焼酎用麹菌株の選択法及び選択キット
【課題】各種の焼酎用原料穀類に適した麹菌株を迅速・容易に選択する選択法と選択キットを提供する。
【解決手段】麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択する。麹菌株の分生子を予め各種変性処理を行い焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することも可能である。尚、焼酎原料穀類は、芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシからなる群から選ばれる穀類である。また、上記した選択培地の成分うち焼酎原料穀類を含まないものと、焼酎原料穀類と、麹菌株分生子とをそれぞれ別々の容器に収納して一体に構成した選択キットを使用して麹菌株を選択することも可能である。
【解決手段】麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択する。麹菌株の分生子を予め各種変性処理を行い焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することも可能である。尚、焼酎原料穀類は、芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシからなる群から選ばれる穀類である。また、上記した選択培地の成分うち焼酎原料穀類を含まないものと、焼酎原料穀類と、麹菌株分生子とをそれぞれ別々の容器に収納して一体に構成した選択キットを使用して麹菌株を選択することも可能である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焼酎用麹菌株の選択法に関し、とくに焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した麹菌株の選択法及びそれに使用する選択キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より焼酎の製造においては、熟練の杜氏が長年の経験とカンによって各種の麹菌株の選別を行い、米、麦などの穀類を基質として数多くの製品が作られている。すなわち、米焼酎においては米麹を出発原料とし、麦焼酎では麦麹を出発原料としてきた。しかしながら、米や麦以外の穀類を使用した焼酎の製造工程においては、主に出発原料として米麹を使用してモロミを作り、各種の焼酎用穀類を加えて蒸留を行ない、そば焼酎、粟焼酎等として製造されている。このため各種の穀類を使用した純粋の焼酎と称することができないものであった。
【０００３】
そこで、サツマイモを麹基質として、イモ麹を得るイモ麹の製造方法及びイモ麹を用いた焼酎が提案されている（特許文献１参照。）。この製造方法によって、サツマイモとイモ麹を使用した純粋な焼酎を得ることができるとされている。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２７５７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に提案されているイモ麹の製造方法及びイモ麹を用いた焼酎の場合、イモ麹の製造方法において新たな技術を開示しているものの、イモに適した麹菌株の選別法に関しては何ら技術の開示がなく、従来の熟練者の経験とカンによって選別されたものであり、未熟な作業者では選別が困難であるとともに、時間と手間がかかるという問題点があった。
【０００６】
上記の問題点に鑑み本発明者は、先に発明・出願した重層選択培地によるセルロース高分解性株の選択法（特開２００６−１６６８４８号）に着目し、鋭意研究の結果、麹菌株の選択法において焼酎用穀類を含有する培地を用いて麹菌株を導入して培養することによって、杜氏等の熟練者以外ではできなかった焼酎用穀類に適した麹菌株の選択を容易に行なうことができる選択法及び選択キットを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このため本発明は、麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを第１の特徴とする。
【０００８】
前記麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを第２の特徴とする。
【０００９】
また、前記焼酎原料穀類は、芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシからなる群から選ばれる穀類であることを第３の特徴とする。
【００１０】
そして、前記焼酎原料穀類を含まない培地と、当該培地と混合する焼酎原料穀類と、当該焼酎穀類に使用する麹菌株分生子とがそれぞれ別々の容器に収納され、一体に構成されている選択キットであることを第４の特徴とする。
【００１１】
