだけには限定されない。典型的な置換されたフラノース及び非環式糖は、１又は複数の炭素原子が１又は複数の同じ又は異なった-R, -OR, -NRR又はハロゲン基（ここで、個々のRは独立して、H, C1-C6アルキル又はC5-C14アリールである）により置換されているそれらの糖である。
【００６６】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド”とは、１又は複数の、典型的には１つのリボース炭素が、下記式：
【化１２】
【００６７】
[式中、ａは０〜４の整数である]
を有するホスフェートエステルにより置換されているヌクレオシドを言及する。好ましくは、ａは２であり、そしてホスフェートエステルは、リボース、例えばリボース3’−三リン酸、2’−デオキシリボース３−三リン酸、リボース5’− 三リン酸、2’−デオキシリボース5’− 三リン酸、3’−ハロリボース5’− 三リン酸、3’−アルキルリボース5’− 三リン酸、2’, 3’−ジデオキシリボース5’− 三リン酸、等の3’又は5’炭素に結合される。
【００６８】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ヌクレオチド類似体”とは、ヌクレオ塩基、リボース糖及び/又は１又は複数のホスフェートエステルがそのそれぞれの類似体により置換されているヌクレオチドを言及する。典型的なヌクレオ塩基及びリボース糖類似体は、ヌクレオシド類似体に関して前に記載されるそれらである。典型的なホスフェートエステル類似体は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホラミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオネート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェート、ペプチド核酸（PNA）モノマー、等、存在するなら、いずれかの結合されたカウンターイオンを包含する。
【００６９】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“核酸”とは、ホスフェートエステルヌクレオチド間連鎖によりお互いに共有結合されるヌクレオシドモノマー単位の線状ポリマー鎖を言及する。特にことわらない限り、“核酸”とは、本明細書において使用される場合、いずれかの長さのポリマー、例えばオリゴヌクレオチド、核酸、及び当業界において通常使用されるような核酸を包含する。従って、本発明の核酸は、少数のモノマー単位（例えば、４〜40個）〜数百のモノマー単位、数千のモノマー単離又はそれよりも多くのモノマー単位の範囲であり得る。そのような核酸はまた、それらの機能に関して、例えばプライマー又はプローブとしても本明細書において記載され得る。核酸が文字の配列、例えば“ATGCCTG”により表される場合いつでも、その配列は5’→3’方向で表されることが理解されるであろう。特にことわらない限り、本明細書に記載される配列の核酸は、2’−デオキシリボ核酸である。
【００７０】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“核酸類似体”とは、少なくとも１つのヌクレオシドモノマー単位が“ヌクレオシド類似体”であり、そして/又は少なくとも１つのホスフェートエステルヌクレオチド間連鎖が、“ヌクレオチド類似体”下で定義されたようなホスフェートエステル類似体である核酸を言及する。好ましい種類の核酸類似体は、糖及びヌクレオチド間連鎖が荷電されていない中性アミド、例えばモノホリノカルバメート及びペプチド核酸（“PNA”）により置換されているそれらである。好ましいPNAは、N−（２−アミノエチル）グリシンアミド主鎖を有するそれらである（例えば、Nielsen など., 1991, Science 254: 1497-1500を参照のこと）。
【００７１】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“ラベル”とは、ヌクレオシド又はヌクレオチド、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、核酸、核酸類似体又はターミネーターに共有又は非共有結合される検出できる分子又は原子を言及する。１つの態様においては、ヌクレオシド又はヌクレオチド、ヌクレオシド又はヌクレオチド類似体、核酸、核酸類似体又はターミネーターは、ヌクレオ塩基に共有結合される検出できるラベルを有する。用語“ラベル”とはまた、もう１つの検出できるラベル、例えば消光剤の検出を調節する分子を言及する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語“検出できるラベル”とは、“直接的に”検出される分子又はラベル（例えば、色原体又は蛍光団）のみならず、また第２、第３、又はそれ以上の結合パートナー（例えば、アビジン又はストレプトアビジン）（その１つは、“直接的な”ラベルを担持する）へのその結合により“間接的に”検出される成分（例えば、ビオチン）も包含すること意味する。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドは、ビオチン−修飾され、そしてビオチンに高い親和性で結合するアビジン又はストレプトアビジンに基づいて検出システムを用いて検出できる。前記アビジン又はストレプトアビジンは、酵素に接合され得、この存在は、酵素の色原体基質との反応を可能にし、そして進行する色（すなわち、“比色化合物”）を測定することにより検出される。
【００７３】
本発明の方法における有用な酵素の非制限例は、次のものである：ホースラディシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、マレートデヒドロゲナーゼ、スタフィロコーカスヌクレアーゼ、デルタ−V−テスロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ。
【００７４】
ラベルの他の例は、適切な波長の光に暴露される場合、蛍光により検出可能になり、そして顕微鏡又は蛍光計により検出され、そして/又は測定される蛍光化合物を包含する。通常使用される蛍光ラベリング化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、γ−フタルアルデヒド及びフルオレサミンを包含する。検出できるラベルは、蛍光−放出金属、例えば152Eu、又は金属キレート基、例えばジエチレントリアミン五酢酸又はエチレンジアミン四酢酸を用いて、オリゴヌクレオチドに結合され得るランタニドシリーズの他のものであり得る。
【００７５】
ラベルは、化学発光化合物であり得、この存在は化学反応の間に発生する発光を測定することにより検出される。有用な化学発光ラベリング化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、テロマチックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩及びオキサレートエステルである。同様に、生物発光化合物は、オリゴヌクレオチドをラベルするために使用され、そして発光を測定することにより検出される。この場合、触媒タンパク質は、光化学発光反応の効率を高める。有用な生物発光ラベリング化合物の例は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ及びエクオリンを包含する。
【００７６】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“受容体色素”とは、光に暴露される場合、蛍光の形でエネルギーを話す化合物を言及する。“状態色素の蛍光団”とは、光に暴露される場合、従来の分光分析手段により検出できるレベルで放射線を放す受容体色素の原子の網状構造体である。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“非−蛍光”とは、放射線に暴露される場合、従来の分光分析手段により検出できるレベルで放射線を放さない化合物を言及する。
【００７７】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“弱蛍光”とは、放射線に暴露される場合、従来の分光分析手段により検出できる低レベルで放射線を放す化合物を言及する。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“光”とは、受容体色素の蛍光を引き起こす、190〜800nmの範囲の波長を有する電磁エネルギーを言及する。
【００７８】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“特異的”とは、通常の試験環境下での試験サンプルにおける意図された標的とのみハイブリダイズするが、しかし他の核酸分子とはハイブリダイズしない、反応に使用される核酸、例えばハイブリダイゼーション反応に使用されるプローブ、PCRに使用されるプライマー、又は組成物に存在する核酸を言及する。
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“選択的”とは、通常の試験環境下での試験サンプルにおける他の核酸とハイブリダイズするよりも、意図される標的物と、より頻繁に、より急速に、又は長い期間、ハイブリダイズする、反応に使用される核酸、例えばハイブリダイゼーションに使用されるプローブ、PCRに使用されるプライマー又は医薬製剤に存在する核酸を言及する。
【００７９】
本明細書において使用される場合、用語“緊縮条件下でハイブリダイズする”とは、お互い少なくとも60％（65％、70％又は75％、又はそれ以上）同一であるヌクレオチド配列が典型的には、お互いハイブリダイズされたまま存続する、ハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を記載する。緊縮条件は、核酸の性質（例えば、長さ、GC含有率、等）、及び方法自体（ハイブリダイゼーション、増幅、等）に依存する。そのような方法は、当業者に良く知られており、そしてCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6. 3.6に見出され得る。１つの態様においては、緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約45℃での６×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム（SSC）におけるハイブリダイゼーション、続く、約68℃での0.1×SSC、0.2％SDSによる１又は複数回の洗浄である。
【００８０】
もう１つの態様においては、緊縮ハイブリダイゼーション条件は、約45℃での６×SSCにおけるハイブリダイゼーション、続く、50〜65℃での0.2×SSC、0.1％SDSによる１又は複数回の洗浄（すなわち、50℃、55℃、60℃又は65℃での１又は複数回の洗浄）である。本発明の核酸は、それらの条件下で、単独で、A又はTヌクレオチドのみから成るヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸分子を包含しないことが理解される。例えば、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）における相補的配列に対する約15〜40個の塩基のオリゴヌクレオチドの緊縮ハイブリダイゼーションは、次の条件下で行われ得る：50mMのKClの塩濃度、10mMのトリスHClの緩衝液濃度、1.5mMのMg2+濃度、７〜7.5のpH及び55〜60℃のアニーリング濃度。
【００８１】
ポリメラーゼ鎖反応（PCR）における相補的配列に対する約15〜40個の塩基のオリゴヌクレオチドの中位の緊縮条件は、次の条件下で行われ得る：50mMのKClの塩濃度、10mMのトリスHClの緩衝液濃度、1.5mMのMg2+濃度、７〜7.5のpH及び48〜54℃のアニーリング濃度。ポリメラーゼ鎖反応（PCR）における相補的配列に対する約15〜40個の塩基のオリゴヌクレオチドの低い緊縮条件は、次の条件下で行われ得る：50mMのKClの塩濃度、10mMのトリスHClの緩衝液濃度、1.5mMのMg2+濃度、７〜7.5のpH及び37〜47℃のアニーリング濃度。
【００８２】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“立体的に純粋な”とは、化合物の１つの立体異性体を含んで成り、そしてその化合物の他の立体異性体を実質的に有さない組成物を言及する。例えば、１つのキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物は、その化合物の反対の鏡像異性体を実質的に有さないであろう。２つのキラル中心を有する化合物の立体的に純粋な組成物は、前記化合物の他のジアステレオマーを実質的に有さないであろう。
【００８３】
典型的な立体的に純粋な化合物は、約80重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約20重量％以下の前記化合物の他の立体異性体、より好ましくは約90重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約10重量％以下の前記化合物の他の立体異性体、さらにより好ましくは、約95重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約５重量％以下の前記化合物の他の立体異性体、及び最も好ましくは、約97重量％以上の前記化合物の１つの立体異性体及び約３重量％以下の前記化合物の他の立体異性体を含んで成る。
【００８４】
本明細書において使用される場合、及び特にことわらない限り、用語“実質的に有さない”とは、１つの化合物を含んで成り、そして検出できるか又は有意な量の他の化合物を有さない組成物を言及する。実質的に有さない典型的な組成物は、約80重量％以上の所望する化合物及び約20重量％以下の１又は複数の他の化合物、より好ましくは約90重量％以上の所望する化合物及び約10重量％以下の１又は複数の他の化合物、さらにより好ましくは約95重量％以上の所望する化合物及び約５重量％以下の１又は複数の他の化合物、及び最も好ましくは約97重量％以上の所望する化合物及び約３重量％以下の１又は複数の他の化合物を含んで成る。
【００８５】
3.2略語：
特定のヌクレオ塩基及びヌクレオシド又はヌクレオチドを言及するために本明細書に使用される略語は、当業界において通常使用されるそれらであり、そして次の通りである：
【００８６】
【表１】
【００８７】
次の追加の略語が明細書に使用される：
明細書を通して使用される略語は、当業界において通常使用されるそれらであり、そして次の通りである：
【００８８】
【表２】
【００８９】
４．本発明の特定の記載：
本発明は、実施され得る実験プロトコール及び分析のために使用され得る検出方法(顕微鏡及び非顕微鏡）の両者において、酵素基質が相当の多様性を提供するので、機能することができるヌクレオチド誘導体に直接的に結合される検出できるラベルを有する発見に由来する。検出できるラベル（例えば、ビオチンヌクレオチド）は、細胞又は粗細胞抽出物により合成され、従って、新生（成長する）ポリヌクレオチド鎖の検出及び/又は単離を可能にする方法に存在するポリヌクレオ中に導入され得る。さらに、酵素は、ポリヌクレオチドにおける高い選択的又は部位特異的位置中にプローブ、例えばビオチンヌクレオチドを導入するための試薬として使用され得る。
【００９０】
１つの態様においては、本発明の化合物は、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの5’又は3’末端に、及び/又は配列内に結合され得る。検出感度は例えば、オリゴヌクレオチド、プライマー又はプローブに結合される検出可能ラベルの数に依存する。シグナル強度及び検出感度は、オリゴヌクレオチドに結合される検出可能ラベルの数と共に上昇する。内部ラベリングは、オリゴ−又はポリヌクレオチドと標的配列との間に形成されるハイブリッドに対する低い感度及び不安定化効果をもたらす立体的妨害を導入することができる。
【００９１】
従って、ハイブリッド安定性、検出感度及び費用間を妥協するために、一定の態様においては、典型的なオリゴヌクレオチドは、約３個の本発明の化合物を含むことができ、両末端で１つ及び内部で１つ、そして成分間に最少約15個の塩基を有する。本発明の化合物を含むヌクレオチドの合成は、下記例に示されるようにして達成される。C-5炭素原子に結合される検出可能ラベルプローブを含むイミダゾールヌクレオシド三リン酸は、原核及び真核起源の広範囲の種類の精製された次の核酸ポリメラーゼのための実際的な基質であるが、但しそれらだけには限定されない：E. コリのDNAポリメラーゼI、バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼ、ネズミ（A9）及びヒト（HeLa）細胞からのDNAポリメラーゼα及びβ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、及びヘルペス単純ウィルスのDNAポリメラーゼ。
【００９２】
さらに、検出できるラベルリボヌクレオシド三リン酸は、E. コリ及びバクテリオファージT7のRNAポリメラーゼのための基質として機能することができる。実際、検出できるラベルされたRNAプローブは、E. コリ又はT7 DNAポリメラーゼを用いて、又は化合物、例えばビオチニル-pCpを共にRNAリガーゼを用いて3’末端−ラベリング方法により、DNA鋳型から酵素的に調製され得る。抗体のそれらの類似体に対する利用可能性により、免疫学的又は親和性方法による新生転写体の単離はまた、実施可能である。
【００９３】
本発明の修飾においては、アリルアミンポリエチレングリコールリンカーアームを通して環に共有結合されるビオチン分子を含むヌクレオチドの類似体、例えばdUTP及びUTP（但し、それらだけには限定されない）が、合成され得る。低レベルのビオチン置換（50分子又はそれ以下/kb）を含むDNAは、置換されていない対照DNAのそれとは区別できない、変性、再結合及びハイブリダイゼーションを有する。
【００９４】
非制限例として、ビオチニル化は、検出試薬又は親和性捕獲マトリックスにより認識され得るプローブに、不良に又は検出できない分子を形質転換するラベル又は“標識”を提供する。ビオチンによりラベルされると、ラベルされたヌクレオチドは、複合体タンパク質及び核酸ブロット及びアレイをプローブするために使用され得る。次に、この標識された分子は、蛍光団、蛍光微小球、酵素、発色団、磁気粒子、又はコロイド状金によりラベルされた適切なアビジン接合体により検出され得る。ビオチニル化された分子はまた、種々の形の固定されたストレプトアビジン、例えばストレプトアビジンアガロースにより捕獲されるか、又は電子顕微鏡のために、反応性金化合物、例えばNANOGOLD(商標)(Nanoprobes, Inc., Yaphank, NY)又は Alexa Fluor(商標); FluoroNanogold ストレプトアビジン 1.4 nm 金クラスター (Molecular Probes, Eugene, OR)により染色され得る。
【００９５】
4.1検出可能ラベル：
4.1.1化合物及びラベルの構造：
１つの観点においては、本発明は、ヌクレオチド配列の検出のためのラベルとして有用である種類の化合物に向けられる。
【００９６】
本発明の第１の態様は、下記式I：
【化１３】
【００９７】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【００９８】
【化１４】
【００９９】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H, -NHC(O)NH2, -NH2, -OH, O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのラベルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を包含する。１つの態様においては、リンカーは、(アルキルO)n，(NH)n，(C(O)NH)n，(NHC(O)NH)n，(NH-アルキル-O-アルキル-NH)n，又は(アルキル)nであり、ここでｎは１〜30の整数である。１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、消光剤、蛍光化合物、又は非−又は弱−蛍光化合物である。
【０１００】
本発明の第２の態様は、下記式II：
【化１５】
【０１０１】
[式中、塩基は、下記式：
【化１６】
【０１０２】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-H、-NHC(O)NH2, -NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、-H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, CO2H,-C02アルキルであり；
X, Y及びXの個々は独立して、H,-OH,-0（アルキル）,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【０１０３】
【化１７】
【０１０４】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、当業者に知られているいずれかのリンカーである]で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物を包含する。
【０１０５】
式IIの化合物の１つの態様においては、X, Y及びZの少なくとも１つは-OHである。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、X, Y及びZの個々は-OHである。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Y及びZの少なくとも１つは-OHであり、そしてXは、下記式：
