生化学的検査方法
【課題】プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査し得る生化学的検査方法を提供すること。
【解決手段】発光性分子が保持されたレファレンスアレイに励起照明を与えて光画像をレファレンス光画像として撮り込むとともに、生化学検査用アレイに同一の励起照明を与えて光画像をサンプル光画像として撮り込み、該サンプル光画像を前記レファレンス光画像で補正する。
【解決手段】発光性分子が保持されたレファレンスアレイに励起照明を与えて光画像をレファレンス光画像として撮り込むとともに、生化学検査用アレイに同一の励起照明を与えて光画像をサンプル光画像として撮り込み、該サンプル光画像を前記レファレンス光画像で補正する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）のために、アレイドハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応の幾つかの方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いたＳＢＨがある。
【０００３】
また、従来「ジェノセンサー（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）」なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジェノセンサーの概念には、ハイブリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。
【０００４】
このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージェノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及び多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージェノセンサーは、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。
【０００５】
（１）表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。
【０００６】
（２）ハイブリダイゼーション反応に要する時間が短縮し（平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイブリダイゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。
【０００７】
（３）多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。
【０００８】
（４）大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。
【０００９】
以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平９−５０４８６４号公報を引用し、図２７を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。
【００１０】
図２７は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図である。図２７において、多孔性のガラスウェハー１０１には、複数のテーパ孔１０２が配設されており、これら各孔１０２にテーパ付きウェル１０３が埋設されている。テーパ付きウェル１０３は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を底部に含む。各チャンネル１０４は図示のように多くの微小の貫通孔１０５を有している。このウェルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。
【００１１】
（１）３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン４ｍｌ、キシレン１２ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基）０．５ｍｌの溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを８０℃の該溶液に５時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、８０℃にて乾燥することにより、ウェハーをエポキシシラン−誘導体化ガラスとする。
【００１２】
（２）５′−または３′−アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に１０μＭ−５０μＭにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー１０１（シリカウェハー）に微量分注する。６５℃にて一晩反応させた後、その表面を６５℃の水、次いで１０ｍＭトリエチルアミンで簡単に流し、表面上の未反応エポキシ基を取り除く。次いで、６５℃の水で再度流し、風乾することにより、アミン−誘導化オリゴヌクレオチドをエポキシシラン−誘導体化ガラスに結合させる。
【００１３】
（３）増幅の間に産物に［32Ｐ］ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ−32Ｐ［ＡＴＰ］＋ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて増幅産物を５′−標識することによって、標的ＤＮＡ（分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濾過によって除去する。好ましくは、１のＰＣＲ断片を５′−ビオチン標識すれば、ストレプトアビジン・アフィニティークロマトグラフィーによる一本鎖の調製ができる。少なくとも５ｎＭ（５ｆｍｏｌ／μｌ）の濃度であって、少なくとも５，０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの特異活性のハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭＥＤＴＡ、３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中に標的ＤＮＡを溶解する。数百塩基長のＰＣＲ断片が、少なくともオクタマー長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適している。
【００１４】
（４）標的ＤＮＡ試料をチップの多孔性領域に流し込み、６℃にて５〜１５分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行なう。次いで、１８℃にて同様の時間、多孔性チップを通してハイブリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニウムの代わりに、１ＭＫＣＬもしくはＮａＣｌまたは５．２Ｍベタインを含有する緩衝液でハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００１５】
（５）ＣＣＤジェノセンサー装置を用いてハイブリダイゼーション強度の検出及び定量を行なう。ＣＣＤジェノセンサー装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従来では、上述した従来技術に限らず、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を各々の発光強度としてＣＣＤのような同一のエリアセンサーまたはラインセンサーで検出する場合、すべてのプローブアレイ要素を均一に照明する必要がある。この理由は、発光性分子の発光状態が励起光の強度に依存するからである。
【００１７】
そこで、励起光の強度をモニターして、この強度の空間分布で検出値を補正することが容易に考えられる。しかしこの場合でも、励起光の強度と発光強度との関係が複雑であることと、発光性分子の密度、温度、時間などによりその関係が変化することにより、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査することができないという欠点が有る。
【００１８】
また、励起光のノイズやプローブの分注誤差によるノイズも十分に除去されない。さらに、発光性分子の発光特性が考慮されていないので、各反応状態を正確に検査することができないという欠点が有る。
【００１９】
本発明の目的は、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査し得る生化学的検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
課題を解決し目的を達成するために、本発明の生化学的検査方法は以下の如く構成されている。
【００２１】
本発明の生化学的検査方法は、第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、光で励起発光する発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、前記アレイ型検出器により得られた光画像の対象領域内の最小検出量を蛍光バックグラウンドとし、該蛍光バックグラウンドを前記光画像から差し引いた光画像を対象画像とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査し得る生化学的検査方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００２４】
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１において、励起光源１１には、水銀光源等が用いられる。この光源１１から出射される励起光の光路上には、シャッター１２、レンズ１３、二枚の励起フィルタ１４を選択的に切り替え可能な励起フィルタユニット１４０、およびダイクロイックミラー１５が配置され、このダイクロイックミラー１５の反射光路上には、対物レンズ１６および後述する生化学検査用アレイ１またはレファレンスアレイ４が配置されている。また、ダイクロイックミラー１５の透過光路上には、複数枚のＮＤフィルタ１７を選択的に切り替え可能なＮＤフィルタユニット１７０、結像レンズ１８、およびＣＣＤカメラ１９が配置されている。ＣＣＤカメラ１９には画像処理部２０が接続され、画像処理部２０には表示部２１が接続されている。
【００２５】
図２の（ａ），（ｂ）は、本第１の実施の形態で使用する生化学検査用アレイの概略構成を示す図であり、図２の（ａ）は上面のフォーマットを示す図、図２の（ｂ）は一部側面図である。生化学検査用アレイ１は、図２７に示した三次元アレイからなる。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１にはプローブアレイ要素３が二次元に配列されており、４隅にそれぞれ位置検出用アレイ要素２が配置されている。これらプローブアレイ要素３および位置検出用アレイ要素２は、図２７に示したようにテーパ付きウェル１０３からなり、底部に０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を有し、さらに各チャンネル１０４は図２の（ｂ）に示すように多くの微小な貫通孔１０５を有している。各貫通孔１０５の壁面には、プローブ３１が結合している。
【００２６】
すなわち生化学検査用アレイ１では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー１０１の表面の異なるテーパ付きウェル１０３にそれぞれプローブの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー１０１の内部に設けられた各チャンネル１０４の各貫通孔１０５で保持するのが良いが、多孔性ガラスウェハー１０１を設けずに、直接各貫通孔１０５にプローブの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔１０５を含む部材が、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。
【００２７】
図３は、本第１の実施の形態で使用するレファレンスアレイの上面のフォーマットを示す図である。レファレンスアレイ４は、蛍光分子を保持可能な三次元アレイからなる。図３に示すように、レファレンスアレイ４には蛍光分子保持用要素５が二次元に配列されており、４隅にそれぞれ位置検出用アレイ要素２が配置されている。
【００２８】
図２の（ａ），図３に示すように、生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４は同一のフォーマットを有している。４隅に位置する４個の位置検出用アレイ要素２は、生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４で同じ位置に存在するものであり、顕微鏡下の図示しないステージ上に生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４を配置するときの両者の位置合わせ用に使用される。従って、位置検出用アレイ要素２は必ずしも図２の（ａ），図３に示す位置である必要はなく、両者で同じ位置に存在すればどの位置でも良い。もちろん、生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４のフォーマット自身も、これらの条件を満たすものであれば任意で良い。
【００２９】
以下、本第１の実施の形態における生化学検査の概略を説明する。
【００３０】
最初に検査者は、アレイ用基板に標識として使用する蛍光分子と同一のｎRM個の蛍光分子をそれぞれ蛍光分子保持用要素５に、標識と異なる発光波長の蛍光分子をそれぞれ位置検出用アレイ要素２にスポッティングしてレファレンスアレイ４を製作する。ここで、Ｒはレファレンスを意味する添字、Ｍは蛍光物質に対応する添字である。
【００３１】
次に、顕微鏡観察下で位置出し配置されたレファレンスアレイ４に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みレファレンス蛍光画像とする。該レファレンス蛍光画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００３２】
次に検査者は、前記レファレンスアレイ４を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイ１を配置する。この生化学検査用アレイ１では、あらかじめ標識と異なる発光波長の蛍光分子をアレイ用基板の位置検出用アレイ要素２に、対応するプローブ液を同じくプローブアレイ要素３にそれぞれ固相化してある。
【００３３】
次に検査者は、該生化学検査用アレイ１に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素３から除去する。
【００３４】
次に、該生化学検査用アレイ１に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みサンプル蛍光画像とする。該サンプル蛍光画像は、前記レファレンス蛍光画像と同じく標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００３５】
次に、前記レファレンス蛍光画像および前記サンプル蛍光画像を各々要素単位に分割し、複数の分割画像（該分割画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数×プローブアレイ要素数×２だけ存在する）とする。なお、この時の分割条件は、４個の前記位置検出用アレイ要素２の重心位置または二値化画像の図心位置の座標と、既知のアレイフォーマットにより決定する。
【００３６】
さて、γ値が１の受光素子上に無収差レンズで結像した時に、最大信号の１／２のレベルでの二値化点が主光線と最適像面との交点と考えて良い。そこで、全ての前記分割画像を最大信号の１／２のレベルで二値化して、この二値化画像の領域を設定し、この領域の最大ｘ座標、最小ｘ座標、最大ｙ座標および最小ｙ座標を求める。
【００３７】
レファレンス二値化画像については、最大ｘ座標をｘRMkmax、最小ｘ座標をｘRMkmin、最大ｙ座標をｙRMkmaxおよび最小ｙ座標をｙRMkminとし、サンプル二値化画像については、最大ｘ座標をｘSMkmax、最小ｘ座標をｘSMkmin、最大ｙ座標をｙSMkmaxおよび最小ｙ座標をｙSMkminとする。同時に、前記サンプル蛍光画像の分割画像に関してのみ前記二値化画像の実面積を計算し、これをＳMkとする。
【００３８】
図４は、前記レファレンス蛍光画像および前記サンプル蛍光画像の分割画像を示す図であり、図５は図４に表示されている線分ＡＢ上のＣＣＤからの出力信号を示す図である。二値化領域４１とこの領域の最大ｘ座標ｘmax 、最小ｘ座標ｘmin 、最大ｙ座標ｙmax および最小ｙ座標ｙmin との関係は図４および図５に示す通りである（なお、図中では添字RMkおよびSMkは区別不要のため省略してある）。
【００３９】
次に、測定領域４２およびノイズサンプリング領域４３を決定するための矩形領域を与える２つの座標を、図４および図５に示すように（ｘ′min ，ｙ′min ）および（ｘ′max ，ｙ′max ）として、このｘ′min 、ｙ′min 、ｘ′max およびｙ′max を次式で与える。
【数１】
【００４０】
ただし、βは光学系の像倍率であり、δは次式で与える。
【数２】
【００４１】
ここで、λは検出する標識Ｍの蛍光波長、ａは試料側の開口数、Δはデフォーカス量である。また、右辺の第１項は回折像の中心から二次の回折ピークと三次の回折ピークとの間の谷間までの距離（回折によるボケ量）を表し、第２項はフォーカシング誤差に起因するボケ量（デフォーカスによるボケ量）を表す。すなわち、（５）式はフォーカシング誤差を考慮したときの最大ボケ量を与える式と考えて良い。
【００４２】
さて、分割画像は図５に示すように、検出されるべき信号５１とノイズ信号５２との合成信号で形成されている。ノイズは装置構成や測定環境に依存するが、一般的には励起光ノイズ（励起光に起因するノイズ）が支配的であり、時には迷光ノイズ（励起光以外の光源に起因するノイズ）も無視できない。また、励起光ノイズには励起光の基板での反射光ノイズ、励起光による基板の自家発光ノイズなどがある。
【００４３】
図６は、前述したノイズ信号を出力信号から差し引いた信号を示す図である。この減算処理をすることにより、検出されるべき信号６１を取り出すことができる。なお、図４〜図６は説明しやすいようにモデル化して表現してあるが、実際には検出されるべき信号およびノイズ信号は平坦でなく、位置によりむらがある。特に前述した励起光ノイズは照明むらを反映するので、ノイズ信号のむらの最大の原因となる。
【００４４】
本実施の形態においては、検出されるべき信号のむらにより二値化領域が図４に示すような円形でない場合または１つの分割画像に複数の二値化領域が存在する場合でも、（ｘ′min ，ｙ′min ）および（ｘ′max ，ｙ′max ）で定まる矩形領域を測定領域とすることで、この測定領域内に検出されるべきすべての信号が含まれることが保証される。
【００４５】
そこで本実施の形態においては、ノイズ信号のむらを前提として、測定領域４２の信号からノイズサンプリング領域４３内の平均ノイズ信号を差し引き、図６に示す検出信号を得る。平均ノイズ信号は、ノイズサンプリング領域内の信号の総和をノイズサンプリング領域の面積で除することで求められる。次に、差し引かれて得られた検出信号の測定領域４２内での総和を、アレイ要素ごとの信号強度とする。
【００４６】
このような方法によれば、検出されるべき信号の近傍でノイズ信号をサンプリングできるので、検出されるべき信号の検出精度が向上する。しかも、前述のごとくデフォーカスを考慮して測定領域を設定してあるので、デフォーカスノイズが発生しないことも明らかである。
【００４７】
以上により、標識に使用する蛍光物質の種類数×プローブアレイ要素数×２の数量の信号強度が得られる。今、プローブアレイ要素３および蛍光分子保持用要素５の信号強度をそれぞれＰRMk およびＰSMk で表す。ここでＲおよびＳは、それぞれレファレンスおよびサンプルを示す添字、Ｍは蛍光物質に対応する添字、ｋは蛍光分子保持用要素５の番号であると同時にこれに対応したプローブアレイ要素３の番号である。
【００４８】
次に、プローブアレイ要素３の信号強度ＰSMk をプローブアレイ要素３の面積で補正してＰMkとする。次式によりＰMkを求める。
【数３】
【００４９】
ここで、ＳO はプローブアレイ要素３の標準面積、ＳMkは先に計算された各プローブアレイ要素３の二値化画像の実面積である。この補正により、プローブ分注誤差によるノイズを除去することができる。
【００５０】
次に、前記サンプル蛍光画像のプローブアレイ要素３ごとの強度信号ＰMkを前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子（または化学発光分子）数ｎMkで表すと次のようになる。
【数４】
【００５１】
ただし、ρは蛍光の発光関数の非線型係数であり定数で与えられる。また、ＩMkは次式で表すことができる。
【数５】
【００５２】
ここで、ｎRMはレファレンスアレイ４の番号ｋの蛍光分子保持用要素５に存在する標識Ｍの蛍光分子数（または化学発光分子）である。
【００５３】
従って（８）式でＩMkを求め、（７）式を用いて前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子（または化学発光分子）数ｎMkを求めることができる。すなわち、プローブアレイ要素３ごとに、標識物質数の信号強度ＰMkの検出値からその数だけの方程式を作り、これらの方程式を解くことにより前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子（または化学発光分子）数ｎMkを求める。（７）式および（８）式により、
【数６】
【００５４】
となる。
（８）式において非線型係数ρが０とみなせる場合には、ＩMkは蛍光分子（または化学発光分子）１個当たりの信号強度となる。このときに（９）式は非常に簡単な式となりｎMkは次式により求められる。
【数７】
【００５５】
次に、非線型係数ρが０とみなせない場合のｎMkの逐次近似法による求め方について述べる。（９）式において、ｉ回目のｎMkの近似値を
【数８】
【００５６】
で表し、これを求める右辺のｎMkにはｉ−１回目のｎMkの近似値を用いる。これを式で示すと次のようになる。
【数９】
【００５７】
ただし、ｉ＝１，２，３，…とする。また、ｎMkの初期値として
【数１０】
【００５８】
を与え、さらに、収束条件として次式を与えるのが良い。
【数１１】
【００５９】
すなわち、（１３）式を満たす時の
【数１２】
【００６０】
を求めるｎMkとする。
図７，図８は、本第１の実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図７，図８に従って検査方法およびその作用を説明する。
【００６１】
(1)ステップＳ１：まず検査者は、２色の蛍光分子で標識された２種の生化学的物質の溶液を作成する。この場合検査者は、比較したい２種の生化学的物質の溶液を同一濃度で作成し、一方をＦＩＴＣ、他方をローダミンで標識する。これらの標識物質は、蛍光波長の異なる物質の組み合わせであれば他の物質でも構わない。その後、作成した２種の生化学的物質の溶液を１：１の割合で混合して攪拌し、生化学的物質の混合溶液とする。混合比率については、２種の生化学的物質の溶液および標識物質の特性に応じて変更しても良い。
【００６２】
(2)ステップＳ２：検査者は、２色の蛍光分子を保有するレファレンスアレイ４を製作する。この場合検査者は、アレイ用基板に蛍光標識として使用するＦＩＴＣおよびローダミンを同一の蛍光分子数ｎRMだけそれぞれ蛍光分子保持用要素５に、標識と異なる発光波長の蛍光分子をそれぞれ位置検出用アレイ要素２にスポッティングしてレファレンスアレイ４を製作する。この際、スポッティングする位置はプローブアレイ要素３に対応する位置とする。ここでＲはレファレンスを意味する添字、Ｍは蛍光物質に対応する添字である。