尚、上記麹菌株の分生子の変性処理法としては、紫外線などの電磁波による暴露や、同質高次倍数体の製法、遺伝的組換体の形成法等が有効に使用される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る焼酎用麹菌株の選択法によれば、杜氏等の熟練者でなくとも、従来使用していた麹菌株の中から各種の焼酎原料穀類に適した麹菌株を迅速・容易に選択できるという優れた効果を有する。
【００１３】
そして、各種の焼酎原料である穀類に適した麹を選択し、焼酎原料穀類の麹を製造できるため、各種の穀類からできた純粋の焼酎が得られるという優れた効果を有する。
【００１４】
また、麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養することによって、焼酎原料穀類に適し、元の麹菌株と比較して増殖性に富む麹菌株が得られるという優れた効果を有する。
【００１５】
さらに、本発明の選択キットによれば、予め用意された焼酎製造に使用する焼酎原料穀類と培地成分とを混合し、焼酎用麹菌株を接種することによって焼酎用麹菌株を培養して選択することができるため、熟練者でなくとも容易に焼酎原料穀類に最適な麹菌株が得られるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の第１の発明について説明する。本発明は麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択する焼酎用麹菌株の選択法である。これをさらに詳述する。
【００１７】
（元株の培養保存）
まず、元株となる麹菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ（ＩＦＯ４３０８）を所定の方法にて復元して試験管にポテトデキストロース寒天培地を加えて作成した斜面培地上に塗布し、２８℃で培養し、４℃で保存する。
【００１８】
（分生子の調製）
次に、ポテトデキストロース寒天培地を直径９ｃｍのシャーレに加えて寒天平板培地を作成し、その上に斜面培地上に着床した麹菌株の分生子を塗布し、２８℃で成熟分生子が十分量着床するまで培養し、４℃で保存する。
【００１９】
（重層選択培地による選択）
麹菌の分生子を後述する重層選択培地の下層培地に加え、直径１５センチのガラス製深型プレートに入れ、４℃で固化させ、次に固化した下層培地上に上層培地を加え４℃でさらに固化させ、そして上層培地が完全に固化後例えば２８℃で７日間培養を行なう。上層培地上に出現するコロニーの出現時期を比較し、さらにコロニーの直径（コロニーの大きさ）を測定して優良麹菌株の選択を行なう。
【００２０】
（重層選択培地の構成）
１）上層培地
ツァペック培地 １００ｍｌ
寒天 ３ｇ
ペプトン ０．５ｇ
焼酎原料穀類粉末 １０ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌ
２）下層培地
ツァペック培地 １００ｍｌ
寒天 ３ｇ
ペプトン ０．５ｇ
焼酎原料穀類粉末 １０ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌ
（注）ツァペック培地の組成（使用時の濃度）
ＮａＮＯ３：２．０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：１．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ：０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ
【００２１】
元株の麹菌株から、上記の重層選択培地上に出現したコロニーを調製することによって焼酎原料穀類に適した麹菌株を選択することができる。すなわち、上記コロニーの内早期に出現したものと元株とを、選択に使用した焼酎原料を含む寒天培地に加えて２８℃で５日間培養を行い、比較すると早期に出現したコロニー（選択培地表面上の大型のコロニー）が高い増殖性を示した。
【００２２】
次に本発明の第２の発明について説明する。本発明は麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを特長とする焼酎用麹菌株の選択法である。これをさらに詳述する。尚、元株の培養保存及び分生子の調製に関しては、上述した内容と同じであり省略する。
【００２３】
（変異処理）
上記で調製された分生子の変異処理を行なう。変異処理法としては、各種の方法があるが、本発明の実施の形態においては、次に示す２段階の処理により説明する。
１）同質高次倍数体の形成（コルヒチン処理）
分生子をコルヒチンを含有するツァペック培地に加え、例えば２８℃で７日間静置培養する。培養後、培地をフィルターにて濾過し伸びた菌子を除去し、高次倍数体を含む分生子を得る。
２）遺伝的組換体の形成（ベノミル処理）
上記で得られた高次倍数体を含む分生子をベノミルを含むツァペック培地に加え、例えば２８℃で７日間静置培養する。培養後、培地をフィルターにて濾過し伸びた菌子を除去し、遺伝的組換体を含む分生子を得る。
【００２４】
（重層選択培地による選択）
