溶媒組成物
【課題】機能を長期に安定して維持する
【解決手段】酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含んでいる。耐熱性スーパーオキシドディスムターゼによって酸素ラジカルを除去することができ、酸化的変質を受けうる物質が酸化することを防止する。
【解決手段】酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含んでいる。耐熱性スーパーオキシドディスムターゼによって酸素ラジカルを除去することができ、酸化的変質を受けうる物質が酸化することを防止する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内燃機関等に使用される潤滑剤や、燃料電池等に使用される冷媒として使用できる溶媒組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、自動車等の内燃機関や、自動変速機、緩衝器、パワーステアリング等の駆動系機器や、ギア等にはその作動を円滑にするために潤滑油が用いられている。また、ブレーキ装置等にはブレーキフルードが充填されている。また、燃料電池を搭載した車両においては、燃料電池を冷却するための溶液状の冷媒が用いられることも考えられる。また、冷却装置であるラジエーターにはロングライフクーラント（LLC）等のクーラントが充填されている。
【０００３】
このように、自動車等の内燃機関においては、様々な構成部品に溶媒組成物が用いられている。これら潤滑剤やフルード類に代表される溶媒組成物の劣化を防止するために、従来、酸化防止のフェノール系やアミン系等の添加剤を添加することが知られている（特許文献１参照）。すなわち、これら添加剤は、溶媒組成物中に生じる劣化物と反応することでその酸化を防止している。また、添加剤と劣化物との反応産物を溶媒組成物中に分散させるため、従来、清浄剤や分散剤を添加している。
【０００４】
より具体的に、溶媒組成物中に生じる酸素ラジカルによって潤滑油基油等が酸化されることで不溶解性のスラッジが生成し、これが大きな障害をもたらすことが指摘されていた。特許文献１には、スラッジの発生量を低減するように、酸化防止剤としてフェノール系やアミン系等の添加剤を使用していた。しかしながら、特許文献１に開示された技術であっても、酸化防止剤は反応と共に減少し、いずれは酸化防止効果が喪失してしまう。また、特許文献１に開示された技術であっても、スラッジの発生を完全に抑えることはできず、スラッジによる機能低下は避けられない。従って、従来の技術においては、潤滑油等の溶媒組成物の機能劣化を長期間にわたって抑制する有効な手段は知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１７９２７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、機能を長期に安定して維持することができる溶媒組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
すなわち、本発明にかかる溶媒組成物は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含んでいる。本発明にかかる溶媒組成物においては、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼによって酸素ラジカルを除去することができ、酸化的変質を受けうる物質が酸化することを防止することができる。
【０００８】
特に、本発明にかかる溶媒組成物においては、耐熱性分子シャペロンを更に含むことが好ましい。耐熱性分子シャペロンは、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを安定化することができ、酸素ラジカルを除去するといった耐熱性スーパーオキシドディスムターゼ活性を高温状態で長期間維持することができる。
【０００９】
本発明において、上記酸化的変質を受けうる物質としては潤滑剤成分や冷媒成分を挙げることができる。換言すると、本発明にかかる溶媒組成物は潤滑剤や冷媒として使用することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、酸化的変質を受けうる物質を含有する溶媒組成物において、当該物質の酸化的変質を長期間防止することが可能となる。これにより、本発明にかかる溶媒組成物は、その機能を低減することなく、例えば高温条件下で長期間にわたって使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質を含み、特定の用途に使用される溶媒組成物に広く適用される。ここで、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質としては、例えば、鉱油等の潤滑油基油成分、マイクロエマルジョン等の水系潤滑剤成分、エチレングリコール等の冷媒成分、等を挙げることができる。また、これら物質以外にも、リン酸エステル、シリコーン油、水-グリコール混合物といった物質を挙げることができる。これら各物質は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けることによって、潤滑油基油としての機能、水系潤滑剤としての機能、冷媒成分としての機能が毀損されることとなる。
【００１２】
また、本発明にかかる溶媒組成物の用途は、上述した物質が有する機能に依存することとなる。すなわち、上記物質として鉱油等の潤滑油基油成分を使用する場合には潤滑油として使用され、上記物質としてエチレングリコール等の冷媒成分を使用する場合には冷媒として使用され、上記物質としてマイクロエマルジョン等の水系潤滑剤を使用する場合には水系潤滑剤として使用される。
【００１３】
本発明にかかる溶媒組成物は、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼ（以下、耐熱性SODと略称する）を含み、当該耐熱性SODによって酸素ラジカルの蓄積が防止されている。耐熱性SODとは、高温条件下で酸素ラジカルを過酸化水素に変化させる活性を有する酵素を意味する。ここで高温条件下とは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃を意味する。したがって、耐熱性SODとは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃の条件下で上記活性を有する酵素を意味する。
【００１４】
耐熱性SODは、公知の耐熱性微生物から単離・精製することができるし、当該耐熱性微生物から耐熱性SODをコードする遺伝子（耐熱性SOD遺伝子と称する）を単離し、単離した耐熱性SOD遺伝子を用いて生成することもできる。例えば、耐熱性微生物として、Bacillus属及びThermus thermophilis、Aeropyrum pernixを挙げることができる。より具体的には、Thermus thermophilis HD8株を使用して耐熱性SOD及び耐熱性SOD遺伝子を単離することができる。
【００１５】
Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性SODは、８５℃、５０分の熱処理ではほぼ１００％、また９０℃、５０分の熱処理でも活性を９０％以上維持することができる。このように、Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性SODは、熱安定性に大変優れているため、高温条件化においても酸素ラジカルを効率的に除去することができる。また、Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性SODは、分子構造が安定であることから有機溶媒にも耐性であり、一般的に酵素が失活しやすい有機溶媒中あるいは有機溶媒水溶液中においも使用することができる。
