癌の治療のためのカナマイシンアンチセンス核酸
本発明は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列を含む核酸に関する。この核酸は、ＤＮＡワクチンアジュバントとして有用であり、例えば癌の治療のために、例えば非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えば全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）と組み合わせて使用され得る。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列を含む核酸に関する。この核酸は、ＤＮＡワクチンアジュバントとして有用であり、例えば癌の治療のために、例えば非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤（non-immunosuppressive inducer of tumor cell apoptosis）、例えば全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）と組み合わせて使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国における死亡原因が２番目に高く、心疾患の次である。これらの癌死亡の約１０％が血液癌、例えば白血病、リンパ腫及び骨髄腫によって引き起こされる。欧州及び米国のみで、１９０万人の人々が血液癌を罹患していると推定される。これらの血液癌の幾つかは奇病であり、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ、ＡＭＬタイプＭ３）は、前骨髄球性白血病遺伝子（ＰＭＬ）をレチノイン酸受容体アルファ遺伝子（ＲＡＲα）と融合させる相互転座ｔ（１５；１７）によって、及び前骨髄球性段階における骨髄分化の停止によって特徴づけられる。全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）媒介性分化療法は現在、ＡＰＬ患者における標準的治療法の基本である。しかし、ＡＴＲＡと化学療法を組み合わせた現行の治療で獲得される寿命の延長にもかかわらず、現行の維持療法の順守をしないために、約１０人の患者はなお再発する。したがって、残存疾患を根絶するための新規治療方針及び生活の質の改善が求められている。
【０００３】
現在までに、多くの腫瘍関連性抗原が同定されており、これらの腫瘍抗原に対する免疫応答を引き起こさせるためのワクチン接種戦略が開発された。天然及び組み換え癌タンパク質抗原は、規定の免疫原性抗原を標準レベルで含み、そしてそれらの有効性は、適切なアジュバント及び送達系の発見に依存する。ＤＮＡ送達、例えば生存宿主に対する遺伝子発現カセットの直接的注入は、ワクチン及び免疫療法に対する新規アプローチである。送達された遺伝子の発現は、発現された抗原に対する宿主免疫防御の特異的免疫活性をもたらし得る。
【０００４】
ワクチン戦略の有効性は、体液性及び細胞毒性の両方であり得る免疫応答の獲得に依存する。ＤＮＡワクチンは、これらの要求を満たし、プラスミドによってコードされた抗原に対する強力且つ持続的細胞媒介性免疫応答（ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の産生）及び体液性免疫応答をもたらすことが示されている。癌へのこの種のワクチン接種の適用は、Ｂ−非ホジキンリンパ腫（B-Non Hodgkin’s Lymphoma）（Ｂ−ＮＨＬ）に対して、それに対する抗腫瘍応答を引き起こす抗原として表面免疫グロブリンのイディオタイプを用いて、最初に使用された（Stevenson et al., 1995, Immunological Reviews 145:211-28; Syrengelas et al., 1996, Nature Medicine 2:1038-41, Rice et al., 2008, Nature Reviews 8:108-20）。当該防御免疫は、リンパ腫及び骨髄腫の他のマウスモデルにおいても観察された。
【０００５】
しかし、細胞免疫系の全身性の機能障害が数人の癌患者において報告されている。このため、これらの患者、特にＡＰＬ患者の悪い免疫状態は、ワクチン戦略単独の治療への免疫療法的アプローチに対する主要な障害とみなされる。Padua 他(2003, Nature Medicine 9:1413-1417)は、ＡＰＬ動物モデル（Brown et al. 1997, Proc Natl Acad Sci U S A. 94:2551-6）を利用して、ＰＭＬ−ＲＡＲα腫瘍抗原が破傷風毒素断片（ＦｒＣ）配列と連結された核酸を含むＤＮＡワクチンのインビボにおける有効性を試験した。それらの結果は、ＡＴＲＡがＰＭＬ−ＲＡＲα−ＦｒＣ ＤＮＡワクチン接種においてアジュバントとして作用して、ＡＰＬマウスの生存を延長させることを実証した。これは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＲＡＲα抗体及びＩＦＮγ産生の増大を伴い、関連性免疫応答の誘導を実証した。
【０００６】
国際公開第０３／０９０７７８号は、（ｉ）非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばＡＴＲＡ、及び（ｉｉ）免疫原性ポリペプチド、例えばＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ、ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳ−ＦｒＣ又はＳｃＦｖＢＣＬ１−ＦｒＣをコードする配列を含む核酸、を含むワクチン組成物が、ＡＰＬマウスを再発及び死亡から救済することをさらに教示している。
【０００７】
したがって、ＤＮＡワクチン接種とＡＴＲＡ投与とを組み合わせる治療法は、白血病の有望な治療法を構成する（Padua and Chomienne, 2004, Discovery Medicine 4:41-44）。癌患者において免疫応答を増大させるために有用である、ＤＮＡアジュバント開発への必要性が当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の説明
驚くべきことに、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的である配列番号１のＫａｎＡＳ配列が、ＤＮＡワクチン接種における非常に有効なアジュバントであることが明らかとなった。
【０００９】
より具体的には、本発明者は、配列番号１のＫａｎＡＳ配列を、単独で又はＰＭＬ−ＲＡＲα腫瘍抗原と融合されて含むプラスミドが、ＡＴＲＡと組み合わせて投与されたときに、ＡＰＬマウスの生存を延長させることを示した。さらに、ＭＤＳマウスにおいて、ＫａｎＡＳは単独で寿命を延長させた。免疫応答はフローサイトメトリーによって測定され、ＫａｎＡＳ単独で処置されたＭＤＳマウスが、同定された野生型ＦＶＢ／Ｎマウスと比較して、３倍増加したメモリーＴ細胞を有することが判明した。さらに、白血病幹細胞群は、ＫａｎＡＳを用いた処置で減少した（未処置マウスにおいて約２５％、処置マウスにおいて約１０％）。最終的に、ＤＮＡがリガンドの１つである受容体である、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流経路に存在する、ＭｙＤ８８転写産物の一時的上方制御が観察された。
【００１０】
免疫応答を発揮する任意の抗原が、ＫａｎＡＳの上流又は下流でクローニングされ得る。ＫａｎＡＳを含む核酸を用いたＤＮＡワクチン接種はしたがって、全ての癌に適用可能であり、感染症を含む、免疫応答を必要とする多くの他の疾患に対して適用可能である。本発明のＤＮＡワクチン接種戦略は、癌遺伝子が生殖細胞系に存在し、遺伝する癌、例えば乳癌及び結腸癌に対して遺伝的素因を有する個人に対しても適用可能である。
【００１１】
さらに自家ワクチンとは異なり、本発明のＤＮＡワクチンは、既定の癌状態に特異的なワクチンではない。それらは、自己抗原に対する自己免疫を含む危険が全く存在しない。さらに、これらのワクチンは、容易にスケールアップ可能な標準的細菌発酵処理によって製造され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明のＫａｎＡＳ核酸を含む、ｐＶａｘ１４及びｐＶａｘ１５プラスミドを示す。ｐＶａｘ１４は配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含み、ｐＶａｘ１５は配列番号３のＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸を含む。
【図２】図２は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸が、ＡＰＬ（急性前骨髄球性白血病）マウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。プラスミド地図に関する図１０を参照。列１：ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｎ＝１２）（ＰＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）；列２：ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ｎ＝４８）（ＶＶＡＣＳ０１）；列３：ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ｎ＝１２）（ＶＶＡＣＳ０４）；列４：ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ｎ＝１２）（ＶＶＡＣＳ０１）．列５：ＡＴＲＡ（ｎ＝３２）；列６：プラセボ＋ＤＮＡ（ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ）（ｎ＝１１）（ＶＶＡＣＳ０１）；列７：プラセボ（ｎ＝１０）。
【図３】図３は、配列番号３のＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１５核酸が、ＡＰＬマウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。列１：ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ｎ＝２１）（ＶＶＡＣＳ０１）；列２：ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ（ｎ＝１０）（ｐＶａｘ１５，ＶＶＡＣＳ０３）；列３：ＡＴＲＡ（ｎ＝９）。
【図４】図４は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４（ＶＶＡＣＳ０２）核酸が、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）マウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。列１：ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｐＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）（ｎ＝６）；列２：未処置（ｎ＝２５）。Ｐ＝０．０００２。
【図５】図５は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸が、ＭＤＳマウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｎ＝１０）（ｐＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）；ＰＭＬ−ＲＡＲａＡＳ−ＦｒＣ（ｎ＝１６）（ＶＶＡＣＳ０４）；未処置：ｎ＝２５。Ｐ値：未処置ｖｓ．ＰＭＬ−ＲＡＲａＡＳ−ＦｒＣ＜０．０００１；未処置ｖｓ．ｐＶａｘＫａｎＡＳ＝０．０００２；ＰＭＬ−ＲＡＲａＡＳ−ＦｒＣ ｖｓ．ｐＶａｘＫａｎＡＳ＝０．３６４８。
【図６】図６は、ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣが、ＭＤＳマウスモデルの寿命を延長させることを示す。ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ｎ＝１６）（ＶＶＡＣＳ０４）；未処置：ｎ＝２６；ＡＴＲＡ：０＝１１；ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ｎ＝９）（ＶＶＡＣＳ０４）。Ｌｏｇ−ランクＰ値：ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４），ＡＴＲＡ又はＡＴＲＡ＋ＤＮＡｖｓ未処置＝＜０．０００１；ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４） ｖｓ．ＡＴＲＡ＝０．９９９４；ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４） ｖｓ．ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４）＝０．１９５７；ＡＴＲＡ ｖｓ．ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ＋ＡＴＲＡ＝０．３８３４。
【図７】図７は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸を用いたマウスのワクチン接種が、ＣＤ４+、ＣＤ４４hi、ＣＤ６２ＬloメモリーＴ細胞群の増大をもたらすことを示す。Ｄ１５、Ｄ３３及びＤ１８３は、ＭＤＳの診断からの日数を示す。
【図８】図８は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸を用いたマウスのワクチン接種が、安定なレベルでのＭａｃ−２hi／Ｇｒ１lo白血病始原細胞群の維持を可能とすることを示す。Ｄ１５、Ｄ３３及びＤ１８３は、ＭＤＳの診断からの日数を示す。
【図９】図９は、ＤＮＡワクチン接種が、ＤＮＡがリガンドであるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流のシグナル経路に存在する、ＭｙＤ８８を上方制御することを示す。したがって、ＤＮＡワクチン接種時に見られるＭｙＤ８８の発現増大は、ＴＬＲの一時的活性化が存在することを示す。
【図１０】図１０は、ＶＶＡＣＳプラスミド地図を示す。
【図１１】図１１は、ＡＭＬマウスモデルにおける、異なるＶＶＡＣＳ産物（ＶＶＡＣＳ０１ ＆ ＶＶＡＣＳ０２ ＆ ＶＶＡＣＳ０３）プラスＡＴＲＡの効果を示す。
【図１２】図１２は、ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種が、特異的なＴ細胞応答をもたらすことを示す。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイは、ＩＦＮｇの増大を示す。
【図１３】図１３は、ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種が、病勢安定（stable disease）を維持することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＫａｎＡＳ核酸
本発明は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的な配列を含む、又はから成る、単離及び／又は精製された核酸に関する。本発明のかかる核酸は、「ＫａｎＡＳ核酸」と呼ばれる。前記カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片は、任意の長さであり得、例えば少なくとも、最大、又は約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７３又は５００個の連続的ヌクレオチドであり得る。
【００１４】
本発明において、「核酸」は、リボヌクレオシドのリン酸エステルポリマー形態（「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオシドのリン酸エステルポリマー形態（「ＤＮＡ分子」）又はそれらの任意のリン酸エステル類縁体、例えばホスホロチオエート及びチオエステルのことであって、それらは一本鎖形態又は二本鎖らせんのいずれかであり得る。用語「核酸」は、二本鎖ＤＮＡ、特に直鎖（例えば制限断片）又は環状ＤＮＡ分子を含む。核酸は好ましくはＤＮＡ分子に相当する。
【００１５】
本明細書において使用される「単離及び／又は精製された」は、ヒト又は動物の身体から単離及び／又は精製された化合物、並びに／或いは化合物のライブラリーから単離及び／又は精製された化合物のことである。
【００１６】
本明細書において使用される用語「カナマイシン耐性タンパク質」は、カナマイシンに対する耐性を付与することができる酵素のことである。かかる酵素は、以下の酵素反応を触媒する：
【００１７】
ＡＴＰ ＋ カナマイシン → ＡＤＰ ＋ カナマイシン３’−リン酸
【００１８】
カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列は、任意の微生物由来であり得、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトミセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）、サルモネラ・ティフィムリム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ストレプトミセス・リボシディフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）又はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来であり得る。好ましくは、カナマイシン耐性タンパク質をコードする前記配列は、配列番号９の１２２６〜２０２０位のヌクレオチドから成る配列を有する。
【００１９】
本発明のＫａｎＡＳ核酸は、ｐＶａｘ１ベクター（カタログ番号V260-20, Invitrogen, Carlsbad, California, USA）断片に相補的な配列をさらに含み得る。ｐＶａｘ１ベクターの配列は、配列番号９として示される。
【００２０】
したがって本発明のＫａｎＡＳ核酸は、例えば、配列番号９の断片に相補的である配列であって、配列番号９の前記断片は、配列番号９の１２２６〜２０２０位に位置するヌクレオチドの内、少なくとも、最大又は約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７３又は５００個の連続的ヌクレオチドを含む。配列番号９の断片は、例えば、配列番号９の１２２６〜２０２０位に位置するヌクレオチドの内、５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００又は４５０〜５００個の連続的ヌクレオチドを含み得る。ＫａｎＡＳ核酸はまた、かかる配列の誘導体に相当し得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸は：
