皮膚を脱色するためのフェオダクチルム科藻類抽出物の使用
本発明は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の、特に皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化を目的とした脱色活性剤としての、化粧用組成物における使用に関する。
該抽出物は、脂質抽出物であることが好ましい。
本発明は、皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化のための美容ケア法において、この抽出物を含有する化粧用組成物の、皮膚の少なくとも１つの関心領域への適用を含むことを特徴とする美容ケア法にも関する。
該抽出物は、脂質抽出物であることが好ましい。
本発明は、皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化のための美容ケア法において、この抽出物を含有する化粧用組成物の、皮膚の少なくとも１つの関心領域への適用を含むことを特徴とする美容ケア法にも関する。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）抽出物の、化粧用脱色剤としての使用、及び色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色、体毛若しくは頭髪の明色化のための美容スキンケア法にも関する。
【０００２】
当技術分野では、多くの脱色剤が知られている。
【０００３】
プロテアソームは、損傷タンパク質の除去を特に担っているため、細胞維持に非常に重要な細胞内のタンパク質分解多酵素複合体である（Ｆｒｉｇｕｅｔ Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （２０００） ９０８： １４３〜１５４）。プロテアソーム系は、触媒複合体、プロテアソーム２０Ｓ、並びにその活性及び特異性に影響を及ぼす複数のレギュレーターから形成される。レギュレーター１９Ｓのプロテアソーム２０Ｓとの会合は、ユビキチンタンパク質の分解を実施するプロテアソーム２６Ｓを形成する。該プロテアソームは、哺乳類細胞中、細胞質ゾル及び核の両方に位置し、小胞体及び細胞膜との相互作用が存在する。プロテアソーム２０Ｓは、７００ｋＤａの分子量を有し、α型又はβ型の遺伝子によってコードされた１４個の異なるサブユニットからなる。１４個の該サブユニットは、７個のサブユニットの４つの環の円柱状の積重ねとして配置され、頂端の環はαサブユニットから形成され、中央の環はβサブユニットから形成されている。このタンパク分解複合体は、塩基性残基（「トリプシン様」活性）、疎水性残基（「キモトリプシン様」活性）及び酸性残基（「ペプチジルグルタミルペプチド加水分解酵素」活性）のＣ末端部で、タンパク質を優先的に切断する。これらのペプチダーゼ活性は、３個の異なるβサブユニットが担い、その構造内に位置しており、したがって、細胞タンパク質の時機を失した分解を回避するが、活性部位がその潜在的基質へ接近し難いという問題を生じる。最後に、細胞老化の過程において、プロテアソーム活性の減少によって少なくとも部分的に説明される、酸化によるアミノ酸の修飾のサインである、カルボニル基を保有する損傷タンパク質の蓄積が生じる（Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ， Ｉ．ら、Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．（２０００）５５Ａ：Ｂ２２０〜２２７及びＦｒｉｇｕｅｔ Ｂ．、Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００６）５８０：２９１０〜２９１６）。
【０００４】
さらに、Ａｎｄｏ Ｈ．ら、ｉｎ Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｉａ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ： ａ ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、（２００４）．２７９：１５４２７〜３３は、Ｂ１６Ｆ１０細胞（安定にメラニンを発現し、生成するマウスメラノサイト株）中で、プロテアソーム依存性タンパク質分解を介してチロシナーゼが分解され、この分解が、リノール酸を用いた処理後に刺激され得るか、又は反対に、パルミチン酸を用いた処理を介して減少され得ることを実証した。
【０００５】
藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムは、植物プランクトンの一部を構成し、温帯気候由来の珪藻類の単細胞藻類である。
【０００６】
本出願人名の国際特許出願の国際公開第０２／０８０８７６号パンフレットは、この藻類抽出物の、ＵＶへの曝露の有害な影響から皮膚を積極的に保護するため、又は皮膚の老化の影響を予防若しくは抑制するための化粧剤としての使用について開示している。
【０００７】
前記国際特許出願によると、この化粧剤の特性は、この抽出物が、皮膚細胞、特にケラチノサイトのプロテアソームの活性化を促進し、したがって酸化タンパク質の分解促進につながるという事実によって説明される。
【０００８】
少なくとも１種の光合成海洋及び／又は淡水微生物の清澄化培養培地の調製プロセス、並びに、特に化粧品の分野におけるこの清澄化培養培地の使用は、国際特許出願の国際公開第２００６／００８４０１号パンフレットにも記載されている。
【０００９】
前記文献は、該清澄化培養培地の可能な用途の中で、着色剤又は脱色剤としての用途について述べているが、バイオマス自体又はその抽出物の使用については全く触れていない。その上、前記文献は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの清澄化物質が、脱色特性を全く有していないことを示している。
【００１０】
皮膚色素沈着の形成機構が、メラノサイトにおけるメラニンの合成を伴うことが想起される。この機構は、以下の主要ステップを概略的に伴う。
チロシン→ドーパ→ドーパキノン→ドーパクロム→メラニン
【００１１】
チロシナーゼは、この一連の反応において重要な役割を果たす酵素である。チロシナーゼは、メラニン色素の形成につながる、チロシンをドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）へ変換するための反応、及びドーパをドーパキノンへ変換するための反応を特に触媒する。
【００１２】
ある物質は、メラノサイトに、これらの細胞の活性を抑制することにより直接作用する場合、又はメラニン生合成のステップの１つをブロックする場合、脱色剤として認められる。検討中の物質が、メラニン形成に関与する酵素のうちの１種を抑制する場合が特にそうである。
【００１３】
驚くべきことに、本発明者らは、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物が、注目すべき皮膚脱色特性を有することを証明したが、それに対し、上述した科学的刊行物（Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９、１５４２７〜３３）によれば、チロシナーゼ分解に対するその阻害活性が知られているこの同一の藻類は、相当量のパルミチン酸を含有すると考えられている。
【００１４】
したがって、第１の態様によると、本発明は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の、特に色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色、体毛若しくは頭髪の明色化を目的とした脱色活性剤としての、化粧用組成物における使用に関する。
【００１５】
この第１の態様によると、本発明は、より具体的には、該活性剤が、皮膚の脱色又は退色を目的とした使用に関する。
【００１６】
第２の態様によると、本発明は、この抽出物を含有する化粧用組成物の、皮膚の少なくとも１つの関心領域への適用を含むことを特徴とする、皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色、体毛若しくは頭髪の明色化のための美容ケア法に関する。
【００１７】
この第２の態様によると、該抽出物は、所望の効果を得るのに効果的な量、特に、皮膚におけるチロシナーゼ分解の刺激を誘発するのに効果的な量で使用される。
【００１８】
上記２つの態様では、該藻類抽出物は、好ましくは０．００１重量％と５重量％の間、より好ましくは０．００１重量％と１重量％の間の濃度で、該組成物において使用される。
【００１９】
本発明の発明者らによって実施された試験は、該抽出物が、その脂肪酸含量が高くなるにつれてより活性であることを示した。
【００２０】
このことが、可能な限り脂肪酸が豊富なフェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物が、好ましくは少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％の脂肪酸を含有する抽出物が、本発明の２つの各態様に従って使用されると見込まれる理由である。
【００２１】
高脂肪抽出物を得るためのプロセスは、そのような抽出物を得るのに使用され得る。
【００２２】
第１の変法によると、高脂肪抽出物を得るために、脂肪酸を抽出するのに十分に無極性である溶媒又は溶媒媒体を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含むプロセスが使用されるであろう。
【００２３】
そのような溶媒又は溶媒媒体は、以下で無極性溶媒と呼ぶ。
【００２４】
以下に述べるそのような無極性溶媒の例としては、イソプロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンが挙げられる。
【００２５】
しかし、無極性溶媒を用いた該藻類のそのような処理ステップに限定せずに、多くの場合に、無極性溶媒を用いた抽出ステップの他に、極性溶媒を用いた少なくとも１つの抽出ステップを含む、一連の抽出ステップを使用することが有利である。
【００２６】
極性溶媒を用いたそのような抽出ステップの結果は、エステル化脂肪酸、特にグリセリドの加水分解を引き起こし、それらを塩形態で抽出することである。
【００２７】
有利には、無極性溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含むそのようなプロセスは、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、水−アルコール又はこれらのアルコールの混合物、エチレングリコールなどのＣ２〜Ｃ６多価アルコール、クロロホルム及びジクロロメタンなどの塩素系溶媒、酢酸エチルなどのＣ３〜Ｃ６有機酸エステル、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンなどのＣ６〜Ｃ１０アルカン、並びにジイソプロピルエーテルなどのＣ５〜Ｃ８エーテルから選択された抽出溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを特に含み、前記溶媒は、場合によって塩基性化されている。
【００２８】
本発明の抽出物の調製に使用されるプロセスの特に有利な一変法によると、該藻類は、塩基性化された水−アルコール混合物を用いた抽出の第１のステップへ付され、前記水−アルコール混合物のアルコールは、イソプロパノール、エタノール及びメタノールから選択されることが好ましく、前記ステップは、脂肪酸が、水−アルコール相において塩化形態で回収されることを可能にする。
【００２９】
それに従って該藻類が第１のステップで塩基性化された水−アルコール混合物を用いて処理される、上記プロセスの特に有利な一変法によると、こうして回収された画分は、無極性相中で、特に脂肪酸が豊富な抽出物を回収することを目的とした様々な操作に付される。
【００３０】
具体的には、塩基性化された水−アルコール混合物は、無極性溶媒を使用した液液抽出ステップへそれをかける前に酸性化される。
【００３１】
そのようなプロセスは、前記無極性溶媒の除去により、前記抽出物を含有する油を回収するステップも含む。
【００３２】
この無極性溶媒は、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンであることが有利であろう。
【００３３】
一般に、任意の抽出操作の前に、該藻類が凍結されることが有利である。好ましくは、凍結は、約−４０℃と−２０℃の間の温度で、好ましくは約１日と７日の間実施される。この先行ステップは、シリカ（藻類細胞の骨格から得られた）のデカンテーションを促進するように、後に抽出溶媒との接触によって熱ショックを与えるために、有利に使用される。次いで、該藻類は、その抽出溶液と接触される。
【００３４】
有利な一変形実施形態によると、凍結された藻類は、加熱抽出溶媒中に直接浸漬される。
【００３５】
藻類の抽出溶媒における室温での浸軟も、有利に実施される。
【００３６】
有利な一変形実施形態によると、該藻類の浸軟は、室温で、好ましくは約５分と８０分の間、より好ましくは約２０分と４０分の間実施される。
【００３７】
さらに別の有利な変形実施形態によると、該抽出は、還流させながら実施される。
【００３８】
さらに別の有利な変形実施形態によると、該抽出は、不活性雰囲気下、好ましくは窒素飽和雰囲気下で実施され得る。このことは、活性分子の顕著な酸化分解を特に回避することを可能にする。
【００３９】
この抽出物は、窒素などの不活性ガス下で、場合により、活性分子を保護するために抗酸化剤も添加して、調節することが有利である。
【００４０】
有利な一変形実施形態によると、使用される抽出溶媒の量は、藻類の乾量として表現される該藻類の量１００ｇについて、約０．１リットルと２０リットルの間、好ましくは約２リットルと１０リットルの間である。
【００４１】
無極性溶媒を用いた抽出ステップの前に、塩基性化された水−アルコール混合物を用いた抽出が行われるプロセスの別の有利な変法によると、上述の藻類抽出物は、そのいくつかを以上に記載した、以下の一連のステップの後に得られる。
ａ）該藻類が、前述の通り凍結され、次いで、抽出溶媒中に浸漬される、
ｂ）該藻類の浸軟が実施される、
ｃ）抽出溶媒が、例えば、水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液を用いて、ｐＨ１０〜１４、好ましくはｐＨ１３に塩基性化される、
ｄ）不溶性物質が、水−アルコール相から除去される、
ｅ）蒸留水が、水−アルコール相へ添加される、
ｆ）こうして得られた水−アルコール溶液は、水−アルコール相と混和しない無極性溶媒、例えば、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンを用いた液液プロセスを介して洗浄される、
ｇ）無極性溶媒を含有する層が除去される、
ｈ）無極性溶媒を含有する層の除去後に回収された水−アルコール相が、例えば、硫酸水溶液又は塩酸水溶液を用いて、ｐＨ１〜３、好ましくはｐＨ２に酸性化される、
ｉ）酸性化後に得られた溶液は、アルコール相又は水−アルコール相と混和しない無極性溶媒、例えば、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンを用いた液液抽出を受ける、
ｊ）次いで、水−アルコール相が除去される、
ｋ）水−アルコール相の除去後に回収された無極性溶媒を含有する層は、本発明によって所望される抽出物である、無極性溶媒を含まない油を得るために、蒸発を受ける。
【００４２】
塩基性化され、次いで酸性化されたアルコールの使用は、化粧用組成物において許容可能な視覚及び嗅覚の特性（黄色、及び許容可能な臭気）を有する抽出物を得ることを可能にする。
【００４３】
本発明の次に有利な実施形態によると、上述の藻類抽出物は、超臨界ＣＯ２を用いて該藻類を抽出することによって得られる。この特定の溶媒の使用は、該藻類が、前もって凍結乾燥されていたことを前提とする。
【００４４】
本発明の他の特徴、目的及び利点は、本発明の範囲を全く制限しないものである実例として単に示す、本発明の複数の実施例、及び比較活性試験、及び化粧用組成物の配合例への参照と共に示す、以下の説明的記載の観点から明白に現れるであろう。
【００４５】
実施例では、別段の定めのない限り、示す割合は、重量パーセントとして表現する。温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧である。
【００４６】
各図は、実施例のセクションＩＩで示す試験を参照しながら示す。それらは、それぞれ、比較すると、以下のものを例示する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】キモトリプシン様活性を示す図である。
【図１Ｂ】ポストグルタミン酸様加水分解酵素活性を示す図である。
【図１Ｃ】トリプシン様活性を示す図である。
【図２Ａ】２４時間での溶解に関して得られた、抗プロテアソームウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図２Ｂ】７２時間での溶解に関して得られた、抗プロテアソームウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図３Ａ】２４時間での溶解に関して得られた、抗ユビキチンウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図３Ｂ】７２時間での溶解に関して得られた、抗ユビキチンウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４Ａ】２４時間での溶解に関する、抗チロシナーゼウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４Ｂ】７２時間での溶解に関する、抗チロシナーゼウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】チロシナーゼ活性の測定値を示す図である。
【図６】免疫沈降試験の結果を示す図である。
【実施例】
【００４８】
［Ｉ．本発明による抽出物の調製］
［実施例１：第１のプロセスに従った、イソプロパノール（ＩＰＡ）などの極性溶媒を用いた抽出］
該プロセスの好ましい様式によると、該抽出全体は、活性分子の顕著な分解を回避するために、不活性雰囲気下（窒素による飽和）で実施する。
【００４９】
この実施例では、２５０ｋｇのバイオマス（フェオダクチルム・トリコルヌーツム）を使用する。
【００５０】
次いで、−２０℃で凍結したこのバイオマスを、撹拌しながら、８０〜８３℃で還流させたイソプロパノール（ＩＰＡ）中に浸漬する。熱ショックは、シリカ（該藻類細胞の骨格から得られた）のデカンテーションを促進する。
【００５１】
使用する溶媒の量は、バイオマス中に含有される水１リットル当たりＩＰＡ１０リットルである。したがって、固形物の割合が３０％の場合、上述の２５０ｋｇのバイオマスは、次のように７５ｋｇの固形物量と１７５ｋｇの水に区分される。この場合、使用するＩＰＡの量は、１７５０ｋｇである。
【００５２】
全体（バイオマス＋ＩＰＡ）を、約８０℃で撹拌しながら３０分還流させ、次いで、約５０℃に冷却する。バイオマス及びＩＰＡを約５０℃に冷却した後、消耗したバイオマス／ＩＰＡ中に溶解した藻類抽出物の分離を実施するために、その全体を、Ｇｕｅｄｕ型の濾過装置へ移す。
【００５３】
該抽出物を、バッチ式反応期中で濃縮する（濃縮係数＝７１．５）。濃縮抽出物は、油状の外観を有する。
【００５４】
次いで、この油性抽出物を、油１ｋｇ当たり溶媒１０ｋｇの割合で、冷ＩＰＡ中に溶解する。撹拌を２０分継続する。次いで、その液体を濾過する（それが残留粘着性スラッジの除去を可能にする）。
【００５５】
脱色及び脱臭処理を、８０リットルＳｃｈｏｔｔ反応器中の２つのバッチで実施し、ゼオライト及び活性炭の添加により、室温で３０分継続する。添加したゼオライト（Ａｂｓｅｎｔ２０００、供給業者ＵＯＰ）の量は０．９４ｋｇであり、活性炭（ＣＸＶ、供給業者ＣＥＣＡ）の量は１．６ｋｇである。炭対ゼオライト比率は、１．７である。
【００５６】
次いで、ゼオライト及び炭を、紙による濾過により除去する。
【００５７】
抗酸化剤（最終重量濃度０．０５％のＤＬ−α−トコフェロール及び最終重量濃度０．０５％のパルミチン酸アスコルビル）を、原液を介してＩＰＡに組み込む。
【００５８】
次いで、抗酸化剤を含有する濾液を、窒素などの不活性ガス下で、茶色の油が得られるまで、バッチ式に濃縮する。
【００５９】
この油は、以下で、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの本発明による抽出物Ｅ１と呼ぶ。