【０１０６】
【化１８】
である。
【０１０７】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化１９】
である。
【０１０８】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化２０】
である。
【０１０９】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化２１】
である。
【０１１０】
式IIの化合物のもう１つの態様においは、R1は、-H、-NHC(O)NH2, -NH2,-OH,-O-アルキル, アルキル, 又は‐COOHである。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、リンカーは、(アルキルO)n, (NH)n, (C(O)NH)n , (NHC(O)NH)n, (NH-アルキル-O-アルキル-NH)n, 又は(アルキル) nであり、ここでｎは１〜30の整数である。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、消光剤、蛍光化合物、又は非−又は弱−蛍光化合物である。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、リンカーは、(CH2CH2O)n (ここでｎは１〜10の整数である)である。
【０１１１】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、ラベルは、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である。
式IIの化合物のもう１つの態様においては、蛍光団ha、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである。
【０１１２】
式IIの化合物のもう１つの態様においては、ラベルは、下記式：
【化２２】
である。
【０１１３】
もう１つの態様は、下記式III ：
【化２３】
で表される化合物を包含する。
【０１１４】
式III の化合物の１つの態様においては、X, Y及びZは独立して、H, OH, 下記式：
【化２４】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１１５】
式III の化合物のもう１つの態様においては、前記化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式IV：
【０１１６】
【化２５】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１１７】
【化２６】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１１８】
もう１つの態様は、下記式V：
【化２７】
【０１１９】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化２８】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２０】
もう１つの態様は、下記式VI：
【化２９】
【０１２１】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３０】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２２】
もう１つの態様においては、前記化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式VII：
【０１２３】
【化３１】
【０１２４】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３２】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２５】
もう１つの態様は、下記式VIII：
【化３３】
【０１２６】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３４】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２７】
もう１つの態様は、下記式IX：
【化３５】
【０１２８】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３６】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１２９】
もう１つの態様は、下記式X：
【化３７】
【０１３０】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化３８】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１３１】
もう１つの態様は、下記式XI：
【化３９】
【０１３２】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化４０】
（式中、R3は−H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１３３】
もう１つの態様は、下記式XII：
【化４１】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３４】
もう１つの態様は、下記式XIII：
【化４２】
【０１３５】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
もう１つの態様は、下記式XIV：
【化４３】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３６】
もう１つの態様は、下記式XV：
【化４４】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３７】
もう１つの態様は、下記式XVI：
【化４５】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３８】
もう１つの態様は、下記式XVII：
【化４６】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１３９】
もう１つの態様は、下記式XVIII：
【化４７】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１４０】
もう１つの態様は、下記式XIX：
【化４８】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１４１】
もう１つの態様は、下記式XX：
【化４９】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１４２】
もう１つの態様は、下記式XXI：
【化５０】
【０１４３】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化５１】
【０１４４】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−又は弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１４５】
もう１つの態様は、下記式XXII：
【化５２】
【０１４６】
[式中、塩基は、下記式：
【化５３】
【０１４７】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0（アルキル）,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【０１４８】
【化５４】
【０１４９】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−又は弱−蛍光化合物、又は消光剤である]で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチドを包含する。
【０１５０】
１つの態様においては、X, Y及びZの少なくとも１つは、-OHである。
もう１つの態様においては、X, Y及びZの個々は、-OHである。
もう１つの態様においては、Y及びZの少なくとも１つは、-OHであり、そしてXは、下記式：
【０１５１】
【化５５】
[式中、R3は‐H又は金属である]である。
【０１５２】
もう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化５６】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１５３】
もう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化５７】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１５４】
もう１つの態様においては、Xは、下記式：
【化５８】
[式中、R3は-H又は金属である]である。
【０１５５】
もう1つの態様においては、R1は-NHC(O)NH2である。
もう１つの態様においては、リンカーは、(CH2CH2O)n (ここでｎは１〜10の整数である)である。
もう１つの態様においては、ラベルは、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である。
もう１つの態様においては、前記蛍光団は、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである。
【０１５６】
もう１つの態様においては、ラベルは、下記式：
【化５９】
である。
【０１５７】
もう１つの態様は、下記式XXIII ：
【化６０】
【０１５８】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化６１】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１５９】
もう１つの態様においては、化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式XXIV：
【０１６０】
【化６２】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１６１】
【化６３】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６２】
もう１つの態様は、下記式XXV：
【化６４】
【０１６３】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化６５】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６４】
もう１つの態様は、下記式XXVI：
【化６６】
【０１６５】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化６７】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６６】
もう１つの態様においては、化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式XXVII：
【０１６７】
【化６８】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１６８】
【化６９】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１６９】
もう１つの態様は、下記式XXVIII：
【化７０】
【０１７０】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化７１】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７１】
もう１つの態様は、下記式XXIX：
【化７２】
【０１７２】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化７３】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７３】
もう１つの態様においては、化合物は立体的に純粋である。
もう１つの態様は、下記式XXX：
【０１７４】
【化７４】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【０１７５】
【化７５】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７６】
もう１つの態様は、下記式XXXI：
【化７６】
【０１７７】
[式中、X, Y及びZは独立して、H, OH、下記式：
【化７７】
（式中、R3は-H又は金属である）である]で表される化合物を包含する。
【０１７８】
もう１つの態様は、下記式XXXII：
【化７８】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１７９】
もう１つの態様は、下記式XXXIII：
【化７９】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８０】
もう１つの態様は、下記式XXXIV：
【化８０】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８１】
もう１つの態様は、下記式XXXV：
【化８１】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８２】
もう１つの態様は、下記式XXXVI：
【化８２】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８３】
もう１つの態様は、下記式XXXVII：
【化８３】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８４】
もう１つの態様は、下記式XXXVIII：
【化８４】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８５】
もう１つの態様は、下記式XXXIX：
【化８５】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８６】
もう１つの態様は、下記式XXXX：
【化８６】
[式中、R3はH又は金属である]で表される化合物を包含する。
【０１８７】
4.1.2検出できるラベル塩基：
本明細書に記載される式Iの化合物は、ヌクレオシド及びヌクレオチドをラベルするために使用され得る。イミダゾール化合物は原則として、式Iの化合物において塩基として適合できる。従って、本発明は、塩基、例えばイミダゾール及び置換されたイミダゾールを包含するが、但しそれらだけには限定されない。好ましい塩基は、下記式：
【０１８８】
【化８７】
【０１８９】
[式中、ヌクレオシド又はヌクレオチドの糖は、塩基のN1に共有結合され；そして
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hである]
で表される化合物を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１９０】
4.1.3結合基又はリンカー：
本発明は、式Iの化合物を供給するために、ラベルにヌクレオシド、ヌクレオチド、又はヌクレオシド又はヌクレオチオ類似体を接合するか又は結合することを含んで成る。ラベルは、種々の手段、例えばイオン誘引又は共有結合により、結合基を通して接合される。好ましくは、化合物は、共有結合を通して結合される。結合基又はリンカーは、試薬、例えばヌクレオシド又はヌクレオチド、又は核酸の“相補的官能価”と反応し、そしてラベルに化合物を結合する“連鎖”を形成することができる。リンカーは、当業者に知られているいずれかのリンカーであり得る。好ましい結合基は、(CH2CH2O)n, (CH2O)n又は(CH2)nを包含するが、但しそれらだけには限定されず、ここで、ｎは約１〜約30、好ましくは約２〜約20、より好ましくは約３〜約10の整数である。任意には、リンカーは共有結合である（すなわち、ラベルは共有結合により塩基に結合され得る）。
【０１９１】
4.1.4ラベル：
ラベルは、当業者に知られているいずれかの検出できるラベルであり得る。式Iの化合物と共に使用され得るラベルは、ビオチン、ビオチン誘導体及びいずれかの蛍光団を包含する。ある態様においては、ビオチン又は蛍光受容体を含むラベルが使用され得る。蛍光受容体は、キサンテン色素、例えばフルオレセイン、及びローダミン色素から選択され得る。結合のための部位として、又は試薬、好ましくはポリヌクレオチドへの結合のための結合官能価として使用さえ得るそれらのキサンテン環上に種々の置換基を有する。多くの適切な形のそれらの化合物は市販されている。蛍光ラベルのもう１つの基は、α又はβ位置にアミノ基を有する、ナフチルアミン及びそれらの誘導体である。
【０１９２】
そのようなナフチルアミノ化合物間に、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−p−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートを包含する。他のラベルは次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：クマリン、例えば３−フェニル−７−イソシアネートクマリン；アクリジン、例えば９−イソチオシアネートアクリジン及びアクリジンオレンジ；N−（ｐ−（２−ベンゾキサゾリル）フェニル）−マレイミド；シアニン；BODIPY'色素(Molecular Probes, Eugene, OR)：ベンゾキサジアゾール；スチルベン；ピレン；及び同様のもの。
【０１９３】
好ましくは、ラベルは、ビオチン、フルオレセイン及びローダミン色素から選択される。より好ましくは、ラベルはビオチンである。オリゴヌクレオチドへの結合のためのそれらのラベル及び適切な結合方法は、Khanna など. アメリカ特許第 4,439, 356号; Marshall (1975) gistochemical J., 7 : 299-303; Menchen など., アメリカ特許第 5,188, 934号; Menchen など., ヨーロッパ特許出願第87310256.0 号; Bergot など., 国際出願PCT/U590/05565号 ; 及び Barone など., Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 20 (4-7), 1141-1145, 2001に記載される。
【０１９４】
一定の特定態様においては、ラベルは、ビオチン、フルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン（FAM）、2’, 7’−ジメトキシ−4’, 5’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（JOE）、ローダミン、６−カルボキシローダミン（R6G）、N, N, N’, N’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（TAMRA）、６−カルボキシ−X−ローダミン（ROX）、４−（4’−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（DABCYL）、５−（2’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（EDANS）、テトラクロロフルオレセイン（TET）、インドジカルボシアニン３（Cy3）、インドジカルボシアニン５（Cy5）、インドジカルボシアニン5.5（CY5.5）、３−（カルボキシペンチル）−3’−エチル−5, 5’−ジメチルオキサカルボ−シアニン（CyA）、又はlH,5H,llH,15H-キサンテノ[2,3, 4 ij : 5, 6, 7 i'j']ジキノリジン-18- イウム, 9- [2 (又は4) [ [ [6 [2, 5-ジオキシ-1-ピロリジニル) オキシ]-6- オキソヘキシル] アミノ] スルホニル]-4 (又は 2)-スルホフェニル]- 2,3, 6,7, 12,13, 16,17-オクタヒドロ-,内部塩（TR又はTexas Red）である。代表的蛍光団は、下記のものを包含する：
【０１９５】
【表３】
【０１９６】
4.1.5糖：
式Iの化合物と一般的に適合する糖は、下記式：
【化８８】
【０１９７】
[式中、R, R’及びR’’は独立して、H, 金属又はモノ−、ジ−、又はトリホスフェートである]
で表されるリボース及びリボース類似体を包含する。それらはまた、ヌクレオシド及びヌクレオチドにおける糖を置換するために使用され得る成分を包含する。
【０１９８】
4.2検出的にラベルされたオリゴヌクレオチドの精製：
式Iの化合物を含むオリゴヌクレオチドは、当業者に知られているいずれかの方法により精製され得る。１つの非制限態様においては、オリゴヌクレオチドは、逆相HPLCにより精製される。手短には、オリゴヌクレオチドを含むサンプルが、Hamilton PRP-1カラム（1.0cm×25cm）に負荷され、そして5％〜50％のアセトニトリル線状グラジエントにより40分にわたって溶出される。
【０１９９】
蛍光ラベルされたオリゴヌクレオチド種に対応するHPLC画分が集められ、プールされ、そして凍結乾燥される。凍結乾燥に続いて、オリゴヌクレオチドサンプルが水に溶解され、そして例えば、過塩素酸リチウムにより沈殿され、続いて、10,000gで10分間、遠心分離される。次に、得られるペレットは、10％水性アセトンにより洗浄される。この方法は、“標準純度”の単一逆相HPLC（RP-HPLC）オリゴヌクレオチドを生成する。
【０２００】