上記ベノミル処理された分生子を、重層選択培地の下層培地に加え、直径１５センチのガラス製深型プレートに入れ、４℃で固化させ、次に固化した下層培地上に上層培地を加え４℃でさらに固化させ、そして上層培地が完全に固化後例えば２８℃で７日間培養を行なう。上層培地上に出現するコロニーの大きさを比較し、麹菌株の選択を行なう。
【００２５】
ベノミル処理された分生子から、上記の重層選択培地上に出現したコロニーを調製することによって焼酎原料穀類に適した麹菌株を選択することができる。すなわち、上記コロニーの内早期に出現したものと元株とを、選択に使用した焼酎原料を含む寒天培地に加えて２８℃で５日間培養を行い、比較すると早期に出現したコロニーが高い増殖性を示した。
【００２６】
そして、本発明による選択キットは、上述した選択培地の成分のうち焼酎原料穀類を含まないものと、焼酎原料穀類と、麹菌株分生子とがそれぞれ別々の容器（例えば密閉したプラスチック容器）に収納されて一体に構成されており、麹菌株の選択を行なう際には、滅菌されたシャーレなどに前記選択培地と焼酎原料穀類を投入して混合し、麹菌株分生子を接種し、さらに前記選択培地と焼酎原料穀類を投入して混合し積層して例えば２８℃で７日間培養を行なう。
【００２７】
培養の結果は、上記した第１、第２の発明と同様培地表面に出現したコロニーによって判定できる。すなわち、本発明のキットを使用することによって、焼酎原料穀類に最適な麹菌株を容易に選択することができる。
【００２８】
尚、選択キットに使用する焼酎原料穀類は、上述した芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシなどが使用可能であり、また麹菌株分生子も焼酎製造業者独自のものを使用できる。
【実施例１】
【００２９】
（芋焼酎用麹菌株の選択）
麹菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ（ＩＦＯ４３０８）の凍結乾燥分生子を指定の方法で復元して、試験管にポテトデキストロース（ＰＤＡ）寒天培地（極東製薬工業製）を加えて作成した斜面培地上に塗布し、２８℃で培養を行い、４℃で保存した。次に傾斜培地上に着生した分生子を直径９センチのガラスシャーレ内に作成した寒天平板培地上に塗布し、２８℃にて成熟分生子が十分量着生するまで培養を行い、４℃で保存した。
【００３０】
（重層選択培地の調製）
直径１５センチのガラス製深型プレートにツァペック培地１００ｍｌ、寒天（Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）３ｇ、ペプトン（Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）０．５ｇ、甘藷粉末１０ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌを加え、さらに上記の成熟分生子を加えて４℃で固化させ下層培地とする。尚、甘藷粉末は甘藷をカッターナイフにより５ｍｍ四方の角片とし、ミキサー（ＳＣＭ−４０Ａ 石崎電気製作所製）で１分間粉砕し調製した。そして、固化した下層培地上にツァペック培地１００ｍｌ、寒天３ｇ、ペプトン０．５ｇ、甘藷粉末１０ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌを加え４℃で固化させた。図１は、本発明に使用した重層選択培地の説明図を示す。
【００３１】
（重層選択培地による選択）
上記調製した重層選択培地を２８℃で６日間培養し、上層培地表面にコロニーを形成させた。このコロニーのうち最も早期に出現したものを芋焼酎用優良菌株として選択した。図２に結果を示す。
【００３２】
（選択菌株の評価）
選択菌株の酵素生産性と増殖評価用培地として、下記の培地を使用し直径９センチのガラス製シャーレに加え、その中心部に元株と選択株の菌体２ミリ四方を置き、２８℃で５日間培養を行なった。その結果を図３に示す。
・評価用培地
ツァペック培地 １００ｍｌ
寒天 １．５ｇ
ペプトン ０．５ｇ
甘藷粉末 １０ｇ
【００３３】
（結果）
図３に示すように選択株と元株をコロニー直径で比較すると、選択株５８．５６ｍｍ、元株４４．３７ｍｍとなり、選択株の方が大きく、増殖性に優れていることが判明した。
【実施例２】
【００３４】
（変異処理した芋焼酎用麹菌株の選択）
実施例１において培養した成熟分生子を以下の２段階変異処理を行なった。
【００３５】
（コルヒチン処理）
上記の成熟分生子を５０ｍｌの三角フラスコに、ツァペック培地とグルコース０．２５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、コルヒチン０．０２５ｇを追加した培地２５ｍｌに投入して２８℃で７日間培養した。培養液をガラスフィルターで濾過し、同質高次倍数体を有する分生子を含有する濾過液を得た。
【００３６】
（ベノミル処理）
