生体分子を急速に結晶化するための方法及び装置
本発明は、生体分子、好ましくはタンパク質の溶液からの生体分子結晶の急速な形成を促進するための方法及び装置であって、タンパク質の溶液が電場中のその等電点に従って急速に濃縮される方法及び装置に関する。本発明の方法によるタンパク質の結晶化は、数時間以内に起こる。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、好ましくはタンパク質の溶液からの生体分子結晶の急速な形成を促進するための方法及び装置であって、タンパク質の溶液が電場中のその等電点に従って急速に濃縮される方法及び装置に関する。本発明の方法によるタンパク質の結晶化は、数時間以内に起こる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質結晶化には、３つの主な適用例、即ち（１）構造生物学及び薬剤設計、（２）生物分離、及び（３）精製がある。結晶形成は、典型的には最適条件での核形成後の飽和タンパク質溶液の調製に基づく、緩慢で冗長なプロセスである。タンパク質結晶化に関する最適条件には、特に飽和溶液中の最適なタンパク質濃度、ｐＨ及び温度があり、一方これらの条件は大規模な試行錯誤の実験によって決定される。
【０００３】
従来のタンパク質結晶化法、及びタンパク質結晶化を容易にする条件を決定するための方法は、特に米国特許第６，５９６，０７７号、米国特許第６，５９３，１１８号、米国特許第６，５７９，３５８号、米国特許第６，５００，９３３号、米国特許第６，４０９，８３２号、米国特許第６，２６８，１５８号、米国特許第５，９７６，３２５号、米国特許第５，７２８，５５９号、米国特許第５，２７１，７９５号、米国特許第５，１０４，４７８号、米国特許第４，７３７，２３２号及び米国特許第４，３３０，３６３号中に開示されている。
【０００４】
シリカヒドロゲル、アガロース及びポリアクリルアミドなどのゲル中での生体分子、特にタンパク質の結晶化は当分野で知られている（例えば、ＣｒｙｓｔａｌＥｘ（商標）、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．）。液体溶液からの成長と比較して浮力、対流及び沈降を考慮する必要がないので、この方法は有利であると考えられる。この方法はさらに、ゲルの粘性によって分子拡散を制御し、したがって多くの点で宇宙のような微重力環境中の結晶成長の有益な性質を模倣する。この方法の他の利点は、結晶は周囲温度ではゲル中において被包状態に保たれること、形状をＸ線回折に直接施すことさえも可能であることである。この方法は基本的に、重合前又は重合後、数日間から数週間の制御温度でのゲル中への保存後、ゲルに１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度でタンパク質溶液を、タンパク質の結晶化が起こるまで加えることを含む。この方法を使用して、適切な結晶が得られたことが示されたが（Ｓａｕｔｅｒら、「タンパク質；構造、機能及び遺伝的性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」４８：１４６〜１５０、２００２）、しかしながら、この方法はタンパク質結晶の成長に関してはほとんど使用されず、当分野で知られている他の方法と同程度に緩慢である。
【０００５】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）技術は、ｐＨと共に変わるタンパク質の特徴的な純電荷に基づく、タンパク質の分離及び精製用に広く使用されている。タンパク質は、それぞれのタンパク質がその純電荷がゼロである勾配内の地点に移動するｐＨ勾配のある電場に施し、この地点は「等電点」又は「ｐＩ」と呼ばれる。
【０００６】
タンパク質の分離及び精製用のＩＥＦ技術は、特に本発明の本発明者によるＷＯ０３／００８９７７、米国特許第６，５３７，４３２号、米国特許第５，４８０，５６２号、米国特許第５，４６４，５１７号、米国特許第５，４５１，６６２号、米国特許第５，０８２，５４８号、米国特許第４，９７１，６７０号、米国特許第４，４９５，２７９号、及び米国特許第４，２４３，５０７号中に記載されている。
【０００７】
結晶の成長が遭遇する障害を克服するため、及び結晶化、特にタンパク質の結晶化を可能にするためのさらに迅速で消耗の少ない手段を提供するための、対処されていない必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体分子の濃縮溶液を得て次いで前記生体分子を急速に結晶化するための等電点電気泳動を使用して、典型的にはわずか数時間以内に、生体分子を急速に結晶化するための方法及び装置に関する。
【０００９】
本発明は、任意のＩＥＦ手順を使用することにより希釈タンパク質溶液を濃縮することによって、溶液内のタンパク質の急速な結晶化を容易にするタンパク質溶液が生成するという、予期せぬ発見に部分的に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様によれば、本発明は生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生体分子種と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得るステップと
を含む上記方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、少なくとも１つの結晶化リアクター及び少なくとも１つの生体分子種をランニングバッファー中に置くステップをさらに含む。ステップ（ｃ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含むことが好ましい。ステップ（ｅ）は、生体分子結晶の形成を監視するステップをさらに含むことが有利である。
【００１２】
さらに他の実施形態によれば、結晶化は２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に起こる。
【００１３】
他の実施形態によれば、少なくとも１つの生体分子種は、溶液、ゲル及び懸濁液からなる群から選択される媒体中に与えられる。
【００１４】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの生体分子種は固体支持体上に固定される。
【００１５】
本明細書で使用する用語「結晶化リアクター」又は「リアクター」は、一定のｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む所定の体積、密度、及び粘度の任意の媒体を指す。いくつかの実施形態によれば、ＩＥＦバッファーは少なくとも１つのポリマーをさらに含み、生成する結晶化リアクターは所定の多孔度を有する。密度、粘度、孔の大きさ（ＩＥＦバッファーがポリマーを含む場合）及び結晶化リアクターの体積は、所望の生体分子がリアクターに入ることができ、さらにその中で拡散することができるように設計する。結晶化リアクターの体積は、使用される所望の生体分子の量に依存する。その体積内では、結晶化が起こる。本発明の結晶化リアクターは、電場の影響下で機能的に安定していることが好ましい。
【００１６】
本明細書で使用する「ＩＥＦバッファー」は、その広い意味で使用して、所与のｐＨ値付近でバッファー能力を有し、本明細書で以後バッファー剤とも呼ぶ成分を含むバッファーを表す。或いはバッファーは、両性電解質、アンフォリン、アクリルアミド誘導体又はバッファー剤の組合せだけには限られないがこれらを含めた、組織化してｐＨ勾配を形成する成分を含むことができる。本発明のＩＥＦバッファーは典型的には結晶化リアクターの成分であり、粘性液体、スラリー又はゲルの形である。本発明によれば、生体分子のｐＩがＩＥＦバッファーのｐＨ範囲内にない限り、生体分子はＩＥＦバッファーを通過することができる。本発明のＩＥＦバッファーは、電場の影響下で機能的に安定していることが好ましい。
【００１７】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの生体分子種は、化学成分を含むタンパク質複合体、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される。好ましい実施形態によれば、生体分子種はタンパク質である。生体分子はタンパク質、ペプチド又はポリペプチドから選択されることが好ましい。
【００１８】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはキャピラリー内に与える。さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターは固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。
【００１９】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーを含み、ポリマーは直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、１つ又は複数の物質を含む。さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）で使用する物質はポリマーを含む。
【００２０】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーをさらに含み、ポリマーは分岐ポリマー、直鎖ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、グリコールポリマー、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
【００２１】
さらに他の実施形態によれば、ＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えない狭いｐＨ範囲を有する。
【００２２】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持する。
【００２３】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場強度は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間に維持する。
【００２４】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｄ）は電場を与えることができるデバイスの存在下で行い、電場はＤＣ又はＡＣとして供給する。
【００２５】
ある実施形態によれば、デバイスは陰極、陽極及び電圧電源供給装置を含む。一実施形態によれば、電場がリアクター中又はリアクター内を通過するように、結晶化リアクターの反対側に電極を置く。他の実施形態によれば、電極はワイヤーである。さらに他の実施形態によれば、電極はワイヤー又は薄プレートの平行組である。さらに他の実施形態によれば、電極は白金、チタン、クロム、金、タンタル、パラジウム、酸化パラジウム、ゲルマニウム、ニッケル及びロジウム又はこれらを含む合金からなる群から選択される物質でできているか、或いはこれらでコーティングされている。電極はパラジウム、白金、チタン、炭素又はこれらを含む合金でできているか、或いはこれらでコーティングされていることが好ましい。
【００２６】
デバイスが働いて、生体分子を結晶化リアクター内に向ける。したがって、さらに他の実施形態によれば、電場は交流電場又は直流電場から選択される。結晶化リアクターが密閉系内に含まれる場合、（例えば、電場がリアクターの片側、リアクターの反対側の外を通過することができない）、したがって、デバイスは電場を、バッファーを含む結晶化リアクターの内側及び外側に向けることができることが有利である（即ち、交流電場）。
【００２７】
他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターは、任意の望ましい形状及び幾何形を有することができる。
【００２８】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターは円筒形を有する。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つの結晶化リアクターの直径は約２０μｍ〜約１０ｍｍである。いくつかの他の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結晶化リアクターの長さは約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍである。
【００２９】
様々な実施形態によれば、本発明の方法のステップ（ａ）は、複数の結晶化リアクター中で互いに同じであるか或いは異なるＩＥＦバッファーをそれぞれの結晶化リアクターが含む、複数の結晶化リアクターを提供することを含む。好ましい実施形態によれば、結晶化リアクターは互いに離れている。ある実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、それぞれの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得ることを含む。他の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、複数の結晶化リアクター内で複数の結晶を得ることを含む。
【００３０】
一実施形態によれば、それぞれのＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えない狭いｐＨ範囲を有する。他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は重複しない。或いは、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は部分的に重複する。本明細書で使用する用語「部分的に重複する」は、その最も一般的な意味で解釈され、例えば１つのｐＨ範囲の上限が少なくとも１つの他のｐＨ範囲の下限と重複する複数のｐＨ範囲を指す。或いはこの用語は、１つのｐＨ範囲が少なくとも１つの他のｐＨ範囲より広く、したがって広い方のｐＨ範囲が１つの他のｐＨ範囲を完全に含む、複数のｐＨ範囲を指すことができる。
【００３１】
さらに他の実施形態によれば、１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップは０．１ｐＨ単位を超えず、好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えない。用語「ｐＨステップ」は、異なる又は部分的に異なるｐＨ範囲を有する２つの異なるＩＥＦバッファー間のｐＨ値の増分差を指す。ｐＨステップは、１つのｐＨ範囲の上限と他のｐＨ範囲の下限の間の差を指すことができる。或いはｐＨステップは、１つのｐＨ範囲の中央ｐＨ値と他のｐＨ範囲の中央ｐＨ値の間の差を指すことができる。
【００３２】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。他の実施形態によれば、結晶化リアクターを空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。さらに他の実施形態によれば、支持体は生体分子不透過性である。さらに他の実施形態によれば、支持体はイオン不透過性である。
【００３３】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターを含む支持体は固定化ｐＨ勾配、ｐＨ膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態であってよい。
【００３４】
他の態様によれば本発明は、複数の生体分子を含む溶液を選別し、そこから選択した少なくとも１つの生体分子種を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）複数の生体分子を含む媒体を提供するステップと、
（ｂ）支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも１つの生体分子種を含む支持体上に少なくとも１つの位置を得るステップと、
（ｃ）少なくとも１つの位置を含む部分を前記支持体から回収するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｅ）（ｃ）の部分と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｆ）少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に、前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｇ）前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの生体分子結晶を得るステップと
を含む上記方法を提供する。
【００３５】
他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）は支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも１つの位置、１つの生体分子種を含む位置を支持体上に得ることを含む。
【００３６】
一実施形態によれば、ステップ（ｂ）中の選別は、少なくとも１つの生体分子種の質量によるものである。他の実施形態によれば、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を含めた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及びゲル電気泳動からなる群から選択される方法によってステップ（ｂ）を行う。これらの方法のいずれか１つは、非変性条件下で行うことが好ましい。
【００３７】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は前記部分及び前記少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む。ステップ（ｅ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含むことが好ましい。ステップ（ｇ）は、生体分子結晶の形成を監視する及び／又は検出するステップをさらに含むことが有利である。
【００３８】
さらに他の実施形態によれば、結晶を２４時間以内、好ましくは１２時間以内に得る。
【００３９】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｄ）のＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する。
【００４０】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持する。さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である。さらに他の実施形態によれば、電場はＤＣ又はＡＣとして供給する。
【００４１】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）中で使用する支持体はゲルである。他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）中で使用する支持体は、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、ニトロセルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む。さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）中で使用する支持体はポリマーを含み、ステップ（ｆ）は、
少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクターにおいて、前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮バンドを生成させることを含む。
【００４２】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は自動化されており、生体分子、好ましくはタンパク質の高スループットの結晶化に適している。
【００４３】
本発明の方法は、それが典型的には１時間未満以内に急速なタンパク質結晶化を助長する点において、タンパク質結晶化のための当分野で知られている方法より有利である。さらに本発明の方法は大きな結晶を得ることができ、したがって十分大きな結晶を必要とする適用例、例えば高品質のＸ線回折データの回収に適している。
【００４４】
本発明の方法による急速な結晶化は、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、ｐＨ膜、及び所望のｐＨ範囲を有するゲル中の両性電解質の任意の組成物などの、当分野で知られている多くのＩＥＦ系を使用して実施することができる。ただし、ＩＥＦ系は本発明の原理に適合しているか、或いは適合するように改変されているものとする。好ましくは、本発明のＩＥＦ系は、結晶化リアクターとも呼ばれる複数の異なる物体を含み、それぞれの結晶化リアクターはあるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを有する。場合によっては、結晶化リアクターは互いに離れており、したがって複数の離れたｐＨ範囲、場合によっては狭いｐＨ範囲の系を確立する。複数の離れた結晶化リアクターによって広がるｐＨ範囲は、重複するか或いは重複しない可能性がある。
【００４５】
本発明の方法の他の特定の利点は、十分に精製されていないタンパク質溶液から、タンパク質結晶を得ることができることである。何故なら本発明の方法は、タンパク質分離及び不純物からの分離を対象とする等電点電気泳動を含むからである。
【００４６】
他の態様によれば本発明は、生体分子、好ましくはタンパク質の結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
（ａ）上側及び下側を有するバッファー室であって、バッファー室が流体を保持することができる少なくとも１つのバッファー区画を囲うように下側が底部で封じられているバッファー室と、
（ｂ）少なくとも１つの結晶化リアクターであって、この少なくとも１つの結晶化リアクターはＩＥＦバッファーを含み、この少なくとも１つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも１つの結晶化リアクターと、
（ｃ）電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
（ｄ）バッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置を提供する。
【００４７】
一実施形態によれば、装置は上側及び下側を有するホルダーをさらに含み、このホルダーは少なくとも１つの結晶化リアクターを含み、或いは少なくとも１つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合されており、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、このホルダーはバッファー室内に含まれている。他の実施形態によれば、少なくとも１つのバッファー区画内にホルダーを配備する。ある実施形態によればホルダーは、少なくとも１つの結晶化リアクターを含むキャピラリーである。
【００４８】
他の実施形態によれば、装置は２つの端部を有する２つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の１つの端部はホルダーの１つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の１つの端部は少なくとも１つのバッファー室内に含まれている。装置は、それぞれのバッファー室が１つの塩橋の１つの端部を囲うようなそれぞれのバッファー室である、２つのバッファー室を含むことが好ましい。
【００４９】
好ましい実施形態によれば、装置は少なくとも１つの結晶化リアクターにおいて温度を管理することができる温度制御モジュールをさらに含む。
【００５０】
他の実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つの空洞を含み、この少なくとも１つの空洞はＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターを含む。
【００５１】
さらに他の実施形態によれば、それぞれの空洞を結晶化リアクターを含むように適合させた複数の空洞を、ホルダーは有する。いくつかの実施形態によれば、１つの結晶化リアクターの温度は他の結晶化リアクターの温度と異なる。
【００５２】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの耐性より大きな耐性を有する物質を含む。
【００５３】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは非導電性物質を含む。非導電性物質は、ポリ−Ｎ−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレン、セラミック、ガラス及びポリ−メチル−メタクリレートからなる群から選択することができる。
【００５４】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは生体分子に対して不透過性である物質を含み、１つの空洞内の結晶化リアクターから任意の他の空洞内の結晶化リアクターへのタンパク質の拡散を回避する。
【００５５】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーをさらに含み、ポリマーは、分岐ポリマー、直鎖ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、グリコールポリマー、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、少なくとも１つの物質を含む。
【００５６】
さらに他の実施形態によれば、バッファー室は非導電性物質を含む。
【００５７】
さらに他の実施形態によれば、本発明の装置を、少なくとも１つの結晶化リアクター内での結晶の形成を顕微鏡下で監視するために適合させる。
【００５８】
他の実施形態によれば、バッファー区画は、ランニングバッファー及びランニングバッファー中に溶けた少なくとも１つの生体分子を含む溶液を保持するように適合させる。
【００５９】
一実施形態によれば本発明は、高スループットで急速なマクロ分子の結晶化のための、小型化及び自動化された装置並びに方法を提供する。本発明の装置は、自動式相互作用成分、例えばＩＥＦバッファー（イモビリン、両性電解質など）を含む前重合結晶化リアクターを空洞に充填するための滴定装置、空洞又は結晶化リアクターからタンパク質結晶を回収するための抽出装置、及び結晶化リアクター内のタンパク質結晶の形成を調べて記録するためのデバイスを有すると解釈することができる。
【００６０】
本発明のこれらの目的及び他の目的、特徴並びに利点は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明は、タンパク質溶液からのタンパク質結晶の急速な生成を誘導するための方法及び装置を提供する。本発明の方法は等電点電気泳動、及びしたがって典型的には１５時間の間以内の急速なタンパク質の結晶化を容易にする、濃縮タンパク質溶液又はバンドの形成を含む。
【００６２】
タンパク質結晶を成長させるために使用されている現在の方法はいずれも、結晶の形成をもたらすと思われる最適条件のために、冗長な「試行錯誤の」実験及び調査を利用するものである。タンパク質の結晶化に影響を与える様々な要因の総説は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１４、ｐｐ．１１２〜２０（１９８５）によって公開されている。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ及びＧｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｊ．「結晶の成長（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ）」、９０、ｐｐ．５１〜５９（１９８８）は、結晶化されたタンパク質及び核酸、並びにそれらが結晶化された条件のリストを編集した。結晶及び結晶化法、並びに解明されたタンパク質及び核酸構造の配位のまとめの概要は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋによって保持されている［ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｂｎｌ．ｇｏｖ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、ｐｐ．５３５〜４２（１９７７）］。これらの参照を使用して、適切なタンパク質結晶を形成するための前置きとしてタンパク質の結晶化に必要な条件を決定することができ、他のタンパク質用の結晶化戦略を手助けすることができる。或いは、優れた試行錯誤式の検索戦略は大抵の場合、タンパク質に関する許容可能なレベルの純度を得ることができるという条件で、多くのタンパク質に関する適切な結晶化条件を生み出すことができる［例えば、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．及びＣ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４、ｐｐ．１２２１９〜２３（１９７９）を参照のこと］。
【００６３】
一般に結晶は、結晶化するタンパク質と適切な水性溶媒又は塩などの適切な結晶化剤を含む水性溶媒、又は有機溶媒を組み合わせることによって生成される。溶媒はタンパク質と組み合わせ、結晶化を誘導するのに適しておりタンパク質の活性及び安定性を維持するのに認め得ると実験によって決定した温度において攪拌を施すことができる。溶媒は２価カチオンなどの共溶質、共因子又はカオトロープ剤、並びにｐＨを調節するためのバッファー種を場合によっては含むことができる。共溶質及びそれらの濃度に関する必要性を実験によって決定して、結晶化を容易にする。
【００６４】
産業規模のプロセスでは、結晶化をもたらす調節型の沈殿を、バッチプロセスにおけるタンパク質、沈殿剤、共溶質、及び場合によってはバッファーの単純な組合せによって最適に行うことができる。他のオプションとして、出発物質としてタンパク質沈殿剤を使用することによって、タンパク質を結晶化することができる。この場合、タンパク質沈殿剤を結晶化溶液に加え、結晶が形成されるまでインキュベートする。他の研究室での結晶化法、透析又は蒸気拡散法なども採用することができる。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ同書及びＧｉｌｌｉｌａｎｄ同書は、結晶化の文献のその総説中に適切な条件の包括的なリストを含む。
【００６５】
明確な等電点を有する任意のタンパク質を使用して、本発明の教示に従いタンパク質結晶を調製することができる。しかしながら、結晶化に関する条件、ＩＥＰバッファーの含量、密度、粘性、及び他の特徴など、並びに結晶化リアクターにおける温度、特に設定パラメータを最適化して、望ましい質の結晶を生成することができることを記さなければならない。したがって、これらの特徴及び条件をある程度調節することは、本発明の方法及び装置を使用して結晶を与えるために必要な可能性があることは、当業者により理解されるであろう。
【００６６】
用語「タンパク質結晶」又は「結晶」を本明細書において交互に使用して、結晶格子に配列したタンパク質分子を記載する。タンパク質結晶は、３次元構造中で周期的に繰り返されるある型の特異的なタンパク質−タンパク質結合を含む。本発明のタンパク質結晶は、タンパク質溶液の凍結乾燥によって得られるものなどの、無定形の固体形タンパク質又はタンパク質の沈殿は含まない。結晶は格子構造、独特な形状、並びに屈折率及び複屈折などの光学的性質を含めた独特な特徴を示す。結晶は、３次元構造中で周期的に繰り返される型で配列した原子からなる。対照的に無定形物質は、ときどき無定形沈殿と呼ばれる非結晶性の固体形の物質である。このような沈殿は結晶固体状態に独特な分子の格子構造を有しておらず、結晶形の物質に典型的な複屈折及び他の分光性を示さない。
【００６７】
用語「濃縮タンパク質溶液」又は「濃縮溶液」を本明細書において交互に使用して、タンパク質の濃度が飽和、又はさらに過飽和から約５０％飽和と等しい濃度の範囲である、少なくとも１つのタンパク質を含む媒体を記載する。ＩＥＦバッファーが重合される場合、タンパク質は濃縮によってバンドを形成し、したがって「濃縮タンパク質バンド」又は「濃縮バンド」の用語を使用する。
【００６８】
典型的には、本発明のタンパク質結晶化は、ランニングバッファー中においてタンパク質溶液を用いて開始することができ、そのタンパク質溶液は知られている等電点（ｐＩ）を有する少なくとも１つのタンパク質を含む。タンパク質溶液は希釈溶液であってよい。タンパク質溶液に電場を導入すると、タンパク質のｐＩと重複するｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクター中にタンパク質が誘導される。したがって、それぞれのタンパク質分子は、前記リアクターの体積中に誘導されるとその電荷を放出し、電場中での動きが止まり、結晶化リアクター中に非電荷タンパク質の濃縮溶液又はバンドが生成する。最初に希釈した溶液からの、タンパク質の電気泳動による蓄積及び濃縮のプロセスは非常に早く効率的であり、典型的には約数分間、或いはさらに数十分間のタイムスパン内で起こる。蓄積するタンパク質分子は、拡散によって結晶化リアクター内で広がり、その中での急速な結晶核形成及び成長をもたらす。
【００６９】
「等電点電気泳動」又は「ＩＥＦ」は、ＩＥＦ法に曝される分子、典型的にはタンパク質の純電荷に基づく一般的な分離技術である。タンパク質の純電荷は、そのアミノ酸含量から測定する。典型的なタンパク質で見られる２０個のアミノ酸のうち、４個（アスパラギン酸及びグルタミン酸、システイン及びチロシン）は負電荷を有しており、３個（リシン、アルギニン及びヒスチジン）はあるｐＨ範囲で正電荷を有する。アミノ酸のその特異的配列によって定義される特異的タンパク質は、その長さ部分に沿っていくつかの帯電した基をしたがって取り込む可能性がある。電荷及びｐＨに関する滴定曲線に従い問題のアミノ酸のｐＫに従うと、それぞれのアミノ酸によって貢献される電荷の程度は周辺溶液の優勢ｐＨによって支配され、最小値０から最大値１の電荷まで変わる可能性がある（アミノ酸に依存して陽性又は陰性）。すべてのアミノ酸が露出される変性条件下では、タンパク質分子の合計電荷は、いずれも優勢な溶液ｐＨにおける、その成分であるアミノ酸の電荷の合計によって大まかに与えられる。