【００１６】
一例として、本発明にかかる溶媒組成物に使用できる耐熱性SODとして、Thermus thermophilis HD8株由来の耐熱性SODのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、配列番号２に示す耐熱性SODをコードする耐熱性SOD遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。なお、本発明にかかる溶媒組成物は、Thermus thermophilis HD8株由来の耐熱性SODに限定されず、他の耐熱性微生物由来の耐熱性SODを使用することもできる。例えば、Aeropyrum pernix由来の耐熱性SODやBacillus属由来の耐熱性SODを挙げることができる。Aeropyrum pernix由来の耐熱性SODをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、当該耐熱性SODのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１７】
このように、本発明にかかる溶媒組成物において使用可能な耐熱性SODのアミノ酸配列を具体的に示したが、これらのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、高温条件下で酸素ラジカルを過酸化水素に変化させる活性を有するタンパク質であれば耐熱性SODとして使用可能である。ここで、数個のアミノ酸残基としては、２〜５０残基、好ましくは２〜２０残基、より好ましくは２〜１０残基を意味する。特に、欠失、置換、付加又は挿入することができるアミノ酸残基としては、耐熱性を付与する立体構造を規定する領域及び酸素ラジカルを過酸化水素に変化させる活性に関与する領域を除く領域を構成するアミノ酸残基を挙げることができる。
【００１８】
１又は数個のアミノ酸残基を欠失、置換、付加又は挿入する手法としては、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Joseph Sambrook 及びDavid W. Russell (著)）等に記載された方法を適宜改変して使用することができる。
【００１９】
上述した耐熱性SODは、溶液中に限らず、樹脂、金属又はプラスチック素材からなる担体へ固定化されてもよい。耐熱性SODを固定化する方法としては、特に限定されないが、例えば、「J. Biochem. Biophys. Methods 55, 67-70, 2003（M. Wilchek及びT. Miron（著))」、「Biotechnolgy and Bioengineering, 82, 86-92, 2003（S. Piletsky、E. Piletska、A. Bossi、N. Turner及びA. Turner(著))及び「Biomaterials, 26, 4944-4947, 2005(T. Haruyama、T. Sakai及びK. Matsuno(著))」に挙げられた方法を採用することができる。固定化された耐熱性SOD（固定化耐熱性SODと称する）を使用する場合、酸素ラジカルにより酸化的変質を受けうる物質を含む溶液を固定化耐熱性SODに接触させることで、当該溶液に含まれる酸素ラジカルを除去することができる。
【００２０】
また、本発明にかかる溶媒組成物は、耐熱性分子シャペロンを含むことが望ましい。耐熱性分子シャペロンとは、高温条件下において他のタンパク質の高次構造形成を助力する機能を有する一群のタンパク質を意味する。本発明にかかる溶媒組成物においては、特に、耐熱性分子シャペロンの中でも、高温条件下でタンパク質のフォールディングを補助する耐熱性シャペロニンを使用することが望ましい。ここで高温条件下とは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃を意味する。したがって、耐熱性分子シャペロンとは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃の条件下で上記機能を有するタンパク質を意味する。
【００２１】
本発明にかかる溶媒組成物において耐熱性分子シャペロンを含ませることによって、上述した耐熱性SODの耐熱性をより向上させることができる。すなわち、上述した耐熱性SODの熱安定性を向上させることができる。耐熱性分子シャペロンは、公知の耐熱性微生物から単離・精製することができるし、当該耐熱性微生物から耐熱性分子シャペロンをコードする遺伝子（耐熱性分子シャペロン遺伝子と称する）を単離し、単離した耐熱性分子シャペロン遺伝子を用いて生成することもできる。例えば、耐熱性微生物として好熱性細菌を使用することができる。好熱性細菌としては、例えば、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、Methanococcus jannaschii及びThermoplasma acidophilumを挙げることができる。より具体的には、Pyrococcus furiosusを使用して耐熱性分子シャペロン及び耐熱性分子シャペロン遺伝子を単離することができる。
【００２２】
一例として、本発明にかかる溶媒組成物に使用できる耐熱性分子シャペロンとして、Pyrococcus furiosus由来の耐熱性分子シャペロンであるシャペロニンのアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、配列番号６に示すシャペロニンをコードする耐熱性分子シャペロニン遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。Pyrococcus furiosus由来のシャペロニンは、Bacillus属由来の耐熱性SODと共存した溶液中で８０℃、５０分間の処理を行っても、当該耐熱性SODの活性を最大４０％安定化するといった効果を示す。さらに、Thermus属由来のリンゴ酸脱水素酵素と共存した１５〜２５％エチレングリコール中で８０℃、６０分間の処理を行っても、当該リンゴ酸脱水素酵素の活性を１５〜３０％安定化するといった効果を示す。
【００２３】
なお、本発明にかかる溶媒組成物は、Pyrococcus furiosus由来の耐熱性シャペロニンに限定されず、他の耐熱性微生物由来の耐熱性シャペロニンを使用することもできる。例えば、Pyrococcus horikoshii及びMethanococcus jannaschii、Thermoplasma acidophilum由来の耐熱性シャペロニンを挙げることができる(以下の文献を参照：K. Hongo, H. Hirai, C. Uemura, S. Ono, J. Tsunemi, T. Higurashi, T. Mizobata, Y. Kawata, FEBS Letters, 580, 34-40, 2006)。Pyrococcus horikoshii由来の耐熱性分子シャペロンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７に示し、当該耐熱性分子シャペロンのアミノ酸配列を配列番号８に示す。Methanococcus jannaschii由来の耐熱性分子シャペロンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号９に示し、当該耐熱性分子シャペロンのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００２４】