− 配列番号１又は２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である配列；
− 配列番号１又は２の、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０個の連続的ヌクレオチドの断片；又は
− 配列番号１又は２の誘導体
を含むか、又はから成る。
【００２２】
これらのＫａｎＡＳ核酸は、好ましくは生物活性を示す。本明細書において使用される用語ＫａｎＡＳ核酸の「生物活性」は、哺乳動物、例えばマウス、ラット又はヒトにおいて免疫応答を引き起こす能力のことである。かかる生物活性を測定する方法は、当業者に周知である。例えば、Padua 他 （2003, Nature Medicine 9:1413-1417）において開示された方法が使用され得る。１つの好ましい実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸の生物活性は、ＡＴＲＡと組み合わせて投与されたとき、ＡＰＬ又はＭＤＳのマウスモデル（以降、「ＡＰＬマウス」又は「ＭＤＳマウス」と呼ぶ）において生存を延長する能力を評価することによって測定される（本発明の実施例２及び３を参照）。
【００２３】
本発明の問い合わせ配列と、例えば少なくとも９５％「同一」である配列を有する核酸によって、当該配列が、当該問い合わせ配列の各１００ヌクレオチドごとに最大５個のヌクレオチドの変更を含み得ることが意図される。他言すれば、問い合わせ配列と少なくとも９５％同一である配列を有する核酸を得るために、最大５％（１００個中５個）の配列中のヌクレオチドが、挿入されるか、欠失されるか又は別のヌクレオチドで置換され得る。
【００２４】
用語「誘導体」は、断片（fragment）、類縁体（homologue）、変異体（mutant）及び天然発生のバリアント（variant）、例えば対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、又はタンパク質プロセシングを通じて得られたバリアントを含む。参照配列と「少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一」であるアミノ酸配列から成る誘導体は、当該参照配列と比較して、変異、例えば欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。置換の場合、参照配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む誘導体は、参照配列よりも別の種由来の相同配列に相当し得る。当該置換は、以下の表に示された通りの保存的置換に相当し得る。
【００２５】
【表１】
【００２６】
１つの具体的な実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸は、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドをコードするアンチセンス配列を含むか、又はから成り、ここで前記アンチセンス配列はカナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的である。
【００２７】
ＫａｎＡＳ核酸は、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする配列をさらに含み得る。少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする前記配列は例えば、国際公開第０３／０９０７７８号に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列に相当する。
【００２８】
１つの実施形態において、当該免疫原性ポリペプチドは腫瘍抗原に相当する。したがってこの実施形態にしたがって、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列、及び腫瘍抗原をコードする配列を含む。これらの２つの配列は、フレーム中で融合され得、すなわち、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列によってコードされるペプチド又はポリペプチドと、腫瘍抗原との間の融合タンパク質の発現をもたらす。当該腫瘍抗原は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列によってコードされるペプチド又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端と融合され得る。
【００２９】
有利に使用され得る腫瘍抗原の中で、ヒトＰＭＬ（前骨髄球性白血病遺伝子）−ＲＡＲα（レチノイン酸受容体アルファ遺伝子）、急性骨髄性白血病１／８−２１（ＡＭＬ１／ＥＴＯ）、コア結合因子ベータ／筋ミオシン重鎖（ＣＢＦベータ／ＭＹＨ１１）、ｅｔｓ−様遺伝子／血小板由来増殖因子受容体ベータ（Ｔｅｌ−ＰＤＧＦ）、前骨髄球性白血病ジンクフィンガー／レチノイン酸受容体アルファ（ＰＬＺＦ−ＲＡＲ）、４０個の潜在的パートナーが存在する骨髄／リンパ（ＭＬＬ）融合体（fusion）、ｅｔｓ−様遺伝子／急性骨髄性白血病１（ＡＭＬ−１−ＥＴＯ）、切断点クラスター領域／アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）（ＢＣＲ−ＡＢＬ）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ、ＭＬＬ−ＡＦ４、及び変異によって活性化される癌遺伝子、例えばＲＡＳ遺伝子、が引用され得る。
【００３０】
本発明の具体的実施形態において、腫瘍抗原はＰＭＬ−ＲＡＲαである。用語「ＰＭＬ−ＲＡＲα」は、The 他 (1990, Nature 347:558-61)に記載されている、ｔ（１５；１７）染色体転座から生じる融合タンパク質を意味する。ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原は例えば、配列番号５の配列又はその誘導体を含み得る、又はから成り得る。
【００３１】
好ましい実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸は、以下：
− 配列番号３又は４のＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳと、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一である配列；
− 配列番号３又は４の内、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００若しくは５５０個の連続的ヌクレオチドの断片；又は、
− 配列番号３又は４の誘導体
を含む、又はから成る。
【００３２】
これらのＫａｎＡＳ核酸は好ましくは生物活性を示す。
【００３３】
或いは、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、癌状態に対して「非特異的」である。本実施形態の枠組み内において、当該配列が腫瘍抗原を含まないとしても、任意の免疫応答増強剤が好適であり得る。
【００３４】
癌状態に対して「非特異的」である免疫原性ポリペプチドは、例えば、国際公開第０３／０９０７７８号に開示されており、ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳ又はＳｃＦｖＢＣＬ１を含む。「非特異的」免疫原性ポリペプチドは例えば、配列番号６（ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳ）の配列若しくはその誘導体を含む又はから成る配列によってコードされ得る。前記「非特異的」免疫原性ポリペプチドをコードする配列はまた、破傷風毒素断片Ｃ（ＦｒＣ）（配列番号１６）、コレラ毒素（ＣＴ）配列、Ｅ．コリ易熱性毒素（ＬＴ）配列、百日咳毒素（ＰＴ）配列、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素Ａ配列、及びそれらの免疫原性断片から成る群から選択され得る。
【００３５】
免疫原性ポリペプチドは、好適なソフトウェアを用いて当業者によって容易に同定され得る。例えば、（疎水性プロットを分析することにより）ポリペプチドの疎水性を特徴付けすることによって、それらが免疫原性であるか否かを予測可能である。ポリペプチドの疎水性の特徴付けのためのソフトウェアは、例えば、Kyte-Doolittle 又はHopp-Woods アルゴリズムの使用に基づくものを含む。Kyte-Doolittleアルゴリズムは、タンパク質の疎水性を表現するために広く適用される基準である。０超の値を有する領域は、性質上疎水性である。Hopp-Woods アルゴリズムは、ポリペプチドの潜在的な抗原性領域を予測するために考案された。０超の値は親水性であり、したがって折り畳まれたタンパク質表面において曝露される傾向にある。
【００３６】
具体的な実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、配列番号１８〜２３のいずれか１つから成る群から選択される。これらの免疫原性ポリペプチドは、ポリペプチドの疎水性の特徴付けをするための上記ソフトウェアを用いて同定された。
【００３７】
本発明は、ＫａｎＡＳ核酸を含むベクターにさらに関する。ここで当該ベクター上において、当該ＫａｎＡＳ核酸は、当該ＫａｎＡＳ核酸の転写を可能とするシグナル（例えばプロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサー）の制御下に配置されている。当該ベクターは好ましくは、ＤＮＡワクチン接種ベクターに、すなわちＤＮＡワクチンの開発のために特に設計されたベクターに相当する。当該ＤＮＡワクチン接種ベクターは、例えばｐＶａｘ１ (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 又はｐＣＤＮＡ3 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 発現ベクターに相当し得るか、又はそれらに由来し得る。当該ベクターは、抗生物質、例えばアンピシリン又はカナマイシンに対する耐性を付与する耐性遺伝子をさらに含み得る。或いは、当該ベクターは、抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を全く含まない。
【００３８】
本発明のＫａｎＡＳ核酸の治療的使用
上記のＫａｎＡＳ核酸は、ＤＮＡワクチン接種において、特にアジュバントとして有用であることが明らかとなった。かかるＫａｎＡＳ核酸は、免疫応答を引き起こし、したがって免疫応答の増強が求められている種々の疾患、例えば感染症及び癌を治療するために使用され得る。したがって本発明は、ＤＮＡワクチン接種における（例えばアジュバントとしての）使用のための、及び／又は、癌、良性腫瘍若しくは感染症の治療又は予防における使用のための、本発明のＫａｎＡＳ核酸に関する。
【００３９】
本明細書において使用される用語「癌」は、任意の種類の悪性（すなわち良性ではない）腫瘍のことである。
【００４０】
悪性腫瘍は好ましくは、血液（blood）（又は血液（haemotological））癌、例えば白血病、リンパ腫又は骨髄腫に相当する。かかる血液癌は例えば、急性前骨髄球性白血病（acute promyelocytic leukaemia）（ＡＰＬ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukaemia）（ＡＭＬ）、リンパ性若しくは骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic lymphocytic leukaemia）（ＣＭＬ）、骨髄単球性白血病（myelomonocytic leukaemia）（ＣＭＭＬ）、小児急性リンパ性白血病（childhood acute lymphoblastic leukaemia）（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome）（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫（Hodgkin lymphoma）（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin lymphoma）（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（multiple myeloma）（ＭＭ）を含む。
【００４１】
或いは当該腫瘍は、固形腫瘍、例えば上皮性悪性腫瘍（carcinoma）、腺癌（adenocarcinoma）、非上皮性悪性腫瘍（sarcoma）、悪性黒色腫（malignant melanoma）、中皮腫（mesothelioma）又は芽細胞腫（blastoma）に相当し得る。具体的実施形態において、当該固形腫瘍は、膵臓癌、肺癌、乳癌、結腸癌又は結腸直腸癌に相当し得る。
【００４２】
用語「感染症」は、種々の生命体、例えば細菌、マイコプラズマ、原虫、真菌及びウィルス（例えばＨＩＶ、肝炎ウィルス、特にＨＢＶ若しくはＨＣＶ）によって引き起こされる疾患を含む。
【００４３】
「治療」は、（すなわち、所定の疾患を罹患している患者に対する）治療的使用を意味し、「予防」は、（すなわち、所定の疾患の発症に対して感受性である個体に対する）予防的使用を意味する。用語「治療」は、疾患の全快をもたらす治療のみならず、疾患の進行を遅らせ、及び／又は患者の生存を延長する治療を含む。
【００４４】
癌治療の枠内において、本発明のＫａｎＡＳ核酸は好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わせた、同時又は連続的使用のためのものである。他言すれば、当該非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシスの誘導剤及び当該核酸は、同時に、すなわち時間的に同時に、又は連続的に、すなわち患者の一般的治療スケジュールの間において異なる時間に投与され得る。しかし、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、単独で使用されたときにおいても有効である（例えば、実施例３を参照）。
【００４５】
「アポトーシス」は、画一的な形態学的変化を示す、細胞死の一形態のことである。アポトーシスは、例えばDengler 他 (1995, Anticancer Drugs. 6:522-32)に記載されたヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーアッセイによって、又はGorczyca (1993, Cancer Res. 53:1945-51)によって記載されたインサイチュにおける末端デオキシヌクレオチド転移酵素及びニック翻訳アッセイ（terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay）（ＴＵＮＥＬ分析）によって測定され得る。
【００４６】
「非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤」は、当業者に周知である。非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、例えば、レチノイド化合物、ヒ素関連性化合物、ＣＤ４３７、並びに他の分化誘導剤及びアポトーシス誘導剤、ＣＤ４４を活性化する化合物、例えば抗体及びヒアルロン酸、造血増殖因子及び分化因子、５−アザシチジン及び他の脱メチル化剤、ファルネシル転移酵素（ＦＴＩ）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、小分子例えばイマチニブ（Imatinib）、ＢＨ３模倣阻害剤、例えばＡＢＴ７３７、並びにＲＡＣ１阻害剤に相当し得る。
【００４７】
「レチノイド化合物」はビタミンＡ誘導体のことであり、例えば、レチノイン酸（ＲＡ）、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シス ＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シス ＲＡ及びレチノイン酸の合成類縁体、例えばＡＭ５８０を含む。好ましくは、当該レチノイド化合物は、ＡＴＲＡ又はＡＭ５８０に相当する。
【００４８】
「ヒ素関連性化合物」は、ヒ素のようにホスファターゼ阻害剤である任意の化合物、又はジチオール基結合によって共有結合を形成することができる任意の化合物を意味する。かかる化合物は例えば、ヒ素及び三酸化ヒ素を含む。
【００４９】
好ましい実施形態において、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、前記核酸によって引き起こされる生物学的応答に対してアジュバント活性を有する。
【００５０】
「アジュバント活性」は、本明細書において、２つの成分の組み合わせによって達成される効果であって、当該２つの成分のいずれか１つの効果よりも大きいものと定義される。
【００５１】
場合により非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わされる、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、少なくとも１つの抗癌剤、例えば５−アザシチジン (Vidaza（商標）) 又はデシタビン（decitabine）と組み合わせて（同時に、又は連続的に）投与され得る。
【００５２】
癌治療の枠内において、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、好ましくは、腫瘍抗原をコードする配列を含む。最も好ましくは、当該腫瘍抗原は、治療されるべき癌に特異的である。癌療法のために有用な抗原の例は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のためのＰＭＬ−ＲＡＲα、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）タイプＭ２の治療のためのＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＡＭＬタイプＭ４好酸球増多症におけるＣＢＦベータ−ＭＹＨ１１、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）のためのＴｅｌ−ＰＤＧＦ、バリアントＡＰＬにおけるＰＬＺＦ−ＲＡＲα、種々のリンパ性白血病又は骨髄性白血病におけるＭＬＬ融合体（fusion）、小児急性リンパ性白血病のための、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ、ＭＬＬ−ＡＦ４又は変異によって活性化される癌遺伝子、例えばＲＡＳ遺伝子、並びに、慢性骨髄性白血病又は小児急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療のためのＢＣＲ−ＡＢＬ、を含む。