【００７０】
ＩＥＦは、それらの等電点によってタンパク質を分離するための、広く使用されている電気泳動法である。ＩＥＦは、典型的にはゲル内で所望のＩＥＦバッファーによって確定されるｐＨ勾配による、帯電したタンパク質の移動に関するものであり、タンパク質の移動は電場から派生するか或いは電場によって誘導される。特定のｐＩを有するタンパク質はその電荷を失い、そのタンパク質のｐＩと等しいｐＨを有するｐＨ勾配ゲル中の位置に達すると、したがってゲル内での移動を止める。この位置でタンパク質は蓄積する。ＩＥＦの利点は、それぞれが特定のｐＩを有する複数のタンパク質を、溶液中のタンパク質混合物に直接由来する別個のバンド中で分析することができることである。古典的ＩＥＦ法の最終的な結果は、それぞれのｐＨバンドが特定のｐＩを有する特定のタンパク質に載せられている、複数のｐＨバンドである。異なる比率の帯電アミノ酸を有する２つのタンパク質は、あるｐＨでのそれらの異なる純電荷によって分離することができる。印加する電場の影響下では、より強く帯電したタンパク質が、同じ大きさ及び形状のあまり帯電していないタンパク質より速く移動するであろう。非対流媒体（典型的にはポリアクリルアミドなどのゲル）を介してサンプルゾーンからタンパク質を移動させる場合、電気泳動による分離が生じるであろう。印加する電場の下での移動の過程で、そのｐＨがタンパク質の純電荷がゼロである値を有する領域（等電点ｐＨ）にタンパク質が入る場合、タンパク質はその媒体に対して移動するのを止めるであろう。さらに、単調なｐＨ勾配を介して移動が起こる場合、タンパク質はこの等電点ｐＨ値に「集まる」であろう。タンパク質がさらに酸性のｐＨ値に移動する場合、タンパク質はさらに正に帯電し、正確に方向付けされた電場は等電点にタンパク質を押し戻すであろう。同様に、タンパク質がさらに塩基性のｐＨ値に移動する場合、タンパク質はさらに負に帯電し、同じ電場が等電点にタンパク質を押し戻すであろう。等電点電気泳動と呼ばれるこの分離法は、各配列中の数百個の中のわずか１個の帯電したアミノ酸が異なる２つのタンパク質を解明することができる。
【００７１】
等電点電気泳動の手順に関する重要な要件は、適切な空間的ｐＨ勾配の形成である。これは帯電分子（両性電解質）の異種混合物を最初は均質な分離媒体に封入することによって動的に、或いは空間的勾配の滴定基を、その中で移動が起こるゲルマトリクスに取り込ませることによって静的に実施することができる。前者は古典的な両性電解質系の等電点電気泳動であり、後者はさらに最近開発された固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）等電点電気泳動技術である。ＩＰＧ手法はｐＨ勾配がゲル中で固定されるという利点を有し、一方で両性電解質系の手法は、両性電解質分子が印加した電場中を移動するので位置移動の影響を受けやすい。最良の現在の方法は２つの手法を組み合わせて、ｐＨ勾配が空間的に固定されているが、少量の両性電解質が存在してタンパク質のＩＰＧの帯電したゲルマトリクス上への吸着を低下させる系を与える。
【００７２】
所望のｐＨ勾配ＩＰＧゲルを形成するのに必要な組成勾配は、塩基性ｐＨを生み出すために配合した重ゲルモノマー組成物、酸性ｐＨを生み出すために配合した軽ゲルモノマー組成物、過硫酸アンモニウムなどの重合開始剤、及びテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）などの重合触媒から一般に生成される。グリセロール及び酸化ジューテリウム（重水）を使用して、溶液の密度を増大させることができ、したがって生じる密度勾配と地球の重力の相互作用によって、モールド中で形成される勾配の安定化を手助けすることができる。いくつかの参照文献は、重合可能なモノマーの勾配を生み出すための自動式デバイスを記載している。このようなシステムは、タンパク質の分子量による分離において使用する多孔質勾配ゲルを作製するために使用されてきている。Ａｌｔｌａｎｄら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０（１２Ｐｔ１）：２０９８〜２１０３、１９８４）は、ＩＰＧゲルの作製において使用する滴定モノマーの勾配を生み出すための、このようなシステムの使用を示している。米国特許第４，１６９，０３６号は、電気泳動分離用のスラブ−ゲルホルダーを装着させるためのシステムを記載している。勾配ゲルを生成するための自動装置の開示は、特に米国特許第４，５９４，０６４号、米国特許第６，５５４，９９１号中に開示されている。
【００７３】
本発明による急速な結晶化は、本発明の実施を可能にするための適切な物理的条件を必要とする。本発明の方法及び装置内のいくつかの要因が、結晶化の動態に影響を与える。
【００７４】
最初に、所望のタンパク質が適切な結晶化リアクターに接近することを確実にするために、ランニングバッファー中の分子の動態を速めて、任意の分子が結晶化リアクターと衝突する確率を高めることが有利である。
【００７５】
ランニングバッファー中のタンパク質の移動は、本発明の方法によって導入する電場によって生じる対流熱の結果として増大することが有利である。タンパク質のこの増大した動態は、任意のタンパク質がランニングバッファー中に浸された結晶化リアクターと衝突し、さらにその中で捕捉される確率を高めると企図される。
【００７６】
一実施形態によれば、ランニングバッファー中のタンパク質の速度は、ランニングバッファーを循環させるデバイスによって加速させる。循環は典型的には、攪拌バー、ポンプ、バイブレータ、例えば圧力バイブレータ、攪拌装置、傾斜型デバイス、又は当分野で知られている任意の攪拌デバイス及び技術を使用して実施することができる。他の実施形態では、循環用のデバイスは、ランニングバッファーに対してＩＥＦバッファー又は結晶化リアクターを動かすための機構であってよい。例えば、ＩＥＦバッファー又は結晶化リアクターをランニングバッファー中で回転させることができる。
【００７７】
或いは、本発明の方法はこのような循環デバイスを欠く。本発明の他の実施形態では、等電点電気泳動中に自然に生じる対流電流によってのみ循環を与える。
【００７８】
他の実施形態によれば、生体分子を循環させるのに十分な対流エネルギーの量は、ランニングバッファー１ｃｍ３当たり１０−１０ジュールである。
【００７９】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は、ＷＯ０３／００８９７７中に開示された原理に従う迅速なＩＥＦ手順を使用することを含む。
【００８０】
第２に、適切な結晶化リアクターと接触する所望のタンパク質が前記リアクターと衝突し、濃縮タンパク質溶液又は濃縮タンパク質バンドを形成することを確実にすること。典型的には、濃縮タンパク質溶液／バンドは結晶化リアクター内、結晶化リアクターと外部環境の間の界面の近辺で生じ、次いでタンパク質は結晶化リアクター内に入り拡散し、タンパク質結晶を最終的に形成する。
【００８１】
結晶化リアクターの粘性及び体積は、所望のタンパク質がリアクターに入りその中で拡散することができ、そのリアクター内でさらに結晶化することができるように設計する。結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーがゲルの形である場合、したがってそのゲルの多孔度をさらに調節して所望の結晶を得る。ゲル中のタンパク質に関する典型的な拡散定数は、タンパク質分布が約０．１ｍｍの距離に広がる拡散時間が約１０００秒（２０分まで）であるような拡散定数である。したがって、比較可能な寸法を有する結晶の結晶成長に関する予想時間はこの程度である。
【００８２】
結晶化の効率に影響を与える他の重要なパラメータは、結晶化リアクターにおけるｐＨである。生体分子のｐＩ値よりわずかに上又は下に結晶化リアクターのｐＨ値を変化させることによって、生体分子をリアクターに入った後にわずかな電荷を有する、したがって結晶化リアクター内で他の形式の動きをする状態にする。
【００８３】
さらに、結晶化リアクターの構造は他の適用例のための結晶の単離、又は／及び結晶化リアクター内の結晶のＸ線回折データの回収に適したものでなければならない。
【００８４】
結晶化リアクターの構築において、固定液体膜を使用することができる。特に、固定液体膜は本発明の結晶化リアクターに対する外被として使用することができ、所望の生体分子に対する選択的透過性の境界をリアクターに与える。固定液体膜は、典型的には微孔質固体内に封じられる。多孔質膜を作製するための最も広く使用されている簡単な方法の１つはＧｅｌｇａｒｄ（商標）法であり、その方法中では半晶質のフィルム又は繊維を溶融物から押し出しする。ポリプロピレンのような固体状ポリマーを伸長させることによって、多孔性が誘導される。０．０４μｍまでの孔の大きさ、並びに１００〜１５００μｍのＩＤ及び２５μｍの壁の厚さを有する中空繊維が利用可能であり、例えば血中酸素供給器において使用される。このような固定液体膜は、エチルアルコール、エチレングリコール、及びイソプロピルアルコールと一般に適合性がある。広く使用されている多孔質膜の他の例は、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（商標）、微孔質ポリ（テトラフルオロエチレン）であり、これは伸長法によっても製造され、化学的に不活性であり、疎水性合成ポリマー膜である。
【００８５】
結晶化リアクターの寸法は使用する所望のタンパク質の量、及び使用するシステム及び／又は装置の型に依存する。結晶化リアクターの容量は、（１）リアクター内、典型的にはリアクターと外部環境の間の界面の近辺の濃縮生体分子溶液／バンドの形成を容易にする、且つ（２）その中での生体分子の拡散を可能にし、したがって前記生体分子の結晶化を可能にするように設計することもできる。
【００８６】
第３に本発明の方法は、結晶化リアクター当たりに１つのタンパク質種のみが存在することを必要とする。何故なら、無関係なタンパク質又は他の不純物の存在が、所望の結晶化プロセスに干渉するからである。１つのタンパク質種のみが結晶化リアクターに入ることを確実にするために、ＩＥＦバッファーによって結晶化リアクター中に広がるｐＨ範囲はその１つのタンパク質種のｐＩを含む。しかしながら本発明の方法は、前記種が精製されていない場合でさえも、任意の所望のタンパク質種の結晶化を容易にする。非精製タンパク質の溶液を与える場合、少なくとも１つの結晶化リアクターが、ＩＥＦバッファーによって結晶化リアクター中に広がるｐＨ範囲が十分狭く、好ましくは非常に狭く、したがって不純物の結晶化を避ける、所望のタンパク質種のｐＩを含むＩＥＦバッファーを含むことが必要とされる。
【００８７】
したがって、ある実施形態によれば、それぞれの結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーは、極端に狭いｐＨ範囲、例えば５．５０〜５．６０（０．１ｐＨ単位以下の差）、又は非常に狭いｐＨ範囲、例えば５．５２〜５．５４（０．０２ｐＨ単位以下の差）を有する。本発明のＩＥＦバッファーは一定のｐＨ値に調節された一種のバッファー剤であり得るので、このことは可能である。この場合、ＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は、バッファー剤が調節されたｐＨ値周辺のバッファー剤のバッファー能力と等しい。本発明に従い使用することができるＩＥＦバッファーの一例は、トリスグリシン（ｐＨ８．２０＋／−０．０５、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６１〜０７７１）である。
【００８８】
用語「ｐＨ範囲」はＩＥＦバッファー中の最高のｐＨ値から最低のｐＨ値まで（例えば、ｐＨ７．９〜ｐＨ８．９）、或いはＩＥＦバッファー中の最高のｐＨ値と最低のｐＨ値の間の差を指す（例えば、１．０ｐＨ単位）。
【００８９】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は重複しない。さらに他の実施形態によれば、１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップは０．１ｐＨ単位を超えず、０．０２ｐＨ単位を超えないことが好ましい。
【００９０】
用語「ステップ」又は「ｐＨステップ」を本明細書において交互に使用して、異なるか或いは部分的に異なるｐＨ範囲を有する２つの異なるＩＥＦバッファー間の、ｐＨ値の増分差を記載する。例えば、結晶化リアクター＃１と結晶化リアクター＃２の間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位である場合、結晶化リアクター＃１はｐＨ６．８で始まりｐＨ７．８で終わるｐＨ勾配を有する可能性があり、結晶化リアクター＃２はｐＨ７．９で始まりｐＨ８．９で終わるｐＨ勾配を有する可能性がある（即ち、結晶化リアクター＃１の下限、ｐＨ７．９と結晶化リアクター＃２の上限、ｐＨ７．８の間の差、０．１ｐＨ単位のステップに相当）。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、３つ以上の結晶化リアクターの間のｐＨステップは均一である必要はない。
【００９２】
さらに他の実施形態によれば、結晶化リアクター内の間隔は均一である必要はない。用語「間隔」は、ＩＥＦバッファーによって生み出されたｐＨ勾配内のｐＨ値間の増分差を指す。例えば結晶化リアクター内では、リアクター内の全ｐＨ範囲中、間隔はわずか０．０２ｐＨ単位であってよい（例えば、ｐＨ６．８、ｐＨ６．８２、ｐＨ６．８４、ｐＨ６．８６など）。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、結晶化リアクターの間隔は均一である必要はない。
【００９４】
一実施形態によれば、結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は比較的広く、例えば１ｐＨ単位を超え、或いは２ｐＨ単位を超える。他の実施形態によれば、結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は狭く、例えば約１ｐＨ単位以下である。さらに他の実施形態によれば、結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は非常に狭く、例えば約０．２ｐＨ単位以下、或いは約０．０２ｐＨ単位以下である。
【００９５】
一実施形態によれば、ＩＥＦバッファーのｐＨ間隔は０．１ｐＨ単位以下である。他の実施形態によれば、ＩＥＦバッファーのｐＨ間隔は０．０２ｐＨ単位以下である。
【００９６】
本発明の一実施形態によれば、２つ以上のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップは０．０１単位以下である。本発明の他の実施形態によれば、２つ以上のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップは０．０２単位以下である。
【００９７】
一実施形態によれば本発明は、生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩに対応するｐＨを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生体分子種と前記少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｄ）ランニングバッファー中に電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｅ）濃縮溶液中の前記少なくとも１つの生体分子種を、前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で結晶化するステップと
を含む上記方法を提供する。
【００９８】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、少なくとも１つの生体分子種及び前記少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む。さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む。ステップ（ｅ）は、生体分子結晶の形成を監視すること及び／又は検出するステップをさらに含むことが有利である。
【００９９】
本発明の方法のステップ（ｃ）に従う、少なくとも１つの生体分子種と少なくとも１つの結晶化リアクターの接触は、様々な方法で実施することができる。例えば、溶液中に生体分子を提供する場合、生体分子溶液と少なくとも１つの結晶化リアクターの接触は、一滴又は複数滴の溶液を結晶化リアクターに施すことによって実施することができる。生体分子溶液は、結晶化リアクターに設置、配置又は位置付けして、生体分子と結晶化リアクターの間の接触を得る、膜、マトリクス又は任意の他の吸収性物質上に施すことができる。ゲル断片中に生体分子を提供する場合、そのゲル断片を少なくとも１つの結晶化リアクターと接触させることができる。
【０１００】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法のステップ（ｃ）は、実質的に結合した生体分子及び少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファーの溶液中に置くことを、さらに含むことができる。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「生体分子」は、細胞、細胞成分又は生物に対して観察可能な影響を有する、人工又は天然の任意の化合物を指す。この用語はタンパク質、化学成分を含むタンパク質複合体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ポリヌクレオチド、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブに適用する。用語「生体分子」は、「タンパク質」の好ましい実施形態と共に例示されることが多い。
【０１０２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」を交互に使用して、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学成分類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用することもできる。１つ又は複数のアミノ酸残基が「非天然」アミノ酸であり、いずれの天然に存在するアミノ酸にも対応しないアミノ酸ポリマーも、本明細書の用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」を使用することによって含まれる。
【０１０３】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列のいずれかであってよい、一連の核酸を５’から３’リン酸ジエステル結合中に含むヌクレオチド配列を指す。核酸がＤＮＡである場合、ヌクレオチド配列は一本鎖又は二本鎖のいずれかである。本発明のタンパク質をコードする核酸は、セルロースと高い親和性で結合することができ、このようなタンパク質をコードする核酸配列と相補的であり、或いはこのようなタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下でそれと安定的に結合した状態である、タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡである。
【０１０４】
任意の形のタンパク質を、本発明の方法に従い結晶化することができる。タンパク質は糖タンパク質、リンタンパク質、スルホタンパク質、ヨードタンパク質、メチル化タンパク質、非修飾タンパク質であってよく、或いは他の修飾を含んでよい。このようなタンパク質は、例えば抗体を含めた治療用タンパク質、予防用タンパク質、界面活性剤タンパク質を含めた清浄剤タンパク質、化粧品タンパク質を含めたパーソナルケアタンパク質、獣医学用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質及び除染タンパク質であってよい。このようなタンパク質中に含まれるのは、例えばリゾチーム、デヒドロゲナーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニル酸シクラーゼ、トランスフェラーゼ及びオキシドレダクターゼなどの酵素である。ヒドロラーゼの例には、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、ヒダントイナーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、スブチリスチン、サーモリシン、並びに他のプロテアーゼ及びリゾチームがある。リアーゼの例には、アルドラーゼ及びヒドロキシニトリルリアーゼがある。オキシドレダクターゼの例には、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸アルコールデヒドロゲナーゼ、及び他のデヒドロゲナーゼがある。他の酵素にはセルラーゼ及びオキシダーゼがある。
【０１０５】
治療用タンパク質又は予防用タンパク質の例には、ホルモン、例えばインシュリン、グルコゴン様ペプチド１及び副甲状腺ホルモンなど、抗体、阻害剤、成長因子、後中耳ホルモン、神経成長ホルモン、血液凝固因子、接着性分子、骨形態形成タンパク質及びレクチン栄養因子、サイトカイン、例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５など、遊走阻止因子、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン、トキソイド、エリスロポイエチン、第ＶＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成タンパク質、ウレアーゼ、トキソイド、生殖ホルモン、ＦＳＨ及びＬＳＨがある。
【０１０６】
治療用タンパク質、以下の：白血球マーカー、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＥ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７及びそのリガンドＣＤ２８、及びそのリガンドＢ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．３、ＣＤ２９及びそのリガンドＣＤ３０、及びそのリガンドＣＤ４０、及びそのリガンドｇｐ３９、ＣＤ４４、ＣＤ４５及びイソ型、Ｃｄｗ５２（Ｃａｍｐａｔｈ抗原）、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−１、及びＴＣＲ組織適合性抗原、例えばＭＨＣクラスＩ又はＩＩ抗原、ルイスＹ抗原、ＳＬｅｘ、ＳＬｅｙ、ＳＬｅａ及びＳＬｅｂなど；インテグリン、例えばＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６及びＬＦＡ−１など；接着性分子、例えばＭａｃ−１及びｐ１５０、９５など；セレクチン、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＥ−セレクチン及びそれらの抗受容体ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＬＦＡ−３など；インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４及びＩＬ−１５など；インターロイキン受容体、例えばＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１４Ｒ及びＩＬ−１５Ｒなど；ケモカイン、例えばＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ１、ＮＡＰ−２、Ｇｒｏα、Ｇｒｏβ及びＩＬ−８など；成長因子、例えばＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＴＳＨ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＰＴＨｒＰ、ＥＧＦファミリー、ＥＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、エンドセリン及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）など；成長因子受容体、例えばＴＮＦαＲ、ＲＧＦβＲ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ／ＶＰＦＲ、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＴＨｒＰＲ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＥＰＯ−Ｒなど；ＧＣＳＦ−Ｒ及び他の造血因子受容体；インターフェロン受容体、例えばＩＦＮαＲ、ＩＦＮβＲ及びＩＦＮγＲなど；免疫グロブリン及びそれらの受容体、例えばＩｇＥ、ＦｃｅＲＩ及びＦｃｅＲＩＩなど；血液因子、例えば補体Ｃ３ｂ、補体Ｃ５ａ、補体Ｃ５ｂ−９、Ｒｈ因子、フィブリノゲン、フィブリン及びミエリン関連成長阻害剤なども含まれる。
【０１０７】
本発明の方法により結晶化されるタンパク質は、例えば破傷風毒素、ジフテリア毒素、ウイルス表面タンパク質、例えばＣＭＶ糖タンパク質Ｂ、Ｈ及びｇＣＩＩＩなど、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質、ＲＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＥＢＶエンベロープ糖タンパク質、ＶＺＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＰＶエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原；ウイルス構造タンパク質、ウイルス酵素、寄生虫タンパク質、寄生虫糖タンパク質、寄生虫酵素及び細菌タンパク質を含めた、任意の天然、合成又は組換えタンパク質抗原であってよい。ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ムチン、ＣＥＡ及びエンドシアリンなどの腫瘍抗原も含まれる。イエダニ抗原、ｌｏｌｐ１（牧草）抗原及びウルシオールなどのアレルゲンが含まれる。シュードモナス内毒素及びオステオポンチン／ウロポンチン、蛇毒及び蜂毒などの毒素が含まれる。糖タンパク質腫瘍関連抗原、例えば胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及び前立腺特異的抗原も含まれる（ＰＳＡ；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、「免疫学の進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、６２、ｐｐ．２１７〜５６、１９９６）。
【０１０８】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーを含み、ポリマーは直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される１つ又は複数の物質を含む。結晶化リアクターは、従来のアクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液又はアガロース溶液以外の、或いはこれに加えた、様々なモノマーを含むことができる。従来の化学重合型ゲルにおいて、ヒドロキシエチルメタクリレート及び他の低分子量アクリレート型化合物をモノマーとして使用することは知られており、これらは「Ｌｏｎｅ−Ｒａｎｇｅｒ」ゲルとして商用化されてきている。１つ又は複数のアクリレート型基で置換されたポリマーの使用は、アルコール又はアセトンなどの混和性有機溶媒と水の混合溶媒中での分離に非常に適しているとして、文献中にも記載されている（Ｚｅｗｅｒｔ及びＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ、「電気泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」１３：８２４〜８３１、１９９２）。ゲル形成モノマーは、ひとたび重合するとその組合せが特定の型の電気泳動に適したゲルを形成するという条件で、架橋を形成することができる物質と組み合わせた、光重合反応基を含む任意の実質的に水溶性である分子であってもよい。
【０１０９】
ＩＥＦバッファーに加えることができる例示的な物質には、メチレン−ビス−アクリルアミド又は他の知られている架橋剤と組み合わせたアクリルアミド；ヒドロキシエチルメタクリレート、及びアクリル酸、メタクリル酸の他の低分子量（約３００ダルトン未満）誘導体、並びにクロトン酸などのそのアルキル置換誘導体；ビニルピロリドン、並びに他の低分子量ビニル及びアリル化合物；アガロース（「Ａｃｒｙｌａｉｄｅ」架橋剤、ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．）、デキストラン、及び他の多糖の誘導体、並びにヒドロキシエチルセルロースを含めたセルロース誘導体などの誘導体を含めた、非イオン性ポリマーのビニル、アリル、アクリル及びメタクリル誘導体；ポリビニルアルコール；エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシドのポリマー、及びこれらのコポリマーを含めた、グリコールのモノマー、オリゴマー及びポリマー誘導体；ポリＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルアクリル酸）、ポリマーＮ−イソプロピルアクリルアミド（これは温度感受性である）、マレイン酸ポリマー及びコポリマー、部分的に加水分解されたＥＶＡＣ（エチレンと酢酸ビニルのポリマー）、エチレンイミン、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド、並びにこれら同士、及びピリジン、ピロリドン、オキサゾリジン、スチレン、及びヒドロキシ酸などのさらに疎水性である化合物とのサブユニットのコポリマーなどの、他の水適合性ポリマーのアクリル、ビニル又はアリル誘導体がある。特に溶媒又は界面活性剤がゲル形成溶液中に含まれるときは、重合可能な物質は完全に水溶性である必要はない。
【０１１０】
追加的或いは代替的にＩＥＦバッファーは、当分野で知られている方法によって調製することができる一般的なポリマーの誘導体を含むことができる。例えば、酸、無水物又は塩化アシル、無水アクリル酸などを用いたヒドロキシルのエステル化と同様に、アリルグリシジルエーテルをヒドロキシル基に加えることは知られている。無水アシル又は塩化アシルを用いてアミンは容易に誘導体化する。
【０１１１】
候補となる非アクリルアミドモノマーは、例えばアリルアルコール、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチル［メチル］アクリレート）、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールモノアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ビニルカプロラクタム、ビニルピロリドン、アリルグリシジルデキストラン、ポリビニルアルコールのアリルグリシジル誘導体、セルロース及び誘導体、酢酸ビニル、並びに１つ又は複数のアクリル、ビニル又はアリル基を含む他の分子を含むことができる。
【０１１２】
一実施形態によれば、結晶化リアクターは重合ＩＥＦバッファーを含み、約２０μｍ〜約５ｍｍの直径、及び約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの長さなどの寸法を有する。重合バッファーを含む結晶化リアクターは、バッファー区画内のバッファー溶液中に浸したときにその構造を保ち、特にバッファー溶液が電場の影響を受けるときにその構造を保つことが好ましい。
【０１１３】
結晶化リアクターが重合ＩＥＦバッファーを含む場合、ＩＥＦ手順中に生体分子種の濃縮バンドが、その生体分子種の等電点（ｐＩ）がＩＥＦバッファーによって広がるｐＨ範囲内にある場合、結晶化リアクターと外部環境の間の界面付近に形成される。バンド内の生体分子種が次いで結晶化リアクター内に拡散し、予想外に急速な結晶の成長が始まる。
【０１１４】
前に詳細に述べたように、結晶化リアクターのポリマーは、電気泳動目的に適していることが知られている、任意のよく知られている典型的なゲル形成物質であってよい。このような物質には、十分に化学反応性がありイオン化可能な基、即ちカルボキシル、スルホン、ホスホン基などの酸性基、及びアミノ基などの含窒素塩基性基の導入を可能にするゲル形成ポリマーがある。典型的な適切な物質は、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール及び架橋ポリエチレンオキシドを含めたヒドロキシルポリマーである。適切に化学修飾された架橋ポリアクリルアミドゲル、寒天又はアガロースゲルも使用することができる。重合ＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターは、ポリマーを加えることによって重合するバッファーを与えることによって、電気泳動の分野で知られているポリマー及び方法を使用することによって一般的に調製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「分子クローニングにおける電気泳動バッファー（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｎｏｌａｎ、Ｃ．ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ．Ｂ．２３〜２４を参照。
【０１１５】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターを固体支持体と連結させる。好都合なことに、結晶化リアクターを支持体、例えば多孔質担体支持体、濾過紙、綿布又は亜麻布、又は適切な強度を与えるのに適した他のウエブ状物質などの上で支持することができる。さらに、寒天又はアガロースゲルのいくつかの架橋が、電場の影響に耐えるために望ましい。
【０１１６】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはキャピラリー内に与える。通常、Ｘ線結晶学法による回折像の回収用の結晶は、その結晶化媒体から注意深く分離し、キャピラリーチューブ中に挿入する。チューブはデンタルワックス又はシリコーングリース、及び水和作用状態を保つための少量の内部の結晶化媒体を使用して外気から密封する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｍａｌａｂａｒ、ｐ．２１４、１９８９）。キャピラリー内の結晶化リアクターを使用することによって本発明の方法を適用すること、