オリゴヌクレオチドは任意には、“高純度”二重逆相＋イオン交換HPLC（IE＋RP HPLC）精製されたオリゴヌクレオチドを生成するために、イオン交換HPLCにより再精製され得る。１つの態様においては、オリゴヌクレオチドは、５×10 Sourceカラム（Amersham Phannacia Biotech, Piscataway, NJ）上にそれらを負荷することにより再精製され、そして１MのLiCl、0.1MのTRIS緩衝液（pH8.0）の0％〜50％線状グラジエントを用いて溶出される。オリゴヌクレオチド種に対応するHPLCピークが、集められ、プールされ、過塩素酸リチウムにより沈殿され、そして凍結乾燥される。
【０２０１】
化合物及び/又はオリゴヌクレオチド自体は、例えばVoyager DE BioSpectrometry workstation (PE BioSystems, Framingham, MA)を用いて、質量分光計により、合成及び精製の後、確められ得る。
【０２０２】
4.3検出できるラベルの検出：
検出できるラベルは、制限なしに、ラベルの検出のために適切である、当業者に知られているいずれかの手段により検出され得る。例えば、本発明の一定の修飾されたヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、適切な条件下で複合体を形成できるポリペプチド（例えば、アビジン又は抗体）と、化合物とを接触することにより検出され得るが、但し、ポリペプチドは、複合体又は複数の複合体が一般的に従来の検出技法により形成される場合、検出され得る１又は複数の成分を含むべきである。他の検出できるラベルは、例えば分光光学的技法により検出され得る。
【０２０３】
4.3.1アビジン：
本発明のビオチン−ラベルされた化合物のための１つのポリペプチド検出器は、アビジンである。アビジンが実質的に表示できるインジケーター分子（例えば、蛍光色素、例えばフルオレセイン又はローダミン）、電子密の試薬（例えば、フェリチン、ヘモシアニン、又はコロイド状金）、又は不溶性反応物を沈殿することができる酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）に結合される場合、プローブの存在、位置及び/又は量が確立され得る。
【０２０４】
アビジン−ビオチン技法は、流動細胞計測法及び光、電子及び蛍光顕微鏡、及び溶液に基づく方法、例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA）において使用され得る。さらに、アビジン−ビオチン及び抗体−ヘプテン技法は時折、複合体溶液、細胞又は組織サンプルにおける複数標的物の同時、多色彩検出のために組み合わされる。さらに、検出試薬及びサンドイッチプロトコールの適切な選択により、それらの技法は、低い分析物を増殖するために使用され得る。例えば、架橋方法は、アビジン又はストレプトアビジンが２つのビオチニル化された分子間で橋として作用する、シグナル増幅及び改良された組織侵入のための通常の免疫組織技法である。
【０２０５】
アビジンは、不運なことには、核酸又はクロマチン材料と共に使用される場合、ビオチンインジケータータンパク質として低い所望性にする１つの性質を有する。アビジンは、濃縮されたクロマチン、又はそのビオチン−結合性質に無関係である態様で、多量の核酸を含む亜細胞画分に強く結合することが報告されている（Heggeness, Stain Technol., 52, 165, 1977; Heggenessなど., J Cell. Biol., 73,783, 1977; & Bayer など., N. letlzods of Biochernical Analysis, 26, 1, 1980）。
【０２０６】
4.3.2ストレプトアビジン：
ビオチン−含有ヌクレオチド及び誘導体のためのもう1つのプローブは、ストレプトアビジン、すなわち土壌生物ストレプトミセス・アビジン（Streptomyces avidinii）により合成されるアビジン−様タンパク質である。その調製及び精製は、引用により本明細書に組み込まれる、Hoffrnan, など., Proc, Natl. Acad. Sci., 77,4666 (1980)に記載されている。ストレプトアビジンは、アビジンよりも低いpI（5.0）を有し、グリコシル化されず、そしてアビジンよりもDNAに対して低い非特異的結合を示し、そして従って核酸検出を包含する用途において実質的な利点を提供する。
【０２０７】
タンパク質ストレプトアビジンは、カップリングされた可視化システム（例えば、蛍光プローブ（下記4.6.1.1を参照のこと）又は組織化学試薬（下記4.3.3を参照のこと）を、ハイブリダイズされたビオチン−含有ポリヌクレオチドの部位に特異的に方向づけするためのビークルとしての抗−ビオチンIgGに代わるものである。抗−ビオチンIgG以上のストレプトアビジンの利点の１つは、ビオチン対するその親和性がKassn＝1015であり、そしてヘプテンIgG相互作用についての会合定数が107〜1010であることである。早い反応速度及び極度な親和性とは、ビオチニル化されたプローブを局在化するために必要とされる時間がストレプトアビジンに関して、数分であるのに対して、免疫学的試薬に関しては、数字間であろうことを意味する。
【０２０８】
ビオチンストレプトアビジン検出システムを用いての組織サンプルからのタンパク質の分析は、Bio Rad Amplified Alkaline Phosphatase Immun-Blot Detection (BioRad Laboratories, Hercules, CA)を用いてのウェスターンブロット検出により例示されるが、当業界において良く知られている。この検出型は、ストレプトアビジンの増殖を伴った、ビオチニル化された第2抗体を使用する。次に、ビオチニル化されたアルカリホスファターゼは、サンドイッチを完結し、そして色を進行する試薬（例えば、５−プロモ−４−クロロ−インドイルホスフェート及びニトロプル−テトラゾリウム）が添加される。これは、ビオチニル化されたアルカリホスファターゼ結合のいずれかの点で紫色の沈殿物を形成する。
【０２０９】
4.3.3単一特異的ウサギIgG抗ビオチン免疫グロプリン：
ビオチン様プローブ検出のためのタンパク質は、単一異的ウサギIgG抗ビオチン免疫グロブリンである。この化合物は、ウシ血清アルブミン−接合されたビオチンによりウサギを免疫化し、続いて親和性クロマトグラフィーにより精製することにより調製され得る（Berger, Melody in Enzynzology, 62,319, (1979)）。抗−ビオチン抗体は、クロマチン材料への抗体のほとんど無いか、存在するなら、非特異的結合が生じるので、現場ハイブリダイゼーションによる染色体上の特異的ポリヌクレオチド配列の検出において非常に有用であることがわかっている。
【０２１０】
4.3.4免疫学的及び組織化学的方法：
ビオチンの検出のための免疫学的及び組織化学的方法は、その基本的アプローチが遺伝子マッピングの急速な方法、現場ハイブリダイゼーション、及びブロットハイブリダイゼーション方法による特定核酸配列の検出のための非放射線方法のために有用であることを示している。この技法は、新規の臨床学的診断方法の開発に使用され得る。
このアプローチを用いて、特定のデオキシリボ核酸又はリボ核酸分子、特に生存生物（例えば、細菌、菌類、ウィルス、酵母又は哺乳類）由来の分子の存在を決定することが可能である。これは、患者又は他の対象における病因体含有核酸の診断を可能にする。
【０２１１】
さらに、それは、抗生物質耐性を決定するために細菌をスクリーニングするための方法を提供する。従って、例えばストレプトコーカス・ピオゲネス（Streptococcus pyrogenes）又はネイセリア・メニンギチジス（Neisseris meningitides）におけるペニシリン耐性；スタフィロコーカス・アウレウス（Staplalococcus auteus）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、シュードモナス・アエルキノア（Pseudomonas aeruqinosa）、ストレプトコーカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）又はネイセリア・コノルホエアエ（Neisseria gouorrhoeae）におけるテトラサイクリン耐性；及びマイコバクテリウム・ツベルキュロシス(Mycobacterium tuberculosis)におけるアミノグリコシド耐性が決定され得る。
【０２１２】
それらの方法においては、核酸配列に対して相補的であり、生物又はその抗生物質耐性を特徴づけ、そしてさらに、本発明の１又は複数の修飾されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが調製される。このポリヌクレオチドは、研究される生物から得られる核酸によりハイブリダイズされる。ハイブリダイズの失敗は、生物又は特徴的耐性の不在を示す。次に、ハイブリダイズされた核酸重複体は、その重複体と、検出可能成分を担持する適切なポリペプチドとの間で複合体を形成し、そして適切な検出技法を用いて、その複合体の存在を検出することにより同定される。正の検出は、複合体、重複体及び従って、興味ある核酸配列が存在することを示す。
【０２１３】
このアプローチは、遺伝子障害、例えばサラセミア及び鎌状赤血球貧血症の診断に拡張され得るが、但しそれらだけには限定されない。その存在又は不在（サラセミアの場合）が障害に関連するデオキシリボヌクレオチド酸遺伝子配列が、適切な検出可能ポリペプチドとの複合体形成に基づいて、本発明のポリヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに従って検出され得る。
【０２１４】
染色体上の特定の遺伝子座に対する遺伝子又はそれらの転写体のマッピングは、単調で退屈な及び時間の浪費、例えば主に、細胞融合及び体細胞遺伝学の技法を伴う。現場ハイブリダイゼーションは染色体ポリテニゼーションを受ける種、例えばショウジョウバエにおける単一の遺伝子配列をマッピングするために都合良く使用されて来たが、ほとんどの高等真核生物の染色体におけるユニークな配列遺伝子の検出は、標準オハイブリダイゼーション方法を用いて困難であった。組換えDNA技法は真核細胞に見出される実質的にすべての単一コピー配列の分子クローニングを実施可能にして来たので、そのようなクローン化されたゲノムフラグメントの染色体起源をマッピングするための急速且つ敏感な方法を有することは非常に有益であろう。
【０２１５】
修飾されたヌクレオチドは、放射性同位体の使用を回避する現場ハイブリダイゼーションによる遺伝子マッピングの方法に使用され得る。この方法は、ニック翻訳によりDNAプローブ中に酵素的に組込まれ得るチミジン類似体含有ビオチンを利用する。現場ハイブリダイゼーションの後、ビオチン分子は、親和性精製された抗−ビオチン抗体のための標識として作用する。
【０２１６】
ポリテン染色体は、現場遺伝子マッピングのための間接的免疫蛍光により検出されたので、本発明の修飾されたヌクレオチドを用いてのプローブの効力を確立するための試験システムとして使用される。それらのクローンの多くは、放射性同位体を用いる従来の現場ハイブリダイゼーション方法によりショウジョウバエ染色体地図上の特定のバンドをすでに割り当てられて来た。
【０２１７】
この免疫学的方法はまた、サテライトDNAがマウス中期染色体のセントロメア領域までマッピングされている哺乳類染色体と実施できることがまた示されている。この結果は、ヒト及び他の哺乳類からの染色体における単一コピー（ユニーク）配列についての単純遺伝子マッピング方法の開発のための基本的な基礎を提供する。そのような方法は、染色体の遺伝子機構の理解を高く促進すべきであり、そして臨床学的細胞遺伝子診断を、より急速且つ実際的にする。
【０２１８】
染色体拡張が攻撃される単一段階の“抗体サンドイッチ”方法、すなわちウサギ抗ビオチンIgGとの後ハイブリダイゼーションは、成功するが、このプロトコールは明白な遺伝子割り当てのための十分な蛍光を生成することはできない。しかしながら、より強い蛍光比色シグナルが、Lamm など., (1972);及び Wofsy, など., (1974)により記載される“ハプテン−抗体サンドイッチ技法”を用いることにより達成され得る。この方法においては、一次抗体（例えば、非特異的ウサギ抗ビオチンIgG）が、ヘプタン化された試薬、例えば２，４−ジニトロフルオロベンゼンにより化学的に修飾され、好ましくは免疫グロブリンの抗原親和性カラム（ビオチンSepharoseTM）への結合を伴う。
【０２１９】
15〜20ほどの多くのヘプテン（DNP）基が、その抗原結合親和性又は特異性を低めることなく、一次抗体にカップリングされ得る（Wallace and Wofsy, 1979を参照のこと）。試験サンプルの一次抗体処理、続いて、蛍光ラベルされた抗IgGよりもむしろ蛍光ラベルされた抗ヘプテンIgG抗体とのインキュベーションを行う場合、蛍光シグナルの５〜７倍の上昇が達成され得る。
【０２２０】
単一特異的テンジュクネズミ抗DNP IgGがまた入手できるので、二次抗体はビオチンによりハプテン化され得、そして従って２種の抗−ヘプテンIgG集団、すなわちDNPラベルされた抗−ビオチンIgG及びビオチン−ラベルされた抗−DNP IgGを生成することができる。それらは他方では、数回のハプテン−抗体サンドイッチを達成するため使用され得、そして次に、多くの哺乳類種からのIgG分子に対して特異的に結合し、そしてその付随する有用性を伴って、一次抗体シグナルの莫大な増幅をもたらす、スタフィロコーカス・アウレウスからの蛍光ラベルされたプロテインAにより追跡され得る。
【０２２１】
ビオチニル化されたDNAプローブによりハイブリダイズされたポリテン染色体が、ストレプトアビジンと共にインキュベートされ、続いて、ビオチン及びFITCにより二重ラベルされたウシ血清アルブミン（FITC、ビオチニル−BSA）と共にインキュベートされる。４個のストレプトアビジンサブユニットの１つのみがたぶん、個々のビオチン化されたDNA部位での結合に包含されるので、実質的に１つのラベルされたBSA分子が、ストレプトアビジンビオチニルヌクレオチド複合体の残る３個の非接合されたサブユニットの個々に結合することができる。この単一ストレプトアビジン＋FITC、ビオチニル−BSA層からの蛍光シグナルが、基本的な“抗体サンドイッチ方法”を用いて、対照に比較されるであろう。
【０２２２】
“抗体サンドイッチ”及びストレプトアビジン＋FITC、ビオチニル−BSA検出強度が比較できる場合、ストレプトアビジン＋FITC、ビオチニルBSAシステムを、複数“ハプテン抗体サンドイッチ”アプローチに類似する態様で、単一コピー感受性に増強することができる。BSA上のビオチン基のいくつかは、第１層のストレプトアビジンに結合されないので、第２層のストレプトアビジンは、十分なシグナルが得られるまで、添加され得る。例えば、第２層において、２つのストレプトアビジンプロモーターのみが個々の第１層BSAに結合し、そしてそれらのストレプトアビジンプロモーターの個々の３個のFITCビオチニルBSA分子を結合する場合、第２層強度は第１層からの強度の２倍であり；第３層に関しては、類似する結合理論によれば、蛍光強度は第１層の強度の12倍であり、その結果、全体強度は急速に上昇するであろう。
【０２２３】
連続的に添加される層に関しては、より大きなキャリヤータンパク質、例えばBSAよりもむしろチオグロブリンが、結合される蛍光及びビオチンプローブの量を最大にするために使用され得る。ビオチンプローブとキャリヤータンパク質との間に長いリンカーアームを使用することがまた必要である。長いリンカーアームは、ビオチン化された蛍光キャリヤー分子の個々の接合されていないストレプトアビジンサブユニットへの理論的供給を立体的に最適化し、そしてビオチン化された蛍光キャリヤーに結合する続く層におけるストレプトアビジンプロモーターの数を最大にすべきである。適切な調節は、蛍光プローブ及びビオチンによるキャリヤータンパク質の置換が溶解性及び/又は非特異的結合問題を引き起こさないことを保証するために行われる。
【０２２４】
ストレプトアビジン−キャリヤータンパク質供給システムは、その供給速度の他に、免疫蛍光アプローチよりも２つの有意な利点を有する。第２に、キャリヤータンパク質のみが修飾される必要があり、そしてビオチン基がストレプトアビジンに接近できる限り、機能的又はさらに全体的構造統合性を維持する必要はない。
【０２２５】
ハイブリダイズされたプローブを可視化するための蛍光方法に代わる方法は、酵素、例えばペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを、不溶性の着色された沈殿物への可溶性基質の酵素転換が光顕微鏡可視化を可能にするハイブリダイゼーション部位に向けることである。この技法の重要な利点は、組織化学的方法が蛍光検出よりも10〜100倍、敏感であることである。さらに、着色された沈殿物は、集中的な光照射により漂白されず、従って蛍光光顕微鏡の一般的な欠点の１つを回避する。
【０２２６】
それらの酵素は、二官能価試薬、例えばグルタルアルデヒドを用いて、又はペルオキシダーゼの場合、ペルオキシダーゼ炭化水素成分のアルデヒドへの酸化及び所望するタンパク質のε−アミノ基とのそれらの残基へのカップリングを通して、“ハプテン抗体サンドイッチ”技法において、蛍光プローブの代わりに、最終抗体にカップリングされ得る。ストレプトアビジンビオチン化されたキャリヤータンパク質方法に関しては、それにカップリングされるビオチニル基を有する酵素が、蛍光ビオチン化されたキャリヤーシステムを置換する。他方では、酵素は、ビオチン化されたBSA又はチログロブリンを用いて前の層に構築されるストレプトアビジン部位の増幅を伴って、ストレプトアビジンの最後の層に、ビオチンを通してカップリングされ得る。
【０２２７】
非常に低いレベルの蛍光の検出及び/又は映像化は、レーザー及び光電子増倍管から構成される、現在入手できる像増幅器又はシステムを用いて可能である。それらの方法は、個々の光子のレベル以下の光の検出を可能にする。適切なデジタル処理システムにより、像の個々の点（すなわち、個々の画素）が目的での点により放される光子の数に厳密に比例する像が生成され得る。細胞又は細胞の一部がレーザー線を通して流れるこの種類のシステム又は流動システムを用いて、100〜眼により検出され得る1000以上の因子の蛍光材料についての検出感度の上昇を得ることができる。この上昇は、単一のコピー遺伝子の蛍光を検出するために十分である。
【０２２８】
4.3.5他の検出技法：
式Iの化合物はまた、例えば酵素又は蛍光団による接合により、シグナル生成化合物に直接的に接合され得る。本発明の例示的な酵素は、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、オキシドレダクターゼ、及びペルオキシダーゼを包含するが、但しそれらだけには限定されない。本発明の例示的蛍光化合物は、上記セレクション4.1.4に開示されるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されず、そしてまた、ローダミン及びその誘導体、ダンシル及びウンベリフェロンを包含する。本発明の例示的な化学発光化合物は、ルシフェリン及び２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えばルミノールを包含するが、但しそれだけには限定されない。
【０２２９】
ラベルを検出するための手段は、当業者に良く知られている。例えば、ラベルが蛍光ラベルである場合、それは、光の適切な波長を有する蛍光色素を励起し、そして得られる蛍光を、例えば顕微鏡、視覚的調査、写真フィルム、電子検出器、例えば電荷カップリングされた装置又は光増幅器の使用、及び同様のものによる検出により検出され得る。同様に、酵素ラベルは、酵素のための適切な基質を供給し、そしてその得られる反応生成物を検出することにより検出され得る。最終的に、単純な比色ラベルがしばしば、ラベルにより結合される色彩を観察することにより、単純に検出される。従って、種々のディップステックアッセイにおいては、接合された金がしばしばピンク色に出現する。
【０２３０】
4,4 ホスホラミジット合成：
本発明のもう１つの好ましい種類の試薬は、本発明の化合物を組み込むホスホラミジット化合物である。ホスホラミジット試薬は、下記一般構造：
【０２３１】
【化８９】
【０２３２】
を有し、そして本発明の化合物の糖のヒドロキシル基（例えば、3’又は5’ヒドロキシル基）と共有結合を形成することができる。従って、本発明は、5’-OH又は3’-OHでホスホラミジット試薬を含んで成る、式Ｉ−XLのいずれかの化合物からホスホラミジット化合物を製造するための方法を提供する。そのようなホスホラミジット試薬は特に、本発明の化合物によりラベルされた核酸の自動化学合成のために有用である。
【０２３３】
そのようなホスホラミジット試薬は、ヌクレオシド又はヌクレオチド、又は核酸のヒドロキシル基、例えば5’−ヒドロキシル基と反応する場合、ホスフェートエステル連鎖を生成するために、酸化されるホスフィットエステル連鎖を形成する。ホスホラミジット化学の詳細な議論に関しては、例えば引用により本明細書に組込まれるCarruthers など., アメリカ特許第4, 458, 066号 及び 4,415, 732号 及び Gait, 1985, Oligonucleotide Syntlaesis : A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Englandを参照のこと。ホスホラミジット試薬は、ヌクレオシド又は非ヌクレオシド性であり得る。
【０２３４】
4.5検出可能ラベル−含有オリゴヌクレオチド：
本発明はさらに、本発明の化合物を含んで成るオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドにおける１又は複数のヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、いずれの長さのものでもあり得るが、但し、好ましくは少なくとも８個の長さのヌクレオチドである。他の態様においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、10, 12, 15, 18, 20又はそれ以上の長さのヌクレオチドである。ある態様においては、オリゴヌクレオチドは、50以下、40以下、又は30以下の長さのヌクレオチドである。