【００５３】
本発明はまた、免疫応答を引き起こすための、及び／又は癌若しくは感染症を治療若しくは予防するための方法であって、有効量の本発明のＫａｎＡｓ核酸を、それを必要とする個体へ投与する工程であって、場合により前記ＫａｎＡｓを核酸非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わせて投与する前記工程を含む、前記方法を意図する。
【００５４】
「有効量」は、治療されるべき疾患を予防、治療又は遅延させることができるペプチド濃度を達成するために十分な量を意味する。かかる濃度は当業者によってごく普通に決定され得る。実際に投与される化合物の量は通常、治療される環境、選択された投与経路、投与される実際の化合物、年齢、体重、個々の患者の応答、患者の症状の深刻度などを含む、関連性のある環境を考慮して、医師によって決定され得る。投与量が投与されるペプチドの安定性に依存し得ることはまた、当業者により理解され得る。
【００５５】
「それを必要とする個体」は、治療若しくは予防されるべき疾患を罹患している、又は罹患し易い個体を意味する。本発明の枠内において、治療されるべき個体は、好ましくはヒト個体である。しかし、ＫａｎＡＳ核酸の獣医学的使用が同様に、本発明において意図される。
【００５６】
本発明の医薬組成物
本発明のＫａｎＡＳ核酸は、薬剤（医薬）として有用である。したがって本発明の一態様は、物理学的に許容される担体中において、上記のＫａｎＡＳ核酸、及び／又はかかるＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクター、を含む医薬組成物を対象とする。かかる医薬組成物は好ましくは、ワクチン組成物に相当する。
【００５７】
用語「生理学的に許容される担体」は、活性成分の生物活性の有効性を妨害せず、且つ投与される宿主に対して毒性ではない、任意の担体を含むことを意味する。好適な生理学的に許容される担体は当業者に周知であり、例えば本技術分野における標準的参考文献である Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985)に記載されている。
【００５８】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばヒ素、三酸化ヒ素、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シスＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シスＲＡ又はＡＭ５８０、をさらに含む。かかる医薬組成物は、癌の治療のために特に有用である。好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、ＫａｎＡＳ核酸、及び／又は当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクターによって引き起こされる生物学的応答に対してアジュバント活性を有する。最も好ましくは、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、腫瘍抗原、例えば治療されるべき癌に特異的な腫瘍抗原を含む。
【００５９】
医薬組成物は、少なくとも１つの抗癌剤、例えば５−アザシチジン (Vidaza（商標）) 又はデシタビン（decitabine）をさらに含み得る。
【００６０】
本発明はさらに、以下の組み合わせに関する：
（ｉ）生理学的に許容される担体中、本発明のＫａｎＡＳ核酸、及び／又はかかるＫａｎＡＳ核酸を含むベクターを含む、第１の医薬組成物；及び
（ｉｉ）生理学的に許容される担体中、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばヒ素、三酸化ヒ素、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シスＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シスＲＡ又はＡＭ５８０を含む、第２の医薬組成物；及び、場合により、
（ｉｉｉ）抗癌剤、例えば５−アザシチジン (Vidaza（商標）) 又はデシタビン（decitabine）。
【００６１】
かかる組み合わせは、例えばキットに相当し得る。当該キットは、癌の治療における使用説明書をさらに含み得る。或いは、第１及び第２の組成物は別々に商品化され得る。
【００６２】
本発明の組み合わせの第１及び第２の医薬組成物は、連続的に（すなわち、共通の治療スケジュール期間内において異なる時に）投与されることが意図され得るか、又は同時に投与されることが意図され得る。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の組み合わせの第１の医薬組成物は、腫瘍抗原、例えば治療される癌に特異的な腫瘍抗原（例えば、ＰＭＬ−ＲＡＲα、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＣＢＦベータ−ＭＹＨ１１、Ｔｅｌ−ＰＤＧＦ、ＰＬＺＦ−ＲＡＲα、ＭＬＬ融合体、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１又はＢＣＲ−ＡＢＬ）をコードする配列を含む、ＫａｎＡＳ核酸を含む。最も好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、ＫａｎＡＳ核酸、及び／又は当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクターによって引き起こされる生物学的応答に対してアジュバント活性を有する。
【００６４】
本発明のＫａｎＡＳ核酸、及び／又は当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクターは、送達用のビヒクルを使用しない、裸の（naked）形態で投与され得る。この目的を達成するために、当該核酸は生理学的に許容される溶液、例えば無菌食塩水又は無菌緩衝食塩水中に、担体と共に、又は担体を用いずに希釈される。存在する場合には、担体は好ましくは等張性、低張性、又は弱い高張性であり、相対的に低いイオン強度、例えばショ糖溶液、例えば２０％ショ糖を含有する溶液によって提供されるイオン強度を有する。
【００６５】
或いは、本発明のＫａｎＡＳ核酸、及び／若しくは当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクター、又は本発明のワクチン組成物、組み合わせ、若しくはキットの核酸は、細胞への取り込みを支援する薬剤と共に投与され得る。かかる薬剤の例は、（ｉ）細胞透過性を改変する化学物質、例えばブピバカイン（bupivacaine）（例えば、国際公開第９４／１６７３７号参照）、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの被包のためのリポソーム若しくはウィルス粒子、又は（ｉｉｉ）それら自身をポリヌクレオチドと共に結合させる、カチオン性脂質又はシリカ、金若しくはタングステン微小粒子。
【００６６】
アニオン性及び中性リポソームは、当技術分野で周知であり（リポソームの製造方法の詳細な説明については、例えば、Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press, 1990を参照）、ポリヌクレオチドを含む、広範囲の製造物を送達するために有用である。
【００６７】
カチオン性脂質はまた、当業者に周知であり、遺伝子送達のために一般的に使用される。かかる脂質は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｍ、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、及びコレステロール誘導体、例えばＤＣ−Ｃｈｏｌ（３ ベータ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）を含む。これらのカチオン性脂質の記載は、ＥＰ１８７，７０２、国際公開第９０／１１０９２号、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、国際公開第９１／１５５０１号、国際公開第９５／２６３５６号及び米国特許第５，５２７，９２８号明細書において見ることができる。遺伝子送達のためのカチオン性脂質は、中性脂質、例えば国際公開第９０／１１０９２号に記載されているＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と共に好ましくは使用される。
【００６８】
カチオン性リポソームを含む製剤は、場合により他のトランスフェクション促進性化合物（transfection-facilitating compound）を含み得る。それらの多くは、国際公開第９３／１８７５９号、第９３／１９７６８号、第９４／２５６０８号及び第９５／０２３９７号に記載されている。それらは、核膜を通じたＤＮＡの輸送を容易にするために有用なスペルミン誘導体（例えば国際公開第９３／１８７５９号参照）、並びに膜透過性化合物、例えばＧＡＬＡ、グラミシジンＳ及びカチオン性胆汁酸塩（例えば国際公開第９３／１９７６８号参照）を含む。
【００６９】
金又はタングステン微小粒子は、国際公開第９１／００３５９号又は第９３／１７７０６号に記載されているような遺伝子送達のために使用され得る。微小粒子被覆されたポリヌクレオチドは、皮内経路を介して、又は表皮内経路を介して、無針注射器具（「遺伝子銃（gene gun）」）、例えば米国特許第４，９４５，０５０号明細書、第５，０１５，５８０号明細書及び国際公開第９４／２４２６３号に記載されたものを用いて注射される。或いは、裸のＤＮＡが直接的に注射、すなわち筋肉注射され得る。
【００７０】
医薬組成物において使用されるＤＮＡ量は、例えば、ＤＮＡコンストラクト中で使用されるプロモーターの強度、発現される腫瘍抗原の免疫原性、投与対象の哺乳動物の状態（例えば体重又は年齢）、投与様式、及び製剤の種類に依存する。一般的に、約１μｇ〜約８ｍｇの、好ましくは約１μｇ〜約１ｍｇの（Graham, B. S.et al.J.Infect.Dis.194, 1650-1660(15-12-2006)）、好ましくは約１０μｇ〜約８００μｇの、及びより好ましくは約２５μｇ〜約２５０μｇの、治療的に有効な投与量が、ヒト成人に投与され得る。当該投与は、単回投与で達成され得るか、又は間隔を空けて繰り返される。
【００７１】
投与経路は、ＤＮＡワクチン接種の分野において使用される任意の従来の経路である。一般的な指針として本発明の核酸は、非経口経路で、例えば皮内経路で、表皮内経路で、又は筋肉内経路で投与され得る。投与経路の選択は、選択される剤形に依存する。ブピバカイン（bupivacaine）と共に製剤化されるポリヌクレオチドは、筋肉へ有利に投与される。中性若しくはアニオン性リポソーム、又はカチオン性脂質、例えばＤＯＴＭＡ又はＤＣ−Ｃｈｏｌが使用されるとき、当該製剤は、筋肉内経路で又は皮内経路で有利に注射され得る。裸の形態のポリヌクレオチドは、筋肉内、皮内又は皮下経路で有利に投与され得る。さらに、エレクトロポレーションが、ＤＮＡの筋肉への送達を改善するためになされ得る（Mir et al. 1999, Proc Natl Acad Sci U S A. 96:4262-7）。
【００７２】
癌治療の枠内において、核酸療法は好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばヒ素の投与、低用量の化学療法、又は全トランスレチノイン酸、又は他のレチノイン酸化合物、例えば９−シスＲＡ、４ＨＰＲ、１３シスＲＡ、ＣＤ４３７、並びに他の分化及びアポトーシス誘導剤、抗体又はヒアルロン酸によるＣＤ４４の活性化、造血増殖及び分化因子と組み合わされ得る。患者はこの誘導剤を、本発明の核酸と同一のワクチン組成物中に存在する形で、又は別の組成物の形態で存在する形で投与される。後者の場合、投与経路は、当該核酸に対して使用される投与経路と同一であってもよく、又は当該投与経路と異なってもよい。例えば、皮内経路又は筋肉内経路で核酸組成物が送達される一方で、誘導剤は経口で投与される。
【００７３】
雑誌の記事又は要約、刊行された特許出願、公表された特許又は他の参考文献を含む、本明細書に引用された全ての参考文献は、当該引用された参考文献中に存在する全てのデータ、表、図及び文章を含めて、本明細書中に参照により完全に組み込まれる。
【００７４】
異なる意味を有するが、用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」及び「から成る（consisting of）」は、本明細書中において交換可能に使用され、互いに置き換えられ得る。
【００７５】
本発明は、以下の実施例及び図を考慮してさらに評価され得る。
【実施例】
【００７６】
実施例
実施例１：ＤＮＡコンストラクト
５つのＤＮＡコンストラクトが使用された：
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０１とも呼ばれる）。国際公開第０３／０９０７７８号の１８ページ１２行目〜１９ページ２行目、実施例１ｂに記載されている。
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０４とも呼ばれる）。国際公開第０３／０９０７７８号の１９ページ、４〜１５行目、実施例１ｂに記載されている。
− ｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクト（ｐＶａｘ１４又はＶＶＡＣＳ０２とも呼ばれる）。配列番号１の配列から成る核酸の、ｐＶａｘ１ベクターへのクローニングにより産生された。
− ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクト（ｐＶａｘ１５又はＶＶＡＣＳ０３とも呼ばれる）。ＰＭＬ−ＲＡＲα腫瘍抗原をコードする配列の、ｐＶａｘ１４へのクローニングにより産生された。
− ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト、ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣの、ｐＶａｘ１ベクターへのクローニングにより産生された。
【００７７】
ｐＶａｘ１４（ｐＶａｘＫａｎＡＳ又はＶＶＡＣＳ０２）を、以下のプラマー対を用いた、ｐＶａｘ１のＰＣＲ増幅によって構築した：配列番号１０及び１１のプライマー対、並びに配列番号１２及び１３のプライマー対。ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩをクローニングサイトとして用いた。
【００７８】
ｐＶａｘ１５（ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ又はＶＶＡＣＳ０３）を、配列番号１４及び１５のプライマーを用いて、ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲＦｒＣ由来のリーダーＰＭＬ−ＲＡＲ１０５ｂｐ配列を増幅することによって構築した。増幅された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩクローニングサイトを用いて、ｐＶａｘ１４へとクローニングした。
【００７９】
ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０１）及びｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ（ＶＶＡＣＳ０３）を、ＣＯＳ細胞へと一時的にトランスフェクトした。ＲＱ−ＰＣＲ実験は、ＰＭＬ−ＲＡＲαが両方のコンストラクトを用いて発現されることを実証した。
【００８０】
実施例２：ＫａｎＡＳは、ＡＰＬマウスモデルの寿命を延長する。
Padua 他 (2003, Nature Medicine 9:1413-1417)に開示されたプロトコルを用いて、ＡＰＬマウスモデルにおける異なるＤＮＡコンストラクトの効果を試験した。簡潔に述べると、１０4個のＡＰＬ細胞を、ＦＶＢ／Ｎマウスへと注射した。その後、５ｍｇ／日のＡＴＲＡを２１日間放出するＡＴＲＡペレットを、トロカールを用いてマウスの頸部後方に導入した。ＤＮＡ（２×５０マイクログラムのプラスミド）を、ＡＴＲＡペレットを導入した日後に、及び２０日毎に、合計３回注射した。以下のＤＮＡコンストラクトをマウスに注射した：
− ｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクト、ｐＶａｘ１４とも呼ばれる：
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０１）；
− ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト；及び
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０４）。
【００８１】
ＡＴＲＡペレットの製造業者（Innovative Research, Sarasota, USA）から購入されたペレットを、プラセボとして使用した。
【００８２】
マウスを２年間監視下に置き、Kaplan-Meier曲線を作図した。
【００８３】
結果を、図２及び以下の表１に示す。ｌｏｇ−ランク(Mantel-Cox)及びWilcoxon 検定をKaplan-Meier 曲線に適用した。いずれも統計的検定も、有意性の観点で同一の結果を導いた。
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
したがって、ＡＴＲＡと組み合わせて投与されるｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクトは、ＡＰＬマウスモデルにおいて保護効果を有する。約４０％のマウスは死亡を免れた。この保護効果は、ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクトの保護効果と同程度である。他方で、ｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクトの保護効果は、ＡＴＲＡ担体のものとは有意に異なる（ｐ＝<０．０５、ＡＴＲＡ対ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＫａｎＡＳについて）。
【００８８】
ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクト（ｐＶａｘ１５とも呼ばれる）の効果を試験するために、別の実験を行った。本実験において使用されるＡＰＬ細胞がより高代継代且つより悪性であり、マウスが９カ月間監視下に置かれた以外は、プロトコルは上記と同一であった。