【０１１７】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は複数の結晶化リアクターを提供することを含む。さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターは、空間的に接触可能な方法で固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は複数の結晶を得ることを含み、その複数の結晶は、１つの装置内に含まれる同じ結晶化リアクター又は異なる結晶化リアクターで形成することができる。１つの装置内に含まれる異なる結晶化リアクターにおける複数の結晶は、実質的に同じ時間及び／又は実質的に同じ結晶化の設定下で形成することができる。したがって本発明の方法及び装置は、同時及び／又は同様の条件及び／又は設定下の、様々な生体分子の高スループット結晶化に適している。
【０１１８】
「固体支持体」又は「ホルダー」又は「マトリクス」を本明細書において交互に使用して、少なくとも１つの結晶化リアクターを含む不活性支持成分を指す。この成分は、少なくとも１つの結晶化リアクターを含むストリップ、膜、チップ、シート、又は任意の他の支持形であってよい。
【０１１９】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの耐性より大きな耐性を有する物質を含む。
【０１２０】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは非導電性物質を含む。非導電性物質は、ポリ−Ｎ−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレンからなる群から選択することができる。
【０１２１】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは生体分子に対して不透過性である物質を含み、１つの空洞内の結晶化リアクターから任意の他の空洞内の結晶化リアクターへのタンパク質の拡散を回避する。
【０１２２】
本発明のホルダーは固形物質又は半固形物質、例えばセラミック、ガラス、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）、ルサイト、又はゲルなどであり、１つ又は複数の結晶化リアクターを含むことができ、或いは結晶化リアクターを含むように適合させた１つ又は複数の空洞を含むことができる。一実施形態によれば、ホルダーを形成する物質は伝導性が乏しい。他の実施形態によれば、ホルダーは一部分或いは全体が、生体分子不透過性及びイオン不透過性である物質でできている。結晶化リアクターは例えばゲルとして、或いは支持体と連結、接合、又は実質的に接触したゲルとして、ホルダーの表面上に設定することができ、或いはホルダー中にエッチングした溝中に設定することができ、或いは結晶化リアクターがランニングバッファーと接触することができる限りはホルダー中で延長することができる。ホルダーは本発明の装置のバッファー室内を移動することができるか、或いはその中に固定することができる。
【０１２３】
本発明の一実施形態によれば、結晶化リアクターがマトリクス中で延長する場合、したがって結晶化リアクターの片側はランニングバッファーと接触しており、その側は生体分子不透過性物質でできた層で覆われていることが好ましい。
【０１２４】
それぞれの空洞が結晶化リアクターをほぼ含む複数の空洞を含むホルダーは、例えばホルダーの片側からホルダーの反対側まで穴又はチャンネルを掘ることによって、所定のｐＨ範囲を有するゲルに凝固するＩＥＦバッファーと混合させた、アガロース又はポリアクリルアミドゲルなどのポリマーをチャンネルに充填することによって作製することができる。ホルダー中の溝は、ホルダーの反対側に延長することはできない。溝はホルダーのいずれかの側に作製することができる。一実施形態によれば、溝はホルダーの片側に存在する。
【０１２５】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は、同じであるか或いは異なるＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供することを含む。さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は重複しない。
【０１２６】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターを含む固体支持体は、ＰｒｏｔｅｏｍＩＱ（商標）ＩＰＧストリップ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）などの固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、Ｓｅｒｖａｌｙｔ Ｐｒｅｃｏｔｅｓ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）、ｐＨ膜及び市販のプレキャストゲル（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｒｅｓｃｏ Ｉｎｃ．、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びその他）からなる群から選択される。ただし、複数の結晶化リアクターの配列は本発明の原理に適合しているか、或いは適合するように改変されているものとする。好ましくは、本発明によれば、複数の結晶化リアクターは不連続な配列のリアクターを形成し、それぞれのリアクターはあるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含み、それぞれのＩＥＦバッファーによって広がるｐＨ範囲は、その不連続な配列中の他のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲と重複するか或いは重複しない可能性がある。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は重合ＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供する。複数の結晶化リアクターは同一であってよく、或いはそれぞれの結晶化リアクターは異なるゲル（ポリマー）を含むことができる。場合によっては複数の結晶化リアクターは、特に異なる透過性（例えば、異なる孔サイズ）、構造及び粘性を示す複数の結晶化リアクターから生じる、異なる濃度の同じポリマーを含む。
【０１２８】
市販のＩＰＧストリップは、それぞれのＩＰＧストリップが複数の単離ｐＨバンドを含み、それぞれのｐＨバンドが一定のｐＨ範囲を含むという条件で、本発明を実施するために使用することができる。しかしながら、市販のＩＰＧストリップの欠点は、それぞれ個々のｐＨバンドの体積及び形状は、特に生体分子の拡散はバンド内では制限されるので、結晶を形成するのに一般に適していないことである。したがって、カスタムメイドのＩＰＧストリップは、本発明の原理に従い結晶を得るのに非常に適している。カスタムメイドのストリップの設計を最適化して、その中での生体分子の濃縮、拡散及び結晶化を容易にする。
【０１２９】
カスタムメイドのＩＰＧストリップは、不活性支持体、典型的にはアクリルアミドゲルと化学結合するように処理したマイラープラスチック製シートと結合した薄い平面状のＩＰＧゲル形（例えば、Ｇｅｌｂｏｎｄ（商標）ＰＡＧフィルム、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を作製するための、現在の慣習に従い典型的には作製する。ＩＰＧゲルは、０．５ｍｍ厚、１０〜３０ｃｍ長（分離方向）及び約１０ｃｍ幅の長方形プレートとして典型的には形成される。多数のサンプルをこのようなゲルに平行したレーンで施すことはできるが、交差汚染を生み出すレーン間のタンパク質の拡散という付随する問題点がある。所与のレーンに施したタンパク質すべてをそのレーン中で回収することが重要である場合（典型的には２−Ｄ電気泳動の場合と同様に）、ゲルを狭いストリップ（典型的には３ｍｍ幅）に分けることが必要不可欠であり、そのそれぞれが別個のゲルとして働くことがしたがって可能であることが分かっている。したがってサンプルのタンパク質は１つのストリップによって表されるゲルの体積に制限されるので、それはいずれもそのストリップ中で回収される。ＩＰＧ技術における等電点電気泳動によるタンパク質の分離は、当分野において広く記載されている。ＩＰＧの概念は米国特許第４，１３０，４７０号中に開示されており、多数の後の刊行物中にさらに記載されている。
【０１３０】
或いは、米国特許第４，２４３，５０７号中に開示されたのと同様に、重合ＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターは結合剤によってホルダーに取り付けることができる。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「ＩＥＦバッファー」は、所与のｐＨ値周辺でバッファー能力を有する成分（バッファー剤）、又は構造化してｐＨ勾配を形成する成分（例えば両性電解質、イモビリン又はバッファー剤の組合せ）を含むバッファーを指す。
【０１３２】
本発明のＩＥＦバッファーは、タンパク質のｐＩがＩＥＦバッファーのｐＨ範囲内にない限り、ＩＥＦバッファー中の電場内をタンパク質が移動することができる、粘性液体又はスラリー又はゲルの形であってよい。本発明のＩＥＦバッファーは、尿素、界面活性剤及び還元剤などの他の成分を必要に応じて含むことができる。本発明のＩＥＦバッファーは、電場の影響下で機能的に安定していることが望ましい。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「粘性液体」は、最小の対流移動、好ましくは対流移動なしで、最小〜ゼロの沈降で、粘性液体中でのマクロ分子の拡散を容易にする、最適化された粘性を有する液体又は他の媒体を指す。
【０１３４】
ＩＥＦバッファー、及びＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターは手作業によって、或いは様々なデバイスによって形成することができる。例えば、ＩＥＦバッファーは支持体の表面に堆積させる（例えばコーティング、プリント又はスポットする）ことができ、表面に固定することができ、或いは支持体の溝又はチャンネルに堆積させることができる。支持体はマトリクス、マトリクスと同じ物質でできた膜又はビーズなどであってよい。
【０１３５】
酸性溶液と塩基性溶液を混合して所望のｐＨ値を有するバッファーを形成するデバイス（「滴定装置」）によって、ＩＥＦバッファーを作製することができる。重合の目的用に、バッファーをモノマー（例えばアクリルアミド）及び重合剤とさらに組み合わせ、所望の位置にＩＥＦバッファーを置く他のデバイス（例えば空洞）に充填することができる。
【０１３６】
一実施形態によれば、本発明のＩＥＦバッファーを生成するために使用する両性電解質は、両性（即ち、酸性媒体中では正に帯電し、塩基性媒体中では負に帯電している）、可溶性であり、且つ約３００から１０００ｕまでのＭｒ値を有する、一組の様々なオリゴ−アミノ及び／又はオリゴカルボン酸である。本発明で使用する両性電解質は、調製することができるか或いは購入することができる。例えば、いくつかの担体両性電解質が当分野では知られている（例えば、ページ３１〜５０、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、Ｐ．Ｇ．、（１９８３）「等電点電気泳動：理論、方法及び用途（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ：Ｔｈｅｏｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｅｄｓ．、Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、アムステルダム；米国特許第３，４８５，７３６号）。或いは、購入される両性電解質には、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ（ＬＫＢ）、Ｓｅｒｖａｌｙｔｅｓ（Ｓｅｒｖａ）、Ｂｉｏｌｙｔｅｓ又はＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）がある。
【０１３７】
イモビリンを使用して、本発明のＩＥＦ溶液を生成することもできる。イモビリンは、一般式：ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒの非両性、二官能性のアクリルアミド誘導体である。本発明に従い有用であるイモビリンは、調製することができるか或いは購入することができる。イモビリンを合成するための方法は当分野で知られている、例えば、Ｂｊｅｌｌｑｕｉｓｔら、（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６：３１７、１９８３）。イモビリンをアクリルアミドと共重合させて、固定化ｐＨ勾配からなる結晶化リアクターを形成することができる。本発明のｐＨ勾配は、両性又は非両性のバッファーを混合することによって形成することができる。例えば、このようなバッファーの組合せは、Ａｌｌｅｎ、ＲＣら、「タンパク質のゲル電気泳動及び等電点電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」：「選択された技術（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ベルリン：Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ＆ Ｃｏ．（１９８４）中、及び米国特許第５，４４７，６１２号（Ｂｉｅｒ）中に記載されている。いくつかのＩＥＦバッファー剤には、（１）５０ｍＭのグリシン、１４ｍＭのＮａＯＨ；（２）５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２ｍＭのＮａＯＨ；（３）５０ｍＭのＴＨＭＡ、４４．６ｍＭのＨＣｌ；（４）５２ｍＭのクエン酸、９６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；（５）５０ｍＭのＢＩＣＩＮＥ、１８ｍＭのＮａＯＨ；及び（６）５０ｍＭのＤＭＧＡ、４０ｍＭのＮａＯＨからなる群から選択されるバッファー剤がある。それぞれのセル中でＩＥＦバッファーによって生じるｐＨ勾配は、狭いｐＨ範囲又は広いｐＨ範囲（例えば、それぞれｐＨ６．８〜ｐＨ７．８又はｐＨ６．８〜ｐＨ１２．８）を有する可能性がある。
【０１３８】
本発明の方法において使用し、本発明の装置及び方法の電力供給によって生じる電場は、本発明の方法及び装置が耐えることができる任意の電圧、例えば１００〜１００００ボルト、又は５００〜１００００ボルト、又は５００〜５０００ボルトであってよい。ただし、生成する熱はランニングバッファーを含む区画中に放散させることができ、適切な冷却によって調節することができるものとする。供給される電圧はＤＣ又はＡＣであってよい。ＤＣ及びＡＣ電流を供給することができる電力供給装置及び電極は市販されており、当分野で知られている。
【０１３９】
一実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である。
【０１４０】
さらに他の実施形態によれば、電場は交流電場、直流電場からなる群から選択される。ＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターが、結晶化リアクター中へのその進入の反対側に電流が出るのを妨げるように密閉される場合、したがって一実施形態によれば、電場は可逆的である。結晶化リアクターが開放状態である場合、したがって電場は直流、即ち単向性、又は交流である可能性がある。
【０１４１】
用語「バッファー」又は「バッファー溶液」又は「ランニングバッファー」を本明細書において交互に使用して、一方では弱酸（炭酸など）及びこの酸の塩の１つ、及び弱酸の少なくとも１つの酸塩；或いは他方では、弱塩基（アンモニアなど）及び塩基の塩の１つを含む溶液を記載する。これらの成分を有するので、バッファーはそれぞれの成分の濃度に従って、溶液のｐＨを確定することができる。バッファーはさらに、水素イオン濃度の変化に対するその耐性のために、酸又は塩基を加えても確定したｐＨを維持することができる。ｐＨを確定し維持する所与のバッファーの能力は、「バッファー能力」とも呼ばれる。
【０１４２】
さらに他の実施形態によれば、単離したほぼ純粋なタンパク質の溶液を本発明において使用して、タンパク質結晶を得ることができる。純粋なタンパク質は、当分野で知られている任意の適切なタンパク質精製法によって得ることができ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（Ｍｅｔｈ．「酵素学（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１８２：８３〜８９、１９９０）中及びＳｃｏｐｅｓ（「タンパク質の精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」：「原理及び実践（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８２）中に記載されたものを含む。タンパク質の精製は、他の生物物質から、所望のタンパク質をコードする組換え核酸を用いて形質転換した細胞の細胞成分などからの、所望のタンパク質の単離を含む。例えば、免疫親和性クロマトグラフィーを使用することによって、例えば所望のタンパク質と特異的に結合する抗体を使用して、精製を実施することができる。
【０１４３】
用語「非精製タンパク質」及び「十分に精製されていないタンパク質」を本明細書において交互に使用して、その本来の状態で付随しないその構造又は成分の一部分ではない成分から、完全に分離されていないタンパク質を記載する。典型的には、精製タンパク質は約６０〜９０％Ｗ／Ｗ、約９５％、及び約９９％の純粋なタンパク質をタンパク質サンプル中に含む。本発明において使用するタンパク質は、ＩＥＦ手順の前に必ずしも十分に精製する必要はない。
【０１４４】
一実施形態によれば本発明は、多数のタンパク質を分析し選択したタンパク質を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を含む溶液を提供するステップと、
（ｂ）支持体上での電気泳動によって溶液を分析し、それによって少なくとも１つの生体分子種に対応する少なくとも１つのバンドを支持体中に得るステップと、
（ｃ）支持体から一部分を分離することであって、その部分が（ｂ）で分析した少なくとも１つのバンドを含むステップと、
（ｄ）あるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップであって、そのｐＨ範囲が前記少なくとも１つのバンドのｐＩを含むステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つのバンドを少なくとも１つの結晶化リアクターに加えるステップと、
（ｆ）ランニングバッファーに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に、（ｂ）で分析した少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｇ）少なくとも１つの結晶化リアクター内で、（ｆ）の濃縮溶液中の前記少なくとも１つの生体分子種を結晶化するステップと
を含む上記方法を提供する。
【０１４５】
さらに他の実施形態によれば、さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、加えた少なくとも１つのバンドをランニングバッファー中の少なくとも１つの結晶化リアクターに置くステップをさらに含む。ステップ（ｅ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含むことが好ましい。ステップ（ｇ）は、タンパク質結晶の形成を監視する及び／又は検出するステップをさらに含むことが有利である。
【０１４６】
結晶の形成の調査及び検出は、結晶化リアクター中のサンプルの生体分子を検出するためのデバイス；検出デバイスからのデータを受信するためのデバイス；及び受信したデータを処理するためのデバイスの、いずれか１つによって実施することができる。一実施形態によれば、走査型マイクロデンシトメーターが、結晶化リアクターからのシグナルを検出し、受信し処理する。
【０１４７】
結晶化リアクター中のサンプルの生体分子を検出し、検出デバイスからのデータを受信し、受信したデータを処理するのに必要不可欠な１つ又は複数のデバイスを、コンピュータ中にパッケージ化することができる。
【０１４８】
検出デバイスを設計して、波長、複数の波長又は１つの波長のスペクトルである電磁放射を、同時又は順次にレーン上に投影することができる。一実施形態によれば、照明光源は単色である。例えば検出デバイスは、狭いスペクトルの光がそれぞれのリアクター上に投影された後の特定の波長における、それぞれの結晶化リアクターからの吸収の程度を迅速に順次読み取る、カスタムメイドの光度計であってよい。或いは、検出デバイスを設計してそれぞれのリアクターを同時に読み取る、且つ／或いはいくつかの波長においてそれぞれのリアクターから放出された電磁放射に関する読み取り値を得ることができる。
【０１４９】
適切な検出デバイスには、裸眼、分光光度、化学発光、光度／密度計、電気化学検出装置、又は生体分子が標識されているかどうか、及びその標識の型に依存する放射化学検出装置があるが、これらだけには限られない。シグナルを生成する反応を引き起こすための他の成分、又は前述の方法に従い検出可能なシグナルを増大させるための他の成分を、標識が必要とする可能性がある。適切なシグナル生成システムの詳細な論述は、米国特許第５，１８５，２４３号中で見ることができる。標識を結合させるための技術の詳細は当分野で知られている。例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）１５１：２０５〜２０９、及び欧州特許出願第０３０２１７５号を参照のこと。
【０１５０】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）の溶液は支持体上での等電点電気泳動によって溶液を分析し、それによって少なくとも１つの生体分子種の等電点に対応する少なくとも１つのバンドを支持体中に得る。
【０１５１】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｄ）のＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する。
【０１５２】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度が０〜３０℃の範囲内に維持されるように本発明の方法を行う。他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である。
【０１５３】
さらに他の実施形態によれば、本発明は、それぞれの結晶化リアクターにおける温度が、任意の他の結晶化リアクターの温度とは別個である、好ましくは異なる、複数の結晶化リアクターを提供する。温度は、本発明の方法において拡散及び結晶の成長を最適化するために調節することができる、１つのパラメータである。
【０１５４】
様々な市販の温度制御モジュールを、本発明の文脈で使用するために適合させることができる。代表的な適切なモジュールは、ロボットによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用に設計した自動式熱循環装置であり、これを改変して本発明の要件に適合させることができる。例えば、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈの熱循環装置（ＭＪＲ、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州；例えば、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（商標）、Ｄｙａｄ（商標）、Ｍｉｎｉ−Ｃｙｃｌｅｒ、ＰＴＣ−１００（商標）、Ｔｅｔｒａｄ（商標））はペルティエ熱を特徴とし、Ａｌｐｈａ（商標）モジュールは交換可能な発熱体であり、ユーザがサンプル形式を迅速に変えるのを可能にする。これらの循環装置のいくつかはＨｏｔ Ｂｏｎｎｅｔ（商標）加熱蓋を特徴とし、マイクロウエルプレート及びさらに顕微鏡スライドを含めた、様々なサンプル形式に使用することができる。他の適切なシステムは、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）装置（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）である。このシステムはミクロ流体に基づくこの会社のＩ−ＣＯＲＥ（登録商標）技術に基づくものであり、それぞれのサンプルを異なる実験条件に施すことを可能にする温度制御モジュールである。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）は、他の適切な温度制御モジュールを与える。ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒは４つのプログラム可能なブロックを特徴とし、最適化を簡潔にするための勾配特徴を与える。この循環装置の特異性は、それがロボットアームを使用してサンプルをブロックからブロックに動かし、それぞれのブロックの温度が異なる可能性があることである。
【０１５５】
一連の開示は、マクロ分子及びマクロ分子含有サンプルをゲル、最も頻繁にはタンパク質又は核酸分離用に使用されるスラブゲルの表面に充填するために使用される、様々な形状の開口部（「サンプルウエル」）を扱っている。それぞれの場合、サンプル中のマクロ分子をそれらが分解ゲル中を移動する前に薄い開始ゾーン中に濃縮させるために、これらのサンプルウエルを設計する。以下の参照文献は、ウエルを形成するためにゲルに対して配置したデバイスの使用を記載している：米国特許第５，３０４，２９２号は、破片の両端がスラブの上端と接触するウエル壁をスラブの上部に形成するための、圧縮性ガスケットの破片の使用を記載している。米国特許第５，１６４，０６５号は、ＤＮＡシークエンシングゲルと組み合わせて使用するサメの歯のすきぐしを記載している。
【０１５６】
急速な結晶化のための装置
本発明は、急速な結晶化のための装置も提供する。さらに他の実施形態によれば、本発明は、タンパク質結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
（ａ）少なくとも１つの結晶化リアクターであって、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも１つの結晶化リアクターと、
（ｂ）電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
（ｃ）バッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置を提供する。
【０１５７】
一実施形態によれば、装置は上側及び下側を有するホルダーをさらに含み、そのホルダーは少なくとも１つの結晶化リアクターを含むか、或いは少なくとも１つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合しており、前記少なくとも１つの結晶化リアクターはＩＥＦバッファーを含み、ホルダーはバッファー区画内に含まれる。他の実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つのバッファー区画内に置く。ある実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つの結晶化リアクターを含むキャピラリーである。
【０１５８】
さらに他の実施形態によれば、装置は２つの端部を有する２つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の１つの端部はホルダーの１つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の１つの端部は少なくとも１つのバッファー室内に含まれる。装置は２つのバッファー室、それぞれのバッファー室が１つの塩橋の１つの端部を囲うようなそれぞれのバッファー室を含むことが好ましい。
【０１５９】
典型的には、塩橋はイオン導電体として働き、生体分子溶液を含む少なくとも１つの結晶化リアクター、或いはそれを含む成分、ホルダー及び／又は支持体などと、バッファー区画内のバッファーの間に通常配置される。本発明の装置に適した塩橋の例には、塩化カリウム又は硝酸カリウムなどの電解質を寒天培地に溶かすことによって得ることができるイオン導電体を充填した、ガラス、セラミック材料又はプラスチックチューブがある。
【０１６０】
他の実施形態によれば、バッファー区画は、ランニングバッファー及びランニングバッファー内に溶解した少なくとも１つの生体分子種を含む溶液を保持するように適合させる。
【０１６１】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つの空洞を有しており、この少なくとも１つの空洞はＩＥＦバッファー及びポリマーを含む結晶化リアクターを保持するように適合している。
【０１６２】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは複数の空洞を含み、それぞれの空洞は、ポリマー及びＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターを含む。
【０１６３】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は重複しない。
【０１６４】
記載する種類の装置中の複数の結晶化リアクターを含むホルダーは、任意の所望の形状、例えば並んで配置される水平系の結晶化リアクターとして配置することができ、一般的なスペーサーによって、或いは垂直系として隔てることができる。
【０１６５】
ここで図１を参照すると、本発明の装置は、数本の電極、即ちアノード及びカソード、並びにランニングバッファーを含むバッファー室を含む。この装置はイモビリンバッファーを含む結晶化リアクター（図１Ａ）、キャピラリー内の結晶化リアクター（図１Ｂ）、又は複数の別個で単離されたｐＨバンドを含むカスタムメイドのＩＰＧストリップ（図１Ｃ）をさらに含む。
【０１６６】
ここで図２及び３を参照すると、本発明の装置は、バッファー室（２）内に囲われたバッファー区画（１）、ホルダー（３）、結晶化リアクター（５）及び電極（６）を含む複数の空洞（４）を含む。
【０１６７】
一実施形態によれば、本発明の装置は複数の結晶化リアクターを含み、それぞれの結晶化リアクターはＩＥＦバッファーを含み、場合によってはＩＥＦバッファーは重合されている。複数のＩＥＦバッファーによって生じるｐＨ範囲のｐＨの上限及び下限は、異なっているか或いは同一であってよい。例えば、結晶化リアクター＃１中のＩＥＦバッファーはｐＨ６．８で始まりｐＨ７．８で終わるｐＨ範囲を有する可能性があり、結晶化リアクター＃２中のＩＥＦバッファーはｐＨ７．９で始まりｐＨ８．９で終わるｐＨ範囲を有する可能性がある。さらに、結晶化リアクター＃１と結晶化リアクター＃２のＩＥＦバッファー間のｐＨステップは、異なるｐＩ単位又は同一のｐＩ単位であってよい。
【０１６８】
さらに他の実施形態によれば、ＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は広くて、狭くて或いは非常に狭くてよく、例えば０．１ｐＨ単位以下、０．０２ｐＨ単位以下、或いは０．０１ｐＨ単位以下で広がる。
【０１６９】
さらに他の実施形態によれば、ＩＥＦ手順は本発明の装置を使用して行い、ランニングバッファーを含むバッファー区画は、ＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを含む複数の空洞を含むホルダーをさらに含む。この設定を使用して、複数の空洞を物理的に隔てることによって互いに離し、これによってランニングバッファーを介した動きではなく、１つの結晶化リアクターから他の結晶化リアクターへの直接の生体分子の動きを実質的に妨げる。したがって生体分子は主に、ランニングバッファーを介して１つの結晶化リアクターから他の結晶化リアクターに動く。他の実施形態によれば、結晶化リアクターは同じ又は異なるｐＨ範囲を含む。さらに他の実施形態では、本発明は、１つの設定を使用して複数の別個のタンパク質を結晶化することができるように、実質的に重複しないｐＨ範囲を有する多数の別個の隔離された結晶化リアクターを含む。さらに、結晶化リアクターが狭い、好ましくは非常に狭いｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、本発明の装置、システム及び方法を使用することによって、特に伝統的なＩＥＦゲルと比較して高い、本発明の方法の分解能のために、０．０２ｐＨ単位以下離れたｐＩ値を有する複数の別個のタンパク質を１つの設定で結晶化することが可能である。
【０１７０】
システムの１つの形状によれば、１つの結晶化リアクターから隣接する結晶化リアクター中、例えばわずかに異なるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクター間の生体分子の拡散は、本発明の装置を使用することによって避けられる。ただし、結晶化リアクターを含むホルダーが、生体分子に対して不透過性である物質を含むものとする。
【０１７１】
以下の名称は、それらが本明細書全体及び以下の特許請求の範囲中に現れるとき、本発明の装置の成分に使用する：用語「バッファー室」又は「ランニングバッファー室」は交互に使用することができ、タンパク質溶液を含むバッファーを保持する容器又はリザーバを表す。用語「マトリクス」又は「チップ」又は「アレイ」又は「ホルダー」は交互に使用することができ、結晶化リアクターを含む成分を表すことができる。
【０１７２】
急速な結晶化の適用例
急速なマクロ分子の結晶化は、保存、薬剤設計及び薬剤送達に関して非常に産業的価値がある。多量の結晶マクロ分子の調製に関する産業上の必要性も存在する。産業規模の処理に適した、当分野で知られている結晶化の方法は存在しない。何故なら、結晶が成長しない危険性が常に存在し、結晶が実際に成長し始める場合、所望の大きさの結晶を得るのに必要とされる長い時間は実用的ではないからである。