【００６０】
［実施例２：二段階の第２のプロセスに従った抽出］
該抽出は、２５０ｋｇのバイオマス（フェオダクチルム・トリコルヌーツム）から得られた４９．８ｋｇの凍結乾燥質量、すなわち、約２０％の乾燥質量を、９ｋｇの３０．５％水酸化ナトリウム水溶液を用いて塩基性化した９６％無水エタノール５３９ｋｇに分散させることによって開始する。エタノールの還流温度及び窒素雰囲気下での３０分の浸軟後、その全体を１８℃に冷却する。
【００６１】
次いで、不溶性物質を、窒素下での吸引濾過によって分離し、棄却する。
【００６２】
１５１ｋｇの蒸留水を、５７３．９ｋｇの濾液へ添加する。この水−アルコール相を、ゆっくりと１０分撹拌し、次いで、１６２ｋｇのヘプタンを用いた液液プロセスによって洗浄する。液液分配のヘプタン上相を除去する。該抽出の開始時に実施した塩基性化の結果として、塩形態の脂肪酸を含有するので、下相を回収する。ヘプタン洗浄操作を、さらに２回繰り返し、下相を系統的に回収する。
【００６３】
こうして得た７２０ｋｇの下相を、ｐＨを２．２にし、したがって酸の形態の脂肪酸を得るために、２．８ｋｇの硫酸を添加することにより酸性化する。その溶液全体を、窒素下で１０分撹拌し、次いで、この場合は１５８ｋｇのヘプタンの画分によって形成されている無極性溶媒を用いた液液抽出にかける。遊離脂肪酸を含有する５つの画分から得た、合計で６９７ｋｇのヘプタン相を回収するために、該ヘプタン洗浄操作を、さらに５回繰り返す。回転蒸発器上で、次いで分子蒸留によって蒸発乾固したこの相は、本発明による活性抽出物、すなわち、０．６５ｋｇの油量を生じる。
【００６４】
生成した油は、均一な液体であり、暗黄色である。
【００６５】
この油は、以下で、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの本発明による抽出物Ｅ２と呼ぶ。
【００６６】
上述のプロセスに従って得た抽出物Ｅ２は、以下の脂肪酸組成を有する（重量パーセント）。
− ミリスチン酸 ４．１６％
− パルミチン酸 １３．８２％
− パルミトオレイン酸 １６．４８％
− エイコサペンタエン酸 ２４．７５％
− ドコサヘキサエン酸 １．７５％
【００６７】
［ＩＩ．メラノサイトプロテアソーム及びこれらのメラノサイトのチロシナーゼ活性に対する、本発明の抽出物の活性を証明するための試験］
［１．試験の原理］
以下で記載する試験は、本発明の抽出物の、メラノサイトプロテアソームの様々な活性に対する影響を、このプロテアソームの様々な活性を測定することにより特徴づけることを目的としている。
【００６８】
各試験は、本発明の抽出物の、ユビキチンタンパク質の量に対する影響を特徴づけることも目的としている。
【００６９】
各試験は、本発明の抽出物の、チロシナーゼの量及びその活性に対する影響を特徴づけることも目的としている。
【００７０】
このセクションで記載する全ての試験は、上記実施例２に従って調製した抽出物Ｅ２を使用して実施した。
【００７１】
［２．材料及び方法］
［２．１ プロテアソーム活性及びチロシナーゼ活性を分析するためのＭＮＴ１細胞（ヒトメラノサイト細胞株）の処理］
【００７２】
［２．１Ａ：細胞培養］
［使用する試薬を、以下で本文中に規定する。］
ａ）従う手順
［Ｄ０での接種］
・ＭＮＴ１、１０６細胞／直径３５ｍｍのシャーレ、３点
・ＭＮＴ１培地、２ｍＬ／シャーレ（以下の構成を参照）
［Ｄ１での処理］
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ（ウシ血性アルブミン）＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
３７℃で１時間、磁気撹拌子で撹拌する
［− Ｄ４での第２の処理］
＋シクロへキシミド １μｇ／ｍＬ（タンパク合成阻害剤）
＋チロシナーゼ活性を分析するための１２０ｎＭ Ｍｇ１３２。
− ４時間後の溶解物の調製
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた２回のすすぎ洗い
氷のベッド上、掻取りによる１５０μＬの溶解緩衝液での回収。
−２０℃で凍結
− ブラッドフォード法を介したタンパク質分析
− プロテアソーム活性分析
【００７３】
［ｂ）培地及び試薬］
［− ＭＮＴ１培地］
ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：６１９６５−０２６）
＋２０％ＦＣＳ
＋１０％追加ＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ：１２０５５−０９１）
＋１％ピルビン酸ナトリウム １００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ：１２３６０−０３９）
＋１％非必須アミノ酸、ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ：１１１４０−０３５）
【００７４】
［− 原液］
− リノール酸（Ｓｉｇｍａ；Ｌ１０１２）
ＥｔＯＨ中２．８ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５５８５）
ＥｔＯＨ中２．５６ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− フェオダクチルム
ＥｔＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− ビタミンＣ
ＰＢＳ中２５．６ｍｇ／ｍＬ（培地中１％）
− ビタミンＥ
ＥｔＯＨ中２１．５５ｍｇ／ｍＬ（培地中０．１％）
− Ｍｇ１３２（Ｓｉｇｍａ；Ｃ２２１１）
ＤＭＳＯ中１２０μＭ（培地中０．１％）
− シクロへキシミド（Ｓｉｇｍａ；Ｃ７６９８）
【００７５】
［− 溶解緩衝液］
トリス−ＨＣｌ １．５Ｍ、ｐＨ７．５
４５．３７５ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ；Ｔ１５０３）を、２００ｍＬの蒸留水中に溶解する、
１２Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨを７．５に調整し、次いで２５０ｍＬにする
１Ｍスクロース溶液（Ｍｅｒｃｋ；ｒｅｆ．７６５４）
８．５５ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解し、次いで２５ｍＬに調整する。
２ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ７５０６）
６ｍｇを２５ｍＬの蒸留水中に溶解する。
又は、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ５９２１）１２．４ｍｇを２５ｍＬの蒸留水中に溶解する；
４℃で保存する。
４％トリトンＸ１００溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｘ１００）
０．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する（非常にゆっくりと）
０．５ｍＬ分量を採取し、−２０℃で保存する
４０ｍＭ ＰＭＳＦ溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｐ７６２６）
１４ｍｇを２ｍＬの無水エタノール中に溶解する。
５０ｍＬ分量を採取し、４℃で９カ月保存する
０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｌ２８８４；−２０℃で保存）
水溶性。５０μＬ分量を採取し、−２０℃で１カ月保存する。
１Ｍ ＤＬ−ジチオスレイトール溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｄ０６３２；４℃で保存）
０．１５４ｇを１ｍＬの蒸留水中に溶解する。
１０μＬ分量を採取し、−２０℃で保存する。
５００ｍＭＥＤＴＡ四ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．ＥＤ４Ｓ）
３．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する；４℃で保存する。
【００７６】
［− 溶解緩衝液の調製（１００ｍＬ当たり）］
そこから４．３９ｍＬ分量を採取する、−２０℃で保存する不完全な溶液の調製：
【表１】
【００７７】
完全な溶液を、
４．３９ｍＬの不完全溶液
＋５００μＬの４％トリトンＸ１００
＋１０μＬのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１Ｍ
＋５０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン
＋５０μＬの４０ｍＭ ＰＭＳＦ（硫化フェニルメタンスルホニル）
を用いて即時調製する。
酵素活性分析については、ロイペプチンは、プロテアソームの活性を抑制するため、添加しない。
【００７８】
［２．１Ｂ：ブラッドフォード法を介したタンパク質分析］
（刊行物「Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｙｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６）７２：２４８〜２５４を参照）
【００７９】
［ａ）校正範囲量の調製：］
ＢＳＡ原液：５０μｇ／ｍＬ（ＢＩＯＲＡＤ；タンパク質標準試料：ｒｅｆ．５００−０００６）
【表２】
【００８０】
各チューブ中：２００μＬのクーマシーブルーＧ２５０を添加。
クーマシーブルーは、その原液の５倍希釈によって即時調製する。
【００８１】
［ｂ）試料の調製：］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− 溶解緩衝液中の細胞の回収、次いで、超音波処理、次に、タンパク質濃度の分析
タンパク質濃度＞３ｍｇ／ｍＬである場合、１０倍希釈を実施し、次いで、
１００μＬの希釈細胞抽出物
＋７００μＬのＭｉｌｌｉＱ水
＋２００μＬのブルー
を、又は、濃度が低い場合は、
１０μＬの細胞抽出物
＋７９０μＬのＭｉｌｌｉＱ水
＋２００μＬのブルー
を入れる。
− ボルテックスにより撹拌し、５分待ち、次いで、５９５ｎｍで読み取る
【００８２】
［２．１Ｃ：プロテアソーム活性分析］
該細胞を、ＰＢＳを用いて２回すすぎ洗いし、次いで、特定のプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ロイシナール）の存在下及び非存在下で、各活性に特異的な蛍光原ペプチド基質を使用して、プロテアソームの各ペプチダーゼ活性を測定する。ペプチド基質生成物は、以下のものである。キモトリプシン様活性についてはＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ａｍｃ（ＬＬＶＹ−ａｍｃ）、ポストグルタミン酸加水分解酵素活性についてはＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ｎａ（ＬＬＥ−ｎａ）及びトリプシン様活性についてはＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ａｍｃ（ＬＳＴＲ−ａｍｃ）。分析の原理は、蛍光原ペプチドからの蛍光体アミノメチルクマリン又はβ−ナフチルアミンの放出が原因の、蛍光の増加を経時的に監視することにある。
【００８３】
［ａ）ＬＬＶＹ活性（キモトリプシン様）］
［ａ．１−原理］
プロテアソーム
（ＬＬＶＹ活性
（キモトリプシン様））
Ｎ−サクシニル−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ−−−−−→Ｎ−サクシニル−ＬＬＶＹ＋蛍光ＭＣＡ
３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長での、分光蛍光計を用いた読み取り。
【００８４】
［ａ．２−試薬］
− ＴＲＩＳ２５ｍＭ緩衝液ｐＨ７.５
− ７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ａ９８９１）
２０ｍＭ原液（３．５ｍｇ／１ｍＬ ＤＭＳＯ）
− 蛍光原基質：Ｎ−サクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｓｉｇｍａ：Ｓ６５１０）
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液
【００８５】
［ａ．３−ＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン）校正範囲量］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− ＭＣＡ原液を、ＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈する。
− ９６ウェルプレート中で、各量を２点分配する。
【表３】
− ブランク液の調製：２００μＬのＴＲＩＳ緩衝液。
− ３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計上で読み取る。３５５ｎｍ及び４６０ｎｍ、利得４０で、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）を用いる。
【００８６】
［ａ．４−ＬＬＶＹ活性（キモトリプシン様）の分析］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− ９６ウェルプレート中に、一定容積の細胞溶解物（２０μｇのタンパク質に相当すべき、各試料の最低タンパク質濃度から求める）を２点導入し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。
− ＴＲＩＳ緩衝液中で２５μＭに予め希釈した１００μＬのＬＬＶＹ−ＭＣＡ基質（最終１２．５μＭ）を添加する。
− ３５５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長、利得４０で、２分毎に３０分、分光蛍光計を読み取る。
【００８７】
［ａ．５−結果］
未加工の結果を、Ｆ．Ｕ．／分で表現し、Ｆ．Ｕ.は、蛍光単位で表現される、その装置によって与えられた値を示す。
該分析を、溶解物のタンパク質濃度の関数として設定した容積Ｖの細胞溶解物を含有する、２００μＬの反応物容積について実施する。
即時分析したタンパク質を、μｇ／μＬで表す。
【００８８】
校正範囲量から、該活性は、以下の通り、放出されたＭＣＡのｐｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇで表現し得る。
【数１】
【００８９】
［ｂ−ＬＬＥ活性（ポストグルタミン酸加水分解酵素））］
［ｂ．１−原理］
以下の切断反応を研究した。
プロテアソーム
（ＬＬＥ活性
（ポストグルタミン酸加水分解酵素）
Ｎ−ＣＢＺ−ＬＬＥ−ＮＡ−−−−−−−−−−−→Ｎ−ＣＢＺ−ＬＬＥ−＋ＮＡ蛍光
３３３ｎｍの励起波長及び４１０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計を読み取る。
【００９０】
［ｂ．２−試薬］
− ２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．５
− β−ナフチルアミド（ＮＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ｎ８３８１）
２０ｍＭ原液（５．７３ｍｇ／２ｍＬ ＤＭＳＯ）
− 蛍光原基質Ｎ−ＣＢＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−β−ナフチルアミド（Ｓｉｇｍａ：Ｃ０７８８）
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液
【００９１】
［ｂ．３−ＮＡ（β−ナフチルアミド）校正範囲量］
校正を、以下の通り実施する。
− ＮＡ原液を、ＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈する。
− ９６ウェルプレート中で、各量を２点分配する。
以下の表に示す通りである。
【表４】
− ブランク液の調製：２００μＬのＴＲＩＳ緩衝液。
− ３３３ｎｍの励起波長及び４１０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計上で読み取る。３４０ｎｍ及び４１０ｎｍ、利得８３で、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）を用いる。
【００９２】
［ｂ．４−ＬＬＥ活性（ポストグルタミン酸加水分解酵素）の分析］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− ９６ウェルプレート中に、一定容積の細胞溶解物（２０μｇのタンパク質に相当すべき、各試料の最低タンパク質濃度から求める）を２点導入し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。
− ＴＲＩＳ緩衝液中で３００μＭに予め希釈した１００μＬのＬＬＥ−ＮＡ基質（最終１５０μＭ）を添加する。
− ３４０ｎｍの励起波長及び４１０ｎｍの発光波長、利得８３で、２分毎に３５分、分光蛍光計を読み取る。
【００９３】
［ｂ．５−結果］
未加工の結果を、Ｆ．Ｕ．／分で表現する。
該分析を、溶解物のタンパク質濃度の関数として設定した容積Ｖの細胞溶解物を含有する、２００μＬの反応物容積について実施する。
即時分析したタンパク質を、μｇ／μＬで表す。
校正範囲量から、該活性は、以下の通り、放出されたＭＣＡのｐｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇで表現し得る。
【数２】
【００９４】
［ｃ）ＬＳＴＲ活性（トリプシン様）］
［ｃ．１−原理］
プロテアソーム
（ＬＳＴＲ活性
（トリプシン様））
Ｎｔ Ｂｏｃ ＬＳＴＲ−ＭＣＡ−−−−−−−→Ｎｔ Ｂｏｃ ＬＳＴＲ＋蛍光ＭＣＡ
３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長で分光蛍光計を読み取る。
【００９５】
［ｃ．２−試薬］
− ２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．５
− ７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ａ９８９１）
２０ｍＭ原液（３．５ｍｇ／１ｍＬ ＤＭＳＯ）
− 蛍光原基質：Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ７−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｓｉｇｍａ：Ｂ４６３６）
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液
プロテアソーム阻害剤：Ｍｇ１３２（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）（Ａｆｆｉｎｉｔｙ、ＺＷ８４４０）
ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ原液
【００９６】
［ｃ．３−ＭＣＡ校正範囲量］
校正曲線を、以下の通りプロットする（以下の表参照）。
− ＭＣＡ原液を、ＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈する。
− ９６ウェルプレート中で、各量を２点分配する。
【表５】
− ブランク液の調製：２００μＬのＴＲＩＳ緩衝液。
− ３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計上で読み取る。３５５ｎｍ及び４６０ｎｍ、利得３０で、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）を用いる。
【００９７】
［ｃ．４−ＬＳＴＲ活性の分析］
− ９６ウェルプレート中に、一定容積の細胞溶解物（５０μｇのタンパク質に相当すべき、各試料の最低タンパク質濃度から求める）を２点導入し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。
− ＴＲＩＳ緩衝液中で８０μＭに予め希釈した１００μＬのＬＳＴＲ−ＭＣＡ基質（最終４０μＭ）を添加する。
− 並行して、阻害剤Ｍｇ１３２を試験することにより、それが実際にプロテアソーム活性であることを確認する。