【０２３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは典型的には、相補的塩基対合を形成し、そして3’末端で相補的鎖の合成の起点として作用する-OH基を与える。従って、その主鎖は、ホスホジエステル連鎖を通して１つに必ずしも制限される必要はない。例えば、それはペプチド連鎖に基づいて主鎖又はペプチド核酸としてOの代わりにSを有するホスホロチオエート誘導体から構成され得る。
一般的に、検出できるラベルされたオリゴヌクレオチドは、種々の異なった個体支持体、例えば調節された多孔性ガラス又はポリスチレンにより合成され得るが、但しそれらだけには限定されない。
【０２３６】
4.6検出可能ラベルの使用方法：
ハイブリダイゼーションを検出するための手段として検出可能ラベルを使用するいくつかのハイブリダイゼーションアッセイ形は記載されており、それらのいくつかは下記に記載される。それらのアッセイは例えば、サンプルにおける特定のヌクレオチド配列の存在を検出し、標的核酸配列内の突然変異の存在を検出するために、標的核酸上の連続配列の存在を検出し、核酸ハイブリダイゼーションの運動学をモニターし、そしてPCR反応の進行をモニターするために有用である。
【０２３７】
ハイブリダイズする配列は、安定したハイブリッドを提供するためには完全な相補性を有する必要はない。多くの情況下で、約10％以下の塩基が、４個の又はそれ以上のヌクレオチドの無視できるループのミスマッチである安定したハイブリッドが形成するであろう。従って、本明細書において使用される場合、用語“相補的”とは、特にことわらない限り、一般的に、約90％又はそれ以上の相同性が存在するアッセイ条件下でその“補体”と安定した重複体を形成するオリゴヌクレオチドを言及する。
【０２３８】
4.6.1標的核酸の検出：
核酸ハイブリダイゼーション現象の検出のために本発明の化合物を使用する典型的な態様が本明細書に記載される。
本明細書に記載されるアッセイ形は単一の検出可能ラベルのみを使用するシステムにより表されるが、多−レポーターシステムもまた実施され得る。そのような多−レポーターシステムは、単一反応体積における複数のハイブリダイゼーション現象の分析を必要とする用途において好都合である。そのようなシステムにおいては、レポーター分子の個々が、他のレポーターの発光の間スペクトル分解できる発光を生成する。
【０２３９】
4.6.1.1プローブ方法：
１つのアッセイ形においては、単一のオリゴヌクレオチドプローブが使用される。プローブは、本発明の化合物を含んで成る。化合物は、プローブの3’末端又は5’末端に結合されるか、又はプローブ配列内のいずれかのヌクレオチドで存在するっことができる。
オリゴヌクレオチドプローブ企画及び合成の基本原理は良く知られている。それらの基本原理は一般的に、本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプローブの企画及び合成に適用する。
【０２４０】
本発明は、実質的に無限の数の異なったオリゴヌクレオチドプローブを包含する。例えば、本発明に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、長さの点で相当に変化することができる。好ましい長さは、考慮、例えば標的核酸の長さ、興味あるヌクレオチド配列の長さ、標的核酸型（すなわち、DNA又はRNA）、標的核酸G−C含有率、及びプローブ上の検出可能ラベルの空間に依存するであろう。好ましくは、本発明の実施に使用されるプローブの長さは、20〜200個のヌクレオチドである。より好ましくは、前記長さは、40〜100個のヌクレオチドである。
【０２４１】
プローブの長さにかかわらず、プローブは、ヌクレオチド配列において変化することができる。本発明に使用されるプローブのヌクレオチド配列は、標的核酸の配列に依存するであろう。プローブのヌクレオチド配列は、選択された現場ハイブリダイゼーション条件下での標的核酸とのハイブリダイゼーションを可能にするために、標的核酸に対して十分な相補性を有するべきである。好ましくは、プローブと標的核酸との間の塩基対適合は、少なくとも80％である。より好ましくは、塩基対適合は約100％である。
オリゴヌクレオチドにおける検出可能ラベルの合計数及び空間は変化することができる。好ましくは、検出可能ラベルは、オリゴヌクレオチドの3’末端から５個の塩基内に組込まれる。
【０２４２】
4.6.1.2 5’→3’エキソヌクレアーゼアッセイ：
5’→3’エキソヌクレアーゼアッセイとして本明細書に言及される、さらにもう１つのアッセイ形においては、レポーターラベル、例えば蛍光団、及び消光剤ラベル、例えばテトラメチルローダミン、Black Hole Quenchers (BioSearch Technologies, Novato, CA), DABCYL, 又はQSY-4の両者を含む二重ラベルされたプローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーションに基づいて消化され、それにより、プローブからラベルの１つ又は両者が遊離される（Lee など., 1993, US, 4, 88 : 7276 7280 ; アメリカ特許第5, 538, 848 号及び第 5, 210, 015号）。
【０２４３】
本発明の方法においては、蛍光団又は消光剤のいずれか又は両者が、本発明の化合物を用いて、オリゴヌクレオチド中に組込まれ得る。この方法においては、二重ラベルされたプローブが、標的核酸にハイブリダイズされる。さらに、オリゴヌクレオチドプライマーが、プローブから上流の位置で、すなわちプローブに対して5’方向、及び標的核酸の3’末端に隣接して、標的核酸にハイブリダイズされる。次に、プライマーは、5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素、例えばDNAポリメラーゼを用いて延長され、それにより延長されたプライマーが形成される。
【０２４４】
プライマー延長反応の間、ポリメラーゼの5’→3’エキソヌクレアーゼ活性は、レポーターラベルを含む第１プローブフラグメント及び消光剤ラベルを含む第２プローブフラグメントを形成するために、プローブを消化するよう作用する。従って、レポーター及び消光剤ラベルが分離され、そしてレポーターの蛍光が消化されなくなる。この方法は、Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CAから入手できるTaqMan(商標)キット及び試薬を用いて行われ得る。
【０２４５】
4.6.1.3 同時PCR：
本明細書に記載されるアッセイは、核酸増幅段階、例えばPCRと組合して行われ得る。すなわち、ハイブリダイゼーションアッセイを行う前、核酸サンプルのすべて又は一部が増幅され得る。増幅段階と組合して行われる場合、ハイブリダイゼーションアッセイは、エンド−ポイント形又は同時形で行われ得る。エンド−ポイント形においては、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応が完結した後、例えばPCR反応の増幅サイクルのすべて又は実質的にすべてが完結された後、実施される。同時形においては、ハイブリダイゼーションアッセイは、増幅反応の間、例えばPCRの個々の熱サイクルの後、複数回、実施される（Higuch, アメリカ特許第5,994,056号及び第6,171,785号；それらの個々は引用により本明細書に組み込まれる）。同時形は、標的核酸の初期量の定量的測定が必要とされる場合、例えば病原体核酸のコピー数が血液サンプルに存在する場合、好ましい。
【０２４６】
4.6.1.4リボヌクレアーゼ活性の検出：
検出可能ラベル−含有核酸はまた、サンプルにおけるRNアーゼ活性の存在及び/又は量を検出するために使用され得る。
手短には、リボヌクレアーゼ活性は、RNアーゼ基質として作用する合成オリゴヌクレオチドをサンプルと共に、リボヌクレアーゼ酵素による基質の分解のために十分な時間インキュベートすることにより検出される。基質は、切断部位として機能する内部位置での少なくとも１つのリボヌクレオチド残基、切断部位の一方上でのレポーター色素、又は切断部位の他方上での消光剤色素を含む一本鎖核酸分子を含んで成る。内部リボヌクレアーゼ残基の切断に基づいて、発光が消光色素により消光されるレポーター色素が検出できるようになる。従って、蛍光シグナルの検出は、リボヌクレアーゼ切断現象が生じ、そして従って、サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する。
【０２４７】
１つの態様においては、本発明のRNアーゼ検出方法は、１又は複数の陽性対照と共に行われる。１つの態様においては、陽性対照は、定量的陽性対照である。
【０２４８】
4.6.1.5 エンドヌクレアーゼ活性の検出：
検出可能ラベル含有核酸はまた、サンプルにおけるエンドヌクレアーゼ活性の存在及び/又は量を検出するために使用され得る。
手短には、エンドヌクレアーゼ活性は、ラベルされたオリゴヌクレオチドを、サンプルと共に、エンドヌクレアーゼ酵素、又はエンドヌクレオ分解活性を有する他の分子による基質の分解のために十分な時間インキュベートすることにより検出される。
【０２４９】
基質は、切断部位として機能する内部位置での少なくとも１つのデオキシリボヌクレオチド残基、前記切断部位の一方側上でのレポーター色素、及び前記切断部位の他方側上での消光剤色素を含む一本鎖核酸分子を含んで成る。内部リボヌクレアーゼ残基の切断に基づいて、この発光が消光剤色素により消光されるレポーター色素が検出できるようになる。従って、蛍光シグナルの検出は、エンドヌクレオ分解性切断現象が生じ、そして従って、サンプルがエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示す。
１つの態様においては、本発明のエンドヌクレアーゼ検出方法は、１又は複数の陽性対照と共に行われる。１つの態様において、その陽性対照は、定量的陽性対照である。
【０２５０】
4.6.1.6 TdT活性の検出：
検出可能ラベル含有核酸はまた、サンプルにおける末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）活性の存在及び/又は量を検出するために使用され得る。
手短には、TdT活性は、ラベルされていないオリゴ−又はポリヌクレオチドを、ラベルを担持するヌクレオチド三リン酸の存在下で、サンプルと共に、TdT酵素、又はTdT活性を有する他の分子による１又は複数のラベルされたヌクレオチド三リン酸の基質への付加のために十分な時間インキュベートすることにより検出される。基質は、少なくとも１つの遊離3’OH基を含む一本鎖又は二本鎖核酸分子を含んで成る。基質へのラベルの付加は、ラベルされたヌクレオチド三リン酸からのオリゴ−又はポリヌクレオチドの分離に基づいて検出され得る。
【０２５１】
１つの態様においては、本発明のTdT検出方法は、１又は複数の陽性対照と共に実施される。１つの態様においては、陽性対照は、定量的陽性対照である。１つの態様においては、オリゴ−又はポリヌクレオチドは、内部部位で消光剤によりラベルされ、そしてラベルされたヌクレオチドは内部部位で蛍光団によりラベルされ、そしてラベルされたヌクレオチド三リン酸はラベルとして消光剤分子を担持する。上記２種の態様のいずれかにおいては、ラベルされたヌクレオチド三リン酸の付加は、TdT活性の同時検出を可能にする。そのようなアッセイは、オリゴ−又はポリヌクレオチド上のラベルが、蛍光共鳴エネルギートランスファー（FRET）が消化剤と蛍光団との間で生じるよう配置されることを必要とする。
【０２５２】
4.6.1.7 染色体核型分類：
本発明はまた、染色体核型分類方法も提供する。この方法においては、既知の遺伝子に対応し、そして修飾されたヌクレオチドを含む修飾されたポリヌクレオチドが調製される。それらのポリヌクレオチドは、染色体デオキシリボ核酸によりハイブリダイズされ、そして得られる重複体は、複合体形式を可能にするための適切な条件下で適切なポリペプチドと接触される。前記ポリペプチドは、複合体の位置が決定され、そして特定の遺伝子の位置が確定されるよう、検出可能成分を含む。
【０２５３】
4.6.1.8 腫瘍細胞の検出：
腫瘍細胞は、本発明に従って修飾され、そしてポリペプチド、例えばα−胎児タンパク質又は癌胎児性抗原（この存在が特定の腫瘍細胞についての診断である）の生成に関連するデオキシリボ核酸遺伝子配列から合成されるメッセンジャーリボ核酸に対して相補的であるポリヌクレオチドを調製することにより診断され得る。従ってハイブリダイゼーション及びハイブリッド重複体が、腫瘍細胞の検出方法を提供する。
【０２５４】
4.7キット：
本発明はさらに、本発明の生成物を含んで成るキットを提供する。そのようなキットは、中でも、本明細書に記載される方法の実施のために、又は本明細書に記載される組成物の合成のための材料を提供するために有用である。一般的に、本発明のキットは、１又は複数の容器に、本発明の化合物、又は本発明の化合物を組み込むオリゴヌクレオチドを含んで成る。追加の成分が、本発明の化合物を利用する特定の用途に依存して、キットに含まれ得る。
【０２５５】
例えば、キットがセクション4.6.1.3に記載される同時PCRアッセイに向けられる場合、キットはさらに、DNAポリメラーゼを含むことができる。本発明のキットがセクション4.5.1.4のRNアーゼ検出アッセイの実施に向けられる場合、キットはさらに、RNアーゼを含まない水を含むことができる。キットが二本鎖又は一本鎖DNA分子の末端ラベリングに向けられる場合、キットはさらに末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含んで成る。キットが酵素アッセイ、例えばエンドヌクレアーゼ活性又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性のアッセイに向けられる場合、キットはさらに、既知比活性の標準量のエンドヌクレアーゼ又は末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを含む。
【０２５６】
そのようなキットは任意には、１又は複数の次のものを含む：負及び/又は陽性対照、緩衝液、及びキットの試薬の使用のための説明書。キットが診断用途のために意図される場合、キットはさらに、診断用途のための調節是認を示すラベルを含むことができる。
【０２５７】
4.8 検出可能ラベルの一般的な合成：
本発明はさらに、本発明の純粋な例示であるが、しかし本発明の範囲を制限しない次の例の考慮により明確にされるべきであろう。
本発明の化合物は、スキーム１−５に例示される合成方法を通して得られる。本発明の化合物及びその中間体を調製するために有用な出発材料は、市販されているか、又は既知の合成方法及び試薬を用いて、市販の材料から調製され得る。
【０２５８】
4.8.1 スキーム１：リンカーラベル化合物の合成：
【化９０】
リンカー及びラベルを含んで成る化合物を合成するために有用な方法を概略し、ここでリンカーは例えばポリエチレングリコール又はポリメチレンであり、そしてラベルは比色、化学発光、生物発光又は蛍光発光化合物である。
【０２５９】
第１に、化合物２のカルボキシル基が、N−ヒドロキシスクシンイミド（NHS）基により置換され、アミド化及びペプチドカップリングが促進される。しかしながら、他の適切なカップリング基は、当業界において良く知られており、例えば次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：1−[ビス（ジメチルアミノ）メチレン]−ヘキサフルオロホスフェート−１，３−オキシド−O−（ベンゾトリアゾール−１−イル）N, N, N’, N’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（HBTU）、ジシクロへキシルカルボジイミド（DCC）、又はO−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（HATU）。
【０２６０】
ジアミン１（ここでリンカーはテトラエチレングリコール又はテトラメチレングリコールである）は市販されている（Aldrich Chemical Co. , Milwaukee, Wisconsin）。さらに、QはSH又はOHであり得、この場合、アミンは任意には、保護され得る。化合物３への化合物１の転換のために適切な有機溶媒は、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、トルエン、キシレン、炭化水素溶媒（例えば、ペンタン、ヘキサン及びヘプタン）、及びそれらの混合物を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０２６１】
化合物２への化合物１の添加の後、反応混合物は約２日間、攪拌され、そして反応混合物は、反応が適切な分析方法、好ましくは薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される場合、実質的に完結するまで、攪拌される。次に、反応混合物は、当業界に知られている方法により消化され、そして化合物２が単離され、そして所望には、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。
【０２６２】
4.8.2 スキーム２：保護されたα−置換された−リンカー−ラベル化合物の合成：
【化９１】
【０２６３】
スキーム２は、−リンカー−ラベル化合物５を形成するために、R2−置換された化合物４によるリンカーラベル化合物３のカップリングを示し、ここでR2は本明細書に記載され、そして−Pgは保護基である。
好ましくは、化合物５を合成するために、約１当量の４及び1.5当量の３の溶液が、不活性雰囲気下で適切な有機溶媒に溶解される。極性非プロトン性溶媒（例えば、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル又はジメチルスルホキシド）の使用が好ましい。溶液は、約15℃〜ほぼ室温の範囲内の一定温度で、好ましくは室温で維持され、そして塩基、好ましくはアミン塩基、例えばジイソプロピルエチルアミンが添加されるが、但しそれらだけには限定されない。好ましくは、約10当量の置換されたアミンが１回の添加で添加される。
【０２６４】
アミン塩基の添加の後、反応混合物は、室温で約１〜４時間、好ましくは反応混合物の温度が一定に維持するような速度で攪拌される。反応混合物は、その反応が、適切な分析方法、好ましくは薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより分析される場合、実質的に完結するまで、この温度で攪拌される。次に、反応混合物は消光され、化合物５を含む混合物が得られた。化合物５は、当業界において知られている技法（例えば、分離用HPLC又はフラッシュクロマトグラフィー）により精製される。しかしながら、化合物５を含む粗調製物はまた、さらに精製しないで次の段階に使用され得る。
【０２６５】
4.8.3 スキーム３：α−置換されたリンカー−ラベルされた化合物の保護解除：
【化９２】
【０２６６】
スキーム３は、置換されたリンカーラベルされた化合物５の保護解除のために有用な方法を概略する。保護解除についての典型的方法は、極性有機溶媒に化合物５を溶解することを包含する。化合物６への化合物５の転換のために適切な有機溶媒は、メタノール、ジメチルホルムアミド、アセトニトリル又はジメチルスルホキシドを包含するが、但しそれらだけには限定されない。化合物５が溶解された後、保護解除剤が添加される。適切な保護解除剤は、化合物におけるいずれの他の成分とも反応しないで、保護基を除去するであろう。
【０２６７】
適切な保護解除試薬の例は、ピペリジン、モルホリン及びDBUを包含するが、但しそれらだけには限定されない。反応混合物は、反応が、適切な分析方法、好ましくはニンヒドリン、薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより決定される場合、実質的に完結するまで（例えば、約12時間）、室温で攪拌される。次に、反応混合物が消光され、そして化合物６が作業により単離され、そして所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。
【０２６８】
4.8.4 スキーム４：オキサノシン化合物の合成：
【化９３】
【０２６９】
式７のプリン糖は、室温で、pH3−４の緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム）及び無菌水に、化合物７を溶解することにより、式８のオキサノシン糖化合物に転換され得る。次に、亜硝酸ナトリウムが添加され、そしてその溶液が室温で攪拌される。反応混合物は、反応が、適切な分析方法、好ましくは高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより決定される場合、実質的に完結するまで（例えば、約24時間）、室温で攪拌される。次に、反応混合物が消光され、そして化合物６が作業により単離され、そして所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【０２７０】
4.8.5 スキーム５：ウレア−置換されたイミダゾールアミド検出可能ラベルの合成：
【化９４】
【０２７１】
検出可能ラベル化合物８は、緩衝液（例えば、硼酸ナトリウム）中、オキサノシン化合物8と、無菌水中、置換されたリンカーラベル化合物６とを接触することにより合成され得る。反応混合物は、反応が、適切な分析方法、好ましくは高性能液体クロマトグラフィーを用いることにより決定される場合、実質的に完結するまで（例えば、約24時間）、34℃〜40℃で軽く攪拌しながらインキュベーターに維持される。次に、反応混合物が消光され、そして化合物９が作業により単離され、そして所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【０２７２】