【０１７３】
大規模なマクロ分子の結晶化、及び特にタンパク質の結晶化用の、迅速で効率の良い技術を生み出すための動機は以下のものである。
【０１７４】
第１に、純粋である結晶状態のマクロ分子を生成することが望ましい。このような結晶は、治療剤及びワクチンの剤形調製に非常に有利な形のタンパク質又は核酸を構成する。本発明は、マクロ分子を結晶化するための迅速な方法を提供する。大規模な結晶化は、臨床薬製造プロセス、治療剤及びワクチンを製造するためのプロセスにおける、最終的な精製ステップ及び／又は濃縮ステップとして導入することができる。さらに、大規模な結晶化は、製造プロセス中のいくつかの精製ステップを交換することができる。例えば、タンパク質の結晶化はタンパク質配合物の生成を簡素化し、それを一層手ごろなものにすることができる。
【０１７５】
第２に、マクロ分子の結晶を保存することは、溶液を保存することより有利である。何故なら、溶液中で起こるマクロ分子の相互作用は、全体の反応速度が相当低下するために、結晶状態を妨げるか或いは著しく低下させるからである。したがって結晶状態は、生物マクロ分子の混合物の保存に特に適している。結晶の貯蔵寿命は、米国特許第６，５４１，６０６号中に開示されたのと同様に、ポリマー担体を含むマトリクス内に結晶を被包して組成物を形成することによって、さらに延長させることができる。この組成物は、タンパク質の本来の生物学的活性がある三次構造の保存状態を高め、必要とされる場所及び時に活性タンパク質をゆっくりと放出することができるリザーバを形成する。
【０１７６】
第３に、固体状の結晶調製物を容易に還元して、非常に高いタンパク質濃度を有する直ぐに使用可能な非経口配合物を生成することができる。このようなタンパク質濃度は、配合物が皮下投与を目的とするものである場合は非常に有用であるとみなされる、例えば国際特許公開ＷＯ９７／０４８０１を参照のこと。皮下投与に関しては、１．５ｍｌ以下の注射体積が十分許容可能である。したがって、１週間単位では１ｍｇ／ｋｇで投与されるタンパク質に関しては、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が必要とされ、１００〜２００ｍｇ／ｍｌが好ましい。凝集の問題のために、これらの濃度を液体配合物において得るのは困難である。本発明の方法によって得られるタンパク質結晶を使用して、これらの濃度は容易に得ることができる。
【０１７７】
第４に、タンパク質結晶は薬剤調製に非常に有利な形も構成する。ｉｎ ｖｉｖｏ用の徐放性配合物の主成分として結晶を使用することができる。当業者が理解するように、粒子の大きさは結晶の溶解及び活性物質の放出のために重要である。結晶が実質的に均一な粒子の大きさを有し非晶質沈殿を含まない場合、放出の速度はさらに予想しやすくなることも知られている、例えば欧州特許第２６５，２１４号を参照のこと。したがって、タンパク質結晶は植え込み型デバイスにおいて有利に使用することができる、例えば国際特許公開ＷＯ９６／４００４９を参照のこと。植え込み型リザーバは一般に約２５〜２５０μｌである。この体積制限によって、高濃度（１０％を超える）の配合物及び最小量の懸濁媒体が好ましい。本発明の方法によって得られるタンパク質結晶は、このような高濃度で非水性懸濁液に容易に配合することができる。
【０１７８】
第５に、結晶の他の利点は、いくつかの変数を操作して経時的にマクロ分子の放出を調節することができることである。例えば、結晶の大きさ、形状、溶解に影響を与える賦形剤との配合、架橋、架橋のレベル、及びポリマーマトリクス中への被包をいずれも操作して、生物分子用の送達媒体を生成することができる。
【０１７９】
本発明は、前に記載したニーズを提供する。本発明の方法の以下の利点によって、本発明の方法はマクロ分子の高スループットの産業用の結晶化に適したものとなる：
１．少量の希釈した、必ずしも精製されていないタンパク質サンプルから結晶を成長させる能力。
２．濃縮タンパク質溶液又は濃縮タンパク質バンドが、数時間以内、さらに数分間以内に直ぐに生成される。
３．結晶化リアクター中に蓄積するマクロ分子は非帯電状態であるか、或いは非常に少量の電荷を有しており、したがって静電気による反発作用は、無視できる程度であるか或いは存在しない。
４．沈降、対流又は沈殿が、濃縮したマクロ分子溶液の形成中又は結晶の形成中に生じない。
５．結晶の成長が非常に速い、約数分間又は数時間以内である可能性がある。
６．本発明の方法のＩＥＦ成分による、結晶化過程中のタンパク質サンプルの製造過程の精製によって、不純物及び他のイソ型による考えられる汚染が排除され、したがって本発明の方法は、既存の結晶化法と比較して、あまり精製されていないタンパク質サンプルを用いた作業を可能にする。
７．キャピラリー内で結晶化リアクターを使用する、本発明の方法を適用するためのオプションは、結晶学的方法に特に適している。何故なら、リアクターから異なる環境に結晶を移動させる必要がないからである。このような移動は、結晶の構造及び安定性を危うくする。
【０１８０】
本発明の方法の前述の利点によって本発明の方法は、所与のタンパク質の個々のイソ型の同時の分離及び結晶化に適したものとなる。
【０１８１】
一実施形態によれば本発明は、高スループットで急速なマクロ分子の結晶化のための、小型化及び自動化された装置並びに方法を提供する。本発明の装置は、自動式相互作用成分、例えばＩＥＦバッファー（イモビリン、両性電解質など）を含む前重合結晶化リアクターを空洞に充填するための滴定装置、空洞又は結晶化リアクターからタンパク質結晶を回収するための抽出装置、及び結晶化リアクター内のタンパク質結晶の形成を調べて記録するためのデバイスを有ように構築することができる。
【０１８２】
本発明の原理に従い形成される結晶のさらなる安定性は、この目的用の当分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、米国特許第６，５４１，６０６号中に開示されたのと同様に結晶を被包することができ、或いはキャピラリーチューブ中に挿入することができ、次いでこれをデンタルワックス又はシリコーングリース、及び水和作用状態を保つための少量の内部の結晶化バッファーを使用して外気から密封する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、同書）。
【０１８３】
本発明の方法及び装置による結晶化プロセスの最適化は、異なるゲル濃度（孔径、拡散定数）及び様々なタンパク質希釈液を有するいくつかの結晶化リアクターを使用して、１つの実験によって達成することができる。それぞれの結晶化リアクターは、異なる温度に曝すこともできる。
【実施例】
【０１８４】
（実施例１）
ｐ５３タンパク質の成分の結晶化
３つのタンパク質サンプルが供給された：
（ａ）ｐ５３ヒトＤＢＤ［ｐＩ（理論値）＝８．８３］
（ｂ）Ｃ Ｅｌｅｇａｎｓからのβ−転写因子［ｐＩ（理論値）＝５．９８］
（ｃ）ヒトβ−転写因子［ｐＩ（理論値）＝５．５］
【０１８５】
３つのサンプルすべてを、市販のＩＰＧストリップｐＨ３〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上での当初のＩＥＦによって分析して、特定のタンパク質のｐＨを測定した（図４）。図４中に見ることができるように、３つの「精製」タンパク質溶液のそれぞれは、多数の異なるタンパク質バンドから構成されることが分かった。
【０１８６】
本発明の方法による結晶化用に、特定のタンパク質のあるｐＩに対応するバンドを選択した。図４Ｃ中に図式的に記載したのと同様に、理論値ｐＩ付近のｐＨ値を有する手製のＩＰＧストリップ及び装置を使用して、結晶化を行った。数個の結晶が急速に形成された。結晶をＩＰＧゲルから抽出し、ｐ５３サンプルに関して得た散乱像は実際、２．８Å分解能で多結晶サンプルに特徴的であった。
【０１８７】
（実施例２）
ＬＰＧズームストリップを使用することによる、ＩＥＦによって分離したタンパク質の結晶化の可能性の実証
我々の結晶化技術はわずか数マイクログラムの量のタンパク質を必要とするので、ＩＥＦによる分離は結晶を得るための物質の源として働くことができる。このような実験は、図５中に見られるのと同様にｐ５３サンプルから分離したバンドの１つで行った。
【０１８８】
以下の手順を使用した：ＩＰＧストリップから、我々はｐＨ９．６までのバンドを選択し切断し、結晶化用に我々は、図４Ｃ中に示すシステムを選択して使用した。その目的で短いＩＰＧズームストリップを、９．５〜９．７５の範囲０．０５のステップで調製した。ストリップは標準的な密度勾配法によって調製した。ＩＥＦ実験から切断したタンパク質バンドは、ＩＰＧストリップの端近くのポリアクリルアミドに接着させた。ストリップは図４Ｃ中に示す電気泳動チャンバーの上に置いた。図６Ａ中に実証したように、標準的なＩＥＦ手順は分離画分の集中及び結晶化をもたらし、上質の結晶が生じた。２．４Åの分解能を実証する回折像を図６Ｂに示す。
【０１８９】
（実施例３）
ミオグロビンの結晶化
ウマ心臓ミオグロビン（７５μｇ）を１．５ｍｌの水に溶かし、結晶化装置中に導入した。この溶液はＩＥＦ手順用のランニングバッファー（ｐＨ＝７．００）として働いた。イモビリン（商標）バッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、直径１ｍｍ及び深さ１ｍｍの１０％ポリアクリルアミドゲルの円筒形空洞中に重合させた（ｐＨ＝６．８０）。ＩＥＦ分離は以下の条件：１２００Ｖ、３０分間、及び電極間の距離０．５ｃｍの下で行った。
【０１９０】
ＩＥＦは装置の強い攪拌下４℃で行って、バッファー溶液内のタンパク質の移動を容易にした。ＩＥＦ手順のために行った有効な測定によって、ゲルの空洞中に蓄積したタンパク質の量は、溶液中の全タンパク質の約５０％であったことが示された。
【０１９１】
顕微鏡下でゲルの空洞を監視することによって、ゲル中の非常に発達した結晶構造が明らかになった（図７Ａ）。
【０１９２】
（実施例４）
ヘモグロビンＳの結晶化
ヘモグロビンＳの溶液（１μｇ／ｍｌ、水中；Ｓｉｇｍａ）、ｐＩ＝７．０を、６．９〜７．０５のｐＨ範囲を有するｐＨバッファー（イモビリン（商標）、４％ポリアクリルアミドゲル中）中への等電点電気泳動によって濃縮した。１０００Ｖ／ｃｍの電場を、２５℃の温度の下で３０分間引加した。３０分後、４００μｍ長の結晶を得た（図７Ｂ）。
【０１９３】
（実施例５）
フィコシアニンの結晶化
１μｇ／ｍｌの溶液中で約４．５のｐＩを有する市販のフィコシアニン（１μｇ；Ｓｉｇｍａ）に、４．４〜４．６のｐＨ範囲を有するｐＨバッファー（イモビリン（商標）、４％ポリアクリルアミドゲル中）においてＩＥＦ手順を施した。等電点電気泳動の条件は：２５℃、１００Ｖ／ｃｍの電場、及び３０分の実験時間であった。３０分後、結晶を得た（図８Ａ）。
【０１９４】
同様に、アルコールデヒドロゲナーゼ（図８Ｂ）及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ；図９Ａ）の結晶を得た。
【０１９５】
（実施例６）
アクアポリン３の結晶化
膜タンパク質は一般に、構造決定に関する最も重要なタンパク質であるとみなされている。残念ながら、タンパク質を結晶化するための最も標準的な方法は、膜タンパク質の結晶を生成することができない。この本発明の実施例は、最も重要な膜タンパク質の１つであるアクアポリンの結晶化を可能にする本発明の方法の能力を実証する。
【０１９６】
水及びＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むランニングバッファー中でｐＩ＝６．７のラットアクアポリン３の溶液（１μｇ／ｍｌ；Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、結晶化手順を施した。ｐＨゲル空洞（４％ポリアクリルアミド、ｐＨ６．６５〜６．８）中のタンパク質の濃縮手順は、以下の条件：４０分の実験時間、２５℃及び１００Ｖ／ｃｍを使用してＩＥＦによって行った。生成した結晶は図９Ｂに示す。
【０１９７】
（実施例７）
ウシ炭酸脱水酵素の結晶化
５．９５のｐＩを有するウシ炭酸脱水酵素の溶液（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を、ＩＥＦによって５．８〜６．０のｐＨを有するｐＨゲル区画（空洞；４％ポリアクリルアミド）中に濃縮した。この濃縮手順は、１００Ｖ／ｃｍの電場の下で２５℃において４０分を要した。４０分後、結晶を得た（図１０）。
【０１９８】
（実施例８）
ペプシン−４、クレアチンキナーゼ１、β−ヒト成長因子、アビジン、ヘルセプチン、Ｌｙ１リゾチーム、リボヌクレアーゼ−１及びプロスタグランジンの結晶化
ペプシン−４、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、β−ヒト成長因子（βｈＧＦ）、アビジン、ヘルセプチン、Ｌｙ１リゾチーム、リボヌクレアーゼ−１（ＲＮＡｓｅ−１）及びプロスタグランジンのタンパク質結晶化は、表１中に詳細に述べたように行った。生成した結晶及び／又は結晶化したタンパク質の分画の回折は図１１〜１５中に示す。
【０１９９】
【表１】
【０２００】
特定の実施形態のこれまでの説明は、本発明の一般的性質を完全に明らかにするため、現行の知識を適用することによって、他者はこのような特定の実施形態を過度の実験を必要とせず一般的概念から逸脱しないように、各種用途に容易に改変及び／又は適合させることができ、したがって、このような適合及び改変は、開示した実施形態の均等物の意味及び範囲内に含まれるはずであり、含まれるものとする。本明細書で使用する語法又は述語は、制限ではなく説明を目的とすることは理解されよう。各種の開示された機能を果たすための手段、材料、及びステップは、本発明から逸脱することなく各種の代替形をとることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】バッファー室（２）内に囲われたバッファー区画（１）、ホルダー（３）、電極（６）、塩橋（１０）及び固体支持体（７）、１つ又は複数の結晶化リアクター（５）を含むキャピラリー（８）又はストリップ（１４）、及び場合によっては荷重点（９）を含む、様々な結晶化システムの概略図（Ａ−Ｃ）である。
【図２】バッファー室（２）内に囲われたバッファー区画（１）、ホルダー（３）、結晶化リアクター（５）及び電極（６）を含む複数の空洞（４）を含む、結晶化装置の概略図である。
【図３】（Ａ）はホルダー（３）中に含まれる結晶化リアクター（５）内の、タンパク質バンド（１２）からのタンパク質の移動を記載する図であり、（Ｂ）は３つの結晶化リアクターを含むホルダー（３）の上面図（左図）及び側面図を記載する横断面図である。
【図４】３〜１０のｐＨ範囲の市販のＩＰＧストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのＩＥＦによる、３つのタンパク質サンプルの分離を表す図である。
【図５】９．５〜９．７５の狭いｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを用いて本発明の方法を使用して図１のＩＰＧストリップから得た、タンパク質の分離及び急速な結晶化を示す図である。
【図６】本発明の方法によって得たｐ５３の結晶（Ａ）及びその回折像（Ｂ）を示す図である。
【図７】結晶化リアクター中で得た一種のミオグロビンタンパク質結晶、約１００μｍ長の像（Ａ）（３００μｍ×１５０μｍ）及びゲル中のヘモグロビン結晶の像（Ｂ）を示す図である。中央の縦長の物体は、約４００μｍ長のヘモグロビン結晶である。
【図８】フィコシアニン結晶（Ａ）及びゲル中のアルコールデヒドロゲナーゼ結晶（Ｂ）の像を示す図である。
【図９】空洞内のゲルから抽出したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）結晶の像（Ａ）及びゲル中のアクアポリン３の結晶の像（Ｂ）を示す図である。
【図１０】重合ＩＥＦバッファーからなる結晶化リアクター内の炭酸脱水酵素結晶（Ａ）及び結晶化リアクターから抽出した結晶（Ｂ）の像を示す図である。
【図１１】ペプシン−４結晶（Ｂ）の回折像（Ａ）の像を示す図である。
【図１２】クレアチンキナーゼ１結晶（Ａ）、β−ヒト成長因子結晶（Ｂ）及びアビジン結晶（Ｃ）の像を示す図である。
【図１３】ヘルセプチン（Ａ）及びＬｙ１リゾチーム（Ｂ）のタンパク質結晶を示す図である。
【図１４】リゾチーム結晶（Ａ）及びリボヌクレアーゼ−１結晶（Ｂ）の回折像を示す図である。
【図１５】プロスタグランジン結晶（Ａ）及びタンパク質結晶を含まない重合ＩＥＦバッファーからなる結晶化リアクター（Ｂ）の回折像を示す図である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子、好ましくはタンパク質の溶液からの生体分子結晶の急速な形成を促進するための方法及び装置であって、タンパク質の溶液が電場中のその等電点に従って急速に濃縮される方法及び装置に関する。本発明の方法によるタンパク質の結晶化は、数時間以内に起こる。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質結晶化には、３つの主な適用例、即ち（１）構造生物学及び薬剤設計、（２）生物分離、及び（３）精製がある。結晶形成は、典型的には最適条件での核形成後の飽和タンパク質溶液の調製に基づく、緩慢で冗長なプロセスである。タンパク質結晶化に関する最適条件には、特に飽和溶液中の最適なタンパク質濃度、ｐＨ及び温度があり、一方これらの条件は大規模な試行錯誤の実験によって決定される。
【０００３】
従来のタンパク質結晶化法、及びタンパク質結晶化を容易にする条件を決定するための方法は、特に米国特許第６，５９６，０７７号、米国特許第６，５９３，１１８号、米国特許第６，５７９，３５８号、米国特許第６，５００，９３３号、米国特許第６，４０９，８３２号、米国特許第６，２６８，１５８号、米国特許第５，９７６，３２５号、米国特許第５，７２８，５５９号、米国特許第５，２７１，７９５号、米国特許第５，１０４，４７８号、米国特許第４，７３７，２３２号及び米国特許第４，３３０，３６３号中に開示されている。
【０００４】
シリカヒドロゲル、アガロース及びポリアクリルアミドなどのゲル中での生体分子、特にタンパク質の結晶化は当分野で知られている（例えば、ＣｒｙｓｔａｌＥｘ（商標）、Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｒｐ．）。液体溶液からの成長と比較して浮力、対流及び沈降を考慮する必要がないので、この方法は有利であると考えられる。この方法はさらに、ゲルの粘性によって分子拡散を制御し、したがって多くの点で宇宙のような微重力環境中の結晶成長の有益な性質を模倣する。この方法の他の利点は、結晶は周囲温度ではゲル中において被包状態に保たれること、形状をＸ線回折に直接施すことさえも可能であることである。この方法は基本的に、重合前又は重合後、数日間から数週間の制御温度でのゲル中への保存後、ゲルに１０〜２０ｍｇ／ｍｌの濃度でタンパク質溶液を、タンパク質の結晶化が起こるまで加えることを含む。この方法を使用して、適切な結晶が得られたことが示されたが（Ｓａｕｔｅｒら、「タンパク質；構造、機能及び遺伝的性質（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）」４８：１４６〜１５０、２００２）、しかしながら、この方法はタンパク質結晶の成長に関してはほとんど使用されず、当分野で知られている他の方法と同程度に緩慢である。
【０００５】
等電点電気泳動（ＩＥＦ）技術は、ｐＨと共に変わるタンパク質の特徴的な純電荷に基づく、タンパク質の分離及び精製用に広く使用されている。タンパク質は、それぞれのタンパク質がその純電荷がゼロである勾配内の地点に移動するｐＨ勾配のある電場に施し、この地点は「等電点」又は「ｐＩ」と呼ばれる。
【０００６】
タンパク質の分離及び精製用のＩＥＦ技術は、特に本発明の本発明者によるＷＯ０３／００８９７７、米国特許第６，５３７，４３２号、米国特許第５，４８０，５６２号、米国特許第５，４６４，５１７号、米国特許第５，４５１，６６２号、米国特許第５，０８２，５４８号、米国特許第４，９７１，６７０号、米国特許第４，４９５，２７９号、及び米国特許第４，２４３，５０７号中に記載されている。
【０００７】
結晶の成長が遭遇する障害を克服するため、及び結晶化、特にタンパク質の結晶化を可能にするためのさらに迅速で消耗の少ない手段を提供するための、対処されていない必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生体分子の濃縮溶液を得て次いで前記生体分子を急速に結晶化するための等電点電気泳動を使用して、典型的にはわずか数時間以内に、生体分子を急速に結晶化するための方法及び装置に関する。
【０００９】
本発明は、任意のＩＥＦ手順を使用することにより希釈タンパク質溶液を濃縮することによって、溶液内のタンパク質の急速な結晶化を容易にするタンパク質溶液が生成するという、予期せぬ発見に部分的に基づいている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
一態様によれば、本発明は生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生体分子種と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得るステップと
を含む上記方法を提供する。
【００１１】
他の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、少なくとも１つの結晶化リアクター及び少なくとも１つの生体分子種をランニングバッファー中に置くステップをさらに含む。ステップ（ｃ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含むことが好ましい。ステップ（ｅ）は、生体分子結晶の形成を監視するステップをさらに含むことが有利である。
【００１２】
さらに他の実施形態によれば、結晶化は２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に起こる。
【００１３】
他の実施形態によれば、少なくとも１つの生体分子種は、溶液、ゲル及び懸濁液からなる群から選択される媒体中に与えられる。
【００１４】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの生体分子種は固体支持体上に固定される。
【００１５】
本明細書で使用する用語「結晶化リアクター」又は「リアクター」は、一定のｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む所定の体積、密度、及び粘度の任意の媒体を指す。いくつかの実施形態によれば、ＩＥＦバッファーは少なくとも１つのポリマーをさらに含み、生成する結晶化リアクターは所定の多孔度を有する。密度、粘度、孔の大きさ（ＩＥＦバッファーがポリマーを含む場合）及び結晶化リアクターの体積は、所望の生体分子がリアクターに入ることができ、さらにその中で拡散することができるように設計する。結晶化リアクターの体積は、使用される所望の生体分子の量に依存する。その体積内では、結晶化が起こる。本発明の結晶化リアクターは、電場の影響下で機能的に安定していることが好ましい。
【００１６】
本明細書で使用する「ＩＥＦバッファー」は、その広い意味で使用して、所与のｐＨ値付近でバッファー能力を有し、本明細書で以後バッファー剤とも呼ぶ成分を含むバッファーを表す。或いはバッファーは、両性電解質、アンフォリン、アクリルアミド誘導体又はバッファー剤の組合せだけには限られないがこれらを含めた、組織化してｐＨ勾配を形成する成分を含むことができる。本発明のＩＥＦバッファーは典型的には結晶化リアクターの成分であり、粘性液体、スラリー又はゲルの形である。本発明によれば、生体分子のｐＩがＩＥＦバッファーのｐＨ範囲内にない限り、生体分子はＩＥＦバッファーを通過することができる。本発明のＩＥＦバッファーは、電場の影響下で機能的に安定していることが好ましい。
【００１７】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの生体分子種は、化学成分を含むタンパク質複合体、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される。好ましい実施形態によれば、生体分子種はタンパク質である。生体分子はタンパク質、ペプチド又はポリペプチドから選択されることが好ましい。
【００１８】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはキャピラリー内に与える。さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターは固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。
【００１９】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーを含み、ポリマーは直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、１つ又は複数の物質を含む。さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）で使用する物質はポリマーを含む。
【００２０】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーをさらに含み、ポリマーは分岐ポリマー、直鎖ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、グリコールポリマー、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される少なくとも１つの物質を含む。
【００２１】
さらに他の実施形態によれば、ＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えない狭いｐＨ範囲を有する。
【００２２】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持する。
【００２３】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場強度は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間に維持する。
【００２４】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｄ）は電場を与えることができるデバイスの存在下で行い、電場はＤＣ又はＡＣとして供給する。
【００２５】
ある実施形態によれば、デバイスは陰極、陽極及び電圧電源供給装置を含む。一実施形態によれば、電場がリアクター中又はリアクター内を通過するように、結晶化リアクターの反対側に電極を置く。他の実施形態によれば、電極はワイヤーである。さらに他の実施形態によれば、電極はワイヤー又は薄プレートの平行組である。さらに他の実施形態によれば、電極は白金、チタン、クロム、金、タンタル、パラジウム、酸化パラジウム、ゲルマニウム、ニッケル及びロジウム又はこれらを含む合金からなる群から選択される物質でできているか、或いはこれらでコーティングされている。電極はパラジウム、白金、チタン、炭素又はこれらを含む合金でできているか、或いはこれらでコーティングされていることが好ましい。
【００２６】
デバイスが働いて、生体分子を結晶化リアクター内に向ける。したがって、さらに他の実施形態によれば、電場は交流電場又は直流電場から選択される。結晶化リアクターが密閉系内に含まれる場合、（例えば、電場がリアクターの片側、リアクターの反対側の外を通過することができない）、したがって、デバイスは電場を、バッファーを含む結晶化リアクターの内側及び外側に向けることができることが有利である（即ち、交流電場）。
【００２７】
他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターは、任意の望ましい形状及び幾何形を有することができる。
【００２８】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターは円筒形を有する。いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つの結晶化リアクターの直径は約２０μｍ〜約１０ｍｍである。いくつかの他の実施形態によれば、前記少なくとも１つの結晶化リアクターの長さは約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍである。
【００２９】
様々な実施形態によれば、本発明の方法のステップ（ａ）は、複数の結晶化リアクター中で互いに同じであるか或いは異なるＩＥＦバッファーをそれぞれの結晶化リアクターが含む、複数の結晶化リアクターを提供することを含む。好ましい実施形態によれば、結晶化リアクターは互いに離れている。ある実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、それぞれの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得ることを含む。他の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、複数の結晶化リアクター内で複数の結晶を得ることを含む。
【００３０】
一実施形態によれば、それぞれのＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えない狭いｐＨ範囲を有する。他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は重複しない。或いは、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は部分的に重複する。本明細書で使用する用語「部分的に重複する」は、その最も一般的な意味で解釈され、例えば１つのｐＨ範囲の上限が少なくとも１つの他のｐＨ範囲の下限と重複する複数のｐＨ範囲を指す。或いはこの用語は、１つのｐＨ範囲が少なくとも１つの他のｐＨ範囲より広く、したがって広い方のｐＨ範囲が１つの他のｐＨ範囲を完全に含む、複数のｐＨ範囲を指すことができる。
【００３１】
さらに他の実施形態によれば、１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップは０．１ｐＨ単位を超えず、好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えない。用語「ｐＨステップ」は、異なる又は部分的に異なるｐＨ範囲を有する２つの異なるＩＥＦバッファー間のｐＨ値の増分差を指す。ｐＨステップは、１つのｐＨ範囲の上限と他のｐＨ範囲の下限の間の差を指すことができる。或いはｐＨステップは、１つのｐＨ範囲の中央ｐＨ値と他のｐＨ範囲の中央ｐＨ値の間の差を指すことができる。
【００３２】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。他の実施形態によれば、結晶化リアクターを空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。さらに他の実施形態によれば、支持体は生体分子不透過性である。さらに他の実施形態によれば、支持体はイオン不透過性である。
【００３３】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターを含む支持体は固定化ｐＨ勾配、ｐＨ膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態であってよい。
【００３４】
他の態様によれば本発明は、複数の生体分子を含む溶液を選別し、そこから選択した少なくとも１つの生体分子種を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）複数の生体分子を含む媒体を提供するステップと、
（ｂ）支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも１つの生体分子種を含む支持体上に少なくとも１つの位置を得るステップと、
（ｃ）少なくとも１つの位置を含む部分を前記支持体から回収するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｅ）（ｃ）の部分と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｆ）少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に、前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｇ）前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの生体分子結晶を得るステップと
を含む上記方法を提供する。
【００３５】
他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）は支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも１つの位置、１つの生体分子種を含む位置を支持体上に得ることを含む。
【００３６】
一実施形態によれば、ステップ（ｂ）中の選別は、少なくとも１つの生体分子種の質量によるものである。他の実施形態によれば、等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を含めた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、及びゲル電気泳動からなる群から選択される方法によってステップ（ｂ）を行う。これらの方法のいずれか１つは、非変性条件下で行うことが好ましい。
【００３７】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は前記部分及び前記少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む。ステップ（ｅ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含むことが好ましい。ステップ（ｇ）は、生体分子結晶の形成を監視する及び／又は検出するステップをさらに含むことが有利である。
【００３８】
さらに他の実施形態によれば、結晶を２４時間以内、好ましくは１２時間以内に得る。
【００３９】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｄ）のＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する。
