炭疽菌組成物ならびに使用および生成方法
感染を防止もしくは減少するか、または炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）によって生じる臨床的転帰を改善するために免疫応答を誘発するのに有効な組成物および方法を提供する。組成物は、場合により、薬学的に許容可能な担体と組み合わされた炭疽菌毒素タンパク質と関連する抗原エピトープのすべてもしくは活性部分を含む天然に存在するかまたは合成のタンパク質、ペプチド、あるいはタンパク質断片を含む。好適な抗原エピトープは、個々にもしくは組み合わせのいずれかで、防御抗原、致死因子または浮腫因子の免疫原性領域に対応する。さらに、炭疽菌毒素の影響を減少するための抗体を含む方法および組成物について説明する。方法は、ヒトまたは動物に、本明細書に記載の組成物を、免疫応答を誘発するかまたは炭疽菌感染を処置するのに十分な用量で投与することに関与する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関し、より詳細には、ヒトまたは動物における炭疽菌感染を処置、防止もしくは減少するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭疽は、胞子形成菌の炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）によって生じる疾患である。動物産物を扱う仕事をするヒト、特に、獣医、検査技師、農場従事者および動物の皮膚または毛を扱う仕事をする従業者のような個体は、炭疽にかかる危険性がある。イラン、トルコ、イラク、パキスタン、およびサハラ以南のアフリカのような地域は、炭疽の高度流行地（ｈｙｐｅｒｅｎｄｅｍｉｃ）であるが、生物体は世界のほとんどの地域で見出すことができる。一般的な世界中の集団は、バイオテロ行為の結果としての炭疽菌（感染に脆弱であるが、軍隊は、バイオテロおよび／または戦争行為の結果としての感染に脆弱である。
【０００３】
炭疽は、肺炭疽病、胃腸炭疽病、および皮膚炭疽病の異なる３つの様式で疾患を発現する。肺炭疽病は、胞子を吸入することによって生じる。胃腸炭疽は、汚染された肉中の胞子を摂取することによって生じ、および胞子が開放創に接触する場合、皮膚炭疽病が発生する。非処置の肺または胃腸炭疽は、本質的に１００パーセントの致死率を有する一方、皮膚炭疽は、２５パーセントまでの致死率を有する。
【０００４】
炭疽に感染したヒトでは、処置の奏効は、それらのすべてが生存の可能性を低減し得る抗生物質耐性の発生率の増加、抗生物質が有効であり得る前に発生し得る過度の敗血症性応答、ならびに疑いの減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｓｐｉｃｉｏｎ）および貧弱な早期検出方法に基づく処置の遅延のような、いくつかの因子によって制限される。抗生物質による炭疽の早期処置は、死亡率を減少するのに必須であるが、吸入感染では完全には有効ではないことが公知である。処置の遅延は、生存率をかなり減少する。しかし、感染の初期症状は、一般的な非致死性の感染に類似するため、早期処置は困難である。例えば、炭疽菌胞子を吸入すると、はじめは、一般的な風邪の症状に似た症状を示し得る。さらに、細菌へのかかり方に依存して、炭疽菌感染の症状は、出現までに７〜６０日間を要し得る。さらに、即時的有効な抗生物質処置でさえも、血液中に高レベルで残存し、および継続してそれらの病原作用を仲介し得る循環性毒素の影響を改善しない。
【０００５】
炭疽菌の病原性は、浮腫の出現によって明白にされる毒性効果、および感染した被験体の死をもたらし得るいわゆる致死性の毒性効果の２つの様式で発現される。これらの影響は、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）の３つのタンパク質の組み合わせによって示される毒素系によって産生される毒素の存在に起因すると考えられる。ヒトおよび哺乳動物の両方において、宿主が症状を呈さない感染の初期段階中でさえも、毒素は身体中に増加する。これは、処置の遅延が何故致死性であるかを説明する。それ故、毒素の有害な作用を妨害する処置を含む改善された炭疽菌診療治療が必要不可欠であるだけなく、感染において早期に炭疽の存在を確立するためのポイントオブケアの、迅速、かつ極めて高感度な診断試験が必要不可欠である。
【０００６】
通常ポリクローナル抗体である、毒素を抗体で中和する作動力である受動免疫が、さまざまな細菌感染のための診療治療として使用されている（ＫｅｌｌｅｒおよびＳｔｉｅｈｍ、２０００年）。患者のポリクローナル抗血清の使用に対する主な制約は、異なる種から誘導されるタンパク質に対する患者の免疫応答による「血清病」の可能性である。さらに、より高い親和性抗体は、毒素の中和により有効であるが、ポリクローナル血清またはハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体であっても、親和性を意図的に増強するための一般的様式は存在しない。さらに、正常なドナーは炭疽菌に対して有効な体液性免疫を有さないため、プールされたドナーの静脈免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を使用する従来のアプローチは有効ではない。
【０００７】
炭疽菌に対するワクチンは現在利用可能であるが、最適ではない。ごく最近市販されたワクチンでさえも複数の一次注入、年ごとの追加接種を必要とし、および吸入攻撃および有害事象に対して長期間の有効性の証明を提供することができない。さらに、現在利用可能なワクチンは重度の有害作用を示す。
【０００８】
炭疽菌の毒性の機構は次のとおりである。防御抗原（ＰＡ８３）の８３ｋＤａの形態は、迅速に増殖している炭疽菌細胞から分泌され、およびＴＥＭ８またはＣＭＧ２のような特定の宿主細胞表面受容体に結合する。（Ｈ．Ｍ．ＳｃｏｂｉｅおよびＪ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．８，１０６−１１２（２００５年））。膜結合型フューリン、および／またはフューリン様プロテアーゼ、おそらくＰＡＣＥ４による以後の切断は、アミノ末端２０ｋＤａ断片を遊離し、受容体結合型ＰＡ６３を生じる。次いで、ＰＡ６３サブユニットは、オリゴマー形成して七量体リングとなり、次に、炭疽菌毒素の致死因子および浮腫因子成分に対する結合部位を作製する。受容体／毒素複合体の酸性エンドソームへのエンドサイトーシスは、ＰＡ６３のコンホメーション変化を誘発し、それによって毒素のＡサブユニット（ＬＦまたはＥＦ）がエンドソームに放出される。リソソーム酸性化および以後の受容体放出は、オリゴマーＰＡ６３ポアの不可逆的膜挿入を容易にする。ポアは、ＬＦおよび／またはＥＦの細胞質への輸送を可能にし、ここで、それらは、それらのそれぞれの毒性を誘発する。
【０００９】
ＥＦは、ほとんどの細胞タイプに毒性であるカルシウム／カルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼであり、および局所的炎症および浮腫を生じるが、通常、致死性ではない。防御抗原および浮腫因子からなる浮腫毒素は、最近、マウスモデルにおける組織病巣および死のを引き起こすことが示されている（「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｄｅｍａ ｔｏｘｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ」、Ｆｉｒｏｖｅｄ，Ａ．Ｍ．、Ｇ．Ｆ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｍ．Ｍｏａｙｅｒｉ、Ｒ．Ｋａｋｋａｒ、Ｙ．Ｓｈｅｎ、Ｊ．Ｆ．Ｗｉｇｇｉｎｓ、Ｅ．Ｍ．ＭｃＮａＩＩｙ、Ｗ．Ｊ．Ｔａｎｇ、およびＳ．Ｈ．Ｌｅｐｐｌａ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ１６７：１３０９−１３２０（２００５年）を参照のこと）。
【００１０】
ＬＦは、ＭＡＰ−キナーゼ−キナーゼおよびいくつかのペプチドホルモンを切断する細胞タイプ特異的メタロプロテアーゼである。防御抗原および致死因子の組み合わせによって形成される致死性毒素は、マクロファージの溶解を生じる亜鉛依存性プロテアーゼである。致死因子は、炭疽菌の毒性に関連する主な病原因子であり、および全身性ショックおよび死の原因であると考えられる。いずれの毒素Ａサブユニットも、ＰＡまたは機構的手段による細胞質到達の非存在下では病原性ではない（「Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ａｎｔｈｒａｘ ｌｅｔｈａｌ ｔｏｘｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ａ．Ｍ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，７１２３（１９８６年）を参照のこと）。
【００１１】
ＰＡ８３および七量体ＰＡ６３の結晶構造は解明されている（例えば、「Ｃｒｙｓｔａｌ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｃ．Ｐｅｔｏｓａら、Ｎａｔｕｒｅ．３８５，８３３（１９９７年）を参照のこと）。これらの構造データは、ＰＡ６３のカルボキシ末端側のドメイン４が毒素複合体の受容体仲介取り込みの原因であることを示す実験データ（例えば、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｓ．Ｆ．Ｌｉｔｔｌｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−ＵＫ．１４２，７０７ （１９９６年）および「Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｙ．Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５４９３（１９９１年）を参照のこと）を支持する。
【００１２】
炭疽菌は、生物兵器として６０年間を超える間使用されており、また細菌を入手および増殖することが比較的容易であり、ならびに胞子の安定性に基づく大規模な攻撃のための有望な因子である。兵器化された炭疽は、１９４１年、英国政府によって最初に開発され、スコットランド付近の島において炭疽菌胞子の放出が試験された（Ｍｏｕｒｅｚ，Ｍ．Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２：１３５−１６４（２００４年）およびＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ａら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ３２３：２９９−３１５（２００２年））。この試験中に感染した個体はいなかった一方、海水およびホルムアルデヒドを使用して土壌を滅菌するまで、島は、４５年間、生物災害の状態であった。しかし、そのとき以来、ヒトへの感染および死を生じる軍事用炭疽菌の偶発的ならびに意図的な放出が認められている。１９７９年にソビエト社会主義共和国連邦の軍事施設から炭疽の偶発的放出により、６８人が死亡、および３１マイルまで離れた所でのウシの感染が発生した。そして２００１年、米国において感染した手紙を介する意図的な炭疽の散布により、２２例が炭疽（１１例の皮膚炭疽および１１例の肺炭疽）を発症し、５人が死亡した（Ｇｕａｒｎｅｒ，Ｊ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６３：７０１−７０９（２００３年）およびＱｕｉｎｎ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９０：１２２８−１２３６（２００４年）を参照のこと）。これらの出来事は、炭疽菌胞子のエアロゾル状態での放出からの防御を提供する安全、有効なワクチンおよび早期診療のための潜在的に指向された免疫治療剤の必要性を強調する。
【００１３】
現在の米国のワクチン（吸収炭疽ワクチン、ＡＶＡ）は、弱毒Ｖ７７０−ＮＰ１−Ｒ株、非カプセル化ウシ単離体のアルハイドロゲル吸収型無細胞ろ過物である。このワクチン接種は０、２、４週間目、ならびにさらに６、１２、および１８ヶ月目に投与され、年ごとの追加接種が推奨される。このワクチンに関する初期のデータは、動物研究から得られており、ＡＶＡは炭疽菌の完全なビルレント株による致死性の攻撃からマウスを保護しない一方、ワクチン接種されたマウスは、非カプセル化株による攻撃から保護されることを示す。これらのモデルはまた、主な毒素タンパク質（ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ）に対する抗体の受動輸送が、弱毒株による攻撃に対する防御を提供することができることを実証している（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５１７１−５１７５（１９９７年）；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５６：１８０７−１８１３（１９８８年）；Ｐｒｉｃｅ，Ｂ．Ｍら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：４５０９−４５１５（２００１年）およびＷｅｌｋｏｓ，Ｓ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：１６７７−１６８５（２００１年）を参照のこと）。ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦに対する抗体はまた、臨床的炭疽と診断された個体の血清サンプルにおいて検出されているが、ワクチン接種は、主に抗防御抗原抗体を生じる。しかし、炭疽菌の変異株をワクチン接種されたマウスを使用するいくつかの研究により、ＬＦおよびＥＦの防御への有意な寄与が示されている（Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｎ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：３２７６−３２８３（２００４年）およびＬｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９：６７６−６８２（１９９４年）を参照のこと）。それ故、これらのタンパク質に対する抗体のレベルを増強することは、防御を増強し得る。従って、現在のワクチンが最適でないため、新規かつ改善された予防的組成物および方法が必要である。
【００１４】
必要なものは、炭疽菌感染の症状を防止、阻害および低減することができる方法ならびに組成物である。組成物は、炭疽菌毒素、即ち、防御抗原、致死因子および浮腫因子の活性を克服することが可能であるべきである。好ましくは、組成物は、動物またはヒトにおける免疫応答を誘導することが可能であるべきである。また、致死因子および浮腫因子のような炭疽菌毒素の成分に指向された中和抗体を産生させるために使用することができる組成物も必要である。さらに加えて、必要なものは、特に、炭疽菌感染に指向された免疫療法に使用することができる方法および組成物である。最後に、炭疽菌感染の症状を防止、阻害および低減するための方法ならびに組成物は、好ましくは、非毒性であるべきであり、およびほとんど副作用を生じるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
炭疽菌感染の症状を処置、防止、阻害および低減するための方法ならびに組成物を提供する。本明細書に記載の組成物は、炭疽菌毒素、即ち、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）の活性を特異的に克服する。より詳細には、組成物は、場合により、ＰＡを含む到達ビヒクルもしくは担体ポリペプチドと組合されるペプチド、または炭疽菌の抗原領域に対応するエピトープ、あるいはこれらの活性断片を含む免疫原性組成物を含む。特定の実施態様では、組成物は、炭疽菌毒素に関連する１つもしくはそれ以上の抗原領域に対応する複数のエピトープを含む。さらなる実施態様では、炭疽菌毒素に関連する抗原領域は、動物もしくはヒトに投与される場合、免疫原性応答を誘発するＰＡ、ＬＦまたはＥＦから誘導されるペプチドあるいはペプチド断片である。別の実施態様では、組成物は、動物もしくはヒトに投与される場合、免疫応答を誘発するＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦから誘導される複数のペプチドあるいはこれらの断片を含む。複数のペプチドは、個別であるか、または例えば融合タンパク質において組み合わされ得る。以下のような理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載の組成物は、炭疽菌（毒性および感染の防止または減少を生じる体液性免疫応答を誘発してもよい。
【００１６】
本明細書において提供される組成物は、２０ｋＤａ未満の分子量を有する免疫原性炭疽菌ペプチドを含み、従って、炭疽ワクチンにおける使用が意図される先に記載の抗原ドメインより小さい。ペプチドは、好ましくは、４０アミノ酸長もしくはそれ以下である。ペプチドは、場合により、例えば、防御抗原タンパク質に限定されない担体に結合される。ＰＡに好適なペプチドを表４および６に記載する。ＬＦに好適なペプチドを表１〜３および５に記載する。ＥＦに好適なペプチドを表７に記載する。
【００１７】
好ましくは、本明細書に記載の組成物は、炭疽に対する免疫応答を誘導するため、例えば、炭疽菌、炭疽に関連する原因因子に対してヒトもしくは動物を処置、防御またはワクチン接種するための方法において有用である。
【００１８】
本明細書に記載の組成物の特定の実施態様は、到達それらの外部表面に提示されるエピトープ、エピトープ断片、合成ペプチドもしくは保存的に改変されたペプチド断片を有するリポソームまたはビヒクルなどの、到達または担体ビヒクルをさらに含む。別の実施態様では、所望されるエピトープまたはその免疫原性ペプチド断片は、部分的または全体的に、担体、例えば、リポソームでカプセル化されてもよい。さらに別の実施態様では、エピトープもしくはそれらの免疫原性断片またはペプチドは、金コロイドなどの金属コロイドを使用する到達機構によって所望される部位に輸送されてもよい。上記の組成物は、所定の炭疽菌毒素に対する免疫を改善するためのワクチンとして有用であり、それがなければ、免疫系によって効果的に標的化されない。
【００１９】
組成物は、炭疽の衰弱効果を減少するための治療計画においてさらに有用である。以下のような理論に拘束されようとは思わないが、得られる循環抗体は炭疽菌毒素に結合ることによって、炭疽菌感染の普及を防止するか、既存の感染を減少するか、または感染の影響を低減すると考えられる。
【００２０】
組成物はまた、炭疽菌抗原エピトープに特異的な、単離されたおよび組換え抗体を含む。単離された抗体は、強力な抗原刺激免疫応答を伴うヒトまたは動物から産生および精製され、およびそのような循環抗体を必要とする脆弱、非機能的もしくは非抗原刺激化免疫系を伴うヒトまたは動物に注入される。抗体は、本明細書に記載のペプチドの１つもしくはそれ以上を動物に投与し、次いで、必要とされる抗体を回収、精製および改変すること、またはタンパク質／タンパク質断片／ペプチドで免疫した動物、ワクチン接種した個体もしくは炭疽菌感染の生存体から防御、抗ペプチド応答をアフィニティー精製することのいずれかによって、生成される。これらのアフィニティー精製された抗体は、配列決定し、および免疫治療剤としての使用のために組換え的に産生させることができる。抗体は、モノクローナル抗体であっても、またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、動物に投与される場合、炭疽に対して免疫応答を誘導する２０ｋＤａ未満の分子量、好ましくは、４０アミノ酸長もしくはそれ以下を有する炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性である。それ故、炭疽菌感染は、炭疽菌毒素に関連する独特なエピトープもしくはペプチドを含む組成物を使用する個体の能動免疫か、または抗体もしくは炭疽菌毒素に特異的な抗体の群を投与することを介する受動免疫のいずれかによって、減少あるいは阻害される。抗体は、患者に投与される場合の有害作用を減少するように改変してもよい。ヒト化抗体は、この用途に理想的である。
【００２１】
あるいは、抗体またはペプチドは、イムノアッセイなどの方法における試薬として使用される。抗体またはペプチド試薬は、潜在的に感染した動物またはヒト由来のサンプルと組み合わされ、および抗体−抗原複合体の形成が検出される。イムノアッセイは、循環抗体または炭疽菌タンパク質を検出することのいずれかによって、動物またはヒトにおける炭疽菌感染を検出するのに有用である。あるいは、イムノアッセイは、動物またはヒトにおける炭疽菌感染に対する特異的防御免疫を検出するのに有用である。予め決定された抗炭疽抗体価を検出する場合、動物は、炭疽攻撃に対して保護されるべきであり、および以後のワクチン接種または追加接種は必要でなくてもよい。
【００２２】
従って、本発明の目的は、炭疽菌によって生じる感染の影響を防止および減少するための方法ならびに組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、炭疽の発生または蔓延を防止、減少および処置するための方法ならびに組成物を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、宿主における活性な体液性および／または細胞性応答を誘発することによって、炭疽菌によって生じる感染を有するヒトまたは動物におけるこのような感染の影響を防止および減少するための方法ならびに組成物を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、炭疽菌感染に対してヒトまたは動物にワクチン接種するための方法および組成物を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、炭疽菌感染に対してヒトまたは動物に受動免疫するための方法および組成物を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、抗原性であり、およびヒトまたは動物において炭疽菌に対する免疫応答を誘発する炭疽菌毒素に関連する独特なエピトープを含む組成物を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、抗原性であり、およびヒトまたは動物において炭疽菌に対する免疫応答を誘発する炭疽菌毒素に関連する独特なエピトープを含む組成物を提供することであって、毒素は、個々にもしくは組み合わせで、防御抗原、致死因子、または浮腫因子である。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、炭疽菌に対して個体の応答を増加するように抗原性部分で改変された炭疽菌エピトープまたはペプチド断片およびその使用方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の目的は、炭疽に対してヒトまたは動物を受動免疫するのに有用な抗体を提供することである。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴ならびに利点は、開示された実施態様の以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲の検討後に明らかとなろう。
【００３２】
本明細書に記載の組成物および方法は、本明細書に含まれる具体的な実施態様の以下の詳細な説明を参考にして、さらに容易に理解し得る。本発明について、その特定の実施態様の具体的な詳細を参考に説明してきたが、そのような詳細は、本発明の範囲を制限するものとして認識すべきではないことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、炭疽菌病原因子の結合およびプロセシングの概略図を提供する。
【図２】図２は、マウスにおける中和抗体を含む抗ＬＦおよび抗ＰＡ抗血清の作製のための研究の詳細を提供するフローチャートである。
【図３】図３は、免疫化Ａ／Ｊマウスにおける抗ＬＦおよび抗ＰＡ ＩｇＧ抗体価の結果を提供するエンドポイント力価のグラフである。
【図４】図４は、致死性毒素攻撃のための研究計画を提供するフローチャートである。
【図５】図５は、連続的重複ペプチド配列に特異的な抗体の検出のための固相ＥＬＩＳＡ技術の概略図を提供する。
【図６】図６は、致死因子の連続的マウスＢ細胞エピトープのデータを提供する。
【図７】図７は、防御抗原の連続的マウスＢ細胞エピトープのデータを提供する。
【図８】図８は、Ｂ細胞エピトープ選択における株背景対ＭＨＣの計画研究を提供する。
【図９】図９は、Ａ／Ｊ、Ｂ６およびＢ６．Ｈ２ｋマウスにおける致死因子エピトープのデータを提供する。
【図１０】図１０は、Ａ／Ｊ、Ｂ６およびＢ６．Ｈ２ｋマウスにおける防御抗原エピトープのデータを提供する。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、ＡＶＡワクチン接種後の抗炭疽菌抗体に関するデータを提供する。
【図１２】図１２は、連続的ヒトＢ細胞防御抗原抗体のデータを提供する。
【図１３】図１３は、ヒト防御抗原体液性エピトープの表を提供する。
【図１４】図１４は、連続的ヒトＢ細胞致死因子体液性エピトープのデータを提供する。
【図１５】図１５は、ヒト致死因子体液性エピトープの表を提供する。
【図１６】図１６は、マウスにおける中和抗体を含む抗浮腫因子（ＥＦ）抗血清の作製のための研究の詳細を提供するフローチャートである。
【図１７】図１７は、免疫化Ａ／Ｊマウスにおける抗ＥＦ ＩｇＧ抗体価の結果を提供する。
【図１８】図１８ＡおよびＢは、ＥＦ免疫化Ａ／Ｊマウスにおける致死浮腫毒素攻撃の結果を提供する。
【図１９】図１９ＡおよびＢは、ＥＦの連続的マウスＢ細胞エピトープのデータを提供する。
【図２０】図２０は、ＰＡおよびＬＦ免疫化マウスから精製されるペプチド結合性抗体は、致死性毒素の作用をインビトロで中和することができることを示すデータを提供する。