【００６３】
なお、スポッティングの方法は、使用する蛍光分子の重量とその分子量から使用する蛍光分子数を特定し、この蛍光分子数の蛍光分子の溶液を既定量となるように作り、この溶液をインクジェット方式によりアレイ用基板上に吐出するものである。１要素当たりの蛍光分子数ｎRMは、これらの諸量（溶液量および溶液中の蛍光分子数）と溶液の吐出量とから計算して求められる。なお、蛍光分子の保持方法として固相化試薬を用いると確実な保持が可能となるが、必ずしも必要ではない。
【００６４】
(3)ステップＳ３：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、レファレンスアレイ４の蛍光画像を色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、レファレンスアレイ４を励起光源１１で励起照明して、各蛍光分子保持用要素５内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この際、検査者は励起フィルタユニット１４０を切り替え操作して所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルタ１４を照明光路ｂ上に配置し、さらにＮＤフィルタユニット１７０を切り替え操作して所望のＮＤフィルタ１７を観察光路ａ上に配置する。
【００６５】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介してレファレンスアレイ４の上面全体に照射される。レファレンスアレイ４から発生した蛍光は、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、ＮＤフィルタ１７、および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、蛍光分子の色別に蛍光画像が撮り込まれる。従ってこの段階で、２色×ＮＤフィルタの枚数分の蛍光画像が得られる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだ蛍光画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００６６】
なお、本実施の形態では受光素子としてＣＣＤを用いているが、ＣＣＤに特定するものではなく、他のエリアセンサを用いても良い。従って、以下に記述される「ＣＣＤ」は「エリアセンサ」でも通用するものである。
【００６７】
(4)ステップＳ４：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、レファレンスアレイ４のバックグラウンド画像を蛍光分子の色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、レファレンスアレイ４の蛍光画像を撮り込んだ直後にシャッター１２により励起照明を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を撮り込む。このバックグラウンド画像の数は、蛍光画像の数と同一となる。このバックグラウンド画像は、検出強度に不要な暗電流ノイズおよび迷光ノイズにより構成される。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだバックグラウンド画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００６８】
(5)ステップＳ５：検査者は、生化学検査用アレイ１に生化学的物質の混合溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させる。この場合検査者は、図１に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図２の（ａ）に示す生化学検査用アレイ１を配置し、その表面に一様に生化学的物質の混合溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと混合溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素３内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子が間接的にプローブに結合することになる。
【００６９】
(6)ステップＳ６：検査者は、生化学検査用アレイ１から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１の各プローブアレイ要素３から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。
【００７０】
(7)ステップＳ７：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１の蛍光画像を色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ１を励起光源１１で励起照明して、各プローブアレイ要素３内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この際、検査者は励起フィルタユニット１４０を切り替え操作して所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルタ１４を照明光路ｂ上に配置し、さらにＮＤフィルタユニット１７０を切り替え操作して所望のＮＤフィルタ１７を観察光路ａ上に配置する。
【００７１】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介して生化学検査用アレイ１の上面全体に照射される。生化学検査用アレイ１から発生した蛍光は、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、ＮＤフィルタ１７、および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、蛍光分子の色別に蛍光画像が撮り込まれる。この生化学検査用アレイ１の蛍光画像の数は、レファレンスアレイ４のバックグラウンド画像および蛍光画像の数と同一となる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだ蛍光画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００７２】
(8)ステップＳ８：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像を蛍光分子の色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、前述した生化学検査用アレイ１の蛍光画像を撮り込んだ直後にシャッター１２により励起照明を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を撮り込む。この生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像の数は、蛍光画像の数と同一となる。このバックグラウンド画像は、レファレンスアレイ４のバックグラウンド画像と同様に、検出強度に不要な暗電流ノイズおよび迷光ノイズにより構成される。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだバックグラウンド画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００７３】
(9)ステップＳ９：画像処理部２０は、レファレンスとサンプルの各蛍光画像から各バックグラウンド画像を差し引き、色別およびＮＤフィルタ別の補正画像とする。一般的に、受光素子の出力には暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズが含まれる。この直流ノイズを除去するために、レファレンスアレイ４および生化学検査用アレイ１について各々蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き、これを補正画像と称し以後の処理の対象とする。従って、この段階で２色×ＮＤフィルタの枚数の補正画像が得られる。なお、蛍光画像およびバックグラウンド画像は、以後不要となる。
【００７４】
(10)ステップＳ１０：画像処理部２０は、各補正画像中の位置検出用アレイ要素２に対応する画像の重心位置を検出する。図２の（ａ）および図３に示すように、生化学検査用アレイ１およびレファレンスアレイ４に形成されるアレイ要素は二次元に配列されており、共に４隅に位置する４個のアレイ要素が位置検出用アレイ要素２として用いられる。それ以外のアレイ要素はプローブアレイ要素３または蛍光分子保持用要素５として用いられる。
【００７５】
位置検出用アレイ要素２は位置信号を出すためのものであるから、その要素内の物質は発光物質または反射物質であれば何でも良いことになるが、望ましくは使用される２色の蛍光波長とは異なる蛍光波長の蛍光物質を用いる方が良い。その理由は、位置検出用アレイ要素２から発生する蛍光がノイズとして作用する可能性を無くすことができるからである。この場合には、位置検出用の励起波長で照明し、位置検出をすることになる。
【００７６】
(11)ステップＳ１１：画像処理部２０は、各補正画像を回転移動して、色別およびＮＤフィルタ別の回転画像とする。この場合、レファレンスアレイ４および生化学検査用アレイ１について各々得られた４個の位置座標で形成される各四辺形が最小偏差で矩形となるように位置座標を修正してから、各矩形の各辺が座標軸と平行になるように各画像中心を回転中心として各補正画像を回転移動する。移動後の画像を各々回転画像と呼ぶ。なお、各補正画像は以後不要となる。
【００７７】
(12)ステップＳ１２：画像処理部２０は、各回転画像を蛍光分子保持用要素５およびプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、各々色別、ＮＤフィルタ別および要素別の分割画像とする
この場合、画像処理部２０は、レファレンスアレイ４および生化学検査用アレイ１の各回転画像の４個の位置座標と蛍光分子保持用要素５およびプローブアレイ要素３の配列条件とから分割条件を決定して、この分割条件ですべての回転画像を蛍光分子保持用要素５またはプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、分割画像とする。なお、レファレンスアレイ４の回転画像の分割画像をレファレンス分割画像、生化学検査用アレイ１の回転画像の分割画像をサンプル分割画像と呼ぶ。従ってこの段階で、２×ＮＤフィルタの枚数×プローブアレイ要素数分の分割画像が得られる。なお、各回転画像は以後不要となる。
【００７８】
(13)ステップＳ１３：画像処理部２０は、最適なＮＤフィルタ１７に対応する各分割画像を色別および要素別の測定用画像として抽出する。
【００７９】
この場合、画像処理部２０は、同一色で同一位置の蛍光分子保持用要素５のＮＤフィルタ枚数分のレファレンス分割画像の中から、最大信号強度がダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大であるレファレンス分割画像を１個抽出する。これを測定用レファレンス画像と呼ぶ。同様に画像処理部２０は、同一色で同一位置のプローブアレイ要素３のＮＤフィルタ枚数分のサンプル分割画像の中から、最大信号強度がダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大であるサンプル分割画像を１個抽出する。これを測定用サンプル画像と呼ぶ。
【００８０】
(14)ステップＳ１４：画像処理部２０は、抽出した各測定用画像を二値化し、色別および要素別の二値化画像とする。測定用レファレンス画像および測定用サンプル画像のすべてについて、各々最大信号の１／２レベルで二値化し、これをそれぞれレファレンス二値化画像およびサンプル二値化画像とする。サンプル二値化画像については二値化領域４１の面積ＳMkを算出する。
【００８１】
(15)ステップＳ１５：画像処理部２０は、各二値化画像により測定領域４２およびノイズサンプリング領域４３を設定する。
【００８２】
この場合画像処理部２０は、レファレンス二値化画像のすべてについて、各々の最大ｘ座標ｘRMkmax、最小ｘ座標ｘRMkmin、最大ｙ座標ｙRMkmaxおよび最小ｙ座標ｙRMkminを求める。同様にサンプル二値化画像のすべてについて、各々の最大ｘ座標ｘSMkmax、最小ｘ座標ｘSMkmin、最大ｙ座標ｙSMkmaxおよび最小ｙ座標ｙSMkminを求めてから、ノイズのサンプリング領域を設定するための座標ｘ′RMkmax、ｘ′RMkmin、ｙ′RMkmax、ｙ′RMkmin、ｘ′SMkmax、ｘ′SMkmin、ｙ′SMkmaxおよびｙ′SMkminを算出する。
【００８３】
そして、点（ｘ′RMkmin，ｙ′RMkmin）および点（ｘ′RMkmax，ｙ′SMkmax）で定まる矩形内を測定用レファレンス画像の測定領域とし、該矩形外を測定用レファレンス画像のノイズサンプリング領域とする。同様に、点（ｘ′SMkmin，ｙ′SMkmin）および点（ｘ′SMkmax，ｙ′SMkmax）で定まる矩形内を測定用サンプル画像の測定領域とし、該矩形外を測定用サンプル画像のノイズサンプリング領域とする。
【００８４】
(16)ステップＳ１６：画像処理部２０は、測定用画像上で測定領域４２の信号から平均ノイズ信号を差し引く。
【００８５】
この場合画像処理部２０は、測定用レファレンス画像のノイズサンプリング領域４３の信号から単位面積当たりのノイズを求め、測定用レファレンス画像の測定領域４２の信号からこの信号を差し引いてレファレンス画像の検出信号とする。同様に、測定用サンプル画像のノイズサンプリング領域４３の信号から単位面積当たりのノイズを求め、測定用サンプル画像の測定領域４２の信号からこの信号を差し引いてサンプル画像の検出信号とする。
【００８６】
(17)ステップＳ１７：画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の標準面積当たりの信号強度を色別に算出する。
【００８７】
この場合画像処理部２０は、各蛍光分子保持用要素５の測定領域４２内での検出信号の総和をＰRMk として算出する。同様に、各プローブアレイ要素３の測定領域４２内での検出信号の総和をＰSMk として算出する。次いで、プローブアレイ要素３の標準面積ＳO 当たりの信号強度を（６）式を用いて色別に算出する。これらの信号強度は、励起光むら、励起光ノイズおよびプローブの分注誤差により生じる強度誤差が除去された強度として得られる。
【００８８】
(18)ステップＳ１８：画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の標準面積当たりに存在する蛍光分子（または化学発光分子）数を色別に算出する。この場合画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の標準面積ＳO 当たりの信号強度から、（１１）式、（１２）式および（１３）式を用いてプローブアレイ要素３の標準面積ＳO 当たりに存在する蛍光分子数ｎMkを色別に算出する。
【００８９】
(19)ステップＳ１９：画像処理部２０は、色別に算出した蛍光分子（または化学発光分子）数を両軸とする散布図を表示する。この場合画像処理部２０は、２色の蛍光物質のプローブアレイ要素３ごとの蛍光分子数を各々ｘ軸およびｙ軸とした散布図を、表示部２１に表示する。
【００９０】
図９は、上記散布図の例であり、ｘ軸をサンプルＡの蛍光分子数、ｙ軸をサンプルＢの蛍光分子数として対数メモリ上に示している。図９はｍ個のプローブアレイ要素３の各プローブについて簡略して示しており、‘プローブ３’以外はサンプルＡとサンプルＢの蛍光分子数のバランスが範囲９１（二本の破線間）内にある。この場合、サンプルＡとサンプルＢについて、そのプローブとの結合反応が同程度と判断され、プローブ３についてはサンプルＢの反応がサンプルＡの反応よりも明らかに強いと判断される。なお、ｘ軸およびｙ軸はいずれも対数軸とし、前記範囲９１を決定する二本の破線は、ｙ＝ｍnｘ および ｙ＝（１／ｍn）ｘ、実線はｙ＝ｘの直線で表わされる（３本の直線は数学的に平行となる）。ｙ＝ｘに対して±１０％の範囲を設定する場合には、ｍn＝１．１とし、この値を画像処理部２０で適宜設定して表示できる。このような散布図により、各プローブアレイ要素のプローブとサンプルとの反応状態を正確に表現できる。
【００９１】
本第１の実施の形態によれば、レファレンス蛍光画像を導入しているので、励起照明に空間的にむらがある場合でも適切に出力補正することができる。さらに、使われる蛍光分子の発光特性およびその時間的変動をも考慮した方法であるので、各プローブアレイ要素ごとに存在する標識Ｍの蛍光分子数ｎMkすなわちプローブと対象物質との反応状態を正確に求めることができる。この場合には、標識は蛍光分子に限らず、化学発光分子等の発光性分子であれば良い。なお、レファレンス蛍光画像の撮り込みとサンプル蛍光画像の撮り込みは、順序を逆にしても何ら支障がない。
【００９２】
図１０は、本第２の実施の形態で使用する生化学検査用アレイの上面のフォーマットを示す図である。図１０に示す生化学検査用アレイ６は、図２の（ａ）に示した生化学検査用アレイ１における４個の位置検出用アレイ要素２を、それぞれプローブアレイ要素３に代えた構成をなしている。
【００９３】
図１１は、本第２の実施の形態で使用するレファレンスアレイの上面のフォーマットを示す図である。図１１に示すレファレンスアレイ７は、蛍光分子を保持可能な三次元アレイからなり、一面の蛍光分子保持領域８が設けられている。該蛍光分子保持領域８は、図１０に示した全プローブアレイ要素３の占める領域よりも広い領域として設定される。なお、生化学検査用アレイ６およびレファレンスアレイ７は、第１の実施の形態に示した生化学検査用アレイ１およびレファレンスアレイ４に代えて用いられる。
【００９４】
以下、本第２の実施の形態における生化学検査の概略を説明する。
【００９５】
最初に検査者は、アレイ用基板に標識として使用する蛍光分子と同一の蛍光分子を蛍光分子保持領域８に均一な分布で供給してレファレンスアレイ７を製作する。
【００９６】
次に、顕微鏡観察下で位置出し配置されたレファレンスアレイ７に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みレファレンス蛍光画像とする。該レファレンス蛍光画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００９７】
次に検査者は、前記レファレンスアレイ７を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイ６を配置する。この生化学検査用アレイ６では、あらかじめプローブ液をプローブアレイ要素３にそれぞれ固相化してある。
【００９８】
次に検査者は、該生化学検査用アレイ６に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素３から除去する。
【００９９】
次に、該生化学検査用アレイ６に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みサンプル蛍光画像とする。該サンプル蛍光画像は、前記レファレンス蛍光画像と同じく標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッターなどで励起照明を遮断するのが好ましい。前記サンプル蛍光画像の各プローブアレイ要素３ごとの信号強度をＰMkで表す。ここでＭは蛍光物質に対応する添字、ｋはプローブアレイ要素の番号である。
【０１００】
次に画像処理部２０は、各プローブアレイ要素３の位置および実面積ＳMkを画像処理により検出し、（６）式を用いてＰMkを算出し、前記レファレンス蛍光画像から前記位置と同じ位置におけるプローブアレイ要素３の標準面積ＳO に相当する信号強度を切り出し、この信号強度をＰRMk で表す。ここでＲはレファレンスを意味する添字である。
【０１０１】
次に、前記サンプル蛍光画像のプローブアレイ要素３ごとの信号強度ＰMkを前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子数ｎMkで表すと、前述と同じ（７）式となる。
【０１０２】
以後の処理は、第１の実施の形態と同様である。ただし、本第２の実施の形態は第１の実施の形態と異なりｎRMが不明であるので、一般的には蛍光物質の構成比率を求めるに留まる。しかし、レファレンスアレイ７を第１の実施の形態に使用するレファレンスアレイ４で予め較正することによりＩMkを求めておけば、蛍光物質の絶対数量を求めることもできる。
【０１０３】
本第２の実施の形態では、望ましくは自家蛍光作用の無いレファレンス用基板を用いる方が良い。これは、レファレンスアレイ７では自家蛍光ノイズを除去するためのサンプリング領域が確保できないためである。しかしながら、レファレンスアレイ７と同一の基板をそのまま第二のレファレンスアレイとし、この中の各プローブアレイ要素に対応する領域をサンプリング領域として自家発光強度を検出し、これを前記信号強度ＰMkから差し引くことにより、自家蛍光作用を有するレファレンス用基板であっても自家蛍光ノイズを除去することができる。この場合は、他のノイズも同時に除去することができる利点がある。また、本第２の実施の形態の固有の効果は、レファレンスアレイの製作が容易であることにある。なお、レファレンス蛍光画像の撮り込みとサンプル蛍光画像の撮り込みは、順序を逆にしても何ら支障がないことは第１の実施の形態と同様である。
【０１０４】
本発明によれば、以下のような作用を奏する。
【０１０５】
（１）本発明の生化学的検査方法によれば、サンプル光画像をレファレンス蛍光画像で補正することにより、照明が均一でない場合でも各プローブアレイ要素内でのプローブと生化学的物質との反応状態を正確に検査することができる。
【０１０６】
（２）立体構造の反応担体を用いる場合、反応系が複雑となるため不正確になりがちであるが、本発明の生化学的検査方法によれば、実比較できるため上記（１）による作用効果が増大する。
【０１０７】
（３）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１０８】
（４）本発明の生化学的検査方法によれば、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１０９】
（５）本発明の生化学的検査方法によれば、レファレンスアレイを容易に製造することができる。
【０１１０】
（６）本発明の生化学的検査方法によれば、プローブアレイ要素の近傍での励起光ノイズを除去することができるため、各プローブアレイ要素における反応状態を正確に検査することができる。
【０１１１】
（７）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、表面での光学的特性が複雑であるため、プローブアレイ要素の近傍でのノイズを補正でき、上記（６）による作用効果が増大する。
【０１１２】
（８）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（６）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１１３】
（９）本発明の生化学的検査方法によれば、アレイ要素の近傍での励起光ノイズを除去することができるため、各アレイ要素における反応状態を正確に検査することができる。
【０１１４】
（１０）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、反応量がプローブアレイ要素の面積に比例するので、この面積で補正することによりプローブの分注誤差を除去することになる。従って、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態の比較を正確に行なうことができる。