【００４０】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持する。さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である。さらに他の実施形態によれば、電場はＤＣ又はＡＣとして供給する。
【００４１】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）中で使用する支持体はゲルである。他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）中で使用する支持体は、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、ニトロセルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む。さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）中で使用する支持体はポリマーを含み、ステップ（ｆ）は、
少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクターにおいて、前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮バンドを生成させることを含む。
【００４２】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は自動化されており、生体分子、好ましくはタンパク質の高スループットの結晶化に適している。
【００４３】
本発明の方法は、それが典型的には１時間未満以内に急速なタンパク質結晶化を助長する点において、タンパク質結晶化のための当分野で知られている方法より有利である。さらに本発明の方法は大きな結晶を得ることができ、したがって十分大きな結晶を必要とする適用例、例えば高品質のＸ線回折データの回収に適している。
【００４４】
本発明の方法による急速な結晶化は、固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、ｐＨ膜、及び所望のｐＨ範囲を有するゲル中の両性電解質の任意の組成物などの、当分野で知られている多くのＩＥＦ系を使用して実施することができる。ただし、ＩＥＦ系は本発明の原理に適合しているか、或いは適合するように改変されているものとする。好ましくは、本発明のＩＥＦ系は、結晶化リアクターとも呼ばれる複数の異なる物体を含み、それぞれの結晶化リアクターはあるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを有する。場合によっては、結晶化リアクターは互いに離れており、したがって複数の離れたｐＨ範囲、場合によっては狭いｐＨ範囲の系を確立する。複数の離れた結晶化リアクターによって広がるｐＨ範囲は、重複するか或いは重複しない可能性がある。
【００４５】
本発明の方法の他の特定の利点は、十分に精製されていないタンパク質溶液から、タンパク質結晶を得ることができることである。何故なら本発明の方法は、タンパク質分離及び不純物からの分離を対象とする等電点電気泳動を含むからである。
【００４６】
他の態様によれば本発明は、生体分子、好ましくはタンパク質の結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
（ａ）上側及び下側を有するバッファー室であって、バッファー室が流体を保持することができる少なくとも１つのバッファー区画を囲うように下側が底部で封じられているバッファー室と、
（ｂ）少なくとも１つの結晶化リアクターであって、この少なくとも１つの結晶化リアクターはＩＥＦバッファーを含み、この少なくとも１つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも１つの結晶化リアクターと、
（ｃ）電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
（ｄ）バッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置を提供する。
【００４７】
一実施形態によれば、装置は上側及び下側を有するホルダーをさらに含み、このホルダーは少なくとも１つの結晶化リアクターを含み、或いは少なくとも１つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合されており、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、このホルダーはバッファー室内に含まれている。他の実施形態によれば、少なくとも１つのバッファー区画内にホルダーを配備する。ある実施形態によればホルダーは、少なくとも１つの結晶化リアクターを含むキャピラリーである。
【００４８】
他の実施形態によれば、装置は２つの端部を有する２つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の１つの端部はホルダーの１つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の１つの端部は少なくとも１つのバッファー室内に含まれている。装置は、それぞれのバッファー室が１つの塩橋の１つの端部を囲うようなそれぞれのバッファー室である、２つのバッファー室を含むことが好ましい。
【００４９】
好ましい実施形態によれば、装置は少なくとも１つの結晶化リアクターにおいて温度を管理することができる温度制御モジュールをさらに含む。
【００５０】
他の実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つの空洞を含み、この少なくとも１つの空洞はＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターを含む。
【００５１】
さらに他の実施形態によれば、それぞれの空洞を結晶化リアクターを含むように適合させた複数の空洞を、ホルダーは有する。いくつかの実施形態によれば、１つの結晶化リアクターの温度は他の結晶化リアクターの温度と異なる。
【００５２】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの耐性より大きな耐性を有する物質を含む。
【００５３】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは非導電性物質を含む。非導電性物質は、ポリ−Ｎ−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレン、セラミック、ガラス及びポリ−メチル−メタクリレートからなる群から選択することができる。
【００５４】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは生体分子に対して不透過性である物質を含み、１つの空洞内の結晶化リアクターから任意の他の空洞内の結晶化リアクターへのタンパク質の拡散を回避する。
【００５５】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーをさらに含み、ポリマーは、分岐ポリマー、直鎖ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、グリコールポリマー、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、少なくとも１つの物質を含む。
【００５６】
さらに他の実施形態によれば、バッファー室は非導電性物質を含む。
【００５７】
さらに他の実施形態によれば、本発明の装置を、少なくとも１つの結晶化リアクター内での結晶の形成を顕微鏡下で監視するために適合させる。
【００５８】
他の実施形態によれば、バッファー区画は、ランニングバッファー及びランニングバッファー中に溶けた少なくとも１つの生体分子を含む溶液を保持するように適合させる。
【００５９】
一実施形態によれば本発明は、高スループットで急速なマクロ分子の結晶化のための、小型化及び自動化された装置並びに方法を提供する。本発明の装置は、自動式相互作用成分、例えばＩＥＦバッファー（イモビリン、両性電解質など）を含む前重合結晶化リアクターを空洞に充填するための滴定装置、空洞又は結晶化リアクターからタンパク質結晶を回収するための抽出装置、及び結晶化リアクター内のタンパク質結晶の形成を調べて記録するためのデバイスを有すると解釈することができる。
【００６０】
本発明のこれらの目的及び他の目的、特徴並びに利点は、以下の詳細な説明及び添付の特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６１】
本発明は、タンパク質溶液からのタンパク質結晶の急速な生成を誘導するための方法及び装置を提供する。本発明の方法は等電点電気泳動、及びしたがって典型的には１５時間の間以内の急速なタンパク質の結晶化を容易にする、濃縮タンパク質溶液又はバンドの形成を含む。
【００６２】
タンパク質結晶を成長させるために使用されている現在の方法はいずれも、結晶の形成をもたらすと思われる最適条件のために、冗長な「試行錯誤の」実験及び調査を利用するものである。タンパク質の結晶化に影響を与える様々な要因の総説は、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１１４、ｐｐ．１１２〜２０（１９８５）によって公開されている。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ及びＧｉｌｌｉｌａｎｄ、Ｊ．「結晶の成長（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｇｒｏｗｔｈ）」、９０、ｐｐ．５１〜５９（１９８８）は、結晶化されたタンパク質及び核酸、並びにそれらが結晶化された条件のリストを編集した。結晶及び結晶化法、並びに解明されたタンパク質及び核酸構造の配位のまとめの概要は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋによって保持されている［ｈｔｔｐ／／ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｂｎｌ．ｇｏｖ；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１１２、ｐｐ．５３５〜４２（１９７７）］。これらの参照を使用して、適切なタンパク質結晶を形成するための前置きとしてタンパク質の結晶化に必要な条件を決定することができ、他のタンパク質用の結晶化戦略を手助けすることができる。或いは、優れた試行錯誤式の検索戦略は大抵の場合、タンパク質に関する許容可能なレベルの純度を得ることができるという条件で、多くのタンパク質に関する適切な結晶化条件を生み出すことができる［例えば、Ｃ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊｒ．及びＣ．Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５４、ｐｐ．１２２１９〜２３（１９７９）を参照のこと］。
【００６３】
一般に結晶は、結晶化するタンパク質と適切な水性溶媒又は塩などの適切な結晶化剤を含む水性溶媒、又は有機溶媒を組み合わせることによって生成される。溶媒はタンパク質と組み合わせ、結晶化を誘導するのに適しておりタンパク質の活性及び安定性を維持するのに認め得ると実験によって決定した温度において攪拌を施すことができる。溶媒は２価カチオンなどの共溶質、共因子又はカオトロープ剤、並びにｐＨを調節するためのバッファー種を場合によっては含むことができる。共溶質及びそれらの濃度に関する必要性を実験によって決定して、結晶化を容易にする。
【００６４】
産業規模のプロセスでは、結晶化をもたらす調節型の沈殿を、バッチプロセスにおけるタンパク質、沈殿剤、共溶質、及び場合によってはバッファーの単純な組合せによって最適に行うことができる。他のオプションとして、出発物質としてタンパク質沈殿剤を使用することによって、タンパク質を結晶化することができる。この場合、タンパク質沈殿剤を結晶化溶液に加え、結晶が形成されるまでインキュベートする。他の研究室での結晶化法、透析又は蒸気拡散法なども採用することができる。ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ同書及びＧｉｌｌｉｌａｎｄ同書は、結晶化の文献のその総説中に適切な条件の包括的なリストを含む。
【００６５】
明確な等電点を有する任意のタンパク質を使用して、本発明の教示に従いタンパク質結晶を調製することができる。しかしながら、結晶化に関する条件、ＩＥＰバッファーの含量、密度、粘性、及び他の特徴など、並びに結晶化リアクターにおける温度、特に設定パラメータを最適化して、望ましい質の結晶を生成することができることを記さなければならない。したがって、これらの特徴及び条件をある程度調節することは、本発明の方法及び装置を使用して結晶を与えるために必要な可能性があることは、当業者により理解されるであろう。
【００６６】
用語「タンパク質結晶」又は「結晶」を本明細書において交互に使用して、結晶格子に配列したタンパク質分子を記載する。タンパク質結晶は、３次元構造中で周期的に繰り返されるある型の特異的なタンパク質−タンパク質結合を含む。本発明のタンパク質結晶は、タンパク質溶液の凍結乾燥によって得られるものなどの、無定形の固体形タンパク質又はタンパク質の沈殿は含まない。結晶は格子構造、独特な形状、並びに屈折率及び複屈折などの光学的性質を含めた独特な特徴を示す。結晶は、３次元構造中で周期的に繰り返される型で配列した原子からなる。対照的に無定形物質は、ときどき無定形沈殿と呼ばれる非結晶性の固体形の物質である。このような沈殿は結晶固体状態に独特な分子の格子構造を有しておらず、結晶形の物質に典型的な複屈折及び他の分光性を示さない。
【００６７】
用語「濃縮タンパク質溶液」又は「濃縮溶液」を本明細書において交互に使用して、タンパク質の濃度が飽和、又はさらに過飽和から約５０％飽和と等しい濃度の範囲である、少なくとも１つのタンパク質を含む媒体を記載する。ＩＥＦバッファーが重合される場合、タンパク質は濃縮によってバンドを形成し、したがって「濃縮タンパク質バンド」又は「濃縮バンド」の用語を使用する。
【００６８】
典型的には、本発明のタンパク質結晶化は、ランニングバッファー中においてタンパク質溶液を用いて開始することができ、そのタンパク質溶液は知られている等電点（ｐＩ）を有する少なくとも１つのタンパク質を含む。タンパク質溶液は希釈溶液であってよい。タンパク質溶液に電場を導入すると、タンパク質のｐＩと重複するｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクター中にタンパク質が誘導される。したがって、それぞれのタンパク質分子は、前記リアクターの体積中に誘導されるとその電荷を放出し、電場中での動きが止まり、結晶化リアクター中に非電荷タンパク質の濃縮溶液又はバンドが生成する。最初に希釈した溶液からの、タンパク質の電気泳動による蓄積及び濃縮のプロセスは非常に早く効率的であり、典型的には約数分間、或いはさらに数十分間のタイムスパン内で起こる。蓄積するタンパク質分子は、拡散によって結晶化リアクター内で広がり、その中での急速な結晶核形成及び成長をもたらす。
【００６９】
「等電点電気泳動」又は「ＩＥＦ」は、ＩＥＦ法に曝される分子、典型的にはタンパク質の純電荷に基づく一般的な分離技術である。タンパク質の純電荷は、そのアミノ酸含量から測定する。典型的なタンパク質で見られる２０個のアミノ酸のうち、４個（アスパラギン酸及びグルタミン酸、システイン及びチロシン）は負電荷を有しており、３個（リシン、アルギニン及びヒスチジン）はあるｐＨ範囲で正電荷を有する。アミノ酸のその特異的配列によって定義される特異的タンパク質は、その長さ部分に沿っていくつかの帯電した基をしたがって取り込む可能性がある。電荷及びｐＨに関する滴定曲線に従い問題のアミノ酸のｐＫに従うと、それぞれのアミノ酸によって貢献される電荷の程度は周辺溶液の優勢ｐＨによって支配され、最小値０から最大値１の電荷まで変わる可能性がある（アミノ酸に依存して陽性又は陰性）。すべてのアミノ酸が露出される変性条件下では、タンパク質分子の合計電荷は、いずれも優勢な溶液ｐＨにおける、その成分であるアミノ酸の電荷の合計によって大まかに与えられる。
【００７０】
ＩＥＦは、それらの等電点によってタンパク質を分離するための、広く使用されている電気泳動法である。ＩＥＦは、典型的にはゲル内で所望のＩＥＦバッファーによって確定されるｐＨ勾配による、帯電したタンパク質の移動に関するものであり、タンパク質の移動は電場から派生するか或いは電場によって誘導される。特定のｐＩを有するタンパク質はその電荷を失い、そのタンパク質のｐＩと等しいｐＨを有するｐＨ勾配ゲル中の位置に達すると、したがってゲル内での移動を止める。この位置でタンパク質は蓄積する。ＩＥＦの利点は、それぞれが特定のｐＩを有する複数のタンパク質を、溶液中のタンパク質混合物に直接由来する別個のバンド中で分析することができることである。古典的ＩＥＦ法の最終的な結果は、それぞれのｐＨバンドが特定のｐＩを有する特定のタンパク質に載せられている、複数のｐＨバンドである。異なる比率の帯電アミノ酸を有する２つのタンパク質は、あるｐＨでのそれらの異なる純電荷によって分離することができる。印加する電場の影響下では、より強く帯電したタンパク質が、同じ大きさ及び形状のあまり帯電していないタンパク質より速く移動するであろう。非対流媒体（典型的にはポリアクリルアミドなどのゲル）を介してサンプルゾーンからタンパク質を移動させる場合、電気泳動による分離が生じるであろう。印加する電場の下での移動の過程で、そのｐＨがタンパク質の純電荷がゼロである値を有する領域（等電点ｐＨ）にタンパク質が入る場合、タンパク質はその媒体に対して移動するのを止めるであろう。さらに、単調なｐＨ勾配を介して移動が起こる場合、タンパク質はこの等電点ｐＨ値に「集まる」であろう。タンパク質がさらに酸性のｐＨ値に移動する場合、タンパク質はさらに正に帯電し、正確に方向付けされた電場は等電点にタンパク質を押し戻すであろう。同様に、タンパク質がさらに塩基性のｐＨ値に移動する場合、タンパク質はさらに負に帯電し、同じ電場が等電点にタンパク質を押し戻すであろう。等電点電気泳動と呼ばれるこの分離法は、各配列中の数百個の中のわずか１個の帯電したアミノ酸が異なる２つのタンパク質を解明することができる。
【００７１】
等電点電気泳動の手順に関する重要な要件は、適切な空間的ｐＨ勾配の形成である。これは帯電分子（両性電解質）の異種混合物を最初は均質な分離媒体に封入することによって動的に、或いは空間的勾配の滴定基を、その中で移動が起こるゲルマトリクスに取り込ませることによって静的に実施することができる。前者は古典的な両性電解質系の等電点電気泳動であり、後者はさらに最近開発された固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）等電点電気泳動技術である。ＩＰＧ手法はｐＨ勾配がゲル中で固定されるという利点を有し、一方で両性電解質系の手法は、両性電解質分子が印加した電場中を移動するので位置移動の影響を受けやすい。最良の現在の方法は２つの手法を組み合わせて、ｐＨ勾配が空間的に固定されているが、少量の両性電解質が存在してタンパク質のＩＰＧの帯電したゲルマトリクス上への吸着を低下させる系を与える。
【００７２】
所望のｐＨ勾配ＩＰＧゲルを形成するのに必要な組成勾配は、塩基性ｐＨを生み出すために配合した重ゲルモノマー組成物、酸性ｐＨを生み出すために配合した軽ゲルモノマー組成物、過硫酸アンモニウムなどの重合開始剤、及びテトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）などの重合触媒から一般に生成される。グリセロール及び酸化ジューテリウム（重水）を使用して、溶液の密度を増大させることができ、したがって生じる密度勾配と地球の重力の相互作用によって、モールド中で形成される勾配の安定化を手助けすることができる。いくつかの参照文献は、重合可能なモノマーの勾配を生み出すための自動式デバイスを記載している。このようなシステムは、タンパク質の分子量による分離において使用する多孔質勾配ゲルを作製するために使用されてきている。Ａｌｔｌａｎｄら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３０（１２Ｐｔ１）：２０９８〜２１０３、１９８４）は、ＩＰＧゲルの作製において使用する滴定モノマーの勾配を生み出すための、このようなシステムの使用を示している。米国特許第４，１６９，０３６号は、電気泳動分離用のスラブ−ゲルホルダーを装着させるためのシステムを記載している。勾配ゲルを生成するための自動装置の開示は、特に米国特許第４，５９４，０６４号、米国特許第６，５５４，９９１号中に開示されている。
【００７３】
本発明による急速な結晶化は、本発明の実施を可能にするための適切な物理的条件を必要とする。本発明の方法及び装置内のいくつかの要因が、結晶化の動態に影響を与える。
【００７４】
最初に、所望のタンパク質が適切な結晶化リアクターに接近することを確実にするために、ランニングバッファー中の分子の動態を速めて、任意の分子が結晶化リアクターと衝突する確率を高めることが有利である。
【００７５】
ランニングバッファー中のタンパク質の移動は、本発明の方法によって導入する電場によって生じる対流熱の結果として増大することが有利である。タンパク質のこの増大した動態は、任意のタンパク質がランニングバッファー中に浸された結晶化リアクターと衝突し、さらにその中で捕捉される確率を高めると企図される。
【００７６】
一実施形態によれば、ランニングバッファー中のタンパク質の速度は、ランニングバッファーを循環させるデバイスによって加速させる。循環は典型的には、攪拌バー、ポンプ、バイブレータ、例えば圧力バイブレータ、攪拌装置、傾斜型デバイス、又は当分野で知られている任意の攪拌デバイス及び技術を使用して実施することができる。他の実施形態では、循環用のデバイスは、ランニングバッファーに対してＩＥＦバッファー又は結晶化リアクターを動かすための機構であってよい。例えば、ＩＥＦバッファー又は結晶化リアクターをランニングバッファー中で回転させることができる。
【００７７】
或いは、本発明の方法はこのような循環デバイスを欠く。本発明の他の実施形態では、等電点電気泳動中に自然に生じる対流電流によってのみ循環を与える。
【００７８】
他の実施形態によれば、生体分子を循環させるのに十分な対流エネルギーの量は、ランニングバッファー１ｃｍ３当たり１０−１０ジュールである。
【００７９】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は、ＷＯ０３／００８９７７中に開示された原理に従う迅速なＩＥＦ手順を使用することを含む。
【００８０】
第２に、適切な結晶化リアクターと接触する所望のタンパク質が前記リアクターと衝突し、濃縮タンパク質溶液又は濃縮タンパク質バンドを形成することを確実にすること。典型的には、濃縮タンパク質溶液／バンドは結晶化リアクター内、結晶化リアクターと外部環境の間の界面の近辺で生じ、次いでタンパク質は結晶化リアクター内に入り拡散し、タンパク質結晶を最終的に形成する。
【００８１】
結晶化リアクターの粘性及び体積は、所望のタンパク質がリアクターに入りその中で拡散することができ、そのリアクター内でさらに結晶化することができるように設計する。結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーがゲルの形である場合、したがってそのゲルの多孔度をさらに調節して所望の結晶を得る。ゲル中のタンパク質に関する典型的な拡散定数は、タンパク質分布が約０．１ｍｍの距離に広がる拡散時間が約１０００秒（２０分まで）であるような拡散定数である。したがって、比較可能な寸法を有する結晶の結晶成長に関する予想時間はこの程度である。
【００８２】
結晶化の効率に影響を与える他の重要なパラメータは、結晶化リアクターにおけるｐＨである。生体分子のｐＩ値よりわずかに上又は下に結晶化リアクターのｐＨ値を変化させることによって、生体分子をリアクターに入った後にわずかな電荷を有する、したがって結晶化リアクター内で他の形式の動きをする状態にする。
【００８３】
さらに、結晶化リアクターの構造は他の適用例のための結晶の単離、又は／及び結晶化リアクター内の結晶のＸ線回折データの回収に適したものでなければならない。
【００８４】
結晶化リアクターの構築において、固定液体膜を使用することができる。特に、固定液体膜は本発明の結晶化リアクターに対する外被として使用することができ、所望の生体分子に対する選択的透過性の境界をリアクターに与える。固定液体膜は、典型的には微孔質固体内に封じられる。多孔質膜を作製するための最も広く使用されている簡単な方法の１つはＧｅｌｇａｒｄ（商標）法であり、その方法中では半晶質のフィルム又は繊維を溶融物から押し出しする。ポリプロピレンのような固体状ポリマーを伸長させることによって、多孔性が誘導される。０．０４μｍまでの孔の大きさ、並びに１００〜１５００μｍのＩＤ及び２５μｍの壁の厚さを有する中空繊維が利用可能であり、例えば血中酸素供給器において使用される。このような固定液体膜は、エチルアルコール、エチレングリコール、及びイソプロピルアルコールと一般に適合性がある。広く使用されている多孔質膜の他の例は、Ｇｏｒｅ−Ｔｅｘ（商標）、微孔質ポリ（テトラフルオロエチレン）であり、これは伸長法によっても製造され、化学的に不活性であり、疎水性合成ポリマー膜である。
【００８５】
結晶化リアクターの寸法は使用する所望のタンパク質の量、及び使用するシステム及び／又は装置の型に依存する。結晶化リアクターの容量は、（１）リアクター内、典型的にはリアクターと外部環境の間の界面の近辺の濃縮生体分子溶液／バンドの形成を容易にする、且つ（２）その中での生体分子の拡散を可能にし、したがって前記生体分子の結晶化を可能にするように設計することもできる。
【００８６】
第３に本発明の方法は、結晶化リアクター当たりに１つのタンパク質種のみが存在することを必要とする。何故なら、無関係なタンパク質又は他の不純物の存在が、所望の結晶化プロセスに干渉するからである。１つのタンパク質種のみが結晶化リアクターに入ることを確実にするために、ＩＥＦバッファーによって結晶化リアクター中に広がるｐＨ範囲はその１つのタンパク質種のｐＩを含む。しかしながら本発明の方法は、前記種が精製されていない場合でさえも、任意の所望のタンパク質種の結晶化を容易にする。非精製タンパク質の溶液を与える場合、少なくとも１つの結晶化リアクターが、ＩＥＦバッファーによって結晶化リアクター中に広がるｐＨ範囲が十分狭く、好ましくは非常に狭く、したがって不純物の結晶化を避ける、所望のタンパク質種のｐＩを含むＩＥＦバッファーを含むことが必要とされる。
【００８７】
したがって、ある実施形態によれば、それぞれの結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーは、極端に狭いｐＨ範囲、例えば５．５０〜５．６０（０．１ｐＨ単位以下の差）、又は非常に狭いｐＨ範囲、例えば５．５２〜５．５４（０．０２ｐＨ単位以下の差）を有する。本発明のＩＥＦバッファーは一定のｐＨ値に調節された一種のバッファー剤であり得るので、このことは可能である。この場合、ＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は、バッファー剤が調節されたｐＨ値周辺のバッファー剤のバッファー能力と等しい。本発明に従い使用することができるＩＥＦバッファーの一例は、トリスグリシン（ｐＨ８．２０＋／−０．０５、Ｂｉｏｒａｄ、カタログ番号１６１〜０７７１）である。
【００８８】
用語「ｐＨ範囲」はＩＥＦバッファー中の最高のｐＨ値から最低のｐＨ値まで（例えば、ｐＨ７．９〜ｐＨ８．９）、或いはＩＥＦバッファー中の最高のｐＨ値と最低のｐＨ値の間の差を指す（例えば、１．０ｐＨ単位）。
【００８９】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は重複しない。さらに他の実施形態によれば、１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップは０．１ｐＨ単位を超えず、０．０２ｐＨ単位を超えないことが好ましい。
【００９０】
用語「ステップ」又は「ｐＨステップ」を本明細書において交互に使用して、異なるか或いは部分的に異なるｐＨ範囲を有する２つの異なるＩＥＦバッファー間の、ｐＨ値の増分差を記載する。例えば、結晶化リアクター＃１と結晶化リアクター＃２の間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位である場合、結晶化リアクター＃１はｐＨ６．８で始まりｐＨ７．８で終わるｐＨ勾配を有する可能性があり、結晶化リアクター＃２はｐＨ７．９で始まりｐＨ８．９で終わるｐＨ勾配を有する可能性がある（即ち、結晶化リアクター＃１の下限、ｐＨ７．９と結晶化リアクター＃２の上限、ｐＨ７．８の間の差、０．１ｐＨ単位のステップに相当）。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、３つ以上の結晶化リアクターの間のｐＨステップは均一である必要はない。
【００９２】
さらに他の実施形態によれば、結晶化リアクター内の間隔は均一である必要はない。用語「間隔」は、ＩＥＦバッファーによって生み出されたｐＨ勾配内のｐＨ値間の増分差を指す。例えば結晶化リアクター内では、リアクター内の全ｐＨ範囲中、間隔はわずか０．０２ｐＨ単位であってよい（例えば、ｐＨ６．８、ｐＨ６．８２、ｐＨ６．８４、ｐＨ６．８６など）。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、結晶化リアクターの間隔は均一である必要はない。
【００９４】
一実施形態によれば、結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は比較的広く、例えば１ｐＨ単位を超え、或いは２ｐＨ単位を超える。他の実施形態によれば、結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は狭く、例えば約１ｐＨ単位以下である。さらに他の実施形態によれば、結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は非常に狭く、例えば約０．２ｐＨ単位以下、或いは約０．０２ｐＨ単位以下である。
【００９５】
一実施形態によれば、ＩＥＦバッファーのｐＨ間隔は０．１ｐＨ単位以下である。他の実施形態によれば、ＩＥＦバッファーのｐＨ間隔は０．０２ｐＨ単位以下である。
【００９６】
本発明の一実施形態によれば、２つ以上のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップは０．０１単位以下である。本発明の他の実施形態によれば、２つ以上のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップは０．０２単位以下である。
【００９７】
一実施形態によれば本発明は、生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩに対応するｐＨを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生体分子種と前記少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｄ）ランニングバッファー中に電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｅ）濃縮溶液中の前記少なくとも１つの生体分子種を、前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で結晶化するステップと
を含む上記方法を提供する。
【００９８】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、少なくとも１つの生体分子種及び前記少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む。さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｃ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む。ステップ（ｅ）は、生体分子結晶の形成を監視すること及び／又は検出するステップをさらに含むことが有利である。
【００９９】
本発明の方法のステップ（ｃ）に従う、少なくとも１つの生体分子種と少なくとも１つの結晶化リアクターの接触は、様々な方法で実施することができる。例えば、溶液中に生体分子を提供する場合、生体分子溶液と少なくとも１つの結晶化リアクターの接触は、一滴又は複数滴の溶液を結晶化リアクターに施すことによって実施することができる。生体分子溶液は、結晶化リアクターに設置、配置又は位置付けして、生体分子と結晶化リアクターの間の接触を得る、膜、マトリクス又は任意の他の吸収性物質上に施すことができる。ゲル断片中に生体分子を提供する場合、そのゲル断片を少なくとも１つの結晶化リアクターと接触させることができる。
【０１００】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法のステップ（ｃ）は、実質的に結合した生体分子及び少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファーの溶液中に置くことを、さらに含むことができる。
【０１０１】
本明細書で使用する用語「生体分子」は、細胞、細胞成分又は生物に対して観察可能な影響を有する、人工又は天然の任意の化合物を指す。この用語はタンパク質、化学成分を含むタンパク質複合体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、ＤＮＡ、ＲＮＡ、酵素、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ポリヌクレオチド、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブに適用する。用語「生体分子」は、「タンパク質」の好ましい実施形態と共に例示されることが多い。
【０１０２】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」を交互に使用して、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。これらの用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工の化学成分類似体であるアミノ酸ポリマー、及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用することもできる。１つ又は複数のアミノ酸残基が「非天然」アミノ酸であり、いずれの天然に存在するアミノ酸にも対応しないアミノ酸ポリマーも、本明細書の用語「タンパク質」、「ペプチド」及び「ポリペプチド」を使用することによって含まれる。