4.8.6 スキーム６：置換されていないイミダゾール−アミン検出可能ラベルの合成：
【化９５】
【０２７３】
化合物12は、当業者に知られている方法を用いて、グリコシル化された塩基11を生成するために、ハロゲン置換されたイミダゾール10をまずグリコシル化することにより合成され得る（例えば、引用により本明細書に組込まれるNucleic Acid Research (1995), 23 (4), 647-653 and Tetrahedron Asynzmetfy (1996), 7 (12), 3455-3464を参照のこと）。次に、グリコシル化された塩基11は、化合物12のために適切な条件下で、置換された−リンカーラベル化合物６と接触せしめられる。
【０２７４】
例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Journal of Heterocyclic Chemistry (2000), 37 (1), 119-126 ; Australian Journal of Chemistry (1987), 40 (8), 1399-1413; Khim. Farm. Zh. (1977), 11 (10), 38-42; Chemistry of Eeterocyclic Compounds (2000), 36 (2), 182-184; Inddian Journal of Chemistry, Sect. B, (1982), 21B(10), 928-640を参照のこと。化合物12は、所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【０２７５】
4.9 スキーム７：置換されていないイミダゾールアミド化合物の合成：
【化９６】
【０２７６】
化合物13は、当業者に知られている方法を用いて、グリコシル化された塩基11(a)を生成するために、カルボキシ官能化されたイミダゾール10をまずグリコシル化することにより合成され得る。例えば、引用により本明細書に組込まれるNucleic Acid Research (1995), 23 (4), 647-653; Bioorg. Med. Chem. Lett. , (1995), 5 (15), 1679-1684; 及び Setrahedron Ssymme7ry (1996), 7 (12), 3455-3464を参照のこと。グリコシル化された塩基11（ａ）が11（ｂ）に転換され、そして次に、化合物13の形成のために適切な条件下で、ラベル化合物６と反応される。
【０２７７】
例えば、引用により本明細書に組み込まれる、Journal of Heterocyclic Chemistry (2000), 37 (1), 119-126 ; Australian Journal of Chemistry (1987), 40 (8), 1399-1413; Khim. Farm. Zh. (1977), 11 (10), 38-42; Chemistry of Heterocyclic Compounds (2000), 36 (2), 182-184; Indian Journal of Chemistry, Sect. B, (1982), 21B (10), 928-640を参照のこと。化合物13は、所望により、当業界において知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー又は分離用HPLCにより精製される。化合物はさらに、所望により、例えば水と共に凍結乾燥することにより精製され得る。
【実施例】
【０２７８】
4.10 例：本発明の化合物の合成：
4.10.1 例１：ビオチン−PEG−アミンの合成：
【化９７】
【０２７９】
2.0Lの丸底フラスコを、テトラエチレングリコールジアミン（7.0g, 36.4mモル）（Molecular BioSciences ; Boulder, COから市販されている）及びジクロロメタン（600ml）により充填した。この透明な溶液に、ジクロロメタン（100ml）中、ヒドロキシスクシンイミド（“NHS”）ビオチン（2.73g、8.0mモル）（Molecular BioScienceから入手できる）の懸濁液を、50分間にわたって添加した。反応を室温で２日間、攪拌した。溶媒を回転蒸発器上で減圧下で除去し、そして生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（70％の収率）。
【０２８０】
4.10.2 例２：FMOC−メチル−PEG−ビオチンの合成：
【化９８】
【０２８１】
DMSO DMF (6ml, 5:1の比)中、FMOC−ホモアニリン（0.65g、2.0mモル）（Flukaから市販されている）、ビオチンPEGアミン（0.56g、1.34mモル）の溶液に、DMF中、HBTU（5ml、1.0mM溶液）を、冷却条件下で添加した。５分間の攪拌の後、N, N−ジイソプロピルエチルアミン（1.0ml）を添加し、そして反応混合物を1.0時間、室温で攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発し、そして生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（50％収率）。
【０２８２】
4.10.3 例３：メチル−PEG−ビオチンの合成：
【化９９】
【０２８３】
FMOC保護基を、１，８−ジアサビシクロ[5.4.0]−ウンデク−７−エン（DBU）を用いて、アミンから除去した。メタノール中、FMOCホモアニリンPEGビオチン（0.25g、0.345mモル）の溶液に、DBU（0.2g、1.31mモル）を室温で添加し、そして反応を一晩、攪拌した。メタノールを真空下で除去し、そして生成物をカラムクロマトグラフィーにより精製した（87％収率）。
【０２８４】
4.10.4 例４：オキサノシン三リン酸の合成：
【化１００】
【０２８５】
グアノシン三リン酸（210mg、0.384mモル、リチウム塩）（Sigma, St. Louis, MOから入手できる）を、酢酸ナトリウム緩衝液（2ml、12M、pH3.7）及び無菌水（4ml）の溶液に、室温で溶解した。この透明な溶液に、無菌水（2ml）中、亜硝酸ナトリウム（50mg、0.724mモル、1.88当量）を、軽く攪拌しながら室温で添加し、そして反応を24時間、放置した。この反応ン分析用PLCは、１つの主要（キサントシン）及び１つのマイナー（オキサノシン）なピークを示し、そして検出できる出発材料を示さなかった。化合物を、分離用カラム（Zorbax, S -C 18, 21.2 mm x 25 cm, Part # 880975-102) (Agilent Technologies (Palo Alto, CA)から市販されている)を用いて精製した。予測される生成物を含む、集められた画分を一緒にプールし、そして凍結乾燥した。精製されたオキサノシン三リン酸を、水と共に２日の凍結乾燥した後、白色固形物（42mg、21％の収率）として得た。
【０２８６】
4.10.5 例５：αメチル−PEG−ビオチンイミダゾール三リン酸の合成：
【化１０１】
【０２８７】
硼酸ナトリウム緩衝液（12ml、250mM、pH9.0）中、オキサノシン三リン酸（15mg、0.0286mモル）の溶液に、無菌水（1.0ml）中、メチル−PEG−ビオチン（20mg、0.0398mモル、1.39当量）を添加した。この反応混合物を、シェーカーを用いて、軽く動かしながら、38℃で24時間インキュベーターにおいて維持した。反応混合物をHPLCにより分析し、そして所望する生成物、すなわち有意な量のオキサノシン及び少々のアミンを見出した。化合物を、RP-HPLC（Symmetry Semi prep column, C-18, 7. 8 x 300 mm, Part # WAT 066235, Waters Corporation, Milord, MAからの）により精製し、そして11mg（40％の収率）を単離した。
【０２８８】
4.10.6 イミダゾール−PEG−ビオチンによるTDTラベリング：
本発明の化合物は、逆相HPLCにより精製され、そして分子質量により定量化された非放射性リボヌクレオチド類似体を包含するが、ただしそれらだけには限定されない。前記化合物は、例えば末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TdT）のための基質として使用され得る。例示的な例として、イミダゾール−PEG−ピオチンは、鋳型無関係のビオチニル化のための二本鎖又は一本鎖DNA分子の3’ヒドロキシル末端に移行され得る。イミダゾール−PEG−ビオチンによりラベルされたDNAフラグメントは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイに効果的にハイブリダイズし、そしてストレプトアビジン蛍光色素接合体による染色を通して容易に検出され得る。
【０２８９】
4.10.7 フラグメント化及びラベリング：
ゲノムDNAサンプル（10mMのTRIS緩衝液中、50ng, pH8.3）を、マスター混合物、MgCl2、及び所望する組のCYP450多型体を増幅するのに適切な１組のプライマーと共に混合した。マスター混合物は次の成分を含んだ：TRIS HCl緩衝液、pH8.3；硫酸アンモニウム；DNAポリメラーゼ、ウラシル−N−グリコシラーゼ、及びデオキシヌクレオチド三リン酸dATP, dCTP, dTTP, dGTP及びdUTPの個々。反応を次の熱サイクルプロフィールにゆだねた：50℃で２分、95℃で10分、（35サイクル）95℃で15秒、67℃で4分、続いて72℃で７分のインキュベーション、及び４℃での維持。
【０２９０】
PCR反応からのPCR反応生成物からのアンプリコンのアリコートを、DNアーゼI及びホスファターゼの混合物と共にインキュベートし、アンプリコンを25−100bpの長さに切断し、そしてPCR混合物におけるdNTPを脱リン酸化した。続いてフラグメント化されたアンプリコンを、TdTを用いて、イミダゾール−PEG−ビオチンによりラベルした。
【０２９１】
4.10.7.1 DNアーゼフラグメント反応：
PCR反応生成物を、DNアーゼI、EDTA、アルカリホスファターゼ及び水を含むDNアーゼフラグメント化試薬と共に組合した。その混合物を、25℃で20分、次に95℃で10分インキュベートした。次に、フラグメント化されたアンプリコンを、TdT反応の開始の前、４℃で維持した。
【０２９２】
4.10.7.2 TdTラベリング反応：
次に、DNアーゼフラグメント化されたアンプリコンを、TdT緩衝液（1Mのカコジル酸カリウム、250mMのトリス塩基、10mMのCoCl2及び0.2mMのDTT、pH7.6）、イミダゾールPEGビオチン、TdT、水を含むラベリング混合物と共にインキュベートし、そして37℃で１時間、次に95℃で5分間、攪拌した。次に、イミダゾール−PEG−ビオチンによりラベルされたアンプリコンを、ハイブリダイゼーション溶液に移す前、４℃で維持した。
【０２９３】
4.10.8 マイクロアレイハイブリダイゼーション：
ラベルされたアンプリコンを、マイクロアレイハイブリダイゼーション緩衝液（SSPE, Triton X-100, 標準化オリゴヌクレオチド、Denhardt溶液、及び脱イオン水）に移した。
変性されたサンプルを、45℃での30分間のハイブリダイゼーションのためにフルーイディックスステーション上に負荷し、続いて50℃で洗浄し、ストレプトアビジンフィコエリトリンにより10分間、染色し、そして室温で洗浄した。マイクロアレイを、レーザーにより走査し、ソフトウェアにより遺伝子型信号に転換される蛍光強度値を生成した。PEG−ビオチンイミダゾール化合物によるハイブリダイゼーション性能を、次のいくつかの測定基準によりモニターした：バックグラウンド強度（BG）、チップ強度値：重要な完全適合（重要突然変異部位のためのKeyPM）及び参照完全適合（RefPM）、通過率（重要及び参照）、及び重要突然変異部位のための識別割合。
【０２９４】
マイクロアレイ上でのイミダゾールPEG−ビオチンの移行効率及び機能的性能を評価するために、２種の臨床学的サンプル及び対照サンプルを、250μMのイミダゾール−PEG−ビオチンの存在下で種々の量のTdT（200, 400及び800単位）によりラベルした。
【０２９５】
【表４】
【０２９６】
表４は、イミダゾールPEGビオチンラベルによるヌクレオシドのラベリングの効率を示す。特に、表４は、CYP450多型体の検出におけるイミダゾールPEGビオチンラベルの効率を示す。
本発明は、本明細書に記載される特定の態様により範囲を制限されない。実際、本発明の種々の修飾は、前述の記載及び添付図面から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾は、本発明の範囲内にある。
本明細書に引用される種々の出版物、特許及び特許出願は、その開示を引用により本明細書に組込まれる。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式I：
【化１】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -NH2, -OH, (アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項２】
下記式II：
【化３】
[式中、塩基は、下記式：
【化４】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化５】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項３】
X, Y及びZの少なくとも１つが、−OHである請求項２記載の化合物。
【請求項４】
X、Y及びZの個々が、−OHである請求項２記載の化合物。
【請求項５】
Y及びZの少なくとも１つが、−OHであり、そしてXが、下記式；
【化６】
である請求項２記載の化合物。
【請求項６】
Xが、下記式：
【化７】
である請求項２記載の化合物。
【請求項７】
Xが、下記式：
【化８】
である請求項２記載の化合物。
【請求項８】
Xが、下記式：
【化９】
である請求項２記載の化合物。
【請求項９】
R1が、-NHC(O)NH2である請求項２記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカーが、(CH2CH2O)nであり、ここでｎは、１〜10の整数である請求項２記載の化合物。
【請求項１１】
前記ラベルが、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である請求項２記載の化合物。
【請求項１２】
前記蛍光団が、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、非もしくは弱蛍光化合物、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである請求項２記載の化合物。
【請求項１３】
前記ラベルが、下記式：
【化１０】
である請求項２記載の化合物。
【請求項１４】
下記式III ：
【化１１】
[式中、X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-O(アルキル), - SH,-SR4,-NHR4,-NR4R5、下記式：
【化１２】
であり、ここでR3は−H又は金属であり；R4は−H又はアルキルであり；そしてR5は−H又はアルキルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項１５】
X, Y及びZが独立して、−H、−OH、下記式：
【化１３】
である請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項14記載の化合物。
【請求項１７】
下記式IV：
【化１４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項１８】
下記式V：
【化１６】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１７】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項１９】
下記式VI：
【化１８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２０】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
下記式VII：
【化２０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２２】
下記式VIII：
【化２２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２３】
下記式IX：
【化２４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２４】
下記式X：
【化２６】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２７】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２５】
下記式XI：
【化２８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２６】
下記式XII：
【化３０】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２７】
下記式XIII：
【化３１】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２８】
下記式XIV：
【化３２】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２９】
下記式XV：
【化３３】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３０】
下記式XVI：
【化３４】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３１】
下記式XVII：
【化３５】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３２】
下記式XVIII：
【化３６】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３３】
下記式XIX：
【化３７】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３４】
下記式XX：
【化３８】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３５】
下記式XXI：
【化３９】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化４０】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
下記式XXII：
【化４１】
[式中、塩基は、下記式：
【化４２】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0（アルキル）,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化４３】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
X, Y及びZの少なくとも１つが、−OHである請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
X、Y及びZの個々が、−OHである請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
Y及びZの少なくとも１つが、−OHであり、そしてXが、下記式；
【化４４】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
Xが、下記式：
【化４５】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
Xが、下記式：
【化４６】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
Xが、下記式：
【化４７】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
R1が、-NHC(O)NH2である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記リンカーが、(CH2CH2O)nであり、ここでｎは、１〜10の整数である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ラベルが、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記蛍光団が、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、非もしくは弱蛍光化合物、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記ラベルが、下記式：
【化４８】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
下記式XXIII：
【化４９】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５０】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項４９】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項48記載の化合物。
【請求項５０】
下記式XXIV：