− ５０μｇのタンパク質に、ＴＲＩＳ緩衝液中で４００μＭに予め希釈した１０μＬのＭｇ１３２の溶液（最終２０μＭ）を添加し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。次に、ＴＲＩＳ緩衝液中で８０μＭに予め希釈した１００μＬのＬＳＴＲ基質（最終４０μＭ）を添加する。
− ３５５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長、利得３０で、２分毎に３０分、分光蛍光計を読み取る。
【００９８】
［ｃ．５−結果］
未加工の結果を、Ｆ．Ｕ．／分で表現する。
該分析を、溶解物のタンパク質濃度の関数として設定した容積Ｖの細胞溶解物を含有する、２００μＬの反応物容積について実施する。
即時分析したタンパク質を、μｇ／μＬで表す。
校正範囲量から、該活性は、以下の通り、放出されたＭＣＡのｐｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇで表現し得る。
【数３】
【００９９】
［２．１Ｄ：チロシナーゼ活性の測定］
分析の原理
該分析は、チロシナーゼのドーパ−オキシダーゼ活性の測定に基づく。該分析の原理は、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）上で４７５ｎｍで吸収する、ドーパクロムの検出に基づく。
【０１００】
材料：
− 溶解緩衝液
− 基質：Ｌ−ドーパの自動酸化が原因で即時調製する、ＰＢＳ中の１０ｍＭでのＬ−ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ−９６２８、ＭＷ１９７．２）。
【０１０１】
培地中のヒトメラノサイトを、２５μＭのリノール酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は２５μＭのパルミチン酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は５μｇ／ｍＬのフェオダクチルム（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）を用いて、１％ＢＳＡ、５０μＭビタミンＥ及び１ｍＭビタミンＣを含有するＭＮＴ１培地中で処理した。メラノサイトを、処理の７２時間後に回収し、溶解した。次いで、５０μｇの抽出物を、１ｍＭのＬ−ドーパミンを用いて、３７℃で１時間インキュベートする。チロシナーゼ活性の測定を、サーモスタットで３７℃に維持したマイクロプレートリーダーを使用して、４７５ｎｍで２分毎に実施する。
【０１０２】
ドーパ−オキシダーゼ活性を、タンパク質のＯＤ／分／ｍｇとして得る。ブランク液を、Ｌ−ＤＯＰＡの存在下で、溶解緩衝液を用いて調製する。
【０１０３】
［２．２ プロテアソーム、ユビキチンタンパク質及びチロシナーゼをウェスタンブロット法によって分析するための、ＭＮＴ１の処理］
【０１０４】
［２．２Ａ：細胞培養］
［ａ）手順：］
［Ｄ０での接種］
１０６個のＭＮＴ１細胞／直径３５ｍｍのシャーレ、４点
ＭＮＴ１培地中、２ｍＬ／シャーレ
［Ｄ１での処理］
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ウシ血性アルブミン（ＢＳＡ）＋ビタミンＥ（ビタミンＥ）５０μＭ＋ビタミンＣ（ビタミンＣ）１ｍＭ
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
＋１２０ｎＭ Ｍｇ１３２
３７℃で１時間、磁気撹拌子で撹拌する
［Ｄ２、Ｄ３及びＤ４での溶解物の調製］
ＰＢＳを用いた２回のすすぎ洗い
掻取りによる、１５０μＬのＬａｅｍｍｌｉ２×緩衝液＋１％ＤＴＴ（１０ｍＭ）中の細胞叢の回収。
２つのシャーレ／Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ
−２０℃で凍結
［タンパク質分析（ブラッドフォード）及びウェスタンブロット法］
該タンパク質分析法は、以前使用したものと同じであり、ウェスタンブロット法である。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブでタンパク質を分析した後、１μｇ／μＬのタンパク質を得るために、各試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ２×緩衝液で希釈する。これらの試料溶液に、１０×ブロモフェノールブルーを添加する。各試料は、−２０℃で凍結し得る。
【０１０５】
［ｂ）培地及び試薬］
［− ＭＮＴ−１培地］
ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：６１９６５−０２６）
＋２０％ＦＣＳ
＋１０％追加ＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ：１２０５５−０９１）
＋１％ピルビン酸ナトリウム １００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ：１２３６０−０３９）
＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ：１１１４０−０３５）
【０１０６】
［− 原液］
− リノール酸（Ｓｉｇｍａ；Ｌ１０１２）
ＥｔＯＨ中２．８ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５５８５）
ＥｔＯＨ中２．５６ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− フェオダクチルム
ＥｔＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− ビタミンＣ
ＰＢＳ中２５．６ｍｇ／ｍＬ（培地中１％）
− ビタミンＥ
ＥｔＯＨ中２１．５５ｍｇ／ｍＬ（培地中０．１％）
− Ｍｇ１３２（Ｓｉｇｍａ；Ｃ２２１１）
ＤＭＳＯ中１２０μＭ（培地中０．１％）
【０１０７】
［− 溶解緩衝液］
１Ｍ ＤＬ−ジチオスレイトール溶液（４℃で保存したＳｉｇｍａ：ｒｅｆ．Ｄ０６３２）
０．１５４ｇを、１ｍＬの蒸留水中に溶解する。
１０μＬ分量を採取し、−２０℃で保存する。
［− Ｌａｅｍｍｌｉ２×試料還元緩衝液（変性剤）］
トリス−ＨＣｌ０．０６Ｍ ｐＨ６．８；ＳＤＳ２．３％；グリセロール１０％
−濃縮ゲル緩衝液 トリス０．５Ｍ ｐＨ６．８ ６．２５ｍＬ
−ＳＤＳ １０％ １１．５０ｍＬ
−グリセロール ５ｍＬ
−５０ｍＬにするための蒸留水
【０１０８】
［２．２Ｂ：ウェスタンブロット］
［ａ）試料の調製及び電気泳動］
タンパク質の電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉ法（１９７０）に従って、変性及び還元条件下で、バッチ緩衝液において、厚さ１ｍｍ〜１．５ｍｍのポリアクリルアミドミニゲル中で実施する。１２％Ｔ、２．７％Ｃを含有するゲルは、２０〜１２０ｋＤａの範囲の低分子量タンパク質の分離を可能にする。８％Ｔ；２．７％Ｃを含有するゲルは、３５〜２５０ｋＤａの高分子量タンパク質の分離を可能にする。
【０１０９】
該ゲルを生成するのに必要な全ての溶液は、以下の付属書Ａに提示する。
【０１１０】
［− 分離ゲル］
このゲルは、前日又は当日、ただしいずれの場合も、移動の１〜２時間前に注入し得る。
【０１１１】
該ゲルの注入を、ピペットを使用して、濃縮ゲルのために用意したコームの底から最大で約０．５ｍｍまで実施する。
【０１１２】
均一な基線（±１ｍＬ／ゲル）を得るために、無水エタノールを、表面へ穏やかに添加する。
【０１１３】
［− 濃縮ゲル（スタッキングゲル）］
該エタノールを除去する。
ポリエチレンのパスツールホールピペット（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．２２３−９５２８）を使用して、２．５ｍＬのゲルを注入し、次いで、コームを挿入する。１時間後、該ゲルは重合する。
【０１１４】
［試料の調製］
シャーレから細胞を回収する前に、該細胞を、ＰＢＳを用いて２回すすぎ洗いする。最後のすすぎ洗い後、ＰＢＳを可能な限り除去する。掻取りにより、該細胞を、Ｌａｅｍｍｌｉ２×緩衝液＋１０ｍＭ ＤＴＴ（以下の付属書Ａを参照）に回収する（５×１０６細胞／溶解緩衝液の最小ｍＬ）。１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した溶解物を、−２０℃で凍結する。
【０１１５】
電気泳動を実施する前に、解凍した溶解物を、９５℃で１０分加熱し、タンパク質を分析する。
【０１１６】
タンパク質分析を、分離ゲルの重合の間、又は前日に実施する（付属書Ｃを参照）。
【０１１７】
タンパク質≦１μｇ／μＬの同一の溶液を得るために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、各試料をＬａｅｍｍｌｉ２×緩衝液で希釈する。これらの試料溶液に、１０×ブロモフェノールブルーを添加する。
【０１１８】
［適用］
各試料を、９５℃で５分加熱する。
【０１１９】
適用する容積は、タンパク質の所望の量（最大容積＝１ｍｍのゲルについて２５μＬ、１．５ｍｍのゲルについて４０μＬ）に応じて異なる。１０μｇのタンパク質、すなわち１０μＬは、基準量であり、次いで、標的タンパク質の発現に応じて、それを適用する。
【０１２０】
コームを除去する。２００ｍＬの１×移動緩衝液を、耐漏えい性を確実にするように注意しながら、該ゲル上、２つのゲルの間の中央区画へ、次いで、石英セルへ注入する。
【０１２１】
マイクロピペット上の適合させたテーパーチップ、及び１０μＬの染色済み分子量対照（Ｂｉｏｒａｄ、Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ；ｒｅｆ．１６１−０３０５）又は（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｕｌｌ Ｒａｎｇｅ Ｒａｉｎｂｏｗ；ｒｅｆ．ＲＰＮ８００Ｗ）も使用して、各試料を適用する。
【０１２２】
［移動］
電気泳動を、室温で２００Ｖで実施する。移動前端がゲルを離れたときに（約４０分の移動）、電気泳動を停止する。
【０１２３】
［ｂ）膜上へのタンパク質のセミドライ転写］
濾紙の２枚の厚手シート（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．１７０３３９６０）及びセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．１６２−０１１５）を、この方法の原点である、Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９）の転写緩衝液中へ浸漬する（付属書Ｂを参照）。
【０１２４】
セミドライ転写装置（Ｂｉｏｒａｄ）において、濾紙の湿らせた厚手シートを陽極上に置く。
【０１２５】
移動が完了すると、濃縮ゲルを除去し、分離ゲルをセルロース膜へ適用する。該膜及びゲルを、濾紙の該シート上に置く。濾紙の２枚目のシートを、ゲルへ適用する。
【０１２６】
「サンドイッチ」の製造の間、転写を引き起こすものであるため、全ての気泡を、ガラスステムを使用して除去しなければならない。該装置を、陰極を形成する蓋で閉じる。
【０１２７】
該タンパク質転写を、１０Ｖで１時間３０分実施する。
【０１２８】
［ｃ）ポンソーレッドを用いたマーキング］
転写の質を確認するために、ポンソーレッド（Ｓｉｇｍａ；Ｐ７１７０）を用いてタンパク質を染色する。
【０１２９】
セルロース膜を、ＭｉｌｌｉＱ水を用いてすすぎ洗いし、次いで１×ポンソーレッド浴中に、撹拌しながら１０分浸漬する。次いで、染色剤がタンパク質バンド上にのみ残るようになるまで、該膜を、複数のＭｉｌｌｉＱ水浴中で洗浄する。
【０１３０】
該膜を、プラスチック中へ挿入し、走査する。
【０１３１】
タンパク質バンドは、転写されたタンパク質の合計量を求めるために、定量化し得る。
【０１３２】
［ｄ）非特異的結合部位の遮断］
以下の付属書Ｂで調製するＰＢＳ−Ｔ緩衝液（２０ｍＬ／膜）中の５％脱脂乳（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）から形成される非特異的結合部位を遮断するための溶液において、該膜を、４℃で終夜、又は室温で１時間３０分撹拌する。
【０１３３】
［ｅ）免疫検出］
抗体の基準品及び最適な希釈度は、以下の付属書Ｄに示す。
【０１３４】
非特異的部位を遮断した後、該膜を、ＰＢＳ−Ｔ中で急速にすすぎ洗いする。
【０１３５】
次に、この膜を、ＰＢＳ−Ｔ中で最適な濃度に希釈した一次抗体と、該抗体に応じて５％乳（ｍ／ｖ）あり又はなしで、撹拌しながら室温で１時間、又は４℃で終夜接触させる。
【０１３６】
次いで、過剰な遊離非結合抗体を除去するために、該膜を、ＰＢＳ−Ｔ中で急速に３回、１０分すすぎ洗いする。
【０１３７】
次に、該膜を、ＰＢＳ−Ｔ又は５％ミルク（５ｍＬ）で希釈した適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体と、室温で撹拌しながら接触させる。
【０１３８】
４５分インキュベートした後、該膜を急速に２回すすぎ洗いし、次いで、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液を用いて５回、５分、最後には１×ＰＢＳ中で洗浄する。
【０１３９】
排出後、該膜を、「タンパク質」側を上にして、キッチンフィルム（ＳＡＲＡＮ）上に置く。
【０１４０】
ルミノールをペルオキシダーゼ基質として用いながら高感度化学発光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｒｅｆ．ＲＰＮ２２０９）を使用して、該膜を明らかにする。ペルオキシダーゼ及び増幅剤の作用下で、ルミノールは酸化し、一時的な励起状態となる。基底状態への回復は、該膜上にあるオートラジオグラフィーフィルムに当たる、光子の放出により生じる。
【０１４１】
該検出キットの２つの溶液各１ｍＬを混合する（２ｍＬ、該膜を被覆するのに必要な最低容積）。
【０１４２】
直ちに、その混合物を、該膜上へ均一に注入し、室温で正確に１分接触させる。
【０１４３】
排出した膜を、Ｓａｒａｎキッチンフィルムの下で密封し、光から保護したカセットへ置き、次いで、プレフラッシュしたオートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ ｒｅｆ．ＲＰＮ２１０３Ｋ）を用いて被覆する。
【０１４４】
５分の曝露後、該オートラジオグラフィーフィルムを現像する。所望の信号を最適化するために、必要であれば、新しいフィルムを再曝露する（最大で１時間）。
【０１４５】
該バンドを、Ｇｅｌｓ Ａｎａｌｙｓｔｓ３．０１ソフトウェアによって定量化する。
【０１４６】
［２．３ チロシナーゼの免疫沈降を実施するためのＭＮＴ−１タンパク質抽出物の調製］
［２．３Ａ：細胞培養］
［ａ）手順］
【０１４７】
［Ｄ０での接種］
１０６個のＭＮＴ１細胞／直径３５ｍｍのシャーレ、３点
ＭＮＴ１培地中２ｍＬ／シャーレ
【０１４８】
［Ｄ１での処理］
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ２．５及び５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ２．５及び５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ１ｍＭ
＋１２０ｎＭ Ｍｇ１３２
【０１４９】
［３７℃で１時間、磁気撹拌子で撹拌する］
溶解物の調製及びＤ２での計数
ＰＢＳを用いた２回のすすぎ洗い
氷のベッド上、
１５０μＬの溶解緩衝液での回収
掻取りによる。
−２０℃で凍結
ＰＢＳを用いたすすぎ洗い
＋０．５ｍＬ トリプシン／ＥＤＴＡ
＋０．５ｍＬ ＰＢＳ＋１０％ＦＣＳ
【０１５０】
［Ｚ２計数機上での計数］
０．５ｍＬの懸濁液＋１０ｍＬ Ｉｓｏｔｏｎ上
【０１５１】
［ｂ）培地及び試薬］
［− ＭＮＴ１培地］
ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：６１９６５−０２６）
＋２０％ＦＣＳ
＋１０％追加ＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ：１２０５５−０９１）
＋１％ピルビン酸ナトリウム １００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ：１２３６０−０３９）
＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ：１１１４０−０３５）
【０１５２】
［− 原液］
− リノール酸（Ｓｉｇｍａ；Ｌ１０１２）
ＥｔＯＨ中２．８ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５５８５）
ＥｔＯＨ中２．５６ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− フェオダクチルム
ＥｔＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− ビタミンＣ
ＰＢＳ中２５．６ｍｇ／ｍＬ（培地中１％）
− ビタミンＥ
ＥｔＯＨ中２１．５５ｍｇ／ｍＬ（培地中０．１％）
− Ｍｇ１３２（Ｓｉｇｍａ；Ｃ２２１１）
ＤＭＳＯ中１２０μＭ（培地中０．１％）
【０１５３】
［− 溶解緩衝液］
トリス−ＨＣｌ １．５Ｍ、ｐＨ７．５
４５．３７５ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ；Ｔ１５０３）を、２００ｍＬの蒸留水中に溶解する、
１２Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨを７．５に調整し、次いで２５０ｍＬにする
１Ｍスクロース溶液（Ｍｅｒｃｋ；ｒｅｆ．７６５４）
８．５５ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解し、次いで２５ｍＬに調整する。
２ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ７５０６）
６ｍｇを２５ｍＬの蒸留水中に溶解する。
又は、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ５９２１）１２．４ｍｇを、２５ｍＬの蒸留水中に溶解する；
４℃で保存する。
４％トリトンＸ１００溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｘ１００）
０．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する（非常にゆっくりと）
０．５ｍＬ分量を採取し、−２０℃で保存する
４０ｍＭ ＰＭＳＦ溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｐ７６２６）
１４ｍｇを２ｍＬの無水エタノール中に溶解する。
５０ｍＬ分量を採取し、４℃で９カ月保存する
０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｌ２８８４；−２０℃で保存）
水溶性。５０μＬ分量を採取し、−２０℃で１カ月保存する。
１Ｍ ＤＬ−ジチオスレイトール溶液（４℃で保存したＳｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｄ０６３２）
０．１５４ｇを１ｍＬの蒸留水中に溶解する。
１０μＬ分量を採取し、−２０℃で保存する。
５００ｍＭのＥＤＴＡ四ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．ＥＤ４Ｓ）
３．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する；４℃で保存する。
【０１５４】
［− 溶解緩衝液の調製（１００ｍＬ当たり）］
そこから４．３９ｍＬ分量を採取する、−２０℃で保存する不完全な溶液の調製：
【表６】
【０１５５】
完全な溶液を、
４．３９ｍＬの不完全溶液
＋５００μＬの４％トリトンＸ１００
＋１０μＬの１Ｍ ＤＴＴ
＋５０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン
＋５０μＬの４０ｍＭでのＰＭＳＦ
を用いて即時調製する。
【０１５６】
酵素活性分析については、ロイペプチンは、プロテアソームの活性を抑制するため、添加しない。
【０１５７】
［２．３Ｂ：免疫沈降の手順］
培地中のヒトメラノサイトを、２５μＭのリノール酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は２５μＭのパルミチン酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は５μｇ／ｍＬのフェオダクチルム（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）を用いて、１％ＢＳＡ、５０μＭビタミンＥ及び１ｍＭビタミンＣを含有するＭＮＴ１培地中で処理した。該メラノサイトを、処理の２４又は７２時間後に回収し、溶解する。