【図２１】図２１は、ＩｇＧ抗ＰＡペプチド濃度および生存能パーセントを示すグラフを提供する。
【図２２】図２２Ａ〜Ｇは、ペプチドエピトープの確認を示すデータのグラフである。
【図２３】図２３Ａ〜Ｃは、ヒトＡＶＡワクチン由来のいくつかのペプチド結合性抗体が致死性毒素の作用をインビトロで中和することができることを示すデータを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書では、ヒトまたは動物における炭疽に対する免疫応答を誘導するための免疫原性炭疽菌ペプチド組成物および方法について説明する。抗炭疽菌抗体、抗体を作製する方法、および抗体を使用して炭疽菌感染を処置するための方法についても説明する。さらに、炭疽菌感染の検出のための試薬およびアッセイについて説明する。
【００３５】
本明細書において提供される炭疽菌ペプチドは免疫原性であり、および２０ｋＤａ未満の分子量を有する。ペプチドは、防御抗原（ＰＡ）タンパク質、致死因子（ＬＦ）タンパク質、および浮腫因子（ＥＦ）タンパク質として公知の免疫学的に重要な炭疽菌タンパク質の部分もしくは断片、またはこれらの組み合わせである。好ましくは、各炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、４０アミノ酸未満である。より好ましくは、アミノ酸配列は６アミノ酸より大きく、４０アミノ酸未満である。あるいは、アミノ酸配列は６アミノ酸より大きく、２０アミノ酸長未満である。好適な実施態様では、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、１２〜１８アミノ酸の間の長さを有する。あるいは、好適な長さは８〜１０アミノ酸長である。一実施態様では、炭疽菌ペプチドの連続アミノ酸配列は１２アミノ酸長である。選択的および代表的な炭疽菌ペプチドアミノ酸配列を本明細書において提供する。
【００３６】
本明細書において提供される抗体は、特に、ＰＡ、ＬＦまたはＥＦである炭疽菌タンパク質に免疫反応性であり、ならびに本明細書に記載の炭疽菌ペプチドを動物に投与し、および炭疽菌ペプチドに特異的な抗体を含む動物から生物学的液体を回収または精製することによって調製される。抗体は、疾患を処置するための免疫療法として、炭疽に感染したヒト患者などの動物に投与される。
【００３７】
本明細書に記載の炭疽菌ペプチドおよび抗体はまた、炭疽菌感染の検出または診断のためのイムノアッセイにおける試薬としても有用である。
【００３８】
本明細書に記載の炭疽菌ペプチドをコードする核酸配列もまた、本発明の範囲内にあると考えられる。これらの核酸配列は、炭疽菌ペプチドの産生に有用である。核酸配列はまた、ＤＮＡワクチンとしても有用であり、およびベクターに挿入して、動物またはヒトにトランスフェクトし、抗原エピトープもしくはペプチドを系に導入することによって、身体に免疫原性ペプチドに対する免疫応答を装架させる。
【００３９】
定義
本明細書において使用する用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、１つもしくはそれ以上を意味するものとして規定され、および文脈が不適切である場合を除いて複数を含む。
【００４０】
本明細書において使用する用語「抗体」または「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、二重特異性、サル化、およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片を含み、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む。
【００４１】
用語「抗原」は、動物における免疫応答を誘導することができる全体またはその断片を指す。用語は、免疫原および抗原性または抗原決定基を担う領域を含む。
【００４２】
本明細書において用いる語句「生物学的活性」は、生物系から誘導される化合物もしくはこれらに反応性である化合物、またはこれらの化合物の機能性、反応性、および特異性を模倣する他の化合物の機能性、反応性、および特異性を指す。適切な生物学的に活性な化合物の例として、酵素、抗体、抗原およびタンパク質を含む。
【００４３】
語句「生物学的に純粋な」または「単離された」は、その生来の状態において見出されるように、通常、材料に伴う成分を実質的もしくは本質的に含まない材料を指す。それ故、本明細書に記載のペプチドは、通常、それらのインサイチュ環境に関連する材料を含みない。一般的に、本明細書に記載の単離された抗増殖性ペプチドは、銀染色ゲル上のバンドの強度によって測定されるように、少なくとも約８０％純粋、通常、少なくとも約９０％純粋、好ましくは、少なくとも約９５％純粋である。
【００４４】
タンパク質の純度または均質性は、当該技術分野において周知の多くの方法、例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続く染色時の可視化によって示され得る。特定の目的のために、高解像度が必要であり、およびＨＰＬＣまたは精製のための類似の手段が利用される。
【００４５】
好ましくは、本発明のエピトープおよびペプチドは、相対的に長さが短い（即ち、約４０アミノ酸未満）。このような短いアミノ酸配列は、標準的な化学ペプチド合成技術を使用して、合成することができる。
【００４６】
配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、続いて、残りのアミノ酸を配列に逐次付加する固相合成は、本明細書に記載の免疫原性ペプチドの化学合成に好適な方法である。固相合成のための技術は、当業者に公知である。
【００４７】
あるいは、本明細書に記載の抗原ペプチドは、組み換え核酸方法論を使用して合成される。一般的に、これは、ペプチドをコードする核酸配列を作製すること、発現カセット中の核酸を特定のプロモーターの制御下に配置すること、宿主においてペプチドを発現させること、発現されたペプチドまたはポリペプチドを単離すること、および必要であれば、ペプチドを再生することに関与する。このような手順を介して当業者を指導するのに十分な技術が、文献において見出される。
【００４８】
一旦発現されると、組換えペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従って、精製することができる。均質性が約５０〜９５％の実質的に純粋な組成が好適であり、および８０〜９５％もしくはそれを超える均質性が治療用薬剤としての使用に最も好適である。
【００４９】
当業者であれば、化学合成、生物学的発現または精製後、免疫原性ペプチドが構成性ペプチドの生来のコンホメーションとは実質的に異なるコンホメーションを所有し得ることを認識するであろう。この場合、免疫原性ペプチドを変性および減少し、次いでペプチドを好適なコンホメーションにリフォールディングすることがしばしば必要である。タンパク質を減少および変性し、およびリフォールディングを誘導する方法については、当業者に周知である。
【００５０】
本明細書において使用する用語「体液」として、唾液、歯肉滲出物、脳脊髄液、胃腸液、粘液、尿生殖器分泌物、関節液、血液、血清、血漿、尿、嚢胞液、リンパ液、腹水、胸水、間質液、細胞内液、眼液（ｏｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、精液、乳房分泌物、および硝子体液、および鼻分泌物を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書において使用する用語「担体」は、炭疽菌毒素の免疫原または免疫原性ペプチド断片を組み入れることができるか、または関連させることができ、従って、免疫原または免疫原性ペプチドの部分をヒトもしくは動物の免疫系に提示あるいは暴露し、および免疫原性組成物を炭疽菌について抗原性にする構造を意味する。用語「担体」は、到達方法をさらに含み、ここで、免疫原性ペプチドまたはペプチド断片組成物は、到達機構によって所望される部位に輸送され得る。
【００５２】
さらに、用語「担体」は、当業者に公知のワクチン到達機構をさらに含み、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド、および防御抗原（ＰＡ）、特に、組換えＰＡを含む炭疽菌由来のポリペプチド、ならびに他のアジュバントを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される抗原エピトープ組成物は、アジュバント、保存剤、希釈剤、乳化剤、安定剤、および公知でありかつワクチンにおいて使用される他の組成物をさらに含むことができることもまた理解すべきである。当該技術分野において公知の任意のアジュバント系は、本明細書に記載の組成物において使用することができる。そのようなアジュバントとして、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、多分散性β−（１，４）結合型アセチル化マンナン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーアジュバント、改変型脂質アジュバント、サポニン誘導体アジュバント、硫酸デキストランなどの大きなポリマーアニオン、およびアラム（ａｌｕｍ）、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウムなどの無機ゲル、を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書において提供される抗原ペプチド組成物において使用することができる担体タンパク質、または担体として、マルトース結合タンパク質「ＭＢＰ」；ウシ血清アルブミン「ＢＳＡ」；キーホールリンペット（ｌｙｍｐｅｔ）ヘモシニアン「ＫＬＨ」；オボアルブミン；フラジェリン；サイログロブリン；任意の種の血清アルブミン；任意の種のγグロブリン；同一遺伝子型細胞；Ｉａ抗原を有する同一遺伝子型細胞；Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸のポリマー；破傷風トキソイド、ならびに、特に、炭疽菌自体に由来する組換えＰＡポリペプチドを含むが、これらに限定されない。担体は、炭疽菌ペプチドにコンジュゲートされるか、またはそうでなければ共有的もしくは非共有的に結合される。
【００５４】
語句「より本質的になる」は、語句が指すペプチドの本質的特性を実質的に変更するあらゆる要素を排除するために、本明細書において使用される。それ故、「〜より本質的になる」ペプチドの記載は、該ペプチドの生物学的活性を実質的に変更するあらゆるアミノ酸置換、付加、欠失または修飾を排除する。
【００５５】
本明細書において使用する用語「浮腫因子」または「ＥＦ」は、炭疽菌の野生型全長浮腫因子を指す（配列番号３およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＡ７９２１５；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＬ，Ｔｉｐｐｅｔｔｓ ＭＴ，Ｌｅｐｐｌａ ＳＨ．Ｇｅｎｅ．１９８８年１２月２０日；７３（２）：３６３−７１を参照のこと）。
【００５６】
用語「有効量」は、ヒトもしくは動物に投与される場合、免疫応答を誘発するか、炭疽菌感染を防止、減少または低減するか、反応性の減少を生じるかまたは炭疽菌疾患の拡張および増殖を阻害するエピトープまたは免疫原性ペプチドの量を指す。有効量は日常的手順に従い、当業者によって容易に決定される。
【００５７】
例えば、免疫原性エピトープ組成物は、筋肉内、非経口的、皮下、エアロゾルとして吸入を介して、または経口的に、１例の患者あたり約１．０μｇ〜５．０ｍｇの範囲で投与し得るが、この範囲を制限することを意図するものではない。免疫応答を誘発するのに必要とされるエピトープまたは免疫原性ペプチド組成物の実際の量は、投与されるエピトープの免疫原性および個体の免疫応答に依存して、それぞれ個々の患者について変動する。結果的に、個体に投与される特定の量は、日常的な実験によって決定され、および当業者の訓練および経験に基づく。
【００５８】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、抗体に結合する三次元構造特徴のような免疫系によって認識される高分子の一部を意味する。あるいは、用語「エピトープ」は、アミノ酸配列によって決定される直鎖エピトープを指す。
【００５９】
また、本明細書において使用する用語「免疫原性の」は、炭疽菌（に対して指向された抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞を誘発または増強し、およびヒトまたは動物における免疫応答に寄与する物質を指す。動物または個体が炭疽菌感染の影響を防止、低減もしくは軽減するように本発明の組成物に対して十分な抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞を産生する場合、免疫応答が発生する。
【００６０】
本明細書において使用する用語「致死因子」または「ＬＦ」は、炭疽菌の野生型全長致死因子を指す（配列番号２およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＭ２６１１７；Ｒｅａｄ ＴＤ、Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ、Ｐｏｐ Ｍ、Ｓｈｕｍｗａｙ Ｍ、Ｕｍａｙａｍ Ｌ、Ｊｉａｎｇ Ｌ、Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ Ｅ、Ｂｕｓｃｈ ＪＤ、Ｓｍｉｔｈ ＫＬ、Ｓｃｈｕｐｐ ＪＭ、Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｄ、Ｋｅｉｍ Ｐ、Ｆｒａｓｅｒ ＣＭ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２年６月１４日；２９６（５５７５）：２０２８−３３）を参照のこと）。
【００６１】
本明細書において使用する用語「防御抗原」または「ＰＡ」は、炭疽菌の野生型全長防御抗原を指す（配列番号１およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＡ２２６３７；Ｗｅｌｋｏｓ ＳＬ、Ｌｏｗｅ ＪＲ、Ｅｄｅｎ−ＭｃＣｕｔｃｈａｎ Ｆ、Ｖｏｄｋｉｎ Ｍ、Ｌｅｐｐｌａ ＳＨ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ＪＪ．Ｇｅｎｅ．１９８８年９月３０日；６９（２）：２８７−３００）を参照のこと）。
【００６２】
用語「ペプチド」は、そのα炭素が、あるアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と別のアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応によって形成されるペプチド結合を介して連結されるアミノ酸（一般的には、Ｌ−アミノ酸）の鎖である。鎖の一方の端の末端アミノ酸（即ち、アミノ末端）は遊離のアミノ基を有する一方、鎖の他方の端の末端アミノ酸（即ち、カルボキシ末端）は遊離のカルボキシル基を有する。従って、用語「アミノ末端」（Ｎ末端と略称される）は、ペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸上の遊離のα−アミノ基、またはペプチド内の他の任意の位置におけるアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与している場合はイミノ基）を指す。同様に、用語「カルボキシ末端」（Ｃ末端と略称される）は、ペプチドのカルボキシ末端におけるアミノ酸上の遊離のカルボキシル基、またはペプチド内の他の任意の位置におけるアミノ酸のカルボキシル基を指す。
【００６３】
一般的に、ペプチドを構成するアミノ酸は、アミノ末端から開始し、およびペプチドのカルボキシ末端に向かう方向に増加するような順番で番号付けされる。それ故、あるアミノ酸が別のアミノ酸の「後に続く」という場合、そのアミノ酸は、前方のアミノ酸よりペプチドのカルボキシ末端寄りに位置する。
【００６４】
用語「残基」は、アミノ酸（ＤもしくはＬ）あるいはアミド結合またはアミド結合擬似物によってオリゴペプチドに組み入れられるアミノ酸擬似物を指す。従って、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、または他で制限しない限り、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能する天然アミノ酸の既知のアナログ（即ち、アミノ酸擬似物）を包含してもよい。さらに、アミド結合擬似物は、当業者に周知のペプチド骨格改変を含む。
【００６５】
さらに加えて、当業者であれば、上記のように、コードされた配列において単一のアミノ酸または小さな百分率のアミノ酸（典型的に５％未満）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、保存的に改変されたバージョンであり、ここで、変更は、アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸による置換を生じることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。以下の６つの群は、それぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６６】
炭疽菌ペプチド組成物
本明細書において提供される炭疽菌ペプチドは、ＰＡ、ＬＦ、もしくはＥＦ炭疽菌毒素タンパク質の免疫原性部分または断片であり、およびペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する。各ペプチドは、以下により詳細に記載されるように、炭疽菌毒素タンパク質の少なくとも１個のエピトープを含む。好ましくは、各炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、４０アミノ酸未満である。一実施態様では、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、６アミノ酸より大きく、４０アミノ酸または２０アミノ酸長未満である。好適な実施態様では、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、６アミノ酸より大きく、２０アミノ酸長未満である。最も好ましくは、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、１２〜１８アミノ酸の間の長さを有する。理想的には、炭疽菌ペプチドは８〜１０アミノ酸の間の配列を有する。あるいは、炭疽菌ペプチドは１２アミノ酸長である。
【００６７】
同じまたは異なる炭疽菌毒素タンパク質由来の炭疽菌ペプチドの組み合わせ、炭疽菌ペプチドを含む融合タンパク質、担体に結合された炭疽菌ペプチド、および保存的に改変されたペプチドもまた、本明細書に記載のペプチドの範囲内に含まれる。さらに、ペプチドは、天然に存在する、組換え、改変型または合成であってもよい。
【００６８】
それらの意図される用途に依存して、免疫原性組成物、例えば、炭疽ワクチン組成物を産生させるために、ペプチドは、アジュバント、賦形剤、保存剤、到達ビヒクル、他の抗原性部分などに付着または混合される。炭疽菌ペプチドはまた、それらの抗原性を増加するように改変することもできる。抗原性部分およびアジュバントの例として、親油性ムラミルジペプチド誘導体、非イオン性ブロックポリマー、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバント、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
上記のように、各ペプチドは、炭疽菌毒素タンパク質の少なくとも１個のエピトープを含む。エピトープは、免疫系、具体的には、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される高分子の当該部分である。エピトープは、抗体が反応するタンパク質上の単一の抗原性部位である。通常、エピトープは非自己タンパク質から誘導されると考えられるが、認識され得る宿主から誘導される配列もまた、エピトープとして分類される。ほとんどのＢ細胞エピトープは、抗原分子の三次元表面特徴として考えることができる。これらの特徴は正確に適合し、それ故、抗体に結合する。エピトープを認識する抗体の部分はパラトープと呼ばれる。連続的エピトープは、抗体によって認識され得、および分子の表面上または分子の部分的表面上のいずれかにおいて見出され得る。本明細書において使用される方法論は、固相表面において極端に高い濃度／密度で合成される連続的エピトープを構築する。このアプローチは、連続的配列に結合する抗体の検出を可能にし、および、時には、１つの機能的エピトープをもたらす分子の表面上において一緒になる２つの結合領域をさらに同定する。
【００７０】
本明細書において使用されるように、エピトープは、以下の防御抗原、致死因子または浮腫因子の少なくとも１つに関連する免疫原性の領域を含むものとして規定される。一実施態様では、エピトープは、防御抗原、致死因子または浮腫因子に免疫原性であるさまざまな保存的アミノ酸を含む。好ましくは、本明細書に記載の組成物は、これらの３つの炭疽菌毒素タンパク質のそれぞれに由来する１個もしくはそれ以上のエピトープを含む。より好ましくは、組成物は、炭疽菌毒素系のそれぞれの毒素タンパク質、ＰＡ、ＬＦおよびＥＦのそれぞれのドメイン由来の１個もしくはそれ以上のエピトープを含む。
【００７１】
本明細書において提供される免疫原性ペプチドは、全長炭疽菌タンパク質のペプチド、部分または断片である。全長組換え防御抗原、致死因子および浮腫因子タンパク質は、組換えベクター、例えば、標準的な細菌またはバキュロウイルス遺伝子発現系を使用して、産生される。全長タンパク質は、多様な方法を使用して、個々のドメインに切断するかまたは消化することができる。さらに、全長防御抗原、致死因子および浮腫因子のアミノ酸配列およびドメインは、当該技術分野において周知である（また、それぞれ配列番号１〜３およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡ２２６３７、ＡＡＭ２６１１７、およびＡＡ７９２１５を参照のこと）。好適な実施態様では、組成物は、これらの炭疽菌毒素タンパク質のそれぞれに由来する１つもしくはそれ以上の免疫原性ペプチドを含む。
【００７２】
好適な実施態様では、組成物は、各炭疽菌毒素タンパク質由来の１つもしくはそれ以上の免疫原性ペプチドを含む。
【００７３】
一実施態様では、炭疽菌ペプチド組成物中のペプチドは、好ましくは、エピトープ（ａ）ヒトについて、１〜９ＰＡ（表６）；１〜１０ＬＦ（表５）および１〜１３ＥＦ（表７）およびそれらの断片（図１２〜１５を参照のこと）ならびに（ｂ）マウスについて、１〜２７ＬＦ（表１）；１〜２８ＬＦ（表２）；１〜２７ＬＦ（表３）；１〜２５ＰＡ（表４）；１〜１７ＥＦ（表８）および１〜９ＥＦ（表９）およびそれらの断片である（図６、７および１９を参照のこと）。
【００７４】
別の実施態様では、ペプチドは表１〜９のペプチドである。防御抗原由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、表４および６〜７のペプチド配列を含む。
【００７５】
致死因子由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、表１〜３および５のペプチド配列を含む。
【００７６】
浮腫因子由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、表８〜１０のペプチド配列を含む。
【００７７】
防御抗原および致死因子由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、それぞれ図１３および１５において言及されるペプチド配列を含む。
【００７８】
高度に好適な炭疽菌ペプチドを、以下に記載の表に掲載する。
【００７９】
表１：マウス要約的致死因子
表１は、マウス致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示する。ＬＦを含む８１０アミノ酸のうち、合計で３９２反応性アミノ酸を同定した。正規化されたＯＤ測定によって決定されるように、ペプチドが０．３以上の反応性を有することが観察された場合、ペプチドを反応性とみなした。隣接する重複ペプチドよりなる伸長型エピトープは、０．４もしくはそれ以上のＯＤを実証する少なくとも１つのペプチドを含む必要がある。隣接する反応性ペプチドを実証しない単一の反応性ペプチドは、ＯＤが１．０を超えない限り、エピトープを構成しないものとみなした。この分類に基づいて、全体で、免疫化マウス系における致死因子の２７個のエピトープを同定した。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表２：伸長型マウス要約的致死因子
表２は、マウス致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．２より大きい場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。各伸長型エピトープ（複合的配列して示される）は、０．４以上の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を実証する少なくとも１つのデカペプチドを含むことが必要とされる。この場合、ＬＦを含む合計で８１０アミノ酸のうち４４０反応性アミノ酸を同定した。この分類に基づいて、全体で２８個のエピトープを同定した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表３：さらなるマウス致死因子データ