【０１１５】
（１１）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１０）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態の比較を正確に行なうことができる。
【０１１６】
（１２）本発明の生化学的検査方法によれば、例えば立体構造の反応担体を用いる場合、反応量がプローブアレイ要素の面積に比例するので、この面積で補正することによりプローブの分注誤差を除去することになる。従って、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態の比較を正確に行なうことができる。
【０１１７】
（１３）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の蛍光分子数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および係数蛍光分子数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する発光性分子の数を正確に求めることができる。
【０１１８】
（１４）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、反応系が複雑となるため、システムに対応する非線型係数を用いることで上記（１３）による作用効果が増大する。
【０１１９】
（１５）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１３）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１２０】
（１６）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２１】
（１７）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２２】
（１８）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２３】
（１９）本発明の生化学的検査方法によれば、各プローブアレイ要素内に存在する色ごとの発光性分子の数を求めることができる。
【０１２４】
（２０）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２５】
図１２は、本発明の第３の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１２において図１と同一な部分には同符号を付してある。
【０１２６】
図１２において、画像処理部２０には、システム制御部２２、ファイル処理部２３、および入力部２４が接続されている。ファイル処理部２３には記憶部２５が接続されている。入力部２４は、マウスや各種ボタンを備えている。なお、励起フィルタ１４、ダイクロイックミラー１５、およびＮＤフィルタ１７は、キューブユニットを構成する。励起フィルタ１４とダイクロイックミラー１５とＮＤフィルタ１７の観察光路ａおよび照明光路ｂ上での組み合せに応じて、異物検出キューブ、レファレンス用キューブ、蛍光Ｍ用キューブが構成される。
【０１２７】
図１３〜図２１は、本第３の実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図１３〜図２１に従って検査方法およびその作用を説明する。
【０１２８】
図１３は、蛍光輝度測定の手順を示すメインフローチャートである。ステップＳ２１で、表示部２１にシステムイメージの画像が表示される。ステップＳ２２で、画像処理部２０はファイル処理部２３を介して記憶部２５からシステム変数を読み込む。システム変数は、以下の通りである。
【０１２９】
β;光学系の横倍率 ＡＳ;検出開口数 Δ;デフォーカス量の絶対値
λＧ;異物検出波長 Ｎｘ，Ｎｙ;カメラの有効画素数
ＰＩ;カメラの画素ピッチ Ｂ;ＡＤ変換ビット数 ｔ０;最小蓄積時間
ステップＳ２３で、チップアレイフォーマットとして生化学検査用アレイ１のフォーマットが設定される。ステップＳ２４で、測定条件が設定される。ステップＳ２５で、画像処理部２０は、ＨＧ＝０，ＨＳ＝０、測定開始スイッチ＝０、測定終了スイッチ＝０とする。ステップＳ２６で、ＳＷＲ＝１である場合、ステップＳ２７で、レファレンスが設定され、ステップＳ２８で、検査者によりサンプルチップである生化学検査用アレイ１がセットされる。ステップＳ２６で、ＳＷＲ＝１でない場合、ステップＳ２８で、生化学検査用アレイ１がセットされる。ステップＳ２９で、測定開始スイッチ＝１になった場合、ステップＳ３０で、画像処理部２０は、測定開始スイッチ＝０とする。
【０１３０】
ステップＳ３１で、ＳＷＧ＝１である場合、システム制御部２２は、ステップＳ３２で上記キューブユニットを異物検出キューブに切換え、ステップＳ３３で励起光の光路上のシャッター１２を開く。ステップＳ３４で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９から異物画像（ゴミ画像）を撮り込んだ後、ステップＳ３５で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。画像処理部２０は、ステップＳ３６で異物画像を微分し、ステップＳ３７で異物判定度を決定し、ステップＳ３８で異物関数を決定し、ステップＳ３９で、ｗＧｔ（ｘ，ｙ）＝ｗＧ（ｘ，ｙ）とする。
【０１３１】
ステップＳ３９の後、またはステップＳ３１でＳＷＧ＝１でない場合、ステップＳ４０で、システム制御部２２はシャッター１２を開く。ステップＳ４１で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９からサンプル画像を撮り込んだ後、ステップＳ４２で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。
【０１３２】
画像処理部２０は、ステップＳ４３で蛍光輝度の測定を行い、ステップＳ４４で測定データのアレイイメージを表示部２１に表示し、ステップＳ４５でｔ測定データをファイル処理部２３を介して記憶部２５に保存する。なお、測定データは、ρＲ;レファレンス異物占有率、ρ;サンプル異物占有率、ΓＭＢ;蛍光バックグラウンド輝度、（ｉ，ｊ）；スポット番地、Γ”Ｍ（ｉ，ｊ）;スポット輝度、ΓＭＣ（ｉ，ｊ）；蛍光クロストーク輝度、ＳＭ（ｉ，ｊ）；スポット面積、ＲＥＭＭ（ｉ，ｊ）；メッセージ、からなる。
【０１３３】
ステップＳ４６で測定終了スイッチ＝１である場合、ステップＳ４７で、ファイル処理部２３は、チップアレイフォーマット、サンプル条件、測定条件の記述されたファイルを記憶部２５に保存し、処理を終了する。ステップＳ４６で測定終了スイッチ＝１でない場合、ステップＳ２９以降の処理が行われる。
【０１３４】
図１４は、上記ステップＳ２３に示したチップアレイフォーマット設定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ１０１で、検査者は、入力部２４のオプションボタンにより、アレイフォーマット設定画面を指定する。なお、オプションボタン‘Ａ’は「既存のアレイフォーマットファイルを編集する」、‘Ｂ’は「最後に使用したアレイフォーマットファイルを編集する」、‘Ｃ’は「新規にアレイフォーマットファイルを設定する」であり、デフォルトは‘Ｂ’である。
【０１３５】
ステップＳ１０２で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘ＯＫ’は「アレイフォーマット設定画面を確定して次に進む」であり、‘中止’は「ファイルを更新しないで終了する」である。
【０１３６】
ステップＳ１０３でオプションボタン‘Ａ’が設定され、ステップＳ１０４で保存可能なＦＤ（フロッピー（登録商標）ディスク）がセットされ、ステップＳ１０５でＦＤに指定ファイルが有る場合、ステップＳ１０６で、ファイル処理部２３はＦＤにディレクトリを移動する。検査者は入力部２４から、ステップＳ１０７でリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ１０８でコマンドボタンにより指定ファイルを開く。
【０１３７】
ステップＳ１０３でオプションボタン‘Ｂ’が設定された場合、ステップＳ１０９で、ファイル処理部２３は記憶部２５に保存されているリースントファイルを開く。ステップＳ１０３でオプションボタン‘Ｃ’が設定された場合、ステップＳ１１０で、ファイル処理部２３はデフォルトファイルを開く。ステップＳ１０８、Ｓ１０９、Ｓ１１０の後、ステップＳ１１１で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンによりアレイフォーマットの設定値を確定する。
【０１３８】
ステップＳ１１２で、画像処理部２０は、テキストボックスによりステップＳ１１１で確定したチップアレイ変数を読み込む。チップアレイ変数は、以下の通りである。
【０１３９】
Ｓ０；プローブ１個の標準面積 Ｐｘ，Ｐｙ；プローブのピッチ
ｍｘ，ｍｙ；プローブ配列数 ＮＰ；位置検出用プローブ数
ステップＳ１１３で、画像処理部２０は、
Ｒ０＝０．６４＋１．４４Ｓ０／πＰｘＰｙ
を計算し、処理を終了する。
【０１４０】
図１５は、上記ステップＳ２４に示した測定条件設定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ２０１で、検査者は、入力部２４のオプションボタンにより、測定条件設定画面を指定する。なお、オプションボタン‘Ａ’は「既存の測定条件ファイルを編集する」、‘Ｂ’は「最後に使用した測定条件ファイルを編集する」、‘Ｃ’は「新規に測定条件ファイルを設定する」であり、デフォルトは‘Ｂ’である。
【０１４１】
ステップＳ２０２で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘ＯＫ’は「測定条件設定画面の指定方法を確定して次に進む」であり、‘中止’は「ファイルを更新しないで終了する」である。
【０１４２】
ステップＳ２０３でオプションボタン‘Ａ’が設定された場合、検査者は入力部２４から、ステップＳ２０４でリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ２０５でコマンドボタンにより指定ファイルを開く。ステップＳ２０３でオプションボタン‘Ｂ’が設定された場合、ステップＳ２０６で、ファイル処理部２３は記憶部２５に記憶されているリースントファイルを開く。ステップＳ２０３でオプションボタン‘Ｃ’が設定された場合、ステップＳ２０７で、ファイル処理部２３は記憶部２５に記憶されているデフォルトファイルを開く。
【０１４３】
ステップＳ２０５、Ｓ２０６、Ｓ２０７の後、ステップＳ２０８で、検査者は、入力部２４にてテキストボックスによりユーザー変数の編集を行う。ステップＳ２０９で、検査者は、入力部２４にてチェックボックスによりユーザー機能の追加と削除を行う。ステップＳ２１０で、検査者は、入力部２４にて測定条件の編集を行う。ステップＳ２１１で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより測定条件を確定する。
【０１４４】
ステップＳ２１２で、画像処理部２０は入力部２４から、ステップＳ２１１で確定したユーザー標識変数、ユーザー測定変数、及びユーザー機能変数を読み込み、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１４５】
ユーザー標識変数は、以下の通りである。（()内はデフォルト値）
Ｍｍａｘ;蛍光標識数(2)
ＭＡ;サンプルＡの蛍光標識（ＦＩＴＣ）（λＡ自動入力）
ＭＢ;サンプルＢの蛍光標識（ＴＥＸＳ ＲＥＤ）（λＢ自動入力）
（Ｍｍａｘ＝２の時）
ユーザー測定変数は、以下の通りである。（()内はデフォルト値）
ｔ０;最小蓄積時間(ｔ０) ｎｍａｘ；蓄積階層数（ＡＵＴＯ）
ｋｍａｘ；測定回数(10)
ＮＰ; 位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）(0)
ユーザー機能変数は、以下の通りである。（機能付は１、無は０、()内はデフォルト値）
ＳＷＲ；レファレンス処理(1)
ＳＷＲＧ；レファレンスチップの異物処理(1)（ＳＷＲ＝１の時）
ＳＷＢ；バックグラウンド処理(1)
ＳＷＧ；サンプルの異物処理(1)(オプションボタン併用)
（非処理データとの併用出力の場合はＳＷＧ＝２）
図１６は、上記ステップＳ２７に示したレファレンス設定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ３０１で、検査者は、入力部２４のオプションボタンにより、レファレンスモードを指定する。なお、オプションボタン‘Ａ’は「既存のレファレンスファイルを使用する」、‘Ｂ’は「最後に使用したレファレンスファイルを使用する」、‘Ｃ’は「新規にレファレンス輝度を測定する」であり、デフォルトは‘Ｂ’である。
【０１４６】
ステップＳ３０２で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘ＮＥＸＴ’は「次に進む」であり、‘ＢＡＣＫ’は「前に戻る」である。
【０１４７】
ステップＳ３０３でオプションボタン‘Ａ’が設定された場合、ステップＳ３０４で、検査者は入力部２４からリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ３０５で、画像処理部２０は指定されたファイルを対象ファイルとする。ステップＳ３０３でオプションボタン‘Ｂ’が設定された場合、ステップＳ３０６で、画像処理部２０はリースントファイルを対象ファイルとする。ステップＳ３０５またはステップＳ３０６の後、ステップＳ３０７で、画像処理部２０は対象ファイルからＷＲ（ｘ，ｙ）を読み込み、処理を終了する。
【０１４８】
ステップＳ３０３でオプションボタン‘Ｃ’が設定された場合、ステップＳ３０８で、検査者によりレファレンスチップであるレファレンスアレイ４がセットされる。ステップＳ３０９でＳＷＲＧ＝１である場合、システム制御部２２は、ステップＳ３１０で上記キューブユニットを異物検出キューブに切換え、ステップＳ３１１でシャッター１２を開く。ステップＳ３１２で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９から異物画像を撮り込んだ後、ステップＳ３１３で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。画像処理部２０は、ステップＳ３１４で異物画像を微分し、ステップＳ３１５でレファレンス異物判定度を決定し、ステップＳ３１６で異物関数を決定し、ステップＳ３１７で、ｗＲＧ（ｘ，ｙ）＝ｗＧ（ｘ，ｙ）とする。
【０１４９】
ステップＳ３１７の後、またはステップＳ３０９でＳＷＧ＝１でない場合、システム制御部２２は、ステップＳ３１８で上記キューブユニットをレファレンス用キューブに切換え、ステップＳ３１９でシャッター１２を開く。ステップＳ３２０で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９からレファレンス蛍光画像を撮り込んだ後、ステップＳ３２１で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。
【０１５０】
画像処理部２０は、ステップＳ３２２でレファレンスバックグラウンドの補正を行い、ステップＳ３２３でファイル処理部２３がリースントファイルとしてレファレンス変数を保存する。
【０１５１】
ステップＳ３２４で、検査者が入力部２４のオプションボタンにより、‘保存する’を指定した場合、ステップＳ３２５で、検査者は入力部２５からリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ３２６で、ファイル処理部２３はリースントファイルを指定されたファイルにコピーし、処理を終了する。ステップＳ３２４で、検査者が入力部２５のオプションボタンにより、‘保存しない’を指定した場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１５２】
図１７は、上記ステップＳ４１に示したサンプル画像撮り込みの手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ４０１でＭ＝１とし、ステップＳ４０２でｎＭｍａｘ＝ｎｍａｘとする。ステップＳ４０３で、検査者は上記キューブユニットを蛍光Ｍ用キューブに切換える。画像処理部２０は、ステップＳ４０４でｎ＝１とし、ステップＳ４０５でｋ＝１，ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＝０とする。
【０１５３】
システム制御部２２及び画像処理部２０は、ステップＳ４０６でＣＣＤカメラ１９から、蓄積時間２ｎ−１ｔ０でサンプルチップの蛍光画像を第ｎ階層蛍光画像Γ’Ｍｎ（ｘ，ｙ）として撮り込み、ステップＳ４０７で、ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＋Γ’Ｍｎ（ｘ，ｙ）を計算する。画像処理部２０は、ステップＳ４０８で、ｋ＝ｋｍａｘでない場合、ステップＳ４０９でｋ＝ｋ＋１とし、ステップＳ４０６以降の処理を行う。
【０１５４】
ステップＳ４０８で、ｋ＝ｋｍａｘである場合、画像処理部２０は、ステップＳ４１０で、ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）／ｋによりｋｍａｘ個の平均画像を計算し、ステップＳ４１１で、画像中央部の最小輝度ΓＭｎminの計測を行う。
【０１５５】
このように、蓄積時間を同一とするサンプルチップの複数の蛍光画像が撮り込まれ、それら蛍光画像の平均画像が算出される。
【０１５６】
画像処理部２０は、ステップＳ４１２でｎ＝ｎＭｍａｘでなく、ステップＳ４１３でΓＭｎｍｉｎ＞２Ｂ−１でない場合、ステップＳ４１４でｎ＝ｎ＋１とし、ステップＳ４０５以降の処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ４１３でΓＭｎｍｉｎ＞２Ｂ−１である場合、ステップＳ４１５でｎＭｍａｘ＝ｎとする。
【０１５７】
ステップＳ４１５の後、またはステップＳ４１２でｎ＝ｎＭｍａｘである場合、画像処理部２０は、ステップＳ４１６でＭ＝Ｍｍａｘでなければ、ステップＳ４１７でＭ＝Ｍ＋１とし、ステップＳ４０２以降の処理を行い、ステップＳ４１６でＭ＝Ｍｍａｘであれば、処理を終了する。
【０１５８】
図１８は、上記ステップＳ４１１に示した中央部の最小輝度計測の手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ５０１でΓＭｎｍｉｎ＝２Ｂ−１とし、ステップＳ５０２でｙ＝０、ステップＳ５０３でｘ＝０とする。画像処理部２０は、ステップＳ５０４で、０．４５Ｎｘ−１＜ｘ＜０．５５Ｎｘ−１であり、ステップＳ５０５で、０．４５Ｎｙ−１＜ｙ＜０．５５Ｎｙ−１であり、ステップＳ５０６で、ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＜ΓＭｎｍｉｎである場合、ステップＳ５０７で、ΓＭｎｍｉｎ＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）とする。
【０１５９】
ステップＳ５０７の後、またはステップＳ５０４で０．４５Ｎｘ−１＜ｘ＜０．５５Ｎｘ−１でない場合、またはステップＳ５０５で０．４５Ｎｙ−１＜ｙ＜０．５５Ｎｙ−１でない場合、またはステップＳ５０６でΓＭｎ（ｘ，ｙ）＜ΓＭｎｍｉｎでない場合、画像処理部２０は、ステップＳ５０８でｘ＝Ｎｘ−１でなければ、ステップＳ５０９でｘ＝ｘ＋１とし、ステップＳ５０４以降の処理を行う。
【０１６０】
ステップＳ５０８でｘ＝Ｎｘ−１であり、ステップＳ５１０でｙ＝Ｎｙ−１でない場合、画像処理部２０は、ステップＳ５１１でｙ＝ｙ＋１とし、ステップＳ５０３以降の処理を行う。ステップＳ５１０でｙ＝Ｎｙ−１である場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１６１】
図１９は、上記ステップＳ４３に示した蛍光輝度測定の手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ６０１でＭ＝１とし、ステップＳ６０２で、サンプル蛍光画像の迷光補正と空間移動平均化処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ６０３で画像分割線を決定し、ステップＳ６０４でサンプル蛍光画像を回転し、ステップＳ６０５で蛍光バックグラウンド補正を行う。この蛍光バックグラウンド補正では、サンプル蛍光画像のノイズサンプリング領域（ローカルバックグラウンド領域）内の蛍光の最小検出量を蛍光バックグラウンドとし、該蛍光バックグラウンドを前記サンプル蛍光画像から差し引いた蛍光画像を対象画像とする。この場合、図４に示すように、測定領域４２の境界とノイズサンプリング領域４３の境界とを同一とする。
【０１６２】
画像処理部２０は、ステップＳ６０６でｊ＝１、ステップＳ６０７でｉ＝１、ステップＳ６０８でｎ＝ｎｍａｘとする。画像処理部２０は、ステップＳ６０９で最適画像のチェックをし、ステップＳ６１０で、
【数１３】
【０１６３】
である場合、ステップＳ６１１で測定領域を決定する。
画像処理部２０は、ステップＳ６１２で、ｘ’ｍｉｎ＝ｂ２’（ｉ，ｊ−１）でなく、ステップＳ６１３で、ｘ’ｍａｘ＝ｂ２’（ｉ，ｊ）でなく、ステップＳ６１４で、ｙ’ｍｉｎ＝ｂ１’（ｉ−１）でなく、ステップＳ６１５で、ｙ’ｍａｘ＝ｂ１’（ｉ）でない場合、ステップＳ６１６でスポット輝度を計測する。ステップＳ６１２でｘ’ｍｉｎ＝ｂ２’（ｉ，ｊ−１）であるか、ステップＳ６１３でｘ’ｍａｘ＝ｂ２’（ｉ，ｊ）であるか、ステップＳ６１４でｙ’ｍｉｎ＝ｂ１’（ｉ−１）であるか、ステップＳ６１５でｙ’ｍａｘ＝ｂ１’（ｉ）である場合、ステップＳ６１７で、画像処理部２０は、ＲＥＭＭ（ｉ，ｊ）＝スポット異常とする。
【０１６４】
ステップＳ６１０で、
【数１４】
【０１６５】
でなく、ステップＳ６１８でｎ＝１でない場合、画像処理部２０は、ステップＳ６１９でｎ＝ｎ−１とし、ステップＳ６０９以降の処理を行う。ステップＳ６１８でｎ＝１である場合、画像処理部２０は、ステップＳ６２０で、ＲＥＭＭ（ｉ，ｊ）＝蓄積時間大により計測不能とする。
【０１６６】
ステップＳ６１６またはステップＳ６２０の後、画像処理部２０は、ステップＳ６２１でｉ＝ｍｘでない場合、ステップＳ６２２でｉ＝ｉ＋１とし、ステップＳ６０８以降の処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ６２１でｉ＝ｍｘであり、ステップＳ６２３でｊ＝ｍｙでない場合、ステップＳ６２４でｊ＝ｊ＋１とし、ステップＳ６０７以降の処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ６２３でｊ＝ｍｙであり、ステップＳ６２５でＭ＝Ｍｍａｘでない場合、ステップＳ６２６でＭ＝Ｍ＋１とし、ステップＳ６０２以降の処理を行う。ステップＳ６２５でＭ＝Ｍｍａｘである場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１６７】
なお、上記ステップＳ６０２では、サンプル蛍光画像に対して空間移動平均化により平滑化処理を行ったが、平均化オペレータを用いて平滑化処理を行なってもよい。
【０１６８】
図２０は、上記ステップＳ６０２に示したサンプル蛍光画像の迷光補正と空間移動平均化の手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ７０１でｎ＝１とし、ステップＳ７０２で、ｋ＝１，Γ（ｘ，ｙ）＝０とする。画像処理部２０は、ステップＳ７０３でＣＣＤカメラ１９から、蓄積時間２ｎ−１ｔ０でサンプルチップの第ｎ階層迷光バックグラウンド画像をΓ’（ｘ，ｙ）として撮り込み、ステップＳ７０４で、Γ（ｘ，ｙ）＝Γ（ｘ，ｙ）＋Γ’（ｘ，ｙ）とする。
【０１６９】