【０１５８】
溶解物（５００μｇのタンパク質）を、１０μＬの抗チロシナーゼ抗体（チロシナーゼＡｂ−１モノクローナル抗体（クローンＴ３１１）Ｌａｂ ｖｉｓｉｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は抗ユビキチンモノクローナル抗体（抗モノユビキチンモノクローナル（ＳＣ−８０１７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））を用いて、４℃で１時間インキュベートした。次いで、この混合物を、５０μＬのＡ−セファロースタンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７−５２８０−０１）を用いて処理し、４℃で１６時間インキュベートした。次いで、該混合物を、１０００×ｇで５分遠心分離する。そのペレットを洗浄し、２００μＬのＰＢＳ、１％ＮＰ４０（（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳ１９６２８）を用いて再懸濁し、１０００×ｇで５分遠心分離した。３回の連続洗浄後、そのペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に置き、次いで、ニトロセルロース膜上へ転写させた。次いで、該膜を、抗チロシナーゼモノクローナル抗体を用いて、１時間インキュベートした（チロシナーゼＡｂ−１モノクローナル抗体（クローンＴ３１１）Ｌａｂ ｖｉｓｉｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（１／２０００）。ウェスタンブロット法を、ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体（１／５０００）、及びＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＮＡ９３１０）によって展開した。
【０１５９】
［３．結果］
［３．１ 藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物をＭＮＴ−１メラノサイト株へ添加することにより誘発される、プロテアソーム活性の調節］
藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物のメラニン合成に対する影響を特徴づけるために、ＭＮＴ−１株のメラノサイト細胞の様々な培地を調製した（藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物、脂肪酸、又はプロテアソーム依存性タンパク質分解阻害剤Ｍｇ１３２を追加、又は別の方法で有する培地）。
【０１６０】
先に概要を述べたように、以前の研究は、プロテアソームによるチロシナーゼの分解を促進することにより、リノール酸の存在下でのメラノサイト培養が、メラニンの量の減少につながったこと、及び、パルミチン酸の存在下で調製した同じ培養が、逆の効果をもたらしたことを明らかにした。皮膚色素沈着を制御する、メラニン合成の制限酵素であるチロシナーゼの活性に対する藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の影響を特徴づけるために、これらの２つの化合物（リノール酸及びパルミチン酸）を、それぞれ、正及び負の対照として使用した。ＭＮＴ−１メラノサイト株のこれらの同一の細胞抽出物から、プロテアソーム活性の研究を実施した。プロテアソーム２０Ｓの３つの触媒部位に特異的な蛍光原性の合成基質ペプチドを使用して、プロテアソーム活性を測定した。
【０１６１】
並行して、特異的抗体を使用して、ウェスタンブロット法により、プロテアソームの２０Ｓ及び２６Ｓの形態を定量化した。
【０１６２】
プロテアソーム活性の分析のために、該細胞を、細胞処理の７２時間後に溶解し、タンパク質濃度を求めた。
【０１６３】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示した結果は、藻類抽出物（Ｐｈ）又はリノール酸の添加７２時間後に、蛍光原ペプチドを使用して測定したプロテアソームの３つのペプチダーゼ活性が増加、及び著しく増加したことを示す（キモトリプシン様、ポストグルタミン酸加水分解酵素及びトリプシン様活性）。
【０１６４】
さらに、パルミチン酸を用いて７２時間処理したメラノサイトでは、２つのペプチダーゼ活性（キモトリプシン様及びポストグルタミン酸加水分解酵素活性）が低減している。プロテアソーム依存性タンパク質分解阻害剤Ｍｇ１３２の存在下で培養したＭＮＴ−１株の細胞抽出物を使用して測定したプロテアソーム活性は、正の対照としての役割を果たす。これらの全ての結果を、付属書の表１にまとめる。
【０１６５】
プロテアソームのペプチダーゼ活性のこの活性化の原因を求めるために、本発明者らは、ウェスタンブロット技法を介して、ＭＮＴ−１の溶解物から、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物、脂肪酸、又はプロテアソーム依存性タンパク質分解阻害剤Ｍｇ１３２を用いたそれらの処理の２４時間及び７２時間後に得たホモジネート中のプロテアソームの量を評価した。
【０１６６】
図２Ａ及び２Ｂに示した結果は、これらの処理が、細胞抽出物中のプロテアソームの量を変えないことを示す。
【０１６７】
これらの結果は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物又はリノール酸を用いたプロテアソーム活性の刺激が、ＭＮＴ−１メラノサイト株の細胞におけるプロテアソームの２０Ｓ又は２６Ｓの形態の発現又は分布を変えないことを示す。
【０１６８】
［３．２ 藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物のＭＮＴ−１メラノサイト株への添加後の、ユビキチン修飾タンパク質の状態］
本発明者らは、脂肪酸又は該藻類抽出物を用いた処理の２４時間又は７２時間後に、ユビキチンタンパク質のレベル（図３Ａ、３Ｂ）が、プロテアソーム阻害剤Ｍｇ１３２の存在下で細胞を培養した場合を除いて、変わらなかったことを示した。
【０１６９】
これらの観察は、ユビキチン化機構が、該藻類又はリノール酸を用いた処理によって影響されなかったことを証明する。
【０１７０】
［３．３ 藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物のＭＮＴ−１メラノサイト株への添加によって誘発される、チロシナーゼの発現及び活性の調節］
これらの様々な条件下で培養したＭＮＴ−１メラノサイトの細胞抽出物を用いて、「材料及び方法」セクションで規定した手順によって開始し、チロシナーゼの量及びその活性に対する、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の影響を特徴づけた。
【０１７１】
本発明者らは、フェオダクチルム・トリコルヌーツム又はリノール酸を用いたＭＮＴ−１メラノサイトの処理の２４時間又は７２時間後に、チロシナーゼにおける有意な減少が観察されたこと（図４Ａ及び４Ｂ）、及び該細胞を、プロテアソーム阻害剤であるＭｇ１３２を用いて処理すると、この減少が逆転され得ることを示した。
【０１７２】
本発明者らは、Ｉｍａｇｅ ｍａｓｔｅｒ １Ｄソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してこの減少を定量化し、その結果を、表２及び３に示している。
【０１７３】
これらの予備的観察は、チロシナーゼがプロテアソームの生理学的基質であり、その分解が、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物によって活性化され得ることを証明する。
【０１７４】
第１段階では、ＭＮＴ−１株の細胞抽出物に適用可能な、チロシナーゼ活性の分析のための特異的技法の展開に着手した。本発明者らは、フェオダクチルム・トリコルヌーツム又はリノール酸を用いたＭＮＴ−１メラノサイトの処理の７２時間後の細胞におけるチロシナーゼ活性を測定し、本発明者らは、この活性における有意な減少を観察した（図５及び表４）。
【表７】
【０１７５】
表２：２４時間でのチロシナーゼの定量化
【表８】
【０１７６】
表３：７２時間でのチロシナーゼの定量化
【表９】
【０１７７】
表４：７２時間でのチロシナーゼ活性
プロテアソーム基質チロシナーゼが、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物を用いて処理したＭＮＴ−１株のメラノサイト細胞の抽出物においてより良好に分解したことを確認するために、７２時間での免疫化学的検出及び免疫沈降によって、チロシナーゼ及びユビキチン結合形態のチロシナーゼの定性的及び定量的研究を実施した（図６）。これらの結果は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物を用いて処理した細胞においては、チロシナーゼが、急速に分解するため、ユビキチン化形態で蓄積しないことを示す。
【０１７８】
［ＩＩＩ．化粧用組成物の例］
濃度を重量パーセントで表す。
以下の例で使用する抽出物は、抽出物Ｅ２である。
【０１７９】
［１．エマルジョンゲル形態の脱色用美容デイクリーム］
【表１０】
上記エマルジョンゲルの使用は、程度の差はあっても強烈な日光の放射、又は直射日光にさえ曝されている人々が、色白の状態を維持し、色素沈着斑の出現を回避することを可能にする。
【０１８０】
［２．日焼け止め液体化粧用組成物（ＳＰＦ３０）］
【表１１】
【０１８１】
この組成物は、強烈な日光へ曝されている間に色素沈着斑の出現を生じる傾向がある個人の場合、その現象を予防する。高濃度の日焼け止めの存在が、メラニンのレベルの減少の結果である、天然の保護の減少を補うことに注意されたい。
【０１８２】
［３．肌色を明るくするための美容フェイスローション］
【表１２】
この美白ローションは、化粧を落として皮膚を洗浄した後で使用する。
【０１８３】
［４．顔用の美容液］
【表１３】
この高濃度液組成物１滴を、一般に、フェイスクリームの適用前に、顔へ適用する。この液は、肌色の明るさを得る又は維持するために、通常、１〜２週間の治療で使用する。
【０１８４】
［５．体毛を明色化するための美容ローション］
【表１４】
このローションは、明色化する有毛領域、特に腕へ、毛が徐々に明色化するようにするのに十分な時間適用する。
【０１８５】
［６．斑点予防美容ハンドクリームゲル］
【表１５】
このクリームは、手の上の斑点（日光性及び／又は老人性色素斑）へ、その色を薄めるために直接適用すべきである。
【０１８６】
［付属書Ａ］
Ｉ−バッチ緩衝液において、変性及び還元条件下での電気泳動ゲルに使用する緩衝液及び溶液
【０１８７】
［モノマー溶液：］
アクリルアミド／ビス−アクリルアミド、３０％Ｔ、２．６７％Ｃ（Ｂｉｏｒａｄ；ｒｅｆ．１６１−０１５８）
【０１８８】
分離ゲル緩衝液：トリス−ＨＣｌ １．５Ｍ ｐＨ８．８。
− 蒸留水１００ｍＬ当たり１８．１５ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ；Ｔ１５０３）
− １２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを８．８に調整する
【０１８９】
濃縮ゲル緩衝液：トリス−ＨＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ６．８。
− 蒸留水１００ｍＬ当たり６ｇのトリス塩基
− １２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを６．８に調整する
１０×移動緩衝液：トリス０．２５Ｍ ｐＨ８．３、グリシン１．９２Ｍ；ＳＤＳ１％
− トリス塩基 １２ｇ
− グリシン ５７．６ｇ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．；５０３７Ｇ）
− ＳＤＳ１０％（Ｓｉｇｍａ；Ｌ５７５０） ４０ｍＬ
− ４００ｍＬにするための蒸留水
これらの溶液を４℃で保存する。
【０１９０】
１０％、すなわち１００ｍｇ／ｍＬでの過硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８：（Ｓｉｇｍａ；Ａ１４３３）
一定分量に分けて、−２０℃で保存する
【０１９１】
Ｌａｅｍｍｌｉ２×還元試料緩衝液：トリス−ＨＣｌ０．０６Ｍ ｐＨ６．８；ＳＤＳ２．３％；グリセロール１０％；ブロモフェノールブルー０．０２％
− 濃縮ゲル緩衝液 トリス０．５Ｍ ｐＨ６．８ ６．２５ｍＬ
− ＳＤＳ１０％ １１．５０ｍＬ
− グリセロール ５ｍＬ
− ５０ｍＬにするための蒸留水
【０１９２】
１０×ブロモフェノールブルー（飽和溶液）：
スパーテルチップ一杯（ｓｐａｔｕｌａ ｔｉｐｆｕｌ）のブロモフェノールブルーを、５ｍＬのＬａｅｍｍｌｉ２×緩衝液中に入れ、撹拌し、超音波処理し、遠心分離し、その上澄みのみを回収する。
これらの溶液を室温で保存する。
【０１９３】
着色済み標準試料−
− 低分子量（Ｂｉｏｒａｄ；ｒｅｆ．１６１−０３０５）
それらは、
− ホスホリラーゼＢ １０４ｋＤａ
− ウシ血性アルブミン ８２ｋＤａ
− 卵アルブミン ４８．３ｋＤａ
− 炭酸脱水酵素 ３３．４ｋＤａ
− 大豆トリプシン阻害剤 ２８．３ｋＤａ
− リソシーム １９．４ｋＤａ
からなる。
− １０〜２５０ｋＤａの高分子量（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ｒｅｆ．ＲＰＮ８００）
【０１９４】
ＩＩ−ゲル電気泳動
− １２％Ｔでの分離ゲルの調製
【表１６】
【０１９５】
− １２％Ｔでの濃縮ゲルの調製
【表１７】
【０１９６】
［付属書Ｂ］
転写及び免疫検出用の溶液
［Ｔｏｗｂｉｎ転写緩衝液。］
トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、ｐＨ８．３；グリシン１９２ｍＭ；２０％メタノール
− トリス塩基 ３．０３ｇ
− １００ｍＬの蒸留水中に溶解すべきグリシン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．；５０３７Ｇ） １４．４ｇ
− メタノール ２００ｍＬ
− １０００ｍＬにするための蒸留水
【０１９７】
［ＰＢＳ−Ｔ緩衝液］
１０×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１４２００−０６７）の１０倍希釈液
そこへ０．１％ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ；Ｐ１３７９）を添加する
これらの溶液を４℃で保存する
【０１９８】
［ポンソーレッド（Ｓｉｇｍａ；Ｐ７１７０）］
５％酢酸溶液中の０．１％での溶液（ｗ／ｖ）
【０１９９】
［付属書Ｃ］
［タンパク質分析］
（Ｂｉｏｒａｄキット；タンパク質標準試料；ｒｅｆ．５００−０００６）
ブラッドフォード法
電気泳動を実施する前に、解凍した溶解物を、９５℃で１０分加熱する。
【０２００】
［変性溶解緩衝液（２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液＋ＤＴＴ１０ｍＭ）中の溶解物について］
Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液は、該キットの試薬と適合性がないため、この方法を介して分析を実施するために、それを除去することが必須である。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、５００μＬのアセトンを、５μＬの溶解物（タンパク質濃度の関数として適合させる容積）へ添加する。
該チューブを、−２０℃に少なくとも１０分置く。
次いで、それらを４℃で１０分、１７０００×ｇで遠心分離する。
その上澄みを、反転により除去し、アセトンの蒸発後に、ペレットを５０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ中に溶解し、ブラッドフォード法を介してタンパク質を分析する（該試料の１０倍希釈液）。
【０２０１】
［非変性溶解緩衝液中の溶解物について］
この溶解緩衝液の成分は、この濃度（１０μＬの試料／ウェル）で、Ｂｉｏｒａｄキットの試薬を妨害しない。その範囲内に入り、優先的にはその上位となるように、該試料のみを希釈すべき、又はすべきではない。
【０２０２】
［校正範囲量の調製：］
ＢＳＡ原液：２ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ；Ａ２１５３；４℃）
【０２０３】
該範囲は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブで調製し、凍結又は４℃で保存し得る。
【表１８】
【０２０４】
該試薬（クーマシーブルーＧ２５０）を、５倍に即時希釈する（１時間維持する）。９６ウェルプレートへ、
− 該範囲について１０μＬの原液
− 該対照について１０μＬの水
− 該試料対照について１０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ
− 分析する１０μＬの試料（３点又は４点）
を用いて希釈した２００μＬの試薬を添加する。
該プレートを振盪し、１０分発色させる。
５９５ｎｍで吸収度を測定する。発色は、最大で４０分安定である。
【０２０５】
［付属書Ｄ］
［一次及び二次抗体のリスト］
【表１９】
【０２０６】
【表２０】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）抽出物の、化粧用脱色剤としての使用、及び色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色、体毛若しくは頭髪の明色化のための美容スキンケア法にも関する。
【０００２】
当技術分野では、多くの脱色剤が知られている。
【０００３】
プロテアソームは、損傷タンパク質の除去を特に担っているため、細胞維持に非常に重要な細胞内のタンパク質分解多酵素複合体である（Ｆｒｉｇｕｅｔ Ｂ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ、Ａｎｎ． ＮＹ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （２０００） ９０８： １４３〜１５４）。プロテアソーム系は、触媒複合体、プロテアソーム２０Ｓ、並びにその活性及び特異性に影響を及ぼす複数のレギュレーターから形成される。レギュレーター１９Ｓのプロテアソーム２０Ｓとの会合は、ユビキチンタンパク質の分解を実施するプロテアソーム２６Ｓを形成する。該プロテアソームは、哺乳類細胞中、細胞質ゾル及び核の両方に位置し、小胞体及び細胞膜との相互作用が存在する。プロテアソーム２０Ｓは、７００ｋＤａの分子量を有し、α型又はβ型の遺伝子によってコードされた１４個の異なるサブユニットからなる。１４個の該サブユニットは、７個のサブユニットの４つの環の円柱状の積重ねとして配置され、頂端の環はαサブユニットから形成され、中央の環はβサブユニットから形成されている。このタンパク分解複合体は、塩基性残基（「トリプシン様」活性）、疎水性残基（「キモトリプシン様」活性）及び酸性残基（「ペプチジルグルタミルペプチド加水分解酵素」活性）のＣ末端部で、タンパク質を優先的に切断する。これらのペプチダーゼ活性は、３個の異なるβサブユニットが担い、その構造内に位置しており、したがって、細胞タンパク質の時機を失した分解を回避するが、活性部位がその潜在的基質へ接近し難いという問題を生じる。最後に、細胞老化の過程において、プロテアソーム活性の減少によって少なくとも部分的に説明される、酸化によるアミノ酸の修飾のサインである、カルボニル基を保有する損傷タンパク質の蓄積が生じる（Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ， Ｉ．ら、Ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ａｇｉｎｇ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．（２０００）５５Ａ：Ｂ２２０〜２２７及びＦｒｉｇｕｅｔ Ｂ．、Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｐａｉｒ ｉｎ ａｇｅｉｎｇ ａｎｄ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（２００６）５８０：２９１０〜２９１６）。