【００８９】
結果を図３、及び以下の表２に示す。
【００９０】
【表５】
【００９１】
ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクトも同様に、ＡＴＲＡ単体と比較して保護効果を有する（ｐ＝０．０００９）。ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクトは、ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクトと少なくとも同程度に効果的である。
【００９２】
実施例３：ＫａｎＡＳ及びＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣは、ＭＤＳマウスモデルの寿命を延長する。
Omidvar 他 (2007, Cancer Res. 67:11657-67)に記載されたＭＤＳマウスモデルを、ＭＤＳにおけるＫａｎＡＳの効果を調べるために使用した。このマウスモデルは、ＢＣＬ−２を有する変異体ＮＲＡＳを生じるマウスの使用に基づく。それらは、血小板減少症及び切迫した死を示唆する血小板数に減少するまで監視下に置かれた。
【００９３】
ワクチン接種プロトコルは以下の通りである：２×５０マイクログラムのＤＮＡを診断後の日に投与した（０日目）。当該日付は、末梢血血小板数が正常値未満（＜１０5／マイクロリットル）に減少した日に相当した。２０日目及び４０日目に、２×５０マイクログラムのＤＮＡを再度注射した。ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ＶＶＡＣＳ０２）で処置された６匹のマウスを用いて第一の実験を行った。図４に示される通り、ＫａｎＡＳ単体は、未処置群と比較してマウスの寿命を延長した（ｐ＝０．００３）。
【００９４】
ｐＶａｘＫａｎＡＳで処置された１０匹のマウス、及びｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４）で処置された１６匹のマウスを用いて、第二の実験を行った。結果が図５に示される本実験によって、先の実験の枠組み内で得られる結果を確認した。
【００９５】
ＡＴＲＡ、及びｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲＡＳＦｒＣ又はＶＶＡＣＳ０４の併用投与の効果を試験するために、第三の実験を行った（図６）。マウスの４つの群に分けた：
− ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣで処置されたマウス；
− ＡＴＲＡで処置されたマウス；
− ＡＴＲＡ及びｐｃＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣで処置されたマウス；及び
− 未処置マウス。
【００９６】
血小板数が１０5／マイクロリットル未満に減少して疾患が発症までマウスを監視下に置いた。１０ｍｇのＡＴＲＡを２１日間放出するペレット(Innovative Research, Sarasota, USA)を用いて当該マウスを処置した。次の日に、２×５０マイクログラムのＤＮＡでマウスを処置し、その後２０日の間隔を空けて２回処置し、合計で１匹のマウスあたり３００マイクログラム与えた。
【００９７】
結果的に、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトは、単体で用いられる場合、及び非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わされる場合のいずれにおいても、ＤＮＡワクチン接種において非常に有効であった。かかるＫａｎＡＳコンストラクトは、例えばＡＰＬ及びＭＤＳの患者を疾患再発又は疾患増悪から保護するために、ＤＮＡワクチンとして使用され得る。
【００９８】
実施例４：ＭＤＳマウスモデルにおける疾患の再発
ＢＣＬ−２を有する変異体ＮＲＡＳを生じるトランスジェニックマウスは治癒されず、必然的に再発及び死亡するだろう。したがって、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトの投与で誘導される免疫がどの程度続くかを決定するために、実験を行った。この目的のために、ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｐＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）で処置されたＭＤＳマウスのＣＤ４+、ＣＤ４４hi、ＣＤ６２Ｌloプロファイル（図７）及びＭａｃ−２hi／Ｇｒ１loプロファイル（図８）を分析した。疾患の再発は、Ｍａｃ１hi／Ｇｒ１lo群の増加によって追跡された。それは白血病幹細胞の減少のマーカーである。
【００９９】
血球数を測定することによって、マウスの疾患増悪を追跡した。血小板が１０5／マイクロリットルに減少したとき、マウスを試験に採用し、２×５０マイクログラムのｐＶａｘ１４（ｐＶａｘＫａｎＡＳ）ＤＮＡをワクチン接種した。２０日間の間隔をあけて、ＤＮＡの注射を繰り返した。その後、最後の注射を４０日目に行った。
【０１００】
３回目の注射の後、マウスの疾患増悪を追跡した。より具体的には、Ｍａｃ１／Ｇｒ１の状況をフローサイトメトリーによって（図８）、並びにＣＤ４４hi及びＣＤ６２Ｌloによって特徴付けられるメモリーＴ細胞の存在によって（図７）試験した。疾患の再発は約１５０日目に生じた。
【０１０１】
ｐＶａｘＫａｎＡＳ単体で処理されたＭＤＳマウスは、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスと比較して、メモリーＴ細胞が３倍増加することが明らかとなった。さらに、白血病幹細胞（leukaemic initiating cell）群は、ｐＶａｘＫａｎＡＳを用いた処理で減少した（未処置マウスで約２５％、対して処置マウスで約１０％）。これらの結果は、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトが、癌患者の治療のために効果的であることを裏付けた。
【０１０２】
実施例５：ＡＭＬマウスモデルにおける、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトの効果
ＫａｎＡＳ核酸を含む、又は含まない異なるコンストラクトの効果を、ＡＭＬマウスモデルにおいて評価した。
【０１０３】
当該コンストラクトを図１０に示す。ＶＶＡＣＳ０２及びＶＶＡＣＳ０４と呼ばれるコンストラクトは、本発明のＫａｎＡＳ核酸を「Ｆｌｉｐｐｅｒ」領域に含む。より具体的には、ＶＶＡＣＳ０２は上記のｐＶａｘ１４と呼ばれるベクターである。このベクターの配列を配列番号１７で示す。
【０１０４】
図２及び１１は、ＡＴＲＡと、ＫＡｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトとの組み合わせが、マウスの寿命を延長することを示す。
【０１０５】
ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）ＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種が、特異的なＴ細胞応答を引き起こすか否かを決定するために、Elispotアッセイ（Furugaki et al., Blood. 2010; 115:653-6）が使用された。当該結果を図１２に示す。
【０１０６】
図１３に示される通り、ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）を用いたＤＮＡワクチン接種は、病勢安定（stable disease）をもたらした。
【０１０７】
ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）を用いたＤＮＡワクチン接種が、病勢安定をもたらしたという事実は、Fan 他 (Nat Med. 2009;15:566-71)によって記載された通り、Firefly（商標）装置（Cell Biosciences）を用いてＥＲＫを定量化することによってさらに研究された。当該結果を以下の表３及び４に示す。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）の作用機序が特徴付けされた。
【０１１０】
第一に、ＦＶＮコントロールマウスにおけるメモリーＴ細胞及び４匹のＭＤＳ−ＡＭＬマウスにおけるメモリーＴ細胞を、ＶＶＡＣＳ０２及びＡＴＲＡを用いた処置の後の異なる日に評価した。メモリーＴ細胞群−ＣＤ４＋、ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ６２Ｌｌｏの増加が２回目のＤＮＡワクチン接種後に観察された（データ示さず）。さらに、メモリーＴ細胞は、最後ＤＮＡ注射後、約４〜５か月間高レベルを維持した。（データ示さず）。
【０１１１】
第二に、ＭｙＤ８８（ＴＬＲ下流の遺伝子）の発現を、（ｉ）コントロールのＦＶＢＮマウス、（ｉｉ）ＶＶＡＣＳ０２及びＡＴＲＡで、１１３日目又は１４２日目に処置した２匹のＭＤＳ−ＡＭＬマウス、及び（ｉｉｉ）別の薬剤で処置した１匹のＭＤＳ−ＡＭＬマウス、で評価した。１１３日目にＶＶＡＣＳ０２で処置したマウスにおいて、ＭｙＤ８８の発現増大及びＴＬＲの活性化が観察された（データ示さず）。さらに、最後のＤＮＡ注射後約３．５か月で基礎発現が見られた。この効果は他のマウスにおいて観察されなかった。この結果は、Ｔｏｌｌ様受容体が、ＶＶＡＣＳ０２の有益な効果の一因となることを示唆している。
【０１１２】
要約すると、実施例５に示した実験データは、ＶＶＡＣＳ０２がＭＤＳモデルにおいて病勢安定をもたらすことを実証する。それはまた、好適な免疫応答を生じさせる。ＤＮＡアジュバントを用いない治療、例えばＡＴＲＡ単体での治療とは対照的に、その発現が上方制御される、下流分子のＭＹＤ８８を測定することによって示された通り、ＶＶＡＣＳ０２が作用する機構が、Ｔｏｌｌ様受容体が関与するＤＮＡアジュバントとしてであることをこれらの結果は示唆する。
【０１１３】
実施例６：ＭＤＳマウスモデルにおける、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクト、ＡＴＲＡ及び５−アザシチジンの組み合わせの効果
【０１１４】
ＫａｎＡＳ、ＡＴＲＡ及び５−アザシチジンの組み合わせのＭＤＳに対する効果を試験するために、Omidvar 他 (2007, Cancer Res. 67:11657-67)に記載されたＭＤＳマウスモデルが使用された。
【０１１５】
１ｍｇ／ｍｌの５−アザシチジン溶液を１００マイクロリットル、診断日に、そしてその後マウスが死亡するまで、月曜日、水曜日及び金曜日に、ＩＰでマウスに注射した。
【０１１６】
ＡＴＲＡを１０ｍｇ、２１日間放出ペレットで投与した。
【０１１７】
ワクチン接種プロトコルは以下の通りであった：１００マイクログラムのＤＮＡ（ＶＶＡＣＳ０２又はｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）を、診断日後に投与した（０日目）。その日は、末梢血の血小板数が正常未満に減少した日であった（＜１０5／マイクロリットル）。２０日目及び４０日目に、２×５０マイクログラムのＤＮＡを再度注射した。
【０１１８】
１２回の５−アザシチジン注射の後に、マウスを４つの群にランダムに分けた：
− ５−アザシチジン（ｎ＝５）
− ５−アザシチジン＋ＡＴＲＡ（ｎ＝４）
− ５−アザシチジン＋ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡ（ｎ＝４）
− 5-アザシチジン＋ＡＴＲＡ＋ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡ（ｎ＝４）
【０１１９】
結果を以下の表５に示す。
【０１２０】
【表７】
【０１２１】
ＫａｎＡＳ、ＡＴＲＡ及び５−アザシチジンの組み合わせはしたがって、ＭＤＳマウスモデルの寿命を延長した。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列表の説明
配列番号１は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的な配列を含む、ＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２３】
配列番号２は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的な配列を含み、及びｐＶａｘプラスミドの断片と相補的な配列をさらに含む、ＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２４】
配列番号３は、ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原をコードする配列、及びカナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的な配列を含む、ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２５】
配列番号４は、ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原をコードする配列、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的な配列、及びｐＶａｘプラスミドの断片と相補的な配列を含む、ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２６】
配列番号５は、ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原をコードする配列を示す。
配列番号６は、ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳの配列を示す。
配列番号７は、ｐＶａｘ１４プラスミドの断片を示す。
配列番号８は、ｐＶａｘ１５プラスミドの断片を示す。
配列番号９は、空のｐＶａｘ１ベクターの配列を示す。
【０１２７】
配列番号１０〜１３は、ｐＶａｘ１４プラスミドを構築するために使用されるプライマーを示す。
配列番号１４及び１５は、ｐＶａｘ１５プラスミドを構築するために使用されるプライマーを示す。
【０１２８】
配列番号１６は、ＦｒＣ配列を示す。
配列番号１７は、ｐＶａｘ１４プラスミドの完全配列を示す。ｆｌｉｐｐｅｒ領域は、配列番号２のＫａｎＡＳ配列を含む。
配列番号１８〜２３は、免疫原性ポリペプチドの配列を示す。
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列を含む核酸に関する。この核酸は、ＤＮＡワクチンアジュバントとして有用であり、例えば癌の治療のために、例えば非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤（non-immunosuppressive inducer of tumor cell apoptosis）、例えば全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）と組み合わせて使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
癌は、米国における死亡原因が２番目に高く、心疾患の次である。これらの癌死亡の約１０％が血液癌、例えば白血病、リンパ腫及び骨髄腫によって引き起こされる。欧州及び米国のみで、１９０万人の人々が血液癌を罹患していると推定される。これらの血液癌の幾つかは奇病であり、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ、ＡＭＬタイプＭ３）は、前骨髄球性白血病遺伝子（ＰＭＬ）をレチノイン酸受容体アルファ遺伝子（ＲＡＲα）と融合させる相互転座ｔ（１５；１７）によって、及び前骨髄球性段階における骨髄分化の停止によって特徴づけられる。全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）媒介性分化療法は現在、ＡＰＬ患者における標準的治療法の基本である。しかし、ＡＴＲＡと化学療法を組み合わせた現行の治療で獲得される寿命の延長にもかかわらず、現行の維持療法の順守をしないために、約１０人の患者はなお再発する。したがって、残存疾患を根絶するための新規治療方針及び生活の質の改善が求められている。
【０００３】
現在までに、多くの腫瘍関連性抗原が同定されており、これらの腫瘍抗原に対する免疫応答を引き起こさせるためのワクチン接種戦略が開発された。天然及び組み換え癌タンパク質抗原は、規定の免疫原性抗原を標準レベルで含み、そしてそれらの有効性は、適切なアジュバント及び送達系の発見に依存する。ＤＮＡ送達、例えば生存宿主に対する遺伝子発現カセットの直接的注入は、ワクチン及び免疫療法に対する新規アプローチである。送達された遺伝子の発現は、発現された抗原に対する宿主免疫防御の特異的免疫活性をもたらし得る。
【０００４】
ワクチン戦略の有効性は、体液性及び細胞毒性の両方であり得る免疫応答の獲得に依存する。ＤＮＡワクチンは、これらの要求を満たし、プラスミドによってコードされた抗原に対する強力且つ持続的細胞媒介性免疫応答（ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞及びＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の産生）及び体液性免疫応答をもたらすことが示されている。癌へのこの種のワクチン接種の適用は、Ｂ−非ホジキンリンパ腫（B-Non Hodgkin’s Lymphoma）（Ｂ−ＮＨＬ）に対して、それに対する抗腫瘍応答を引き起こす抗原として表面免疫グロブリンのイディオタイプを用いて、最初に使用された（Stevenson et al., 1995, Immunological Reviews 145:211-28; Syrengelas et al., 1996, Nature Medicine 2:1038-41, Rice et al., 2008, Nature Reviews 8:108-20）。当該防御免疫は、リンパ腫及び骨髄腫の他のマウスモデルにおいても観察された。
【０００５】
しかし、細胞免疫系の全身性の機能障害が数人の癌患者において報告されている。このため、これらの患者、特にＡＰＬ患者の悪い免疫状態は、ワクチン戦略単独の治療への免疫療法的アプローチに対する主要な障害とみなされる。Padua 他(2003, Nature Medicine 9:1413-1417)は、ＡＰＬ動物モデル（Brown et al. 1997, Proc Natl Acad Sci U S A. 94:2551-6）を利用して、ＰＭＬ−ＲＡＲα腫瘍抗原が破傷風毒素断片（ＦｒＣ）配列と連結された核酸を含むＤＮＡワクチンのインビボにおける有効性を試験した。それらの結果は、ＡＴＲＡがＰＭＬ−ＲＡＲα−ＦｒＣ ＤＮＡワクチン接種においてアジュバントとして作用して、ＡＰＬマウスの生存を延長させることを実証した。これは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞、ＲＡＲα抗体及びＩＦＮγ産生の増大を伴い、関連性免疫応答の誘導を実証した。