【化５１】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５２】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５１】
下記式XXV：
【化５３】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５４】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５２】
下記式XXVI：
【化５５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５３】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項36記載の化合物。
【請求項５４】
下記式XXVII：
【化５７】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５８】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５５】
下記式XXVIII：
【化５９】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６０】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５６】
下記式XXIX：
【化６１】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６２】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５７】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項56記載の化合物。
【請求項５８】
下記式XXX：
【化６３】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６４】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５９】
下記式XXXI：
【化６５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６０】
下記式XXXII：
【化６７】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６１】
下記式XXXIII：
【化６８】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６２】
下記式XXXIV：
【化６９】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６３】
下記式XXXV：
【化７０】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６４】
下記式XXXVI：
【化７１】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６５】
下記式XXXVII：
【化７２】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６６】
下記式XXXVIII：
【化７３】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６７】
下記式XXXIX：
【化７４】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６８】
下記式XL：
【化７５】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６９】
試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと、オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブを含んで成る組成物とを接触せしめ、ここで前記オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブは、下記式：
【化７６】
[式中、塩基は、下記式：
【化７７】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化７８】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、又は非−もしくは弱−蛍光化合物である]
で表される化合物を含んで成り、
ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは、中位の緊縮条件下で前記標的核酸と選択的に又は特異的にハイブリダイズすることができ；
任意には、前記サンプルを、前記励起できる波長の光に暴露し；そして
前記接触が組成物の色又は蛍光発光の変化を生成するかどうかを検出することを含んで成り、ここで前記組成物の色又は蛍光発光の変化が、標的核酸が試験サンプルに存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項７０】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の3’末端で結合される請求項69記載の方法。
【請求項７１】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の5’末端で結合される請求項69記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物が前記オリゴヌクレオチド又は核酸から除去されるよう、前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階をさらに含んで成る請求項69記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階が、ポリメラーゼ酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によりもたらされる請求項69記載の方法。
【請求項７４】
標的核酸へのハイブリダイゼーションに基づいて消化される、レポーターラベル及び消光剤ラベルの両者を包含する二重ラベルされたプローブを含んで成り、ここで前記消化により、プローブから１つの又は両ラベルが開放される請求項69記載の方法。
【請求項７５】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項35記載の化合物を含んで成り；
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する、ことを特徴とする方法。
【請求項７６】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ｄ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項35記載の化合物を含んで成り；
（ｅ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｆ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
（ｇ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｈ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｉ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項７７】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は請求項35記載の化合物及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項７８】
ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法であって、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、請求項13記載の化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを検出することを含んで成る方法。
【請求項７９】
請求項35記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びDNAポリメラーゼを含んで成る即時PCRアッセイのためのキット。
【請求項８０】
請求項35記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びRNアーゼを含まない水を含んで成るRNアーゼ検出アッセイのためのキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式I：
【化１】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項２】
下記式II：
【化３】
[式中、塩基は、下記式：
【化４】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化５】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項３】
前記ラベルが、下記式：
【化６】
である請求項２記載の化合物。
【請求項４】
下記式III ：
【化７】
[式中、X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-O(アルキル), - SH,-SR4,-NHR4,-NR4R5、下記式：
【化８】
であり、ここでR3は−H又は金属であり；R4は−H又はアルキルであり；そしてR5は−H又はアルキルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項５】
X, Y及びZが独立して、−H、−OH、下記式：
【化９】
である請求項４記載の化合物。
【請求項６】
下記式IV：
【化１０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項７】
下記式V：
【化１２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項８】
下記式VI：
【化１４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項９】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
下記式VII：
【化１６】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１７】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
下記式VIII：
【化１８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１２】
下記式IX：
【化２０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項１３】
下記式X：
【化２２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
下記式XI：
【化２４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項１５】
下記式XII：
【化２６】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１６】
下記式XIII：
【化２７】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項15記載の化合物。
【請求項１７】
下記式XIV：
【化２８】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項15記載の化合物。
【請求項１８】
下記式XV：
【化２９】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項１９】
下記式XVI：
【化３０】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
下記式XVII：
【化３１】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項18記載の化合物。
【請求項２１】
下記式XVIII：
【化３２】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項２２】
下記式XIX：
【化３３】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項21記載の化合物。
【請求項２３】
下記式XX：
【化３４】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項21記載の化合物。
【請求項２４】
下記式XXIII：
【化３５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化３６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項24記載の化合物。
【請求項２６】
下記式XXIV：
【化３７】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化３８】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項24記載の化合物。
【請求項２７】
下記式XXV：
【化３９】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４０】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項24記載の化合物。
【請求項２８】
下記式XXIX：
【化４１】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４２】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項２９】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項28記載の化合物。
【請求項３０】
下記式XXX：
【化４３】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４４】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項３１】
下記式XXXI：
【化４５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項３２】
下記式XXI：
【化４７】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化４８】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、又は請求項２〜31のいずれか１項に記載の化合物、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項２〜31のいずれか１項に記載の化合物を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
X, Y及びZの少なくとも１つが、−OHである請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
X、Y及びZの個々が、−OHである請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
Y及びZの少なくとも１つが、−OHであり、そしてXが、下記式；
【化４９】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
Xが、下記式：
【化５０】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
Xが、下記式：
【化５１】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
Xが、下記式：
【化５２】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
R1が、-NHC(O)NH2である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記リンカーが、(CH2CH2O)nであり、ここでｎは、１〜10の整数である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記ラベルが、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記蛍光団が、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、非もしくは弱蛍光化合物、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ラベルが、下記式：
【化５３】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと、請求項32〜44のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含んで成る組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項４６】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の3’末端で結合される請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の5’末端で結合される請求項45記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物が前記オリゴヌクレオチド又は核酸から除去されるよう、前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階をさらに含んで成る請求項45記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階が、ポリメラーゼ酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によりもたらされる請求項45記載の方法。
【請求項５０】
標的核酸へのハイブリダイゼーションに基づいて消化される、レポーターラベル及び消光剤ラベルの両者を包含する二重ラベルされたプローブを含んで成り、ここで前記消化により、プローブから１つの又は両ラベルが開放される請求項45記載の方法。
【請求項５１】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項32〜44のいずれか１項に記載の化合物を含んで成り；
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する、ことを特徴とする方法。
【請求項５２】
下記の工程：
（ａ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｂ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｃ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定する；
ことをさらに含んで成る請求項51記載の方法であって、
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項５３】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は請求項35記載の化合物及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項５４】
ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法であって、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、請求項３記載の化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを検出することを含んで成る方法。
【請求項５５】
請求項32記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びDNAポリメラーゼを含んで成る即時PCRアッセイのためのキット。
【請求項５６】
請求項32記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びRNアーゼを含まない水を含んで成るRNアーゼ検出アッセイのためのキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式I：
【化１】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項２】
下記式II：
【化３】
[式中、塩基は、下記式：
【化４】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化５】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項３】
下記式III ：
【化６】
[式中、X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-O(アルキル), - SH,-SR4,-NHR4,-NR4R5、下記式：
【化７】