このように、本発明にかかる溶媒組成物において使用可能な耐熱性分子シャペロンのアミノ酸配列を具体的に示したが、これらのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、高温条件下で分子シャペロンとして機能するタンパク質であれば耐熱性分子シャペロンとして使用可能である。ここで、数個のアミノ酸残基としては、２〜５０残基、好ましくは２〜２０残基、より好ましくは２〜１０残基を意味する。特に、欠失、置換、付加又は挿入することができるアミノ酸残基としては、耐熱性を付与する立体構造を規定する領域及び分子シャペロン活性に関与する領域を除く領域を構成するアミノ酸残基を挙げることができる。１又は数個のアミノ酸残基を欠失、置換、付加又は挿入する手法としては、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Joseph Sambrook 及びDavid W. Russell (著)）等に記載された方法を適宜改変して使用することができる。
【００２５】
また、本発明にかかる溶媒組成物は、有機溶媒系、有機溶媒水溶液系、水系のいずれの態様でもよい。さらに、本発明にかかる溶媒組成物は、用途に応じて種々の添加物を含むことができる。例えば、本発明にかかる溶媒組成物は、基油、防錆剤、界面活性剤、防腐剤、消泡剤、及びその他の添加剤（例えば、極圧添加剤、防食剤、粘度指数向上剤、酸化防止剤、清浄分散剤、着色剤、香料等）を適宜配合して使用できる。上記基油としては、鉱油、例えば、マシン油、タービン油、スピンドル油、シリンダー油等を挙げることができる。
【００２６】
一方、本発明にかかる溶媒組成物において耐熱性SODは、0.002%（重量比）、好ましくは0.1%（重量比）添加することが望ましい。また、本発明にかかる溶媒組成物において耐熱性分子シャペロンは、使用する耐熱性SOD酵素のサブユニットモル数と同量、好ましくは数倍量、より好ましくは数十倍量（例えば４０倍）添加することが望ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
１．耐熱性SOD酵素のクローニング
Thermus thermophilus HB8株のゲノムDNAを以下のようにして調製した。
【００２９】
培養したThermus thermophilus HB8菌体およそ0.1 gを0.1 M NaCl及び1 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）、3 mlに懸濁し、終濃度が0.3 mg/mlになるようにリゾチームを加えて37℃で60分間反応させた。その後、終濃度１%になるようにSDSを加え、さらに60℃で10分間インキュベートした。次に、終濃度50μg/mlのRNaseAとプロテイナーゼKを加え、37℃で一晩インキュベートした後、フェノール抽出を２回、イソアミル-クロルフォルム抽出を１回行った。その後、エタノール沈殿を行い、回収されたゲノムDNAを1 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）に溶解させ、-30℃で保存した。
【００３０】
次にThermus thermophilus HB8株のゲノムDNAを鋳型として、5’上流側プライマーにAGGTGACATATGCCGTACCCGTTCAA（T-HB8Nde+）（配列番号１１）を、3’下流側プライマーにCTGAATTCTATGGGGATCAGGCCTTC（T-HB8EcoRI-）（配列番号１２）を用いたPCR法によって、耐熱性SOD遺伝子を含むDNA断片を増幅した。耐熱性SODを含むDNA断片を発現プラスミドpET23a(+)のNdeI-EcoRIサイトに導入することで、耐熱性SOD遺伝子をクローニングした。得られた発現プラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODを大量に発現する系を確立した。
【００３１】
２．大量培養と酵素精製
上記１．で調製した大量発現系である大腸菌をそれぞれ３７℃、１２時間LB培地で振とう培養した。その結果、菌体は約3g/L得られ、各系において耐熱性SODは良好に発現したことを確認した。各系において発現した耐熱性SODは、共に以下の方法によって精製した。
【００３２】
すなわち、先ず、菌体を破砕緩衝液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM 2-メルカプトエタノール及び0.1 mM EDTAからなる組成）に懸濁し、その後、超音波破砕を行った。次に、遠心後、上澄み溶液（粗抽出液）を８０℃、２０分間熱処理し、熱に弱い大腸菌由来のタンパク質を失活・沈殿化した。耐熱性SODは熱に安定であるので、この操作によって非常に効率よく精製された。最終的には、熱処理後の上澄み液をQセファロース陰イオン交換カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、0 - 1 M NaClで溶出させて完全精製することができた。本酵素は活性部位にMnを結合して活性を示すMn-SODであるので、精製後の酵素を0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5)に1 mg/ml SODとなるように調製した後、70℃、30分間熱処理することで活性化を行った。
【００３３】
３．活性測定
上記２．で精製された耐熱性SODの酵素活性は、キサンチン-キサンチンオキシダーゼから発生させた酸素ラジカルによる水溶性テトラゾリウム塩（WST）の酸化を指標として測定した。すなわち、酸素ラジカルによる酸化基質にWSTを用い、耐熱性SODの有無でどれだけ水溶性テトラゾリウムフォルマザンの生成が抑えられるかを指標にして測定した（以下の文献を参照：H. Ueda, D. Kawana, S. Maeda, M. Sawamura, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 485-488,1999）。WSTが酸化されて水溶性テトラゾリウムフォルマザンになると、450 nmに紫外吸収が生じるので、これを測定することで酸素ラジカルによる酸化反応を簡便に測定できる。活性測定緩衝液には0.17 mM キサンチンと0.11 mM EDTAを含む35 mM 炭酸ナトリウム(pH 10.2)を使用した。酸化基質としては0.24 mMのWSTを用いた。耐熱性SODは、0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5 各温度で調整済)に1 mg/ml SODになるように溶かして使用した。
【００３４】
この活性測定系では，酸化基質であるWSTが酸素ラジカルで酸化されうる物質、すなわち機能性物質としてのモデル化合物と見なすことができる。この基質WSTの酸化を耐熱性SODが防ぐ働きをする。
【００３５】
４．至適温度と熱安定性の評価
Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODについて、上記３．に記載した活性測定を２５℃から８５℃までの温度範囲で測定した。結果を図１に示す。図１から判るように、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODは、７５℃以上で最大活性を持ち、５５℃でもおよそ最大活性の５０％の活性を発揮することが分かった。
【００３６】
また、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SOD について、0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5 )に1 mg/ml SOD酵素になるように調製した標品を９０℃と１００℃に保って熱失活の程度を調べた。結果を図２に示す。図２から判るように、９０℃、５０分間処理では９５％、１００℃、５０分間の処理でも７０％の活性を保持していた。なお、図２には示していないが、８５℃、５０分間熱処理ではほぼ１００％の活性が保持された。