上記で得られた濾過液を５０ｍｌの三角フラスコに、ツァペック培地とグルコース０．２５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、ベノミル０．１μｇ／ｍｌを追加した培地２５ｍｌに投入して２８℃で７日間培養した。培養液をガラスフィルターで濾過し、同質遺伝子組換体を有する分生子を含有する濾過液を得た。
【００３７】
（重層選択培地による選択）
次に、実施例１と同様の重層選択培地の調製を行ない、上記のベノミル処理した濾過液を下層に注入し、４℃で固化した後上層培地を調整し、上記実施例１と同様に培養し選択を行なった。その結果を図４示す。
【００３８】
（選択菌株の評価）
選択菌株の酵素生産性と増殖評価用培地として、上述した培地を使用し直径９センチのガラス製シャーレに加え、その中心部に元株と選択株の菌体２ミリ四方を置き、２８℃で５日間培養を行なった。その結果を図５に示す。
【００３９】
（結果）
図５ａは上記の２段階変異処理を行なったＫ１株と元株の比較を示し、図５ｂは上記のコルヒチン処理のみ行なったＫ２株と元株との比較を示している。図に示す各株のコロニー直径を測定した結果、Ｋ１・４６．２９ｍｍ、Ｋ２・５３．０６ｍｍ、元株・４４．３７ｍｍとなり、選択株が元株と比べ菌体の直径が大きく、増殖性に優れていることが確認された。
【実施例３】
【００４０】
（元株と選択株の酵素活性測定）
実施例１及び実施例２によって選択して得られた株菌と元株の酵素活性を測定した。
【００４１】
（液体培養）
１００ｍｌフラスコにツァペック培地５０ｍｌ、可溶性澱粉０．５ｇ、ペプトン０．２５ｇを加え、シリコ栓をして、これに元株及び選択株菌２ｍｍ四方を斜面培地から接種し、２８℃にて５日間回転振盪培養を行なった。尚、振盪率は１６０ｒｐｍとする。
【００４２】
（酵素活性測定）
上記方法で培溶後の培地をワットマンろ紙（Ｎ０．２）にてろ過を行い、菌体を除去したろ液を酵素液として使用する。まず酵素液２ｍｌに基質（可溶性澱粉１ｇ＋酢酸緩衝液１００ｍｌ）４ｍｌを加え、５０℃で１時間往復振盪（１２５ｓｔｒｏｋｅ／ｍｉｎ）を行なった。振盪後、反応液を蒸留水で５倍に希釈し、この希釈水１ｍｌを試験管に加え、さらにＤＮＡ（ジニトロサリチル酸）溶液３ｍｌを加え５分間煮沸する。煮沸後、水中で試験管を冷却し、蒸留水を加え２５ｍｌとし、攪拌した後この溶液の５３０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
（結果）
表１に示すように、変異処理由来Ｋ２株が酵素高生産性であることが判明した。また、他の変異処理由来ｋ１株は元株とほぼ同等であることが分った。そして、未変異処理株１−３及び１−４酵素生産性も元株とほぼ同等であることが判明した。
【００４５】
以上、本発明の焼酎用麹菌株の選択法によれば、従来使用していた麹菌株の中から各種の焼酎原料穀類に適した麹菌株を迅速・容易に選択できる。さらに、麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養することによって、焼酎原料穀類に適し、元の麹菌株と比較して増殖性に富む麹菌株が得られる。とくに、麹菌株を変異処理したものは酵素生産性に富んだ麹菌株となる。そして、各種の焼酎原料である穀類に適した麹を選択し、焼酎原料穀類の麹を製造できるため、各種の穀類からできた純粋の焼酎が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、麹菌株を使用する各種製造業において、有効な麹製造技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地を示す説明図である。
【図２】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により元株を培養した結果を示す写真である。
【図３】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により選択した未変異処理分生子由来の選択株と元株を培養した結果を示す写真である。
【図４】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により選択した変異処理由来の選択株を培養した結果を示す写真である。
【図５】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により選択した変異処理由来の選択株と、元株を培養した結果を示す写真である。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、焼酎用麹菌株の選択法に関し、とくに焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した麹菌株の選択法及びそれに使用する選択キットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