【０００４】
さらに、Ａｎｄｏ Ｈ．ら、ｉｎ Ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｉａ ｐｒｏｔｅａｓｏｍａｌ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ： ａ ｎｅｗ ａｓｐｅｃｔ ｏｆ ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ−ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、（２００４）．２７９：１５４２７〜３３は、Ｂ１６Ｆ１０細胞（安定にメラニンを発現し、生成するマウスメラノサイト株）中で、プロテアソーム依存性タンパク質分解を介してチロシナーゼが分解され、この分解が、リノール酸を用いた処理後に刺激され得るか、又は反対に、パルミチン酸を用いた処理を介して減少され得ることを実証した。
【０００５】
藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムは、植物プランクトンの一部を構成し、温帯気候由来の珪藻類の単細胞藻類である。
【０００６】
本出願人名の国際特許出願の国際公開第０２／０８０８７６号パンフレットは、この藻類抽出物の、ＵＶへの曝露の有害な影響から皮膚を積極的に保護するため、又は皮膚の老化の影響を予防若しくは抑制するための化粧剤としての使用について開示している。
【０００７】
前記国際特許出願によると、この化粧剤の特性は、この抽出物が、皮膚細胞、特にケラチノサイトのプロテアソームの活性化を促進し、したがって酸化タンパク質の分解促進につながるという事実によって説明される。
【０００８】
少なくとも１種の光合成海洋及び／又は淡水微生物の清澄化培養培地の調製プロセス、並びに、特に化粧品の分野におけるこの清澄化培養培地の使用は、国際特許出願の国際公開第２００６／００８４０１号パンフレットにも記載されている。
【０００９】
前記文献は、該清澄化培養培地の可能な用途の中で、着色剤又は脱色剤としての用途について述べているが、バイオマス自体又はその抽出物の使用については全く触れていない。その上、前記文献は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの清澄化物質が、脱色特性を全く有していないことを示している。
【００１０】
皮膚色素沈着の形成機構が、メラノサイトにおけるメラニンの合成を伴うことが想起される。この機構は、以下の主要ステップを概略的に伴う。
チロシン→ドーパ→ドーパキノン→ドーパクロム→メラニン
【００１１】
チロシナーゼは、この一連の反応において重要な役割を果たす酵素である。チロシナーゼは、メラニン色素の形成につながる、チロシンをドーパ（ジヒドロキシフェニルアラニン）へ変換するための反応、及びドーパをドーパキノンへ変換するための反応を特に触媒する。
【００１２】
ある物質は、メラノサイトに、これらの細胞の活性を抑制することにより直接作用する場合、又はメラニン生合成のステップの１つをブロックする場合、脱色剤として認められる。検討中の物質が、メラニン形成に関与する酵素のうちの１種を抑制する場合が特にそうである。
【００１３】
驚くべきことに、本発明者らは、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物が、注目すべき皮膚脱色特性を有することを証明したが、それに対し、上述した科学的刊行物（Ａｎｄｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００４）２７９、１５４２７〜３３）によれば、チロシナーゼ分解に対するその阻害活性が知られているこの同一の藻類は、相当量のパルミチン酸を含有すると考えられている。
【００１４】
したがって、第１の態様によると、本発明は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の、特に色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色、体毛若しくは頭髪の明色化を目的とした脱色活性剤としての、化粧用組成物における使用に関する。
【００１５】
この第１の態様によると、本発明は、より具体的には、該活性剤が、皮膚の脱色又は退色を目的とした使用に関する。
【００１６】
第２の態様によると、本発明は、この抽出物を含有する化粧用組成物の、皮膚の少なくとも１つの関心領域への適用を含むことを特徴とする、皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色、体毛若しくは頭髪の明色化のための美容ケア法に関する。
【００１７】
この第２の態様によると、該抽出物は、所望の効果を得るのに効果的な量、特に、皮膚におけるチロシナーゼ分解の刺激を誘発するのに効果的な量で使用される。
【００１８】
上記２つの態様では、該藻類抽出物は、好ましくは０．００１重量％と５重量％の間、より好ましくは０．００１重量％と１重量％の間の濃度で、該組成物において使用される。
【００１９】
本発明の発明者らによって実施された試験は、該抽出物が、その脂肪酸含量が高くなるにつれてより活性であることを示した。
【００２０】
このことが、可能な限り脂肪酸が豊富なフェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物が、好ましくは少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％の脂肪酸を含有する抽出物が、本発明の２つの各態様に従って使用されると見込まれる理由である。
【００２１】
高脂肪抽出物を得るためのプロセスは、そのような抽出物を得るのに使用され得る。
【００２２】
第１の変法によると、高脂肪抽出物を得るために、脂肪酸を抽出するのに十分に無極性である溶媒又は溶媒媒体を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含むプロセスが使用されるであろう。
【００２３】
そのような溶媒又は溶媒媒体は、以下で無極性溶媒と呼ぶ。
【００２４】
以下に述べるそのような無極性溶媒の例としては、イソプロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン及びヘプタンが挙げられる。
【００２５】
しかし、無極性溶媒を用いた該藻類のそのような処理ステップに限定せずに、多くの場合に、無極性溶媒を用いた抽出ステップの他に、極性溶媒を用いた少なくとも１つの抽出ステップを含む、一連の抽出ステップを使用することが有利である。
【００２６】
極性溶媒を用いたそのような抽出ステップの結果は、エステル化脂肪酸、特にグリセリドの加水分解を引き起こし、それらを塩形態で抽出することである。
【００２７】
有利には、無極性溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含むそのようなプロセスは、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、水−アルコール又はこれらのアルコールの混合物、エチレングリコールなどのＣ２〜Ｃ６多価アルコール、クロロホルム及びジクロロメタンなどの塩素系溶媒、酢酸エチルなどのＣ３〜Ｃ６有機酸エステル、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンなどのＣ６〜Ｃ１０アルカン、並びにジイソプロピルエーテルなどのＣ５〜Ｃ８エーテルから選択された抽出溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを特に含み、前記溶媒は、場合によって塩基性化されている。
【００２８】
本発明の抽出物の調製に使用されるプロセスの特に有利な一変法によると、該藻類は、塩基性化された水−アルコール混合物を用いた抽出の第１のステップへ付され、前記水−アルコール混合物のアルコールは、イソプロパノール、エタノール及びメタノールから選択されることが好ましく、前記ステップは、脂肪酸が、水−アルコール相において塩化形態で回収されることを可能にする。
【００２９】
それに従って該藻類が第１のステップで塩基性化された水−アルコール混合物を用いて処理される、上記プロセスの特に有利な一変法によると、こうして回収された画分は、無極性相中で、特に脂肪酸が豊富な抽出物を回収することを目的とした様々な操作に付される。
【００３０】
具体的には、塩基性化された水−アルコール混合物は、無極性溶媒を使用した液液抽出ステップへそれをかける前に酸性化される。
【００３１】
そのようなプロセスは、前記無極性溶媒の除去により、前記抽出物を含有する油を回収するステップも含む。
【００３２】
この無極性溶媒は、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンであることが有利であろう。
【００３３】
一般に、任意の抽出操作の前に、該藻類が凍結されることが有利である。好ましくは、凍結は、約−４０℃と−２０℃の間の温度で、好ましくは約１日と７日の間実施される。この先行ステップは、シリカ（藻類細胞の骨格から得られた）のデカンテーションを促進するように、後に抽出溶媒との接触によって熱ショックを与えるために、有利に使用される。次いで、該藻類は、その抽出溶液と接触される。
【００３４】
有利な一変形実施形態によると、凍結された藻類は、加熱抽出溶媒中に直接浸漬される。
【００３５】
藻類の抽出溶媒における室温での浸軟も、有利に実施される。
【００３６】
有利な一変形実施形態によると、該藻類の浸軟は、室温で、好ましくは約５分と８０分の間、より好ましくは約２０分と４０分の間実施される。
【００３７】
さらに別の有利な変形実施形態によると、該抽出は、還流させながら実施される。
【００３８】
さらに別の有利な変形実施形態によると、該抽出は、不活性雰囲気下、好ましくは窒素飽和雰囲気下で実施され得る。このことは、活性分子の顕著な酸化分解を特に回避することを可能にする。
【００３９】
この抽出物は、窒素などの不活性ガス下で、場合により、活性分子を保護するために抗酸化剤も添加して、調節することが有利である。
【００４０】
有利な一変形実施形態によると、使用される抽出溶媒の量は、藻類の乾量として表現される該藻類の量１００ｇについて、約０．１リットルと２０リットルの間、好ましくは約２リットルと１０リットルの間である。
【００４１】
無極性溶媒を用いた抽出ステップの前に、塩基性化された水−アルコール混合物を用いた抽出が行われるプロセスの別の有利な変法によると、上述の藻類抽出物は、そのいくつかを以上に記載した、以下の一連のステップの後に得られる。
ａ）該藻類が、前述の通り凍結され、次いで、抽出溶媒中に浸漬される、
ｂ）該藻類の浸軟が実施される、
ｃ）抽出溶媒が、例えば、水酸化ナトリウム水溶液又は水酸化カリウム水溶液を用いて、ｐＨ１０〜１４、好ましくはｐＨ１３に塩基性化される、
ｄ）不溶性物質が、水−アルコール相から除去される、
ｅ）蒸留水が、水−アルコール相へ添加される、
ｆ）こうして得られた水−アルコール溶液は、水−アルコール相と混和しない無極性溶媒、例えば、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンを用いた液液プロセスを介して洗浄される、
ｇ）無極性溶媒を含有する層が除去される、
ｈ）無極性溶媒を含有する層の除去後に回収された水−アルコール相が、例えば、硫酸水溶液又は塩酸水溶液を用いて、ｐＨ１〜３、好ましくはｐＨ２に酸性化される、
ｉ）酸性化後に得られた溶液は、アルコール相又は水−アルコール相と混和しない無極性溶媒、例えば、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンを用いた液液抽出を受ける、
ｊ）次いで、水−アルコール相が除去される、
ｋ）水−アルコール相の除去後に回収された無極性溶媒を含有する層は、本発明によって所望される抽出物である、無極性溶媒を含まない油を得るために、蒸発を受ける。
【００４２】
塩基性化され、次いで酸性化されたアルコールの使用は、化粧用組成物において許容可能な視覚及び嗅覚の特性（黄色、及び許容可能な臭気）を有する抽出物を得ることを可能にする。
【００４３】
本発明の次に有利な実施形態によると、上述の藻類抽出物は、超臨界ＣＯ２を用いて該藻類を抽出することによって得られる。この特定の溶媒の使用は、該藻類が、前もって凍結乾燥されていたことを前提とする。
【００４４】
本発明の他の特徴、目的及び利点は、本発明の範囲を全く制限しないものである実例として単に示す、本発明の複数の実施例、及び比較活性試験、及び化粧用組成物の配合例への参照と共に示す、以下の説明的記載の観点から明白に現れるであろう。
【００４５】
実施例では、別段の定めのない限り、示す割合は、重量パーセントとして表現する。温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧である。
【００４６】
各図は、実施例のセクションＩＩで示す試験を参照しながら示す。それらは、それぞれ、比較すると、以下のものを例示する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１Ａ】キモトリプシン様活性を示す図である。
【図１Ｂ】ポストグルタミン酸様加水分解酵素活性を示す図である。
【図１Ｃ】トリプシン様活性を示す図である。
【図２Ａ】２４時間での溶解に関して得られた、抗プロテアソームウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図２Ｂ】７２時間での溶解に関して得られた、抗プロテアソームウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図３Ａ】２４時間での溶解に関して得られた、抗ユビキチンウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図３Ｂ】７２時間での溶解に関して得られた、抗ユビキチンウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４Ａ】２４時間での溶解に関する、抗チロシナーゼウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図４Ｂ】７２時間での溶解に関する、抗チロシナーゼウェスタンブロットの結果を示す図である。
【図５】チロシナーゼ活性の測定値を示す図である。
【図６】免疫沈降試験の結果を示す図である。
【実施例】
【００４８】
［Ｉ．本発明による抽出物の調製］
［実施例１：第１のプロセスに従った、イソプロパノール（ＩＰＡ）などの極性溶媒を用いた抽出］
該プロセスの好ましい様式によると、該抽出全体は、活性分子の顕著な分解を回避するために、不活性雰囲気下（窒素による飽和）で実施する。
【００４９】
この実施例では、２５０ｋｇのバイオマス（フェオダクチルム・トリコルヌーツム）を使用する。
【００５０】
次いで、−２０℃で凍結したこのバイオマスを、撹拌しながら、８０〜８３℃で還流させたイソプロパノール（ＩＰＡ）中に浸漬する。熱ショックは、シリカ（該藻類細胞の骨格から得られた）のデカンテーションを促進する。
【００５１】
使用する溶媒の量は、バイオマス中に含有される水１リットル当たりＩＰＡ１０リットルである。したがって、固形物の割合が３０％の場合、上述の２５０ｋｇのバイオマスは、次のように７５ｋｇの固形物量と１７５ｋｇの水に区分される。この場合、使用するＩＰＡの量は、１７５０ｋｇである。
【００５２】
全体（バイオマス＋ＩＰＡ）を、約８０℃で撹拌しながら３０分還流させ、次いで、約５０℃に冷却する。バイオマス及びＩＰＡを約５０℃に冷却した後、消耗したバイオマス／ＩＰＡ中に溶解した藻類抽出物の分離を実施するために、その全体を、Ｇｕｅｄｕ型の濾過装置へ移す。
【００５３】
該抽出物を、バッチ式反応期中で濃縮する（濃縮係数＝７１．５）。濃縮抽出物は、油状の外観を有する。
【００５４】
次いで、この油性抽出物を、油１ｋｇ当たり溶媒１０ｋｇの割合で、冷ＩＰＡ中に溶解する。撹拌を２０分継続する。次いで、その液体を濾過する（それが残留粘着性スラッジの除去を可能にする）。
【００５５】
脱色及び脱臭処理を、８０リットルＳｃｈｏｔｔ反応器中の２つのバッチで実施し、ゼオライト及び活性炭の添加により、室温で３０分継続する。添加したゼオライト（Ａｂｓｅｎｔ２０００、供給業者ＵＯＰ）の量は０．９４ｋｇであり、活性炭（ＣＸＶ、供給業者ＣＥＣＡ）の量は１．６ｋｇである。炭対ゼオライト比率は、１．７である。
【００５６】
次いで、ゼオライト及び炭を、紙による濾過により除去する。
【００５７】
抗酸化剤（最終重量濃度０．０５％のＤＬ−α−トコフェロール及び最終重量濃度０．０５％のパルミチン酸アスコルビル）を、原液を介してＩＰＡに組み込む。
【００５８】
次いで、抗酸化剤を含有する濾液を、窒素などの不活性ガス下で、茶色の油が得られるまで、バッチ式に濃縮する。
【００５９】
この油は、以下で、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの本発明による抽出物Ｅ１と呼ぶ。
【００６０】
［実施例２：二段階の第２のプロセスに従った抽出］
該抽出は、２５０ｋｇのバイオマス（フェオダクチルム・トリコルヌーツム）から得られた４９．８ｋｇの凍結乾燥質量、すなわち、約２０％の乾燥質量を、９ｋｇの３０．５％水酸化ナトリウム水溶液を用いて塩基性化した９６％無水エタノール５３９ｋｇに分散させることによって開始する。エタノールの還流温度及び窒素雰囲気下での３０分の浸軟後、その全体を１８℃に冷却する。
【００６１】
次いで、不溶性物質を、窒素下での吸引濾過によって分離し、棄却する。
【００６２】
１５１ｋｇの蒸留水を、５７３．９ｋｇの濾液へ添加する。この水−アルコール相を、ゆっくりと１０分撹拌し、次いで、１６２ｋｇのヘプタンを用いた液液プロセスによって洗浄する。液液分配のヘプタン上相を除去する。該抽出の開始時に実施した塩基性化の結果として、塩形態の脂肪酸を含有するので、下相を回収する。ヘプタン洗浄操作を、さらに２回繰り返し、下相を系統的に回収する。
【００６３】
こうして得た７２０ｋｇの下相を、ｐＨを２．２にし、したがって酸の形態の脂肪酸を得るために、２．８ｋｇの硫酸を添加することにより酸性化する。その溶液全体を、窒素下で１０分撹拌し、次いで、この場合は１５８ｋｇのヘプタンの画分によって形成されている無極性溶媒を用いた液液抽出にかける。遊離脂肪酸を含有する５つの画分から得た、合計で６９７ｋｇのヘプタン相を回収するために、該ヘプタン洗浄操作を、さらに５回繰り返す。回転蒸発器上で、次いで分子蒸留によって蒸発乾固したこの相は、本発明による活性抽出物、すなわち、０．６５ｋｇの油量を生じる。
【００６４】
生成した油は、均一な液体であり、暗黄色である。
【００６５】
この油は、以下で、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの本発明による抽出物Ｅ２と呼ぶ。
【００６６】
上述のプロセスに従って得た抽出物Ｅ２は、以下の脂肪酸組成を有する（重量パーセント）。
− ミリスチン酸 ４．１６％
− パルミチン酸 １３．８２％
− パルミトオレイン酸 １６．４８％
− エイコサペンタエン酸 ２４．７５％
− ドコサヘキサエン酸 １．７５％
【００６７】
［ＩＩ．メラノサイトプロテアソーム及びこれらのメラノサイトのチロシナーゼ活性に対する、本発明の抽出物の活性を証明するための試験］
［１．試験の原理］
以下で記載する試験は、本発明の抽出物の、メラノサイトプロテアソームの様々な活性に対する影響を、このプロテアソームの様々な活性を測定することにより特徴づけることを目的としている。
【００６８】
各試験は、本発明の抽出物の、ユビキチンタンパク質の量に対する影響を特徴づけることも目的としている。
【００６９】
各試験は、本発明の抽出物の、チロシナーゼの量及びその活性に対する影響を特徴づけることも目的としている。
【００７０】
このセクションで記載する全ての試験は、上記実施例２に従って調製した抽出物Ｅ２を使用して実施した。
【００７１】
［２．材料及び方法］
［２．１ プロテアソーム活性及びチロシナーゼ活性を分析するためのＭＮＴ１細胞（ヒトメラノサイト細胞株）の処理］
【００７２】
［２．１Ａ：細胞培養］
［使用する試薬を、以下で本文中に規定する。］
ａ）従う手順
［Ｄ０での接種］
・ＭＮＴ１、１０６細胞／直径３５ｍｍのシャーレ、３点
・ＭＮＴ１培地、２ｍＬ／シャーレ（以下の構成を参照）
［Ｄ１での処理］
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ（ウシ血性アルブミン）＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