【０００６】
国際公開第０３／０９０７７８号は、（ｉ）非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばＡＴＲＡ、及び（ｉｉ）免疫原性ポリペプチド、例えばＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ、ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳ−ＦｒＣ又はＳｃＦｖＢＣＬ１−ＦｒＣをコードする配列を含む核酸、を含むワクチン組成物が、ＡＰＬマウスを再発及び死亡から救済することをさらに教示している。
【０００７】
したがって、ＤＮＡワクチン接種とＡＴＲＡ投与とを組み合わせる治療法は、白血病の有望な治療法を構成する（Padua and Chomienne, 2004, Discovery Medicine 4:41-44）。癌患者において免疫応答を増大させるために有用である、ＤＮＡアジュバント開発への必要性が当技術分野において存在する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の説明
驚くべきことに、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的である配列番号１のＫａｎＡＳ配列が、ＤＮＡワクチン接種における非常に有効なアジュバントであることが明らかとなった。
【０００９】
より具体的には、本発明者は、配列番号１のＫａｎＡＳ配列を、単独で又はＰＭＬ−ＲＡＲα腫瘍抗原と融合されて含むプラスミドが、ＡＴＲＡと組み合わせて投与されたときに、ＡＰＬマウスの生存を延長させることを示した。さらに、ＭＤＳマウスにおいて、ＫａｎＡＳは単独で寿命を延長させた。免疫応答はフローサイトメトリーによって測定され、ＫａｎＡＳ単独で処置されたＭＤＳマウスが、同定された野生型ＦＶＢ／Ｎマウスと比較して、３倍増加したメモリーＴ細胞を有することが判明した。さらに、白血病幹細胞群は、ＫａｎＡＳを用いた処置で減少した（未処置マウスにおいて約２５％、処置マウスにおいて約１０％）。最終的に、ＤＮＡがリガンドの１つである受容体である、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流経路に存在する、ＭｙＤ８８転写産物の一時的上方制御が観察された。
【００１０】
免疫応答を発揮する任意の抗原が、ＫａｎＡＳの上流又は下流でクローニングされ得る。ＫａｎＡＳを含む核酸を用いたＤＮＡワクチン接種はしたがって、全ての癌に適用可能であり、感染症を含む、免疫応答を必要とする多くの他の疾患に対して適用可能である。本発明のＤＮＡワクチン接種戦略は、癌遺伝子が生殖細胞系に存在し、遺伝する癌、例えば乳癌及び結腸癌に対して遺伝的素因を有する個人に対しても適用可能である。
【００１１】
さらに自家ワクチンとは異なり、本発明のＤＮＡワクチンは、既定の癌状態に特異的なワクチンではない。それらは、自己抗原に対する自己免疫を含む危険が全く存在しない。さらに、これらのワクチンは、容易にスケールアップ可能な標準的細菌発酵処理によって製造され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明のＫａｎＡＳ核酸を含む、ｐＶａｘ１４及びｐＶａｘ１５プラスミドを示す。ｐＶａｘ１４は配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含み、ｐＶａｘ１５は配列番号３のＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸を含む。
【図２】図２は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸が、ＡＰＬ（急性前骨髄球性白血病）マウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。プラスミド地図に関する図１０を参照。列１：ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｎ＝１２）（ＰＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）；列２：ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ｎ＝４８）（ＶＶＡＣＳ０１）；列３：ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ｎ＝１２）（ＶＶＡＣＳ０４）；列４：ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ｎ＝１２）（ＶＶＡＣＳ０１）．列５：ＡＴＲＡ（ｎ＝３２）；列６：プラセボ＋ＤＮＡ（ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ）（ｎ＝１１）（ＶＶＡＣＳ０１）；列７：プラセボ（ｎ＝１０）。
【図３】図３は、配列番号３のＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１５核酸が、ＡＰＬマウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。列１：ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ｎ＝２１）（ＶＶＡＣＳ０１）；列２：ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ（ｎ＝１０）（ｐＶａｘ１５，ＶＶＡＣＳ０３）；列３：ＡＴＲＡ（ｎ＝９）。
【図４】図４は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４（ＶＶＡＣＳ０２）核酸が、ＭＤＳ（骨髄異形成症候群）マウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。列１：ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｐＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）（ｎ＝６）；列２：未処置（ｎ＝２５）。Ｐ＝０．０００２。
【図５】図５は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸が、ＭＤＳマウスモデルにおいて寿命を延長させることを示す。ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｎ＝１０）（ｐＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）；ＰＭＬ−ＲＡＲａＡＳ−ＦｒＣ（ｎ＝１６）（ＶＶＡＣＳ０４）；未処置：ｎ＝２５。Ｐ値：未処置ｖｓ．ＰＭＬ−ＲＡＲａＡＳ−ＦｒＣ＜０．０００１；未処置ｖｓ．ｐＶａｘＫａｎＡＳ＝０．０００２；ＰＭＬ−ＲＡＲａＡＳ−ＦｒＣ ｖｓ．ｐＶａｘＫａｎＡＳ＝０．３６４８。
【図６】図６は、ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣが、ＭＤＳマウスモデルの寿命を延長させることを示す。ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ｎ＝１６）（ＶＶＡＣＳ０４）；未処置：ｎ＝２６；ＡＴＲＡ：０＝１１；ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ｎ＝９）（ＶＶＡＣＳ０４）。Ｌｏｇ−ランクＰ値：ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４），ＡＴＲＡ又はＡＴＲＡ＋ＤＮＡｖｓ未処置＝＜０．０００１；ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４） ｖｓ．ＡＴＲＡ＝０．９９９４；ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４） ｖｓ．ＡＴＲＡ＋ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４）＝０．１９５７；ＡＴＲＡ ｖｓ．ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣ＋ＡＴＲＡ＝０．３８３４。
【図７】図７は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸を用いたマウスのワクチン接種が、ＣＤ４+、ＣＤ４４hi、ＣＤ６２ＬloメモリーＴ細胞群の増大をもたらすことを示す。Ｄ１５、Ｄ３３及びＤ１８３は、ＭＤＳの診断からの日数を示す。
【図８】図８は、配列番号１のＫａｎＡＳ核酸を含むｐＶａｘ１４核酸を用いたマウスのワクチン接種が、安定なレベルでのＭａｃ−２hi／Ｇｒ１lo白血病始原細胞群の維持を可能とすることを示す。Ｄ１５、Ｄ３３及びＤ１８３は、ＭＤＳの診断からの日数を示す。
【図９】図９は、ＤＮＡワクチン接種が、ＤＮＡがリガンドであるＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）の下流のシグナル経路に存在する、ＭｙＤ８８を上方制御することを示す。したがって、ＤＮＡワクチン接種時に見られるＭｙＤ８８の発現増大は、ＴＬＲの一時的活性化が存在することを示す。
【図１０】図１０は、ＶＶＡＣＳプラスミド地図を示す。
【図１１】図１１は、ＡＭＬマウスモデルにおける、異なるＶＶＡＣＳ産物（ＶＶＡＣＳ０１ ＆ ＶＶＡＣＳ０２ ＆ ＶＶＡＣＳ０３）プラスＡＴＲＡの効果を示す。
【図１２】図１２は、ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種が、特異的なＴ細胞応答をもたらすことを示す。Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイは、ＩＦＮｇの増大を示す。
【図１３】図１３は、ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種が、病勢安定（stable disease）を維持することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のＫａｎＡＳ核酸
本発明は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的な配列を含む、又はから成る、単離及び／又は精製された核酸に関する。本発明のかかる核酸は、「ＫａｎＡＳ核酸」と呼ばれる。前記カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片は、任意の長さであり得、例えば少なくとも、最大、又は約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７３又は５００個の連続的ヌクレオチドであり得る。
【００１４】
本発明において、「核酸」は、リボヌクレオシドのリン酸エステルポリマー形態（「ＲＮＡ分子」）又はデオキシリボヌクレオシドのリン酸エステルポリマー形態（「ＤＮＡ分子」）又はそれらの任意のリン酸エステル類縁体、例えばホスホロチオエート及びチオエステルのことであって、それらは一本鎖形態又は二本鎖らせんのいずれかであり得る。用語「核酸」は、二本鎖ＤＮＡ、特に直鎖（例えば制限断片）又は環状ＤＮＡ分子を含む。核酸は好ましくはＤＮＡ分子に相当する。
【００１５】
本明細書において使用される「単離及び／又は精製された」は、ヒト又は動物の身体から単離及び／又は精製された化合物、並びに／或いは化合物のライブラリーから単離及び／又は精製された化合物のことである。
【００１６】
本明細書において使用される用語「カナマイシン耐性タンパク質」は、カナマイシンに対する耐性を付与することができる酵素のことである。かかる酵素は、以下の酵素反応を触媒する：
【００１７】
ＡＴＰ ＋ カナマイシン → ＡＤＰ ＋ カナマイシン３’−リン酸
【００１８】
カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列は、任意の微生物由来であり得、例えば、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトミセス・フラジエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）、サルモネラ・ティフィムリム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ストレプトミセス・リボシディフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｂｏｓｉｄｉｆｉｃｕｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）又はラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）由来であり得る。好ましくは、カナマイシン耐性タンパク質をコードする前記配列は、配列番号９の１２２６〜２０２０位のヌクレオチドから成る配列を有する。
【００１９】
本発明のＫａｎＡＳ核酸は、ｐＶａｘ１ベクター（カタログ番号V260-20, Invitrogen, Carlsbad, California, USA）断片に相補的な配列をさらに含み得る。ｐＶａｘ１ベクターの配列は、配列番号９として示される。
【００２０】
したがって本発明のＫａｎＡＳ核酸は、例えば、配列番号９の断片に相補的である配列であって、配列番号９の前記断片は、配列番号９の１２２６〜２０２０位に位置するヌクレオチドの内、少なくとも、最大又は約５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、４７３又は５００個の連続的ヌクレオチドを含む。配列番号９の断片は、例えば、配列番号９の１２２６〜２０２０位に位置するヌクレオチドの内、５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００又は４５０〜５００個の連続的ヌクレオチドを含み得る。ＫａｎＡＳ核酸はまた、かかる配列の誘導体に相当し得る。
【００２１】
好ましい実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸は：
− 配列番号１又は２と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一である配列；
− 配列番号１又は２の、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００又は４５０個の連続的ヌクレオチドの断片；又は
− 配列番号１又は２の誘導体
を含むか、又はから成る。
【００２２】
これらのＫａｎＡＳ核酸は、好ましくは生物活性を示す。本明細書において使用される用語ＫａｎＡＳ核酸の「生物活性」は、哺乳動物、例えばマウス、ラット又はヒトにおいて免疫応答を引き起こす能力のことである。かかる生物活性を測定する方法は、当業者に周知である。例えば、Padua 他 （2003, Nature Medicine 9:1413-1417）において開示された方法が使用され得る。１つの好ましい実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸の生物活性は、ＡＴＲＡと組み合わせて投与されたとき、ＡＰＬ又はＭＤＳのマウスモデル（以降、「ＡＰＬマウス」又は「ＭＤＳマウス」と呼ぶ）において生存を延長する能力を評価することによって測定される（本発明の実施例２及び３を参照）。
【００２３】
本発明の問い合わせ配列と、例えば少なくとも９５％「同一」である配列を有する核酸によって、当該配列が、当該問い合わせ配列の各１００ヌクレオチドごとに最大５個のヌクレオチドの変更を含み得ることが意図される。他言すれば、問い合わせ配列と少なくとも９５％同一である配列を有する核酸を得るために、最大５％（１００個中５個）の配列中のヌクレオチドが、挿入されるか、欠失されるか又は別のヌクレオチドで置換され得る。
【００２４】
用語「誘導体」は、断片（fragment）、類縁体（homologue）、変異体（mutant）及び天然発生のバリアント（variant）、例えば対立遺伝子バリアント、スプライスバリアント、又はタンパク質プロセシングを通じて得られたバリアントを含む。参照配列と「少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一」であるアミノ酸配列から成る誘導体は、当該参照配列と比較して、変異、例えば欠失、挿入及び／又は置換を含み得る。置換の場合、参照配列と少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む誘導体は、参照配列よりも別の種由来の相同配列に相当し得る。当該置換は、以下の表に示された通りの保存的置換に相当し得る。
【００２５】
【表１】
【００２６】
１つの具体的な実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸は、少なくとも１つのペプチド又はポリペプチドをコードするアンチセンス配列を含むか、又はから成り、ここで前記アンチセンス配列はカナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的である。
【００２７】
ＫａｎＡＳ核酸は、少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする配列をさらに含み得る。少なくとも１つの免疫原性ポリペプチドをコードする前記配列は例えば、国際公開第０３／０９０７７８号に記載の免疫原性ポリペプチドをコードする核酸配列に相当する。
【００２８】
１つの実施形態において、当該免疫原性ポリペプチドは腫瘍抗原に相当する。したがってこの実施形態にしたがって、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列、及び腫瘍抗原をコードする配列を含む。これらの２つの配列は、フレーム中で融合され得、すなわち、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列によってコードされるペプチド又はポリペプチドと、腫瘍抗原との間の融合タンパク質の発現をもたらす。当該腫瘍抗原は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に対して相補的な配列によってコードされるペプチド又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端と融合され得る。
【００２９】
