生体標本の処理方法及び解析方法
【課題】生体標本中の個々の細胞ごとに標的物質を位置精度よく分析するための前処理として、生体標本内の標的物質の位置情報を保持したまま、試薬および反応生成物を固定するための生体標本の処理方法、および解析方法を提供すること。
【解決手段】細胞または組織を含む生体標本上に多孔質体によって構成される薄膜を接触させ、該薄膜の非接触面側より、インクジェットで標本の特定の領域に試薬溶液を供給することにより、前記生体標本表面内の細胞レベルでの領域内に限定して前記試薬の供給、保持および反応生成を行う生体標本の試薬処理方法。さらに、生体標本の画像情報を読み取り位置情報を記録し、当該画像情報に合わせて特定の領域に上記試薬処理方法を行った後、顕微鏡観察または質量分析によって解析する、生体標本の解析方法。
【解決手段】細胞または組織を含む生体標本上に多孔質体によって構成される薄膜を接触させ、該薄膜の非接触面側より、インクジェットで標本の特定の領域に試薬溶液を供給することにより、前記生体標本表面内の細胞レベルでの領域内に限定して前記試薬の供給、保持および反応生成を行う生体標本の試薬処理方法。さらに、生体標本の画像情報を読み取り位置情報を記録し、当該画像情報に合わせて特定の領域に上記試薬処理方法を行った後、顕微鏡観察または質量分析によって解析する、生体標本の解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学、病理学、生化学等の医学・生物学分野に属し、特に生物標本に試薬を添加し反応させる方法及び反応産物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）解析の進展により、生体内に存在する遺伝子産物であるタンパク質の解析の重要性が急速にクローズアップされてきている。中でも、組織切片におけるタンパク質解析の重要性が指摘されている。例えば、癌組織切片から再発や転移に関わるタンパク質を明らかにするといった試みが数多くなされている。細胞、組織等の生体標本表面のタンパク質を解析する手段としては、顕微鏡観察が多く用いられる。この場合、標的のタンパク質等を同定する目的においては、特異抗体を介して標的の物質を標識し、その標識の発色、発光、蛍光等を検出するという方法が用いられてきた。近年では、例えば特開２００１−２４９１２５号公報に記載されているように、試料切片に直接レーザー照射してマススペクトルを得る方法も提示されている。また、生体標本表面を直接処理する手段として、特開２００４−３４７５９４号公報に記載されているように、インクジェット法で量、位置を制御した試薬を生体標本に直接付与し、生体標本の解析をおこなっている。さらに、生体標本におけるタンパク質等の、細胞レベルでの微細な二次元分布の可視化を目的とした、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法（飛行時間型二次イオン質量分析法）をベースとする情報取得手法及び装置が国際公開第２００５／００３７１５号パンフレットに開示されている。この手法では、インクジェット法などを用い、イオン化促進物質および／または消化酵素を上記の生体標本に直接付与したのち、その位置情報を保持したまま、サブミクロンメートルでの高空間分解能を持つＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を行う。これにより、反応生成物におけるタンパク質の種類に関する情報（消化酵素により限定分解されたペプチドの情報を含む）を可視化することができる。
【特許文献１】特開２００１−２４９１２５号公報
【特許文献２】特開２００４−３４７５９４号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／００３７１５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特開２００４−３４７５９４号公報および、国際公開第２００５／００３７１５号パンフレットに記載の方法では、ある生体標本内における反応生成物分布などの情報を取得できる。しかし、１つの細胞サイズ径（１０μｍ）以内の分布といった、より微細なレベルでの二次元分布情報を得るためには、インクジェットの滴下手法に改善が必要である。それは、試薬を供給するインクジェットの液滴量が、通常１ｐｌ〜１００ｐｌと微量でありながら、このとき生体標本上に滴下された際のドットサイズ径は１０μｍから１０００μｍに渡る大きさになる。そのため、通常の１つの細胞径以内での情報取得を目的とした際、試薬の拡散、流出による分布の拡大化、または、試薬の蒸発による反応条件の低下などの問題が生じる。したがって、１つの細胞サイズ径以内での二次元分布情報を得たい場合には、試薬を生体標本上のより微小な領域に個別に付与し、液滴の拡散および蒸発を極力抑えて、反応が終わるまでのある一定の時間試薬を保持する必要がある。このような生体標本の分析において、癌細胞など特定の病変細胞中のタンパク質、或いは癌細胞に隣接する細胞中のタンパク質での、試料および反応生成物の２次元分布をより精度良く解析できれば、診断デバイスや創薬デバイスの開発に寄与できると考えられる。
【０００４】
そこで本発明は、生体標本内の特定の構造またはその構成分子を生体標本中の個々の細胞ごとに、位置精度よく分析することを目的とし、その前処理として、生体標本内の特定の構造またはその構成分子の位置情報を細胞レベルで保持したまま、試薬および反応生成物を固定するための生体標本の処理方法、および解析方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討した結果、インクジェット技術と多孔質体によって構成される薄膜の併用により上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の第一の方法は、細胞または組織を含む生体標本上に、多孔質体によって構成される薄膜を接触させる工程と、
該薄膜の非接触面側にインクジェットで少なくとも１種類以上の試薬を含む溶液を吐出し、該溶液を該薄膜の細孔を通じて前記生体標本の特定の領域に供給する工程と、を有し、
前記多孔質体の細孔の径が前記生体標本に含まれる細胞の径より小さいことにより、細胞レベルで区別して試薬を供給することを可能とする、生体標本への試薬供給方法である。
【０００７】
本発明の第二の方法は、本発明の第一の方法により生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給し、
さらに、前記試薬溶液を前記特定の領域に保持して反応生成を行う工程を有する、
細胞レベルで区別して試薬処理することを可能とする、生体標本の試薬処理方法である。
【０００８】
本発明の第三の方法は、本発明の第二の方法により生体標本の特定の領域を処理し、
さらに、試薬処理した特定の領域を顕微鏡観察または質量分析によって解析する工程を有する、
細胞レベルでの標的物質の位置情報の解析を可能とする、生体標本の解析方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生体標本上の任意の位置に、細胞１つのサイズ径に匹敵する１０μｍ以内の領域に限局して試薬を供給するとともに、その領域内での特定の構造またはその構成分子の位置情報を細胞単位で保持したまま、一定時間の試薬の供給および保持による十分な反応生成をさせる試薬処理方法を提供することができる。さらに試薬処理方法を用いた生体標本の解析方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においては、生体標本の特定の領域に対し、インクジェット法による試薬溶液の供給を行うことによって、多孔質体によって構成される薄膜を通しての分配をおこなう。多孔質体を通して生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給することによって、生体標本に含まれる細胞または組織中の、特定の構造及びその構成分子に、それらの位置情報を維持したまま試薬が分配、保持される。当該特定の構造の構成分子を標的物質とすることができる。このように、液滴を供給することによる試薬の分配を、分注と記載する。位置情報を維持するとは、試薬の分注後、あるいはそれに続く反応生成後における特定の構造またはその構成分子の位置情報が分注前の、あるいは生存時の位置情報と実質的に同じであることをいう。少なくとも特定の構造または標的物質が含まれる細胞または組織の範囲内で位置情報が維持されることが好ましく、標的物質が含まれる細胞内の特定の構造の範囲内で維持されることがさらに好ましい。細胞または組織中の特定の構造またはその構成分子の位置情報を解析する場合は、標的物質には特定の構造を構成する分子、好ましくは特定の構造に特徴的な分子、さらに好ましくは特定の構造に特異的に存在する分子を好適に用いることができる。
【００１１】