３７℃で１時間、磁気撹拌子で撹拌する
［− Ｄ４での第２の処理］
＋シクロへキシミド １μｇ／ｍＬ（タンパク合成阻害剤）
＋チロシナーゼ活性を分析するための１２０ｎＭ Ｍｇ１３２。
− ４時間後の溶解物の調製
ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）を用いた２回のすすぎ洗い
氷のベッド上、掻取りによる１５０μＬの溶解緩衝液での回収。
−２０℃で凍結
− ブラッドフォード法を介したタンパク質分析
− プロテアソーム活性分析
【００７３】
［ｂ）培地及び試薬］
［− ＭＮＴ１培地］
ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：６１９６５−０２６）
＋２０％ＦＣＳ
＋１０％追加ＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ：１２０５５−０９１）
＋１％ピルビン酸ナトリウム １００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ：１２３６０−０３９）
＋１％非必須アミノ酸、ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ：１１１４０−０３５）
【００７４】
［− 原液］
− リノール酸（Ｓｉｇｍａ；Ｌ１０１２）
ＥｔＯＨ中２．８ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５５８５）
ＥｔＯＨ中２．５６ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− フェオダクチルム
ＥｔＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− ビタミンＣ
ＰＢＳ中２５．６ｍｇ／ｍＬ（培地中１％）
− ビタミンＥ
ＥｔＯＨ中２１．５５ｍｇ／ｍＬ（培地中０．１％）
− Ｍｇ１３２（Ｓｉｇｍａ；Ｃ２２１１）
ＤＭＳＯ中１２０μＭ（培地中０．１％）
− シクロへキシミド（Ｓｉｇｍａ；Ｃ７６９８）
【００７５】
［− 溶解緩衝液］
トリス−ＨＣｌ １．５Ｍ、ｐＨ７．５
４５．３７５ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ；Ｔ１５０３）を、２００ｍＬの蒸留水中に溶解する、
１２Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨを７．５に調整し、次いで２５０ｍＬにする
１Ｍスクロース溶液（Ｍｅｒｃｋ；ｒｅｆ．７６５４）
８．５５ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解し、次いで２５ｍＬに調整する。
２ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ７５０６）
６ｍｇを２５ｍＬの蒸留水中に溶解する。
又は、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ５９２１）１２．４ｍｇを２５ｍＬの蒸留水中に溶解する；
４℃で保存する。
４％トリトンＸ１００溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｘ１００）
０．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する（非常にゆっくりと）
０．５ｍＬ分量を採取し、−２０℃で保存する
４０ｍＭ ＰＭＳＦ溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｐ７６２６）
１４ｍｇを２ｍＬの無水エタノール中に溶解する。
５０ｍＬ分量を採取し、４℃で９カ月保存する
０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｌ２８８４；−２０℃で保存）
水溶性。５０μＬ分量を採取し、−２０℃で１カ月保存する。
１Ｍ ＤＬ−ジチオスレイトール溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｄ０６３２；４℃で保存）
０．１５４ｇを１ｍＬの蒸留水中に溶解する。
１０μＬ分量を採取し、−２０℃で保存する。
５００ｍＭＥＤＴＡ四ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．ＥＤ４Ｓ）
３．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する；４℃で保存する。
【００７６】
［− 溶解緩衝液の調製（１００ｍＬ当たり）］
そこから４．３９ｍＬ分量を採取する、−２０℃で保存する不完全な溶液の調製：
【表１】
【００７７】
完全な溶液を、
４．３９ｍＬの不完全溶液
＋５００μＬの４％トリトンＸ１００
＋１０μＬのＤＴＴ（ジチオスレイトール）、１Ｍ
＋５０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン
＋５０μＬの４０ｍＭ ＰＭＳＦ（硫化フェニルメタンスルホニル）
を用いて即時調製する。
酵素活性分析については、ロイペプチンは、プロテアソームの活性を抑制するため、添加しない。
【００７８】
［２．１Ｂ：ブラッドフォード法を介したタンパク質分析］
（刊行物「Ａ Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｇｒａｍ Ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｄｙｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ」、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｍ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７６）７２：２４８〜２５４を参照）
【００７９】
［ａ）校正範囲量の調製：］
ＢＳＡ原液：５０μｇ／ｍＬ（ＢＩＯＲＡＤ；タンパク質標準試料：ｒｅｆ．５００−０００６）
【表２】
【００８０】
各チューブ中：２００μＬのクーマシーブルーＧ２５０を添加。
クーマシーブルーは、その原液の５倍希釈によって即時調製する。
【００８１】
［ｂ）試料の調製：］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− 溶解緩衝液中の細胞の回収、次いで、超音波処理、次に、タンパク質濃度の分析
タンパク質濃度＞３ｍｇ／ｍＬである場合、１０倍希釈を実施し、次いで、
１００μＬの希釈細胞抽出物
＋７００μＬのＭｉｌｌｉＱ水
＋２００μＬのブルー
を、又は、濃度が低い場合は、
１０μＬの細胞抽出物
＋７９０μＬのＭｉｌｌｉＱ水
＋２００μＬのブルー
を入れる。
− ボルテックスにより撹拌し、５分待ち、次いで、５９５ｎｍで読み取る
【００８２】
［２．１Ｃ：プロテアソーム活性分析］
該細胞を、ＰＢＳを用いて２回すすぎ洗いし、次いで、特定のプロテアソーム阻害剤ＭＧ１３２（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ロイシナール）の存在下及び非存在下で、各活性に特異的な蛍光原ペプチド基質を使用して、プロテアソームの各ペプチダーゼ活性を測定する。ペプチド基質生成物は、以下のものである。キモトリプシン様活性についてはＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ａｍｃ（ＬＬＶＹ−ａｍｃ）、ポストグルタミン酸加水分解酵素活性についてはＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−ｎａ（ＬＬＥ−ｎａ）及びトリプシン様活性についてはＬｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−ａｍｃ（ＬＳＴＲ−ａｍｃ）。分析の原理は、蛍光原ペプチドからの蛍光体アミノメチルクマリン又はβ−ナフチルアミンの放出が原因の、蛍光の増加を経時的に監視することにある。
【００８３】
［ａ）ＬＬＶＹ活性（キモトリプシン様）］
［ａ．１−原理］
プロテアソーム
（ＬＬＶＹ活性
（キモトリプシン様））
Ｎ−サクシニル−ＬＬＶＹ−ＭＣＡ−−−−−→Ｎ−サクシニル−ＬＬＶＹ＋蛍光ＭＣＡ
３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長での、分光蛍光計を用いた読み取り。
【００８４】
［ａ．２−試薬］
− ＴＲＩＳ２５ｍＭ緩衝液ｐＨ７.５
− ７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ａ９８９１）
２０ｍＭ原液（３．５ｍｇ／１ｍＬ ＤＭＳＯ）
− 蛍光原基質：Ｎ−サクシニル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｓｉｇｍａ：Ｓ６５１０）
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液
【００８５】
［ａ．３−ＭＣＡ（７−アミノ−４−メチルクマリン）校正範囲量］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− ＭＣＡ原液を、ＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈する。
− ９６ウェルプレート中で、各量を２点分配する。
【表３】
− ブランク液の調製：２００μＬのＴＲＩＳ緩衝液。
− ３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計上で読み取る。３５５ｎｍ及び４６０ｎｍ、利得４０で、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）を用いる。
【００８６】
［ａ．４−ＬＬＶＹ活性（キモトリプシン様）の分析］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− ９６ウェルプレート中に、一定容積の細胞溶解物（２０μｇのタンパク質に相当すべき、各試料の最低タンパク質濃度から求める）を２点導入し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。
− ＴＲＩＳ緩衝液中で２５μＭに予め希釈した１００μＬのＬＬＶＹ−ＭＣＡ基質（最終１２．５μＭ）を添加する。
− ３５５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長、利得４０で、２分毎に３０分、分光蛍光計を読み取る。
【００８７】
［ａ．５−結果］
未加工の結果を、Ｆ．Ｕ．／分で表現し、Ｆ．Ｕ.は、蛍光単位で表現される、その装置によって与えられた値を示す。
該分析を、溶解物のタンパク質濃度の関数として設定した容積Ｖの細胞溶解物を含有する、２００μＬの反応物容積について実施する。
即時分析したタンパク質を、μｇ／μＬで表す。
【００８８】
校正範囲量から、該活性は、以下の通り、放出されたＭＣＡのｐｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇで表現し得る。
【数１】
【００８９】
［ｂ−ＬＬＥ活性（ポストグルタミン酸加水分解酵素））］
［ｂ．１−原理］
以下の切断反応を研究した。
プロテアソーム
（ＬＬＥ活性
（ポストグルタミン酸加水分解酵素）
Ｎ−ＣＢＺ−ＬＬＥ−ＮＡ−−−−−−−−−−−→Ｎ−ＣＢＺ−ＬＬＥ−＋ＮＡ蛍光
３３３ｎｍの励起波長及び４１０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計を読み取る。
【００９０】
［ｂ．２−試薬］
− ２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．５
− β−ナフチルアミド（ＮＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ｎ８３８１）
２０ｍＭ原液（５．７３ｍｇ／２ｍＬ ＤＭＳＯ）
− 蛍光原基質Ｎ−ＣＢＺ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−β−ナフチルアミド（Ｓｉｇｍａ：Ｃ０７８８）
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液
【００９１】
［ｂ．３−ＮＡ（β−ナフチルアミド）校正範囲量］
校正を、以下の通り実施する。
− ＮＡ原液を、ＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈する。
− ９６ウェルプレート中で、各量を２点分配する。
以下の表に示す通りである。
【表４】
− ブランク液の調製：２００μＬのＴＲＩＳ緩衝液。
− ３３３ｎｍの励起波長及び４１０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計上で読み取る。３４０ｎｍ及び４１０ｎｍ、利得８３で、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）を用いる。
【００９２】
［ｂ．４−ＬＬＥ活性（ポストグルタミン酸加水分解酵素）の分析］
そのプロセスを、以下の通り実施する。
− ９６ウェルプレート中に、一定容積の細胞溶解物（２０μｇのタンパク質に相当すべき、各試料の最低タンパク質濃度から求める）を２点導入し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。
− ＴＲＩＳ緩衝液中で３００μＭに予め希釈した１００μＬのＬＬＥ−ＮＡ基質（最終１５０μＭ）を添加する。
− ３４０ｎｍの励起波長及び４１０ｎｍの発光波長、利得８３で、２分毎に３５分、分光蛍光計を読み取る。
【００９３】
［ｂ．５−結果］
未加工の結果を、Ｆ．Ｕ．／分で表現する。
該分析を、溶解物のタンパク質濃度の関数として設定した容積Ｖの細胞溶解物を含有する、２００μＬの反応物容積について実施する。
即時分析したタンパク質を、μｇ／μＬで表す。
校正範囲量から、該活性は、以下の通り、放出されたＭＣＡのｐｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇで表現し得る。
【数２】
【００９４】
［ｃ）ＬＳＴＲ活性（トリプシン様）］
［ｃ．１−原理］
プロテアソーム
（ＬＳＴＲ活性
（トリプシン様））
Ｎｔ Ｂｏｃ ＬＳＴＲ−ＭＣＡ−−−−−−−→Ｎｔ Ｂｏｃ ＬＳＴＲ＋蛍光ＭＣＡ
３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長で分光蛍光計を読み取る。
【００９５】
［ｃ．２−試薬］
− ２５ｍＭ ＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ７．５
− ７−アミノ−４−メチルクマリン（ＭＣＡ）（Ｓｉｇｍａ：Ａ９８９１）
２０ｍＭ原液（３．５ｍｇ／１ｍＬ ＤＭＳＯ）
− 蛍光原基質：Ｎ−ｔ−ＢＯＣ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ７−７−アミド−４−メチルクマリン（Ｓｉｇｍａ：Ｂ４６３６）
ＤＭＳＯ中の１０ｍＭ原液
プロテアソーム阻害剤：Ｍｇ１３２（Ｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＣＨＯ）（Ａｆｆｉｎｉｔｙ、ＺＷ８４４０）
ＤＭＳＯ中の２０ｍＭ原液
【００９６】
［ｃ．３−ＭＣＡ校正範囲量］
校正曲線を、以下の通りプロットする（以下の表参照）。
− ＭＣＡ原液を、ＴＲＩＳ緩衝液中で４μＭに希釈する。
− ９６ウェルプレート中で、各量を２点分配する。
【表５】
− ブランク液の調製：２００μＬのＴＲＩＳ緩衝液。
− ３５０ｎｍの励起波長及び４４０ｎｍの発光波長で、分光蛍光計上で読み取る。３５５ｎｍ及び４６０ｎｍ、利得３０で、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）を用いる。
【００９７】
［ｃ．４−ＬＳＴＲ活性の分析］
− ９６ウェルプレート中に、一定容積の細胞溶解物（５０μｇのタンパク質に相当すべき、各試料の最低タンパク質濃度から求める）を２点導入し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。
− ＴＲＩＳ緩衝液中で８０μＭに予め希釈した１００μＬのＬＳＴＲ−ＭＣＡ基質（最終４０μＭ）を添加する。
− 並行して、阻害剤Ｍｇ１３２を試験することにより、それが実際にプロテアソーム活性であることを確認する。
− ５０μｇのタンパク質に、ＴＲＩＳ緩衝液中で４００μＭに予め希釈した１０μＬのＭｇ１３２の溶液（最終２０μＭ）を添加し、ＴＲＩＳ緩衝液を用いて１００μＬにする。次に、ＴＲＩＳ緩衝液中で８０μＭに予め希釈した１００μＬのＬＳＴＲ基質（最終４０μＭ）を添加する。
− ３５５ｎｍの励起波長及び４６０ｎｍの発光波長、利得３０で、２分毎に３０分、分光蛍光計を読み取る。
【００９８】
［ｃ．５−結果］
未加工の結果を、Ｆ．Ｕ．／分で表現する。
該分析を、溶解物のタンパク質濃度の関数として設定した容積Ｖの細胞溶解物を含有する、２００μＬの反応物容積について実施する。
即時分析したタンパク質を、μｇ／μＬで表す。
校正範囲量から、該活性は、以下の通り、放出されたＭＣＡのｐｍｏｌ／分／タンパク質のｍｇで表現し得る。
【数３】
【００９９】
［２．１Ｄ：チロシナーゼ活性の測定］
分析の原理
該分析は、チロシナーゼのドーパ−オキシダーゼ活性の測定に基づく。該分析の原理は、ＦＬＵＯｓｔａｒ（ＢＭＧ）上で４７５ｎｍで吸収する、ドーパクロムの検出に基づく。
【０１００】
材料：
− 溶解緩衝液
− 基質：Ｌ−ドーパの自動酸化が原因で即時調製する、ＰＢＳ中の１０ｍＭでのＬ−ＤＯＰＡ（Ｓｉｇｍａ、Ｄ−９６２８、ＭＷ１９７．２）。
【０１０１】
培地中のヒトメラノサイトを、２５μＭのリノール酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は２５μＭのパルミチン酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は５μｇ／ｍＬのフェオダクチルム（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）を用いて、１％ＢＳＡ、５０μＭビタミンＥ及び１ｍＭビタミンＣを含有するＭＮＴ１培地中で処理した。メラノサイトを、処理の７２時間後に回収し、溶解した。次いで、５０μｇの抽出物を、１ｍＭのＬ−ドーパミンを用いて、３７℃で１時間インキュベートする。チロシナーゼ活性の測定を、サーモスタットで３７℃に維持したマイクロプレートリーダーを使用して、４７５ｎｍで２分毎に実施する。
【０１０２】
ドーパ−オキシダーゼ活性を、タンパク質のＯＤ／分／ｍｇとして得る。ブランク液を、Ｌ−ＤＯＰＡの存在下で、溶解緩衝液を用いて調製する。
【０１０３】
［２．２ プロテアソーム、ユビキチンタンパク質及びチロシナーゼをウェスタンブロット法によって分析するための、ＭＮＴ１の処理］
【０１０４】
［２．２Ａ：細胞培養］
［ａ）手順：］
［Ｄ０での接種］
１０６個のＭＮＴ１細胞／直径３５ｍｍのシャーレ、４点
ＭＮＴ１培地中、２ｍＬ／シャーレ
［Ｄ１での処理］
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ウシ血性アルブミン（ＢＳＡ）＋ビタミンＥ（ビタミンＥ）５０μＭ＋ビタミンＣ（ビタミンＣ）１ｍＭ
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
＋１２０ｎＭ Ｍｇ１３２
３７℃で１時間、磁気撹拌子で撹拌する
［Ｄ２、Ｄ３及びＤ４での溶解物の調製］
ＰＢＳを用いた２回のすすぎ洗い
掻取りによる、１５０μＬのＬａｅｍｍｌｉ２×緩衝液＋１％ＤＴＴ（１０ｍＭ）中の細胞叢の回収。
２つのシャーレ／Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブ
−２０℃で凍結
［タンパク質分析（ブラッドフォード）及びウェスタンブロット法］
該タンパク質分析法は、以前使用したものと同じであり、ウェスタンブロット法である。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブでタンパク質を分析した後、１μｇ／μＬのタンパク質を得るために、各試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ２×緩衝液で希釈する。これらの試料溶液に、１０×ブロモフェノールブルーを添加する。各試料は、−２０℃で凍結し得る。
【０１０５】
［ｂ）培地及び試薬］