有利に使用され得る腫瘍抗原の中で、ヒトＰＭＬ（前骨髄球性白血病遺伝子）−ＲＡＲα（レチノイン酸受容体アルファ遺伝子）、急性骨髄性白血病１／８−２１（ＡＭＬ１／ＥＴＯ）、コア結合因子ベータ／筋ミオシン重鎖（ＣＢＦベータ／ＭＹＨ１１）、ｅｔｓ−様遺伝子／血小板由来増殖因子受容体ベータ（Ｔｅｌ−ＰＤＧＦ）、前骨髄球性白血病ジンクフィンガー／レチノイン酸受容体アルファ（ＰＬＺＦ−ＲＡＲ）、４０個の潜在的パートナーが存在する骨髄／リンパ（ＭＬＬ）融合体（fusion）、ｅｔｓ−様遺伝子／急性骨髄性白血病１（ＡＭＬ−１−ＥＴＯ）、切断点クラスター領域／アベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）（ＢＣＲ−ＡＢＬ）、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ、ＭＬＬ−ＡＦ４、及び変異によって活性化される癌遺伝子、例えばＲＡＳ遺伝子、が引用され得る。
【００３０】
本発明の具体的実施形態において、腫瘍抗原はＰＭＬ−ＲＡＲαである。用語「ＰＭＬ−ＲＡＲα」は、The 他 (1990, Nature 347:558-61)に記載されている、ｔ（１５；１７）染色体転座から生じる融合タンパク質を意味する。ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原は例えば、配列番号５の配列又はその誘導体を含み得る、又はから成り得る。
【００３１】
好ましい実施形態において、ＫａｎＡＳ核酸は、以下：
− 配列番号３又は４のＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳと、少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％同一である配列；
− 配列番号３又は４の内、少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００若しくは５５０個の連続的ヌクレオチドの断片；又は、
− 配列番号３又は４の誘導体
を含む、又はから成る。
【００３２】
これらのＫａｎＡＳ核酸は好ましくは生物活性を示す。
【００３３】
或いは、免疫原性ポリペプチドをコードする配列は、癌状態に対して「非特異的」である。本実施形態の枠組み内において、当該配列が腫瘍抗原を含まないとしても、任意の免疫応答増強剤が好適であり得る。
【００３４】
癌状態に対して「非特異的」である免疫原性ポリペプチドは、例えば、国際公開第０３／０９０７７８号に開示されており、ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳ又はＳｃＦｖＢＣＬ１を含む。「非特異的」免疫原性ポリペプチドは例えば、配列番号６（ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳ）の配列若しくはその誘導体を含む又はから成る配列によってコードされ得る。前記「非特異的」免疫原性ポリペプチドをコードする配列はまた、破傷風毒素断片Ｃ（ＦｒＣ）（配列番号１６）、コレラ毒素（ＣＴ）配列、Ｅ．コリ易熱性毒素（ＬＴ）配列、百日咳毒素（ＰＴ）配列、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）毒素Ａ配列、及びそれらの免疫原性断片から成る群から選択され得る。
【００３５】
免疫原性ポリペプチドは、好適なソフトウェアを用いて当業者によって容易に同定され得る。例えば、（疎水性プロットを分析することにより）ポリペプチドの疎水性を特徴付けすることによって、それらが免疫原性であるか否かを予測可能である。ポリペプチドの疎水性の特徴付けのためのソフトウェアは、例えば、Kyte-Doolittle 又はHopp-Woods アルゴリズムの使用に基づくものを含む。Kyte-Doolittleアルゴリズムは、タンパク質の疎水性を表現するために広く適用される基準である。０超の値を有する領域は、性質上疎水性である。Hopp-Woods アルゴリズムは、ポリペプチドの潜在的な抗原性領域を予測するために考案された。０超の値は親水性であり、したがって折り畳まれたタンパク質表面において曝露される傾向にある。
【００３６】
具体的な実施形態において、免疫原性ポリペプチドは、配列番号１８〜２３のいずれか１つから成る群から選択される。これらの免疫原性ポリペプチドは、ポリペプチドの疎水性の特徴付けをするための上記ソフトウェアを用いて同定された。
【００３７】
本発明は、ＫａｎＡＳ核酸を含むベクターにさらに関する。ここで当該ベクター上において、当該ＫａｎＡＳ核酸は、当該ＫａｎＡＳ核酸の転写を可能とするシグナル（例えばプロモーター、ターミネーター及び／又はエンハンサー）の制御下に配置されている。当該ベクターは好ましくは、ＤＮＡワクチン接種ベクターに、すなわちＤＮＡワクチンの開発のために特に設計されたベクターに相当する。当該ＤＮＡワクチン接種ベクターは、例えばｐＶａｘ１ (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 又はｐＣＤＮＡ3 (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) 発現ベクターに相当し得るか、又はそれらに由来し得る。当該ベクターは、抗生物質、例えばアンピシリン又はカナマイシンに対する耐性を付与する耐性遺伝子をさらに含み得る。或いは、当該ベクターは、抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子を全く含まない。
【００３８】
本発明のＫａｎＡＳ核酸の治療的使用
上記のＫａｎＡＳ核酸は、ＤＮＡワクチン接種において、特にアジュバントとして有用であることが明らかとなった。かかるＫａｎＡＳ核酸は、免疫応答を引き起こし、したがって免疫応答の増強が求められている種々の疾患、例えば感染症及び癌を治療するために使用され得る。したがって本発明は、ＤＮＡワクチン接種における（例えばアジュバントとしての）使用のための、及び／又は、癌、良性腫瘍若しくは感染症の治療又は予防における使用のための、本発明のＫａｎＡＳ核酸に関する。
【００３９】
本明細書において使用される用語「癌」は、任意の種類の悪性（すなわち良性ではない）腫瘍のことである。
【００４０】
悪性腫瘍は好ましくは、血液（blood）（又は血液（haemotological））癌、例えば白血病、リンパ腫又は骨髄腫に相当する。かかる血液癌は例えば、急性前骨髄球性白血病（acute promyelocytic leukaemia）（ＡＰＬ）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukaemia）（ＡＭＬ）、リンパ性若しくは骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（chronic lymphocytic leukaemia）（ＣＭＬ）、骨髄単球性白血病（myelomonocytic leukaemia）（ＣＭＭＬ）、小児急性リンパ性白血病（childhood acute lymphoblastic leukaemia）（ＡＬＬ）、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome）（ＭＤＳ）、ホジキンリンパ腫（Hodgkin lymphoma）（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（non-Hodgkin lymphoma）（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（multiple myeloma）（ＭＭ）を含む。
【００４１】
或いは当該腫瘍は、固形腫瘍、例えば上皮性悪性腫瘍（carcinoma）、腺癌（adenocarcinoma）、非上皮性悪性腫瘍（sarcoma）、悪性黒色腫（malignant melanoma）、中皮腫（mesothelioma）又は芽細胞腫（blastoma）に相当し得る。具体的実施形態において、当該固形腫瘍は、膵臓癌、肺癌、乳癌、結腸癌又は結腸直腸癌に相当し得る。
【００４２】
用語「感染症」は、種々の生命体、例えば細菌、マイコプラズマ、原虫、真菌及びウィルス（例えばＨＩＶ、肝炎ウィルス、特にＨＢＶ若しくはＨＣＶ）によって引き起こされる疾患を含む。
【００４３】
「治療」は、（すなわち、所定の疾患を罹患している患者に対する）治療的使用を意味し、「予防」は、（すなわち、所定の疾患の発症に対して感受性である個体に対する）予防的使用を意味する。用語「治療」は、疾患の全快をもたらす治療のみならず、疾患の進行を遅らせ、及び／又は患者の生存を延長する治療を含む。
【００４４】
癌治療の枠内において、本発明のＫａｎＡＳ核酸は好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わせた、同時又は連続的使用のためのものである。他言すれば、当該非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシスの誘導剤及び当該核酸は、同時に、すなわち時間的に同時に、又は連続的に、すなわち患者の一般的治療スケジュールの間において異なる時間に投与され得る。しかし、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、単独で使用されたときにおいても有効である（例えば、実施例３を参照）。
【００４５】
「アポトーシス」は、画一的な形態学的変化を示す、細胞死の一形態のことである。アポトーシスは、例えばDengler 他 (1995, Anticancer Drugs. 6:522-32)に記載されたヨウ化プロピジウムを用いたフローサイトメトリーアッセイによって、又はGorczyca (1993, Cancer Res. 53:1945-51)によって記載されたインサイチュにおける末端デオキシヌクレオチド転移酵素及びニック翻訳アッセイ（terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay）（ＴＵＮＥＬ分析）によって測定され得る。
【００４６】
「非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤」は、当業者に周知である。非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、例えば、レチノイド化合物、ヒ素関連性化合物、ＣＤ４３７、並びに他の分化誘導剤及びアポトーシス誘導剤、ＣＤ４４を活性化する化合物、例えば抗体及びヒアルロン酸、造血増殖因子及び分化因子、５−アザシチジン及び他の脱メチル化剤、ファルネシル転移酵素（ＦＴＩ）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（ＨＤＡＣｉ）、小分子例えばイマチニブ（Imatinib）、ＢＨ３模倣阻害剤、例えばＡＢＴ７３７、並びにＲＡＣ１阻害剤に相当し得る。
【００４７】
「レチノイド化合物」はビタミンＡ誘導体のことであり、例えば、レチノイン酸（ＲＡ）、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シス ＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シス ＲＡ及びレチノイン酸の合成類縁体、例えばＡＭ５８０を含む。好ましくは、当該レチノイド化合物は、ＡＴＲＡ又はＡＭ５８０に相当する。
【００４８】
「ヒ素関連性化合物」は、ヒ素のようにホスファターゼ阻害剤である任意の化合物、又はジチオール基結合によって共有結合を形成することができる任意の化合物を意味する。かかる化合物は例えば、ヒ素及び三酸化ヒ素を含む。
【００４９】
好ましい実施形態において、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、前記核酸によって引き起こされる生物学的応答に対してアジュバント活性を有する。
【００５０】
「アジュバント活性」は、本明細書において、２つの成分の組み合わせによって達成される効果であって、当該２つの成分のいずれか１つの効果よりも大きいものと定義される。
【００５１】
場合により非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わされる、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、少なくとも１つの抗癌剤、例えば５−アザシチジン (Vidaza（商標）) 又はデシタビン（decitabine）と組み合わせて（同時に、又は連続的に）投与され得る。
【００５２】
癌治療の枠内において、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、好ましくは、腫瘍抗原をコードする配列を含む。最も好ましくは、当該腫瘍抗原は、治療されるべき癌に特異的である。癌療法のために有用な抗原の例は、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）及び骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）の治療のためのＰＭＬ−ＲＡＲα、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）タイプＭ２の治療のためのＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＡＭＬタイプＭ４好酸球増多症におけるＣＢＦベータ−ＭＹＨ１１、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）のためのＴｅｌ−ＰＤＧＦ、バリアントＡＰＬにおけるＰＬＺＦ−ＲＡＲα、種々のリンパ性白血病又は骨髄性白血病におけるＭＬＬ融合体（fusion）、小児急性リンパ性白血病のための、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１、Ｅ２Ａ−ＰＢＸ、ＭＬＬ−ＡＦ４又は変異によって活性化される癌遺伝子、例えばＲＡＳ遺伝子、並びに、慢性骨髄性白血病又は小児急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の治療のためのＢＣＲ−ＡＢＬ、を含む。
【００５３】
本発明はまた、免疫応答を引き起こすための、及び／又は癌若しくは感染症を治療若しくは予防するための方法であって、有効量の本発明のＫａｎＡｓ核酸を、それを必要とする個体へ投与する工程であって、場合により前記ＫａｎＡｓを核酸非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わせて投与する前記工程を含む、前記方法を意図する。
【００５４】
「有効量」は、治療されるべき疾患を予防、治療又は遅延させることができるペプチド濃度を達成するために十分な量を意味する。かかる濃度は当業者によってごく普通に決定され得る。実際に投与される化合物の量は通常、治療される環境、選択された投与経路、投与される実際の化合物、年齢、体重、個々の患者の応答、患者の症状の深刻度などを含む、関連性のある環境を考慮して、医師によって決定され得る。投与量が投与されるペプチドの安定性に依存し得ることはまた、当業者により理解され得る。
【００５５】
「それを必要とする個体」は、治療若しくは予防されるべき疾患を罹患している、又は罹患し易い個体を意味する。本発明の枠内において、治療されるべき個体は、好ましくはヒト個体である。しかし、ＫａｎＡＳ核酸の獣医学的使用が同様に、本発明において意図される。
【００５６】
本発明の医薬組成物
本発明のＫａｎＡＳ核酸は、薬剤（医薬）として有用である。したがって本発明の一態様は、物理学的に許容される担体中において、上記のＫａｎＡＳ核酸、及び／又はかかるＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクター、を含む医薬組成物を対象とする。かかる医薬組成物は好ましくは、ワクチン組成物に相当する。
【００５７】
用語「生理学的に許容される担体」は、活性成分の生物活性の有効性を妨害せず、且つ投与される宿主に対して毒性ではない、任意の担体を含むことを意味する。好適な生理学的に許容される担体は当業者に周知であり、例えば本技術分野における標準的参考文献である Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, Easton, USA, 1985)に記載されている。
【００５８】
好ましい実施形態において、医薬組成物は、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばヒ素、三酸化ヒ素、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シスＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シスＲＡ又はＡＭ５８０、をさらに含む。かかる医薬組成物は、癌の治療のために特に有用である。好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、ＫａｎＡＳ核酸、及び／又は当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクターによって引き起こされる生物学的応答に対してアジュバント活性を有する。最も好ましくは、本発明のＫａｎＡＳ核酸は、腫瘍抗原、例えば治療されるべき癌に特異的な腫瘍抗原を含む。
【００５９】
医薬組成物は、少なくとも１つの抗癌剤、例えば５−アザシチジン (Vidaza（商標）) 又はデシタビン（decitabine）をさらに含み得る。
【００６０】
本発明はさらに、以下の組み合わせに関する：
（ｉ）生理学的に許容される担体中、本発明のＫａｎＡＳ核酸、及び／又はかかるＫａｎＡＳ核酸を含むベクターを含む、第１の医薬組成物；及び
（ｉｉ）生理学的に許容される担体中、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばヒ素、三酸化ヒ素、全トランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）、９−シスＲＡ、４−ＨＰＰＲ、１３−シスＲＡ又はＡＭ５８０を含む、第２の医薬組成物；及び、場合により、
（ｉｉｉ）抗癌剤、例えば５−アザシチジン (Vidaza（商標）) 又はデシタビン（decitabine）。
【００６１】
かかる組み合わせは、例えばキットに相当し得る。当該キットは、癌の治療における使用説明書をさらに含み得る。或いは、第１及び第２の組成物は別々に商品化され得る。
【００６２】
本発明の組み合わせの第１及び第２の医薬組成物は、連続的に（すなわち、共通の治療スケジュール期間内において異なる時に）投与されることが意図され得るか、又は同時に投与されることが意図され得る。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の組み合わせの第１の医薬組成物は、腫瘍抗原、例えば治療される癌に特異的な腫瘍抗原（例えば、ＰＭＬ−ＲＡＲα、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＣＢＦベータ−ＭＹＨ１１、Ｔｅｌ−ＰＤＧＦ、ＰＬＺＦ−ＲＡＲα、ＭＬＬ融合体、ＴＥＬ−ＡＭＬ−１又はＢＣＲ−ＡＢＬ）をコードする配列を含む、ＫａｎＡＳ核酸を含む。最も好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤は、ＫａｎＡＳ核酸、及び／又は当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクターによって引き起こされる生物学的応答に対してアジュバント活性を有する。