【０１０３】
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ又はＤＮＡ配列のいずれかであってよい、一連の核酸を５’から３’リン酸ジエステル結合中に含むヌクレオチド配列を指す。核酸がＤＮＡである場合、ヌクレオチド配列は一本鎖又は二本鎖のいずれかである。本発明のタンパク質をコードする核酸は、セルロースと高い親和性で結合することができ、このようなタンパク質をコードする核酸配列と相補的であり、或いはこのようなタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下でそれと安定的に結合した状態である、タンパク質をコードするＲＮＡ又はＤＮＡである。
【０１０４】
任意の形のタンパク質を、本発明の方法に従い結晶化することができる。タンパク質は糖タンパク質、リンタンパク質、スルホタンパク質、ヨードタンパク質、メチル化タンパク質、非修飾タンパク質であってよく、或いは他の修飾を含んでよい。このようなタンパク質は、例えば抗体を含めた治療用タンパク質、予防用タンパク質、界面活性剤タンパク質を含めた清浄剤タンパク質、化粧品タンパク質を含めたパーソナルケアタンパク質、獣医学用タンパク質、食品タンパク質、飼料タンパク質、診断用タンパク質及び除染タンパク質であってよい。このようなタンパク質中に含まれるのは、例えばリゾチーム、デヒドロゲナーゼ、ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、リアーゼ、リガーゼ、アデニル酸シクラーゼ、トランスフェラーゼ及びオキシドレダクターゼなどの酵素である。ヒドロラーゼの例には、エラスターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、ニトリラーゼ、アミラーゼ、ペクチナーゼ、ヒダントイナーゼ、アスパラギナーゼ、ウレアーゼ、スブチリスチン、サーモリシン、並びに他のプロテアーゼ及びリゾチームがある。リアーゼの例には、アルドラーゼ及びヒドロキシニトリルリアーゼがある。オキシドレダクターゼの例には、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルタミン酸アルコールデヒドロゲナーゼ、及び他のデヒドロゲナーゼがある。他の酵素にはセルラーゼ及びオキシダーゼがある。
【０１０５】
治療用タンパク質又は予防用タンパク質の例には、ホルモン、例えばインシュリン、グルコゴン様ペプチド１及び副甲状腺ホルモンなど、抗体、阻害剤、成長因子、後中耳ホルモン、神経成長ホルモン、血液凝固因子、接着性分子、骨形態形成タンパク質及びレクチン栄養因子、サイトカイン、例えばＴＧＦ−β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、α−ＩＦＮ、β−ＩＦＮ、γ−ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８、リンホトキシン、ＩＬ−５など、遊走阻止因子、ＧＭＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−３、単球−マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、多剤耐性タンパク質、他のリンホカイン、トキソイド、エリスロポイエチン、第ＶＩＩＩ因子、アミリン、ＴＰＡ、ドルナーゼ−α、α−１−アンチトリプシン、ヒト成長ホルモン、神経成長ホルモン、骨形態形成タンパク質、ウレアーゼ、トキソイド、生殖ホルモン、ＦＳＨ及びＬＳＨがある。
【０１０６】
治療用タンパク質、以下の：白血球マーカー、例えばＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＥ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７及びそのリガンドＣＤ２８、及びそのリガンドＢ７．１、Ｂ７．２、Ｂ７．３、ＣＤ２９及びそのリガンドＣＤ３０、及びそのリガンドＣＤ４０、及びそのリガンドｇｐ３９、ＣＤ４４、ＣＤ４５及びイソ型、Ｃｄｗ５２（Ｃａｍｐａｔｈ抗原）、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＴＬＡ−４、ＬＦＡ−１、及びＴＣＲ組織適合性抗原、例えばＭＨＣクラスＩ又はＩＩ抗原、ルイスＹ抗原、ＳＬｅｘ、ＳＬｅｙ、ＳＬｅａ及びＳＬｅｂなど；インテグリン、例えばＶＬＡ−１、ＶＬＡ−２、ＶＬＡ−３、ＶＬＡ−４、ＶＬＡ−５、ＶＬＡ−６及びＬＦＡ−１など；接着性分子、例えばＭａｃ−１及びｐ１５０、９５など；セレクチン、例えばＬ−セレクチン、Ｐ−セレクチン及びＥ−セレクチン及びそれらの抗受容体ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２及びＬＦＡ−３など；インターロイキン、例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４及びＩＬ−１５など；インターロイキン受容体、例えばＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４Ｒ、ＩＬ−５Ｒ、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−７Ｒ、ＩＬ−８Ｒ、ＩＬ−１０Ｒ、ＩＬ−１１Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−１４Ｒ及びＩＬ−１５Ｒなど；ケモカイン、例えばＰＦ４、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ１α、ＭＣＰ１、ＮＡＰ−２、Ｇｒｏα、Ｇｒｏβ及びＩＬ−８など；成長因子、例えばＴＮＦα、ＴＧＦβ、ＴＳＨ、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＰＴＨｒＰ、ＥＧＦファミリー、ＥＧＦ、ＰＤＧＦファミリー、エンドセリン及びガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）など；成長因子受容体、例えばＴＮＦαＲ、ＲＧＦβＲ、ＴＳＨＲ、ＶＥＧＦＲ／ＶＰＦＲ、ＦＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＴＨｒＰＲ、ＰＤＧＦＲファミリー、ＥＰＯ−Ｒなど；ＧＣＳＦ−Ｒ及び他の造血因子受容体；インターフェロン受容体、例えばＩＦＮαＲ、ＩＦＮβＲ及びＩＦＮγＲなど；免疫グロブリン及びそれらの受容体、例えばＩｇＥ、ＦｃｅＲＩ及びＦｃｅＲＩＩなど；血液因子、例えば補体Ｃ３ｂ、補体Ｃ５ａ、補体Ｃ５ｂ−９、Ｒｈ因子、フィブリノゲン、フィブリン及びミエリン関連成長阻害剤なども含まれる。
【０１０７】
本発明の方法により結晶化されるタンパク質は、例えば破傷風毒素、ジフテリア毒素、ウイルス表面タンパク質、例えばＣＭＶ糖タンパク質Ｂ、Ｈ及びｇＣＩＩＩなど、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質、ＲＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＳＶエンベロープ糖タンパク質、ＥＢＶエンベロープ糖タンパク質、ＶＺＶエンベロープ糖タンパク質、ＨＰＶエンベロープ糖タンパク質、インフルエンザウイルス糖タンパク質、肝炎ファミリー表面抗原；ウイルス構造タンパク質、ウイルス酵素、寄生虫タンパク質、寄生虫糖タンパク質、寄生虫酵素及び細菌タンパク質を含めた、任意の天然、合成又は組換えタンパク質抗原であってよい。ｈｅｒ２−ｎｅｕ、ムチン、ＣＥＡ及びエンドシアリンなどの腫瘍抗原も含まれる。イエダニ抗原、ｌｏｌｐ１（牧草）抗原及びウルシオールなどのアレルゲンが含まれる。シュードモナス内毒素及びオステオポンチン／ウロポンチン、蛇毒及び蜂毒などの毒素が含まれる。糖タンパク質腫瘍関連抗原、例えば胎児性癌抗原（ＣＥＡ）、ヒトムチン、ｈｅｒ−２／ｎｅｕ及び前立腺特異的抗原も含まれる（ＰＳＡ；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎら、「免疫学の進展（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、６２、ｐｐ．２１７〜５６、１９９６）。
【０１０８】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはポリマーを含み、ポリマーは直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される１つ又は複数の物質を含む。結晶化リアクターは、従来のアクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液又はアガロース溶液以外の、或いはこれに加えた、様々なモノマーを含むことができる。従来の化学重合型ゲルにおいて、ヒドロキシエチルメタクリレート及び他の低分子量アクリレート型化合物をモノマーとして使用することは知られており、これらは「Ｌｏｎｅ−Ｒａｎｇｅｒ」ゲルとして商用化されてきている。１つ又は複数のアクリレート型基で置換されたポリマーの使用は、アルコール又はアセトンなどの混和性有機溶媒と水の混合溶媒中での分離に非常に適しているとして、文献中にも記載されている（Ｚｅｗｅｒｔ及びＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ、「電気泳動（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）」１３：８２４〜８３１、１９９２）。ゲル形成モノマーは、ひとたび重合するとその組合せが特定の型の電気泳動に適したゲルを形成するという条件で、架橋を形成することができる物質と組み合わせた、光重合反応基を含む任意の実質的に水溶性である分子であってもよい。
【０１０９】
ＩＥＦバッファーに加えることができる例示的な物質には、メチレン−ビス−アクリルアミド又は他の知られている架橋剤と組み合わせたアクリルアミド；ヒドロキシエチルメタクリレート、及びアクリル酸、メタクリル酸の他の低分子量（約３００ダルトン未満）誘導体、並びにクロトン酸などのそのアルキル置換誘導体；ビニルピロリドン、並びに他の低分子量ビニル及びアリル化合物；アガロース（「Ａｃｒｙｌａｉｄｅ」架橋剤、ＦＭＣ Ｃｏｒｐ．）、デキストラン、及び他の多糖の誘導体、並びにヒドロキシエチルセルロースを含めたセルロース誘導体などの誘導体を含めた、非イオン性ポリマーのビニル、アリル、アクリル及びメタクリル誘導体；ポリビニルアルコール；エチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシドのポリマー、及びこれらのコポリマーを含めた、グリコールのモノマー、オリゴマー及びポリマー誘導体；ポリＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルアクリル酸）、ポリマーＮ−イソプロピルアクリルアミド（これは温度感受性である）、マレイン酸ポリマー及びコポリマー、部分的に加水分解されたＥＶＡＣ（エチレンと酢酸ビニルのポリマー）、エチレンイミン、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド、並びにこれら同士、及びピリジン、ピロリドン、オキサゾリジン、スチレン、及びヒドロキシ酸などのさらに疎水性である化合物とのサブユニットのコポリマーなどの、他の水適合性ポリマーのアクリル、ビニル又はアリル誘導体がある。特に溶媒又は界面活性剤がゲル形成溶液中に含まれるときは、重合可能な物質は完全に水溶性である必要はない。
【０１１０】
追加的或いは代替的にＩＥＦバッファーは、当分野で知られている方法によって調製することができる一般的なポリマーの誘導体を含むことができる。例えば、酸、無水物又は塩化アシル、無水アクリル酸などを用いたヒドロキシルのエステル化と同様に、アリルグリシジルエーテルをヒドロキシル基に加えることは知られている。無水アシル又は塩化アシルを用いてアミンは容易に誘導体化する。
【０１１１】
候補となる非アクリルアミドモノマーは、例えばアリルアルコール、ＨＥＭＡ（ヒドロキシエチル［メチル］アクリレート）、ポリエチレングリコールモノアクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールモノアクリレート、エチレングリコールジアクリレート、ビニルカプロラクタム、ビニルピロリドン、アリルグリシジルデキストラン、ポリビニルアルコールのアリルグリシジル誘導体、セルロース及び誘導体、酢酸ビニル、並びに１つ又は複数のアクリル、ビニル又はアリル基を含む他の分子を含むことができる。
【０１１２】
一実施形態によれば、結晶化リアクターは重合ＩＥＦバッファーを含み、約２０μｍ〜約５ｍｍの直径、及び約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの長さなどの寸法を有する。重合バッファーを含む結晶化リアクターは、バッファー区画内のバッファー溶液中に浸したときにその構造を保ち、特にバッファー溶液が電場の影響を受けるときにその構造を保つことが好ましい。
【０１１３】
結晶化リアクターが重合ＩＥＦバッファーを含む場合、ＩＥＦ手順中に生体分子種の濃縮バンドが、その生体分子種の等電点（ｐＩ）がＩＥＦバッファーによって広がるｐＨ範囲内にある場合、結晶化リアクターと外部環境の間の界面付近に形成される。バンド内の生体分子種が次いで結晶化リアクター内に拡散し、予想外に急速な結晶の成長が始まる。
【０１１４】
前に詳細に述べたように、結晶化リアクターのポリマーは、電気泳動目的に適していることが知られている、任意のよく知られている典型的なゲル形成物質であってよい。このような物質には、十分に化学反応性がありイオン化可能な基、即ちカルボキシル、スルホン、ホスホン基などの酸性基、及びアミノ基などの含窒素塩基性基の導入を可能にするゲル形成ポリマーがある。典型的な適切な物質は、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール及び架橋ポリエチレンオキシドを含めたヒドロキシルポリマーである。適切に化学修飾された架橋ポリアクリルアミドゲル、寒天又はアガロースゲルも使用することができる。重合ＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターは、ポリマーを加えることによって重合するバッファーを与えることによって、電気泳動の分野で知られているポリマー及び方法を使用することによって一般的に調製することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）「分子クローニングにおける電気泳動バッファー（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｎｏｌａｎ、Ｃ．ｅｄ．）、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ｐｐ．Ｂ．２３〜２４を参照。
【０１１５】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターを固体支持体と連結させる。好都合なことに、結晶化リアクターを支持体、例えば多孔質担体支持体、濾過紙、綿布又は亜麻布、又は適切な強度を与えるのに適した他のウエブ状物質などの上で支持することができる。さらに、寒天又はアガロースゲルのいくつかの架橋が、電場の影響に耐えるために望ましい。
【０１１６】
さらに他の実施形態によれば、少なくとも１つの結晶化リアクターはキャピラリー内に与える。通常、Ｘ線結晶学法による回折像の回収用の結晶は、その結晶化媒体から注意深く分離し、キャピラリーチューブ中に挿入する。チューブはデンタルワックス又はシリコーングリース、及び水和作用状態を保つための少量の内部の結晶化媒体を使用して外気から密封する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、Ｋｒｉｅｇｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｍａｌａｂａｒ、ｐ．２１４、１９８９）。キャピラリー内の結晶化リアクターを使用することによって本発明の方法を適用すること、
【０１１７】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は複数の結晶化リアクターを提供することを含む。さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターは、空間的に接触可能な方法で固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる。さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は複数の結晶を得ることを含み、その複数の結晶は、１つの装置内に含まれる同じ結晶化リアクター又は異なる結晶化リアクターで形成することができる。１つの装置内に含まれる異なる結晶化リアクターにおける複数の結晶は、実質的に同じ時間及び／又は実質的に同じ結晶化の設定下で形成することができる。したがって本発明の方法及び装置は、同時及び／又は同様の条件及び／又は設定下の、様々な生体分子の高スループット結晶化に適している。
【０１１８】
「固体支持体」又は「ホルダー」又は「マトリクス」を本明細書において交互に使用して、少なくとも１つの結晶化リアクターを含む不活性支持成分を指す。この成分は、少なくとも１つの結晶化リアクターを含むストリップ、膜、チップ、シート、又は任意の他の支持形であってよい。
【０１１９】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの耐性より大きな耐性を有する物質を含む。
【０１２０】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは非導電性物質を含む。非導電性物質は、ポリ−Ｎ−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレンからなる群から選択することができる。
【０１２１】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは生体分子に対して不透過性である物質を含み、１つの空洞内の結晶化リアクターから任意の他の空洞内の結晶化リアクターへのタンパク質の拡散を回避する。
【０１２２】
本発明のホルダーは固形物質又は半固形物質、例えばセラミック、ガラス、ポリスチレン、ポリ（メチルメタクリレート）、ルサイト、又はゲルなどであり、１つ又は複数の結晶化リアクターを含むことができ、或いは結晶化リアクターを含むように適合させた１つ又は複数の空洞を含むことができる。一実施形態によれば、ホルダーを形成する物質は伝導性が乏しい。他の実施形態によれば、ホルダーは一部分或いは全体が、生体分子不透過性及びイオン不透過性である物質でできている。結晶化リアクターは例えばゲルとして、或いは支持体と連結、接合、又は実質的に接触したゲルとして、ホルダーの表面上に設定することができ、或いはホルダー中にエッチングした溝中に設定することができ、或いは結晶化リアクターがランニングバッファーと接触することができる限りはホルダー中で延長することができる。ホルダーは本発明の装置のバッファー室内を移動することができるか、或いはその中に固定することができる。
【０１２３】
本発明の一実施形態によれば、結晶化リアクターがマトリクス中で延長する場合、したがって結晶化リアクターの片側はランニングバッファーと接触しており、その側は生体分子不透過性物質でできた層で覆われていることが好ましい。
【０１２４】
それぞれの空洞が結晶化リアクターをほぼ含む複数の空洞を含むホルダーは、例えばホルダーの片側からホルダーの反対側まで穴又はチャンネルを掘ることによって、所定のｐＨ範囲を有するゲルに凝固するＩＥＦバッファーと混合させた、アガロース又はポリアクリルアミドゲルなどのポリマーをチャンネルに充填することによって作製することができる。ホルダー中の溝は、ホルダーの反対側に延長することはできない。溝はホルダーのいずれかの側に作製することができる。一実施形態によれば、溝はホルダーの片側に存在する。
【０１２５】
さらに他の実施形態によれば、本発明の方法は、同じであるか或いは異なるＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供することを含む。さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターのｐＨ範囲は重複しない。
【０１２６】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクターを含む固体支持体は、ＰｒｏｔｅｏｍＩＱ（商標）ＩＰＧストリップ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ｓｙｓｔｅｍｓ）などの固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、Ｓｅｒｖａｌｙｔ Ｐｒｅｃｏｔｅｓ（商標）ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．）、ｐＨ膜及び市販のプレキャストゲル（例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ａｍｒｅｓｃｏ Ｉｎｃ．、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びその他）からなる群から選択される。ただし、複数の結晶化リアクターの配列は本発明の原理に適合しているか、或いは適合するように改変されているものとする。好ましくは、本発明によれば、複数の結晶化リアクターは不連続な配列のリアクターを形成し、それぞれのリアクターはあるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含み、それぞれのＩＥＦバッファーによって広がるｐＨ範囲は、その不連続な配列中の他のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲と重複するか或いは重複しない可能性がある。
【０１２７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の方法は重合ＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供する。複数の結晶化リアクターは同一であってよく、或いはそれぞれの結晶化リアクターは異なるゲル（ポリマー）を含むことができる。場合によっては複数の結晶化リアクターは、特に異なる透過性（例えば、異なる孔サイズ）、構造及び粘性を示す複数の結晶化リアクターから生じる、異なる濃度の同じポリマーを含む。
【０１２８】
市販のＩＰＧストリップは、それぞれのＩＰＧストリップが複数の単離ｐＨバンドを含み、それぞれのｐＨバンドが一定のｐＨ範囲を含むという条件で、本発明を実施するために使用することができる。しかしながら、市販のＩＰＧストリップの欠点は、それぞれ個々のｐＨバンドの体積及び形状は、特に生体分子の拡散はバンド内では制限されるので、結晶を形成するのに一般に適していないことである。したがって、カスタムメイドのＩＰＧストリップは、本発明の原理に従い結晶を得るのに非常に適している。カスタムメイドのストリップの設計を最適化して、その中での生体分子の濃縮、拡散及び結晶化を容易にする。
【０１２９】
カスタムメイドのＩＰＧストリップは、不活性支持体、典型的にはアクリルアミドゲルと化学結合するように処理したマイラープラスチック製シートと結合した薄い平面状のＩＰＧゲル形（例えば、Ｇｅｌｂｏｎｄ（商標）ＰＡＧフィルム、ＦＭＣ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を作製するための、現在の慣習に従い典型的には作製する。ＩＰＧゲルは、０．５ｍｍ厚、１０〜３０ｃｍ長（分離方向）及び約１０ｃｍ幅の長方形プレートとして典型的には形成される。多数のサンプルをこのようなゲルに平行したレーンで施すことはできるが、交差汚染を生み出すレーン間のタンパク質の拡散という付随する問題点がある。所与のレーンに施したタンパク質すべてをそのレーン中で回収することが重要である場合（典型的には２−Ｄ電気泳動の場合と同様に）、ゲルを狭いストリップ（典型的には３ｍｍ幅）に分けることが必要不可欠であり、そのそれぞれが別個のゲルとして働くことがしたがって可能であることが分かっている。したがってサンプルのタンパク質は１つのストリップによって表されるゲルの体積に制限されるので、それはいずれもそのストリップ中で回収される。ＩＰＧ技術における等電点電気泳動によるタンパク質の分離は、当分野において広く記載されている。ＩＰＧの概念は米国特許第４，１３０，４７０号中に開示されており、多数の後の刊行物中にさらに記載されている。
【０１３０】
或いは、米国特許第４，２４３，５０７号中に開示されたのと同様に、重合ＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターは結合剤によってホルダーに取り付けることができる。
【０１３１】
本明細書で使用する用語「ＩＥＦバッファー」は、所与のｐＨ値周辺でバッファー能力を有する成分（バッファー剤）、又は構造化してｐＨ勾配を形成する成分（例えば両性電解質、イモビリン又はバッファー剤の組合せ）を含むバッファーを指す。
【０１３２】
本発明のＩＥＦバッファーは、タンパク質のｐＩがＩＥＦバッファーのｐＨ範囲内にない限り、ＩＥＦバッファー中の電場内をタンパク質が移動することができる、粘性液体又はスラリー又はゲルの形であってよい。本発明のＩＥＦバッファーは、尿素、界面活性剤及び還元剤などの他の成分を必要に応じて含むことができる。本発明のＩＥＦバッファーは、電場の影響下で機能的に安定していることが望ましい。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「粘性液体」は、最小の対流移動、好ましくは対流移動なしで、最小〜ゼロの沈降で、粘性液体中でのマクロ分子の拡散を容易にする、最適化された粘性を有する液体又は他の媒体を指す。
【０１３４】
ＩＥＦバッファー、及びＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターは手作業によって、或いは様々なデバイスによって形成することができる。例えば、ＩＥＦバッファーは支持体の表面に堆積させる（例えばコーティング、プリント又はスポットする）ことができ、表面に固定することができ、或いは支持体の溝又はチャンネルに堆積させることができる。支持体はマトリクス、マトリクスと同じ物質でできた膜又はビーズなどであってよい。
【０１３５】
酸性溶液と塩基性溶液を混合して所望のｐＨ値を有するバッファーを形成するデバイス（「滴定装置」）によって、ＩＥＦバッファーを作製することができる。重合の目的用に、バッファーをモノマー（例えばアクリルアミド）及び重合剤とさらに組み合わせ、所望の位置にＩＥＦバッファーを置く他のデバイス（例えば空洞）に充填することができる。
【０１３６】
一実施形態によれば、本発明のＩＥＦバッファーを生成するために使用する両性電解質は、両性（即ち、酸性媒体中では正に帯電し、塩基性媒体中では負に帯電している）、可溶性であり、且つ約３００から１０００ｕまでのＭｒ値を有する、一組の様々なオリゴ−アミノ及び／又はオリゴカルボン酸である。本発明で使用する両性電解質は、調製することができるか或いは購入することができる。例えば、いくつかの担体両性電解質が当分野では知られている（例えば、ページ３１〜５０、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、Ｐ．Ｇ．、（１９８３）「等電点電気泳動：理論、方法及び用途（Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ：Ｔｈｅｏｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ｅｄｓ．、Ｗｏｒｋ ａｎｄ Ｂｕｒｄｏｎ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｂ．Ｖ．、アムステルダム；米国特許第３，４８５，７３６号）。或いは、購入される両性電解質には、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅｓ（ＬＫＢ）、Ｓｅｒｖａｌｙｔｅｓ（Ｓｅｒｖａ）、Ｂｉｏｌｙｔｅｓ又はＰｈａｒｍａｌｙｔｅｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）がある。
【０１３７】
イモビリンを使用して、本発明のＩＥＦ溶液を生成することもできる。イモビリンは、一般式：ＣＨ２＝ＣＨ−ＣＯ−ＮＨ−Ｒの非両性、二官能性のアクリルアミド誘導体である。本発明に従い有用であるイモビリンは、調製することができるか或いは購入することができる。イモビリンを合成するための方法は当分野で知られている、例えば、Ｂｊｅｌｌｑｕｉｓｔら、（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、６：３１７、１９８３）。イモビリンをアクリルアミドと共重合させて、固定化ｐＨ勾配からなる結晶化リアクターを形成することができる。本発明のｐＨ勾配は、両性又は非両性のバッファーを混合することによって形成することができる。例えば、このようなバッファーの組合せは、Ａｌｌｅｎ、ＲＣら、「タンパク質のゲル電気泳動及び等電点電気泳動（Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｆｏｃｕｓｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」：「選択された技術（Ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）」、ベルリン：Ｗａｌｔｅｒ ｄｅ Ｇｒｕｙｔｅｒ ＆ Ｃｏ．（１９８４）中、及び米国特許第５，４４７，６１２号（Ｂｉｅｒ）中に記載されている。いくつかのＩＥＦバッファー剤には、（１）５０ｍＭのグリシン、１４ｍＭのＮａＯＨ；（２）５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１２ｍＭのＮａＯＨ；（３）５０ｍＭのＴＨＭＡ、４４．６ｍＭのＨＣｌ；（４）５２ｍＭのクエン酸、９６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；（５）５０ｍＭのＢＩＣＩＮＥ、１８ｍＭのＮａＯＨ；及び（６）５０ｍＭのＤＭＧＡ、４０ｍＭのＮａＯＨからなる群から選択されるバッファー剤がある。それぞれのセル中でＩＥＦバッファーによって生じるｐＨ勾配は、狭いｐＨ範囲又は広いｐＨ範囲（例えば、それぞれｐＨ６．８〜ｐＨ７．８又はｐＨ６．８〜ｐＨ１２．８）を有する可能性がある。
【０１３８】
本発明の方法において使用し、本発明の装置及び方法の電力供給によって生じる電場は、本発明の方法及び装置が耐えることができる任意の電圧、例えば１００〜１００００ボルト、又は５００〜１００００ボルト、又は５００〜５０００ボルトであってよい。ただし、生成する熱はランニングバッファーを含む区画中に放散させることができ、適切な冷却によって調節することができるものとする。供給される電圧はＤＣ又はＡＣであってよい。ＤＣ及びＡＣ電流を供給することができる電力供給装置及び電極は市販されており、当分野で知られている。
【０１３９】
一実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である。
【０１４０】
さらに他の実施形態によれば、電場は交流電場、直流電場からなる群から選択される。ＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターが、結晶化リアクター中へのその進入の反対側に電流が出るのを妨げるように密閉される場合、したがって一実施形態によれば、電場は可逆的である。結晶化リアクターが開放状態である場合、したがって電場は直流、即ち単向性、又は交流である可能性がある。
【０１４１】
用語「バッファー」又は「バッファー溶液」又は「ランニングバッファー」を本明細書において交互に使用して、一方では弱酸（炭酸など）及びこの酸の塩の１つ、及び弱酸の少なくとも１つの酸塩；或いは他方では、弱塩基（アンモニアなど）及び塩基の塩の１つを含む溶液を記載する。これらの成分を有するので、バッファーはそれぞれの成分の濃度に従って、溶液のｐＨを確定することができる。バッファーはさらに、水素イオン濃度の変化に対するその耐性のために、酸又は塩基を加えても確定したｐＨを維持することができる。ｐＨを確定し維持する所与のバッファーの能力は、「バッファー能力」とも呼ばれる。
【０１４２】
さらに他の実施形態によれば、単離したほぼ純粋なタンパク質の溶液を本発明において使用して、タンパク質結晶を得ることができる。純粋なタンパク質は、当分野で知られている任意の適切なタンパク質精製法によって得ることができ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ（Ｍｅｔｈ．「酵素学（Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）」、１８２：８３〜８９、１９９０）中及びＳｃｏｐｅｓ（「タンパク質の精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」：「原理及び実践（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク、１９８２）中に記載されたものを含む。タンパク質の精製は、他の生物物質から、所望のタンパク質をコードする組換え核酸を用いて形質転換した細胞の細胞成分などからの、所望のタンパク質の単離を含む。例えば、免疫親和性クロマトグラフィーを使用することによって、例えば所望のタンパク質と特異的に結合する抗体を使用して、精製を実施することができる。
【０１４３】
用語「非精製タンパク質」及び「十分に精製されていないタンパク質」を本明細書において交互に使用して、その本来の状態で付随しないその構造又は成分の一部分ではない成分から、完全に分離されていないタンパク質を記載する。典型的には、精製タンパク質は約６０〜９０％Ｗ／Ｗ、約９５％、及び約９９％の純粋なタンパク質をタンパク質サンプル中に含む。本発明において使用するタンパク質は、ＩＥＦ手順の前に必ずしも十分に精製する必要はない。
【０１４４】
一実施形態によれば本発明は、多数のタンパク質を分析し選択したタンパク質を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を含む溶液を提供するステップと、
（ｂ）支持体上での電気泳動によって溶液を分析し、それによって少なくとも１つの生体分子種に対応する少なくとも１つのバンドを支持体中に得るステップと、