表３は、マウス致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示する。ＬＦを含む８１０アミノ酸のうち、合計で３９２反応性アミノ酸を同定した。正規化されたＯＤ測定によって決定されるように、ペプチドが０．２以上の反応性を有することが観察された場合、ペプチドを反応性とみなした。隣接する重複ペプチドよりなる伸長型エピトープは、０．４もしくはそれ以上のＯＤを実証する少なくとも１つのペプチドを含む必要がある。隣接する反応性ペプチドを実証しない単一の反応性ペプチドは、ＯＤが１．０を超えない限り、エピトープを構成しないものとみなした。この分類に基づいて、全体で免疫化マウス系における致死因子の２７個のエピトープを同定した。
【００８４】
【表３】
【００８５】
表４：編集されたマウスＰＡ
表４は、マウス防御抗原の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．２より大きく、および０．４もしくはそれより大きい反応性を伴う少なくとも１つのデカペプチドを含みた場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて２５個のエピトープを同定した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
表５．編集されたヒト致死因子
表５は、ヒト致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、応答が、コントロールに対し平均＋２標準偏差より大きく、および５０％を超える個体が所定の領域についてポジティブであった場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて、１０個のエピトープを同定した。
【００８８】
【表５】
【００８９】
表６．新たに同定された防御抗原ヒトエピトープ
表６は、ヒト防御抗原の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、ペプチド応答が、コントロールに対し平均＋１．５標準偏差より大きく、および３０％を超える個体が所定の領域についてポジティブであった場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて９個のエピトープを同定した。
【００９０】
【表６】
【００９１】
表７．ＡＶＡワクチン接種された個体血清によって認識され、および中和によって階層化される防御抗原タンパク質内のエピトープ
表７は、インビトロ保護アッセイにおいてマクロファージ死滅を阻害する血清の能力に基づいて個体を階層化した場合のヒト防御抗原の免疫原性デカペプチドおよび対応する体液性エピトープを開示する。ペプチド応答が、コントロールに対し平均＋２標準偏差より大きく、および３０％を超える個体が所定の応答についてポジティブであった場合、エピトープを反応性とみなした。この方法論を使用して、本発明者らは、合計で１３個のエピトープについて、低度の応答体の中に１個の独特なエピトープ、中度の応答体の中に７個の独特なエピトープ、および高度の応答体の中に５個の独特なエピトープを同定することができた。
【００９２】
【表７】
【００９３】
表８．編集された浮腫因子（ヒト）
表８は、ヒト浮腫因子の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、ペプチド応答が、コントロールに対し平均＋２標準偏差より大きく、および６０％を超える個体が所定の領域についてポジティブであった場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて、１７個のエピトープを同定した。
【００９４】
【表８】
【００９５】
表９．マウス要約的浮腫因子
表９は、マウス浮腫因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．１６より大きい場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。各伸長型エピトープ（複合的配列して示される）は、０．３以上の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を実証する少なくとも１つのデカペプチドを含むことが必要とされる。この場合、ＥＦを含む合計で８００アミノ酸のうち１１８反応性アミノ酸を同定した。この分類に基づいて、全体で、９個のエピトープを同定した。
【００９６】
【表９】
【００９７】
表１０：さらなるマウス浮腫因子データ
表１０は、マウス浮腫因子の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．１６より大きく、および０．３もしくはそれより大きい反応性を伴う少なくとも１つのデカペプチドを含みた場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて、９個のエピトープを同定した。
【００９８】
【表１０】
【００９９】
炭疽菌ペプチド処方
炭疽菌ペプチドの１つもしくはそれ以上は、既知の技術を使用して、薬学的に許容可能な担体などの生理学的に許容可能な処方において調製することができる。例えば、ペプチドは、治療組成物を形成するために、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせられる。
【０１００】
あるいは、ペプチドをコードする遺伝子または核酸配列は、遺伝子治療技術を使用する継続投与のためのベクターで到達してもよい。本明細書において提供される組成物は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与してもよい。固体組成物の例として、丸剤、クリーム、およびインプラント可能な投薬単位を含む。丸剤は経口的に投与してもよい。治療用クリームは、局所的に投与してもよい。インプラント可能な投薬単位は、局所的に投与してもよく、または治療組成物の全身放出のために、例えば、皮下にインプラントしてもよい。液体組成物の例として、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内注入に適応可能な処方ならびに局所および眼内投与のための処方を含む。エアロゾル処方の例として、肺への投与のための吸入器処方を含む。
【０１０１】
組成物は、標準的な投与経路によって投与してもよい。一般に、組成物は、局所、経口、経直腸、経鼻または非経口（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内）経路で投与してもよい。さらに、組成物は、持続放出マトリックス、例えば、生分解性ポリマーに組み入れてもよく、そのポリマーは、到達が所望される場所付近にインプラントされる。本方法は、単回投薬の投与、予め決定された時間間隔での反復投薬の投与、および予め決定された期間の持続投与を含む。
【０１０２】
ここで使用されるような持続放出マトリックスは、材料、通常は、酵素もしくは酸／塩基加水分解または溶解によって生分解可能であるポリマーより作製されるマトリックスである。一旦、身体に挿入されたら、マトリックスは、酵素および体液によって作用される。持続放出マトリックスは、望ましくは、生体適合性材料、例えば、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンから選択される。好適な生分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）のいずれかのうちの１つのマトリックスである。
【０１０３】
あるいは、免疫原性炭疽菌ペプチドは、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子の担体表面免疫原性領域上に存在するように、膜性担体などの担体に挿入することができる。防御抗原、致死因子および浮腫因子は、「非自己」として免疫系によって認識されるため、これらはすべて免疫原性である。しかし、防御抗原、致死因子および浮腫因子毒素の全体未満をリポソームの表面上に挿入すると、エピトープの免疫系への提示を改変し得、場合によって、エピトープの免疫原性を低減し得る。
【０１０４】
免疫原性リポソームは、精製されたまたは部分的に精製された防御抗原、致死因子および浮腫因子の存在下でリポソームを再構成することによって、作製してもよい。さらに、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子ペプチドは、リポソームに再構成してもよい。組成物において使用することができるリポソームは、当業者に公知のリポソームを含む。リポソームを作製するのに有用な任意の標準的な脂質を使用してもよい。標準的な二層および多重層リポソームを使用して、本発明の組成物を作製してもよい。
【０１０５】
組成物の用量は、感染の進行、使用される特定の組成物、および患者の重量および病態などの他の臨床的因子ならびに投与経路に依存する。
【０１０６】
抗炭疽菌抗体組成物
上記の特徴を有する炭疽菌ペプチドは、炭疽菌タンパク質に反応性であるモノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の産生に使用される。免疫原性ペプチドを含む組成物は、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子に特異的に免疫反応性であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。抗体は、当業者に周知の方法によって作製される。
【０１０７】
免疫原性炭疽菌ペプチド組成物ならびに抗ＬＦ、ＥＦおよびＰＡ抗体は、任意の適切な手段、好ましくは、注入によって、ヒトまたは動物に注入される。例えば、防御抗原、致死因子および浮腫因子の免疫原性ペプチドは、皮下または筋肉内注入によって投与される。内部で産生されようとまたは外部の供給源から提供されようと、循環抗ＬＦ、ＰＡまたはＥＦ抗体は適切な受容体に結合し、および感染および疾患を刺激する炭疽菌の能力を減少または不活化する。
【０１０８】
分析物に対するそのより高い特異性のため、好適な抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって作製される。好適な方法は、Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５８（１９７９年）の方法の改変されたバージョンである。簡単に説明すると、マウスまたはウサギなどの動物に、アジュバント中の免疫原を接種、脾臓細胞を回収、および骨髄腫細胞系統、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３と混合する。ポリエチレングリコールの添加によって、細胞を誘導して、融合させる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む選択培地（ＨＡＴ）に細胞をプレート化することによって、ハイブリドーマを化学的に選択する。続いて、抗炭疽菌モノクローナル抗体を産生する能力について、ハイブリドーマをスクリーニングする。抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、拡大し、および将来の産生のために凍結保存する。
【０１０９】
本明細書に記載の抗炭疽菌抗体は、炭疽菌感染の処置のための治療組成物および炭疽菌感染の検出または診断のためのイムノアッセイにおける試薬の両方として有用である。抗体は、これらの設計された用途に従って改変することができる。
【０１１０】
炭疽に感染した動物またはヒト患者に投与される治療処置としての用途のための抗炭疽菌抗体は、その抗体がより容易に忍容性であり、およびより少ない有害な副作用を有するように改変してもよい。例えば、当業者に既知であり、および米国特許第６，３３１，４１５号明細書に記載のようなハイブリッド、キメラまたは変更された抗体になるように、抗体を改変してもよい。好ましくは、抗体は、当業者に公知の方法に従って「ヒト化」される。ヒト化抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子の重要なエピトープを標的化する患者の免疫原性配列から産生される。免疫原性配列を使用して、炭疽に既に感染したこれらの個体における毒素形成を防止することができる。これらの抗炭疽菌抗体はまた、炭疽菌に対して個体を受動免疫することによって感染の開始を防止し、反応性を減少するか、または炭疽菌の増殖を阻害するために投与される。個体に投与される場合、抗ＬＦ、ＥＦおよびＰＡ抗体は、炭疽菌に結合することによって、炭疽菌毒素の有効な循環濃度を減少する。結果的に、炭疽菌毒素依存性感染は、防止、減少または阻害される。
【０１１１】
抗体が、炭疽菌毒素の検出、例えば、患者における炭疽菌感染の検出のためのイムノアッセイにおける試薬としての用途が意図される場合、それが直接的または間接的な検出であり得るように、抗体を改変し得る。例えば、抗体は、炭疽菌タンパク質の同定および定量のための検出可能な標識で、直接標識してもよい。イムノアッセイにおける用途のための標識は、一般的に当業者に公知であり、および酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質および金コロイドおよびラテックスビーズなどの着色された粒子含む発色物質を含む。
【０１１２】
あるいは、抗体は、免疫グロブリン、例えば、タンパク質ＡもしくはＧまたは第二抗体に対する親和性を有する標識された物質との反応によって、間接的に標識してもよい。抗体を、第２の物質にコンジュゲートし、および抗体にコンジュゲートされた第２の物質に親和性を有する標識された第３の物質で検出してもよい。例えば、抗体をビオチンにコンジュゲートし、および標識されたアビジンまたはストレプトアビジンを使用して、抗体−ビオチンコンジュゲートを検出してもよい。同様に、抗体をハプテンにコンジュゲートし、標識された抗ハプテン抗体を使用して、抗体−ハプテンコンジュゲートを検出してもよい。抗体およびアッセイコンジュゲートを標識するこれらならびに他の方法は、当業者に周知である。
【０１１３】
処置すべき疾患および病態
本明細書に記載の炭疽菌ペプチド組成物は、炭疽菌（感染の疾患、症状および合併症を処置、防止、低減または軽減するのに有用である。本明細書に記載の組成物は、炭疽の原因因子に対する予防薬として特に有用であり、および炭疽菌に対するワクチンとして格別に有用である。組成物は、毒素成分、防御抗原、致死因子および浮腫因子に対して指向された中和抗体を産生させることによって、炭疽菌を処置または防止するのに格別に有用である。本明細書に記載の抗炭疽菌抗体組成物は、炭疽菌感染の処置のための免疫療法剤を提供するのに有用である。
【０１１４】
炭疽菌に感染したヒトまたは動物への本明細書において提供される組成物の投与は、感染の症状および免疫原性反応を減少または軽減するのに有用である。
【０１１５】
炭疽菌に暴露する危険性にあるヒトまたは動物への本明細書において提供される組成物の投与は、感染の症状および免疫原性反応を減少または軽減するのに有用である。防御抗原、致死因子および／または浮腫因子の免疫原性ペプチドを含む組成物は、炭疽菌に対する免疫を誘導するためにヒトまたは動物に投与される。免疫されたヒトまたは動物は、防御抗原、致死因子および浮腫因子の対応する領域に結合し、それによって炭疽菌感染を刺激するその能力を減少または不活化する炭疽菌に対する循環抗体を発達する。
【０１１６】
抗体およびイムノアッセイ検出方法
サンプル中の炭疽菌タンパク質の検出のための炭疽菌ペプチド、抗体、方法、およびキットが提供される。上記の炭疽菌ペプチドは、患者由来の生物学的サンプル中の抗炭疽菌抗体を検出するのに有用である。さらに、炭疽菌ペプチドは、生物学的サンプル中の炭疽菌毒素の検出のための抗炭疽菌抗体の産生に有用である。
【０１１７】
上記のように、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦ毒素について感度をを有する抗炭疽菌モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法に従って、本明細書に記載の炭疽菌ペプチドの１つもしくはそれ以上で動物を免疫し、エピトープと反応する抗体を単離し、ならびに血液などの生物学的液体から抗体を回収および精製することによって、産生される。
【０１１８】
炭疽菌毒素に免疫反応性の抗体を含むイムノアッセイ方法は、動物サンプルなどのサンプル中の炭疽の検出に有用である。このような抗体を用いるイムノアッセイは、サンプル中の低濃度のタンパク質を検出することが可能である。抗体は、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦタンパク質上の１つもしくはそれ以上のエピトープに免疫反応性であり、および最低でもサンプル中に存在し得る他のタンパク質と反応し、それ故、炭疽に暴露した可能性のあるヒトなどのサンプルにおいて炭疽の存在の正確な決定を提供する。好適な抗体は、それらの高い特異性故に、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である。
【０１１９】
抗体は、炭疽菌タンパク質の検出のための従来のイムノアッセイ試薬を伴うキットに集合的に集成される。キットは、場合により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方、ならびにサンプル中の炭疽菌タンパク質の存在の決定のための標準を含み得る。これらの試薬を含むキットは、炭疽菌タンパク質の簡単、迅速な、オンサイト検出を提供する。
【０１２０】
イムノアッセイ
試薬として抗体を用い、上記の炭疽菌ペプチドを使用して調製される高感度なイムノアッセイが提供される。イムノアッセイは、さまざまなサンプル、特にヒトサンプル中の炭疽菌毒素の存在または量を検出するのに有用である。サンプルは、炭疽菌タンパク質が抗体にアクセス可能である任意の供給源から入手し得る。例えば、サンプルは、炭疽に感染した疑いのある動物の血液または血清などの生物学的液体サンプルであり得る。従って、イムノアッセイは、炭疽菌感染の診断または予後に有用である。
【０１２１】
試薬として本明細書に記載の炭疽菌ペプチドを用いるイムノアッセイもまた提供される。ペプチドは、炭疽ワクチンを接種した個体から採取される生物学的サンプル中の炭疽に対する特異的防御免疫を試験するための試薬として使用される。ペプチドは、生物学的サンプル中の抗体に結合する。このタイプのイムノアッセイの結果は、ワクチン接種した個体の炭疽に対する免疫応答性に関する情報を提供し、これは、その個体に必要とされる追加接種の数を減少するために使用することができるか、または代替的防御手順を必要とする個体を同定するために使用することができる。
【０１２２】
試薬は、炭疽菌タンパク質の検出のための任意の異種もしくは同種サンドイッチまたは競合イムノアッセイにおいて用いられ得る。試薬は、検出可能な標識で標識されるか、または固相に結合されるかのいずれかである。試薬を固相に結合するための方法は、当業者に周知である。イムノアッセイ方法に従って、分析物を含むサンプルを、十分な期間、抗体のペプチドへの結合を促進する条件下で、試薬と反応させる。イムノアッセイ試薬およびサンプルは、異なる組み合わせおよび順序で反応され得ることが、当業者に理解されよう。粒子のろ過、コートされたチューブまたはウェルからの反応溶液のデカンテーション、磁気分離、毛管作用、および当業者に公知の他の手段などの固相に結合した試薬を非結合試薬から分離するための物理的手段が用いられる。固相の個別洗浄が方法に含まれ得ることもまた、理解されよう。
【０１２３】
サンプル中の炭疽菌タンパク質、または抗炭疽菌抗体の濃度は、サンプルによって生成される色の強度を色カードと比較するか、または反射計を使用するかのいずれかによって決定される。
【０１２４】
得られる反応混合物、または試薬およびサンプルの組み合わせは、抗体−分析物結合性動力学を最適化する溶液において調製される。適切な溶液は水溶液または緩衝液である。溶液は、好ましくは、特異的結合を促進し、非特異的結合を最小限にし、分析物を可溶化し、試薬反応性を安定化および保護する条件下で提供され、および緩衝液、界面活性剤、溶媒、塩、キレート剤、タンパク質、ポリマー、炭水化物、糖、および当業者に既知の他の物質を含みてもよい。
【０１２５】
反応混合物溶液は、抗体をペプチドに反応および結合させ、抗体−分析物複合体を形成させるのに十分な期間、反応させる。アッセイを完了させるのに必要な時間を最小限にするために、結合を生じる最も短い反応時間が所望される。イムノクロマトグラフィーストリップ試験のための適切な反応期間は、２０分間以下、または約１分間〜２０分間の間である。５分間未満の反応時間が好適である。最も好ましくは、反応時間は３分間未満である。試薬を最適化することによって、試薬を合わせる時に、結合が実質的に完了され得る。
【０１２６】
反応は、試薬が分解もまたは不活化もされない任意の温度で実施される。約４℃〜３７℃の間の温度が好適である。最も好適な反応温度は、周囲または室温（約２５℃）である。
【０１２７】
イムノアッセイキット
サンプル中の炭疽菌タンパク質の検出のためのイムノアッセイキットは、上記のエピトープを使用して調製される１つもしくはそれ以上の抗体を含む。
【０１２８】
キットは、サンプルを入手するための装置、試薬を含むための容器、計時手段、サンプルを希釈するための緩衝液、および比色計、反射計、または色の変化を測定し得る標準をさらに含みてもよい。
【０１２９】
好適な実施態様では、抗体を含む試薬は乾燥状態である。水性サンプルをストリップに添加すると、乾燥試薬の可溶化を生じ、これを反応させる。
【０１３０】
別のイムノアッセイキットは、特異的な防御炭疽菌エピトープ反応性の検出に有用である。ワクチン接種後、防御免疫が作製されている（または継続して作製されている）かどうかを決定するために、しばしば、個体を評価する必要がある。このキットは、固相系に結合した本明細書に記載の免疫原性ペプチドの１つまたは混合物を含む。血清の希釈物は、防御抗体の存在および濃度を測定するために使用されるこれらのペプチドおよび検出系と共にインキュベートされる。
【０１３１】
組成物および方法を、以下の非制限的例によってさらに例示するが、これらは、いかなる様式によっても、それらの範囲に制限を課すものと解釈されるべきではない。対照的に、それらの他の多様な実施態様、改変物、および等価物を採用することができ、それら自体は、本明細書に記載の説明を読んだ後であれば、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく当業者に示唆され得ることが明白に理解されるべきである。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
炭疽菌致死性毒素に対する防御抗体および防御抗原を含むマウス抗血清の作製
図２は、組換えＰＡ、組換えＬＦまたはアジュバント単独でＡ／Ｊマウスのグループを免疫するために使用される研究計画を示す。０日目に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の存在下で初回免疫を行い、および１０、２４および３８日目に追加接種を行った。
【０１３３】
各追加接種の４日後、およびさらに最後の追加接種の７０〜８０日後に行った毒素攻撃の前に、個々のマウスから抗体試験およびエピトープマッピングのための血液サンプルを回収した。
【０１３４】
図３は、免疫化マウスが組換えＬＦおよびＰＡ免疫原に対して強固な抗体応答を産生していた根拠を実証する。図３は、市販のＬＦおよびＰＡ調製物を使用するＥＬＩＳＡによって決定されるＬＦおよびＰＡに対するＩｇＧ抗体価を示す。
【０１３５】
ＬＦ免疫化マウスは２８日目に抗力価の抗ＬＦ抗体を産生し、およびＰＡ免疫化マウスも同様に、２８日目に高力価の抗ＰＡ抗体を産生する一方、アジュバント単独で免疫したマウスは産生しなかった。免疫前に回収したサンプルもまた、これらの抗体に陰性であった。各グループの血清の１／１００血清希釈の平均ＯＤからもまた、このパターンが確認される。
【０１３６】
実施例２
致死性毒素攻撃
エピトープマッピングを行う前に、実施例１のマウスが致死性毒素−中和抗体を産生したかどうかを決定するために研究した。これを確認するために、マウスを、致死量の炭疽菌致死性毒素（ＰＡ＋ＬＦが同時注入される）で攻撃した。使用した用量は、６週齢Ａ／Ｊマウスにおいて決定されるＬＤ５０用量の３倍であった（図４を参照のこと）。
【０１３７】
コントロール群では、７匹のマウスのうち１匹しか、攻撃において生存しなかった。
【０１３８】
対照的に、１０匹のＰＡ免疫化マウスのうちの９匹が攻撃において生存し（ｐ＝０．００９）、および８匹のＬＦ免疫化マウスのうちの７匹（ｐ＝０．００７）が攻撃において生存した。これらのデータは、マウスが毒素−中和抗体を産生したことを示唆した。
【０１３９】
実施例３
エピトープマッピング
免疫化マウス血清において産生される抗ＬＦ、抗ＥＦおよび抗ＰＡ抗体をマッピングするために、８アミノ酸だけ重複する一連の固相結合１０マーペプチドに対して血清をスクリーニングした（図５を参照のこと）。重複デカペプチドは、防御抗原（３７９個のペプチド）、浮腫因子（３９６個のペプチド）および致死因子（４０１個のペプチド）の長さ全体にわたって存在する。
【０１４０】
９６ウェル形式のポリエチレンロッドにおいてデカペプチドを簡便に合成した。改変されたＥＬＩＳＡ技術で、多様なインキュベーションに対し、ピンを９６ウェルプレートに降下し、およびその間に洗浄した。
【０１４１】
各炭疽菌毒素成分に対するそれぞれ個々のデカペプチドを、免疫原性活性について試験した。図６は、致死因子のＢ細胞エピトープについてマウスにおいて得られた結果を実証する。
【０１４２】
実施例４
致死因子のエピトープマッピング
図６は、２８日目の採血〜１０８日目の採血のＬＦ免疫化Ａ／Ｊマウスのマッピング結果を実証する。分子全体を通して複数のエピトープが存在することを見出した。いくつかのエピトープは１０８日目までに反応性が減少したが、致死因子毒素の所定の領域は１０８日目まで強度の上昇または変化を保持した。アジュバント単独で免疫したマウスは、いずれのデカペプチドにも有意に結合することはできなかった。１．０もしくはそれ以上のＯ．Ｄ．を伴う少なくとも１つデカペプチドにおよんだ領域を、エピトープとみなした。これらのエピトープのサブセットを例として図６において強調する。