【００６４】
本発明のＫａｎＡＳ核酸、及び／又は当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクターは、送達用のビヒクルを使用しない、裸の（naked）形態で投与され得る。この目的を達成するために、当該核酸は生理学的に許容される溶液、例えば無菌食塩水又は無菌緩衝食塩水中に、担体と共に、又は担体を用いずに希釈される。存在する場合には、担体は好ましくは等張性、低張性、又は弱い高張性であり、相対的に低いイオン強度、例えばショ糖溶液、例えば２０％ショ糖を含有する溶液によって提供されるイオン強度を有する。
【００６５】
或いは、本発明のＫａｎＡＳ核酸、及び／若しくは当該ＫａｎＡＳ核酸を含む発現ベクター、又は本発明のワクチン組成物、組み合わせ、若しくはキットの核酸は、細胞への取り込みを支援する薬剤と共に投与され得る。かかる薬剤の例は、（ｉ）細胞透過性を改変する化学物質、例えばブピバカイン（bupivacaine）（例えば、国際公開第９４／１６７３７号参照）、（ｉｉ）ポリヌクレオチドの被包のためのリポソーム若しくはウィルス粒子、又は（ｉｉｉ）それら自身をポリヌクレオチドと共に結合させる、カチオン性脂質又はシリカ、金若しくはタングステン微小粒子。
【００６６】
アニオン性及び中性リポソームは、当技術分野で周知であり（リポソームの製造方法の詳細な説明については、例えば、Liposomes: A Practical Approach, RPC New Ed, IRL press, 1990を参照）、ポリヌクレオチドを含む、広範囲の製造物を送達するために有用である。
【００６７】
カチオン性脂質はまた、当業者に周知であり、遺伝子送達のために一般的に使用される。かかる脂質は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）としても知られるＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ Ｔｍ、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３（トリメチルアンモニオ）プロパン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシル−アンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシルスペルミン）、及びコレステロール誘導体、例えばＤＣ−Ｃｈｏｌ（３ ベータ−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール）を含む。これらのカチオン性脂質の記載は、ＥＰ１８７，７０２、国際公開第９０／１１０９２号、米国特許第５，２８３，１８５号明細書、国際公開第９１／１５５０１号、国際公開第９５／２６３５６号及び米国特許第５，５２７，９２８号明細書において見ることができる。遺伝子送達のためのカチオン性脂質は、中性脂質、例えば国際公開第９０／１１０９２号に記載されているＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と共に好ましくは使用される。
【００６８】
カチオン性リポソームを含む製剤は、場合により他のトランスフェクション促進性化合物（transfection-facilitating compound）を含み得る。それらの多くは、国際公開第９３／１８７５９号、第９３／１９７６８号、第９４／２５６０８号及び第９５／０２３９７号に記載されている。それらは、核膜を通じたＤＮＡの輸送を容易にするために有用なスペルミン誘導体（例えば国際公開第９３／１８７５９号参照）、並びに膜透過性化合物、例えばＧＡＬＡ、グラミシジンＳ及びカチオン性胆汁酸塩（例えば国際公開第９３／１９７６８号参照）を含む。
【００６９】
金又はタングステン微小粒子は、国際公開第９１／００３５９号又は第９３／１７７０６号に記載されているような遺伝子送達のために使用され得る。微小粒子被覆されたポリヌクレオチドは、皮内経路を介して、又は表皮内経路を介して、無針注射器具（「遺伝子銃（gene gun）」）、例えば米国特許第４，９４５，０５０号明細書、第５，０１５，５８０号明細書及び国際公開第９４／２４２６３号に記載されたものを用いて注射される。或いは、裸のＤＮＡが直接的に注射、すなわち筋肉注射され得る。
【００７０】
医薬組成物において使用されるＤＮＡ量は、例えば、ＤＮＡコンストラクト中で使用されるプロモーターの強度、発現される腫瘍抗原の免疫原性、投与対象の哺乳動物の状態（例えば体重又は年齢）、投与様式、及び製剤の種類に依存する。一般的に、約１μｇ〜約８ｍｇの、好ましくは約１μｇ〜約１ｍｇの（Graham, B. S.et al.J.Infect.Dis.194, 1650-1660(15-12-2006)）、好ましくは約１０μｇ〜約８００μｇの、及びより好ましくは約２５μｇ〜約２５０μｇの、治療的に有効な投与量が、ヒト成人に投与され得る。当該投与は、単回投与で達成され得るか、又は間隔を空けて繰り返される。
【００７１】
投与経路は、ＤＮＡワクチン接種の分野において使用される任意の従来の経路である。一般的な指針として本発明の核酸は、非経口経路で、例えば皮内経路で、表皮内経路で、又は筋肉内経路で投与され得る。投与経路の選択は、選択される剤形に依存する。ブピバカイン（bupivacaine）と共に製剤化されるポリヌクレオチドは、筋肉へ有利に投与される。中性若しくはアニオン性リポソーム、又はカチオン性脂質、例えばＤＯＴＭＡ又はＤＣ−Ｃｈｏｌが使用されるとき、当該製剤は、筋肉内経路で又は皮内経路で有利に注射され得る。裸の形態のポリヌクレオチドは、筋肉内、皮内又は皮下経路で有利に投与され得る。さらに、エレクトロポレーションが、ＤＮＡの筋肉への送達を改善するためになされ得る（Mir et al. 1999, Proc Natl Acad Sci U S A. 96:4262-7）。
【００７２】
癌治療の枠内において、核酸療法は好ましくは、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤、例えばヒ素の投与、低用量の化学療法、又は全トランスレチノイン酸、又は他のレチノイン酸化合物、例えば９−シスＲＡ、４ＨＰＲ、１３シスＲＡ、ＣＤ４３７、並びに他の分化及びアポトーシス誘導剤、抗体又はヒアルロン酸によるＣＤ４４の活性化、造血増殖及び分化因子と組み合わされ得る。患者はこの誘導剤を、本発明の核酸と同一のワクチン組成物中に存在する形で、又は別の組成物の形態で存在する形で投与される。後者の場合、投与経路は、当該核酸に対して使用される投与経路と同一であってもよく、又は当該投与経路と異なってもよい。例えば、皮内経路又は筋肉内経路で核酸組成物が送達される一方で、誘導剤は経口で投与される。
【００７３】
雑誌の記事又は要約、刊行された特許出願、公表された特許又は他の参考文献を含む、本明細書に引用された全ての参考文献は、当該引用された参考文献中に存在する全てのデータ、表、図及び文章を含めて、本明細書中に参照により完全に組み込まれる。
【００７４】
異なる意味を有するが、用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」及び「から成る（consisting of）」は、本明細書中において交換可能に使用され、互いに置き換えられ得る。
【００７５】
本発明は、以下の実施例及び図を考慮してさらに評価され得る。
【実施例】
【００７６】
実施例
実施例１：ＤＮＡコンストラクト
５つのＤＮＡコンストラクトが使用された：
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０１とも呼ばれる）。国際公開第０３／０９０７７８号の１８ページ１２行目〜１９ページ２行目、実施例１ｂに記載されている。
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０４とも呼ばれる）。国際公開第０３／０９０７７８号の１９ページ、４〜１５行目、実施例１ｂに記載されている。
− ｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクト（ｐＶａｘ１４又はＶＶＡＣＳ０２とも呼ばれる）。配列番号１の配列から成る核酸の、ｐＶａｘ１ベクターへのクローニングにより産生された。
− ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクト（ｐＶａｘ１５又はＶＶＡＣＳ０３とも呼ばれる）。ＰＭＬ−ＲＡＲα腫瘍抗原をコードする配列の、ｐＶａｘ１４へのクローニングにより産生された。
− ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト、ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣの、ｐＶａｘ１ベクターへのクローニングにより産生された。
【００７７】
ｐＶａｘ１４（ｐＶａｘＫａｎＡＳ又はＶＶＡＣＳ０２）を、以下のプラマー対を用いた、ｐＶａｘ１のＰＣＲ増幅によって構築した：配列番号１０及び１１のプライマー対、並びに配列番号１２及び１３のプライマー対。ＮｏｔＩ及びＢａｍＨＩをクローニングサイトとして用いた。
【００７８】
ｐＶａｘ１５（ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ又はＶＶＡＣＳ０３）を、配列番号１４及び１５のプライマーを用いて、ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲＦｒＣ由来のリーダーＰＭＬ−ＲＡＲ１０５ｂｐ配列を増幅することによって構築した。増幅された断片を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩクローニングサイトを用いて、ｐＶａｘ１４へとクローニングした。
【００７９】
ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０１）及びｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ（ＶＶＡＣＳ０３）を、ＣＯＳ細胞へと一時的にトランスフェクトした。ＲＱ−ＰＣＲ実験は、ＰＭＬ−ＲＡＲαが両方のコンストラクトを用いて発現されることを実証した。
【００８０】
実施例２：ＫａｎＡＳは、ＡＰＬマウスモデルの寿命を延長する。
Padua 他 (2003, Nature Medicine 9:1413-1417)に開示されたプロトコルを用いて、ＡＰＬマウスモデルにおける異なるＤＮＡコンストラクトの効果を試験した。簡潔に述べると、１０4個のＡＰＬ細胞を、ＦＶＢ／Ｎマウスへと注射した。その後、５ｍｇ／日のＡＴＲＡを２１日間放出するＡＴＲＡペレットを、トロカールを用いてマウスの頸部後方に導入した。ＤＮＡ（２×５０マイクログラムのプラスミド）を、ＡＴＲＡペレットを導入した日後に、及び２０日毎に、合計３回注射した。以下のＤＮＡコンストラクトをマウスに注射した：
− ｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクト、ｐＶａｘ１４とも呼ばれる：
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０１）；
− ｐＶａｘＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクト；及び
− ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳＦｒＣコンストラクト（ＶＶＡＣＳ０４）。
【００８１】
ＡＴＲＡペレットの製造業者（Innovative Research, Sarasota, USA）から購入されたペレットを、プラセボとして使用した。
【００８２】
マウスを２年間監視下に置き、Kaplan-Meier曲線を作図した。
【００８３】
結果を、図２及び以下の表１に示す。ｌｏｇ−ランク(Mantel-Cox)及びWilcoxon 検定をKaplan-Meier 曲線に適用した。いずれも統計的検定も、有意性の観点で同一の結果を導いた。
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】
【表４】
【００８７】
したがって、ＡＴＲＡと組み合わせて投与されるｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクトは、ＡＰＬマウスモデルにおいて保護効果を有する。約４０％のマウスは死亡を免れた。この保護効果は、ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクトの保護効果と同程度である。他方で、ｐＶａｘＫａｎＡＳコンストラクトの保護効果は、ＡＴＲＡ担体のものとは有意に異なる（ｐ＝<０．０５、ＡＴＲＡ対ＡＴＲＡ＋ｐＶａｘＫａｎＡＳについて）。
【００８８】
ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクト（ｐＶａｘ１５とも呼ばれる）の効果を試験するために、別の実験を行った。本実験において使用されるＡＰＬ細胞がより高代継代且つより悪性であり、マウスが９カ月間監視下に置かれた以外は、プロトコルは上記と同一であった。
【００８９】
結果を図３、及び以下の表２に示す。
【００９０】
【表５】
【００９１】
ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクトも同様に、ＡＴＲＡ単体と比較して保護効果を有する（ｐ＝０．０００９）。ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳコンストラクトは、ｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣコンストラクトと少なくとも同程度に効果的である。
【００９２】
実施例３：ＫａｎＡＳ及びＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣは、ＭＤＳマウスモデルの寿命を延長する。
Omidvar 他 (2007, Cancer Res. 67:11657-67)に記載されたＭＤＳマウスモデルを、ＭＤＳにおけるＫａｎＡＳの効果を調べるために使用した。このマウスモデルは、ＢＣＬ−２を有する変異体ＮＲＡＳを生じるマウスの使用に基づく。それらは、血小板減少症及び切迫した死を示唆する血小板数に減少するまで監視下に置かれた。
【００９３】
ワクチン接種プロトコルは以下の通りである：２×５０マイクログラムのＤＮＡを診断後の日に投与した（０日目）。当該日付は、末梢血血小板数が正常値未満（＜１０5／マイクロリットル）に減少した日に相当した。２０日目及び４０日目に、２×５０マイクログラムのＤＮＡを再度注射した。ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ＶＶＡＣＳ０２）で処置された６匹のマウスを用いて第一の実験を行った。図４に示される通り、ＫａｎＡＳ単体は、未処置群と比較してマウスの寿命を延長した（ｐ＝０．００３）。
【００９４】
ｐＶａｘＫａｎＡＳで処置された１０匹のマウス、及びｐＣＤＮＡ3ＰＭＬ−ＲＡＲαＦｒＣ（ＶＶＡＣＳ０４）で処置された１６匹のマウスを用いて、第二の実験を行った。結果が図５に示される本実験によって、先の実験の枠組み内で得られる結果を確認した。
【００９５】
ＡＴＲＡ、及びｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲＡＳＦｒＣ又はＶＶＡＣＳ０４の併用投与の効果を試験するために、第三の実験を行った（図６）。マウスの４つの群に分けた：
− ｐＣＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣで処置されたマウス；
− ＡＴＲＡで処置されたマウス；
− ＡＴＲＡ及びｐｃＤＮＡ３ＰＭＬＲＡＲαＡＳＦｒＣで処置されたマウス；及び
− 未処置マウス。
【００９６】
血小板数が１０5／マイクロリットル未満に減少して疾患が発症までマウスを監視下に置いた。１０ｍｇのＡＴＲＡを２１日間放出するペレット(Innovative Research, Sarasota, USA)を用いて当該マウスを処置した。次の日に、２×５０マイクログラムのＤＮＡでマウスを処置し、その後２０日の間隔を空けて２回処置し、合計で１匹のマウスあたり３００マイクログラム与えた。
【００９７】
結果的に、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトは、単体で用いられる場合、及び非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わされる場合のいずれにおいても、ＤＮＡワクチン接種において非常に有効であった。かかるＫａｎＡＳコンストラクトは、例えばＡＰＬ及びＭＤＳの患者を疾患再発又は疾患増悪から保護するために、ＤＮＡワクチンとして使用され得る。
【００９８】
実施例４：ＭＤＳマウスモデルにおける疾患の再発
ＢＣＬ−２を有する変異体ＮＲＡＳを生じるトランスジェニックマウスは治癒されず、必然的に再発及び死亡するだろう。したがって、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトの投与で誘導される免疫がどの程度続くかを決定するために、実験を行った。この目的のために、ｐＶａｘＫａｎＡＳ（ｐＶａｘ１４，ＶＶＡＣＳ０２）で処置されたＭＤＳマウスのＣＤ４+、ＣＤ４４hi、ＣＤ６２Ｌloプロファイル（図７）及びＭａｃ−２hi／Ｇｒ１loプロファイル（図８）を分析した。疾患の再発は、Ｍａｃ１hi／Ｇｒ１lo群の増加によって追跡された。それは白血病幹細胞の減少のマーカーである。
【００９９】
血球数を測定することによって、マウスの疾患増悪を追跡した。血小板が１０5／マイクロリットルに減少したとき、マウスを試験に採用し、２×５０マイクログラムのｐＶａｘ１４（ｐＶａｘＫａｎＡＳ）ＤＮＡをワクチン接種した。２０日間の間隔をあけて、ＤＮＡの注射を繰り返した。その後、最後の注射を４０日目に行った。
【０１００】
３回目の注射の後、マウスの疾患増悪を追跡した。より具体的には、Ｍａｃ１／Ｇｒ１の状況をフローサイトメトリーによって（図８）、並びにＣＤ４４hi及びＣＤ６２Ｌloによって特徴付けられるメモリーＴ細胞の存在によって（図７）試験した。疾患の再発は約１５０日目に生じた。
【０１０１】