【００３７】
これら図１及び２に示した結果から、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODは幅広い温度域で活性を有し、特に高熱に強いことが明らかになった。
【００３８】
５．耐熱性シャペロニンによる耐熱性SODの安定化効果
上記１．で記述した同様な方法を用いて調製したPyrococcus furiosusのゲノムDNAを鋳型として、5’上流側プライマーにGTCTGTACATATGGCCCAGTTAGCAGGCCAA(Pfu-cpnNde+)（配列番号１３）を、3’下流側プライマーにGAACGGATCCTTAGTCCAGATCACTGCTGAAGTCCT(Pfu-cpnBam-)（配列番号１４）を用いたPCR法によって、耐熱性シャペロニン遺伝子(Pfu-cpn)を含むDNA断片を増幅した。また、得られたDNA断片を発現プラスミドpET23a(+)のNdeI-BamHIサイトに導入し、これを用いて、上記１．と同様にして、大腸菌による大量発現系を確立した。大量発現した耐熱性シャペロニンは、次のようにして精製した。菌体を破砕緩衝液（25 mM HEPES-KOH（pH 7.6）、50 mM KCl及び1 mM フッ化フェニルメタンスルフォニルからなる組成）に懸濁し、その後、氷中で超音波破砕を行った。次に、遠心後、上澄み溶液（粗抽出液）を８０℃、３０分間熱処理し、熱に弱い大腸菌由来のタンパク質を失活・沈殿化した。最後に、熱処理後の上澄み液をリソースQ陰イオン交換カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、0 - 0.5 M KClで溶出させて精製することができた(以下の文献を参照：K. Hongo, H. Hirai, C. Uemura, S. Ono, J. Tsunemi, T. Higurashi, T. Mizobata, Y. Kawata, FEBS Letters, 580, 34-40, 2006)。
【００３９】
また、本実験では、得られた耐熱性シャペロニンの中等度（60℃）耐熱性酵素SODの安定化効果を検証するため、Bacillus由来の中等度耐熱性SODを調製した。Bacillus由来の中等度耐熱性SODは和光純薬から凍結乾燥粉末を購入したものをそのまま使用した。
【００４０】
50mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.0)にBacillus由来のSOD を1 mg/mlの濃度に調製し、８０℃の熱処理を行い、適時残存活性を調べ、耐熱性シャペロニンの有無による残存活性の相違を検証した。結果を図３に示す。図３に示すように、耐熱性シャペロニンを含まない緩衝液で処理した場合には１０分後にはほぼ１０％の残存活性に低下した。これに対して、耐熱性シャペロニンを0.5 mM 塩化マンガン存在下でSOD酵素のモル比で８０倍等量加えると、１０分後で残存活性が６０％、５０分後でも残存活性が４０％観測された。この結果から、耐熱性シャペロニンはSODの熱失活を抑制することが明らかになった。
【００４１】
６．有機溶媒含有水溶液中での耐熱性シャペロニンの活性発現
一般的に酵素は有機溶媒中では不安定になることが多い。燃料電池の冷媒として使用されるエチレングリコール(EG)-水系での使用環境を考慮して、有機溶媒中における耐熱性シャペロニン(Pfu-cpn)の酵素の安定化効果を検証した。
【００４２】
本実験では、有機溶媒としてEG濃度が１５％、２３％或いは２５％であるようなEG-水系を調製した。また、本実験では、安定化対象の酵素としてThermus属由来の耐熱性リンゴ酸脱水素酵素を使用した。耐熱性リンゴ酸脱水素酵素は天野製薬から購入し、10 mM 酢酸マグネシウム及び10 mM KClを含む50 mM MOPS-KOH (pH 7.4)の緩衝液に溶解した後、セントリコンC-100（10万分子量カット：アミコン社製）を用いて混入しているデキストランを除去して用いた。このリンゴ酸脱水素酵素は54 kDa（27kDa x 2量体）の質量であるので、この操作で濾過液に濾過され、高分子量であるデキストランと分離することができた。
【００４３】
調製した耐熱性リンゴ酸脱水素酵素（0.2 mg/ml）をEG各濃度の有機溶媒に添加し、８０℃の熱処理を行い、適時残存活性を測定し、耐熱性シャペロニンの有無による残存活性の相違を検証した。なお、耐熱性リンゴ酸脱水素酵素の活性は以下のようにして測定した。
【００４４】
2.9 mlの反応緩衝液（100 mM Tris-HCl（pH 7.8）、10 mM 酢酸マグネシウム及び270 μM βNADH、0.5 mMオキサロ酢酸からなる組成）に測定サンプル溶液を0.1 ml加えて、25℃で340 nmの吸光度の減少の度合いによって活性測定を行った。
【００４５】
結果を図４に示す。図４から判るように、EG濃度が１５％、２３％及び２５％と増加するにつれて、８０℃での耐熱性リンゴ酸脱水素酵素は不安定化し、残存活性は例えば２５％EG中では３０分後には２５％となった。しかし、耐熱性シャペロニンを４０モル倍等量存在させておくと、３０分後の残存活性は５５％に改善された。この結果は、耐熱性シャペロニンの酵素の安定化効果は、エチレングリコール含有水溶液中でも働くことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODの至適温度を検討した結果を示す特性図である。
【図２】Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODの熱安定性を検討した結果を示す特性図である。
【図３】耐熱性シャペロニンによる酵素保護効果を検討した結果を示す特性図である。
【図４】耐熱性シャペロニンによる酵素保護効果をエチレングリコール含有水溶液中で検討した結果を示す特性図である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、内燃機関等に使用される潤滑剤や、燃料電池等に使用される冷媒として使用できる溶媒組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、自動車等の内燃機関や、自動変速機、緩衝器、パワーステアリング等の駆動系機器や、ギア等にはその作動を円滑にするために潤滑油が用いられている。また、ブレーキ装置等にはブレーキフルードが充填されている。また、燃料電池を搭載した車両においては、燃料電池を冷却するための溶液状の冷媒が用いられることも考えられる。また、冷却装置であるラジエーターにはロングライフクーラント（LLC）等のクーラントが充填されている。
【０００３】
このように、自動車等の内燃機関においては、様々な構成部品に溶媒組成物が用いられている。これら潤滑剤やフルード類に代表される溶媒組成物の劣化を防止するために、従来、酸化防止のフェノール系やアミン系等の添加剤を添加することが知られている（特許文献１参照）。すなわち、これら添加剤は、溶媒組成物中に生じる劣化物と反応することでその酸化を防止している。また、添加剤と劣化物との反応産物を溶媒組成物中に分散させるため、従来、清浄剤や分散剤を添加している。
【０００４】
より具体的に、溶媒組成物中に生じる酸素ラジカルによって潤滑油基油等が酸化されることで不溶解性のスラッジが生成し、これが大きな障害をもたらすことが指摘されていた。特許文献１には、スラッジの発生量を低減するように、酸化防止剤としてフェノール系やアミン系等の添加剤を使用していた。しかしながら、特許文献１に開示された技術であっても、酸化防止剤は反応と共に減少し、いずれは酸化防止効果が喪失してしまう。また、特許文献１に開示された技術であっても、スラッジの発生を完全に抑えることはできず、スラッジによる機能低下は避けられない。従って、従来の技術においては、潤滑油等の溶媒組成物の機能劣化を長期間にわたって抑制する有効な手段は知られていなかった。