【０１４３】
０．２（Ｏ．Ｄ）のスケールを超える免疫原性が観察される個々のデカペプチドを、免疫原性ペプチドとして同定した。各伸長型エピトープ（複合的配列して示される）は、０．４以上のＯ．Ｄ．を実証する少なくとも１つのデカペプチドを含むことが必要とされる。
【０１４４】
例として強調したエピトープのサブセットを、致死因子の結晶構造上に重ね合わせた。
【０１４５】
図６の結晶構造上に重ね合わせ、また表１において同定されるエピトープは、野生型致死因子の以下のアミノ酸位置に対応する（配列番号２を参照のこと）。
【０１４６】
１：ＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩ（配列番号９５）：野生型致死因子のアミノ酸９４〜１１４に対応する。
２：ＳＥＤＫＫＫＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨ（配列番号９６）：野生型致死因子のアミノ酸１３１〜１５０に対応する。
３：ＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＧＥＩＮＬＳＬＥＥＬＫＤ（配列番号２６５）：野生型致死因子のアミノ酸２６１〜２９４に対応する。
４：ＬＬＫＫＬＱＩＰＩＥ（配列番号４７）：野生型致死因子のアミノ酸３２５〜３３４に対応する。
５：ＳＬＳＱＥＥＫＥＬＬＫＲＩＱ（配列番号１０２）：野生型致死因子のアミノ酸３４３〜３５６に対応する。
６：ＤＦＬＳＴＥＥＫＥＦＬＫＫＬＱＩＤＩＲＤ（配列番号２６６）：野生型致死因子のアミノ酸３６１〜３７８に対応する。
７：ＳＬＳＥＥＥＫＥＬＬＮＲＩＱ（配列番号１０４）：野生型致死因子のアミノ酸３８１〜３９４に対応する。
８：ＬＳＥＫＥＫＥＦＬＫＫＬＫＬＤＩ（配列番号１０５）：野生型致死因子のアミノ酸４０１〜４１６に対応する。
９：ＧＰＹＤＩＮＧＲＬＱＤＴ（配列番号２６７）：野生型致死因子のアミノ酸４１７〜４２８に対応する。
１０：ＬＩＤＳＰＳＩＮＬＤＶＲＫＱ（配列番号１０７）：野生型致死因子のアミノ酸４３１〜４４４に対応する。
１１：ＬＶＤＧＮＧＲＦＶＦＴＤＩＴＬＰ（配列番号１１０）：野生型致死因子のアミノ酸６５５〜６７０に対応する。
１２：ＧＹＴＨＱＤＥＩＹＥＧＶ（配列番号２６８）：野生型致死因子のアミノ酸６７５〜６８６に対応する。
【０１４７】
興味深いことに、致死因子エピトープは、ドメインＩ、ＰＡ結合ドメインおよびドメインＩＩＩにおいてクラスターを形成する傾向があり、これらは、ＭＡＰ−キナーゼ−キナーゼ基質に接触するいくつかの残基を有する。
【０１４８】
また、致死因子のドメインＩＶ、触媒ドメインにおいても２つのエピトープを観察した。
【０１４９】
実施例５
防御抗原のエピトープマッピング
図７は、２８日目の採血〜１０８日目の採血のＰＡ免疫化Ａ／Ｊマウスのマッピング結果を実証する。さらに、分子全体を通して複数のエピトープが存在することを見出した。高い抗体価にもかかわらず、ＰＡは、ＬＦについて観察される場合より少ないエピトープを有した。
【０１５０】
０．４（Ｏ．Ｄ．）もしくはそれ以上の反応性を伴う少なくとも１つデカペプチドにおよんだ領域を、エピトープとみなした。８個の優勢なエピトープ、すべての同定されたエピトープのサブセットを、例としてＰＡ結晶構造に重複させた。興味深いことに、エピトープのうちの１つはフューリン切断部位におよぶが、エピトープのうちの２つは、ＬＦおよびＥＦへの結合に影響を及ぼすことに関与しているＰＡの領域において生じる。
【０１５１】
エピトープ５は、結晶構造において解明されていない。
【０１５２】
また、いくつかのマークされていないエピトープを図７に示す。本実施例では、０．２のスケールを超える免疫原性であり、および０．４もしくはそれ以上の反応性を伴う少なくとも１つのデカペプチドを含むことが観察された個々のデカペプチドが免疫原性ペプチドを規定する。
【０１５３】
図７の結晶構造上に重ね合わせ、また表４において同定されるエピトープ（配列上の番号）は、野生型防御抗原の以下のアミノ酸位置に対応する（配列番号１を参照のこと）。
【０１５４】
１：ＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＤＳＥＮ（配列番号２６９）：野生型防御抗原のアミノ酸６７〜８６に対応する。
２：ＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤ（配列番号１５６）：野生型防御抗原のアミノ酸１８５〜２０６に対応する。
３：ＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰ（配列番号１５９）：野生型防御抗原のアミノ酸２５７〜２７８に対応する。
４：ＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮ（配列番号１６２）：野生型防御抗原のアミノ酸２９３〜３１０に対応する。
５：ＮＡＥＶＨＡＳＦＥＤＩＧＧＳＶＳＡＧ（配列番号２７０）：野生型防御抗原のアミノ酸３３５〜３５２に対応する。
６：ＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳ（配列番号１６７）：野生型防御抗原のアミノ酸５７３〜５８８に対応する。
７：（配列番号１７０）：野生型防御抗原のアミノ酸６３３〜６５４に対応する。
８：ＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫ（配列番号１７１）：野生型防御抗原のアミノ酸６５３〜６６２に対応する。
【０１５５】
実施例６
株背景対ＭＨＣ
ＰＡおよびＬＦの同定可能なＢ細胞エピトープの数を広げるために、免疫化Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてもまたエピトープをマッピングした（図８を参照のこと）。
【０１５６】
エピトープ選択におけるＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ対遺伝的背景の相対的重要性を評価するために、Ａ／ＪマウスのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプにコンジェニックなＣ５７ＢＬ／６マウスにおける応答についても評価した（図８を参照のこと）。
【０１５７】
図９は、２８日目の採血におけるＬＦ免疫後のマッピング結果を示す。
【０１５８】
いくつかのエピトープを株間で共通であると同定し、「Ｃ」で示される一方、他のエピトープは遺伝的背景に依存し、「Ｂ」で示される。この場合、Ａ／Ｊ背景は重要である。
【０１５９】
興味深いことに、他のエピトープはＭＨＣクラスＩＩの影響を強く受け、およびこれらのエピトープは「Ｍ」で示される。その場合、「ｋ」ハプロタイプは、このエピトープに必要である。
【０１６０】
全体的に、ほとんどのエピトープが非ＭＨＣ背景遺伝子によって決定される一方、いくつかのエピトープが２つの株の間で共通であった。
【０１６１】
ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプは、Ｂ細胞エピトープ選択の重要な決定基ではないことを見出した。
【０１６２】
図１０は、２８日目の採血におけるＰＡ免疫後のマッピング結果を示す。
【０１６３】
実施例７
ワクチン接種ヒトにおける防御抗原に対する抗体の評価
炭疽ワクチン接種後の体液性免疫応答についての調査を開始するために、吸収炭疽ワクチン（ＡＶＡ）の３回もしくはそれ以上の投薬を受けた個体を採用し、および末梢血液を回収した。１１４例のワクチン接種した個体ならびに２６例の非ワクチン接種コントロールの集団（ｃｏｈｏｒｔ）を研究に採用した。個体の大部分６１．４％は白人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）であり、２３．６８％のアフリカ系アメリカ人（Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ）、５．２６％のアジア人（Ａｓｉａｎ）、および９．６４％のその他の民族を伴った。平均年齢は３３．８３（±８．６）であり、ワクチン接種の平均回数は５．１２（±１．４７）であり、および最後のワクチン接種からの平均時間は２．４５（±１．３９）年であった。
【０１６４】
これらの個体由来の血清を、標準的なＥＬＩＳＡにおいて使用し、防御抗原、致死因子、および浮腫因子のレベルを検出した。コントロールの平均＋２倍の標準偏差より大きい光学密度をポジティブとみなした。ワクチン接種した個体は検出可能な抗防御抗原抗体を有する（図１１）一方、ただ１つのサブセットのみが検出可能な抗致死因子または抗浮腫因子抗体を有した。抗防御抗原抗体を伴う個体は、抗体価（１：１０、１：１００、１：１，０００、および１：１０，０００）に基づいて４つのグループに分けることができた。意外にも、抗原特異的抗体のレベルは、ワクチンを接種した固体の年齢にも、またワクチン接種の回数にも相関しなかった（図１１）。さらに、抗致死または浮腫因子抗体の有無は、抗防御抗原抗体のレベルに相関しなかった。しかし、ワクチン接種後の年数と抗ＰＡ力価との間のには、有意な（ｐ＝０．０００８）逆相関が見出された。それ故、最も高い力価の抗防御抗原抗体を伴うそれらの個体に、ごく最近ワクチン接種した（ワクチン接種後１．０±０．４年、図１１）。
【０１６５】
実施例８
毒素マクロファージ死滅のインビトロ阻害についてのＡＶＡワクチン化個体血清の評価
潜在的に中和している抗体が最も興味深いため、本実施例では、高応答体であるそれらの個体において同定されるエピトープ（図２３および表７）ならびに毒素中和について高い能力を伴う領域における抗体に注目した。高応答体において同定される最も優勢なエピトープは、エピトープ、ＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡ（配列番号１９７）であり、フューリン切断部位を含む領域として同定された。事実、高応答体の６例中５例（または８３％）は、固相ペプチドアッセイに基づいて、この抗原領域に対して指向された抗体を有した。フューリン切断部位内のこのエピトープに加えて、他の２つのエピトープが防御を仲介する能力について分析した。これらのうち第１のものは、リガンド結合領域内のエピトープ（ＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶ、配列番号１９９）であった。最後のエピトープは、防御抗原で免疫したマウス由来の血清に対して固相ペプチドアッセイを使用して同定した（下記において説明する）が、これは防御抗原の受容体結合ドメイン内に存在する。
【０１６６】
目的のこれらの３つのエピトープに対して指向された抗体について試験するために、これらの領域を含むペプチドを合成し、およびペプチド特異的ＥＬＩＳＡにおいて使用した。図２２（パネルＡ〜Ｃ）において示されるように、フューリン切断部位エピトープにおいて指向された抗体で１６例の個体を同定し、リガンド結合部位エピトープで指向された抗体で１２例の個体を同定し、および受容体結合部位において同定された抗体で１８例の個体を同定した。一旦、これらの独特な抗原領域が同定および確認されたら、これらのエピトープに対する抗体が防御を仲介する能力について試験した。それ故、カラム吸収を使用して、ペプチド特異的抗体を富化し、続いて、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡおよび毒素中和を行った。図２２（パネルＤ〜Ｆ）において示されるように、すべての場合において、対応するペプチドに特異的な抗体を有意に富化および枯渇することが可能であった。次いで、これらの富化および枯渇されたサンプルを、標準的な毒素中和アッセイにおいて使用し、これらのペプチド特異的抗体が防御を仲介する能力について試験した。図２２（パネルＧ）において示されるように、フューリン切断部位内のエピトープに対して指向された抗体は毒素活性を阻止することが可能であった一方、他の２つのエピトープにおいて指向された抗体はそれほど可能ではなかった。それ故、ＡＶＡワクチン接種後に作製されるフューリンペプチド特異的抗体は、毒素活性を中和することが可能である。
【０１６７】
実施例９
防御抗原抗体の特異性
実施例３について上記に記載のように、固相支持体上に合成された重複デカペプチドを利用して、防御抗原抗体応答の精密な特異性を評価した。簡単に説明すると、ワクチン接種した個体由来の血清を、ＰＡの重複デカペプチドと共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰに連結されたヒトＩｇＧコンジュゲートと共にインキュベーションを行い、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。図１２において示されるように、ワクチン接種後の防御抗原抗体応答の精密な特異性を明確に観察することができる。図１２はまた、ＰＡの結晶構造上に重ね合わせられたほとんどの反応性エピトープ（エピトープ番号１〜９）を示す。免疫原性に関連する領域の観察は、エピトープおよび免疫原性ペプチド断片である個々のデカペプチドの検出を可能にする。
【０１６８】
図２３は、ワクチン接種した個体血清がマクロ相死滅を阻害する能力（中和の代用インビトロモデル）によって階層化される応答の精密な特異性を示す。体液性エピトープ特異性のさらなるおよび独特な領域を、この方法によって決定した。
【０１６９】
実施例１０
ワクチン接種ヒトにおける致死因子に対する抗体の評価
上記で考察したように、炭疽ワクチン接種後の体液性および細胞性免疫の検査のために、吸収炭疽ワクチン（ＡＶＡ）の３回もしくはそれ以上の投薬を受けた個体、ならびに年齢、性別、および人種の一致した非ワクチン接種コントロール由来の血清を分析した。図１１において認められるように、試験した大部分の個体は、推奨される６回のワクチン接種を受け、および最後のワクチン接種からの平均時間は、２．３３（±１．９）年であった。致死因子に対する抗体のレベルを検出するために、血清をＥＬＩＳＡによって試験した。コントロールの平均＋２倍の標準偏差より大きい光学密度をポジティブとみなした。
【０１７０】
すべてのワクチン接種した個体（ｎ＝２９）は、検出可能な抗防御抗原抗体を有した（図１１）。しかし、これらのワクチン接種した個体のただ１つのサブセットは、致死因子（ｎ＝９）または浮腫因子（ｎ＝１０）に対する検出可能な抗体を有した。
【０１７１】
実施例３について上記に記載のように、固相支持体上に合成された重複デカペプチドを利用して、致死因子抗体応答の精密な特異性を評価した。簡単に説明すると、ワクチン接種した個体由来の血清を、ＬＦの重複デカペプチドと共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰに連結されたヒトＩｇＧコンジュゲートと共にインキュベーションを行い、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。図１４において示されるように、ワクチン接種後の致死因子抗体応答の精密な特異性を明確に観察することができる。図１４はまた、ＬＦの結晶構造上に重ね合わせられたほとんどの反応性エピトープ（エピトープ番号１〜１０）を示す。免疫原性に関連する領域の観察は、エピトープおよび免疫原性ペプチド断片である個々のデカペプチドの検出を可能にする。
【０１７２】
実施例１１
炭疽菌浮腫因子に対する防御抗体を含む抗血清の作製
図１６は、組換えＥＦまたはアジュバント単独でＡ／Ｊマウスのグループを免疫するために使用される研究計画を示す。０日目にＣＦＡの存在下で初回免疫を行い、および１０、２４および３８日目に追加接種を行った。
【０１７３】
各追加接種の４〜５日後、およびさらに最後の追加接種の１２９日後であった浮腫毒素攻撃の前に、個々のマウスから抗体試験およびエピトープマッピングのための血液サンプルを回収した。
【０１７４】
図１７は、免疫化マウスが組換えＥＦに対して強固な抗体応答を産生していた根拠を実証する。図１７は、市販のＥＦ調製物を使用するＥＬＩＳＡによって決定されるＥＦに対するＩｇＧ抗体価を示す。
【０１７５】
すべてのＥＦ免疫化マウスは、２８、４２および１７１日目に高力価の抗ＥＦ抗体を産生した。
【０１７６】
実施例１２
浮腫性毒素攻撃
実施例１１のマウスを、それらが浮腫毒素−中和抗体を産生したかどうかを決定するために研究した。これを確認するために、はじめに、免疫されていない６週齢のＡ／Ｊマウスにおける浮腫毒素のＬＤ５０を決定した（図１８Ａを参照のこと）。次いで、実施例１１のマウスを、致死量の炭疽菌浮腫毒素（ＰＡ＋ＥＦが同時注入される）で攻撃した。使用した用量は、Ａ／Ｊマウスにおいて決定されるＬＤ５０用量の４倍であった。
【０１７７】
ＥＦ免疫化マウスの５０パーセントが致死性の浮腫毒素攻撃に対して生存した一方、アジュバント単独で免疫されていたコントロールマウスで攻撃に対し生存したのは０％であった（図１８Ｂを参照のこと）。これらのデータは、実施例１１のＥＦ免疫化マウスが浮腫毒素−中和抗体を産生したことを示唆した。
【０１７８】
実施例１３
浮腫因子のエピトープマッピング
図１９は、１５日目の採血および２８日目の採血のＥＦ免疫化Ａ／Ｊマウスのマッピング結果を実証する。応答は、１５日目に単一のエピトープによって開始し、次いで、拡大して、２８日目までには複数のエピトープを含んだことが見出された。アジュバント単独で免疫したマウスは、いずれのデカペプチドにも有意に結合することはできなかった。０．３およびそれ以上のＯ．Ｄ．を伴う少なくとも１つのデカペプチドにおよんだ領域を、エピトープとみなした。この特定のマウス株からの例として、これらのエピトープを図１９において強調し、および既知のＥＦ結晶構造上に重ね合わせる。
【０１７９】
図１９の結晶構造上に重ね合わせ、また表９において同定されるエピトープは、野生型浮腫因子の以下のアミノ酸位置に対応する（配列番号３を参照のこと）。
【０１８０】
１：ＫＮＳＭＮＳＲＧＥＫＶＰＦＡＳＲＦＶ（配列番号２５６）：野生型浮腫因子のアミノ酸１２５〜１４２に対応する。
２：ＹＡＩＮＳＥＱＳＫＥＶＹ（配列番号２５７）：野生型浮腫因子のアミノ酸１５９〜１７０に対応する。
３：ＳＳＤＬＬＦＳＱＫＦＫＥ（配列番号２５８）：野生型浮腫因子のアミノ酸２０５〜２１６に対応する。
４．ＬＥＬＹＡＰＤＭＦＥＹＭ（配列番号２５９）：野生型浮腫因子のアミノ酸２５７〜２６８に対応する。
５．ＥＧＥＩＧＫＩＰＬＫＬＤ（配列番号２６０）：野生型浮腫因子のアミノ酸３９５〜４０６に対応する。
６．ＤＹＤＬＦＡＬＡＰＳＬＴ（配列番号２６１）：野生型浮腫因子のアミノ酸４９１〜５０２に対応する。
７．ＮＷＱＫＱＭＬＤＲＬＮＥＡＶ（配列番号２６２）：野生型浮腫因子のアミノ酸５５１〜５６４に対応する。
８．ＮＥＡＶＫＹＴＧＹＴＧＧ（配列番号２６３）：野生型浮腫因子のアミノ酸５６１〜５７２に対応する。
９．ＱＤＮＥＥＦＰＥＫＤＮＥＩＦ（配列番号２６４）：野生型浮腫因子のアミノ酸５８１〜５９４に対応する。
【０１８１】
実施例１４
マウス免疫血清を使用するＰＡおよびＬＦの中和ペプチドエピトープの同定
ＬＦおよびＰＡ免疫化Ａ／Ｊマウス由来の免疫血清を、それぞれ、図６および７、ならびに表１〜４においても開示される次のエピトープ：ＰＡ１６４〜１７７、ＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤ（配列番号２７１）；ＰＡ２３０〜２４３、ＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫ（配列番号２７２）；およびＬＦ２３２〜２４７、ＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦ（配列番号２７３）から構築される複数の抗原ペプチドカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーに供した。ここで番号は、ＰＡでは配列番号１およびＬＦでは配列番号２におけるアミノ酸を指す。個々のカラム画分を本来の血清容積まで濃縮し、および標準的な致死性毒素仲介マクロファージ細胞死アッセイにおいて滴定した。図２０において示されるように、このようにして精製された抗体のすべての３つの調製物は、細胞生存能％の増加によって示されるように、致死性毒素がマウスマクロファージ細胞系統を死滅させる能力を中和する能力を実証した。各保持された（即ち、ペプチド結合性）画分の全ＩｇＧの濃度を定量したが、これを図２０に示す。
【０１８２】
上記のすべての科学記事、公開、要約、特許および特許出願は、それらの全体が本明細書において参考として援用される。
【０１８３】
本発明について、開示された実施態様を参考にして詳細に説明してきたが、本発明の趣旨および範囲内において多くの変形および改変を行うことができることが理解されよう。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫学の分野に関し、より詳細には、ヒトまたは動物における炭疽菌感染を処置、防止もしくは減少するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
炭疽は、胞子形成菌の炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ）によって生じる疾患である。動物産物を扱う仕事をするヒト、特に、獣医、検査技師、農場従事者および動物の皮膚または毛を扱う仕事をする従業者のような個体は、炭疽にかかる危険性がある。イラン、トルコ、イラク、パキスタン、およびサハラ以南のアフリカのような地域は、炭疽の高度流行地（ｈｙｐｅｒｅｎｄｅｍｉｃ）であるが、生物体は世界のほとんどの地域で見出すことができる。一般的な世界中の集団は、バイオテロ行為の結果としての炭疽菌（感染に脆弱であるが、軍隊は、バイオテロおよび／または戦争行為の結果としての感染に脆弱である。
【０００３】
炭疽は、肺炭疽病、胃腸炭疽病、および皮膚炭疽病の異なる３つの様式で疾患を発現する。肺炭疽病は、胞子を吸入することによって生じる。胃腸炭疽は、汚染された肉中の胞子を摂取することによって生じ、および胞子が開放創に接触する場合、皮膚炭疽病が発生する。非処置の肺または胃腸炭疽は、本質的に１００パーセントの致死率を有する一方、皮膚炭疽は、２５パーセントまでの致死率を有する。
【０００４】
炭疽に感染したヒトでは、処置の奏効は、それらのすべてが生存の可能性を低減し得る抗生物質耐性の発生率の増加、抗生物質が有効であり得る前に発生し得る過度の敗血症性応答、ならびに疑いの減少（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｓｕｓｐｉｃｉｏｎ）および貧弱な早期検出方法に基づく処置の遅延のような、いくつかの因子によって制限される。抗生物質による炭疽の早期処置は、死亡率を減少するのに必須であるが、吸入感染では完全には有効ではないことが公知である。処置の遅延は、生存率をかなり減少する。しかし、感染の初期症状は、一般的な非致死性の感染に類似するため、早期処置は困難である。例えば、炭疽菌胞子を吸入すると、はじめは、一般的な風邪の症状に似た症状を示し得る。さらに、細菌へのかかり方に依存して、炭疽菌感染の症状は、出現までに７〜６０日間を要し得る。さらに、即時的有効な抗生物質処置でさえも、血液中に高レベルで残存し、および継続してそれらの病原作用を仲介し得る循環性毒素の影響を改善しない。
【０００５】
炭疽菌の病原性は、浮腫の出現によって明白にされる毒性効果、および感染した被験体の死をもたらし得るいわゆる致死性の毒性効果の２つの様式で発現される。これらの影響は、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）の３つのタンパク質の組み合わせによって示される毒素系によって産生される毒素の存在に起因すると考えられる。ヒトおよび哺乳動物の両方において、宿主が症状を呈さない感染の初期段階中でさえも、毒素は身体中に増加する。これは、処置の遅延が何故致死性であるかを説明する。それ故、毒素の有害な作用を妨害する処置を含む改善された炭疽菌診療治療が必要不可欠であるだけなく、感染において早期に炭疽の存在を確立するためのポイントオブケアの、迅速、かつ極めて高感度な診断試験が必要不可欠である。
【０００６】
通常ポリクローナル抗体である、毒素を抗体で中和する作動力である受動免疫が、さまざまな細菌感染のための診療治療として使用されている（ＫｅｌｌｅｒおよびＳｔｉｅｈｍ、２０００年）。患者のポリクローナル抗血清の使用に対する主な制約は、異なる種から誘導されるタンパク質に対する患者の免疫応答による「血清病」の可能性である。さらに、より高い親和性抗体は、毒素の中和により有効であるが、ポリクローナル血清またはハイブリドーマ由来のモノクローナル抗体であっても、親和性を意図的に増強するための一般的様式は存在しない。さらに、正常なドナーは炭疽菌に対して有効な体液性免疫を有さないため、プールされたドナーの静脈免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）を使用する従来のアプローチは有効ではない。
【０００７】
炭疽菌に対するワクチンは現在利用可能であるが、最適ではない。ごく最近市販されたワクチンでさえも複数の一次注入、年ごとの追加接種を必要とし、および吸入攻撃および有害事象に対して長期間の有効性の証明を提供することができない。さらに、現在利用可能なワクチンは重度の有害作用を示す。
【０００８】
炭疽菌の毒性の機構は次のとおりである。防御抗原（ＰＡ８３）の８３ｋＤａの形態は、迅速に増殖している炭疽菌細胞から分泌され、およびＴＥＭ８またはＣＭＧ２のような特定の宿主細胞表面受容体に結合する。（Ｈ．Ｍ．ＳｃｏｂｉｅおよびＪ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．８，１０６−１１２（２００５年））。膜結合型フューリン、および／またはフューリン様プロテアーゼ、おそらくＰＡＣＥ４による以後の切断は、アミノ末端２０ｋＤａ断片を遊離し、受容体結合型ＰＡ６３を生じる。次いで、ＰＡ６３サブユニットは、オリゴマー形成して七量体リングとなり、次に、炭疽菌毒素の致死因子および浮腫因子成分に対する結合部位を作製する。受容体／毒素複合体の酸性エンドソームへのエンドサイトーシスは、ＰＡ６３のコンホメーション変化を誘発し、それによって毒素のＡサブユニット（ＬＦまたはＥＦ）がエンドソームに放出される。リソソーム酸性化および以後の受容体放出は、オリゴマーＰＡ６３ポアの不可逆的膜挿入を容易にする。ポアは、ＬＦおよび／またはＥＦの細胞質への輸送を可能にし、ここで、それらは、それらのそれぞれの毒性を誘発する。