ステップＳ７０５でｋ＝ｋｍａｘでない場合、画像処理部２０は、ステップＳ７０６でｋ＝ｋ＋１とし、ステップＳ７０３以降の処理を行う。ステップＳ７０５でｋ＝ｋｍａｘである場合、画像処理部２０は、ステップＳ７０７で、Γｎ（ｘ，ｙ）＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）−Γ（ｘ，ｙ）／ｋによりｋｍａｘ個の平均画像を計算し、ΓＭｎｍａｘ＝０、ΓＭｎｍｉｎ＝２Ｂ−１とする。画像処理部２０は、ステップＳ７０８でｙ＝ｋＳとし、ステップＳ７０９でｘ＝ｋＳとする。
【０１７０】
画像処理部２０は、ステップＳ７１０で、
【数１５】
【０１７１】
を計算し、ステップＳ７１１で、画像中央部の最大輝度
【数１６】
【０１７２】
および最小輝度
【数１７】
【０１７３】
の計測を行う。
画像処理部２０は、ステップＳ７１２で、ｘ＝Ｎｘ−ｋＳ−１でない場合、ステップＳ７１３でｘ＝ｘ＋１とし、ステップＳ７１０以降の処理を行う。ステップＳ７１２でｘ＝Ｎｘ−ｋＳ−１であり、ステップＳ７１４で、ｙ＝Ｎｙ−ｋＳ−１でない場合、画像処理部２０は、ステップＳ７１５でｙ＝ｙ＋１とし、ステップＳ７０９以降の処理を行う。ステップＳ７１４でｙ＝Ｎｙ−ｋＳ−１であり、ステップＳ７１６で、ｎ＝ｎＭｍａｘでない場合、画像処理部２０は、ステップＳ７１７でｎ＝ｎ＋１とし、ステップＳ７０２以降の処理を行う。ステップＳ７１６でｎ＝ｎＭｍａｘである場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１７４】
図２１は、上記ステップＳ６０３に示した画像分割線決定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ８０１で、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８０２で最適反応像（全体像）の二値化を行い、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８０３でノーマーカー用行勾配の演算を行い、ステップＳ８０４でノーマーカー最小列ピッチの演算を行い、ステップＳ８０５でノーマーカー用列信号の挿入を行い、ステップＳ８０６で行分割線関数の演算を行う。
【０１７５】
さらに画像処理部２０は、二値化されたサンプル蛍光画像の全体画像に対して、ステップＳ８０７でノーマーカー用列勾配の演算を行い、ステップＳ８０８でノーマーカー最小行ピッチの演算を行い、ステップＳ８０９でノーマーカー用行信号の挿入を行い、ステップＳ８１０で列分割線関数の演算を行う。画像処理部２０は、ステップＳ８１１で、得られた画像分割線の適否判断を行う。
【０１７６】
ステップＳ８０１でＮＰ＝１である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８１２でマーカー１個の位置検出を行い、ステップＳ８１３で最適反応像（全体像）の二値化を行い、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８１４でノーマーカー用行勾配の演算を行い、ステップＳ８１５で１点マーカー最小列ピッチの演算を行い、ステップＳ８１６でノーマーカー用列信号の挿入を行い、ステップＳ８１７で行分割線関数の演算を行う。
【０１７７】
さらに画像処理部２０は、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８１８でノーマーカー用列勾配の演算を行い、ステップＳ８１９で１点マーカー最小行ピッチの演算を行い、ステップＳ８２０でノーマーカー用行信号の挿入を行い、ステップＳ８２１で列分割線関数の演算を行う。画像処理部２０は、ステップＳ８２２で、得られた画像分割線の適否判断を行う。
【０１７８】
ステップＳ８０１でＮＰ＝２である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８２３でマーカー２個の位置検出を行い、ステップＳ８２４で最適反応像（全体像）の二値化を行い、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８２５でノーマーカー用行勾配の演算を行い、ステップＳ８２６でノーマーカー用列勾配の演算を行い、ステップＳ８２７で２点マーカー用分割線関数の演算を行う。画像処理部２０は、ステップＳ８３２で、最適反応画像を決定する。
【０１７９】
ステップＳ８０１でＮＰ＝３である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８２８でマーカー３個の位置検出を行い、ステップＳ８２９で３点マーカー用分割線関数の演算を行い、ステップＳ８３２で最適反応画像を決定する。ステップＳ８０１でＮＰ＝４である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８３０でマーカー４個の位置検出を行い、ステップＳ８３１で４点マーカー用分割線関数の演算を行い、ステップＳ８３２で最適反応画像を決定する。
【０１８０】
ステップＳ８１１またはステップＳ８２２またはステップＳ８３２の後、ステップＳ８３３で、画像処理部２０は表示部２１に、
【数１８】
【０１８１】
ｙ＝ａ１ｘ＋ｂ１（ｋ）（行分割線）、ｘ＝ａ２ｙ＋ｂ２（ｋ）（列分割線）の表示
を行う。
【０１８２】
図２２は、表示部２１のサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図である。図２２は、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合を示している。図２２に示すように、画像処理部２０は、複数の行分割線７１（横破線）と列分割線７２（縦破線）により、サンプル蛍光画像をプローブアレイ要素単位で複数の分割画像７０に分割する。この場合、各分割画像７０は略正方形状をなしている。検査者は、表示部２１に拡大表示されるサンプル蛍光画像の各分割画像７０上で、入力部２５のマウス等により、測定領域とノイズサンプリング領域（ローカルバックグラウンド領域）とを指定する。画像処理部２０は、該ノイズサンプリング領域からローカルバックグラウンドを検出し、この検出量で前記測定領域からの検出量を補正する。
【０１８３】
ステップＳ８３４で、検査者は、入力部２５のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘分割線補正’は「分割線を補正する」であり、‘ＮＥＸＴ’は「次に進む」であり、‘ＢＡＣＫ’は「メインフローチャートの測定条件の設定（ステップＳ２４）に戻る」であり、‘異常領域指定’は「異常領域を異物画像に加えて再計算する」である。
【０１８４】
検査者は、‘異常領域指定’を確定した場合、入力部２５のマウス等により、表示部２１に表示されるサンプル蛍光画像上で、異常領域を指定する。異常領域とは、異常とみなされるものの、異物画像としては処理されない領域である。画像処理部２０は、指定された異常領域を検査対象外の領域とする。さらに画像処理部２０は、前記異常領域に異物画像の領域を加えて検査対象外の領域とする。
【０１８５】
図２３は、表示部２１のサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図である。図２３は、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合を示している。図２３に示すように、画像処理部２０は、複数の行分割線７１と列分割線７２により、サンプル蛍光画像をプローブアレイ要素単位で複数の分割画像７０に分割する。この場合、各分割画像７０は平行四辺形状をなしている。
【０１８６】
生化学検査用アレイにおけるプローブアレイ要素３の配列状態は、図２３に示すように、行毎（または列毎、または行毎及び列毎）に連続的にずれ、列毎（または行毎、または行毎及び列毎）に勾配を有している場合がある。この場合、図２２に示したような分割を行い、プローブアレイ要素３毎の分割画像を略正方形状とすることはできない。このため画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の配列状態に応じて、全ての行分割線７１と全ての列分割線７２の少なくとも一方（図２３では全ての列分割線７２）を所定角度傾ける処理を行う。これにより、プローブアレイ要素３毎の分割画像は、平行四辺形状になる。
【０１８７】
図２４は、二値化されたサンプル蛍光画像の行分割線と列分割線の勾配演算例を示す概念図である。図２４は、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合を示している。図２４は、全体画像中の各プローブアレイ要素３の部分が明領域、その他の部分が暗領域である二値化画像をなしているものとする。なお画像処理部２０は、サンプル蛍光画像の二値化に際し、測定領域内での出力値の中央値で二値化を行い、二値化画像を得る。
【０１８８】
画像処理部２０は、全体画像中の明領域と暗領域を、−ｘ方向から＋ｘ方向へ向けて検出して＋ｘ方向へ圧縮処理し、全列の明領域圧縮像と暗領域圧縮像を生成する。図２４では、この圧縮処理の結果、明領域と検出された領域がＯＮ信号で、暗領域と検出された領域がＯＦＦ信号で示されている。そして画像処理部２０は、圧縮した明領域と暗領域を示す各ＯＮ信号と各ＯＦＦ信号のｙ軸方向での幅（縦幅）を検出する。
【０１８９】
生化学検査用アレイにおけるプローブアレイ要素３の配列状態は、行毎に傾きを有している場合がある。このため、図２４に示すように行毎に傾き角度に差がある場合、各ＯＮ信号間でｙ軸方向の幅に差が生じるとともに、各ＯＦＦ信号間でｙ軸方向の幅に差が生じる。
【０１９０】
画像処理部２０は、最も広い幅を有するＯＦＦ信号（圧縮した暗領域）が生じたプローブアレイ要素３の行の傾き角度（勾配）、すなわちＯＦＦ信号の示す領域に接する一方の行の傾き角度を算出する。そして画像処理部２０は、算出した傾き角度を、全ての行分割線の傾き角度（勾配）とする。
【０１９１】
また同様に、画像処理部２０は、全体画像中の明領域と暗領域をｙ方向から−ｙ方向へ向けて検出して−ｙ方向へ圧縮処理し、全行の明領域圧縮像と暗領域圧縮像を生成する。この圧縮処理の結果、明領域と検出された領域がＯＮ信号で、暗領域と検出された領域がＯＦＦ信号で示される。そして画像処理部２０は、圧縮した明領域と暗領域を示す各ＯＮ信号と各ＯＦＦ信号のｘ軸方向での幅（横幅）を検出する。
【０１９２】
生化学検査用アレイにおけるプローブアレイ要素３の配列状態は、列毎に傾きを有している場合がある。このため、列毎に傾き角度に差がある場合、各ＯＮ信号間でｘ軸方向の幅に差が生じるとともに、各ＯＦＦ信号間でｘ軸方向の幅に差が生じる。
【０１９３】
画像処理部２０は、最も広い幅を有するＯＦＦ信号（圧縮した暗領域）が生じたプローブアレイ要素３の列の傾き角度（勾配）、すなわちＯＦＦ信号の示す領域に接する一方の列の傾き角度を算出する。そして画像処理部２０は、算出した傾き角度を、全ての列分割線の傾き角度（勾配）とする。
【０１９４】
次に、二値化されたサンプル蛍光画像の各行分割線の間隔と各列分割線の間隔の第１の演算例について説明する。画像処理部２０は、図２４に示すように、全列の圧縮像の各明領域の中央位置をｐとし、全列の圧縮像の各暗領域の中央位置をｑとする。そして画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｐを示す各点を基に、各行分割線の間隔を算出する。あるいは、画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｑを示す各点を基に、各行分割線の間隔を算出する。
【０１９５】
また画像処理部２０は、全行の圧縮像の各明領域の中央位置をｐ’（不図示）とし、全行の圧縮像の各暗領域の中央位置をｑ’（不図示）とする。そして画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｐ’を示す各点を基に、各列分割線の間隔を算出する。あるいは、画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｑ’を示す各点を基に、各列分割線の間隔を算出する。
【０１９６】
行分割線と列分割線の勾配演算の際に、生化学検査用アレイ６上に異物等が存在すると、圧縮した明領域の幅が、プローブアレイ要素３のみによる本来の明領域圧縮像の幅よりも広くなる。この場合、画像処理部２０は、連続する各明領域の幅をプローブアレイ要素３の配列条件と比較し、前記各明領域の幅が本来の明領域圧縮像の幅に相当するか否かを判断する。そして画像処理部２０は、前記各明領域のうち本来の明領域圧縮像の幅に相当しない部分がある場合、その部分の領域をプローブアレイ要素３の配列条件に基づく暗領域に置き換える。その後、画像処理部２０は、各行分割線または各列分割線の間隔を算出する。これにより、異物等による影響を除いた適切な行分割線と列分割線の勾配演算を行える。
【０１９７】
次に、二値化されたサンプル蛍光画像の各行分割線の間隔と各列分割線の間隔の第２の演算例について説明する。位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝１，２，３，４である場合、画像処理部２０は、生化学検査用アレイに設けられた所定の位置検出用アレイ要素２の中心位置を検出し、該中心位置を基に行分割線および列分割線の初期位置を算出する。そして画像処理部２０は、前記初期位置と、各位置検出用アレイ要素２を基準としたプローブアレイ要素３の配列条件とに基づき、各行分割線の間隔と各列分割線の間隔を算出する。
【０１９８】
次に、分割画像における測定領域の決定処理について説明する。
【０１９９】
図２５は、レファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図である。図２５において図４と同一な部分には同符号を付してある。画像処理部２０は、分割画像に対して該分割画像内の出力値の中央値で二値化を行い、二値化画像を得る。その後、画像処理部２０は、この二値化画像の二値化ライン４０に外接する矩形４１１を一定量膨張させた矩形４１２を、ノイズサンプリング領域（ローカルバックグラウンド領域）４３の境界とする。そして画像処理部２０は、分割画像内でこの境界の外側を前記ノイズサンプリング領域４３とし、この境界の内側を測定領域４２とする。これにより、二値化領域４１全域とその周辺を含めた領域を、測定領域４２とすることができる。
【０２００】
なお画像処理部２０は、λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とした場合、膨張の量δを下式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２０１】
図２６は、レファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図である。図２６において図４と同一な部分には同符号を付してある。画像処理部２０は、分割画像に対して該分割画像内の出力値の中央値で二値化を行い、二値化画像を得る。その後、画像処理部２０は、この二値化画像の二値化ライン４０に内接する矩形４１１を一定量収縮させた矩形４１２を、測定領域４２の境界とする。そして画像処理部２０は、分割画像内でこの境界の内側を前記測定領域４２とし、二値化ライン４０の外側をノイズサンプリング領域４３とする。これにより、二値化領域４１のみを、測定領域４２とすることができる。
【０２０２】
なお画像処理部２０は、λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とした場合、収縮の量δを下式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２０３】
図２５または図２６に示した測定領域の決定処理の後、画像処理部２０は、測定領域４２の単位面積当りの平均発光強度からノイズサンプリング領域４３の単位面積当りの平均発光強度を差し引いた強度を、各プローブの反応強度として検出する。
【０２０４】
なお、本発明の生化学的検査方法は以下の構成を有する。
【０２０５】
(1)レファレンスアレイは、生化学検査用アレイと同一のフォーマットで各プローブアレイ要素に対応するアレイ要素に同数の前記発光性分子が保持されている。
【０２０６】
(2)光で励起発光する複数の異なる発光性分子で標識された第１の生化学的物質を含む複数のサンプルの混合溶液を被検サンプルの溶液とし、複数の異なる発光性分子が一定の割合で混在して保持されたレファレンスアレイを用いて、各プローブアレイ要素内のプローブと前記各サンプルとの反応状態を検査する。
【０２０７】
(3)プローブアレイ要素の標準面積に対応する発光強度または単位面積当たりの平均発光強度を検出する。
【０２０８】
(4)発光関数として、光で励起発光する複数の異なる発光性分子で標識された第１の生化学的物質を含む複数のサンプルの混合溶液を被検サンプルの溶液とし、前記複数の異なる発光性分子が一定の割合で混在して保持されたレファレンスアレイを用いて、各プローブアレイ要素内のプローブと前記各サンプルとの反応状態を検査する。
【０２０９】
(5)発光関数を定めるパラメータとして非線型係数を設定し、該非線型係数を用いて各プローブアレイ要素内に存在する発光性分子の数を求める。
【０２１０】
(6)ｎMkをプローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量、Ｊを発光性分子の種類数、ＩMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの１分子当たりの発光強度、ρを非線型係数、ＰMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度とし、前記発光関数を
【数１９】
【０２１１】
とする。
(7)前記ＩMkを
【数２０】
【０２１２】
とする。
(8)ＰMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度、ｎRMを前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量、ＰRMk を前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度とし、前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量ｎMkを式
【数２１】
【０２１３】
により求める。
(9)ρを非線型係数、ｎRMを前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量、ＰRMk を前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度、ＰMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度、
【数２２】
【０２１４】
を前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量ｎMkのｉ番目の演算値とし、初期値
【数２３】
【０２１５】
および逐次演算式
【数２４】
【０２１６】
および逐次演算終了判定式
【数２５】
【０２１７】
を用いて、逐次演算終了時の
【数２６】
【０２１８】
を前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量ｎMkとする。
【０２１９】
(10)光で励起発光する複数の異なる発光性分子で標識された第１の生化学的物質を含む複数のサンプルの混合溶液を被検サンプルの溶液とし、該被検サンプルの溶液を生化学検査用アレイに供給する。
【０２２０】
(11)予め生化学検査用アレイの異物画像を取得し、異常領域に該異物画像の異物領域を加えて非対象領域とする。
【０２２１】
(12)λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とし、膨張の量δを式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２２２】
(13)λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とし、収縮の量δを式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２２３】
なお、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係るレファレンスアレイのフォーマットを示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態に係るレファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図。
【図５】本発明の第１の実施の形態に係るＣＣＤからの出力信号を示す図。
【図６】本発明の第１の実施の形態に係るノイズ信号を出力信号から差し引いた信号を示す図。
【図７】本発明の第１の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図８】本発明の第１の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図９】本発明の第１の実施の形態に係る散布図。
【図１０】本発明の第２の実施の形態で使用する生化学検査用アレイの上面のフォーマットを示す図。
【図１１】本発明の第２の実施の形態で使用するレファレンスアレイの上面のフォーマットを示す図。
【図１２】本発明の第３の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図１３】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１４】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１５】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１６】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１７】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１８】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１９】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図２０】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図２１】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図２２】本発明の第３の実施の形態に係るサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図。
【図２３】本発明の第３の実施の形態に係るサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図。
【図２４】本発明の第３の実施の形態に係る行分割線と列分割線の勾配演算例を示す概念図。
【図２５】本発明の第３の実施の形態に係るレファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図。
【図２６】本発明の第３の実施の形態に係るレファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図。
【図２７】従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図。
【符号の説明】
【０２２５】
１…生化学検査用アレイ
２…位置検出用アレイ要素
３…プローブアレイ要素
３１…プローブ
４…レファレンスアレイ
５…蛍光分子保持用要素
６…生化学検査用アレイ
７…レファレンスアレイ
８…蛍光分子保持領域
１１…励起光源
１２…シャッター
１３…レンズ
１４０…励起フィルタユニット
１４…励起フィルタ
１５…ダイクロイックミラー
１６…対物レンズ
１７０…ＮＤフィルタユニット
１７…ＮＤフィルタ
１８…結像レンズ
１９…ＣＣＤカメラ
２０…画像処理部
２１…表示部
２２…システム制御部
２３…ファイル処理部