【０００５】
【特許文献１】特開平５−１７９２７５号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
そこで、本発明は、機能を長期に安定して維持することができる溶媒組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
すなわち、本発明にかかる溶媒組成物は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含んでいる。本発明にかかる溶媒組成物においては、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼによって酸素ラジカルを除去することができ、酸化的変質を受けうる物質が酸化することを防止することができる。
【０００８】
特に、本発明にかかる溶媒組成物においては、耐熱性分子シャペロンを更に含むことが好ましい。耐熱性分子シャペロンは、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを安定化することができ、酸素ラジカルを除去するといった耐熱性スーパーオキシドディスムターゼ活性を高温状態で長期間維持することができる。
【０００９】
本発明において、上記酸化的変質を受けうる物質としては潤滑剤成分や冷媒成分を挙げることができる。換言すると、本発明にかかる溶媒組成物は潤滑剤や冷媒として使用することができる。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、酸化的変質を受けうる物質を含有する溶媒組成物において、当該物質の酸化的変質を長期間防止することが可能となる。これにより、本発明にかかる溶媒組成物は、その機能を低減することなく、例えば高温条件下で長期間にわたって使用することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質を含み、特定の用途に使用される溶媒組成物に広く適用される。ここで、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質としては、例えば、鉱油等の潤滑油基油成分、マイクロエマルジョン等の水系潤滑剤成分、エチレングリコール等の冷媒成分、等を挙げることができる。また、これら物質以外にも、リン酸エステル、シリコーン油、水-グリコール混合物といった物質を挙げることができる。これら各物質は、酸素ラジカルによる酸化的変質を受けることによって、潤滑油基油としての機能、水系潤滑剤としての機能、冷媒成分としての機能が毀損されることとなる。
【００１２】
また、本発明にかかる溶媒組成物の用途は、上述した物質が有する機能に依存することとなる。すなわち、上記物質として鉱油等の潤滑油基油成分を使用する場合には潤滑油として使用され、上記物質としてエチレングリコール等の冷媒成分を使用する場合には冷媒として使用され、上記物質としてマイクロエマルジョン等の水系潤滑剤を使用する場合には水系潤滑剤として使用される。
【００１３】
本発明にかかる溶媒組成物は、耐熱性スーパーオキシドディスムターゼ（以下、耐熱性SODと略称する）を含み、当該耐熱性SODによって酸素ラジカルの蓄積が防止されている。耐熱性SODとは、高温条件下で酸素ラジカルを過酸化水素に変化させる活性を有する酵素を意味する。ここで高温条件下とは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃を意味する。したがって、耐熱性SODとは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃の条件下で上記活性を有する酵素を意味する。
【００１４】
耐熱性SODは、公知の耐熱性微生物から単離・精製することができるし、当該耐熱性微生物から耐熱性SODをコードする遺伝子（耐熱性SOD遺伝子と称する）を単離し、単離した耐熱性SOD遺伝子を用いて生成することもできる。例えば、耐熱性微生物として、Bacillus属及びThermus thermophilis、Aeropyrum pernixを挙げることができる。より具体的には、Thermus thermophilis HD8株を使用して耐熱性SOD及び耐熱性SOD遺伝子を単離することができる。
【００１５】
Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性SODは、８５℃、５０分の熱処理ではほぼ１００％、また９０℃、５０分の熱処理でも活性を９０％以上維持することができる。このように、Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性SODは、熱安定性に大変優れているため、高温条件化においても酸素ラジカルを効率的に除去することができる。また、Thermus thermophilus HB8由来の耐熱性SODは、分子構造が安定であることから有機溶媒にも耐性であり、一般的に酵素が失活しやすい有機溶媒中あるいは有機溶媒水溶液中においも使用することができる。
【００１６】
一例として、本発明にかかる溶媒組成物に使用できる耐熱性SODとして、Thermus thermophilis HD8株由来の耐熱性SODのアミノ酸配列を配列番号２に示す。また、配列番号２に示す耐熱性SODをコードする耐熱性SOD遺伝子の塩基配列を配列番号１に示す。なお、本発明にかかる溶媒組成物は、Thermus thermophilis HD8株由来の耐熱性SODに限定されず、他の耐熱性微生物由来の耐熱性SODを使用することもできる。例えば、Aeropyrum pernix由来の耐熱性SODやBacillus属由来の耐熱性SODを挙げることができる。Aeropyrum pernix由来の耐熱性SODをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号３に示し、当該耐熱性SODのアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００１７】
このように、本発明にかかる溶媒組成物において使用可能な耐熱性SODのアミノ酸配列を具体的に示したが、これらのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、高温条件下で酸素ラジカルを過酸化水素に変化させる活性を有するタンパク質であれば耐熱性SODとして使用可能である。ここで、数個のアミノ酸残基としては、２〜５０残基、好ましくは２〜２０残基、より好ましくは２〜１０残基を意味する。特に、欠失、置換、付加又は挿入することができるアミノ酸残基としては、耐熱性を付与する立体構造を規定する領域及び酸素ラジカルを過酸化水素に変化させる活性に関与する領域を除く領域を構成するアミノ酸残基を挙げることができる。
【００１８】
１又は数個のアミノ酸残基を欠失、置換、付加又は挿入する手法としては、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Joseph Sambrook 及びDavid W. Russell (著)）等に記載された方法を適宜改変して使用することができる。
【００１９】