【０００９】
ＥＦは、ほとんどの細胞タイプに毒性であるカルシウム／カルモジュリン依存性アデニル酸シクラーゼであり、および局所的炎症および浮腫を生じるが、通常、致死性ではない。防御抗原および浮腫因子からなる浮腫毒素は、最近、マウスモデルにおける組織病巣および死のを引き起こすことが示されている（「Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｅｄｅｍａ ｔｏｘｉｎ ｃａｕｓｅｓ ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅ ｌｅｓｉｏｎｓ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｌｅｔｈａｌｉｔｙ ｉｎ ｍｉｃｅ」、Ｆｉｒｏｖｅｄ，Ａ．Ｍ．、Ｇ．Ｆ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｍ．Ｍｏａｙｅｒｉ、Ｒ．Ｋａｋｋａｒ、Ｙ．Ｓｈｅｎ、Ｊ．Ｆ．Ｗｉｇｇｉｎｓ、Ｅ．Ｍ．ＭｃＮａＩＩｙ、Ｗ．Ｊ．Ｔａｎｇ、およびＳ．Ｈ．Ｌｅｐｐｌａ．Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ１６７：１３０９−１３２０（２００５年）を参照のこと）。
【００１０】
ＬＦは、ＭＡＰ−キナーゼ−キナーゼおよびいくつかのペプチドホルモンを切断する細胞タイプ特異的メタロプロテアーゼである。防御抗原および致死因子の組み合わせによって形成される致死性毒素は、マクロファージの溶解を生じる亜鉛依存性プロテアーゼである。致死因子は、炭疽菌の毒性に関連する主な病原因子であり、および全身性ショックおよび死の原因であると考えられる。いずれの毒素Ａサブユニットも、ＰＡまたは機構的手段による細胞質到達の非存在下では病原性ではない（「Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ ａｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ａｎｔｈｒａｘ ｌｅｔｈａｌ ｔｏｘｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ａｎ ａｃｉｄ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ」、Ａ．Ｍ．Ｆｒｉｅｄｌａｎｄｅｒ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１，７１２３（１９８６年）を参照のこと）。
【００１１】
ＰＡ８３および七量体ＰＡ６３の結晶構造は解明されている（例えば、「Ｃｒｙｓｔａｌ−ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ」、Ｃ．Ｐｅｔｏｓａら、Ｎａｔｕｒｅ．３８５，８３３（１９９７年）を参照のこと）。これらの構造データは、ＰＡ６３のカルボキシ末端側のドメイン４が毒素複合体の受容体仲介取り込みの原因であることを示す実験データ（例えば、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｅｔｈａｌ ｆａｃｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｏｆ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ ｕｓｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｓ．Ｆ．Ｌｉｔｔｌｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−ＵＫ．１４２，７０７ （１９９６年）および「Ｔｈｅ ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｅｎｄ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｓ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｈｒａｘ ｔｏｘｉｎ ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｙ．Ｓｉｎｇｈら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，１５４９３（１９９１年）を参照のこと）を支持する。
【００１２】
炭疽菌は、生物兵器として６０年間を超える間使用されており、また細菌を入手および増殖することが比較的容易であり、ならびに胞子の安定性に基づく大規模な攻撃のための有望な因子である。兵器化された炭疽は、１９４１年、英国政府によって最初に開発され、スコットランド付近の島において炭疽菌胞子の放出が試験された（Ｍｏｕｒｅｚ，Ｍ．Ｒｅｖ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １５２：１３５−１６４（２００４年）およびＧｒｅｅｎｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ａら、Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ Ｓｃｉ ３２３：２９９−３１５（２００２年））。この試験中に感染した個体はいなかった一方、海水およびホルムアルデヒドを使用して土壌を滅菌するまで、島は、４５年間、生物災害の状態であった。しかし、そのとき以来、ヒトへの感染および死を生じる軍事用炭疽菌の偶発的ならびに意図的な放出が認められている。１９７９年にソビエト社会主義共和国連邦の軍事施設から炭疽の偶発的放出により、６８人が死亡、および３１マイルまで離れた所でのウシの感染が発生した。そして２００１年、米国において感染した手紙を介する意図的な炭疽の散布により、２２例が炭疽（１１例の皮膚炭疽および１１例の肺炭疽）を発症し、５人が死亡した（Ｇｕａｒｎｅｒ，Ｊ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐａｔｈｏｌ １６３：７０１−７０９（２００３年）およびＱｕｉｎｎ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９０：１２２８−１２３６（２００４年）を参照のこと）。これらの出来事は、炭疽菌胞子のエアロゾル状態での放出からの防御を提供する安全、有効なワクチンおよび早期診療のための潜在的に指向された免疫治療剤の必要性を強調する。
【００１３】
現在の米国のワクチン（吸収炭疽ワクチン、ＡＶＡ）は、弱毒Ｖ７７０−ＮＰ１−Ｒ株、非カプセル化ウシ単離体のアルハイドロゲル吸収型無細胞ろ過物である。このワクチン接種は０、２、４週間目、ならびにさらに６、１２、および１８ヶ月目に投与され、年ごとの追加接種が推奨される。このワクチンに関する初期のデータは、動物研究から得られており、ＡＶＡは炭疽菌の完全なビルレント株による致死性の攻撃からマウスを保護しない一方、ワクチン接種されたマウスは、非カプセル化株による攻撃から保護されることを示す。これらのモデルはまた、主な毒素タンパク質（ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦ）に対する抗体の受動輸送が、弱毒株による攻撃に対する防御を提供することができることを実証している（Ｌｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６５：５１７１−５１７５（１９９７年）；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ５６：１８０７−１８１３（１９８８年）；Ｐｒｉｃｅ，Ｂ．Ｍら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６９：４５０９−４５１５（２００１年）およびＷｅｌｋｏｓ，Ｓ．ら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４７：１６７７−１６８５（２００１年）を参照のこと）。ＰＡ、ＬＦ、およびＥＦに対する抗体はまた、臨床的炭疽と診断された個体の血清サンプルにおいて検出されているが、ワクチン接種は、主に抗防御抗原抗体を生じる。しかし、炭疽菌の変異株をワクチン接種されたマウスを使用するいくつかの研究により、ＬＦおよびＥＦの防御への有意な寄与が示されている（Ｍｏｈａｍｅｄ，Ｎ．ら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７２：３２７６−３２８３（２００４年）およびＬｉｔｔｌｅ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ １９９：６７６−６８２（１９９４年）を参照のこと）。それ故、これらのタンパク質に対する抗体のレベルを増強することは、防御を増強し得る。従って、現在のワクチンが最適でないため、新規かつ改善された予防的組成物および方法が必要である。
【００１４】
必要なものは、炭疽菌感染の症状を防止、阻害および低減することができる方法ならびに組成物である。組成物は、炭疽菌毒素、即ち、防御抗原、致死因子および浮腫因子の活性を克服することが可能であるべきである。好ましくは、組成物は、動物またはヒトにおける免疫応答を誘導することが可能であるべきである。また、致死因子および浮腫因子のような炭疽菌毒素の成分に指向された中和抗体を産生させるために使用することができる組成物も必要である。さらに加えて、必要なものは、特に、炭疽菌感染に指向された免疫療法に使用することができる方法および組成物である。最後に、炭疽菌感染の症状を防止、阻害および低減するための方法ならびに組成物は、好ましくは、非毒性であるべきであり、およびほとんど副作用を生じるべきではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
炭疽菌感染の症状を処置、防止、阻害および低減するための方法ならびに組成物を提供する。本明細書に記載の組成物は、炭疽菌毒素、即ち、防御抗原（ＰＡ）、致死因子（ＬＦ）および浮腫因子（ＥＦ）の活性を特異的に克服する。より詳細には、組成物は、場合により、ＰＡを含む到達ビヒクルもしくは担体ポリペプチドと組合されるペプチド、または炭疽菌の抗原領域に対応するエピトープ、あるいはこれらの活性断片を含む免疫原性組成物を含む。特定の実施態様では、組成物は、炭疽菌毒素に関連する１つもしくはそれ以上の抗原領域に対応する複数のエピトープを含む。さらなる実施態様では、炭疽菌毒素に関連する抗原領域は、動物もしくはヒトに投与される場合、免疫原性応答を誘発するＰＡ、ＬＦまたはＥＦから誘導されるペプチドあるいはペプチド断片である。別の実施態様では、組成物は、動物もしくはヒトに投与される場合、免疫応答を誘発するＰＡ、ＬＦおよび／またはＥＦから誘導される複数のペプチドあるいはこれらの断片を含む。複数のペプチドは、個別であるか、または例えば融合タンパク質において組み合わされ得る。以下のような理論に拘束されようとは思わないが、本明細書に記載の組成物は、炭疽菌（毒性および感染の防止または減少を生じる体液性免疫応答を誘発してもよい。
【００１６】
本明細書において提供される組成物は、２０ｋＤａ未満の分子量を有する免疫原性炭疽菌ペプチドを含み、従って、炭疽ワクチンにおける使用が意図される先に記載の抗原ドメインより小さい。ペプチドは、好ましくは、４０アミノ酸長もしくはそれ以下である。ペプチドは、場合により、例えば、防御抗原タンパク質に限定されない担体に結合される。ＰＡに好適なペプチドを表４および６に記載する。ＬＦに好適なペプチドを表１〜３および５に記載する。ＥＦに好適なペプチドを表７に記載する。
【００１７】
好ましくは、本明細書に記載の組成物は、炭疽に対する免疫応答を誘導するため、例えば、炭疽菌、炭疽に関連する原因因子に対してヒトもしくは動物を処置、防御またはワクチン接種するための方法において有用である。
【００１８】
本明細書に記載の組成物の特定の実施態様は、到達それらの外部表面に提示されるエピトープ、エピトープ断片、合成ペプチドもしくは保存的に改変されたペプチド断片を有するリポソームまたはビヒクルなどの、到達または担体ビヒクルをさらに含む。別の実施態様では、所望されるエピトープまたはその免疫原性ペプチド断片は、部分的または全体的に、担体、例えば、リポソームでカプセル化されてもよい。さらに別の実施態様では、エピトープもしくはそれらの免疫原性断片またはペプチドは、金コロイドなどの金属コロイドを使用する到達機構によって所望される部位に輸送されてもよい。上記の組成物は、所定の炭疽菌毒素に対する免疫を改善するためのワクチンとして有用であり、それがなければ、免疫系によって効果的に標的化されない。
【００１９】
組成物は、炭疽の衰弱効果を減少するための治療計画においてさらに有用である。以下のような理論に拘束されようとは思わないが、得られる循環抗体は炭疽菌毒素に結合ることによって、炭疽菌感染の普及を防止するか、既存の感染を減少するか、または感染の影響を低減すると考えられる。
【００２０】
組成物はまた、炭疽菌抗原エピトープに特異的な、単離されたおよび組換え抗体を含む。単離された抗体は、強力な抗原刺激免疫応答を伴うヒトまたは動物から産生および精製され、およびそのような循環抗体を必要とする脆弱、非機能的もしくは非抗原刺激化免疫系を伴うヒトまたは動物に注入される。抗体は、本明細書に記載のペプチドの１つもしくはそれ以上を動物に投与し、次いで、必要とされる抗体を回収、精製および改変すること、またはタンパク質／タンパク質断片／ペプチドで免疫した動物、ワクチン接種した個体もしくは炭疽菌感染の生存体から防御、抗ペプチド応答をアフィニティー精製することのいずれかによって、生成される。これらのアフィニティー精製された抗体は、配列決定し、および免疫治療剤としての使用のために組換え的に産生させることができる。抗体は、モノクローナル抗体であっても、またはポリクローナル抗体であってもよい。抗体は、動物に投与される場合、炭疽に対して免疫応答を誘導する２０ｋＤａ未満の分子量、好ましくは、４０アミノ酸長もしくはそれ以下を有する炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性である。それ故、炭疽菌感染は、炭疽菌毒素に関連する独特なエピトープもしくはペプチドを含む組成物を使用する個体の能動免疫か、または抗体もしくは炭疽菌毒素に特異的な抗体の群を投与することを介する受動免疫のいずれかによって、減少あるいは阻害される。抗体は、患者に投与される場合の有害作用を減少するように改変してもよい。ヒト化抗体は、この用途に理想的である。
【００２１】
あるいは、抗体またはペプチドは、イムノアッセイなどの方法における試薬として使用される。抗体またはペプチド試薬は、潜在的に感染した動物またはヒト由来のサンプルと組み合わされ、および抗体−抗原複合体の形成が検出される。イムノアッセイは、循環抗体または炭疽菌タンパク質を検出することのいずれかによって、動物またはヒトにおける炭疽菌感染を検出するのに有用である。あるいは、イムノアッセイは、動物またはヒトにおける炭疽菌感染に対する特異的防御免疫を検出するのに有用である。予め決定された抗炭疽抗体価を検出する場合、動物は、炭疽攻撃に対して保護されるべきであり、および以後のワクチン接種または追加接種は必要でなくてもよい。
【００２２】
従って、本発明の目的は、炭疽菌によって生じる感染の影響を防止および減少するための方法ならびに組成物を提供することである。
【００２３】
本発明の別の目的は、炭疽の発生または蔓延を防止、減少および処置するための方法ならびに組成物を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、宿主における活性な体液性および／または細胞性応答を誘発することによって、炭疽菌によって生じる感染を有するヒトまたは動物におけるこのような感染の影響を防止および減少するための方法ならびに組成物を提供することである。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、炭疽菌感染に対してヒトまたは動物にワクチン接種するための方法および組成物を提供することである。
【００２６】
本発明のさらに別の目的は、炭疽菌感染に対してヒトまたは動物に受動免疫するための方法および組成物を提供することである。
【００２７】
本発明の別の目的は、抗原性であり、およびヒトまたは動物において炭疽菌に対する免疫応答を誘発する炭疽菌毒素に関連する独特なエピトープを含む組成物を提供することである。
【００２８】
本発明の別の目的は、抗原性であり、およびヒトまたは動物において炭疽菌に対する免疫応答を誘発する炭疽菌毒素に関連する独特なエピトープを含む組成物を提供することであって、毒素は、個々にもしくは組み合わせで、防御抗原、致死因子、または浮腫因子である。
【００２９】
本発明のさらに別の目的は、炭疽菌に対して個体の応答を増加するように抗原性部分で改変された炭疽菌エピトープまたはペプチド断片およびその使用方法を提供する。
【００３０】
本発明の別の目的は、炭疽に対してヒトまたは動物を受動免疫するのに有用な抗体を提供することである。
【００３１】
本発明のこれらおよび他の目的、特徴ならびに利点は、開示された実施態様の以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲の検討後に明らかとなろう。
【００３２】
本明細書に記載の組成物および方法は、本明細書に含まれる具体的な実施態様の以下の詳細な説明を参考にして、さらに容易に理解し得る。本発明について、その特定の実施態様の具体的な詳細を参考に説明してきたが、そのような詳細は、本発明の範囲を制限するものとして認識すべきではないことが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、炭疽菌病原因子の結合およびプロセシングの概略図を提供する。
【図２】図２は、マウスにおける中和抗体を含む抗ＬＦおよび抗ＰＡ抗血清の作製のための研究の詳細を提供するフローチャートである。
【図３】図３は、免疫化Ａ／Ｊマウスにおける抗ＬＦおよび抗ＰＡ ＩｇＧ抗体価の結果を提供するエンドポイント力価のグラフである。
【図４】図４は、致死性毒素攻撃のための研究計画を提供するフローチャートである。
【図５】図５は、連続的重複ペプチド配列に特異的な抗体の検出のための固相ＥＬＩＳＡ技術の概略図を提供する。
【図６】図６は、致死因子の連続的マウスＢ細胞エピトープのデータを提供する。
【図７】図７は、防御抗原の連続的マウスＢ細胞エピトープのデータを提供する。
【図８】図８は、Ｂ細胞エピトープ選択における株背景対ＭＨＣの計画研究を提供する。
【図９】図９は、Ａ／Ｊ、Ｂ６およびＢ６．Ｈ２ｋマウスにおける致死因子エピトープのデータを提供する。
【図１０】図１０は、Ａ／Ｊ、Ｂ６およびＢ６．Ｈ２ｋマウスにおける防御抗原エピトープのデータを提供する。
【図１１】図１１Ａ〜Ｄは、ＡＶＡワクチン接種後の抗炭疽菌抗体に関するデータを提供する。
【図１２】図１２は、連続的ヒトＢ細胞防御抗原抗体のデータを提供する。
【図１３】図１３は、ヒト防御抗原体液性エピトープの表を提供する。
【図１４】図１４は、連続的ヒトＢ細胞致死因子体液性エピトープのデータを提供する。
【図１５】図１５は、ヒト致死因子体液性エピトープの表を提供する。
【図１６】図１６は、マウスにおける中和抗体を含む抗浮腫因子（ＥＦ）抗血清の作製のための研究の詳細を提供するフローチャートである。
【図１７】図１７は、免疫化Ａ／Ｊマウスにおける抗ＥＦ ＩｇＧ抗体価の結果を提供する。
【図１８】図１８ＡおよびＢは、ＥＦ免疫化Ａ／Ｊマウスにおける致死浮腫毒素攻撃の結果を提供する。
【図１９】図１９ＡおよびＢは、ＥＦの連続的マウスＢ細胞エピトープのデータを提供する。
【図２０】図２０は、ＰＡおよびＬＦ免疫化マウスから精製されるペプチド結合性抗体は、致死性毒素の作用をインビトロで中和することができることを示すデータを提供する。
【図２１】図２１は、ＩｇＧ抗ＰＡペプチド濃度および生存能パーセントを示すグラフを提供する。
【図２２】図２２Ａ〜Ｇは、ペプチドエピトープの確認を示すデータのグラフである。
【図２３】図２３Ａ〜Ｃは、ヒトＡＶＡワクチン由来のいくつかのペプチド結合性抗体が致死性毒素の作用をインビトロで中和することができることを示すデータを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書では、ヒトまたは動物における炭疽に対する免疫応答を誘導するための免疫原性炭疽菌ペプチド組成物および方法について説明する。抗炭疽菌抗体、抗体を作製する方法、および抗体を使用して炭疽菌感染を処置するための方法についても説明する。さらに、炭疽菌感染の検出のための試薬およびアッセイについて説明する。
【００３５】
本明細書において提供される炭疽菌ペプチドは免疫原性であり、および２０ｋＤａ未満の分子量を有する。ペプチドは、防御抗原（ＰＡ）タンパク質、致死因子（ＬＦ）タンパク質、および浮腫因子（ＥＦ）タンパク質として公知の免疫学的に重要な炭疽菌タンパク質の部分もしくは断片、またはこれらの組み合わせである。好ましくは、各炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、４０アミノ酸未満である。より好ましくは、アミノ酸配列は６アミノ酸より大きく、４０アミノ酸未満である。あるいは、アミノ酸配列は６アミノ酸より大きく、２０アミノ酸長未満である。好適な実施態様では、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、１２〜１８アミノ酸の間の長さを有する。あるいは、好適な長さは８〜１０アミノ酸長である。一実施態様では、炭疽菌ペプチドの連続アミノ酸配列は１２アミノ酸長である。選択的および代表的な炭疽菌ペプチドアミノ酸配列を本明細書において提供する。
【００３６】
本明細書において提供される抗体は、特に、ＰＡ、ＬＦまたはＥＦである炭疽菌タンパク質に免疫反応性であり、ならびに本明細書に記載の炭疽菌ペプチドを動物に投与し、および炭疽菌ペプチドに特異的な抗体を含む動物から生物学的液体を回収または精製することによって調製される。抗体は、疾患を処置するための免疫療法として、炭疽に感染したヒト患者などの動物に投与される。
【００３７】
本明細書に記載の炭疽菌ペプチドおよび抗体はまた、炭疽菌感染の検出または診断のためのイムノアッセイにおける試薬としても有用である。
【００３８】
本明細書に記載の炭疽菌ペプチドをコードする核酸配列もまた、本発明の範囲内にあると考えられる。これらの核酸配列は、炭疽菌ペプチドの産生に有用である。核酸配列はまた、ＤＮＡワクチンとしても有用であり、およびベクターに挿入して、動物またはヒトにトランスフェクトし、抗原エピトープもしくはペプチドを系に導入することによって、身体に免疫原性ペプチドに対する免疫応答を装架させる。
【００３９】
定義
本明細書において使用する用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、１つもしくはそれ以上を意味するものとして規定され、および文脈が不適切である場合を除いて複数を含む。
【００４０】
本明細書において使用する用語「抗体」または「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル、キメラ、一本鎖、二重特異性、サル化、およびヒト化抗体ならびにＦａｂ断片を含み、Ｆａｂ免疫グロブリン発現ライブラリーの産物を含む。
【００４１】
用語「抗原」は、動物における免疫応答を誘導することができる全体またはその断片を指す。用語は、免疫原および抗原性または抗原決定基を担う領域を含む。
【００４２】
本明細書において用いる語句「生物学的活性」は、生物系から誘導される化合物もしくはこれらに反応性である化合物、またはこれらの化合物の機能性、反応性、および特異性を模倣する他の化合物の機能性、反応性、および特異性を指す。適切な生物学的に活性な化合物の例として、酵素、抗体、抗原およびタンパク質を含む。
【００４３】
語句「生物学的に純粋な」または「単離された」は、その生来の状態において見出されるように、通常、材料に伴う成分を実質的もしくは本質的に含まない材料を指す。それ故、本明細書に記載のペプチドは、通常、それらのインサイチュ環境に関連する材料を含みない。一般的に、本明細書に記載の単離された抗増殖性ペプチドは、銀染色ゲル上のバンドの強度によって測定されるように、少なくとも約８０％純粋、通常、少なくとも約９０％純粋、好ましくは、少なくとも約９５％純粋である。
【００４４】
タンパク質の純度または均質性は、当該技術分野において周知の多くの方法、例えば、タンパク質サンプルのポリアクリルアミドゲル電気泳動、それに続く染色時の可視化によって示され得る。特定の目的のために、高解像度が必要であり、およびＨＰＬＣまたは精製のための類似の手段が利用される。
【００４５】
好ましくは、本発明のエピトープおよびペプチドは、相対的に長さが短い（即ち、約４０アミノ酸未満）。このような短いアミノ酸配列は、標準的な化学ペプチド合成技術を使用して、合成することができる。
【００４６】
配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に付着させ、続いて、残りのアミノ酸を配列に逐次付加する固相合成は、本明細書に記載の免疫原性ペプチドの化学合成に好適な方法である。固相合成のための技術は、当業者に公知である。
【００４７】
あるいは、本明細書に記載の抗原ペプチドは、組み換え核酸方法論を使用して合成される。一般的に、これは、ペプチドをコードする核酸配列を作製すること、発現カセット中の核酸を特定のプロモーターの制御下に配置すること、宿主においてペプチドを発現させること、発現されたペプチドまたはポリペプチドを単離すること、および必要であれば、ペプチドを再生することに関与する。このような手順を介して当業者を指導するのに十分な技術が、文献において見出される。
【００４８】