であり、ここでR3は−H又は金属であり；R4は−H又はアルキルであり；そしてR5は−H又はアルキルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項４】
下記式IV：
【化８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項３記載の化合物。
【請求項５】
下記式VI：
【化１０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６】
下記式IX：
【化１２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項７】
下記式XXI：
【化１４】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化１５】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、又は請求項２〜６のいずれか１項に記載の化合物、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の化合物を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと、請求項７又は８に記載のオリゴヌクレオチドを含んで成る組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項１０】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項７又は８に記載の化合物を含んで成り；
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する、ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は請求項７記載の化合物及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項１２】
ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法であって、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、請求項１記載の化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを検出することを含んで成る方法。
【請求項１３】
請求項７記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びDNAポリメラーゼを含んで成る即時PCRアッセイのためのキット。
【請求項１４】
請求項７記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びRNアーゼを含まない水を含んで成るRNアーゼ検出アッセイのためのキット。
【請求項１】
下記式I：
【化１】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -NH2, -OH, (アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項２】
下記式II：
【化３】
[式中、塩基は、下記式：
【化４】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化５】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項３】
X, Y及びZの少なくとも１つが、−OHである請求項２記載の化合物。
【請求項４】
X、Y及びZの個々が、−OHである請求項２記載の化合物。
【請求項５】
Y及びZの少なくとも１つが、−OHであり、そしてXが、下記式；
【化６】
である請求項２記載の化合物。
【請求項６】
Xが、下記式：
【化７】
である請求項２記載の化合物。
【請求項７】
Xが、下記式：
【化８】
である請求項２記載の化合物。
【請求項８】
Xが、下記式：
【化９】
である請求項２記載の化合物。
【請求項９】
R1が、-NHC(O)NH2である請求項２記載の化合物。
【請求項１０】
前記リンカーが、(CH2CH2O)nであり、ここでｎは、１〜10の整数である請求項２記載の化合物。
【請求項１１】
前記ラベルが、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である請求項２記載の化合物。
【請求項１２】
前記蛍光団が、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、非もしくは弱蛍光化合物、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである請求項２記載の化合物。
【請求項１３】
前記ラベルが、下記式：
【化１０】
である請求項２記載の化合物。
【請求項１４】
下記式III ：
【化１１】
[式中、X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-O(アルキル), - SH,-SR4,-NHR4,-NR4R5、下記式：
【化１２】
であり、ここでR3は−H又は金属であり；R4は−H又はアルキルであり；そしてR5は−H又はアルキルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項１５】
X, Y及びZが独立して、−H、−OH、下記式：
【化１３】
である請求項14記載の化合物。
【請求項１６】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項14記載の化合物。
【請求項１７】
下記式IV：
【化１４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項１８】
下記式V：
【化１６】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１７】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項１９】
下記式VI：
【化１８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２０】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項19記載の化合物。
【請求項２１】
下記式VII：
【化２０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２２】
下記式VIII：
【化２２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２３】
下記式IX：
【化２４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２４】
下記式X：
【化２６】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２７】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２５】
下記式XI：
【化２８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２６】
下記式XII：
【化３０】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２７】
下記式XIII：
【化３１】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２８】
下記式XIV：
【化３２】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項２９】
下記式XV：
【化３３】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３０】
下記式XVI：
【化３４】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３１】
下記式XVII：
【化３５】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３２】
下記式XVIII：
【化３６】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３３】
下記式XIX：
【化３７】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３４】
下記式XX：
【化３８】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される化合物。
【請求項３５】
下記式XXI：
【化３９】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化４０】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
下記式XXII：
【化４１】
[式中、塩基は、下記式：
【化４２】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0（アルキル）,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化４３】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
X, Y及びZの少なくとも１つが、−OHである請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
X、Y及びZの個々が、−OHである請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
Y及びZの少なくとも１つが、−OHであり、そしてXが、下記式；
【化４４】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
Xが、下記式：
【化４５】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
Xが、下記式：
【化４６】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
Xが、下記式：
【化４７】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
R1が、-NHC(O)NH2である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記リンカーが、(CH2CH2O)nであり、ここでｎは、１〜10の整数である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
前記ラベルが、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４６】
前記蛍光団が、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、非もしくは弱蛍光化合物、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４７】
前記ラベルが、下記式：
【化４８】
である請求項36記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４８】
下記式XXIII：
【化４９】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５０】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項４９】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項48記載の化合物。
【請求項５０】
下記式XXIV：
【化５１】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５２】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５１】
下記式XXV：
【化５３】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５４】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５２】
下記式XXVI：
【化５５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５３】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項36記載の化合物。
【請求項５４】
下記式XXVII：
【化５７】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化５８】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５５】
下記式XXVIII：
【化５９】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６０】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５６】
下記式XXIX：
【化６１】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６２】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５７】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項56記載の化合物。
【請求項５８】
下記式XXX：
【化６３】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６４】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項５９】
下記式XXXI：
【化６５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化６６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６０】
下記式XXXII：
【化６７】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６１】
下記式XXXIII：
【化６８】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６２】
下記式XXXIV：
【化６９】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６３】
下記式XXXV：
【化７０】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６４】
下記式XXXVI：
【化７１】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６５】
下記式XXXVII：
【化７２】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６６】
下記式XXXVIII：
【化７３】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６７】
下記式XXXIX：
【化７４】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６８】
下記式XL：
【化７５】
[式中、R3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６９】
試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと、オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブを含んで成る組成物とを接触せしめ、ここで前記オリゴ−又はポリヌクレオチドプローブは、下記式：
【化７６】
[式中、塩基は、下記式：
【化７７】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化７８】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、又は非−もしくは弱−蛍光化合物である]
で表される化合物を含んで成り、
ここで前記オリゴヌクレオチドプローブは、中位の緊縮条件下で前記標的核酸と選択的に又は特異的にハイブリダイズすることができ；
任意には、前記サンプルを、前記励起できる波長の光に暴露し；そして
前記接触が組成物の色又は蛍光発光の変化を生成するかどうかを検出することを含んで成り、ここで前記組成物の色又は蛍光発光の変化が、標的核酸が試験サンプルに存在することを示すことを特徴とする方法。
【請求項７０】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の3’末端で結合される請求項69記載の方法。
【請求項７１】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の5’末端で結合される請求項69記載の方法。
【請求項７２】
前記化合物が前記オリゴヌクレオチド又は核酸から除去されるよう、前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階をさらに含んで成る請求項69記載の方法。
【請求項７３】
前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階が、ポリメラーゼ酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によりもたらされる請求項69記載の方法。
【請求項７４】
標的核酸へのハイブリダイゼーションに基づいて消化される、レポーターラベル及び消光剤ラベルの両者を包含する二重ラベルされたプローブを含んで成り、ここで前記消化により、プローブから１つの又は両ラベルが開放される請求項69記載の方法。
【請求項７５】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項35記載の化合物を含んで成り；
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する、ことを特徴とする方法。
【請求項７６】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ｄ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項35記載の化合物を含んで成り；
（ｅ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｆ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
（ｇ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｈ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｉ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項７７】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は請求項35記載の化合物及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項７８】
ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法であって、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、請求項13記載の化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを検出することを含んで成る方法。
【請求項７９】
請求項35記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びDNAポリメラーゼを含んで成る即時PCRアッセイのためのキット。
【請求項８０】
請求項35記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びRNアーゼを含まない水を含んで成るRNアーゼ検出アッセイのためのキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式I：
【化１】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項２】
下記式II：
【化３】
[式中、塩基は、下記式：
【化４】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化５】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項３】
前記ラベルが、下記式：
【化６】
である請求項２記載の化合物。
【請求項４】
下記式III ：
【化７】
[式中、X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-O(アルキル), - SH,-SR4,-NHR4,-NR4R5、下記式：
【化８】
であり、ここでR3は−H又は金属であり；R4は−H又はアルキルであり；そしてR5は−H又はアルキルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項５】
X, Y及びZが独立して、−H、−OH、下記式：
【化９】
である請求項４記載の化合物。
【請求項６】
下記式IV：