従来より焼酎の製造においては、熟練の杜氏が長年の経験とカンによって各種の麹菌株の選別を行い、米、麦などの穀類を基質として数多くの製品が作られている。すなわち、米焼酎においては米麹を出発原料とし、麦焼酎では麦麹を出発原料としてきた。しかしながら、米や麦以外の穀類を使用した焼酎の製造工程においては、主に出発原料として米麹を使用してモロミを作り、各種の焼酎用穀類を加えて蒸留を行ない、そば焼酎、粟焼酎等として製造されている。このため各種の穀類を使用した純粋の焼酎と称することができないものであった。
【０００３】
そこで、サツマイモを麹基質として、イモ麹を得るイモ麹の製造方法及びイモ麹を用いた焼酎が提案されている（特許文献１参照。）。この製造方法によって、サツマイモとイモ麹を使用した純粋な焼酎を得ることができるとされている。
【０００４】
【特許文献１】特開平８−２７５７０号公報
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、上記特許文献１に提案されているイモ麹の製造方法及びイモ麹を用いた焼酎の場合、イモ麹の製造方法において新たな技術を開示しているものの、イモに適した麹菌株の選別法に関しては何ら技術の開示がなく、従来の熟練者の経験とカンによって選別されたものであり、未熟な作業者では選別が困難であるとともに、時間と手間がかかるという問題点があった。
【０００６】
上記の問題点に鑑み本発明者は、先に発明・出願した重層選択培地によるセルロース高分解性株の選択法（特開２００６−１６６８４８号）に着目し、鋭意研究の結果、麹菌株の選択法において焼酎用穀類を含有する培地を用いて麹菌株を導入して培養することによって、杜氏等の熟練者以外ではできなかった焼酎用穀類に適した麹菌株の選択を容易に行なうことができる選択法及び選択キットを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
このため本発明は、麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを第１の特徴とする。
【０００８】
前記麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを第２の特徴とする。
【０００９】
また、前記焼酎原料穀類は、芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシからなる群から選ばれる穀類であることを第３の特徴とする。
【００１０】
そして、前記焼酎原料穀類を含まない培地と、当該培地と混合する焼酎原料穀類と、当該焼酎穀類に使用する麹菌株分生子とがそれぞれ別々の容器に収納され、一体に構成されている選択キットであることを第４の特徴とする。
【００１１】
尚、上記麹菌株の分生子の変性処理法としては、紫外線などの電磁波による暴露や、同質高次倍数体の製法、遺伝的組換体の形成法等が有効に使用される。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る焼酎用麹菌株の選択法によれば、杜氏等の熟練者でなくとも、従来使用していた麹菌株の中から各種の焼酎原料穀類に適した麹菌株を迅速・容易に選択できるという優れた効果を有する。
【００１３】
そして、各種の焼酎原料である穀類に適した麹を選択し、焼酎原料穀類の麹を製造できるため、各種の穀類からできた純粋の焼酎が得られるという優れた効果を有する。
【００１４】
また、麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養することによって、焼酎原料穀類に適し、元の麹菌株と比較して増殖性に富む麹菌株が得られるという優れた効果を有する。
【００１５】
さらに、本発明の選択キットによれば、予め用意された焼酎製造に使用する焼酎原料穀類と培地成分とを混合し、焼酎用麹菌株を接種することによって焼酎用麹菌株を培養して選択することができるため、熟練者でなくとも容易に焼酎原料穀類に最適な麹菌株が得られるという効果を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の第１の発明について説明する。本発明は麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択する焼酎用麹菌株の選択法である。これをさらに詳述する。
【００１７】
（元株の培養保存）
まず、元株となる麹菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ（ＩＦＯ４３０８）を所定の方法にて復元して試験管にポテトデキストロース寒天培地を加えて作成した斜面培地上に塗布し、２８℃で培養し、４℃で保存する。
【００１８】
（分生子の調製）
次に、ポテトデキストロース寒天培地を直径９ｃｍのシャーレに加えて寒天平板培地を作成し、その上に斜面培地上に着床した麹菌株の分生子を塗布し、２８℃で成熟分生子が十分量着床するまで培養し、４℃で保存する。
【００１９】
（重層選択培地による選択）