特定の構造とは例えば癌組織または癌細胞に特有に形成される構造であってもよく、これらの構造の構成分子、例えばタンパク質、脂質等を含み、好ましくは特定の構造に特異的である構成分子、例えば癌特異的抗原等を含む。癌に限らず、あらゆる病気、疾患等の病理的組織もしくは細胞についても本発明の対象となることはいうまでもない。
【００１２】
また、本発明においては、インクジェット法を用いて、多孔質体を通しての試薬の分注による反応生成を行う（図１）ことにより、生体標本を試薬処理したうえで、好ましくは標的物質を認識化する試薬により標的物質を認識可能な形態にしたうえで、解析することができる。これには顕微鏡観察や質量分析による方法等が用いられる。
【００１３】
本発明における生体標本は、固相化処理を受けていない生物の細胞または組織を含んでいる。細胞または組織は、生体内における微細構造をそのまま保持した状態のものを用いることができる。このような状態を得るために、細胞または組織が適当な包埋剤によって包埋されたものを用いることができる。生体内における微細構造を保持した生体標本を用いることができるため、本発明の方法によって解析することができる標的物質の局在は、生体内におけるのと同じものとして形態学的に検証することができる。前記生体標本は、ガラス製支持体、樹脂製支持体、金属製支持体等の支持体の表面に固着させて使用するか、または電気的にメンブレンに転写させて使用することができる。これらの標本は、必要に応じ、定法による染色、洗浄、脱塩等の前処理を行う。
【００１４】
本発明における多孔質体で構成される薄膜は、生体標本に接触させて用いられ、前記多孔質体の細孔には少なくとも１種類以上の試薬が供給される。本発明における多孔質体の役割は、細孔内に含まれる試薬を位置精度良く生体組織に接触させ、一定時間の液滴保持による十分な反応生成を促進することにある。
【００１５】
前記試薬は、生体標本に使用される際には、液体の状態で使用される。よって、多孔質体の材料には、耐水性を有し、試薬の反応性を阻害しにくい材料を用いればよく、また、このような材料で多孔質体の表面が被膜されているものでも構わない。例示すると、有機材料、無機材料、金属、金属酸化膜、セラミックスなどが挙げられるが、これに限るものではない。さらには、多孔質体の細孔表面（細孔内壁）は、親水性であることが好ましい。親水性にすることにより、液体の導入、保持が容易となり、酵素水溶液状態での使用に好適である。
【００１６】
また、前記多孔質体の細孔径は、生体標本に含まれる細胞の径より小さいことが好ましい。よって、多孔質体の細孔径は、１０ｎｍから１０μｍの間であることが好ましい。細孔径が１０ｎｍより小さい場合は、試薬溶液を細孔内部に保持および通過させることが難しいといった問題が生じる可能性がある。そして、細孔径が１０μｍを越える場合は、細胞サイズに対して細孔径が同等以上になり、複数の細胞にまたがった試薬反応が生じる可能性が高くなる。その結果、細胞単位での位置情報を維持して解析する上で、精度が低くなってしまう可能性がある。細孔の径が深さ方向で一定でない場合は、少なくとも生体標本との接触面での細孔径が１０μｍ以下であることが望ましく、このような例として半円錐状の細孔（円錐先端側が接触面）や球状の細孔（図２−Ｅ参照）等が挙げられる。より好ましい細孔径は、試薬溶液を細孔に注入することを考慮すれば、１μｍから１０μｍの間である。
【００１７】
多孔質体の細孔構造は、試薬溶液を位置精度良く生体標本に分注できる構造であれば特に限定されるものではない。つまり、多孔質体の上面（前記上面とは、本発明において生体標本が接触する側と逆の面を称する。）から生体標本の接触面に至るまで貫通していればよく、いかなる構造も使用可能である。例えば、図２（Ａ）のように連続的な網目状構造であっても、十分に密な構造であったり、多孔質体の厚さが充分薄い形状であったりすれば、試薬溶液が、多孔質体内において２次元平面方向に拡がり過ぎる前に、試薬溶液を分注、反応させることが可能である。さらには、細孔構造は細孔が独立に存在する構造であることがより好ましい。図２（Ｂ）のように、各細孔が連結せずに独立に存在すれば、さらに２次元平面方向への拡がりを抑え位置情報の精度を上げることが可能である。さらには、図２（Ｃ）のように、細孔構造が、生体標本との接触面に対して略垂直であることが望ましい。垂直孔であれば、試薬溶液の到達時間も速く、また位置情報の精度もさらに上げることができる。
【００１８】
多孔質体によって構成される薄膜の厚さは、試薬溶液を精度良く分注できる範囲であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、１μｍから１０μｍの範囲にあることである。該膜が薄すぎると、試薬反応後、生体標本より除去する際に膜の一部が生体標本表面に残る可能性が高まり、厚すぎると、多孔質体の貫通方向性のズレにより、位置精度の低下が生じることに注意する必要がある。
【００１９】
多孔質体によって構成される薄膜の大きさは、上述のように生体標本上の分析目的とする領域に効率良く接触させることができれば特に限定されない。薄膜の接触、および、除去の作業効率を考慮して、該生体標本の大きさより５ｍｍ程度大きめに用意することが望ましい。
【００２０】
以上説明したような多孔質体によって構成される薄膜は、一般的なパターニング技術により形成することが可能である。例えば、フォトリソグラフィー、電子線リソグラフィー、Ｘ線リソグラフィー等のいわゆる半導体加工技術や、レーザー加工技術、機械加工技術等をもちいることが可能である。さらには、これらトップダウン方式の技術以外の方法も用いることができる。例えばポリマーや、無機物の相分離を利用して微細なパターンを形成する技術、金属の陽極酸化により細孔を形成する技術あるいは水滴や界面活性剤ミセル等鋳型を利用して細孔を形成する技術等、種々の方法を用いることが可能となる。また、図２（Ｄ）のように微粒子等の凝集体を多孔質体として用い、その粒界の空間を細孔として使用することも可能である。逆に、図２（Ｅ）のように、球状の細孔を持つ多孔質体を使用することも可能である。
【００２１】
上述のようにして用意した生体標本上の特定の領域に対し、試薬溶液を分注する。本発明においては、分注方法としてインクジェット法を用い、試薬溶液の微小滴を前記特定の領域に供給し付着させる。本発明において用いるインクジェット法の機構としては、例えば機械的加圧パルス方式（ピエゾ）を利用したピエゾジェット法および、電気熱変換体による膜沸騰方式（バブルジェット）等を用いることができるが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の分注方法においては、インクジェット法を用いることにより、極微量の試薬を吐出することが可能となる。このとき、１個のインクジェット吐出部からの１回の吐出につき供給される試薬量（１液滴分の量）を例えば数ｐｌ程度に制御することができるが、インクジェットの機構によっては、さらに少ない量に制御することもできる。また、吐出を繰り返すことができるため、試薬を連続的に供給することが可能であり、このことからも分注する量の上限は特に限定されない。特定の１つの領域に対しては、例えばナノリットルレベル、通常１００ｎｌ程度の試薬量を分注することができる。インクジェット吐出部が複数の吐出口を有し、同時に複数の液滴を吐出することにより特定の領域に試薬を供給する態様も本発明に含まれる。複数の液滴を重ね打ちすることにより、試薬の種類、濃度および吐出量をコントロールして処理することが可能である。
【００２３】
適度な時間間隔での連続供給により、試薬の蒸発による損失を防ぎ、好適な反応条件を維持することが可能である。また、このようにして、抗体溶液等、希少かつ高価な試薬であっても必要最低限の使用量しか消費しないため、大幅なコストダウンを図ることができる。
【００２４】
本発明においては、例えば１ｐｌ程度の吐出によって直径１０μｍ程度の極小の分注範囲を生じる。この極小の分注範囲を用いることにより、細胞の１つ１つを区別して、特定の細胞の範囲に位置する細孔への分注が可能となる。インクジェットの機構によってさらに小さい範囲に限局することもできる。細胞を区別して試薬処理するためには細孔間で試薬が混合しないことが望ましく、そのために分配される試薬は細孔間で分離されるように注入量を設定する必要がある。
【００２５】
また、同一生体標本上に特定の領域を２つ以上設定することも可能である。従って、同一生体標本上でも異なる領域で別種の試薬溶液を添加することが可能になり、複数種の解析を行うことが可能になる。
【００２６】
さらに、試薬付与前に予め生体標本の画像情報を読み取り位置情報を記録しておき、画像情報から特定の領域を選択し、記録された特定の領域に自動的に試薬を供給させることができる。例えば、光学顕微鏡により画像情報を読取り、位置情報を記録する機構と、記録された位置情報に基づいて特定の領域にインクジェット吐出を指示するプログラムとを用いる、そして、これらと連動可能な、または一緒にシステムを構成する公知のインクジェット装置とを用いて自動化が可能である。位置情報を記録する機構は、さらに解析の際に標的物質の位置情報を取得することも可能とし、これらの位置情報より標本内での標的物質の局在などの解析を行ってもよい。