［− ＭＮＴ−１培地］
ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：６１９６５−０２６）
＋２０％ＦＣＳ
＋１０％追加ＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ：１２０５５−０９１）
＋１％ピルビン酸ナトリウム １００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ：１２３６０−０３９）
＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ：１１１４０−０３５）
【０１０６】
［− 原液］
− リノール酸（Ｓｉｇｍａ；Ｌ１０１２）
ＥｔＯＨ中２．８ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５５８５）
ＥｔＯＨ中２．５６ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− フェオダクチルム
ＥｔＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− ビタミンＣ
ＰＢＳ中２５．６ｍｇ／ｍＬ（培地中１％）
− ビタミンＥ
ＥｔＯＨ中２１．５５ｍｇ／ｍＬ（培地中０．１％）
− Ｍｇ１３２（Ｓｉｇｍａ；Ｃ２２１１）
ＤＭＳＯ中１２０μＭ（培地中０．１％）
【０１０７】
［− 溶解緩衝液］
１Ｍ ＤＬ−ジチオスレイトール溶液（４℃で保存したＳｉｇｍａ：ｒｅｆ．Ｄ０６３２）
０．１５４ｇを、１ｍＬの蒸留水中に溶解する。
１０μＬ分量を採取し、−２０℃で保存する。
［− Ｌａｅｍｍｌｉ２×試料還元緩衝液（変性剤）］
トリス−ＨＣｌ０．０６Ｍ ｐＨ６．８；ＳＤＳ２．３％；グリセロール１０％
−濃縮ゲル緩衝液 トリス０．５Ｍ ｐＨ６．８ ６．２５ｍＬ
−ＳＤＳ １０％ １１．５０ｍＬ
−グリセロール ５ｍＬ
−５０ｍＬにするための蒸留水
【０１０８】
［２．２Ｂ：ウェスタンブロット］
［ａ）試料の調製及び電気泳動］
タンパク質の電気泳動を、Ｌａｅｍｍｌｉ法（１９７０）に従って、変性及び還元条件下で、バッチ緩衝液において、厚さ１ｍｍ〜１．５ｍｍのポリアクリルアミドミニゲル中で実施する。１２％Ｔ、２．７％Ｃを含有するゲルは、２０〜１２０ｋＤａの範囲の低分子量タンパク質の分離を可能にする。８％Ｔ；２．７％Ｃを含有するゲルは、３５〜２５０ｋＤａの高分子量タンパク質の分離を可能にする。
【０１０９】
該ゲルを生成するのに必要な全ての溶液は、以下の付属書Ａに提示する。
【０１１０】
［− 分離ゲル］
このゲルは、前日又は当日、ただしいずれの場合も、移動の１〜２時間前に注入し得る。
【０１１１】
該ゲルの注入を、ピペットを使用して、濃縮ゲルのために用意したコームの底から最大で約０．５ｍｍまで実施する。
【０１１２】
均一な基線（±１ｍＬ／ゲル）を得るために、無水エタノールを、表面へ穏やかに添加する。
【０１１３】
［− 濃縮ゲル（スタッキングゲル）］
該エタノールを除去する。
ポリエチレンのパスツールホールピペット（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．２２３−９５２８）を使用して、２．５ｍＬのゲルを注入し、次いで、コームを挿入する。１時間後、該ゲルは重合する。
【０１１４】
［試料の調製］
シャーレから細胞を回収する前に、該細胞を、ＰＢＳを用いて２回すすぎ洗いする。最後のすすぎ洗い後、ＰＢＳを可能な限り除去する。掻取りにより、該細胞を、Ｌａｅｍｍｌｉ２×緩衝液＋１０ｍＭ ＤＴＴ（以下の付属書Ａを参照）に回収する（５×１０６細胞／溶解緩衝液の最小ｍＬ）。１．５ｍＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに回収した溶解物を、−２０℃で凍結する。
【０１１５】
電気泳動を実施する前に、解凍した溶解物を、９５℃で１０分加熱し、タンパク質を分析する。
【０１１６】
タンパク質分析を、分離ゲルの重合の間、又は前日に実施する（付属書Ｃを参照）。
【０１１７】
タンパク質≦１μｇ／μＬの同一の溶液を得るために、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、各試料をＬａｅｍｍｌｉ２×緩衝液で希釈する。これらの試料溶液に、１０×ブロモフェノールブルーを添加する。
【０１１８】
［適用］
各試料を、９５℃で５分加熱する。
【０１１９】
適用する容積は、タンパク質の所望の量（最大容積＝１ｍｍのゲルについて２５μＬ、１．５ｍｍのゲルについて４０μＬ）に応じて異なる。１０μｇのタンパク質、すなわち１０μＬは、基準量であり、次いで、標的タンパク質の発現に応じて、それを適用する。
【０１２０】
コームを除去する。２００ｍＬの１×移動緩衝液を、耐漏えい性を確実にするように注意しながら、該ゲル上、２つのゲルの間の中央区画へ、次いで、石英セルへ注入する。
【０１２１】
マイクロピペット上の適合させたテーパーチップ、及び１０μＬの染色済み分子量対照（Ｂｉｏｒａｄ、Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｌｏｗ Ｒａｎｇｅ；ｒｅｆ．１６１−０３０５）又は（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｆｕｌｌ Ｒａｎｇｅ Ｒａｉｎｂｏｗ；ｒｅｆ．ＲＰＮ８００Ｗ）も使用して、各試料を適用する。
【０１２２】
［移動］
電気泳動を、室温で２００Ｖで実施する。移動前端がゲルを離れたときに（約４０分の移動）、電気泳動を停止する。
【０１２３】
［ｂ）膜上へのタンパク質のセミドライ転写］
濾紙の２枚の厚手シート（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．１７０３３９６０）及びセルロース膜（Ｂｉｏｒａｄ、ｒｅｆ．１６２−０１１５）を、この方法の原点である、Ｔｏｗｂｉｎら（１９７９）の転写緩衝液中へ浸漬する（付属書Ｂを参照）。
【０１２４】
セミドライ転写装置（Ｂｉｏｒａｄ）において、濾紙の湿らせた厚手シートを陽極上に置く。
【０１２５】
移動が完了すると、濃縮ゲルを除去し、分離ゲルをセルロース膜へ適用する。該膜及びゲルを、濾紙の該シート上に置く。濾紙の２枚目のシートを、ゲルへ適用する。
【０１２６】
「サンドイッチ」の製造の間、転写を引き起こすものであるため、全ての気泡を、ガラスステムを使用して除去しなければならない。該装置を、陰極を形成する蓋で閉じる。
【０１２７】
該タンパク質転写を、１０Ｖで１時間３０分実施する。
【０１２８】
［ｃ）ポンソーレッドを用いたマーキング］
転写の質を確認するために、ポンソーレッド（Ｓｉｇｍａ；Ｐ７１７０）を用いてタンパク質を染色する。
【０１２９】
セルロース膜を、ＭｉｌｌｉＱ水を用いてすすぎ洗いし、次いで１×ポンソーレッド浴中に、撹拌しながら１０分浸漬する。次いで、染色剤がタンパク質バンド上にのみ残るようになるまで、該膜を、複数のＭｉｌｌｉＱ水浴中で洗浄する。
【０１３０】
該膜を、プラスチック中へ挿入し、走査する。
【０１３１】
タンパク質バンドは、転写されたタンパク質の合計量を求めるために、定量化し得る。
【０１３２】
［ｄ）非特異的結合部位の遮断］
以下の付属書Ｂで調製するＰＢＳ−Ｔ緩衝液（２０ｍＬ／膜）中の５％脱脂乳（Ｒｅｇｉｌａｉｔ）から形成される非特異的結合部位を遮断するための溶液において、該膜を、４℃で終夜、又は室温で１時間３０分撹拌する。
【０１３３】
［ｅ）免疫検出］
抗体の基準品及び最適な希釈度は、以下の付属書Ｄに示す。
【０１３４】
非特異的部位を遮断した後、該膜を、ＰＢＳ−Ｔ中で急速にすすぎ洗いする。
【０１３５】
次に、この膜を、ＰＢＳ−Ｔ中で最適な濃度に希釈した一次抗体と、該抗体に応じて５％乳（ｍ／ｖ）あり又はなしで、撹拌しながら室温で１時間、又は４℃で終夜接触させる。
【０１３６】
次いで、過剰な遊離非結合抗体を除去するために、該膜を、ＰＢＳ−Ｔ中で急速に３回、１０分すすぎ洗いする。
【０１３７】
次に、該膜を、ＰＢＳ−Ｔ又は５％ミルク（５ｍＬ）で希釈した適切なペルオキシダーゼ結合二次抗体と、室温で撹拌しながら接触させる。
【０１３８】
４５分インキュベートした後、該膜を急速に２回すすぎ洗いし、次いで、ＰＢＳ−Ｔ緩衝液を用いて５回、５分、最後には１×ＰＢＳ中で洗浄する。
【０１３９】
排出後、該膜を、「タンパク質」側を上にして、キッチンフィルム（ＳＡＲＡＮ）上に置く。
【０１４０】
ルミノールをペルオキシダーゼ基質として用いながら高感度化学発光検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｒｅｆ．ＲＰＮ２２０９）を使用して、該膜を明らかにする。ペルオキシダーゼ及び増幅剤の作用下で、ルミノールは酸化し、一時的な励起状態となる。基底状態への回復は、該膜上にあるオートラジオグラフィーフィルムに当たる、光子の放出により生じる。
【０１４１】
該検出キットの２つの溶液各１ｍＬを混合する（２ｍＬ、該膜を被覆するのに必要な最低容積）。
【０１４２】
直ちに、その混合物を、該膜上へ均一に注入し、室温で正確に１分接触させる。
【０１４３】
排出した膜を、Ｓａｒａｎキッチンフィルムの下で密封し、光から保護したカセットへ置き、次いで、プレフラッシュしたオートラジオグラフィーフィルム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ ＥＣＬ ｒｅｆ．ＲＰＮ２１０３Ｋ）を用いて被覆する。
【０１４４】
５分の曝露後、該オートラジオグラフィーフィルムを現像する。所望の信号を最適化するために、必要であれば、新しいフィルムを再曝露する（最大で１時間）。
【０１４５】
該バンドを、Ｇｅｌｓ Ａｎａｌｙｓｔｓ３．０１ソフトウェアによって定量化する。
【０１４６】
［２．３ チロシナーゼの免疫沈降を実施するためのＭＮＴ−１タンパク質抽出物の調製］
［２．３Ａ：細胞培養］
［ａ）手順］
【０１４７】
［Ｄ０での接種］
１０６個のＭＮＴ１細胞／直径３５ｍｍのシャーレ、３点
ＭＮＴ１培地中２ｍＬ／シャーレ
【０１４８】
［Ｄ１での処理］
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ２．５及び５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ １ｍＭ
− リノール酸 ２５μＭ
− パルミチン酸 ２５μＭ
− フェオダクチルム ２．５及び５μｇ／ｍＬ
ＭＮＴ１培地中
＋１％ＢＳＡ＋ビタミンＥ ５０μＭ＋ビタミンＣ１ｍＭ
＋１２０ｎＭ Ｍｇ１３２
【０１４９】
［３７℃で１時間、磁気撹拌子で撹拌する］
溶解物の調製及びＤ２での計数
ＰＢＳを用いた２回のすすぎ洗い
氷のベッド上、
１５０μＬの溶解緩衝液での回収
掻取りによる。
−２０℃で凍結
ＰＢＳを用いたすすぎ洗い
＋０．５ｍＬ トリプシン／ＥＤＴＡ
＋０．５ｍＬ ＰＢＳ＋１０％ＦＣＳ
【０１５０】
［Ｚ２計数機上での計数］
０．５ｍＬの懸濁液＋１０ｍＬ Ｉｓｏｔｏｎ上
【０１５１】
［ｂ）培地及び試薬］
［− ＭＮＴ１培地］
ＤＭＥＭ ４．５ｇ／ｍＬのグルコース（Ｇｉｂｃｏ：６１９６５−０２６）
＋２０％ＦＣＳ
＋１０％追加ＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ：１２０５５−０９１）
＋１％ピルビン酸ナトリウム １００ｍＭ（Ｇｉｂｃｏ：１２３６０−０３９）
＋１％ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ：１１１４０−０３５）
【０１５２】
［− 原液］
− リノール酸（Ｓｉｇｍａ；Ｌ１０１２）
ＥｔＯＨ中２．８ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− パルミチン酸（Ｓｉｇｍａ；Ｐ５５８５）
ＥｔＯＨ中２．５６ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− フェオダクチルム
ＥｔＯＨ中２ｍｇ／ｍＬ（培地中０．２５％）
− ビタミンＣ
ＰＢＳ中２５．６ｍｇ／ｍＬ（培地中１％）
− ビタミンＥ
ＥｔＯＨ中２１．５５ｍｇ／ｍＬ（培地中０．１％）
− Ｍｇ１３２（Ｓｉｇｍａ；Ｃ２２１１）
ＤＭＳＯ中１２０μＭ（培地中０．１％）
【０１５３】
［− 溶解緩衝液］
トリス−ＨＣｌ １．５Ｍ、ｐＨ７．５
４５．３７５ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ；Ｔ１５０３）を、２００ｍＬの蒸留水中に溶解する、
１２Ｎ ＨＣｌを用いて、ｐＨを７．５に調整し、次いで２５０ｍＬにする
１Ｍスクロース溶液（Ｍｅｒｃｋ；ｒｅｆ．７６５４）
８．５５ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解し、次いで２５ｍＬに調整する。
２ｍＭ ＭｇＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ７５０６）
６ｍｇを２５ｍＬの蒸留水中に溶解する。
又は、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｍ５９２１）１２．４ｍｇを、２５ｍＬの蒸留水中に溶解する；
４℃で保存する。
４％トリトンＸ１００溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｘ１００）
０．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する（非常にゆっくりと）
０．５ｍＬ分量を採取し、−２０℃で保存する
４０ｍＭ ＰＭＳＦ溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｐ７６２６）
１４ｍｇを２ｍＬの無水エタノール中に溶解する。
５０ｍＬ分量を採取し、４℃で９カ月保存する
０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｌ２８８４；−２０℃で保存）
水溶性。５０μＬ分量を採取し、−２０℃で１カ月保存する。
１Ｍ ＤＬ−ジチオスレイトール溶液（４℃で保存したＳｉｇｍａ；ｒｅｆ．Ｄ０６３２）
０．１５４ｇを１ｍＬの蒸留水中に溶解する。
１０μＬ分量を採取し、−２０℃で保存する。
５００ｍＭのＥＤＴＡ四ナトリウム溶液（Ｓｉｇｍａ；ｒｅｆ．ＥＤ４Ｓ）
３．８ｇを２０ｍＬの蒸留水中に溶解する；４℃で保存する。
【０１５４】
［− 溶解緩衝液の調製（１００ｍＬ当たり）］
そこから４．３９ｍＬ分量を採取する、−２０℃で保存する不完全な溶液の調製：
【表６】
【０１５５】
完全な溶液を、
４．３９ｍＬの不完全溶液
＋５００μＬの４％トリトンＸ１００
＋１０μＬの１Ｍ ＤＴＴ
＋５０μＬの０．５ｍｇ／ｍＬロイペプチン
＋５０μＬの４０ｍＭでのＰＭＳＦ
を用いて即時調製する。
【０１５６】
酵素活性分析については、ロイペプチンは、プロテアソームの活性を抑制するため、添加しない。
【０１５７】
［２．３Ｂ：免疫沈降の手順］
培地中のヒトメラノサイトを、２５μＭのリノール酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は２５μＭのパルミチン酸（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）又は５μｇ／ｍＬのフェオダクチルム（±１２０ｎＭ Ｍｇ１３２）を用いて、１％ＢＳＡ、５０μＭビタミンＥ及び１ｍＭビタミンＣを含有するＭＮＴ１培地中で処理した。該メラノサイトを、処理の２４又は７２時間後に回収し、溶解する。
【０１５８】
溶解物（５００μｇのタンパク質）を、１０μＬの抗チロシナーゼ抗体（チロシナーゼＡｂ−１モノクローナル抗体（クローンＴ３１１）Ｌａｂ ｖｉｓｉｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）又は抗ユビキチンモノクローナル抗体（抗モノユビキチンモノクローナル（ＳＣ−８０１７、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））を用いて、４℃で１時間インキュベートした。次いで、この混合物を、５０μＬのＡ−セファロースタンパク質（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、１７−５２８０−０１）を用いて処理し、４℃で１６時間インキュベートした。次いで、該混合物を、１０００×ｇで５分遠心分離する。そのペレットを洗浄し、２００μＬのＰＢＳ、１％ＮＰ４０（（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳ１９６２８）を用いて再懸濁し、１０００×ｇで５分遠心分離した。３回の連続洗浄後、そのペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に置き、次いで、ニトロセルロース膜上へ転写させた。次いで、該膜を、抗チロシナーゼモノクローナル抗体を用いて、１時間インキュベートした（チロシナーゼＡｂ−１モノクローナル抗体（クローンＴ３１１）Ｌａｂ ｖｉｓｉｏｎ ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（１／２０００）。ウェスタンブロット法を、ペルオキシダーゼ結合抗マウス免疫グロブリン抗体（１／５０００）、及びＥＣＬキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＮＡ９３１０）によって展開した。
【０１５９】
［３．結果］
［３．１ 藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物をＭＮＴ−１メラノサイト株へ添加することにより誘発される、プロテアソーム活性の調節］
藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物のメラニン合成に対する影響を特徴づけるために、ＭＮＴ−１株のメラノサイト細胞の様々な培地を調製した（藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物、脂肪酸、又はプロテアソーム依存性タンパク質分解阻害剤Ｍｇ１３２を追加、又は別の方法で有する培地）。
【０１６０】
先に概要を述べたように、以前の研究は、プロテアソームによるチロシナーゼの分解を促進することにより、リノール酸の存在下でのメラノサイト培養が、メラニンの量の減少につながったこと、及び、パルミチン酸の存在下で調製した同じ培養が、逆の効果をもたらしたことを明らかにした。皮膚色素沈着を制御する、メラニン合成の制限酵素であるチロシナーゼの活性に対する藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の影響を特徴づけるために、これらの２つの化合物（リノール酸及びパルミチン酸）を、それぞれ、正及び負の対照として使用した。ＭＮＴ−１メラノサイト株のこれらの同一の細胞抽出物から、プロテアソーム活性の研究を実施した。プロテアソーム２０Ｓの３つの触媒部位に特異的な蛍光原性の合成基質ペプチドを使用して、プロテアソーム活性を測定した。
【０１６１】
並行して、特異的抗体を使用して、ウェスタンブロット法により、プロテアソームの２０Ｓ及び２６Ｓの形態を定量化した。
【０１６２】
プロテアソーム活性の分析のために、該細胞を、細胞処理の７２時間後に溶解し、タンパク質濃度を求めた。
【０１６３】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示した結果は、藻類抽出物（Ｐｈ）又はリノール酸の添加７２時間後に、蛍光原ペプチドを使用して測定したプロテアソームの３つのペプチダーゼ活性が増加、及び著しく増加したことを示す（キモトリプシン様、ポストグルタミン酸加水分解酵素及びトリプシン様活性）。
【０１６４】
さらに、パルミチン酸を用いて７２時間処理したメラノサイトでは、２つのペプチダーゼ活性（キモトリプシン様及びポストグルタミン酸加水分解酵素活性）が低減している。プロテアソーム依存性タンパク質分解阻害剤Ｍｇ１３２の存在下で培養したＭＮＴ−１株の細胞抽出物を使用して測定したプロテアソーム活性は、正の対照としての役割を果たす。これらの全ての結果を、付属書の表１にまとめる。
【０１６５】
プロテアソームのペプチダーゼ活性のこの活性化の原因を求めるために、本発明者らは、ウェスタンブロット技法を介して、ＭＮＴ−１の溶解物から、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物、脂肪酸、又はプロテアソーム依存性タンパク質分解阻害剤Ｍｇ１３２を用いたそれらの処理の２４時間及び７２時間後に得たホモジネート中のプロテアソームの量を評価した。
【０１６６】
図２Ａ及び２Ｂに示した結果は、これらの処理が、細胞抽出物中のプロテアソームの量を変えないことを示す。