一旦発現されると、組換えペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む標準的な手順に従って、精製することができる。均質性が約５０〜９５％の実質的に純粋な組成が好適であり、および８０〜９５％もしくはそれを超える均質性が治療用薬剤としての使用に最も好適である。
【００４９】
当業者であれば、化学合成、生物学的発現または精製後、免疫原性ペプチドが構成性ペプチドの生来のコンホメーションとは実質的に異なるコンホメーションを所有し得ることを認識するであろう。この場合、免疫原性ペプチドを変性および減少し、次いでペプチドを好適なコンホメーションにリフォールディングすることがしばしば必要である。タンパク質を減少および変性し、およびリフォールディングを誘導する方法については、当業者に周知である。
【００５０】
本明細書において使用する用語「体液」として、唾液、歯肉滲出物、脳脊髄液、胃腸液、粘液、尿生殖器分泌物、関節液、血液、血清、血漿、尿、嚢胞液、リンパ液、腹水、胸水、間質液、細胞内液、眼液（ｏｃｕｌａｒ ｆｌｕｉｄ）、精液、乳房分泌物、および硝子体液、および鼻分泌物を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本明細書において使用する用語「担体」は、炭疽菌毒素の免疫原または免疫原性ペプチド断片を組み入れることができるか、または関連させることができ、従って、免疫原または免疫原性ペプチドの部分をヒトもしくは動物の免疫系に提示あるいは暴露し、および免疫原性組成物を炭疽菌について抗原性にする構造を意味する。用語「担体」は、到達方法をさらに含み、ここで、免疫原性ペプチドまたはペプチド断片組成物は、到達機構によって所望される部位に輸送され得る。
【００５２】
さらに、用語「担体」は、当業者に公知のワクチン到達機構をさらに含み、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイド、および防御抗原（ＰＡ）、特に、組換えＰＡを含む炭疽菌由来のポリペプチド、ならびに他のアジュバントを含むが、これらに限定されない。本明細書において提供される抗原エピトープ組成物は、アジュバント、保存剤、希釈剤、乳化剤、安定剤、および公知でありかつワクチンにおいて使用される他の組成物をさらに含むことができることもまた理解すべきである。当該技術分野において公知の任意のアジュバント系は、本明細書に記載の組成物において使用することができる。そのようなアジュバントとして、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、多分散性β−（１，４）結合型アセチル化マンナン、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーアジュバント、改変型脂質アジュバント、サポニン誘導体アジュバント、硫酸デキストランなどの大きなポリマーアニオン、およびアラム（ａｌｕｍ）、水酸化アルミニウム、またはリン酸アルミニウムなどの無機ゲル、を含むが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書において提供される抗原ペプチド組成物において使用することができる担体タンパク質、または担体として、マルトース結合タンパク質「ＭＢＰ」；ウシ血清アルブミン「ＢＳＡ」；キーホールリンペット（ｌｙｍｐｅｔ）ヘモシニアン「ＫＬＨ」；オボアルブミン；フラジェリン；サイログロブリン；任意の種の血清アルブミン；任意の種のγグロブリン；同一遺伝子型細胞；Ｉａ抗原を有する同一遺伝子型細胞；Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸のポリマー；破傷風トキソイド、ならびに、特に、炭疽菌自体に由来する組換えＰＡポリペプチドを含むが、これらに限定されない。担体は、炭疽菌ペプチドにコンジュゲートされるか、またはそうでなければ共有的もしくは非共有的に結合される。
【００５４】
語句「より本質的になる」は、語句が指すペプチドの本質的特性を実質的に変更するあらゆる要素を排除するために、本明細書において使用される。それ故、「〜より本質的になる」ペプチドの記載は、該ペプチドの生物学的活性を実質的に変更するあらゆるアミノ酸置換、付加、欠失または修飾を排除する。
【００５５】
本明細書において使用する用語「浮腫因子」または「ＥＦ」は、炭疽菌の野生型全長浮腫因子を指す（配列番号３およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＡ７９２１５；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ＤＬ，Ｔｉｐｐｅｔｔｓ ＭＴ，Ｌｅｐｐｌａ ＳＨ．Ｇｅｎｅ．１９８８年１２月２０日；７３（２）：３６３−７１を参照のこと）。
【００５６】
用語「有効量」は、ヒトもしくは動物に投与される場合、免疫応答を誘発するか、炭疽菌感染を防止、減少または低減するか、反応性の減少を生じるかまたは炭疽菌疾患の拡張および増殖を阻害するエピトープまたは免疫原性ペプチドの量を指す。有効量は日常的手順に従い、当業者によって容易に決定される。
【００５７】
例えば、免疫原性エピトープ組成物は、筋肉内、非経口的、皮下、エアロゾルとして吸入を介して、または経口的に、１例の患者あたり約１．０μｇ〜５．０ｍｇの範囲で投与し得るが、この範囲を制限することを意図するものではない。免疫応答を誘発するのに必要とされるエピトープまたは免疫原性ペプチド組成物の実際の量は、投与されるエピトープの免疫原性および個体の免疫応答に依存して、それぞれ個々の患者について変動する。結果的に、個体に投与される特定の量は、日常的な実験によって決定され、および当業者の訓練および経験に基づく。
【００５８】
本明細書において使用する用語「エピトープ」は、抗体に結合する三次元構造特徴のような免疫系によって認識される高分子の一部を意味する。あるいは、用語「エピトープ」は、アミノ酸配列によって決定される直鎖エピトープを指す。
【００５９】
また、本明細書において使用する用語「免疫原性の」は、炭疽菌（に対して指向された抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞を誘発または増強し、およびヒトまたは動物における免疫応答に寄与する物質を指す。動物または個体が炭疽菌感染の影響を防止、低減もしくは軽減するように本発明の組成物に対して十分な抗体、Ｔ細胞および他の反応性免疫細胞を産生する場合、免疫応答が発生する。
【００６０】
本明細書において使用する用語「致死因子」または「ＬＦ」は、炭疽菌の野生型全長致死因子を指す（配列番号２およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＭ２６１１７；Ｒｅａｄ ＴＤ、Ｓａｌｚｂｅｒｇ ＳＬ、Ｐｏｐ Ｍ、Ｓｈｕｍｗａｙ Ｍ、Ｕｍａｙａｍ Ｌ、Ｊｉａｎｇ Ｌ、Ｈｏｌｔｚａｐｐｌｅ Ｅ、Ｂｕｓｃｈ ＪＤ、Ｓｍｉｔｈ ＫＬ、Ｓｃｈｕｐｐ ＪＭ、Ｓｏｌｏｍｏｎ Ｄ、Ｋｅｉｍ Ｐ、Ｆｒａｓｅｒ ＣＭ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００２年６月１４日；２９６（５５７５）：２０２８−３３）を参照のこと）。
【００６１】
本明細書において使用する用語「防御抗原」または「ＰＡ」は、炭疽菌の野生型全長防御抗原を指す（配列番号１およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＡＡ２２６３７；Ｗｅｌｋｏｓ ＳＬ、Ｌｏｗｅ ＪＲ、Ｅｄｅｎ−ＭｃＣｕｔｃｈａｎ Ｆ、Ｖｏｄｋｉｎ Ｍ、Ｌｅｐｐｌａ ＳＨ、Ｓｃｈｍｉｄｔ ＪＪ．Ｇｅｎｅ．１９８８年９月３０日；６９（２）：２８７−３００）を参照のこと）。
【００６２】
用語「ペプチド」は、そのα炭素が、あるアミノ酸のα炭素のカルボキシル基と別のアミノ酸のα炭素のアミノ基との間の縮合反応によって形成されるペプチド結合を介して連結されるアミノ酸（一般的には、Ｌ−アミノ酸）の鎖である。鎖の一方の端の末端アミノ酸（即ち、アミノ末端）は遊離のアミノ基を有する一方、鎖の他方の端の末端アミノ酸（即ち、カルボキシ末端）は遊離のカルボキシル基を有する。従って、用語「アミノ末端」（Ｎ末端と略称される）は、ペプチドのアミノ末端におけるアミノ酸上の遊離のα−アミノ基、またはペプチド内の他の任意の位置におけるアミノ酸のα−アミノ基（ペプチド結合に関与している場合はイミノ基）を指す。同様に、用語「カルボキシ末端」（Ｃ末端と略称される）は、ペプチドのカルボキシ末端におけるアミノ酸上の遊離のカルボキシル基、またはペプチド内の他の任意の位置におけるアミノ酸のカルボキシル基を指す。
【００６３】
一般的に、ペプチドを構成するアミノ酸は、アミノ末端から開始し、およびペプチドのカルボキシ末端に向かう方向に増加するような順番で番号付けされる。それ故、あるアミノ酸が別のアミノ酸の「後に続く」という場合、そのアミノ酸は、前方のアミノ酸よりペプチドのカルボキシ末端寄りに位置する。
【００６４】
用語「残基」は、アミノ酸（ＤもしくはＬ）あるいはアミド結合またはアミド結合擬似物によってオリゴペプチドに組み入れられるアミノ酸擬似物を指す。従って、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、または他で制限しない限り、天然に存在するアミノ酸に類似する様式で機能する天然アミノ酸の既知のアナログ（即ち、アミノ酸擬似物）を包含してもよい。さらに、アミド結合擬似物は、当業者に周知のペプチド骨格改変を含む。
【００６５】
さらに加えて、当業者であれば、上記のように、コードされた配列において単一のアミノ酸または小さな百分率のアミノ酸（典型的に５％未満）を変更、付加または欠失する個々の置換、欠失または付加は、保存的に改変されたバージョンであり、ここで、変更は、アミノ酸の化学的に類似のアミノ酸による置換を生じることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該技術分野において周知である。以下の６つの群は、それぞれ、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００６６】
炭疽菌ペプチド組成物
本明細書において提供される炭疽菌ペプチドは、ＰＡ、ＬＦ、もしくはＥＦ炭疽菌毒素タンパク質の免疫原性部分または断片であり、およびペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する。各ペプチドは、以下により詳細に記載されるように、炭疽菌毒素タンパク質の少なくとも１個のエピトープを含む。好ましくは、各炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、４０アミノ酸未満である。一実施態様では、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、６アミノ酸より大きく、４０アミノ酸または２０アミノ酸長未満である。好適な実施態様では、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、６アミノ酸より大きく、２０アミノ酸長未満である。最も好ましくは、炭疽菌ペプチドのアミノ酸配列は、１２〜１８アミノ酸の間の長さを有する。理想的には、炭疽菌ペプチドは８〜１０アミノ酸の間の配列を有する。あるいは、炭疽菌ペプチドは１２アミノ酸長である。
【００６７】
同じまたは異なる炭疽菌毒素タンパク質由来の炭疽菌ペプチドの組み合わせ、炭疽菌ペプチドを含む融合タンパク質、担体に結合された炭疽菌ペプチド、および保存的に改変されたペプチドもまた、本明細書に記載のペプチドの範囲内に含まれる。さらに、ペプチドは、天然に存在する、組換え、改変型または合成であってもよい。
【００６８】
それらの意図される用途に依存して、免疫原性組成物、例えば、炭疽ワクチン組成物を産生させるために、ペプチドは、アジュバント、賦形剤、保存剤、到達ビヒクル、他の抗原性部分などに付着または混合される。炭疽菌ペプチドはまた、それらの抗原性を増加するように改変することもできる。抗原性部分およびアジュバントの例として、親油性ムラミルジペプチド誘導体、非イオン性ブロックポリマー、水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムアジュバント、およびそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
上記のように、各ペプチドは、炭疽菌毒素タンパク質の少なくとも１個のエピトープを含む。エピトープは、免疫系、具体的には、抗体、Ｂ細胞、またはＴ細胞によって認識される高分子の当該部分である。エピトープは、抗体が反応するタンパク質上の単一の抗原性部位である。通常、エピトープは非自己タンパク質から誘導されると考えられるが、認識され得る宿主から誘導される配列もまた、エピトープとして分類される。ほとんどのＢ細胞エピトープは、抗原分子の三次元表面特徴として考えることができる。これらの特徴は正確に適合し、それ故、抗体に結合する。エピトープを認識する抗体の部分はパラトープと呼ばれる。連続的エピトープは、抗体によって認識され得、および分子の表面上または分子の部分的表面上のいずれかにおいて見出され得る。本明細書において使用される方法論は、固相表面において極端に高い濃度／密度で合成される連続的エピトープを構築する。このアプローチは、連続的配列に結合する抗体の検出を可能にし、および、時には、１つの機能的エピトープをもたらす分子の表面上において一緒になる２つの結合領域をさらに同定する。
【００７０】
本明細書において使用されるように、エピトープは、以下の防御抗原、致死因子または浮腫因子の少なくとも１つに関連する免疫原性の領域を含むものとして規定される。一実施態様では、エピトープは、防御抗原、致死因子または浮腫因子に免疫原性であるさまざまな保存的アミノ酸を含む。好ましくは、本明細書に記載の組成物は、これらの３つの炭疽菌毒素タンパク質のそれぞれに由来する１個もしくはそれ以上のエピトープを含む。より好ましくは、組成物は、炭疽菌毒素系のそれぞれの毒素タンパク質、ＰＡ、ＬＦおよびＥＦのそれぞれのドメイン由来の１個もしくはそれ以上のエピトープを含む。
【００７１】
本明細書において提供される免疫原性ペプチドは、全長炭疽菌タンパク質のペプチド、部分または断片である。全長組換え防御抗原、致死因子および浮腫因子タンパク質は、組換えベクター、例えば、標準的な細菌またはバキュロウイルス遺伝子発現系を使用して、産生される。全長タンパク質は、多様な方法を使用して、個々のドメインに切断するかまたは消化することができる。さらに、全長防御抗原、致死因子および浮腫因子のアミノ酸配列およびドメインは、当該技術分野において周知である（また、それぞれ配列番号１〜３およびＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡ２２６３７、ＡＡＭ２６１１７、およびＡＡ７９２１５を参照のこと）。好適な実施態様では、組成物は、これらの炭疽菌毒素タンパク質のそれぞれに由来する１つもしくはそれ以上の免疫原性ペプチドを含む。
【００７２】
好適な実施態様では、組成物は、各炭疽菌毒素タンパク質由来の１つもしくはそれ以上の免疫原性ペプチドを含む。
【００７３】
一実施態様では、炭疽菌ペプチド組成物中のペプチドは、好ましくは、エピトープ（ａ）ヒトについて、１〜９ＰＡ（表６）；１〜１０ＬＦ（表５）および１〜１３ＥＦ（表７）およびそれらの断片（図１２〜１５を参照のこと）ならびに（ｂ）マウスについて、１〜２７ＬＦ（表１）；１〜２８ＬＦ（表２）；１〜２７ＬＦ（表３）；１〜２５ＰＡ（表４）；１〜１７ＥＦ（表８）および１〜９ＥＦ（表９）およびそれらの断片である（図６、７および１９を参照のこと）。
【００７４】
別の実施態様では、ペプチドは表１〜９のペプチドである。防御抗原由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、表４および６〜７のペプチド配列を含む。
【００７５】
致死因子由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、表１〜３および５のペプチド配列を含む。
【００７６】
浮腫因子由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、表８〜１０のペプチド配列を含む。
【００７７】
防御抗原および致死因子由来の好適な炭疽菌ペプチドとして、それぞれ図１３および１５において言及されるペプチド配列を含む。
【００７８】
高度に好適な炭疽菌ペプチドを、以下に記載の表に掲載する。
【００７９】
表１：マウス要約的致死因子
表１は、マウス致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示する。ＬＦを含む８１０アミノ酸のうち、合計で３９２反応性アミノ酸を同定した。正規化されたＯＤ測定によって決定されるように、ペプチドが０．３以上の反応性を有することが観察された場合、ペプチドを反応性とみなした。隣接する重複ペプチドよりなる伸長型エピトープは、０．４もしくはそれ以上のＯＤを実証する少なくとも１つのペプチドを含む必要がある。隣接する反応性ペプチドを実証しない単一の反応性ペプチドは、ＯＤが１．０を超えない限り、エピトープを構成しないものとみなした。この分類に基づいて、全体で、免疫化マウス系における致死因子の２７個のエピトープを同定した。
【００８０】
【表１】
【００８１】
表２：伸長型マウス要約的致死因子
表２は、マウス致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．２より大きい場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。各伸長型エピトープ（複合的配列して示される）は、０．４以上の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を実証する少なくとも１つのデカペプチドを含むことが必要とされる。この場合、ＬＦを含む合計で８１０アミノ酸のうち４４０反応性アミノ酸を同定した。この分類に基づいて、全体で２８個のエピトープを同定した。
【００８２】
【表２】
【００８３】
表３：さらなるマウス致死因子データ
表３は、マウス致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示する。ＬＦを含む８１０アミノ酸のうち、合計で３９２反応性アミノ酸を同定した。正規化されたＯＤ測定によって決定されるように、ペプチドが０．２以上の反応性を有することが観察された場合、ペプチドを反応性とみなした。隣接する重複ペプチドよりなる伸長型エピトープは、０．４もしくはそれ以上のＯＤを実証する少なくとも１つのペプチドを含む必要がある。隣接する反応性ペプチドを実証しない単一の反応性ペプチドは、ＯＤが１．０を超えない限り、エピトープを構成しないものとみなした。この分類に基づいて、全体で免疫化マウス系における致死因子の２７個のエピトープを同定した。
【００８４】
【表３】
【００８５】
表４：編集されたマウスＰＡ
表４は、マウス防御抗原の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．２より大きく、および０．４もしくはそれより大きい反応性を伴う少なくとも１つのデカペプチドを含みた場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて２５個のエピトープを同定した。
【００８６】
【表４】
【００８７】
表５．編集されたヒト致死因子
表５は、ヒト致死因子の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、応答が、コントロールに対し平均＋２標準偏差より大きく、および５０％を超える個体が所定の領域についてポジティブであった場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて、１０個のエピトープを同定した。
【００８８】
【表５】
【００８９】
表６．新たに同定された防御抗原ヒトエピトープ
表６は、ヒト防御抗原の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、ペプチド応答が、コントロールに対し平均＋１．５標準偏差より大きく、および３０％を超える個体が所定の領域についてポジティブであった場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて９個のエピトープを同定した。
【００９０】
【表６】
【００９１】
表７．ＡＶＡワクチン接種された個体血清によって認識され、および中和によって階層化される防御抗原タンパク質内のエピトープ
表７は、インビトロ保護アッセイにおいてマクロファージ死滅を阻害する血清の能力に基づいて個体を階層化した場合のヒト防御抗原の免疫原性デカペプチドおよび対応する体液性エピトープを開示する。ペプチド応答が、コントロールに対し平均＋２標準偏差より大きく、および３０％を超える個体が所定の応答についてポジティブであった場合、エピトープを反応性とみなした。この方法論を使用して、本発明者らは、合計で１３個のエピトープについて、低度の応答体の中に１個の独特なエピトープ、中度の応答体の中に７個の独特なエピトープ、および高度の応答体の中に５個の独特なエピトープを同定することができた。
【００９２】
【表７】
【００９３】
表８．編集された浮腫因子（ヒト）
表８は、ヒト浮腫因子の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、ペプチド応答が、コントロールに対し平均＋２標準偏差より大きく、および６０％を超える個体が所定の領域についてポジティブであった場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて、１７個のエピトープを同定した。
【００９４】
【表８】
【００９５】
表９．マウス要約的浮腫因子
表９は、マウス浮腫因子の免疫原性デカペプチドおよび対応する複合的免疫原性ペプチドを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．１６より大きい場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。各伸長型エピトープ（複合的配列して示される）は、０．３以上の光学密度（Ｏ．Ｄ．）を実証する少なくとも１つのデカペプチドを含むことが必要とされる。この場合、ＥＦを含む合計で８００アミノ酸のうち１１８反応性アミノ酸を同定した。この分類に基づいて、全体で、９個のエピトープを同定した。
【００９６】
【表９】
【００９７】
表１０：さらなるマウス浮腫因子データ
表１０は、マウス浮腫因子の免疫原性デカペプチドおよび対応するエピトープを開示し、ここで、光学密度測定によって決定されるように、ペプチド反応性が０．１６より大きく、および０．３もしくはそれより大きい反応性を伴う少なくとも１つのデカペプチドを含みた場合、ペプチドおよび複合的配列を反応性とみなした。この場合、この分類に基づいて、９個のエピトープを同定した。
【００９８】
【表１０】
【００９９】
炭疽菌ペプチド処方
炭疽菌ペプチドの１つもしくはそれ以上は、既知の技術を使用して、薬学的に許容可能な担体などの生理学的に許容可能な処方において調製することができる。例えば、ペプチドは、治療組成物を形成するために、薬学的に許容可能な賦形剤と組み合わせられる。
【０１００】
あるいは、ペプチドをコードする遺伝子または核酸配列は、遺伝子治療技術を使用する継続投与のためのベクターで到達してもよい。本明細書において提供される組成物は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与してもよい。固体組成物の例として、丸剤、クリーム、およびインプラント可能な投薬単位を含む。丸剤は経口的に投与してもよい。治療用クリームは、局所的に投与してもよい。インプラント可能な投薬単位は、局所的に投与してもよく、または治療組成物の全身放出のために、例えば、皮下にインプラントしてもよい。液体組成物の例として、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内注入に適応可能な処方ならびに局所および眼内投与のための処方を含む。エアロゾル処方の例として、肺への投与のための吸入器処方を含む。
【０１０１】
組成物は、標準的な投与経路によって投与してもよい。一般に、組成物は、局所、経口、経直腸、経鼻または非経口（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内）経路で投与してもよい。さらに、組成物は、持続放出マトリックス、例えば、生分解性ポリマーに組み入れてもよく、そのポリマーは、到達が所望される場所付近にインプラントされる。本方法は、単回投薬の投与、予め決定された時間間隔での反復投薬の投与、および予め決定された期間の持続投与を含む。
【０１０２】
ここで使用されるような持続放出マトリックスは、材料、通常は、酵素もしくは酸／塩基加水分解または溶解によって生分解可能であるポリマーより作製されるマトリックスである。一旦、身体に挿入されたら、マトリックスは、酵素および体液によって作用される。持続放出マトリックスは、望ましくは、生体適合性材料、例えば、リポソーム、ポリラクチド（ポリ乳酸）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）、ポリ酸無水物、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドンおよびシリコーンから選択される。好適な生分解性マトリックスは、ポリラクチド、ポリグリコリド、またはポリラクチド−コ−グリコリド（乳酸およびグリコール酸のコポリマー）のいずれかのうちの１つのマトリックスである。
【０１０３】
あるいは、免疫原性炭疽菌ペプチドは、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子の担体表面免疫原性領域上に存在するように、膜性担体などの担体に挿入することができる。防御抗原、致死因子および浮腫因子は、「非自己」として免疫系によって認識されるため、これらはすべて免疫原性である。しかし、防御抗原、致死因子および浮腫因子毒素の全体未満をリポソームの表面上に挿入すると、エピトープの免疫系への提示を改変し得、場合によって、エピトープの免疫原性を低減し得る。