【００２７】
本発明においては、上述のように極少量の試薬溶液を生体標本上の極小の領域に供給、保持することができるため、従来のようにサンプル上に物理的な区画を構築する等の必要がない。このため、作業時間を低減することができるとともに区画の構築等によるサンプルの損傷を避けることができる。
【００２８】
本発明においては、生体標本中の特定の組織もしくは細胞に含まれる分子、好ましくは特定の組織もしくは細胞を特定することができる分子、さらには組織もしくは細胞中の特定の分子等を標的物質とすることができる。例えば、抗原（ハプテンを含む）、抗体及び酵素等を標的物質とすることができる。そして、これらの物質を含め、一般的にタンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等を標的物質とすることができる。本発明における試薬としては、生体標本中の標的物質を認識可能な形態にすること（認識化）によって、その局在を検出することができるものを用いると良いがこれに限定されない。これらの試薬により、標的物質の組織もしくは細胞における局在を検出することが可能であり、標的物質が特定の組織もしくは細胞に特異的な分子であれば、試薬が生体標本内での当該組織もしくは細胞の局在を検出する指標となる。なお、認識可能とは、可視化や質量分析等によって検出することができることをいう。
【００２９】
本発明においては、前記試薬として、標的物質と化学反応する化合物や、標的物質と特異的に結合する物質を用いて、直接的又は間接的に認識化することができる。標的物質と化学反応する化合物としては、標的物質の化学的性質に応じて発色、発光、蛍光等の常法によって検出することができるものを特に限定されることなく用いることができる。
【００３０】
標的物質と特異的に結合する物質としては、生体物質でも合成物でも良い。前記生体物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等を挙げることができ、これら生体物質が有する特異的な結合能を利用することができる。すなわち、抗原とそれに対応する抗体、酵素とそれに対応する基質、核酸とそれに対応する核酸等の特異的結合を利用することができる。従って、前記標的物質と特異的に結合する物質は、例えば、抗体、抗原、酵素等として用いることができる。前記合成物としては、これら生体物質が有する機能と同様又は類似の結合能を有する、有機化合物や金属錯体等の類似化合物を用いることができる。類似化合物は、前記生体物質と構造において類似したものだけでなく、前記生体物質の特異的結合能としての機能において同様又は類似したものも含まれる。そのような類似化合物としては、前記生体物質の修飾体や、酵素モデル等が挙げられる。また、認識化の方法によっては、これら標的物質と特異的に結合する物質は、標識が導入されたものであっても良い。すなわち、標識物質によって標識された標識体や、標識物質との複合体であっても良い。
【００３１】
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が抗原（ハプテンを含む）である場合、認識化のために免疫組織化学的手法を用いることができる。抗原としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等が挙げられる。免疫組織化学的手法としては、常法を用いることができる。すなわち、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属抗体法、放射線同位元素抗体法等を特に限定されることなく用いることができる。また、これら方法においては、標識抗体法及び非標識抗体法、さらには直接抗体法及び間接抗体法を問わない。従ってこの場合、本発明における試薬としては、タンパク質、ペプチド、又はこれらに標識物質が導入されたもの等、すなわち一次抗体、二次抗体等が挙げられる。さらにこれら抗体に対して染色等の可視化を行う場合は染色剤等も挙げられる。
【００３２】
標識物質としては、蛍光物質、酵素、重金属含有物質、放射線同位元素含有化合物、その他の化合物等を挙げることができる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等が挙げられる。酵素としては、エンドペプチターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ等が挙げられる。特に、エンドペプチターゼ酵素を用いたタンパク質分子の分解処理方法は、ＭＡＬＤＩまたはＴＯＦ−ＳＩＭＳなどのイオン質量分析法と併用して用いると、より有効に生体標本中のタンパク質位置情報を得られる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法等のイオン質量分析法により解析する場合はさらに、増感物質を本発明の方法により付与することができる。増感物質とは生体標本表面のタンパク質を構成するペプチド鎖に作用して二次イオン種の生成を推進させるものを指す。増感物質としては、例えば、金属錯体、金属塩化合物を均一に溶解した水溶液、硝酸銀水溶液などが挙げられる。
【００３３】
重金属含有物質としては、フェリチン、金コロイド等が挙げられる。その他の化合物としては、酵素モデル等が挙げられる。また、標識物質としてビオチンを用いることもできる。さらにこれに伴い、標識されたビオチンとアビジンとの複合体や標識されたストレプトアビジンを試薬として用いることができる。
【００３４】
上記例示した試薬は、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３５】
なお、生体標本の標的物質の認識化は、前記抗体又は抗体に導入された標識物質に対応した方法で行う。具体的には、発色、発光、蛍光、放射性同位元素の存在等を検出することによって行う。認識化された生体標本の標的物質は、顕微鏡観察又は質量分析によって解析する。
【００３６】
顕微鏡観察を行う場合は、例えば酵素に対しては、それに応じた適当な基質溶液を分注した上で発色法や発光法によって可視化し、光学顕微鏡で観察することができる。蛍光物質に対しては、適当な励起光を照射して蛍光を得る方法によって可視化し、蛍光顕微鏡やレーザー顕微鏡によって観察することができる。重金属含有物質に対しては、照射光の散乱によって可視化し、電子顕微鏡によって観察することができる。放射性同位元素に対しては、オートラジオグラフィー法によって可視化して観察することができる。
【００３７】
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が酵素である場合、認識化のために酵素組織化学的手法を用いることができる。この場合、前記試薬としては、標的物質である酵素に応じた適当な基質を用い、常法によって標的物質の酵素を認識化することができる。
【００３８】
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）である場合、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法を用いることができる。この場合、試薬としては、標的となる遺伝子を含む核酸とハイブリッド形成することができるＤＮＡプローブの標識体を用い、常法によって標的物質の核酸を認識化することができる。標識体の標識物質としては、免疫組織化学的手法において例示したものを含め、当業者が適宜定めると良い。
【００３９】
質量分析を行う場合は、例えば、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法やレーザー脱離イオン化質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）法を用いることができる。ＬＤＩ−ＭＳ法の場合、認識化された標的物質に対して例えば以下の操作を行う。まず、必要に応じて消化等の処理を行う。消化においては、例えば、トリプシンなどのタンパク質消化酵素溶液を添加し、湿潤条件下にてインキュベートする。このように必要に応じ処理された標的物質に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。あるいは、前記必要に応じ処理された標的物質に対し、必要に応じてマトリクス溶液を重ねて分注し、その分注位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。本発明においては、微小な範囲に限定して分注を行うため、このときに得られるマススペクトルにおいては、特定の領域以外からの不必要なシグナル、すなわちバックグラウンドを低減することができる。また、マトリクス溶液の分注及びレーザー照射を、試料上の一点の位置のみでなく、一定の範囲にわたって繰り返し行うことによって、特定の細胞又は組織の、質量分布に基づいたイメージング（２次元分布状態の検出）が可能になり、生体標本上で標的物質のマッピングができる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法の場合、質量スペクトル分析およびイメージング方法は、特開２００４−０８５５４６号公報及び国際公開第２００５／００３７１５号パンフレットに開示された実施形態等を用いて行うことができる。これらの方法に従うと検出対象とするタンパク質分子が複数である場合も解析が可能である。