２４…入力部
２５…記憶部
４０…二値化ライン
４１…二値化領域
４２…測定領域
４３…ノイズサンプリング領域
７０…分割画像
７１…行分割線
７２…列分割線
１０１…多孔性ガラスウェハー
１０２…孔
１０３…テーパ付きウェル
１０４…チャンネル
１０５…貫通孔
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生化学的反応の状態を検査する生化学的検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
最近、「ハイブリダイゼーションによる配列決定」（ＳＢＨ）のために、アレイドハイブリダイゼーション（ａｒｒａｙｅｄ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）反応の幾つかの方法が開発されている。これには、例えば膜上に格子状配列された異なるオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ試料のアレイとの段階的なハイブリダイゼーションの方法を用いたＳＢＨがある。
【０００３】
また、従来「ジェノセンサー（ｇｅｎｏｓｅｎｓｏｒ）」なる語は、その中で二次元アレイの表面に標的核酸配列と相補配列の認識素子としてのオリゴヌクレオチドを結合する方式を称してきた。さらに、ジェノセンサーの概念には、ハイブリダイゼーションを迅速に検出することができ、各試験部位に微細電子部品が存在する微細加工装置が含まれる。
【０００４】
このような二次元アレイに対して、近年以下のような新規なフロースルージェノセンサーが提供されている。そこでは、固形支持材料のウェハーにわたり斑点状に配され密充填された孔またはチャンネル内に、核酸認識素子が固定化されている。支持ウェハーとして有用なマイクロチャンネルまたはナノチャンネルのガラス及び多孔性シリコンの製造には、公知の微細加工技術を利用できる。このフロースルージェノセンサーは、微細加工された光学及び電子工学検出部品、フィルム、荷電結合素子アレイ、カメラシステム及びりん光貯蔵技術を包含する種々の公知の検出方法を利用している。このフロースルー装置については、公知の平面表面設計に比して以下の利点が得られる。
【０００５】
（１）表面積が膨大に増大したことにより、検出感度が改善される。
【０００６】
（２）ハイブリダイゼーション反応に要する時間が短縮し（平均標的分子が表面に結合したプローブに出くわすのに要する時間が、数時間から数ミリ秒に短縮され）、ハイブリダイゼーションがスピード化され、順反応及び逆反応の両方において誤対合識別ができる。
【０００７】
（３）多孔性ウェハーを通して溶液を徐々に流動できるため、希薄な核酸溶液を分析することができる。
【０００８】
（４）大気に曝される平面表面上のプローブ溶液の小液滴が迅速に乾燥するのを避けられることにより、各分離領域内の表面に対するプローブ分子の化学結合が促進する。
【０００９】
以上の利点を有するこのフロースルー装置を、以後三次元アレイと称する。このような三次元アレイに関する従来技術として、特表平９−５０４８６４号公報を引用し、図２７を用いてその構成及び作用を簡単に説明する。
【００１０】
図２７は、三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図である。図２７において、多孔性のガラスウェハー１０１には、複数のテーパ孔１０２が配設されており、これら各孔１０２にテーパ付きウェル１０３が埋設されている。テーパ付きウェル１０３は、そこに固定した生体分子の結合領域を構成する０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を底部に含む。各チャンネル１０４は図示のように多くの微小の貫通孔１０５を有している。このウェルアレイを用い、以下のステップで検出を行なう。
【００１１】
（１）３−グリシドキシプロピル−トリメトキシシラン４ｍｌ、キシレン１２ｍｌ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（フーニッヒ（Ｈｕｎｉｇ）塩基）０．５ｍｌの溶液をウェハーの孔に流入させ、次いで、そのウェハーを８０℃の該溶液に５時間浸漬し、次いで、テトラヒドロフランでフラッシュし、８０℃にて乾燥することにより、ウェハーをエポキシシラン−誘導体化ガラスとする。
【００１２】
（２）５′−または３′−アルキルアミン（化学合成の間に導入した）を有する複数のオリゴヌクレオチドプローブを、水に１０μＭ−５０μＭにて溶解し、それぞれ多孔性のガラスウェハー１０１（シリカウェハー）に微量分注する。６５℃にて一晩反応させた後、その表面を６５℃の水、次いで１０ｍＭトリエチルアミンで簡単に流し、表面上の未反応エポキシ基を取り除く。次いで、６５℃の水で再度流し、風乾することにより、アミン−誘導化オリゴヌクレオチドをエポキシシラン−誘導体化ガラスに結合させる。
【００１３】
（３）増幅の間に産物に［32Ｐ］ヌクレオチドを取り込ませるポリメラーゼ連鎖反応によるか、またはガンマ−32Ｐ［ＡＴＰ］＋ポリヌクレオチド・キナーゼを用いて増幅産物を５′−標識することによって、標的ＤＮＡ（分析物）を調製する。取り込まれなかった標識は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濾過によって除去する。好ましくは、１のＰＣＲ断片を５′−ビオチン標識すれば、ストレプトアビジン・アフィニティークロマトグラフィーによる一本鎖の調製ができる。少なくとも５ｎＭ（５ｆｍｏｌ／μｌ）の濃度であって、少なくとも５，０００ｃｐｍ／ｆｍｏｌの特異活性のハイブリダイゼーション緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８、２ｍＭＥＤＴＡ、３．３Ｍ塩化テトラメチルアンモニウム）中に標的ＤＮＡを溶解する。数百塩基長のＰＣＲ断片が、少なくともオクタマー長の表面につなぎ留めたオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに適している。
【００１４】
（４）標的ＤＮＡ試料をチップの多孔性領域に流し込み、６℃にて５〜１５分間インキュベートし、ハイブリダイゼーションを行なう。次いで、１８℃にて同様の時間、多孔性チップを通してハイブリダイゼーション溶液を流動させることによって洗浄する。別法として、塩化テトラメチルアンモニウムの代わりに、１ＭＫＣＬもしくはＮａＣｌまたは５．２Ｍベタインを含有する緩衝液でハイブリダイゼーションを行なうこともできる。
【００１５】
（５）ＣＣＤジェノセンサー装置を用いてハイブリダイゼーション強度の検出及び定量を行なう。ＣＣＤジェノセンサー装置は、高解像度及び高感度のものを用い、化学ルミネセント、蛍光または放射能標識用として用意される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
従来では、上述した従来技術に限らず、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を各々の発光強度としてＣＣＤのような同一のエリアセンサーまたはラインセンサーで検出する場合、すべてのプローブアレイ要素を均一に照明する必要がある。この理由は、発光性分子の発光状態が励起光の強度に依存するからである。
【００１７】
そこで、励起光の強度をモニターして、この強度の空間分布で検出値を補正することが容易に考えられる。しかしこの場合でも、励起光の強度と発光強度との関係が複雑であることと、発光性分子の密度、温度、時間などによりその関係が変化することにより、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査することができないという欠点が有る。
【００１８】
また、励起光のノイズやプローブの分注誤差によるノイズも十分に除去されない。さらに、発光性分子の発光特性が考慮されていないので、各反応状態を正確に検査することができないという欠点が有る。
【００１９】
本発明の目的は、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査し得る生化学的検査方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
課題を解決し目的を達成するために、本発明の生化学的検査方法は以下の如く構成されている。
【００２１】
本発明の生化学的検査方法は、第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、光で励起発光する発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、前記アレイ型検出器により得られた光画像の対象領域内の最小検出量を蛍光バックグラウンドとし、該蛍光バックグラウンドを前記光画像から差し引いた光画像を対象画像とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によれば、プローブアレイ要素内での生化学的な各反応状態を正確に検査し得る生化学的検査方法を提供できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
以下、本発明の実施の形態を図面を参照して説明する。
【００２４】
図１は、本発明の第１の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１において、励起光源１１には、水銀光源等が用いられる。この光源１１から出射される励起光の光路上には、シャッター１２、レンズ１３、二枚の励起フィルタ１４を選択的に切り替え可能な励起フィルタユニット１４０、およびダイクロイックミラー１５が配置され、このダイクロイックミラー１５の反射光路上には、対物レンズ１６および後述する生化学検査用アレイ１またはレファレンスアレイ４が配置されている。また、ダイクロイックミラー１５の透過光路上には、複数枚のＮＤフィルタ１７を選択的に切り替え可能なＮＤフィルタユニット１７０、結像レンズ１８、およびＣＣＤカメラ１９が配置されている。ＣＣＤカメラ１９には画像処理部２０が接続され、画像処理部２０には表示部２１が接続されている。
【００２５】
図２の（ａ），（ｂ）は、本第１の実施の形態で使用する生化学検査用アレイの概略構成を示す図であり、図２の（ａ）は上面のフォーマットを示す図、図２の（ｂ）は一部側面図である。生化学検査用アレイ１は、図２７に示した三次元アレイからなる。図２の（ａ）に示すように、生化学検査用アレイ１にはプローブアレイ要素３が二次元に配列されており、４隅にそれぞれ位置検出用アレイ要素２が配置されている。これらプローブアレイ要素３および位置検出用アレイ要素２は、図２７に示したようにテーパ付きウェル１０３からなり、底部に０．１−１０μｍ直径のチャンネル１０４を有し、さらに各チャンネル１０４は図２の（ｂ）に示すように多くの微小な貫通孔１０５を有している。各貫通孔１０５の壁面には、プローブ３１が結合している。
【００２６】
すなわち生化学検査用アレイ１では、プローブの結合反応を確実にするために、望ましくは多孔性ガラスウェハー１０１の表面の異なるテーパ付きウェル１０３にそれぞれプローブの溶液が供給され、該溶液中に含まれるプローブを多孔性ガラスウェハー１０１の内部に設けられた各チャンネル１０４の各貫通孔１０５で保持するのが良いが、多孔性ガラスウェハー１０１を設けずに、直接各貫通孔１０５にプローブの溶液を微量分注して保持しても良い。この貫通孔１０５を含む部材が、多孔質または繊維質の物質あるいは成形物から成る立体構造の反応担体として構成される。
【００２７】
図３は、本第１の実施の形態で使用するレファレンスアレイの上面のフォーマットを示す図である。レファレンスアレイ４は、蛍光分子を保持可能な三次元アレイからなる。図３に示すように、レファレンスアレイ４には蛍光分子保持用要素５が二次元に配列されており、４隅にそれぞれ位置検出用アレイ要素２が配置されている。
【００２８】
図２の（ａ），図３に示すように、生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４は同一のフォーマットを有している。４隅に位置する４個の位置検出用アレイ要素２は、生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４で同じ位置に存在するものであり、顕微鏡下の図示しないステージ上に生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４を配置するときの両者の位置合わせ用に使用される。従って、位置検出用アレイ要素２は必ずしも図２の（ａ），図３に示す位置である必要はなく、両者で同じ位置に存在すればどの位置でも良い。もちろん、生化学検査用アレイ１とレファレンスアレイ４のフォーマット自身も、これらの条件を満たすものであれば任意で良い。
【００２９】
以下、本第１の実施の形態における生化学検査の概略を説明する。
【００３０】
最初に検査者は、アレイ用基板に標識として使用する蛍光分子と同一のｎRM個の蛍光分子をそれぞれ蛍光分子保持用要素５に、標識と異なる発光波長の蛍光分子をそれぞれ位置検出用アレイ要素２にスポッティングしてレファレンスアレイ４を製作する。ここで、Ｒはレファレンスを意味する添字、Ｍは蛍光物質に対応する添字である。
【００３１】
次に、顕微鏡観察下で位置出し配置されたレファレンスアレイ４に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みレファレンス蛍光画像とする。該レファレンス蛍光画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００３２】
次に検査者は、前記レファレンスアレイ４を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイ１を配置する。この生化学検査用アレイ１では、あらかじめ標識と異なる発光波長の蛍光分子をアレイ用基板の位置検出用アレイ要素２に、対応するプローブ液を同じくプローブアレイ要素３にそれぞれ固相化してある。
【００３３】
次に検査者は、該生化学検査用アレイ１に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素３から除去する。
【００３４】
次に、該生化学検査用アレイ１に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みサンプル蛍光画像とする。該サンプル蛍光画像は、前記レファレンス蛍光画像と同じく標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００３５】
次に、前記レファレンス蛍光画像および前記サンプル蛍光画像を各々要素単位に分割し、複数の分割画像（該分割画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数×プローブアレイ要素数×２だけ存在する）とする。なお、この時の分割条件は、４個の前記位置検出用アレイ要素２の重心位置または二値化画像の図心位置の座標と、既知のアレイフォーマットにより決定する。
【００３６】
さて、γ値が１の受光素子上に無収差レンズで結像した時に、最大信号の１／２のレベルでの二値化点が主光線と最適像面との交点と考えて良い。そこで、全ての前記分割画像を最大信号の１／２のレベルで二値化して、この二値化画像の領域を設定し、この領域の最大ｘ座標、最小ｘ座標、最大ｙ座標および最小ｙ座標を求める。
【００３７】
レファレンス二値化画像については、最大ｘ座標をｘRMkmax、最小ｘ座標をｘRMkmin、最大ｙ座標をｙRMkmaxおよび最小ｙ座標をｙRMkminとし、サンプル二値化画像については、最大ｘ座標をｘSMkmax、最小ｘ座標をｘSMkmin、最大ｙ座標をｙSMkmaxおよび最小ｙ座標をｙSMkminとする。同時に、前記サンプル蛍光画像の分割画像に関してのみ前記二値化画像の実面積を計算し、これをＳMkとする。
【００３８】
図４は、前記レファレンス蛍光画像および前記サンプル蛍光画像の分割画像を示す図であり、図５は図４に表示されている線分ＡＢ上のＣＣＤからの出力信号を示す図である。二値化領域４１とこの領域の最大ｘ座標ｘmax 、最小ｘ座標ｘmin 、最大ｙ座標ｙmax および最小ｙ座標ｙmin との関係は図４および図５に示す通りである（なお、図中では添字RMkおよびSMkは区別不要のため省略してある）。
【００３９】
次に、測定領域４２およびノイズサンプリング領域４３を決定するための矩形領域を与える２つの座標を、図４および図５に示すように（ｘ′min ，ｙ′min ）および（ｘ′max ，ｙ′max ）として、このｘ′min 、ｙ′min 、ｘ′max およびｙ′max を次式で与える。
【数１】
【００４０】
ただし、βは光学系の像倍率であり、δは次式で与える。
【数２】
【００４１】
ここで、λは検出する標識Ｍの蛍光波長、ａは試料側の開口数、Δはデフォーカス量である。また、右辺の第１項は回折像の中心から二次の回折ピークと三次の回折ピークとの間の谷間までの距離（回折によるボケ量）を表し、第２項はフォーカシング誤差に起因するボケ量（デフォーカスによるボケ量）を表す。すなわち、（５）式はフォーカシング誤差を考慮したときの最大ボケ量を与える式と考えて良い。
【００４２】
さて、分割画像は図５に示すように、検出されるべき信号５１とノイズ信号５２との合成信号で形成されている。ノイズは装置構成や測定環境に依存するが、一般的には励起光ノイズ（励起光に起因するノイズ）が支配的であり、時には迷光ノイズ（励起光以外の光源に起因するノイズ）も無視できない。また、励起光ノイズには励起光の基板での反射光ノイズ、励起光による基板の自家発光ノイズなどがある。
【００４３】
図６は、前述したノイズ信号を出力信号から差し引いた信号を示す図である。この減算処理をすることにより、検出されるべき信号６１を取り出すことができる。なお、図４〜図６は説明しやすいようにモデル化して表現してあるが、実際には検出されるべき信号およびノイズ信号は平坦でなく、位置によりむらがある。特に前述した励起光ノイズは照明むらを反映するので、ノイズ信号のむらの最大の原因となる。
【００４４】
本実施の形態においては、検出されるべき信号のむらにより二値化領域が図４に示すような円形でない場合または１つの分割画像に複数の二値化領域が存在する場合でも、（ｘ′min ，ｙ′min ）および（ｘ′max ，ｙ′max ）で定まる矩形領域を測定領域とすることで、この測定領域内に検出されるべきすべての信号が含まれることが保証される。
【００４５】
そこで本実施の形態においては、ノイズ信号のむらを前提として、測定領域４２の信号からノイズサンプリング領域４３内の平均ノイズ信号を差し引き、図６に示す検出信号を得る。平均ノイズ信号は、ノイズサンプリング領域内の信号の総和をノイズサンプリング領域の面積で除することで求められる。次に、差し引かれて得られた検出信号の測定領域４２内での総和を、アレイ要素ごとの信号強度とする。
【００４６】
このような方法によれば、検出されるべき信号の近傍でノイズ信号をサンプリングできるので、検出されるべき信号の検出精度が向上する。しかも、前述のごとくデフォーカスを考慮して測定領域を設定してあるので、デフォーカスノイズが発生しないことも明らかである。
【００４７】
以上により、標識に使用する蛍光物質の種類数×プローブアレイ要素数×２の数量の信号強度が得られる。今、プローブアレイ要素３および蛍光分子保持用要素５の信号強度をそれぞれＰRMk およびＰSMk で表す。ここでＲおよびＳは、それぞれレファレンスおよびサンプルを示す添字、Ｍは蛍光物質に対応する添字、ｋは蛍光分子保持用要素５の番号であると同時にこれに対応したプローブアレイ要素３の番号である。
【００４８】
次に、プローブアレイ要素３の信号強度ＰSMk をプローブアレイ要素３の面積で補正してＰMkとする。次式によりＰMkを求める。
【数３】
【００４９】
ここで、ＳO はプローブアレイ要素３の標準面積、ＳMkは先に計算された各プローブアレイ要素３の二値化画像の実面積である。この補正により、プローブ分注誤差によるノイズを除去することができる。
【００５０】
次に、前記サンプル蛍光画像のプローブアレイ要素３ごとの強度信号ＰMkを前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子（または化学発光分子）数ｎMkで表すと次のようになる。
【数４】
【００５１】
ただし、ρは蛍光の発光関数の非線型係数であり定数で与えられる。また、ＩMkは次式で表すことができる。
【数５】
【００５２】
ここで、ｎRMはレファレンスアレイ４の番号ｋの蛍光分子保持用要素５に存在する標識Ｍの蛍光分子数（または化学発光分子）である。
【００５３】
従って（８）式でＩMkを求め、（７）式を用いて前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子（または化学発光分子）数ｎMkを求めることができる。すなわち、プローブアレイ要素３ごとに、標識物質数の信号強度ＰMkの検出値からその数だけの方程式を作り、これらの方程式を解くことにより前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子（または化学発光分子）数ｎMkを求める。（７）式および（８）式により、
【数６】
【００５４】
となる。
（８）式において非線型係数ρが０とみなせる場合には、ＩMkは蛍光分子（または化学発光分子）１個当たりの信号強度となる。このときに（９）式は非常に簡単な式となりｎMkは次式により求められる。
【数７】
【００５５】
次に、非線型係数ρが０とみなせない場合のｎMkの逐次近似法による求め方について述べる。（９）式において、ｉ回目のｎMkの近似値を
【数８】
【００５６】
で表し、これを求める右辺のｎMkにはｉ−１回目のｎMkの近似値を用いる。これを式で示すと次のようになる。
【数９】
【００５７】
ただし、ｉ＝１，２，３，…とする。また、ｎMkの初期値として
【数１０】
【００５８】
を与え、さらに、収束条件として次式を与えるのが良い。
【数１１】
【００５９】
すなわち、（１３）式を満たす時の
【数１２】
【００６０】
を求めるｎMkとする。
図７，図８は、本第１の実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図７，図８に従って検査方法およびその作用を説明する。
【００６１】
(1)ステップＳ１：まず検査者は、２色の蛍光分子で標識された２種の生化学的物質の溶液を作成する。この場合検査者は、比較したい２種の生化学的物質の溶液を同一濃度で作成し、一方をＦＩＴＣ、他方をローダミンで標識する。これらの標識物質は、蛍光波長の異なる物質の組み合わせであれば他の物質でも構わない。その後、作成した２種の生化学的物質の溶液を１：１の割合で混合して攪拌し、生化学的物質の混合溶液とする。混合比率については、２種の生化学的物質の溶液および標識物質の特性に応じて変更しても良い。
【００６２】
(2)ステップＳ２：検査者は、２色の蛍光分子を保有するレファレンスアレイ４を製作する。この場合検査者は、アレイ用基板に蛍光標識として使用するＦＩＴＣおよびローダミンを同一の蛍光分子数ｎRMだけそれぞれ蛍光分子保持用要素５に、標識と異なる発光波長の蛍光分子をそれぞれ位置検出用アレイ要素２にスポッティングしてレファレンスアレイ４を製作する。この際、スポッティングする位置はプローブアレイ要素３に対応する位置とする。ここでＲはレファレンスを意味する添字、Ｍは蛍光物質に対応する添字である。
【００６３】
なお、スポッティングの方法は、使用する蛍光分子の重量とその分子量から使用する蛍光分子数を特定し、この蛍光分子数の蛍光分子の溶液を既定量となるように作り、この溶液をインクジェット方式によりアレイ用基板上に吐出するものである。１要素当たりの蛍光分子数ｎRMは、これらの諸量（溶液量および溶液中の蛍光分子数）と溶液の吐出量とから計算して求められる。なお、蛍光分子の保持方法として固相化試薬を用いると確実な保持が可能となるが、必ずしも必要ではない。
【００６４】