【０１０４】
免疫原性リポソームは、精製されたまたは部分的に精製された防御抗原、致死因子および浮腫因子の存在下でリポソームを再構成することによって、作製してもよい。さらに、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子ペプチドは、リポソームに再構成してもよい。組成物において使用することができるリポソームは、当業者に公知のリポソームを含む。リポソームを作製するのに有用な任意の標準的な脂質を使用してもよい。標準的な二層および多重層リポソームを使用して、本発明の組成物を作製してもよい。
【０１０５】
組成物の用量は、感染の進行、使用される特定の組成物、および患者の重量および病態などの他の臨床的因子ならびに投与経路に依存する。
【０１０６】
抗炭疽菌抗体組成物
上記の特徴を有する炭疽菌ペプチドは、炭疽菌タンパク質に反応性であるモノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方の産生に使用される。免疫原性ペプチドを含む組成物は、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子に特異的に免疫反応性であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体を産生する。抗体は、当業者に周知の方法によって作製される。
【０１０７】
免疫原性炭疽菌ペプチド組成物ならびに抗ＬＦ、ＥＦおよびＰＡ抗体は、任意の適切な手段、好ましくは、注入によって、ヒトまたは動物に注入される。例えば、防御抗原、致死因子および浮腫因子の免疫原性ペプチドは、皮下または筋肉内注入によって投与される。内部で産生されようとまたは外部の供給源から提供されようと、循環抗ＬＦ、ＰＡまたはＥＦ抗体は適切な受容体に結合し、および感染および疾患を刺激する炭疽菌の能力を減少または不活化する。
【０１０８】
分析物に対するそのより高い特異性のため、好適な抗体はモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に周知の方法によって作製される。好適な方法は、Ｋｅａｒｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：１５４８−１５５８（１９７９年）の方法の改変されたバージョンである。簡単に説明すると、マウスまたはウサギなどの動物に、アジュバント中の免疫原を接種、脾臓細胞を回収、および骨髄腫細胞系統、例えば、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８，６５３と混合する。ポリエチレングリコールの添加によって、細胞を誘導して、融合させる。ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む選択培地（ＨＡＴ）に細胞をプレート化することによって、ハイブリドーマを化学的に選択する。続いて、抗炭疽菌モノクローナル抗体を産生する能力について、ハイブリドーマをスクリーニングする。抗体を産生するハイブリドーマをクローニングし、拡大し、および将来の産生のために凍結保存する。
【０１０９】
本明細書に記載の抗炭疽菌抗体は、炭疽菌感染の処置のための治療組成物および炭疽菌感染の検出または診断のためのイムノアッセイにおける試薬の両方として有用である。抗体は、これらの設計された用途に従って改変することができる。
【０１１０】
炭疽に感染した動物またはヒト患者に投与される治療処置としての用途のための抗炭疽菌抗体は、その抗体がより容易に忍容性であり、およびより少ない有害な副作用を有するように改変してもよい。例えば、当業者に既知であり、および米国特許第６，３３１，４１５号明細書に記載のようなハイブリッド、キメラまたは変更された抗体になるように、抗体を改変してもよい。好ましくは、抗体は、当業者に公知の方法に従って「ヒト化」される。ヒト化抗体、例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、防御抗原、致死因子および／または浮腫因子の重要なエピトープを標的化する患者の免疫原性配列から産生される。免疫原性配列を使用して、炭疽に既に感染したこれらの個体における毒素形成を防止することができる。これらの抗炭疽菌抗体はまた、炭疽菌に対して個体を受動免疫することによって感染の開始を防止し、反応性を減少するか、または炭疽菌の増殖を阻害するために投与される。個体に投与される場合、抗ＬＦ、ＥＦおよびＰＡ抗体は、炭疽菌に結合することによって、炭疽菌毒素の有効な循環濃度を減少する。結果的に、炭疽菌毒素依存性感染は、防止、減少または阻害される。
【０１１１】
抗体が、炭疽菌毒素の検出、例えば、患者における炭疽菌感染の検出のためのイムノアッセイにおける試薬としての用途が意図される場合、それが直接的または間接的な検出であり得るように、抗体を改変し得る。例えば、抗体は、炭疽菌タンパク質の同定および定量のための検出可能な標識で、直接標識してもよい。イムノアッセイにおける用途のための標識は、一般的に当業者に公知であり、および酵素、放射性同位元素、蛍光物質、発光物質および金コロイドおよびラテックスビーズなどの着色された粒子含む発色物質を含む。
【０１１２】
あるいは、抗体は、免疫グロブリン、例えば、タンパク質ＡもしくはＧまたは第二抗体に対する親和性を有する標識された物質との反応によって、間接的に標識してもよい。抗体を、第２の物質にコンジュゲートし、および抗体にコンジュゲートされた第２の物質に親和性を有する標識された第３の物質で検出してもよい。例えば、抗体をビオチンにコンジュゲートし、および標識されたアビジンまたはストレプトアビジンを使用して、抗体−ビオチンコンジュゲートを検出してもよい。同様に、抗体をハプテンにコンジュゲートし、標識された抗ハプテン抗体を使用して、抗体−ハプテンコンジュゲートを検出してもよい。抗体およびアッセイコンジュゲートを標識するこれらならびに他の方法は、当業者に周知である。
【０１１３】
処置すべき疾患および病態
本明細書に記載の炭疽菌ペプチド組成物は、炭疽菌（感染の疾患、症状および合併症を処置、防止、低減または軽減するのに有用である。本明細書に記載の組成物は、炭疽の原因因子に対する予防薬として特に有用であり、および炭疽菌に対するワクチンとして格別に有用である。組成物は、毒素成分、防御抗原、致死因子および浮腫因子に対して指向された中和抗体を産生させることによって、炭疽菌を処置または防止するのに格別に有用である。本明細書に記載の抗炭疽菌抗体組成物は、炭疽菌感染の処置のための免疫療法剤を提供するのに有用である。
【０１１４】
炭疽菌に感染したヒトまたは動物への本明細書において提供される組成物の投与は、感染の症状および免疫原性反応を減少または軽減するのに有用である。
【０１１５】
炭疽菌に暴露する危険性にあるヒトまたは動物への本明細書において提供される組成物の投与は、感染の症状および免疫原性反応を減少または軽減するのに有用である。防御抗原、致死因子および／または浮腫因子の免疫原性ペプチドを含む組成物は、炭疽菌に対する免疫を誘導するためにヒトまたは動物に投与される。免疫されたヒトまたは動物は、防御抗原、致死因子および浮腫因子の対応する領域に結合し、それによって炭疽菌感染を刺激するその能力を減少または不活化する炭疽菌に対する循環抗体を発達する。
【０１１６】
抗体およびイムノアッセイ検出方法
サンプル中の炭疽菌タンパク質の検出のための炭疽菌ペプチド、抗体、方法、およびキットが提供される。上記の炭疽菌ペプチドは、患者由来の生物学的サンプル中の抗炭疽菌抗体を検出するのに有用である。さらに、炭疽菌ペプチドは、生物学的サンプル中の炭疽菌毒素の検出のための抗炭疽菌抗体の産生に有用である。
【０１１７】
上記のように、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦ毒素について感度をを有する抗炭疽菌モノクローナルおよびポリクローナル抗体は、当業者に周知の方法に従って、本明細書に記載の炭疽菌ペプチドの１つもしくはそれ以上で動物を免疫し、エピトープと反応する抗体を単離し、ならびに血液などの生物学的液体から抗体を回収および精製することによって、産生される。
【０１１８】
炭疽菌毒素に免疫反応性の抗体を含むイムノアッセイ方法は、動物サンプルなどのサンプル中の炭疽の検出に有用である。このような抗体を用いるイムノアッセイは、サンプル中の低濃度のタンパク質を検出することが可能である。抗体は、ＰＡ、ＥＦおよびＬＦタンパク質上の１つもしくはそれ以上のエピトープに免疫反応性であり、および最低でもサンプル中に存在し得る他のタンパク質と反応し、それ故、炭疽に暴露した可能性のあるヒトなどのサンプルにおいて炭疽の存在の正確な決定を提供する。好適な抗体は、それらの高い特異性故に、ハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である。
【０１１９】
抗体は、炭疽菌タンパク質の検出のための従来のイムノアッセイ試薬を伴うキットに集合的に集成される。キットは、場合により、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方、ならびにサンプル中の炭疽菌タンパク質の存在の決定のための標準を含み得る。これらの試薬を含むキットは、炭疽菌タンパク質の簡単、迅速な、オンサイト検出を提供する。
【０１２０】
イムノアッセイ
試薬として抗体を用い、上記の炭疽菌ペプチドを使用して調製される高感度なイムノアッセイが提供される。イムノアッセイは、さまざまなサンプル、特にヒトサンプル中の炭疽菌毒素の存在または量を検出するのに有用である。サンプルは、炭疽菌タンパク質が抗体にアクセス可能である任意の供給源から入手し得る。例えば、サンプルは、炭疽に感染した疑いのある動物の血液または血清などの生物学的液体サンプルであり得る。従って、イムノアッセイは、炭疽菌感染の診断または予後に有用である。
【０１２１】
試薬として本明細書に記載の炭疽菌ペプチドを用いるイムノアッセイもまた提供される。ペプチドは、炭疽ワクチンを接種した個体から採取される生物学的サンプル中の炭疽に対する特異的防御免疫を試験するための試薬として使用される。ペプチドは、生物学的サンプル中の抗体に結合する。このタイプのイムノアッセイの結果は、ワクチン接種した個体の炭疽に対する免疫応答性に関する情報を提供し、これは、その個体に必要とされる追加接種の数を減少するために使用することができるか、または代替的防御手順を必要とする個体を同定するために使用することができる。
【０１２２】
試薬は、炭疽菌タンパク質の検出のための任意の異種もしくは同種サンドイッチまたは競合イムノアッセイにおいて用いられ得る。試薬は、検出可能な標識で標識されるか、または固相に結合されるかのいずれかである。試薬を固相に結合するための方法は、当業者に周知である。イムノアッセイ方法に従って、分析物を含むサンプルを、十分な期間、抗体のペプチドへの結合を促進する条件下で、試薬と反応させる。イムノアッセイ試薬およびサンプルは、異なる組み合わせおよび順序で反応され得ることが、当業者に理解されよう。粒子のろ過、コートされたチューブまたはウェルからの反応溶液のデカンテーション、磁気分離、毛管作用、および当業者に公知の他の手段などの固相に結合した試薬を非結合試薬から分離するための物理的手段が用いられる。固相の個別洗浄が方法に含まれ得ることもまた、理解されよう。
【０１２３】
サンプル中の炭疽菌タンパク質、または抗炭疽菌抗体の濃度は、サンプルによって生成される色の強度を色カードと比較するか、または反射計を使用するかのいずれかによって決定される。
【０１２４】
得られる反応混合物、または試薬およびサンプルの組み合わせは、抗体−分析物結合性動力学を最適化する溶液において調製される。適切な溶液は水溶液または緩衝液である。溶液は、好ましくは、特異的結合を促進し、非特異的結合を最小限にし、分析物を可溶化し、試薬反応性を安定化および保護する条件下で提供され、および緩衝液、界面活性剤、溶媒、塩、キレート剤、タンパク質、ポリマー、炭水化物、糖、および当業者に既知の他の物質を含みてもよい。
【０１２５】
反応混合物溶液は、抗体をペプチドに反応および結合させ、抗体−分析物複合体を形成させるのに十分な期間、反応させる。アッセイを完了させるのに必要な時間を最小限にするために、結合を生じる最も短い反応時間が所望される。イムノクロマトグラフィーストリップ試験のための適切な反応期間は、２０分間以下、または約１分間〜２０分間の間である。５分間未満の反応時間が好適である。最も好ましくは、反応時間は３分間未満である。試薬を最適化することによって、試薬を合わせる時に、結合が実質的に完了され得る。
【０１２６】
反応は、試薬が分解もまたは不活化もされない任意の温度で実施される。約４℃〜３７℃の間の温度が好適である。最も好適な反応温度は、周囲または室温（約２５℃）である。
【０１２７】
イムノアッセイキット
サンプル中の炭疽菌タンパク質の検出のためのイムノアッセイキットは、上記のエピトープを使用して調製される１つもしくはそれ以上の抗体を含む。
【０１２８】
キットは、サンプルを入手するための装置、試薬を含むための容器、計時手段、サンプルを希釈するための緩衝液、および比色計、反射計、または色の変化を測定し得る標準をさらに含みてもよい。
【０１２９】
好適な実施態様では、抗体を含む試薬は乾燥状態である。水性サンプルをストリップに添加すると、乾燥試薬の可溶化を生じ、これを反応させる。
【０１３０】
別のイムノアッセイキットは、特異的な防御炭疽菌エピトープ反応性の検出に有用である。ワクチン接種後、防御免疫が作製されている（または継続して作製されている）かどうかを決定するために、しばしば、個体を評価する必要がある。このキットは、固相系に結合した本明細書に記載の免疫原性ペプチドの１つまたは混合物を含む。血清の希釈物は、防御抗体の存在および濃度を測定するために使用されるこれらのペプチドおよび検出系と共にインキュベートされる。
【０１３１】
組成物および方法を、以下の非制限的例によってさらに例示するが、これらは、いかなる様式によっても、それらの範囲に制限を課すものと解釈されるべきではない。対照的に、それらの他の多様な実施態様、改変物、および等価物を採用することができ、それら自体は、本明細書に記載の説明を読んだ後であれば、本発明の趣旨および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく当業者に示唆され得ることが明白に理解されるべきである。
【実施例】
【０１３２】
実施例１
炭疽菌致死性毒素に対する防御抗体および防御抗原を含むマウス抗血清の作製
図２は、組換えＰＡ、組換えＬＦまたはアジュバント単独でＡ／Ｊマウスのグループを免疫するために使用される研究計画を示す。０日目に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）の存在下で初回免疫を行い、および１０、２４および３８日目に追加接種を行った。
【０１３３】
各追加接種の４日後、およびさらに最後の追加接種の７０〜８０日後に行った毒素攻撃の前に、個々のマウスから抗体試験およびエピトープマッピングのための血液サンプルを回収した。
【０１３４】
図３は、免疫化マウスが組換えＬＦおよびＰＡ免疫原に対して強固な抗体応答を産生していた根拠を実証する。図３は、市販のＬＦおよびＰＡ調製物を使用するＥＬＩＳＡによって決定されるＬＦおよびＰＡに対するＩｇＧ抗体価を示す。
【０１３５】
ＬＦ免疫化マウスは２８日目に抗力価の抗ＬＦ抗体を産生し、およびＰＡ免疫化マウスも同様に、２８日目に高力価の抗ＰＡ抗体を産生する一方、アジュバント単独で免疫したマウスは産生しなかった。免疫前に回収したサンプルもまた、これらの抗体に陰性であった。各グループの血清の１／１００血清希釈の平均ＯＤからもまた、このパターンが確認される。
【０１３６】
実施例２
致死性毒素攻撃
エピトープマッピングを行う前に、実施例１のマウスが致死性毒素−中和抗体を産生したかどうかを決定するために研究した。これを確認するために、マウスを、致死量の炭疽菌致死性毒素（ＰＡ＋ＬＦが同時注入される）で攻撃した。使用した用量は、６週齢Ａ／Ｊマウスにおいて決定されるＬＤ５０用量の３倍であった（図４を参照のこと）。
【０１３７】
コントロール群では、７匹のマウスのうち１匹しか、攻撃において生存しなかった。
【０１３８】
対照的に、１０匹のＰＡ免疫化マウスのうちの９匹が攻撃において生存し（ｐ＝０．００９）、および８匹のＬＦ免疫化マウスのうちの７匹（ｐ＝０．００７）が攻撃において生存した。これらのデータは、マウスが毒素−中和抗体を産生したことを示唆した。
【０１３９】
実施例３
エピトープマッピング
免疫化マウス血清において産生される抗ＬＦ、抗ＥＦおよび抗ＰＡ抗体をマッピングするために、８アミノ酸だけ重複する一連の固相結合１０マーペプチドに対して血清をスクリーニングした（図５を参照のこと）。重複デカペプチドは、防御抗原（３７９個のペプチド）、浮腫因子（３９６個のペプチド）および致死因子（４０１個のペプチド）の長さ全体にわたって存在する。
【０１４０】
９６ウェル形式のポリエチレンロッドにおいてデカペプチドを簡便に合成した。改変されたＥＬＩＳＡ技術で、多様なインキュベーションに対し、ピンを９６ウェルプレートに降下し、およびその間に洗浄した。
【０１４１】
各炭疽菌毒素成分に対するそれぞれ個々のデカペプチドを、免疫原性活性について試験した。図６は、致死因子のＢ細胞エピトープについてマウスにおいて得られた結果を実証する。
【０１４２】
実施例４
致死因子のエピトープマッピング
図６は、２８日目の採血〜１０８日目の採血のＬＦ免疫化Ａ／Ｊマウスのマッピング結果を実証する。分子全体を通して複数のエピトープが存在することを見出した。いくつかのエピトープは１０８日目までに反応性が減少したが、致死因子毒素の所定の領域は１０８日目まで強度の上昇または変化を保持した。アジュバント単独で免疫したマウスは、いずれのデカペプチドにも有意に結合することはできなかった。１．０もしくはそれ以上のＯ．Ｄ．を伴う少なくとも１つデカペプチドにおよんだ領域を、エピトープとみなした。これらのエピトープのサブセットを例として図６において強調する。
【０１４３】
０．２（Ｏ．Ｄ）のスケールを超える免疫原性が観察される個々のデカペプチドを、免疫原性ペプチドとして同定した。各伸長型エピトープ（複合的配列して示される）は、０．４以上のＯ．Ｄ．を実証する少なくとも１つのデカペプチドを含むことが必要とされる。
【０１４４】
例として強調したエピトープのサブセットを、致死因子の結晶構造上に重ね合わせた。
【０１４５】
図６の結晶構造上に重ね合わせ、また表１において同定されるエピトープは、野生型致死因子の以下のアミノ酸位置に対応する（配列番号２を参照のこと）。
【０１４６】
１：ＥＫＶＰＳＤＶＬＥＭＹＫＡＩＧＧＫＩ（配列番号９５）：野生型致死因子のアミノ酸９４〜１１４に対応する。
２：ＳＥＤＫＫＫＫＤＩＹＧＫＤＡＬＬＨＥＨ（配列番号９６）：野生型致死因子のアミノ酸１３１〜１５０に対応する。
３：ＱＨＲＤＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦＮＥＧＥＩＮＬＳＬＥＥＬＫＤ（配列番号２６５）：野生型致死因子のアミノ酸２６１〜２９４に対応する。
４：ＬＬＫＫＬＱＩＰＩＥ（配列番号４７）：野生型致死因子のアミノ酸３２５〜３３４に対応する。
５：ＳＬＳＱＥＥＫＥＬＬＫＲＩＱ（配列番号１０２）：野生型致死因子のアミノ酸３４３〜３５６に対応する。
６：ＤＦＬＳＴＥＥＫＥＦＬＫＫＬＱＩＤＩＲＤ（配列番号２６６）：野生型致死因子のアミノ酸３６１〜３７８に対応する。
７：ＳＬＳＥＥＥＫＥＬＬＮＲＩＱ（配列番号１０４）：野生型致死因子のアミノ酸３８１〜３９４に対応する。
８：ＬＳＥＫＥＫＥＦＬＫＫＬＫＬＤＩ（配列番号１０５）：野生型致死因子のアミノ酸４０１〜４１６に対応する。
９：ＧＰＹＤＩＮＧＲＬＱＤＴ（配列番号２６７）：野生型致死因子のアミノ酸４１７〜４２８に対応する。
１０：ＬＩＤＳＰＳＩＮＬＤＶＲＫＱ（配列番号１０７）：野生型致死因子のアミノ酸４３１〜４４４に対応する。
１１：ＬＶＤＧＮＧＲＦＶＦＴＤＩＴＬＰ（配列番号１１０）：野生型致死因子のアミノ酸６５５〜６７０に対応する。
１２：ＧＹＴＨＱＤＥＩＹＥＧＶ（配列番号２６８）：野生型致死因子のアミノ酸６７５〜６８６に対応する。
【０１４７】
興味深いことに、致死因子エピトープは、ドメインＩ、ＰＡ結合ドメインおよびドメインＩＩＩにおいてクラスターを形成する傾向があり、これらは、ＭＡＰ−キナーゼ−キナーゼ基質に接触するいくつかの残基を有する。
【０１４８】
また、致死因子のドメインＩＶ、触媒ドメインにおいても２つのエピトープを観察した。
【０１４９】
実施例５
防御抗原のエピトープマッピング
図７は、２８日目の採血〜１０８日目の採血のＰＡ免疫化Ａ／Ｊマウスのマッピング結果を実証する。さらに、分子全体を通して複数のエピトープが存在することを見出した。高い抗体価にもかかわらず、ＰＡは、ＬＦについて観察される場合より少ないエピトープを有した。
【０１５０】
０．４（Ｏ．Ｄ．）もしくはそれ以上の反応性を伴う少なくとも１つデカペプチドにおよんだ領域を、エピトープとみなした。８個の優勢なエピトープ、すべての同定されたエピトープのサブセットを、例としてＰＡ結晶構造に重複させた。興味深いことに、エピトープのうちの１つはフューリン切断部位におよぶが、エピトープのうちの２つは、ＬＦおよびＥＦへの結合に影響を及ぼすことに関与しているＰＡの領域において生じる。
【０１５１】
エピトープ５は、結晶構造において解明されていない。
【０１５２】
また、いくつかのマークされていないエピトープを図７に示す。本実施例では、０．２のスケールを超える免疫原性であり、および０．４もしくはそれ以上の反応性を伴う少なくとも１つのデカペプチドを含むことが観察された個々のデカペプチドが免疫原性ペプチドを規定する。
【０１５３】
図７の結晶構造上に重ね合わせ、また表４において同定されるエピトープ（配列上の番号）は、野生型防御抗原の以下のアミノ酸位置に対応する（配列番号１を参照のこと）。
【０１５４】
１：ＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＤＳＥＮ（配列番号２６９）：野生型防御抗原のアミノ酸６７〜８６に対応する。
２：ＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤ（配列番号１５６）：野生型防御抗原のアミノ酸１８５〜２０６に対応する。
３：ＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰ（配列番号１５９）：野生型防御抗原のアミノ酸２５７〜２７８に対応する。
４：ＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＮＥＤＱＳＴＱＮ（配列番号１６２）：野生型防御抗原のアミノ酸２９３〜３１０に対応する。
５：ＮＡＥＶＨＡＳＦＥＤＩＧＧＳＶＳＡＧ（配列番号２７０）：野生型防御抗原のアミノ酸３３５〜３５２に対応する。
６：ＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳ（配列番号１６７）：野生型防御抗原のアミノ酸５７３〜５８８に対応する。
７：（配列番号１７０）：野生型防御抗原のアミノ酸６３３〜６５４に対応する。
８：ＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫ（配列番号１７１）：野生型防御抗原のアミノ酸６５３〜６６２に対応する。
【０１５５】
実施例６
株背景対ＭＨＣ
ＰＡおよびＬＦの同定可能なＢ細胞エピトープの数を広げるために、免疫化Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてもまたエピトープをマッピングした（図８を参照のこと）。
【０１５６】
エピトープ選択におけるＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ対遺伝的背景の相対的重要性を評価するために、Ａ／ＪマウスのＭＨＣクラスＩＩハプロタイプにコンジェニックなＣ５７ＢＬ／６マウスにおける応答についても評価した（図８を参照のこと）。
【０１５７】
図９は、２８日目の採血におけるＬＦ免疫後のマッピング結果を示す。
【０１５８】
いくつかのエピトープを株間で共通であると同定し、「Ｃ」で示される一方、他のエピトープは遺伝的背景に依存し、「Ｂ」で示される。この場合、Ａ／Ｊ背景は重要である。
【０１５９】
興味深いことに、他のエピトープはＭＨＣクラスＩＩの影響を強く受け、およびこれらのエピトープは「Ｍ」で示される。その場合、「ｋ」ハプロタイプは、このエピトープに必要である。
【０１６０】
全体的に、ほとんどのエピトープが非ＭＨＣ背景遺伝子によって決定される一方、いくつかのエピトープが２つの株の間で共通であった。
【０１６１】
ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプは、Ｂ細胞エピトープ選択の重要な決定基ではないことを見出した。
【０１６２】
図１０は、２８日目の採血におけるＰＡ免疫後のマッピング結果を示す。
【０１６３】
実施例７
ワクチン接種ヒトにおける防御抗原に対する抗体の評価
炭疽ワクチン接種後の体液性免疫応答についての調査を開始するために、吸収炭疽ワクチン（ＡＶＡ）の３回もしくはそれ以上の投薬を受けた個体を採用し、および末梢血液を回収した。１１４例のワクチン接種した個体ならびに２６例の非ワクチン接種コントロールの集団（ｃｏｈｏｒｔ）を研究に採用した。個体の大部分６１．４％は白人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）であり、２３．６８％のアフリカ系アメリカ人（Ａｆｒｉｃａｎ Ａｍｅｒｉｃａｎ）、５．２６％のアジア人（Ａｓｉａｎ）、および９．６４％のその他の民族を伴った。平均年齢は３３．８３（±８．６）であり、ワクチン接種の平均回数は５．１２（±１．４７）であり、および最後のワクチン接種からの平均時間は２．４５（±１．３９）年であった。
【０１６４】