【０１６７】
これらの結果は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物又はリノール酸を用いたプロテアソーム活性の刺激が、ＭＮＴ−１メラノサイト株の細胞におけるプロテアソームの２０Ｓ又は２６Ｓの形態の発現又は分布を変えないことを示す。
【０１６８】
［３．２ 藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物のＭＮＴ−１メラノサイト株への添加後の、ユビキチン修飾タンパク質の状態］
本発明者らは、脂肪酸又は該藻類抽出物を用いた処理の２４時間又は７２時間後に、ユビキチンタンパク質のレベル（図３Ａ、３Ｂ）が、プロテアソーム阻害剤Ｍｇ１３２の存在下で細胞を培養した場合を除いて、変わらなかったことを示した。
【０１６９】
これらの観察は、ユビキチン化機構が、該藻類又はリノール酸を用いた処理によって影響されなかったことを証明する。
【０１７０】
［３．３ 藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物のＭＮＴ−１メラノサイト株への添加によって誘発される、チロシナーゼの発現及び活性の調節］
これらの様々な条件下で培養したＭＮＴ−１メラノサイトの細胞抽出物を用いて、「材料及び方法」セクションで規定した手順によって開始し、チロシナーゼの量及びその活性に対する、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の影響を特徴づけた。
【０１７１】
本発明者らは、フェオダクチルム・トリコルヌーツム又はリノール酸を用いたＭＮＴ−１メラノサイトの処理の２４時間又は７２時間後に、チロシナーゼにおける有意な減少が観察されたこと（図４Ａ及び４Ｂ）、及び該細胞を、プロテアソーム阻害剤であるＭｇ１３２を用いて処理すると、この減少が逆転され得ることを示した。
【０１７２】
本発明者らは、Ｉｍａｇｅ ｍａｓｔｅｒ １Ｄソフトウェア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用してこの減少を定量化し、その結果を、表２及び３に示している。
【０１７３】
これらの予備的観察は、チロシナーゼがプロテアソームの生理学的基質であり、その分解が、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物によって活性化され得ることを証明する。
【０１７４】
第１段階では、ＭＮＴ−１株の細胞抽出物に適用可能な、チロシナーゼ活性の分析のための特異的技法の展開に着手した。本発明者らは、フェオダクチルム・トリコルヌーツム又はリノール酸を用いたＭＮＴ−１メラノサイトの処理の７２時間後の細胞におけるチロシナーゼ活性を測定し、本発明者らは、この活性における有意な減少を観察した（図５及び表４）。
【表７】
【０１７５】
表２：２４時間でのチロシナーゼの定量化
【表８】
【０１７６】
表３：７２時間でのチロシナーゼの定量化
【表９】
【０１７７】
表４：７２時間でのチロシナーゼ活性
プロテアソーム基質チロシナーゼが、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物を用いて処理したＭＮＴ−１株のメラノサイト細胞の抽出物においてより良好に分解したことを確認するために、７２時間での免疫化学的検出及び免疫沈降によって、チロシナーゼ及びユビキチン結合形態のチロシナーゼの定性的及び定量的研究を実施した（図６）。これらの結果は、藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物を用いて処理した細胞においては、チロシナーゼが、急速に分解するため、ユビキチン化形態で蓄積しないことを示す。
【０１７８】
［ＩＩＩ．化粧用組成物の例］
濃度を重量パーセントで表す。
以下の例で使用する抽出物は、抽出物Ｅ２である。
【０１７９】
［１．エマルジョンゲル形態の脱色用美容デイクリーム］
【表１０】
上記エマルジョンゲルの使用は、程度の差はあっても強烈な日光の放射、又は直射日光にさえ曝されている人々が、色白の状態を維持し、色素沈着斑の出現を回避することを可能にする。
【０１８０】
［２．日焼け止め液体化粧用組成物（ＳＰＦ３０）］
【表１１】
【０１８１】
この組成物は、強烈な日光へ曝されている間に色素沈着斑の出現を生じる傾向がある個人の場合、その現象を予防する。高濃度の日焼け止めの存在が、メラニンのレベルの減少の結果である、天然の保護の減少を補うことに注意されたい。
【０１８２】
［３．肌色を明るくするための美容フェイスローション］
【表１２】
この美白ローションは、化粧を落として皮膚を洗浄した後で使用する。
【０１８３】
［４．顔用の美容液］
【表１３】
この高濃度液組成物１滴を、一般に、フェイスクリームの適用前に、顔へ適用する。この液は、肌色の明るさを得る又は維持するために、通常、１〜２週間の治療で使用する。
【０１８４】
［５．体毛を明色化するための美容ローション］
【表１４】
このローションは、明色化する有毛領域、特に腕へ、毛が徐々に明色化するようにするのに十分な時間適用する。
【０１８５】
［６．斑点予防美容ハンドクリームゲル］
【表１５】
このクリームは、手の上の斑点（日光性及び／又は老人性色素斑）へ、その色を薄めるために直接適用すべきである。
【０１８６】
［付属書Ａ］
Ｉ−バッチ緩衝液において、変性及び還元条件下での電気泳動ゲルに使用する緩衝液及び溶液
【０１８７】
［モノマー溶液：］
アクリルアミド／ビス−アクリルアミド、３０％Ｔ、２．６７％Ｃ（Ｂｉｏｒａｄ；ｒｅｆ．１６１−０１５８）
【０１８８】
分離ゲル緩衝液：トリス−ＨＣｌ １．５Ｍ ｐＨ８．８。
− 蒸留水１００ｍＬ当たり１８．１５ｇのトリス塩基（Ｓｉｇｍａ；Ｔ１５０３）
− １２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを８．８に調整する
【０１８９】
濃縮ゲル緩衝液：トリス−ＨＣｌ ０．５Ｍ ｐＨ６．８。
− 蒸留水１００ｍＬ当たり６ｇのトリス塩基
− １２Ｎ ＨＣｌを用いてｐＨを６．８に調整する
１０×移動緩衝液：トリス０．２５Ｍ ｐＨ８．３、グリシン１．９２Ｍ；ＳＤＳ１％
− トリス塩基 １２ｇ
− グリシン ５７．６ｇ
（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．；５０３７Ｇ）
− ＳＤＳ１０％（Ｓｉｇｍａ；Ｌ５７５０） ４０ｍＬ
− ４００ｍＬにするための蒸留水
これらの溶液を４℃で保存する。
【０１９０】
１０％、すなわち１００ｍｇ／ｍＬでの過硫酸アンモニウム（ＮＨ４）２Ｓ２Ｏ８：（Ｓｉｇｍａ；Ａ１４３３）
一定分量に分けて、−２０℃で保存する
【０１９１】
Ｌａｅｍｍｌｉ２×還元試料緩衝液：トリス−ＨＣｌ０．０６Ｍ ｐＨ６．８；ＳＤＳ２．３％；グリセロール１０％；ブロモフェノールブルー０．０２％
− 濃縮ゲル緩衝液 トリス０．５Ｍ ｐＨ６．８ ６．２５ｍＬ
− ＳＤＳ１０％ １１．５０ｍＬ
− グリセロール ５ｍＬ
− ５０ｍＬにするための蒸留水
【０１９２】
１０×ブロモフェノールブルー（飽和溶液）：
スパーテルチップ一杯（ｓｐａｔｕｌａ ｔｉｐｆｕｌ）のブロモフェノールブルーを、５ｍＬのＬａｅｍｍｌｉ２×緩衝液中に入れ、撹拌し、超音波処理し、遠心分離し、その上澄みのみを回収する。
これらの溶液を室温で保存する。
【０１９３】
着色済み標準試料−
− 低分子量（Ｂｉｏｒａｄ；ｒｅｆ．１６１−０３０５）
それらは、
− ホスホリラーゼＢ １０４ｋＤａ
− ウシ血性アルブミン ８２ｋＤａ
− 卵アルブミン ４８．３ｋＤａ
− 炭酸脱水酵素 ３３．４ｋＤａ
− 大豆トリプシン阻害剤 ２８．３ｋＤａ
− リソシーム １９．４ｋＤａ
からなる。
− １０〜２５０ｋＤａの高分子量（Ａｍｅｒｓｈａｍ；ｒｅｆ．ＲＰＮ８００）
【０１９４】
ＩＩ−ゲル電気泳動
− １２％Ｔでの分離ゲルの調製
【表１６】
【０１９５】
− １２％Ｔでの濃縮ゲルの調製
【表１７】
【０１９６】
［付属書Ｂ］
転写及び免疫検出用の溶液
［Ｔｏｗｂｉｎ転写緩衝液。］
トリス−ＨＣｌ２５ｍＭ、ｐＨ８．３；グリシン１９２ｍＭ；２０％メタノール
− トリス塩基 ３．０３ｇ
− １００ｍＬの蒸留水中に溶解すべきグリシン（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ．；５０３７Ｇ） １４．４ｇ
− メタノール ２００ｍＬ
− １０００ｍＬにするための蒸留水
【０１９７】
［ＰＢＳ−Ｔ緩衝液］
１０×ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１４２００−０６７）の１０倍希釈液
そこへ０．１％ツイーン２０（Ｓｉｇｍａ；Ｐ１３７９）を添加する
これらの溶液を４℃で保存する
【０１９８】
［ポンソーレッド（Ｓｉｇｍａ；Ｐ７１７０）］
５％酢酸溶液中の０．１％での溶液（ｗ／ｖ）
【０１９９】
［付属書Ｃ］
［タンパク質分析］
（Ｂｉｏｒａｄキット；タンパク質標準試料；ｒｅｆ．５００−０００６）
ブラッドフォード法
電気泳動を実施する前に、解凍した溶解物を、９５℃で１０分加熱する。
【０２００】
［変性溶解緩衝液（２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液＋ＤＴＴ１０ｍＭ）中の溶解物について］
Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液は、該キットの試薬と適合性がないため、この方法を介して分析を実施するために、それを除去することが必須である。
Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブにおいて、５００μＬのアセトンを、５μＬの溶解物（タンパク質濃度の関数として適合させる容積）へ添加する。
該チューブを、−２０℃に少なくとも１０分置く。
次いで、それらを４℃で１０分、１７０００×ｇで遠心分離する。
その上澄みを、反転により除去し、アセトンの蒸発後に、ペレットを５０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ中に溶解し、ブラッドフォード法を介してタンパク質を分析する（該試料の１０倍希釈液）。
【０２０１】
［非変性溶解緩衝液中の溶解物について］
この溶解緩衝液の成分は、この濃度（１０μＬの試料／ウェル）で、Ｂｉｏｒａｄキットの試薬を妨害しない。その範囲内に入り、優先的にはその上位となるように、該試料のみを希釈すべき、又はすべきではない。
【０２０２】
［校正範囲量の調製：］
ＢＳＡ原液：２ｍｇ／ｍＬ（Ｓｉｇｍａ；Ａ２１５３；４℃）
【０２０３】
該範囲は、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆチューブで調製し、凍結又は４℃で保存し得る。
【表１８】
【０２０４】
該試薬（クーマシーブルーＧ２５０）を、５倍に即時希釈する（１時間維持する）。９６ウェルプレートへ、
− 該範囲について１０μＬの原液
− 該対照について１０μＬの水
− 該試料対照について１０μＬの０．１Ｍ ＮａＯＨ
− 分析する１０μＬの試料（３点又は４点）
を用いて希釈した２００μＬの試薬を添加する。
該プレートを振盪し、１０分発色させる。
５９５ｎｍで吸収度を測定する。発色は、最大で４０分安定である。
【０２０５】
［付属書Ｄ］
［一次及び二次抗体のリスト］
【表１９】
【０２０６】
【表２０】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の、特に皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化を目的とした脱色活性剤としての、化粧用組成物における使用。
【請求項２】
前記藻類抽出物が、最終組成物の総重量に対して、０．００１重量％と５重量％の間、好ましくは０．００１重量％と１重量％の間の濃度で、前記組成物において使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抽出物が、少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％の脂肪酸を含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記抽出物が、前記藻類から、脂肪酸を抽出するのに十分に無極性である溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含むプロセスで得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記溶媒が、イソプロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン又はヘプタンであることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記抽出プロセスが、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、これらのアルコールの水−アルコール混合物、エチレングリコールなどのＣ２〜Ｃ６多価アルコール、クロロホルム及びジクロロメタンなどの塩素系溶媒、酢酸エチルなどのＣ３〜Ｃ６有機酸エステル、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンなどのＣ６〜Ｃ１０アルカン、並びにジイソプロピルエーテルなどのＣ５〜Ｃ８エーテルから選択される抽出溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含み、前記抽出溶媒が、場合によって塩基性化されていることを特徴とする、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
前記抽出物が、塩基性化された水−アルコール混合物を用いた、藻類の抽出の第１のステップを含む抽出プロセスで得られ、前記水−アルコール混合物のアルコールが、イソプロパノール、エタノール及びメタノールの群から選択されることが好ましく、前記ステップが、水−アルコール相において塩形態で脂肪酸を回収することを可能にすることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記抽出プロセスが、前記水−アルコール混合物を酸性化し、次いで無極性溶媒を使用した液液抽出を実施し、最後に前記無極性溶媒を除去して、前記抽出物を油の形態で得ることを含む、無極性相における脂肪酸の回収ステップをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記無極性溶媒が、ヘプタン、ヘキサン及びシクロヘキサンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記藻類抽出物が、超臨界ＣＯ２を使用した抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化のための美容ケア法において、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化粧用組成物の、皮膚の少なくとも１つの関心領域への適用を含むことを特徴とする美容ケア法。
【請求項１２】
前記組成物が、所望の効果を得るのに効果的な量の前記抽出物を含有することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１】
藻類フェオダクチルム・トリコルヌーツムの抽出物の、特に皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化を目的とした脱色活性剤としての、化粧用組成物における使用。
【請求項２】
前記藻類抽出物が、最終組成物の総重量に対して、０．００１重量％と５重量％の間、好ましくは０．００１重量％と１重量％の間の濃度で、前記組成物において使用されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抽出物が、少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも６０重量％の脂肪酸を含有することを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記抽出物が、前記藻類から、脂肪酸を抽出するのに十分に無極性である溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含むプロセスで得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記溶媒が、イソプロパノール、ヘキサン、シクロヘキサン又はヘプタンであることを特徴とする、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記抽出プロセスが、Ｃ１〜Ｃ６アルコール、これらのアルコールの水−アルコール混合物、エチレングリコールなどのＣ２〜Ｃ６多価アルコール、クロロホルム及びジクロロメタンなどの塩素系溶媒、酢酸エチルなどのＣ３〜Ｃ６有機酸エステル、ヘプタン、ヘキサン又はシクロヘキサンなどのＣ６〜Ｃ１０アルカン、並びにジイソプロピルエーテルなどのＣ５〜Ｃ８エーテルから選択される抽出溶媒を用いた抽出の少なくとも１つのステップを含み、前記抽出溶媒が、場合によって塩基性化されていることを特徴とする、請求項４又は５に記載の使用。
【請求項７】
前記抽出物が、塩基性化された水−アルコール混合物を用いた、藻類の抽出の第１のステップを含む抽出プロセスで得られ、前記水−アルコール混合物のアルコールが、イソプロパノール、エタノール及びメタノールの群から選択されることが好ましく、前記ステップが、水−アルコール相において塩形態で脂肪酸を回収することを可能にすることを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記抽出プロセスが、前記水−アルコール混合物を酸性化し、次いで無極性溶媒を使用した液液抽出を実施し、最後に前記無極性溶媒を除去して、前記抽出物を油の形態で得ることを含む、無極性相における脂肪酸の回収ステップをさらに含むことを特徴とする、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記無極性溶媒が、ヘプタン、ヘキサン及びシクロヘキサンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記藻類抽出物が、超臨界ＣＯ２を使用した抽出によって得られることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
皮膚の色素沈着斑の低減若しくは除去、又は肌色若しくは体毛若しくは頭髪の明色化のための美容ケア法において、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化粧用組成物の、皮膚の少なくとも１つの関心領域への適用を含むことを特徴とする美容ケア法。
【請求項１２】
前記組成物が、所望の効果を得るのに効果的な量の前記抽出物を含有することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【図１Ａ】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【図１Ｂ】
【図１Ｃ】
【図２Ａ】
【図２Ｂ】
【図３Ａ】
【図３Ｂ】
【図４Ａ】
【図４Ｂ】
【図５】
【図６】
【公表番号】特表２０１０−５２０２６７（Ｐ２０１０−５２０２６７Ａ）
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願番号】特願２００９−５５２２５８（Ｐ２００９−５５２２５８）
【出願日】平成２０年３月７日（２００８．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５０３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２５７８９
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０２１８９５７９）エルブイエムエイチ レシェルシェ (68)
【Ｆターム（参考）】
【公表日】平成２２年６月１０日（２０１０．６．１０）
【国際特許分類】
【出願日】平成２０年３月７日（２００８．３．７）
【国際出願番号】ＰＣＴ／ＦＲ２００８／０５０３９４
【国際公開番号】ＷＯ２００８／１２５７８９
【国際公開日】平成２０年１０月２３日（２００８．１０．２３）
【出願人】（５０２１８９５７９）エルブイエムエイチ レシェルシェ (68)
【Ｆターム（参考）】
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