上述した耐熱性SODは、溶液中に限らず、樹脂、金属又はプラスチック素材からなる担体へ固定化されてもよい。耐熱性SODを固定化する方法としては、特に限定されないが、例えば、「J. Biochem. Biophys. Methods 55, 67-70, 2003（M. Wilchek及びT. Miron（著))」、「Biotechnolgy and Bioengineering, 82, 86-92, 2003（S. Piletsky、E. Piletska、A. Bossi、N. Turner及びA. Turner(著))及び「Biomaterials, 26, 4944-4947, 2005(T. Haruyama、T. Sakai及びK. Matsuno(著))」に挙げられた方法を採用することができる。固定化された耐熱性SOD（固定化耐熱性SODと称する）を使用する場合、酸素ラジカルにより酸化的変質を受けうる物質を含む溶液を固定化耐熱性SODに接触させることで、当該溶液に含まれる酸素ラジカルを除去することができる。
【００２０】
また、本発明にかかる溶媒組成物は、耐熱性分子シャペロンを含むことが望ましい。耐熱性分子シャペロンとは、高温条件下において他のタンパク質の高次構造形成を助力する機能を有する一群のタンパク質を意味する。本発明にかかる溶媒組成物においては、特に、耐熱性分子シャペロンの中でも、高温条件下でタンパク質のフォールディングを補助する耐熱性シャペロニンを使用することが望ましい。ここで高温条件下とは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃を意味する。したがって、耐熱性分子シャペロンとは、例えば６０℃、好ましくは８０℃、より好ましくは１００℃の条件下で上記機能を有するタンパク質を意味する。
【００２１】
本発明にかかる溶媒組成物において耐熱性分子シャペロンを含ませることによって、上述した耐熱性SODの耐熱性をより向上させることができる。すなわち、上述した耐熱性SODの熱安定性を向上させることができる。耐熱性分子シャペロンは、公知の耐熱性微生物から単離・精製することができるし、当該耐熱性微生物から耐熱性分子シャペロンをコードする遺伝子（耐熱性分子シャペロン遺伝子と称する）を単離し、単離した耐熱性分子シャペロン遺伝子を用いて生成することもできる。例えば、耐熱性微生物として好熱性細菌を使用することができる。好熱性細菌としては、例えば、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、Methanococcus jannaschii及びThermoplasma acidophilumを挙げることができる。より具体的には、Pyrococcus furiosusを使用して耐熱性分子シャペロン及び耐熱性分子シャペロン遺伝子を単離することができる。
【００２２】
一例として、本発明にかかる溶媒組成物に使用できる耐熱性分子シャペロンとして、Pyrococcus furiosus由来の耐熱性分子シャペロンであるシャペロニンのアミノ酸配列を配列番号６に示す。また、配列番号６に示すシャペロニンをコードする耐熱性分子シャペロニン遺伝子の塩基配列を配列番号５に示す。Pyrococcus furiosus由来のシャペロニンは、Bacillus属由来の耐熱性SODと共存した溶液中で８０℃、５０分間の処理を行っても、当該耐熱性SODの活性を最大４０％安定化するといった効果を示す。さらに、Thermus属由来のリンゴ酸脱水素酵素と共存した１５〜２５％エチレングリコール中で８０℃、６０分間の処理を行っても、当該リンゴ酸脱水素酵素の活性を１５〜３０％安定化するといった効果を示す。
【００２３】
なお、本発明にかかる溶媒組成物は、Pyrococcus furiosus由来の耐熱性シャペロニンに限定されず、他の耐熱性微生物由来の耐熱性シャペロニンを使用することもできる。例えば、Pyrococcus horikoshii及びMethanococcus jannaschii、Thermoplasma acidophilum由来の耐熱性シャペロニンを挙げることができる(以下の文献を参照：K. Hongo, H. Hirai, C. Uemura, S. Ono, J. Tsunemi, T. Higurashi, T. Mizobata, Y. Kawata, FEBS Letters, 580, 34-40, 2006)。Pyrococcus horikoshii由来の耐熱性分子シャペロンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号７に示し、当該耐熱性分子シャペロンのアミノ酸配列を配列番号８に示す。Methanococcus jannaschii由来の耐熱性分子シャペロンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番号９に示し、当該耐熱性分子シャペロンのアミノ酸配列を配列番号１０に示す。
【００２４】
このように、本発明にかかる溶媒組成物において使用可能な耐熱性分子シャペロンのアミノ酸配列を具体的に示したが、これらのアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸残基が欠失、置換、付加又は挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質であっても、高温条件下で分子シャペロンとして機能するタンパク質であれば耐熱性分子シャペロンとして使用可能である。ここで、数個のアミノ酸残基としては、２〜５０残基、好ましくは２〜２０残基、より好ましくは２〜１０残基を意味する。特に、欠失、置換、付加又は挿入することができるアミノ酸残基としては、耐熱性を付与する立体構造を規定する領域及び分子シャペロン活性に関与する領域を除く領域を構成するアミノ酸残基を挙げることができる。１又は数個のアミノ酸残基を欠失、置換、付加又は挿入する手法としては、例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual（Joseph Sambrook 及びDavid W. Russell (著)）等に記載された方法を適宜改変して使用することができる。
【００２５】
また、本発明にかかる溶媒組成物は、有機溶媒系、有機溶媒水溶液系、水系のいずれの態様でもよい。さらに、本発明にかかる溶媒組成物は、用途に応じて種々の添加物を含むことができる。例えば、本発明にかかる溶媒組成物は、基油、防錆剤、界面活性剤、防腐剤、消泡剤、及びその他の添加剤（例えば、極圧添加剤、防食剤、粘度指数向上剤、酸化防止剤、清浄分散剤、着色剤、香料等）を適宜配合して使用できる。上記基油としては、鉱油、例えば、マシン油、タービン油、スピンドル油、シリンダー油等を挙げることができる。
【００２６】
一方、本発明にかかる溶媒組成物において耐熱性SODは、0.002%（重量比）、好ましくは0.1%（重量比）添加することが望ましい。また、本発明にかかる溶媒組成物において耐熱性分子シャペロンは、使用する耐熱性SOD酵素のサブユニットモル数と同量、好ましくは数倍量、より好ましくは数十倍量（例えば４０倍）添加することが望ましい。
【実施例】
【００２７】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。
【００２８】
〔実施例１〕
１．耐熱性SOD酵素のクローニング
Thermus thermophilus HB8株のゲノムDNAを以下のようにして調製した。
【００２９】
培養したThermus thermophilus HB8菌体およそ0.1 gを0.1 M NaCl及び1 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 7.5）、3 mlに懸濁し、終濃度が0.3 mg/mlになるようにリゾチームを加えて37℃で60分間反応させた。その後、終濃度１%になるようにSDSを加え、さらに60℃で10分間インキュベートした。次に、終濃度50μg/mlのRNaseAとプロテイナーゼKを加え、37℃で一晩インキュベートした後、フェノール抽出を２回、イソアミル-クロルフォルム抽出を１回行った。その後、エタノール沈殿を行い、回収されたゲノムDNAを1 mM EDTAを含む10 mM Tris-HCl緩衝液（pH 8.0）に溶解させ、-30℃で保存した。