(3)ステップＳ３：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、レファレンスアレイ４の蛍光画像を色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、レファレンスアレイ４を励起光源１１で励起照明して、各蛍光分子保持用要素５内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この際、検査者は励起フィルタユニット１４０を切り替え操作して所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルタ１４を照明光路ｂ上に配置し、さらにＮＤフィルタユニット１７０を切り替え操作して所望のＮＤフィルタ１７を観察光路ａ上に配置する。
【００６５】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介してレファレンスアレイ４の上面全体に照射される。レファレンスアレイ４から発生した蛍光は、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、ＮＤフィルタ１７、および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、蛍光分子の色別に蛍光画像が撮り込まれる。従ってこの段階で、２色×ＮＤフィルタの枚数分の蛍光画像が得られる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだ蛍光画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００６６】
なお、本実施の形態では受光素子としてＣＣＤを用いているが、ＣＣＤに特定するものではなく、他のエリアセンサを用いても良い。従って、以下に記述される「ＣＣＤ」は「エリアセンサ」でも通用するものである。
【００６７】
(4)ステップＳ４：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、レファレンスアレイ４のバックグラウンド画像を蛍光分子の色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、レファレンスアレイ４の蛍光画像を撮り込んだ直後にシャッター１２により励起照明を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を撮り込む。このバックグラウンド画像の数は、蛍光画像の数と同一となる。このバックグラウンド画像は、検出強度に不要な暗電流ノイズおよび迷光ノイズにより構成される。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだバックグラウンド画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００６８】
(5)ステップＳ５：検査者は、生化学検査用アレイ１に生化学的物質の混合溶液を供給し、各プローブと特異的に反応させる。この場合検査者は、図１に示した蛍光顕微鏡の観察下で、試料面に図２の（ａ）に示す生化学検査用アレイ１を配置し、その表面に一様に生化学的物質の混合溶液を供給する。これにより、生化学検査用アレイ１上のプローブアレイ要素３内のプローブと混合溶液に含まれる生化学的物質との間に特異的な結合反応が生じる。この結果、各プローブアレイ要素３内で反応の強さに応じた数量の蛍光分子が間接的にプローブに結合することになる。
【００６９】
(6)ステップＳ６：検査者は、生化学検査用アレイ１から未反応の生化学的物質を除去する。この場合検査者は、前述した結合反応後に、生化学検査用アレイ１の各プローブアレイ要素３から未結合の生化学的物質を除去する。一般的には洗浄液を用いて洗浄する方法が採用されるが、反応担体が立体構造である場合には洗浄液を用いずにポンプなどで溶液ごと除去しても良い。但し、洗浄液を用いる方が確実に除去されることは言うまでもない。
【００７０】
(7)ステップＳ７：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１の蛍光画像を色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、生化学検査用アレイ１を励起光源１１で励起照明して、各プローブアレイ要素３内の蛍光分子が発生する蛍光の画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この際、検査者は励起フィルタユニット１４０を切り替え操作して所望の蛍光分子の色に対応する励起フィルタ１４を照明光路ｂ上に配置し、さらにＮＤフィルタユニット１７０を切り替え操作して所望のＮＤフィルタ１７を観察光路ａ上に配置する。
【００７１】
励起光源１１からの励起光は、レンズ１３、励起フィルタ１４を介してダイクロイックミラー１５で反射され、対物レンズ１６を介して生化学検査用アレイ１の上面全体に照射される。生化学検査用アレイ１から発生した蛍光は、対物レンズ１６、ダイクロイックミラー１５、ＮＤフィルタ１７、および結像レンズ１８を介して、ＣＣＤカメラ１９に入射し、蛍光分子の色別に蛍光画像が撮り込まれる。この生化学検査用アレイ１の蛍光画像の数は、レファレンスアレイ４のバックグラウンド画像および蛍光画像の数と同一となる。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだ蛍光画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００７２】
(8)ステップＳ８：検査者は観察光路ａ上のＮＤフィルタ１７を切り替えながら、生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像を蛍光分子の色別にＣＣＤカメラ１９で撮り込む。この場合、前述した生化学検査用アレイ１の蛍光画像を撮り込んだ直後にシャッター１２により励起照明を遮断し、ＣＣＤカメラ１９でバックグラウンド画像を撮り込む。この生化学検査用アレイ１のバックグラウンド画像の数は、蛍光画像の数と同一となる。このバックグラウンド画像は、レファレンスアレイ４のバックグラウンド画像と同様に、検出強度に不要な暗電流ノイズおよび迷光ノイズにより構成される。ＣＣＤカメラ１９で撮り込んだバックグラウンド画像は、画像処理部２０へ送られる。
【００７３】
(9)ステップＳ９：画像処理部２０は、レファレンスとサンプルの各蛍光画像から各バックグラウンド画像を差し引き、色別およびＮＤフィルタ別の補正画像とする。一般的に、受光素子の出力には暗電流ノイズや迷光ノイズなどの直流ノイズが含まれる。この直流ノイズを除去するために、レファレンスアレイ４および生化学検査用アレイ１について各々蛍光画像からバックグラウンド画像を差し引き、これを補正画像と称し以後の処理の対象とする。従って、この段階で２色×ＮＤフィルタの枚数の補正画像が得られる。なお、蛍光画像およびバックグラウンド画像は、以後不要となる。
【００７４】
(10)ステップＳ１０：画像処理部２０は、各補正画像中の位置検出用アレイ要素２に対応する画像の重心位置を検出する。図２の（ａ）および図３に示すように、生化学検査用アレイ１およびレファレンスアレイ４に形成されるアレイ要素は二次元に配列されており、共に４隅に位置する４個のアレイ要素が位置検出用アレイ要素２として用いられる。それ以外のアレイ要素はプローブアレイ要素３または蛍光分子保持用要素５として用いられる。
【００７５】
位置検出用アレイ要素２は位置信号を出すためのものであるから、その要素内の物質は発光物質または反射物質であれば何でも良いことになるが、望ましくは使用される２色の蛍光波長とは異なる蛍光波長の蛍光物質を用いる方が良い。その理由は、位置検出用アレイ要素２から発生する蛍光がノイズとして作用する可能性を無くすことができるからである。この場合には、位置検出用の励起波長で照明し、位置検出をすることになる。
【００７６】
(11)ステップＳ１１：画像処理部２０は、各補正画像を回転移動して、色別およびＮＤフィルタ別の回転画像とする。この場合、レファレンスアレイ４および生化学検査用アレイ１について各々得られた４個の位置座標で形成される各四辺形が最小偏差で矩形となるように位置座標を修正してから、各矩形の各辺が座標軸と平行になるように各画像中心を回転中心として各補正画像を回転移動する。移動後の画像を各々回転画像と呼ぶ。なお、各補正画像は以後不要となる。
【００７７】
(12)ステップＳ１２：画像処理部２０は、各回転画像を蛍光分子保持用要素５およびプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、各々色別、ＮＤフィルタ別および要素別の分割画像とする
この場合、画像処理部２０は、レファレンスアレイ４および生化学検査用アレイ１の各回転画像の４個の位置座標と蛍光分子保持用要素５およびプローブアレイ要素３の配列条件とから分割条件を決定して、この分割条件ですべての回転画像を蛍光分子保持用要素５またはプローブアレイ要素３ごとの画像に分割し、分割画像とする。なお、レファレンスアレイ４の回転画像の分割画像をレファレンス分割画像、生化学検査用アレイ１の回転画像の分割画像をサンプル分割画像と呼ぶ。従ってこの段階で、２×ＮＤフィルタの枚数×プローブアレイ要素数分の分割画像が得られる。なお、各回転画像は以後不要となる。
【００７８】
(13)ステップＳ１３：画像処理部２０は、最適なＮＤフィルタ１７に対応する各分割画像を色別および要素別の測定用画像として抽出する。
【００７９】
この場合、画像処理部２０は、同一色で同一位置の蛍光分子保持用要素５のＮＤフィルタ枚数分のレファレンス分割画像の中から、最大信号強度がダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大であるレファレンス分割画像を１個抽出する。これを測定用レファレンス画像と呼ぶ。同様に画像処理部２０は、同一色で同一位置のプローブアレイ要素３のＮＤフィルタ枚数分のサンプル分割画像の中から、最大信号強度がダイナミックレンジの範囲内にあり、その中で信号強度が最大であるサンプル分割画像を１個抽出する。これを測定用サンプル画像と呼ぶ。
【００８０】
(14)ステップＳ１４：画像処理部２０は、抽出した各測定用画像を二値化し、色別および要素別の二値化画像とする。測定用レファレンス画像および測定用サンプル画像のすべてについて、各々最大信号の１／２レベルで二値化し、これをそれぞれレファレンス二値化画像およびサンプル二値化画像とする。サンプル二値化画像については二値化領域４１の面積ＳMkを算出する。
【００８１】
(15)ステップＳ１５：画像処理部２０は、各二値化画像により測定領域４２およびノイズサンプリング領域４３を設定する。
【００８２】
この場合画像処理部２０は、レファレンス二値化画像のすべてについて、各々の最大ｘ座標ｘRMkmax、最小ｘ座標ｘRMkmin、最大ｙ座標ｙRMkmaxおよび最小ｙ座標ｙRMkminを求める。同様にサンプル二値化画像のすべてについて、各々の最大ｘ座標ｘSMkmax、最小ｘ座標ｘSMkmin、最大ｙ座標ｙSMkmaxおよび最小ｙ座標ｙSMkminを求めてから、ノイズのサンプリング領域を設定するための座標ｘ′RMkmax、ｘ′RMkmin、ｙ′RMkmax、ｙ′RMkmin、ｘ′SMkmax、ｘ′SMkmin、ｙ′SMkmaxおよびｙ′SMkminを算出する。
【００８３】
そして、点（ｘ′RMkmin，ｙ′RMkmin）および点（ｘ′RMkmax，ｙ′SMkmax）で定まる矩形内を測定用レファレンス画像の測定領域とし、該矩形外を測定用レファレンス画像のノイズサンプリング領域とする。同様に、点（ｘ′SMkmin，ｙ′SMkmin）および点（ｘ′SMkmax，ｙ′SMkmax）で定まる矩形内を測定用サンプル画像の測定領域とし、該矩形外を測定用サンプル画像のノイズサンプリング領域とする。
【００８４】
(16)ステップＳ１６：画像処理部２０は、測定用画像上で測定領域４２の信号から平均ノイズ信号を差し引く。
【００８５】
この場合画像処理部２０は、測定用レファレンス画像のノイズサンプリング領域４３の信号から単位面積当たりのノイズを求め、測定用レファレンス画像の測定領域４２の信号からこの信号を差し引いてレファレンス画像の検出信号とする。同様に、測定用サンプル画像のノイズサンプリング領域４３の信号から単位面積当たりのノイズを求め、測定用サンプル画像の測定領域４２の信号からこの信号を差し引いてサンプル画像の検出信号とする。
【００８６】
(17)ステップＳ１７：画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の標準面積当たりの信号強度を色別に算出する。
【００８７】
この場合画像処理部２０は、各蛍光分子保持用要素５の測定領域４２内での検出信号の総和をＰRMk として算出する。同様に、各プローブアレイ要素３の測定領域４２内での検出信号の総和をＰSMk として算出する。次いで、プローブアレイ要素３の標準面積ＳO 当たりの信号強度を（６）式を用いて色別に算出する。これらの信号強度は、励起光むら、励起光ノイズおよびプローブの分注誤差により生じる強度誤差が除去された強度として得られる。
【００８８】
(18)ステップＳ１８：画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の標準面積当たりに存在する蛍光分子（または化学発光分子）数を色別に算出する。この場合画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の標準面積ＳO 当たりの信号強度から、（１１）式、（１２）式および（１３）式を用いてプローブアレイ要素３の標準面積ＳO 当たりに存在する蛍光分子数ｎMkを色別に算出する。
【００８９】
(19)ステップＳ１９：画像処理部２０は、色別に算出した蛍光分子（または化学発光分子）数を両軸とする散布図を表示する。この場合画像処理部２０は、２色の蛍光物質のプローブアレイ要素３ごとの蛍光分子数を各々ｘ軸およびｙ軸とした散布図を、表示部２１に表示する。
【００９０】
図９は、上記散布図の例であり、ｘ軸をサンプルＡの蛍光分子数、ｙ軸をサンプルＢの蛍光分子数として対数メモリ上に示している。図９はｍ個のプローブアレイ要素３の各プローブについて簡略して示しており、‘プローブ３’以外はサンプルＡとサンプルＢの蛍光分子数のバランスが範囲９１（二本の破線間）内にある。この場合、サンプルＡとサンプルＢについて、そのプローブとの結合反応が同程度と判断され、プローブ３についてはサンプルＢの反応がサンプルＡの反応よりも明らかに強いと判断される。なお、ｘ軸およびｙ軸はいずれも対数軸とし、前記範囲９１を決定する二本の破線は、ｙ＝ｍnｘ および ｙ＝（１／ｍn）ｘ、実線はｙ＝ｘの直線で表わされる（３本の直線は数学的に平行となる）。ｙ＝ｘに対して±１０％の範囲を設定する場合には、ｍn＝１．１とし、この値を画像処理部２０で適宜設定して表示できる。このような散布図により、各プローブアレイ要素のプローブとサンプルとの反応状態を正確に表現できる。
【００９１】
本第１の実施の形態によれば、レファレンス蛍光画像を導入しているので、励起照明に空間的にむらがある場合でも適切に出力補正することができる。さらに、使われる蛍光分子の発光特性およびその時間的変動をも考慮した方法であるので、各プローブアレイ要素ごとに存在する標識Ｍの蛍光分子数ｎMkすなわちプローブと対象物質との反応状態を正確に求めることができる。この場合には、標識は蛍光分子に限らず、化学発光分子等の発光性分子であれば良い。なお、レファレンス蛍光画像の撮り込みとサンプル蛍光画像の撮り込みは、順序を逆にしても何ら支障がない。
【００９２】
図１０は、本第２の実施の形態で使用する生化学検査用アレイの上面のフォーマットを示す図である。図１０に示す生化学検査用アレイ６は、図２の（ａ）に示した生化学検査用アレイ１における４個の位置検出用アレイ要素２を、それぞれプローブアレイ要素３に代えた構成をなしている。
【００９３】
図１１は、本第２の実施の形態で使用するレファレンスアレイの上面のフォーマットを示す図である。図１１に示すレファレンスアレイ７は、蛍光分子を保持可能な三次元アレイからなり、一面の蛍光分子保持領域８が設けられている。該蛍光分子保持領域８は、図１０に示した全プローブアレイ要素３の占める領域よりも広い領域として設定される。なお、生化学検査用アレイ６およびレファレンスアレイ７は、第１の実施の形態に示した生化学検査用アレイ１およびレファレンスアレイ４に代えて用いられる。
【００９４】
以下、本第２の実施の形態における生化学検査の概略を説明する。
【００９５】
最初に検査者は、アレイ用基板に標識として使用する蛍光分子と同一の蛍光分子を蛍光分子保持領域８に均一な分布で供給してレファレンスアレイ７を製作する。
【００９６】
次に、顕微鏡観察下で位置出し配置されたレファレンスアレイ７に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みレファレンス蛍光画像とする。該レファレンス蛍光画像は、標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッター１２などで励起照明を遮断するのが好ましい。
【００９７】
次に検査者は、前記レファレンスアレイ７を排出し、これと同じ位置に生化学検査用アレイ６を配置する。この生化学検査用アレイ６では、あらかじめプローブ液をプローブアレイ要素３にそれぞれ固相化してある。
【００９８】
次に検査者は、該生化学検査用アレイ６に蛍光分子で標識された被検サンプルの溶液を供給し、各プローブとサンプル溶液中の物質とで結合反応を生じさせた後、未結合の前記物質をプローブアレイ要素３から除去する。
【００９９】
次に、該生化学検査用アレイ６に励起照明を与えて、蛍光画像をＣＣＤカメラ１９で撮り込みサンプル蛍光画像とする。該サンプル蛍光画像は、前記レファレンス蛍光画像と同じく標識に使用する蛍光物質の種類数だけ撮り込まれる。なお、蛍光物質の劣化を防止するために、撮り込まれた後直ちにシャッターなどで励起照明を遮断するのが好ましい。前記サンプル蛍光画像の各プローブアレイ要素３ごとの信号強度をＰMkで表す。ここでＭは蛍光物質に対応する添字、ｋはプローブアレイ要素の番号である。
【０１００】
次に画像処理部２０は、各プローブアレイ要素３の位置および実面積ＳMkを画像処理により検出し、（６）式を用いてＰMkを算出し、前記レファレンス蛍光画像から前記位置と同じ位置におけるプローブアレイ要素３の標準面積ＳO に相当する信号強度を切り出し、この信号強度をＰRMk で表す。ここでＲはレファレンスを意味する添字である。
【０１０１】
次に、前記サンプル蛍光画像のプローブアレイ要素３ごとの信号強度ＰMkを前記プローブアレイ要素３に存在する標識Ｍの蛍光分子数ｎMkで表すと、前述と同じ（７）式となる。
【０１０２】
以後の処理は、第１の実施の形態と同様である。ただし、本第２の実施の形態は第１の実施の形態と異なりｎRMが不明であるので、一般的には蛍光物質の構成比率を求めるに留まる。しかし、レファレンスアレイ７を第１の実施の形態に使用するレファレンスアレイ４で予め較正することによりＩMkを求めておけば、蛍光物質の絶対数量を求めることもできる。
【０１０３】
本第２の実施の形態では、望ましくは自家蛍光作用の無いレファレンス用基板を用いる方が良い。これは、レファレンスアレイ７では自家蛍光ノイズを除去するためのサンプリング領域が確保できないためである。しかしながら、レファレンスアレイ７と同一の基板をそのまま第二のレファレンスアレイとし、この中の各プローブアレイ要素に対応する領域をサンプリング領域として自家発光強度を検出し、これを前記信号強度ＰMkから差し引くことにより、自家蛍光作用を有するレファレンス用基板であっても自家蛍光ノイズを除去することができる。この場合は、他のノイズも同時に除去することができる利点がある。また、本第２の実施の形態の固有の効果は、レファレンスアレイの製作が容易であることにある。なお、レファレンス蛍光画像の撮り込みとサンプル蛍光画像の撮り込みは、順序を逆にしても何ら支障がないことは第１の実施の形態と同様である。
【０１０４】
本発明によれば、以下のような作用を奏する。
【０１０５】
（１）本発明の生化学的検査方法によれば、サンプル光画像をレファレンス蛍光画像で補正することにより、照明が均一でない場合でも各プローブアレイ要素内でのプローブと生化学的物質との反応状態を正確に検査することができる。
【０１０６】
（２）立体構造の反応担体を用いる場合、反応系が複雑となるため不正確になりがちであるが、本発明の生化学的検査方法によれば、実比較できるため上記（１）による作用効果が増大する。
【０１０７】
（３）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１０８】
（４）本発明の生化学的検査方法によれば、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１０９】
（５）本発明の生化学的検査方法によれば、レファレンスアレイを容易に製造することができる。
【０１１０】
（６）本発明の生化学的検査方法によれば、プローブアレイ要素の近傍での励起光ノイズを除去することができるため、各プローブアレイ要素における反応状態を正確に検査することができる。
【０１１１】
（７）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、表面での光学的特性が複雑であるため、プローブアレイ要素の近傍でのノイズを補正でき、上記（６）による作用効果が増大する。
【０１１２】
（８）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（６）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１１３】
（９）本発明の生化学的検査方法によれば、アレイ要素の近傍での励起光ノイズを除去することができるため、各アレイ要素における反応状態を正確に検査することができる。
【０１１４】
（１０）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、反応量がプローブアレイ要素の面積に比例するので、この面積で補正することによりプローブの分注誤差を除去することになる。従って、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態の比較を正確に行なうことができる。
【０１１５】
（１１）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１０）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態の比較を正確に行なうことができる。
【０１１６】
（１２）本発明の生化学的検査方法によれば、例えば立体構造の反応担体を用いる場合、反応量がプローブアレイ要素の面積に比例するので、この面積で補正することによりプローブの分注誤差を除去することになる。従って、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態の比較を正確に行なうことができる。
【０１１７】
（１３）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の蛍光分子数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および係数蛍光分子数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する発光性分子の数を正確に求めることができる。
【０１１８】
（１４）本発明の生化学的検査方法によれば、立体構造の反応担体を用いる場合、反応系が複雑となるため、システムに対応する非線型係数を用いることで上記（１３）による作用効果が増大する。
【０１１９】
（１５）本発明の生化学的検査方法によれば、上記（１３）による作用効果に加えて、各プローブアレイ要素に保持されるプローブの状態に差が有る場合でも、参照サンプルと被検サンプルの反応状態の比較から、各プローブアレイ要素ごとのプローブと被検サンプルとの反応状態を正確に検査することができる。
【０１２０】
（１６）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２１】