麹菌の分生子を後述する重層選択培地の下層培地に加え、直径１５センチのガラス製深型プレートに入れ、４℃で固化させ、次に固化した下層培地上に上層培地を加え４℃でさらに固化させ、そして上層培地が完全に固化後例えば２８℃で７日間培養を行なう。上層培地上に出現するコロニーの出現時期を比較し、さらにコロニーの直径（コロニーの大きさ）を測定して優良麹菌株の選択を行なう。
【００２０】
（重層選択培地の構成）
１）上層培地
ツァペック培地 １００ｍｌ
寒天 ３ｇ
ペプトン ０．５ｇ
焼酎原料穀類粉末 １０ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌ
２）下層培地
ツァペック培地 １００ｍｌ
寒天 ３ｇ
ペプトン ０．５ｇ
焼酎原料穀類粉末 １０ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌ
（注）ツァペック培地の組成（使用時の濃度）
ＮａＮＯ３：２．０ｇ／ｌ、Ｋ２ＨＰＯ４：１．０ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ／ｌ、ＫＣｌ：０．５ｇ／ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．０１ｇ／ｌ
【００２１】
元株の麹菌株から、上記の重層選択培地上に出現したコロニーを調製することによって焼酎原料穀類に適した麹菌株を選択することができる。すなわち、上記コロニーの内早期に出現したものと元株とを、選択に使用した焼酎原料を含む寒天培地に加えて２８℃で５日間培養を行い、比較すると早期に出現したコロニー（選択培地表面上の大型のコロニー）が高い増殖性を示した。
【００２２】
次に本発明の第２の発明について説明する。本発明は麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを特長とする焼酎用麹菌株の選択法である。これをさらに詳述する。尚、元株の培養保存及び分生子の調製に関しては、上述した内容と同じであり省略する。
【００２３】
（変異処理）
上記で調製された分生子の変異処理を行なう。変異処理法としては、各種の方法があるが、本発明の実施の形態においては、次に示す２段階の処理により説明する。
１）同質高次倍数体の形成（コルヒチン処理）
分生子をコルヒチンを含有するツァペック培地に加え、例えば２８℃で７日間静置培養する。培養後、培地をフィルターにて濾過し伸びた菌子を除去し、高次倍数体を含む分生子を得る。
２）遺伝的組換体の形成（ベノミル処理）
上記で得られた高次倍数体を含む分生子をベノミルを含むツァペック培地に加え、例えば２８℃で７日間静置培養する。培養後、培地をフィルターにて濾過し伸びた菌子を除去し、遺伝的組換体を含む分生子を得る。
【００２４】
（重層選択培地による選択）
上記ベノミル処理された分生子を、重層選択培地の下層培地に加え、直径１５センチのガラス製深型プレートに入れ、４℃で固化させ、次に固化した下層培地上に上層培地を加え４℃でさらに固化させ、そして上層培地が完全に固化後例えば２８℃で７日間培養を行なう。上層培地上に出現するコロニーの大きさを比較し、麹菌株の選択を行なう。
【００２５】
ベノミル処理された分生子から、上記の重層選択培地上に出現したコロニーを調製することによって焼酎原料穀類に適した麹菌株を選択することができる。すなわち、上記コロニーの内早期に出現したものと元株とを、選択に使用した焼酎原料を含む寒天培地に加えて２８℃で５日間培養を行い、比較すると早期に出現したコロニーが高い増殖性を示した。
【００２６】
そして、本発明による選択キットは、上述した選択培地の成分のうち焼酎原料穀類を含まないものと、焼酎原料穀類と、麹菌株分生子とがそれぞれ別々の容器（例えば密閉したプラスチック容器）に収納されて一体に構成されており、麹菌株の選択を行なう際には、滅菌されたシャーレなどに前記選択培地と焼酎原料穀類を投入して混合し、麹菌株分生子を接種し、さらに前記選択培地と焼酎原料穀類を投入して混合し積層して例えば２８℃で７日間培養を行なう。
【００２７】
培養の結果は、上記した第１、第２の発明と同様培地表面に出現したコロニーによって判定できる。すなわち、本発明のキットを使用することによって、焼酎原料穀類に最適な麹菌株を容易に選択することができる。
【００２８】
尚、選択キットに使用する焼酎原料穀類は、上述した芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシなどが使用可能であり、また麹菌株分生子も焼酎製造業者独自のものを使用できる。
【実施例１】
【００２９】
（芋焼酎用麹菌株の選択）
麹菌株Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ（ＩＦＯ４３０８）の凍結乾燥分生子を指定の方法で復元して、試験管にポテトデキストロース（ＰＤＡ）寒天培地（極東製薬工業製）を加えて作成した斜面培地上に塗布し、２８℃で培養を行い、４℃で保存した。次に傾斜培地上に着生した分生子を直径９センチのガラスシャーレ内に作成した寒天平板培地上に塗布し、２８℃にて成熟分生子が十分量着生するまで培養を行い、４℃で保存した。
【００３０】