【００４０】
なお質量分析による解析は、認識化していない標的物質についても行うことが可能である。例えば、本発明の試薬処理が特定の組織もしくは細胞を標的物質以外の指標物質により識別する反応であり、該試薬処理後に標的物質についての質量分析を行うことにより、標的物質と特定の組織や細胞とを関連させ解析することができる。例えば、本発明の試薬処理方法により、ある種の癌を特異的に検出する標識化した抗体を標本に付与して反応させ、抗体の標識を検出して癌組織または細胞の位置情報を取得した後、質量分析により癌領域と正常な領域を比較して検出される物質の解析を行うことができる。
【００４１】
上述のように本発明によると、生体標本上の微小な区画のみに限定して試薬を分注するため、従来法に比べ使用する試薬の消費量を大幅に減らすことができる。また解析対象となる生体標本は病理組織標本等希少なものが多く想定されるが、同一検体上で複数種の解析が可能になるので、生体標本をより有効に活用できる。さらに、質量分析に導入するときは、試薬を分注した領域以外からのシグナルすなわちバックグラウンドの低減が期待できる。
【実施例】
【００４２】
以下に、組織切片サンプルにおける微細な領域をＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により解析する例を示す。サンプルの調製にあたりマウス脳凍結切片を作製し、これをシリコン基板上に固定する。
【００４３】
さらにこの切片試料をＤｉｒｅｃｔ Ｂｌｕｅ ７１により染色し、フォトリソグラフィーによりフォトレジストを材料とした多孔質体（垂直細孔、平均細孔径３μｍ、細孔間隔６μｍ）によって構成される薄膜を作製し、この切片試料生体標本上に密着するように接触させる。
【００４４】
光学顕微鏡で標的とする病変細胞上の多孔質体細孔の位置を確認した後、消化酵素としてトリプシン１０μｇ／ｍＬを混合し溶解したリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を、インクジェットヘッドリザーバーに入れ、インクジェットにより、標的となる病変細胞を含む領域の細孔位置に４ｐｌずつ分注する（図３（ａ）参照）。このとき、消化酵素１滴が形成する領域の径はおよそ３０μｍとなるので、領域が重なるようにして滴下してサンプル全体を覆うようにする。乾燥によって酵素溶液が消失しないように適度な量の分注を続け、所定時間経過後、細孔中の水分および、低分子混合成分を蒸発させたのち、生体標本上の多孔質体薄膜をはがして除去する。これにより、表面に消化分解されて形成される断片ペプチドが付着した生体標本試料を得ることができ、その分解生成物をＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析によって検出する。なお、この測定において様々なタンパク質、ペプチドの分解生成物が検出されるが、消化酵素で限定分解された分解物のイオン種から、分解前のタンパク質を特定するには開示されているプロテオーム解析結果（各種データベース）を利用することにより、特定のタンパク質、または、ペプチド由来の断片ペプチドを見つけることができる。
【００４５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析後、前記の断片ペプチドの質量シグナルを選択してイメージングすると、図３（ｂ）のように、特定の、多孔質体の細孔の位置に前記シグナルが検出され、分解前の目的タンパク質が存在する位置を特定することができる。ここに示した方法を利用すると生体標本の構成物の分布状態を細胞レベルで把握可能となり、細胞レベルでの分布状態に基づいて、測定対象とした標本に悪性の癌であるか、良性の腫瘍でるか等判別することができる。また、検体中における疾病に特有な物質の有無を細胞レベルで検出することができ、これにより精密な疾病の診断が可能となる。さらに顕微鏡観察において測定された対応生体標本のイメージと、二次イオン種のピーク強度を二次元的にイメージ表示させたものとを対照させることで、生体標本の表面における、対象タンパク質分子の局在部位の特定を行うことが可能となる。
【００４６】
なお、本実施例における質量スペクトル分析、および、イメージング方法は、特開２００４−０８５５４６公報に開示された実施形態を用いて行うことができる。今回用いた具体的な測定条件は以下のとおりである。
［ＴＯＦ−ＳＩＭＳの測定条件］
装置 ＩＯＮ ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ５
＜一次イオン＞
一次イオン：２５ｋＶ，Ｂｉ3+，９．６ｐｓ
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓ／ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：２ｎｓ
一次イオンビーム径：５μｍ
＜二次イオン＞
二次イオン検出モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定領域：１００×１００μｍ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：２５６
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の生体標本処理の概要図である。
【図２】本発明の多孔質体によって構成される薄膜の説明図である。（Ａ）連続的な網目状構造。（Ｂ）独立した細孔からなる細孔構造。（Ｃ）略垂直の細孔からなる細孔構造。（Ｄ）微粒子の凝集体からなる多孔質体。（Ｅ）球状の細孔からなる多孔質体。
【図３】実施例のトリプシンによって分解された生体標本中タンパク質のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析を示す図である。（ａ）生体標本上に多孔質体を接触させ、多孔質体の細孔に酵素を分注した状態を示す図。（ｂ）生体標本中タンパク質のＳＩＭＳイメージプロファイル。
【符号の説明】
【００４８】
９ 細孔
１０ 細孔中に分注された酵素溶液
１１ 病変細胞
１２ 正常細胞
１３ 酵素溶液インクジェット供給領域
１４ 多孔質体
１５ 生体試料
１６ 酵素による分解物の質量ピーク強度を示すシグナル
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞生物学、病理学、生化学等の医学・生物学分野に属し、特に生物標本に試薬を添加し反応させる方法及び反応産物を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年のゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）解析の進展により、生体内に存在する遺伝子産物であるタンパク質の解析の重要性が急速にクローズアップされてきている。中でも、組織切片におけるタンパク質解析の重要性が指摘されている。例えば、癌組織切片から再発や転移に関わるタンパク質を明らかにするといった試みが数多くなされている。細胞、組織等の生体標本表面のタンパク質を解析する手段としては、顕微鏡観察が多く用いられる。この場合、標的のタンパク質等を同定する目的においては、特異抗体を介して標的の物質を標識し、その標識の発色、発光、蛍光等を検出するという方法が用いられてきた。近年では、例えば特開２００１−２４９１２５号公報に記載されているように、試料切片に直接レーザー照射してマススペクトルを得る方法も提示されている。また、生体標本表面を直接処理する手段として、特開２００４−３４７５９４号公報に記載されているように、インクジェット法で量、位置を制御した試薬を生体標本に直接付与し、生体標本の解析をおこなっている。さらに、生体標本におけるタンパク質等の、細胞レベルでの微細な二次元分布の可視化を目的とした、ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法（飛行時間型二次イオン質量分析法）をベースとする情報取得手法及び装置が国際公開第２００５／００３７１５号パンフレットに開示されている。この手法では、インクジェット法などを用い、イオン化促進物質および／または消化酵素を上記の生体標本に直接付与したのち、その位置情報を保持したまま、サブミクロンメートルでの高空間分解能を持つＴＯＦ−ＳＩＭＳ法を行う。これにより、反応生成物におけるタンパク質の種類に関する情報（消化酵素により限定分解されたペプチドの情報を含む）を可視化することができる。