ｐＶａｘＫａｎＡＳ単体で処理されたＭＤＳマウスは、野生型ＦＶＢ／Ｎマウスと比較して、メモリーＴ細胞が３倍増加することが明らかとなった。さらに、白血病幹細胞（leukaemic initiating cell）群は、ｐＶａｘＫａｎＡＳを用いた処理で減少した（未処置マウスで約２５％、対して処置マウスで約１０％）。これらの結果は、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトが、癌患者の治療のために効果的であることを裏付けた。
【０１０２】
実施例５：ＡＭＬマウスモデルにおける、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトの効果
ＫａｎＡＳ核酸を含む、又は含まない異なるコンストラクトの効果を、ＡＭＬマウスモデルにおいて評価した。
【０１０３】
当該コンストラクトを図１０に示す。ＶＶＡＣＳ０２及びＶＶＡＣＳ０４と呼ばれるコンストラクトは、本発明のＫａｎＡＳ核酸を「Ｆｌｉｐｐｅｒ」領域に含む。より具体的には、ＶＶＡＣＳ０２は上記のｐＶａｘ１４と呼ばれるベクターである。このベクターの配列を配列番号１７で示す。
【０１０４】
図２及び１１は、ＡＴＲＡと、ＫＡｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクトとの組み合わせが、マウスの寿命を延長することを示す。
【０１０５】
ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）ＤＮＡを用いたＤＮＡワクチン接種が、特異的なＴ細胞応答を引き起こすか否かを決定するために、Elispotアッセイ（Furugaki et al., Blood. 2010; 115:653-6）が使用された。当該結果を図１２に示す。
【０１０６】
図１３に示される通り、ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）を用いたＤＮＡワクチン接種は、病勢安定（stable disease）をもたらした。
【０１０７】
ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）を用いたＤＮＡワクチン接種が、病勢安定をもたらしたという事実は、Fan 他 (Nat Med. 2009;15:566-71)によって記載された通り、Firefly（商標）装置（Cell Biosciences）を用いてＥＲＫを定量化することによってさらに研究された。当該結果を以下の表３及び４に示す。
【０１０８】
【表６】
【０１０９】
ＶＶＣＡＳ０２（ｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）の作用機序が特徴付けされた。
【０１１０】
第一に、ＦＶＮコントロールマウスにおけるメモリーＴ細胞及び４匹のＭＤＳ−ＡＭＬマウスにおけるメモリーＴ細胞を、ＶＶＡＣＳ０２及びＡＴＲＡを用いた処置の後の異なる日に評価した。メモリーＴ細胞群−ＣＤ４＋、ＣＤ４４ｈｉ、ＣＤ６２Ｌｌｏの増加が２回目のＤＮＡワクチン接種後に観察された（データ示さず）。さらに、メモリーＴ細胞は、最後ＤＮＡ注射後、約４〜５か月間高レベルを維持した。（データ示さず）。
【０１１１】
第二に、ＭｙＤ８８（ＴＬＲ下流の遺伝子）の発現を、（ｉ）コントロールのＦＶＢＮマウス、（ｉｉ）ＶＶＡＣＳ０２及びＡＴＲＡで、１１３日目又は１４２日目に処置した２匹のＭＤＳ−ＡＭＬマウス、及び（ｉｉｉ）別の薬剤で処置した１匹のＭＤＳ−ＡＭＬマウス、で評価した。１１３日目にＶＶＡＣＳ０２で処置したマウスにおいて、ＭｙＤ８８の発現増大及びＴＬＲの活性化が観察された（データ示さず）。さらに、最後のＤＮＡ注射後約３．５か月で基礎発現が見られた。この効果は他のマウスにおいて観察されなかった。この結果は、Ｔｏｌｌ様受容体が、ＶＶＡＣＳ０２の有益な効果の一因となることを示唆している。
【０１１２】
要約すると、実施例５に示した実験データは、ＶＶＡＣＳ０２がＭＤＳモデルにおいて病勢安定をもたらすことを実証する。それはまた、好適な免疫応答を生じさせる。ＤＮＡアジュバントを用いない治療、例えばＡＴＲＡ単体での治療とは対照的に、その発現が上方制御される、下流分子のＭＹＤ８８を測定することによって示された通り、ＶＶＡＣＳ０２が作用する機構が、Ｔｏｌｌ様受容体が関与するＤＮＡアジュバントとしてであることをこれらの結果は示唆する。
【０１１３】
実施例６：ＭＤＳマウスモデルにおける、ＫａｎＡＳを含むＤＮＡコンストラクト、ＡＴＲＡ及び５−アザシチジンの組み合わせの効果
【０１１４】
ＫａｎＡＳ、ＡＴＲＡ及び５−アザシチジンの組み合わせのＭＤＳに対する効果を試験するために、Omidvar 他 (2007, Cancer Res. 67:11657-67)に記載されたＭＤＳマウスモデルが使用された。
【０１１５】
１ｍｇ／ｍｌの５−アザシチジン溶液を１００マイクロリットル、診断日に、そしてその後マウスが死亡するまで、月曜日、水曜日及び金曜日に、ＩＰでマウスに注射した。
【０１１６】
ＡＴＲＡを１０ｍｇ、２１日間放出ペレットで投与した。
【０１１７】
ワクチン接種プロトコルは以下の通りであった：１００マイクログラムのＤＮＡ（ＶＶＡＣＳ０２又はｐＶａｘ１４又はｐＶａｘＫａｎＡＳ）を、診断日後に投与した（０日目）。その日は、末梢血の血小板数が正常未満に減少した日であった（＜１０5／マイクロリットル）。２０日目及び４０日目に、２×５０マイクログラムのＤＮＡを再度注射した。
【０１１８】
１２回の５−アザシチジン注射の後に、マウスを４つの群にランダムに分けた：
− ５−アザシチジン（ｎ＝５）
− ５−アザシチジン＋ＡＴＲＡ（ｎ＝４）
− ５−アザシチジン＋ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡ（ｎ＝４）
− 5-アザシチジン＋ＡＴＲＡ＋ＶＶＡＣＳ０２ ＤＮＡ（ｎ＝４）
【０１１９】
結果を以下の表５に示す。
【０１２０】
【表７】
【０１２１】
ＫａｎＡＳ、ＡＴＲＡ及び５−アザシチジンの組み合わせはしたがって、ＭＤＳマウスモデルの寿命を延長した。
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列表の説明
配列番号１は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的な配列を含む、ＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２３】
配列番号２は、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的な配列を含み、及びｐＶａｘプラスミドの断片と相補的な配列をさらに含む、ＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２４】
配列番号３は、ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原をコードする配列、及びカナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的な配列を含む、ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２５】
配列番号４は、ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原をコードする配列、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片と相補的な配列、及びｐＶａｘプラスミドの断片と相補的な配列を含む、ＰＭＬ−ＲＡＲαＫａｎＡＳ核酸の配列を示す。
【０１２６】
配列番号５は、ＰＭＬ−ＲＡＲα抗原をコードする配列を示す。
配列番号６は、ＰＭＬ−ＲＡＲαＡＳの配列を示す。
配列番号７は、ｐＶａｘ１４プラスミドの断片を示す。
配列番号８は、ｐＶａｘ１５プラスミドの断片を示す。
配列番号９は、空のｐＶａｘ１ベクターの配列を示す。
【０１２７】
配列番号１０〜１３は、ｐＶａｘ１４プラスミドを構築するために使用されるプライマーを示す。
配列番号１４及び１５は、ｐＶａｘ１５プラスミドを構築するために使用されるプライマーを示す。
【０１２８】
配列番号１６は、ＦｒＣ配列を示す。
配列番号１７は、ｐＶａｘ１４プラスミドの完全配列を示す。ｆｌｉｐｐｅｒ領域は、配列番号２のＫａｎＡＳ配列を含む。
配列番号１８〜２３は、免疫原性ポリペプチドの配列を示す。
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡワクチン接種における使用のための、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的なアンチセンス配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的なアンチセンス配列を含む、単離された核酸であって、前記アンチセンス配列が：
ａ）配列番号９の断片に相補的である配列であって、前記断片が、配列番号９の１２２６〜２０２０位に位置するヌクレオチドの内、少なくとも５０個の連続的ヌクレオチドを含む、前記配列；
ｂ）配列番号１又は２の配列
ｃ）配列番号１又は２と少なくとも８０％同一である配列；
ｄ）配列番号１又は２の、少なくとも５０個の連続的ヌクレオチドの断片；及び
ｅ）哺乳動物において免疫応答を引き起こすことができる、（ａ）又は（ｂ）の誘導体
から成る群から選択される配列から成る、前記単離された核酸。
【請求項３】
免疫原性ポリペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
前記免疫原性ポリペプチドが腫瘍抗原である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記腫瘍抗原をコードする配列が、配列番号５のＰＭＬ−ＲＡＲα配列と少なくとも８０％同一である、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
ａ）配列番号３又は４の配列；
ｂ）配列番号３又は４と少なくとも８０％同一である配列；
ｃ）配列番号３又は４の内、少なくとも５０個の連続的ヌクレオチドの断片；及び
ｄ）哺乳動物において免疫応答を引き起こすことができる、（ａ）の誘導体
から成る群から選択される配列を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
癌、良性腫瘍若しくは感染症の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
癌の治療及び／又は予防において、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わせて、同時に又は連続的に使用されるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
前記癌が、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小児急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）から成る群から選択される血液癌である、請求項７又は８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記癌が、上皮性悪性腫瘍、腺癌、非上皮性悪性腫瘍、黒色腫、中皮腫及び芽細胞腫から成る群から選択される固形腫瘍である、請求項７又は８に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１１に記載のベクター；
（ｉｉ）生理学的に許容される担体；及び、場合により
（ｉｉｉ）非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤
を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
（ｉ）生理学的に許容される担体中、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１１に記載のベクターを含む、第１の医薬組成物；及び、
（ｉｉ）生理学的に許容される担体中、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤を含む、第２の医薬組成物
の組み合わせ。
【請求項１４】
前記非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤が、レチノイド化合物又はヒ素関連性化合物である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項１２に記載の医薬組成物、又は請求項１３に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
前記レチノイド化合物がＡＴＲＡである、請求項１４に記載の核酸、請求項１４に記載の医薬組成物、又は請求項１４に記載の組み合わせ。
【請求項１】
ＤＮＡワクチン接種における使用のための、カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的なアンチセンス配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
カナマイシン耐性タンパク質をコードする配列の断片に相補的なアンチセンス配列を含む、単離された核酸であって、前記アンチセンス配列が：
ａ）配列番号９の断片に相補的である配列であって、前記断片が、配列番号９の１２２６〜２０２０位に位置するヌクレオチドの内、少なくとも５０個の連続的ヌクレオチドを含む、前記配列；
ｂ）配列番号１又は２の配列
ｃ）配列番号１又は２と少なくとも８０％同一である配列；
ｄ）配列番号１又は２の、少なくとも５０個の連続的ヌクレオチドの断片；及び
ｅ）哺乳動物において免疫応答を引き起こすことができる、（ａ）又は（ｂ）の誘導体
から成る群から選択される配列から成る、前記単離された核酸。
【請求項３】
免疫原性ポリペプチドをコードする配列をさらに含む、請求項１又は２に記載の核酸。
【請求項４】
前記免疫原性ポリペプチドが腫瘍抗原である、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
前記腫瘍抗原をコードする配列が、配列番号５のＰＭＬ−ＲＡＲα配列と少なくとも８０％同一である、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
ａ）配列番号３又は４の配列；
ｂ）配列番号３又は４と少なくとも８０％同一である配列；
ｃ）配列番号３又は４の内、少なくとも５０個の連続的ヌクレオチドの断片；及び
ｄ）哺乳動物において免疫応答を引き起こすことができる、（ａ）の誘導体
から成る群から選択される配列を含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
癌、良性腫瘍若しくは感染症の治療及び／又は予防における使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
癌の治療及び／又は予防において、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤と組み合わせて、同時に又は連続的に使用されるための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
前記癌が、リンパ性白血病、骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小児急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）から成る群から選択される血液癌である、請求項７又は８に記載の核酸。
【請求項１０】
前記癌が、上皮性悪性腫瘍、腺癌、非上皮性悪性腫瘍、黒色腫、中皮腫及び芽細胞腫から成る群から選択される固形腫瘍である、請求項７又は８に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸を含むベクター。
【請求項１２】
（ｉ）請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１１に記載のベクター；
（ｉｉ）生理学的に許容される担体；及び、場合により
（ｉｉｉ）非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤
を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
（ｉ）生理学的に許容される担体中、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸、又は請求項１１に記載のベクターを含む、第１の医薬組成物；及び、
（ｉｉ）生理学的に許容される担体中、非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤を含む、第２の医薬組成物
の組み合わせ。
【請求項１４】
前記非免疫抑制性の腫瘍細胞アポトーシス誘導剤が、レチノイド化合物又はヒ素関連性化合物である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の核酸、請求項１２に記載の医薬組成物、又は請求項１３に記載の組み合わせ。
【請求項１５】
前記レチノイド化合物がＡＴＲＡである、請求項１４に記載の核酸、請求項１４に記載の医薬組成物、又は請求項１４に記載の組み合わせ。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【公表番号】特表２０１２−５２１７４９（Ｐ２０１２−５２１７４９Ａ）
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２０１２−５０１３１８（Ｐ２０１２−５０１３１８）
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４０３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０９０１６
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【出願人】（５１０１６２８５０）ユニベルシテ パリ ディデロ−パリ ７ (2)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２４年９月２０日（２０１２．９．２０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２２年３月２６日（２０１０．３．２６）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＥＰ２０１０／０５４０３９
【国際公開番号】ＷＯ２０１０／１０９０１６
【国際公開日】平成２２年９月３０日（２０１０．９．３０）
【出願人】（５００２４８４６７）アンスティテュ ナシオナル ドゥ ラ サントゥ エ ドゥ ラ ルシェルシェ メディカル（イーエヌエスエーエールエム） (19)
【出願人】（５１０１６２８５０）ユニベルシテ パリ ディデロ−パリ ７ (2)
【Ｆターム（参考）】
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