（重層選択培地の調製）
直径１５センチのガラス製深型プレートにツァペック培地１００ｍｌ、寒天（Ｂａｃｔｏ Ｐｅｐｔｏｎｅ Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）３ｇ、ペプトン（Ｂａｃｔｏ Ａｇａｒ Ｉｎｃ．，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＵＳＡ）０．５ｇ、甘藷粉末１０ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌを加え、さらに上記の成熟分生子を加えて４℃で固化させ下層培地とする。尚、甘藷粉末は甘藷をカッターナイフにより５ｍｍ四方の角片とし、ミキサー（ＳＣＭ−４０Ａ 石崎電気製作所製）で１分間粉砕し調製した。そして、固化した下層培地上にツァペック培地１００ｍｌ、寒天３ｇ、ペプトン０．５ｇ、甘藷粉末１０ｇ、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ０．１ｍｌを加え４℃で固化させた。図１は、本発明に使用した重層選択培地の説明図を示す。
【００３１】
（重層選択培地による選択）
上記調製した重層選択培地を２８℃で６日間培養し、上層培地表面にコロニーを形成させた。このコロニーのうち最も早期に出現したものを芋焼酎用優良菌株として選択した。図２に結果を示す。
【００３２】
（選択菌株の評価）
選択菌株の酵素生産性と増殖評価用培地として、下記の培地を使用し直径９センチのガラス製シャーレに加え、その中心部に元株と選択株の菌体２ミリ四方を置き、２８℃で５日間培養を行なった。その結果を図３に示す。
・評価用培地
ツァペック培地 １００ｍｌ
寒天 １．５ｇ
ペプトン ０．５ｇ
甘藷粉末 １０ｇ
【００３３】
（結果）
図３に示すように選択株と元株をコロニー直径で比較すると、選択株５８．５６ｍｍ、元株４４．３７ｍｍとなり、選択株の方が大きく、増殖性に優れていることが判明した。
【実施例２】
【００３４】
（変異処理した芋焼酎用麹菌株の選択）
実施例１において培養した成熟分生子を以下の２段階変異処理を行なった。
【００３５】
（コルヒチン処理）
上記の成熟分生子を５０ｍｌの三角フラスコに、ツァペック培地とグルコース０．２５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、コルヒチン０．０２５ｇを追加した培地２５ｍｌに投入して２８℃で７日間培養した。培養液をガラスフィルターで濾過し、同質高次倍数体を有する分生子を含有する濾過液を得た。
【００３６】
（ベノミル処理）
上記で得られた濾過液を５０ｍｌの三角フラスコに、ツァペック培地とグルコース０．２５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、ベノミル０．１μｇ／ｍｌを追加した培地２５ｍｌに投入して２８℃で７日間培養した。培養液をガラスフィルターで濾過し、同質遺伝子組換体を有する分生子を含有する濾過液を得た。
【００３７】
（重層選択培地による選択）
次に、実施例１と同様の重層選択培地の調製を行ない、上記のベノミル処理した濾過液を下層に注入し、４℃で固化した後上層培地を調整し、上記実施例１と同様に培養し選択を行なった。その結果を図４示す。
【００３８】
（選択菌株の評価）
選択菌株の酵素生産性と増殖評価用培地として、上述した培地を使用し直径９センチのガラス製シャーレに加え、その中心部に元株と選択株の菌体２ミリ四方を置き、２８℃で５日間培養を行なった。その結果を図５に示す。
【００３９】
（結果）
図５ａは上記の２段階変異処理を行なったＫ１株と元株の比較を示し、図５ｂは上記のコルヒチン処理のみ行なったＫ２株と元株との比較を示している。図に示す各株のコロニー直径を測定した結果、Ｋ１・４６．２９ｍｍ、Ｋ２・５３．０６ｍｍ、元株・４４．３７ｍｍとなり、選択株が元株と比べ菌体の直径が大きく、増殖性に優れていることが確認された。
【実施例３】
【００４０】
（元株と選択株の酵素活性測定）
実施例１及び実施例２によって選択して得られた株菌と元株の酵素活性を測定した。
【００４１】
（液体培養）
１００ｍｌフラスコにツァペック培地５０ｍｌ、可溶性澱粉０．５ｇ、ペプトン０．２５ｇを加え、シリコ栓をして、これに元株及び選択株菌２ｍｍ四方を斜面培地から接種し、２８℃にて５日間回転振盪培養を行なった。尚、振盪率は１６０ｒｐｍとする。
【００４２】
（酵素活性測定）
上記方法で培溶後の培地をワットマンろ紙（Ｎ０．２）にてろ過を行い、菌体を除去したろ液を酵素液として使用する。まず酵素液２ｍｌに基質（可溶性澱粉１ｇ＋酢酸緩衝液１００ｍｌ）４ｍｌを加え、５０℃で１時間往復振盪（１２５ｓｔｒｏｋｅ／ｍｉｎ）を行なった。振盪後、反応液を蒸留水で５倍に希釈し、この希釈水１ｍｌを試験管に加え、さらにＤＮＡ（ジニトロサリチル酸）溶液３ｍｌを加え５分間煮沸する。煮沸後、水中で試験管を冷却し、蒸留水を加え２５ｍｌとし、攪拌した後この溶液の５３０ｎｍでの吸光度を測定した。その結果を表１に示す。