【特許文献１】特開２００１−２４９１２５号公報
【特許文献２】特開２００４−３４７５９４号公報
【特許文献３】国際公開第２００５／００３７１５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
特開２００４−３４７５９４号公報および、国際公開第２００５／００３７１５号パンフレットに記載の方法では、ある生体標本内における反応生成物分布などの情報を取得できる。しかし、１つの細胞サイズ径（１０μｍ）以内の分布といった、より微細なレベルでの二次元分布情報を得るためには、インクジェットの滴下手法に改善が必要である。それは、試薬を供給するインクジェットの液滴量が、通常１ｐｌ〜１００ｐｌと微量でありながら、このとき生体標本上に滴下された際のドットサイズ径は１０μｍから１０００μｍに渡る大きさになる。そのため、通常の１つの細胞径以内での情報取得を目的とした際、試薬の拡散、流出による分布の拡大化、または、試薬の蒸発による反応条件の低下などの問題が生じる。したがって、１つの細胞サイズ径以内での二次元分布情報を得たい場合には、試薬を生体標本上のより微小な領域に個別に付与し、液滴の拡散および蒸発を極力抑えて、反応が終わるまでのある一定の時間試薬を保持する必要がある。このような生体標本の分析において、癌細胞など特定の病変細胞中のタンパク質、或いは癌細胞に隣接する細胞中のタンパク質での、試料および反応生成物の２次元分布をより精度良く解析できれば、診断デバイスや創薬デバイスの開発に寄与できると考えられる。
【０００４】
そこで本発明は、生体標本内の特定の構造またはその構成分子を生体標本中の個々の細胞ごとに、位置精度よく分析することを目的とし、その前処理として、生体標本内の特定の構造またはその構成分子の位置情報を細胞レベルで保持したまま、試薬および反応生成物を固定するための生体標本の処理方法、および解析方法を提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、鋭意検討した結果、インクジェット技術と多孔質体によって構成される薄膜の併用により上記目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】
本発明の第一の方法は、細胞または組織を含む生体標本上に、多孔質体によって構成される薄膜を接触させる工程と、
該薄膜の非接触面側にインクジェットで少なくとも１種類以上の試薬を含む溶液を吐出し、該溶液を該薄膜の細孔を通じて前記生体標本の特定の領域に供給する工程と、を有し、
前記多孔質体の細孔の径が前記生体標本に含まれる細胞の径より小さいことにより、細胞レベルで区別して試薬を供給することを可能とする、生体標本への試薬供給方法である。
【０００７】
本発明の第二の方法は、本発明の第一の方法により生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給し、
さらに、前記試薬溶液を前記特定の領域に保持して反応生成を行う工程を有する、
細胞レベルで区別して試薬処理することを可能とする、生体標本の試薬処理方法である。
【０００８】
本発明の第三の方法は、本発明の第二の方法により生体標本の特定の領域を処理し、
さらに、試薬処理した特定の領域を顕微鏡観察または質量分析によって解析する工程を有する、
細胞レベルでの標的物質の位置情報の解析を可能とする、生体標本の解析方法である。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、生体標本上の任意の位置に、細胞１つのサイズ径に匹敵する１０μｍ以内の領域に限局して試薬を供給するとともに、その領域内での特定の構造またはその構成分子の位置情報を細胞単位で保持したまま、一定時間の試薬の供給および保持による十分な反応生成をさせる試薬処理方法を提供することができる。さらに試薬処理方法を用いた生体標本の解析方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においては、生体標本の特定の領域に対し、インクジェット法による試薬溶液の供給を行うことによって、多孔質体によって構成される薄膜を通しての分配をおこなう。多孔質体を通して生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給することによって、生体標本に含まれる細胞または組織中の、特定の構造及びその構成分子に、それらの位置情報を維持したまま試薬が分配、保持される。当該特定の構造の構成分子を標的物質とすることができる。このように、液滴を供給することによる試薬の分配を、分注と記載する。位置情報を維持するとは、試薬の分注後、あるいはそれに続く反応生成後における特定の構造またはその構成分子の位置情報が分注前の、あるいは生存時の位置情報と実質的に同じであることをいう。少なくとも特定の構造または標的物質が含まれる細胞または組織の範囲内で位置情報が維持されることが好ましく、標的物質が含まれる細胞内の特定の構造の範囲内で維持されることがさらに好ましい。細胞または組織中の特定の構造またはその構成分子の位置情報を解析する場合は、標的物質には特定の構造を構成する分子、好ましくは特定の構造に特徴的な分子、さらに好ましくは特定の構造に特異的に存在する分子を好適に用いることができる。
【００１１】
特定の構造とは例えば癌組織または癌細胞に特有に形成される構造であってもよく、これらの構造の構成分子、例えばタンパク質、脂質等を含み、好ましくは特定の構造に特異的である構成分子、例えば癌特異的抗原等を含む。癌に限らず、あらゆる病気、疾患等の病理的組織もしくは細胞についても本発明の対象となることはいうまでもない。
【００１２】
また、本発明においては、インクジェット法を用いて、多孔質体を通しての試薬の分注による反応生成を行う（図１）ことにより、生体標本を試薬処理したうえで、好ましくは標的物質を認識化する試薬により標的物質を認識可能な形態にしたうえで、解析することができる。これには顕微鏡観察や質量分析による方法等が用いられる。
【００１３】
本発明における生体標本は、固相化処理を受けていない生物の細胞または組織を含んでいる。細胞または組織は、生体内における微細構造をそのまま保持した状態のものを用いることができる。このような状態を得るために、細胞または組織が適当な包埋剤によって包埋されたものを用いることができる。生体内における微細構造を保持した生体標本を用いることができるため、本発明の方法によって解析することができる標的物質の局在は、生体内におけるのと同じものとして形態学的に検証することができる。前記生体標本は、ガラス製支持体、樹脂製支持体、金属製支持体等の支持体の表面に固着させて使用するか、または電気的にメンブレンに転写させて使用することができる。これらの標本は、必要に応じ、定法による染色、洗浄、脱塩等の前処理を行う。
【００１４】
本発明における多孔質体で構成される薄膜は、生体標本に接触させて用いられ、前記多孔質体の細孔には少なくとも１種類以上の試薬が供給される。本発明における多孔質体の役割は、細孔内に含まれる試薬を位置精度良く生体組織に接触させ、一定時間の液滴保持による十分な反応生成を促進することにある。
【００１５】
前記試薬は、生体標本に使用される際には、液体の状態で使用される。よって、多孔質体の材料には、耐水性を有し、試薬の反応性を阻害しにくい材料を用いればよく、また、このような材料で多孔質体の表面が被膜されているものでも構わない。例示すると、有機材料、無機材料、金属、金属酸化膜、セラミックスなどが挙げられるが、これに限るものではない。さらには、多孔質体の細孔表面（細孔内壁）は、親水性であることが好ましい。親水性にすることにより、液体の導入、保持が容易となり、酵素水溶液状態での使用に好適である。
【００１６】
また、前記多孔質体の細孔径は、生体標本に含まれる細胞の径より小さいことが好ましい。よって、多孔質体の細孔径は、１０ｎｍから１０μｍの間であることが好ましい。細孔径が１０ｎｍより小さい場合は、試薬溶液を細孔内部に保持および通過させることが難しいといった問題が生じる可能性がある。そして、細孔径が１０μｍを越える場合は、細胞サイズに対して細孔径が同等以上になり、複数の細胞にまたがった試薬反応が生じる可能性が高くなる。その結果、細胞単位での位置情報を維持して解析する上で、精度が低くなってしまう可能性がある。細孔の径が深さ方向で一定でない場合は、少なくとも生体標本との接触面での細孔径が１０μｍ以下であることが望ましく、このような例として半円錐状の細孔（円錐先端側が接触面）や球状の細孔（図２−Ｅ参照）等が挙げられる。より好ましい細孔径は、試薬溶液を細孔に注入することを考慮すれば、１μｍから１０μｍの間である。