【化１０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項７】
下記式V：
【化１２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項８】
下記式VI：
【化１４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項９】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項８記載の化合物。
【請求項１０】
下記式VII：
【化１６】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１７】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１１】
下記式VIII：
【化１８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１２】
下記式IX：
【化２０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項１３】
下記式X：
【化２２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項１４】
下記式XI：
【化２４】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化２５】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項１５】
下記式XII：
【化２６】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項１６】
下記式XIII：
【化２７】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項15記載の化合物。
【請求項１７】
下記式XIV：
【化２８】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項15記載の化合物。
【請求項１８】
下記式XV：
【化２９】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項１９】
下記式XVI：
【化３０】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項18記載の化合物。
【請求項２０】
下記式XVII：
【化３１】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項18記載の化合物。
【請求項２１】
下記式XVIII：
【化３２】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項２２】
下記式XIX：
【化３３】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項21記載の化合物。
【請求項２３】
下記式XX：
【化３４】
[式中、R3は、H又は金属である]
で表される請求項21記載の化合物。
【請求項２４】
下記式XXIII：
【化３５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化３６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項４記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項24記載の化合物。
【請求項２６】
下記式XXIV：
【化３７】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化３８】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項24記載の化合物。
【請求項２７】
下記式XXV：
【化３９】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４０】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項24記載の化合物。
【請求項２８】
下記式XXIX：
【化４１】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４２】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項２９】
前記化合物が、立体的に純粋である請求項28記載の化合物。
【請求項３０】
下記式XXX：
【化４３】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４４】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項12記載の化合物。
【請求項３１】
下記式XXXI：
【化４５】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化４６】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項８記載の化合物。
【請求項３２】
下記式XXI：
【化４７】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化４８】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、又は請求項２〜31のいずれか１項に記載の化合物、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項２〜31のいずれか１項に記載の化合物を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
X, Y及びZの少なくとも１つが、−OHである請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
X、Y及びZの個々が、−OHである請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
Y及びZの少なくとも１つが、−OHであり、そしてXが、下記式；
【化４９】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３７】
Xが、下記式：
【化５０】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３８】
Xが、下記式：
【化５１】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３９】
Xが、下記式：
【化５２】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４０】
R1が、-NHC(O)NH2である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４１】
前記リンカーが、(CH2CH2O)nであり、ここでｎは、１〜10の整数である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４２】
前記ラベルが、ビオチン、ビオチン誘導体又は蛍光団である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４３】
前記蛍光団が、フルオレセイン、テトラクロロフルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、非もしくは弱蛍光化合物、Cy3、テトラメチルローダミン、Cy3.5、カルボキシ−x−ローダミン、テキサスレッド、Cy5、Cy5.5、フィコエリスリン又はアロフィコシアニンである請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４４】
前記ラベルが、下記式：
【化５３】
である請求項33記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４５】
試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと、請求項32〜44のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含んで成る組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項４６】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の3’末端で結合される請求項45記載の方法。
【請求項４７】
前記化合物が、前記オリゴヌクレオチド又は核酸の5’末端で結合される請求項45記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物が前記オリゴヌクレオチド又は核酸から除去されるよう、前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階をさらに含んで成る請求項45記載の方法。
【請求項４９】
前記オリゴヌクレオチドプローブを消化する段階が、ポリメラーゼ酵素の5’→3’エキソヌクレアーゼ活性によりもたらされる請求項45記載の方法。
【請求項５０】
標的核酸へのハイブリダイゼーションに基づいて消化される、レポーターラベル及び消光剤ラベルの両者を包含する二重ラベルされたプローブを含んで成り、ここで前記消化により、プローブから１つの又は両ラベルが開放される請求項45記載の方法。
【請求項５１】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項32〜44のいずれか１項に記載の化合物を含んで成り；
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する、ことを特徴とする方法。
【請求項５２】
下記の工程：
（ａ）前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
（ｂ）前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
（ｃ）検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定する；
ことをさらに含んで成る請求項51記載の方法であって、
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いリボヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項５３】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は請求項35記載の化合物及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項５４】
ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法であって、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、請求項３記載の化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを検出することを含んで成る方法。
【請求項５５】
請求項32記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びDNAポリメラーゼを含んで成る即時PCRアッセイのためのキット。
【請求項５６】
請求項32記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びRNアーゼを含まない水を含んで成るRNアーゼ検出アッセイのためのキット。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式I：
【化１】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化２】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル, CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項２】
下記式II：
【化３】
[式中、塩基は、下記式：
【化４】
で表され、
糖は、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2,-OH,-O(アルキル), アルキル, 又は C02Hであり、
R2は、−H又はアルキルであり；
X, Y及びZの個々は独立して、H,-OH,-0-アルキル,-SH,-SR4, -NHR4, -NR4R5、下記式：
【化５】
であり；
R3は、−H又は金属であり；
R4は、−H又はアルキルであり；
R5は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；
Qは、O, S又はNHであり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項３】
下記式III ：
【化６】
[式中、X, Y及びZの個々は独立して、-H,-OH,-O(アルキル), - SH,-SR4,-NHR4,-NR4R5、下記式：
【化７】
であり、ここでR3は−H又は金属であり；R4は−H又はアルキルであり；そしてR5は−H又はアルキルである]
で表される、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物。
【請求項４】
下記式IV：
【化８】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化９】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される請求項３記載の化合物。
【請求項５】
下記式VI：
【化１０】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１１】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項６】
下記式IX：
【化１２】
[式中、X、Y及びZは独立して、H、OH、下記式：
【化１３】
であり、ここでR3はH又は金属である]
で表される化合物。
【請求項７】
下記式XXI：
【化１４】
[式中、糖は、リボース、デオキシリボース、又はリボース糖類似体であり；
塩基は、下記式：
【化１５】
で表され；
糖が、塩基のN1に共有結合され；
R1は、-NHC(O)NH2, -H,-NH2, -OH, -O(アルキル), アルキル,又は CO2Hであり；
R2は、−H又はアルキルであり；
リンカーは、(CH2CH2O)n, (CH2O)n, 又は (CH2)nであり；
ｎは、１〜30の整数であり；そして
ラベルは、比色化合物、化学発光化合物、生物発光化合物、蛍光化合物、非−もしくは弱−蛍光化合物、又は消光剤である]
で表される、又は請求項２〜６のいずれか１項に記載の化合物、単独での又はそのカウンターイオンと組合しての化合物、又はその安定塩、溶媒化合物、包接化合物又は混合物、を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項２〜６のいずれか１項に記載の化合物を含んで成るオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
試験サンプルにおける標的核酸の存在又は不在を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと、請求項７又は８に記載のオリゴヌクレオチドを含んで成る組成物とを接触せしめることを含んで成る方法。
【請求項１０】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
（ａ）前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は、
i. 一本鎖領域を含んで成る切断ドメイン；前記一本鎖領域はアデノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、シトシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、グアノシン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖、及びウリジン残基のすぐ3’側の少なくとも１つのヌクレオチド間連鎖を含んで成り、そして前記切断ドメインがデオキシリボヌクレオチド切断可能ヌクレオチド間連鎖を含まず；及び
ii. 前記ヌクレオチド間連鎖の一方側上での請求項７又は８に記載の化合物を含んで成り；
（ｂ）前記試験反応混合物を、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；そして
（ｃ）検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り、ここで前記反応混合物からの検出できるシグナルの放出が、前記サンプルがリボヌクレアーゼ活性を含むことを示唆する、ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
試験サンプルにおけるリボヌクレアーゼ活性を検出するための方法であって、
前記試験サンプルと基質とを接触し、それにより、試験反応混合物を創造し、ここで前記基質は請求項７記載の化合物及び消光剤を含んで成る核酸分子を含んで成り；
前記試験反応混合物を、前記消光剤から前記検出できるラベルを分離するために、前記サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記試験反応混合物から放されるかどうかを決定することを含んで成り；
前記基質と対照サンプルとを接触せしめ、前記対照サンプルは、予定された量のリボヌクレアーゼを含んで成り、それにより、対照反応混合物を創造し；
前記対照反応混合物を、前記対照サンプルにおけるリボヌクレアーゼによる基質の切断のために十分な時間インキュベートし；
検出できるシグナルが、前記対照反応混合物から放たれるかを決定することを含んで成り；
ここで前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における高いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも高いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるよりも前記試験反応混合物における低いシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルにおけるよりも低いエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示し、そして前記対照反応混合物におけるシグナル検出に等しい前記試験反応混合物におけるシグナルの検出が、前記試験サンプルが前記対照サンプルに存在するのと同じ量のエンドヌクレアーゼ活性を含むことを示唆することを特徴づける方法。
【請求項１２】
ラベルされたポリヌクレオチドの製造方法であって、
（ａ）3’ヒドロキシル末端を得るために、二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドと末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼとを接触せしめ；
（ｂ）ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを得るために、前記二本鎖又は一本鎖ヌクレオチドの3’ヒドロキシ末端への前記化合物の結合のために適切な条件下で、請求項１記載の化合物と接触せしめ；そして
（ｃ）前記ビオチンラベルされたポリヌクレオチドを検出することを含んで成る方法。
【請求項１３】
請求項７記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びDNAポリメラーゼを含んで成る即時PCRアッセイのためのキット。
【請求項１４】
請求項７記載の化合物、負又は正の対照、緩衝液、及びRNアーゼを含まない水を含んで成るRNアーゼ検出アッセイのためのキット。
【公表番号】特表２００６−５１０６２３（Ｐ２００６−５１０６２３Ａ）
【公表日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００４−５５４４０６（Ｐ２００４−５５４４０６）
【出願日】平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１３０１４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８３９７
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１８年３月３０日（２００６．３．３０）
【国際特許分類】
【出願日】平成１５年１１月２０日（２００３．１１．２０）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２００３／０１３０１４
【国際公開番号】ＷＯ２００４／０４８３９７
【国際公開日】平成１６年６月１０日（２００４．６．１０）
【出願人】（５９１００３０１３）エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー (1,754)
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ−ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
【Ｆターム（参考）】
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