【００３０】
次にThermus thermophilus HB8株のゲノムDNAを鋳型として、5’上流側プライマーにAGGTGACATATGCCGTACCCGTTCAA（T-HB8Nde+）（配列番号１１）を、3’下流側プライマーにCTGAATTCTATGGGGATCAGGCCTTC（T-HB8EcoRI-）（配列番号１２）を用いたPCR法によって、耐熱性SOD遺伝子を含むDNA断片を増幅した。耐熱性SODを含むDNA断片を発現プラスミドpET23a(+)のNdeI-EcoRIサイトに導入することで、耐熱性SOD遺伝子をクローニングした。得られた発現プラスミドを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODを大量に発現する系を確立した。
【００３１】
２．大量培養と酵素精製
上記１．で調製した大量発現系である大腸菌をそれぞれ３７℃、１２時間LB培地で振とう培養した。その結果、菌体は約3g/L得られ、各系において耐熱性SODは良好に発現したことを確認した。各系において発現した耐熱性SODは、共に以下の方法によって精製した。
【００３２】
すなわち、先ず、菌体を破砕緩衝液（10 mM Tris-HCl（pH 7.5）、10 mM 2-メルカプトエタノール及び0.1 mM EDTAからなる組成）に懸濁し、その後、超音波破砕を行った。次に、遠心後、上澄み溶液（粗抽出液）を８０℃、２０分間熱処理し、熱に弱い大腸菌由来のタンパク質を失活・沈殿化した。耐熱性SODは熱に安定であるので、この操作によって非常に効率よく精製された。最終的には、熱処理後の上澄み液をQセファロース陰イオン交換カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、0 - 1 M NaClで溶出させて完全精製することができた。本酵素は活性部位にMnを結合して活性を示すMn-SODであるので、精製後の酵素を0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5)に1 mg/ml SODとなるように調製した後、70℃、30分間熱処理することで活性化を行った。
【００３３】
３．活性測定
上記２．で精製された耐熱性SODの酵素活性は、キサンチン-キサンチンオキシダーゼから発生させた酸素ラジカルによる水溶性テトラゾリウム塩（WST）の酸化を指標として測定した。すなわち、酸素ラジカルによる酸化基質にWSTを用い、耐熱性SODの有無でどれだけ水溶性テトラゾリウムフォルマザンの生成が抑えられるかを指標にして測定した（以下の文献を参照：H. Ueda, D. Kawana, S. Maeda, M. Sawamura, Biosci. Biotechnol. Biochem., 63, 485-488,1999）。WSTが酸化されて水溶性テトラゾリウムフォルマザンになると、450 nmに紫外吸収が生じるので、これを測定することで酸素ラジカルによる酸化反応を簡便に測定できる。活性測定緩衝液には0.17 mM キサンチンと0.11 mM EDTAを含む35 mM 炭酸ナトリウム(pH 10.2)を使用した。酸化基質としては0.24 mMのWSTを用いた。耐熱性SODは、0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5 各温度で調整済)に1 mg/ml SODになるように溶かして使用した。
【００３４】
この活性測定系では，酸化基質であるWSTが酸素ラジカルで酸化されうる物質、すなわち機能性物質としてのモデル化合物と見なすことができる。この基質WSTの酸化を耐熱性SODが防ぐ働きをする。
【００３５】
４．至適温度と熱安定性の評価
Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODについて、上記３．に記載した活性測定を２５℃から８５℃までの温度範囲で測定した。結果を図１に示す。図１から判るように、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODは、７５℃以上で最大活性を持ち、５５℃でもおよそ最大活性の５０％の活性を発揮することが分かった。
【００３６】
また、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SOD について、0.5 mM 塩化マンガンを含む50 mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.5 )に1 mg/ml SOD酵素になるように調製した標品を９０℃と１００℃に保って熱失活の程度を調べた。結果を図２に示す。図２から判るように、９０℃、５０分間処理では９５％、１００℃、５０分間の処理でも７０％の活性を保持していた。なお、図２には示していないが、８５℃、５０分間熱処理ではほぼ１００％の活性が保持された。
【００３７】
これら図１及び２に示した結果から、Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODは幅広い温度域で活性を有し、特に高熱に強いことが明らかになった。
【００３８】
５．耐熱性シャペロニンによる耐熱性SODの安定化効果
上記１．で記述した同様な方法を用いて調製したPyrococcus furiosusのゲノムDNAを鋳型として、5’上流側プライマーにGTCTGTACATATGGCCCAGTTAGCAGGCCAA(Pfu-cpnNde+)（配列番号１３）を、3’下流側プライマーにGAACGGATCCTTAGTCCAGATCACTGCTGAAGTCCT(Pfu-cpnBam-)（配列番号１４）を用いたPCR法によって、耐熱性シャペロニン遺伝子(Pfu-cpn)を含むDNA断片を増幅した。また、得られたDNA断片を発現プラスミドpET23a(+)のNdeI-BamHIサイトに導入し、これを用いて、上記１．と同様にして、大腸菌による大量発現系を確立した。大量発現した耐熱性シャペロニンは、次のようにして精製した。菌体を破砕緩衝液（25 mM HEPES-KOH（pH 7.6）、50 mM KCl及び1 mM フッ化フェニルメタンスルフォニルからなる組成）に懸濁し、その後、氷中で超音波破砕を行った。次に、遠心後、上澄み溶液（粗抽出液）を８０℃、３０分間熱処理し、熱に弱い大腸菌由来のタンパク質を失活・沈殿化した。最後に、熱処理後の上澄み液をリソースQ陰イオン交換カラム（アマシャムバイオサイエンス社製）にかけ、0 - 0.5 M KClで溶出させて精製することができた(以下の文献を参照：K. Hongo, H. Hirai, C. Uemura, S. Ono, J. Tsunemi, T. Higurashi, T. Mizobata, Y. Kawata, FEBS Letters, 580, 34-40, 2006)。
【００３９】
また、本実験では、得られた耐熱性シャペロニンの中等度（60℃）耐熱性酵素SODの安定化効果を検証するため、Bacillus由来の中等度耐熱性SODを調製した。Bacillus由来の中等度耐熱性SODは和光純薬から凍結乾燥粉末を購入したものをそのまま使用した。
【００４０】
50mM HEPES-KOH緩衝液(pH 7.0)にBacillus由来のSOD を1 mg/mlの濃度に調製し、８０℃の熱処理を行い、適時残存活性を調べ、耐熱性シャペロニンの有無による残存活性の相違を検証した。結果を図３に示す。図３に示すように、耐熱性シャペロニンを含まない緩衝液で処理した場合には１０分後にはほぼ１０％の残存活性に低下した。これに対して、耐熱性シャペロニンを0.5 mM 塩化マンガン存在下でSOD酵素のモル比で８０倍等量加えると、１０分後で残存活性が６０％、５０分後でも残存活性が４０％観測された。この結果から、耐熱性シャペロニンはSODの熱失活を抑制することが明らかになった。