【００１７】
多孔質体の細孔構造は、試薬溶液を位置精度良く生体標本に分注できる構造であれば特に限定されるものではない。つまり、多孔質体の上面（前記上面とは、本発明において生体標本が接触する側と逆の面を称する。）から生体標本の接触面に至るまで貫通していればよく、いかなる構造も使用可能である。例えば、図２（Ａ）のように連続的な網目状構造であっても、十分に密な構造であったり、多孔質体の厚さが充分薄い形状であったりすれば、試薬溶液が、多孔質体内において２次元平面方向に拡がり過ぎる前に、試薬溶液を分注、反応させることが可能である。さらには、細孔構造は細孔が独立に存在する構造であることがより好ましい。図２（Ｂ）のように、各細孔が連結せずに独立に存在すれば、さらに２次元平面方向への拡がりを抑え位置情報の精度を上げることが可能である。さらには、図２（Ｃ）のように、細孔構造が、生体標本との接触面に対して略垂直であることが望ましい。垂直孔であれば、試薬溶液の到達時間も速く、また位置情報の精度もさらに上げることができる。
【００１８】
多孔質体によって構成される薄膜の厚さは、試薬溶液を精度良く分注できる範囲であれば特に限定されるものではないが、好ましくは、１μｍから１０μｍの範囲にあることである。該膜が薄すぎると、試薬反応後、生体標本より除去する際に膜の一部が生体標本表面に残る可能性が高まり、厚すぎると、多孔質体の貫通方向性のズレにより、位置精度の低下が生じることに注意する必要がある。
【００１９】
多孔質体によって構成される薄膜の大きさは、上述のように生体標本上の分析目的とする領域に効率良く接触させることができれば特に限定されない。薄膜の接触、および、除去の作業効率を考慮して、該生体標本の大きさより５ｍｍ程度大きめに用意することが望ましい。
【００２０】
以上説明したような多孔質体によって構成される薄膜は、一般的なパターニング技術により形成することが可能である。例えば、フォトリソグラフィー、電子線リソグラフィー、Ｘ線リソグラフィー等のいわゆる半導体加工技術や、レーザー加工技術、機械加工技術等をもちいることが可能である。さらには、これらトップダウン方式の技術以外の方法も用いることができる。例えばポリマーや、無機物の相分離を利用して微細なパターンを形成する技術、金属の陽極酸化により細孔を形成する技術あるいは水滴や界面活性剤ミセル等鋳型を利用して細孔を形成する技術等、種々の方法を用いることが可能となる。また、図２（Ｄ）のように微粒子等の凝集体を多孔質体として用い、その粒界の空間を細孔として使用することも可能である。逆に、図２（Ｅ）のように、球状の細孔を持つ多孔質体を使用することも可能である。
【００２１】
上述のようにして用意した生体標本上の特定の領域に対し、試薬溶液を分注する。本発明においては、分注方法としてインクジェット法を用い、試薬溶液の微小滴を前記特定の領域に供給し付着させる。本発明において用いるインクジェット法の機構としては、例えば機械的加圧パルス方式（ピエゾ）を利用したピエゾジェット法および、電気熱変換体による膜沸騰方式（バブルジェット）等を用いることができるが、これに限定されない。
【００２２】
本発明の分注方法においては、インクジェット法を用いることにより、極微量の試薬を吐出することが可能となる。このとき、１個のインクジェット吐出部からの１回の吐出につき供給される試薬量（１液滴分の量）を例えば数ｐｌ程度に制御することができるが、インクジェットの機構によっては、さらに少ない量に制御することもできる。また、吐出を繰り返すことができるため、試薬を連続的に供給することが可能であり、このことからも分注する量の上限は特に限定されない。特定の１つの領域に対しては、例えばナノリットルレベル、通常１００ｎｌ程度の試薬量を分注することができる。インクジェット吐出部が複数の吐出口を有し、同時に複数の液滴を吐出することにより特定の領域に試薬を供給する態様も本発明に含まれる。複数の液滴を重ね打ちすることにより、試薬の種類、濃度および吐出量をコントロールして処理することが可能である。
【００２３】
適度な時間間隔での連続供給により、試薬の蒸発による損失を防ぎ、好適な反応条件を維持することが可能である。また、このようにして、抗体溶液等、希少かつ高価な試薬であっても必要最低限の使用量しか消費しないため、大幅なコストダウンを図ることができる。
【００２４】
本発明においては、例えば１ｐｌ程度の吐出によって直径１０μｍ程度の極小の分注範囲を生じる。この極小の分注範囲を用いることにより、細胞の１つ１つを区別して、特定の細胞の範囲に位置する細孔への分注が可能となる。インクジェットの機構によってさらに小さい範囲に限局することもできる。細胞を区別して試薬処理するためには細孔間で試薬が混合しないことが望ましく、そのために分配される試薬は細孔間で分離されるように注入量を設定する必要がある。
【００２５】
また、同一生体標本上に特定の領域を２つ以上設定することも可能である。従って、同一生体標本上でも異なる領域で別種の試薬溶液を添加することが可能になり、複数種の解析を行うことが可能になる。
【００２６】
さらに、試薬付与前に予め生体標本の画像情報を読み取り位置情報を記録しておき、画像情報から特定の領域を選択し、記録された特定の領域に自動的に試薬を供給させることができる。例えば、光学顕微鏡により画像情報を読取り、位置情報を記録する機構と、記録された位置情報に基づいて特定の領域にインクジェット吐出を指示するプログラムとを用いる、そして、これらと連動可能な、または一緒にシステムを構成する公知のインクジェット装置とを用いて自動化が可能である。位置情報を記録する機構は、さらに解析の際に標的物質の位置情報を取得することも可能とし、これらの位置情報より標本内での標的物質の局在などの解析を行ってもよい。
【００２７】
本発明においては、上述のように極少量の試薬溶液を生体標本上の極小の領域に供給、保持することができるため、従来のようにサンプル上に物理的な区画を構築する等の必要がない。このため、作業時間を低減することができるとともに区画の構築等によるサンプルの損傷を避けることができる。
【００２８】
本発明においては、生体標本中の特定の組織もしくは細胞に含まれる分子、好ましくは特定の組織もしくは細胞を特定することができる分子、さらには組織もしくは細胞中の特定の分子等を標的物質とすることができる。例えば、抗原（ハプテンを含む）、抗体及び酵素等を標的物質とすることができる。そして、これらの物質を含め、一般的にタンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等を標的物質とすることができる。本発明における試薬としては、生体標本中の標的物質を認識可能な形態にすること（認識化）によって、その局在を検出することができるものを用いると良いがこれに限定されない。これらの試薬により、標的物質の組織もしくは細胞における局在を検出することが可能であり、標的物質が特定の組織もしくは細胞に特異的な分子であれば、試薬が生体標本内での当該組織もしくは細胞の局在を検出する指標となる。なお、認識可能とは、可視化や質量分析等によって検出することができることをいう。
【００２９】
本発明においては、前記試薬として、標的物質と化学反応する化合物や、標的物質と特異的に結合する物質を用いて、直接的又は間接的に認識化することができる。標的物質と化学反応する化合物としては、標的物質の化学的性質に応じて発色、発光、蛍光等の常法によって検出することができるものを特に限定されることなく用いることができる。
【００３０】
標的物質と特異的に結合する物質としては、生体物質でも合成物でも良い。前記生体物質としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等を挙げることができ、これら生体物質が有する特異的な結合能を利用することができる。すなわち、抗原とそれに対応する抗体、酵素とそれに対応する基質、核酸とそれに対応する核酸等の特異的結合を利用することができる。従って、前記標的物質と特異的に結合する物質は、例えば、抗体、抗原、酵素等として用いることができる。前記合成物としては、これら生体物質が有する機能と同様又は類似の結合能を有する、有機化合物や金属錯体等の類似化合物を用いることができる。類似化合物は、前記生体物質と構造において類似したものだけでなく、前記生体物質の特異的結合能としての機能において同様又は類似したものも含まれる。そのような類似化合物としては、前記生体物質の修飾体や、酵素モデル等が挙げられる。また、認識化の方法によっては、これら標的物質と特異的に結合する物質は、標識が導入されたものであっても良い。すなわち、標識物質によって標識された標識体や、標識物質との複合体であっても良い。
【００３１】