これらの個体由来の血清を、標準的なＥＬＩＳＡにおいて使用し、防御抗原、致死因子、および浮腫因子のレベルを検出した。コントロールの平均＋２倍の標準偏差より大きい光学密度をポジティブとみなした。ワクチン接種した個体は検出可能な抗防御抗原抗体を有する（図１１）一方、ただ１つのサブセットのみが検出可能な抗致死因子または抗浮腫因子抗体を有した。抗防御抗原抗体を伴う個体は、抗体価（１：１０、１：１００、１：１，０００、および１：１０，０００）に基づいて４つのグループに分けることができた。意外にも、抗原特異的抗体のレベルは、ワクチンを接種した固体の年齢にも、またワクチン接種の回数にも相関しなかった（図１１）。さらに、抗致死または浮腫因子抗体の有無は、抗防御抗原抗体のレベルに相関しなかった。しかし、ワクチン接種後の年数と抗ＰＡ力価との間のには、有意な（ｐ＝０．０００８）逆相関が見出された。それ故、最も高い力価の抗防御抗原抗体を伴うそれらの個体に、ごく最近ワクチン接種した（ワクチン接種後１．０±０．４年、図１１）。
【０１６５】
実施例８
毒素マクロファージ死滅のインビトロ阻害についてのＡＶＡワクチン化個体血清の評価
潜在的に中和している抗体が最も興味深いため、本実施例では、高応答体であるそれらの個体において同定されるエピトープ（図２３および表７）ならびに毒素中和について高い能力を伴う領域における抗体に注目した。高応答体において同定される最も優勢なエピトープは、エピトープ、ＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡ（配列番号１９７）であり、フューリン切断部位を含む領域として同定された。事実、高応答体の６例中５例（または８３％）は、固相ペプチドアッセイに基づいて、この抗原領域に対して指向された抗体を有した。フューリン切断部位内のこのエピトープに加えて、他の２つのエピトープが防御を仲介する能力について分析した。これらのうち第１のものは、リガンド結合領域内のエピトープ（ＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶ、配列番号１９９）であった。最後のエピトープは、防御抗原で免疫したマウス由来の血清に対して固相ペプチドアッセイを使用して同定した（下記において説明する）が、これは防御抗原の受容体結合ドメイン内に存在する。
【０１６６】
目的のこれらの３つのエピトープに対して指向された抗体について試験するために、これらの領域を含むペプチドを合成し、およびペプチド特異的ＥＬＩＳＡにおいて使用した。図２２（パネルＡ〜Ｃ）において示されるように、フューリン切断部位エピトープにおいて指向された抗体で１６例の個体を同定し、リガンド結合部位エピトープで指向された抗体で１２例の個体を同定し、および受容体結合部位において同定された抗体で１８例の個体を同定した。一旦、これらの独特な抗原領域が同定および確認されたら、これらのエピトープに対する抗体が防御を仲介する能力について試験した。それ故、カラム吸収を使用して、ペプチド特異的抗体を富化し、続いて、ペプチド特異的ＥＬＩＳＡおよび毒素中和を行った。図２２（パネルＤ〜Ｆ）において示されるように、すべての場合において、対応するペプチドに特異的な抗体を有意に富化および枯渇することが可能であった。次いで、これらの富化および枯渇されたサンプルを、標準的な毒素中和アッセイにおいて使用し、これらのペプチド特異的抗体が防御を仲介する能力について試験した。図２２（パネルＧ）において示されるように、フューリン切断部位内のエピトープに対して指向された抗体は毒素活性を阻止することが可能であった一方、他の２つのエピトープにおいて指向された抗体はそれほど可能ではなかった。それ故、ＡＶＡワクチン接種後に作製されるフューリンペプチド特異的抗体は、毒素活性を中和することが可能である。
【０１６７】
実施例９
防御抗原抗体の特異性
実施例３について上記に記載のように、固相支持体上に合成された重複デカペプチドを利用して、防御抗原抗体応答の精密な特異性を評価した。簡単に説明すると、ワクチン接種した個体由来の血清を、ＰＡの重複デカペプチドと共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰに連結されたヒトＩｇＧコンジュゲートと共にインキュベーションを行い、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。図１２において示されるように、ワクチン接種後の防御抗原抗体応答の精密な特異性を明確に観察することができる。図１２はまた、ＰＡの結晶構造上に重ね合わせられたほとんどの反応性エピトープ（エピトープ番号１〜９）を示す。免疫原性に関連する領域の観察は、エピトープおよび免疫原性ペプチド断片である個々のデカペプチドの検出を可能にする。
【０１６８】
図２３は、ワクチン接種した個体血清がマクロ相死滅を阻害する能力（中和の代用インビトロモデル）によって階層化される応答の精密な特異性を示す。体液性エピトープ特異性のさらなるおよび独特な領域を、この方法によって決定した。
【０１６９】
実施例１０
ワクチン接種ヒトにおける致死因子に対する抗体の評価
上記で考察したように、炭疽ワクチン接種後の体液性および細胞性免疫の検査のために、吸収炭疽ワクチン（ＡＶＡ）の３回もしくはそれ以上の投薬を受けた個体、ならびに年齢、性別、および人種の一致した非ワクチン接種コントロール由来の血清を分析した。図１１において認められるように、試験した大部分の個体は、推奨される６回のワクチン接種を受け、および最後のワクチン接種からの平均時間は、２．３３（±１．９）年であった。致死因子に対する抗体のレベルを検出するために、血清をＥＬＩＳＡによって試験した。コントロールの平均＋２倍の標準偏差より大きい光学密度をポジティブとみなした。
【０１７０】
すべてのワクチン接種した個体（ｎ＝２９）は、検出可能な抗防御抗原抗体を有した（図１１）。しかし、これらのワクチン接種した個体のただ１つのサブセットは、致死因子（ｎ＝９）または浮腫因子（ｎ＝１０）に対する検出可能な抗体を有した。
【０１７１】
実施例３について上記に記載のように、固相支持体上に合成された重複デカペプチドを利用して、致死因子抗体応答の精密な特異性を評価した。簡単に説明すると、ワクチン接種した個体由来の血清を、ＬＦの重複デカペプチドと共にインキュベートし、続いて、ＨＲＰに連結されたヒトＩｇＧコンジュゲートと共にインキュベーションを行い、４５０ｎｍにおける吸光度を決定した。図１４において示されるように、ワクチン接種後の致死因子抗体応答の精密な特異性を明確に観察することができる。図１４はまた、ＬＦの結晶構造上に重ね合わせられたほとんどの反応性エピトープ（エピトープ番号１〜１０）を示す。免疫原性に関連する領域の観察は、エピトープおよび免疫原性ペプチド断片である個々のデカペプチドの検出を可能にする。
【０１７２】
実施例１１
炭疽菌浮腫因子に対する防御抗体を含む抗血清の作製
図１６は、組換えＥＦまたはアジュバント単独でＡ／Ｊマウスのグループを免疫するために使用される研究計画を示す。０日目にＣＦＡの存在下で初回免疫を行い、および１０、２４および３８日目に追加接種を行った。
【０１７３】
各追加接種の４〜５日後、およびさらに最後の追加接種の１２９日後であった浮腫毒素攻撃の前に、個々のマウスから抗体試験およびエピトープマッピングのための血液サンプルを回収した。
【０１７４】
図１７は、免疫化マウスが組換えＥＦに対して強固な抗体応答を産生していた根拠を実証する。図１７は、市販のＥＦ調製物を使用するＥＬＩＳＡによって決定されるＥＦに対するＩｇＧ抗体価を示す。
【０１７５】
すべてのＥＦ免疫化マウスは、２８、４２および１７１日目に高力価の抗ＥＦ抗体を産生した。
【０１７６】
実施例１２
浮腫性毒素攻撃
実施例１１のマウスを、それらが浮腫毒素−中和抗体を産生したかどうかを決定するために研究した。これを確認するために、はじめに、免疫されていない６週齢のＡ／Ｊマウスにおける浮腫毒素のＬＤ５０を決定した（図１８Ａを参照のこと）。次いで、実施例１１のマウスを、致死量の炭疽菌浮腫毒素（ＰＡ＋ＥＦが同時注入される）で攻撃した。使用した用量は、Ａ／Ｊマウスにおいて決定されるＬＤ５０用量の４倍であった。
【０１７７】
ＥＦ免疫化マウスの５０パーセントが致死性の浮腫毒素攻撃に対して生存した一方、アジュバント単独で免疫されていたコントロールマウスで攻撃に対し生存したのは０％であった（図１８Ｂを参照のこと）。これらのデータは、実施例１１のＥＦ免疫化マウスが浮腫毒素−中和抗体を産生したことを示唆した。
【０１７８】
実施例１３
浮腫因子のエピトープマッピング
図１９は、１５日目の採血および２８日目の採血のＥＦ免疫化Ａ／Ｊマウスのマッピング結果を実証する。応答は、１５日目に単一のエピトープによって開始し、次いで、拡大して、２８日目までには複数のエピトープを含んだことが見出された。アジュバント単独で免疫したマウスは、いずれのデカペプチドにも有意に結合することはできなかった。０．３およびそれ以上のＯ．Ｄ．を伴う少なくとも１つのデカペプチドにおよんだ領域を、エピトープとみなした。この特定のマウス株からの例として、これらのエピトープを図１９において強調し、および既知のＥＦ結晶構造上に重ね合わせる。
【０１７９】
図１９の結晶構造上に重ね合わせ、また表９において同定されるエピトープは、野生型浮腫因子の以下のアミノ酸位置に対応する（配列番号３を参照のこと）。
【０１８０】
１：ＫＮＳＭＮＳＲＧＥＫＶＰＦＡＳＲＦＶ（配列番号２５６）：野生型浮腫因子のアミノ酸１２５〜１４２に対応する。
２：ＹＡＩＮＳＥＱＳＫＥＶＹ（配列番号２５７）：野生型浮腫因子のアミノ酸１５９〜１７０に対応する。
３：ＳＳＤＬＬＦＳＱＫＦＫＥ（配列番号２５８）：野生型浮腫因子のアミノ酸２０５〜２１６に対応する。
４．ＬＥＬＹＡＰＤＭＦＥＹＭ（配列番号２５９）：野生型浮腫因子のアミノ酸２５７〜２６８に対応する。
５．ＥＧＥＩＧＫＩＰＬＫＬＤ（配列番号２６０）：野生型浮腫因子のアミノ酸３９５〜４０６に対応する。
６．ＤＹＤＬＦＡＬＡＰＳＬＴ（配列番号２６１）：野生型浮腫因子のアミノ酸４９１〜５０２に対応する。
７．ＮＷＱＫＱＭＬＤＲＬＮＥＡＶ（配列番号２６２）：野生型浮腫因子のアミノ酸５５１〜５６４に対応する。
８．ＮＥＡＶＫＹＴＧＹＴＧＧ（配列番号２６３）：野生型浮腫因子のアミノ酸５６１〜５７２に対応する。
９．ＱＤＮＥＥＦＰＥＫＤＮＥＩＦ（配列番号２６４）：野生型浮腫因子のアミノ酸５８１〜５９４に対応する。
【０１８１】
実施例１４
マウス免疫血清を使用するＰＡおよびＬＦの中和ペプチドエピトープの同定
ＬＦおよびＰＡ免疫化Ａ／Ｊマウス由来の免疫血清を、それぞれ、図６および７、ならびに表１〜４においても開示される次のエピトープ：ＰＡ１６４〜１７７、ＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤ（配列番号２７１）；ＰＡ２３０〜２４３、ＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫ（配列番号２７２）；およびＬＦ２３２〜２４７、ＶＬＱＬＹＡＰＥＡＦＮＹＭＤＫＦ（配列番号２７３）から構築される複数の抗原ペプチドカラムを使用するアフィニティークロマトグラフィーに供した。ここで番号は、ＰＡでは配列番号１およびＬＦでは配列番号２におけるアミノ酸を指す。個々のカラム画分を本来の血清容積まで濃縮し、および標準的な致死性毒素仲介マクロファージ細胞死アッセイにおいて滴定した。図２０において示されるように、このようにして精製された抗体のすべての３つの調製物は、細胞生存能％の増加によって示されるように、致死性毒素がマウスマクロファージ細胞系統を死滅させる能力を中和する能力を実証した。各保持された（即ち、ペプチド結合性）画分の全ＩｇＧの濃度を定量したが、これを図２０に示す。
【０１８２】
上記のすべての科学記事、公開、要約、特許および特許出願は、それらの全体が本明細書において参考として援用される。
【０１８３】
本発明について、開示された実施態様を参考にして詳細に説明してきたが、本発明の趣旨および範囲内において多くの変形および改変を行うことができることが理解されよう。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炭疽菌タンパク質の免疫原性ペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、および動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導する、組成物。
【請求項２】
前記炭疽菌タンパク質は防御抗原、致死因子または浮腫因子タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは４０アミノ酸未満を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは担体に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記担体は防御抗原タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫原性ペプチドの２つもしくはそれ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫原性ペプチドは、炭疽菌タンパク質の２つもしくはそれ以上の免疫原性ペプチドの融合タンパク質であって、各ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、動物に投与される場合に免疫応答を誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチドは、表４（配列番号：１５２〜１７４）および表６（配列番号：１８５〜１９３）に記載の炭疽菌防御抗原アミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチドは、表３（配列番号：９２〜１１６）および表５（配列番号：１７５〜１８４）に記載の炭疽菌致死因子タンパク質アミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドは、表７（配列番号：１９４〜２０６）に記載の炭疽菌浮腫因子タンパク質アミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
動物に、炭疽菌タンパク質の免疫原性ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する、炭疽に対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項１２】
前記動物は炭疽に感染し、および誘導される前記免疫応答は、前記動物における炭疽菌感染を処置するのに有効である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導される免疫応答は、前記動物における炭疽菌感染に対して防御するのに有効である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性の抗体を含む組成物であって、前記ペプチドは、２０ｋＤａ未満の分子量を有し、動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導する、組成物。
【請求項１５】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
動物に、炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性の抗体を含む有効量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する、炭疽に感染した動物を処置する方法。
【請求項１７】
動物に、炭疽菌タンパク質の免疫原性ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する、炭疽に対する抗体を産生させる方法。
【請求項１８】
前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
動物における炭疽菌感染を検出するための方法であって、
前記動物由来のサンプルと、炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性の抗体とを組み合わせることであって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導することと、
前記抗体と前記サンプル中の炭疽菌タンパク質との間で形成される複合体を検出することと、
を含み、
前記複合体の検出は、前記動物における前記炭疽菌感染を示す、方法。
【請求項２０】
動物における炭疽菌感染を検出するための方法であって、
前記動物由来のサンプルと、炭疽菌タンパク質の免疫反応性ペプチドとを組み合わせることであって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、および動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導することと、
前記サンプル中の抗体と前記免疫反応性ペプチドとの間で形成される複合体を検出することと、
を含み、
前記複合体の検出は、前記動物における前記炭疽菌感染を示す、方法。
【請求項２１】
動物における炭疽菌感染に対する特異的防御免疫を検出するための方法であって、
前記動物由来のサンプルと、炭疽菌タンパク質の免疫反応性ペプチドとを組み合わせることであって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、および動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導することと、
前記サンプル中の抗体と前記免疫反応性ペプチドとの間で形成される複合体を検出することと、
を含み、
予め決定された量の前記複合体の検出は、前記動物における前記炭疽菌感染に対する特異的防御免疫を示す、方法。
【請求項１】
炭疽菌タンパク質の免疫原性ペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、および動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導する、組成物。
【請求項２】
前記炭疽菌タンパク質は防御抗原、致死因子または浮腫因子タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ペプチドは４０アミノ酸未満を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ペプチドは担体に結合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記担体は防御抗原タンパク質である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫原性ペプチドの２つもしくはそれ以上を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫原性ペプチドは、炭疽菌タンパク質の２つもしくはそれ以上の免疫原性ペプチドの融合タンパク質であって、各ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、動物に投与される場合に免疫応答を誘導する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ペプチドは、表４（配列番号：１５２〜１７４）および表６（配列番号：１８５〜１９３）に記載の炭疽菌防御抗原アミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ペプチドは、表３（配列番号：９２〜１１６）および表５（配列番号：１７５〜１８４）に記載の炭疽菌致死因子タンパク質アミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ペプチドは、表７（配列番号：１９４〜２０６）に記載の炭疽菌浮腫因子タンパク質アミノ酸配列よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
動物に、炭疽菌タンパク質の免疫原性ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する、炭疽に対する免疫応答を誘導する方法。
【請求項１２】
前記動物は炭疽に感染し、および誘導される前記免疫応答は、前記動物における炭疽菌感染を処置するのに有効である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記誘導される免疫応答は、前記動物における炭疽菌感染に対して防御するのに有効である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性の抗体を含む組成物であって、前記ペプチドは、２０ｋＤａ未満の分子量を有し、動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導する、組成物。
【請求項１５】
前記抗体はヒト化抗体である、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
動物に、炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性の抗体を含む有効量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する、炭疽に感染した動物を処置する方法。
【請求項１７】
動物に、炭疽菌タンパク質の免疫原性ペプチドを含む有効量の組成物を投与することを含み、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有する、炭疽に対する抗体を産生させる方法。
【請求項１８】
前記抗体はモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
動物における炭疽菌感染を検出するための方法であって、
前記動物由来のサンプルと、炭疽菌タンパク質のペプチドに免疫反応性の抗体とを組み合わせることであって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導することと、
前記抗体と前記サンプル中の炭疽菌タンパク質との間で形成される複合体を検出することと、
を含み、
前記複合体の検出は、前記動物における前記炭疽菌感染を示す、方法。
【請求項２０】
動物における炭疽菌感染を検出するための方法であって、
前記動物由来のサンプルと、炭疽菌タンパク質の免疫反応性ペプチドとを組み合わせることであって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、および動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導することと、
前記サンプル中の抗体と前記免疫反応性ペプチドとの間で形成される複合体を検出することと、
を含み、
前記複合体の検出は、前記動物における前記炭疽菌感染を示す、方法。
【請求項２１】
動物における炭疽菌感染に対する特異的防御免疫を検出するための方法であって、
前記動物由来のサンプルと、炭疽菌タンパク質の免疫反応性ペプチドとを組み合わせることであって、前記ペプチドは２０ｋＤａ未満の分子量を有し、および動物に投与される場合に炭疽に対する免疫応答を誘導することと、
前記サンプル中の抗体と前記免疫反応性ペプチドとの間で形成される複合体を検出することと、
を含み、
予め決定された量の前記複合体の検出は、前記動物における前記炭疽菌感染に対する特異的防御免疫を示す、方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【公表番号】特表２００９−５３６９５１（Ｐ２００９−５３６９５１Ａ）
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５０９８９３（Ｐ２００９−５０９８９３）
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１１６０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５７６０
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５９４００３６７６）オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション (14)
【氏名又は名称原語表記】ＯＫＬＡＨＯＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８２５ Ｎ．Ｅ． １３ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈｏｍａ ７３１０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５０８３３５５３２）
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２１年１０月２２日（２００９．１０．２２）
【国際特許分類】
【出願日】平成１９年５月１４日（２００７．５．１４）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０１１６０８
【国際公開番号】ＷＯ２００７／１４５７６０
【国際公開日】平成１９年１２月２１日（２００７．１２．２１）
【出願人】（５９４００３６７６）オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション (14)
【氏名又は名称原語表記】ＯＫＬＡＨＯＭＡ ＭＥＤＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＦＯＵＮＤＡＴＩＯＮ
【住所又は居所原語表記】８２５ Ｎ．Ｅ． １３ｔｈ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｏｋｌａｈｏｍａ Ｃｉｔｙ，Ｏｋｌａｈｏｍａ ７３１０４，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ
【出願人】（５０８３３５５３２）
【Ｆターム（参考）】
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