【００４１】
６．有機溶媒含有水溶液中での耐熱性シャペロニンの活性発現
一般的に酵素は有機溶媒中では不安定になることが多い。燃料電池の冷媒として使用されるエチレングリコール(EG)-水系での使用環境を考慮して、有機溶媒中における耐熱性シャペロニン(Pfu-cpn)の酵素の安定化効果を検証した。
【００４２】
本実験では、有機溶媒としてEG濃度が１５％、２３％或いは２５％であるようなEG-水系を調製した。また、本実験では、安定化対象の酵素としてThermus属由来の耐熱性リンゴ酸脱水素酵素を使用した。耐熱性リンゴ酸脱水素酵素は天野製薬から購入し、10 mM 酢酸マグネシウム及び10 mM KClを含む50 mM MOPS-KOH (pH 7.4)の緩衝液に溶解した後、セントリコンC-100（10万分子量カット：アミコン社製）を用いて混入しているデキストランを除去して用いた。このリンゴ酸脱水素酵素は54 kDa（27kDa x 2量体）の質量であるので、この操作で濾過液に濾過され、高分子量であるデキストランと分離することができた。
【００４３】
調製した耐熱性リンゴ酸脱水素酵素（0.2 mg/ml）をEG各濃度の有機溶媒に添加し、８０℃の熱処理を行い、適時残存活性を測定し、耐熱性シャペロニンの有無による残存活性の相違を検証した。なお、耐熱性リンゴ酸脱水素酵素の活性は以下のようにして測定した。
【００４４】
2.9 mlの反応緩衝液（100 mM Tris-HCl（pH 7.8）、10 mM 酢酸マグネシウム及び270 μM βNADH、0.5 mMオキサロ酢酸からなる組成）に測定サンプル溶液を0.1 ml加えて、25℃で340 nmの吸光度の減少の度合いによって活性測定を行った。
【００４５】
結果を図４に示す。図４から判るように、EG濃度が１５％、２３％及び２５％と増加するにつれて、８０℃での耐熱性リンゴ酸脱水素酵素は不安定化し、残存活性は例えば２５％EG中では３０分後には２５％となった。しかし、耐熱性シャペロニンを４０モル倍等量存在させておくと、３０分後の残存活性は５５％に改善された。この結果は、耐熱性シャペロニンの酵素の安定化効果は、エチレングリコール含有水溶液中でも働くことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODの至適温度を検討した結果を示す特性図である。
【図２】Thermus thermophilus HB8株由来の耐熱性SODの熱安定性を検討した結果を示す特性図である。
【図３】耐熱性シャペロニンによる酵素保護効果を検討した結果を示す特性図である。
【図４】耐熱性シャペロニンによる酵素保護効果をエチレングリコール含有水溶液中で検討した結果を示す特性図である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含む溶媒組成物。
【請求項２】
耐熱性分子シャペロンを更に含むことを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項３】
上記耐熱性スーパーオキシドディスムターゼは、Thermus thermophilis又はAeropyrum pernix由来であることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項４】
上記耐熱性分子シャペロンは、好熱性細菌由来のものであることを特徴とする請求項２記載の溶媒組成物。
【請求項５】
上記好熱性細菌は、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、 Methanococcus jannaschii又はThermoplasma acidophilumであることを特徴とする請求項４記載の溶媒組成物。
【請求項６】
水系溶媒を含むことを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項７】
上記水系溶媒は、エチレングリコールを含有することを特徴とする請求項６記載の溶媒組成物。
【請求項８】
上記物質は潤滑剤成分又は冷媒成分であることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項９】
潤滑剤として使用されることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項１０】
冷媒として使用されることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項１１】
上記耐熱性スーパーオキシドディスムターゼは担体へ固定化されていることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項１】
酸素ラジカルによる酸化的変質を受けうる物質と、酸素ラジカル除去能を有する耐熱性スーパーオキシドディスムターゼを含む溶媒組成物。
【請求項２】
耐熱性分子シャペロンを更に含むことを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項３】
上記耐熱性スーパーオキシドディスムターゼは、Thermus thermophilis又はAeropyrum pernix由来であることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項４】
上記耐熱性分子シャペロンは、好熱性細菌由来のものであることを特徴とする請求項２記載の溶媒組成物。
【請求項５】
上記好熱性細菌は、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus horikoshii、 Methanococcus jannaschii又はThermoplasma acidophilumであることを特徴とする請求項４記載の溶媒組成物。
【請求項６】
水系溶媒を含むことを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項７】
上記水系溶媒は、エチレングリコールを含有することを特徴とする請求項６記載の溶媒組成物。
【請求項８】
上記物質は潤滑剤成分又は冷媒成分であることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項９】
潤滑剤として使用されることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項１０】
冷媒として使用されることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【請求項１１】
上記耐熱性スーパーオキシドディスムターゼは担体へ固定化されていることを特徴とする請求項１記載の溶媒組成物。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図２】
【図３】
【図４】
【公開番号】特開２００８−５７９７（Ｐ２００８−５７９７Ａ）
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−１８１４０１（Ｐ２００６−１８１４０１）
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年１月１７日（２００８．１．１７）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年６月３０日（２００６．６．３０）
【出願人】（０００００３２０７）トヨタ自動車株式会社 (59,920)
【出願人】（５０４１５０４６１）国立大学法人鳥取大学 (271)
【Ｆターム（参考）】
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