（１７）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２２】
（１８）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２３】
（１９）本発明の生化学的検査方法によれば、各プローブアレイ要素内に存在する色ごとの発光性分子の数を求めることができる。
【０１２４】
（２０）本発明の生化学的検査方法によれば、一般的にプローブアレイ要素内の発光性分子の数と総発光強度とは比例しないので、総発光強度を線型係数、非線型係数および発光性分子の数の結合式で与える。この非線型係数は分子間距離、プローブアレイの構造および反応条件により決定される定数である。そして、採用するシステムに合わせた非線型係数を導入することにより、各プローブアレイ要素内に存在する蛍光分子数を正確に求めることができる。
【０１２５】
図１２は、本発明の第３の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図である。図１２において図１と同一な部分には同符号を付してある。
【０１２６】
図１２において、画像処理部２０には、システム制御部２２、ファイル処理部２３、および入力部２４が接続されている。ファイル処理部２３には記憶部２５が接続されている。入力部２４は、マウスや各種ボタンを備えている。なお、励起フィルタ１４、ダイクロイックミラー１５、およびＮＤフィルタ１７は、キューブユニットを構成する。励起フィルタ１４とダイクロイックミラー１５とＮＤフィルタ１７の観察光路ａおよび照明光路ｂ上での組み合せに応じて、異物検出キューブ、レファレンス用キューブ、蛍光Ｍ用キューブが構成される。
【０１２７】
図１３〜図２１は、本第３の実施の形態による検査手順を示すフローチャートである。以下、図１３〜図２１に従って検査方法およびその作用を説明する。
【０１２８】
図１３は、蛍光輝度測定の手順を示すメインフローチャートである。ステップＳ２１で、表示部２１にシステムイメージの画像が表示される。ステップＳ２２で、画像処理部２０はファイル処理部２３を介して記憶部２５からシステム変数を読み込む。システム変数は、以下の通りである。
【０１２９】
β;光学系の横倍率 ＡＳ;検出開口数 Δ;デフォーカス量の絶対値
λＧ;異物検出波長 Ｎｘ，Ｎｙ;カメラの有効画素数
ＰＩ;カメラの画素ピッチ Ｂ;ＡＤ変換ビット数 ｔ０;最小蓄積時間
ステップＳ２３で、チップアレイフォーマットとして生化学検査用アレイ１のフォーマットが設定される。ステップＳ２４で、測定条件が設定される。ステップＳ２５で、画像処理部２０は、ＨＧ＝０，ＨＳ＝０、測定開始スイッチ＝０、測定終了スイッチ＝０とする。ステップＳ２６で、ＳＷＲ＝１である場合、ステップＳ２７で、レファレンスが設定され、ステップＳ２８で、検査者によりサンプルチップである生化学検査用アレイ１がセットされる。ステップＳ２６で、ＳＷＲ＝１でない場合、ステップＳ２８で、生化学検査用アレイ１がセットされる。ステップＳ２９で、測定開始スイッチ＝１になった場合、ステップＳ３０で、画像処理部２０は、測定開始スイッチ＝０とする。
【０１３０】
ステップＳ３１で、ＳＷＧ＝１である場合、システム制御部２２は、ステップＳ３２で上記キューブユニットを異物検出キューブに切換え、ステップＳ３３で励起光の光路上のシャッター１２を開く。ステップＳ３４で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９から異物画像（ゴミ画像）を撮り込んだ後、ステップＳ３５で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。画像処理部２０は、ステップＳ３６で異物画像を微分し、ステップＳ３７で異物判定度を決定し、ステップＳ３８で異物関数を決定し、ステップＳ３９で、ｗＧｔ（ｘ，ｙ）＝ｗＧ（ｘ，ｙ）とする。
【０１３１】
ステップＳ３９の後、またはステップＳ３１でＳＷＧ＝１でない場合、ステップＳ４０で、システム制御部２２はシャッター１２を開く。ステップＳ４１で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９からサンプル画像を撮り込んだ後、ステップＳ４２で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。
【０１３２】
画像処理部２０は、ステップＳ４３で蛍光輝度の測定を行い、ステップＳ４４で測定データのアレイイメージを表示部２１に表示し、ステップＳ４５でｔ測定データをファイル処理部２３を介して記憶部２５に保存する。なお、測定データは、ρＲ;レファレンス異物占有率、ρ;サンプル異物占有率、ΓＭＢ;蛍光バックグラウンド輝度、（ｉ，ｊ）；スポット番地、Γ”Ｍ（ｉ，ｊ）;スポット輝度、ΓＭＣ（ｉ，ｊ）；蛍光クロストーク輝度、ＳＭ（ｉ，ｊ）；スポット面積、ＲＥＭＭ（ｉ，ｊ）；メッセージ、からなる。
【０１３３】
ステップＳ４６で測定終了スイッチ＝１である場合、ステップＳ４７で、ファイル処理部２３は、チップアレイフォーマット、サンプル条件、測定条件の記述されたファイルを記憶部２５に保存し、処理を終了する。ステップＳ４６で測定終了スイッチ＝１でない場合、ステップＳ２９以降の処理が行われる。
【０１３４】
図１４は、上記ステップＳ２３に示したチップアレイフォーマット設定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ１０１で、検査者は、入力部２４のオプションボタンにより、アレイフォーマット設定画面を指定する。なお、オプションボタン‘Ａ’は「既存のアレイフォーマットファイルを編集する」、‘Ｂ’は「最後に使用したアレイフォーマットファイルを編集する」、‘Ｃ’は「新規にアレイフォーマットファイルを設定する」であり、デフォルトは‘Ｂ’である。
【０１３５】
ステップＳ１０２で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘ＯＫ’は「アレイフォーマット設定画面を確定して次に進む」であり、‘中止’は「ファイルを更新しないで終了する」である。
【０１３６】
ステップＳ１０３でオプションボタン‘Ａ’が設定され、ステップＳ１０４で保存可能なＦＤ（フロッピー（登録商標）ディスク）がセットされ、ステップＳ１０５でＦＤに指定ファイルが有る場合、ステップＳ１０６で、ファイル処理部２３はＦＤにディレクトリを移動する。検査者は入力部２４から、ステップＳ１０７でリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ１０８でコマンドボタンにより指定ファイルを開く。
【０１３７】
ステップＳ１０３でオプションボタン‘Ｂ’が設定された場合、ステップＳ１０９で、ファイル処理部２３は記憶部２５に保存されているリースントファイルを開く。ステップＳ１０３でオプションボタン‘Ｃ’が設定された場合、ステップＳ１１０で、ファイル処理部２３はデフォルトファイルを開く。ステップＳ１０８、Ｓ１０９、Ｓ１１０の後、ステップＳ１１１で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンによりアレイフォーマットの設定値を確定する。
【０１３８】
ステップＳ１１２で、画像処理部２０は、テキストボックスによりステップＳ１１１で確定したチップアレイ変数を読み込む。チップアレイ変数は、以下の通りである。
【０１３９】
Ｓ０；プローブ１個の標準面積 Ｐｘ，Ｐｙ；プローブのピッチ
ｍｘ，ｍｙ；プローブ配列数 ＮＰ；位置検出用プローブ数
ステップＳ１１３で、画像処理部２０は、
Ｒ０＝０．６４＋１．４４Ｓ０／πＰｘＰｙ
を計算し、処理を終了する。
【０１４０】
図１５は、上記ステップＳ２４に示した測定条件設定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ２０１で、検査者は、入力部２４のオプションボタンにより、測定条件設定画面を指定する。なお、オプションボタン‘Ａ’は「既存の測定条件ファイルを編集する」、‘Ｂ’は「最後に使用した測定条件ファイルを編集する」、‘Ｃ’は「新規に測定条件ファイルを設定する」であり、デフォルトは‘Ｂ’である。
【０１４１】
ステップＳ２０２で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘ＯＫ’は「測定条件設定画面の指定方法を確定して次に進む」であり、‘中止’は「ファイルを更新しないで終了する」である。
【０１４２】
ステップＳ２０３でオプションボタン‘Ａ’が設定された場合、検査者は入力部２４から、ステップＳ２０４でリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ２０５でコマンドボタンにより指定ファイルを開く。ステップＳ２０３でオプションボタン‘Ｂ’が設定された場合、ステップＳ２０６で、ファイル処理部２３は記憶部２５に記憶されているリースントファイルを開く。ステップＳ２０３でオプションボタン‘Ｃ’が設定された場合、ステップＳ２０７で、ファイル処理部２３は記憶部２５に記憶されているデフォルトファイルを開く。
【０１４３】
ステップＳ２０５、Ｓ２０６、Ｓ２０７の後、ステップＳ２０８で、検査者は、入力部２４にてテキストボックスによりユーザー変数の編集を行う。ステップＳ２０９で、検査者は、入力部２４にてチェックボックスによりユーザー機能の追加と削除を行う。ステップＳ２１０で、検査者は、入力部２４にて測定条件の編集を行う。ステップＳ２１１で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより測定条件を確定する。
【０１４４】
ステップＳ２１２で、画像処理部２０は入力部２４から、ステップＳ２１１で確定したユーザー標識変数、ユーザー測定変数、及びユーザー機能変数を読み込み、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１４５】
ユーザー標識変数は、以下の通りである。（()内はデフォルト値）
Ｍｍａｘ;蛍光標識数(2)
ＭＡ;サンプルＡの蛍光標識（ＦＩＴＣ）（λＡ自動入力）
ＭＢ;サンプルＢの蛍光標識（ＴＥＸＳ ＲＥＤ）（λＢ自動入力）
（Ｍｍａｘ＝２の時）
ユーザー測定変数は、以下の通りである。（()内はデフォルト値）
ｔ０;最小蓄積時間(ｔ０) ｎｍａｘ；蓄積階層数（ＡＵＴＯ）
ｋｍａｘ；測定回数(10)
ＮＰ; 位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）(0)
ユーザー機能変数は、以下の通りである。（機能付は１、無は０、()内はデフォルト値）
ＳＷＲ；レファレンス処理(1)
ＳＷＲＧ；レファレンスチップの異物処理(1)（ＳＷＲ＝１の時）
ＳＷＢ；バックグラウンド処理(1)
ＳＷＧ；サンプルの異物処理(1)(オプションボタン併用)
（非処理データとの併用出力の場合はＳＷＧ＝２）
図１６は、上記ステップＳ２７に示したレファレンス設定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ３０１で、検査者は、入力部２４のオプションボタンにより、レファレンスモードを指定する。なお、オプションボタン‘Ａ’は「既存のレファレンスファイルを使用する」、‘Ｂ’は「最後に使用したレファレンスファイルを使用する」、‘Ｃ’は「新規にレファレンス輝度を測定する」であり、デフォルトは‘Ｂ’である。
【０１４６】
ステップＳ３０２で、検査者は、入力部２４のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘ＮＥＸＴ’は「次に進む」であり、‘ＢＡＣＫ’は「前に戻る」である。
【０１４７】
ステップＳ３０３でオプションボタン‘Ａ’が設定された場合、ステップＳ３０４で、検査者は入力部２４からリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ３０５で、画像処理部２０は指定されたファイルを対象ファイルとする。ステップＳ３０３でオプションボタン‘Ｂ’が設定された場合、ステップＳ３０６で、画像処理部２０はリースントファイルを対象ファイルとする。ステップＳ３０５またはステップＳ３０６の後、ステップＳ３０７で、画像処理部２０は対象ファイルからＷＲ（ｘ，ｙ）を読み込み、処理を終了する。
【０１４８】
ステップＳ３０３でオプションボタン‘Ｃ’が設定された場合、ステップＳ３０８で、検査者によりレファレンスチップであるレファレンスアレイ４がセットされる。ステップＳ３０９でＳＷＲＧ＝１である場合、システム制御部２２は、ステップＳ３１０で上記キューブユニットを異物検出キューブに切換え、ステップＳ３１１でシャッター１２を開く。ステップＳ３１２で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９から異物画像を撮り込んだ後、ステップＳ３１３で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。画像処理部２０は、ステップＳ３１４で異物画像を微分し、ステップＳ３１５でレファレンス異物判定度を決定し、ステップＳ３１６で異物関数を決定し、ステップＳ３１７で、ｗＲＧ（ｘ，ｙ）＝ｗＧ（ｘ，ｙ）とする。
【０１４９】
ステップＳ３１７の後、またはステップＳ３０９でＳＷＧ＝１でない場合、システム制御部２２は、ステップＳ３１８で上記キューブユニットをレファレンス用キューブに切換え、ステップＳ３１９でシャッター１２を開く。ステップＳ３２０で、画像処理部２０がＣＣＤカメラ１９からレファレンス蛍光画像を撮り込んだ後、ステップＳ３２１で、システム制御部２２はシャッター１２を閉じる。
【０１５０】
画像処理部２０は、ステップＳ３２２でレファレンスバックグラウンドの補正を行い、ステップＳ３２３でファイル処理部２３がリースントファイルとしてレファレンス変数を保存する。
【０１５１】
ステップＳ３２４で、検査者が入力部２４のオプションボタンにより、‘保存する’を指定した場合、ステップＳ３２５で、検査者は入力部２５からリストボックスによりファイルを指定し、ステップＳ３２６で、ファイル処理部２３はリースントファイルを指定されたファイルにコピーし、処理を終了する。ステップＳ３２４で、検査者が入力部２５のオプションボタンにより、‘保存しない’を指定した場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１５２】
図１７は、上記ステップＳ４１に示したサンプル画像撮り込みの手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ４０１でＭ＝１とし、ステップＳ４０２でｎＭｍａｘ＝ｎｍａｘとする。ステップＳ４０３で、検査者は上記キューブユニットを蛍光Ｍ用キューブに切換える。画像処理部２０は、ステップＳ４０４でｎ＝１とし、ステップＳ４０５でｋ＝１，ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＝０とする。
【０１５３】
システム制御部２２及び画像処理部２０は、ステップＳ４０６でＣＣＤカメラ１９から、蓄積時間２ｎ−１ｔ０でサンプルチップの蛍光画像を第ｎ階層蛍光画像Γ’Ｍｎ（ｘ，ｙ）として撮り込み、ステップＳ４０７で、ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＋Γ’Ｍｎ（ｘ，ｙ）を計算する。画像処理部２０は、ステップＳ４０８で、ｋ＝ｋｍａｘでない場合、ステップＳ４０９でｋ＝ｋ＋１とし、ステップＳ４０６以降の処理を行う。
【０１５４】
ステップＳ４０８で、ｋ＝ｋｍａｘである場合、画像処理部２０は、ステップＳ４１０で、ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）／ｋによりｋｍａｘ個の平均画像を計算し、ステップＳ４１１で、画像中央部の最小輝度ΓＭｎminの計測を行う。
【０１５５】
このように、蓄積時間を同一とするサンプルチップの複数の蛍光画像が撮り込まれ、それら蛍光画像の平均画像が算出される。
【０１５６】
画像処理部２０は、ステップＳ４１２でｎ＝ｎＭｍａｘでなく、ステップＳ４１３でΓＭｎｍｉｎ＞２Ｂ−１でない場合、ステップＳ４１４でｎ＝ｎ＋１とし、ステップＳ４０５以降の処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ４１３でΓＭｎｍｉｎ＞２Ｂ−１である場合、ステップＳ４１５でｎＭｍａｘ＝ｎとする。
【０１５７】
ステップＳ４１５の後、またはステップＳ４１２でｎ＝ｎＭｍａｘである場合、画像処理部２０は、ステップＳ４１６でＭ＝Ｍｍａｘでなければ、ステップＳ４１７でＭ＝Ｍ＋１とし、ステップＳ４０２以降の処理を行い、ステップＳ４１６でＭ＝Ｍｍａｘであれば、処理を終了する。
【０１５８】
図１８は、上記ステップＳ４１１に示した中央部の最小輝度計測の手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ５０１でΓＭｎｍｉｎ＝２Ｂ−１とし、ステップＳ５０２でｙ＝０、ステップＳ５０３でｘ＝０とする。画像処理部２０は、ステップＳ５０４で、０．４５Ｎｘ−１＜ｘ＜０．５５Ｎｘ−１であり、ステップＳ５０５で、０．４５Ｎｙ−１＜ｙ＜０．５５Ｎｙ−１であり、ステップＳ５０６で、ΓＭｎ（ｘ，ｙ）＜ΓＭｎｍｉｎである場合、ステップＳ５０７で、ΓＭｎｍｉｎ＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）とする。
【０１５９】
ステップＳ５０７の後、またはステップＳ５０４で０．４５Ｎｘ−１＜ｘ＜０．５５Ｎｘ−１でない場合、またはステップＳ５０５で０．４５Ｎｙ−１＜ｙ＜０．５５Ｎｙ−１でない場合、またはステップＳ５０６でΓＭｎ（ｘ，ｙ）＜ΓＭｎｍｉｎでない場合、画像処理部２０は、ステップＳ５０８でｘ＝Ｎｘ−１でなければ、ステップＳ５０９でｘ＝ｘ＋１とし、ステップＳ５０４以降の処理を行う。
【０１６０】
ステップＳ５０８でｘ＝Ｎｘ−１であり、ステップＳ５１０でｙ＝Ｎｙ−１でない場合、画像処理部２０は、ステップＳ５１１でｙ＝ｙ＋１とし、ステップＳ５０３以降の処理を行う。ステップＳ５１０でｙ＝Ｎｙ−１である場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１６１】
図１９は、上記ステップＳ４３に示した蛍光輝度測定の手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ６０１でＭ＝１とし、ステップＳ６０２で、サンプル蛍光画像の迷光補正と空間移動平均化処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ６０３で画像分割線を決定し、ステップＳ６０４でサンプル蛍光画像を回転し、ステップＳ６０５で蛍光バックグラウンド補正を行う。この蛍光バックグラウンド補正では、サンプル蛍光画像のノイズサンプリング領域（ローカルバックグラウンド領域）内の蛍光の最小検出量を蛍光バックグラウンドとし、該蛍光バックグラウンドを前記サンプル蛍光画像から差し引いた蛍光画像を対象画像とする。この場合、図４に示すように、測定領域４２の境界とノイズサンプリング領域４３の境界とを同一とする。
【０１６２】
画像処理部２０は、ステップＳ６０６でｊ＝１、ステップＳ６０７でｉ＝１、ステップＳ６０８でｎ＝ｎｍａｘとする。画像処理部２０は、ステップＳ６０９で最適画像のチェックをし、ステップＳ６１０で、
【数１３】
【０１６３】
である場合、ステップＳ６１１で測定領域を決定する。
画像処理部２０は、ステップＳ６１２で、ｘ’ｍｉｎ＝ｂ２’（ｉ，ｊ−１）でなく、ステップＳ６１３で、ｘ’ｍａｘ＝ｂ２’（ｉ，ｊ）でなく、ステップＳ６１４で、ｙ’ｍｉｎ＝ｂ１’（ｉ−１）でなく、ステップＳ６１５で、ｙ’ｍａｘ＝ｂ１’（ｉ）でない場合、ステップＳ６１６でスポット輝度を計測する。ステップＳ６１２でｘ’ｍｉｎ＝ｂ２’（ｉ，ｊ−１）であるか、ステップＳ６１３でｘ’ｍａｘ＝ｂ２’（ｉ，ｊ）であるか、ステップＳ６１４でｙ’ｍｉｎ＝ｂ１’（ｉ−１）であるか、ステップＳ６１５でｙ’ｍａｘ＝ｂ１’（ｉ）である場合、ステップＳ６１７で、画像処理部２０は、ＲＥＭＭ（ｉ，ｊ）＝スポット異常とする。
【０１６４】
ステップＳ６１０で、
【数１４】
【０１６５】
でなく、ステップＳ６１８でｎ＝１でない場合、画像処理部２０は、ステップＳ６１９でｎ＝ｎ−１とし、ステップＳ６０９以降の処理を行う。ステップＳ６１８でｎ＝１である場合、画像処理部２０は、ステップＳ６２０で、ＲＥＭＭ（ｉ，ｊ）＝蓄積時間大により計測不能とする。
【０１６６】
ステップＳ６１６またはステップＳ６２０の後、画像処理部２０は、ステップＳ６２１でｉ＝ｍｘでない場合、ステップＳ６２２でｉ＝ｉ＋１とし、ステップＳ６０８以降の処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ６２１でｉ＝ｍｘであり、ステップＳ６２３でｊ＝ｍｙでない場合、ステップＳ６２４でｊ＝ｊ＋１とし、ステップＳ６０７以降の処理を行う。画像処理部２０は、ステップＳ６２３でｊ＝ｍｙであり、ステップＳ６２５でＭ＝Ｍｍａｘでない場合、ステップＳ６２６でＭ＝Ｍ＋１とし、ステップＳ６０２以降の処理を行う。ステップＳ６２５でＭ＝Ｍｍａｘである場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１６７】
なお、上記ステップＳ６０２では、サンプル蛍光画像に対して空間移動平均化により平滑化処理を行ったが、平均化オペレータを用いて平滑化処理を行なってもよい。
【０１６８】
図２０は、上記ステップＳ６０２に示したサンプル蛍光画像の迷光補正と空間移動平均化の手順を示すサブフローチャートである。画像処理部２０は、ステップＳ７０１でｎ＝１とし、ステップＳ７０２で、ｋ＝１，Γ（ｘ，ｙ）＝０とする。画像処理部２０は、ステップＳ７０３でＣＣＤカメラ１９から、蓄積時間２ｎ−１ｔ０でサンプルチップの第ｎ階層迷光バックグラウンド画像をΓ’（ｘ，ｙ）として撮り込み、ステップＳ７０４で、Γ（ｘ，ｙ）＝Γ（ｘ，ｙ）＋Γ’（ｘ，ｙ）とする。
【０１６９】
ステップＳ７０５でｋ＝ｋｍａｘでない場合、画像処理部２０は、ステップＳ７０６でｋ＝ｋ＋１とし、ステップＳ７０３以降の処理を行う。ステップＳ７０５でｋ＝ｋｍａｘである場合、画像処理部２０は、ステップＳ７０７で、Γｎ（ｘ，ｙ）＝ΓＭｎ（ｘ，ｙ）−Γ（ｘ，ｙ）／ｋによりｋｍａｘ個の平均画像を計算し、ΓＭｎｍａｘ＝０、ΓＭｎｍｉｎ＝２Ｂ−１とする。画像処理部２０は、ステップＳ７０８でｙ＝ｋＳとし、ステップＳ７０９でｘ＝ｋＳとする。
【０１７０】
画像処理部２０は、ステップＳ７１０で、
【数１５】
【０１７１】
を計算し、ステップＳ７１１で、画像中央部の最大輝度
【数１６】
【０１７２】
および最小輝度
【数１７】
【０１７３】
の計測を行う。
画像処理部２０は、ステップＳ７１２で、ｘ＝Ｎｘ−ｋＳ−１でない場合、ステップＳ７１３でｘ＝ｘ＋１とし、ステップＳ７１０以降の処理を行う。ステップＳ７１２でｘ＝Ｎｘ−ｋＳ−１であり、ステップＳ７１４で、ｙ＝Ｎｙ−ｋＳ−１でない場合、画像処理部２０は、ステップＳ７１５でｙ＝ｙ＋１とし、ステップＳ７０９以降の処理を行う。ステップＳ７１４でｙ＝Ｎｙ−ｋＳ−１であり、ステップＳ７１６で、ｎ＝ｎＭｍａｘでない場合、画像処理部２０は、ステップＳ７１７でｎ＝ｎ＋１とし、ステップＳ７０２以降の処理を行う。ステップＳ７１６でｎ＝ｎＭｍａｘである場合、画像処理部２０は処理を終了する。
【０１７４】
図２１は、上記ステップＳ６０３に示した画像分割線決定の手順を示すサブフローチャートである。ステップＳ８０１で、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８０２で最適反応像（全体像）の二値化を行い、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８０３でノーマーカー用行勾配の演算を行い、ステップＳ８０４でノーマーカー最小列ピッチの演算を行い、ステップＳ８０５でノーマーカー用列信号の挿入を行い、ステップＳ８０６で行分割線関数の演算を行う。
【０１７５】