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が抗原（ハプテンを含む）である場合、認識化のために免疫組織化学的手法を用いることができる。抗原としては、タンパク質、ペプチド、核酸、糖、脂質等が挙げられる。免疫組織化学的手法としては、常法を用いることができる。すなわち、蛍光抗体法、酵素抗体法、重金属抗体法、放射線同位元素抗体法等を特に限定されることなく用いることができる。また、これら方法においては、標識抗体法及び非標識抗体法、さらには直接抗体法及び間接抗体法を問わない。従ってこの場合、本発明における試薬としては、タンパク質、ペプチド、又はこれらに標識物質が導入されたもの等、すなわち一次抗体、二次抗体等が挙げられる。さらにこれら抗体に対して染色等の可視化を行う場合は染色剤等も挙げられる。
【００３２】
標識物質としては、蛍光物質、酵素、重金属含有物質、放射線同位元素含有化合物、その他の化合物等を挙げることができる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）等が挙げられる。酵素としては、エンドペプチターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、酸フォスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、チロシナーゼ等が挙げられる。特に、エンドペプチターゼ酵素を用いたタンパク質分子の分解処理方法は、ＭＡＬＤＩまたはＴＯＦ−ＳＩＭＳなどのイオン質量分析法と併用して用いると、より有効に生体標本中のタンパク質位置情報を得られる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法等のイオン質量分析法により解析する場合はさらに、増感物質を本発明の方法により付与することができる。増感物質とは生体標本表面のタンパク質を構成するペプチド鎖に作用して二次イオン種の生成を推進させるものを指す。増感物質としては、例えば、金属錯体、金属塩化合物を均一に溶解した水溶液、硝酸銀水溶液などが挙げられる。
【００３３】
重金属含有物質としては、フェリチン、金コロイド等が挙げられる。その他の化合物としては、酵素モデル等が挙げられる。また、標識物質としてビオチンを用いることもできる。さらにこれに伴い、標識されたビオチンとアビジンとの複合体や標識されたストレプトアビジンを試薬として用いることができる。
【００３４】
上記例示した試薬は、単独で用いてもよいし、２種以上を混合して用いてもよい。
【００３５】
なお、生体標本の標的物質の認識化は、前記抗体又は抗体に導入された標識物質に対応した方法で行う。具体的には、発色、発光、蛍光、放射性同位元素の存在等を検出することによって行う。認識化された生体標本の標的物質は、顕微鏡観察又は質量分析によって解析する。
【００３６】
顕微鏡観察を行う場合は、例えば酵素に対しては、それに応じた適当な基質溶液を分注した上で発色法や発光法によって可視化し、光学顕微鏡で観察することができる。蛍光物質に対しては、適当な励起光を照射して蛍光を得る方法によって可視化し、蛍光顕微鏡やレーザー顕微鏡によって観察することができる。重金属含有物質に対しては、照射光の散乱によって可視化し、電子顕微鏡によって観察することができる。放射性同位元素に対しては、オートラジオグラフィー法によって可視化して観察することができる。
【００３７】
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が酵素である場合、認識化のために酵素組織化学的手法を用いることができる。この場合、前記試薬としては、標的物質である酵素に応じた適当な基質を用い、常法によって標的物質の酵素を認識化することができる。
【００３８】
本発明において、生体標本中の標的物質である生体物質が核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡを含む）である場合、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成法を用いることができる。この場合、試薬としては、標的となる遺伝子を含む核酸とハイブリッド形成することができるＤＮＡプローブの標識体を用い、常法によって標的物質の核酸を認識化することができる。標識体の標識物質としては、免疫組織化学的手法において例示したものを含め、当業者が適宜定めると良い。
【００３９】
質量分析を行う場合は、例えば、飛行時間型二次イオン質量分析（ＴＯＦ−ＳＩＭＳ）法やレーザー脱離イオン化質量分析（ＬＤＩ−ＭＳ）法を用いることができる。ＬＤＩ−ＭＳ法の場合、認識化された標的物質に対して例えば以下の操作を行う。まず、必要に応じて消化等の処理を行う。消化においては、例えば、トリプシンなどのタンパク質消化酵素溶液を添加し、湿潤条件下にてインキュベートする。このように必要に応じ処理された標的物質に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。あるいは、前記必要に応じ処理された標的物質に対し、必要に応じてマトリクス溶液を重ねて分注し、その分注位置に対してレーザーを照射し、マススペクトルを得る。本発明においては、微小な範囲に限定して分注を行うため、このときに得られるマススペクトルにおいては、特定の領域以外からの不必要なシグナル、すなわちバックグラウンドを低減することができる。また、マトリクス溶液の分注及びレーザー照射を、試料上の一点の位置のみでなく、一定の範囲にわたって繰り返し行うことによって、特定の細胞又は組織の、質量分布に基づいたイメージング（２次元分布状態の検出）が可能になり、生体標本上で標的物質のマッピングができる。ＴＯＦ−ＳＩＭＳ法の場合、質量スペクトル分析およびイメージング方法は、特開２００４−０８５５４６号公報及び国際公開第２００５／００３７１５号パンフレットに開示された実施形態等を用いて行うことができる。これらの方法に従うと検出対象とするタンパク質分子が複数である場合も解析が可能である。
【００４０】
なお質量分析による解析は、認識化していない標的物質についても行うことが可能である。例えば、本発明の試薬処理が特定の組織もしくは細胞を標的物質以外の指標物質により識別する反応であり、該試薬処理後に標的物質についての質量分析を行うことにより、標的物質と特定の組織や細胞とを関連させ解析することができる。例えば、本発明の試薬処理方法により、ある種の癌を特異的に検出する標識化した抗体を標本に付与して反応させ、抗体の標識を検出して癌組織または細胞の位置情報を取得した後、質量分析により癌領域と正常な領域を比較して検出される物質の解析を行うことができる。
【００４１】
上述のように本発明によると、生体標本上の微小な区画のみに限定して試薬を分注するため、従来法に比べ使用する試薬の消費量を大幅に減らすことができる。また解析対象となる生体標本は病理組織標本等希少なものが多く想定されるが、同一検体上で複数種の解析が可能になるので、生体標本をより有効に活用できる。さらに、質量分析に導入するときは、試薬を分注した領域以外からのシグナルすなわちバックグラウンドの低減が期待できる。
【実施例】
【００４２】
以下に、組織切片サンプルにおける微細な領域をＴＯＦ−ＳＩＭＳ法により解析する例を示す。サンプルの調製にあたりマウス脳凍結切片を作製し、これをシリコン基板上に固定する。
【００４３】
さらにこの切片試料をＤｉｒｅｃｔ Ｂｌｕｅ ７１により染色し、フォトリソグラフィーによりフォトレジストを材料とした多孔質体（垂直細孔、平均細孔径３μｍ、細孔間隔６μｍ）によって構成される薄膜を作製し、この切片試料生体標本上に密着するように接触させる。
【００４４】
光学顕微鏡で標的とする病変細胞上の多孔質体細孔の位置を確認した後、消化酵素としてトリプシン１０μｇ／ｍＬを混合し溶解したリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を、インクジェットヘッドリザーバーに入れ、インクジェットにより、標的となる病変細胞を含む領域の細孔位置に４ｐｌずつ分注する（図３（ａ）参照）。このとき、消化酵素１滴が形成する領域の径はおよそ３０μｍとなるので、領域が重なるようにして滴下してサンプル全体を覆うようにする。乾燥によって酵素溶液が消失しないように適度な量の分注を続け、所定時間経過後、細孔中の水分および、低分子混合成分を蒸発させたのち、生体標本上の多孔質体薄膜をはがして除去する。これにより、表面に消化分解されて形成される断片ペプチドが付着した生体標本試料を得ることができ、その分解生成物をＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析によって検出する。なお、この測定において様々なタンパク質、ペプチドの分解生成物が検出されるが、消化酵素で限定分解された分解物のイオン種から、分解前のタンパク質を特定するには開示されているプロテオーム解析結果（各種データベース）を利用することにより、特定のタンパク質、または、ペプチド由来の断片ペプチドを見つけることができる。
【００４５】
ＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析後、前記の断片ペプチドの質量シグナルを選択してイメージングすると、図３（ｂ）のように、特定の、多孔質体の細孔の位置に前記シグナルが検出され、分解前の目的タンパク質が存在する位置を特定することができる。ここに示した方法を利用すると生体標本の構成物の分布状態を細胞レベルで把握可能となり、細胞レベルでの分布状態に基づいて、測定対象とした標本に悪性の癌であるか、良性の腫瘍でるか等判別することができる。また、検体中における疾病に特有な物質の有無を細胞レベルで検出することができ、これにより精密な疾病の診断が可能となる。さらに顕微鏡観察において測定された対応生体標本のイメージと、二次イオン種のピーク強度を二次元的にイメージ表示させたものとを対照させることで、生体標本の表面における、対象タンパク質分子の局在部位の特定を行うことが可能となる。
【００４６】
なお、本実施例における質量スペクトル分析、および、イメージング方法は、特開２００４−０８５５４６公報に開示された実施形態を用いて行うことができる。今回用いた具体的な測定条件は以下のとおりである。
［ＴＯＦ−ＳＩＭＳの測定条件］
装置 ＩＯＮ ＴＯＦ社製ＴＯＦ−ＳＩＭＳ ５
＜一次イオン＞
一次イオン：２５ｋＶ，Ｂｉ3+，９．６ｐｓ
一次イオンのパルス周波数：２．５ｋＨｚ（４００μｓ／ｓｈｏｔ）
一次イオンパルス幅：２ｎｓ
一次イオンビーム径：５μｍ
＜二次イオン＞
二次イオン検出モード：ｐｏｓｉｔｉｖｅ
測定領域：１００×１００μｍ
二次イオンｉｍａｇｅのｐｉｘｅｌ数：１２８×１２８
積算回数：２５６
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】本発明の生体標本処理の概要図である。
【図２】本発明の多孔質体によって構成される薄膜の説明図である。（Ａ）連続的な網目状構造。（Ｂ）独立した細孔からなる細孔構造。（Ｃ）略垂直の細孔からなる細孔構造。（Ｄ）微粒子の凝集体からなる多孔質体。（Ｅ）球状の細孔からなる多孔質体。
【図３】実施例のトリプシンによって分解された生体標本中タンパク質のＴＯＦ−ＳＩＭＳ分析を示す図である。（ａ）生体標本上に多孔質体を接触させ、多孔質体の細孔に酵素を分注した状態を示す図。（ｂ）生体標本中タンパク質のＳＩＭＳイメージプロファイル。
【符号の説明】
【００４８】
９ 細孔
１０ 細孔中に分注された酵素溶液
１１ 病変細胞
１２ 正常細胞
１３ 酵素溶液インクジェット供給領域
１４ 多孔質体
１５ 生体試料
１６ 酵素による分解物の質量ピーク強度を示すシグナル
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または組織を含む生体標本上に、多孔質体によって構成される薄膜を接触させる工程と、
該薄膜の非接触面側にインクジェットで少なくとも１種類以上の試薬を含む溶液を吐出し、該溶液を該薄膜の細孔を通じて前記生体標本の特定の領域に供給する工程と、を有し、
前記多孔質体の細孔の径が前記生体標本に含まれる細胞の径より小さいことにより、細胞レベルで区別して試薬を供給することを可能とする、生体標本への試薬供給方法。
【請求項２】
前記薄膜を構成する多孔質体の細孔が、該薄膜を略垂直方向に貫通していること、を特徴とする請求項１に記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項３】
前記薄膜を構成する多孔質体の細孔の径が、１０ｎｍから１０μｍの間であること、を特徴とする請求項１または２に記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項４】
前記試薬の少なくとも１種が、前記生体標本に含まれる細胞または組織中の標的物質と、化学的もしくは生物学的に反応する化合物、及び／または特異的に結合する物質である、請求項１乃至３のいずれかに記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項５】
前記標的物質と特異的に結合する物質の少なくとも１種が、ポリペプチドからなる生体物質、及び／または該生体物質と同様もしくは類似の結合能を有する類似化合物である、請求項４に記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項６】
前記生体標本の画像情報を読み取り位置情報を記録する工程を更に有し、
前記画像情報に合わせて前記特定の領域にインクジェットで試薬を供給することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の方法により生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給し、
さらに、前記試薬溶液を前記特定の領域に保持して反応生成を行う工程を有する、
細胞レベルで区別して試薬処理することを可能とする、生体標本の試薬処理方法。
【請求項８】
請求項７に記載の試薬処理方法により生体標本の特定の領域を処理し、
さらに、試薬処理した特定の領域を顕微鏡観察または質量分析によって解析する工程を有する、
細胞レベルでの標的物質の位置情報の解析を可能とする、生体標本の解析方法。
【請求項１】
細胞または組織を含む生体標本上に、多孔質体によって構成される薄膜を接触させる工程と、
該薄膜の非接触面側にインクジェットで少なくとも１種類以上の試薬を含む溶液を吐出し、該溶液を該薄膜の細孔を通じて前記生体標本の特定の領域に供給する工程と、を有し、
前記多孔質体の細孔の径が前記生体標本に含まれる細胞の径より小さいことにより、細胞レベルで区別して試薬を供給することを可能とする、生体標本への試薬供給方法。
【請求項２】
前記薄膜を構成する多孔質体の細孔が、該薄膜を略垂直方向に貫通していること、を特徴とする請求項１に記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項３】
前記薄膜を構成する多孔質体の細孔の径が、１０ｎｍから１０μｍの間であること、を特徴とする請求項１または２に記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項４】
前記試薬の少なくとも１種が、前記生体標本に含まれる細胞または組織中の標的物質と、化学的もしくは生物学的に反応する化合物、及び／または特異的に結合する物質である、請求項１乃至３のいずれかに記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項５】
前記標的物質と特異的に結合する物質の少なくとも１種が、ポリペプチドからなる生体物質、及び／または該生体物質と同様もしくは類似の結合能を有する類似化合物である、請求項４に記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項６】
前記生体標本の画像情報を読み取り位置情報を記録する工程を更に有し、
前記画像情報に合わせて前記特定の領域にインクジェットで試薬を供給することを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載の生体標本への試薬供給方法。
【請求項７】
請求項１乃至６のいずれかに記載の方法により生体標本の特定の領域に試薬溶液を供給し、
さらに、前記試薬溶液を前記特定の領域に保持して反応生成を行う工程を有する、
細胞レベルで区別して試薬処理することを可能とする、生体標本の試薬処理方法。
【請求項８】
請求項７に記載の試薬処理方法により生体標本の特定の領域を処理し、
さらに、試薬処理した特定の領域を顕微鏡観察または質量分析によって解析する工程を有する、
細胞レベルでの標的物質の位置情報の解析を可能とする、生体標本の解析方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図２】
【図３】
【公開番号】特開２００８−９６２４５（Ｐ２００８−９６２４５Ａ）
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００６−２７７３８５（Ｐ２００６−２７７３８５）
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．バブルジェット
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成２０年４月２４日（２００８．４．２４）
【国際特許分類】
【出願日】平成１８年１０月１１日（２００６．１０．１１）
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．バブルジェット
【出願人】（０００００１００７）キヤノン株式会社 (59,756)
【Ｆターム（参考）】
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