【００４３】
【表１】
【００４４】
（結果）
表１に示すように、変異処理由来Ｋ２株が酵素高生産性であることが判明した。また、他の変異処理由来ｋ１株は元株とほぼ同等であることが分った。そして、未変異処理株１−３及び１−４酵素生産性も元株とほぼ同等であることが判明した。
【００４５】
以上、本発明の焼酎用麹菌株の選択法によれば、従来使用していた麹菌株の中から各種の焼酎原料穀類に適した麹菌株を迅速・容易に選択できる。さらに、麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養することによって、焼酎原料穀類に適し、元の麹菌株と比較して増殖性に富む麹菌株が得られる。とくに、麹菌株を変異処理したものは酵素生産性に富んだ麹菌株となる。そして、各種の焼酎原料である穀類に適した麹を選択し、焼酎原料穀類の麹を製造できるため、各種の穀類からできた純粋の焼酎が得られる。
【産業上の利用可能性】
【００４６】
本発明によれば、麹菌株を使用する各種製造業において、有効な麹製造技術として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地を示す説明図である。
【図２】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により元株を培養した結果を示す写真である。
【図３】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により選択した未変異処理分生子由来の選択株と元株を培養した結果を示す写真である。
【図４】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により選択した変異処理由来の選択株を培養した結果を示す写真である。
【図５】本発明の焼酎用麹菌株の選択法に係る重層選択培地により選択した変異処理由来の選択株と、元株を培養した結果を示す写真である。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択する焼酎用麹菌株の選択法。
【請求項２】
前記麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを特長とする請求項１記載の焼酎用麹菌株の選択法。
【請求項３】
前記焼酎原料穀類は、芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシからなる群から選ばれる穀類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の焼酎用麹菌株の選択法。
【請求項４】
請求項１乃至２に記載の焼酎用麹菌株の選択に使用する選択キットであって、前記焼酎原料穀類を含まない選択培地と、当該培地と混合する焼酎原料穀類と、当該焼酎穀類に使用する麹菌株分生子とがそれぞれ別々の容器に収納され、一体に構成されていることを特徴とする焼酎用麹菌株の選択キット。
【請求項１】
麹菌株の分生子を、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択する焼酎用麹菌株の選択法。
【請求項２】
前記麹菌株の分生子を変異処理し、焼酎原料穀類を含有する重層選択培地を用いて培養し、焼酎原料穀類を用いた焼酎用麹の製造に適した有効麹菌株を選択することを特長とする請求項１記載の焼酎用麹菌株の選択法。
【請求項３】
前記焼酎原料穀類は、芋、麦、そば、粟、ひえ、トウモロコシからなる群から選ばれる穀類であることを特徴とする請求項１又は２に記載の焼酎用麹菌株の選択法。
【請求項４】
請求項１乃至２に記載の焼酎用麹菌株の選択に使用する選択キットであって、前記焼酎原料穀類を含まない選択培地と、当該培地と混合する焼酎原料穀類と、当該焼酎穀類に使用する麹菌株分生子とがそれぞれ別々の容器に収納され、一体に構成されていることを特徴とする焼酎用麹菌株の選択キット。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【公開番号】特開２００８−５４６５６（Ｐ２００８−５４６５６Ａ）
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７５７９４（Ｐ２００６−２７５７９４）
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（８０３００００７８）株式会社みやざきＴＬＯ (20)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年３月１３日（２００８．３．１３）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年９月８日（２００６．９．８）
【出願人】（８０３００００７８）株式会社みやざきＴＬＯ (20)
【Ｆターム（参考）】
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