さらに画像処理部２０は、二値化されたサンプル蛍光画像の全体画像に対して、ステップＳ８０７でノーマーカー用列勾配の演算を行い、ステップＳ８０８でノーマーカー最小行ピッチの演算を行い、ステップＳ８０９でノーマーカー用行信号の挿入を行い、ステップＳ８１０で列分割線関数の演算を行う。画像処理部２０は、ステップＳ８１１で、得られた画像分割線の適否判断を行う。
【０１７６】
ステップＳ８０１でＮＰ＝１である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８１２でマーカー１個の位置検出を行い、ステップＳ８１３で最適反応像（全体像）の二値化を行い、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８１４でノーマーカー用行勾配の演算を行い、ステップＳ８１５で１点マーカー最小列ピッチの演算を行い、ステップＳ８１６でノーマーカー用列信号の挿入を行い、ステップＳ８１７で行分割線関数の演算を行う。
【０１７７】
さらに画像処理部２０は、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８１８でノーマーカー用列勾配の演算を行い、ステップＳ８１９で１点マーカー最小行ピッチの演算を行い、ステップＳ８２０でノーマーカー用行信号の挿入を行い、ステップＳ８２１で列分割線関数の演算を行う。画像処理部２０は、ステップＳ８２２で、得られた画像分割線の適否判断を行う。
【０１７８】
ステップＳ８０１でＮＰ＝２である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８２３でマーカー２個の位置検出を行い、ステップＳ８２４で最適反応像（全体像）の二値化を行い、二値化された全体画像に対して、ステップＳ８２５でノーマーカー用行勾配の演算を行い、ステップＳ８２６でノーマーカー用列勾配の演算を行い、ステップＳ８２７で２点マーカー用分割線関数の演算を行う。画像処理部２０は、ステップＳ８３２で、最適反応画像を決定する。
【０１７９】
ステップＳ８０１でＮＰ＝３である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８２８でマーカー３個の位置検出を行い、ステップＳ８２９で３点マーカー用分割線関数の演算を行い、ステップＳ８３２で最適反応画像を決定する。ステップＳ８０１でＮＰ＝４である場合、画像処理部２０は、ステップＳ８３０でマーカー４個の位置検出を行い、ステップＳ８３１で４点マーカー用分割線関数の演算を行い、ステップＳ８３２で最適反応画像を決定する。
【０１８０】
ステップＳ８１１またはステップＳ８２２またはステップＳ８３２の後、ステップＳ８３３で、画像処理部２０は表示部２１に、
【数１８】
【０１８１】
ｙ＝ａ１ｘ＋ｂ１（ｋ）（行分割線）、ｘ＝ａ２ｙ＋ｂ２（ｋ）（列分割線）の表示
を行う。
【０１８２】
図２２は、表示部２１のサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図である。図２２は、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合を示している。図２２に示すように、画像処理部２０は、複数の行分割線７１（横破線）と列分割線７２（縦破線）により、サンプル蛍光画像をプローブアレイ要素単位で複数の分割画像７０に分割する。この場合、各分割画像７０は略正方形状をなしている。検査者は、表示部２１に拡大表示されるサンプル蛍光画像の各分割画像７０上で、入力部２５のマウス等により、測定領域とノイズサンプリング領域（ローカルバックグラウンド領域）とを指定する。画像処理部２０は、該ノイズサンプリング領域からローカルバックグラウンドを検出し、この検出量で前記測定領域からの検出量を補正する。
【０１８３】
ステップＳ８３４で、検査者は、入力部２５のコマンドボタンにより確定をする。なお、コマンドボタン‘分割線補正’は「分割線を補正する」であり、‘ＮＥＸＴ’は「次に進む」であり、‘ＢＡＣＫ’は「メインフローチャートの測定条件の設定（ステップＳ２４）に戻る」であり、‘異常領域指定’は「異常領域を異物画像に加えて再計算する」である。
【０１８４】
検査者は、‘異常領域指定’を確定した場合、入力部２５のマウス等により、表示部２１に表示されるサンプル蛍光画像上で、異常領域を指定する。異常領域とは、異常とみなされるものの、異物画像としては処理されない領域である。画像処理部２０は、指定された異常領域を検査対象外の領域とする。さらに画像処理部２０は、前記異常領域に異物画像の領域を加えて検査対象外の領域とする。
【０１８５】
図２３は、表示部２１のサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図である。図２３は、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合を示している。図２３に示すように、画像処理部２０は、複数の行分割線７１と列分割線７２により、サンプル蛍光画像をプローブアレイ要素単位で複数の分割画像７０に分割する。この場合、各分割画像７０は平行四辺形状をなしている。
【０１８６】
生化学検査用アレイにおけるプローブアレイ要素３の配列状態は、図２３に示すように、行毎（または列毎、または行毎及び列毎）に連続的にずれ、列毎（または行毎、または行毎及び列毎）に勾配を有している場合がある。この場合、図２２に示したような分割を行い、プローブアレイ要素３毎の分割画像を略正方形状とすることはできない。このため画像処理部２０は、プローブアレイ要素３の配列状態に応じて、全ての行分割線７１と全ての列分割線７２の少なくとも一方（図２３では全ての列分割線７２）を所定角度傾ける処理を行う。これにより、プローブアレイ要素３毎の分割画像は、平行四辺形状になる。
【０１８７】
図２４は、二値化されたサンプル蛍光画像の行分割線と列分割線の勾配演算例を示す概念図である。図２４は、位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝０である場合を示している。図２４は、全体画像中の各プローブアレイ要素３の部分が明領域、その他の部分が暗領域である二値化画像をなしているものとする。なお画像処理部２０は、サンプル蛍光画像の二値化に際し、測定領域内での出力値の中央値で二値化を行い、二値化画像を得る。
【０１８８】
画像処理部２０は、全体画像中の明領域と暗領域を、−ｘ方向から＋ｘ方向へ向けて検出して＋ｘ方向へ圧縮処理し、全列の明領域圧縮像と暗領域圧縮像を生成する。図２４では、この圧縮処理の結果、明領域と検出された領域がＯＮ信号で、暗領域と検出された領域がＯＦＦ信号で示されている。そして画像処理部２０は、圧縮した明領域と暗領域を示す各ＯＮ信号と各ＯＦＦ信号のｙ軸方向での幅（縦幅）を検出する。
【０１８９】
生化学検査用アレイにおけるプローブアレイ要素３の配列状態は、行毎に傾きを有している場合がある。このため、図２４に示すように行毎に傾き角度に差がある場合、各ＯＮ信号間でｙ軸方向の幅に差が生じるとともに、各ＯＦＦ信号間でｙ軸方向の幅に差が生じる。
【０１９０】
画像処理部２０は、最も広い幅を有するＯＦＦ信号（圧縮した暗領域）が生じたプローブアレイ要素３の行の傾き角度（勾配）、すなわちＯＦＦ信号の示す領域に接する一方の行の傾き角度を算出する。そして画像処理部２０は、算出した傾き角度を、全ての行分割線の傾き角度（勾配）とする。
【０１９１】
また同様に、画像処理部２０は、全体画像中の明領域と暗領域をｙ方向から−ｙ方向へ向けて検出して−ｙ方向へ圧縮処理し、全行の明領域圧縮像と暗領域圧縮像を生成する。この圧縮処理の結果、明領域と検出された領域がＯＮ信号で、暗領域と検出された領域がＯＦＦ信号で示される。そして画像処理部２０は、圧縮した明領域と暗領域を示す各ＯＮ信号と各ＯＦＦ信号のｘ軸方向での幅（横幅）を検出する。
【０１９２】
生化学検査用アレイにおけるプローブアレイ要素３の配列状態は、列毎に傾きを有している場合がある。このため、列毎に傾き角度に差がある場合、各ＯＮ信号間でｘ軸方向の幅に差が生じるとともに、各ＯＦＦ信号間でｘ軸方向の幅に差が生じる。
【０１９３】
画像処理部２０は、最も広い幅を有するＯＦＦ信号（圧縮した暗領域）が生じたプローブアレイ要素３の列の傾き角度（勾配）、すなわちＯＦＦ信号の示す領域に接する一方の列の傾き角度を算出する。そして画像処理部２０は、算出した傾き角度を、全ての列分割線の傾き角度（勾配）とする。
【０１９４】
次に、二値化されたサンプル蛍光画像の各行分割線の間隔と各列分割線の間隔の第１の演算例について説明する。画像処理部２０は、図２４に示すように、全列の圧縮像の各明領域の中央位置をｐとし、全列の圧縮像の各暗領域の中央位置をｑとする。そして画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｐを示す各点を基に、各行分割線の間隔を算出する。あるいは、画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｑを示す各点を基に、各行分割線の間隔を算出する。
【０１９５】
また画像処理部２０は、全行の圧縮像の各明領域の中央位置をｐ’（不図示）とし、全行の圧縮像の各暗領域の中央位置をｑ’（不図示）とする。そして画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｐ’を示す各点を基に、各列分割線の間隔を算出する。あるいは、画像処理部２０は、各明領域の中央位置ｑ’を示す各点を基に、各列分割線の間隔を算出する。
【０１９６】
行分割線と列分割線の勾配演算の際に、生化学検査用アレイ６上に異物等が存在すると、圧縮した明領域の幅が、プローブアレイ要素３のみによる本来の明領域圧縮像の幅よりも広くなる。この場合、画像処理部２０は、連続する各明領域の幅をプローブアレイ要素３の配列条件と比較し、前記各明領域の幅が本来の明領域圧縮像の幅に相当するか否かを判断する。そして画像処理部２０は、前記各明領域のうち本来の明領域圧縮像の幅に相当しない部分がある場合、その部分の領域をプローブアレイ要素３の配列条件に基づく暗領域に置き換える。その後、画像処理部２０は、各行分割線または各列分割線の間隔を算出する。これにより、異物等による影響を除いた適切な行分割線と列分割線の勾配演算を行える。
【０１９７】
次に、二値化されたサンプル蛍光画像の各行分割線の間隔と各列分割線の間隔の第２の演算例について説明する。位置検出用マーカー数（位置検出用プローブ数）ＮＰ＝１，２，３，４である場合、画像処理部２０は、生化学検査用アレイに設けられた所定の位置検出用アレイ要素２の中心位置を検出し、該中心位置を基に行分割線および列分割線の初期位置を算出する。そして画像処理部２０は、前記初期位置と、各位置検出用アレイ要素２を基準としたプローブアレイ要素３の配列条件とに基づき、各行分割線の間隔と各列分割線の間隔を算出する。
【０１９８】
次に、分割画像における測定領域の決定処理について説明する。
【０１９９】
図２５は、レファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図である。図２５において図４と同一な部分には同符号を付してある。画像処理部２０は、分割画像に対して該分割画像内の出力値の中央値で二値化を行い、二値化画像を得る。その後、画像処理部２０は、この二値化画像の二値化ライン４０に外接する矩形４１１を一定量膨張させた矩形４１２を、ノイズサンプリング領域（ローカルバックグラウンド領域）４３の境界とする。そして画像処理部２０は、分割画像内でこの境界の外側を前記ノイズサンプリング領域４３とし、この境界の内側を測定領域４２とする。これにより、二値化領域４１全域とその周辺を含めた領域を、測定領域４２とすることができる。
【０２００】
なお画像処理部２０は、λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とした場合、膨張の量δを下式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２０１】
図２６は、レファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図である。図２６において図４と同一な部分には同符号を付してある。画像処理部２０は、分割画像に対して該分割画像内の出力値の中央値で二値化を行い、二値化画像を得る。その後、画像処理部２０は、この二値化画像の二値化ライン４０に内接する矩形４１１を一定量収縮させた矩形４１２を、測定領域４２の境界とする。そして画像処理部２０は、分割画像内でこの境界の内側を前記測定領域４２とし、二値化ライン４０の外側をノイズサンプリング領域４３とする。これにより、二値化領域４１のみを、測定領域４２とすることができる。
【０２０２】
なお画像処理部２０は、λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とした場合、収縮の量δを下式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２０３】
図２５または図２６に示した測定領域の決定処理の後、画像処理部２０は、測定領域４２の単位面積当りの平均発光強度からノイズサンプリング領域４３の単位面積当りの平均発光強度を差し引いた強度を、各プローブの反応強度として検出する。
【０２０４】
なお、本発明の生化学的検査方法は以下の構成を有する。
【０２０５】
(1)レファレンスアレイは、生化学検査用アレイと同一のフォーマットで各プローブアレイ要素に対応するアレイ要素に同数の前記発光性分子が保持されている。
【０２０６】
(2)光で励起発光する複数の異なる発光性分子で標識された第１の生化学的物質を含む複数のサンプルの混合溶液を被検サンプルの溶液とし、複数の異なる発光性分子が一定の割合で混在して保持されたレファレンスアレイを用いて、各プローブアレイ要素内のプローブと前記各サンプルとの反応状態を検査する。
【０２０７】
(3)プローブアレイ要素の標準面積に対応する発光強度または単位面積当たりの平均発光強度を検出する。
【０２０８】
(4)発光関数として、光で励起発光する複数の異なる発光性分子で標識された第１の生化学的物質を含む複数のサンプルの混合溶液を被検サンプルの溶液とし、前記複数の異なる発光性分子が一定の割合で混在して保持されたレファレンスアレイを用いて、各プローブアレイ要素内のプローブと前記各サンプルとの反応状態を検査する。
【０２０９】
(5)発光関数を定めるパラメータとして非線型係数を設定し、該非線型係数を用いて各プローブアレイ要素内に存在する発光性分子の数を求める。
【０２１０】
(6)ｎMkをプローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量、Ｊを発光性分子の種類数、ＩMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの１分子当たりの発光強度、ρを非線型係数、ＰMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度とし、前記発光関数を
【数１９】
【０２１１】
とする。
(7)前記ＩMkを
【数２０】
【０２１２】
とする。
(8)ＰMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度、ｎRMを前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量、ＰRMk を前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度とし、前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量ｎMkを式
【数２１】
【０２１３】
により求める。
(9)ρを非線型係数、ｎRMを前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量、ＰRMk を前記レファレンスアレイの要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度、ＰMkを前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの発光強度、
【数２２】
【０２１４】
を前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量ｎMkのｉ番目の演算値とし、初期値
【数２３】
【０２１５】
および逐次演算式
【数２４】
【０２１６】
および逐次演算終了判定式
【数２５】
【０２１７】
を用いて、逐次演算終了時の
【数２６】
【０２１８】
を前記プローブアレイ要素ｋ内の発光性分子Ｍの数量ｎMkとする。
【０２１９】
(10)光で励起発光する複数の異なる発光性分子で標識された第１の生化学的物質を含む複数のサンプルの混合溶液を被検サンプルの溶液とし、該被検サンプルの溶液を生化学検査用アレイに供給する。
【０２２０】
(11)予め生化学検査用アレイの異物画像を取得し、異常領域に該異物画像の異物領域を加えて非対象領域とする。
【０２２１】
(12)λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とし、膨張の量δを式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２２２】
(13)λを検出する蛍光波長、ａを試料側の開口数、Δをデフォーカス量とし、収縮の量δを式
δ＝１．６１９×λ／ａ＋ａ｜Δ｜
により定める。
【０２２３】
なお、本発明は上記実施の形態のみに限定されず、要旨を変更しない範囲で適宜変形して実施できる。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】本発明の第１の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図２】本発明の第１の実施の形態に係る生化学検査用アレイの概略構成を示す図。
【図３】本発明の第１の実施の形態に係るレファレンスアレイのフォーマットを示す図。
【図４】本発明の第１の実施の形態に係るレファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図。
【図５】本発明の第１の実施の形態に係るＣＣＤからの出力信号を示す図。
【図６】本発明の第１の実施の形態に係るノイズ信号を出力信号から差し引いた信号を示す図。
【図７】本発明の第１の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図８】本発明の第１の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図９】本発明の第１の実施の形態に係る散布図。
【図１０】本発明の第２の実施の形態で使用する生化学検査用アレイの上面のフォーマットを示す図。
【図１１】本発明の第２の実施の形態で使用するレファレンスアレイの上面のフォーマットを示す図。
【図１２】本発明の第３の実施の形態に係る生化学的検査方法を実施する顕微鏡装置の構成を示す図。
【図１３】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１４】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１５】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１６】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１７】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１８】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図１９】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図２０】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図２１】本発明の第３の実施の形態に係る検査手順を示すフローチャート。
【図２２】本発明の第３の実施の形態に係るサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図。
【図２３】本発明の第３の実施の形態に係るサンプル蛍光画像上に表示された分割線を示す概念図。
【図２４】本発明の第３の実施の形態に係る行分割線と列分割線の勾配演算例を示す概念図。
【図２５】本発明の第３の実施の形態に係るレファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図。
【図２６】本発明の第３の実施の形態に係るレファレンス蛍光画像およびサンプル蛍光画像の分割画像を示す図。
【図２７】従来例に係る三次元アレイをなすテーパ付き試料ウェルアレイを示す図。
【符号の説明】
【０２２５】
１…生化学検査用アレイ
２…位置検出用アレイ要素
３…プローブアレイ要素
３１…プローブ
４…レファレンスアレイ
５…蛍光分子保持用要素
６…生化学検査用アレイ
７…レファレンスアレイ
８…蛍光分子保持領域
１１…励起光源
１２…シャッター
１３…レンズ
１４０…励起フィルタユニット
１４…励起フィルタ
１５…ダイクロイックミラー
１６…対物レンズ
１７０…ＮＤフィルタユニット
１７…ＮＤフィルタ
１８…結像レンズ
１９…ＣＣＤカメラ
２０…画像処理部
２１…表示部
２２…システム制御部
２３…ファイル処理部
２４…入力部
２５…記憶部
４０…二値化ライン
４１…二値化領域
４２…測定領域
４３…ノイズサンプリング領域
７０…分割画像
７１…行分割線
７２…列分割線
１０１…多孔性ガラスウェハー
１０２…孔
１０３…テーパ付きウェル
１０４…チャンネル
１０５…貫通孔
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、光で励起発光する発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、
前記アレイ型検出器により得られた光画像の対象領域内の最小検出量を蛍光バックグラウンドとし、該蛍光バックグラウンドを前記光画像から差し引いた光画像を対象画像とすることを特徴とする生化学的検査方法。
【請求項１】
第１の生化学的物質の溶液を、表面に該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質が各々保持されている生化学検査用アレイに供給し、光で励起発光する発光性分子による標識を用いて前記生化学検査用アレイの各プローブアレイ要素ごとに前記発光性分子の発光強度をアレイ型検出器で検出することにより、前記第１の生化学的物質と該第１の生化学的物質に特異的に反応する第２の生化学的物質との反応状態を前記各プローブアレイ要素ごとに検査する生化学的検査方法であり、
前記アレイ型検出器により得られた光画像の対象領域内の最小検出量を蛍光バックグラウンドとし、該蛍光バックグラウンドを前記光画像から差し引いた光画像を対象画像とすることを特徴とする生化学的検査方法。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【公開番号】特開２００６−１４５５４９（Ｐ２００６−１４５５４９Ａ）
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００５−３７２５３９（Ｐ２００５−３７２５３９）
【出願日】平成１７年１２月２６日（２００５．１２．２６）
【分割の表示】特願２００５−９２６３４（Ｐ２００５−９２６３４）の分割
【原出願日】平成１４年３月２２日（２００２．３．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
【公開日】平成１８年６月８日（２００６．６．８）
【国際特許分類】
【出願日】平成１７年１２月２６日（２００５．１２．２６）
【分割の表示】特願２００５−９２６３４（Ｐ２００５−９２６３４）の分割
【原出願日】平成１４年３月２２日（２００２．３．２２）
【出願人】（００００００３７６）オリンパス株式会社 (11,466)
【Ｆターム（参考）】
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