（ｃ）支持体から一部分を分離することであって、その部分が（ｂ）で分析した少なくとも１つのバンドを含むステップと、
（ｄ）あるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップであって、そのｐＨ範囲が前記少なくとも１つのバンドのｐＩを含むステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つのバンドを少なくとも１つの結晶化リアクターに加えるステップと、
（ｆ）ランニングバッファーに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に、（ｂ）で分析した少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｇ）少なくとも１つの結晶化リアクター内で、（ｆ）の濃縮溶液中の前記少なくとも１つの生体分子種を結晶化するステップと
を含む上記方法を提供する。
【０１４５】
さらに他の実施形態によれば、さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｅ）は、加えた少なくとも１つのバンドをランニングバッファー中の少なくとも１つの結晶化リアクターに置くステップをさらに含む。ステップ（ｅ）は、ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含むことが好ましい。ステップ（ｇ）は、タンパク質結晶の形成を監視する及び／又は検出するステップをさらに含むことが有利である。
【０１４６】
結晶の形成の調査及び検出は、結晶化リアクター中のサンプルの生体分子を検出するためのデバイス；検出デバイスからのデータを受信するためのデバイス；及び受信したデータを処理するためのデバイスの、いずれか１つによって実施することができる。一実施形態によれば、走査型マイクロデンシトメーターが、結晶化リアクターからのシグナルを検出し、受信し処理する。
【０１４７】
結晶化リアクター中のサンプルの生体分子を検出し、検出デバイスからのデータを受信し、受信したデータを処理するのに必要不可欠な１つ又は複数のデバイスを、コンピュータ中にパッケージ化することができる。
【０１４８】
検出デバイスを設計して、波長、複数の波長又は１つの波長のスペクトルである電磁放射を、同時又は順次にレーン上に投影することができる。一実施形態によれば、照明光源は単色である。例えば検出デバイスは、狭いスペクトルの光がそれぞれのリアクター上に投影された後の特定の波長における、それぞれの結晶化リアクターからの吸収の程度を迅速に順次読み取る、カスタムメイドの光度計であってよい。或いは、検出デバイスを設計してそれぞれのリアクターを同時に読み取る、且つ／或いはいくつかの波長においてそれぞれのリアクターから放出された電磁放射に関する読み取り値を得ることができる。
【０１４９】
適切な検出デバイスには、裸眼、分光光度、化学発光、光度／密度計、電気化学検出装置、又は生体分子が標識されているかどうか、及びその標識の型に依存する放射化学検出装置があるが、これらだけには限られない。シグナルを生成する反応を引き起こすための他の成分、又は前述の方法に従い検出可能なシグナルを増大させるための他の成分を、標識が必要とする可能性がある。適切なシグナル生成システムの詳細な論述は、米国特許第５，１８５，２４３号中で見ることができる。標識を結合させるための技術の詳細は当分野で知られている。例えば、Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８５）１５１：２０５〜２０９、及び欧州特許出願第０３０２１７５号を参照のこと。
【０１５０】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｂ）の溶液は支持体上での等電点電気泳動によって溶液を分析し、それによって少なくとも１つの生体分子種の等電点に対応する少なくとも１つのバンドを支持体中に得る。
【０１５１】
さらに他の実施形態によれば、ステップ（ｄ）のＩＥＦバッファーは０．２ｐＨ単位を超えない、好ましくは０．１ｐＨ単位を超えない、より好ましくは０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する。
【０１５２】
さらに他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度が０〜３０℃の範囲内に維持されるように本発明の方法を行う。他の実施形態によれば、ランニングバッファー溶液の温度は０〜３０℃の範囲内に維持し、電場は５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である。
【０１５３】
さらに他の実施形態によれば、本発明は、それぞれの結晶化リアクターにおける温度が、任意の他の結晶化リアクターの温度とは別個である、好ましくは異なる、複数の結晶化リアクターを提供する。温度は、本発明の方法において拡散及び結晶の成長を最適化するために調節することができる、１つのパラメータである。
【０１５４】
様々な市販の温度制御モジュールを、本発明の文脈で使用するために適合させることができる。代表的な適切なモジュールは、ロボットによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）用に設計した自動式熱循環装置であり、これを改変して本発明の要件に適合させることができる。例えば、ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈの熱循環装置（ＭＪＲ、Ｗａｌｔｈａｍ、マサチューセッツ州；例えば、ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ（商標）、Ｄｙａｄ（商標）、Ｍｉｎｉ−Ｃｙｃｌｅｒ、ＰＴＣ−１００（商標）、Ｔｅｔｒａｄ（商標））はペルティエ熱を特徴とし、Ａｌｐｈａ（商標）モジュールは交換可能な発熱体であり、ユーザがサンプル形式を迅速に変えるのを可能にする。これらの循環装置のいくつかはＨｏｔ Ｂｏｎｎｅｔ（商標）加熱蓋を特徴とし、マイクロウエルプレート及びさらに顕微鏡スライドを含めた、様々なサンプル形式に使用することができる。他の適切なシステムは、Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）装置（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、カリフォルニア州）である。このシステムはミクロ流体に基づくこの会社のＩ−ＣＯＲＥ（登録商標）技術に基づくものであり、それぞれのサンプルを異なる実験条件に施すことを可能にする温度制御モジュールである。ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）は、他の適切な温度制御モジュールを与える。ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒは４つのプログラム可能なブロックを特徴とし、最適化を簡潔にするための勾配特徴を与える。この循環装置の特異性は、それがロボットアームを使用してサンプルをブロックからブロックに動かし、それぞれのブロックの温度が異なる可能性があることである。
【０１５５】
一連の開示は、マクロ分子及びマクロ分子含有サンプルをゲル、最も頻繁にはタンパク質又は核酸分離用に使用されるスラブゲルの表面に充填するために使用される、様々な形状の開口部（「サンプルウエル」）を扱っている。それぞれの場合、サンプル中のマクロ分子をそれらが分解ゲル中を移動する前に薄い開始ゾーン中に濃縮させるために、これらのサンプルウエルを設計する。以下の参照文献は、ウエルを形成するためにゲルに対して配置したデバイスの使用を記載している：米国特許第５，３０４，２９２号は、破片の両端がスラブの上端と接触するウエル壁をスラブの上部に形成するための、圧縮性ガスケットの破片の使用を記載している。米国特許第５，１６４，０６５号は、ＤＮＡシークエンシングゲルと組み合わせて使用するサメの歯のすきぐしを記載している。
【０１５６】
急速な結晶化のための装置
本発明は、急速な結晶化のための装置も提供する。さらに他の実施形態によれば、本発明は、タンパク質結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
（ａ）少なくとも１つの結晶化リアクターであって、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも１つの結晶化リアクターと、
（ｂ）電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
（ｃ）バッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置を提供する。
【０１５７】
一実施形態によれば、装置は上側及び下側を有するホルダーをさらに含み、そのホルダーは少なくとも１つの結晶化リアクターを含むか、或いは少なくとも１つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合しており、前記少なくとも１つの結晶化リアクターはＩＥＦバッファーを含み、ホルダーはバッファー区画内に含まれる。他の実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つのバッファー区画内に置く。ある実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つの結晶化リアクターを含むキャピラリーである。
【０１５８】
さらに他の実施形態によれば、装置は２つの端部を有する２つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の１つの端部はホルダーの１つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の１つの端部は少なくとも１つのバッファー室内に含まれる。装置は２つのバッファー室、それぞれのバッファー室が１つの塩橋の１つの端部を囲うようなそれぞれのバッファー室を含むことが好ましい。
【０１５９】
典型的には、塩橋はイオン導電体として働き、生体分子溶液を含む少なくとも１つの結晶化リアクター、或いはそれを含む成分、ホルダー及び／又は支持体などと、バッファー区画内のバッファーの間に通常配置される。本発明の装置に適した塩橋の例には、塩化カリウム又は硝酸カリウムなどの電解質を寒天培地に溶かすことによって得ることができるイオン導電体を充填した、ガラス、セラミック材料又はプラスチックチューブがある。
【０１６０】
他の実施形態によれば、バッファー区画は、ランニングバッファー及びランニングバッファー内に溶解した少なくとも１つの生体分子種を含む溶液を保持するように適合させる。
【０１６１】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは少なくとも１つの空洞を有しており、この少なくとも１つの空洞はＩＥＦバッファー及びポリマーを含む結晶化リアクターを保持するように適合している。
【０１６２】
さらに他の実施形態によれば、ホルダーは複数の空洞を含み、それぞれの空洞は、ポリマー及びＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクターを含む。
【０１６３】
さらに他の実施形態によれば、複数の結晶化リアクター内のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は重複しない。
【０１６４】
記載する種類の装置中の複数の結晶化リアクターを含むホルダーは、任意の所望の形状、例えば並んで配置される水平系の結晶化リアクターとして配置することができ、一般的なスペーサーによって、或いは垂直系として隔てることができる。
【０１６５】
ここで図１を参照すると、本発明の装置は、数本の電極、即ちアノード及びカソード、並びにランニングバッファーを含むバッファー室を含む。この装置はイモビリンバッファーを含む結晶化リアクター（図１Ａ）、キャピラリー内の結晶化リアクター（図１Ｂ）、又は複数の別個で単離されたｐＨバンドを含むカスタムメイドのＩＰＧストリップ（図１Ｃ）をさらに含む。
【０１６６】
ここで図２及び３を参照すると、本発明の装置は、バッファー室（２）内に囲われたバッファー区画（１）、ホルダー（３）、結晶化リアクター（５）及び電極（６）を含む複数の空洞（４）を含む。
【０１６７】
一実施形態によれば、本発明の装置は複数の結晶化リアクターを含み、それぞれの結晶化リアクターはＩＥＦバッファーを含み、場合によってはＩＥＦバッファーは重合されている。複数のＩＥＦバッファーによって生じるｐＨ範囲のｐＨの上限及び下限は、異なっているか或いは同一であってよい。例えば、結晶化リアクター＃１中のＩＥＦバッファーはｐＨ６．８で始まりｐＨ７．８で終わるｐＨ範囲を有する可能性があり、結晶化リアクター＃２中のＩＥＦバッファーはｐＨ７．９で始まりｐＨ８．９で終わるｐＨ範囲を有する可能性がある。さらに、結晶化リアクター＃１と結晶化リアクター＃２のＩＥＦバッファー間のｐＨステップは、異なるｐＩ単位又は同一のｐＩ単位であってよい。
【０１６８】
さらに他の実施形態によれば、ＩＥＦバッファーのｐＨ範囲は広くて、狭くて或いは非常に狭くてよく、例えば０．１ｐＨ単位以下、０．０２ｐＨ単位以下、或いは０．０１ｐＨ単位以下で広がる。
【０１６９】
さらに他の実施形態によれば、ＩＥＦ手順は本発明の装置を使用して行い、ランニングバッファーを含むバッファー区画は、ＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを含む複数の空洞を含むホルダーをさらに含む。この設定を使用して、複数の空洞を物理的に隔てることによって互いに離し、これによってランニングバッファーを介した動きではなく、１つの結晶化リアクターから他の結晶化リアクターへの直接の生体分子の動きを実質的に妨げる。したがって生体分子は主に、ランニングバッファーを介して１つの結晶化リアクターから他の結晶化リアクターに動く。他の実施形態によれば、結晶化リアクターは同じ又は異なるｐＨ範囲を含む。さらに他の実施形態では、本発明は、１つの設定を使用して複数の別個のタンパク質を結晶化することができるように、実質的に重複しないｐＨ範囲を有する多数の別個の隔離された結晶化リアクターを含む。さらに、結晶化リアクターが狭い、好ましくは非常に狭いｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、本発明の装置、システム及び方法を使用することによって、特に伝統的なＩＥＦゲルと比較して高い、本発明の方法の分解能のために、０．０２ｐＨ単位以下離れたｐＩ値を有する複数の別個のタンパク質を１つの設定で結晶化することが可能である。
【０１７０】
システムの１つの形状によれば、１つの結晶化リアクターから隣接する結晶化リアクター中、例えばわずかに異なるｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む結晶化リアクター間の生体分子の拡散は、本発明の装置を使用することによって避けられる。ただし、結晶化リアクターを含むホルダーが、生体分子に対して不透過性である物質を含むものとする。
【０１７１】
以下の名称は、それらが本明細書全体及び以下の特許請求の範囲中に現れるとき、本発明の装置の成分に使用する：用語「バッファー室」又は「ランニングバッファー室」は交互に使用することができ、タンパク質溶液を含むバッファーを保持する容器又はリザーバを表す。用語「マトリクス」又は「チップ」又は「アレイ」又は「ホルダー」は交互に使用することができ、結晶化リアクターを含む成分を表すことができる。
【０１７２】
急速な結晶化の適用例
急速なマクロ分子の結晶化は、保存、薬剤設計及び薬剤送達に関して非常に産業的価値がある。多量の結晶マクロ分子の調製に関する産業上の必要性も存在する。産業規模の処理に適した、当分野で知られている結晶化の方法は存在しない。何故なら、結晶が成長しない危険性が常に存在し、結晶が実際に成長し始める場合、所望の大きさの結晶を得るのに必要とされる長い時間は実用的ではないからである。
【０１７３】
大規模なマクロ分子の結晶化、及び特にタンパク質の結晶化用の、迅速で効率の良い技術を生み出すための動機は以下のものである。
【０１７４】
第１に、純粋である結晶状態のマクロ分子を生成することが望ましい。このような結晶は、治療剤及びワクチンの剤形調製に非常に有利な形のタンパク質又は核酸を構成する。本発明は、マクロ分子を結晶化するための迅速な方法を提供する。大規模な結晶化は、臨床薬製造プロセス、治療剤及びワクチンを製造するためのプロセスにおける、最終的な精製ステップ及び／又は濃縮ステップとして導入することができる。さらに、大規模な結晶化は、製造プロセス中のいくつかの精製ステップを交換することができる。例えば、タンパク質の結晶化はタンパク質配合物の生成を簡素化し、それを一層手ごろなものにすることができる。
【０１７５】
第２に、マクロ分子の結晶を保存することは、溶液を保存することより有利である。何故なら、溶液中で起こるマクロ分子の相互作用は、全体の反応速度が相当低下するために、結晶状態を妨げるか或いは著しく低下させるからである。したがって結晶状態は、生物マクロ分子の混合物の保存に特に適している。結晶の貯蔵寿命は、米国特許第６，５４１，６０６号中に開示されたのと同様に、ポリマー担体を含むマトリクス内に結晶を被包して組成物を形成することによって、さらに延長させることができる。この組成物は、タンパク質の本来の生物学的活性がある三次構造の保存状態を高め、必要とされる場所及び時に活性タンパク質をゆっくりと放出することができるリザーバを形成する。
【０１７６】
第３に、固体状の結晶調製物を容易に還元して、非常に高いタンパク質濃度を有する直ぐに使用可能な非経口配合物を生成することができる。このようなタンパク質濃度は、配合物が皮下投与を目的とするものである場合は非常に有用であるとみなされる、例えば国際特許公開ＷＯ９７／０４８０１を参照のこと。皮下投与に関しては、１．５ｍｌ以下の注射体積が十分許容可能である。したがって、１週間単位では１ｍｇ／ｋｇで投与されるタンパク質に関しては、少なくとも５０ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が必要とされ、１００〜２００ｍｇ／ｍｌが好ましい。凝集の問題のために、これらの濃度を液体配合物において得るのは困難である。本発明の方法によって得られるタンパク質結晶を使用して、これらの濃度は容易に得ることができる。
【０１７７】
第４に、タンパク質結晶は薬剤調製に非常に有利な形も構成する。ｉｎ ｖｉｖｏ用の徐放性配合物の主成分として結晶を使用することができる。当業者が理解するように、粒子の大きさは結晶の溶解及び活性物質の放出のために重要である。結晶が実質的に均一な粒子の大きさを有し非晶質沈殿を含まない場合、放出の速度はさらに予想しやすくなることも知られている、例えば欧州特許第２６５，２１４号を参照のこと。したがって、タンパク質結晶は植え込み型デバイスにおいて有利に使用することができる、例えば国際特許公開ＷＯ９６／４００４９を参照のこと。植え込み型リザーバは一般に約２５〜２５０μｌである。この体積制限によって、高濃度（１０％を超える）の配合物及び最小量の懸濁媒体が好ましい。本発明の方法によって得られるタンパク質結晶は、このような高濃度で非水性懸濁液に容易に配合することができる。
【０１７８】
第５に、結晶の他の利点は、いくつかの変数を操作して経時的にマクロ分子の放出を調節することができることである。例えば、結晶の大きさ、形状、溶解に影響を与える賦形剤との配合、架橋、架橋のレベル、及びポリマーマトリクス中への被包をいずれも操作して、生物分子用の送達媒体を生成することができる。
【０１７９】
本発明は、前に記載したニーズを提供する。本発明の方法の以下の利点によって、本発明の方法はマクロ分子の高スループットの産業用の結晶化に適したものとなる：
１．少量の希釈した、必ずしも精製されていないタンパク質サンプルから結晶を成長させる能力。
２．濃縮タンパク質溶液又は濃縮タンパク質バンドが、数時間以内、さらに数分間以内に直ぐに生成される。
３．結晶化リアクター中に蓄積するマクロ分子は非帯電状態であるか、或いは非常に少量の電荷を有しており、したがって静電気による反発作用は、無視できる程度であるか或いは存在しない。
４．沈降、対流又は沈殿が、濃縮したマクロ分子溶液の形成中又は結晶の形成中に生じない。
５．結晶の成長が非常に速い、約数分間又は数時間以内である可能性がある。
６．本発明の方法のＩＥＦ成分による、結晶化過程中のタンパク質サンプルの製造過程の精製によって、不純物及び他のイソ型による考えられる汚染が排除され、したがって本発明の方法は、既存の結晶化法と比較して、あまり精製されていないタンパク質サンプルを用いた作業を可能にする。
７．キャピラリー内で結晶化リアクターを使用する、本発明の方法を適用するためのオプションは、結晶学的方法に特に適している。何故なら、リアクターから異なる環境に結晶を移動させる必要がないからである。このような移動は、結晶の構造及び安定性を危うくする。
【０１８０】
本発明の方法の前述の利点によって本発明の方法は、所与のタンパク質の個々のイソ型の同時の分離及び結晶化に適したものとなる。
【０１８１】
一実施形態によれば本発明は、高スループットで急速なマクロ分子の結晶化のための、小型化及び自動化された装置並びに方法を提供する。本発明の装置は、自動式相互作用成分、例えばＩＥＦバッファー（イモビリン、両性電解質など）を含む前重合結晶化リアクターを空洞に充填するための滴定装置、空洞又は結晶化リアクターからタンパク質結晶を回収するための抽出装置、及び結晶化リアクター内のタンパク質結晶の形成を調べて記録するためのデバイスを有ように構築することができる。
【０１８２】
本発明の原理に従い形成される結晶のさらなる安定性は、この目的用の当分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、米国特許第６，５４１，６０６号中に開示されたのと同様に結晶を被包することができ、或いはキャピラリーチューブ中に挿入することができ、次いでこれをデンタルワックス又はシリコーングリース、及び水和作用状態を保つための少量の内部の結晶化バッファーを使用して外気から密封する（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、同書）。
【０１８３】
本発明の方法及び装置による結晶化プロセスの最適化は、異なるゲル濃度（孔径、拡散定数）及び様々なタンパク質希釈液を有するいくつかの結晶化リアクターを使用して、１つの実験によって達成することができる。それぞれの結晶化リアクターは、異なる温度に曝すこともできる。
【実施例】
【０１８４】
（実施例１）
ｐ５３タンパク質の成分の結晶化
３つのタンパク質サンプルが供給された：
（ａ）ｐ５３ヒトＤＢＤ［ｐＩ（理論値）＝８．８３］
（ｂ）Ｃ Ｅｌｅｇａｎｓからのβ−転写因子［ｐＩ（理論値）＝５．９８］
（ｃ）ヒトβ−転写因子［ｐＩ（理論値）＝５．５］
【０１８５】
３つのサンプルすべてを、市販のＩＰＧストリップｐＨ３〜１０（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上での当初のＩＥＦによって分析して、特定のタンパク質のｐＨを測定した（図４）。図４中に見ることができるように、３つの「精製」タンパク質溶液のそれぞれは、多数の異なるタンパク質バンドから構成されることが分かった。
【０１８６】
本発明の方法による結晶化用に、特定のタンパク質のあるｐＩに対応するバンドを選択した。図４Ｃ中に図式的に記載したのと同様に、理論値ｐＩ付近のｐＨ値を有する手製のＩＰＧストリップ及び装置を使用して、結晶化を行った。数個の結晶が急速に形成された。結晶をＩＰＧゲルから抽出し、ｐ５３サンプルに関して得た散乱像は実際、２．８Å分解能で多結晶サンプルに特徴的であった。
【０１８７】
（実施例２）
ＬＰＧズームストリップを使用することによる、ＩＥＦによって分離したタンパク質の結晶化の可能性の実証
我々の結晶化技術はわずか数マイクログラムの量のタンパク質を必要とするので、ＩＥＦによる分離は結晶を得るための物質の源として働くことができる。このような実験は、図５中に見られるのと同様にｐ５３サンプルから分離したバンドの１つで行った。
【０１８８】
以下の手順を使用した：ＩＰＧストリップから、我々はｐＨ９．６までのバンドを選択し切断し、結晶化用に我々は、図４Ｃ中に示すシステムを選択して使用した。その目的で短いＩＰＧズームストリップを、９．５〜９．７５の範囲０．０５のステップで調製した。ストリップは標準的な密度勾配法によって調製した。ＩＥＦ実験から切断したタンパク質バンドは、ＩＰＧストリップの端近くのポリアクリルアミドに接着させた。ストリップは図４Ｃ中に示す電気泳動チャンバーの上に置いた。図６Ａ中に実証したように、標準的なＩＥＦ手順は分離画分の集中及び結晶化をもたらし、上質の結晶が生じた。２．４Åの分解能を実証する回折像を図６Ｂに示す。
【０１８９】
（実施例３）
ミオグロビンの結晶化
ウマ心臓ミオグロビン（７５μｇ）を１．５ｍｌの水に溶かし、結晶化装置中に導入した。この溶液はＩＥＦ手順用のランニングバッファー（ｐＨ＝７．００）として働いた。イモビリン（商標）バッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を、直径１ｍｍ及び深さ１ｍｍの１０％ポリアクリルアミドゲルの円筒形空洞中に重合させた（ｐＨ＝６．８０）。ＩＥＦ分離は以下の条件：１２００Ｖ、３０分間、及び電極間の距離０．５ｃｍの下で行った。
【０１９０】
ＩＥＦは装置の強い攪拌下４℃で行って、バッファー溶液内のタンパク質の移動を容易にした。ＩＥＦ手順のために行った有効な測定によって、ゲルの空洞中に蓄積したタンパク質の量は、溶液中の全タンパク質の約５０％であったことが示された。
【０１９１】
顕微鏡下でゲルの空洞を監視することによって、ゲル中の非常に発達した結晶構造が明らかになった（図７Ａ）。
【０１９２】
（実施例４）
ヘモグロビンＳの結晶化
ヘモグロビンＳの溶液（１μｇ／ｍｌ、水中；Ｓｉｇｍａ）、ｐＩ＝７．０を、６．９〜７．０５のｐＨ範囲を有するｐＨバッファー（イモビリン（商標）、４％ポリアクリルアミドゲル中）中への等電点電気泳動によって濃縮した。１０００Ｖ／ｃｍの電場を、２５℃の温度の下で３０分間引加した。３０分後、４００μｍ長の結晶を得た（図７Ｂ）。
【０１９３】
（実施例５）
フィコシアニンの結晶化
１μｇ／ｍｌの溶液中で約４．５のｐＩを有する市販のフィコシアニン（１μｇ；Ｓｉｇｍａ）に、４．４〜４．６のｐＨ範囲を有するｐＨバッファー（イモビリン（商標）、４％ポリアクリルアミドゲル中）においてＩＥＦ手順を施した。等電点電気泳動の条件は：２５℃、１００Ｖ／ｃｍの電場、及び３０分の実験時間であった。３０分後、結晶を得た（図８Ａ）。
【０１９４】
同様に、アルコールデヒドロゲナーゼ（図８Ｂ）及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ；図９Ａ）の結晶を得た。
【０１９５】
（実施例６）
アクアポリン３の結晶化
膜タンパク質は一般に、構造決定に関する最も重要なタンパク質であるとみなされている。残念ながら、タンパク質を結晶化するための最も標準的な方法は、膜タンパク質の結晶を生成することができない。この本発明の実施例は、最も重要な膜タンパク質の１つであるアクアポリンの結晶化を可能にする本発明の方法の能力を実証する。
【０１９６】
水及びＡｍｐｈｏｌｉｎｅ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を含むランニングバッファー中でｐＩ＝６．７のラットアクアポリン３の溶液（１μｇ／ｍｌ；Ａｌｐｈａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）に、結晶化手順を施した。ｐＨゲル空洞（４％ポリアクリルアミド、ｐＨ６．６５〜６．８）中のタンパク質の濃縮手順は、以下の条件：４０分の実験時間、２５℃及び１００Ｖ／ｃｍを使用してＩＥＦによって行った。生成した結晶は図９Ｂに示す。
【０１９７】
（実施例７）
ウシ炭酸脱水酵素の結晶化
５．９５のｐＩを有するウシ炭酸脱水酵素の溶液（１μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ）を、ＩＥＦによって５．８〜６．０のｐＨを有するｐＨゲル区画（空洞；４％ポリアクリルアミド）中に濃縮した。この濃縮手順は、１００Ｖ／ｃｍの電場の下で２５℃において４０分を要した。４０分後、結晶を得た（図１０）。
【０１９８】
（実施例８）
ペプシン−４、クレアチンキナーゼ１、β−ヒト成長因子、アビジン、ヘルセプチン、Ｌｙ１リゾチーム、リボヌクレアーゼ−１及びプロスタグランジンの結晶化
ペプシン−４、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、β−ヒト成長因子（βｈＧＦ）、アビジン、ヘルセプチン、Ｌｙ１リゾチーム、リボヌクレアーゼ−１（ＲＮＡｓｅ−１）及びプロスタグランジンのタンパク質結晶化は、表１中に詳細に述べたように行った。生成した結晶及び／又は結晶化したタンパク質の分画の回折は図１１〜１５中に示す。
【０１９９】
【表１】
【０２００】
特定の実施形態のこれまでの説明は、本発明の一般的性質を完全に明らかにするため、現行の知識を適用することによって、他者はこのような特定の実施形態を過度の実験を必要とせず一般的概念から逸脱しないように、各種用途に容易に改変及び／又は適合させることができ、したがって、このような適合及び改変は、開示した実施形態の均等物の意味及び範囲内に含まれるはずであり、含まれるものとする。本明細書で使用する語法又は述語は、制限ではなく説明を目的とすることは理解されよう。各種の開示された機能を果たすための手段、材料、及びステップは、本発明から逸脱することなく各種の代替形をとることができる。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】バッファー室（２）内に囲われたバッファー区画（１）、ホルダー（３）、電極（６）、塩橋（１０）及び固体支持体（７）、１つ又は複数の結晶化リアクター（５）を含むキャピラリー（８）又はストリップ（１４）、及び場合によっては荷重点（９）を含む、様々な結晶化システムの概略図（Ａ−Ｃ）である。
【図２】バッファー室（２）内に囲われたバッファー区画（１）、ホルダー（３）、結晶化リアクター（５）及び電極（６）を含む複数の空洞（４）を含む、結晶化装置の概略図である。
【図３】（Ａ）はホルダー（３）中に含まれる結晶化リアクター（５）内の、タンパク質バンド（１２）からのタンパク質の移動を記載する図であり、（Ｂ）は３つの結晶化リアクターを含むホルダー（３）の上面図（左図）及び側面図を記載する横断面図である。
【図４】３〜１０のｐＨ範囲の市販のＩＰＧストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でのＩＥＦによる、３つのタンパク質サンプルの分離を表す図である。
【図５】９．５〜９．７５の狭いｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを用いて本発明の方法を使用して図１のＩＰＧストリップから得た、タンパク質の分離及び急速な結晶化を示す図である。
【図６】本発明の方法によって得たｐ５３の結晶（Ａ）及びその回折像（Ｂ）を示す図である。
【図７】結晶化リアクター中で得た一種のミオグロビンタンパク質結晶、約１００μｍ長の像（Ａ）（３００μｍ×１５０μｍ）及びゲル中のヘモグロビン結晶の像（Ｂ）を示す図である。中央の縦長の物体は、約４００μｍ長のヘモグロビン結晶である。
【図８】フィコシアニン結晶（Ａ）及びゲル中のアルコールデヒドロゲナーゼ結晶（Ｂ）の像を示す図である。
【図９】空洞内のゲルから抽出したグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）結晶の像（Ａ）及びゲル中のアクアポリン３の結晶の像（Ｂ）を示す図である。
【図１０】重合ＩＥＦバッファーからなる結晶化リアクター内の炭酸脱水酵素結晶（Ａ）及び結晶化リアクターから抽出した結晶（Ｂ）の像を示す図である。
【図１１】ペプシン−４結晶（Ｂ）の回折像（Ａ）の像を示す図である。
【図１２】クレアチンキナーゼ１結晶（Ａ）、β−ヒト成長因子結晶（Ｂ）及びアビジン結晶（Ｃ）の像を示す図である。
【図１３】ヘルセプチン（Ａ）及びＬｙ１リゾチーム（Ｂ）のタンパク質結晶を示す図である。
【図１４】リゾチーム結晶（Ａ）及びリボヌクレアーゼ−１結晶（Ｂ）の回折像を示す図である。
【図１５】プロスタグランジン結晶（Ａ）及びタンパク質結晶を含まない重合ＩＥＦバッファーからなる結晶化リアクター（Ｂ）の回折像を示す図である。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生体分子種と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得るステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が少なくとも１つの結晶化リアクター及び少なくとも１つの生体分子種をランニングバッファー中に置くステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）が生体分子結晶の形成を監視するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
結晶化が２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に起こる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの生体分子種がペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、化学成分を含むタンパク質複合体、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生体分子種がポリペプチド又はタンパク質から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の少なくとも１つの生体分子種を支持体上に固定する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの結晶化リアクターをキャピラリー内に与える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの結晶化リアクターを固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＥＦバッファーがポリマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマーが直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの結晶化リアクターが円筒形を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
円筒形が約２０μｍ〜約１０ｍｍの直径、及び約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの長さを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＥＦバッファーが０．２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＥＦバッファーが０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ランニングバッファーの温度を０〜３０℃の範囲内に維持する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
電場を５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間に維持する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
電場をＤＣ又はＡＣとして供給する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において複数の結晶化リアクターを提供し、それぞれの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含む、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＥＦバッファーが０．２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＥＦバッファーが０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数の結晶化リアクター中のＩＥＦバッファーが互いに異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
複数のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲が互いに部分的に重複する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｐＨ範囲が重複しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
１つ又は複数のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位を超えない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つ又は複数のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップが０．０２ｐＨ単位を超えない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
結晶化リアクターが互いに離れている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
複数の結晶化リアクターを、空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
支持体が生体分子不透過性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
支持体がイオン不透過性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
複数の結晶化リアクターを、固定化ｐＨ勾配ストリップ、ｐＨ膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）の前に少なくとも１つの生体分子種を含む溶液を選別するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
複数の生体分子を含む溶液を選別し少なくとも１つの生体分子種を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）複数の生体分子を含む媒体を提供するステップと、
（ｂ）支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも１つの生体分子種を含む支持体上に少なくとも１つの位置を得るステップと、
（ｃ）少なくとも１つの位置を含む部分を前記支持体から回収するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの生体分子のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｅ）（ｃ）の部分と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｆ）少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に、前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｇ）（ｆ）の前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得るステップと
を含む上記方法。
【請求項３６】
等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を含めた薄層クロマトグラフィー、及びゲル電気泳動からなる群から選択される方法によってステップ（ｂ）を行う、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法を非変性条件下で行う、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）中の選別が少なくとも１つの生体分子種の質量によるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｅ）が前記部分及び少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの生体分子種がタンパク質又はポリペプチドから選択される、請求項３５から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
結晶を２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に得る、請求項３５から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＩＥＦバッファーがポリマーを含む、請求項３５から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ｐＨ範囲が０．２ｐＨ単位を超えない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
ランニングバッファーの温度を０〜３０℃の範囲内に維持する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
電場が５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
電場をＤＣ又はＡＣとして供給する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）中の支持体がゲルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｂ）中の支持体がポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、ニトロセルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｄ）において複数のＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供し、それぞれのＩＥＦバッファーがｐＨ範囲を確定し、少なくとも１つのＩＥＦバッファーが少なくとも１つの生体分子のｐＩを含むｐＨ範囲を確定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
ｐＨ範囲が０．２ｐＨ単位を超えない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
狭いｐＨ範囲が０．０２ｐＨ単位を超えない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
複数のＩＥＦバッファーがポリマーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
複数のＩＥＦバッファーが部分的に重複するｐＨ範囲を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数のＩＥＦバッファーが重複しないｐＨ範囲を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
複数の結晶化リアクターが互いに離れている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
複数の結晶化リアクターを、空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
支持体が生体分子不透過性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
支持体がイオン不透過性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
複数の結晶化リアクターを、固定化ｐＨ勾配ストリップ、ｐＨ膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位を超えない、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップが０．０２ｐＨ単位を超えない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
生体分子結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
（ａ）上側及び下側を有するバッファー室であって、バッファー室が流体を保持することができる少なくとも１つのバッファー区画を囲うように下側が底部で封じられているバッファー室と、
（ｂ）少なくとも１つの結晶化リアクターであって、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも１つの結晶化リアクターと、
（ｃ）電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
（ｄ）少なくとも１つのバッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置。
【請求項６５】
成分（ｂ）が上側及び下側の２つの端部を有するホルダーであり、前記ホルダーが少なくとも１つの結晶化リアクターを含み、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、前記ホルダーがバッファー区画内に含まれる、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
２つの端部を有する２つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の１つの端部がホルダーの１つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の１つの端部が少なくとも１つのバッファー室内に含まれる、請求項６４に記載の装置。
【請求項６７】
２つのバッファー室を含み、それぞれのバッファー室が１つの塩橋の１つの端部を囲う、請求項６６に記載の装置。
【請求項６８】
ホルダーが少なくとも１つの結晶化リアクターを含むように適合させたキャピラリーである、請求項６５に記載の装置。
【請求項６９】
少なくとも１つの結晶化リアクターにおいて温度を管理することができる温度制御モジュールをさらに含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項７０】
成分（ｂ）が少なくとも１つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合させたホルダーを含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項７１】
ホルダーが少なくとも１つの空洞を含み、前記少なくとも１つの空洞を結晶化リアクターを含むように適合させた、請求項６５に記載の装置。
【請求項７２】
ホルダーが、それぞれの空洞が結晶化リアクターを含むように適合させた複数の空洞を有する、請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
空洞中の１つの結晶化リアクターの温度が、他の空洞中の他の結晶化リアクターの温度と異なる、請求項７２に記載の装置。
【請求項７４】
バッファー室が非導電性物質を含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項７５】
ホルダーが、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの抵抗より大きな抵抗を有する物質を含む、請求項６５に記載の装置。
【請求項７６】
非導電性物質が、ポリ−Ｎ−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレン、セラミック、ガラス及びポリ−メチル−メタクリレートからなる群から選択される、請求項７５に記載の装置。
【請求項７７】
ホルダーが生体分子に対して不透過性である材料を含む、請求項７０に記載の装置。
【請求項７８】
顕微鏡下での少なくとも１つの結晶化リアクターの検出用にさらに適合させた、請求項６４に記載の装置。
【請求項７９】
電場を生成させるためのデバイスが複数の電極を含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項８０】
複数の電極が、白金、チタン、クロム、金、タンタル、パラジウム、酸化パラジウム、ゲルマニウム、ニッケル及びロジウム又はこれらを含む合金からなる群から選択される金属を含む、請求項７９に記載の装置。
【請求項８１】
電場を生成させるためのデバイスがＤＣ又はＡＣ電流を供給する、請求項６４に記載の装置。
【請求項８２】
バッファー区画が、ランニングバッファー及び前記ランニングバッファーによって溶解した少なくとも１つの生体分子を含む溶液を保持するように適合された、請求項６４に記載の装置。
【請求項８３】
小型化された、請求項６４に記載の装置。
【請求項８４】
さらに自動化された、請求項８３に記載の装置。
【請求項８５】
生体分子が、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、化学成分を含むタンパク質複合体、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される、請求項６４に記載の装置。
【請求項８６】
生体分子がタンパク質である、請求項８５に記載の装置。
【請求項８７】
結晶化が２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に起こる、請求項６４に記載の装置。
【請求項１】
生体分子を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）少なくとも１つの生体分子種を提供するステップと、
（ｂ）少なくとも１つの生体分子種のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｃ）前記少なくとも１つの生体分子種と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｄ）前記少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｅ）前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得るステップと
を含む上記方法。
【請求項２】
ステップ（ｃ）が少なくとも１つの結晶化リアクター及び少なくとも１つの生体分子種をランニングバッファー中に置くステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｅ）が生体分子結晶の形成を監視するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
結晶化が２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に起こる、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１つの生体分子種がペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、化学成分を含むタンパク質複合体、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
生体分子種がポリペプチド又はタンパク質から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の少なくとも１つの生体分子種を支持体上に固定する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの結晶化リアクターをキャピラリー内に与える、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つの結晶化リアクターを固体支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ＩＥＦバッファーがポリマーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ポリマーが直鎖ポリマー、分岐ポリマー、ポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つの結晶化リアクターが円筒形を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
円筒形が約２０μｍ〜約１０ｍｍの直径、及び約０．５ｍｍ〜約１０ｍｍの長さを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＩＥＦバッファーが０．２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＩＥＦバッファーが０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ランニングバッファーの温度を０〜３０℃の範囲内に維持する、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
電場を５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間に維持する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
電場をＤＣ又はＡＣとして供給する、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｂ）において複数の結晶化リアクターを提供し、それぞれの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含む、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＩＥＦバッファーが０．２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＩＥＦバッファーが０．０２ｐＨ単位を超えないｐＨ範囲を有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
複数の結晶化リアクター中のＩＥＦバッファーが互いに異なる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
複数のＩＥＦバッファーのｐＨ範囲が互いに部分的に重複する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ｐＨ範囲が重複しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
１つ又は複数のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位を超えない、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
１つ又は複数のＩＥＦバッファーの間のｐＨステップが０．０２ｐＨ単位を超えない、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
結晶化リアクターが互いに離れている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
複数の結晶化リアクターを、空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
支持体が生体分子不透過性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
支持体がイオン不透過性である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
複数の結晶化リアクターを、固定化ｐＨ勾配ストリップ、ｐＨ膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
ステップ（ａ）の前に少なくとも１つの生体分子種を含む溶液を選別するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
複数の生体分子を含む溶液を選別し少なくとも１つの生体分子種を急速に結晶化するための方法であって、
（ａ）複数の生体分子を含む媒体を提供するステップと、
（ｂ）支持体上の複数の生体分子を選別し、それによって少なくとも１つの生体分子種を含む支持体上に少なくとも１つの位置を得るステップと、
（ｃ）少なくとも１つの位置を含む部分を前記支持体から回収するステップと、
（ｄ）少なくとも１つの生体分子のｐＩを含むｐＨ範囲を有するＩＥＦバッファーを含む、少なくとも１つの結晶化リアクターを提供するステップと、
（ｅ）（ｃ）の部分と少なくとも１つの結晶化リアクターを接触させるステップと、
（ｆ）少なくとも１つの結晶化リアクターに電場を導入し、それによって前記少なくとも１つの結晶化リアクター内に、前記少なくとも１つの生体分子種の濃縮溶液を生成するステップと、
（ｇ）（ｆ）の前記少なくとも１つの結晶化リアクター内で少なくとも１つの結晶を得るステップと
を含む上記方法。
【請求項３６】
等電点電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）技術を含めた薄層クロマトグラフィー、及びゲル電気泳動からなる群から選択される方法によってステップ（ｂ）を行う、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法を非変性条件下で行う、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ステップ（ｂ）中の選別が少なくとも１つの生体分子種の質量によるものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
ステップ（ｅ）が前記部分及び少なくとも１つの結晶化リアクターをランニングバッファー中に置くステップをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
ランニングバッファーを攪拌するステップをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの生体分子種がタンパク質又はポリペプチドから選択される、請求項３５から４０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
結晶を２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に得る、請求項３５から４１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＩＥＦバッファーがポリマーを含む、請求項３５から４２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
ｐＨ範囲が０．２ｐＨ単位を超えない、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
ランニングバッファーの温度を０〜３０℃の範囲内に維持する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
電場が５０Ｖ／ｃｍと２０００Ｖ／ｃｍの間である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
電場をＤＣ又はＡＣとして供給する、請求項３５に記載の方法。
【請求項４８】
ステップ（ｂ）中の支持体がゲルである、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ｂ）中の支持体がポリアクリルアミド、アガロース、ヒドロゲル、セルロース、ニトロセルロース、修飾セルロース、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリエチレンオキシド及びグリコールポリマーからなる群から選択されるポリマーを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５０】
ステップ（ｄ）において複数のＩＥＦバッファーを含む複数の結晶化リアクターを提供し、それぞれのＩＥＦバッファーがｐＨ範囲を確定し、少なくとも１つのＩＥＦバッファーが少なくとも１つの生体分子のｐＩを含むｐＨ範囲を確定する、請求項３５に記載の方法。
【請求項５１】
ｐＨ範囲が０．２ｐＨ単位を超えない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
狭いｐＨ範囲が０．０２ｐＨ単位を超えない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
複数のＩＥＦバッファーがポリマーを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
複数のＩＥＦバッファーが部分的に重複するｐＨ範囲を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数のＩＥＦバッファーが重複しないｐＨ範囲を有する、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
複数の結晶化リアクターが互いに離れている、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
複数の結晶化リアクターを支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
複数の結晶化リアクターを、空間的に接触可能な方法で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
支持体が生体分子不透過性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
支持体がイオン不透過性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
複数の結晶化リアクターを、固定化ｐＨ勾配ストリップ、ｐＨ膜及びプレキャストゲルからなる群から選択される形態で支持体と連結、接合、又は実質的に接触させる、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップが０．１ｐＨ単位を超えない、請求項５０に記載の方法。
【請求項６３】
１つ又は複数のＩＥＦバッファー間のｐＨステップが０．０２ｐＨ単位を超えない、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
生体分子結晶の急速な形成を誘導するのに適した装置であって、
（ａ）上側及び下側を有するバッファー室であって、バッファー室が流体を保持することができる少なくとも１つのバッファー区画を囲うように下側が底部で封じられているバッファー室と、
（ｂ）少なくとも１つの結晶化リアクターであって、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがバッファー室内に含まれる少なくとも１つの結晶化リアクターと、
（ｃ）電場を生成させるためのデバイスと、場合によって、
（ｄ）少なくとも１つのバッファー区画内に含まれる流体を循環させるための手段と
を含む上記装置。
【請求項６５】
成分（ｂ）が上側及び下側の２つの端部を有するホルダーであり、前記ホルダーが少なくとも１つの結晶化リアクターを含み、前記少なくとも１つの結晶化リアクターがＩＥＦバッファーを含み、前記ホルダーがバッファー区画内に含まれる、請求項６４に記載の装置。
【請求項６６】
２つの端部を有する２つの塩橋をさらに含み、それぞれの塩橋の１つの端部がホルダーの１つの端部と接触しており、それぞれの塩橋の１つの端部が少なくとも１つのバッファー室内に含まれる、請求項６４に記載の装置。
【請求項６７】
２つのバッファー室を含み、それぞれのバッファー室が１つの塩橋の１つの端部を囲う、請求項６６に記載の装置。
【請求項６８】
ホルダーが少なくとも１つの結晶化リアクターを含むように適合させたキャピラリーである、請求項６５に記載の装置。
【請求項６９】
少なくとも１つの結晶化リアクターにおいて温度を管理することができる温度制御モジュールをさらに含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項７０】
成分（ｂ）が少なくとも１つの結晶化リアクターを含む支持体を支持するように適合させたホルダーを含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項７１】
ホルダーが少なくとも１つの空洞を含み、前記少なくとも１つの空洞を結晶化リアクターを含むように適合させた、請求項６５に記載の装置。
【請求項７２】
ホルダーが、それぞれの空洞が結晶化リアクターを含むように適合させた複数の空洞を有する、請求項７１に記載の装置。
【請求項７３】
空洞中の１つの結晶化リアクターの温度が、他の空洞中の他の結晶化リアクターの温度と異なる、請求項７２に記載の装置。
【請求項７４】
バッファー室が非導電性物質を含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項７５】
ホルダーが、結晶化リアクター内に含まれるポリマーの抵抗より大きな抵抗を有する物質を含む、請求項６５に記載の装置。
【請求項７６】
非導電性物質が、ポリ−Ｎ−メチルメタクリルアミド、アクリル、ルサイト、ポリスチレン、セラミック、ガラス及びポリ−メチル−メタクリレートからなる群から選択される、請求項７５に記載の装置。
【請求項７７】
ホルダーが生体分子に対して不透過性である材料を含む、請求項７０に記載の装置。
【請求項７８】
顕微鏡下での少なくとも１つの結晶化リアクターの検出用にさらに適合させた、請求項６４に記載の装置。
【請求項７９】
電場を生成させるためのデバイスが複数の電極を含む、請求項６４に記載の装置。
【請求項８０】
複数の電極が、白金、チタン、クロム、金、タンタル、パラジウム、酸化パラジウム、ゲルマニウム、ニッケル及びロジウム又はこれらを含む合金からなる群から選択される金属を含む、請求項７９に記載の装置。
【請求項８１】
電場を生成させるためのデバイスがＤＣ又はＡＣ電流を供給する、請求項６４に記載の装置。
【請求項８２】
バッファー区画が、ランニングバッファー及び前記ランニングバッファーによって溶解した少なくとも１つの生体分子を含む溶液を保持するように適合された、請求項６４に記載の装置。
【請求項８３】
小型化された、請求項６４に記載の装置。
【請求項８４】
さらに自動化された、請求項８３に記載の装置。
【請求項８５】
生体分子が、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、酵素、抗体、タンパク質−ＤＮＡ複合体、化学成分を含むタンパク質複合体、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗原、抗原エピトープ及びその変異体、ホルモン、炭水化物、脂質、リン脂質並びにビオチン化プローブからなる群から選択される、請求項６４に記載の装置。
【請求項８６】
生体分子がタンパク質である、請求項８５に記載の装置。
【請求項８７】
結晶化が２４時間以内、好ましくは１２時間未満以内に起こる、請求項６４に記載の装置。
【図２】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図４】
【図５】
【図３】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図４】
【図５】
【公表番号】特表２００７−５０４２１５（Ｐ２００７−５０４２１５Ａ）
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−５２５２６３（Ｐ２００６−５２５２６３）
【出願日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００７９４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１８４１
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０６０７５２０７）バイオフォームズ (1)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成１９年３月１日（２００７．３．１）
【国際特許分類】
【出願日】平成１６年９月２日（２００４．９．２）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＩＬ２００４／０００７９４
【国際公開番号】ＷＯ２００５／０２１８４１
【国際公開日】平成１７年３月１０日（２００５．３．１０）
【出願人】（５０６０７５２０７）バイオフォームズ (1)
【Ｆターム（参考）】
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